JP2001095579A - 微生物の検出方法 - Google Patents
微生物の検出方法Info
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- JP2001095579A JP2001095579A JP27605399A JP27605399A JP2001095579A JP 2001095579 A JP2001095579 A JP 2001095579A JP 27605399 A JP27605399 A JP 27605399A JP 27605399 A JP27605399 A JP 27605399A JP 2001095579 A JP2001095579 A JP 2001095579A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 幾種ものプローブを作製せずにＢａｃｉｌｌ
ｕｓ属に属する微生物のうち共通の塩基配列を有するＢ
ａｃｉｌｌｕｓ属微生物を検出する方法を提供する。 【解決手段】 Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物に共
通している下記塩基配列を有する核酸プローブを用いて
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物を検出することを特
徴とする微生物の検出方法。 １ ５′ｇｔａｃｃｇｃｃｃｔａｔｔｃｇａａｃｇ３′ ２ ５′ｃｇａａｇｃｃａｃｃｔｔｔｔａｔｇ３′ ３ ５′ｃｃｃｃａａｔｃａｔｃｔｇｔｃｃｃａ３′ ４ ５′ａｔｇｃｇｃｃｇｃｇｇｇｃｃｃａｔｃｔｇ３′
ｕｓ属に属する微生物のうち共通の塩基配列を有するＢ
ａｃｉｌｌｕｓ属微生物を検出する方法を提供する。 【解決手段】 Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物に共
通している下記塩基配列を有する核酸プローブを用いて
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物を検出することを特
徴とする微生物の検出方法。 １ ５′ｇｔａｃｃｇｃｃｃｔａｔｔｃｇａａｃｇ３′ ２ ５′ｃｇａａｇｃｃａｃｃｔｔｔｔａｔｇ３′ ３ ５′ｃｃｃｃａａｔｃａｔｃｔｇｔｃｃｃａ３′ ４ ５′ａｔｇｃｇｃｃｇｃｇｇｇｃｃｃａｔｃｔｇ３′
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は微生物の検出方法に
関し、特にＢａｃｉｌｌｕｓ属に共通の１６ｓｒＤＮＡ
にコードされる塩基配列の一部もしくはすべてを含む核
酸プローブを用いてＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物
を検出する方法に関するものである。
関し、特にＢａｃｉｌｌｕｓ属に共通の１６ｓｒＤＮＡ
にコードされる塩基配列の一部もしくはすべてを含む核
酸プローブを用いてＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物
を検出する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】生物処理による水処理技術において、Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ属グループに属する微生物は澱粉、油脂
などの分解性が高く、種々の抗生物質や抗菌物質を産出
することから廃水処理上の注目度が高い。また、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ属に属する微生物は胞子を形成することによ
り耐熱性菌としての特徴を有し、コンポストなど高温で
の微生物処理における主役と考えられている。生物処理
による水処理やごみ処理において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属
微生物の果たす役割は高いと考えられている。そこで、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物の有無を検出する必要があ
る。
ａｃｉｌｌｕｓ属グループに属する微生物は澱粉、油脂
などの分解性が高く、種々の抗生物質や抗菌物質を産出
することから廃水処理上の注目度が高い。また、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ属に属する微生物は胞子を形成することによ
り耐熱性菌としての特徴を有し、コンポストなど高温で
の微生物処理における主役と考えられている。生物処理
による水処理やごみ処理において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属
微生物の果たす役割は高いと考えられている。そこで、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物の有無を検出する必要があ
る。
【０００３】従来から標準的な検出培地を用いてＢａｃ
ｉｌｌｕｓ属微生物の検出が行われているが、すべての
菌を検出することはできず、また必ずしもＢａｃｉｌｌ
ｕｓ属菌が成育するとも限らない。最近、核酸プローブ
を用いた検出方法が発達し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属す
る微生物もこれにより検出されるようになってきてい
る。しかしながら、多くのＢａｃｉｌｌｕｓ属を網羅す
るプローブは開発されておらず、個々のプローブを作製
しなければならないのが現状である。
ｉｌｌｕｓ属微生物の検出が行われているが、すべての
菌を検出することはできず、また必ずしもＢａｃｉｌｌ
ｕｓ属菌が成育するとも限らない。最近、核酸プローブ
を用いた検出方法が発達し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属す
る微生物もこれにより検出されるようになってきてい
る。しかしながら、多くのＢａｃｉｌｌｕｓ属を網羅す
るプローブは開発されておらず、個々のプローブを作製
しなければならないのが現状である。
【０００４】近年、特定の微生物のみを特異的に検出す
る方法としてｒＲＮＡ配列を標的とした蛍光プローブを
用いたハイブリダイゼーションを行い、蛍光顕微鏡下で
特定の細菌を標出する蛍光 ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリ
ダイゼーション（ＦＩＳＨ）が普及しつつある。ｒＲＮ
Ａはリボゾームを構成するＲＮＡであり、科、属、種と
いったレベルで共通な、または特異な配列を見出すこと
ができる。したがって、目的に応じた配列をプローブと
して利用することによって科や属レベルでの遺伝情報を
もとにした特定細菌の検出が可能になる。しかしなが
ら、プローブの設計において種レベルでのプローブ設計
は比較的多く見られるが、科、属レベルでのプローブは
あまりない。そこで、属レベルでの微生物を検出するプ
ローブが望まれる。
る方法としてｒＲＮＡ配列を標的とした蛍光プローブを
用いたハイブリダイゼーションを行い、蛍光顕微鏡下で
特定の細菌を標出する蛍光 ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリ
ダイゼーション（ＦＩＳＨ）が普及しつつある。ｒＲＮ
Ａはリボゾームを構成するＲＮＡであり、科、属、種と
いったレベルで共通な、または特異な配列を見出すこと
ができる。したがって、目的に応じた配列をプローブと
して利用することによって科や属レベルでの遺伝情報を
もとにした特定細菌の検出が可能になる。しかしなが
ら、プローブの設計において種レベルでのプローブ設計
は比較的多く見られるが、科、属レベルでのプローブは
あまりない。そこで、属レベルでの微生物を検出するプ
ローブが望まれる。
【０００５】ところで、生物的水処理やコンポストにお
いて重要な働きをしているとされるＢａｃｉｌｌｕｓ属
にグループされる微生物は、１９９９年６月現在におい
てｒＲＮＡ登録数についてだけでも３２１種あり、検体
中のＢａｃｉｌｌｕｓ属微生物を検出するには幾つもの
プローブを設計する必要がある。
いて重要な働きをしているとされるＢａｃｉｌｌｕｓ属
にグループされる微生物は、１９９９年６月現在におい
てｒＲＮＡ登録数についてだけでも３２１種あり、検体
中のＢａｃｉｌｌｕｓ属微生物を検出するには幾つもの
プローブを設計する必要がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、上記
のような現状の問題点を克服し、幾種ものプローブを作
製せずにＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物のうち共通
の塩基配列を有するＢａｃｉｌｌｕｓ属微生物を検出す
る方法を提供することにある。
のような現状の問題点を克服し、幾種ものプローブを作
製せずにＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物のうち共通
の塩基配列を有するＢａｃｉｌｌｕｓ属微生物を検出す
る方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記課題を達成するた
め、本願で特許請求される発明は下記のとおりである。 （１）Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物に共通してい
る塩基配列を有する核酸プローブを用いてＢａｃｉｌｌ
ｕｓ属に属するする微生物を検出することを特徴とする
微生物の検出方法。 （２）前記塩基配列が１６ｓｒＤＮＡにコードされてい
る（１）記載の方法。 （３）前記塩基配列が１６ｓｒＲＮＡに含まれる（１）
記載の方法。
め、本願で特許請求される発明は下記のとおりである。 （１）Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物に共通してい
る塩基配列を有する核酸プローブを用いてＢａｃｉｌｌ
ｕｓ属に属するする微生物を検出することを特徴とする
微生物の検出方法。 （２）前記塩基配列が１６ｓｒＤＮＡにコードされてい
る（１）記載の方法。 （３）前記塩基配列が１６ｓｒＲＮＡに含まれる（１）
記載の方法。
【０００８】（４）前記塩基配列が下記の４つの配列の
いずれかである（１）記載記載の方法。 １ ５′ｇｔａｃｃｇｃｃｃｔａｔｔｃｇａａｃｇ３′ ２ ５′ｃｇａａｇｃｃａｃｃｔｔｔｔａｔｇ３′ ３ ５′ｃｃｃｃａａａｔｃａｔｃｔｇｔｃｃｃａ３′ ４ ５′ａｔｇｃｇｃｃｇｃｇｇｇｃｃｃａｔｃｔｇ３′ 本発明において、核酸プローブを用いてＢａｃｉｌｌｕ
ｓ属に属する微生物を検出する方法において、幾つかの
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に共通のプローブで汚泥、コンポス
トなどの検体中に存在するＢａｃｉｌｌｕｓ属に分類さ
れる菌類を検出するために設計したプローブの塩基配列
は以下のとおりである。
いずれかである（１）記載記載の方法。 １ ５′ｇｔａｃｃｇｃｃｃｔａｔｔｃｇａａｃｇ３′ ２ ５′ｃｇａａｇｃｃａｃｃｔｔｔｔａｔｇ３′ ３ ５′ｃｃｃｃａａａｔｃａｔｃｔｇｔｃｃｃａ３′ ４ ５′ａｔｇｃｇｃｃｇｃｇｇｇｃｃｃａｔｃｔｇ３′ 本発明において、核酸プローブを用いてＢａｃｉｌｌｕ
ｓ属に属する微生物を検出する方法において、幾つかの
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に共通のプローブで汚泥、コンポス
トなどの検体中に存在するＢａｃｉｌｌｕｓ属に分類さ
れる菌類を検出するために設計したプローブの塩基配列
は以下のとおりである。
【０００９】 プローブ１ ５′ｇｔａｃｃｇｃｃｃｔａｔｔｃｇａａｃｇ３′ プローブ２ ５′ｃｇａａｇｃｃａｃｃｔｔｔｔａｔｇ３′ また、ごくわずかのＢａｃｉｌｌｕｓ属以外の菌をも検
出し得るが、多くのＢａｃｉｌｌｕｓ属菌に共通のプロ
ーブとしてスクリーニングの用途のあるプローブの塩基
配列は下記のとおりである。 プローブ３ ５′ｃｃｃｃａａｔｃａｔｃｔｇｔｃｃｃａ３′ プローブ４ ５′ａｔｇｃｇｃｃｇｃｇｇｇｃｃｃａｔｃｔｇ３′ これらのプローブは数種のＢａｃｉｌｌｕｓに菌共通し
た塩基配列であり、この配列とハイブリダイズし得る菌
はＢａｃｉｌｌｕｓ属の菌として検出することができ
る。
出し得るが、多くのＢａｃｉｌｌｕｓ属菌に共通のプロ
ーブとしてスクリーニングの用途のあるプローブの塩基
配列は下記のとおりである。 プローブ３ ５′ｃｃｃｃａａｔｃａｔｃｔｇｔｃｃｃａ３′ プローブ４ ５′ａｔｇｃｇｃｃｇｃｇｇｇｃｃｃａｔｃｔｇ３′ これらのプローブは数種のＢａｃｉｌｌｕｓに菌共通し
た塩基配列であり、この配列とハイブリダイズし得る菌
はＢａｃｉｌｌｕｓ属の菌として検出することができ
る。
【００１０】
【発明の実施の形態】実施例Ｂａｃｉｌｌｕｓ 属に分類される細菌を前記ＦＩＳＨ法
において検出するために、汚泥サンプル中から単離した
株についてその１６ｓｒＲＮＡ塩基配列を調べたとこ
ろ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ〔ｇｅｎｅ＝
ｒｒｎＯ〕と一致した。このＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ〔ｇｅｎｅ＝ｒｒｎＯ〕を含む認識プライマ
ーの設計を行い、前述のプローブ１およびプローブ２を
設計した。
において検出するために、汚泥サンプル中から単離した
株についてその１６ｓｒＲＮＡ塩基配列を調べたとこ
ろ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ〔ｇｅｎｅ＝
ｒｒｎＯ〕と一致した。このＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ〔ｇｅｎｅ＝ｒｒｎＯ〕を含む認識プライマ
ーの設計を行い、前述のプローブ１およびプローブ２を
設計した。
【００１１】前記プローブ１について、Ｅ．ｃｏｌｉ
（ＮＩＨＪ４４）とＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ
（ＡＴＣＣ６０５１）を公知の方法でパラホルムにて固
定した菌体とスライドグラスにのせて風乾させた。公知
の方法にてアルコールでサンプルの脱水を行ってから、
Ｂａｃｉｌｌｕｓサンプルについてのみ３７℃、１０分
間のリゾチーム処理と、引き続いて６５℃、３０分間の
ＤＴＴ（ジチオスレイトール）／ＳＤＳ処理を行って再
度アルコールでサンプルを脱水した。
（ＮＩＨＪ４４）とＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ
（ＡＴＣＣ６０５１）を公知の方法でパラホルムにて固
定した菌体とスライドグラスにのせて風乾させた。公知
の方法にてアルコールでサンプルの脱水を行ってから、
Ｂａｃｉｌｌｕｓサンプルについてのみ３７℃、１０分
間のリゾチーム処理と、引き続いて６５℃、３０分間の
ＤＴＴ（ジチオスレイトール）／ＳＤＳ処理を行って再
度アルコールでサンプルを脱水した。
【００１２】次に、両サンプルに全真菌共通のプローブ
ＥＵＢ３３８と前記プローブ１を用いて以下のとおり公
知の方法でハイブリダイゼーションを行った。すなわ
ち、０．９Ｍ ＮａＣｌ、５０％ パラホルム、０．０
１％ ＳＤＳ、ｐＨ７．２のハイブリダイゼーション
バッファーを調整し、５０ｎｇ／μｌに調整したプロー
ブをバッファーを１：８の割合で混合したものを調整し
た。各々スライドグラス上のサンプルにプローブを滴下
して、４４℃にて３時間ハイブリダイズした。その後、
４６℃、２０分の洗浄を行った後、落射型蛍光顕微鏡に
て観察した。
ＥＵＢ３３８と前記プローブ１を用いて以下のとおり公
知の方法でハイブリダイゼーションを行った。すなわ
ち、０．９Ｍ ＮａＣｌ、５０％ パラホルム、０．０
１％ ＳＤＳ、ｐＨ７．２のハイブリダイゼーション
バッファーを調整し、５０ｎｇ／μｌに調整したプロー
ブをバッファーを１：８の割合で混合したものを調整し
た。各々スライドグラス上のサンプルにプローブを滴下
して、４４℃にて３時間ハイブリダイズした。その後、
４６℃、２０分の洗浄を行った後、落射型蛍光顕微鏡に
て観察した。
【００１３】その結果、プローブＥＵＢ３３８では両方
のサンプルにおいて蛍光プローブがハイブリダイズした
ためによる蛍光観察が認められた。一方、プローブ１で
はＥｃｏｌｉではハイブリダイズしなかったため観察が
できなかったが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
（ＡＴＣＣ６・５１）ではハイブリダイズによる蛍光観
察が確認された。なお、いずれもＤＡＰＩによる対比染
色を行って菌体の判別を行った。
のサンプルにおいて蛍光プローブがハイブリダイズした
ためによる蛍光観察が認められた。一方、プローブ１で
はＥｃｏｌｉではハイブリダイズしなかったため観察が
できなかったが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
（ＡＴＣＣ６・５１）ではハイブリダイズによる蛍光観
察が確認された。なお、いずれもＤＡＰＩによる対比染
色を行って菌体の判別を行った。
【００１４】水処理場から採取した汚泥サンプルについ
て、公知の方法でパラホルムアルデヒド固定を行った。
この汚泥をスライドグラスにのせ風乾させた後、公知の
方法でアルコール脱水を行った。前記と同様リゾチーム
とＤＴＴ／ＳＤＳによる前処理を施した後、ハイブリダ
イゼーション バッファーで調整したプローブをスライ
ドグラス上に滴下し、ハイブリダイゼーションを行っ
た。前記同様、洗浄後ＤＡＰＩによる対比染色を行って
から検境した。これにより汚泥中のＢａｃｉｌｌｕｓ属
の存在が確認された。
て、公知の方法でパラホルムアルデヒド固定を行った。
この汚泥をスライドグラスにのせ風乾させた後、公知の
方法でアルコール脱水を行った。前記と同様リゾチーム
とＤＴＴ／ＳＤＳによる前処理を施した後、ハイブリダ
イゼーション バッファーで調整したプローブをスライ
ドグラス上に滴下し、ハイブリダイゼーションを行っ
た。前記同様、洗浄後ＤＡＰＩによる対比染色を行って
から検境した。これにより汚泥中のＢａｃｉｌｌｕｓ属
の存在が確認された。
【００１５】
【発明の効果】本発明によれば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に
属する微生物について数少ないプローブでスクリーニン
グおよび検出することが可能になった。
属する微生物について数少ないプローブでスクリーニン
グおよび検出することが可能になった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (4)
- 【請求項１】 Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物に共
通している塩基配列を有する核酸プローブを用いてＢａ
ｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物を検出することを特徴と
する微生物の検出方法。 - 【請求項２】 前記塩基配列が１６ｓｒＤＮＡにコード
されている請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記塩基配列が１６ｓｒＲＮＡに含まれ
る請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 前記塩基配列が下記の４つの配列のいず
れかである請求項１記載記載の方法。 １ ５′ｇｔａｃｃｇｃｃｃｔａｔｔｃｇａａｃｇ３′ ２ ５′ｃｇａａｇｃｃａｃｃｔｔｔｔａｔｇ３′ ３ ５′ｃｃｃｃａａｔｃａｔｃｔｇｔｃｃｃａ３′ ４ ５′ａｔｇｃｇｃｃｇｃｇｇｇｃｃｃａｔｃｔｇ３′
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27605399A JP2001095579A (ja) | 1999-09-29 | 1999-09-29 | 微生物の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27605399A JP2001095579A (ja) | 1999-09-29 | 1999-09-29 | 微生物の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001095579A true JP2001095579A (ja) | 2001-04-10 |
Family
ID=17564146
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27605399A Pending JP2001095579A (ja) | 1999-09-29 | 1999-09-29 | 微生物の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001095579A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2857375A1 (fr) * | 2003-07-10 | 2005-01-14 | Biomerieux Sa | Procede de detection et/ou d'identification de bacteries de genre staphylococcus |
| EP1788093A1 (en) * | 2004-08-04 | 2007-05-23 | Suntory Limited | Instrument for detecting bacterium, method of detecting bacterium and kit for detecting bacterium |
-
1999
- 1999-09-29 JP JP27605399A patent/JP2001095579A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2857375A1 (fr) * | 2003-07-10 | 2005-01-14 | Biomerieux Sa | Procede de detection et/ou d'identification de bacteries de genre staphylococcus |
| EP1644526B1 (fr) * | 2003-07-10 | 2008-05-07 | Biomerieux | Procede de detection et/ou d identification de bacteries de genre staphylococcus |
| US7659059B2 (en) | 2003-07-10 | 2010-02-09 | Biomerieux | Method for detecting and/or identifying bacteria of the genus Staphylococcus |
| EP1788093A1 (en) * | 2004-08-04 | 2007-05-23 | Suntory Limited | Instrument for detecting bacterium, method of detecting bacterium and kit for detecting bacterium |
| EP1788093B1 (en) * | 2004-08-04 | 2013-05-15 | Suntory Holdings Limited | Instrument for detecting bacterium, method of detecting bacterium and kit for detecting bacterium |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060317 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081209 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090407 |