DE69534516T2

DE69534516T2 - Gleichzeitiger nachweis, identifizierung und differenzierung von eubakterien unter verwendung eines hybridisierungs-assays

Info

Publication number: DE69534516T2
Application number: DE69534516T
Authority: DE
Inventors: Geert Jannes; Rudi Rossau; Hugo Van Heuverswyn
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1994-06-24
Filing date: 1995-06-23
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2015-06-24
Also published as: CA2193101A1; HK1037687A1; US6811978B2; DK0769068T3; ES2250971T3; US20030215802A1; EP1098007A1; AU2924695A; DE69534516D1; EP1091004A2; US20050142575A1; US6025132A; US6312903B1; JP3833703B2; RU2154106C2; ATE423853T1; ATE306560T1; BR9508101A; EP0769068B1; US7390623B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuresonden, die vom Spacer-Bereich zwischen den ribosomalen Ribonukleinsäure(rRNA)-Genen 16S und 23S erlangt werden und für den spezifischen Nachweis von eubakteriellen Organismen in einer biologischen Probe durch einen Hybridisierungsvorgang verwendet werden sollen, wie auch Nukleinsäureprimer, die für die Amplifikation dieses Spacer-Bereichs von eubakteriellen Organismen in einer biologischen Probe verwendet werden sollen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch neue Spacer-Bereich-Sequenzen, von denen die Sonden oder Primer erlangt werden können.
Seit der Einführung der Polymerase-Kettenreaktion und einiger anderer Nukleinsäureamplifikationstechniken steigt die Bedeutung der DNA-Sonden-Technologie bei der Diagnose von Mikroorganismen in biologischen Proben aller Arten an. Da er häufig genauer und möglicherweise empfindlicher ist – wenn ein angemessenes Amplifikations- und/oder Nachweissystem verwendet wird – könnte der DNA-Sonden-Ansatz letztendlich die herkömmlichen Identifizierungstechniken ersetzen.
Die Verlässlichkeit von Tests auf Nukleinsäurebasis hängt im Wesentlichen von der Empfindlichkeit und der Genauigkeit der verwendeten Sonden und/oder Primer ab. Der Eckpfeiler dieser Art von Assay ist somit die Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen, die für die Gruppe von Organismen, die von Interesse sind, einzigartig sind.
Die meisten der Tests auf Nukleinsäurebasis, die entweder in der Literatur beschrieben wurden und/oder im Handel erhältlich sind, zielen auf den Nachweis von nur einem bestimmten Organismus in einer biologischen Probe ab. Da die meisten biologischen Proben gewöhnlich eine große Vielfalt von klinisch relevanten Mikroorganismen enthalten können, muss eine Vielzahl von gesonderten Prüfungen durchgeführt werden, um alle relevanten Mikroorganismen, die möglicherweise vorhanden sind, nachzuweisen. Dieser Ansatz wäre sehr teuer, mühsam und zeitaufwändig. Folglich ist die Anzahl der Tests, die in den meisten Routinediagnoselabors tatsächlich an einer bestimmten Probe durchgeführt werden, auf den Nachweis von nur einigen der relevantesten Organismen beschränkt. Daher wäre es äußerst bequem, über Zugriff auf ein System zu verfügen, das den schnellen, einfachen und gleichzeitigen Nachweis einer Vielzahl von unterschiedlichen Organismen ermöglicht. Je mehr Organismen, nach denen in der gleichen Prüfung gesucht werden kann, desto kostenwirksamer wäre der Vorgang.
Wie in früheren Veröffentlichungen vorgelegt ist der zwischen dem 16S-rRNA- und dem 23S-rRNA-Gen gelegene Spacer-Bereich, der auch als der intern transkribierte Spacer (IST) bezeichnet wird, ein vorteilhafter Zielbereich für die Sondenentwicklung für den Nachweis von Pathogenen bakteriellen Ursprungs (internationale Anmeldung WO 91/16454; Rossau et al., 1992; EP-A-0 395 292).
Einer seiner am meisten geschätzten Vorteile ist, dass Sequenzen, die für eine große Vielfalt von bakteriellen Taxa einzigartig sind, in einem sehr begrenzten Bereich des bakteriellen Genoms gefunden werden können. Diese Eigentümlichkeit gestattet eine vorteilhafte Gestaltung von "Sonden-Panelen", die den gleichzeitigen Nachweis eines Satzes von Organismen, die möglicherweise in einer bestimmten Art einer biologischen Probe vorhanden sind, ermöglichen. Da sie durch quasi-universell konservierte Nukleotidsequenzen flankiert sind – die sich genauer im 3'-Teil des 16S-rRNA-Gens bzw. im 5'-Teil des 23S-rRNA-Gens befinden – können außerdem fast alle Spacer gleichzeitig mit einem begrenzten Satz von Amplifikationsprimern amplifiziert werden. Alternativ können bestimmte Primersätze von den Spacer-Sequenzen selbst erlangt werden, wodurch spezies- oder gruppen-spezifische Amplifikationen gestattet werden.
Der 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich ist eine verhältnismässig kurze (etwa 200 bis 1000 Basenpaare) Strecke von DNA, die im Genom von fast allen eubakteriellen Organismen in einer oder mehreren Kopien vorhanden ist. Wenn im Genom eines Bakteriums mehrere Kopien vorhanden sind, können diese Kopien entweder identisch sein (wie es in einigen Neisseria-Spezies höchstwahrscheinlich der Fall ist) oder können sie sich voneinander unterscheiden (wie es für E. coli der Fall ist). Dieser Unterschied kann auf einige wenige Nukleotide beschränkt sein, doch können auch Deletionen und Insertionen von beträchtlicher Länge vorhanden sein.
Bis jetzt sind Spacer-Sonden nur für eine begrenzte Zahl von Organismen, von denen viele in der internationalen Anmeldung WO 91/16454 offenbart wurden, beschrieben und öffentlich erhältlich gemacht. wie oben beschrieben wäre es sehr vorteilhaft, wenn man fähig wäre, gleichzeitig ein Panel von Pathogenen nachzuweisen, z.B. ein Panel von Pathogenen, die möglicherweise in der gleichen Art von biologischer Probe vorhanden sind, oder ein Panel von Pathogenen, die möglicherweise die gleiche Art von Krankheitssymptomen verursachen und die klinisch oder biochemisch schwer zu unterscheiden sind, oder ein Panel von Organismen, die zum gleichen Taxon gehören. Um die unterschiedlichen Panele so vollständig als möglich zu machen, werden zusätzliche Sonden oder Sätze von Sonden, die sich im Spacer-Bereich befinden und die Identifizierung wenigstens der folgenden bakteriellen Gruppen oder Spezies ermöglichen, benötigt:

– der Mycobacterium-Spezies
– der Listeria-Spezies
– der Chlamydia-Spezies
– der Acinetobacter-Spezies
– der Mycoplasma-Spezies
– der Streptococcus-Spezies
– der Staphylococcus-Spezies
– der Salmonella-Spezies
– der Brucella-Spezies
– der Yersinia-Spezies
– der Pseudomonas-Spezies

Diese zusätzlichen Spacer-Sonden müssen peinlich genau gestaltet sein, damit sie unter den gleichen Hybridisierungs- und Waschbedingungen gleichzeitig mit wenigstens einer anderen Sonde verwendet werden können, wodurch der Nachweis eines bestimmten Panels von Organismen gestattet wird.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden oder Sätze von Sonden auszuwählen, die den 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich als Ziel aufweisen, und die den Nachweis und die Identifizierung mindestens eines, und vorzugsweise mehr als eines, der oben erwähnten Mikroorganismen gestatten. Die Sonden oder Sondensätze werden in einer solchen Weise ausgewählt, dass sie unter den gleichen Hybridisierungs- und Waschbedingungen in Kombination mit wenigstens einer anderen Sonde, die vorzugsweise ebenfalls vom 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich stammt, verwendet werden können, um möglichst den gleichzeitigen Nachweis von mehreren Mikroorganismen in einer Probe zu gestatten.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein schnelles und verlässlichs Hybridisierungsverfahren zum Nachweis und zur Identifizierung mindestens eines Mikroorganismus in einer Probe oder zum gleichzeitigen Nachweis und zur gleichzeitigen Identifizierung von mehreren Mikroorganismen in einer Probe bereitzustellen.
Es ist genauer eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Hybridisierungsverfahren bereitzustellen, das einen gleichzeitigen Nachweis und eine gleichzeitige Identifizierung eines Satzes von Mikroorganismen gestattet, die wahrscheinlich in einer bestimmten Art von Probe vorhanden sind.
Es ist genauer eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden oder Sätze von Sonden für den möglichen gleichzeitigen Nachweis von Mikroorganismen in einer aus dem Respirationstrakt stammenden Probe bereitzustellen.
Es ist eine andere besondere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden oder Sätze von Sonden für den möglichen gleichzeitigen Nachweis von Mikroorganismen in einer vom Liquor stammenden Probe bereitzustellen.
Es ist noch eine andere besondere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden oder Sätze von Sonden für den möglichen gleichzeitigen Nachweis von Mikroorganismen in einer aus dem Urogenitaltrakt stammenden Probe bereitzustellen.
Es ist noch eine andere besondere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden oder Sätze von Sonden für den möglichen gleichzeitigen Nachweis von Mikroorganismen in einer aus dem Gastrointestinaltrakt eines Patienten entnommenen Probe bereitzustellen.
Es ist noch eine andere besondere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden oder Sätze von Sonden für den möglichen gleichzeitigen Nachweis von Mikroorganismen in einer aus Lebensmitteln oder Umweltproben stammenden Probe bereitzustellen.
Es ist außerdem eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines bestimmten Taxons in einer Probe oder eines Satzes von bestimmten Taxa bereitzustellen, wobei es sich beim Taxon entweder um eine vollständige Gattung oder um eine Untergruppe innerhalb einer Gattung, eine Spezies oder sogar Unterarten innerhalb einer Spezies (Subspezies, Serovare, Sequevare, Biovare ...) handelt.
Es ist genauer eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden oder Sätze von Sonden für den Nachweis von Mycobacterium-Spezies und -Subspezies, genauer für den Nachweis von Stämmen des M.-tuberculosis-Komplexes, Mycobacterium-Stämmen aus dem MAIS-Komplex, M.-avium- und M.-paratuberculosis-, M.-intracellulare- und M.-intracellulare-artigen Stämmen, M. scrofulaceum, M. kansasii, M. chelonae, M. gordonae, M. ulcerans, M. genavense, M. xenopi, M. simiae, M. fortuitum, M. malmoense, M. celatum und M. haemophilum, bereitzustellen.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden oder Sätze von Sonden für den Nachweis von Mycoplasma-Stämmen, genauer von M. pneumoniae und M. genitalium, bereitzustellen.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden oder Sätze von Sonden von den Nachweis von Pseudomonas-Stämmen, genauer P. aeruginosa, bereitzustellen.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden oder Sätze von Sonden für den Nachweis von Staphylococcus-Stämmen, genauer S. aureus und S. epidermidis, bereitzustellen.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden oder Sätze von Sonden für den Nachweis von Acinetobacter-Stämmen, genauer A. baumanii, bereitzustellen.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden oder Sätze von Sonden für den Nachweis von Listeria-Stämmen, genauer Listeria monocytogenes, bereit zustellen.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden oder Sätze von Sonden für den Nachweis von Brucella-Stämmen bereitzustellen.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden oder Sätze von Sonden für den Nachweis von Salmonella-Stämmen bereitzustellen.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden oder Sätze von Sonden für den Nachweis von Chlamydia-Stämmen, genauer C. trachomatis und C. psittaci, bereitzustellen.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden oder Sätze von Sonden für den Nachweis von Streptococcus-Stämmen bereitzustellen.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden oder Sätze von Sonden für den Nachweis von Yersinia-enterolitica-Stämmen bereitzustellen.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Primer bereitzustellen, die eine spezifische Amplifikation des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs für bestimmte Organismen gestatten. Genauer ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Primer für die spezifische Amplifikation des Spacer-Bereichs von Mycobacterium-, Chlamydia-, Listeria-, Brucella- und Yersinia-enterolitica-Stämmen bereitzustellen.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Kits für den Nachweis wenigstens eines Organismus in einer Probe bereitzustellen, in denen diese Sonden und/oder Primer verwendet werden.
Es wird bemerkt, dass in der Literatur oder in öffentlich zugänglichen Datenbanken bereits Spacer-Sequenzen für einige der oben erwähnten Mikroorganismen veröffentlicht wurden.
Es sollte jedoch klar gemacht werden, dass die in der gegenwärtigen Erfindung offenbarten Spacer-Bereich-Sequenzen (1 bis 103) neu sind und sich, falls sie von der gleichen Spezies wie jene stammen, von denen beim Stand der Technik bereits eine Spacer-Sequenz beschrieben wurde, zu einem gewissen Ausmaß von den bereits beschriebenen Sequenzen unterscheiden.
Außerdem ist es die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, aus der Zusammenstellung von Sequenzdaten über Spacer-Bereiche bestimmte Sonden und Sätze von Sonden auszuwählen, die den Nachweis und die Identifizierung eines bestimmten Panels von Organismen, seien es die Organismen, die zu einem gemeinsamen Taxon gehören, oder die Organismen, die möglicherweise in der gleichen Art von Probe vorhanden sind, ermöglichen.
Der Auswahlvorgang besteht gewöhnlich aus einem theoretischen und einem experimentellen Teil. Zuerst müssen die unterschiedlichen Spacer-Sequenzen an jene der "nächsten Nachbarn" oder an die Spacer-Sequenzen von anderen Mikroorganismen, die wahrscheinlich in der gleichen Probe vorhanden sind, angeglichen werden. Dies erfordert natürlich die Sequenzbestimmung des Spacer-Bereichs, wie in den Beispielen beschrieben ist. Aus der Angleichung können Bereiche der Abweichung definiert werden, aus denen gemäß Richtlinien, die dem Fachmann bekannt sind und nachstehend ausführlicher angegeben sind, Sonden mit gewünschten Hybridisierungseigenschaften gestaltet werden.
Zweitens müssen die gestalteten Sonden experimentell getestet und hinsichtlich ihrer Nützlichkeit unter bestimmten Hybridisierungsbedingungen und/oder in Kombination mit anderen Sonden bewertet werden. Das experimentelle Testen kann nach jedem in der Technik bekann ten Hybridisierungsverfahren erfolgen, doch ein bevorzugter Assay für das gleichzeitige Testen von unterschiedlichen Sonden unter den gleichen Bedingungen ist der reverse Hybridisierungsassay. Ein bestimmtes Format für die reverse Hybridisierung von unterschiedlichen Sonden, die bei der gegenwärtigen Erfindung gleichzeitig verwendet werden, ist der wie nachstehend beschriebene LiPA (Liniensondenassay).
Beim experimentellen Testen kann ein unerwartetes Hybridisierungsverhalten auftreten, wenn die Sonden an die Zielnukleinsäure hybridisiert werden, und es können bestimmte Sondenanpassungen benötigt werden.
Außerdem muss die Spezifität und die Empfindlichkeit der Sonden mit einer großen Sammlung von Stämmen, die sowohl zum festzustellenden Taxon als auch zu anderen Taxa gehören, getestet werden. Aufgrund einer Genom-Heterogenität im Spacer-Bereich oder der Existenz von mehreren Spacer-Bereichen mit unterschiedlichen Sequenzen im gleichen Organismus ist es sehr oft nötig, Spacer-Bereiche von zusätzlichen Stämmen zu sequenzieren oder zusätzliche Spacer-Bereiche im gleichen Stamm zu sequenzieren, und die Sonden gemäß den neuen Sequenzdaten umzugestalten, um eine bessere Empfindlichkeit und/oder Spezifität zu erhalten (siehe, z.B., Beispiel 3). In manchen Fällen kann es notwendig oder bevorzugt sein, für den gleichen Organismus mehrere Sonden zu verwenden (siehe, z.B., Beispiel 2 und 7). Ausßerdem können manche Organismen beim Sequenzieren eine unerwartete (Un)verwandtheit zeigen, die zu einer Revision der Stammklassifizierung führen kann, die im Gegensatz zu klassischen taxonomischen Kriterien steht (siehe, z.B., Beispiel 2 und 7).
Letztlich ist der experimentelle Teil des Sondenauswahlvorgangs unerlässlich und zum theoretischen Teil ergänzend. Die Sondengestaltung, insbesondere unter den festen Bedingungen der reversen Hybridisierung (die gleichen Bedingungen für jede Sonde) ist nicht einfach, und Sonden müssen peinlich genau bewertet werden, bevor sie in einem reversen Hybridisierungsformat verwendet werden können. Daher können Sonden nicht immer einfach auf einer theoretischen Basis aus einer bekannten Gensequenz erlangt werden.
Zum Gestalten von Sonden mit gewünschten Eigenschaften können die folgenden nützlichen Richtlinien befolgt werden.
Da das Ausmaß und die Spezifität von Hybridisierungsreaktionen wie den hierin beschriebenen durch eine Anzahl von Faktoren beeinflusst werden, wird die Manipulation eines oder mehrerer dieser Faktoren die genaue Empfindlichkeit und Spezifität einer bestimmten Sonde, ob diese perfekt komplementär zu ihrem Ziel ist, oder nicht, bestimmen. Die Wichtigkeit und die Wirkung von verschiedenen Assaybedingungen, die hierin näher erklärt sind, sind dem Fachmann bekannt.
Erstens sollte die Stabilität des [Sonde:Ziel]-Nukleinsäurehybrids so ausgewählt werden, dass sie mit den Assaybedingungen kompatibel ist. Dies kann durch Vermeiden langer Sequenzen, die reich an A und T sind, durch Beenden der Hybride mit G:C-Basenpaaren, und durch Gestalten der Sonde mit einem passenden Tm erreicht werden. Der Anfangs- und der Endpunkt der Sonde sollten so ausgewählt werden, dass die Länge und der %GC-Gehalt zu einem Tm führen, der um etwa 2 bis 10°C höher als die Temperatur ist, bei der der Endassay durchgeführt werden wird. Die Basenzusammensetzung der Sonde ist bedeutend, da G-C-Basenpaare aufgrund einer zusätzlichen Wasserstoffbindung im Vergleich zu A-T-Basenpaaren eine größere Wärmestabilität zeigen. Somit wird eine Hybridisierung, die komplementäre Nukleinsäuren mit höherem G-C-Gehalt umfasst, bei höheren Temperaturen stabiler sein.
Bedingungen wie die Ionenstärke und die Inkubationstemperatur, unter denen eine Sonde verwendet werden wird, sollten beim Aufbauen einer Sonde ebenfalls in Betracht gezogen werden. Es ist bekannt, dass die Hybridisierung zunehmen wird, wenn die Ionenstärke des Reaktionsgemischs zunimmt, und dass die Wärmestabilität der Hybride mit der zunehmenden Ionenstärke zunehmen wird. Andererseits werden chemische Reagenzien wie etwa Formamid, Harnstoff, DMSO und Alkohole, die Wasserstoffbindungen sprengen, die Strenge der Hybridisierung erhöhen. Die Destabilisierung der Wasserstoffbindungen durch derartige Reagenzien kann den Tm stark verringern. Im Allgemeinen tritt die optimale Hybridisierung für synthetische Oligonukleotidsonden mit einer Länge von etwa 10 bis 50 Basen für einen gegebenen Duplex ungefähr 5°C unter der Schmelztemperatur auf. Eine Inkubation bei Temperaturen unter dem Optimum kann die Hybridisierung von nicht zusammenpassenden Basensequenzen gestatten und kann daher zu einer verminderten Spezifität führen.
Es ist wünschenswert, über Sonden zu verfügen, die unter Bedingungen von hoher Strenge hybridisieren. Unter Bedingungen von hoher Strenge werden sich nur höchst komplementäre Nukleinsäurehybride bilden; ohne einen ausreichenden Grad an Komplementarität werden sich keine Hybride bilden. Demgemäß bestimmt die Strenge der Assaybedingungen das Ausmaß an Komplementarität, die zwischen zwei Nukleinsäuresträngen, welche einen Hybrid bilden, benötigt wird. Die Strenge wird so ausgewählt, dass sie den Unterschied in der Stabilität zwischen dem mit dem Ziel gebildeten Hybrid und der Nicht-Ziel-Nukleinsäure maximiert. In manchen Beispielen der gegenwärtigen Erfindung, z.B., wenn höchst verwandte Organismen unterschieden werden müssen, kann es nötig sein, einzelne Basenpaarveränderungen nachzuweisen. In diesen Fällen werden Bedingungen mit sehr hoher Strenge benötigt.
Zweitens sollten die Sonden so positioniert werden, dass die Stabilität des [Sonde:Nicht-Ziel]-Nukleinsäurehybrids minimiert wird. Dies kann durch Minimieren der Länge der perfekten Komplementarität mit Nicht-Ziel-Organismen, Vermeiden von GC-reichen Bereichen einer Homologie mit Nicht-Ziel-Sequenzen, und durch derartiges Positionieren der Sonde, dass sie so viele destabilisierende Fehlpaarungen als möglich überspannt, erreicht werden. Ob eine Sondensequenz dazu nützlich ist, nur eine bestimmte Art von Organismus nachzuweisen, hängt in hohem Maße vom Unterschied in der Wärmestabilität zwischen [Sonde:Ziel]-Hybriden und [Sonde:Nicht-Ziel]-Hybriden ab. Beim Gestalten von Sonden sollten die Unterschiede dieser Temperaturwerte so groß als möglich sein (z.B. wenigstens 2°C und vorzugsweise 5°C).
Die Länge der Zielnukleinsäuresequenz und, demgemäß, die Länge der Sondensequenz kann ebenfalls wichtig sein. In manchen Fällen können mehrere Sequenzen aus einem bestimmten Bereich vorhanden sein, die sich in der Stelle und in der Länge unterscheiden, und die Sonden mit den gewünschten Hybridisierungseigenschaften ergeben werden. In anderen Fällen kann eine Sequenz deutlich besser als eine andere sein, die nur um eine einzelne Base verschieden ist. Obwohl es möglich ist, dass Nukleinsäuren, die nicht perfekt komplementär sind, hybridisieren, wird normalerweise hauptsächlich der längste Strang einer perfekt komplementären Basensequenz die Hybridstabilität bestimmen. Obwohl Oligonukleotidsonden mit unterschiedlichen Längen und unterschiedlicher Basenzusammensetzung verwendet werden können, weisen Oligonukleotidsonden, die bei dieser Erfindung bevorzugt sind, eine Länge von zwischen etwa 10 und 50 Basen auf und sind sie der Zielnukleinsäure ausreichend homolog.
Drittens sind Bereiche in der Ziel-DNA oder -RNA, von denen bekannt ist, dass sie starke interne Strukturen bilden, die eine Hybridisierung hemmen, weniger bevorzugt. In der gleichen Weise sollten Sonden mit ausgedehnter Selbstkomplementarität vermieden werden. Wie oben erklärt ist eine Hybridisierung die Verbindung von zwei einzelnen Strängen komplementärer Nukleinsäuren, um einen wasserstoffgebundenen Doppelstrang zu bilden. Es ist stillschweigend inbegriffen, dass, wenn einer der beiden Stränge ganz oder teilweise an einem Hybrid beteiligt ist, er weniger fähig sein wird, an der Bildung eines neuen Hybrids beteiligt zu sein. Es kann intramolekulare und intermolekulare Hybride geben, die in den Molekülen einer Art von Sonde gebildet sind, wenn ausreichende Selbstkomplementarität besteht. Derartige Strukturen können durch sorgfältige Sondengestaltung vermieden werden. Durch ein derartiges Gestalten einer Sonde, dass ein wesentlicher Anteil der Sequenz von Interesse einzelsträngig ist, können die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Hybridisierung stark gesteigert werden. Es sind Computerprogramme erhältlich, um nach dieser Art von Wechselwirkung zu suchen. Doch in bestimmten Fällen kann es möglicherweise nicht möglich sein, diese Art von Wechselwirkung zu vermeiden.
Die Sonden der vorliegenden Erfindung sind dazu gestaltet, unter den gleichen Hybridisierungsbedingungen eine optimale Leistung zu erzielen, so dass sie in Sätzen für eine gleichzeitige Hybridisierung verwendet werden können; dies steigert die Verwendbarkeit dieser Sonden stark und führt zu einem deutlichen Gewinn an Zeit und Mühe. Offensichtlich sollten dann, wenn andere Hybridisierungsbedingungen bevorzugt werden sollten, alle Sonden durch Anfügen oder Streichen einer Anzahl von Nukleotiden an ihren äußersten Enden entsprechend angepasst werden. Es sollte sich versehen, dass diese begleitenden Anpassungen im Wesentlichen das gleiche Ergebnis hervorrufen sollten, nämlich, dass die jeweiligen Sonden noch spezifisch mit dem definierten Ziel hybridisieren. Derartige Anpassungen könnten auch nötig sein, wenn das amplifizierte Material in seiner Natur RNA und nicht DNA sein sollte, wie es für das NASBA-System der Fall ist.
Die Hybridisierungsbedingungen können unter Bezugnahme auf mehrere Parameter wie etwa die Natur und die Konzentration der Bestandteile der Medien und die Temperatur, unter der die Hybride gebildet und gewaschen werden, überwacht werden.
Die Hybridisierungs- und Waschtemperatur ist in ihrem oberen Wert abhängig von der Sequenz der Sonde (ihrer Nukleinsäurezusammensetzung, Art und Länge) beschränkt. Die maximale Hybridisierungs- oder Waschtemperatur der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Sonden reicht in den wie im Abschnitt "Beispiele" beschriebenen besonderen Hybridisierungs- und Waschmedien von 40°C bis 60°C, und vorzugsweise von 45°C bis 55°C. Bei höheren Temperaturen tritt das Duplexieren (= die Bildung der Hybride) mit der Aufspaltung (oder Denaturierung) des zwischen der Sonde und dem Ziel gebildeten Hybrids in Konkurrenz.
In einem bevorzugten Hybridisierungsmedium nach der Erfindung, das 3 × SSC und 20% Formamid enthält, können die Hybridisierungstemperaturen von 45°C bis 55°C reichen, wobei eine Hybridisierungstemperatur von 50°C bevorzugt ist. Ein bevorzugtes Waschmedium enthält 3 × SSC und 20% Formamid, und die bevorzugten Waschtemperaturen sind die gleichen wie die bevorzugten Hybridisierungstemperaturen, d.h., betragen vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C und insbesondere 50°C.
Doch wenn Modifikationen eingebracht werden, sei dies entweder in den Sonden oder in den Medien, sollten die Temperaturen, bei denen die Sonden verwendet werden können, um die benötigte Spezifität zu erhalten, nach bekannten Beziehungen wie etwa den im Folgenden Literaturverweis beschriebenen verändert werden: Hames B. und Higgins S (Hrsg.), Nucleic acid hybridization. A practical approach, IRL Press, Oxford, Großbritannien, 1985.
Die ausgewählten Nukleinsäuresonden, die aus dem 165-23S-rRNA-Spacer-Bereich stammen und durch die vorliegende Erfindung beschrieben sind, sind in Tabelle 1a angeführt (SEQ ID NO 1 bis 64, 175 bis 191, 193 bis 201, und 210 bis 212). Wie im Abschnitt "Beispiele" beschrieben zeigen einige dieser Sonden eine bessere Empfindlichkeit und/oder Spezifität als andere, und werden die besseren Sonden daher bevorzugt in Verfahren zum Nachweis des Organismus von Interesse in einer biologischen Probe verwendet. Es ist jedoch möglich, dass für bestimmte Anwendungen (z.B. die Epidemiologie, die Unterstammtypisierung ...) ein Sondensatz, der die weniger spezifischen und/oder weniger empfindlichen Sonden beinhaltet, sehr informativ sein kann (siehe z.B. Beispiel 7).
Die folgenden Definitionen dienen dazu, die Begriffe und Ausdrücke, die in den wie nachstehend dargelegten verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, zu veranschaulichen.
Der Begriff "Spacer" ist eine abgekürzte Bezeichnung, die sich auf den intern transkribierten Spacer-Bereich 16S-23S-rRNA bezieht.
Der Begriff "Sonde" bezieht sich auf einzelsträngige sequenzspezifische Oligonukleotide, die eine Sequenz aufweisen, welche ausreichend komplementär ist, um an die nachzuweisende Zielsequenz zu hybridisieren.
Die genauere Bezeichnung "Spacer-Sonde" bezieht sich auf eine wie oben definierte Sonde, die eine Sequenz aufweist, welche ausreichend komplementär ist, um an eine Zielsequenz zu hybridisieren, die sich im Spacer-Bereich bzw. in den Spacer-Bereichen des nachzuweisen den Organismus (oder der nachzuweisenden Gruppe von Organismen) befindet.
Vorzugsweise sind diese Sonden zu 70%, 80%, 90% oder mehr als 95% zum exakten Komplement der nachzuweisenden Zielsequenz homolog. Diese Zielsequenzen sind entweder genomische DNA oder Vorläufer-RNA oder amplifizierte Versionen davon.
Vorzugsweise sind diese Sonden etwa 5 bis 50 Nukleotide und insbesondere etwa 10 bis 25 Nukleotide lang. Die wie in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleotide können Ribonukleotide, Desoxyribonukleotide und modifizierte Nukleotide wie etwa Inosine oder Nukleotide, die modifizierte Gruppen enthalten, welche ihre Hybridisierungseigenschaften nicht wesentlich verändern, sein. Außerdem ist dem Fachmann offensichtlich, das jede beliebige der nachstehend angegebenen Sonden als solche oder in ihrer komplementären Form oder in ihrer RNA-Form (wobei T durch U ersetzt ist) verwendet werden kann.
Die Sonden nach der Erfindung können durch Klonen von rekombinanten Plasmiden, die Inserte enthalten, welche die entsprechenden Nukleotidsequenzen beinhalten, gebildet werden, nötigenfalls, indem letztere nach dem Verwenden der adäquaten Nukleasen aus den geklonten Plasmiden gespalten und z.B. durch Fraktionierung nach dem Molekulargewicht wiedergewonnen werden. Die Sonden nach der vorliegenden Erfindung können auch chemisch synthetisiert werden, zum Beispiel durch das herkömmliche Phospho-Triester-Verfahren.
Der Begriff "komplementäre" Nukleinsäuren bedeutet wie hierin verwendet, dass die Nukleinsäuresequenzen miteinander eine perfekt basengepaarte Doppelhelix bilden.
Der Begriff "homolog" ist wie in der gegenwärtigen An meldung verwendet gleichbedeutend mit "identisch": dies bedeutet, dass Polynukleinsäuren, von denen es heißt, dass sie z.B. zu 80% homolog sind, nach der Angleichung der Sequenzen 80% identische Basenpaare an der gleichen Position zeigen.
Der Begriff "Polynukleinsäure" entspricht entweder doppelsträngiger oder einzelsträngiger cDNA oder genomischer DNA oder RNA, die wenigstens 10, 20, 30, 40 oder 50 angrenzende Nukleotide enthält. Eine Polynukleinsäure, die in der Länge kleiner als 100 Nukleotide ist, wird häufig auch als Oligonukleotid bezeichnet, Einzelsträngige Polynukleinsäuresequenzen sind in der gegenwärtigen Erfindung immer von 5'-Ende zum 3'-Ende dargestellt.
Der Begriff "nächster Nachbar" bedeutet das Taxon, von dem bekannt ist oder erwartet wird, dass es hinsichtlich der DNA-Homologie am nächsten verwandt ist, und das vom Organismus von Interesse unterschieden werden muss.
Der Ausdruck "gewünschte Hybridisierungseigenschaften" bedeutet, dass die Sonde nur an die DNA oder RNA von Organismen, für die sie gestaltet wurde, und nicht an DNA oder RNA von anderen Organismen (nächsten Nachbarn oder Organismen, die wahrscheinlich in der gleichen Probe vorhanden sind) hybridisiert. In der Praxis bedeutet dies, dass die Intensität des Hybridisierungssignals mit der Ziel-DNA oder -RNA von den Organismen, für die die Sonden gestaltet wurden, verglichen mit Nicht-Ziel-Sequenzen wenigstens zwei, drei, vier, fünf, zehn oder mehr mal stärker ist.
Diese gewünschten Hybridisierungseigenschaften entsprechen dem, was später im Text "spezifische Hybridisierung" genannt wird.
Der Ausdruck "taxonspezifische Hybridisierung" oder "taxonspezifische Sonde" bedeutet, dass die Sonde nur an die DNA oder RNA von dem Taxon, für das sie gestaltet wurde, und nicht an DNA oder RNA von anderen Taxa hybridisiert.
Der Begriff "Taxon" kann sich auf eine vollständige Gattung oder eine Untergruppe innerhalb einer Gattung, eine Spezies oder sogar eine Unterart innerhalb einer Spezies (Subspezies, Serovare, Sequevare, Biovare ...) beziehen.
Der Begriff "spezifische Amplifikation" oder "spezifische Primer" bezieht sich auf den Umstand, dass diese Primer nur den Spacer-Bereich von jenen Organismen, für die sie gestaltet wurden, und nicht von anderen Organismen amplifizieren.
Der Begriff "Empfindlichkeit" bezieht sich auf die Anzahl der falsch negativen Ergebnisse, d.h., wenn 1 der 100 nachzuweisenden Stämme übersehen wird, zeigt der Test eine Empfindlichkeit von (100–1/100)% = 99%.
Der Begriff "Spezifität" bezieht sich auf die Anzahl von falsch positiven Ergebnissen, d.h., wenn von 100 nachgewiesenen Stämmen 2 zu Organismen zu gehören scheinen, für die der Test nicht gestaltet ist, ist die Spezifität des Tests (100–2/100)% = 98%.
Die als "bevorzugt" ausgewählten Sonden zeigen eine Empfindlichkeit und eine Spezifität von mehr als 80%, vorzugsweise mehr als 90%, und insbesondere mehr als 95%.
Der Begriff "Primer" bezieht sich auf eine einzelsträngige DNA-Oligonukleotidsequenz, die fähig ist, als ein Punkt des Beginns für die Synthese eines Primerverlängerungsprodukts zu wirken, das zum Nukleinsäurestrang, der zu kopieren ist, komplementär ist. Die Länge und die Sequenz des Primers müssen derart sein, dass sie das Starten der Synthese des Verlängerungsprodukts gestatten. Vorzugsweise ist der Primer etwa 5 bis 50 Nukleotide lang. Die spezifische Länge und Sequenz werden von der Komplexität der benötigten DNA- oder RNA-Ziele wie auch von den Bedingungen der Primerverwendung wie etwa der Temperatur und der Ionenstärke abhängen. Der Umstand, dass die Amplifikationsprimer der entsprechenden Matrizensequenz nicht exakt entsprechen müssen, um eine richtige Amplifikation zu gewährleisten, ist in der Literatur reichlich dokumentiert (Kwok et al., 1990).
Das verwendete Amlifikationsverfahren kann entweder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR; Saiki et al., 1988), die Ligase-Kettenreaktion (LCR; Landgren et al., 1988; Wu & Wallace, 1989; Barany, 1991), die Amplifikation auf Basis der Nukleinsäuresequenz (NASBA; Guatelli et al., 1990; Compton, 1991), das Amplifikationssystem auf Transkriptionsbasis (TAS; Kwoh et al., 1989), die Strangverschiebungs-Amplifikation (SDA; Duck, 1990; Walker et al., 1992) oder die Amplifikation durch Qβ-Replicase (Lizardi et al., 1988; Lomeli et al., 1989) oder jedes beliebige andere geeignete Verfahren zum Amplifizieren von Nukleinsäuremolekülen, das in der Technik bekannt ist, sein.
Die als Primer oder Sonden verwendeten Oligonukleotide können auch Nukleotid-Analoga wie etwa Phosporothioate (Matsukura et al., 1987), Alkylphosphorothioate (Miller et al., 1979) oder Peptidnukleinsäuren (Nielsen et al., 1991; Nielsen et al., 1993) umfassen oder können interkalierende Agenzien enthalten (Asseline et al., 1984).
Wie die meisten Variationen oder Modifikationen, die in die ursprünglichen DNA-Sequenzen der Erfindung eingebracht werden, werden diese Variationen Anpassungen hinsichtlich der Bedingungen, unter denen die Oligonukleotide verwendet werden sollten, um die benötigte Spezifität und Empfindlichkeit zu erhalten, notwendig machen. Doch die letztendlichen Ergebnisse der Hybridisierung werden im Wesentlichen die gleichen wie jene sein, die mit den unmodifizierten Oligonukleotiden erhalten werden.
Die Einführung dieser Abwandlungen kann vorteilhaft sein, um Eigenschaften wie die Hybridisierungskinetik, die Umkehrbarkeit der Hybridbildung, die biologische Stabilität der Oligonukleotidmoleküle usw. positiv zu beeinflussen.
Der Begriff "fester Träger" kann sich auf jedes beliebige Substrat beziehen, an das eine Oligonukleotidsonde gekoppelt werden kann, vorausgesetzt, dass es seine Hybridisierungseigenschaften bewahrt und vorausgesetzt, dass die Hintergrundkonzentration der Hybridisierung gering bleibt. Gewöhnlich wird das feste Substrat eine Mikrotiterplatte, eine Membran (z.B. Nylon oder Nitrocellulose) oder eine Mikrokugel (ein Kügelchen) sein. Vor der Aufbringung auf die Membran oder der Fixierung kann es günstig sein, die Nukleinsäuresonde zu modifizieren, um die Fixierung zu erleichtern oder die Hybridisierungsleistungsfähigkeit zu verbessern. Derartige Modifikationen können das Ansynthetisieren eines Homopolymers, das Koppeln mit verschiedenen reaktiven Gruppen wie etwa aliphatischen Gruppen, NH₂-Gruppen, SH-Gruppen, Carboxylgruppen, oder das Koppeln mit Biotin, Haptenen oder Proteinen umfassen.
Der Begriff "markiert" bezieht sich auf die Verwendung von markierten Nukleinsäuren. Das Markieren kann durch die Verwendung von markierten Nukleotiden, die wie durch Saiki et al. (1988) oder Bej et al. (1990) veranschaulicht während des Polymeraseschritts aufgenommen werden, oder durch die Verwendung von markierten Primern, oder durch jedes beliebige andere Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, durchgeführt werden. Die Natur der Markierung kann isotop (³²P, ³⁵S, usw.) oder nichtisotop (Biotin, Digoxigenin, usw.) sein.
Die "Probe" kann jedes beliebige biologische Material sein, das entweder direkt vom infizierten Menschen (oder Tier), oder nach einem Kultivieren (der Anreicherung) genommen wird, oder eine Probe sein, die von Nahrungsmitteln oder Futter genommen wird. Beim biologischen Material kann es sich z.B. um Expektorationen jeglicher Art, Broncheolavagen, Blut, Hautgewebe, Biopsien, Lymphozytenblutkulturmaterial, Kolonien, usw. handeln. Die Proben können nach jeder beliebigen der in der Technik bekannten Techniken angefertigt oder extrahiert werden.
Beim "Ziel"material in diesen Proben kann es sich wie oben aufgezeigt entweder um genomische DNA oder Vorläufer-RNA des nachzuweisenden Organismus (= des Zielorganismus) oder um amplifizierte Versionen davon handeln. Genauer wird die Nukleinsäuresequenz des Zielmaterials im Spacer-Bereich des Zielorganismus bzw. der Zielorganismen lokalisiert.
Der Nachweis und die Identifizierung des Zielmaterials kann unter Verwendung eines der vielen Elektrophoreseverfahren, Hybridisierungsverfahren oder Sequenzierungsverfahren, die in der Literatur beschrieben sind und Fachleuten gegenwärtig bekannt sind, durchgeführt werden. Doch eine sehr günstige und vorteilhafte Technik für den gleichzeitigen Nachweis von Nukleinsäuren, die möglicherweise in biologischen Proben vorhanden sind, ist die Liniensondenassaytechnik. Der Liniensondenassay (LiPA) ist ein reverses Hybridisierungsformat (Saiki et al., 1989), das Membranstreifen verwendet, auf die mehrere Oligonukleotidsonden (einschließlich negativer oder positiver Kontrolloligonukleotide) bequem als parallele Linien aufgebracht werden können.
Die wie durch Stuyver et al. (1993) und in der internationalen Anmeldung WO 94/12670 beschriebene LiPA-Technik stellt einen sehr schnellen und benutzerfreundli chen Hybridisierungstest bereit. Ergebnisse können innerhalb von vier Stunden nach dem Beginn der Amplifikation abgelesen werden. Nach der Amplifikation, während der gewöhnlich eine nichtisotope Markierung in das amplifizierte Produkt aufgenommen wird, und der alkalischen Denaturierung wird das amplifizierte Produkt mit den Sonden auf der Membran in Kontakt gebracht und die Hybridisierung für etwa 1 bis 1,5 Stunden ausgeführt. In der Folge werden die gebildeten Hybride durch einen enzymatischen Vorgang nachgewiesen, der zu einem sichtbaren purpur-braunen Niederschlag führt. Das LiPA-Format ist völlig mit im Handel erhältlichen Abtastvorrichtungen kompatibel, was eine automatische Interpretation der Ergebnisse möglich macht. Alle diese Vorteile machen das LiPA-Format zur Verwendung in einer Routineeinstellung heranziehbar.
Das LiPA-Format ist nicht nur ein vorteilhaftes Werkzeug zur Identifizierung und zum Nachweis von Pathogenen an der Speziesebene, sondern auch an höheren oder niedrigeren taxonomischen Ebenen. Zum Beispiel können die Sondengestaltungen an den LiPA-Streifen in einer solchen Weise ausgewählt werden, dass sie eine vollständige Gattung (z.B. Neisseria, Listeria, usw.) nachweisen können, oder Untergruppen innerhalb einer Gattung (z.B. Untergruppen im Mycobacterium-aviumintracellulare-scrofulaceum-Komplex) identifizieren können, oder in manchen Fällen sogar Unterarten (Subspezies, Serovare, Sequevare, Biovare usw., was immer klinisch relevant ist) innerhalb einer Spezies nachweisen können.
Es sollte betont werden, dass die Fähigkeit zum gleichzeitigen Erzeugen von Hybridisierungsergebnissen mit einer Anzahl von Sonden ein herausragender Nutzen der LiPA-Technologie ist. In vielen Fällen übertrifft die Menge an Informationen, die durch eine besondere Kombination von Sonden erreicht werden kann, die Daten, die durch Verwenden einzelner Sondenassays erhalten werden können, bei weitem. Daher ist die Auswahl der Sonden auf dem Membranstreifen von höchster Wichtigkeit, da ein optimierter Sondensatz den Höchstwert an Informationen, der möglich ist, erzeugen wird. Dies ist hierin im Weiteren durch Beispiele genauer erläutert.
Der Umstand, dass unterschiedliche Sonden auf einem Streifen kombiniert werden können, bietet auch die Möglichkeit, bequem mit einem Mangel an Empfindlichkeit aufgrund einer Sequenzheterogenität im Zielbereich der nachzuweisenden Gruppe von Organismen fertig zu werden. Aufgrund dieser Heterogenität können zwei oder mehr Sonden benötigt werden, um alle Organismen der bestimmten Gruppe positiv zu identifizieren. Diese Sonden können an verschiedenen Stellen auf Membranstreifen aufgebracht werden, und das Ergebnis wird als positiv interpretiert, wenn wenigstens eine dieser Sonden positiv ist. Alternativ können diese Sonden an der gleichen Stelle als ein Gemisch aufgebracht werden, wodurch die Anzahl der Zeilen auf einem Streifen verringert wird. Diese Verringerung kann günstig sein, um den Streifen kürzer zu machen, oder um fähig zu sein, die gesamte Anzahl an Sonden auf einem Streifen zu erweitern. Ein anderer alternativer Ansatz, angesichts seiner praktischen Vorteile, ist die Synthese von Oligonukleotiden, die die Sequenzen von zwei (oder mehr) unterschiedlichen Sonden (= degenerierte Sonden) beherbergen, welche dann weiter verarbeitet und als ein Oligonukleotidmolekül auf den Streifen aufgebracht werden können. Dieser Ansatz würde die Herstellungsvorgänge der LiPA-Streifen beträchtlich vereinfachen. Zum Beispiel werden sowohl Sonden mit einer Nukleotidsequenz A als auch mit einer Nukleotidsequenz B benötigt, um alle Stämme des Taxons X nachzuweisen. Bei der letzteren Alternative kann eine Sonde synthetisiert werden, die die Nukleotidsequenz AB aufweist. Die Sonde wird die kombinierten Eigenschaften der Sonden A und B aufweisen.
Aufgrund der oben erwähnten Eigenschaften kann das Li PA-System als ein bevorzugtes Format für ein Hybridisierungsverfahren betrachtet werden, bei dem mehrere Organismen gleichzeitig in einer Probe nachgewiesen werden müssen. Außerdem ist das LiPA-System wie im Abschnitt "Beispiele" beschrieben ein bevorzugtes Format für ein Auswahlverfahren für die experimentelle Bewertung und Auswahl von theoretisch gestalteten Sonden.
Außerdem sollte klar sein, dass jeder beliebige andere Hybridisierungsassay, bei dem unterschiedliche Sonden unter den gleichen Hybridisierungs- und Waschbedingungen verwendet werden, für die oben erwähnten Nachweis- und/oder Auswahlverfahren verwendet werden kann. Zum Beispiel kann es möglich sein, die Zielnukleinsäure auf einem festen Träger zu immobilisieren und Gemische von unterschiedlichen Sonden zu verwenden, die alle unterschiedlich markiert sind, was zu einem unterschiedlichen Nachweissignal für jede der an das Ziel hybridisierten Sonden führt.
Als ein Beispiel ist nachstehend der Vorgang umrissen, der zum Nachweis eines oder mehrerer Organismen in einer Probe unter Verwendung des LiPA-Formats befolgt wird:

– Zuerst werden die Nukleinsäuren des in der Probe nachzuweisenden Organismus bzw. der in der Probe nachzuweisenden Organismen zur Amplifikation und/oder Hybridisierung verfügbar gemacht.
– Zweitens werden die Nukleinsäuren, falls vorhanden, wie nachstehend angegeben mit dem einen oder anderen Zielamplifikationssystem amplifiziert. Gewöhnlich wird die Amplifikation benötigt, um das anschließende Hybridisierungssignal zu verbessern. Doch für manche Proben oder manche Organismen könnte eine Amplifikation nicht notwendig sein. Dies könnte auch der Fall sein, wenn für den Nachweis der gebildeten Hybride höchst empfindliche Signalamplifikationssysteme verwendet werden.
– Drittens werden die Nukleinsäuren, die in der Probe oder im sich ergebenden amplifizierten Produkt vorhanden sind, eventuell nach einem Denaturierungsschritt mit LiPA-Streifen in Kontakt gebracht, auf denen eine oder mehrere DNA-Sonden, die den Nachweis der Organismen von Interesse gestatten, immobilisiert sind, und wird der Hybridisierung das Vonstattengehen gestattet.
– Schließlich werden die Hybride, eventuell nach der Durchführung eines Waschschritts, unter Verwendung eines bequemen und kompatiblen Nachweissystems nachgewiesen. Aus den beobachteten Hybridisierungssignalen oder -mustern kann das Vorhandensein oder Fehlen eines oder mehrerer Organismen, nach denen in der bestimmten biologischen Probe gesucht wurde, gefolgert werden.

Das verwendete Amplifikationssystem kann abhängig von der benötigten bestimmten Anwendung mehr oder weniger universell sein.
Durch das Verwenden universeller Primer, die sich in den konservierten flankierenden Bereichen (den Genen 16S und 23S) des rRNA-Spacers befinden, wird der Spacer-Bereich der meisten, wenn nicht aller, Organismen von eubakteriellem Ursprung amplifiziert werden. Das gleiche Ergebnis kann durch Verwenden einer Kombination von unterschiedlichen Sätzen von Primern mit verringerter Universalität (Multiplex-Amplifikation, d.h., ein Amplifikationsvorgang, bei dem zwei oder mehr Primersätze gleichzeitig in ein und demselben Reaktionsgemisch verwendet werden) erhalten werden.
Für manche Anwendungen kann es passend sein, nicht alle Organismen, die in der Probe vorhanden sind, sondern spezifischere, zuvor definierte Taxa zu amplifizieren,.
Dies kann unter Verwendung spezifischer Primer, die sich entweder in weniger konservierten Teilen der flankierenden Gene der Spacer befinden (z.B. MYCP1-5 für die Amplifikation des Spacer-Bereichs von Mycobacteria), oder in den Spacern selbst befinden (z.B. LIS-P1-P7, BRU-P1-4, CHTR-P1-2 und YEC-P1-2 für die spezifische Amplifikation des Spacer-Bereichs bzw. der Spacer-Bereiche von Listeria-Spezies, Brucella-Spezies, Chlamydia trachomatis, bzw. Yersinia enterocolitica).
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung mindestens eines Mikroorganismus oder zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer Mikroorganismen in einer Probe bereit, das die folgenden Schritte umfasst:

(i) nötigenfalls Freisetzen, Isolieren und/oder Auf konzentrieren der Polynukleinsäuren aus dem nachzuweisenden Mikroorganismus bzw. den nachzuweisenden Mikroorganismen in der Probe;
(ii) nötigenfalls Amplifizieren des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs, oder eines Teils davon, aus dem nachzuweisenden Mikroorganismus bzw. den nachzuweisenden Mikroorganismen mit wenigstens einem geeigneten Primerpaar;
(iii) Hybridisieren der Polynukleinsäuren aus Schritt (i) oder (ii) mit einem Sondensatz, der wenigstens zwei Sonden umfasst, unter den gleichen Hybridisierungs- und Waschbedingungen, wobei die Sonden aus den Sequenzen von Tabelle 1a oder Äquivalenten davon und/oder aus taxonspezifischen Sonden, die von jeder beliebigen der in 1 bis 103 dargestellten Spacer-Sequenzen erlangt werden, ausgewählt werden, wobei die taxonspezifische Sonde so ausgewählt wird, dass sie fähig ist, untex den gleichen Hybridisierungs- und Waschbedingungen wie wenigstens eine der Sonden von Tabelle 1a zu hybridisieren;
(iv) Nachweisen der in Schritt (iii) gebildeten Hybride;
(v) Identifizieren des in der Probe vorhandenen Mikroorganismus bzw. der in der Probe vorhandenen Mikroorganismen aus den in Schritt (iv) erhaltenen differentiellen Hybridisierungssignalen.

Die wie in Tabelle 1a erwähnten Sonden sind alle in einer solchen Weise ausgewählt, dass sie die gewünschten Hybridisierungseigenschaften bei einer Hybridisierungs- und Waschtemperatur von 50°C in einem bevorzugten Hybridisierungs- und Waschmedium aus 3 × SSC und 20% Formamid zeigen.
Der Begriff "Äquivalente" einer Sonde, auch "Varianten" oder "Homologe" oder "offensichtliche Abkömmlinge" genannt, bezieht sich auf Sonden, die sich entweder durch Anfügen an jedes beliebige oder durch Entfernen von jedem beliebigen ihrer äußersten Enden in der Sequenz von jeder beliebigen der in Tabelle 1a angegebenen Sonden unterscheiden, vorausgesetzt, dass diese Äquivalente noch mit dem gleichen RNA- oder DNA-Ziel wie die entsprechende unmodifizierte Sondensequenz hybridisieren. Es sollte bemerkt werden, dass es bei der Verwendung eines Äquivalents einer Sonde nötig sein kann, die Hybridisierungsbedingungen zu modifizieren, um die gleiche Spezifität wie die entsprechende unmodifizierte Sonde zu erhalten. Da es die Aufgabe dieser Erfindung ist, einen Probensatz zu verwenden, der unter den gleichen Hybridisierungs- und Waschbedingungen arbeitet, wird es als eine Folge auch nötig sein, die Sequenz der anderen Sonden, die zum gleichen Satz wie die ursprüngliche unmodifizierte Sonde gehören, entsprechend zu modifizieren. Diese Modifizierung kann nach Grundsätzen, die in der Technik bekannt sind, erfolgen, wie z.B. jenen, die in Hames B. und Higgins S. (Hrsg.): Nucleic acid hybridization. Practical approach. IRL Press, Oxford, Großbritannien, 1985, beschrieben sind.
Der Abschnitt "Beispiele" lehrt ferner ein Verfahren zum Auswählen von taxonspezifischen Sonden aus der Spacer-Bereich-Sequenz bzw. den Spacer-Bereich-Sequenzen des Taxons, wobei die Sonden so ausgewählt werden, dass sie ihre gewünschten Hybridisierungseigenschaften unter vereinheitlichten Hybridisierungs- und Waschbedingungen zeigen.
Der Begriff "vereinheitlichte" Bedingungen bedeutet, dass diese Bedingungen für die unterschiedlichen Sonden die gleichen sind, was den Nachweis unterschiedlicher Taxa ermöglicht.
Vorzugsweise stellt die vorliegende Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren bereit, wobei wenigstens zwei Mikroorganismen gleichzeitig nachgewiesen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der wie in Schritt (iii) beschriebene Sondensatz wenigstens zwei Sonden, die aus den Sequenzen von Tabelle 1a oder Äquivalenten davon ausgewählt sind.
In einer anderen Ausführungsform umfasst der wie in Schritt (iii) beschriebene Sondensatz wenigstens eine Sonde, die aus den Sequenzen von Tabelle 1a oder Äquivalenten davon ausgewählt ist, und wenigstens eine taxonspezifische Sonde, die von jeder beliebigen der wie in 1 bis 103 dargestellten Spacer-Sequenzen erlangt wird.
In noch einer anderen Ausführungsform umfasst der wie in Schritt (iii) beschriebene Sondensatz wenigstens zwei taxonspezifische Sonden, die von jeder beliebigen der wie in 1 bis 103 dargestellten Spacer- Sequenzen erlangt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein wie oben beschriebenes Verfahren bereit, wobei die wie in Schritt (iii) angegebenen Sonden mit mindestens einer anderen Sonde, vorzugsweise auch aus dem 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich, kombiniert werden, wodurch der gleichzeitige Nachweis von unterschiedlichen pathogenen Bakterien, die wahrscheinlich in der gleichen Probe vorhanden sind, ermöglicht wird.
Die Organismen von klinischer Relevanz, die in biologischen Proben vorhanden sind, können abhängig vom Ursprung der Probe beträchtlich verschieden sein. Die häufigsten pathogenen Bakterien, die in Sputumproben oder in Proben, die aus dem Respirationstrakt stammen, gefunden werden können, sind:

– Moraxella catarrhalis
– Streptococcus pneumoniae
– Haemophilus influenzae
– Pseudomonas aeruginosa
– Mycoplasma pneumoniae
– Acinetobacter-Spezies
– Mycobacterium-Spezies
– Staphylococcus aureus
– Legionella pheumophilia

Ein LiPA-Streifen, der Spacer-Sonden beherbergt, die den Nachweis der meisten, wenn nicht aller, dieser Organismen ermöglichen, wäre aus den oben erklärten Gründen äußerst nützlich.
Offensichtlich gilt dies auch für andere biologische Proben, als da sind: Liquor, Urogenitalproben, Gastrointestinalproben, Blut, Harn, Lebensmittelprodukte, Boden, usw. Zum Beispiel würde ein bevorzugtes Panel für den Liquor Sondenkombinationen enthalten, die den Nachweis und die Unterscheidung der folgenden Organismen ermöglichen:

– Neisseria meningitidis
– Streptococcus pneumoniae
– Streptococcus agalactiae
– Listeria monocytogenes
– Mycobacterium tuberculosis

Für einige der oben erwähnten Organismen wurden bereits in einer früheren Patentanmeldung (WO 91/16454) Spacer-Sonden gestaltet. Um fähig zu sein, die meisten Pathogene, die möglicherweise in einer Probe vorhanden sind, in einem einzelnen Test nachzuweisen, können die Sonden der vorliegenden Erfindung mit wenigstens einer der Sonden von WO 91/16454, oder ihren wie in WO 91/16454 angegebenen offensichtlichen Abkömmlingen, kombiniert werden. Zur Klarheit sind diese Sonden nachstehend angeführt:
Die Erfindung stellt somit ein wie oben beschriebenes Verfahren bereit, wobei die Probe aus dem Respirationstrakt stammt, und wobei der wie in Schritt (iii) definierte Sondensatz wenigstens eine aus den folgenden Spacer-Sonden:

oder Äquivalenten dieser Sonden ausgewählte Sonde umfasst,
und/oder wobei der Sondensatz wenigstens eine taxonspe zifische Sonde umfasst, die aus der Spacer-Bereich-Sequenz erlangt wird, die einem der in der Probe nachzuweisenden Mikroorganismen entspricht, wobei diese Spacer-Bereich-Sequenz aus jeder beliebigen der wie durch SEQ ID NO 76 bis 106, 157 bis 174, 124, 125, 111 bis 115, 139 bis 144, oder 126 bis 130 dargestellten Sequenzen ausgewählt wird,
und wobei die Sonden oder Äquivalente möglichst in Kombination mit jeder beliebigen Sonde verwendet werden, die wenigstens einen der folgenden Organismen nachweist: Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis oder Bordetella pertussis.
Die oben erwähnten Sonden der Erfindung sind für den Nachweis von Mycobacterium-Spezies (SEQ ID NO 1 bis 33 und 175 bis 191), von Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO 34 bis 38), von Mycoplasma-Spezies (SEQ ID NO 49 bis 52), von Staphylococcus aureus (SEQ ID NO 53 bis 56) und von Acinetobacter baumanii (SEQ ID NO 57 und 58) gestaltet.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht oder mehr dieser Sonden gleichzeitig verwendet.
Die Erfindung betrifft auch ein wie oben beschriebenes Verfahren, wobei die Probe eine dem Liquor entnommene Probe ist, und wobei der wie in Schritt (iii) beschriebene Sondensatz wenigstens eine aus den folgenden Spacer-Sonden:

und vorzugsweise aus den folgenden Spacer-Sonden:
oder Äquivalenten dieser Sonden ausgewählte Sonde umfasst,
und/oder wobei der Sondensatz wenigstens eine taxonspezifische Sonde umfasst, die aus der Spacer-Bereich-Sequenz erlangt wird, die einem der in der Probe nachzuweisenden Mikroorganismen entspricht, wobei diese Spacer-Bereich-Sequenz aus jeder beliebigen der wie durch SEQ ID NO 116, 118 bis 121, oder 213 bis 215 dargestellten Sequenzen ausgewählt wird,
und wobei die Sonden oder Äquivalente möglichst in Kombination mit jeder beliebigen Sonde verwendet werden, die wenigstens einen der folgenden Organismen nachweist: Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae oder Streptococcus pneumoniae.
Die oben erwähnten Sonden der Erfindung sind für den Nachweis von Mycobacterium-Spezies, genauer Mycobacterium tuberculosis (SEQ ID NO 1 bis 5), und von Listeria-Spezies, genauer Listeria monocytogenes (SEQ ID NO 39 bis 42) gestaltet.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht oder mehr dieser Sonden gleichzei tig verwendet.
Die Erfindung betrifft auch ein wie oben beschriebenes Verfahren, wobei die Probe eine dem Urogenitaltrakt entnommene Probe ist, und wobei der wie in Schritt (iii) beschriebene Sondensatz wenigstens eine aus den folgenden Spacer-Sonden:
oder Äquivalenten dieser Sonden ausgewählte Sonde umfasst,
und/oder wobei der Sondensatz wenigstens eine taxonspezifische Sonde umfasst, die aus der Spacer-Bereich-Sequenz erlangt wird, die einem der in der Probe nachzuweisenden Mikroorganismen entspricht, wobei diese Spacer-Bereich-Sequenz aus jeder beliebigen der wie durch SEQ ID NO 122, 123, 197, 124 oder 125 dargestellten Sequenzen ausgewählt wird,
wobei die Sonden oder Äquivalente möglichst in Kombination mit jeder beliebigen Sonde verwendet werden, die wenigstens einen der folgenden Organismen nachweist:
Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus ducrevi oder Streptococcus agalactiae.
Die oben erwähnten Sonden der Erfindung sind für den Nachweis von Chlamydia-Spezies (SEQ ID NO 45 bis 48 und 201), und von Mycoplasma-Spezies (SEQ ID NO 51 und 52) gestaltet.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei, drei, vier, fünf, sechs oder sieben dieser Sonden gleichzeitig verwendet.
Die Erfindung betrifft auch ein wie oben beschriebenes Verfahren, wobei die Probe eine Lebensmitteln entnommene Probe ist, und wobei der wie in Schritt (iii) beschriebene Sondensatz wenigstens eine aus den folgenden Spacer-Sonden:
und vorzugsweise aus den folgenden Spacer-Sonden:

oder Äquivalenten dieser Sonden ausgewählte Sonde umfasst,
und/oder wobei der Sondensatz wenigstens eine taxonspezifische Sonde umfasst, die aus der Spacer-Bereich-Sequenz erlangt wird, die einem der in der Probe nachzuweisenden Mikroorganismen entspricht, wobei diese Spacer-Bereich-Sequenz aus jeder beliebigen der wie durch SEQ ID NO 116, 118 bis 121, 213 bis 215, 139 bis 144, 131, 132, 154, 133 bis 138, 195 oder 196 dargestellten Sequenzen ausgewählt wird,
wobei die Sonden oder Äquivalente möglichst in Kombination mit jeder beliebigen Sonde verwendet werden, die Stämme von Campylobacter-Spezies nachweist.
Die oben erwähnten Sonden der Erfindung sind für den Nachweis von Listeria-Spezies (SEQ ID NO 39 bis 44), von Staphylococcus-Spezies (SEQ ID NO 53 bis 56), von Brucella-Spezies (SEQ ID NO 59, 60, 193 und 194), von Salmonella-Spezies (SEQ ID NO 61 bis 64) und von Yersinia enterocolitica (SEQ ID NO 198 bis 200) gestaltet.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht oder mehr dieser Sonden gleichzeitig verwendet.
Die Erfindung betrifft auch ein wie oben beschriebenes Verfahren, wobei die Probe eine dem Gastrointestinaltrakt eines Patienen entnommene Probe ist, und wobei der wie in Schritt (iii) beschriebene Sondensatz wenigstens eine aus den folgenden Spacer-Sonden:
und vorzugsweise aus den folgenden Spacer-Sonden:
oder Äquivalenten dieser Sonden ausgewählte Sonde umfasst,
und/oder wobei der Sondensatz wenigstens eine taxonspezifische Sonde umfasst, die aus der Spacer-Bereich-Sequenz erlangt wird, die einem der in der Probe nachzuweisenden Mikroorganismen entspricht, wobei diese Spacer-Bereich-Sequenz aus jeder beliebigen der wie durch SEQ ID NO 133 bis 138 oder 195 bis 196 dargestellten Sequenzen ausgewählt wird,
wobei die Sonden oder Äquivalente möglichst in Kombination mit jeder beliebigen Sonde verwendet werden, die Campylobacter-Spezies nachweist.
Die oben erwähnten Sonden der Erfindung sind dazu gestaltet, Salmonella-Spezies (SEQ ID NO 61 bis 64) und Yersinia enterocolitica (SEQ ID NO 198 bis 200) nachzuweisen.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei, drei, vier, fünf, sechs oder sieben dieser Sonden gleichzeitig verwendet.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der ausge wählten Sonden oder ihrer Äquivalente für den Nachweis von bestimmten bakteriellen Taxa, wobei diese Taxa entweder eine vollständige Gattung, oder eine Untergruppe innerhalb einer Gattung, eine Spezies, oder sogar eine Unterart innerhalb einer Spezies sind.
Die Erfindung stellt somit ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Stämme von Mycobacterium-Spezies und -Subspezies in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:

und vorzugsweise an wenigstens eine Sonde der folgenden beschränkten Gruppe von Spacer-Sonden:

oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 76 bis 110, oder 157 bis 174 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an eine Mycobacterium-Spezies hybridisiert, umfasst.
Die durch SEQ ID NO 76 bis 110 und 157 bis 174 dargestellten Sequenzen sind neu.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht oder mehr dieser Sonden gleichzeitig verwendet.
Wie oben beschrieben handelt es sich beim bevorzugten beschränkten Sondensatz um jene Sonden, die unter den wie im Abschnitt "Beispiele" beschriebenen bestimmten Hybridisierungsbedingungen eine Empfindlichkeit und eine Spezifität von mehr als 80%, vorzugsweise mehr als 90%, und insbesondere mehr als 95% zeigten.
In einer bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Stämme des Mycobacterium-tuberculosis-Komplexes in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 76 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an eine Mycobacterium-Spezies hybridisiert, umfasst. Der M.-tuberculosis-Komplex umfasst M.-tuberculosis-, M.-bovis-, M.-bovis-BCG-, M.-africanum- und M.-microtis-Stämme.
Die in SEQ ID NO 76 dargestellte Sequenz ist neu. Vorzugsweise werden wenigstens zwei oder drei dieser Sonden gleichzeitig verwendet.
In einer anderen bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-Stämme aus dem MAIS-Komplex bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 77 bis 100 oder 108 bis 110 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an Stämme vom MAIS-Komplex hybridisiert, umfasst. Der wie in dieser Erfindung definierte MAIS-Komplex umfasst alle Stämme von M. avium, M. intracellulare und M. scrofulaceum und alle Stämme, die eng mit den oben erwähnten Spezies verwandt sind und nicht klar zu einer anderen definierten Mycobacterium-Spezies gehören. Die letztere Gruppe von Stämmen ist in dieser Erfindung als "MIC-Stämme" (M.-intracellulare-Komplex) definiert.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht oder mehr dieser Sonden gleichzeitig verwendet.
In noch einer anderen bestimmten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer M.-avium- und M.-paratuberculosis-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 77 und 78 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an M. avium oder M. paratuberculosis hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 77 und 78 dargestellten Sequenzen sind neu.
Vorzugsweise verwendet diese Ausführungsform beide Sonden in Kombination.
In noch einer anderen bestimmten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-intracellulare-Stämme und MIC-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 oder 99 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an M.-intracellulare- und MIC-Stämme hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 oder 99 dargestellten Sequenzen sind neu.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht oder mehr dieser Sonden gleichzeitig verwendet.
In noch einer anderen bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-intracellulare-Stämme in einer Probe be reit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens die folgende Sonde:
oder an Äquivalente dieser Sonde,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 89 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an M.-intracellulare-Stämme hybridisiert, umfasst.
In noch einer anderen bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-scrofulaceum-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an die folgende Sonde:
oder an Äquivalente dieser Sonde,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 100 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an M. scrofulaceum hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 100 dargestellte Sequenz ist neu.
In noch einer anderen bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-kansasii-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:

und vorzugsweise an:
oder an Äquivalente dieser Sonde,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 101, 167, 168 oder 169 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an M. kansasii hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 101, 167, 168 und 169 dargestellten Sequenzen sind neu.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei, drei oder vier dieser Sonden gleichzeitig verwendet.
In noch einer anderen bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-chelonae-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonde,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 102, 103 oder 174 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an M. chelonae hybridisiert, umfasst. Nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden diese drei Sonden in Kombination verwendet.
Die wie in SEQ ID NO 102, 103 und 174 dargestellten Sequenzen sind neu.
In noch einer anderen bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-gordonae-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
und vorzugsweise an:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 104, 105 oder 106 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an M. gordonae hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 104 bis 106 dargestellten Sequenzen sind neu.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei oder drei dieser Sonden gleichzeitig verwendet.
In noch einer anderen bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-ulcerans-Stämme oder Mycobacterium-marinum-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an die folgende Sonde:
oder an Äquivalente dieser Sonde,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 157 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an M. ulcerans und M, marinum hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 157 dargestellte Sequenz ist neu.
In noch einer anderen bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-genavense-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 158, 159, 160, 161 oder 162 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an M. genavense hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 158 bis 162 dargestellten Sequenzen sind neu.
Wie in den Beispielen beschrieben beinhaltet M. genavense M.-genavense-Stämme sensu strictu und eine Gruppe von eng verwandten Stämmen, die als M.-simiae-artige bezeichnet werden. Die erstere Gruppe von Stämmen kann spezifisch mit der Sonde MGV-ICG-1 nachgewiesen werden, während die letztere Gruppe spezifisch mit der Sonde MGV-ICG-3 hybridisiert. Die Sonde MGV-ICG-2 weist beide Gruppen nach.
In noch einer anderen bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-xenopi-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an die folgende Sonde:
oder an Äquivalente dieser Sonde,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 163 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an M. xenopi hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 163 dargestellte Sequenz ist neu.
In noch einer anderen bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-simiae-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an die folgende Sonde:
oder an Äquivalente dieser Sonde,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 164 oder 165 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an M. simiae hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 164 oder 165 dargestellte Sequenz ist neu.
In noch einer anderen bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-fortuitum-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden, oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 166 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an M. fortuitum hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 166 dargestellte Sequenz ist neu.
In noch einer anderen bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-celatum-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an die folgende Sonde:
oder an Äquivalente dieser Sonde,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 170 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an M. celatum hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 170 dargestellte Sequenz ist neu.
In noch einer anderen bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-haemophilum-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an die folgende Sonde:
oder an Äquivalente dieser Sonde,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 171, 172 oder 173 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an M. haemophilum hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 171 bis 173 dargestellten Sequenzen sind neu.
In noch einer anderen bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-malmoense-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 107 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an M. malmoense hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 107 dargestellte Sequenz ist neu.
In noch einer anderen bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden umfasst.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform werden beide Sonden in Kombination verwendet.
Die Erfindung stellt auch ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycoplasma-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 124 oder 125 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch mit Mycoplasma-Spezies hybridisiert, umfasst.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei, drei oder vier dieser Sonden gleichzeitig verwendet.
Genauer stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycoplasma-pneumoniae-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 125 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an Mycoplasma pneumoniae hybridisiert, umfasst. Nach einer bevorzugten Ausführungsform werden diese beiden Sonden in Kombination verwendet.
Die wie in SEQ ID NO 125 dargestellte Sequenz ist neu.
In einer anderen besonderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycoplasma-genitalium-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an die folgende Sonde:
oder an Äquivalente dieser Sonde,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 124 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an Mycoplasma genitalium hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 124 dargestellte Sequenz ist neu.
Die Erfindung stellt auch ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Pseudomonas-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 111, 112, 113, 114 oder 115 erlangt wird, vorausge setzt, dass diese Sonde spezifisch an Pseudomonas-Stämme hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 111 bis 115 dargestellten Sequenzen sind neu.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei, drei oder vier dieser Sonden gleichzeitig verwendet.
Genauer stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Pseudomonas-aeruginosa-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
und insbesondere an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 111 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an Pseudomonas aeruginosa hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 111 dargestellte Sequenz ist neu.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei, drei, vier oder fünf dieser Sonden gleichzeitig verwendet.
Die Erfindung stellt auch ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Staphylococcus-Spezies in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 139, 140, 141, 142, 143 oder 144 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an Staphylococcus-Spezies hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 139 bis 144 dargestellten Sequenzen sind neu.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei, drei oder vier dieser Sonden gleichzeitig verwendet.
Genauer stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Staphylococcus-aureus-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der, und vorzugsweise beide folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 139, 140, 141, 142 oder 143 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an Staphylococcus aureus hybridisiert, umfasst. Nach einer bevorzugten Ausführungsform werden diese beiden Sonden in Kombination verwendet.
In einer anderen bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Staphylococcus-epidermitis-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 144 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde zur spezifischen Hybridisierung an Staphylococcus epidermitis gebracht werden kann, umfasst.
Die Erfindung stellt auch ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Acinetobacter-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 126, 127, 128, 129 oder 130 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an Acinetobacter-Spezies hybridisiert, umfasst. Nach einer bevorzugten Ausführungsform werden diese beiden Sonden in Kombination verwendet.
Die wie in SEQ ID NO 126 bis 130 dargestellten Sequenzen sind neu.
Genauer stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Acinetobacter-baumanii-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 126 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an Acinetobacter baumanii hybridisiert, umfasst. Nach einer bevorzugten Ausführungsform werden diese beiden Sonden in Kombination verwendet.
Die Erfindung stellt auch ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Listeria-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
und insbesondere an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 116, 118, 119, 120, 121, 213, 214 oder 215 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an Listeria-Spezies hybridisiert, umfasst.
Wie im Abschnitt "Beispiele" beschrieben umfassen Listeria-Spezies Listeria-Spezies sensu strictu und eine Gruppe von eng verwandten Organismen, die als "Listeria-artige Organismen" bezeichnet werden. Die letztere Gruppe kann spezifisch durch die Sonde LISP-ICG 1 erkannt werden.
Die wie in SEQ ID NO 116, 118 bis 121 und 213 bis 215 dargestellten Sequenzen sind neu.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei, drei, vier, fünf oder sechs dieser Sonden gleichzeitig verwendet.
Genauer stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Listeria-monocytogenes-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
und insbesondere an die folgende Sonde:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 120 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an Listeria monocytogenes hybridisiert, umfasst.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei oder drei dieser Sonden gleichzeitig verwendet.
Die Erfindung stellt auch ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Brucella-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
und insbesondere an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 131, 132 oder 154 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an Brucella-Stämme hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 131, 132 und 154 dargestellten Sequenzen sind neu.
Die Erfindung stellt auch ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Salmonella-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
und insbesondere an die folgende Sonde:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 133, 134, 135, 136, 137 oder 138 erlangt wird, voraus gesetzt, dass diese Sonde spezifisch an Salmonella-Stämme hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 133 bis 138 dargestellten Sequenzen sind neu.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei, drei oder vier dieser Sonden gleichzeitig verwendet.
Die Erfindung betrifft auch ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Chlamydia-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 122, 123 oder 197 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an Chlamydia-Stämme hybridisiert, umfasst.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei, drei, vier oder fünf dieser Sonden gleichzeitig verwendet.
Genauer betrifft die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Chlamydia-trachomatis-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 123 oder 197 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an Chlamydia trachomatis hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 123 und 197 dargestellten Sequenzen sind neu.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei, drei oder vier dieser Sonden gleichzeitig verwendet.
In einer anderen besonderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Chlamydia-psittaci-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens die folgende Sonde:
oder an Äquivalente dieser Sonde,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 122 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an Chlamydia psittaci hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 122 dargestellte Sequenz ist neu.
Die Erfindung stellt auch ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis eines oder mehrerer Streptococcus-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 oder 153 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an Streptococcus-Stämme hybridisiert, oder an Äquivalente dieser Sonden umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 oder 153 dargestellten Sequenzen sind neu.
Die Erfindung stellt auch ein wie oben beschriebenes Verfahren zum Nachweis eines oder mehrerer Yersinia-enterocolitica-Stämme in einer Probe bereit, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
oder an Äquivalente dieser Sonden,
und/oder an jede beliebige Sonde, die von SEQ ID NO 195 oder 196 erlangt wird, vorausgesetzt, dass diese Sonde spezifisch an Yersinia enterocolitica hybridisiert, umfasst.
Die wie in SEQ ID NO 195 und 196 dargestellten Sequenzen sind neu.
In manchen Fällen kann es vorteilhaft sein, nicht alle Organismen, die in einer Probe vorhanden sind, sondern nur spezifischere Taxa, die als relevant betrachtet werden, zu amplifizieren. In diesen Fällen stellt die Erfindung Primer bereit, die die spezifische Amplifikation des Spacer-Bereichs für nur diese zuvor definierten Taxa gestatten.
Die Erfindung stellt somit ein wie oben beschriebenes Verfahren zum spezifischen Nachweis und zur spezifischen Identifizierung von Chlamydia trachomatis in einer Probe bereit, wobei Schritt (ii) die Amplifikation des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs oder eines Teils davon unter Verwendung wenigstens eines der folgenden Primer:
oder von Äquivalenten dieser Primer umfasst, wobei sich diese Äquivalente durch die Änderung eines oder mehrerer Nukleotide in der Sequenz von den oben erwähnten Primern unterscheiden, vorausgesetzt, dass diese Äquivalente noch spezifisch den Spacer-Bereich oder einen Teil davon von Chlamydia trachomatis amplifizieren.
Vorzugsweise werden beide Primer verwendet.
Die Erfindung stellt auch ein wie oben beschriebenes Verfahren zum spezifischen Nachweis und zur spezifischen Identifizierung von Listeria-Spezies in einer Probe bereit, wobei Schritt (ii) die Amplifikation des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs oder eines Teils davon unter Verwendung wenigstens eines der folgenden Primer:
oder von Äquivalenten dieser Primer umfasst, wobei sich diese Äquivalente durch die Änderung eines oder mehrerer Nukleotide in der Sequenz von den oben erwähnten Primern unterscheiden, vorausgesetzt, dass diese Äquivalente noch spezifisch den Spacer-Bereich oder einen Teil davon von Listeria-Spezies amplifizieren.
Die Erfindung betrifft auch ein wie oben beschriebenes Verfahren zum spezifischen Nachweis und zur spezifischen Identifizierung von Mycobacterium-Spezies in einer Probe, wobei Schritt (ii) die Amplifikation des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs oder eines Teils davon unter Verwendung wenigstens eines der folgenden Primer:
oder von Äquivalenten dieser Primer umfasst, wobei sich diese Äquivalente durch die Änderung eines oder mehrerer Nukleotide in der Sequenz von den oben erwähnten Primern unterscheiden, vorausgesetzt, dass diese Äquivalente noch spezifisch den Spacer-Bereich oder einen Teil davon von Mycobacterium-Spezies amplifizieren.
Die Erfindung stellt auch ein wie oben beschriebenes Verfahren zum spezifischen Nachweis und zur spezifischen Identifizierung von Brucella-Spezies in einer Probe bereit, wobei Schritt (ii) die Amplifikation des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs oder eines Teils davon unter Verwendung wenigstens eines der folgenden Primer:
oder von Äquivalenten dieser Primer umfasst, wobei sich diese Äquivalente durch die Änderung eines oder mehrerer Nukleotide in der Sequenz von den oben erwähnten Primern unterscheiden, vorausgesetzt, dass diese Äquivalente noch spezifisch den Spacer-Bereich oder einen Teil davon von Brucella-Spezies amplifizieren.
Die Erfindung stellt auch ein wie oben beschriebenes Verfahren zum spezifischen Nachweis und zur spezifischen Identifizierung von Yersinia-enterocolitica-Spezies in einer Probe bereit, wobei Schritt (ii) die Amplifikation des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs oder eines Teils davon unter Verwendung wenigstens eines der folgenden Primer:
oder von Äquivalenten dieser Primer umfasst, wobei sich diese Äquivalente durch die Änderung eines oder mehrerer Nukleotide in der Sequenz von den oben erwähnten Primern unterscheiden, vorausgesetzt, dass diese Äquivalente noch spezifisch den Spacer-Bereich oder einen Teil davon von Yersinia-enterocolitica-Spezies amplifizieren.
Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung bereit, die wenigstens eine der wie oben definierten Sonden und/oder Primer umfasst.
Diese Zusammensetzung kann jeden beliebigen Träger, jedes beliebige Trägermaterial, jede beliebige Markierung oder jedes beliebige Verdünnungsmittel, die in der Technik für Sonden oder Primer bekannt sind, und genauer jede beliebige der Markierungen oder Trägermaterialien, die im Definitionsabschnitt im Einzelnen angegeben sind, umfassen.
Die Erfindung betrifft genauer wie oben definierte isolierte Sonden und Primer, und genauer jede beliebige der wie in Tabelle 1a angegebenen Sonden oder jeden beliebigen der wie in Tabelle 1b angegebenen Primer.
Nach einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung auch wie oben definierte und in 1 bis 103 (SEQ ID NO 76 bis 154, SEQ ID NO 157 bis 174, SEQ ID NO 195 bis 197 und SEQ ID NO 213 bis 215) dargelegte neue Spacer-Bereich-Sequenzen.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur reversen Hybridisierung bereit, das jede beliebige der wie oben definierten Sonden umfasst, wobei die Sonden an einer bekannten Stelle auf einem festen Träger, und vorzugsweise auf einem Membranstreifen immobilisiert werden.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung einen Kit zum Nachweis und zur Identifizierung wenigstens eines Mikroorganismus oder zum gleichzeitigen Nachweis und zur gleichzeitigen Identifizierung mehrerer Mikroorganismen in einer Probe bereit, wobei der Kit die folgenden Komponenten umfasst:

(i) gegebenenfalls wenigstens ein geeignetes Primerpaar, um die Amplifikation des intercistronischen 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs oder eines Teils davon zu gestatten;
(ii) wenigstens zwei der wie oben definierten Sonden;
(iii) einen Puffer oder zur Herstellung des Puffers notwendige Komponenten, wodurch eine Hybridisierungsreaktion zwischen den Sonden und den in der Probe vorhandenen Polynukleinsäuren oder den amplifizierten Produkten davon ermöglicht wird;
(iv) eine Lösung oder zur Herstellung der Lösung notwendige Komponenten, wodurch das Waschen der gebildeten Hybride unter den entsprechenden Waschbedingungen ermöglicht wird;
(v) gegebenenfalls ein Mittel zum Nachweis der aus der vorhergehenden Hybridisierung erhaltenen Hybride.

ERLÄUTERUNG DER FIGUREN
1 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-tuberculosis-Stamms H37RV ATCC 27294 dar (SEQ ID NO 76).
2 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs von Mycobacterium avium ATCC 151.769 (ITG 4991) dar (SEQ ID NO 77).
3 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs der Mycobacterium-paratuberculosis-Stamms 316F und 2E dar (SEQ ID NO 78).
4 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-Stamms ITG 5513 dar (SEQ ID NO 79).
5 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-Stamms ITG 8695 dar (SEQ ID NO 80).
6 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-Stamms ITG 8708 dar (SEQ ID NO 81).
7 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-Stamms ITG 8715 dar (SEQ ID NO 82).
8 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-Stamms ITG 8054 dar (SEQ ID NO 83).
9 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-Stamms ITG 8737 dar (SEQ ID NO 84).
10 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spa cer-Bereichs des Mycobacterium-Stamms ITG 8743 dar (SEQ ID NO 85).
11 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-Stamms ITG 8745 dar (SEQ ID NO 86).
12 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-Stamms ITG 8748 dar (SEQ ID NO 87).
13 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-Stamms ITG 8752 dar (SEQ ID NO 88).
14 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-intracellulare-Serovars 12 ITG 5915 dar (SEQ ID NO 89).
15 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs von Mycobacterium lufu ITG 4755 dar (SEQ ID NO 90).
16 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-Stamms ITG 5922 dar (SEQ ID NO 91).
17 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-Stamms ITG 1329 dar (SEQ ID NO 92).
18 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-Stamms ITG 1812 dar (SEQ ID NO 93).
19 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-Stamms ITG 5280 dar (SEQ ID NO 94).
20 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-Stamms ITG 5620 dar (SEQ ID NO 95).
21 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-Stamms ITG 5765 dar (SEQ ID NO 96).
22 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs von Mycobacterium ITG 7395 dar (SEQ ID NO 97).
23 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs von Mycobacterium ITG 8738 dar (SEQ ID NO 98).
24 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs von Mycobacterium ITG 926 dar (SEQ ID NO 99).
25 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium scrofulaceum ITG 4988 dar (SEQ ID NO 100).
26 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium kansasii ATCC 22478 (= ITG 4987) dar (SEQ ID NO 101).
27 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium chelonae abcessus ITG 4975 dar (SEQ ID NO 102).
28 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium chelonae chelonae ITG 9855 dar (SEQ ID NO 103).
29 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium gordonae ITG 7703 dar (SEQ ID NO 104).
30 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium gordonae ITG 7836 dar (SEQ ID NO 105).
31 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium gordonae ITG 8059 dar (SEQ ID NO 106).
32 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium malmoense ITG 4842 und ITG 4832 dar (SEQ ID NO 107).
33 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-Stamms 8757 dar (SEQ ID NO 108).
34 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium ITG 8723 dar (SEQ ID NO 109).
35 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium ITG 8724 dar (SEQ ID NO 110).
36 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Pseudomonas aeruginosa UZG 5669 dar (SEQ ID NO 111).
37 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Pseudomonas pseudoalcaligenes LMG 1225 dar (SEQ ID NO 112).
38 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Pseudomonas stutzeri LMG 2333 dar (SEQ ID NO 113).
39 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Pseudomonas alcaligenes LMG 1224 dar (SEQ ID NO 114).
40 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Pseudomonas putida LMG 2232 dar (SEQ ID NO 115).
41 stellt die DNA-Sequenz des kleinen 16S-23S-Spacer-Bereichs von Listeria ivanovii CIP 7842 dar (SEQ ID NO 116).
42 stellt die DNA-Sequenz des kleinen 16S-23S-Spacer-Bereichs von Listeria monocytogenes dar (SEQ ID NO 117).
43 stellt die DNA-Sequenz des kleinen 16S-23S-Spacer-Bereichs des Listeria-seeligeri-Serovars 4A Nr. 4268 dar (SEQ ID NO 118).
44 stellt die teilweise DNA-Sequenz des großen 16S-23S-Spacer-Bereichs aus der Teilsequenz des langen Spacer-Bereichs von Listeria ivanovii CIP 7842 dar (SEQ ID NO 119).
45 stellt die DNA-Sequenz des großen 16S-23S-Spacer-Bereichs des Listeria-monocytogenes-IHE-Serovars 4B dar (SEQ ID NO 120).
46 stellt die DNA-Sequenz des großen 16S-23S-Spacer-Bereichs des Listeria-seeligeri-Serovars 4A NR. 4268 dar (SEQ ID NO 121).
47 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Chlamydia psittaci 6BC dar (SEQ ID NO 122).
48 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Chlamydia trachomatis dar (SEQ ID NO 123).
49 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycoplasma genitalium (U. Gobel) dar (SEQ ID NO 124).
50 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycoplasma pneumoniae ATCC 29432 dar (SEQ ID NO 125).
51 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Acinetobacter baumanii LMG 1041 dar (SEQ ID NO 126).
52 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Acinetobacter calcoaceticus LMG 1046 dar (SEQ ID NO 127).
53 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Acinetobacter haemolyticus LMG 996 dar (SEQ ID NO 128).
54 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Acinetobacter johnsonii LMG 999 dar (SEQ ID NO 129).
55 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Acinetobacter junjii LMG 998 dar (SEQ ID NO 130).
56 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs des Brucella-melitensis-NIDO-Biovars 1 dar (SEQ ID NO 131).
57 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs des Brucella-suis-NIDO-Biovars 1 dar (SEQ ID NO 132).
58 stellt die DNA-Sequenz eines der 16S-23S-Spacer-Bereiche von Salmonella dublin dar (SEQ ID NO 133).
59 stellt die DNA-Sequenz eines der 16S-23S-Spacer-Bereiche von Salmonella dublin dar (SEQ ID NO 134).
60 stellt die DNA-Sequenz eines der 16S-23S-Spacer-Bereiche von Salmonella enteritidis dar (SEQ ID NO 135).
61 stellt die DNA-Sequenz eines der 16S-23S-Spacer-Bereiche von Salmonella enteritidis dar (SEQ ID NO 136).
62 stellt die DNA-Sequenz eines der 16S-23S-Spacer-Bereiche von Salmonella typhimurium dar (SEQ ID NO 137).
63 stellt die DNA-Sequenz eines der 16S-23S-Spacer-Bereiche von Salmonella typhimurium dar (SEQ ID NO 138).
64 stellt die DNA-Sequenz eines der 16S-23S-Spacer-Bereiche des Staphylococcus-aureus-Stamms UZG 5728 dar (SEQ ID NO 139).
65 stellt die DNA-Sequenz eines der 16S-23S-Spacer-Bereiche des Staphylococcus-aureus-Stamms UZG 6289 dar (SEQ ID NO 140).
66 stellt die DNA-Sequenz eines der 16S-23S-Spacer-Bereiche des Staphylococcus-aureus-Stamms UZG 6289 dar (SEQ ID NO 141).
67 stellt die DNA-Sequenz eines der 16S-23S-Spacer-Bereiche des Staphylococcus-aureus-Stamms UZG 6289 dar (SEQ ID NO 142).
68 stellt die DNA-Sequenz eines der 16S-23S-Spacer-Bereiche des Staphylococcus-aureus-Stamms UZG 6289 dar (SEQ ID NO 143).
69 stellt die DNA-Sequenz eines der 16S-23S-Spacer-Bereiche des Staphylococcus-epidermidis-Stamms UZG CNS41 dar (SEQ ID NO 144).
70 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Streptococcus mitis UZG 2465 dar (SEQ ID NO 145).
71 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Streptococcus pyogenes UZG 3671 dar (SEQ ID NO 146).
72 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Streptococcus sanguis UZG 1042 dar (SEQ ID NO 147).
73 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Streptococcus saprophyticus UZG CNS46 dar (SEQ ID NO 148).
74 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs der Streptococcus-Spezies UZG 536 (84) dar (SEQ ID NO 149).
75 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs der Streptococcus-Spezies UZG 4341 dar (SEQ ID NO 150).
76 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs der Streptococcus-Spezies UZG 457 (44B) dar (SEQ ID NO 151).
77 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs der Streptococcus-Spezies UZG 97A dar (SEQ ID NO 152).
78 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Be reichs der Streptococcus-Spezies UZG 483 (76) dar (SEQ ID NO 153).
79 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs des Brucella-abortus-NIDO-Tulya-Biovars 3 dar (SEQ ID NO 154).
80 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium ulcerans ITG 1837 und Mycobacterium marinum ITG 7732 dar (SEQ ID NO 157).
81 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium genavense ITG 8777 dar (SEQ ID NO 158).
82 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium genavense ITG 92-742 dar (SEQ ID NO 159).
83 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium genavense ITG 9500 dar (SEQ ID NO 160).
84 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-simiae-artigen ITG 7379 dar (SEQ ID NO 161).
85 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs des Mycobacterium-simiae-artigen ITG 9745 dar (SEQ ID NO 162).
86 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium xenopi ITG 4986 dar (SEQ ID NO 163).
87 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium simiae A ITG 4485 dar (SEQ ID NO 164).
88 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium simiae B ITG 4484 dar (SEQ ID NO 165).
89 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium fortuitum ITG 4304 dar (SEQ ID NO 166).
90 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium kansasii ITG 6328 dar (SEQ ID NO 167).
91 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium kansasii ITG 8698 dar (SEQ ID NO 168).
92 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium kansasii ITG 8973 dar (SEQ ID NO 169).
93 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium celatum ITG 94-123 dar (SEQ ID NO 170).
94 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium haemophilum ITG 776 dar (SEQ ID NO 171).
95 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium haemophilum ITG 778 dar (SEQ ID NO 172).
96 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium haemophilum ITG 3071 dar (SEQ ID NO 173).
97 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs von Mycobacterium chelonae ITG 94-330 und ITG 94-379 dar (SEQ ID NO 174).
98 stellt die DNA-Sequenz eines 16S-23S-Spacer-Bereichs des Yersini-enterocolitica-Stamms P95 dar (SEQ ID NO 195).
99 stellt die DNA-Sequenz eines 16S-23S-Spacer-Bereichs des Yersini-enterocolitica-Stamms P95 dar (SEQ ID NO 196).
100 stellt die DNA-Sequenz des 16S-23S-Spacer-Bereichs des Chlamydia-trachomatis-Stamms SSDZ 94 M 1961 dar (SEQ ID NO 197).
101 stellt die DNA-Sequenz eines 16S-23S-Spacer-Bereichs des Listeria-artigen Isolats MB 405 dar (SEQ ID NO 213).
102 stellt die DNA-Sequenz eines 16S-23S-Spacer-Bereichs des Listeria-artigen Isolats MB 405 dar (SEQ ID NO 214).
103 stellt die DNA-Sequenz eines 16S-23S-Spacer-Bereichs des Listeria-artigen Isolats MB 405 dar (SEQ ID NO 215).
ERLÄUTERUNG DER TABELLEN
Tabelle 1a: Eine Liste aller neuen Sonden, die vom 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich stammen.
Tabelle 1b: Eine Liste möglicher Primer zur Verwendung für taxonspezifische Amplifikationen des Spacer-Bereichs oder eines Teils davon.
Tabelle 2: Die Hybridisierungsergebnisse für Pseudomonas.
Tabelle 3: Unterschiedliche Sondenmuster, die für mycobakterielle Stammtypen erhalten werden.
Tabelle 4: Mycobacteria-Stämme, die in LiPA getestet wurden.
Tabelle 5: Die Hybridisierungsergebnisse für Listeria (Sonden LMO1, 2, LSE1, LIV1, LIS1).
Tabelle 6: Die Hybridisierungsergebnisse für Listeria (Sonden LMO3, LIS1).
Tabelle 7: Die Hybridisierungsergebnisse für Chlamydia.
Tabelle 8: Neue mycobakterielle Sonden und Hybridisierungsergebnisse.
Tabelle 9: Die Hybridisierungsergebnisse für Brucella.
Tabelle 10: Die Hybridisierungsergebnisse für Staphylococcus.
Tabelle 1a
Tabelle 1b
BEISPIEL 1: Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa ist ein bedeutendes menschliches Pathogen, gewöhnlich im Kontext einer zugrundeliegenden ernsten Krankheit. Es ist auch ein Hauptgrund für im Krankenhaus auftretende Infektionen, die typischerweise dazu neigen, gegenüber antimikrobiellen Reagenzien widerstandsfähig zu sein. Dieses gramnegative, nicht fermentative Stäbchen kann für unterschiedliche klinische Manifestationen wie Wundinfektionen, Bakteriämie, Respirations- und Harnwegsinfektionen verantwortlich sein, und ist auch ein Hauptgrund für Morbidität und Mortalität bei Patienten mit zystischer Fibrose.
Pseudomonas-Spezies werden gegenwärtig auf Basis der Wachstumseigenschaften und mehrerer biochemischer Merkmale unterschieden, was einen Zeitplan von 24 Stunden bis 72 Stunden zum Erhalt einer richtigen Identifizierung des Pathogens mit sich bringt.
Schon die Entwicklung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern verbesserte die Identifizierung von Pseudomonas-Spezies deutlich. Jüngst wurde jedoch gezeigt, dass es unter Verwendung von DNA-Sonden mit oder ohne eine vorherige Amplifikation der Ziel-DNA möglich ist, Organismen auf eine sehr empfindliche und spezifische Weise direkt in klinischen Proben nachzuweisen.
DNA-Sonden zur Untersuchung von Pseudomonas aeruginosa sind bereits beschrieben und werden hauptsächlich für die epidemiologische Typisierung verwendet (Ogle et al., 1987: Samadpour et al., 1988: McIntosh et al., 1992). Doch keine dieser Sonden wurde vom 16S-23S-Spacer erlangt.
Der 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich und ein Teil des 23S-rRNA-Gens wurden unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion für die folgenden Spezies mit konservierten Primern (oberer Primer: TGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA, SEQ ID NO 155; unterer Primer: CCTTTCCCTCACGGTACTGGT, SEQ ID NO 156) amplifiziert:

– Pseudomonas aerunigosa 5669
– Pseudomonas alcaligenes LMG 1224^T
– Pseudomonas fluorescens LMG 5167
– Pseudomonas putida LMG 2232
– Pseudomonas stutzeri LMG 2333^T
– Pseudomonas pseudoalcaligenes LMG 1225^T

Um das Klonen der erhaltenen Amplicone zu erleichtern, wurde dem unteren Primer eine Not∫-Erkennungsstelle angefügt. Nach der Reinigung und der Aufschließung des Fragments mit Not∫ wurde das Amplicon in einem EcoRV/-Not∫-aufgeschlossenen pBluescript-SK⁺-Plasmidvektor geklont.
Das Sequenzieren des 16S-23S-rRNA-Gen-Spacer-Bereichs wurde entweder unter Verwendung doppelsträngiger Plasmid-DNA in Kombination mit Primern, die sich im Plasmidvektor befanden, oder direkt an den PCR-Produkten nach der Reinigung in Kombination mit internen PCR-Primern gemäß der Didesoxy-Kettenabschluss-Chemie durchgeführt.
36 bis 40 stellen die Nukleotidsequenz der 16S-23S-rRNA-Gen-Spacer-Bereiche von den oben beschriebenen unterschiedlichen Pseudomonas-Spezies dar. Für P. fluorescens wurde nur eine teilweise Sequenzinformation erhalten.
Aus der Nukleinsäuresequenz des Spacers des P.-aeruginosa-Stamms 5669 wurden fünf Oligonukleotidsonden ausgewählt und chemisch synthetisiert. Die Sequenzen der Oligonukleotide sind die Folgenden:
Die Spezifitäts- und die Empfindlichkeitsprüfung der Oligonukleotidsonden wurden unter Verwendung eines reversen Hybridisierungsassays durchgeführt. Die genomische DNA der unterschiedlichen getesteten Bakterien wurde unter Verwendung biotinylierter Primer (Idem-Primer wie für den Klonierungsvorgang, siehe oben) amplifiziert. Das erhaltene Amplicon, das den 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich überspannt, wurde denaturiert und an einen Membranstreifen hybridisiert, auf dem die unterschiedlichen Oligonukleotidsonden in einer zeilenartigen Weise (LiPA) immobilisiert waren. Die Hybridisierung wurde in einem Gemisch aus 3 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0) und 20% Formamid (FA) bei einer Temperatur von 50°C für eine Stunde durchgeführt. Das Waschen wurde im gleichen Gemisch bei der gleichen Temperatur für 15 Minuten durchgeführt.
Die Hybride wurden unter Verwendung eines Streptavidin-Konjugats, das an alkalische Phosphatase gekoppelt war, nachgewiesen, und die Sonden wurden durch eine Niederschlagsreaktion unter Verwendung von NBT (Nitrobluetetrazolium) und BCIP (Brom-Chlor-Indolylphosphat) sichtbar gemacht.
Die mit den Sonden PA1, PA2 und PA3 erhaltenen Hybridisierungsergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben und zeigen, dass die Sonden PA1 und PA3 zu 100% für Pseudomonas aeruginosa spezifisch waren und an alle getesteten Stämme hybridisierten. Das Hybridisierungssignal mit der Sonde PA3 bei 50°C war nicht optimal, weshalb die Oligonukleotidsonde durch Anfügen einiger zusätzlicher Nukleotide an die spezifische Sonde verbessert wurde. Diese neu gestaltete Sonde ist PA5.
Die Hybridisierungsexperimente mit der Sonde PA5 bewiesen, dass diese Sonde ebenfalls eine 100%ige Spezifität und eine 100%ige Empfindlichkeit für P. aeruginosa zeigt.
Die Oligonukleotidsonde PA2 hybridisierte nur an 5 von 17 getesteten P.-aeruginosa-Stämmen. Die direkte Sequenzierung des 16S-23S-rRNA-Gen-Spacer-Bereichs der Stämme, die nicht an diese Sonden hybridisierten, zeigten eine gewisse Heterogenität zwischen unterschiedlichen Stämmen. Im Vergleich zur zuerst entwickelten Sonde PA2 wurden zwei Fehlpaarungen erkannt. Um diese Heterogenität zwischen unterschiedlichen Stämmen im Bereich der Sonde P2 zu überwinden, wurde eine neue Sonde PA4 gestaltet. Diese Sonde ist an der Stelle der Fehlpaarungen degeneriert, und einige zusätzliche Nukleotide wurden angefügt, um das Hybridisierungssignal bei 50°C zu verbessern.
Wie durch die Hybridisierungsergebnisse gezeigt wurde mit dieser degenerierten Sonde eine 100%ige Spezifität und eine 100%ige Empfindlichkeit erhalten.
Tabelle 2: Hybridisierungsergebnisse für Pseudomonas (n/m: Anzahl der positiven Stämme/Anzahl der getesteten Stämme)
(ND: nicht durchgeführt)
BEISPIEL 2: Mycobacterium
Eine Vielfalt von mycobakteriellen Spezies kann mit ernsten menschlichen Infektionen in Zusammenhang stehen. Berüchtigte Beispiele sind Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium leprae. In der jüngsten Zeit stieg man häufig auf andere Spezies wie etwa M. avium, M. intracellulare und M. kansasii als menschliche Pathogene, besonders in Wirten mit beeinträchtigter Immunität.
Folglich sollte die Labordiagnose von mycobakteriellen Infektionen nicht auf den M.-tuberculosis-Komplex beschränkt werden, sondern idealerweise die meisten anderen klinisch relevanten mycobakteriellen Spezies beinhalten.
Die Identifizierung und die Unterscheidung von pathogenen Mycobakterien auf Speziesebene durch herkömmliche Labortechniken ist im Allgemeinen schwierig und zeitaufwändig.
Um diese Probleme zu überwinden, wurden DNA-Techniken ausgeführt. Die beschriebenen Techniken erstreckten sich von der einfachen DNA-Sondierung bis zur automatisierten Sequenzanalyse. Mehrere Ansätze wurden jüngst beschrieben (Jonas et al., 1993; Frothingham und Wilson, 1993; Tomioka et al., 1993, Saito et al., 1989, Vaneechoutte et al., 1993; Telenti et al., 1993; Böddinghaus et al., 1990).
Doch diese Verfahren weisen alle ihre besonderen Nachteile auf, und die meisten davon verlassen sich immer noch auf die Kultur. Außerdem, und am wichtigsten, gestattet keine dieser Techniken einen gleichzeitigen Nachweis der unterschiedlichen klinisch relevanten mycobakteriellen Spezies in einem einzelnen Testlauf. Daneben ist die Unterscheidung besonderer Gruppen innerhalb des Mycobacterium-avium-intracellulare-Komple xes problematisch und oft sogar unmöglich.
Um die oben erwähnten Nachteile zu überwinden, wurde ein LiPA-Test entwickelt, der den gleichzeitigen und verlässlichn Nachweis und die Unterscheidung einer Anzahl von Mycobacterium-Spezies und -Gruppen gestattet. Die Sondensätze, die verwendet werden, um diese Ziele zu erreichen, wurden alle vom 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich erlangt. Die verwendeten Verfahren sind analog zu den in Beispiel 1 erwähnten.
Der 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich, und ein Teil der flankierenden Gene der 16S- und der 23S-rRNA, wurden durch PCR mit Primern, die für die Gattung Mycobacterium konserviert waren, amplifiziert. Wenigstens einer der folgenden Primer, die sich im 16S-Gen befinden, wurde als oberer Primer verwendet:
Wenigstens einer der folgenden Primer, die sich im 23S-Gen befinden, wurde als unterer Primer verwendet:
Alle oben erwähnten Primer amplifizierten den Spacer-Bereich von allen getesteten Mycobacterium-Stämmen, außer Primer MYC-P2, der für M. chelonae nicht funktionell war. Um die Empfindlichkeit des Nachweises zu steigern, wurde manchmal eine ineinandergesetzte PCR ausgeführt, wobei P5 und P4 als äußere Primer und P1 und P3 als innere Primer verwendet wurden.
Um fähig zu sein, die Sonden und Sondenkombinationen, die für unseren Zweck geeignet sind, zu gestalten und auszuwählen, wurde der 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich einer Anzahl von mycobakteriellen Stämmen sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden miteinander und mit jenen, die bereits aus der Literatur (z.B. Frothingham et al., 1993, 1994; Kempsell et al., 1992; Suzuki et al., 1988, EP-A-0 395 292; Van der Giessen et al., 1994;) oder aus öffentlich zugänglichen Datenbanken bekannt sind, verglichen. Die entsprechenden Sequenzen sind in 1 bis 35 (SEQ ID NO 76 bis SEQ ID NO 110) dargestellt.
Die von diesen Daten erlangten Sonden wurden alle in einer solchen Weise reguliert, dass das gewünschte Hybridisierungsverhalten unter Verwendung vereinheitlichter Hybridisierungs- und Waschbedingungen (d.h., 3 × SSC, 20% entionisiertes Formamid, 50°C) erhalten wurde. Der Satz der regulierten Sonden, die zur Hybridisierung an unterschiedliche mycobakterielle Stämme verwendet wurden, ist in Tabelle 1a, SEQ ID NO 1 bis 33, dargestellt. Bitte beachten Sie, dass die in diesem Beispiel verwendete Sonden-Nomenklatur eine abgekürzte der in Tabelle 1a verwendeten ist, d.h., die Buchstaben ICG wurden stets weggelassen. Nach dem spezifischen Hybridisierungsmuster, das erhalten wurde, konnten die getesteten Stämme einer der folgenden Spezies oder Speziesgruppen zugeteilt werden: dem M.-tuberculosis-Komplex, M. avium, M. intracelluare oder dem M.-intracellulare-Komplex, M. kansasii, M. chelonae und M. gordonae. Alle Stämme wurden vom Institut für Tropenmedizin, Antwerpen, Belgien, erhalten. Die unterschiedlichen Sondenmuster, die für jede Gruppe erhalten wurden, sind in Tabelle 3 veranschaulicht und nachstehend ausführlicher besprochen.
Der M.-tuberculosis-Komplex
Der M.-tuberculosis-Komplex beherbergt alle Stämme, die zu M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum und M. microti gehören. Die Sonden Mtb1, Mtb2 und Mtb3 hybridisieren mit DNA, die von allen getesteten M.-tuberculosis-Stämmen stammt. Keiner der anderen getesteten Stämme hybridisierte bei den verwendeten Bedingungen mit diesen Sonden.
Zusätzlich hybridisieren Stämme des M.-tuberculosis-Komplexes, wie es bei allen anderen getesteten mycobakteriellen Stämmen der Fall ist, entweder mit der Sonde myc1 oder mit der Sonde myc22 oder mit beiden. Die letzteren beiden Sonden sind, entweder allein oder in Kombination miteinander, als allgemeine Mycobacterium-Sonden gestaltet.
M. avium/M. paratuberculosis
Alle untersuchten Stämme von M. avium und M. paratuberculosis zeigen ein identisches Hybridisierungsmuster mit dem Sondensatz. Für diese Art von Organismen werden positive Hybridisierungssignale mit den Sonden myc1/myc22, mai1, mil11, mav1, mah1 und mav22 erhalten. Die letzteren beiden Sonden hybridisieren ausschließlich mit Stämmen von M. avium und M. paratuberculosis und können somit als speziesspezifische Sonden verwendet werden. Da die 16S-23S-Spacer-Sequenzen von M.-avium-Isolaten und M.-paratuberculosis-Isolaten identisch oder beinahe identisch sind, können diese beiden Taxa nicht voneinander unterschieden werden. Diese Feststellung unterstützt 16S-rRNA-Sequenzierungsdaten, die angeben, dass M. avium und M. paratuberculosis tatsächlich als zu einer Genospezies gehörend betrachtet werden sollten (Rogal et al., 1990), M. avium ssp. avium und M. avium ssp. paratuberculosis.
M. intracellulare und der M.-intracellulare-Komplex (MIC)
MIC-Stämme sind genotypisch höchst verwandte Orga nismen, die nach den Sequenzdaten des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs zu einem einzelnen Cluster gehören, der von anderen Mycobacterium-Spezies gesondert ist. Ihre engsten Verwandten sind M. avium und M. scrofulaceum. Beinahe alle getesteten Stämme, die im Allgemeinen als Stämme des M.-avium-Komplexes (MAC) (der frühere MAIS-Komplex) bezeichnet werden, können in der MIC-Gruppe gefunden werden. Somit umfasst die in der gegenwärtigen Erfindung definierte MIC-Gruppe die durch Frothingham und Wilson (1993) beschriebenen Stämme des MAC-Typs mit Ausnahme von MAC-G, der M. scrofulaceum zu sein scheint. Auch M.-intracellulare-Stämme sensu strictu (M. intracellulare s.s.) sind Teil dieses Clusters.
Da diese MIC-Gruppe eine ziemlich große Gruppe von Stämmen mit Untergruppen darunter, die unterschiedliche Hybridisierungseigenschaften an den Probensatz zeigen, enthält, wurde eine weitere Unterteilung in MIC-Typen ins Auge gefasst.
Typ MIC 1 beherbergt M. intracellulare s. s. zusammen mit einigen anderen MAC-Stämmen. Alle MIC-1-Typ-Isolate ohne Ausnahme hybridisieren an die folgenden Sonden: myc1/myc22, mai1 und mac1. Die folgenden Sonden können verwendet werden, um weitere Unterteilungen in der MIC-1-Gruppe vorzunehmen: mil11, min1, min2 bis 2222, mil22 und mehf1.
Stämme von M. intracellulare sensu stricto (Typ MIC 1.1.a) können durch die Sonde min1, die nur für diese Gruppe von Stämmen positiv ist, von anderen Unterarten in dieser Gruppe unterschieden werden. Alle Stämme des Typs MIC 1.1.a sind positiv, wenn sie mit der M.-intracellulare-Sonde des Gen-Probe Rapid Diagnostic Systems für MAC getestet werden.
Typ MIC 1.1.b und MIC 1.2 beherbergen Stämme, die mit M. intracellulare höchst verwandt sind. Sie können durch Verwenden der Sonden mil11 und mil22 unterschieden werden (siehe Tabelle3). Eine weitere Unterteilung in diesen Gruppen wurde nicht versucht, obwohl dies durch Verwenden der Sonden min2, min22, min222 und min2222 erreicht werden könnte. Eine weitere Unterteilung könnte aus epidemiologischen Gründen von Wert sein.
Nur zwei aus unserer Sammlung von getesteten Stämmen ordnen sich als MIC-2-Stämme ein. Einer dieser Stämme ist ein "Mycobacterium-lufu"-Stamm (ITG 4755). Das spezifische Sondenmuster, das durch diese Stämme erzeugt wurde, ist durch ein positives Hybridisierungssignal mit den folgenden Sonden gekennzeichnet: myc1/myc22, mai1, mil22, mah1 und mal1. Variable Hybridisierungsergebnisse werden mit den Sonden min2222, mac1 und mhef1 erhalten. Die anderen Sonden sind negativ. Es ist nicht unwahrscheinlich, dass sich MIC 2 letztendlich als eine heterogene Gruppe erweisen wird, wenn mehr Stämme dieser Art identifiziert sind. Die variablen Sonden können bei einer weiteren Unterscheidung helfen, wenn dies relevant werden würde.
Typ MIC 3 gruppiert eine ziemlich hohe Anzahl von MAC-Stämmen, die mit Stämmen von M. intracellulare s.s. und den meisten anderen MAC-Stämmen eher entfernt verwandet sind. Dieser Cluster sollte als auf genotypischen Ebenen von M. avium und M. intracellulare verschieden betrachtet werden. Alle MIC-3-Unterarten hybridisieren an die Sonden myc1/myc22, mai1, mil22 und mco1. Ein positives Signal mit der letzteren Sonde (mco1) ist für MIC-3-Stämme charakeristisch. Variable Hybridisierungsergebnisse werden mit den folgenden Sonden erhalten: mac1, mhef1 und mah1. MIC 3 kann durch Verwenden von drei Sonden, mth11, mth2 und mef11, weiter in vier Untergruppen unterteilt werden. Die Sonde mth2 ist für den Typ MIC 3.1 spezifisch, der eine Gruppe von höchst verwandten MAC-Stämmen umfasst, die von Menschen mit beeinträchtigter Immunität isoliert wurden. Die meisten MIC-3-Stämme befinden sich in der Unterart MIC 3.1. Letztendlich könnte dieser Gruppe von Stämmen Speziesstatus verliehen werden, wie es auch für andere Gruppen von MAC-Stämmen, die noch unbenannt sind, der Fall sein könnte. In den Unterarten MIC 3.4, MIC 3.3 und MIC 3.2 finden sich in unserer Sammlung von getesteten Stämmen nur zwei Stämme, ein Stamm bzw. ein Stamm.
Typ MIC 4 ist eine Sammlung von "MAIS"-Stämmen (einschließlich M. malmoense), die entfernt mit M. intracellulare verwandt sind. Die einzige Sonde des oben beschriebenen Satzes, die abgesehen von den allgemeinen Sonden myc1/myc22 an MIC 4 hybridisiert, ist die Sonde mai1. Diese Sonde zeigt eine breite Spezifität und hybridisiert auch mit M. avium, M. intracellulare und anderen MIC-Stämmen und M. scrofulaceum.
M. scrofulaceum
Alle getesteten M.-scrofulaceum-Stämme zeigen ein identisches Hybridisierungsmuster mit dem Sondensatz. Ein positives Signal mit der Sonde msc1 ist für M.-scrofulaceum-Stämme einzigartig. Die einzigen anderen Sonden mit einem positiven Signal für diese Spezies sind offensichtlich myc1/myc22 und auch mai1.
M. kansasii
Die Sonden mka3 und mka4 sind für M. kansasii spezifisch, d.h., am LiPA-Streifen wird ein eindeutig positives Signal erhalten, wenn in der Hybridisie rung amplifizierte DNA von den M.-kansasii-Stämmen verwendet wird, während das Signal bei allen anderen getesteten Organismen fehlt. Obwohl die Sequenzen der Sonden mka1 und mka2 mit der Zielsequenz nicht absolut komplementär sind (drei bzw. eine Fehlpaarung), erwiesen sich auch diese Sonden als nützlich, da sie unter den verwendeten Bedingungen (50°C, 3 × SSC, 20% Formamid) ausschließlich an M.-kansasii-DNA und nicht an jegliche andere getestete mycobakterielle DNA hybridisierten. Dies veranschaulicht, dass Sonden nicht notwendigerweise perfekt zum Ziel passen müssen, um nützlich zu sein, und dass Modifikationen in der Sequenz und in der Länge bis zu einem gewissen Grad gestattet sein können.
M. chelonae
Die Spezies M. chelonae umfasst Stämme von M. chelonae ssp. und M. chelonae ssp. abscessus. Der Spacer-Bereich wurde für einen Stamm jeder Subspezies sequenziert, und es wurden kleine Unterschiede bemerkt (SEQ ID NO 103 und SEQ ID NO 102). Die Sonden mch1 und mch2 hybridisieren an beide Stämme. Alle anderen Sonden mit Ausnahme von myc1/myc22 sind für diese beiden Stämme negativ.
Beim Testen der Sonden mch1 und mch2 mit zwei zusätzlichen Stämmen von M. chelonae, die in Tabelle 4 nicht angeführt sind, d.h., M. chelonae 94-379 und M. chelonae 94-330, beide vom Institut für Tropenmedizin in Antwerpen, Belgien, erhalten, schien es, dass sie nicht an die Sonde mch1 hybridisierten. Dies wurde durch Sequenzieren des Spacer-Bereichs dieser beiden Stämme (SEQ ID NO 184) bestätigt. Eine Clusteranalyse des Spacer-Bereichs mit anderen Mycobakterien zeigte, dass M.-chelonae-Stämme in zwei Gruppen unterteilt werden können. Eine dritte Sonde mch3 wurde gestaltet, um spezifisch diese zweite Gruppe von Stämmen, zu der 94-379 und 94-330 gehören, nachzuweisen.
Dies veranschaulicht, dass die Verwendung von DNA-Sonden, die vom 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich erlangt wurden, beim Unterscheiden unterschiedlicher Gruppen von Stämmen, die nach den klassischen Identifizierungsverfahren zur gleichen Spezies gehören, hilfreich sein kann, und möglicherweise dazu verwendet werden kann, neue Spezies innerhalb der Mycobakterien nachzuweisen und zu beschreiben. In diesem Fall weist mch2 alle M.-chelonae-Stämme nach, während mch1 und mch3 zwischen unterschiedlichen Untergruppen unterscheiden.
M. gordonae
Die fünf getesteten Stämme von M. gordonae hybridisieren alle an die Sonde mgo5. Positive Hybridisierungssignale werden auch mit den Sonden myc1/myc22 erhalten, und einige M.-gordonae-Stämme hybridisieren auch an die Sonden mgo1 und mgo2.
Andere mycobakterielle Spezies
Stämme, die zu anderen mycobakteriellen Stämmen als den oben erwähnten gehören, hybridisieren nur an die allgemeinen Sonden myc1/myc22. Dies zeigt an, dass diese Stämme höchstwahrscheinlich zur Gattung Mycobacterium gehören, aber nicht zu einer der Spezies oder Gruppen gehören, die unter Verwendung einer oder mehrerer der anderen beschriebenen Sonden spezifisch identifiziert werden können.
Abschließend können wir bemerken, dass gemäß den verwendeten besonderen Kombinationen von Sonden der Erfindung DNA-Sonden-Tests auf verschiedenen Ebenen bereitgestellt werden können.
Wenn alle Sonden in ein und demselben LiPA-Test verwendet werden, kann eine Unterscheidung auf der Speziesebene wie auch eine Subtypisierung von bestimmten Gruppen von Mycobakterien erreicht werden. Doch die Sondenanordnung auf einem Streifen könnte auf jene Sonden beschränkt sein, die speziesspezifisch sind, in welchem Fall die Identifizierung auf der Speziesebene durchgeführt wird. Eine weitere Verringerung der Anzahl von Sonden auf dem Streifen könnte zum spezifischen Nachweis von nur einer oder gerade einigen Spezies führen. Offensichtlich können LiPA-Streifen gestaltet werden, die nur versuchen, Stämme, z.B. jene, die zum M.-intracellulare-Komplex (MIC) gehören, zu subtypisieren. Abhängig von den bestimmten Bedürfnissen der Laboratorien, die eine Diagnose und/oder eine Typisierung von Mycobakterien durchführen, könnten alle diese unterschiedlichen Anwendungen von Wert sein. Es ist jedoch klar, dass die Menge an Informationen, die hinsichtlich der Identität der Organismen, welche in der klinischen Probe vorhanden sind, erhalten werden, durch Verwenden einer Kombination von Sonden in einem LiPA-Format verglichen mit DNA-Sonden-Tests, die nur eine einzelne Sonde verwenden, beträchtlich vermehrt wird. Für einige Gruppen, oder wenigstens für die weitere Unterteilung einiger Gruppen, könnte keine einzelne Sonde, die einzigartig an diese (Unter)gruppe hybridisiert, gestaltet werden. In diesem Fall sind nur Sondenmuster fähig, die benötigten Informationen bereitzustellen. Für diese Anwendungen ist das LiPA-Format ein vorteilhaftes Format.
Tabelle 4: Mycobacteria-Stämme, die in LiPA getestet wurden
BEISPIEL 3: Listeria
Die Listeria-Spezies sind eine Gruppe von grampositiven Stäbchen, die in der Natur weit verbreitet ist. Innerhalb dieser Gruppe scheint es, dass nur L. monocytogenes für Menschen und Tiere pathogen ist. L. monocytogenes ist der verursachende Erreger von Listeriose, die Meningitis, Fehlgeburten, Enzephalitis und Septikämie verursacht. Personen mit beeinträchtigter Immunität, neugeborene Säuglinge und schwangere Frauen sind Hochrisikogruppe für diese durch Nahrungsmittel übertragene Krankheit. Die meisten Fälle wurden durch den Verzehr von Nahrungsmitteln tierischen Ursprungs, insbesondere weicher Käse, verursacht. Daher sollte das Vorhandensein von L. monocytogenes aus Nahrungsmitteln ausgeschlossen werden. Als Sicherheitsmaßnahme ist in manchen Ländern die Abwesenheit aller Listeria-Spezies in Nahrungsmittelprodukten erforderlich.
Das klassische Identifizierungsverfahren für L. monocytogenes in Molkereiprodukten umfasst eine Anreicherungskultur für 48 Stunden und anschließend eine Koloniebildung auf einem selektiven Agar-Medium für 48 Stunden gefolgt von einem ganzen Satz von biochemischen und morphologischen Assays (Farber und Peterkin, 1991). Dieser Vorgang könnte durch die Verwendung von Gensonden sehr vereinfacht werden.
Für die Identifizierung von L. monocytogenes sind bereits mehrere DNA-Sonden beschrieben. Einige Sonden stammen von Genen, die für die Pathogenität des Organismus verantwortlich sind, zum Beispiel dem Listeriolysin-O-Gen (Datta et al., 1993) oder dem invasionsverbundenen Protein (iap) Bubert et al., 1992).
Ein im Handel erhältliches Identifizierungssystem auf Basis einer spezifischen 16S-rRNA-Sonde wurde durch GenProbe (Herman und De Ridder, 1993; Ninet et al., 1992) eingeführt.
Diese spezifischen Sonden werden als Bestätigungsassays an Kolonien, die nach der Anreicherung und der Plattierung auf einem selektiven Agar-Medium erhalten wurden, verwendet.
In der jüngsten Zeit berichteten mehrere Veröffentlichungen über die Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion zum Amplifizieren des Zielbereichs für die DNA-Sonden, was die Zeitdauer des Assays verkürzen kann, ohne die Spezifität und die Empfindlichkeit des Assays zu beeinträchtigen. Es sind unterschiedliche Primersätze beschrieben, die spezifisch L. monocytogenes amplifizieren können. Diese Primersätze wurden vom Lysteriolysin-O-Gen (Golstein Thomas et al., 1991) und dem iap-Gen (Jaton et al., 1992) erlangt.
Wir verwendeten den 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich als das Ziel für die Entwicklung einer gattungsspezifischen Sonde für Listeria und einer für Listeria monocytogenes spezifischen Sonde.
Unter Verwendung konservierter Primer, die vom 3'-Ende der 16S-rRNA und vom 5'-Ende der 23S-rRNA (die Sequenzen sind in Beispiel 1 angegeben) erlangt wurden, wurde der Spacer-Bereich unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert und anschließend unter Befolgung der gleichen Vorgänge wie in Beispiel 1 in einem passenden Plasmidvektor geklont.
Es wurden zwei Amplicone erhalten, die sich in der Länge unterschieden (800 bp und 1100 bp). Beide PCR-Fragmente wurden für die folgenden Listeria-Spezies geklont:

– Listeria monocytogenes, Serovar 4b, IHE (Instituut voor Hygiène en Epidemiologie, Belgien)
– Listeria ivanovii CIP 78.42 (Collection Natio nale de Cultures de Microorganisms de l'Institut Pasteur, Frankreich)
– Listeria seeligeri, Serovar 4a, Nr. 42.68 (Bacteriologisches Institut Südd, Versuchs- und Forschungsanstalt für Milchwirtschaft Weihenstephan, Deutschland).

Die Sequenz des Spacer-Bereichs zwischen dem 16S- und dem 23S-rRNA-Gen wurde unter Verwendung des geklonten Materials, das aus dem 800-bp-Fragment stammte, bestimmt, und dies wurde für die drei beschriebenen Listeria-Spezies durchgeführt. 41 bis 43 zeigen die Sequenzen der unterschiedlichen kurzen Spacer-Bereiche, die erhalten wurden. Die Sequenz dieses kurzen Spacer-Bereichs von L. monocytogenes wurde auch aus der EMBL-Datenbank (LMRGSPCR) abgerufen.
Auf Basis dieser Sequenzinformationen wurden die folgenden Oligonukleotide für den speziesspezifischen Nachweis ausgewählt und chemisch synthetisiert:
Außerdem wurde eine gattungsspezifische Sonde für Listeria gestaltet:
Die Oligonukleotidsonden wurden auf einem Membranstreifen immobilisiert, und im Anschluss an eine reverse Hybridisierung mit biotinylierten PCR-Fragmenten wurden die Hybride unter Verwendung einer Niederschlagsreaktion sichtbar gemacht. Die Hybridisierungsergebnisse für verschiedene Listeria-Spezies sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
Tabelle 5
Diese Hybridisierungsergebnisse zeigen, dass die Sonde LIS1 alle beschriebenen Listeria-Spezies nachweisen kann, aber auch, dass die speziesspezifischen Sonden miteinander kreuzhybridisieren. Daher konnten aus diesem kurzen Spacer-Bereich keine Sonden mit ausreichender Spezifität gefunden werden.
Für Listeria monocytogenes wurde der 16S-23S-rRNA-Gen-Spacer auch vom 1100-bp-Fragment ausgehend bestimmt. 45 zeigt die für diese Spezies erhaltene Sequenz. Diese Sequenzinformation wurde auch für L. seeligeri erhalten (siehe 46) und eine teilweise Sequenzinformation des groben Spacer-Bereichs wurde für L. ivanovii erhalten (siehe 44).
Auf Basis der Sequenzangleichung mit L. seeligeri wurde die folgende Oligonukleotidsonde ausgewählt, um spezifisch L. monocytogenes nachzuweisen:
Anfängliche Hybridisierungsergebnisse (nicht gezeigt) zeigten an, dass mit dieser L.-monocytogenes-Sonde LMO3 keine Kreuzhybridisierung mit anderen Listeria-Spezies erkennbar war, und dass alle verwendeten Listeria-Stämme an die allgemeine Sonde LIS1 hybridisierten.
Die Oligonukleotidsonden LIS1 für den Nachweis aller Listeria-Spezies und LMO3 für den spezifischen Nachweis von L. monocytogenes wurden auf einem Membranstreifen immobilisiert und an markierte Amplicone hybridisiert, die den 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich enthielten, der von unterschiedlichen Organismen erlangt wurde. Die Hybridisierungsergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
Für die Sonden LMO3 bzw. LIS1 wurde auf der Spezies- und auf der Gattungsebene eine hervorragende Spezifität und Empfindlichkeit erhalten. Tabelle 6

n.: Anzahl der getestetn Stämme

Diese beiden Sonden können für den Nachweis von Listeria-Spezies und Listeria monocytogenes direkt auf Lebensmittelproben oder nach Anreicherung der Proben in flüssiger Brühe verwendet werden. In beiden Fällen können aufgrund der enormen Hintergrundflora in diesen Proben Amplifikationsprobleme mit dem konservierten Primersatz auftreten.
Um dieses Problem zu umgehen, gestalteten wir mehrere Sätze von Primern, die aus den 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichen von Listeria-Spezies erlangt wurden.
Die Primer LIS-P1 und LIS-P2 sind obere Primer, während LIS-P3 und LIS-P4 untere Primer sind. Diese Primersätze amplifizieren den kleineren 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich wie auch den größeren Spacer von Listeria-Spezies (ausser L. gravi und L. murrayi). Falls nötig, können diese Primer in einem ineinandergesetzten PCR-Assay verwendet werden, wobei LIS-P1/LIS-P4 die äußeren Primer und LIS-P2/LIS-P3 die inneren Primer sind.
Für den spezifischen Nachweis von Listeria monocytogenes wurde die Sonde LMO-ICG-3 vom großen 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich gestaltet und erlangt. Um für einen verbesserten Nachweis dieses Pathogens direkt in Proben spezifisch nur diesen großen Spacer-Bereich zu amplifizieren, wurde ein Satz von Primern vom Teil der Sequenzinformation des großen 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs, der im kleineren rRNA-Spacer nicht vorhanden ist, erlangt. Zu diesem Zweck werden die Primer LIS-P5 und LIS-P6 als die oberen Primer verwendet, und wird LIS-P7 als der untere Primer verwendet.
Während der Bewertung der Sonden für Listeria spp. wurde ein Organismus von Käse isoliert, der nach den klassischen Bestimmungsverfahren Listeria ähnlich war. Dieses Isolat (MB 405) zeigt die folgenden Eigenschaften (ähnlich wie Listeria spp): grampositiv, Wachstum auf Oxford- und Soja-Casein-Pepton-Agar, Katalase-positiv. Der einzige Unterschied zu Listeria spp. war die Motilität, die negativ war.
Unter Verwendung der wie in Beispiel 1 beschriebenen konservierten Primer, um den 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich dieses Isolats MB 405 zu amplifizieren, wurde mit diesem Stamm das gleiche Amplicon-Muster wie mit Listeria spp. erhalten. Die Hybridisierung des Amplicons zeigte, dass mit keiner der Sonden für Listeria spp. ein Signal erhalten wurde.
Das Sequenzieren der 16S-rRNA des Isolats MB 405 und der anschließende Vergleich mit Listeria spp. und Verwandten zeigte, dass der Organismus enger mit Listeria spp. als mit jeder beliebigen anderen Spezies, die bis jetzt in der Literatur beschrieben ist, verwandt ist. Taxonomische Untersuchungen werden zeigen, ob dieses Isolat zur Gattung Listeria gehört, oder nicht. Dieses Isolat, und anschließend isolierte Organismen von der gleichen Art, werden in dieser Anmeldung als Listeriaartige Organismen bezeichnet.
Das Isolat MB 405 schien wenigstens drei unterschiedliche 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereiche zu enthalten, die geklont und sequenziert wurden. Im Anschluss an eine Angleichung mit Listeria spp. wurde eine Oligonukleotidsonde ausgewählt, um spezifisch Listeria-artige Stämme nachzuweisen:
Reverse Hybrisisierungsreaktionen dieser Sonde mit den 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichen von Listeria spp. zeigten, dass es keine Kreuzhybridisierung gab.
BEISPIEL 4: Chlamydia trachomatis
Chlamydia trachomatis ist ein kleines obligatorisches intrazelluläres gramnegatives Bakterium, das 15 Serovare (A bis K, BA, L1, L2, und L3) aufweist, die durch das Hauptprotein der äußeren Membran (MOMP) unterschieden werden, und ein kryptisches Plasmid enthält, das für das intrazelluläre Wachstum benötigt wird. Die Serovare A bis K und Ba bilden den Trachoma-Biovar, während die Serovare L1, L2 und L3 den LGV-Biovar bilden.
Die Serovare A, B, Ba und C sind gewöhnlich mit dem Trachom, der Hauptursache für vermeidbare Blindheit weltweit, verbunden. Die Serovare D bis K finden sich hauptsächlich bei sexuell übertragenen Infektionen und sind die Hauptursache für Gebärmutterhalsentzündung und Beckenentzündungskrankheiten bei Frauen und Harnröhrenentzündung und Nebenhodenentzündung bei Männern. Die Serovare L1, L2 und L3 sind mit Lymphogranuloma venereum, einer seltenen sexuell übertragenen Krankheit, verbunden.
Die Zellkultur wird als das Bewetungsverfahren für die Labordiagnose betrachtet, obwohl die Probenlebensfähigkeit während des Transports schwer aufrechtzuerhalten ist und die Labortechniken zeitaufwändig und technisch anspruchsvoll sind. Daher wurde eine Anzahl von schnelleren Testkits entwickelt, wie etwa ein Enzymimmuntest und eine direkte Fluoreszenz-Antikörper-Färbung. Doch keiner dieser Immuntests hat sich als hohe Grade an Empfindlichkeit oder Spezifität aufweisend erwiesen.
Ein nichtisotoper DNA-Sondenassay (Gen-Probe PAGE; Woods et al., 1990), der chlamydische rRNA nachweist, ist im Handel erhältlich. In der jüngsten Zeit wurde das Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis von Chlamydia-Infektionen verwendet. Der Nachweis zielte entweder auf das kryptische Plasmid (Loeffelholz et al., 1992) oder auf das opml-Gen, das für das Hauptprotein der äußeren Membran codiert (Taylor-Robinson et al., 1992). Verglichen mit anderen Techniken weist die PCR eine höhere Empfindlichkeit und Spezifität auf (Ossewaarde et al., 1992). Keine dieser Assays macht von DNA-Sonden Gebrauch, die vom 16S-23S-rRNA-Gen-Spacer-Bereich erlangt werden.
Für einen Chlamydia-trachomatis-L2- und einen Chlamydia-psittaci-6BC-Stamm wurde ein Teil des ribosomalen RNA-Cistrons, der den 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich enthält, unter Verwendung konservierter Primer amplifiziert (siehe Beispiel 1) und anschließend in einem Plasmidvektor geklont. Der 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich wurde unter Verwendung der der Didesoxy-Kettenabschluss-Chemie sequenziert.
Die Sequenz des Spacer-Bereichs beider Chlamydia-Spezies ist in 47 bis 48 gezeigt.
Auf Basis dieser Sequenzinformationen wurden die folgenden Oligonukleotidsonden chemisch synthetisiert:
Die Oligonukleotidsonden wurden in einer zeilenartigen Weise auf einem Membranstreifen immobilisiert und anschließend in einem reversen Hybridisierungsassay mit biotinylierten PCR-Produkten, die den 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich enthielten, als Ziel verwendet.
Die Hybridisierungen wurden in einer Lösung aus 3 × SSC und 20% Formamid (FA) bei einer Temperatur von 50°C durchgeführt.
Die Hybridisierungsergebnisse mit den unterschiedlichen Sonden sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
Tabelle 7
Wie in der Tabelle gezeigt sind die Sonden CHTR1, CHTR2 und CHTR3 bei einer Hybridisierungstemperatur von 50°C für Chlamydia trachomatis spezifisch und ist die Sonde CHPS1 bei der Hybridisierungstemperatur für Chlamydia psittaci spezifisch.
Mehrere klinische Isolate, die vom SSDZ, Delft, Niederlande, erhalten wurde und unter Verwendung herkömmlicher Verfahren als Chlamydia trachomatis identifiziert wurden, wurden in einem reversen Hybridisierungsassay mit den unterschiedlichen Oligonukleotidsonden getestet. Alle Chlamydia-trachomatis-spezifischen Sonden ergaben ein positives Hybridisierungssignal, und keines der Isolate reagierte mit der Chlamydia-psittaci-Sonde. Für einige klinische Isolate reagierte die Sonde CHTR2 deutlich schwächer als CHTR1 oder CHTR3. Der Spacer-Bereich eines dieser Isolate (94 M 1961) wurde sequenziert (SEQ ID NO 197) und die Sequenz zeigte eine Fehlpaarung mit der Spacer-Sequenz des Stamms L2. Aus dieser neuen Spacer-Sequenz wurde eine zusätzliche Sonde (CHTR4) erlangt:
Diese Sonde ergibt mit einigen klinischen Isolaten von Chlamydia trachomatis ein stärkeres Hybridisierungssignal als CHTR2. Sie kann allein oder in Kombination mit der Sonde CHTR2 (z.B. beide Sonden in einer LiPA-Zeile aufgebracht) verwendet werden.
Um sehr empfindliche Assays für den direkten Nachweis von Chlamydia trachomatis in klinischen Proben zu entwicklen, wurde vom 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich ein spezifischer Primersatz, CHTR-P1 (oberen Primer) und CHTR-P2 (unterer Primer), erlangt, der spezifisch den Spacer-Bereich von Chlamydia-Spezies amplifiziert.
BEISPIEL 5: Mycoplasma pneumoniae und Mycoplasma genitalium
Mycoplasmen sind eine Gruppe der kleinsten bekannten Prokaryoten, die fähig sind, in zellfreien Medien zu wachsen, keine Zellwand besitzen, und sehr kleine Genome mit einem niedrigen G + C-gehalt aufweisen. Mehr als 100 unterschiedliche Spezies wurden aus Menschen, Tieren, Pflanzen und Insekten isoliert.
In Menschen wurden Mycoplasmen entweder als pathogene Organismen oder als Kommensale erkannt. Das bekannteste Pathogen ist Mycoplasma pneumoniae, der Erreger von primär atypischer Pneumonie bei Kindern und jungen Erwachsenen. Die Diagnose von M. pneumoniae beruhte auf der direkten Isolation durch das Kulturverfahren oder auf dem Nachweis spezifischer Antikörper gegen M. pneumoniae im Serum des Patienten.
Ein anderes Pathogen, das zuerst aus Harnröhrenproben von Patienten mit nicht gonokkischer Harnröhrenentzündung isoliert wurde, wurde als Mycoplasma genitalium beschrieben. Dieses Mycoplasma weist mehrere gemeinsame Eigenschaften mit M. pneumoniae auf. Beide Spezies sind pathogen, und beide besitzen die Fähigkeit, an rote Blutkörperchen, verschiedenste Gewebezellen, Glas- und Kunststoffoberflächen anzuhaften. Außerdem teilen sich M. genitalium und M. pneumoniae Antigene, was in serologischen Tests ausgedehnte Kreuzreaktionen verursacht. Die Beobachtung, dass M. genitalium auch in Respirationstraktproben von Patienten mit Pneumonie gefunden werden konnten und aus einem Gemisch mit M. pneumoniae isoliert werden konnten, hat Fragen hinsichtlich der möglichen Pathogenität von M. genitalium aufgeworfen.
Da die Kultivierung beider Spezies zeitaufwändig ist und der Serologie Spezifität fehlt, wurden schnellere und spezifischere Assays entwickelt, um diese Mycoplasmen nachzuweisen. Die Verwendung von Hybridisierungsassays mit DNA-Sonden wurde für diese Spezies beschrieben, doch trotz guter Spezifitäten gestatten diese Tests keinen Nachweis geringer Pegel von M. pneumoniae oder M. genitalium. Daher wurden in der allerjüngsten Zeit DNA-Hybridisierungstechniken entwickelt, die die Polymerase-Kettenreaktion verwenden. Es wurde von M.-pneumoniae-spezifischen PCR-Assays berichtet, die das P1-Adhesin-Gen (Buck et al., 1992) und das 16S-rRNA-Gen (Kuppeveld et al., 1992) verwenden. Es wurden spezifische PCR-Assays für M. genitalium beschrieben, die Sequenzen vom Adhesin-Gen und vom 16S-rRNA-Gen verwenden.
Die Spacer-Sequenzen von klinischen Isolaten von M. pneumoniae und M. genitalium (erhalten von U. Göbel, Universität Freiburg, Deutschland) wurden bestimmt. Sie sind in 49 bis 50 gezeigt. Die gezeigten Sequenzen zeigen einige Unterschiede zu jenen von anderen Stämmen der gleichen Spezies, die in der EMBL-Datenbank hinterlegt waren (MPMAC bzw. MGG37). Auf Basis dieser Informationen wurden vier Sonden erlangt, eine allgemeine Mycoplasma-Sonde, zwei M.-pneumoniae-spezifische, und eine M.-genitalium-spezifische Sonde:
Die Sonden wurden auf LiPA-Streifen aufgebracht und unter Standardbedingungen (3 × SSC, 20% Formamid bei 50°C) an amplifiziertes Spacer-Material von vier M.-pneumoniae-Stämmen, einem M.-genitalium-Stamm und zweiundzwanzig Nicht-Mycoplasma-Spezies-Stämmen hybridisiert. Die allgemeine Sonde hybridisierte nur an die fünf getesteten Mycoplasma-Stämme, während die spezifischen Sonden nur an Stämme der Spezies, für die sie gestaltet waren, hybridisierten.
BEISPIEL 6: Andere mycobakterielle Spezies
Mit der ständigen Verbesserung der Labortechniken nahmen die Informationen über die Systematik und die klinische Bedeutung der sogenannten "potentiell pathogenen Umweltmycobakterien" rasch zu. Mit dem Auftreten neu erkannter Krankheiten sind zusätzliche Syndrome, die mit unterschiedlichen mycobakteriellen Spezies verbunden sind, aufgetaucht und haben hohe Wichtigkeit angenommen.
Um den wie in Beispiel 2 beschriebenen LiPA-Test für einen gleichzeitigen Nachweis von unterschiedlichen mycobakteriellen Spezies auszuweiten, wurde ein neuer Satz von DNA-Sonden gestaltet, um spezifisch die folgenden Spezies zu identifizieren: Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium genavense, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium simiae, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium malmoense, Mycobacterium celatum und Mycobacterium haemophilum.
Diese Sonden wurden von der 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich-Seequenz erlangt. Für die oben erwähnten Spezies wurden diese Informationen durch direktes Sequenzieren von PCR-Produkten oder nach dem Klonen des PCR-amplifizierten Spacer-Bereichs erhalten. Die erhaltenen Sequenzen sind in 80 bis 97, und in 38 für M. malmoense, dargestellt.
Die Sequenzen des Spacer-Bereichs der oben erwähnten mycobakteriellen Spezies wurden verglichen und an die bereits in Beispiel 2 oder in öffentlich zugänglichen Quellen beschriebenen angeglichen. Von den Bereichen der Abweichung wurden speziesspezifische DNA-Sonden gestaltet. Die Sonden wurden in einer solchen Weise ausgewählt und gestaltet, dass das gewünschte Hybridisierungsverhalten (d.h., die speziesspezifische Hybridisierung) unter den gleichen Bedingungen wie den für die anderen in Beispiel 2 erwähnten mycobakteriellen Sonden bestimmten, d.h., 3 × SSC, 20% entionisiertes Formamid, 50°C, erhalten wurde. Dies gestattet den gleichzeitigen Nachweis von wenigstens zwei, und möglicherweise allen, der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen mycobakteriellen Spezies.
Die folgenden Oligonukleotidsonden wurden von der Spacer-Bereich-Sequenz von jeweils M. ulcerans, M. genavense, M. xenopi, M. simiae, M. fortuitum, M. malmoense, M. celatum und M. haemophilum gestaltet:
Die Sonden wurden auf einem LiPA-Streifen immobilisiert und mit amplifiziertem biotinyliertem Material, das von einem Satz wie in Beispiel 2 beschriebener repräsentativer mycobakterieller Speies erlangt wurde, hybridisiert. Die Amplifikation des Spacer-Bereichs wurde durch PCR unter Verwendung eines wie in Beispiel 2 beschriebenen Primersatzes durchgeführt. Die unterschiedlichen Stämme, die für die Spezifitätsprüfung verwendet wurden, sind zusammen mit den erhaltenen Hybridisierungsergebnissen in Tabelle 8 gezeigt. Die Stämme wurden von der Sammlung des Instituts für Tropenmedizin, Antwerpen, Belgien, erhalten.
Die getesteten Sonden (MSI-ICG-1, MXE-ICG-1, MFO-ICG-1, MML-ICG-1, MML-ICG-2, MCE-ICG-1 und MHP-ICG-1) wiesen spezifisch M. simiae, M. xenopi, M. fortuitum, M, malmoense, M. celatum bzw. M. haemophilum nach und zeigten keine Kreuzhybridisierung mit den anderen getesteten mycobakteriellen Spezies. Somit gestatten diese Sonden einen spezifischen Nachweis von mycobakteriellen Spezies, die unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Satzes von DNA-Sonden nicht weiter identifizierbar waren. M. malmoense wurde in Beispiel 2 als ein "MIC-4"-Typ klassifiziert, während die anderen oben erwähnten Spezies nur an die allgemeinen Sonden MYC1/MYC22 für die Gattung Mycobacterium hybridisierten und somit in Beispiel 2 als "andere mycobakterielle Spezies" klassifiziert wurden.
Alle getesteten M.-genavense-Isolate reagierten mit MGV-ICG1 und MGV-ICG2, und nicht mit MSI-ICG1, die für M. simiae, eng mit M. genavense verwandt, gestaltet war. Eine Gruppe von "Zwischen"organismen, zwischen M. simiae und M. genavense befindlich, wurde vom Institut für Tropenmedizin, Antwerpen, Belgien, erhalten, wo sie als "M.-simiae-artige" Stämme klassifiziert waren (Stämme 4358, 4824, 4833, 4844, 4849, 4857, 4859, 7375, 7379, 7730, 9745, 94-1228). Diese Stämme reagierten nur mit der Sonde MGV-ICG2, und nicht mit der Sonde MSI-ICG1, die spezifisch M.-simiae-Stämme sensu stricto nachweist. Das Sequenzieren des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs von zwei dieser "M.-simiae-artigen" Isolate (Stämme 7379 und 9745) (siehe SEQ ID NO 161 und 162) bestätigte, dass sie enger mit M. genavense als mit M. simiae verwandt waren. Eine neue Sonde MGV-ICG3 wurde gestaltet, um spezifisch diese Gruppe von Organismen, die möglicherweise zu einer neuen Spezies gehören, nachzuweisen.
Dies veranschaulicht erneut, dass die Verwendung von DNA-Sonden, die vom 16S-23S-Spacer-Bereich erlangt wer den, beim Unterscheiden unterschiedlicher Gruppen von Stämmen, die durch klassische taxonomische Kriterien ebenfalls als nicht bestimmt festgestellt werden, hilfreich sein kann. Die Verwendung dieser DNA-Sonden kann möglicherweise zur Beschreibung neuer (Sub)spezies innerhalb der Mycobakterien führen. In diesem Fall würde die Sonde MGV-1 nur mit M.-genavense-Stämmen sensu stricto reagieren. Die Sonde MGV-3 würde nur mit den dazwischenliegenden "M.-simiae-artigen" Stämmen reagieren, und die Sonde MGV-2 würde beide Arten von Stämmen nachweisen.
Die Sonde MUL-ICG-1 ragierte mit allen getesteten M.-ulcerans-Stämmen, zeigte aber auch eine Kreuzhybridisierung mit dem M.-marinum-Stamm ITB 7732. Das Sequenzieren des Spacer-Bereichs dieses M.-marinum-Stamms zeigte in der Tat eine mit jener des M.-ulcerans-Stamms 1837 identische Sequenz (siehe 80). Die weitere Unterscheidung zwischen M. marinum und M. ulcerans kann unter Verwendung einer Sonde vom 16S-rRNA-Gen von M. ulcerans, wovon ein Teil mit dem Spacer-Bereich coamplifiziert ist, wenn die Primer MYC P1 bis P5 zur Amplifikation verwendet werden, durchgeführt werden. Eine speziesspezifische 16S-rRNA-Sonde für M. ulcerans, die unter den gleichen Hybridisierungsbedingungen wie die Spacer-Sonden für die Unterscheidung von Mycobacterium-Spezies arbeiten kann, ist zum Beispiel:
Der obige Absatz zeigt, dass es trotz der Bevorzugung, Sonden zu verwenden, die vom Spacer-Bereich erlangt werden, auch möglich und manchmal nötig ist, die Spacer-Sonden mit Sonden zu kombinieren, die von anderen Gensequenzen, z.B. dem 16S-rRNA-Gen, erlangt werden. Hier werden diese zusätzlichen Sonden erneut so ausgewählt, dass sie die gewünschten Hybridisierungseigenschaften unter den gleichen Hybridisierungs- und Waschbedingungen wie die Spacer-Sonden zeigen.
Für M. kansasii wurden zusätzliche Stämme zu den in Beispiel 2 erwähnten mit den in Beispiel 2 beschriebenen Sonden MKA-ICG-1, 2, 3 und 4 getestet. Da keine dieser Sonden völlig zufriedenstellend war, wurden für den M.-kansasii-Nachweis zusätzliche Sonden gestaltet. Daher wurde der Spacer-Bereich einiger der zusätzlichen M.-kansasii-Stämme ITG 6328, 8698 und 8973 sequenziert (siehe 90 bis 92). Diese Stämme wurden ebenfalls vom Institut für Tropenmedizin in Antwerpen, Belgien, erhalten. Offensichtlich bilden die M.-kansasii-Stämme eine ziemlich heterogene Gruppe mit bemerkenswerten Unterschieden in der Spacer-Sequenz zwischen unterschiedlichen Stämmen. Es wurden zusätzliche Sonden MKA-ICG-5, 6, 7, 8, 9 und 10 gestaltet, die alle erneut unter den gleichen Bedingungen wie den früher beschriebenen, d.h., 3 × SSC, 20% entionisiertes Formamid, 50°C, hybridisierten. Die Sonden wurden mit einer Sammlung von Teststämmen, die vom Institut für Tropenmedizin, Antwerpen, Belgien, erhalten wurden, getestet, und die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt.
Soweit getestet, hybridisiert keine der M.-kansasii-Sonden mit einer anderen Spezies als M. kansasii. Doch aufgrund des heterogenen Charakters dieser Spezies hybridisiert keine der M.-kansasii-Sonden mit allen M.-kannsasii-Stämmen. Die unterschiedlichen M.-kansasii-Sonden erkennen unterschiedliche Stämme von M. kansasii. Diese differentielle Hybridisierung kann von klinischer Bedeutung sein. Wenn andererseits ein Nachweis aller M.-kansasii-Stämme erwünscht ist, kann eine Kombination von unterschiedlichen M.-kansasii-Sonden ins Auge gefasst werden.
BEISPIEL 7: Brucella
Bruzellose ist eine sehr weit verbreitete und wirtschaftlich wichtige Tierkrankheit, die auch Menschen befällt.
Für die Identifizierung von Brucella spp. werden hauptsächlich bakteriologische und immunologische Nachweistechniken verwendet. Diese Test sind zeitaufwändig und ergeben häufig falsch positive Ergebnisse. Es werden schnelle und verlässlich Identifizierungsverfahren entwickelt, die hauptsächlich auf DNA-Amplifikation und Hybridisierung beruhen.
Der spezifische Nachweis von Brucella spp. auf Basis der Amplifikation eines 43-kDa-Proteins der äußeren Membran (Fekete A. et al., 1990) oder eines Teils des 16S-rRNA-Gens (Herman und De Ridder, 1992) wurde bereits berschrieben.
Um spezifische DNA-Sonden und Primer für den Nachweis von Brucella spp. zu entwickeln, analysierten wir den 16S-23S-rRNA-Gen-Spacer-Bereich. Unter Verwendung konservierter Primer (die Sequenzen sind in Beispiel 1 angegeben) wurde der Spacer-Bereich amplifiziert und anschließend unter Befolgung der gleichen Vorgänge wie in Beispiel 1 in den Bluescript-SK⁺-Vektor geklont.
Das erhaltene Amplicon mit einer Länge von etwa 1400 bp wurde für die folgenden Brucella-Spezies geklont:

– Brucella abortus NIDO Tulya Biovar 3 (SEQ ID NO 154)
– Brucella melitensis NIDO Biovar 1 (SEQ ID NO 131)
– Brucella suis NIDO Biovar 1 (SEQ ID NO 132)

Das HindIII-Aufschließen der Konstrukte gefolgt durch Subklonen der erhaltenen Fragmente (n = 3) erleichterte das Sequenzieren des Spacer-Bereichs für die drei beschriebenen Brucella spp..
56, 57 und 79 stellen die Sequenzen der Spacer-Bereiche dar, die für die oben erwähnten Stämme von Brucella melitensis, Brucella suis bzw. Brucella abortus erhalten wurden. Aufgrund der hohen Homologie dieser Spacer-Bereich-Sequenzen zwischen den unterschiedlichen Brucella-Spezies wurden aus diesen Sequenzinformationen keine speziesspezifischen DNA-Sonden abgeleitet und nur gattungsspezifische Sonden gestaltet.
Zu diesem Zweck wurden die folgenden Sonden chemisch synthetisiert:
Die Oligonukleotide wurden auf einem Membranstreifen immobilisiert, und im Anschluss an eine reverse Hybridisierung mit biotinylierten PCR-Fragmenten wurden die Hybride unter Verwendung einer Niederschlagsreaktion sichtbar gemacht. Die Hybridisierungsergebnisse der immobilisierten Sonden mit unterschiedlichen Brucella spp. und verwandten Organismen sind in der Tabelle 9 dargestellt.
Diese Hybridisierungsergebnisse zeigen, dass die Sonden BRU-ICG 2, BRU-ICG 3 und BRU-ICG 4 für Brucella spp. spezifisch sind und in einem reversen Hybridisierungsassay zum Nachweis dieser Pathogene verwendet werden können. Die Sonde BRU-ICG 1 kreuzhybridisiert mit Ochrobactrum-antropi- und Rhizobium-loti-Stämmen, die zwei taxonomisch höchst verwandte Organismen sind, doch von denen nicht erwartet wird, dass sie im gleichen Probenmaterial, wie es für den Brucella-Nachweis verwendet wird, vorhanden sind.
Wie in den vorhergehenden Beispielen (z.B. 3 und 4) beschrieben wurden auch für Brucella spezifische Primer vom 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich ausgewählt, um spezifisch den Spacer-Bereich von Brucella-Stämmen zu amplifizieren.
BRU-P1 und BRU-P2 werden als obere Primer verwendet, während BRU-P3 und BRU-P4 als untere Primer verwendet werden. Wenn sie in einem ineinandergesetzten PCR-Assay verwendet werden, ist die Kombination BRU-P1/BRU-P4 der äußere Primersatz, während die Kombination BRU-P2/BRU-P3 der innere Primersatz ist.
TABELLE 9

NT: = nicht getestet,
n: = Anzahl der getesteten Stämme

BEISPIEL 8: Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus ist die staphylococcale Spezies, die am häufigsten mit menschlichen und tierischen Infektionen verbunden ist. Staphylococcus-aureus-Stämme wurden als wichtige ätiologische Agenzien sowohl bei gesellschaftlich erlangten als auch bei nosokomialen Infektionen identifiziert. In der letzten Zeit scheint die nosokomiale Infektion mit methicillin-resistenten S. aureus in vielen Ländern zunehmend vorherrschend zu sein. Die Stämme, die zu dieser Spezies gehören, sind auch verursachende Agenzen für Lebensmittelverderb und -vergiftung.
Um S.-aureus-Stämme in einer schnellen und spezifischen Weise von anderen Staphylokokken zu unterscheiden, wurde die Verwendung von Molekulartechniken auf Basis von DNA-Sonden und/oder PCR bereits in der Literatur beschrieben. Beispiele für Zielgene, die für die Entwicklung dieser Assays auf DNA-Basis verwendet werden, sind das 16S-rRNA-Gen (De Buyser et al., 1992; Geha et al., 1994), das mecA-Gen (Ubukata et al, 1992; Shimaoka et al., 1994) und das nuc-Gen (Brakstad et al., 1992; Chesneau et al., 1993).
Als Ziel für die Entwicklung spezifischer DNA-Sonden wählten wir den 16S-23S-rRNA-Gen-Spacer-Bereich. Eine Amplifikation unter Verwendung konservierter Primer, die vom 16S- und vom 23S-rRNA-Gen erlangt wurden (Sequenzen siehe Beispiel 1), zeigten, dass das erhaltene Muster nicht in allen getesteten S.-aureus-Stämmen gleichartig war. Zahlreiche Schwankungen wurden entweder in der Anzahl der erhaltenen Fragmente oder in der Größe dieser unterschiedlichen Fragmente festgestellt.
Ein Spacer-Bereich von Stamm UZG 5728 und vier Spacer-Bereiche (die sich in der Länge unterschieden) vom Stamm UZG 6289 wurden in den Bluescript-SK⁺-Vektor geklont und anschließend sequenziert. Die Sequenzen sind in 64 bis 68 (SEQ ID NO 139 bis SEQ ID NO 143) dargestellt. Für die Entwicklung spezifischer DNA-Sonden wurden diese unterschiedlichen Spacer-Bereiche miteinander und mit dem Spacer-Bereich, der vom Staphylococcus-epidermidis-Stamm UZG CNS41 (SEQ ID NO 144) erlangt wurde, verglichen.
Die folgenden Sonden wurden chemisch synthetisiert:
Die Oligonukleotide wurden auf einem Membranstreifen immobilisiert, und im Anschluss an eine reverse Hybridisierung mit biotinylierten PCR-Fragmenten wurden die Hybride unter Verwendung einer kolorimetrischen Niederschlagsreaktion sichtbar gemacht.
Die Hybridisierungsergebnisse der immobilisierten Sonden mit verschiedenen Staphylococcus spp. und nicht-staphylococcalen Organismen sind in Tabelle 10 dargestellt.
Diese Hybridisierungsergebnisse zeigen, dass nur die Sonden STAU-ICG 3 und STRU-ICG 4 für Staphylococcus-aureus-Stämme spezifisch sind. Die Sonde STAU-ICG 1 reagiert mit allen getesteten Staphylococcus spp. und die Sonde STAU-ICG 2 kreuzhybridisiert mit dem Stamm S. lugdinensis. Weder die Sonde STAU-ICG 3 noch die Sonde STAU-ICG 4 weist alle getesteten S.-aureus-Stämme nach, doch wenn beide Sonden gleichzeitig in einem LiPA-Assay verwendet werden, hybridisieren alle getesteten S.-aureus-Stämme mit einer dieser Sonden oder mit beiden.
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Claims

Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung mindestens eines Mikroorganismus oder zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer Mikroorganismen in einer Probe, wobei man bei dem Verfahren (i) die Polynukleinsäuren aus dem nachzuweisenden Mikroorganismus bzw. den nachzuweisenden Mikroorganismen in der Probe freisetzt, isoliert und/oder aufkonzentriert; (ii) den 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereich oder einen Teil davon nötigenfalls aus dem nachzuweisenden Mikroorganismus bzw. den nachzuweisenden Mikroorganismen mit wenigstens einem geeigneten Primerpaar amplifiziert; (iii) gleichzeitig eine Hybridisierung der Polynukleinsäuren aus Schritt (i) oder (ii) mit einem wenigstens zwei Sonden umfassenden Sondensatz bei einer Hybridisierungs- und Waschtemperatur von 50°C in einem Hybridisierungs- und Waschmedium von 3 × SSC und 20% Formamid durchführt, wobei die Sonden ausgewählt sind aus den Sequenzen:

oder Äquivalenten davon, wobei die äquivalenten Sonden eine Sequenz aufweisen, die sich von einer der genannten SEQ ID NOs durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an eines bzw. von einem der äußersten Enden der Sonde unterscheidet; (iv) die in Schritt (iii) gebildeten Hybride nachweist; (v) den in der Probe vorhandenen Mikroorganismus bzw. die in der Probe vorhandenen Mikroorganismen anhand der in Schritt (iv) erhaltenen differentiellen Hybridisierungssignale identifiziert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Probe aus dem Respirationstrakt stammt und wobei der Sondensatz mit der in Schritt (iii) angegebenen Bedeutung wenigstens eine unter den folgenden Spacer-Sonden gewählte Sonde:

sowie eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei der Probe um eine dem Liquor entnommene Probe handelt und wobei der Sondensatz, wie er in Schritt (iii) beschrieben ist, wenigstens eine unter den folgenden Spacer-Sonden gewählte Sonde:
sowie eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Probe aus dem Urogenitaltrakt stammt und wobei der Sondensatz, wie er in Schritt (iii) beschrieben ist, wenigstens eine unter den folgenden Spacer-Sonden gewählte Sonde:
sowie eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Probe aus Lebensmitteln stammt und wobei der Sondensatz mit der in Schritt (iii) angegebenen Bedeutung wenigstens eine unter den folgenden Spacer-Sonden gewählte Sonde:

sowie eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Probe aus dem Gastrointestinaltrakt eines Patienten stammt und wobei der Sondensatz mit der in Schritt (iii) angegebenen Bedeutung wenigstens eine unter den folgenden Spacer-Sonden gewählte Sonde:

sowie eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Stämme von Mycobacterium-Spezies und -Subspezies in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:

sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 7 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Stämme des Mycobacterium-tuberculosis-Komplexes in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 7 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-Stämme aus dem MAIS-Komplex, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:

sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 9 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer M.-avium- und M.-paratuberculosis-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 9 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-intracellulare-Stämme und MIC-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:

sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 9 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-intracellulare-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an die folgende Sonde:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonde umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von der oben zitierten Sequenz durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 9 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium- scrofulaceum-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an die folgende Sonde:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonde umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von der oben zitierten Sequenz durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 7 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-kansasii-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 7 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium- chelonae-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 7 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-gordonae-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 7 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-ulcerans-Stämme oder M.-marinum-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an die folgende Sonde:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonde umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von der oben zitierten Sequenz durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 7 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-genavense-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 7 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-xenopi-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an die folgende Sonde:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonde umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von der oben zitierten Sequenz durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 7 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-simiae-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an die folgende Sonde:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonde umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von der oben zitierten Sequenz durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 7 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-fortuitum-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 7 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-celatum-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an die folgende Sonde:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonde umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von der oben zitierten Sequenz durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 7 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-haemophilum-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an die folgende Sonde:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonde umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von der oben zitierten Sequenz durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 7 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycobacterium-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycoplasma-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 25 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycoplasma-pneumoniae-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 25 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Mycoplasma-genitalium-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an die folgende Sonde:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonde umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von der oben zitierten Sequenz durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Pseudomonas-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 28 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Pseudomonas- aeruginosa-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Staphylococcus-Spezies in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 30 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Staphylococcus-aureus-Stämme, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine und vorzugsweise an beide der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Acinetobacter-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 32 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Acinetobacter- baumanii-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Listeria-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 34 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Listeria-monocytogenes-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Brucella-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Salmonella-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Chlamydia-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 38 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Chlamydia-trachomatis-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 38 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Chlamydia-psittaci-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens die folgende Sonde:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonde umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von der oben zitierten Sequenz durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zum spezifischen Nachweis und zur spezifischen Identifizierung von Chlamydia trachomatis in einer Probe, wobei Schritt (ii) die Amplifikation des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs oder eines Teils davon unter Verwendung wenigstens eines der folgenden Primer:
oder von Äquivalenten dieser Primer umfaßt, wobei sich die äquivalenten Primer in ihrer Sequenz durch die Änderung eines oder mehrerer Nukleotide von den oben erwähnten Primern unterscheiden, vorausgesetzt, daß der Spacer-Bereich von Chlamydia trachomatis oder ein Teil davon noch spezifisch von den äquivalenten Primern amplifiziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zum spezifischen Nachweis und zur spezifischen Identifizierung von Listeria-Spezies in einer Probe, wobei Schritt (ii) die Amplifikation des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs oder eines Teils davon unter Verwendung wenigstens eines der folgenden Primer:
oder von Äquivalenten dieser Primer umfaßt, wobei sich die äquivalenten Primer in ihrer Sequenz durch die Änderung eines oder mehrerer Nukleotide von den oben erwähnten Primern unterscheiden, vorausgesetzt, daß der Spacer-Bereich von Listeria-Spezies oder ein Teil davon noch spezifisch von den äquivalenten Primern amplifiziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zum spezifischen Nachweis und zur spezifischen Identifizierung von Mycobacterium-Spezies in einer Probe, wobei Schritt (ii) die Amplifikation des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs oder eines Teils davon unter Verwendung wenigstens eines der folgenden Primer:
oder von Äquivalenten dieser Primer umfaßt, wobei sich die äquivalenten Primer in ihrer Sequenz durch die Änderung eines oder mehrerer Nukleotide von den oben erwähnten Primern unterscheiden, vorausgesetzt, daß der Spacer-Bereich von Mycobacterium-Spezies oder ein Teil davon noch spezifisch von den äquivalenten Primern amplifiziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Nachweis und zur Identifizierung eines oder mehrerer Yersinia-enterocolitica-Stämme in einer Probe, wobei Schritt (iii) die Hybridisierung an wenigstens eine der folgenden Sonden:
sowie an eine zweite, unter den in Anspruch 1 angegebenen Sequenzen gewählte Sonde oder an Äquivalente dieser Sonden umfaßt, wobei sich die äquivalenten Sonden von einer der oben zitierten Sequenzen durch das Anfügen oder Entfernen eines Nukleotids an einem der äußersten Enden unterscheiden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zum spezifischen Nachweis und zur spezifischen Identifizierung von Brucella-Spezies in einer Probe, wobei Schritt (ii) die Amplifikation des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs oder eines Teils davon unter Verwendung wenigstens eines der folgenden Primer:
oder von Äquivalenten dieser Primer umfaßt, wobei sich die äquivalenten Primer in ihrer Sequenz durch die Änderung eines oder mehrerer Nukleotide von den oben erwähnten Primern unterscheiden, vorausgesetzt, daß der Spacer-Bereich von Brucella-Spezies oder ein Teil davon noch spezifisch von den äquivalenten Primern amplifiziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zum spezifischen Nachweis und zur spezifischen Identifizierung von Yersinia-enterocolitica-Spezies in einer Probe, wobei Schritt (ii) die Amplifikation des 16S-23S-rRNA-Spacer-Bereichs oder eines Teils davon unter Verwendung wenigstens eines der folgenden Primer:
oder von Äquivalenten dieser Primer umfaßt, wobei sich die äquivalenten Primer in ihrer Sequenz durch die Änderung eines oder mehrerer Nukleotide von den oben erwähnten Primern unterscheiden, vorausgesetzt, daß der Spacer-Bereich von Yersinia-enterocolitica- Spezies oder ein Teil davon noch spezifisch von den äquivalenten Primern amplifiziert wird.
Zusammensetzung, die wenigstens zwei der Sonden mit der in den Ansprüchen 1 bis 40 und 46 angegebenen Bedeutung umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zur reversen Hybridisierung, wobei die Sonden aus Schritt (iii) auf einer bekannten Stelle auf einem festen Träger, stärker bevorzugt auf einem Membranstreifen immobilisiert werden.
Kit zum Nachweis und zur Identifizierung wenigstens eines Mikroorganismus oder zum gleichzeitigen Nachweis und zur gleichzeitigen Identifizierung mehrerer Mikroorganismen in einer Probe, wobei der Kit die folgenden Komponenten umfaßt: (i) gegebenenfalls wenigstens ein geeignetes Primerpaar, um die Amplifikation des 165-23S-rRNA-Spacer-Bereichs oder eines Teils davon zu gestatten; (ii) wenigstens zwei der Sonden mit der in den Ansprüchen 1 bis 40 und 46 angegebenen Bedeutung; (iii) einen Puffer oder zur Herstellung des Puffers notwendige Komponenten, wodurch eine Hybridisierungsreaktion zwischen den Sonden und den in der Probe vorhandenen Polynukleinsäuren oder den amplifizierten Produkten davon ermöglicht wird; (iv) eine Lösung oder zur Herstellung der Lösung notwendige Komponenten, wodurch das Waschen der gebildeten Hybride unter den entsprechenden Waschbedingungen ermöglicht wird; (v) gegebenenfalls ein Mittel zum Nachweis der aus der vorhergehenden Hybridisierung erhaltenen Hybride.