ES2250971T3 - Deteccion, identificacion y diferenciacion simultaneas de taxones eubacterianos utilizando un ensayo de hibridacion. - Google Patents
Deteccion, identificacion y diferenciacion simultaneas de taxones eubacterianos utilizando un ensayo de hibridacion.Info
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- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA DETECCION E IDENTIFICACION DE AL MENOS UN MICROORGANISMO, O PARA LA DETECCION SIMULTANEA DE VARIOS MICROORGANISMOS EN UNA MUESTRA, QUE COMPRENDE LOS PASOS DE: (I) SI FUERA NECESARIO LIBERAR, AISLAR O CONCENTRAR LOS ACIDOS POLINUCLEICOS PRESENTES EN LA MUESTRA; (II) SI FUERA NECESARIO AMPLIAR LA REGION SEPARADORA DE RARN 16S23S, O UNA PARTE DE ESTA, CON AL MENOS UN PAR CEBADOR ADECUADO, (III) HACER HIBRIDOS LOS ACIDOS POLINUCLEICOS DEL PASO (I) O (II) CON AL MENOS UNA Y PREFERIBLEMENTE MAS DE UNA DE LAS SONDAS SEPARADORAS COMO SE MENCIONA EN LA TABLA 1A O EQUIVALENTES DE LAS MISMAS, BAJO CONDICIONES DE HIBRIDACION Y LAVADO APROPIADAS, Y/O CON UNA SONDA DE TAXONA ESPECIFICA DERIVADA DE CUALQUIERA DE LAS SECUENCIAS SEPARADORAS COMO SE REPRESENTA EN LAS FIGURAS 1-103 BAJO LAS MISMAS CONDICIONES DE HIBRIDACION Y LAVADO; (IV) DETECTAR LOS HIBRIDOS FORMADOS EN EL PASO (III) CON CADA UNA DE LAS SONDAS UTILIZADAS BAJO CONDICIONES DE HIBRIDACION Y LAVADO APROPIADAS; (V) IDENTIFICAR EL MICROORGANISMO(S) PRESENTE(S) EN LA MUESTRA DE LAS SEÑALES DE HIBRIDACION DIFERENCIALES OBTENIDAS EN EL PASO (IV).
Description
Detección, identificación y diferenciación
simultáneas de taxones eubacterianos utilizando un ensayo de
hibridación.
La presente invención se refiere a sondas de
ácido nucleico derivadas de la región espaciadora entre los genes
16S y 23S de ácido ribonucleico ribosómico (rRNA), a utilizar para
la detección específica de organismos eubacterianos en una muestra
biológica por un procedimiento de hibridación, así como a
iniciadores de ácido nucleico a utilizar para la amplificación de
dicha región espaciadora de organismos eubacterianos en una muestra
biológica. La presente invención se refiere también a nuevas
secuencias de región espaciadora de las cuales pueden derivarse
dichas sondas o dichos iniciadores.
Desde el advenimiento de la reacción en cadena de
la polimerasa y algunas otras técnicas de amplificación de ácido
nucleico, el impacto de la tecnología de sondas de DNA en el
diagnóstico de micro-organismos en muestras
biológicas de todo tipo está aumentando. Por ser a menudo más
específico y potencialmente más sensible - si se utiliza un sistema
adecuado de amplificación y/o detección - el enfoque de las sondas
de DNA puede reemplazar con el tiempo las técnicas de identificación
convencionales.
La fiabilidad de los ensayos basados en ácido
nucleico depende esencialmente de la sensibilidad y especificidad de
las sondas y/o iniciadores utilizados. Así, la piedra angular de
este tipo de ensayo es la identificación de secuencias de ácido
nucleico que sean exclusivas par el grupo de organismos de
interés.
La mayoría de los ensayos basados en ácido
nucleico descritos en la bibliografía y/o disponibles comercialmente
apuntan a la detección de solamente un organismo particular en una
muestra biológica. Dado que la mayoría de las muestras biológicas
pueden contener usualmente una gran diversidad de
micro-organismos clínicamente relevantes, tienen que
realizarse una multitud de ensayos separados para detectar todos los
organismos relevantes posiblemente presentes. Este enfoque sería muy
costoso y laborioso, y consumiría mucho tiempo. Por consiguiente,
el número de ensayos realizados actualmente en la mayoría de los
laboratorios de diagnósticos rutinarios sobre una muestra particular
se restringe a la detección de sólo un pequeño número de los
organismos más relevantes. Por consiguiente sería extremadamente
conveniente tener acceso a un sistema que permita la detección
rápida, fácil y simultánea de una multitud de organismos diferentes.
Cuanto mayor fuese el número de organismos que puedan escrutarse en
el mismo ensayo, tanto más eficaz en costes sería el
procedimiento.
Como se ha expuesto en documentos publicados
anteriormente, la región espaciadora situada entre el gen 16S de
rRNA y el gen 23S de rRNA, a la que se hace referencia también como
el espaciador interno transcrito (ITS), es una región diana
ventajosa para el desarrollo de sondas para detección de organismos
patógenos de origen bacteriano (Solicitud Internacional WO 91/16454;
Rossau et al., 1992; documento EP-A 0 395
292).
Una de sus ventajas más apreciadas es que
secuencias exclusivas de una gran diversidad de taxones bacterianos
pueden encontrarse en un área muy limitada del genoma bacteriano.
Esta característica permite un diseño ventajoso de
"paneles-sonda" que permite la detección
simultánea de una serie de organismos posiblemente presentes en un
tipo particular de una muestra biológica. Además, al estar
flanqueados por secuencias nucleotídicas conservadas
cuasi-universalmente - localizadas más
particularmente en la parte 3' del gen 16S de rRNA y la parte 5' del
gen 23S de rRNA respectivamente - casi todos los espaciadores pueden
amplificarse simultáneamente con una serie limitada de iniciadores
de amplificación. Alternativamente, series específicas de
iniciadores pueden derivarse de las secuencias espaciadoras
propiamente dichas, permitiendo de este modo amplificaciones
específicas de especie o
grupo.
grupo.
La región espaciadora 16S-23S de
rRNA es un tramo relativamente corto (aproximadamente 200 a 1000
pares de bases) de DNA presente en una o múltiples copias en el
genoma de casi todos los organismos eubacterianos. Si están
presentes copias múltiples en el genoma de una sola bacteria, estas
copias pueden ser idénticas (como sucede muy probablemente en
algunas especies de Neisseria) o pueden diferir unas de otras
(como sucede para E. coli). Esta diferencia puede estar
limitada a un pequeño número de nucleótidos, pero también pueden
estar presentes deleciones e inserciones de longitud
considerable.
Hasta ahora, se han descrito y están disponibles
públicamente sondas espaciadoras para un número limitado de
organismos, muchos de los cuales se describieron en la Solicitud
Internacional WO 91/16454. Como se ha descrito arriba, sería muy
ventajoso poder detectar simultáneamente un panel de organismos
patógenos; v.g. un panel de organismos patógenos presentes
posiblemente en el mismo tipo de muestra biológica, o un panel de
organismos patógenos causantes posiblemente del mismo tipo de
síntomas de enfermedad, que son difíciles de diferenciar clínica y/o
bioquímicamente, o un panel de organismos pertenecientes al mismo
taxón. A fin de hacer los diferentes paneles lo más completos
posible, se requieren sondas o series de sondas adicionales
localizadas en la región espaciadora y que permitan la
identificación de al menos los grupos o especies bacterianos
siguientes:
- -
- especies de Mycobacterium
- -
- especies de Listeria
- -
- especies de Chlamydia
- -
- especies de Acinetobacter
- -
- especies de Mycoplasma
- -
- especies de Streptococcus
- -
- especies de Staphylococcus
- -
- especies de Salmonella
- -
- especies de Brucella
- -
- especies de Yersinia
- -
- especies de Pseudomonas.
Estas sondas espaciadoras adicionales precisan
diseñarse meticulosamente a fin de poder ser utilizadas
simultáneamente con al menos otra sonda, en las mismas condiciones
de hibridación y lavado, permitiendo la detección de un panel de
organismos particular.
Por consiguiente, la finalidad de la presente
invención es seleccionar sondas o series de sondas que tienen como
diana la región espaciadora 16S-23S de rRNA, y que
permiten la detección e identificación de al menos uno, y con
preferencia más de uno, de los micro-organismos
arriba mencionados. Las sondas o series de sondas se seleccionan de
tal manera que puedan utilizarse en combinación con al menos otra
sonda, preferiblemente procedente también de la región espaciadora
16S-23S de rRNA, en las mismas condiciones de
hibridación y lavado, para permitir posiblemente la detección
simultánea de varios micro-organismos en una
muestra.
Es también un objetivo de la presente invención
proporcionar un método de hibridación rápido y fiable para detección
e identificación de al menos un micro-organismo en
una muestra, o para la detección e identificación simultáneas de
varios micro-organismos en una muestra.
Es más particularmente un objetivo de la presente
invención proporcionar un método de hibridación que permite la
detección e identificación simultáneas de una serie de
micro-organismos, que están posiblemente presentes
en un tipo particular de muestra.
Es más particularmente un objetivo de la presente
invención proporcionar sondas o series de sondas para la posible
detección simultánea de micro-organismos en una
muestra procedente del tracto respiratorio.
Es otro objetivo particular de la presente
invención proporcionar sondas o series de sondas para la posible
detección simultánea de micro-organismos en muestra
procedente de fluido cerebroespinal.
Es otro objetivo particular adicional de la
presente invención proporcionar sondas o series de sondas para la
posible detección simultánea de micro-organismos en
una muestra procedente del tracto urogenital.
Es todavía otro objetivo particular de la
presente invención proporcionar sondas o series de sondas para la
posible detección simultánea de micro-organismos en
una muestra tomada del tracto gastro-intestinal de
un paciente.
Es otro objetivo particular de la presente
invención proporcionar sondas o series de sondas para la posible
detección simultánea de micro-organismos en una
muestra procedente de alimentos o de muestras ambientales.
Es adicionalmente un objetivo de la presente
invención proporcionar un método para la detección e identificación
de un taxón particular en una muestra, o una serie de taxones
particulares, siendo dicho taxón o bien un género completo, o un
subgrupo dentro de un género, una especie o incluso subtipos dentro
de una especie (subespecies, serovars, secuevars, biovars, ...).
Es más particularmente un objetivo de la presente
invención proporcionar sondas o series de sondas para la detección
de especies y subespecies de Mycobacterium, más
particularmente para la detección de cepas complejas de M.
tuberculosis, cepas de Mycobacterium procedentes del
complejo MAIS, M. avium y M. paratuberculosis, M.
intracellulare y análogas a M. intracellulare, M.
scrofulaceum, M. kansasii, M. chelonae, M. gordonae, M. ulcerans, M.
genavense, M. xenopi, M. simiae, M. fortuitum, M. malmoense, M.
celatum y M. haemophilum.
Es también una finalidad de la presente invención
proporcionar sondas o series de sondas para la detección de cepas de
Mycoplasma, más particularmente de M. pneumoniae y
M. genitalium.
Es también un objetivo de la presente invención
proporcionar sondas o series de sondas para la detección de cepas de
Pseudomonas, más particularmente P. aeruginosa.
Es también un objetivo de la presente invención
proporcionar sondas o series de sondas para la detección de especies
de Staphylococcus, más particularmente S. aureus y
S. epidermidis.
Es también un objetivo de la presente invención
proporcionar sondas o series de sondas para la detección de cepas de
Acinetobacter, más particularmente A. baumanii.
Es también un objetivo de la presente invención
proporcionar sondas o series de sondas para la detección de cepas de
Listeria, más particularmente Listeria
monocytogenes.
Es también un objetivo de la presente invención
proporcionar sondas o series de sondas para la detección de cepas de
Brucella.
Es también un objetivo de la presente invención
proporcionar sondas o series de sondas para la detección de cepas de
Salmonella.
Es también un objetivo de la presente invención
proporcionar sondas o series de sondas para la detección de cepas de
Chlamydia, más particularmente C. trachomatis y C.
psittaci.
Es también un objetivo de la presente invención
proporcionar sondas o series de sondas para la detección de cepas de
Streptococcus.
Es también un objetivo de la presente invención
proporcionar sondas o series de sondas para la detección de cepas de
Yersinia enterolitica.
Es también un objetivo de la presente invención
proporcionar iniciadores que permiten la amplificación específica de
la región espaciadora 16S-23S de rRNA para ciertos
organismos. Más particularmente, es un objetivo de la presente
invención proporcionar iniciadores para la amplificación específica
de la región espaciadora de cepas de Mycobacterium, Chlamydia,
Listeria, Brucella y Yersinia enterolitica.
Es también un objetivo de la presente invención
proporcionar kits para detección de al menos un organismo en una
muestra en los cuales se utilizan sondas y/o iniciadores.
Debe indicarse que para un pequeño número de los
organismos arriba mencionados se han publicado ya secuencias
espaciadoras en la bibliografía o en bancos de datos accesibles al
público.
Sin embargo, debe aclararse que las secuencias de
región espaciadora expuestas en la presente invención (Figs.
1-103) son nuevas y, en el caso en que dichas
secuencias proceden de las mismas especies que aquéllas de las
cuales ha sido ya descrita una secuencia espaciadora en la técnica
anterior, difieren en cierto grado de las secuencias ya
des-
critas.
critas.
Además, es el objetivo principal de la presente
invención seleccionar, a partir de la recopilación de datos de
secuencias en regiones espaciadoras, sondas y series de sondas
específicas que permiten la detección e identificación de un panel
particular de organismos, se trate de los organismos pertenecientes
a un taxón común, o de los organismos posiblemente presentes en el
mismo tipo de muestra.
El procedimiento de selección está constituido
usualmente por una parte teórica y una parte experimental. Ante
todo, las diferentes secuencias espaciadoras precisan ser alineadas
con las de los "vecinos más próximos" o con las secuencias
espaciadoras de otros micro-organismos posiblemente
presentes en la misma muestra. Esto requiere por supuesto la
determinación de la secuencia de la región espaciadora, como se
describe en los ejemplos. A partir de la alineación, pueden
definirse regiones de divergencia, a partir de las cuales se diseñan
sondas con características de hibridación deseadas, de acuerdo con
directrices conocidas por los expertos en la técnica y especificadas
con mayor detalle más adelante.
En segundo lugar, las sondas diseñadas precisan
ser ensayadas experimentalmente y evaluadas en cuanto a su utilidad
en condiciones de hibridación específicas y/o en combinación con
otras sondas. El test experimental puede hacerse de acuerdo con
cualquier método de hibridación conocido en la técnica, pero un
ensayo preferido para el test simultáneo de diferentes sondas en las
mismas condiciones es el ensayo de hibridación inversa. Un formato
específico para la hibridación inversa de diferentes sondas
utilizadas simultáneamente en la presente invención es el LiPA (Line
Probe Assay) que se describe más adelante.
En el test experimental, un comportamiento
inesperado de hibridación puede indicar en qué momento las sondas se
hibridan al ácido nucleico diana, y pueden requerirse adaptaciones
específicas de sondas.
Además, la especificidad y sensibilidad de las
sondas precisan ser ensayadas con una gran colección de cepas, tanto
pertenecientes al taxón a detectar como pertenecientes a otros
taxones. Debido a la heterogeneidad del genoma en la región
espaciadora, o a la existencia de regiones espaciadoras múltiples
con secuencias diferentes en el mismo organismo, es en muchos casos
necesario secuenciar regiones espaciadoras de cepas adicionales, o
secuenciar regiones espaciadoras adicionales en la misma cepa, y
rediseñar las sondas de acuerdo con los nuevos datos de secuencia a
fin de obtener una mejor sensibilidad y/o especificidad (véase v.g.
el Ejemplo 3). En algunos casos puede ser necesario o preferible
utilizar varias sondas para el mismo organismo (véase, v.g., los
Ejemplos 2 y 7). Asimismo, después de la secuenciación de la región
espaciadora, algunos organismos pueden exhibir una (falta de)
interrelación inesperada, lo que puede conducir a una revisión de la
clasificación de cepas contraria a los criterios taxonómicos
clásicos (véanse, v.g., los Ejemplos 2 y 7).
En conclusión, la parte experimental del
procedimiento de selección de sondas es indispensable y
complementaria para la parte teórica. El diseño de sondas,
especialmente en las condiciones fijadas de la hibridación inversa
(las mismas condiciones para cada sonda) no es directo y las sondas
tienen que evaluarse meticulosamente antes de poder ser utilizadas
en un formato de hibridación inversa. Por ello, las sondas no
siempre pueden derivarse simplemente sobre una base teórica a partir
de una secuencia génica conocida.
Para el diseño de sondas con características
deseadas pueden seguirse las líneas orientativas útiles
siguientes.
Dado que la extensión y especificidad de
reacciones de hibridación tales como las descritas en esta memoria
están afectadas por numerosos factores, la manipulación de uno o más
de dichos factores determinará la sensibilidad y especificidad
exactas de una sonda particular, tanto si es perfectamente
complementaria a su diana como si no lo es. La importancia y el
efecto de diversas condiciones de ensayo, explicados adicionalmente
en esta memoria, son conocidos por los expertos en la técnica.
En primer lugar, la estabilidad del híbrido de
ácido nucleico [sonda: diana] debe seleccionarse de manera que sea
compatible con las condiciones del test. Esto puede realizarse por
evitación de secuencias largas ricas en A y T, por terminación de
los híbridos con pares de bases G:C, y por diseño de la sonda con un
valor Tm apropiado. Los puntos iniciales y finales de la sonda deben
seleccionarse de tal modo que la longitud y el % de GC den como
resultado un valor Tm de aproximadamente 2-10ºC más
alto que la temperatura a la cual se realizará el ensayo final. La
composición básica de la sonda es importante dado que los pares de
bases G-C exhiben mayor estabilidad térmica en
comparación con los pares de bases A-T debido a
enlaces de hidrógeno adicionales. Así pues, una hibridación que
implique ácidos nucleicos complementarios de mayor contenido en
G-C será estable a temperaturas más
altas.
altas.
Condiciones tales como la concentración iónica y
la temperatura de incubación en las cuales va a utilizarse una sonda
deben tenerse también en cuenta en la construcción de una sonda. Es
sabido que la hibridación aumentará a medida que aumenta la
concentración iónica de la mezcla de reacción, y que la estabilidad
térmica de los híbridos aumentará con la concentración iónica
creciente. Por otra parte, los reactivos químicos, tales como
formamida, urea, DMSO y alcoholes, que rompen los enlaces de
hidrógeno, aumentarán la severidad de la hibridación. La
desestabilización de los enlaces de hidrógeno por tales reactivos
puede reducir notablemente el valor Tm. En general, la hibridación
óptima para sondas de oligonucleótidos sintéticos de aproximadamente
10-50 bases de longitud tiene lugar aproximadamente
a 5ºC por debajo de la temperatura de fusión para un dúplex dado. La
incubación a temperaturas inferiores a la óptima puede permitir que
secuencias de bases no apareadas se hibriden y puede dar por
consiguiente como resultado una especificidad reducida.
Es deseable disponer de sondas que se hibriden
únicamente en condiciones de alta severidad. En condiciones de alta
severidad, únicamente se formarán híbridos de ácido nucleico
fuertemente complementarios; no se formarán híbridos sin un grado
suficiente de complementariedad. De acuerdo con ello, la severidad
de las condiciones de ensayo determina la cantidad de
complementariedad necesaria entre dos cadenas de ácido nucleico que
formen un híbrido. La severidad se selecciona de tal modo que
maximice la diferencia de estabilidad entre el híbrido formado,
diana y el ácido nucleico distinto de la diana. En algunos ejemplos
de la presente invención, v.g., cuando es necesario diferenciar
organismos altamente afines, puede ser preciso detectar cambios de
un solo par de bases. En tales casos, se precisan condiciones de muy
alta severidad.
En segundo lugar, deberían posicionarse las
sondas de tal modo que minimicen la estabilidad del híbrido de ácido
nucleico [sonda: no diana]. Esto puede realizarse minimizando la
longitud de complementariedad perfecta a organismos no diana,
evitando regiones ricas en GC de homología a secuencias no diana, y
posicionando la sonda de modo que abarque tantos desapareamientos
desestabilizadores como sea posible. Si una secuencia de sonda es
útil para detectar únicamente un tipo específico de organismo,
depende en gran parte de la diferencia de estabilidad térmica entre
los híbridos [sonda: diana] y los híbridos [sonda: no diana]. En el
diseño de sondas, las diferencias en estos valores Tm deben ser tan
grandes como sea posible (v.g., al menos 2ºC y preferiblemente
5ºC).
La longitud de la secuencia de ácido nucleico
diana y, de acuerdo con ello, la longitud de la secuencia de sonda
pueden ser también importantes. En algunos casos, pueden existir
varias secuencias procedentes de una región particular, que varían
en localización y longitud, lo cual producirá sondas con las
características de hibridación deseadas. En otros casos, una
secuencia puede ser significativamente mejor que otra que difiere
simplemente en una sola base. Si bien es posible que los ácidos
nucleicos que no son perfectamente complementarios se hibriden, el
tramo más largo de secuencia de bases perfectamente complementaria
determinará primariamente por regla general la estabilidad de los
híbridos. Si bien pueden utilizarse sondas oligonucleotídicas de
diferentes longitudes y composición de bases, las sondas
oligonucleotídicas preferidas en esta invención están comprendidas
entre aproximadamente 10 y 50 bases de longitud y son
suficientemente homólogas al ácido nucleico diana.
En tercer lugar, las regiones en el DNA o RNA
diana que se sabe forman estructuras internas fuertes inhibidoras
de la concentración son menos preferidas. Análogamente, deberían
evitarse sondas con auto-complementariedad extensa.
Como se ha explicado anteriormente, la hibridación es la asociación
de dos cadenas simples de ácidos nucleicos complementarios para
formar una doble cadena unida por enlaces de hidrógeno. Es
implícito que si una de las dos cadenas está implicada total o
parcialmente en un híbrido, la misma será menos capaz de participar
en la formación de un nuevo híbrido. Pueden existir híbridos
intramoleculares e intermoleculares formados dentro de las moléculas
de un tipo de sonda si existe una
auto-complementariedad suficiente. Tales estructuras
pueden evitarse por diseño cuidadoso de las sondas. Diseñando una
sonda de tal modo que una porción sustancial de la secuencia de
interés sea monocatenaria, pueden aumentarse notablemente la tasa y
extensión de la hibridación. Están disponibles programas de
ordenador para investigar este tipo de interacción. Sin embargo, en
ciertos casos puede no ser posible evitar este tipo de
interacción.
Las sondas de la presente invención están
diseñadas para alcanzar una eficiencia óptima en las mismas
condiciones de hibridación de tal modo que aquéllas puedan
utilizarse en series de hibridación simultáneas; esto aumenta
notablemente la validez de dichas sondas y da como resultado una
ganancia importante en tiempo y mano de obra. Evidentemente, cuando
deben preferirse otras condiciones de hibridación, todas las sondas
deberían adaptarse de acuerdo con ello por adición o deleción de
cierto número de nucleótidos en sus extremos. Debe entenderse que
estas adaptaciones concomitantes deberían dar lugar esencialmente
al mismo resultado, es decir que las sondas respectivas se
hibridarán todavía específicamente con la diana definida. Dichas
adaptaciones podrían ser necesarias también si el material
amplificado tuviera que ser de naturaleza RNA y no DNA como en el
caso del sistema
NASBA.
NASBA.
Las condiciones de hibridación pueden
monitorizarse basándose en varios parámetros, tales como la
naturaleza y concentración de los componentes del medio, y las
temperaturas en las cuales se forman y se lavan los híbridos.
La temperatura de hibridación y de lavado está
limitada en valor superior dependiendo de la secuencia de la sonda
(su composición de ácidos nucleicos, clase y longitud). La
temperatura máxima de hibridación o lavado de las sondas descritas
en la presente invención está comprendida entre 40ºC y 60ºC, más
preferiblemente entre 45ºC y 55ºC, en el medio de hibridación y
lavado específico que se describe en la sección de ejemplos. Para
temperaturas más altas, la formación de dúplex (= formación de los
híbridos) compite con la disociación (o desnaturalización) del
híbrido formado entre la sonda y la diana.
En un medio de hibridación preferido de acuerdo
con la invención, que contenga 3 x SSC y formamida al 20%, las
temperaturas de hibridación pueden variar desde 45ºC a 55ºC, con
una temperatura de hibridación preferida de 50ºC. Un medio de lavado
preferido contiene 3 x SSC y formamida al 20%, y las temperaturas de
lavado preferidas son las mismas que las temperaturas de
hibridación preferidas, es decir comprendidas preferiblemente entre
45ºC y 55ºC, y muy preferiblemente 50ºC.
Sin embargo, cuando se introducen modificaciones,
sea en las sondas o en los medios, las temperaturas a las cuales
pueden utilizarse las sondas para obtener la especificidad
requerida deberían modificarse de acuerdo con relaciones conocidas,
tales como las descritas en la referencia siguiente: Hames B y
Higgins S (compiladores). Nucleic acid hybridization. A practical
approach, IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1985.
Las sondas de ácido nucleico seleccionadas
derivadas de la región espaciadora 16S-23S de rRNA y
descritas por la presente invención se enumeran en la Tabla 1a (SEQ
ID NO 1 a 64, 175 a 191, 193 a 201, y 210 a 212). Como se describe
en la sección de ejemplos, algunas de estas sondas exhiben
sensibilidad y/o especificidad mejores que otras, y las mejores
sondas se utilizan por tanto preferiblemente en los métodos para
detectar el organismo de interés en una muestra biológica. No
obstante, es posible que para ciertas aplicaciones (v.g.
epidemiología, tipificación de
\hbox{sustratos, ...)} una
serie de sondas que incluyen las sondas menos específicas y/o menos
sensibles puedan ser muy informativas (véase v.g. el Ejemplo 7).
Las definiciones siguientes sirven para ilustrar
los términos y expresiones utilizados en las diferentes
realizaciones de la presente invención como se expone a
continuación.
El término "espaciador" es un término
abreviado que se refiere a la región espaciadora transcrita interna
16S-23S de rRNA.
El término "sonda" hace referencia a
oligonucleótidos monocatenarios específicos de secuencia que tienen
una secuencia que es suficientemente complementaria para hibridarse
a la secuencia diana a detectar.
El término más específico "sonda
espaciadora" hace referencia a una sonda como se ha definido
arriba que tiene una secuencia que es suficientemente complementaria
para hibridarse a una secuencia diana que está localizada en la o
las regiones espaciadoras del organismo (o grupo de organismos) a
detectar.
Preferiblemente, dichas sondas son homólogas en
un 70%, 80%, 90%, o más de 95% al complemento exacto de la
secuencia diana a detectar. Estas secuencias diana son o bien DNA
genómico o RNA precursor, o versiones amplificadas de los
mismos.
Preferiblemente, estas sondas tienen una longitud
de aproximadamente 5 a 50 nucleótidos, de modo más preferible
aproximadamente 10 a 25 nucleótidos. Los nucleótidos que se
utilizan en la presente invención pueden ser ribonucleótidos,
desoxirribonucleótidos y nucleótidos modificados, tales como inosina
o nucleótidos que contienen grupos modificados que no alteran
esencialmente sus características de hibridación. Además, es
evidente para los expertos en la técnica que cualquiera de las
sondas especificadas más adelante pueden utilizarse como tales, o
en su forma complementaria, o en su forma de RNA (en la cual T está
reemplazado por U).
Las sondas de acuerdo con la invención pueden
formarse por clonación de plásmidos recombinantes que contienen
inserciones que incluyen las secuencias de nucleótidos
correspondientes, en caso necesario por escisión de las últimas de
los plásmidos clonados por utilización de las nucleasas adecuadas y
recuperación de las mismas, v.g. por fraccionamiento de acuerdo con
el peso molecular. Las sondas de acuerdo con la presente invención
pueden sintetizarse también químicamente, por ejemplo por el método
convencional del fosfo-triéster.
El término ácidos nucleicos
"complementarios", tal como se utiliza en esta memoria,
significa que las secuencias de ácido nucleico pueden formar entre
sí una doble hélice perfectamente apareada en bases.
El término "homólogo" tal como se utiliza en
la presente solicitud es sinónimo de idéntico. Esto significa que
los ácidos polinucleicos que se dice tienen una homología de v.g.
80% exhiben 80% de pares de bases idénticos en la misma posición
cuando se alinean sus secuencias.
El término "ácido polinucleico" corresponde
a cDNA o DNA genómico o RNA bicatenarios o monocatenarios, que
contienen al menos 10, 20, 30, 40 ó 50 nucleótidos contiguos. Un
ácido polinucleico que tiene una longitud menor que 100 nucleótidos
se designa también frecuentemente como un oligonucleótido. Las
secuencias de ácidos polinucleicos monocatenarios se representan
siempre en la presente invención desde el extremo 5' al extremo
3'.
El término "vecino más próximo" significa el
taxón que se sabe o se espera que es el más estrechamente
relacionado en términos de homología de DNA y que tiene que
diferenciarse del organismo de interés.
La expresión "características de hibridación
deseadas" significa que la sonda se hibrida únicamente al DNA o
RNA de organismos para los cuales ha sido diseñada, y no a DNA o
RNA de otros organismos (vecinos u organismos más próximos que estén
probablemente presentes en la misma muestra). En la práctica, esto
significa que la intensidad de la señal de hibridación es al menos
2, 3, 4, 5, 10 o más veces más fuerte con el DNA o RNA diana de los
organismos para los cuales se diseñaron las sondas, en comparación
con secuencias no diana.
Estas características de invención deseadas
corresponden a lo que se denomina más adelante en el texto
"hibridación específica".
La expresión "hibridación específica del
taxón" o "sonda específica del taxón" significa que la
sonda se hibrida únicamente al DNA o RNA del taxón para el cual fue
diseñada y no al DNA o RNA de otros taxones.
El término taxón puede hacer referencia a un
género completo o un subgrupo dentro de un género, una especie o
incluso un subtipo dentro de una especie (subespecie, serovars,
sequevars, biovars ...).
El término "amplificación específica" o
"iniciadores específicos", hace referencia al hecho de que
dichos iniciadores amplifican sólo la región espaciadora de estos
organismos para los cuales se diseñaron, y no de otros
organismos.
El término "sensibilidad" hace referencia al
número de resultados negativos falsos: es decir, si 1 de las 100
cepas a detectar se pasa por alto, el test exhibe una sensibilidad
de (100 -1/100) % = 99%.
El término "especificidad" hace referencia
al número de resultados positivos falsos: es decir si en 100 cepas
detectadas, dos parecen pertenecer a organismos para los cuales no
está diseñado el test, la especificidad del test es (100 -2/100) %
= 98%.
Las notas seleccionadas como "preferentes"
exhiben sensibilidad y especificidad mayores que 80%,
preferiblemente mayores que 90% y muy preferiblemente mayores que
95%.
El término "iniciador" hace referencia a una
secuencia oligonucleotídica de DNA monocatenario capaz de actuar
como punto de iniciación para la síntesis de un producto de
extensión del iniciador que es complementario a la cadena de ácido
nucleico a copiar. La longitud y la secuencia del iniciador deben
ser tales que las mismas permitan iniciar la síntesis de los
productos de extensión. Preferiblemente, el iniciador tiene una
longitud de aproximadamente 5-50 nucleótidos. La
longitud y secuencia específicas dependerán de la complejidad de
las dianas de DNA o RNA requeridas, así como las condiciones de uso
de iniciadores tales como la temperatura y la concentración iónica.
El hecho de que los iniciadores de amplificación no tengan que
coincidir exactamente con la secuencia modelo correspondiente para
garantizar una amplificación apropiada está ampliamente documentado
en la bibliografía (Kwok et al.,
1990).
1990).
El método de amplificación utilizado puede ser la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Saiki et al.,
1988), la reacción en cadena de la ligasa (LCR); Landgren et
al., 1988; Wu & Wallace, 1989; Barany, 1991), amplificación
basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA; Guatelli et
al., 1990; Compton, 1991), sistema de amplificación basado en
transcripción (TAS; Kwoh et al., 1989), amplificación por
desplazamiento de cadenas (SDA; Duck, 1990; Walker et al.,
1992) o amplificación por medio de la replicasa Q\beta (Lizardi
et al., 1988; Lomeli et al., 1989) o cualquier otro
método adecuado para amplificar moléculas de ácido nucleico
conocido en la técnica.
Los oligonucleótidos utilizados como iniciadores
o sondas pueden comprender también análogos de nucleótidos tales
como fosforotioatos (Matsukura et al., 1987),
alquilfosforotioatos (Miller et al., 1979) o ácidos nucleicos
peptídicos (Nielsen et al., 1991; Nielsen et al.,
1993) o pueden contener agentes de intercalación (Asseline et
al.,
1984).
1984).
Como la mayoría de las restantes variaciones o
modificaciones introducidas en las secuencias de DNA originales de
la invención, estas variaciones precisarán adaptaciones con
respecto a las condiciones en las cuales debería utilizarse el
oligonucleótido para obtener la especificidad y sensibilidad
requeridas. Sin embargo, los resultados finales de la hibridación
serán esencialmente los mismos que los obtenidos con los
oligonucleótidos no modificados.
La introducción de estas modificaciones puede ser
ventajosa a fin de influir positivamente en características tales
como la cinética de hibridación, la reversibilidad de la formación
de híbridos, la estabilidad biológica de las moléculas
oligonucleotídicas, etc.
El término "soporte sólido" puede hacer
referencia a cualquier sustrato al cual puede acoplarse una sonda
oligonucleotídica, con tal que la misma conserve sus
características de hibridación y con tal que el nivel de ruido de
fondo de la hibridación se mantenga bajo. Usualmente, el sustrato
sólido será una placa de microtitulación, una membrana (v.g. nylon
o nitrocelulosa) o una microesfera (perla). Antes de la aplicación a
la membrana o fijación, puede ser conveniente modificar la sonda de
ácido nucleico a fin de facilitar la fijación o mejorar la
eficiencia de hibridación. Tales modificaciones pueden abarcar
aportación de colas de homopolímeros, acoplamiento con diferentes
grupos reactivos tales como grupos alifáticos, grupos NH_{2},
grupos SH, grupos carboxílicos, o acoplamiento con biotina,
haptenos o proteínas.
El término "marcado" hace referencia al uso
de ácidos nucleicos marcados. La marcación puede llevarse a cabo
por el uso de nucleótidos marcados incorporados durante el paso de
polimerasa de la amplificación tal como se ilustra por Saiki et
al. (1988) o Bej et al. (1990) o por el uso de
iniciadores marcados, o por cualquier otro método conocido por las
personas expertas en la técnica. La naturaleza del marcador puede
ser isotópica (^{32}P, ^{35}S, etc.) o no isotópica (biotina,
digoxigenina, etc.).
La "muestra" puede ser cualquier material
biológico tomado directamente del humano (o animal) infectado, o
después de cultivo (enriquecimiento), o una muestra tomada de
alimento o pienso. El material biológico puede ser, v.g.
expectoraciones de cualquier clase, lavados bronquiales, sangre,
tejido de la piel, biopsias, material linfocítico de cultivo de
sangre, colonias, etc. Dichas muestras pueden prepararse o
extraerse de acuerdo con cualquiera de los métodos conocidos en la
técnica.
El material "diana" en estas muestras puede
ser DNA genómico o RNA precursor del organismo a detectar (=
organismo diana), o versiones amplificadas del mismo como se ha
expuesto anteriormente. De modo más específico, la secuencia de
ácido nucleico del material diana está localizada en la región
espaciadora del o de los organismos diana.
La detección e identificación del material diana
puede realizarse por el uso de uno de los muchos métodos de
electroforesis, métodos de hibridación o métodos de secuenciación
descritos en la bibliografía y conocidos actualmente por las
personas expertas en la técnica. Sin embargo, una técnica muy
conveniente y ventajosa para la detección simultánea de ácidos
nucleicos posiblemente presentes en muestras biológicas es la
técnica Line Probe Assay. El Line Probe Assay (LiPA) es un formato
de hibridación inversa (Saiki et al., 1989) que utiliza
tiras de membrana sobre las cuales pueden aplicarse
convenientemente varias sondas oligonucleotídicas (con inclusión de
oligonucleótidos de control negativos o positivos) convenientemente
como líneas paralelas.
La técnica LiPA, como fue descrita por Stuyver
et al. (1993) y en la solicitud internacional WO 94/12670,
proporciona un ensayo de hibridación muy rápido y cómodo para el
usuario. Los resultados pueden leerse al cabo de 4 horas después del
comienzo de la amplificación. Después de la amplificación durante
la cual se incorpora usualmente un marcador no isotópico en el
producto amplificado, y desnaturalización alcalina, el producto
amplificado se pone en contacto con las sondas sobre la membrana y
la hibridación se lleva a cabo durante aproximadamente 1 a 1,5
horas. Por lo tanto, los híbridos formados se detectan por un
procedimiento enzimático que da como resultado un precipitado
púrpura-pardo apreciable a simple vista. El formato
LiPA es completamente compatible con los dispositivos de escaneo
disponibles comercialmente, haciendo con ello posible la
interpretación automática de los resultados. Todas las ventajas
expuestas hacen que el formato LiPA sea adecuado para uso en un
escenario de
rutina.
rutina.
El formato LiPA es no sólo un instrumento
ventajoso para identificación y detección de patógenos a nivel de
especies, sino también a niveles taxonómicos superiores o
inferiores. Por ejemplo, configuraciones sonda sobre tiras LiPA
pueden seleccionarse de tal manera que las mismas puedan detectar
un género completo (v.g. Neisseria, Listeria, etc.) o puedan
identificar subgrupos dentro de un género (v.g. subgrupos en el
complejo Mycobacterium
avium-intracellulare-scrofulaceum)
o puedan incluso detectar en algunos casos subtipos (subespecies,
serovars, sequevars, biovars, etc. que puedan ser clínicamente
relevantes) dentro de una especie.
Debe subrayarse que la capacidad de generar
simultáneamente resultados de hibridación con varias sondas es una
ventaja extraordinaria de la tecnología LiPA. En muchos casos, la
cantidad de información que puede obtenerse por una combinación
particular de sondas excede notablemente en número de los datos
obtenidos por utilización de ensayos con una sola sonda. Por esta
razón, la selección de las sondas en la tira de membrana es de la
máxima importancia, dado que una serie de sondas optimizada
generará el máximo de información posible. Esto se ilustra de modo
más particular más adelante en esta memoria.
El hecho de que diferentes sondas puedan
combinarse en una sola tira ofrece también la posibilidad de hacer
frente cómodamente a una falta de sensibilidad debida a la
heterogeneidad de secuencias en la región diana del grupo de
organismos a detectar. Debido a esta heterogeneidad, pueden
requerirse dos o más sondas para identificar positivamente todos
los organismos del grupo particular. Estas sondas pueden aplicarse a
tiras de membrana en lugares diferentes y el resultado se
interpreta como positivo si al menos una de estas sondas es
positiva. Alternativamente, estas sondas pueden aplicarse como una
mezcla en la misma localización, reduciendo con ello el número de
líneas en una tira. Esta reducción puede ser conveniente a fin de
hacer la tira más concisa o poder aumentar el número total de
sondas en una tira. Otro enfoque alternativo, a la vista de sus
ventajas prácticas, es la síntesis de oligonucleótidos que alojan
las secuencias de dos (o más) sondas diferentes (= sondas
degeneradas), las cuales pueden procesarse ulteriormente y
aplicarse a la tira como una sola molécula de oligonucleótido. Este
enfoque podría simplificar considerablemente los procedimientos de
fabricación de las tiras LiPA. Por ejemplo, sondas con secuencias
nucleotídicas A y B se requieren ambas para detectar todas las
cepas del taxón X. En la última alternativa, puede sintetizarse una
sonda que tenga la secuencia nucleotídica AB. Esta sonda tendrá las
características combinadas de la sondas A
y B.
y B.
En virtud de las propiedades arriba mencionadas,
el sistema LiPA puede considerarse como un formato preferencial
para un método de hibridación en el cual precisan ser detectados
simultáneamente varios organismos en una muestra. Además, como se
describe en la sección de ejemplos, el sistema LiPA es un formato
preferido para un método de selección para la evaluación y
selección experimentales de sondas diseñadas teóricamente.
Sin embargo, debe quedar claro que cualquier otro
ensayo de hibridación, en el cual se utilicen diferentes sondas en
las mismas condiciones de hibridación y lavado, puede emplearse
para los métodos de detección y/o selección mencionados
anteriormente. Por ejemplo, puede ser posible inmovilizar el ácido
nucleico diana a un soporte sólido, y utilizar mezclas de estas
sondas, todas ellas marcadas diferentemente, dando como resultado
una señal de detección diferente para cada una de las sondas
hibridadas a la diana.
Como ejemplo, se reseña a continuación el
procedimiento a seguir para la detección de uno o más organismos en
una muestra utilizando el formato LiPA:
- -
- En primer lugar, se obtienen los ácidos nucleicos del o de los organismos a detectar en la muestra para amplificación y/o hibridación.
- -
- En segundo lugar, los ácidos nucleicos, si están presentes, se amplifican con uno u otro sistema de amplificación, como se especifica más adelante. Usualmente, la amplificación es necesaria para aumentar la señal de hibridación subsiguiente. Sin embargo, para algunas muestras o algunos organismos podría no ser necesaria amplificación. Éste podría ser también el caso si, para la detección de los híbridos formados, se utilizan sistemas de amplificación de señal altamente sensibles.
- -
- En tercer lugar, eventualmente después de un paso de desnaturalización, los ácidos nucleicos pueden tener la muestra o el producto amplificado resultante se ponen en contacto con tiras LiPA sobre las cuales están inmovilizadas una o más sondas de DNA, que permiten la detección de los organismos de interés, y se deja transcurrir la hibridación.
- -
- Por último, eventualmente después de haber realizado un paso de lavado, se detectan los híbridos utilizando un sistema de detección conveniente y compatible. A partir de las señales o patrones de hibridación observados, puede deducirse la presencia o ausencia de uno o varios organismos escrutados en dicha muestra biológica particular.
El sistema de amplificación utilizado puede ser
más o menos universal, dependiendo de la aplicación específica
necesaria.
Utilizando iniciadores universales localizados en
las regiones flanqueantes conservadas (gen 16S y 23S) del
espaciador de rRNA, puede amplificarse la región espaciadora de la
mayoría, si no de la totalidad, de los organismos de origen
eubacteriano. Puede obtenerse el mismo resultado utilizando una
combinación de series de iniciadores diferentes con universalidad
reducida (amplificación múltiplex, es decir, un procedimiento de
amplificación en el cual dos o más series de iniciadores se utilizan
simultáneamente en una y la misma mezcla de reacción).
\newpage
Para algunas aplicaciones puede ser apropiado
amplificar no todos los organismos presentes de la muestra, sino
más específicamente, taxones definidos de antemano. Esto puede
conseguirse utilizando iniciadores específicos localizados sea en
partes menos conservadas de los genes flanqueantes de los
espaciadores (v.g. MYCP1-5 para amplificación de la
región espaciadora de micobacterias) o localizados en los
espaciadores propiamente dichos (v.g.
LIS-P1-P7,
BRU-P1-4,
CHTR-P1-2 y
YEC-P1-2 para amplificación
específica de la o las regiones espaciadoras de especies de
Listeria, especies de Brucella, Chlamydia trachomatis,
y Yersinia enterocolitica respectivamente).
La presente invención proporciona por tanto un
método para detección e identificación de al menos un
micro-organismo, o para la detección simultánea de
varios micro-organismos base en una muestra, que
comprende los pasos de:
- (i)
- si es necesario liberar, aislar y/o concentrar los ácidos polinucleicos a partir del o de los micro-organismos a detectar en la muestra;
- (ii)
- si es necesario, amplificar la región espaciadora 16S-23S de rRNA, o una parte de ella, a partir del o de los micro-organismos a detectar, con al menos un par de iniciadores adecuados;
- (iii)
- hibridar los ácidos polinucleicos del paso (i) o (ii) con una serie de sondas que comprenda al menos dos sondas, en las mismas condiciones de hibridación y lavado, seleccionándose dichas sondas de las secuencias de la Tabla 1a o equivalentes de las mismas y/o de sondas específicas de taxones derivadas de cualquiera de las secuencias espaciadoras representadas en las Figs. 1-103, seleccionándose dicha sonda específica del taxón de tal modo que la misma sea capaz de hibridarse en las mismas condiciones de hibridación y lavado que al menos una de las sondas de la Tabla 1a;
- (iv)
- detectar los híbridos formados en el paso (iii);
- (v)
- identificar el o los micro-organismos presentes en la muestra a partir de las diferentes señales de hibridación obtenidas en el paso (iv).
Las sondas que se mencionan en la Tabla 1a se
seleccionan todas ellas de tal manera que las mismas exhiben las
características de hibridación deseadas a una temperatura de
hibridación y lavado de 50ºC en un medio preferido de hibridación y
lavado de 3X SSC y formamida al 20%.
El término "equivalentes" de una sonda,
denominado también "variantes" o "homólogos" o
"derivados obvios", hace referencia a sondas que difieren en
secuencia de cualquiera de las sondas especificadas en la Tabla 1a
sea por adición a o eliminación de cualquiera de sus extremos
respectivos de un nucleótido, con tal que dichos equivalentes se
hibriden todavía con la misma diana de RNA o DNA que la secuencia de
la sonda no modificada correspondiente. Debe indicarse que, cuando
se utiliza un equivalente de una sonda, puede ser necesario
modificar las condiciones de hibridación para obtener la misma
especificidad que en el caso de la sonda no modificada
correspondiente. Como consecuencia, dado que el objetivo de esta
invención es utilizar una serie de sondas que funcionen en las
mismas condiciones de hibridación y lavado, será necesario también
modificar de acuerdo con ello la secuencia de las otras sondas,
pertenecientes a la misma serie que la sonda sin modificar
original. Estas modificaciones pueden hacerse de acuerdo con
principios conocidos en la técnica, v.g. tales como los descritos en
Hames B y Higgins S (compiladores): Nucleic acid hybridization. A
practical approach. IRL Press, Oxford, Reino Unido,
1985.
1985.
La sección de ejemplos presenta ulteriormente un
método para seleccionar sondas específicas de taxón a partir de la
o las secuencias de la región espaciadora de dicho taxón,
seleccionándose dichas sondas de tal modo que las mismas exhiben sus
características de hibridación deseadas en condiciones unificadas
de hibridación y lavado.
El término condiciones "unificadas"
significa que estas condiciones son las mismas para las diferentes
sondas que permiten la detección de taxones diferentes.
Con preferencia, la presente invención
proporciona un método como se ha descrito arriba en el cual se
detectan simultáneamente al menos 2
micro-organismos.
En una realización preferida, la serie de sondas
como se describe en el paso (iii) comprende al menos dos sondas que
se seleccionan de las secuencias de la Tabla 1a, o equivalentes de
la misma.
En otra realización, la serie de sondas que se
describen en el paso (iii) comprende al menos una sonda que se
selecciona de las secuencias de la Tabla 1a, o equivalentes de
ellas, y al menos una sonda específica del taxón derivada de
cualquiera de las secuencias espaciadoras que se representan en las
Figs. 1-103.
En otra realización adicional, la serie de sondas
que se describen en el paso (iii) comprende al menos dos sondas
específicas del taxón derivadas de cualquiera de las secuencias
espaciadoras que se representan en las Figs.
1-103.
1-103.
\newpage
La presente invención proporciona también un
método como se ha descrito arriba, en el cual las sondas que se
especifican en el paso (iii) se combinan con al menos otra sonda,
Con preferencia también de la región espaciadora
16S-23S de rRNA, permitiendo la detección simultánea
de diferentes bacterias patógenas que es probable estén presentes
en la misma muestra.
Los organismos de relevancia clínica presentes en
muestras biológicas pueden variar considerablemente dependiendo del
origen de la muestra. Las materias patógenas más comunes que pueden
encontrarse en muestras de esputo, o en muestras procedentes del
tracto respiratorio, son:
- -
- Moraxella catarrhalis
- -
- Streptococcus pneumoniae
- -
- Haemophilus influenzae
- -
- Pseudomonas aeruginosa
- -
- Mycoplasma pneumoniae
- -
- especies de Acinetobacter
- -
- especies de Mycobacterium
- -
- Staphylococcus aureus
- -
- Legionella pneumophila.
Una tira de LiPA que aloje sondas espaciadoras
que permitan la detección de la mayoría, si no la totalidad, de
estos organismos sería extremadamente beneficiosa por las razones
expuestas anteriormente.
Evidentemente, esto es aplicable también para
otras muestras biológicas, tales como las siguientes: fluido
cerebroespinal, muestras urogenitales, muestras gastrointestinales,
sangre, orina, productos alimenticios, suelo, etc. Por ejemplo, un
panel preferido para fluido cerebroespinal podría contener
combinaciones de sondas que permitieran la detección y
diferenciación de los organismos siguientes:
- -
- Neisseria meningitidis
- -
- Streptococcus pneumoniae
- -
- Streptococcus agalactiae
- -
- Listeria monocytogenes
- -
- Mycobacterium tuberculosis.
Para algunos de los organismos arriba
mencionados, se han diseñado ya sondas espaciadoras en una solicitud
de patente previa (documento WO 91/16454). A fin de poder detectar
la mayoría de los organismos patógenos posiblemente presentes en una
muestra en un solo ensayo, las sondas de la presente invención
pueden combinarse con al menos una de las sondas del documento WO
91/16454, o sus derivados obvios como se especifica en el documento
WO 91/16454. Para claridad, se enumeran a continuación estas
sondas:
La invención proporciona por tanto un método como
se ha descrito arriba, en el cual dicha muestra procede del tracto
respiratorio, y en el cual la serie de sondas que se definen en el
paso (iii) comprende al menos una sonda seleccionada de las sondas
espaciadoras siguientes:
\newpage
y más preferiblemente de las sondas
espaciadoras
siguientes:
o equivalentes de dichas
sondas,
y/o en el cual la serie de sondas comprende al
menos una sonda específica de taxón derivada de la secuencia de la
región espaciadora correspondiente a uno de los
micro-organismos a detectar en dicha muestra,
seleccionándose dicha secuencia de región espaciadora de cualquiera
de las secuencias que se representan por SEQ ID NO 76 a 106, 157 a
174, 124, 125, 111 a 115, 139 a 144, ó 126 a 130, y utilizándose
dichas sondas o equivalentes posiblemente en combinación con
cualquier sonda que detecte al menos uno de los organismos
siguientes: Haemophilus influenzae, Streptococcus neumoniae,
Moraxella catarrhalis, o Bordetella pertussis.
Las sondas de la invención arriba mencionadas
están diseñadas para la detección de especies de
Mycobacterium, (SEQ ID NO 1 a 33 y 175 a 191, de
Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO 34 a 38), de especies de
Mycoplasma (SEQ ID NO 49 a 52), de Staphylococcus
aureus (SEQ ID NO 53 a 56) y de Acinetobacter baumanii
(SEQ ID NO 57 y 58).
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más de dichas
sondas.
La invención se refiere también a un método como
se ha descrito arriba, en el cual dicha muestra es una muestra
tomada del fluido cerebroespinal, y en el cual la serie de sondas
que se describen en el paso (iii) comprende al menos una sonda
seleccionada de las sondas espaciadoras siguientes:
y preferiblemente de las sondas
espaciadoras
siguientes:
o equivalentes de dichas
sondas,
y/o en el cual la serie de sondas comprende al
menos una sonda específica de taxón derivada de la secuencia de
región espaciadora correspondiente a uno de los
micro-organismos a detectar en dicha muestra,
seleccionándose dicha secuencia de región espaciadora de cualquiera
de las secuencias que se representan por SEQ ID NO 116,
118-121, ó 213-215,
y utilizándose posiblemente dichas sondas o
equivalentes en combinación con cualquier sonda que detecte al
menos uno de los organismos siguientes: Neisseria meningitidis,
Haemophilus influenzae o Streptococcus pneumoniae.
Las sondas de la invención arriba mencionadas
están diseñadas para la detección de especies de
Mycobacterium, y más particularmente Mycobacterium
tuberculosis (SEQ ID NO 1 a 5), y de especies de
Listeria, más particularmente Listeria monocytogenes
(SEQ ID NO 39 a 42).
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más de dichas
sondas.
La invención se refiere también a un método como
se ha descrito arriba, en el cual dicha muestra es una muestra
tomada del tracto urogenital, y en el cual la serie de sondas que
se describen en el paso (iii) comprende al menos una sonda
seleccionada de las sondas espaciadoras siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
o equivalentes de dichas
sondas,
y/o en el cual la serie de sondas comprende al
menos una sonda específica de taxón derivada de la secuencia de
región espaciadora correspondiente a uno de los
micro-organismos a detectar en dicha muestra,
seleccionándose dicha secuencia de región espaciadora de cualquiera
de las secuencias que se representan por SEQ ID NO 122, 123, 197,
124 ó 125,
utilizándose posiblemente dichas sondas o
equivalentes en combinación con cualquier sonda que detecte al
menos uno de los organismos siguientes: Neisseria gonorrhoeae,
Haemophilus ducreyi o Streptococcus agalactiae.
Las sondas de la invención arriba mencionadas
están diseñadas para la detección de especies de Chlamydia
(SEQ ID NO 45 a 48 y 201) y de especies de Mycoplasma (SEQ
ID NO 51 y 52).
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete de dichas sondas.
La invención se refiere también a un método como
se ha descrito arriba, en el cual dicha muestra es una muestra
tomada de alimento, y en el cual la serie de sondas que se definen
en el paso (iii) comprende al menos una sonda seleccionada de las
sondas espaciadoras siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
y preferiblemente de las sondas
espaciadoras
siguientes:
o equivalentes de dichas
sondas,
y/o en el cual la serie de sondas comprende al
menos una sonda específica de taxón derivada de la secuencia de
región espaciadora correspondiente a uno de los
micro-organismos a detectar en dicha muestra,
seleccionándose dicha secuencia de región espaciadora de cualquiera
de las secuencias que se representan por SEQ ID NO 116,
118-121,213-215,
139-144, 131, 132, 154, 133-138, 195
ó 196, utilizándose posiblemente dichas sondas o equivalentes en
combinación con cualquier sonda que detecte cepas de especies de
Campylobacter.
Las sondas de la invención arriba mencionadas
están diseñadas para la detección de especies de Listeria
(SEQ ID NO 39 a 44), de especies de Staphylococcus (SEQ ID NO
53 a 56), de especies de Brucella (SEQ ID NO 59, 60, 193 y
194), de especies de Salmonella (SEQ ID NO 61 a 64) y de
Yersinia enterocolitica (SEQ ID NO 198 a 200).
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más de dichas
sondas.
La invención se refiere también a un método como
se ha descrito arriba, en el cual dicha muestra es una muestra
tomada del tracto gastrointestinal de un paciente, y en el cual la
serie de sondas que se definen en el paso (iii) comprende al menos
una sonda seleccionada de las sondas espaciadoras siguientes:
y preferiblemente de las sondas
espaciadoras
siguientes:
o equivalentes de dichas
sondas,
y/o en el cual la serie de sondas comprende al
menos una sonda específica de taxón derivada de la secuencia de
región espaciadora correspondiente a uno de los
micro-organismos a detectar en dicha muestra,
seleccionándose dicha secuencia de región espaciadora de cualquiera
de las secuencias que se representan por SEQ ID NO
133-138 ó 195-196,
utilizándose posiblemente dichas sondas o
equivalentes en combinación con cualquier sonda que detecte
especies de Campylobacter.
Las sondas de la invención arriba mencionadas
están diseñadas para detectar especies de Salmonella (SEQ ID
NO 61 a 64) y Yersinia enterocolitica (SEQ ID NO 198 a
200).
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete de dichas sondas.
La invención se refiere también al uso de las
sondas seleccionadas o sus equivalentes para la detección de
taxones bacterianos específicos, siendo dichos taxones un género
completo, o un subgrupo dentro de un género, una especie, o incluso
un subtipo dentro de una especie.
La invención proporciona por tanto un método como
se ha descrito arriba para detectar e identificar una o más cepas
de especies y subespecies de Mycobacterium en una muestra,
en el cual el paso (iii) comprende la hibridación a al menos una de
las sondas siguientes:
y más preferiblemente a al menos
una sonda del grupo restringido de sondas espaciadoras
siguiente:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO
76-110, ó 157-174, con la condición
de que dicha sonda se hibrida específicamente a una especie de
Mycobacterium.
Las secuencias representadas por SEQ ID NO
76-110 y 157-174 son nuevas.
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más de dichas
sondas.
Como se ha descrito arriba, la serie de sondas
restringida preferida son aquellas sondas que exhiben una
sensibilidad y especificidad mayores que 80%, preferiblemente
mayores que 90%, y muy preferiblemente mayores que 95%, en las
condiciones específicas de hibridación que se describen en la
sección de ejemplos.
En una realización específica, la invención
proporciona un método como se ha descrito arriba para detectar e
identificar una o más cepas del complejo de Mycobacterium
tuberculosis en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 76
con tal que dicha sonda se hibrida específicamente al complejo de
M. tuberculosis. El complejo de M. tuberculosis
comprende cepas de M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M.
africanum y M. microti.
La secuencia representada por SEQ ID NO 76 es
nueva.
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos, o tres de dichas sondas.
En otra realización específica, la invención
proporciona un método como se ha descrito anteriormente para
detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium del
complejo MAIS, en el cual el paso (iii) comprende hibridación a al
menos una de las sondas siguientes:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO
77-100 ó 108-110, con la condición
de que dicha sonda se hibrida específicamente a cepas del complejo
MAIS. El complejo MAIS como se define en esta invención comprende
todas las cepas de M. avium, M. intracellulare y M.
scrofulaceum y todas las cepas relacionadas estrechamente con
las especies arriba mencionadas y que no pertenecen claramente a
otra especie de Mycobacterium definida. El último grupo de
cepas se definen en esta invención como "cepas MIC" (complejo
de M. intracellulare).
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más de dichas
sondas.
En otra realización específica adicional, la
invención proporciona un método como se ha descrito arriba, para
detectar e identificar una o más cepas de M. avium y M.
paratuberculosis en una muestra, en el cual el paso (iii)
comprende hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 77 y
78 con la condición de que dicha sonda se hibrida específicamente a
M. avium o M. paratuberculosis.
Las secuencias que se representan en SEQ ID NO 77
y 78 son nuevas.
Con preferencia, esta realización utiliza ambas
sondas en combinación.
En otra realización específica adicional, la
invención proporciona un método como se ha descrito arriba para
detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
intracellulare y cepas MIC en una muestra, en el cual el paso
(iii) comprende hibridación a al menos una de las sondas
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 79,
80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,
97, 98 ó 99 con la condición de que dicha sonda se hibrida
específicamente a cepas de M. intracellulare y cepas MIC.
Las secuencias que se representan en SEQ ID NO
79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95,
96, 97, 98 ó 99 son nuevas.
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más de dichas
sondas.
En otra realización específica adicional, la
invención proporciona un método como se ha descrito arriba, para
detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
intracellulare en una muestra, en el cual el paso (iii)
comprende hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
MIN-ICG-1:
GCATAGTCCTTAGGGCTGATGCGTT
\hskip5cm(SEQ ID NO 12)
o a equivalentes de dicha sonda,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 89
con tal que dicha sonda se hibrida específicamente a cepas de M.
intracellulare.
En otra realización específica adicional, la
invención proporciona un método como se ha descrito arriba, para
detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
scrofulaceum en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a la sonda siguiente:
MSC-ICG-1:
TCGGCTCGTTCTGAGTGGTGTC
\hskip5cm(SEQ ID NO 24)
o a equivalentes de dichas sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 100
con la condición de que dicha sonda se hibrida específicamente a
M. scrofulaceum.
La secuencia que se representa en SEQ ID NO 100
es nueva.
En otra realización específica adicional, la
invención proporciona un método como se ha descrito arriba para
detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
kansasii en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
y más preferiblemente
a:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 101,
167, 168 ó 169 con la condición de que dicha sonda se hibrida
específicamente a M. kansasii.
Las secuencias representadas en SEQ ID NO 101,
167, 168 y 169 son nuevas.
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos, tres o cuatro de dichas sondas.
En otra realización específica adicional, la
invención proporciona un método como se ha descrito arriba para
detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
chelonae en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 102,
103 ó 174 con la condición de que dicha sonda se hibrida
específicamente a M. chelonae. De acuerdo con otra
realización preferente, estas tres sondas se utilizan en
combinación.
Las secuencias que se representan en SEQ ID NO
102, 103 y 174 son nuevas.
En otra realización específica adicional, la
invención proporciona un método como se ha descrito arriba para
detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
gordonae en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
y más preferiblemente
a:
MGO-ICG-5:
CGTGAGGGGTCATCGTCTGTAG
\hskip5cm(SEQ ID NO 33)
o a equivalentes de dichas sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 104,
105 ó 106 con la condición de que dicha sonda se hibrida
específicamente a M. gordonae.
Las secuencias que se representan en SEQ ID NO
104 a 106 son nuevas.
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos o tres de dichas sondas.
En otra realización específica adicional, la
invención proporciona un método como se ha descrito arriba para
detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
ulcerans o cepas de Mycobacterium marinum en una muestra,
en el cual el paso (iii) comprende hibridación a la sonda
siguiente:
MUL-ICG-1:
GGTTTCGGGATGTTGTCCCACC
\hskip5cm(SEQ ID NO 175)
o a equivalentes de dicha sonda,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 157
con la condición de que dicha sonda se hibrida específicamente a
M. ulcerans y M. marinum.
La secuencia que se representa en SEQ ID NO 157
es nueva.
En otra realización específica adicional, la
invención proporciona un método como se ha descrito arriba para
detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
genavense en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 158,
159, 160, 161 ó 162 con la condición de que dicha sonda se hibrida
específicamente a M. genavense.
Las secuencias que se representan en SEQ ID NO
158 a 162 son nuevas.
Como se describe en los ejemplos, M.
genavense incluye cepas de M. genavense en sentido
estricto y un grupo de cepas estrechamente relacionadas denominadas
cepas semejantes a M. simiae. El primer grupo de cepas puede
detectarse específicamente con la sonda
MGV-ICG-1, mientras que el último
grupo se hibrida específicamente con la sonda
MGV-ICG-3. La sonda
MGV-ICG-2 detecta ambos grupos.
En otra realización específica adicional, la
invención proporciona un método como se ha descrito arriba para
detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
xenopi en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a la sonda siguiente:
MXE-ICG-1:
GTTGGGCAGCAGGCAGTAACC
\hskip5cm(SEQ ID NO 178)
o a equivalentes de dicha sonda,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 163
con la condición de que dicha sonda se hibrida específicamente a
M. xenopi.
La secuencia que se representa en SEQ ID NO 163
es nueva.
En otra realización específica adicional, la
invención proporciona un método como se ha descrito arriba para
detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
simiae en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a la sonda siguiente:
MSI-ICG-1:
CCGGCAACGGTTACGTGTTC
\hskip5cm(SEQ ID NO 179)
o a equivalentes de dicha sonda,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 164 ó
165 con la condición de que dicha sonda se hibrida específicamente
a M. simiae.
La secuencia que se representa en SEQ ID NO 164 ó
165 es nueva.
En otra realización específica adicional, la
invención proporciona un método como se ha descrito arriba, para
detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
fortuitum en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación al menos a una de las sondas siguientes:
o a equivalentes de dichas sondas o
a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 166 con la condición de que
dicha sonda se hibrida específicamente a M.
fortuitum.
La secuencia que se representa en SEQ ID NO 166
es nueva.
En otra realización específica adicional, la
invención proporciona un método como se ha descrito arriba para
detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
celatum en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a la sonda siguiente:
MCE-ICG-1:
TGAGGGAGCCCGTGCCTGTA
\hskip5cm(SEQ ID NO 190)
o a equivalentes de dicha sonda,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 170
con la condición de que dicha sonda se hibrida específicamente a
M. celatum.
La secuencia que se representa en SEQ ID NO 170
es nueva.
En otra realización específica adicional, la
invención proporciona un método como se ha descrito arriba para
detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
haemophilum en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a la sonda siguiente:
MHP-ICG-1:
CATGTTGGGCTTGATCGGGTGC
\hskip5cm(SEQ ID NO 191)
o a equivalentes de dicha sonda,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 171,
172 ó 173 con la condición de que dicha sonda se hibrida
específicamente a M. haemophilum.
Las secuencias que se representan en SEQ ID NO
171 a 173 son nuevas.
En otra realización específica adiciona, la
invención proporciona un método como se ha descrito arriba para
detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
malmoense en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 107
con la condición de que dicha sonda se hibrida específicamente a
M. malmoense.
La secuencia que se representa en SEQ ID NO 107
es nueva.
En otra realización específica adicional, la
invención proporciona un método como se ha descrito arriba para
detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium en
una muestra, en el cual el paso (iii) comprende hibridación a al
menos una de las sondas siguientes:
o a equivalentes de dichas
sondas.
De acuerdo con una realización preferida, ambas
sondas se utilizan en combinación.
La invención proporciona también un método como
se ha descrito arriba para detectar e identificar una o más cepas de
Mycoplasma en una muestra, en el cual el paso (iii)
comprende hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 124 ó
125 con la condición de que dicha sonda se hibrida específicamente
con especies de Mycoplasma.
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos, tres o cuatro de dichas sondas.
Más particularmente, la invención proporciona un
método como se ha descrito arriba para detectar e identificar una o
más cepas de Mycoplasma pneumoniae en una muestra, en el
cual el paso (iii) comprende hibridación a al menos una de las
sondas siguientes:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 125
con la condición de que dicha sonda se hibrida específicamente a
Mycoplasma pneumoniae. De acuerdo con una realización
preferida, estas dos sondas se utilizan en combinación.
La secuencia que se representa en SEQ ID NO 125
es nueva.
En otra realización particular, la invención
proporciona un método como se ha descrito arriba para detectar e
identificar una o más cepas de Mycoplasma genitalium en una
muestra, en el cual el paso (iii) comprende hibridación a la sonda
siguiente:
MGE-ICG-1:
CACCCATTAATTTTTTCGGTGTTAAAACCC
\hskip4cm(SEQ ID NO 51)
o a equivalentes de dichas sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 124,
con la condición de que dicha sonda se hibrida específicamente a
Mycoplasma genitalium.
La secuencia que se representa en SEQ ID NO 124
es nueva.
La invención proporciona también un método como
se ha descrito arriba para detectar e identificar una o más cepas de
Pseudomonas en una muestra, en el cual el paso (iii)
comprende hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 111,
112, 113, 114 ó 115 con la condición de que dicha sonda se hibrida
específicamente a cepas de Pseudomonas.
Las secuencias que se representan en SEQ ID NO
111 a 115 son nuevas.
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos, tres, o cuatro de dichas sondas.
Más particularmente, la invención proporciona un
método como se ha descrito arriba para detectar e identificar una o
más cepas de Pseudomonas aeruginosa en una muestra, en el
cual el paso (iii) comprende hibridación a al menos una de las
sondas siguientes:
y muy preferiblemente a al menos
una de las sondas
siguientes:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 111
con la condición de que dicha sonda se hibrida específicamente a
Pseudomonas aeruginosa.
La secuencia que se representa en SEQ ID NO 111
es nueva.
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos, tres, cuatro o cinco de dichas sondas.
La invención proporciona también un método como
se ha descrito arriba para detectar e identificar una o más especies
de Staphylococcus en una muestra, en el cual el paso (iii)
comprende hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 139,
140, 141, 142, 143 ó 144 con la condición de que dicha sonda se
hibrida específicamente a especies de Staphylococcus.
Las secuencias que se representan en SEQ ID NO
139 a 144 son nuevas.
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos, tres, o cuatro de dichas sondas.
Más particularmente, la invención proporciona un
método como se ha descrito arriba para detectar e identificar una o
más cepas de Staphylococcus aureus en una muestra, en el
cual el paso (iii) comprende hibridación a al menos una, y
preferiblemente las dos, de las sondas siguientes:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 139,
140, 141, 142 ó 143 con la condición de que dicha sonda se hibrida
específicamente a especies de Staphylococcus aureus. De
acuerdo con una realización preferida, se utilizan en combinación
las dos sondas citadas.
En otra realización específica, la invención
proporciona un método como se ha descrito arriba para detectar e
identificar una o más cepas de Staphylococcus epidermidis en
una muestra, en el cual el paso (iii) comprende hibridación a
cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 144 con tal que pueda hacerse
que esta sonda se hibrida específicamente a Staphylococcus
epidermidis.
La invención proporciona también un método como
se ha descrito arriba para detectar e identificar una o más cepas
de Acinetobacter en una muestra, en el cual el paso (iii)
comprende hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 126,
127, 128, 129 ó 130, con la condición de que dicha sonda se hibrida
específicamente a Acinetobacter sp. De acuerdo con una
realización preferida, se utilizan en combinación las dos sondas
citadas.
Las secuencias que se representan en SEQ ID NO
126 a 130 son nuevas.
Más particularmente, la invención proporciona un
método como se ha descrito arriba para detectar e identificar una o
más cepas de Acinetobacter baumanii en una muestra, en el
cual el paso (iii) comprende hibridación a al menos una de las
sondas siguientes:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 126
con la condición de que dicha sonda se hibrida específicamente a
Acinetobacter baumanii. De acuerdo con una realización
preferida, las dos sondas citadas se utilizan en combinación.
La invención proporciona también un método como
se ha descrito arriba, para detectar e identificar una o más cepas
de Listeria en una muestra, en el cual el paso (iii)
comprende hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
y muy preferiblemente a al menos
una de las sondas
siguientes:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 116,
118, 119, 120, 121, 213, 214 ó 215 con la condición de que dicha
sonda se hibrida específicamente a especies de Listeria.
Como se describe en la sección de ejemplos, las
especies de Listeria abarcan especies de Listeria en
el sentido estricto, y un grupo de organismos estrechamente
relacionados a los que se hace referencia como "organismos
semejantes a Listeria". El último grupo puede ser
reconocido específicamente por la sonda
LISP-ICG-1.
Las secuencias que se representan en SEQ ID NO
116, 118 a 121 y 213 a 215 son nuevas.
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos, tres, cuatro, cinco o seis de dichas sondas.
Más particularmente, la invención proporciona un
método como se ha descrito arriba, para detectar e identificar una
o más cepas de Listeria monocytogenes en una muestra, en el
cual el paso (iii) comprende hibridación a al menos una de las
sondas siguientes:
y muy preferiblemente a la sonda
siguiente:
LMO-ICG 3:
AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC
\hskip5cm(SEQ ID NO 42)
o a equivalentes de dichas sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 120
con la condición de que dicha sonda se hibrida específicamente a
especies de Listeria monocytogenes.
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos o tres de dichas sondas.
La invención proporciona también un método como
se ha descrito arriba para detectar e identificar una o más cepas de
Brucella en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
y muy preferiblemente a las sondas
siguientes:
BRU-ICG 4: CGCAAGAAGCTTGCTCAAGCC
\hskip5cm(SEQ ID NO 194)
o a equivalentes de dichas sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 131,
132 ó 154 con la condición de que dicha sonda se hibrida
específicamente a cepas de Brucella.
Las secuencias que se representan en SEQ ID NO
131, 132 y 154 son nuevas.
La invención proporciona también un método como
se ha descrito arriba para detectar e identificar una o más cepas de
Salmonella en una muestra, en el cual el paso (iii)
comprende hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
y muy preferiblemente a las sondas
siguientes:
SALM-ICG 1:
CAAAACTGACTTACGAGTCACGTTTGAG
\hskip3cm(SEQ ID NO 61)
o a equivalentes de dichas sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 133,
134, 135, 136, 137 ó 138, con la condición de que dicha sonda se
hibrida específicamente a cepas de Salmonella.
Las secuencias que se representan en SEQ ID NO
133 a 138 son nuevas.
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos, tres, o cuatro de dichas sondas.
La invención se refiere también a un método como
se ha descrito arriba para detectar e identificar una o más cepas
de Chlamydia en una muestra, en el cual el paso (iii)
comprende hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 122,
123 ó 197, con la condición de que dicha sonda se hibrida
específicamente a cepas de Chlamydia.
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos, tres, cuatro o cinco de dichas sondas.
Más particularmente, la invención se refiere a un
método como se ha descrito arriba para detectar e identificar una o
más cepas de Chlamydia trachomatis en una muestra, en el
cual el paso (iii) comprende hibridación a al menos una de las
sondas siguientes:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 123 ó
197 con la condición de que dicha sonda se hibrida específicamente
a Chlamydia trachomatis.
Las secuencias que se representan en SEQ ID NO
123 y 197 son nuevas.
Con preferencia, se utilizan simultáneamente al
menos dos, tres o cuatro de dichas sondas.
En otra realización particular, la invención
proporciona un método como se ha descrito arriba para detectar e
identificar una o más cepas de Chlamydia psittaci en una
muestra, en el cual el paso (iii) comprende hibridación a al menos
la sonda siguiente:
CHPS-ICG 1:
GGATAACTGTCTTAGGACGGTTTGAC
\hskip5cm(SEQ ID NO 48)
o a equivalentes de dicha sonda,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 122,
con la condición de que dicha sonda se hibrida específicamente a
Chlamydia psittaci.
La secuencia que se representa en SEQ ID NO 122
es nueva.
La invención proporciona también un método como
se ha descrito arriba, para detectar una o más cepas de
Streptococcus en una muestra, en el cual el paso (iii)
comprende hibridación a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 145,
146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 ó 153 con la condición de que
dicha sonda se hibrida específicamente a cepas de
Streptococcus, o equivalentes de estas sondas.
Las secuencias que se representan en SEQ ID NO
145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 ó 153 son nuevas.
La invención proporciona también un método como
se ha descrito arriba, para detectar una o más cepas de Yersinia
enterocolitica en una muestra, en el cual el paso (iii)
comprende hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
o a equivalentes de dichas
sondas,
y/o a cualquier sonda derivada de SEQ ID NO 195 ó
196, con la condición de que dicha sonda se hibrida específicamente
a Yersinia enterocolitica.
Las secuencias que se representan en SEQ ID NO
195 y 196 son nuevas.
En algunos casos puede ser ventajoso amplificar
no todos los organismos presentes en una muestra, sino únicamente
taxones más específicos, que se consideran relevantes. En estos
casos, la invención proporciona iniciadores que permiten la
amplificación específica de la región espaciadora para sólo dichos
taxones definidos de antemano.
La invención proporciona por tanto un método como
se ha descrito arriba para detectar e identificar específicamente
Chlamydia trachomatis en una muestra, en el cual el paso
(ii) comprende amplificación de la región espaciadora
16S-23S de rRNA o parte de la misma, utilizando al
menos uno de los iniciadores siguientes:
o equivalente de estos iniciadores,
difiriendo dichos equivalentes en secuencia de los iniciadores
mencionados anteriormente por cambio de uno o más nucleótidos, con
la condición de que dichos equivalentes amplifican todavía
específicamente la región espaciadora de Chlamydia
trachomatis o parte de
ella.
Preferiblemente se utilizan ambos
iniciadores.
La invención proporciona también un método como
se ha descrito arriba para detectar e identificar específicamente
especies de Listeria en una muestra, en el cual el paso (ii)
comprende amplificación de la región espaciadora
16S-23S de rRNA o una parte de la misma, utilizando
al menos uno de los iniciadores siguientes:
o equivalentes de estos
iniciadores, difiriendo dichos equivalentes en secuencia de los
iniciadores mencionados anteriormente por cambio de uno o más
nucleótidos, con la condición de que dichos equivalentes
amplificarán todavía específicamente la región espaciadora de
especies de Listeria o parte de
ella.
La invención se refiere también a un método como
se ha descrito arriba para detectar e identificar específicamente
especies de Mycobacterium en una muestra, en el cual el paso
(ii) comprende amplificación de la región espaciadora
16S-23S de rRNA o una parte de ella, utilizando al
menos uno de los iniciadores siguientes:
o equivalentes de estos
iniciadores, difiriendo dichos equivalentes en secuencia de los
iniciadores arriba mencionados por cambio de uno o más nucleótidos,
con la condición de que dichos equivalentes amplificarán todavía
específicamente la región espaciadora de especies de
Mycobacterium o parte de
ella.
La invención proporciona también un método como
se ha descrito arriba para detectar e identificar específicamente
especies de Brucella en una muestra, en el cual el paso (ii)
comprende amplificación de la región espaciadora
16S-23S de rRNA o parte de ella, utilizando al
menos uno de los iniciadores siguientes:
o equivalentes de estos
iniciadores, difiriendo dichos equivalentes en secuencia de los
iniciadores arriba mencionados por cambio de uno o más nucleótidos,
con la condición de que dichos equivalentes amplifican todavía
específicamente la región espaciadora o parte de ella de especies
de
Brucella.
La invención proporciona también un método como
se ha descrito arriba para detectar e identificar específicamente
especies de Yersinia enterocolitica en una muestra, en el
cual el paso (ii) comprende amplificación de la región espaciadora
16S-23S de rRNA o parte de ella, utilizando al
menos uno de los iniciadores siguientes:
o equivalentes de estos
iniciadores, difiriendo dichos equivalentes en secuencia de los
iniciadores arriba mencionados por cambio de uno o más nucleótidos,
con la condición de que dichos equivalentes amplifiquen todavía
específicamente la región espaciadora de especies de Yersinia
enterocolitica o parte de
ella.
La invención proporciona también una composición
que comprende al menos una de las sondas y/o iniciadores que se han
definido arriba.
Dicha composición puede comprender cualquier
vehículo, soporte, marcador o diluyente conocido en la técnica para
sondas o iniciadores, más particularmente cualquiera de los
marcadores o soportes detallados en la sección de definiciones.
La invención se refiere más particularmente a
sondas e iniciadores aislados como se han definido arriba, más
particularmente cualquiera de las sondas que se especifican en la
Tabla 1a o cualquiera de los iniciadores que se especifican en la
Tabla 1b.
De acuerdo con otra realización, la presente
invención se refiere también a nuevas secuencias de región
espaciadora como se han definido arriba y como se indican en las
Figuras 1-103 (SEQ ID NO 76 a 154, SEQ ID NO 157 a
174, SEQ ID NO 195 a 197 y SEQ ID NO 213 a 215).
En otra realización, la invención proporciona un
método de hibridación inversa que comprende cualquiera de las
sondas que se han definido arriba, en el cual dichas sondas se
inmovilizan en una localización conocida sobre un soporte sólido,
más preferiblemente sobre una tira de membrana.
En otra realización adicional, la invención
proporciona un kit para la detección e identificación de al menos
un micro-organismo, o la detección e identificación
simultáneas de varios micro-organismos en una
muestra, que comprende los componentes siguientes:
- (i)
- en caso apropiado, al menos un par de iniciadores adecuado que permite la amplificación de la región espaciadora intercistrónica 16S-23S de rRNA, o una parte de ella,
- (ii)
- al menos una de las sondas que se han definido arriba;
- (iii)
- un tampón, o componentes necesarios para producir el tampón, que permiten una reacción de hibridación entre dichas sondas y los ácidos polinucleicos presentes en la muestra, o los productos amplificados de los mismos;
- (iv)
- una solución, o componentes necesarios para producir la solución, que permite lavado de los híbridos formados en las condiciones de lavado apropiadas;
- (v)
- en caso apropiado, un medio para detección de los híbridos resultantes de la hibridación que antecede.
Fig 1: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de la cepa de
Mycobacterium tuberculosis H37RV ATCC 27294 (SEQ ID NO
76)
Fig 2: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de
Mycobacterium avium ATCC 151.769 (ITG 4991) (SEQ ID NO
77)
Fig 3: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de las cepas de
Mycobacterium paratuberculosis 316F y 2E (SEQ ID NO 78)
Fig 4: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de la cepa de
Mycobacterium ITG 5513 (SEQ ID NO 79)
Fig 5: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de la cepa de
Mycobacterium ITG 8695 (SEQ ID NO 80)
Fig 6: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de la cepa de
Mycobacterium ITG 8708 (SEQ ID NO 81)
Fig 7. representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de la cepa de
Mycobacterium ITG 8715 (SEQ ID NO 82)
Fig 8: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de la cepa de
Mycobacterium ITG 8054 (SEQ ID NO 83)
Fig 9: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de la cepa de
Mycobacterium ITG 8737 (SEQ ID NO 84)
Fig 10: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de la cepa de
Mycobacterium ITG 8743 (SEQ ID NO 85)
Fig 11: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de la cepa de
Mycobacterium ITG 8745 (SEQ ID NO 86)
Fig 12: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de la cepa de
Mycobacterium ITG 8748 (SEQ ID NO 87)
Fig 13: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de la cepa de
Mycobacterium ITG 8752 (SEQ ID NO 88)
Fig 14: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de
Mycobacterium intracellulare serovar 12 ITG 5915 (SEQ ID NO
89)
Fig 15: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de
Mycobacterium lufu ITG 4755 (SEQ ID NO 90)
Fig 16: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de la cepa de
Mycobacterium ITG 5922 (SEQ ID NO 91)
Fig 17: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de la cepa de
Mycobacterium ITG 1329 (SEQ ID NO 92)
Fig 18: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de la cepa de
Mycobacterium ITG 1812 (SEQ ID NO 93)
Fig 19: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de la cepa de
Mycobacterium ITG 5280 (SEQ ID NO 94)
Fig 20: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de la cepa de
Mycobacterium ITG 5620 (SEQ ID NO 95)
Fig 21: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de la cepa de
Mycobacterium ITG 5765 (SEQ ID NO 96)
Fig 22: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de
Mycobacterium ITG 7395 (SEQ ID NO 97)
Fig 23: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de
Mycobacterium ITG 8738 (SEQ ID NO 98)
Fig 24: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA de
Mycobacterium ITG 926 (SEQ ID NO 99)
Fig 25: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de ycobacterium
scrofulaceum ITG 4988 (SEQ ID NO 100)
Fig 26: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
kansasii ATCC 22478 (= ITG 4987) (SEQ ID NO 101)
Fig 27: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
chelonae abcessus ITG 4975 (SEQ ID NO 102)
Fig 28: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
chelonae chelonae ITG 9855 (SEQ ID NO 103)
Fig 29: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
gordonae ITG 7703 (SEQ ID NO 104)
Fig 30: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
gordonae ITG 7836 (SEQ ID NO 105)
Fig 31: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
gordonae ITG 8059 (SEQ ID NO 106)
Fig 32: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
malmoense ITG 4842 e ITG 4832 (SEQ ID NO 107)
Fig 33: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S- 23S de la cepa de Mycobacterium 8757
(SEQ ID NO 108)
Fig 34: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S- 23S de Mycobacterium ITG 8723 (SEQ ID
NO 109)
Fig 35: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
ITG 8724 (SEQ ID NO 110)
Fig 36: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S- 23S de Pseudomonas aeruginosa UZG
5669 (SEQ ID NO 111)
Fig 37: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S- 23S de Pseudomonas pseudoalcaligenes
LMG 1225 (SEQ ID NO 112)
Fig 38: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Pseudomonas
stutzeri LMG 2333 (SEQ ID NO 113)
Fig 39: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Pseudomonas
alcaligenes LMG 1224 (SEQ ID NO 114)
Fig 40: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Pseudomonas
putida LMG 2232 (SEQ ID NO 115)
Fig 41: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora pequeña 16S-23S de Listeria
ivanovii CIP 7842 (SEQ ID NO 116)
Fig 42: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora pequeña 16S-23S de Listeria
monocitogenes (SEQ ID NO 117)
Fig 43: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora pequeña 16S-23S de Listeria
seeligeri serovar 4A nr. 4268 (SEQ ID NO 118)
Fig 44: representa la secuencia parcial de DNA de
la región espaciadora grande 16S-23S de la
secuencia parcial de la región espaciadora larga de Listeria
ivanovii CIP 7842 (SEQ ID NO 119)
Fig 45: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora grande 16S-23S de Listeria
monocytogenes IHE serovar 4B (SEQ ID NO 120)
Fig 46: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora grande 16S-23S de Listeria
seeligeri serovar 4A nr. 4268 (SEQ ID NO 121)
Fig 47: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Chlamydia
psittaci 6BC (SEQ ID NO 122)
Fig 48: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S- 23S de Chlamydia trachomatis (SEQ ID
NO 123)
Fig 49: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycoplasma
genitalium (U. Gobel) (SEQ ID NO 124)
Fig 50: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Micoplasma
pneumoniae ATCC 29432 (SEQ ID NO 125)
Fig 51: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Acinetobacter
baumanii LMG 1041 (SEQ SD NO 126)
Fig 52: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Acinetobacter
calcoaceticus LMG 1046 (SEQ ID NO 127)
Fig 53: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Acinetobacter
haemolyticus LMG 996 (SEQ ID NO 128)
Fig 54: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Acinetobacter
johnsonii LMG 999 (SEQ ID NO 129)
Fig 55: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Acinetobacter
junii LMG 998 (SEQ ID NO 130)
Fig 56: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Brucella
melitensis NIDO Biovar 1 (SEQ ID NO 131)
Fig 57: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Brucella suis
NIDO Biovar 1 (SEQ ID NO 132)
Fig 58: representa la secuencia de DNA de una de
las regiones espaciadoras 16S-23S de Salmonella
dublin (SEQ ID NO 133)
Fig 59: representa la secuencia de DNA de una de
las regiones espaciadoras 16S-23S de Salmonella
dublin (SEQ ID NO 134)
Fig 60: representa la secuencia de DNA de una de
las regiones espaciadoras 16S-23S de Salmonella
enteritidis (SEQ ID NO 135)
Fig 61: representa la secuencia de DNA de una de
las regiones espaciadoras 16S-23S de Salmonella
enteritidis (SEQ ID NO 136)
Fig 62: representa la secuencia de DNA de una de
las regiones espaciadoras 16S-23S de Salmonella
typhimurium (SEQ ID NO 137)
Fig 63: representa la secuencia de DNA de una de
las regiones espaciadoras 16S-23S de Salmonella
typhimurium (SEQ ID NO 138)
Fig 64: representa la secuencia de DNA de una de
las regiones espaciadoras 16S-23S de la cepa de
Staphylococcus aureus UZG 5728 (SEQ ID NO 139)
Fig 65: representa la secuencia de DNA de una de
las regiones espaciadoras 16S-23S de la cepa de
Staphylococcus aureus UZG 6289 (SEQ ID NO 140)
Fig 66: representa la secuencia de DNA de una de
las regiones espaciadoras 16S-23S de la cepa de
Staphylococcus aureus strain UZG 6289 (SEQ ID NO 141)
Fig 67: representa la secuencia de DNA de una de
las regiones espaciadoras 16S-23S de la cepa de
Staphylococcus aureus UZG 6289 (SEQ ID NO 142)
Fig 68: representa la secuencia de DNA de una de
las regiones espaciadoras 16S-23S de la cepa de
Staphylococcus aureus UZG 6289 (SEQ ID NO 143)
Fig 69: representa la secuencia de DNA de una de
las regiones espaciadoras 16S-23S de la cepa de
Staphylococcus epidermidis UZG CNS41 (SEQ ID NO 144)
Fig 70: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Streptococcus
mitis UZG 2465 (SEQ ID NO 145)
Fig 71: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Streptococcus
pyogenes UZG 3671 (SEQ ID NO 146)
Fig 72: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Streptococcus
sanguis UZG 1042 (SEQ ID NO 147)
Fig 73: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Streptococcus
saprophyticus UZG CNS46 (SEQ ID NO 148)
Fig 74: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Streptococcus
species UZG 536 (84) (SEQ ID NO 149)
Fig 75: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Streptococcus
species UZG 4341 (SEQ ID NO 150)
Fig 76: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Streptococcus
species UZG 457 (44B) (SEQ ID NO 151)
Fig 77: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Streptococcus
species UZG 97A (SEQ ID NO 152)
Fig 78: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Streptococcus
species UZG 483 (76) (SEQ ID NO 153)
Fig 79: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Brucella
abortus NIDO Tulya biovar 3 (SEQ ID NO 154)
Fig 80: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
ulcerans ITG 1837 y Mycobacterium marinum ITG 7732 (SEQ
ID NO 157)
Fig 81: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
genavense ITG 8777 (SEQ ID NO 158)
Fig 82: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
genavense ITG 92-742 (SEQ ID NO 159)
Fig 83: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
genavense ITG 9500 (SEQ ID NO 160)
Fig 84: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de ITG 7379 semejante a
Mycobacterium simiae (SEQ ID NO 161)
Fig 85: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de ITG 9745 semejante a
Mycobacterium simiae (SEQ ID NO 162)
Fig 86: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
xenopi ITG 4986 (SEQ ID NO 163)
Fig 87: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
simiae A ITG 4485 (SEQ ID NO 164)
Fig 88: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S- 23S de Mycobacterium simiae B ITG
4484 (SEQ ID NO 165)
Fig 89: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
fortuitum ITG 4304 (SEQ ID NO 166)
Fig 90: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
kansasii ITG 6328 (SEQ ID NO 167)
Fig 91: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
kansasii ITG 8698 (SEQ ID NO 168)
Fig 92: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
kansasii ITG 8973 (SEQ ID NO 169)
Fig 93: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
celatum ITG 94-123 (SEQ ID NO 170)
Fig 94: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
haemophilum ITG 776 (SEQ ID NO 171)
Fig 95: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
haemophilum ITG 778 (SEQ ID NO 172)
Fig 96: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
haemophilum ITG 3071 (SEQ ID NO 173)
Fig 97: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de Mycobacterium
chelonae ITG 94-330 e ITG 94-379
(SEQ ID NO 174)
Fig 98: representa la secuencia de DNA de una
región espaciadora 16S-23S de la cepa P95 de
Yersinia enterocolitica (SEQ ID NO 195)
Fig 99: representa la secuencia de DNA de una
región espaciadora 16S-23S de la cepa P95 de
Yersinia enterocolitica (SEQ ID NO 196)
Fig 100: representa la secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de la cepa SSDZ 94 M
1961 de Chlamydia trachomatis (SEQ ID NO 197)
Fig 101: representa la secuencia de DNA de una
región espaciadora 16S-23S del material aislado MB
405 semejante a Listeria (SEQ ID NO 213)
Fig 102: representa la secuencia de DNA de una
región espaciadora 16S-23S del material aislado MB
405 semejante a Listeria (SEQ ID NO 214)
Fig 103: representa la secuencia de DNA de una
región espaciadora 16S-23S del material aislado MB
405 semejante a Listeria (SEQ ID NO 215)
Tabla 1a: Lista de todas las nuevas sondas
procedentes de la región espaciadora 16S-23S de
rRNA.
Tabla 1b: Lista de los posibles iniciadores a
utilizar para amplificación específica del taxón de la región
espaciadora o parte de ella.
Tabla 2: Resultados de hibridación para
Pseudomonas.
Tabla 3: Diferentes patrones de sonda obtenidos
para tipos de cepas micobacterianas.
Tabla 4: Cepas de micobacterias ensayadas en
LiPA.
Tabla 5: Resultados de hibridación para
Listeria (Sondas LMO1, 2, LSE1, LIV1, LIS1).
Tabla 6: Resultados de hibridación para
Listeria (sondas LMO3, LIS1).
Tabla 7: Resultados de hibridación para
Chlamydia.
Tabla 8: Nuevas sondas micobacterianas y
resultados de hibridación.
Tabla 9: Resultados de hibridación para
Brucella.
Tabla 10: Resultados de hibridación para
Staphylococcus.
Pseudomonas aeruginosa es un patógeno
humano importante, usualmente en el contexto de una enfermedad grave
subyacente. Es también una causa principal de infecciones
hospitalarias, que son característicamente propensas a la
resistencia a agentes antimicrobianos. Este bastoncillo
gram-negativo no fermentante puede ser responsable
de diferentes manifestaciones clínicas, como infecciones de heridas,
bacteremia, infecciones de los tractos respiratorio y urinario, y
es también una causa principal de morbilidad y mortalidad en
pacientes con fibrosis quística.
Las especies de Pseudomonas se diferencian
actualmente sobre la base de las características de crecimiento y
diversas características bioquímicas que implican un protocolo de
tiempos de 24 h a 72 h para obtener una identificación correcta del
patógeno.
El desarrollo de anticuerpos monoclonales o
policlonales ha mejorado ya significativamente la identificación de
las especies de Pseudomonas. Sin embargo, en fecha reciente
se ha demostrado que es posible detectar organismos directamente en
muestras clínicas de un modo muy sensible y específico utilizando
sondas de DNA con o sin una amplificación previa del DNA diana.
Sondas de DNA para estudiar Pseudomonas
aeruginosa han sido ya descritas y se utilizan principalmente
para tipificación epidemiológica (Ogle et al., 1987;
Samadpour et al., 1988; McIntosh et al., 1992). Sin
embargo, ninguna de estas sondas se ha derivado del espaciador
16S-23S.
La región espaciadora génica
16S-23S de rRNA y una parte del gen 23S de rRNA se
amplificó con iniciadores conservados (iniciador superior:
TGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA, SEQ ID NO 155; iniciador inferior:
CCTTTCCCTCACGGTACTGGT, SEQ ID NO 156) utilizando la reacción en
cadena de la polimerasa para las especies siguientes:
- -
- Pseudomonas aeruginosa 5669
- -
- Pseudomonas alcaligenes LMG 1224^{T}
- -
- Pseudomonas fluorescens LMG 5167
- -
- Pseudomonas putida LMG 2232
- -
- Pseudomonas stutzeri LMG 2333^{T}
- -
- Pseudomonas pseudoalcaligenes LMG 1225^{T}.
Para facilitar la clonación de los amplicones
obtenidos, se añadió un sitio de reconocimiento NotI al
iniciador inferior. Después de purificación y digestión del
fragmento con NotI, el amplicón se clonó en un vector
plasmídico pBluescript SK^{+} digerido con
EcoRV/NotI.
La secuenciación de la región espaciadora del gen
16S-23S de rRNA se realizó de acuerdo con la
química de terminación de cadenas didesoxi utilizando DNA
plasmídico bicatenario combinado con iniciadores localizados en el
vector de plásmido o directamente en los productos PCR después de
purificación combinada con iniciadores PCR internos.
Las Fig. 36 a 40 representan la secuencia de
nucleótidos de las regiones espaciadoras del gen
16S-23S de rRNA de las diferentes especies de
Pseudomonas arriba descritas. Para P. fluorescens
únicamente se obtuvo información parcial de la secuencia.
A partir de la secuencia de ácido nucleico del
espaciador de la cepa 5669 de P. Aeruginosa, se
seleccionaron cinco sondas oligonucleotídicas y se sintetizaron
químicamente. Las secuencias de los oligonucleótidos son las
siguientes:
Se llevaron a cabo tests de especificidad y
sensibilidad de las sondas oligonucleotídicas utilizando un ensayo
de hibridación inversa. El DNA genómico de las diferentes bacterias
ensayadas se amplificó utilizando iniciadores biotinilados (los
mismos iniciadores que para el procedimiento de clonación, véase
arriba). El amplicón obtenido, que abarcaba la región espaciadora
del gen 16S-23S de rRNA, se desnaturalizó y se
hibridó a una tira de membrana sobre la cual se inmovilizaron las
diferentes sondas oligonucleotídicas en línea (LiPA). La hibridación
se llevó a cabo en una mezcla de 3xSSC (1xSSC = NaCl 0,15 M,
citrato de sodio 0,015 M, pH 7,0) y formamida (FA) al 20% a una
tempe-
ratura de 50ºC durante una hora. El lavado se realizó en la misma mezcla y a la misma temperatura durante 15 min.
ratura de 50ºC durante una hora. El lavado se realizó en la misma mezcla y a la misma temperatura durante 15 min.
Los híbridos se detectaron utilizando un
conjugado de estreptavidina acoplado a fosfatasa alcalina y se
visualizaron las sondas por una reacción de precipitación
utilizando NBT (nitroazultetrazolio) y BCIP
(bromo-cloro-fosfato de
indolilo).
Los resultados de hibridación obtenidos con las
sondas PA1, PA2 y PA3 se dan en la Tabla 4 y muestran que las
sondas PA1 y PA3 eran 100% específicas para Pseudomonas
aeruginosa y se hibridaban a todas las cepas ensayadas. La señal
de hibridación con la sonda PA3 a 50ºC no era óptima, por lo que la
sonda oligonucleotídica se mejoró por adición de algunos
nucleótidos adicionales a la sonda específica. Esta sonda de nuevo
diseño es PA5.
PA5 = PA-ICG5:
CTCTTTCACTGGTGATCATTCAAGTCAAG
Los experimentos de hibridación realizados con la
sonda PA5 demostraron que esta sonda exhibe también especificidad
100% y sensibilidad 100% para P. aeruginosa.
La sonda oligonucleotídica PA2 se hibridaza sólo
a 5 de 17 cepas de P. aeruginosa ensayadas.
La secuenciación directa de la región espaciadora
del gen 16S-23S de rRNA de las cepas que no se
hibridaban a estas sondas, mostró cierta heterogeneidad entre las
diferentes cepas. Se observaron dos desapareamientos en comparación
con la primera sonda PA2 desarrollada. Para resolver esta
heterogeneidad entre las diferentes cepas en la región de la sonda
PA2, se diseñó una nueva sonda PA4. Esta sonda está degenerada en la
posición de los desapareamientos y se añadieron varios nucleótidos
adicionales para mejorar la señal de hibridación a 50ºC.
PA4 = PA-ICG4:
TGAATGTTCGT(G/A)(G/A)ATGAACATTGATTTCTGGTC
Se obtuvo 100% de especificidad y 100% de
sensibilidad con esta sonda degenerada como se muestra por los
resultados de hibridación.
| Taxones ensayados | PA1 | PA2 | PA3 | PA4 | PA5 |
| Pseudomonas aeruginosa | 17/17 | 5/17 | 17/17 | 17/17 | 17/17 |
| Pseudomonas alcaligenes | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 |
| Pseudomonas fluorescens | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 |
| Pseudomonas putida | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 |
| Pseudomonas pseudoalcaligenes | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 |
| Pseudomonas stutzeri | 0/1 | 0/ 1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 |
| Pseudomanas cepacia | 0/1 | 0/1 | 0/1 | ND | ND |
| Neisseria gonorrhoeae | 0/1 | 0/1 | 0/1 | ND | ND |
| Escherichia coli | 0/1 | 0/ 1 | 0/1 | ND | ND |
| Bordetella pertussis | 0/1 | 0/1 | 0/1 | ND | ND |
| Bordetella parapertussis | 0/1 | 0/1 | 0/1 | ND | ND |
| Bordotella bronchiseptica | 0/1 | 0/1 | 0/1 | ND | ND |
| Mycobacterium tuberculosis | 0/1 | 0/1 | 0/1 | ND | ND |
| Mycobacterium avium | 0/1 | 0/1 | 0/1 | ND | ND |
| Moraxella catarrhalis | 0/4 | 0/4 | 0/4 | ND | ND |
| Haemophilus influenzae | 0/2 | 0/2 | 0/2 | ND | ND |
| Streotococcus pneumoniae | 0/3 | 0/3 | 0/3 | ND | ND |
| Acinetobacter calcoaceticus | 0/1 | 0/1 | 0/1 | ND | ND |
| Staphylococcus aureus | 0/2 | 0/2 | 0/2 | ND | ND |
| (n/m: número de cepas positivas/número de cepas ensayadas) | |||||
| (ND: no realizado). |
Una diversidad de especies micobacterianas pueden
estar implicadas en enfermedad infecciosa humana grave. Ejemplos
notables son Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium
leprae. Recientemente se han encontrado con mayor frecuencia
otras especies tales como M. avium, M. intracellulare
y M. kansasii como patógenos humanos, especialmente en
hospedadores inmunodeficientes.
Por consiguiente, el diagnóstico en laboratorio
de infecciones micobacterianas no debería restringirse al complejo
de M. tuberculosis sino que debería incluir idealmente la
mayoría de las restantes especies de micobacterias clínicamente
relevantes.
La identificación y diferenciación de
micobacterias patógenas al nivel de especies por técnicas
convencionales de laboratorio es, por lo general, difícil y consume
mucho tiempo.
Para resolver estos problemas se implementaron
técnicas de DNA. Las técnicas descritas se han extendido desde el
sondeo de DNA directo al análisis automático de secuencias.
Recientemente se han consignado varios métodos (Jonas et al.,
1993; Frothingham y Wilson, 1993; Tomioka et al., 1993;
Saito et al., 1989; Vaneechoutte et al., 1993;
Telenti et al., 1993; Böddinghaus et al., 1990).
Sin embargo, todos estos métodos tienen sus
desventajas particulares, y la mayoría de ellos están basados
todavía en cultivo. Además, y lo que es más importante, ninguna de
estas técnicas permite una detección simultánea de las diferentes
especies micobacterianas clínicamente importantes en una sola
ejecución del test. Además, la diferenciación de grupos
particulares dentro del complejo Mycobacterium
avium-intracellulare es problemática y a menudo
incluso imposible.
Para resolver las desventajas arriba mencionadas,
se desarrolló un test LiPA que permite la detección y
diferenciación simultánea y fiable de varias especies y grupos de
Mycobacterium. Las series de sondas utilizadas para alcanzar
estas metas se derivaban todas ellas de la región espaciadora
16S-23S de rRNA. Los métodos utilizados son
análogos a los mencionados en el Ejemplo 1.
La región espaciadora 16S-23S de
rRNA, y parte de los genes flanqueantes 16S y 23S de rRNA, se
amplificó por PCR con iniciadores conservados para el género
Mycobacterium. Como iniciadores superiores se utilizó al
menos uno de los iniciadores siguientes localizado en el gen
16S:
Como iniciadores inferiores para la amplificación
se utilizaron al menos uno de los siguientes iniciadores,
localizados en el gen 23S:
Todos los iniciadores arriba mencionados
amplificaban la región espaciadora de todas las cepas de
Mycobacterium ensayadas, excepto el iniciador
MYC-P2 que no era funcional para M.
chelonae. A fin de mejorar la sensibilidad de la detección, se
realizó en ocasiones una PCR anidada, utilizando P5 y P4 como
iniciadores externos y P1 y P3 como iniciadores internos.
Para poder diseñar y seleccionar las sondas y
combinaciones de sondas que se adaptaran al propósito de los
autores de la invención, se secuenció la región espaciadora
16S-23S de rRNA de varias cepas micobacterianas. Las
secuencias obtenidas se compararon unas con otras y con las ya
conocidas por la bibliografía (v.g. Frothingham et al.,
1993, 1994; Kempsell et al., 1992; Suzuki et al.,
1988; documento EP-A-0395292; Van
der Giessen et al., 1994); o de bancos de datos públicamente
accesibles. Las secuencias correspondientes se representan en Fig.
1 a 35 (SEQ ID NO 76 a SEQ ID NO 110).
Las sondas derivadas de estos datos se ajustaron
todas ellas de tal modo que se obtuvo el comportamiento de
hibridación deseado utilizando condiciones unificadas de
hibridación y lavado (a saber 3 x SSC, formamida desionizada al 20%,
50ºC). La serie de sondas ajustadas utilizadas para la hibridación
a cepas micobacterianas diferentes se representa en la Tabla 1a,
SEQ ID NO 1-33. Téngase en cuenta que la
nomenclatura de las sondas utilizada en este ejemplo es una versión
abreviada de la utilizada en la Tabla 1a: a saber, las letras
"ICG" se han omitido en todos los casos. De acuerdo con el
patrón específico de hibridación obtenido, las cepas ensayadas
pudieron asignarse a una de las especies o grupos de especies
siguientes: complejo de M. tuberculosis, M. avium,
M. intracellulare o complejo de M. intracellulare,
M. kansasii, M. chelonae y M. gordonae. Las
cepas ensayadas que pertenecen a cada grupo se resumen en la Tabla
4. Todas las cepas se obtuvieron del Institute of Tropical
Medicine, Amberes, Bélgica. Los diferentes patrones de sonda
obtenidos para cada grupo se ilustran en la Tabla 3, y se exponen
con mayor detalle a continuación.
El complejo de M. tuberculosis aloja todas
las cepas pertenecientes a M. tuberculosis, M. bovis,
M. africanum y M. microti. Las sondas Mtb1,
Mtb2 y Mtb3 se hibridan con DNA procedente de todas las
cepas del complejo de M. tuberculosis ensayadas. Ninguna de
las otras cepas ensayadas se hibridaba con estas sondas en las
condiciones utilizadas.
Adicionalmente, las cepas del complejo de M.
tuberculosis, como sucede con todas las restantes cepas
micobacterianas ensayadas, se hibridan con la sonda myc1 o
la sonda myc22 o con ambas. Las dos últimas sondas están
diseñadas como sondas generales de Mycobacterium, sea solas
o en combinación.
Todas las cepas de M. avium y M.
paratuberculosis estudiadas revelan un patrón de hibridación
idéntico con la serie de sondas. Para este tipo de organismos se
obtienen señales de hibridación positivas con las sondas
myc1/myc22, mai1, mil11, mav1, mah1 y mav22. Las dos
últimas sondas se hibridan exclusivamente con cepas de M.
avium y M. paratuberculosis, y pueden utilizarse por
tanto como sondas específicas de especie. Dado que las secuencias
espaciadoras 16S-23S de los materiales aislados de
M. avium y materiales aislados de M. paratuberculosis
son idénticas o casi idénticas, estos dos taxones no pueden
discriminarse uno de otro. Este descubrimiento respalda los datos de
secuenciación de 16S de rRNA que indican que M. avium y M.
paratuberculosis deberían considerarse de hecho como
pertenecientes a una genoespecie (Rogal et al., 1990), M.
avium ssp. avium y M. avium ssp.
paratuberculosis.
Las cepas de MIC son organismos genotípicamente
muy emparentados que, de acuerdo con datos de secuencia de DNA de la
región espaciadora 16S-23S de rRNA, pertenecen a una
agrupación distinta que está separada de otras especies de
Mycobacterium. M. avium y M. scrofulaceum son
sus parientes más próximos. Casi todas las cepas ensayadas a las
que se hace referencia generalmente como cepas del complejo de
M. avium (MAC) (el antiguo complejo MAIS) pueden encontrarse
en el grupo MIC. Así, el grupo MIC definido en la presente
invención abarca las cepas de tipo MAC descritas por Frothingham y
Wilson (1993) con la excepción de MAC-G que parece
ser M. scrofulaceum. Asimismo, las cepas M.
intracellulare en sentido estricto (M. intracellulare
s.s.) forman parte de esta agrupación.
Dado que este grupo MIC contiene un grupo
bastante amplio de cepas que comprenden entre ellas subgrupos que
exhiben características de hibridación diferentes a la serie de
sondas, se ideó una subdivisión ulterior en tipos de MIC.
El tipo MIC 1 aloja M. intracellulare
s.s., junto con algunas otras cepas MAC. Todos los materiales
aislados de tipo MIC 1, sin excepción, se hibridan a las sondas
siguientes: myc1/myc22, mai1 y mac1. Pueden utilizarse
las sondas siguientes para realizar subdivisiones adicionales
dentro del grupo MIC 1: mil11, min1, min2 a 2222, mil22 y
mhef1.
Las cepas de M. intracellulare sensu
stricto (tipo MIC 1.1.a) pueden diferenciarse de otros
subtipos en este grupo en virtud de la sonda min1 que es
positiva únicamente para este grupo de cepas. Todas las cepas del
tipo MIC 1.1.a son positivas cuando se ensayan con la sonda M.
intracellulare del sistema
Gen-Probe-Rapid Diagnostic para
MAC. Los tipos MIC 1.1.b y MIC 1.2 alojan variedades
que están estrechamente emparentadas con M. intracellulare.
Las mismas pueden diferenciarse utilizando las sondas mil11
y mil22 (véase la Tabla 3). No se intentó una subdivisión
ulterior dentro de estos grupos, aunque podría conseguirse
utilizando las sondas: min2, min22, min222, y
min2222. Una subdivisión ulterior podría ser valiosa por
razones epidemiológicas.
Únicamente dos de la colección de cepas de los
autores de la invención se ensayaron en grupo como cepas MIC
2. Una de estas cepas es una cepa de "Mycobacterium
lufu" (ITG 4755). El patrón de sonda específico generado por
estas cepas se caracteriza por una señal de hibridación positiva
con las sondas siguientes: myc1/myc22, mai1, mil22, mah1 y
mal1. Se obtienen resultados de hibridación variables con las
sondas min2222, mac1 y mhef1. Las otras sondas son
negativas. No es improbable que MIC 2 pudiera resultar finalmente
ser un grupo heterogéneo cuando se identifiquen más cepas de este
tipo. Las sondas variables pueden contribuir a una diferenciación
fácil, si ello fuese pertinente.
El tipo MIC 3 agrupa un número bastante
alto de cepas MAC que están más bien poco emparentadas con las
cepas M. intracellulare s.s. y la mayoría de las restantes
cepas MAC. Esta agrupación debería considerarse como distinta de
M. avium y M. intracellulare sobre bases genotípicas.
Todos los subtipos MIC 3 se hibridan a las sondas myc1/myc22,
mai1, mil22 y mco 1. Una señal positiva con la última
sonda (mco1) es característica para las cepas MIC3. Se obtienen
resultados de hibridación variables con las sondas siguientes:
mac1, mhef1 y mah1. MIC 3 puede subdividirse
ulteriormente en cuatro subtipos utilizando tres sondas: mth11,
mth2 y mef11. La sonda mth2 es específica para el tipo
MIC 3.1 que abarca un grupo de cepas MAC muy semejantes
aisladas de humanos inmunodeficientes. La mayoría de las cepas MIC 3
están localizadas en el subtipo MIC 3.1. Eventualmente puede
asignarse un estado de especie a este grupo de cepas, como podría
ocurrir también para otros grupos de cepas MAC, todavía sin
denominación asignada. En los subtipos MIC 3.4, MIC 3.3 y
MIC 3.2 únicamente dos, una y una cepas se encuentran
respectivamente en la colección de cepas ensayada por los autores de
la invención.
El tipo MIC 4 es una colección de cepas
"MAIS" (con inclusión de M. malmoense) que están
lejanamente emparentadas con M. intracellulare. La única
sonda de la serie arriba descrita que se hibrida a MIC 4, aparte de
las sondas generales myc1/myc22, es la sonda mai1. Esta
sonda exhibe una especificidad amplia, hibridándose también con
M. avium, M. intracellulare y otras cepas MIC y M.
scrofulaceum.
Todas las cepas de M. scrofulaceum
ensayadas revelan un patrón de hibridación idéntico con la serie
de sondas. Una señal positiva con la sonda msc1 es exclusiva
de las cepas M. scrofulaceum. Las únicas sondas restantes con
señal positiva para esta especie son evidentemente myc1/myc22 así
como mai1.
Las sondas mka3 y mka4 son
específicas para M. kansasii: es decir se obtiene una señal
positiva clara sobre la tira LiPA cuando se utiliza DNA amplificado
procedente de las cepas de M. kansasii en la hibridación,
mientras que con todos los restantes organismos ensayados la señal
está ausente. Aunque las secuencias de las sondas mka1 y
mka2 o son absolutamente complementarias para la secuencia
diana (3 y 1 desapareamientos, respectivamente), estas sondas
demostraron ser útiles también, dado que se hibridaban
exclusivamente con DNA de M. kansasii y no lo hacían con
ningún otro DNA micobacteriano ensayado en las condiciones
utilizadas (50ºC, 3xSSC, formamida al 20%). Esto ilustra que no es
necesario que las sondas coincidan perfectamente con la diana para
ser útiles, y que pueden permitirse modificaciones en secuencia y
longitud hasta cierto punto.
La especie M. chelonae abarca las cepas
M. chelonae ssp. y M. chelonae ssp. abscessus. La
región espaciadora se secuenció para una sola cepa de cada
subespecie y se observaron pequeñas diferencias (SEQ ID NO. 103 y
SEQ ID NO. 102). Las sondas mch1 y mch2 se hibridan
con ambas cepas. Todas las restantes sondas son negativas para
estas dos cepas excepto para myc1/myc22.
Como consecuencia del ensayo de las sondas mch1 y
mch2 con dos cepas adicionales de M. chelonae no mencionadas
en la Tabla 4, a saber M. chelonae 94-379 y
M. chelonae 94-330, obtenidas ambas del
Instituto de Medicina Tropical de Amberes, Bélgica, se encontró que
las mismas no se hibridaban a la sonda mch1. Esto se confirmó por
secuenciación de la región espaciadora de estas dos cepas (SEQ ID
NO. 184). El análisis de agrupaciones de la región espaciadora con
otras micobacterias reveló que las cepas M. chelonae pueden
subdividirse en dos grupos. Se diseñó una tercera sonda mch3
para detectar específicamente este segundo grupo de cepas, a las que
pertenecen 94-379 y 94-330.
Esto ilustra que el uso de sondas de DNA
derivadas de la región espaciadora 16S-23S de rRNA
puede ser útil en la diferenciación de diferentes grupos de cepas,
que pertenecen a la misma especie de acuerdo con los métodos de
identificación clásicos, y posiblemente pueda utilizarse para
detectar y describir nuevas especies dentro de las micobacterias.
En este caso, mch2 detecta todas las cepas de M. chelonae,
mientras que mch1 y mch3 diferencian entre subgrupos diferentes.
Las cinco cepas de M. gordonae ensayadas
se hibridan todas ellas a la sonda mgo5. Se obtienen también
señales de hibridación positivas con las sondas myc1/myc22, y
algunas cepas de M. gordonae se hibridan también a las sondas
mgo1 y mgo2.
Las cepas pertenecientes a otras especies
micobacterianas distintas de las arriba mencionadas se hibridan
únicamente a las sondas generales myc1/myc22. Esto indica
que estas cepas pertenecen muy probablemente al género
Mycobacterium, pero no pertenecen a ninguna de las especies
o grupos que pueden identificarse específicamente utilizando una o
más de las restantes sondas descritas.
En conclusión, puede afirmarse que, de acuerdo
con las combinaciones particulares de sondas de la invención
utilizadas, pueden proporcionarse ensayos de sondas de DNA a
niveles diferentes.
Cuando se utilizan todas las sondas en uno y el
mismo test LiPA, puede conseguirse diferenciación al nivel de
especies así como subtipificación de distintos grupos de
micobacterias. Sin embargo, el ensamblaje de sondas en una sola tira
podría restringirse a aquellas sondas que son específicas de
especie; en dicho caso la identificación se realiza al nivel de
especie. Una reducción ulterior del número de sondas en la tira
podría conducir a la detección específica de solamente una o una
cuantas especies. Evidentemente, pueden diseñarse tiras LiPA que
pretendan exclusivamente subtipificar cepas, v.g., las
pertenecientes al complejo de M. intracellulare (MIC).
Dependiendo de las necesidades particulares de los laboratorios que
realizan el diagnóstico y/o loa tipificación de micobacterias,
podrían ser valiosas todas estas diferentes aplicaciones. Sin
embargo, está claro que utilizando una combinación de sondas en un
formato LiPA, la cantidad de información obtenida en cuanto a la
identidad de los organismos presentes en la muestra clínica, se
incrementa considerablemente en comparación con los ensayos de
sondas de DNA que utilizan una sola sonda. Para algunos grupos, o
al menos para subdivisión ulterior de algunos grupos, no pudo
diseñarse una sonda simple que se hibridará exclusivamente a este
(sub)grupo. En tal caso, únicamente los patrones de sonda son
capaces de proporcionar la información necesaria. Para estas
aplicaciones, el formato LiPA es un formato ventajoso.
Las especies de Listeria son un grupo de
bastoncillos Gram-positivos muy extendidos en la
naturaleza. Dentro de este grupo parece ser que únicamente L.
monocytogenes es patógena para humanos y animales. L.
monocytogenes es el agente causante de la listeriosis, que da
lugar a meningitis, abortos, encefalitis y septicemia. Los
individuos inmunodeficientes, los niños recién nacidos y las mujeres
embarazadas son grupos de alto riesgo para esta enfermedad
vehiculada por los alimentos. La mayoría de los casos han sido
causados por el consumo de alimentos de origen animal,
particularmente quesos blandos. Por esta razón, la presencia de
L. monocytogenes debería excluirse de los alimentos. Por
medidas de seguridad, en algunos países se requiere en los
productos alimenticios la ausencia de todas las especies de
Listeria.
El método clásico de identificación para L.
monocytogenes en los productos lácteos implica un cultivo de
enriquecimiento durante 48 h y formación subsiguiente de colonias
sobre medio de agar selectivo durante 48 h seguido por una serie
completa de ensayos bioquímicos y morfológicos (Farber y Peterkin,
1991). Este procedimiento podría simplificarse mucho por el uso de
sondas de genes.
Han sido descritas ya varias sondas de DNA para
la identificación de L. monocytogenes. Algunas sondas se
derivan de genes responsables de la patogenicidad del organismo,
por ejemplo el gen de listeriolisina O (Datta et al., 1993) o
la proteína asociada a la invasión (iap) (Bubert et al.,
1992).
Un sistema de identificación disponible
comercialmente, basado en la sonda específica 16S de rRNA, fue
introducido por GenProbe (Herman y De Ridder, 1993; Ninet et
al., 1992).
Estas sondas específicas se utilizan como ensayos
de confirmación sobre colonias obtenidas después de enriquecimiento
y extensión en placas sobre medio de agar selectivo.
Recientemente, varias publicaciones han informado
acerca del uso de la reacción en cadena de la polimerasa para
amplificar la región diana para las sondas de DNA, que puede
acortar el tiempo del ensayo sin interferir con la especificidad y
sensibilidad de dicho ensayo. Se describen diferentes series de
iniciadores que pueden amplificar específicamente el DNA de L.
monocytogenes. Estas series de iniciadores se derivaron del gen
de listeriolisina O (Golstein Thomas et al., 1991), y el gen
iap (Jaton et al., 1992).
Los autores de la invención utilizaron la región
espaciadora del gen de rRNA 16S-23S como la diana
para el desarrollo de una sonda específica de género para
Listeria y una sonda específica para Listeria
monocytogenes.
Utilizando iniciadores conservados derivados del
extremo 3' del rRNA 16S y el extremo 5' del rRNA 23S (las secuencias
se dan en el Ejemplo 1) se amplificó la región espaciadora
utilizando la reacción en cadena de la polimerasa y se clonó
subsiguientemente en un vector de plásmido adecuado siguiendo los
mismos procedimientos que en el Ejemplo 3.
Se obtuvieron dos amplicones que diferían en
longitud (800 pb y 1100 pb). Ambos fragmentos de PCR se clonaron
para las especies de Listeria siguientes:
- Listeria monocytogenes, serovar 4b, IHE
(Instituut voor Hygiène en Epidemiologie, Bélgica),
- Listeria ivanovii CIP 78.42 (Colección
Nacional de Cultivos de Micro-organismos del
Instituto Pasteur, Francia)
- Listeria seeligeri serovar 4a, nr. 42.68
(Instituto Bacteriológico, Südd, Versuchs-und
Forschungsanstalt für
Milchwirtschaft Weihenstephan, Alemania).
Milchwirtschaft Weihenstephan, Alemania).
La secuencia de la región espaciadora entre el
gen 16S de rRNA y 23S se determinó utilizando el material clonado
procedente del fragmento PCR de 800 pb y se hizo esto para las tres
especies de Listeria descritas. Las Figs. 41 a 43 muestran
las secuencias de las diferentes regiones espaciadoras cortas
obtenidas. La secuencia de esta región espaciadora corta de L.
monocytogenes se recuperó también del banco de datos EMBL
(LMRGSPCR).
Sobre la base de esta información de secuencia,
los oligonucleótidos siguientes para la detección específica de
especies se seleccionaron y sintetizaron químicamente:
Asimismo, se diseñó una sonda específica de
género para Listeria:
LIS-ICG-1:
CAAGTAACCGAGAATCATCTGAAAGTGAATC
Las sondas de oligonucleótidos se inmovilizaron
sobre una tira de membrana y después de hibridación inversa con
fragmentos PCR biotinilados, se visualizaron los híbridos
utilizando una reacción de precipitación. Los resultados de
hibridación de las diferentes especies de Listeria se
resumen en la Tabla 5.
| Especie | n | LIS1 | LMO1 | LMO2 | LSE1 | LIV1 |
| L. monocytogenes | 1 | + | + | + | - | - |
| L. seeligeri | 2 | + | + | \pm | + | \pm |
| L. ivanovii | 3 | + | \pm | - | \pm | + |
| L. welshimeri | 3 | + | + | \pm | - | - |
| L. innocua | 2 | + | + | + | - | - |
Estos resultados de hibridación demuestran que la
sonda LIS1 puede detectar todas las especies de Listeria
descritas, pero también que las sondas específicas de especie se
hibridan cruzadamente unas con otras. Por consiguiente, a partir de
esta región espaciadora corta no pudieron encontrarse sondas con
especificidad suficiente.
Para Listeria monocytogenes, se determinó
también el espaciador del gen 16S-23S de rRNA
originario del fragmento de 1100 pb. La Fig. 45 muestra la
secuencia obtenida para esta especie. Esta información de secuencia
se obtuvo también para L. seeligeri (véase Fig. 46) y se
obtuvo una información parcial de secuencia de la región
espaciadora grande para L. ivanovii (véase Fig. 44).
Sobre la base de la alineación de secuencia con
L. seeligeri, se seleccionó la sonda oligonucleotídica
siguiente para detectar específicamente L. monocytogenes:
LMO-ICG -3:
AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC
Los resultados iniciales de hibridación (no
presentados) indicaron que no se observaba hibridación cruzada
alguna con otras especies de Listeria con esta sonda LMO3 de
L. monocytogenes, y que todas las cepas de Listeria
utilizadas se hibridaban a la sonda general LIS1.
Las sondas oligonucleotídicas, LIS1 para
detección de todas las especies de Listeria y LMO3 para la
detección específica de L. monocytogenes, se inmovilizaron
sobre una tira de membrana y se hibridaron a amplicones marcados,
que contenían la región espaciadora 16S-23S de
rRNA, derivada de diferentes organismos. Los resultados de
hibridación se muestran en la Tabla siguiente.
Se obtuvieron especificidad y sensibilidad
excelentes para las sondas LMO3 y LIS1 respectivamente al nivel de
especie y género.
| Taxones ensayados | n | LIS1 | LMO3 |
| Listeria monocytogenes | 44 | + | + |
| Listeria ivanovii | 10 | + | - |
| Listeria seeligeri | 11 | + | - |
| Listeria welshimeri | 16 | + | - |
| Listeria innocua | 23 | + | - |
| Listeria murravi | 3 | + | - |
| Listeria gravi | 2 | + | - |
| Brochotrix thermosphacta | 1 | - | - |
| Blochotrix campestris | 1 | - | - |
| Bacillus cereus | 3 | - | - |
| Taxones ensayados | n | LIS1 | LMO3 |
| Bacillus brevis | 2 | - | - |
| Bacillus coalgulans | 1 | - | - |
| Bacillus pumilis | 1 | - | - |
| Bacillus macerans | 1 | - | - |
| Bacillus lentus | 1 | - | - |
| Bacillus firmus | 2 | - | - |
| Bacillus subtilis | 2 | - | - |
| Bacillus megantum | 1 | - | - |
| Enterococcus faecalis | 1 | - | - |
| Enterococcus faecium | 1 | - | - |
| Enterococcus durans | 1 | - | - |
| Lactococcus lactis | 3 | - | - |
| Lactococcus casei | 1 | - | - |
| Escherichia coli | 1 | - | - |
| Hafnia halvei | 1 | - | - |
| Agrobacterium tumefaciens | 2 | - | - |
| Mycoplasma dimorpha | 1 | - | - |
| Clostridium tyrobutyricum | 1 | - | - |
| Clostridium perfringens | 1 | - | - |
| Clostridium sporogenes | 1 | - | - |
| Clostridium acetobutyricum | 1 | - | - |
| Brucella abortus | 1 | - | - |
| Brucella suis | 1 | - | - |
| Brucella melitensis | 1 | - | - |
| Staphylococcus aureus | 1 | - | - |
| Salmonella typhimurium | 1 | - | - |
| Salmonella enteritidis | 1 | - | - |
| Yersinia enterocolítica | 1 | - | - |
| n: número de cepas ensayadas |
Estas dos sondas pueden utilizarse para la
detección de especies de Listeria y Listeria
monocytogenes directamente sobre muestras de alimentos o después
de enriquecimiento de las muestras en caldo líquido. En ambos
casos, pueden presentarse problemas de amplificación con el
conjunto iniciador conservado debido a la enorme flora de fondo
existente en estas muestras.
Para soslayar este problema, se diseñaron varias
series de iniciadores derivados de las regiones espaciadoras
16S-23S de rRNA de especies de Listeria.
Los iniciadores LIS-P1 y
LIS-P2 son iniciadores superiores, mientras que
LIS-P3 y LIS-P4 son iniciadores
inferiores. Estos conjuntos iniciadores amplifican la región
espaciadora 16S-23S de rRNA más pequeña así como el
espaciador mayor de las especies de Listeria (excepto L.
grayi y L. murrayi). Si es necesario, estos iniciadores
pueden utilizarse en un ensayo PCR anidado donde
LIS-P1/LIS-P4 son los iniciadores
externos y LIS-P2/LIS-P3 son los
iniciadores internos.
Para la detección específica de Listeria
monocytogenes se diseñó la sonda
LMO-ICG-3 y se derivó de la región
espaciadora 16S-23S de rRNA grande. A fin de
amplificar específicamente sólo esta región espaciadora grande para
una detección mejorada de este patógeno directamente en las
muestras se derivó una serie de iniciadores de la parte de
información de secuencia procedente de la región espaciadora
16S-23S de rRNA grande que no está presente en el
espaciador de rRNA más pequeño. Para este objetivo, se utilizan los
iniciadores LIS-P5 y LIS-P6 como los
iniciadores superiores y se utiliza LIS-P7 como el
iniciador inferior.
Durante la evaluación de las sondas para
Listeria spp. se aisló un organismo a partir de queso que se
asemejaba a Listeria de acuerdo con los métodos clásicos de
determinación. Este aislado (MB 405) exhibía las características
siguientes (similares a Listeria spp.):
Gram-positivo, crecimiento en Agar de Soja Oxford y
Tríptico, positivo a las catalasas. La única diferencia con la
Listeria spp. era la motilidad, que era negativa.
Utilizando los iniciadores conservados que se
describen en el Ejemplo 1 a fin de amplificar la región espaciadora
16S-23S de rRNA de este aislado MB 405, se obtuvo el
mismo patrón de amplicones con esta cepa que con Listeria
spp. La hibridación del amplicón demostró que no se obtenía
señal alguna con ninguna de las sondas para Listeria spp.
La secuenciación del rRNA 16S del aislado MB 405
y comparación subsiguiente con Listeria spp., y semejantes,
demostró que el organismo estaba más estrechamente emparentado con
Listeria spp. que con cualesquiera otras especies descritas
hasta ahora en la bibliografía. Los estudios taxonómicos demostrarán
si este aislado pertenece o no al género Listeria. Este
aislado, y organismos aislados subsiguientemente del mismo tipo, se
consideran en esta solicitud como organismos semejantes a
Listeria.
El aislado MB 405 parecía contener al menos 3
regiones espaciadoras 16S-23S de rRNA diferentes
que se clonaron y secuenciaron. Después de alineación con
Listeria spp. se seleccionó una sonda oligonucleotídica para
detectar específicamente cepas semejantes a Listeria:
LISP-ICG-1:CGTTTTCATAAGCGATCGCACGTT
Las reacciones de hibridación inversa de esta
sonda con las regiones espaciadoras 16S-23S de rRNA
de Listeria spp. demostraron que no se producía hibridación
cruzada alguna.
Chlamydia trachomatis es una pequeña
bacteria gram-negativa intracelular obligada, que
tiene 15 serovars (A-K, Ba, L1, L2, y L3) que se
distinguen por la proteína principal de la membrana exterior (MOMP)
y contiene un plásmido críptico requerido para crecimiento
intracelular. Las serovars A-K y Ba constituyen la
biovar del tracoma, mientras que las serovars L1, L2, y L3
constituyen la biovar de LGV.
Las serovars A, B, Ba, y C están asociadas
comúnmente con el tracoma, la causa principal de la ceguera
susceptible de prevención mundialmente. Las serovars
D-K se encuentran principalmente en infecciones
transmitidas por vía sexual y son la causa principal de la
cervicitis y la enfermedad inflamatoria pélvica en las mujeres, así
como de la uretritis y epididimitis en los hombres. Las serovars
L1, L2 y L3 están implicadas en el linfogranuloma venéreo, una
enfermedad rara transmitida por vía sexual.
El cultivo de células se considera como el método
que sirve de referencia para diagnóstico de laboratorio, aunque la
viabilidad de las muestras es difícil de mantener durante el
transporte, y las técnicas de laboratorio consumen mucho tiempo y
son técnicamente exigentes. Por esta razón, se desarrollaron varios
kits de ensayo más rápidos, tales como un ensayo de inmunosorbente
unido a enzima, y la tinción directa fluorescente de anticuerpos.
Sin embargo, ninguno de estos inmunoensayos ha demostrado tener
niveles elevados de sensibilidad o especificidad.
Un ensayo de sondas de DNA no isotópico
(Gen-probe PACE; Woods et al., 1990) que
detecta rRNA de
\hbox{ Chlamydia } está disponible
comercialmente. Recientemente, se ha utilizado el método de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detección de
infecciones por Chlamydia. La detección se direccionó, o bien
al plásmido críptico \hbox{(Loeffelholz} et al.,
1992), o al gen omp1, que codifica la proteína principal de
la membrana exterior (Taylor-Robinson et al.,
1992). Comparada con otras técnicas, la PCR tiene sensibilidad y
especificidad mayores (Ossewaarde et al., 1992). Ninguno de
estos ensayos hace uso de sondas de DNA derivadas de la región
espaciadora del gen 16S-23S de rRNA.
Para una cepa de Chlamydia trachomatis L2
y una cepa de Chlamydia psittaci 6BC, una parte del cistrón
ribosómico de RNA, que contenía la región espaciadora
16S-23S de rRNA se amplificó utilizando iniciadores
conservados (véase el Ejemplo 1) y se clonó subsiguientemente en un
vector de plásmido. La región espaciadora de rRNA
16S-23S se secuenció utilizando la química de
terminación de cadenas didesoxi.
La secuencia de la región espaciadora de ambas
especies de Chlamydia se muestra en Fig. 47 a 48.
Sobre la base de esta información de secuencias,
se sintetizaron químicamente las sondas oligonucleotídicas
siguientes:
Las sondas oligonucleotídicas se inmovilizaron de
manera lineal sobre una tira de membrana y se utilizaron
subsiguientemente en un ensayo de hibridación inversa con productos
PCR biotinilados, que contenían la región espaciadora
16S-23S de rRNA, como diana.
Las hibridaciones se realizaron en una solución
de 3x SSC y formamida (FA) al 20% a una temperatura de 50ºC.
Los resultados de hibridación con las diferentes
sondas se muestran en la Tabla siguiente.
| Cepas ensayadas | CHTR1 | CHTR2 | CHTR3 | CHPS1 |
| Chlamydia trachomatis L2 | + | + | + | - |
| Chlamydia psittaci 6BC | - | - | - | + |
| Chlamydia psittaci CP | - | - | - | + |
| Chlamydia psittaci TT | - | - | - | + |
| Haemophilus ducrevi CIP 542 | - | - | - | - |
| Haemophilus influenzae NCTC 8143 | - | - | - | - |
| Neisseria gonorrhoeae NCTC 8375 | - | - | - | - |
| Moraxella catarrhalis LMG 5128 | - | - | - | - |
| Escherichia coli B | - | - | - | - |
| Streptococcus pneumoniae S92-2102 | - | - | - | - |
Como se muestra en la Tabla, a una temperatura de
hibridación de 50ºC, las sondas CHTR1, CHTR2 y CHTR3 son específicas
para Chlamydia trachomatis, y la sonda CHPS1 es específica
para Chlamydia psittaci.
Varios aislados clínicos, obtenidos del SSDZ,
Delft, Países Bajos, identificados como Chlamydia
trachomatis utilizando métodos convencionales se sometieron a un
ensayo de hibridación inversa con las diferentes sondas
oligonucleotídicas. Todas las sondas específicas de Chlamydia
trachomatis daban una señal de hibridación positiva, y ninguno
de los aislados reaccionaba con la sonda de Chlamydia
psittaci. Para algunos aislados clínicos, la sonda
CHTR2 reaccionaba de modo específicamente más débil que CHTR1 o CHTR3. La región espaciadora de uno de estos aislados (94 M 1961) se secuenció (SEQ ID NO 197) y la secuencia reveló un error de apareamiento con la secuencia espaciadora de la cepa L2. Una sonda adicional (CHTR4) se derivó de esta mueva secuencia espaciadora:
CHTR2 reaccionaba de modo específicamente más débil que CHTR1 o CHTR3. La región espaciadora de uno de estos aislados (94 M 1961) se secuenció (SEQ ID NO 197) y la secuencia reveló un error de apareamiento con la secuencia espaciadora de la cepa L2. Una sonda adicional (CHTR4) se derivó de esta mueva secuencia espaciadora:
CHTR-ICG-4:
GAGTAGCGCGGTGAGGACGAGA
\hskip5cm(SEQ ID NO 201)
Esta sonda da una señal de hibridación más fuerte
que CHTR2 con algunos aislados clínicos de Chlamydia
trachomatis. La misma puede utilizarse sola, o en combinación
con la sonda CHTR2 (v.g. aplicadas ambas sondas en una línea
LiPA).
A fin de desarrollar ensayos muy sensibles para
la detección de Chlamydia trachomatis directamente en
especímenes clínicos se derivó un conjunto iniciador específico a
partir de la región espaciadora 16S-23S de rRNA,
CHTR-P1 (iniciador superior) y
CHTR-P2 (iniciador inferior), amplificando
específicamente la región espaciadora de las especies de
Chlamydia:
\newpage
| CHTR-P1 | : | AAGGTTTCTGACTAGGTTGGGC | 69 |
| CHTR-P2 | : | GGTGAAGTGCTTGCATGGATCT | 70 |
Los micoplasmas son un grupo de los procariotas
más pequeños conocidos que son capaces de crecer en medios exentos
de células, carecen de pared celular, y tienen genomas muy pequeños
con un contenido bajo de G+C. Se han aislado más de 100 especies
diferentes de humanos, animales, plantas e insectos.
En los humanos, se han reconocido micoplasmas
como organismos patógenos o como asociados. El patógeno mejor
conocido es Mycoplasma pneumoniae, el agente causante de la
neumonía primaria atípica, especialmente en los niños y los adultos
jóvenes. El diagnóstico de M. pneumoniae ha estado basado en
el aislamiento directo por el método de cultivo o en la detección
de anticuerpos específicos contra M. pneumoniae en el suero
de los pacientes.
Otro patógeno, aislado por primera vez de
especímenes uretrales de pacientes con uretritis gonocócica ha sido
descrito como Mycoplasma genitalium. Este micoplasma tiene
varias propiedades en común con M. pneumoniae. Ambas especies
son patógenas, y ambas poseen la capacidad de adherirse a los
eritrocitos, diversas células tisulares, vidrio, y superficies de
plástico. Adicionalmente, M. genitalium y M.
pneumoniae comparten antígenos, dando lugar a reacciones
cruzadas extensas en los ensayos serológicos. La observación de que
M. genitalium podría encontrarse también en especímenes del
tracto respiratorio de pacientes con neumonía y aislarse de una
mezcla con M. pneumoniae ha generado interrogantes en cuanto
a la posible patogenicidad de M. genitalium.
Dado que el cultivo de ambas especies consume
mucho tiempo y la serología carece de especificidad, se
desarrollaron ensayos más rápidos y más específicos para
identificar estos microplasmas. El uso de ensayos de hibridación con
sondas de DNA se había descrito para estas especies, pero a pesar
de especificidades satisfactorias, estos ensayos no permiten la
detección de niveles bajos de M. pneumoniae o M.
genitalium. Por esta razón, se han desarrollado más
recientemente técnicas de hibridación de DNA utilizando la reacción
en cadena de la polimerasa. Se ha informado de ensayos PCR
específicos de M. pneumoniae utilizando el gen de adhesina
P1 (Buck et al., 1992) y el gen 16S de rRNA (Kuppeveld et
al., 1992). Se describieron ensayos PCR específicos para M.
genitalium utilizando secuencias del gen de adhesina y el gen
16S de rRNA.
Las secuencias espaciadoras de aislados clínicos
de M. pneumoniae y M. genitalium (obtenidos de U.
Göbel, Universidad de Freiburg, Alemania) se determinaron. Las
mismas se muestran en Fig. 49 a 50. Las secuencias muestran algunas
diferencias con respecto a las de otras cepas de la misma especie
depositadas en el banco de datos EMBL (MPMAC y MGG37,
respectivamente). Sobre la base de esta información se derivaron
cuatro sondas: una sonda general de Mycoplasma, dos sondas
específicas de M. pneumoniae, y una sonda específica de
M. genitalium:
Las sondas se aplicaron a tiras LiPA y se
hibridaron en condiciones estándar (3X SSC, formamida al 20% a 50ºC)
a material espaciador amplificado procedente de cuatro cepas de
M. pneumoniae, una cepa de M. genitalium y 22 cepas de
especies no pertenecientes a Mycoplasma. La sonda general se
hibridaba únicamente a las 5 cepas de Mycoplasma ensayadas,
mientras que las sondas específicas se hibridaban solamente a cepas
de las especies para las que habían sido diseñadas.
Con la mejora continua de las técnicas de
laboratorio, la información sobre la sistemática y la significación
clínica de las denominadas "micobacterias ambientales
potencialmente patógenas" ha aumentado rápidamente. Con la
aparición de enfermedades recientemente reconocidas, se han
presentado síndromes adicionales asociados con especies de
micobacterias diferentes y han adquirido mayor importancia.
Con objeto de extender el test LiPA para la
detección simultánea de diferentes especies micobacterianas como se
describe en el Ejemplo 2, se diseñó una nueva serie de sondas de
DNA para identificar específicamente las especies siguientes:
Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium genavense,
Mycobacterium xenopi, Mycobacterium simiae,
Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium malmoense,
Mycobacterium celatum y Mycobacterium
haemophilum.
Estas sondas se derivaron de la secuencia de la
reacción espaciadora 16S-23S de rRNA. Para las
especies arriba mencionadas, esta información se obtuvo por
secuenciación directa de productos PCR o después de clonación de la
región espaciadora amplificada por PCR. Las secuencias obtenidas se
representan en Fig. 80 a 97, y en Fig. 38 para M.
malmoense.
Las secuencias de la región espaciadora de las
especies micobacterianas arriba mencionadas se compararon y
alinearon con las ya descritas en el Ejemplo 2 o en fuentes
disponibles públicamente. A partir de las regiones de divergencia,
se diseñaron sondas de DNA específicas de especie. Las sondas se
seleccionaron y diseñaron de tal manera que el comportamiento de
hibridación deseado (es decir, hibridación específica de especie)
se obtuvo en las mismas condiciones que se han especificado para las
otras sondas micobacterianas mencionadas en el Ejemplo 2, es decir,
3X SSC, formamida desionizada al 20%, 50ºC. Esto permite la
detección simultánea de al menos dos, y posiblemente todas, las
especies micobacterianas descritas en la presente invención.
Las sondas oligonucleotídicas siguientes se
diseñaron a partir de la secuencia de la región espaciadora de,
respectivamente, M. ulcerans, M. genavense, M.
xenopi, M. simiae, M. fortuitum, M.
malmoense, M. celatum y M. haemophilum:
Las sondas se inmovilizaron en una tira LiPA y se
hibridaron con material biotinilado amplificado derivado de una
serie de especies micobacterianas representativas como se describe
en el Ejemplo 2. La amplificación de la región espaciadora se llevó
a cabo por PCR utilizando una serie de iniciadores como se describe
en el Ejemplo 2. Las diferentes cepas utilizadas para ensayos de
especificidad se muestran en la Tabla 8 junto con los resultados de
hibridación obtenidos. Las cepas se obtuvieron de la colección del
Instituto de Medicina Tropical, Amberes, Bélgica.
Las sondas ensayadas (MSI-ICG1,
MXE-ICG-1,
MFO-ICG-1,
MFO-ICG-2,
MML-ICG-1,
MML-ICG-2,
MCE-ICG-1 y
MHP-ICG-1) detectaban
específicamente M. simiae, M. xenopi, M.
fortuitum, M. malmoense, M. celatum y M.
haemophilum respectivamente y no exhibían hibridación cruzada
alguna con las otras especies de micobacterias ensayadas. Así pues,
estas sondas permiten una detección específica de especies
micobacterianas que no eran identificables ulteriormente utilizando
la serie de sondas de DNA descritas en el Ejemplo 2. M.
malmoense se clasificó en el Ejemplo 2 como un tipo "MIC
4", mientras que las otras especies mencionadas arriba se
hibridaban únicamente a las sondas generales MYC1/MYC22 para el
género Mycobacterium, y se clasificaron por tanto en el
Ejemplo 2 como "otras especies de micobacterias".
Todos los aislados de M. genavense
ensayados reaccionaban con MGV-ICG1 y
MGV-ICG2, y no con MSE-ICG1 diseñada
para M. simiae, estrechamente emparentada con M.
genavense. Un grupo de organismos "intermedios", situados
entre M. simiae y M. genavense, se recibieron del
Instituto de Medicina Tropical de Amberes, en el que se
clasificaban como "análogos a M. simiae" (cepas 4358,
4824, 4833, 4844, 4849, 4857, 4859, 7375, 7379, 7730, 9745,
94-1228). Estas cepas reaccionaban únicamente con
la sonda MGV-ICG2 y no con la sonda
MSI-ICG1 que detecta específicamente cepas de M.
simiae en sentido estricto. La secuenciación de la región
espaciadora 16S-23S de rRNA de dos de estos aislados
"semejantes a M. simiae" (cepas 7379 y 9745) (véase SEQ
ID NO 161 y 162) confirmó que las mismas estaban emparentadas más
estrechamente con M. genavense que con M. simiae. Se
diseñó una nueva sonda, MGV-ICG 3, para detectar
específicamente este grupo de organismos, que pertenecen
posiblemente a una nueva especie.
MGV-ICG 3:
TCGGGCCGCGTGTTCGTCAAA
Esto ilustra de nuevo que el uso de sondas de DNA
derivadas de la región espaciadora 16S-23S puede ser
útil en la diferenciación de diferentes grupos de cepas, que se
encuentran también indeterminadas por los criterios taxonómicos
clásicos. El uso de estas sondas de DNA puede conducir posiblemente
a la descripción de nuevas (sub)especies dentro de las
micobacterias. En este caso, la sonda MGV-1 podía
reaccionar únicamente con las cepas de M. genavense en
sentido estricto. La sonda MGV-3 podría reaccionar
únicamente con las cepas intermedias "semejantes a M.
simiae", y la sonda MGV-2 detectaría ambos
tipos de cepas.
La sonda
MUL-ICG-1 reaccionaba con todas las
cepas de M. ulcerans ensayadas, pero exhibía también
hibridación cruzada con la cepa ITG 7732 de M. marinum. La
secuenciación de la región espaciadora de esta cepa de M.
marinum reveló de hecho una secuencia idéntica a la de la cepa
1837 de M. ulcerans (véase Fig. 80). La diferenciación
ulterior entre M. marinum y M. ulcerans puede hacerse
utilizando una sonda del gen 16S de rRNA de M. ulcerans,
parte de la cual está co-amplificada con la región
espaciadora cuando se utilizan para amplificación los iniciadores
MYC P1-P5. Una sonda específica de especie 16S de
rRNA para M. ulcerans, que puede operar en las mismas
condiciones de hibridación que las sondas espaciadoras para la
diferenciación de especies de micobacterias, es por ejemplo:
TGGCCGGTGCAAAGGGCTG
\hskip5cm(SEQ ID NO 216)
El párrafo anterior demuestra que, aunque es
preferible utilizar sondas derivadas de la región espaciadora, es
posible también, y algunas veces necesario, combinar las sondas
espaciadoras con sondas derivadas de otras secuencias génicas, v.g.
el gen 16S de rRNA. En este caso, de nuevo, estas sondas
adicionales se seleccionan de tal modo que muestren las
características de hibridación deseadas en las mismas condiciones de
hibridación y lavado que las sondas espaciadoras.
Para M. kansasii, se han ensayado cepas
adicionales a las mencionadas en el Ejemplo 2 con las sondas
MKA-ICG-1, 2, 3 y 4 descritas en el
Ejemplo 2. Dado que ninguna de estas sondas era enteramente
satisfactoria, se diseñaron sondas adicionales para la detección
M. kansasii. Para ello, se secuenció la región espaciadora de
algunas de las cepas adicionales de M. kansasii, ITG 6328,
8698 y 8973 (véase Fig. 90 a 92). Estas cepas se obtuvieron también
del Instituto de Medicina Tropical de Amberes, Bélgica.
Aparentemente, las cepas de M. kansasii constituyen un grupo
muy heterogéneo, con diferencias notables en la secuencia
espaciadora entre las diferentes cepas. Se diseñaron las sondas
adicionales MKA-ICG-5, 6, 7, 8, 9 y
10, hibridándose de nuevo todas ellas en las mismas condiciones que
se han descrito anteriormente, es decir 3X SSC, formamida
desionizada al 20%, 50ºC. Las sondas se ensayaron con una colección
de cepas de ensayo obtenidas del Instituto de Medicina Tropical,
Amberes, Bélgica, y los resultados se muestran en la Tabla 8.
Ninguna de las sondas de M. kansasii se
hibrida con una especie distinta que M. kansasii, conforme a
los ensayos realizados. Sin embargo, debido al carácter heterogéneo
de esta especie, ninguna de las sondas de M. kansasii se
hibrida con todas las cepas de M. kansasii. Las diferentes
sondas de M. kansasii reconocen cepas de M. kansasii
diferentes. Esta hibridación diferencial puede tener importancia
clínica. Por otra parte, si es deseable la detección de todas las
cepas de M. kansasii, puede idearse una combinación de
diferentes sondas de M. kansasii.
La brucelosis es una zoonosis muy extendida y
económicamente importante que afecta también a los humanos.
Para la identificación de Brucella spp.,
se utilizan principalmente técnicas de detección bacteriológicas e
inmunológicas. Estos ensayos consumen mucho tiempo y a menudo dan
resultados positivos falsos. Se están desarrollando actualmente
métodos rápidos y fiables de identificación, basados principalmente
en la amplificación e hibridación del DNA.
La detección específica de Brucella spp.
basada en la amplificación de una proteína de la membrana exterior
de 43 kDa (Fekete A. et al., 1990) o una parte del gen 16S
de rRNA (Herman y De Ridder, 1992) han sido ya descritas.
Con objeto de desarrollar sondas e iniciadores de
DNA específicos para la detección de Brucella spp. Los
autores de la invención analizaron la región espaciadora del gen
16S-23S de rRNA. Utilizando iniciadores conservados
(las secuencias se dan en el Ejemplo 1) se amplificó la región
espaciadora y se clonó subsiguientemente en el vector Bluescript
SK+ siguiendo los mismos procedimientos que en el Ejemplo 1.
El amplicón obtenido de aproximadamente 1400 pb
de longitud se clonó para las especies de Brucella
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La digestión con HindIII de los
constructos, seguida por subclonación de los fragmentos obtenidos (n
= 3) facilitó la secuenciación de la región espaciadora para las
tres especies de Brucella descritas. Las Figs. 56, 57 y 79
representan las secuencias de las regiones espaciadoras obtenidas
para las cepas arriba mencionadas de, respectivamente, Brucella
melitensis, Brucella suis y Brucella abortus. Debido a la
alta homología de estas secuencias de la región espaciadora entre
las diferentes especies de Brucella, no se dedujo ninguna
sonda de DNA específica de especie a partir de esta información de
secuencias, y se diseñaron únicamente sondas específicas de
género.
Para este propósito, se sintetizaron químicamente
las sondas siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos se inmovilizaron sobre una
tira de membrana y, después de hibridación inversa con fragmentos
PCR biotinilados, se visualizaron los híbridos utilizando una
reacción de precipitación. Los resultados de la hibridación de las
sondas inmovilizadas con diferentes especies de Brucella y
organismos semejantes se representan en la Tabla 9.
Estos resultados de hibridación muestran que las
sondas BRU-ICG 2, BRU-ICG 3 y
BRU-ICG 4 son específicas para Brucella spp.
y pueden utilizarse en un ensayo de hibridación inversa para
detección de estos patógenos. La sonda BRU-ICG 1 se
hibrida cruzadamente con cepas de Ochrobactrum antropi y las
Rhizobium loti, que son dos organismos muy semejantes
taxonómicamente, pero que no se espera estén presentes en el mismo
material muestra que se utiliza para la detección de
Brucella.
Como se describe en Ejemplos previos (v.g. 3 y 4)
se seleccionaron también iniciadores específicos para
Brucella a partir de la región espaciadora 16S- 23S de rRNA,
a fin de amplificar específicamente la región espaciadora de las
cepas de Brucella.
Se utilizaron BRU-P1 y
BRU-P2 como iniciadores superiores, utilizándose en
cambio BRU-P3 y BRU-P4 como
iniciadores inferiores. Cuando se utiliza en un ensayo PCR anidado,
la combinación BRU-P1/BRU-4 es la
serie de iniciadores externa, mientras que la combinación
BRU-P2/BRU-P3 es la serie de
iniciadores interna.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Taxones ensayados | n | BRU-ICG 1 | BRU-ICG 2 | BRU-ICG 3 | BRU-ICG 4 |
| Brucella abortus | 6 | + | + | + | + |
| Brucella suis | 3 | + | + | + | + |
| Brucella melitensis | 4 | + | + | + | + |
| Brucella ovis | 2 | + | + | + | + |
| Brucella canis | 2 | + | + | + | + |
| Brucella neotomae | 1 | + | + | + | + |
| Phyllobacterium rubiacearium | 1 | - | - | NT | NT |
| Ochrobactrum anthropi | 8 | + | - | - | - |
| Agrobacterium tumefaciens | 2 | - | - | NT | NT |
| Agrobacterium rhizogenes | 1 | - | - | NT | NT |
| Mycoplana dimorpha | 1 | - | - | NT | NT |
| Rhizobium loti | 1 | + | - | - | - |
| Rhizobium meliloti | 1 | - | - | NT | NT |
| Rhizobium leguminosarum | 1 | - | - | NT | NT |
| Bradyrhizobium japonicum | 1 | - | - | NT | NT |
| Brochothix thermosphacta | 1 | - | - | NT | NT |
| Brochothix campestris | 1 | - | - | NT | NT |
| Bacillus cereus | 3 | - | - | NT | NT |
| Bacillus brevis | 2 | - | - | NT | NT |
| Bacillus coalgulans | 1 | - | - | NT | NT |
| Bacillus pumilis | 1 | - | - | NT | NT |
| Bacillus macerans | 1 | - | - | NT | NT |
| Bacillus lentus | 1 | - | - | NT | NT |
| Bacillus firmus | 2 | - | - | NT | NT |
| Bacillus subtilis | 2 | - | - | NT | NT |
| Bacillus megantum | 1 | - | - | NT | NT |
| Enterococcus faecalis | 1 | - | - | NT | NT |
| Enterococcus faecium | 1 | - | - | NT | NT |
| Enterococcus durans | 1 | - | - | NT | NT |
| Lactobacillus lactis | 3 | - | - | NT | NT |
| Lactobacillus casei | 1 | - | - | NT | NT |
| Leuconostoc lactis | 1 | - | - | NT | NT |
| Escherichia coli | 1 | - | - | NT | NT |
| Hafnia halvei | 1 | - | - | NT | NT |
| Clostridium tyrobutyricum | 1 | - | - | NT | NT |
| Clostridium perfringens | 1 | - | - | NT | NT |
| Clostridicum sporogenes | 1 | - | - | NT | NT |
| Clostridium acetobutyricum | 1 | - | - | NT | NT |
| Staphylococcus aureus | 1 | - | - | NT | NT |
| Salmonella enteritidis | 1 | - | - | NT | NT |
| Yersinia enterocolitica | 1 | - | - | NT | NT |
| Taxones ensayados | n | BRU-ICG 1 | BRU-ICG 2 | BRU-ICG 3 | BRU-ICG 4 |
| Listeria monocytogenes | 1 | - | - | NT | NT |
| Listeria ivanovii | 1 | - | - | NT | NT |
| Listeria seeligeri | 1 | - | - | NT | NT |
| Listeria welshimeri | 1 | - | - | NT | NT |
| Listeria innocua | 1 | - | - | NT | NT |
| Listeria murravi | 1 | - | - | NT | NT |
| Listeria gravi | 1 | - | - | NT | NT |
| NT = no ensayado \hskip0.5cm n = número de cepas ensayadas |
Staphylococcus aureus es la especie
estafilocócica más comúnmente asociada con infecciones humanas y
animales. Se han identificado cepas de Staphylococcus
aureus como agentes etiológicos importantes en infecciones tanto
adquiridas en la comunidad como en infecciones hospitalarias.
Recientemente, ha aparecido una infección hospitalaria con S.
aureus resistente a la meticilina (MRSA), que se cree es
crecientemente prevaleciente en muchos países. Las cepas
pertenecientes a esta especie son también agentes causales de
deterioro y envenenamiento de los alimentos.
A fin de discriminar de una manera rápida y
específica cepas de S. aureus de otros estafilococos, se ha
descrito ya en la bibliografía el uso de técnicas moleculares
basadas en sondas de DNA y/o PCR. Ejemplos de genes diana utilizados
para el desarrollo de estos ensayos basados en DNA son el gen 16S
de rRNA (De Buyser et al., 1992; Geha et al., 1994),
el gen mecA (Ubukata et al., 1992; Shimaoka et
al., 1994) y el gen nuc (Brakstad et al., 1992;
Chesneau et al., 1993).
Como diana para el desarrollo de sondas
específicas de DNA se seleccionó la región espaciadora del gen
16S-23S de rRNA. La amplificación utilizando
iniciadores conservados derivados de los genes 16S de rRNA y 23S
(secuencias, véase el Ejemplo 1) demostró que el patrón obtenido no
era similar en todas las cepas ensayadas de S. aureus. Se
observaba una gran cantidad de variación en el número de fragmentos
obtenidos y en el tamaño de estos diferentes fragmentos.
Una región espaciadora de la cepa UZG 5728 y
cuatro regiones espaciadoras (que diferían en longitud) de la cepa
UZG 6289 se clonaron al vector Bluescript SK+ y se secuenciaron
subsiguientemente. Las secuencias se representan en Fig. 64 a Fig.
68 (SEQ ID NO 139 a SEQ ID NO 143). Para el desarrollo de sondas
específicas de DNA, estas diferentes regiones espaciadoras se
compararon unas con otras y con la región espaciadora derivada de
la cepa UZG CNS41 de Staphylococcus epidermidis (SEQ ID NO
144).
Se sintetizaron químicamente las sondas
siguientes:
Los oligonucleótidos se inmovilizaron en una tira
de membrana y, después de hibridación inversa con fragmentos PCR
biotinilados, se visualizaron los híbridos utilizando una reacción
de precipitación colorimétrica.
Los resultados de hibridación de las sondas
inmovilizadas con diferentes Staphylococcus spp. y organismos
no estafilocócicos se representan en la Tabla 10.
Estos resultados de hibridación muestran que
solamente las sondas STAU-ICG 3 y
STAU-ICG 4 son específicas para cepas de
Staphylococcus aureus. La sonda STAU-ICG 1
reacciona con todas las cepas de Staphylococcus spp.
ensayadas y la sonda STAU-ICG 2 se hibrida
cruzadamente con la cepa S. lugdinensis. Ni la sonda
STAU-ICG 3 ni la sonda STAU-ICG 4
detectan todas las cepas de S. aureus ensayadas, pero cuando
se utilizan simultáneamente ambas sondas en un ensayo LiPA, todas
las cepas de S. aureus ensayadas se hibridan con una de estas
sondas o con ambas.
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Claims (49)
1. Método para la detección e identificación de
al menos un micro-organismo, o para la detección
simultánea de varios micro-organismos en una
muestra, que comprende los pasos de:
- (i)
- liberación, aislamiento y/o concentración de los ácidos polinucleicos a partir del o de los micro-organismos a detectar en la muestra;
- (ii)
- si es necesario, amplificación de la región espaciadora 16S-23S de rRNA, o una parte de ella, a partir del o de los micro-organismos a detectar, con al menos un par de iniciadores adecuado;
- (iii)
- hibridación simultánea de los ácidos polinucleicos del paso (i) o (ii) con una serie de sondas que comprenden al menos dos sondas a una temperatura de hibridación y lavado de 50ºC en un medio de hibridación y lavado de 3x SSC y formamida al 20%, seleccionándose dichas sondas de las secuencias
\vskip1.000000\baselineskip
- o equivalentes de las mismas, teniendo dichas sondas equivalentes una secuencia que difiere de cualquiera de las SEQ ID NOs mencionadas por adición de o eliminación en cualquiera de los extremos de la sonda de un nucleótido;
- (iv)
- detección de los híbridos formados en el paso (iii);
- (v)
- identificación del o de los micro-organismos presentes en la muestra a partir de las señales de hibridación diferencial obtenidas en el paso (iv).
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en
el cual dicha muestra procede del tracto respiratorio y en el cual
la serie de sondas que se definen en el paso (iii) comprende al
menos una sonda seleccionada de las sondas espaciadoras
siguientes:
y una segunda sonda seleccionada de
las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o equivalentes
de dichas sondas, difiriendo dichos equivalentes de cualquiera de
las secuencias arriba citadas por adición o eliminación de un
nucleótido en cualquiera de los
extremos.
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en
el cual dicha muestra es una muestra tomada del fluido
cerebroespinal, y en el cual la serie de sondas que se describen en
el paso (iii) comprende al menos una sonda seleccionada de las
sondas espaciadoras siguientes:
y una segunda sonda seleccionada de
las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o equivalentes
de dichas sondas, difiriendo dichos equivalentes de cualquiera de
las secuencias arriba citadas por adición o eliminación de un
nucleótido en cualquiera de los
extremos.
4. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en
el cual dicha muestra procede del tracto urogenital, y en el cual
la serie de sondas que se describe en el paso (iii) comprende al
menos una sonda seleccionada de las sondas espaciadoras
siguientes:
y una segunda sonda seleccionada de
las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o equivalentes
de dichas sondas, difiriendo dichos equivalentes de cualquiera de
las secuencias arriba citadas por adición o eliminación de un
nucleótido en cualquiera de los
extremos.
5. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en
el cual dicha muestra procede de alimentos, y en el cual la serie
de sondas que se definen en el paso (iii) comprende al menos una
sonda seleccionada de las sondas espaciadoras siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
y una segunda sonda seleccionada de
las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o equivalentes
de dichas sondas, difiriendo dichos equivalentes de cualquiera de
las secuencias arriba citadas por adición o eliminación de un
nucleótido en cualquiera de los
extremos.
6. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en
el cual dicha muestra procede del tracto
gastro-intestinal de un paciente, y en el cual la
serie de sondas que se definen en el paso (iii) comprende al menos
una sonda seleccionada de las sondas espaciadoras siguientes:
y una segunda sonda seleccionada de
las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o equivalentes
de dichas sondas, difiriendo dichos equivalentes de cualquiera de
las secuencias arriba citadas por adición o eliminación de un
nucleótido en cualquiera de los
extremos.
7. Método de acuerdo con la reivindicación 1 para
detectar e identificar una o más cepas de especies y subespecies de
Mycobacterium en una muestra, en el cual el paso (iii)
comprende hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dichas sondas, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
8. Método de acuerdo con la reivindicación 7,
para detectar e identificar una o más cepas del complejo de
Mycobacterium tuberculosis en una muestra, en el cual el
paso (iii) comprende hibridación a al menos una de las sondas
siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dichas sondas, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
9. Método de acuerdo con la reivindicación 7,
para detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
del complejo MAIS, en el cual el paso (iii) comprende hibridación a
al menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dichas sondas, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
10. Método de acuerdo con la reivindicación 9
para detectar e identificar una o más cepas de M. avium y
M. paratuberculosis en una muestra, en el cual el paso
(iii) comprende hibridación a al menos una de las sondas
siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dichas sondas, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
11. Método de acuerdo con la reivindicación 9,
para detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
intracellulare y cepas de MIC en una muestra, en el cual el
paso (iii) comprende hibridación a al menos una de las sondas
siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dichas sondas, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
12. Método de acuerdo con la reivindicación 9
para detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
intracellulare en una muestra, en el cual el paso (iii)
comprende hibridación a la sonda siguiente:
MIN-ICG-1:
GCATAGTCCTTAGGGCTGATGCGTT
\hskip5cm(SEQ ID NO 12),
y a una segunda sonda seleccionada de las
secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a equivalentes de
dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de la secuencia arriba
citada por adición o eliminación de un nucleótido en cualquiera de
los extremos.
13. Método de acuerdo con la reivindicación 9
para detectar e identificar una o más cepas de ycobacterium
scrofulaceum en una muestra, en el cual el paso (iii)
comprende hibridación a la sonda siguiente:
MSC-ICG-1:
TCGGCTCGTTCTGAGTGGTGTC
\hskip5cm(SEQ ID NO 24),
y a una segunda sonda seleccionada de las
secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a equivalentes de
dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de la secuencia arriba
citada por adición o eliminación de un nucleótido en cualquiera de
los extremos.
14. Método de acuerdo con la reivindicación 7
para detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
kansasii en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
15. Método de acuerdo con la reivindicación 7
para detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
chelonae en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
16. Método de acuerdo con la reivindicación 7
para detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
gordonae en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
17. Método de acuerdo con la reivindicación 7
para detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
ulcerans o cepas de M. marinum en una muestra, en el
cual el paso (iii) comprende hibridación a la sonda siguiente:
MUL-ICG-1:
GGTTTCGGGATGTTGTCCCACC
\hskip5cm(SEQ ID NO 175)
y a una segunda sonda seleccionada de las
secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a equivalentes de
dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de cualquiera de la
secuencia arriba citada por adición o eliminación de un nucleótido
en cualquiera de los extremos.
18. Método de acuerdo con la reivindicación 7
para detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
genavense en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
19. Método de acuerdo con la reivindicación 7
para detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
xenopi en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a la sonda siguiente:
MXE-ICG-1:
GTTGGGCAGCAGGCAGTAACC
\hskip5cm(SEQ ID NO 178)
y a una segunda sonda seleccionada de las
secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a equivalentes de
dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de la secuencia arriba
citada por adición o eliminación de un nucleótido en cualquiera de
los extremos.
20. Método de acuerdo con la reivindicación 7
para detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
simiae en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a la sonda siguiente:
MSI-ICG-1:
CCGGCAACGGTTACGTGTTC
\hskip5cm(SEQ ID NO 179)
y a una segunda sonda seleccionada de las
secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a equivalentes de
dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de la secuencia arriba
citada por adición o eliminación de un nucleótido en cualquiera de
los extremos.
21. Método de acuerdo con la reivindicación 7
para detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
fortuitum en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
22. Método de acuerdo con la reivindicación 7
para detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
celatum en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a la sonda siguiente:
MCE-ICG-1:
TGAGGGAGCCCGTGCCTGTA
\hskip5cm(SEQ ID NO 190)
y a una segunda sonda seleccionada de las
secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a equivalentes de
dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de la secuencia arriba
citada por adición o eliminación de un nucleótido en cualquiera de
los extremos.
23. Método de acuerdo con la reivindicación 7
para detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
haemophilum en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a la sonda siguiente:
MHP-ICG-1:
CATGTTGGGCTTGATCGGGTGC
\hskip5cm(SEQ ID NO 191)
y a una segunda sonda seleccionada de las
secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a equivalentes de
dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de la secuencia arriba
citada por adición o eliminación de un nucleótido en cualquiera de
los extremos.
24. Método de acuerdo con la reivindicación 7
para detectar e identificar una o más cepas de Mycobacterium
en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende hibridación a al
menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
25. Método de acuerdo con la reivindicación 1
para detectar e identificar una o más cepas de Mycoplasma en
una muestra, en el cual el paso (iii) comprende hibridación a al
menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
26. Método de acuerdo con la reivindicación 25
para detectar e identificar una o más cepas de Mycoplasma
pneumoniae en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
27. Método de acuerdo con la reivindicación 25
para detectar e identificar una o más cepas de Mycoplasma
genitalium en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a la sonda siguiente:
MGE-ICG-1:
CACCCATTAATTTTTTCGGTGTTAAAACCC
\hskip3cm(SEQ ID NO 51)
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de la
secuencia arriba citada por adición o eliminación de un nucleótido
en cualquiera de los
extremos.
28. Método de acuerdo con la reivindicación 1
para detectar e identificar una o más cepas de Pseudomonas
en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende hibridación a al
menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
29. Método de acuerdo con la reivindicación 28
para detectar e identificar una o más cepas de Pseudomonas
aeruginosa en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
30. Método de acuerdo con la reivindicación 1
para detectar e identificar una o más cepas de Staphylococcus
en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende hibridación a al
menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
31. Método de acuerdo con la reivindicación 30
para detectar e identificar una o más cepas de Staphylococcus
aureus en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a al menos una, y preferiblemente las dos sondas
siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
32. Método de acuerdo con la reivindicación 1
para detectar e identificar una o más cepas de Acinetobacter
en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende hibridación a al
menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
33. Método de acuerdo con la reivindicación 32
para detectar e identificar una o más cepas de Acinetobacter
baumanii en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
34. Método de acuerdo con la reivindicación 1
para detectar e identificar una o más cepas de Listeria en
una muestra, en el cual el paso (iii) comprende hibridación a al
menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
35. Método de acuerdo con la reivindicación 34
para detectar e identificar una o más cepas de Listeria
monocytogenes en una muestra, en el cual el paso (iii)
comprende hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
36. Método de acuerdo con la reivindicación 1
para detectar e identificar una o más cepas de Brucella en
una muestra, en el cual el paso (iii) comprende hibridación a al
menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
37. Método de acuerdo con la reivindicación 1
para detectar e identificar una o más cepas de Salmonella en
una muestra, en el cual el paso (iii) comprende hibridación a al
menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
38. Método de acuerdo con la reivindicación 1
para detectar e identificar una o más cepas de Chlamydia en
una muestra, en el cual el paso (iii) comprende hibridación a al
menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
39. Método de acuerdo con la reivindicación 38
para detectar e identificar una o más cepas de Chlamydia
trachomatis en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
CHTR-ICG-4:
GAGTAGCGCGGTGAGGACGAGA
\hskip05cm(SEQ ID NO 201)
y a una segunda sonda seleccionada de las
secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a equivalentes de
dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de cualquiera de las
secuencias arriba citadas por adición o eliminación de un nucleótido
en cualquiera de los extremos.
40. Método de acuerdo con la reivindicación 38
para detectar e identificar una o más cepas de Chlamydia
psittaci en una muestra, en el cual el paso (iii) comprende
hibridación a al menos la sonda siguiente:
CHPS-ICG 1:
GGATAACTGTCTTAGGACGGTTTGAC
\hskip5cm(SEQ ID NO 48)
y a una segunda sonda seleccionada de las
secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a equivalentes de
dicha sonda, difiriendo dichos equivalentes de la secuencia arriba
citada por adición o eliminación de un nucleótido en cualquiera de
los extremos.
41. Método de acuerdo con la reivindicación 1
para detectar e identificar específicamente Chlamydia
trachomatis en una muestra, en el cual el paso (ii) comprende
amplificación de la región espaciadora 16S-23S de
rRNA o una parte de la misma, utilizando al menos uno de los
iniciadores siguientes:
o equivalentes de estos
iniciadores, difiriendo dichos equivalentes en secuencia de los
iniciadores mencionados anteriormente por cambio de uno o más
nucleótidos, con la condición de que dichos equivalentes amplifican
todavía específicamente la región espaciadora de Chlamydia
trachomatis o parte de
ella.
42. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
para detectar e identificar específicamente especies de
Listeria en una muestra, en el cual el paso (ii) comprende
amplificación de la región espaciadora 16S-23S de
rRNA o una parte de la misma, utilizando al menos uno de los
iniciadores siguientes:
o equivalentes de estos
iniciadores, difiriendo dichos equivalentes en secuencia de los
iniciadores mencionados anteriormente por cambio de uno o más
nucleótidos, con la condición de que dichos equivalentes amplifican
todavía específicamente la región espaciadora de especies de
Listeria o parte de
ella.
43. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
para detectar e identificar específicamente especies de
Mycobacterium en una muestra, en el cual el paso (ii)
comprende amplificación de la región espaciadora
16S-23S de rRNA o parte de ella, utilizando al
menos uno de los iniciadores siguientes:
o equivalentes de estos
iniciadores, difiriendo dichos equivalentes en secuencia de los
iniciadores mencionados anteriormente por cambio de uno o más
nucleótidos, con la condición de que dichos equivalentes amplifican
todavía específicamente la región espaciadora de especies de
Micobacterium o parte de
ella.
44. Método de acuerdo con la reivindicación 1
para detectar e identificar una o más cepas de Yersinia
enterocolitica en una muestra, en el cual el paso (iii)
comprende hibridación a al menos una de las sondas siguientes:
y a una segunda sonda seleccionada
de las secuencias especificadas en la reivindicación 1 o a
equivalentes de dichas sondas, difiriendo dichos equivalentes de
cualquiera de las secuencias arriba citadas por adición o
eliminación de un nucleótido en cualquiera de los
extremos.
45. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
para detectar e identificar específicamente especies de
Brucella en una muestra, en el cual el paso (ii) comprende
amplificación de la región espaciadora 16S-23S de
rRNA o parte de ella, utilizando al menos uno de los iniciadores
siguientes:
o equivalentes de estos
iniciadores, difiriendo dichos equivalentes en secuencia de los
iniciadores mencionados anteriormente por cambio de uno o más
nucleótidos, con la condición de que dichos equivalentes amplifican
todavía específicamente la región espaciadora de especies de
Brucella o parte de
ella.
46. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
para detectar e identificar específicamente especies de Yersinia
enterocolitica en una muestra, en el cual el paso (ii)
comprende amplificación de la región espaciadora
16S-23S de rRNA o parte de ella, utilizando al
menos uno de los iniciadores siguientes:
o equivalentes de estos
iniciadores, difiriendo dichos equivalentes en secuencia de los
iniciadores mencionados anteriormente por cambio de uno o más
nucleótidos, con la condición de que dichos equivalentes amplifican
todavía específicamente la región espaciadora de especies de
Yersinia enterocolitica o parte de
ella.
47. Composición que comprende al menos dos de las
sondas que se definen en las reivindicaciones 1 a 40 y 44.
48. Método de hibridación inversa de acuerdo con
la reivindicación 1, en el cual las sondas del paso (iii) están
inmovilizadas en una localización conocida sobre un soporte
sólido, más preferiblemente sobre una tira de membrana.
49. Kit para la detección e identificación de al
menos un micro- organismo, o la detección e identificación
simultáneas de varios micro-organismos en una
muestra, que comprende los componentes siguientes:
- (i)
- en caso apropiado, al menos un par de iniciadores adecuados para permitir la amplificación de la región espaciadora 16S-23S de rRNA, o parte de ella;
- (ii)
- al menos dos de las sondas que se definen en las reivindicaciones 1 a 40 y 46;
- (iii)
- un tampón, o componentes necesarios para producir el tampón, que permite(n) la reacción de hibridación entre dichas sondas y los ácidos polinucleicos presentes en la muestra, o los productos amplificados de la misma;
- (iv)
- una solución, o componentes necesarios para producir la solución, que permite(n) el lavado de los híbridos formados en las condiciones de lavado apropiadas;
- (v)
- en caso apropiado, un medio para la detección de los híbridos resultantes de la hibridación que antecede.
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