CN1993482B - 细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供采用简便操作即可快速、准确地判定被检样品中混入的细菌、特别是好气性产芽孢细菌的细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒。本发明的细菌检测器具是根据对象好气性产芽孢细菌所属的属或种的特异性碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板上的微阵列型器具。根据从被检样品中制备的探针和上述基板上固定的寡核苷酸是否发生杂交，能够简便、快速且准确地检测、鉴定被检样品中的好气性产芽孢细菌。
Description
技术领域
本发明涉及细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒，更加具体地说，涉及好气性产芽孢细菌的特异性寡核苷酸固定在基板上的细菌检测器具、使用该细菌检测器具的极其准确且操作性强的细菌检测方法及细菌检测试剂盒。
背景技术
以往，在食品产业中，为了提高制造食品的安全性，已研究开发出各种卫生管理方面的技术。特别是近年来，食品的安全性受到严格监管，对提高技术方面的关心也在提高。
在食品制造现场实施卫生管理时，必需进行微生物管理，因此，必须对微生物进行检测、鉴定。而微生物的检测、鉴定需要专业知识和技术，所以通常将此委托于各种专业机构和部门。接受委托的机构等根据生理性质和生物化学性质以及基因分析的分类对微生物进行检测、鉴定。
在食品微生物管理中最重要的是及时为食品制造现场提供准确的检测结果，但是，现在普遍使用的检测方法、分类鉴定方法，微生物的鉴定需要多日，例如微生物的鉴定几乎需要大约数日～1周时间。因此，急待开发出能够在食品制造现场实施的快速且准确的微生物检测方法。
其中，已知芽孢杆菌属(Bacillus)等好气性产芽孢细菌在土壤、水、空气等自然界中分布广泛，并且有害性细菌很多。例如，在芽孢杆菌属中，已知引起食物中毒的炭疽杆菌(Bacillus anthracis)和蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)等对人类具有病原性。
作为对细菌分类鉴定的方法，已知有基于生理性质和生物化学性质的方法，基于醌组成、菌体脂肪酸组成、细胞壁成分等的方法，基于DNA的G+C含量的方法，基于DNA同源性的方法，使用DNA探针的方法，以及分析16S核糖体RNA基因的碱基序列的方法等。特别是近年来，一般是将基于16S核糖体RNA基因的碱基序列的系统分类得到的组(簇)作为指标，对细菌进行分类、鉴别。
作为鉴定属于好气性产芽孢细菌的细菌的技术，已知例如日本国特开平9-94100号公报(公开日：1997年4月8日：专利文献1)及Shida，O et al.，Proposal for Two New Genera，Brevibacillus gen.nov.and Aneurinibacillusgen.nov.，International Journal of Systematic Bacteriology，939-946(1996)(非专利文献1)中公开的方法。在该技术中，将具有属于短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)等好气性产芽孢细菌细菌的16S核糖体RNA基因中存在的特异性碱基序列的DNA作为引物，将从被鉴定细菌中得到的染色体DNA作为模板应用于PCR法，将特定DNA的扩增作为指标在被鉴定细菌的属水平上进行鉴定。
作为利用16S核糖体RNA基因的芽孢杆菌属细菌的分类技术，已知有Goto，K et al.，Application of the partial 16S rDNA sequence as an index forrapid identification of species in the genus Bacillus，The Journal ofGeneral and Applied Microbiology，46，1-8(2000)(非专利文献2)中公开的方法。在16S核糖体RNA基因的5’端约275bp区域被称为高变区(HV region)，该区是种特异性区域，所以该技术通过分析该区域的碱基序列能够对芽孢杆菌属细菌进行分类。
发明内容
上述各种技术难于在食品制造现场快速且简便地鉴定微生物，因此，期待开发出特别是能够在要求快速性检测的食品产业中的产品出货前快速性检测等中使用的技术。
具体来说，首先上述专利文献1和非专利文献1公开的方法，本来就不是用于食品产业产品出厂前的检测等的技术，其主要是用于鉴定细菌的技术。因此，该方法虽然能够确保用PCR法检测带来的快速性，但因为其是属特异性方法，所以需要根据各属而采用引物，操作烦杂。
此外，非专利文献2所述的方法，其迅速性及简便性还不够。
迅速且简便的微生物鉴定方法，不仅能够在食品制造现场利用，而且还能够用于医药品等的制造、医院、或研究机构等，所以期望开发出这种技术。但是，这样的技术还不为人所知。
鉴于上述问题，本发明的目的是提供不仅能够在属水平、而且能够在种水平鉴定好气性产芽孢细菌，并且能够快速且简便地鉴定的技术。
本发明者为了解决上述课题进行了精心研究，结果在清凉饮料(refreshingbeverage)等食品的代表性污染细菌的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中，发现特定属或特定种的特异性序列，并且发现使用根据该碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板上的器具，通过与来自被检样品的核酸的杂交，能够快速且准确地检测、鉴定目标细菌，完成了本发明。
本发明包括下述发明。
(1)细菌检测器具，其特征在于，从含有检测对象细菌的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中的序列号1～40、43～56或57(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或57)所示的碱基序列的寡核苷酸组中选择的1个或多个寡核苷酸固定在基板上，通过该寡核苷酸和来自被检样品的核酸的杂交，检测、鉴定被检样品中的细菌。
(2)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有属于芽孢杆菌属(Bacillus)细菌的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号1、2或3所示的碱基序列的寡核苷酸中的至少1个固定在基板上。
(3)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有属于短芽孢杆菌属(Brevibacillus)细菌的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号4所示的碱基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(4)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)细菌的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号5所示的碱基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(5)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有属于硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)细菌的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号6所示的碱基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(6)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有属于土芽孢杆菌属(Geobacillus)细菌的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号7所示的碱基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(7)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus)细菌的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号3或8所示的碱基序列的寡核苷酸中的至少1个固定在基板上。
(8)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号9、10或11所示的碱基序列的寡核苷酸中的至少1个固定在基板上。
(9)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号12、13或14所示的碱基序列的寡核苷酸中的至少1个固定在基板上。
(10)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有Bacillussporothermodurans的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号15、43或44所示的碱基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(11)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号16、17或18所示的碱基序列的寡核苷酸中的至少1个固定在基板上。
(12)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号19所示的碱基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(13)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号20或55所示的碱基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(14)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号21～25中任一序列号所示的碱基序列的寡核苷酸中的至少1个固定在基板上。
(15)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号26所示的碱基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(16)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号27所示的碱基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(17)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有Bacillus benzoevorans菌16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号29或30所示的碱基序列的寡核苷酸中的至少1个固定在基板上。
(18)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号31所示的碱基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(19)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号32或33所示的碱基序列的寡核苷酸中的至少1个固定在基板上。
(20)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号34、35或36所示的碱基序列的寡核苷酸中的至少1个固定在基板上。
(21)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号28或37所示的碱基序列的寡核苷酸中的至少1个固定在基板上。
(22)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有Paenibaciilus validus的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号38、39或40所示的碱基序列的寡核苷酸中的至少1个固定在基板上。
(23)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有史氏芽孢杆菌(Bacillussmithii)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号45或46所示的碱基序列的寡核苷酸中的至少1个固定在基板上。
(24)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有Alicyclobacillusacidiphilus的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号47、48或49所示的碱基序列的寡核苷酸中的至少1个固定在基板上。
(25)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有Alicyclobacillushesperidum的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号50或51所示的碱基序列的寡核苷酸中的至少1个固定在基板上。
(26)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有Bacillus fumarioli的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号52或53所示的碱基序列的寡核苷酸中的至少1个固定在基板上。
(27)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有Bacillus acidogenesis的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号54所示的碱基序列的寡核苷酸中的至少1个固定在基板上。
(28)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有Bacillus sonorensis的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中序列号56或57所示的碱基序列的寡核苷酸中的至少1个固定在基板上。
(29)如上述(1)所述的细菌检测器具，其中，含有序列号1～40、43～56或57所示的碱基序列的全部寡核苷酸固定在基板上。
(30)如上述(1)～(29)中任一项所述的细菌检测器具，其特征在于，上述被检样品中的细菌是从下述(a)～(f)中任一项所述的细菌组成的群组中选择的至少1种细菌：
(a)属于芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌；
(b)属于短芽孢杆菌属(Brevibacillus)的细菌；
(c)属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)的细菌；
(d)属于硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)的细菌；
(e)属于土芽孢杆菌属(Geobacillus)的细菌；和
(f)属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的细菌。
(31)如上述(1)～(30)中任一项所述的细菌检测器具，其特征在于，上述基板上具有碳二亚胺基或异氰酸酯基，该碳二亚胺基或异氰酸酯基和上述寡核苷酸或寡核苷酸末端连接的接头反应形成共价键。
(32)细菌检测方法，用于检测、鉴定被检样品中的细菌，其包括如下步骤：
制备被检样品中细菌的核酸的核酸制备步骤；
以该核酸为模板制备标记探针的探针制备步骤；
使用上述(1)～(31)中任一项所述的细菌检测器具，使固定在基板上的寡核苷酸和上述标记探针发生杂交的杂交步骤；
检测杂交信号的信号检测步骤。
(33)细菌检测方法，用于检测、鉴定被检样品中的细菌，其包括如下步骤：
制备被检样品中细菌的核酸的核酸制备步骤；
以该核酸为模板制备标记探针的探针制备步骤；
使用含有序列号1～40及43～57中任一序列号所示的碱基序列的寡核苷酸，使该寡核苷酸和上述标记探针发生杂交的杂交步骤；
检测杂交信号的信号检测步骤。
(34)上述(32)或(33)所述的细菌检测方法，其特征在于，所述被检样品是食品。
(35)如上述(34)所述的细菌检测方法，其特征在于，所述食品是饮料。
(36)如上述(35)所述的细菌检测方法，其特征在于，所述饮料是清凉饮料。
(37)细菌检测试剂盒，其用于实施上述(32)～(36)中任一项所述的细菌检测方法。
(38)细菌检测试剂盒，其用于实施上述(32)～(36)中任一项所述的细菌检测方法，其特征在于，所述试剂盒包括上述杂交步骤及信号检测步骤中使用的试剂。
(39)如上述(38)所述的细菌检测试剂盒，其还包括上述探针制备步骤及/或上述核酸制备步骤中使用的试剂。
本发明的细菌检测器具，根据对象细菌所属的种或属的特异性碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板上，通过该寡核苷酸和来自被检样品的核酸的杂交，能够检测、鉴定被检样品中的细菌。所以，根据本发明即可产生能够准确且简便地检测、鉴定细菌的效果。
此外，如果在基板上固定根据多数细菌种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸，即可产生能够进行全面检测的效果。
本发明的细菌检测试剂盒，因为其包括上述细菌检测器具及必要的试剂，所以产生操作性高、能够更加简便地检测鉴定细菌的效果。
具体实施方式
下面，对本发明的一种实施方式进行说明，但本发明并不限于该实施方式。
(1)本发明的细菌检测器具
本发明的细菌检测器具用于检测、鉴定被检样品中的细菌，根据对象细菌所属的种或属的特异性碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板上，通过该寡核苷酸和来自被检样品的核酸的杂交，检测、鉴定被检样品中的细菌。
[基板]
关于本发明的细菌检测器具使用基板的材质，只要其能够使寡核苷酸稳定固定即可，例如可以为聚碳酸酯或塑料等合成树脂、玻璃等，但不限于这些材质。基板的形状没有特别限定，但可优选使用如板状、薄膜状等基板。
[固定在基板上的寡核苷酸]
本发明的细菌检测器具基板上固定的寡核苷酸是根据检测对象细菌所属的种或属的特异性碱基序列设计的寡核苷酸。通过该寡核苷酸和来自被检样品的核酸之间发生杂交，能够检测出被检样品中含有的属于目标种或属的细菌。此外，对于根据上述检测对象细菌所属种或属的特异性碱基序列设计的寡核苷酸，以下恰当地称其为“捕获寡核苷酸(capture oligonucleotide)”。
尽管上述特异性碱基序列只要从检测对象细菌的基因组碱基序列中选取属或种的特异性碱基序列即可，但优选从检测对象细菌的核糖体RNA基因对应的碱基序列中选取。其中，已知细菌的16S核糖体RNA基因具有很多属或种特异性碱基序列，所以特别优选从16S核糖体RNA基因对应的DNA序列中选取属或种特异性碱基序列。核糖体RNA基因的碱基序列，可以从GenBank、EMBL、DDBJ等数据库等中得到。
捕获寡核苷酸根据上述属或种特异性碱基序列设计即可，因此，其可以为上述属或种特异性碱基序列本身，而且只要能够与从检测对象细菌中制备的核酸发生特异性杂交，也可包含变异，变异的位置没有特别限定。
捕获寡核苷酸的长度(碱基数)没有特别限定，如果过短则难于对杂交进行检测，如果过长则发生非特异性杂交。本发明者对捕获寡核苷酸的最适合长度进行反复研究，确定标准长度为12～24个碱基，更优选为13～22个碱基，但并不限于此。本发明者确认，碱基长度主要取决于序列特性(特异性碱基序列的含有率、以及该碱基序列的重复)，结合性良好的序列即使是链短，也可发生特异性杂交。
当捕获寡核苷酸具有妨碍其与来自被检样品的核酸发生杂交的发夹结构、环状结构或除此之外的立体结构时，通过将构成捕获寡核苷酸的1个或1个以上的核苷酸置换为肌苷或与任何核苷酸不配对的核酸，能够解除其立体结构。
捕获寡核苷酸的合成方法没有特别限定，根据公知的方法(例如Maniaits，T.et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)中描述的方法等)合成即可。一般可以用市售的DNA合成仪进行化学合成。
在本发明的细菌检测器具中，不仅将根据上述检测对象细菌所属的种或属的特异性碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板上，在此基础上优选将所谓的对照捕获寡核苷酸固定在基板上。对照捕获寡核苷酸包括阳性对照捕获寡核苷酸及阴性对照捕获寡核苷酸。阳性对照捕获寡核苷酸用于判定下述探针制备步骤中扩增反应是否正确地进行、杂交是否正确地进行。阴性对照捕获寡核苷酸用于确认未发生非特异性杂交，即未发生假阳性杂交。本发明也包括这些阳性对照捕获寡核苷酸及阴性对照捕获寡核苷酸固定在基板上的细菌检测器具。
阳性对照捕获寡核苷酸，只要根据从检测对象细菌中制备的探针所包含的碱基序列设计即可。此外，使用同一细菌检测器具要同时检测多数检测对象细菌时，可以对各检测对象细菌设计阳性对照捕获寡核苷酸，或者也可以根据从多数检测对象细菌中制备的探针中的相同碱基序列设计。从检测对象细菌中制备的所有探针中没有相同碱基序列时，也可分为数组分别设计阳性对照捕获寡核苷酸。
或者设计引物序列相同、与目标细菌序列不同的人工序列，也可以使该序列的一部分作为阳性对照捕获寡核苷酸。以上述人工序列为模板制备探针(在本说明书中称这种探针为对照探针)，并添加从被检样品中制备的探针，能够验证下述探针制备步骤中扩增反应是否顺利进行和杂交是否顺利进行。
阴性对照捕获寡核苷酸，优选设计为：在阳性对照捕获寡核苷酸的碱基序列中，具有在1个碱基以上且低于该序列具有的碱基数的20％的范围内含有人工置换碱基的碱基序列。进行碱基置换的碱基数，取决于与杂交条件之间的关系，选择来自检测对象细菌的探针不发生杂交的碱基数即可。
检测对象细菌没有特别限定，适当选择欲从被检样品中检测的目标细菌即可。例如可以为混入食品中有可能污染该食品的细菌。其中优选有可能混入、污染饮料的细菌，特别优选有可能混入、污染清凉饮料的细菌为检测对象细菌。食品中混入有害细菌已成为食物中毒等公共卫生方面的非常大的问题，并且也成为食品浑浊、异味发生、风味劣化等质量劣化的原因，因此，急待开发出快速且准确地检测、鉴定这些有害细菌的方法。
作为上述检测对象细菌，例如可以为属于芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌，更加具体地说，可以为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、Bacillus sporothermodurans、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、Bacillusbenzoevorans、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)、史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)、Bacillus fumarioli、Bacillus acidogenesis、Bacillus sonorensis等。
除上述细菌外，还可以为属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)的细菌，更加具体地说，可以为酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus cycloheptanicus、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus acidiphilus等。
除上述细菌外，还可以为属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的细菌，更加具体地说，可以为Paenibacillus validus、Paenibacillus illinoisensis、蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)等。
除上述细菌外，还可以为属于硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)的细菌，更加具体地说，可以为Aneurinibacillus aneurinolyticus等。
除上述细菌外，还可以为属于土芽孢杆菌属(Geobacillus)的细菌，更加具体地说，可以为嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)等。
除上述细菌外，还可以为属于短芽孢杆菌属(Brevibacillus)的细菌，更加具体地说，可以为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)、土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)等。但是检测对象细菌并不限于上述细菌。
作为用于检测、鉴定上述细菌的捕获寡核苷酸，可以为根据属于下述菌属细菌的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中的各属特异性序列设计的寡核苷酸，所述菌属为：芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)。
根据属于上述芽孢杆菌属(Bacillus)细菌16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中的同属特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号1、2或3所示的碱基序列的寡核苷酸。
AGATGGGCCCGCGGCGCATT(序列号1)
GACCCGCGGCGCATT(序列号2)
GGGCAACCTGCCTGTAAGAC(序列号3)
根据属于上述短芽孢杆菌属(Brevibacillus)细菌16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中的同属特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号4所示的碱基序列的寡核苷酸。
ACATAGGGAAACTTATGCTAA(序列号4)
根据属于上述脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)细菌16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中的同属特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号5所示的碱基序列的寡核苷酸。
GAGGAGCCCGCGGCGCATT(序列号5)
根据属于上述硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)细菌16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中的同属特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号6所示的碱基序列的寡核苷酸。
GAAGAACCGCCGGGA(序列号6)
根据属于土芽孢杆菌属(Geobacillus)细菌16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中的同属特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号7所示的碱基序列的寡核苷酸。
ACACCGAAGACCGCATGGTC(序列号7)
根据属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus)细菌16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中的同属特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号3或8所示的碱基序列的寡核苷酸。
GGGCAACCTGCCTGTAAGAC(序列号3)
GACGGTACCTGAGAAGAA(序列号8)
除上述之外，捕获寡核苷酸还可以为根据下述细菌16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中的各细菌种特异性序列设计的寡核苷酸，所述细菌为：蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、Bacillussporothermodurans、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、Bacillus benzoevorans、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、史氏芽孢杆菌(Bacillussmithii)、Bacillus fumarioli、Bacillus acidogenesis、Bacillus sonorensis、酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus acidiphilus、Paenibacillus validus。
根据上述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号9、10或11所示的碱基序列的寡核苷酸。
GATTAAGAGCTTGCTCTTATGAA(序列号9)
CCGCATGGTTCGAAAT(序列号10)
GCTAGTTGAATAAGCTGGC(序列号11)
根据上述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号12、13或14所示的碱基序列的寡核苷酸。
TCGTGCGGACCTTTTAAAAG(序列号12)
CCGCATGGAGGAAAAAG(序列号13)
GCCGGGGAAGAACAAG(序列号14)
根据上述Bacillus sporothermodurans菌16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号15、43或44所示的碱基序列的寡核苷酸。
CTCCGCATGGAGAGAGATT(序列号15)
AAGAGCTTGCTTTTGATCAG(序列号43)
CTTCGCATGAAGGAGAATTG(序列号44)
根据上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号16、17或18所示的碱基序列的寡核苷酸。
GCATGGTTCAAACATAAAAG(序列号16)
GGCTACCACTTACA(序列号17)
GAGCTTGCTCCCTGATGTTA(序列号18)
根据上述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号19所示的碱基序列的寡核苷酸。
TGCTCCCTTAGGTCAGCGGC(序列号19)
根据上述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号20或55所示的碱基序列的寡核苷酸。
GGATGAAAGACGGTTT(序列号20)
CCGGATAGTTCCTTGAACCG(序列号55)
根据上述迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号21～25中任一序列号所示的碱基序列的寡核苷酸。
GAATGGATGGGAGCTTG(序列号21)
AGCTTGCTCCCAGAAG(序列号22)
TTCTCCTGGAGAAAGGTT(序列号23)
AGCTTGCTCCCAGAAGTT(序列号24)
CTGGAGAAAGGTTGAAAGAC(序列号25)
根据上述坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号26所示的碱基序列的寡核苷酸。
GAGGAAAAGCTGAAAGATGG(序列号26)
根据上述环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号27所示的碱基序列的寡核苷酸。
GAGCGGACTTTAAAAGCTTG(序列号27)
根据上述Bacillus benzoevorans菌16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号29或30所示的碱基序列的寡核苷酸。
GAGCGGACTTAAAAAGCTTG(序列号29)
GAGCGGACTTTTGGGAG(序列号30)
根据上述巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号31所示的碱基序列的寡核苷酸。
TAGGATCTTCTCCTTCATGGG(序列号31)
根据上述球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号32或33所示的碱基序列的寡核苷酸。
TCGGCTGTCGCTATAGGATG(序列号32)
AAGTACAGTAGTAACTGGCT(序列号33)
根据上述酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号34、35或36所示的碱基序列的寡核苷酸。
TTTCAGACTGGAATAACACT(序列号34)
AATACACGGGTAGGCATCTA(序列号35)
GGAAAGCTCCTTGTGA(序列号36)
根据上述酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号28或37所示的碱基序列的寡核苷酸。
TTGGGCCGCTGAGAGAG(序列号28)
CGCCCGCGAGGAGGCATCTT(序列号37)
根据上述Paenibacillus validus菌16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号38、39或40所示的碱基序列的寡核苷酸。
GGGGCAACCTGTGGCTTAC(序列号38)
GCTAAGACCGGATAGCTGGT(序列号39)
CGCCTCGGAGAGTAA(序列号40)
根据上述史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号45或46所示的碱基序列的寡核苷酸。
AGCTTGCTTTTTGAAAGTTA(序列号45)
GATAATATCTTCCTTCGC(序列号46)
根据上述Alicyclobacillus acidiphilus的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号47、48或49所示的碱基序列的寡核苷酸。
GTTCAAGGGAAGGCA(序列号47)
CCGTTGAGGAAAGTTGC(序列号48)
ATGCAACACTGATAGAG(序列号49)
根据上述Alicyclobacillus hesperidum的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号50或51所示的碱基序列的寡核苷酸。
GGTCACGAGGAGGCA(序列号50)
GCATCTTCTTGTGAGGA(序列号51)
根据上述Bacillus fumarioli的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号52或53所示的碱基序列的寡核苷酸。
TTGCCCCTTGAGATTAG(序列号52)
TCATCCTTTCCTTCGC(序列号53)
根据上述Bacillus acidogenesis的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号54所示的碱基序列的寡核苷酸。
CTTCTTCCTCCGCATGG(序列号54)
根据上述Bacillus sonorensis的16S核糖体RNA基因对应的碱基序列中同种特异性序列设计的寡核苷酸的具体例子，可以为含有下述序列号56或57所示的碱基序列的寡核苷酸。
AGCGAACCGACGGGA(序列号56)
TCCCTTAGGTTAGCGGC(序列号57)
此外，上述捕获寡核苷酸并不限于含有上述序列号1～40及43～57中所示的任一种碱基序列的寡核苷酸。
对于本发明的细菌检测器具的基板上固定的捕获寡核苷酸，只要能够与从对象细菌中制备的探针发生杂交，对其没有特别限定。因此，作为含有上述序列号1～40及43～57中所示的任一种碱基序列的寡核苷酸，可以为仅含有序列号1～40及43～57中所示的任一种碱基序列的寡核苷酸，也可以为含有序列号1～40及43～57中所示的任一种碱基序列以外的序列的寡核苷酸。作为含有序列号1～40及43～57中所示的任一种碱基序列以外的序列的捕获寡核苷酸，可以为具有下述碱基序列的寡核苷酸，所述碱基序列为基于各16S核糖体RNA基因的碱基序列从序列号1～40及43～57所示的各碱基序列的5’端或3’端、或其两侧延伸的碱基序列。这种寡核苷酸固定在基板上的细菌检测器具也属于本发明。
1个基板上固定的捕获寡核苷酸至少有1种即可，没有特别限定。一般检测样品中混入的细菌时，用1个基板可以全部检测出被检样品中可能检测到的细菌，从操作的简便性和检测的快速性来看可谓优选。因此，本发明的细菌检测器具也特别优选在1个基板上固定多数目标细菌种或属对应的捕获寡核苷酸的所谓微阵列型器具。
[寡核苷酸(捕获寡核苷酸)的固定]
寡核苷酸在基板上的固定方法没有特别限定，可以适当选择并使用公知的方法。例如可以利用物理吸附、电结合或分子共价键等一般杂交法中所使用的方法。本发明的细菌检测器具，优选使用表面具有碳二亚胺基或异氰酸酯基的基材(美国专利：US 5,908,746、日本国特开平8-23975号)进行固定。
将寡核苷酸点样时，如果寡核苷酸的点样量太少，无法充分确保寡核苷酸和探针之间的反应性，因而难于判定。此外，高密度点样存在技术方面的问题，同时成本较高，而使用探针的荧光标记、化学显色等检测杂交信号时也需要更加精密昂贵的检测装置(如扫描仪)。因此，优选寡核苷酸以直径10～1000μm的尺寸固定在基板表面。寡核苷酸在基板上的点样方法没有特别限定，例如可使用点样机将寡核苷酸溶液点样在基板上。因此寡核苷酸溶液通常可点成大致圆形。
(2)本发明的细菌检测方法
本发明的细菌检测方法用于检测、鉴定被检样品中的细菌，其包括制备被检样品中细菌的核酸的核酸制备步骤、以该核酸为模板制备标记探针的探针制备步骤、根据对象细菌所属的种或属的特异性序列设计的寡核苷酸与上述标记探针发生杂交的杂交步骤、检测杂交信号的信号检测步骤。本检测方法的杂交步骤中优选使用上述本发明的细菌检测器具。通过使用该细菌检测器具，能够简便、快速且准确地进行全面检测、鉴定。此外，本检测方法的被检样品优选食品，更优选饮料，特别优选清凉饮料。下面将对各步骤分别详细说明。
[核酸制备步骤]
其为制备被检样品中细菌的核酸的步骤。从被检样品中制备核酸的制备方法，可以适当选择并使用公知的核酸制备方法。例如制备DNA时，可以根据R.F.Wang介绍的方法进行提取(Molecular and Cellular Probes(2000)14，1-5)。该方法为标准制备方法，但还有多种替代方法，可以采用其中的任一种方法。此外，也可以使用市售的试剂盒。
[探针制备步骤]
其为将上述核酸制备步骤中制备的核酸作为模板制备标记探针的步骤。例如可以使用用以扩增含有捕获寡核苷酸及阳性对照捕获性核苷酸的碱基序列的区域而设计的引物，通过核酸扩增来制作探针。作为核酸扩增的方法，例如可以为通过PCR扩增DNA的方法，或通过体外转录法(in vitro transcription)扩增RNA的方法，但并不限于这些方法。
例如通过PCR制备标记探针时，设计PCR使用的引物以使探针扩增含有与捕获寡核苷酸及阳性对照捕获寡核苷酸互补的碱基序列的区域。此外，只要能够杂交，探针可以比捕获寡核苷酸或阳性对照捕获寡核苷酸长，也可比其短。为了得到标记探针，可预先标记PCR使用的引物。此外也可通过预先标记PCR的底物(脱氧核苷酸三磷酸)得到标记探针。或者也可在PCR结束后标记探针。标记物质没有特别限定，例如可以使用荧光物质、半抗原、放射性物质等与通常杂交使用的探针相同的标记物质。具体来说，荧光物质可以为异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(Rodamine)、藻红素(phycoerythrin)(PE)、德州红(TexasRed)、花色素(cyanin)类荧光染料等，半抗原的具体实例包括生物素(BIOTIN)、地高辛(Digoxigenin)(Dig)、二硝基苯酚(DNP)、荧光素(fluorescein)等。
[杂交步骤]
杂交步骤是根据对象细菌所属的种或属的特异性序列设计的寡核苷酸和上述标记探针发生杂交的步骤。杂交可以在固定有上述寡核苷酸的薄膜等上进行，但优选使用本发明的细菌检测器具。通过使用该细菌检测器具，可以简便、快速且准确地进行全面检测、鉴定。杂交步骤中使用的方法没有特别限定，可以适当选择并使用公知的核酸杂交方法。下面所示的是一例具体杂交方法。
在含有例如为SSC(Standard Saline Citrate)的盐溶液、例如为十二烷基硫酸钠(SDS)或牛血清白蛋白(BSA)的阻断溶液及促进融合反应的添加剂的融合液中，加入标记探针。当探针为双链时，通过加热等进行变性。在基板上加数微升标记探针液后，进行数小时的加热操作(通常37℃～50℃)，使基板上固定的寡核苷酸和标记探针之间发生杂交。然后在基板上加入5×SSC或3M四甲基氯化铵进行加热(通常37℃～50℃)，使没有形成特异性杂交体的标记探针从基板上除去，只有特异性杂交体选择性地留在基板上。
[信号检测步骤]
信号检测步骤是判定上述杂交步骤中是否发生杂交的步骤，通常与上述杂交步骤连续进行。
信号检测步骤使用的方法，取决于上述探针制备步骤所制备的探针中导入的标记物质。即、检测杂交体时要使用在探针中导入的荧光物质、半抗原等标记物质。因此，适当选择并使用公知的用以检测使用的探针中所导入的标记物质的方法即可。
例如使用半抗原时，在基板上加入含有识别半抗原的蛋白质或与其结合的蛋白质的结合物和碱性磷酸酯酶或辣根过氧化物酶等的结合物(酶结合物)的溶液，室温下使反应进行数十分钟。
为使杂交体可视化，仅存在半抗原和酶结合物结合体的情况下，添加形成不溶化合物的化合物。该不溶化合物的生成通过酶反应得到扩增并可视化。作为添加的化合物，当酶结合物中的酶是碱性磷酸酯酶时，使用硝基四氮唑蓝(NBT)和BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-对甲苯胺盐)；当酶是辣根过氧化物酶时，使用TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯二胺)等。
通过观察捕获寡核苷酸固定位置的杂交体色素沉淀或荧光发射等杂交信号，判定被检样品中含有的细菌种类。即、检测到杂交信号时，表明被检样品中含有该信号位置点样的寡核苷酸相对应的细菌。此外，如果在阳性对照捕获寡核苷酸的位置发现信号，可以确认本试验正常进行；如在阴性对照捕获寡核苷酸的位置未发现信号，可以确认杂交条件适当。
(3)本发明的细菌检测试剂盒
本发明的细菌检测试剂盒是用于实施上述本发明的细菌检测方法的试剂盒。因此，只要能够实施本发明的细菌检测方法，试剂盒内包括的组成没有特别限定。
本细菌检测试剂盒，优选包括本发明的细菌检测器具，形成包括该细菌检测器具的试剂盒，可以简便、快速且准确地进行全面检测、鉴定。此外，本细菌检测试剂盒中优选包括上述杂交步骤及信号检测步骤中使用的试剂。作为上述杂交步骤使用的试剂，例如可以为SSC(Standard Saline Citrate)等盐溶液、十二烷基硫酸钠(SDS)、牛血清白蛋白(BSA)等阻断溶液及用以促进融合反应的添加剂等。
作为信号检测步骤中使用的试剂，例如可以为识别半抗原的蛋白质和酶的结合物(酶结合物)、NBT、BCIP、TMB等显色底物等。
上述杂交步骤和信号检测步骤中使用的试剂，并不限于所述试剂，可以根据目的选择适当试剂作为试剂盒的组成。
本细菌检测试剂盒中，优选包括上述探针制备步骤中使用的试剂，并且还优选包括上述核酸制备步骤中使用的试剂。作为探针制备步骤中使用的试剂，例如可以为PCR用缓冲液、耐热性DNA合成酶、脱氧三磷酸核苷混合液等。作为核酸制备步骤中使用的试剂，可以为溶菌用缓冲液、DNA回收柱、DNA提取用缓冲液等。但并不限于这些试剂，可以根据目的选择适当试剂作为试剂盒的组成。
通过使用本发明的试剂盒(包括本发明的细菌检测器具及各步骤使用的试剂)，受领被检样品后约6小时即可检测、鉴定出被检样品中含有的细菌。
(4)本发明的用途
本发明的细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒的用途没有特别限定，可用在所有需要判定细菌的用途中。具体来说，如优选应用于细菌污染对质量造成大的影响的各种工业制品的制造过程中，从该工业制品、其制造环境等中分离出的细菌需要快速且准确地检测、鉴定的情况。
作为判定对象的被判定细菌的来源的上述工业制品，代表性例子可以是食品、医药品、试剂、非处方药、一次性医疗器具等，没有特别限定。本发明优选应用在上述例举的工业制品中的食品中。作为食品，更加具体地说，可以为饮料(清凉饮料、酒精饮料、浓缩还原果汁、天然果汁、果汁饮料、咖啡饮料)、面包、和洋式点心(包括冷冻点心)、成品菜食品、乳制品、谷类食品、豆腐、油炸豆腐类、面类、盒饭类、调味料、小麦粉及食肉等农产加工品、营养补助食品(supplement等)、长期保存食品(罐头、冷冻食品、蒸煮袋食品等)等，没有特别限定。
本发明特别优选应用于上述例举食品中的清凉饮料。清凉饮料可以为麦茶、乌龙茶、绿茶、焙煎茶等茶类，没有特别限定。
本发明并不限定于上述各实施方式，在权利要求项所示的范围内可以进行各种变更，将不同实施方式中公开的技术手段适当组合得到的实施方式也包括在本发明的技术范围内。
实施例
[寡核苷酸的合成]
根据规定方法，使用寡核苷酸合成仪(Perkin-elmer Applied biosystems公司制)合成寡核苷酸，经脱保护后进行干燥。该寡核苷酸干燥体用10mMTris-HCl(pH7.5)和1mM EDTA缓冲液溶解，制成100pmol/μL的寡核苷酸溶液。本实施例中使用的全部寡核苷酸均由该方法合成。
合成的寡核苷酸的碱基序列用序列号1～57表示，其中序列号1～40及43～57表示捕获寡核苷酸，序列号41、42表示引物。对于捕获寡核苷酸，使用上述合成仪使5’末端结合氨基，然而对于引物则是使5’末端结合生物素。
[在基板上点样捕获寡核苷酸]
在10μL的5’末端具有氨基的寡核苷酸溶液中混合10μL微点样溶液(TeleChem International Inc.制)，分注于微量滴定板(Greiner LaboratoryInc制)上。在点样机的预定位置设置碳化二亚胺树脂处理的载玻片Carbostation(日清纺织株式会社制、注册商标)后，使点样机工作。
点样结束后，将载玻片置于热水的蒸汽中数秒时间，然后用600mJ紫外线照射。再次在蒸汽中暴露数秒时间，然后将载玻片置于加热板上除去水分。
将载玻片放入含有3％BSA(牛血清白蛋白)的100mM Tris-HCl(pH7.5)·100mM NaCl·0.1％Triton X-100中室温下浸渍30分钟，进行阻断。然后用10mMTris-HCl(pH7.5)·1mM EDTA缓冲液清洗。
室温下干燥载玻片，使用前一直以干燥状态保存于冷暗处。
[核酸制备步骤]
作为检体使用的细菌，使用属于芽孢杆菌属(Bacillus)的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、Bacillussporothermodurans、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、Bacillus benzoevorans、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、史氏芽孢杆菌(Bacillussmithii)、Bacillus fumarioli、Bacillus acidogenesis及Bacillussonorensis。
此外，将属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)的酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、Alicyclobacillus acidiphilus及Alicyclobacillus hesperidum作为检体使用。
此外，将属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的Paenibacillus validus、Paenibacillus illinoisensis、蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)作为检体使用。
此外，将属于硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)的Aneurinibacillusaneurinolyticus作为检体使用。
此外，将属于土芽孢杆菌属(Geobacillus)的嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)作为检体使用。
此外，将属于短芽孢杆菌属(Brevibacillus)的短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)作为检体使用。
另一方面，作为对照检体，使用大肠埃希菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、头葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)。
利用在最适当的培养条件下培养上述各细菌的菌液，使用Genomic DNAPurif.Kit(EdgeBioSystems制、Cat.No.#85171)分别制备各细菌的基因组DNA。
[探针制备步骤]
以得到的各细菌的DNA为模板通过PCR制备核酸探针。PCR反应液的细成为，Taq聚合酶2.5单位、生物素化引物(序列号41和42)各50pmol、10×反应用缓冲液5μL、dNTP各10nmol、模板DNA 100ng，加入灭菌蒸馏水使总量为50μL。使用热循环器，95℃保持3分钟后，95℃30秒、57℃30秒、72℃1分钟的反应循环40次，72℃保持5分钟结束反应。
[杂交步骤和信号检测步骤]
将4μL上述核酸探针溶液和16μL ArrayIt Unihyb HybridizationSolution(TeleChem International Inc.制、注册商标)加在一起并混合，95℃加热处理1分钟后在冰中浸渍1分钟。取该核酸探针溶液的全量，加在固定有捕获寡核苷酸的基板上，在其上面放置盖玻片。将其放入保湿箱，在设定37℃的恒湿器中静置120分钟。取出基板，快速浸入室温下的2×SSC溶液(2×SSC：0.033M NaCl、0.033M枸橼酸钠)中并除去盖玻片，在保持温度37℃的2×SSC中浸渍5分钟。
从2×SSC中取出基板，放入离心机(Beckman公司制)内，以2000rpm离心1分钟，接着使用VECTASTAIN Elite ABC kit(VECTOR公司制)，制作卵白素-生物素化过氧化物酶结合体，在基板上滴1.4mL，室温静置30分钟。
然后在PBS(10mM磷酸钠(pH7.5)、0.9％氯化钠)中清洗。使用TMB substratekit for peroxidase(VECTOR公司制)制备显色溶液，在基板上滴1.4mL室温静置30分钟。用蒸馏水清洗基板停止显色反应。
[判定]
使用爱普生公司制造的扫描仪GT-8700F及其透射单元，用600dpi扫描已发生杂交的区域，用目视来确认扫描图像有无显色。
[结果]
作为各检体使用的21种细菌的结果如表1～21所示。
各表中“+”表示确认有显色的点，“-”表示确认没有显色的点。
表1表示枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的结果。
表1
被检细菌：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
根据表1，确认枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在芽孢杆菌属(Bacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号2、3)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)检测用捕获寡核苷酸(序列号16、17、18)的合计5处显色。
表2表示凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)的结果。
表2
被检细菌：凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)
根据表2，确认凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)在芽孢杆菌属(Bacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号1、3)和凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)检测用捕获寡核苷酸(序列号12、13、14)的合计5处显色。
表3表示球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)的结果
表3
被检细菌：球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)
根据表3，确认球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)在芽孢杆菌属(Bacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号1)和球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)检测用捕获寡核苷酸(序列号32、33)的合计3处显色。
表4表示短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的结果
表4
被检细菌：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)
根据表4，确认短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)在芽孢杆菌属(Bacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号3)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)检测用捕获寡核苷酸(序列号20、55)的合计3处显色。
表5表示Bacillus sporothermodurans菌的结果
表5
被检细菌：Bacillus sporothermodurans
根据表5，Bacillus sporothermodurans在芽孢杆菌属(Bacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号3)和Bacillus sporothermodurans检测用捕获寡核苷酸(序列号15、43)的合计3处显色。
表6表示巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的结果。
表6
被检细菌：巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)
根据表6，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)在芽孢杆菌属(Bacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号1、3)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)检测用捕获寡核苷酸(序列号31)的合计3处显色。
表7表示迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的结果。
表7
被检细菌：迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)
根据表7，确认迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)在芽孢杆菌属(Bacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号1、3)和迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)检测用捕获寡核苷酸(序列号21、22、23、24、25)的合计7处显色。
表8表示坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)的结果。
表8
被检细菌：坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)
根据表8，确认坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)在芽孢杆菌属(Bacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号1，3)和坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)检测用捕获寡核苷酸(序列号26)的合计3处显色。
表9表示环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的结果
表9
被检细菌：环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)
根据表9，确认环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)在芽孢杆菌属(Bacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号1、3)和环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)检测用捕获寡核苷酸(序列号27)的合计3处显色。
表10表示Bacillus benzoevorans的结果。
表10
被检细菌：Bacillus benzoevorans
根据表10，确认Bacillus benzoevorans在芽孢杆菌属(Bacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号1、3)和Bacillus benzoevorans检测用捕获寡核苷酸(序列号30)的合计3处显色。
表11表示地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的结果。
表11
被检细菌：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)
根据表11，确认地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)在芽孢杆菌属(Bacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号2、3)和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)检测用捕获寡核苷酸(序列号19)的合计3处显色。
表12表示酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)的结果。
表12
被检细菌：酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)
根据表12，确认酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)在脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号5)和酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)检测用捕获寡核苷酸(序列号34、35、36)的合计4处显色。
表13表示酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的结果。
表13
被检细菌：酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)
根据表13，确认酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)在脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号5)和酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)检测用捕获寡核苷酸(序列号28、37)的合计3处显色。
表14表示Aneurinibacillus aneurinolyticus的结果。
表14
被检细菌：Aneurinibacillus aneurinolyticus
根据表14，确认Aneurinibacillus aneurinolyticus菌在芽孢杆菌属(Bacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号3)和硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号6)的合计2处显色。
表15表示嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的结果。
表15
被检细菌：嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)
根据表15，确认嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)在芽孢杆菌属(Bacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号1)和土芽孢杆菌属(Geobacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号7)的合计2处显色。
表16表示Paenibacillus validus菌的结果。
表16
被检细菌：Paenibacillus validus
根据表16，确认Paenibacillus validus菌在芽孢杆菌属(Bacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号3)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号8)、以及Paenibacillus validus菌检测用捕获寡核苷酸(序列号38、39、40)的合计5处显色。
表17表示蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的结果。
表17
被检细菌：蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)
根据表17，确认蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)在蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)检测用捕获寡核苷酸(序列号9、10、11)的合计3处显色。
表18表示Paenibacillus illinoisensis的结果。
表18
被检细菌：Paenibacillus illinosensis
根据表18，确认Paenibacillus illinoisensis菌在类芽孢杆菌属(Paenibacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号8)的1处显色。
表19表示蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)的结果。
表19
被检细菌：蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)
根据表19，确认蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)在类芽孢杆菌属(Paenibacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号8)的1处显色。
表20表示多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的结果。
表20
被检细菌：多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
根据表20，确认多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)在类芽孢杆菌属(Paenibacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号8)的1处显色。
表21表示短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)的结果。
表21
被检细菌：短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)
根据表21，确认短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)在短芽孢杆菌属(Brevibacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号4)的1处显色。
表22表示史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)的结果。
表22
被检细菌：史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)
根据表22，确认史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)在芽孢杆菌属(Bacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号1和3)和史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)检测用捕获寡核苷酸(序列号45及46)的合计4处显色。
表23表示Alicyclobacillus acidiphilus的结果。
表23
被检细菌：Alicyclobacillus acidiphilus
根据表23，确认Alicyclobacillus acidiphilus在脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号5)和Alicyclobacillusacidiphilus检测用捕获寡核苷酸(序列号47～49)的合计4处显色。
表24表示Alicyclobacillus hesperidum的结果。
表24
被检细菌：Alicyclobacillus hesperidum
根据表24，确认Alicyclobacillus hesperidum在脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号5)和Alicyclobacillushesperidum检测用捕获寡核苷酸(序列号50和51)的合计3处显色。
表25表示Bacillus fumarioli的结果。
表25被检细菌：Bacillus fumarioli
根据表25，确认Bacillus fumarioli在芽孢杆菌属(Bacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号1和3)和Bacillus fumarioli检测用捕获寡核苷酸(序列号52和53)的合计4处显色。
表26表示Bacillus acidogenesis的结果。
表26
被检细菌：Bacillus acidogenesis
根据表26，确认Bacillus acidogenesis在芽孢杆菌属(Bacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号1～3)和Bacillus acidogenesis检测用捕获寡核苷酸(序列号54)的合计4处显色。
表27表示Bacillus sonorensis的结果。
表27
被检细菌：Bacillus sonorensis
根据表27，确认Bacillus sonorensis在芽孢杆菌属(Bacillus)检测用捕获寡核苷酸(序列号1～3)和Bacillus sonorensis检测用捕获寡核苷酸(序列号56和57)的合计5处显色。
此外，对照菌大肠埃希菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、头葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)对所有的捕获寡核苷酸没有显色(数据省略)。
根据上述结果可以确认，本发明的细菌检测器具(基板)能够特异性检测芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)，并且能够对下述细菌进行种特异性鉴定，所述细菌为：蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、Paenibacillus validus菌、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、Alicyclobacillus acidoterestris、Alicyclobacillus acidocardarius、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、Bacillus benzoevorans、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)、Bacillusfumarioli、Bacillus acidogenesis、Bacillus sonorensis、Alicyclobacillusacidiphilus、Alicyclobacillus hesperidum等。
本发明提供采用简便操作即可快速、准确地判定被检样品中混入的细菌的细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒，因此，本发明能够在食品制造业、饮食产业、药品产业等中的卫生管理、过程管理、质量管理方面应用。
序列表
<110>三得利株式会社(Suntory Limited)
日清纺织株式会社(Nissbinbo Industries Inc.)
<120>细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒(A target bacteria detection instrument，a
target bacteria detection method and a target bacteria detection kit)
<130>PCT05-0065
<150>JP2004-228669
<151>2004-08-04
<160>57
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>芽孢杆菌属(Bacillus sp.)
<400>1
agatgggccc gcggcgcatt 20
<210>2
<211>15
<212>DNA
<213>芽孢杆菌属(Bacillus sp.)
<400>2
gacccgcggc gcatt 15
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>芽孢杆菌属(Bacillus sp.)
<400>3
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<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>短芽孢杆菌属(Brevibacillus sp.)
<400>4
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<211>19
<212>DNA
<213>脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus sp.)
<400>5
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<210>6
<211>15
<212>DNA
<213>硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus sp.)
<400>6
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<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>土芽孢杆菌属(Geobacillus sp.)
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<211>18
<212>DNA
<213>类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)
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<211>23
<212>DNA
<213>蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)
<400>9
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<211>16
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<213>蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)
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<212>DNA
<213>蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)
<400>11
gctagttgaa taagctggc 19
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<213>凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)
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<210>13
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<213>凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)
<400>13
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<211>16
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<213>凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)
<400>14
gccggggaag aacaag 16
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<211>19
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<213>Bacillus sporothermodurans
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ctccgcatgg agagagatt 19
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<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
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gcatggttca aacataaaag 20
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<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
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<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
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<213>地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)
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<212>DNA
<213>酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)
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<213>Bacillus benzoevorans
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gagcggactt aaaaagcttg 20
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<211>17
<212>DNA
<213>Bacillus benzoevorans
<400>30
gagcggactt ttgggag 17
<210>31
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<212>DNA
<213>巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)
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taggatcttc tccttcatgg g 21
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<213>球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)
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tcggctgtcg ctataggatg 20
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<213>球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)
<400>33
aagtacagta gtaactggct 20
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<211>20
<212>DNA
<213>酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)
<400>34
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<213>酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)
<400>35
aatacacggg taggcatcta 20
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<213>酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)
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<213>酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)
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<213>短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)
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<213>Bacillus sonorensis
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Claims (33)
1.好气性产芽孢细菌检测器具，其用于检测和鉴定样品中的好气性产芽孢细菌，所述器具包括用于检测好气性产芽孢细菌的碱基序列为序列号1、2和3的寡核苷酸探针和一个或多个选自碱基序列为序列号9、10和11的寡核苷酸探针组成的组的寡核苷酸探针以及一个或多个选自碱基序列为序列号15和43的寡核苷酸探针组成的组的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针固定在基板上。
2.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测属于短芽孢杆菌属细菌的碱基序列为序列号4的寡核苷酸探针固定在基板上。
3.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测属于脂环酸芽孢杆菌属细菌的碱基序列为序列号5的寡核苷酸探针固定在基板上。
4.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测属于硫胺素芽孢杆菌属细菌的碱基序列为序列号6的寡核苷酸探针固定在基板上。
5.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测属于土芽孢杆菌属细菌的碱基序列为序列号7的寡核苷酸探针固定在基板上。
6.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测属于类芽孢杆菌属细菌的碱基序列为序列号3和8的寡核苷酸探针中的至少1个固定在基板上。
7.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测凝结芽孢杆菌的碱基序列为序列号12、13和14的寡核苷酸探针中的至少1个固定在基板上。
8.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测枯草芽孢杆菌的碱基序列为序列号16、17和18的寡核苷酸探针中的至少1个固定在基板上。
9.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测地衣芽孢杆菌的碱基序列为序列号19的寡核苷酸探针固定在基板上。
10.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测短小芽孢杆菌的碱基序列为序列号20或55的寡核苷酸探针固定在基板上。
11.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测迟缓芽孢杆菌的碱基序列为序列号21～25的寡核苷酸探针中的至少1个固定在基板上。
12.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测坚强芽孢杆菌的碱基序列为序列号26的寡核苷酸探针固定在基板上。
13.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测环状芽孢杆菌的碱基序列为序列号27的寡核苷酸探针固定在基板上。
14.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测Bacillus benzoevorans的碱基序列为序列号29或30的寡核苷酸探针中的至少1个固定在基板上。
15.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测巨大芽孢杆菌的碱基序列为序列号31的寡核苷酸探针固定在基板上。
16.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测球形芽孢杆菌的碱基序列为序列号32或33的寡核苷酸探针中的至少1个固定在基板上。
17.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测酸土环脂芽孢杆菌的碱基序列为序列号34、35或36的寡核苷酸探针中的至少1个固定在基板上。
18.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测酸热脂环酸芽孢杆菌的碱基序列为序列号28或37的寡核苷酸探针中的至少1个固定在基板上。
19.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测Paenibacillus validus的碱基序列为序列号38、39或40的寡核苷酸探针中的至少1个固定在基板上。
20.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测史氏芽孢杆菌的碱基序列为序列号45或46的寡核苷酸探针中的至少1个固定在基板上。
21.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测Alicyclobacillusacidiphilus的碱基序列为序列号47、48或49的寡核苷酸探针中的至少1个固定在基板上。
22.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测Alicyclobacillushesperidum的碱基序列为序列号50或51的寡核苷酸探针中的至少1个固定在基板上。
23.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测Bacillus fumarioli的碱基序列为序列号52或53的寡核苷酸探针中的至少1个固定在基板上。
24.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测Bacillus acidogenesis的碱基序列为序列号54的寡核苷酸探针中的至少1个固定在基板上。
25.如权利要求1所述的器具，其中，用于检测Bacillus sonorensis的碱基序列为序列号56或57的寡核苷酸探针中的至少1个固定在基板上。
26.如权利要求1所述的器具，其中，碱基序列为序列号1～40、43～56或57的全部寡核苷酸探针固定在基板上。
27.如权利要求1～26中任一项所述的器具，其特征在于，上述基板上具有碳二亚胺基或异氰酸酯基，通过该碳二亚胺基或异氰酸酯基和上述寡核苷酸探针或寡核苷酸探针末端连接的接头反应形成共价键。
28.好气性产芽孢细菌检测方法，用于检测、鉴定来自工业制品的被检样品中的好气性产芽孢细菌，其包括如下步骤：
制备被检样品中细菌的核酸的核酸制备步骤；
以该核酸为模板制备标记探针的探针制备步骤；
使用权利要求1～27中任一项所述的好气性产芽孢细菌检测器具，使固定在基板上的寡核苷酸探针和上述标记探针发生杂交的杂交步骤；和
检测杂交信号的信号检测步骤。
29.如权利要求28所述的好气性产芽孢细菌检测方法，其中所述被检样品是食品。
30.如权利要求29所述的好气性产芽孢细菌检测方法，其中所述食品是饮料。
31.如权利要求30所述的好气性产芽孢细菌检测方法，其中所述饮料是清凉饮料。
32.好气性产芽孢细菌检测试剂盒，其用于实施权利要求28～31中任一项所述的好气性产芽孢细菌检测方法。
33.好气性产芽孢细菌检测试剂盒，其用于检测和鉴定样品中的好气性产芽孢细菌，所述试剂盒包括权利要求1-27中任意一项所述的好气性产芽孢细菌检测器具和用于寡核苷酸探针与来自被检样品的核酸之间进行杂交的试剂。
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Owner name: SUNTORY LTD. Free format text: FORMER OWNER: SUNTORY LTD.; APPLICANT Effective date: 20080307 |
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Effective date of registration: 20080307 Address after: Japan Osaka Applicant after: Suntory Ltd. Address before: Japan Osaka Applicant before: Suntory Corporation Co-applicant before: Nisshinbo Industries, Inc. |
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SUNTORY HOLDINGS CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: SUNTORY LTD. Effective date: 20090717 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20090717 Address after: Osaka City, Osaka of Japan Applicant after: Suntory Holdings Limited Address before: Japan Osaka Applicant before: Suntory Ltd. |
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Granted publication date: 20101229 Termination date: 20170804 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |