JP4813215B2

JP4813215B2 - プローブセットの設計方法、それにより設計されたプローブセット、前記プローブセットを備えるマイクロアレイ、前記方法をコンピュータが実行可能にするプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、および前記プローブセットを利用した標的配列の同定方法

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Publication number: JP4813215B2
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Inventors: 祉令呉; 圭祥李; 泰俊權
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Filing date: 2006-03-08
Publication date: 2011-11-09
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Description

本発明は、標的配列の同定に使われうるプローブセットの設計方法、それにより設計されたプローブセット、前記プローブセットを備えるマイクロアレイ、前記方法をコンピュータが実行可能にするプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、および前記プローブセットを利用した標的配列の同定方法に関する。

マイクロアレイとは、基板上の一定領域にポリヌクレオチドが固定化されているものである。このようなマイクロアレイは、当業界ではよく知られている。例えば特許文献１および２にマイクロアレイについて開示されている。また、前記マイクロアレイの製造方法には、一般的にフォトリソグラフィを利用する方法が知られている。フォトリソグラフィを利用する場合、除去可能な基で保護された単量体が塗布された基板の表面上の一定領域をエネルギー源に曝露させて保護基を除去し、前記保護基が除去されたモノマーと、除去可能な基で保護された別の単量体とをカップリングさせるステップを反復することによって、ポリヌクレオチドのマイクロアレイを製造できる。この場合、マイクロアレイ上に固定化されるポリヌクレオチドは、単量体を一つずつ延長させる方式で合成される。また、スポッティング法による場合、マイクロアレイは、既に合成されたポリヌクレオチドを一定位置に固定化させることによって製造されうる。このようなマイクロアレイの製造方法は、例えば特許文献２、３、４に開示されている。マイクロアレイに固定化されるポリヌクレオチド（「プローブ」または「プローブ核酸」または「プローブポリヌクレオチド」ともいう）は、標的核酸と特異的にハイブリダイズできて、標的核酸の検出または確認に使われる。従来のプローブＤＮＡは、各標的配列に対するプローブＤＮＡを選択するための基準を設定し、前記基準に適するＤＮＡ配列を選択する。選択されたＤＮＡ配列に対して前記基準および他の要件を検定した後、最も好ましいプローブ配列を選択する。前記基準には、プローブの長さ、プローブのＴｍ値（二重鎖ＤＮＡ分子のうちの５０％が二つの単一鎖に解離される温度）、および他のＤＮＡとの配列相同性の限界値などが含まれうる。前記基準に適する候補プローブＤＮＡを選択した後、前記候補プローブＤＮＡが標的配列にのみ特異的なものであるか、交差ハイブリダイゼーションを誘導しやすい配列であるかなどについて、Ｔｍおよび配列相同性などを通じて調べる。それらの基準を満足させる候補プローブＤＮＡのうち最も好ましいものを標的ＤＮＡ配列に特異的に結合する配列として選択する。しかし、このようなプローブセットの設計方法は、各標的配列に対してハイブリダイズしつつ、他の配列には交差しない特異的配列のみをプローブとして選択するため、標的配列間の配列相同性が高いか、または同定しようとする標的配列の数が増加する場合、特異的なプローブを設計し難いという問題点があった。

例えば、試料内に存在するバクテリアがどの種であるかを同定するため、従来は、複数のバクテリアの保存配列、特に１６ＳｒＲＮＡ部位が利用されてきた。すなわち、前記１６ＳｒＲＮＡ部位のうち前記種に共通的な配列は、プライマーとして使用され、各種に特異的な配列は、プローブとして使用された。前記方法は、数種のバクテリアを同定するのに使われうるが、１６ＳｒＲＮＡ部位は、高度に保存されているので、１０種以上のバクテリアの同定には使用し難い。例えば、敗血症に関連したバクテリア３７種、および血液の培養時の汚染または菌血症に関連したバクテリア３４種の総７１種の場合、１６ＳｒＲＮＡ配列１，００２ｂｐにおいて、１４種の配列相同性が１００％であり、前記種の９７％の配列相同性が７０％以上であり、前記７１種の配列相同性の平均は８３％と高度に保存されている。したがって、従来の方法を利用して前記７１種を同定するためのプローブを設計する場合、各プローブ間の８０％以下の相同性を有するように設計すると、１２種のみを同定できる。

さらにバクテリア同定のための他の遺伝子である２３ＳｒＲＮＡの場合、配列が幾分異なるため、１６ＳｒＲＮＡを使用する場合より多い種を同定できる。しかし、２３ＳｒＲＮＡ配列は、公開されていない場合が多く、その配列の確認には追加的なコストが発生するという問題点がある。例えば、前記７１種のバクテリアの場合、約２，６００塩基対（以下、ｂｐとする）の２３ＳｒＲＮＡ配列のうちほぼ半分以上の配列が公開されている種の数は、４３種にすぎない。前記２３ＳｒＲＮＡ配列を利用して３０種のバクテリアを同定したという報告がある（非特許文献１）。
米国特許第５，４４５，９３４号明細書米国特許第５，７４４，３０５号明細書米国特許第５，１４３，８５４号明細書米国特許第５，４２４，１８６号明細書Ｒａｐｉｄｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｂａｃｔｅｒｅｍｉａｂｙｕｎｉｖｅｒｓａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ２３ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｔｏａｎｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｒｒａｙ，ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＣＬＩＮＩＣＡＬＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，Ｆｅｂ．２０００，ｐｐ．７８１−７８８

しかしながら、前記非特許文献には、２３ＳｒＲＮＡ配列が公開されていないだけでなく、依然として３０種以上を同定できないという問題点がある。

つまり、既存のプローブセットの設計方法を利用して多数の種を識別可能なプローブを設計するのは、以下のような限界がある。第一に、１６ＳｒＲＮＡを除いて、多数の種に対して同じ位置の公開された配列を得ることが難しい。第二に、１６ＳｒＲＮＡの場合、配列が高く保存されているため、同じ属内の他の種と区別するための配列を発掘し難い。第三に、遺伝子やゲノム上の特定位置において、種間で配列が比較的異なる場合、全ての種に対する配列を得るためには、配列を得るための別途の実験を実施せねばならず、追加コストや開発期間の遅延などが発生する。

本発明の目的は、標的配列の同定に使われるプローブセットの設計方法を提供することである。

本発明の他の目的は、前記方法によって設計されたプローブセットを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記プローブセットを備えるマイクロアレイを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記方法をコンピュータが実行可能にする、プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記プローブセットを利用して標的配列を同定する方法を提供することである。

本発明者らは、前記のような従来の問題点を解決するために鋭意研究した結果、複数の標的配列に含まれる保存配列中の配列を比較して、前記複数の標的配列をグループ化し、前記グループが一つの標的配列で構成される場合、所定のオリゴヌクレオチドを標的配列特異的プローブとして選択し、前記グループが二つ以上の標的配列で構成される場合、グループプローブを選択し、前記二つ以上の標的配列で構成されるグループの標的配列の他の保存配列に対して前記過程を反復すれば、３０個以上の標的配列を同定できるプローブセットを設計できるということを確認することによって、本発明を完成した。本発明の目的を達成するために、本発明は、（ａ）複数の標的配列の一つの保存配列中の配列を比較し、前記一つの保存配列に含まれている一定基準を有するポリヌクレオチドを含む標的配列をグループ化するステップと、（ｂ）前記（ａ）でグループ化されたグループが一つの標的配列で構成される場合、前記一定基準を有するポリヌクレオチドに特異的に結合するオリゴヌクレオチドを標的配列特異的プローブとして選択するステップと、（ｃ）前記（ａ）でグループ化されたグループが二つ以上の標的配列で構成される場合、前記一定基準を有するポリヌクレオチドに特異的に結合するオリゴヌクレオチドを各グループのグループプローブとして選択するステップと、（ｄ）前記（ａ）でグループ化されたグループが二つ以上の標的配列で構成される場合、前記二つ以上の標的配列で構成された各グループの複数の標的配列の他の保存配列に対して、二つ以上の標的配列で構成されるグループが存在しなくなるまで、前記（ａ）〜（ｃ）を反復するステップと、を含むことを特徴とする標的配列の同定に使われるプローブセットの設計方法である。本発明によるプローブセットの設計方法において、前記一定基準は、配列相同性、塩基長、ハイブリダイゼーション融点（Ｔｍ）、ハイブリダイゼーション融点差（ΔＴｍ）、ＧＣ含量、自己整列、変異位置、反復配列の程度および３’末端の塩基構成からなる群から選択されるいずれか一つ以上でありうる。

本発明によるプローブセットの設計方法において、前記一定基準は、同一のグループのポリヌクレオチドに対して１００％の相同性、および異なるグループのポリヌクレオチドに対して９０％以下の相同性であることが好ましい。
本発明によるプローブセットの設計方法において、前記保存配列は、１６ＳｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡ、ｓｏｄＡ、ｇｙｒＡ、ｇｒｏＥＬおよびｒｐｏＢからなる群から選択されうる。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記プローブセットの設計方法によって設計されたプローブセットを提供する。

本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、前記プローブセットが基板上に固定化されていることを特徴とする標的配列同定用のマイクロアレイを提供する。前記基板は、その表面にアミノシラン、ポリ−Ｌ−リシンおよびアルデヒドからなる群から選択される活性基がコーティングされうる。

また、前記基板を構成材料は、シリコンウェーハ、ガラス、石英、金属およびプラスチックからなる群から選択されうる。

本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、前記プローブセットの設計方法をコンピュータが実行可能にするプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。

本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、前記プローブセットを利用して標的配列を同定する方法を提供する。
本発明による標的配列の同定方法は、（ａ）本発明によるマイクロアレイに標的配列を含む反応試料をアプライするステップ、（ｂ）プローブと標的配列とをハイブリダイゼーションさせるステップ、（ｃ）非特異的な反応を除去するために洗浄するステップ、および（ｄ）ハイブリッド形成による蛍光シグナルを検出するステップを含むことが好ましい。

本発明によれば、多数の標的配列を速かに、かつ、正確に同定できるプローブセットを容易に設計できる。

以下、図面を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。

本発明の一形態は、標的配列同定用のプローブセットの設計方法に関する。
図１は、本発明によるプローブセットの設計方法を示すフローチャートである。
本発明によるプローブセットの設計方法は、（ａ）複数の標的配列の一つの保存配列中の配列を比較し、前記一つの保存配列に含まれている一定基準を有するポリヌクレオチドを含む標的配列をグループ化するステップを含む。

本明細書において、「標的配列」とは、プローブとの結合により同定するために選択されるポリヌクレオチドを意味する。前記標的配列は、ゲノムＤＮＡ、制限酵素により切断されたＤＮＡ断片およびＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）産物などを含む。一般的には、ゲノムＤＮＡの特定領域をＰＣＲにより増幅することによって得られるゲノムＤＮＡ断片が多く使われる。本発明の方法は、標的配列が複数個である場合に適用できるプローブセットの設計方法である。

本明細書において、「保存配列」とは、当該標的配列内の同じ部位に位置する同一または類似した塩基配列を有するポリヌクレオチドを意味する。前記保存配列は、当該標的配列のいかなる遺伝子でもよい。例えば、前記（ａ）ステップで比較される保存配列は、１６ＳｒＲＮＡ部位、２３ＳｒＲＮＡ部位、ｓｏｄＡ部位、ｇｙｒＡ部位、ｇｒｏＥＬ部位およびｒｐｏＢからなる群から選択されるいずれか一つでありうる。

本発明によるプローブセットの設計方法において、「基準」は、プローブを選択する従来の通常的な基準でありうる。すなわち、前記基準は、配列相同性、塩基長、ハイブリダイゼーション融点（Ｔｍ）、ハイブリダイゼーション融点差（ΔＴｍ）、ＧＣ含量、自己整列、変異位置、反復配列の程度および３’末端の塩基構成からなる群から選択されるいずれか一つ以上でありうる。また、前記”一定基準”は、同一のグループのポリヌクレオチドに対して１００％、および異なるグループのポリヌクレオチドに対して９０％以下の相同性、１８〜２５ｂｐの塩基長、７２〜７６℃のハイブリダイゼーション融点、３０〜７０％のＧＣ含量、およびＧまたはＣの３’末端塩基構成であることが好ましい。

また、本発明によるプローブセットの設計方法は、（ｂ）前記（ａ）でグループ化されたグループが一つの標的配列で構成される場合、前記一定基準を有するポリヌクレオチドに特異的に結合するオリゴヌクレオチドを標的配列特異的プローブとして選択するステップを含む。

本発明において、プローブの選択は、前記の基準によって従来の公知の方法を利用して決定されうる。すなわち、プローブＤＮＡを選択するための基準を設定し、前記基準に適するＤＮＡ配列を選択し、選択されたＤＮＡ配列に対して前記基準および他の要件を検定した後、最も好ましい配列をプローブＤＮＡとして選択する。前記基準に適する候補プローブＤＮＡが選択されれば、前記基準を満足させる候補プローブＤＮＡのうち最も好ましいものを標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するプローブ配列として選択する。前記プローブＤＮＡは、標的ＤＮＡに対して特異的に結合できるものならば、一つの標的ＤＮＡに対して二つ以上のプローブＤＮＡが選択されてもよい。

また、本発明によるプローブセットの設計方法は、（ｃ）前記（ａ）ステップのグループのうち二つ以上の標的配列で構成されたグループの場合、前記一定基準を有するポリヌクレオチドに特異的に結合するオリゴヌクレオチドを各グループのグループプローブとして選択するステップを含む。

また、本発明によるプローブセットの設計方法は、（ｄ）前記（ａ）ステップのグループのうち二つ以上の標的配列で構成されたグループの場合、前記二つ以上の標的配列で構成された各グループの複数の標的配列の他の保存配列に対して、二つ以上の標的配列で構成されたグループが存在しないまで前記（ａ）ステップ〜（ｃ）ステップを反復するステップを含む。

前記他の保存配列は、前記二つ以上の標的配列で構成された各グループの複数の標的配列のいかなる遺伝子でもよい。前記（ｄ）ステップで比較される他の保存配列は、前記（ａ）ステップで比較された一つの保存配列を除いた保存配列から選択されるいずれか一つでありうる。例えば、前記（ａ）ステップで１６ＳｒＲＮＡ部位が比較された場合、（ｄ）ステップの他の保存配列は、２３ＳｒＲＮＡ部位、ｓｏｄＡ部位、ｇｙｒＡ部位、ｇｒｏＥＬ部位およびｒｐｏＢからなる群から選択されるいずれか一つでありうる。また、各グループで比較される保存配列は、必ずしも同一である必要がない。例えば、前記（ａ）ステップで１６ＳｒＲＮＡ部位が比較された場合、（ｄ）ステップで一つのグループは、２３ＳｒＲＮＡ部位が比較され、他のグループは、ｓｏｄＡ部位が比較されうる。

本ステップは、二つ以上の標的配列で構成されるグループが存在しなくなるまで、すなわち、あらゆるグループが一つの標的配列で構成され、各グループの一つの標的配列に対して標的配列特異的プローブが選択されるまで反復される。

前記ステップにより得られる複数のグループプローブおよび標的配列特異的プローブは、前記複数の標的配列を同定に使用するためのプローブセットとして選択される。
図２は、二つの保存配列を利用した本発明のプローブセットの設計方法の一例を示す概略図である。

理解を助けるために、本例では、６個の標的配列を使用したが、それに制限されず、かえってその数が増加するほど、本発明の効果がさらに発揮されるということを当業者であれば容易に理解できるであろう。

図２に示すように、６個の標的配列の保存配列Ａを比較して、ポリヌクレオチドａを含む標的配列である標的配列１、標的配列２および標的配列３をグループＩとしてグループ化し、ポリヌクレオチドｂを含む標的配列である標的配列４、標的配列５および標的配列６をグループＩＩとしてグループ化する。前記グループＩおよびグループＩＩがいずれも二つ以上の標的配列で構成されているので、前記ポリヌクレオチドａおよびポリヌクレオチドｂをそれぞれグループＩおよびグループＩＩのグループプローブとして選択する。

次いで、前記グループＩおよびグループＩＩそれぞれの複数の標的配列の他の保存配列を比較する。このステップは、各グループに対して独立的に行われるものであるので、各グループに対して異なる保存配列を使用してもよい。例えば、グループＩに対しては保存配列Ｂを比較し、グループＩＩに対しては保存配列Ｃを比較できる。図２に示すように、グループＩの標的配列１、標的配列２および標的配列３の保存配列Ｂを比較して、ポリヌクレオチドａ’を含む標的配列１をグループＩ−１、ポリヌクレオチドｂ’を含む標的配列２をグループＩ−２、およびポリヌクレオチドｃ’を含む標的配列３をグループＩ−３としてグループ化する。また、グループＩＩの標的配列４、標的配列５および標的配列６の保存配列Ｂを比較して、ポリヌクレオチドｄ’を含む標的配列４をグループＩＩ−１、ポリヌクレオチドｅ’を含む標的配列５をグループＩＩ−２、およびポリヌクレオチドｃ’を含む標的配列６をグループＩＩ−３としてグループ化する。前記各グループは、いずれも一つの標的配列で構成されているので、前記ポリヌクレオチドａ’、ポリヌクレオチドｂ’、ポリヌクレオチドｃ’、ポリヌクレオチドｄ’およびポリヌクレオチドｅ’を標的配列特異的プローブとして選択する。
前記例の標的配列３および標的配列６のように、二つの標的配列のグループプローブが異なる場合、それらの標的配列特異的プローブは同一であってもよい。

図３は、二つの保存配列を利用した本発明のプローブセットの設計方法の他の例を示す概略図である。

図３に示すように、６個の標的配列の保存配列Ａを比較して、ポリヌクレオチドａを含む標的配列１および標的配列２をグループＩとしてグループ化し、ポリヌクレオチドｂを含む標的配列３、標的配列４および標的配列５をグループＩＩとしてグループ化し、ポリヌクレオチドｃを含む標的配列６をグループＩＩＩとしてグループ化する。前記グループＩＩＩは、一つの標的配列で構成されているため、前記ポリヌクレオチドｃを標的配列６の標的配列特異的プローブとして選択する。一方、前記グループＩおよびグループＩＩは、二つ以上の標的配列で構成されているので、前記ポリヌクレオチドａおよびポリヌクレオチドｂをそれぞれグループＩおよびグループＩＩのグループプローブとして選択する。次いで、グループＩの標的配列１および標的配列２の保存配列Ｂを比較して、ポリヌクレオチドａ’を含む標的配列１をグループＩ−１、ポリヌクレオチドｂ’を含む標的配列２をグループＩ−２としてグループ化する。前記各グループは、一つの標的配列で構成されているので、前記ポリヌクレオチドａ’およびｂ’を標的配列１および２の標的配列特異的プローブとして選択する。同様に、グループＩＩの標的配列３、標的配列４および標的配列５の保存配列Ｂを比較して、ポリヌクレオチドｃ’を含む標的配列３をグループＩＩ−１、ポリヌクレオチドｄ’を含む標的配列４をグループＩＩ−２、およびポリヌクレオチドｅ’を含む標的配列５をグループＩＩ−３としてグループ化する。前記各グループは、一つの標的配列で構成されているので、前記ポリヌクレオチドｃ’、ｄ’およびｅ’を標的配列３、４および５の標的配列特異的プローブとして選択する。

図４は、三つの保存配列を利用した本発明のプローブセットの設計方法の一例を示す概略図であり、図５は、三つの保存配列を利用した本発明のプローブセットの設計方法の他の例を示す概略図である。

図４および図５に示すように、二つの保存配列を比較した後にも一つ以上のグループが、二つ以上の標的配列で構成されている場合、前記二つ以上の標的配列で構成されたグループに対して、さらに他の保存配列を比較する。具体的な方法は、前述した通りである。図４および図５では、三つの保存配列を利用したが、同定しようとする標的配列の範囲が非常に広い場合、すなわち四つ以上の保存配列を利用してもよい。

本発明の他の一形態は、本発明のプローブセットの設計方法によって設計されたプローブセットに関する。

本発明のさらに他の一形態は、前記プローブセットが基板上に固定化されていることを特徴とするマイクロアレイに関する。

本発明によるマイクロアレイは、本発明によるプローブセットを利用して本分野の当業者に公知されている通常的な方法により製造されうる。

すなわち、前記基板は、その表面にアミノシラン、ポリ−Ｌ−リシンおよびアルデヒドからなる群から選択される活性基がコーティングされうる。また、前記基板を構成する材料は、シリコンウェーハ、ガラス、石英、金属およびプラスチックからなる群から選択されうる。本発明によるプローブセットを基板に固定化させる方法としては、圧電方式を利用したマイクロピペッティング法、ピン状のスポッタを利用した方法などを使用できる。

本発明のさらに他の一形態は、前記プローブセットを利用して標的配列を同定する方法に関する。前記同定方法は、前記マイクロアレイを利用して行われることが好ましい。すなわち、本発明による標的配列の同定方法は、（ａ）本発明によるマイクロアレイに標的配列を含む反応試料をアプライするステップと、（ｂ）プローブと標的配列とをハイブリダイゼーションさせるステップと、（ｃ）非特異的な反応を除去するために洗浄するステップと、および（ｄ）ハイブリッド形成による蛍光シグナルを検出するステップと、を含むことが好ましい。

図６〜図９は、それぞれ図２〜図５により設計されたプローブセットを備えるマイクロアレイのスポッティング配列およびそれを利用した標的配列の同定方法の一例を示す図面である。

本発明によるマイクロアレイにおいて、プローブセットは、図６〜図９のように、それが由来した保存配列別にスポッティングされうるが、特定のスポッティング配列に特別に限定されるものではない。

図６のＡに示すように、保存配列Ａから由来したグループプローブであるポリヌクレオチドａおよびポリヌクレオチドｂを一つのカラムに配列し、保存配列Ｂから由来した各標的配列特異的プローブであるポリヌクレオチドａ’，ｂ’，ｃ’，ｄ’およびｅ’を他のカラムに配列してマイクロアレイを製作した。図６のＢに示すように、前記で製造されたマイクロアレイを利用して本発明の標的配列の同定方法を行った結果、プローブａおよびプローブｃ’にハイブリダイゼーション反応が検出された。再び図２に示すように、プローブａは、グループＩを意味し、プローブｃ’は、そのうち標的配列３を意味する。したがって、前記結果から、試料に含まれているものは、標的配列３であると同定できる。

同様に、図７のＡに示すように、保存配列Ａから由来したグループプローブであるポリヌクレオチドａ、ポリヌクレオチドｂおよび標的配列特異的プローブであるポリヌクレオチドｃを一つのカラムに配列し、保存配列Ｂから由来した各標的配列特異的プローブであるポリヌクレオチドａ’，ｂ’，ｃ’，ｄ’およびｅ’を他のカラムに配列してマイクロアレイを製作した。図７のＢに示すように、前記で製造されたマイクロアレイを利用して本発明の標的配列の同定方法を行った結果、プローブｂおよびプローブｄ’にハイブリダイゼーション反応が検出された。図３と、前記結果とから、試料に含まれているものは、標的配列４であると同定できる。

また、図８のＡに示すように、保存配列Ａ由来のグループプローブであるポリヌクレオチドａおよびｂを一つのカラムに配列し、保存配列Ｂから由来したグループプローブまたは標的配列特異的プローブであるポリヌクレオチドａ’，ｂ’およびｃ’を他のカラムに配列し、保存配列Ｃから由来した標的配列特異的プローブであるポリヌクレオチドａ”，ｂ”およびｃ”を他のカラムに配列してマイクロアレイを製作した。図８のＢに示すように、前記で製造されたマイクロアレイを利用して本発明の標的配列の同定方法を行った結果、プローブｂ、プローブｃ’およびプローブａ”にハイブリダイゼーション反応が検出された。図４と、前記結果とから、試料に含まれているものは、標的配列６であると同定できる。

また、図９のＡに示すように、保存配列Ａから由来したグループプローブまたは標的配列特異的プローブであるポリヌクレオチドａ，ｂおよびｃを一つのカラムに配列し、保存配列Ｂから由来したグループプローブまたは標的配列特異的プローブであるポリヌクレオチドａ’，ｂ’およびｃ’を他のカラムに配列し、保存配列Ｃから由来した標的配列特異的プローブであるポリヌクレオチドａ”およびｂ”を他のカラムに配列してマイクロアレイを製作した。前記で製造されたマイクロアレイを利用して本発明の標的配列の同定方法を行った結果、図９のＢに示すように、プローブａ、プローブａ’およびプローブｂ”にハイブリダイゼーション反応が検出された。図５と、前記結果とから、試料に含まれているものは、標的配列２であると同定できる。

本発明のさらに他の一形態は、本発明によるプローブセットの設計方法をコンピュータが実行可能にするプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体に関する。

本発明は、コンピュータ読み取り可能な記録媒体にコンピュータ（情報処理機能を有する装置をいずれも含む）で読み取り可能なコードとして具現することが可能である。コンピュータ読み取り可能な記録媒体は、コンピュータシステムにより読み取られるデータが保存されるあらゆる種類の記録媒体を含む。コンピュータ読み取り可能な記録媒体の例としては、ＲＯＭ（ＲｅａｄＯｎｌｙＭｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（ＲａｎｄｏｍＡｃｃｅｓｓＭｅｍｏｒｙ）、ＣＤ−ＲＯＭ、磁気テープ、フレキシブルディスク、光データ保存装置などがある。

以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、それらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がそれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
７１種のバクテリアを同定できるプローブセットの設計
本実施例では、表１のような敗血症の誘発と関連したバクテリア３７種（１〜３７番）と、血液培養時の汚染または菌血症の誘発と関連したバクテリア３４種（３８〜７１番）とを含む計７１種のバクテリアを対象として、前記バクテリアを同定できるプローブセットを設計した。

まず、前記７１個の標的種の一つの保存配列である１６ＳｒＲＮＡ部位配列中の配列を比較して、一定基準を有する１８〜２５ｂｐのポリヌクレオチドを含む標的は配列をグループ化し、前記各ポリヌクレオチドを各グループのプローブとして選択した。本実施例のこのステップでは、一定基準は、同一のグループのポリヌクレオチドに対して１００％の相同性、および異なるグループのポリヌクレオチドに対して８０％以下の相同性を有するという基準とした。各種の１６ＳｒＲＮＡ配列は、菌株によって多様であり、公知の配列データベース、例えばＧｅｎＢａｎｋから容易に入手できる。その配列の例を表１にＧｅｎＢａｎｋ登録番号で示した。

次いで、前記各グループの複数の種に対して異なる保存配列である２３ＳｒＲＮＡ、ｓｏｄＡ、ｇｙｒＡ、ｇｒｏＥＬまたはｒｐｏＢ部位配列を独立的に比較して、一定基準を有する１８〜２５ｂｐのポリヌクレオチドを含む標的配列をグループ化した。本実施例のこのステップでは、一定基準は、同一グループのポリヌクレオチドに対して１００％の相同性、および異なるグループのポリヌクレオチドに対して８０％以下の相同性を有するという基準とした。前記グループ化は、全てのグループが一つの種に構成されるまで反復して行い、前記各ポリヌクレオチドを各種の種特異的プローブとして選択した。各種の前記保存配列は、菌株によって多様であり、公知の配列データベース、例えばＧｅｎＢａｎｋから容易に入手できる。

前記ステップにより設計されたグループプローブおよび種特異的プローブの一部の内容を表２に示した。本実施例により、グループプローブ２４個および標的配列特異的プローブ５６個の計８０個のプローブセットを設計し、前記プローブセットを使用すれば、計７１種のバクテリアのうち、敗血症の誘発と関連した出現頻度の低い２種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ，Ｐｒｏｔｅｕｓｐｅｎｎｅｒｉ）および菌血症の誘発と関連した出現頻度の低い５種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｇａｌｌｉｎａｒｕｍ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍ，Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｎｅｓ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｊｅｉｋｅｉｕｍ，Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）を除いた６４種を同定できた。

１６ＳｒＲＮＡ部位のみを利用する既存のプローブセットの設計方法では、各プローブ間の９０％以下の相同性を有するように設計する場合には、７１種のうち３５種のみしか同定できず、８０％以下の相同性を有するように設計する場合には、７１種のうち１２種のみしか同定できない。しかし、本発明は、各プローブ間の８０％以下の相同性を有するように設計する場合にも、６４種を同定できた。

本発明は、図面に示した一実施形態を参考にして説明されたが、これは、例示的なものに過ぎず、当業者であれば、これから多様な変形および均等な他の実施形態が可能であるという点を理解できるであろう。したがって、本発明の真の技術的保護範囲は、特許請求の範囲の技術的思想により決定されねばならない。

本発明は、プローブセット関連の技術分野に適用可能である。

本発明によるプローブセットの設計方法を示すフローチャートである。二つの保存配列を利用した本発明のプローブセットの設計方法の一例を示す概略図である。二つの保存配列を利用した本発明のプローブセットの設計方法の他の例を示す概略図である。三つの保存配列を利用した本発明のプローブセットの設計方法の一例を示す概略図である。三つの保存配列を利用した本発明のプローブセットの設計方法の他の例を示す概略図である。図２により設計されたプローブセットを備えるマイクロアレイのスポッティング配列およびそれを利用した標的配列の同定方法の一例を示す図面である。図３により設計されたプローブセットを備えるマイクロアレイのスポッティング配列およびそれを利用した標的配列の同定方法の一例を示す図面である。図４により設計されたプローブセットを備えるマイクロアレイのスポッティング配列およびそれを利用した標的配列の同定方法の一例を示す図面である。図５により設計されたプローブセットを備えるマイクロアレイのスポッティング配列およびそれを利用した標的配列の同定方法の一例を示す図面である。

Claims

（ａ）複数の標的配列の一つの保存配列中の配列を比較し、前記一つの保存配列に含まれている一定基準を有するポリヌクレオチドを含む標的配列をグループ化するステップと、
（ｂ）前記（ａ）でグループ化されたグループが一つの標的配列で構成される場合、前記一定基準を有するポリヌクレオチドに特異的に結合するオリゴヌクレオチドを標的配列特異的プローブとして選択するステップと、
（ｃ）前記（ａ）でグループ化されたグループが二つ以上の標的配列で構成される場合、前記一定基準を有するポリヌクレオチドに特異的に結合するオリゴヌクレオチドを各グループのグループプローブとして選択するステップと、
（ｄ）前記（ａ）でグループ化されたグループが二つ以上の標的配列で構成される場合、前記二つ以上の標的配列で構成された各グループの複数の標的配列の他の保存配列に対して、二つ以上の標的配列で構成されるグループが存在しなくなるまで、前記（ａ）〜（ｃ）を反復するステップと、を含むことを特徴とする標的配列の同定に使われるプローブセットの設計方法。
前記一定基準は、配列相同性、塩基長、ハイブリダイゼーション融点（Ｔｍ）、ハイブリダイゼーション融点差（ΔＴｍ）、ＧＣ含量、自己整列、変異位置、反復配列程度および３’末端の塩基構成からなる群から選択されるいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記一定基準は、同一のグループのポリヌクレオチドに対して１００％の相同性、および異なるグループのポリヌクレオチドに対して９０％以下の相同性であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記保存配列は、１６ＳｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡ、ｓｏｄＡ、ｇｙｒＡ、ｇｒｏＥＬおよびｒｐｏＢからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の方法によって設計されたプローブセット。
請求項５に記載のプローブセットが基板上に固定化されていることを特徴とする標的配列同定用のマイクロアレイ。
前記基板は、その表面にアミノシラン、ポリ−Ｌ−リシンおよびアルデヒドからなる群から選択される活性基がコーティングされていることを特徴とする請求項６に記載のマイクロアレイ。
前記基板を構成する材料は、シリコンウェーハ、ガラス、石英、金属およびプラスチックからなる群から選択されることを特徴とする請求項６に記載のマイクロアレイ。
請求項１に記載の方法をコンピュータが実行可能にするプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
請求項５に記載のプローブセットを利用して標的配列を同定する方法。
（ａ）請求項６に記載のマイクロアレイに標的配列を含む反応試料をアプライするステップと、
（ｂ）プローブと標的配列とをハイブリダイゼーションさせるステップと、
（ｃ）非特異的な反応を除去するために洗浄するステップと、
（ｄ）ハイブリッド形成による蛍光シグナルを検出するステップと、を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。