PL223163B1 - Zestaw sond i starterów do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, sposób oraz zestaw do analizy próbek medycznych i środowiskowych - Google Patents

Zestaw sond i starterów do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, sposób oraz zestaw do analizy próbek medycznych i środowiskowych

Info

Publication number
PL223163B1
PL223163B1 PL401061A PL40106112A PL223163B1 PL 223163 B1 PL223163 B1 PL 223163B1 PL 401061 A PL401061 A PL 401061A PL 40106112 A PL40106112 A PL 40106112A PL 223163 B1 PL223163 B1 PL 223163B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
unkn
tet
texas red
primers
probes
Prior art date
Application number
PL401061A
Other languages
English (en)
Other versions
PL401061A1 (pl
Inventor
Michał Obuchowski
Iwona Piątek
Małgorzata DĄBROWIECKA
Zbigniew Dąbrowiecki
Original Assignee
Gdański Univ Medyczny
Gdański Uniwersytet Medyczny
Wojskowy Inst Medyczny
Wojskowy Instytut Medyczny
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gdański Univ Medyczny, Gdański Uniwersytet Medyczny, Wojskowy Inst Medyczny, Wojskowy Instytut Medyczny filed Critical Gdański Univ Medyczny
Priority to PL401061A priority Critical patent/PL223163B1/pl
Priority to PCT/PL2013/000130 priority patent/WO2014054956A1/en
Publication of PL401061A1 publication Critical patent/PL401061A1/pl
Publication of PL223163B1 publication Critical patent/PL223163B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Przedmiotem wynalazku są nowe sondy służące do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter Baumannii o sekwencjach 1 i 2 oraz oligonukleotydowe startery o określonych sekwencjach. Ujawniono też sposób analizy materiału genetycznego zawartego w próbkach, w którym to fragment DNA powiela się w reakcji Real-Time PCR z zastosowaniem starterów gdzie w reakcji Real-Time PCR powiela się konserwowane sekwencje z zastosowaniem starterów o określonych sekwencjach, po czym produkt wykrywa się za pomocą sond o sekwencjach 1 i 2. Wynalazek obejmuje również zestaw do analizy materiału genetycznego zawartego w próbkach.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zestaw sond do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, zestaw oligonukleotydowych starterów, sposób oraz zestaw do analizy materiału genetycznego zawartego w próbkach medycznych i środowiskowych.
Acinetobacter baumannii jest oportunistycznym patogenem odpowiedzialnym za wywołanie infekcji szpitalnych takich jak zapalenie płuc, zakażenia krwi, ran czy oparzonych miejsc. Stanowi on coraz większe zagrożenie z uwagi na szybkie nabywanie wielolekooporności, co znacznie utrudnia skuteczne leczenie. Dlatego niezwykle ważna jest diagnostyka.
Obecnie stosowane testy, pozwalające stwierdzić obecność tej bakterii w badanej próbce, opierają się na metodach mikrobiologii klasycznej (hodowla na podłożach wybiórczych, różnicujących, testy biochemiczne). Wymagają one uzyskania czystej hodowli bakteryjnej przed przystąpieniem do oznaczenia, co powoduje że są bardzo czasochłonne. Standardowo na otrzymanie wyników analizy czeka się od 3 do 7 dni. Co więcej, z uwagi na to, iż powyższe testy opierają się na cechach fenotypowych, które są bardzo zmienne wśród mikroorganizmów, pozwalają na określenie przynależności gatunkowej badanego izolatu jedynie w pewnym przybliżeniu, nigdy nie dając 100% pewności.
Technika Real-Time PCR jest bardzo dobrze znana i dosyć powszechnie stosowana w nowoczesnych laboratoriach diagnostycznych. Reakcja Real-Time PCR jest reakcją wykorzystywaną do monitorowania ilości przyrostu kopii badanej sekwencji w czasie. Identyfikacja jest możliwa dzięki zastosowaniu sond znakowanych barwnikami fluoroscencyjnymi.
Z opisu US 2009/0291854 znamy metodę identyfikacji patogenów, w tym Acinetobacter baumannii, w badanej próbce. Metoda ta bazuje na mikromacierzach i hybrydyzacji DNA-DNA, a badana próbka wymaga wielu manipulacji przed właściwym oznaczeniem.
Dlatego istnieje potrzeba poszukiwania nowych, szybszych i bardziej wiarygodnych rozwiązań w kontekście oznaczania obecności Acinetobacter baumannii w próbkach szpitalnych i środowiskowych.
Przedmiotem wynalazku są nowe sondy oraz nowe oligonukleotydowe startery, stanowiące zestaw do wykrywania obecności bakterii Acinetobacter baumannii w próbach szpitalnych oraz środowiskowych. Sposób wykrywania oraz opracowany zestaw posiada szereg zalet w stosunku do stosowanych dotychczas metod mikrobiologii klasycznej. Nie wymaga on uzyskania czystej hodowli bakteryjnej przed przystąpieniem do oznaczania. Bakterie wykrywa się bezpośrednio na dostarczonej próbie, co zmniejsza ryzyko jej zanieczyszczenia, a także znacząco skraca czas potrzebny do otrzymania wyniku. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej oraz przeprowadzenie samej reakcji Real-Time PCR zajmuje około 2 godzin, jednorazowo można oznaczać wiele prób, co również przyśpiesza pracę. Cała procedura opiera się na amplifikacji (powielaniu) charakterystycznych, stałych (niezmiennych) fragmentów DNA chromosomalnego bakterii, dlatego daje ona wiarygodne wyniki. Jesteśmy w stanie odróżnić Acinetobacter baumannii od innych bardzo blisko spokrewnionych gatunków należących do rodzaju Acinetobacter, o bardzo podobnych cechach fenotypowych, jednak o odmiennym znaczeniu klinicznym, co jest prawie niemożliwe przy standardowych procedurach mikrobiologicznych.
Poszukiwanie ulepszonego i uproszczonego sposobu identyfikacji poprzez zastosowanie nowych sond i starterów doprowadziło obecnie do opracowania między innymi sposobu i zestawu do analizy próbek medycznych i środowiskowych pod kątem obecności Acinetobacter baumannii.
Przedmiotem wynalazku jest zestaw sond służących do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, gdzie są to oligonukleotydy o sekwencjach przedstawionych na Fig. 1 i Fig. 2.
Zestaw sond, które są zawarte w sekwencji powielanej przy pomocy starterów przedstawionych na Fig. 3 i Fig. 4.
Zestaw starterów oligonukleotydowych do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, gdzie są to startery o sekwencjach przedstawionych na Fig. 3 i Fig. 4.
Sposób wykrywania bakterii gatunku Acinetobacter baumannii w próbkach medycznych i/lub środowiskowych, w którym to fragment DNA powiela się w reakcji Real-Time PCR z zastosowaniem starterów, gdzie w reakcji Real-Time PCR powiela się konserwowane sekwencje z zastosowaniem starterów o sekwencjach przedstawionych na Fig. 3 i Fig. 4, po czym produkty wykrywa się za pomocą sond o sekwencjach przedstawionych na Fig. 1 i Fig. 2.
Sposób, gdzie produkty charakteryzuje się poprzez sygnały, wyemitowane są z sond wyznakowanych znacznikami fluoroscencyjnymi.
PL 223 163 B1
Zestaw do analizy materiału genetycznego zawartego w próbkach medycznych i/lub środ owiskowych do wykrywania bakterii gatunku Acinetobacter baumannii, zawierający startery o sekwencjach przedstawiono na Fig. 3 i Fig. 4 oraz znakowane sondy o sekwencjach przedstawiono na Fig. 1 i Fig. 2.
Zestaw, który dodatkowo zawiera wzorzec będący DNA chromosomalnym szczepu Acinetobacter baumannii ATCC 17978.
Określenia stosowane powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:
• Konserwowane sekwencje - to sekwencje nukleotydowe, które podczas ewolucji nie zmieniają się wcale lub zmieniają się w niewielkim stopniu i są podobne lub identyczne we wszystkich szczepach w obrębie danego gatunku.
• Próbka medyczna - materiał do analizy pochodzący z punktu opieki zdrowotnej. Jego źródło może stanowić infrastrukturę (np. wymaz z szafki) jak i pacjenci (np. wymaz z rany).
• Próbka środowiskowa - materiał pobrany ze środowiska naturalnego np.: gleba, woda itp. Opis rysunków:
Fig. 1 - sonda do wykrywania Acinetobacter baumannii MIC1,
Fig. 2 - sonda do wykrywania Acinetobacter baumannii IW10,
Fig. 3 - startery do sondy MIC1,
Fig. 4 - startery do sondy IW10,
Fig. 5 - schemat przygotowania rozcieńczeń seryjnych do posiewu na podłoże LAM,
Fig. 6 - zmiana zabarwienia pożywki LAM pod wpływem wzrostu bakterii Acinetobacter spp. Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia Przykład 1
POBRANE PRÓBKI
Pocieramy badaną powierzchnię jałową wymazówką zwilżoną solą fizjologiczną (0,85% NaCl), którą umieszczamy w jałowej, odpowiednio opisanej probówce (bez podłoża transportowego).
TRANSPORT
Próbka nie wymaga zachowania szczególnych warunków transportu, o ile jest dostarczona w ciągu 4h do miejsca badania. Jeżeli ten czas jest dłuższy, próbki należy przechowywać i transpo rtować w temp. 4°C.
PRZYGOTOWANIE PRÓBKI DO TESTU
Wymazówkę płuczemy w 500 ąl pożywki LB (Luria Broth Medium), znajdującej się w nowej, jałowej probówce eppendorfa, pamiętając o dokładnym odsączeniu wacika. Średnio otrzymujemy 400-450 ąl roztworu stanowiącego próbkę.
PODZIAŁ PRÓBKI • Pobieramy 50 ąl roztworu z próbki do jałowej probówki, inkubujemy 10 min w 95°C wirujemy 12 000-15 000 g przez 5 min. Supernatant wykorzystujemy, jako matrycę do reakcji Real-Time PCR.
• Z pozostałej części próbki pobieramy 100 ąl i dodajemy do 10 ml pożywki LB. Inkubujemy przez noc w 37°C z wytrząsaniem, w celu namnożenia bakterii obecnych w próbce, na wypadek, gdyby ich liczba była niewystarczająca do wykonania oznaczeń. Pozwoli to również w razie potrzeby stwierdzić, czy w pierwotnej próbie znajdowały się żywe, czy martwe bakterie (tylko żywe komórki są w stanie dzielić się).
• Kolejne 100 ąl wykorzystujemy do zrobienia posiewów na podłożu LAM (Leeds Acinetobacter Medium), w celu uzyskania izolatów, potwierdzających obecność szukanej bakterii w próbce. Przygotowujemy seryjne rozcieńczenia w soli fizjologicznej zgodnie z załączonym schematem:
PL 223 163 B1
Przygotowane rozcieńczenia oraz pozostałą część próbki wysiewamy na murawę na płytki z podłożem LAM i inkubujemy przez noc w 37°C. Następnego dnia sprawdzamy, czy na płytkach wyrosły kolonie. Szukamy tych o pożądanym fenotypie, tj. okrągłych, wypukłych, o wielkości nie przekraczającej 2 mm średnicy, koloru bladoróżowego lub przeźroczystych, które zabarwiają podłoże z pom arańczowego na różowy. Uzyskanie izolatów z próbek dających dodatni wynik w reakcji Real-Time PCR dodatkowo potwierdza poprawność wykonania oznaczenia. Co więcej, uzyskane w ten sposób kolonie mogą również posłużyć za źródło materiału genetycznego do wykonania reakcji Real-Time PCR w przypadku uzyskania wyników wątpliwych (Fig. 6).
• Do pozostałej próbki dodajemy 200 gl jałowego 50% glicerolu i zamrażamy (-80°C), na wypadek gdyby w przyszłości trzeba było powtórzyć oznaczenie.
REKACJA REAL-TIME PCR
Reakcję przeprowadzamy w termocyklerze płytkowym, zgodnie i następującym profilem termicznym typu one-step.
T a b e l a 1
Temperatura °C Czas [min] Ilość cykli
95,0 3:00 1
95,0 0:10 40
63,0 0:30
Reakcję przeprowadzamy w niskoprofilowych płytkach 96-dołkowych, w końcowej objętości 20 gl na dołek. Oznaczenie wykonujemy w dwóch powtórzeniach dla każdej badanej próbki oraz dla kontroli. Do wyznaczenia krzywej standardowej używamy DNA chromosomalnego o stężeniu 100 ng/gl szczepu referencyjnego Acinetobacter baumannii ATCC17978 (szczep pochodzący z American Type Culture Collection), przygotowanego w 6 rozcieńczeniach (10-1-10-6). Jako kontroli negatywnej używamy jałowej wody (Sigma).
Przygotowujemy mieszaninę reakcyjną o składzie:
• 10 gl SuperMixu (Bio-Rad), zawierającego polimerazę, nukleotydy (dNTPs) bufor oraz jony magnezu (Mg2+), • startery o optymalnym stężeniu ustalonym doświadczalnie (przedstawionym w Tabeli 1), • sondy o optymalnym stężeniu ustalonym doświadczalnie (przedstawionym w Tabeli 1), • dopełniamy jałową wodą do 19 gl.
PL 223 163 B1
W celu ustalenia objętości niezbędnej mieszaniny reakcyjnej należy zsumować ilość próbek, standardów (zwykle 6) i kontroli negatywnych (zwykle 2). Uzyskaną liczbę mnożymy przez 2 (każda reakcja musi być duplikowana) oraz dodajemy 8% przeznaczone na niedokładność i straty podczas pipetowania.
Nanosimy dobrze wymieszaną mieszaninę reakcyjną na płytkę (po 19 pl do każdego dołka), następnie dodajemy matrycę (1 pl).
Przykład
Do przebadania jest 20 próbek.
Obliczenia do mieszaniny reakcyjnej:
(20 próbek + 6 rozcieńczeń standardu + 1 kontrola negatywna) razy 2 powtórzenia = 54, + 8% (z 54) = 58 (wszystkie objętości poszczególnych składników będziemy mnożyć przez 58).
T a b e l a 2
Skład mieszaniny reakcyjnej
Mieszanina reakcyjna Objętość na 1 reakcję [pl] Końcowa objętość (x58) [pl]
SuperMix 10 580
Startery (korzystamy z roztworów podstawowych o stężeniu 10 nM) MIC1 górny 0,9 52,2
MIC1 dolny 0,5 29
IW10 górny 0,6 34,8
IW10 dolny 0,9 52,2
Sondy (korzystamy z roztworów podstawowych o stężeniu 10 mM) S1 0,2 11,6
S10 0,2 11,6
dH2O 5,7 330,6
Razem 19 1102
T a b e l a 3
Stężenia sond i starterów w mieszaninie reakcyjnej
Nazwa startera MIC1 IW10
Sekwencja startera Górny: Dolny: 5'GGTTAGAGCACACGCTTGATAAG3' 5'AGTTCTGGTGGACTAGGAGAG3' 5'GGTGAAGTGCCAATGCAACG3' 5'TCCCGGATTTCATTCAAAGCATTC3'
Końcowe stężenie do reakcji Real-Time PCR Górny: 450 pM Dolny: 250 pM Górny: 300 pM Dolny: 450 pM
Nazwa sondy S1 S10
Sekwencja sondy (5'-3') 5'CGAACTCCTGACCTCCTGCGTGC3' 5'CACGCCTTCTTGCTCGGCTATGGC3'
Końcowe stężenie do reakcji Real-Time PCR 100 pM 100 pM
Wyniki reakcji Real-Time PCR można uznać za wiarygodne, jeśli mieszczą się w zakresie wyznaczonej przez standardy krzywej kalibracyjnej. Rozrzut między powtórzeniami dla danej próbki, jak i standardów, czy kontroli nie może przekraczać 0,5 Cq (0,5 cyklu reakcji Real-Time PCR). Wynik badania próbki można uznać za dodatni (wykryto bakterie Acinetobacter baumannii), gdy wartości Cq uzyskane w reakcji Real-Time PCR na obu sondach mieszczą się w zakresie wyznaczonym przez krzywą kalibracyjną.
W przypadku, gdy wyniki reakcji Real-Time PCR nie są miarodajne, materiał genetyczny jest izolowany z kolonii uzyskanych na podłożu LAM i procedura Real-Time PCR jest powtarzana.
PL 223 163 B1
Przykłady wyników i ich interpretacji po reakcji Real-Time PCR
Objaśnienia:
Well - studzienka (miejsce na płytce)
Fluor - fluorofor (osobno otrzymujemy wyniki dla każdej sondy, wyznakowanej odpowiednim fluoroforem)
Content - określamy, czy jest to standard (Std-), badana próbka (Unkn-), czy kontrola (Neg Ctrllub Pos Ctrl-)
Well Fluor Content Cq Cq Mean KOMENTARZ
1 2 3 4 5 6
A01 TET Std-01 16,13 16,17 Wartości Cq dla rozcieńczeń wzorca (10_1-10“6) na sondzie wyznakowanej znacznikiem fluorescencyjnym TET. Najwyższa wartość Cq to 34,58. Wszystko powyżej tej wartości traktujemy jako wynik ujemny.
A02 TET Std-01 16,21 16,17
A03 TET Std-02 19,39 19,27
A04 TET Std-02 19,15 19,27
A05 TET Std-03 22,92 23,01
A06 TET Std-03 23,09 23,01
A07 TET Std-04 26,88 26,99
A08 TET Std-04 27,09 26,99
A09 TET Std-05 30,11 30,11
A10 TET Std-05 30,11 30,11
A11 TET Std-06 33,96 34,27
A12 TET Std-06 34,58 34,27
B01 TET Unkn-01 16,54 16,67 Wynik dodatni. Wynik w obu powtórzeniach jest wiarygodny, gdyż różnica między wartościami Cq jest mniejsza niż 0,5.
B02 TET Unkn-01 16,81 16,67
B03 TET Unkn-02 N/A 0,00 Wynik negatywny. Brak sygnału w obu powtórzeniach.
B04 TET Unkn-02 N/A 0,00
B05 TET Unkn-03 N/A 0,00 Uznajemy, że jest to próbka negatywna. Brak sygnału w pierwszym powtórzeniu. Wartość Cq dla drugiego powtórzenia jest większa niż rozcieńczenia wzorca 10-6.
B06 TET Unkn-03 36,29 36,29
B07 TET Unkn-04 N/A 0,00 Wynik negatywny.
B08 TET Unkn-04 N/A 0,00
B09 TET Unkn-05 20,53 20,52 Wynik dodatni.
B10 TET Unkn-05 20,50 20,52
B11 TET Unkn-06 17,52 17,77 Wynik dodatni.
B12 TET Unkn-06 18,01 17,77
C01 TET Unkn-07 18,32 18,40 Wynik dodatni.
C02 TET Unkn-07 18,48 18,40
C03 TET Unkn-08 36,14 36,08 Wynik negatywny.
C04 TET Unkn-08 36,03 36,08
C05 TET Unkn-09 35,50 35,50 Wynik negatywny.
C06 TET Unkn-09 N/A 0,00
PL 223 163 B1 cd. tabeli
1 2 3 4 5 6
C07 TET Unkn-10 40,79 37,76 Wynik negatywny. Dla pewności można powtórzyć oznaczenie.
C08 TET Unkn-10 34,74 37,76
C09 TET Unkn-11 32,82 32,96 Wynik dodatni. Dla pewności należałoby powtórzyć oznaczenie z hodowli nocnej, aby zobaczyć, czy w próbce znajdowały się żywe, namnażające się bakterie (wtedy wartość Cq powinna być niższa, wskazując na zwiększenie się liczby bakterii w próbce).
C10 TET Unkn-11 33,11 32,96
C11 TET Unkn-12 28,11 27,92 Wynik dodatni.
C12 TET Unkn-12 27,73 27,92
D01 TET Unkn-13 31,80 33,52 Wynik wątpliwy. Należy powtórzyć oznaczenie ze względu na skrajne wartości Cq oraz ich dużą rozbieżność.
D02 TET Unkn-13 35,23 33,52
D03 TET Unkn-14 40,38 40,38 Wynik negatywny.
D04 TET Unkn-14 N/A 0,00
D05 TET Unkn-15 34,84 34,81 Wynik wątpliwy. Należy powtórzyć oznaczenie ze względu na skrajne wartości Cq.
D06 TET Unkn-15 34,78 34,81
D07 TET Unkn-16 36,66 36,95 Wynik negatywny.
D08 TET Unkn-16 37,24 36,95
D09 TET Unkn-17 38,23 38,23 Wynik negatywny.
D10 TET Unkn-17 N/A 0,00
D11 TET Unkn-18 N/A 0,00 Wynik negatywny.
D12 TET Unkn-18 N/A 0,00
E01 TET Unkn-19 34,58 33,94 Wynik wątpliwy. Należy powtórzyć oznaczenie ze względu na skrajne wartości Cq.
E02 TET Unkn-19 33,30 33,94
E03 TET Unkn-20 20,71 20,87 Wynik dodatni.
E04 TET Unkn-20 21,03 20,87
E05 TET Unkn-21 17,85 17,76 Wynik dodatni.
E06 TET Unkn-21 17,67 17,76
E07 TET Unkn-22 38,02 37,91 Wynik negatywny.
E08 TET Unkn-22 37,79 37,91
E09 TET Unkn-23 29,03 28,98 Wynik dodatni.
E10 TET Unkn-23 28,93 28,98
E11 TET Neg Ctrl-01 N/A 0,00 Wynik negatywny. Kontrola na wodzie. Czasami zdarzają się zanieczyszczenia podczas nakładania próbek na płytkę, ale wtedy wartość Cq jest powyżej wartości dla rozcieńczenia wzorca 10-6.
E12 TET Neg Ctrl- 01 37,23 37,23
F01 TET Neg Ctrl-02 N/A 0,00 Wynik negatywny.
F02 TET Neg Ctrl-02 N/A 0,00
PL 223 163 B1 cd. tabeli
1 2 3 4 5 6
A01 Texas Red Std-01 16,04 16,10 Wartości Cq dla rozcieńczeń wzorca (101-106) na sondzie wyznakowanej znacznikiem fluorescencyjnym Texas Red. Najwyższa wartość Cq to 34,26. Wszystko powyżej tej wartości traktujemy, jako wynik ujemny. Przy rozcieńczeniu 106 zdarzają się większe rozbieżności niż 0,5, ze względu na niskie stężenie materiału genetycznego.
A02 Texas Red Std-01 16,16 16,10
A03 Texas Red Std-02 19,20 19,09
A04 Texas Red Std-02 18,98 19,09
A05 Texas Red Std-03 22,76 22,89
A06 Texas Red Std-03 23,01 22,89
A07 Texas Red Std-04 26,55 26,83
A08 Texas Red Std-04 27,11 26,83
A09 Texas Red Std-05 30,63 30,49
A10 Texas Red Std-05 30,35 30,49
A11 Texas Red Std-06 33,08 33,67
A12 Texas Red Std-06 34,26 33,67
B01 Texas Red Unkn-01 17,01 17,01 Wynik dodatni. Wynik był dodatni również na sondzie znakowanej TET, więc próbkę uznajemy jako dodatnią. Itd.
B02 Texas Red Unkn-01 17,01 17,01
B03 Texas Red Unkn-02 N/A 0,00 Wynik negatywny.
B04 Texas Red Unkn-02 N/A 0,00
B05 Texas Red Unkn-03 N/A 0,00 Wynik negatywny.
B06 Texas Red Unkn-03 N/A 0,00
B07 Texas Red Unkn-04 N/A 0,00 Wynik negatywny.
B08 Texas Red Unkn-04 N/A 0,00
B09 Texas Red Unkn-05 21,91 21,83 Wynik dodatni.
B10 Texas Red Unkn-05 21,75 21,83
PL 223 163 B1 cd. tabeli
1 2 3 4 5 6
B11 Texas Red Unkn-06 17,78 17,89 Wynik dodatni.
B12 Texas Red Unkn-06 18,00 17,89
C01 Texas Red Unkn-07 18,58 18,67 Wynik dodatni.
C02 Texas Red Unkn-07 18,75 18,67
C03 Texas Red Unkn-08 36,88 36,71 Wynik negatywny.
C04 Texas Red Unkn-08 36,53 36,71
C05 Texas Red Unkn-09 36,01 38,38 Wynik negatywny.
C06 Texas Red Unkn-09 40,74 38,38
C07 Texas Red Unkn-10 38,33 38,24 Wynik negatywny.
C08 Texas Red Unkn-10 38,15 38,24
C09 Texas Red Unkn-11 32,27 32,85 Wynik niepewny, należałoby powtórzyć oznaczenie.
C10 Texas Red Unkn-11 33,44 32,85
C11 Texas Red Unkn-12 28,60 28,56 Wynik dodatni.
C12 Texas Red Unkn-12 28,52 28,56
D01 Texas Red Unkn-13 32,06 32,61 Wynik niepewny, należałoby powtórzyć oznaczenie.
D02 Texas Red Unkn-13 33,15 32,61
D03 Texas Red Unkn-14 N/A 0,00 Wynik negatywny.
D04 Texas Red Unkn-14 38,82 38,82
D05 Texas Red Unkn-15 35,74 35,55 Wynik negatywny.
D06 Texas Red Unkn-15 35,36 35,55
D07 Texas Red Unkn-16 37,15 36,94 Wynik negatywny.
D08 Texas Red Unkn-16 36,72 36,94
PL 223 163 B1 cd. tabeli
1 2 3 4 5 6
D09 Texas Red Unkn-17 N/A 0,00 Wynik negatywny.
D10 Texas Red Unkn-17 N/A 0,00
D11 Texas Red Unkn-18 N/A 0,00 Wynik negatywny.
D12 Texas Red Unkn-18 37,06 37,06
E01 Texas Red Unkn-19 35,00 34,29 Wynik niepewny, należałoby powtórzyć oznaczenie.
E02 Texas Red Unkn-19 33,58 34,29
E03 Texas Red Unkn-20 21,11 21,13 Wynik dodatni.
E04 Texas Red Unkn-20 21,14 21,13
E05 Texas Red Unkn-21 18,17 18,07 Wynik dodatni.
E06 Texas Red Unkn-21 17,96 18,07
E07 Texas Red Unkn-22 N/A 0,00 Wynik negatywny.
E08 Texas Red Unkn-22 N/A 0,00
E09 Texas Red Unkn-23 29,51 29,39 Wynik dodatni.
E10 Texas Unkn-23 29,28 29,39
E11 Texas Red Neg Ctrl-01 N/A 0,00 Wynik negatywny.
E12 Texas Red Neg Ctrl-01 37,34 37,34
F01 Texas Red Neg Ctrl-02 N/A 0,00 Wynik negatywny.
F02 Texas Red Neg Ctrl-02 N/A 0,00
Jak widać, wyniki dla obu sond pokrywają się ze sobą, pomimo iż wykrywane są za ich pomocą odmienne fragmenty DNA, Przeprowadzanie reakcji w duplexie (dodając dwie sondy i odpowiadające im pary starterów do jednej mieszaniny reakcyjnej) pozwala na eliminację próbek dających wynik fałszywie pozytywny, gdyż za dodatnie uznajemy wyłącznie próbki, gdzie wykrywamy sygnał fluorescencji pochodzący z obu sond.
PL 223 163 B1
P r z y k ł a d 2
Próby środowiskowe pobierane z obiektów służby zdrowia cywilnej oraz wojskowej.
Miejsce i data pobrania próbek Ilość próbek Pozytywne wyniki Ilość uzyskanych izolatów
SZPITAL 1 60 próbek środowiskowych 15 próbek gleby 10 próbek wody Razem: 85 próbek 8 8
SZPITAL 2 30 3 3
SZPITAL 3 20 6 6
SZPITAL 4 20 6 2
SZPITAL 5 20 - -
RAZEM 175 23 19
Literatura
1. Real-Time PCR Current Technology and Applications, edited by J. Logan, K. Edwards, N. Saunders, wyd. Caister Academic Press 2009, Norfolk, UK.
2. Jawad A., Hawkey P. M., Heritage J., Snelling A. M., Description of Leeds Acinetobacter medium, a new selective and differential medium for isolation of clinically important Acinetobacter spp., and comparison with Herellea agar and Holton's agar., Journal of Clinical Microbiology, 1994 32:2353-2358
3. Peleg A. Seifert H., Paterson D. L., Acinetobacter baumannii: Emergence of a Successful Pathogen, Clinical Microbiology Reviews, 2008, p, 538-582
4. Gerner-Smidt P., Tjernberg J., Ursing J., Reliability of phenotypic tests for identification of Acinetobacter species, J. Clin Microbiol. 1991 29; 277-282.

Claims (7)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Zestaw sond służących do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, znamienny tym, że są to oligonukleotydy o sekwencjach przedstawionych na Fig. 1 i Fig. 2.
  2. 2. Zestaw sond według zastrz. 1, znamienny tym, że są zawarte w sekwencji powielanej przy pomocy starterów przedstawionych na Fig. 3 i Fig. 4.
  3. 3. Zestaw starterów oligonukleotydowych do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, znamienny tym, że są to startery o sekwencjach przedstawionych na Fig. 3 i Fig. 4.
  4. 4. Sposób wykrywania bakterii gatunku Acinetobacter baumannii w próbkach medycznych i/lub środowiskowych, w którym to fragment DNA powiela się w reakcji Real-Time PCR z zastosowaniem starterów, znamienny tym, że w reakcji Real-Time PCR powiela się konserwowane sekwencje z zastosowaniem starterów o sekwencjach przedstawionych na Fig. 3 i Fig. 4, po czym produkty wykrywa się za pomocą sond o sekwencjach przedstawionych na Fig. 1 i Fig. 2.
  5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że produkty charakteryzuje się poprzez sygnały wyemitowane z sond wyznakowanych znacznikami fluoroscencyjnymi.
  6. 6. Zestaw do analizy materiału genetycznego zawartego w próbkach medycznych i/lub środowiskowych do wykrywania bakterii gatunku Acinetobacter baumannii, znamienny tym, że zawiera startery o sekwencjach przedstawionych na Fig. 3 i Fig. 4 oraz znakowane sondy o sekwencjach przedstawionych na Fig. 1 i Fig. 2.
  7. 7. Zestaw według zastrz. 6, znamienny tym, że dodatkowo zawiera wzorzec będący DNA chromosomalnym szczepu Acinetobacter baumannii ATCC 17978.
PL401061A 2012-10-04 2012-10-04 Zestaw sond i starterów do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, sposób oraz zestaw do analizy próbek medycznych i środowiskowych PL223163B1 (pl)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL401061A PL223163B1 (pl) 2012-10-04 2012-10-04 Zestaw sond i starterów do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, sposób oraz zestaw do analizy próbek medycznych i środowiskowych
PCT/PL2013/000130 WO2014054956A1 (en) 2012-10-04 2013-10-02 New probes for the detection of acinetobacter baumannii, oligonucleotide primers, and the method and kit for the analysis of medical and environmental samples

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL401061A PL223163B1 (pl) 2012-10-04 2012-10-04 Zestaw sond i starterów do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, sposób oraz zestaw do analizy próbek medycznych i środowiskowych

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL401061A1 PL401061A1 (pl) 2014-04-14
PL223163B1 true PL223163B1 (pl) 2016-10-31

Family

ID=49486639

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL401061A PL223163B1 (pl) 2012-10-04 2012-10-04 Zestaw sond i starterów do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, sposób oraz zestaw do analizy próbek medycznych i środowiskowych

Country Status (2)

Country Link
PL (1) PL223163B1 (pl)
WO (1) WO2014054956A1 (pl)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109266658B (zh) * 2018-10-17 2022-08-19 昆明理工大学 一种鲍曼不动杆菌的特异基因及其引物和应用
CN111876507A (zh) * 2020-08-24 2020-11-03 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） 一种快速检测鲍曼不动杆菌的试剂盒及使用方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69534516T2 (de) * 1994-06-24 2006-06-29 Innogenetics N.V. Gleichzeitiger nachweis, identifizierung und differenzierung von eubakterien unter verwendung eines hybridisierungs-assays
US6562958B1 (en) * 1998-06-09 2003-05-13 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Acinetobacter baumannii for diagnostics and therapeutics
WO2002077183A2 (en) * 2001-03-21 2002-10-03 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Identification of essential genes in microorganisms
DE10201923B4 (de) 2002-01-19 2006-05-24 Deutsche Carbone Ag Verfahren zur Herstellung eines Gleitkontaktstücks für mittlere bis hohe Stromdichten
US20090253128A1 (en) * 2008-04-03 2009-10-08 Centers For Disease Control Department Of Healthy Nucleotide sequence for identifying of acinetobacter bacteria, and method and kit of identification of acinetobacter bacteria

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014054956A1 (en) 2014-04-10
PL401061A1 (pl) 2014-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. High-throughput cultivation and identification of bacteria from the plant root microbiota
Tang et al. The canine skin and ear microbiome: A comprehensive survey of pathogens implicated in canine skin and ear infections using a novel next-generation-sequencing-based assay
Maukonen et al. Methodologies for the characterization of microbes in industrial environments: a review
Siddiqui et al. Assessing diversity of the female urine microbiota by high throughput sequencing of 16S rDNA amplicons
US11840723B2 (en) Methods for detection and quantification of infectious carbapenem resistant enterobacteriaceae (CRE)
Carleton et al. Whole-genome sequencing is taking over foodborne disease surveillance
Zeng et al. The oral cancer microbiome contains tumor space–specific and clinicopathology-specific bacteria
Atieh Accuracy of real‐time polymerase chain reaction versus anaerobic culture in detection of Aggregatibacter actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis: a meta‐analysis
Cook et al. Use of omics methods for the advancement of food quality and food safety
Sodagari et al. Non-typhoidal Salmonella contamination in egg shells and contents from retail in Western Australia: Serovar diversity, multilocus sequence types, and phenotypic and genomic characterizations of antimicrobial resistance
Vignaud et al. MLVA for Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin: development of a method suitable for inter-laboratory surveillance and application in the context of a raw milk cheese outbreak in France in 2012
Karthek et al. Gene Xpert/MTB RIF assay for spinal tuberculosis-sensitivity, specificity and clinical utility
Xin et al. Rapid detection and differentiating of the predominant Salmonella serovars in chicken farm by TaqMan multiplex real-time PCR assay
EP3362927B1 (en) Methods associated with a database that stores a plurality of reference genomes
Chang et al. Distribution and factors associated with Salmonella enterica genotypes in a diverse population of humans and animals in Qatar using multi-locus sequence typing (MLST)
Yang et al. Phenotypic and genotypic perspectives on detection methods for bacterial antimicrobial resistance in a One Health context: research progress and prospects
Jansen et al. Advancements in analytical methods for studying the human gut microbiome
PL223163B1 (pl) Zestaw sond i starterów do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, sposób oraz zestaw do analizy próbek medycznych i środowiskowych
CN103224984A (zh) 一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物、探针、试剂盒及方法
Li et al. Novel Development of a qPCR Assay Based on the rpo B Gene for Rapid Detection of Cronobacter spp.
Herrera et al. Pursuing new periodontal pathogens with an improved RNA-oligonucleotide quantification technique (ROQT)
Öncül et al. Detecting gram-positive anaerobic cocci directly from the clinical samples by multiplex polymerase chain reaction in odontogenic infections
Sun et al. Beyond the colony-forming-unit: Rapid bacterial evaluation in osteomyelitis
Frank Microbiology in clinical pathology
Sun et al. Rapid bacterial evaluation beyond the colony forming unit in osteomyelitis