JP2001520053A - 粘着集落性種およびハイフォミクロビウム種核酸 - Google Patents
粘着集落性種およびハイフォミクロビウム種核酸Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、２つの新規の粘着集落性菌株ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔを提供する。本発明は、配列番号：１の核酸から成る単離核酸を提供する。ｍｚ１ｔの核酸の例としては、配列番号：２および配列番号：３が挙げられる。ｍｚ２ｔの核酸の例は、配列番号：４である。本発明は、配列番号：５の核酸から成る単離核酸も提供する。廃水試料中の粘着集落クラスターの存在の検出方法であって、以下の：ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で廃水の試料からのＲＮＡを配列番号：１、２、３、４または５の核酸を包含する核酸と接触させ、そしてｂ）粘着集落クラスターの存在を示すハイブリダイゼーションの存在を検出する工程から成る方法が提供される。Ｍ３と呼ばれる新しいハイフォミクロビウム種菌株が、本明細書で提供される。本発明は、ハイフォミクロビウム種Ｍ３の新規の核酸を提供する。例えば、配列番号：６および配列番号：７（Ｍ３のｒＤＮＡ）、配列番号：８、９、１０、１１、１２、１３および１４は、推定ハイフォミクロビウム種配列である。配列番号：１５は、６ｍ３および３ｍ３（スラッジから単離されたハイフォミクロビウム種ｍ３）からのコンセンサス配列である。配列番号：１７の核酸を包含する核酸を用いた、前記のような廃水試料中のハイフォミクロビウム種の存在の検出方法も提供される。配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４および配列番号：１５の核酸も、ハイフォミクロビウム種の検出方法において、全体でまたは断片として利用され得る。
Description
【０００１】 ［発明の属する技術分野］ 本発明は、廃水処理プラントでのスラッジ問題に関連した細菌株の検出方法に
関する。特に、本発明は、廃水処理プラントでのスラッジ問題に関連した新規の
細菌株の同定に関する。特に本発明は、スラッジ問題に関連した細菌株の検出に
用いるための核酸プローブに関する。
関する。特に、本発明は、廃水処理プラントでのスラッジ問題に関連した新規の
細菌株の同定に関する。特に本発明は、スラッジ問題に関連した細菌株の検出に
用いるための核酸プローブに関する。
【０００２】 ［従来の技術］ 廃水処理プラントでのスラッジの２つの重要な望ましい特性は、脱水性および
圧縮性である。産業廃水処理施設での顕微鏡観察は、粘着集落クラスターの存在
がスラッジ脱水性不良のエピソードと相関し、そしてハイフォミクロビウム種の
存在はスラッジ圧縮性不良と関連することが実証されている。
圧縮性である。産業廃水処理施設での顕微鏡観察は、粘着集落クラスターの存在
がスラッジ脱水性不良のエピソードと相関し、そしてハイフォミクロビウム種の
存在はスラッジ圧縮性不良と関連することが実証されている。
【０００３】 ３つの曝気槽のうちの１つにおいて内因性呼吸を増強するよう意図された植物
操作は、スラッジ収量の有意の低減を生じた（Bullard and Barber, 1994）。し
かしながら、スラッジ脱水性不良の周期的エピソードは、このスラッジ最小化戦
略の用途を限定した（Barber et al., 1995 ）。脱水能力の低減は非晶質粘着集
落クラスターの存在と相関するが、しかしこれらのクラスターは一般に良好なス
ラッジ特質の期間中により少ない数度で存在する、ということを顕微鏡は示して
いる。
操作は、スラッジ収量の有意の低減を生じた（Bullard and Barber, 1994）。し
かしながら、スラッジ脱水性不良の周期的エピソードは、このスラッジ最小化戦
略の用途を限定した（Barber et al., 1995 ）。脱水能力の低減は非晶質粘着集
落クラスターの存在と相関するが、しかしこれらのクラスターは一般に良好なス
ラッジ特質の期間中により少ない数度で存在する、ということを顕微鏡は示して
いる。
【０００４】 活性スラッジ中の粘着集落クラスターを形成する生物体の同定およびモニタリ
ングは、ズーグレア属を描写する示差的な形態学的または生理学的特徴の欠乏の
ために複雑にされる（Unz, 1984 ）。歴史的に、ズーグレア種としての種の同定
は、それらが廃水から単離され、フロックを形成されるという事実に主として基
づいていた（Crabtree and McCoy, 1967; Unz, 1971;Friedman and Dugan, 1968
）。示差的保存特徴の欠乏のため、顕微鏡観察が唯一の一般に利用可能なモニタ
リング法であった。
ングは、ズーグレア属を描写する示差的な形態学的または生理学的特徴の欠乏の
ために複雑にされる（Unz, 1984 ）。歴史的に、ズーグレア種としての種の同定
は、それらが廃水から単離され、フロックを形成されるという事実に主として基
づいていた（Crabtree and McCoy, 1967; Unz, 1971;Friedman and Dugan, 1968
）。示差的保存特徴の欠乏のため、顕微鏡観察が唯一の一般に利用可能なモニタ
リング法であった。
【０００５】 小リボソームサブユニットに見出されるＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）の配列を
基礎にした微生物の分類および同定のための分子ベースの方法における新規の開
発は、複雑な微生物コミュニティーのより完全な且つ限定的な分析を可能にした
。しかしながら、この技法は、スラッジ微生物コミュニティーの分析に十分に利
用されたわけではなかった。
基礎にした微生物の分類および同定のための分子ベースの方法における新規の開
発は、複雑な微生物コミュニティーのより完全な且つ限定的な分析を可能にした
。しかしながら、この技法は、スラッジ微生物コミュニティーの分析に十分に利
用されたわけではなかった。
【０００６】 ズーグレア種として過去に分類された株の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列分析は、これ
らの生物体が密接に関連しているわけではないことを示した（Shin et al., 199
3 ）。Z. ramigera ＡＴＣＣ１９６２３はプロテオバクテリアのαサブクラス中
に存在し、プロテオバクテリア、Z.ramigeraＡＴＣＣ１９５４４およびZ. ramig
era ２５９３５はβサブクラスの成員である。３つの主な種類の菌株（ズーグレ
ア種ＡＴＣＣ１９６２３、１９５４４および２５９３５）のために開発された１
６Ｓ ｒＲＮＡプローブによる活性スラッジのプロービングは、Z. ramigera Ａ
ＴＣＣ１９５４４だけが粘着集落クラスターとして一般に存在することを示唆し
た（Rossello-Mora et al., 1995; Wagner et al., 1995 ）。さらに別の種が粘
着集落形成および関連脱水問題に関与するか否かは、確定されていない。
らの生物体が密接に関連しているわけではないことを示した（Shin et al., 199
3 ）。Z. ramigera ＡＴＣＣ１９６２３はプロテオバクテリアのαサブクラス中
に存在し、プロテオバクテリア、Z.ramigeraＡＴＣＣ１９５４４およびZ. ramig
era ２５９３５はβサブクラスの成員である。３つの主な種類の菌株（ズーグレ
ア種ＡＴＣＣ１９６２３、１９５４４および２５９３５）のために開発された１
６Ｓ ｒＲＮＡプローブによる活性スラッジのプロービングは、Z. ramigera Ａ
ＴＣＣ１９５４４だけが粘着集落クラスターとして一般に存在することを示唆し
た（Rossello-Mora et al., 1995; Wagner et al., 1995 ）。さらに別の種が粘
着集落形成および関連脱水問題に関与するか否かは、確定されていない。
【０００７】 活性スラッジ中のグラム陰性糸状細菌のin-situ 検出のための蛍光プローブの
適用は、相対的に新しい（Bradford et al., 1997;Reyes et al., 1997; Wagner
et al., 1993; Wagner et al., 1994）。これらの研究者達はプロテオバクテリ
アのための種々のオリゴヌクレオチドプローブを開発したが、しかしハイフォミ
クロビウム種のための１６Ｓ ｒＤＮＡプローブは従来報告されていない。ハイ
フォミクロビウム種は、下水汚物処理プラントにおいて観察されており（Holm e
t al., 1996 ）、そして土壌、地下水、淡水の池および湖、海洋試料ならびに過
塩性湖中におけるそれらの存在も報告されている。従来の研究は、Hyphomicrobi
um vulgareが、しばしば培養容器の壁に付着する集塊で特徴的に生育する、とい
うことを示した。ハイフォミクロビウム様細菌は一般に自然の環境に存在し、脱
窒条件下でメタノールを利用する（Amaral et al., 1995 ）。ハイフォミクロビ
ウム種は、低栄養条件下では競合的である（Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology ）。
適用は、相対的に新しい（Bradford et al., 1997;Reyes et al., 1997; Wagner
et al., 1993; Wagner et al., 1994）。これらの研究者達はプロテオバクテリ
アのための種々のオリゴヌクレオチドプローブを開発したが、しかしハイフォミ
クロビウム種のための１６Ｓ ｒＤＮＡプローブは従来報告されていない。ハイ
フォミクロビウム種は、下水汚物処理プラントにおいて観察されており（Holm e
t al., 1996 ）、そして土壌、地下水、淡水の池および湖、海洋試料ならびに過
塩性湖中におけるそれらの存在も報告されている。従来の研究は、Hyphomicrobi
um vulgareが、しばしば培養容器の壁に付着する集塊で特徴的に生育する、とい
うことを示した。ハイフォミクロビウム様細菌は一般に自然の環境に存在し、脱
窒条件下でメタノールを利用する（Amaral et al., 1995 ）。ハイフォミクロビ
ウム種は、低栄養条件下では競合的である（Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology ）。
【０００８】 ［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、廃水処理プラントにおける粘着集落クラスターを包含する生物体の
同定およびそれらのルーチンモニタリングのための１６Ｓ ｒＲＮＡオリゴヌク
レオチドプローブを提供する。本発明は、ハイフォミクロビウム種のルーチンモ
ニタリングのための１６Ｓ ｒＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブも提供する。
同定およびそれらのルーチンモニタリングのための１６Ｓ ｒＲＮＡオリゴヌク
レオチドプローブを提供する。本発明は、ハイフォミクロビウム種のルーチンモ
ニタリングのための１６Ｓ ｒＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブも提供する。
【０００９】 ［課題を解決するための手段］ 本発明は、２つの新しい粘着集落性菌株ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔを提供する。
これらの菌株は、それらの新規の核酸および以下に記載するようなその他の特徴
により同定され得る。 本発明は、配列番号：１の核酸から成る単離核酸を提供する。この核酸は、主
として実施例に記載されているようなタウエラ属Thauera 、アゾアルクス属Azoa
rcus、ズーグレア属Zoogloeaおよびロドシクルス属Rhodocyclus の成員とハイブ
リダイズするプローブ（ロドRhodo プローブ）となり得る。
これらの菌株は、それらの新規の核酸および以下に記載するようなその他の特徴
により同定され得る。 本発明は、配列番号：１の核酸から成る単離核酸を提供する。この核酸は、主
として実施例に記載されているようなタウエラ属Thauera 、アゾアルクス属Azoa
rcus、ズーグレア属Zoogloeaおよびロドシクルス属Rhodocyclus の成員とハイブ
リダイズするプローブ（ロドRhodo プローブ）となり得る。
【００１０】 ｍｚ１ｔの核酸の例としては、配列番号：２および配列番号：３のそれぞれ５
‘−３’塩基５３０〜１１３０および９４０〜１４９２が挙げられる。ｍｚ２ｔ
の核酸の例は、配列番号：４の５‘−３’塩基１０８０〜１４９２である。本明
細書中に、そして当業界でルーチンに記載される配列比較法を用いて、これらの
核酸の多数の菌株特異的断片が得られる。
‘−３’塩基５３０〜１１３０および９４０〜１４９２が挙げられる。ｍｚ２ｔ
の核酸の例は、配列番号：４の５‘−３’塩基１０８０〜１４９２である。本明
細書中に、そして当業界でルーチンに記載される配列比較法を用いて、これらの
核酸の多数の菌株特異的断片が得られる。
【００１１】 本発明は、配列番号：５の核酸から成る単離核酸も提供する。このプローブ（
ＭＺ１プローブ）は、ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔの両菌株、ならびにアゾアルクス
種も標的にする。したがって、ＭＺ１プローブは、いくつかの廃水処理施設でス
ラッジ中に粘着集落クラスターを形成するタウエラ属の成員を標的にする。 以下の：ａ）廃水試料からのＲＮＡを配列番号：１の核酸を包含する核酸と接
触させ、そしてｂ）粘着集落クラスターの存在を示すハイブリダイゼーションの
存在を検出する工程から成る廃水試料中の粘着集落クラスターの存在の検出方法
が提供される。
ＭＺ１プローブ）は、ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔの両菌株、ならびにアゾアルクス
種も標的にする。したがって、ＭＺ１プローブは、いくつかの廃水処理施設でス
ラッジ中に粘着集落クラスターを形成するタウエラ属の成員を標的にする。 以下の：ａ）廃水試料からのＲＮＡを配列番号：１の核酸を包含する核酸と接
触させ、そしてｂ）粘着集落クラスターの存在を示すハイブリダイゼーションの
存在を検出する工程から成る廃水試料中の粘着集落クラスターの存在の検出方法
が提供される。
【００１２】 前記のような、しかし配列番号：２、３、４または５の核酸を包含する核酸を
用いる廃水試料中の粘着集落クラスターの存在の検出方法も、提供される。 Ｍ３株と呼ばれる新規のハイフォミクロビウム種が、本明細書では提供される
。これらの菌株は、それらの新規の核酸および以下でさらに説明されるようなそ
の他の特徴により同定され得る。
用いる廃水試料中の粘着集落クラスターの存在の検出方法も、提供される。 Ｍ３株と呼ばれる新規のハイフォミクロビウム種が、本明細書では提供される
。これらの菌株は、それらの新規の核酸および以下でさらに説明されるようなそ
の他の特徴により同定され得る。
【００１３】 本発明は、ハイフォミクロビウム種Ｍ３の新規の核酸を提供する。 例えば、配列番号：６および配列番号：７は、それぞれＭ３複製１（６Ｍ３）
および複製２（３Ｍ３）の５‘−３’塩基３０〜１４９０ ｒＤＮＡである。配
列番号：８、９、１０、１１、１２、１３および１４は、スラッジから得られる
推定上のハイフォミクロビウム種配列である（７つの部分配列−１０６０〜１４
９２）。配列番号：１５は、スラッジから単離されたハイフォミクロビウム種Ｍ
３である６Ｍ３および３Ｍ３からのコンセンサス配列である。
および複製２（３Ｍ３）の５‘−３’塩基３０〜１４９０ ｒＤＮＡである。配
列番号：８、９、１０、１１、１２、１３および１４は、スラッジから得られる
推定上のハイフォミクロビウム種配列である（７つの部分配列−１０６０〜１４
９２）。配列番号：１５は、スラッジから単離されたハイフォミクロビウム種Ｍ
３である６Ｍ３および３Ｍ３からのコンセンサス配列である。
【００１４】 廃水試料中のハイフォミクロビウム種の存在の検出方法が提供される。方法は
、ａ）特定のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、廃水の試料からの
ＤＮＡを配列番号：１６の核酸を包含する核酸と接触させ、そしてｂ）ハイフォ
ミクロビウム種の存在を示すハイブリダイゼーションの存在を検出する工程を包
含する。
、ａ）特定のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、廃水の試料からの
ＤＮＡを配列番号：１６の核酸を包含する核酸と接触させ、そしてｂ）ハイフォ
ミクロビウム種の存在を示すハイブリダイゼーションの存在を検出する工程を包
含する。
【００１５】 前記のような、しかし配列番号：１７の核酸を包含する核酸を用いた廃水試料
中のハイフォミクロビウム種の存在の検出方法も提供される。配列番号：６、配
列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、
配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４および配列番号：１５の核酸
も、ハイフォミクロビウム種の検出方法において、全体でまたは断片として利用
され得る。 本発明の詳細な説明 本発明は、２つの新しいズーグレア株ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔを提供する。こ
れらの菌株は、それらの新規の核酸および以下にさらに記載するようなその他の
特徴により同定され得る。
中のハイフォミクロビウム種の存在の検出方法も提供される。配列番号：６、配
列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、
配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４および配列番号：１５の核酸
も、ハイフォミクロビウム種の検出方法において、全体でまたは断片として利用
され得る。 本発明の詳細な説明 本発明は、２つの新しいズーグレア株ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔを提供する。こ
れらの菌株は、それらの新規の核酸および以下にさらに記載するようなその他の
特徴により同定され得る。
【００１６】 「粘着集落」という用語は、生物スラッジ中の細胞のクラスター中に見出され
る生物体を示し、クラスターそれ自体が「粘着集落」と呼ばれる。クラスターを
形成する生物体の分類学的同一性が不明である場合、生物体は「粘着集落性菌株
」と呼ばれる。 廃水処理の分野の従業者はしばしば、個々の細胞がはっきり目に見えるように
、多糖により散在されるクラスターとして増殖する生物体の群を説明するために
「粘着集落」という用語を用いる。これらのクラスターを形成する生物体がズー
グレア属の成員であるか否かは、大部分は不明であるが、しかし他の研究者達に
よって開発されたZ. ramigera ＡＴＣＣ１９５４４標的化プローブ（ＺＲＡ）を
用いたプロービングは、いくつかのクラスターがこの生物体により形成されるこ
とを示す。本発明の結果は、少なくとも１つの廃水処理施設の活性スラッジ中で
観察されるクラスターがこのプローブにより陽性をプローブしないがしかし、２
つの新規の粘着集落菌株が同定された（ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔ）、ということ
を実証する。菌株ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔは、実施例にさらに記載されるような
タウレア属の既知の成員と最も親密に関連する。 粘着集落菌株核酸 本発明は、配列番号：１の核酸から成る単離核酸を提供する。この核酸は、主
として実施例に記載されているようなタウエラ属Thauera 、アゾアルクス属Azoa
rcus、ズーグレア属Zoogloeaおよびロドシクルス属Rhodocyclus の成員とハイブ
リダイズするプローブ（ロドプローブ）であり得る。ロドプローブは、Z. ramig
era ＡＴＣＣ １９５４４、ならびに２つの新規の粘着集落性菌株ｍｚ１ｔおよ
びｍｚ２ｔをともに標的にする。したがって、それは、粘着集落を群別するため
のプローブとして用いられ得る。
る生物体を示し、クラスターそれ自体が「粘着集落」と呼ばれる。クラスターを
形成する生物体の分類学的同一性が不明である場合、生物体は「粘着集落性菌株
」と呼ばれる。 廃水処理の分野の従業者はしばしば、個々の細胞がはっきり目に見えるように
、多糖により散在されるクラスターとして増殖する生物体の群を説明するために
「粘着集落」という用語を用いる。これらのクラスターを形成する生物体がズー
グレア属の成員であるか否かは、大部分は不明であるが、しかし他の研究者達に
よって開発されたZ. ramigera ＡＴＣＣ１９５４４標的化プローブ（ＺＲＡ）を
用いたプロービングは、いくつかのクラスターがこの生物体により形成されるこ
とを示す。本発明の結果は、少なくとも１つの廃水処理施設の活性スラッジ中で
観察されるクラスターがこのプローブにより陽性をプローブしないがしかし、２
つの新規の粘着集落菌株が同定された（ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔ）、ということ
を実証する。菌株ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔは、実施例にさらに記載されるような
タウレア属の既知の成員と最も親密に関連する。 粘着集落菌株核酸 本発明は、配列番号：１の核酸から成る単離核酸を提供する。この核酸は、主
として実施例に記載されているようなタウエラ属Thauera 、アゾアルクス属Azoa
rcus、ズーグレア属Zoogloeaおよびロドシクルス属Rhodocyclus の成員とハイブ
リダイズするプローブ（ロドプローブ）であり得る。ロドプローブは、Z. ramig
era ＡＴＣＣ １９５４４、ならびに２つの新規の粘着集落性菌株ｍｚ１ｔおよ
びｍｚ２ｔをともに標的にする。したがって、それは、粘着集落を群別するため
のプローブとして用いられ得る。
【００１７】 配列番号：１の核酸を包含する単離核酸も、本発明の範囲内である。ヌクレオ
チドは、配列番号：１の５‘または３’末端に付加され、その結果生じる核酸は
、ロドプローブがハイブリダイズする生物体の少なくとも１つの群を検出するそ
の能力に関して試験される。ロドプローブは、ＭＺ１より広範囲の生物体を標的
する（下記）。特異性はプローブと標的化核酸との間の誤対合数、ならびに温度
およびホルムアミド濃度のいずれもの影響を受けるので、とロドプローブへの塩
基の付加は、付加塩基が保存されるかまたは発散されるか否か、あるいはハイブ
リダイゼーションホルムアミド濃度または温度が増大されるか低減されるかによ
って、その特異性を増大し、それにより、いくつかの標的菌株を排除するかまた
は非標的株を含むと予測される。
チドは、配列番号：１の５‘または３’末端に付加され、その結果生じる核酸は
、ロドプローブがハイブリダイズする生物体の少なくとも１つの群を検出するそ
の能力に関して試験される。ロドプローブは、ＭＺ１より広範囲の生物体を標的
する（下記）。特異性はプローブと標的化核酸との間の誤対合数、ならびに温度
およびホルムアミド濃度のいずれもの影響を受けるので、とロドプローブへの塩
基の付加は、付加塩基が保存されるかまたは発散されるか否か、あるいはハイブ
リダイゼーションホルムアミド濃度または温度が増大されるか低減されるかによ
って、その特異性を増大し、それにより、いくつかの標的菌株を排除するかまた
は非標的株を含むと予測される。
【００１８】 本発明は、ｍｚ１ｔの新規の核酸を提供する。したがって、本発明は、ｍｚ１
ｔと呼ばれる細菌株に特異的な核酸、またはそれと相補的な核酸を提供する。こ
れらの核酸はｍｚ１ｔタンパク質をコードし得るし、あるいはそれらはｒＤＮＡ
またはｒＲＮＡ（例えば１６Ｓ ｒＲＮＡ）であり得るし、あるいはそれらはｍ
ｚ１ｔまたはｍｚ２ｔの核酸と相補的であり得る（例えばプローブまたはプライ
マー）。本発明は、ｍｚ１ｔに特異的な核酸と特異的にハイブリダイズするその
他の非相補的核酸も提供する。ｍｚ１ｔ特異的核酸の核酸のｍｚ１ｔ特異的領域
の核酸と特異的にハイブリダイズする核酸も提供される。
ｔと呼ばれる細菌株に特異的な核酸、またはそれと相補的な核酸を提供する。こ
れらの核酸はｍｚ１ｔタンパク質をコードし得るし、あるいはそれらはｒＤＮＡ
またはｒＲＮＡ（例えば１６Ｓ ｒＲＮＡ）であり得るし、あるいはそれらはｍ
ｚ１ｔまたはｍｚ２ｔの核酸と相補的であり得る（例えばプローブまたはプライ
マー）。本発明は、ｍｚ１ｔに特異的な核酸と特異的にハイブリダイズするその
他の非相補的核酸も提供する。ｍｚ１ｔ特異的核酸の核酸のｍｚ１ｔ特異的領域
の核酸と特異的にハイブリダイズする核酸も提供される。
【００１９】 ｍｚ１ｔの核酸の例としては、配列番号：２および配列番号：３、それぞれ５
‘−３’塩基５３０〜１１３０および９４０〜１４９２が挙げられる。これらの
核酸の多数の菌株特異的断片は、本明細書中に及び当業界でルーチンに記載され
る配列比較法を用いて得られる。 本発明は、ｍｚ２ｔの新規の核酸を提供する。したがって、本発明は、ｍｚ２
ｔと呼ばれる細菌株に特異的な核酸、またはそれと相補的な核酸を提供する。こ
れらの核酸はｍｚ２ｔタンパク質をコードし得るし、あるいはそれらはｒＤＮＡ
またはｒＲＮＡ（例えば１６Ｓ ｒＲＮＡ）であり得るし、あるいはそれらはｍ
ｚ１ｔまたはｍｚ２ｔの核酸と相補的であり得る（例えばプローブまたはプライ
マー）。本発明は、ｍｚ２ｔに特異的な核酸と特異的にハイブリダイズするその
他の非相補的核酸も提供する。ｍｚ２ｔ特異的核酸の核酸のｍｚ２ｔ特異的領域
の核酸と特異的にハイブリダイズする核酸も提供される。ｍｚ２ｔの核酸の例は
、配列番号：４、５‘−３’塩基１０８０〜１４９２である。これらの核酸の多
数の菌株特異的断片は、本明細書中に及び当業界でルーチンに記載される配列比
較法を用いて得られる。
‘−３’塩基５３０〜１１３０および９４０〜１４９２が挙げられる。これらの
核酸の多数の菌株特異的断片は、本明細書中に及び当業界でルーチンに記載され
る配列比較法を用いて得られる。 本発明は、ｍｚ２ｔの新規の核酸を提供する。したがって、本発明は、ｍｚ２
ｔと呼ばれる細菌株に特異的な核酸、またはそれと相補的な核酸を提供する。こ
れらの核酸はｍｚ２ｔタンパク質をコードし得るし、あるいはそれらはｒＤＮＡ
またはｒＲＮＡ（例えば１６Ｓ ｒＲＮＡ）であり得るし、あるいはそれらはｍ
ｚ１ｔまたはｍｚ２ｔの核酸と相補的であり得る（例えばプローブまたはプライ
マー）。本発明は、ｍｚ２ｔに特異的な核酸と特異的にハイブリダイズするその
他の非相補的核酸も提供する。ｍｚ２ｔ特異的核酸の核酸のｍｚ２ｔ特異的領域
の核酸と特異的にハイブリダイズする核酸も提供される。ｍｚ２ｔの核酸の例は
、配列番号：４、５‘−３’塩基１０８０〜１４９２である。これらの核酸の多
数の菌株特異的断片は、本明細書中に及び当業界でルーチンに記載される配列比
較法を用いて得られる。
【００２０】 本発明は、配列番号：５の核酸から成る単離核酸も提供する。このプローブ（
ＭＺ１プローブ）も、菌株ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔならびにアゾアルクス種のい
ずれもを標的にする。したがって、ＭＺ１プローブは、いくつかの廃水処理施設
でスラッジ中に粘着集落クラスターを形成するタウレア属の成員を標的にする。 配列番号：５の核酸を包含する単離核酸も本発明の範囲内である。ヌクレオチ
ドは、配列番号：５の５‘または３’末端に付加され、その結果生じる核酸は、
ＭＺ１プローブがハイブリダイズする生物体の少なくとも１つの群を検出するそ
の能力に関して試験される。ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔの両方を検出するのが望ま
しい場合、ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔ ｒＲＮＡ配列がプローブとして用いられる
配列内から外れない限りは、塩基が付加され得る（１５００塩基まで）。外れる
点で、プローブはｍｚ１ｔまたはｍｚ２ｔに対してより特異的になる。
ＭＺ１プローブ）も、菌株ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔならびにアゾアルクス種のい
ずれもを標的にする。したがって、ＭＺ１プローブは、いくつかの廃水処理施設
でスラッジ中に粘着集落クラスターを形成するタウレア属の成員を標的にする。 配列番号：５の核酸を包含する単離核酸も本発明の範囲内である。ヌクレオチ
ドは、配列番号：５の５‘または３’末端に付加され、その結果生じる核酸は、
ＭＺ１プローブがハイブリダイズする生物体の少なくとも１つの群を検出するそ
の能力に関して試験される。ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔの両方を検出するのが望ま
しい場合、ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔ ｒＲＮＡ配列がプローブとして用いられる
配列内から外れない限りは、塩基が付加され得る（１５００塩基まで）。外れる
点で、プローブはｍｚ１ｔまたはｍｚ２ｔに対してより特異的になる。
【００２１】 実施例は、本発明のプローブが相補的である属に関して標的範囲をより明瞭に
限定する。Zoogloea ramigera として過去に分類された３つの主な種類の菌株の
１６Ｓ ｒＲＮＡ配列に関する他の研究者により成された調査は、これらの種が
密接に関連していないことを示した。これらのうちの１つ（Z. ramigera ＡＴＣ
Ｃ１９５４４）だけが、その種類の菌株としてズーグレア属に留まると予測され
る。他の２つの菌株は、未だ確定されていない属としてその他に移されることが
予測される。
限定する。Zoogloea ramigera として過去に分類された３つの主な種類の菌株の
１６Ｓ ｒＲＮＡ配列に関する他の研究者により成された調査は、これらの種が
密接に関連していないことを示した。これらのうちの１つ（Z. ramigera ＡＴＣ
Ｃ１９５４４）だけが、その種類の菌株としてズーグレア属に留まると予測され
る。他の２つの菌株は、未だ確定されていない属としてその他に移されることが
予測される。
【００２２】 本発明の粘着集落核酸プローブは、コード鎖またはその相補鎖のヌクレオチド
配列、あるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を包含する核
酸であり得る。したがって、本発明のプローブはＤＮＡまたはＲＮＡであり得る
し、生物試料中のＤＮＡまたはＲＮＡを結合し得る。プローブのヌクレオチド配
列は、種々のハイブリダイゼーション条件下で生物試料中の標的核酸（単数また
は複数）とのプローブのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分なスラッ
ジ試料中の核酸配列との相補性を有する任意の配列であり得る。理想的には、プ
ローブは試料中の当該核酸標的（単数または複数）とのみハイブリダイズし、試
料中の非標的核酸とは非特異的にはハイブリダイズしない。ハイブリダイゼーシ
ョン条件は、特定のハイブリダイゼーションプロトコールにおいて望ましい緊縮
程度（例えば、in-situ 溶液ハイブリダイゼーション、ブロット等）によって、
変わり得る。例えば、ハイブリダイゼーション条件が、高温および低塩条件を用
いる高緊縮に対してである場合、プローブはそれが非常に高度の相補性を有する
試料中の核酸配列とだけ結合する。低温および高塩を用いる低緊縮ハイブリダイ
ゼーション条件は、多少の相補性を有するがしかし高緊縮性で生じるためのハイ
ブリダイゼーションに必要とされるのと同様に高度にプローブ配列と相補的であ
るわけではない試料中の核酸配列とのプローブのハイブリダイゼーションを可能
にする。ハイブリダイゼーション条件は、生物試料、プローブの種類および標的
（単数または複数）によって変わる。本発明の核酸の特定の適用のためのハイブ
リダイゼーション条件の最適化方法を、当業者は知っている。ハイブリダイゼー
ション条件の例は、本明細書中に提示される実施例に記載されている。
配列、あるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を包含する核
酸であり得る。したがって、本発明のプローブはＤＮＡまたはＲＮＡであり得る
し、生物試料中のＤＮＡまたはＲＮＡを結合し得る。プローブのヌクレオチド配
列は、種々のハイブリダイゼーション条件下で生物試料中の標的核酸（単数また
は複数）とのプローブのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分なスラッ
ジ試料中の核酸配列との相補性を有する任意の配列であり得る。理想的には、プ
ローブは試料中の当該核酸標的（単数または複数）とのみハイブリダイズし、試
料中の非標的核酸とは非特異的にはハイブリダイズしない。ハイブリダイゼーシ
ョン条件は、特定のハイブリダイゼーションプロトコールにおいて望ましい緊縮
程度（例えば、in-situ 溶液ハイブリダイゼーション、ブロット等）によって、
変わり得る。例えば、ハイブリダイゼーション条件が、高温および低塩条件を用
いる高緊縮に対してである場合、プローブはそれが非常に高度の相補性を有する
試料中の核酸配列とだけ結合する。低温および高塩を用いる低緊縮ハイブリダイ
ゼーション条件は、多少の相補性を有するがしかし高緊縮性で生じるためのハイ
ブリダイゼーションに必要とされるのと同様に高度にプローブ配列と相補的であ
るわけではない試料中の核酸配列とのプローブのハイブリダイゼーションを可能
にする。ハイブリダイゼーション条件は、生物試料、プローブの種類および標的
（単数または複数）によって変わる。本発明の核酸の特定の適用のためのハイブ
リダイゼーション条件の最適化方法を、当業者は知っている。ハイブリダイゼー
ション条件の例は、本明細書中に提示される実施例に記載されている。
【００２３】 プローブは、所望の特異性を達成するよう設計されている。プローブ標的に隣
接する領域が保存領域である場合、塩基の付加はプローブ特異性を低減する傾向
があり、即ち、識別を付与する塩基の割合は低減される。識別を成し遂げること
はできる一方、より大きい割合の識別を提供しない塩基で選択性を達成すること
は難しくなる。さらに、in-situ ハイブリダイゼーション実験では、長さが増大
した場合、プローブは透過性化細胞にあまり入りそうにない。隣接領域が非常に
可変性である場合には、プローブ長の増大はそれをより特異的にする。この場合
、プローブの「群別化機能」は危うくされ、そしていくつかの所望の標的配列は
ハイブリダイズし得ない。好ましい場合には、本発明に開示されたオリゴヌクレ
オチドを包含する核酸は長さが約１６〜２２ヌクレオチドの範囲であることが予
測される。
接する領域が保存領域である場合、塩基の付加はプローブ特異性を低減する傾向
があり、即ち、識別を付与する塩基の割合は低減される。識別を成し遂げること
はできる一方、より大きい割合の識別を提供しない塩基で選択性を達成すること
は難しくなる。さらに、in-situ ハイブリダイゼーション実験では、長さが増大
した場合、プローブは透過性化細胞にあまり入りそうにない。隣接領域が非常に
可変性である場合には、プローブ長の増大はそれをより特異的にする。この場合
、プローブの「群別化機能」は危うくされ、そしていくつかの所望の標的配列は
ハイブリダイズし得ない。好ましい場合には、本発明に開示されたオリゴヌクレ
オチドを包含する核酸は長さが約１６〜２２ヌクレオチドの範囲であることが予
測される。
【００２４】 標的配列は、ＤＮＡシーケンシングにより天然細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡにおい
て同定される配列である。生物体間の関係は、それらの類似性をともに基礎にし
た標的配列の群別化により確定される。オリゴヌクレオチドプローブ配列は、標
的配列間の関係の分析を基礎にした推定配列である。オリゴヌクレオチドプロー
ブは、先ず単一または一群の標的配列中に見出される塩基対を補足し、次に合成
のために３‘−５’から５‘−３’に塩基の順序を逆にすることにより作製され
る。標的配列とオリゴヌクレオチドプローブとの関係を、表１に示す。ヌクレオ
チドプローブを設計する場合、関連細菌単離体の標的配列における同一ストレッ
チの知見はきわめて重要である。オリゴヌクレオチドプローブにおける単一塩基
の付加、控除または変化は、プローブにより検出される生物体の範囲を変えると
思われる。
て同定される配列である。生物体間の関係は、それらの類似性をともに基礎にし
た標的配列の群別化により確定される。オリゴヌクレオチドプローブ配列は、標
的配列間の関係の分析を基礎にした推定配列である。オリゴヌクレオチドプロー
ブは、先ず単一または一群の標的配列中に見出される塩基対を補足し、次に合成
のために３‘−５’から５‘−３’に塩基の順序を逆にすることにより作製され
る。標的配列とオリゴヌクレオチドプローブとの関係を、表１に示す。ヌクレオ
チドプローブを設計する場合、関連細菌単離体の標的配列における同一ストレッ
チの知見はきわめて重要である。オリゴヌクレオチドプローブにおける単一塩基
の付加、控除または変化は、プローブにより検出される生物体の範囲を変えると
思われる。
【００２５】
【表１】
【００２６】 本発明は、本明細書中に記載したハイブリダイゼーション条件下で、配列番号
：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４または配列番号：５として記
載される配列と選択的にまたは特異的にハイブリダイズする単離核酸を提供する
。例えば、ハイブリダイズする核酸は、１つ又はそれ以上の例示菌株のＲＮＡと
ハイブリダイズするプローブであり得る。ハイブリダイズする核酸は、既述の条
件下でハイブリダイゼーションを妨げない非現実的塩基置換も含み得る。
：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４または配列番号：５として記
載される配列と選択的にまたは特異的にハイブリダイズする単離核酸を提供する
。例えば、ハイブリダイズする核酸は、１つ又はそれ以上の例示菌株のＲＮＡと
ハイブリダイズするプローブであり得る。ハイブリダイズする核酸は、既述の条
件下でハイブリダイゼーションを妨げない非現実的塩基置換も含み得る。
【００２７】 核酸配列（オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、プローブ、プライマー等）
を説明するために本明細書中で用いる場合、「特異的」とは、核酸が任意の他の
供給源中では全く同じには見出されない核酸を意味する。特異性の確定は、コン
ピューター処理配列データベースの利用可能性のためにルーチンにされ、この場
合、ほとんどの任意の長さの核酸配列は、同一配列の存在に関して迅速且つ確実
に検査され得る。同一配列が見出されない場合、核酸は列挙源に対して「特異的
」である。核酸は、ｒＤＮＡ／ｒＲＮＡ特異的（即ち、任意の供給源からのｒＤ
ＮＡ／ｒＲＮＡに見出されるが、しかし他の遺伝子には見出されない）、属特異
的（例えば、ハイフォミクロビウム属の多数の種のｒＲＮＡ／ｒＤＮＡには見出
されるが、しかし任意のその他の属には見出されない）、種特異的（例えば、特
定のハイフォミクロビウム種のｒＲＮＡ／ｒＤＮＡには見出されるが、しかし任
意のその他の種では見出されない）、あるいは菌株特異的（即ち、特定の粘着集
落性菌株に見出されるが、しかし異なる粘着集落性菌株のｒＲＮＡまたはｒＤＮ
Ａには見出されない）であり得る。ｒＲＮＡ／ｒＤＮＡ配列が高度に保存される
場合、それはそうでなければ関連のない多数の供給源で見出され得る。
を説明するために本明細書中で用いる場合、「特異的」とは、核酸が任意の他の
供給源中では全く同じには見出されない核酸を意味する。特異性の確定は、コン
ピューター処理配列データベースの利用可能性のためにルーチンにされ、この場
合、ほとんどの任意の長さの核酸配列は、同一配列の存在に関して迅速且つ確実
に検査され得る。同一配列が見出されない場合、核酸は列挙源に対して「特異的
」である。核酸は、ｒＤＮＡ／ｒＲＮＡ特異的（即ち、任意の供給源からのｒＤ
ＮＡ／ｒＲＮＡに見出されるが、しかし他の遺伝子には見出されない）、属特異
的（例えば、ハイフォミクロビウム属の多数の種のｒＲＮＡ／ｒＤＮＡには見出
されるが、しかし任意のその他の属には見出されない）、種特異的（例えば、特
定のハイフォミクロビウム種のｒＲＮＡ／ｒＤＮＡには見出されるが、しかし任
意のその他の種では見出されない）、あるいは菌株特異的（即ち、特定の粘着集
落性菌株に見出されるが、しかし異なる粘着集落性菌株のｒＲＮＡまたはｒＤＮ
Ａには見出されない）であり得る。ｒＲＮＡ／ｒＤＮＡ配列が高度に保存される
場合、それはそうでなければ関連のない多数の供給源で見出され得る。
【００２８】 核酸を説明するために本明細書中で用いる場合、「選択的にハイブリダイズす
る」という用語は、時折無作為にハイブリダイズする核酸を除外し、そして背景
ハイブリダイゼーションとして当業界で認識されるものをさらに区別する。本明
細書中で用いる場合、「特異的」ハイブリダイゼーションとは、核酸が参照核酸
とだけ高緊縮度でハイブリダイズすることを意味する。本発明のハイブリダイズ
する核酸は、それがハイブリダイズする配列のセグメントおよび鎖との少なくと
も９０％、９１％、９２％、９３％、９４％９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％および１００％相補性を有し得る。プローブとして用いられる核酸は、典
型的には、長さが１８、１９、２０、２１または２２ヌクレオチドである。しか
しながら、核酸がプライマーとしてまたはその他の目的のために用いられるか否
かによって、それはより長かったり、より短かったりし得る。典型的には、１６
Ｓ ｒＲＮＡプローブは、長いプローブは、それらが透過性化細胞に容易に入る
ことができないようにin-situ （全細胞）ハイブリダイゼーションには有効でな
いので、２０塩基の範囲で保持される。プライマーとして用いられる場合、本発
明は、所望の領域を増幅するために異なる領域と選択的にハイブリダイズする少
なくとも２つの核酸を含む組成物を提供する。プローブまたはプライマーの長さ
によって、それは、９０％相補性〜完全相補性の範囲であり得るし、緊縮条件下
でなおハイブリダイズする。例えば。粘着集落性菌株の存在を検出する目的のた
めには、ハイブリダイズする核酸（プローブまたはプライマー）とそれがハイブ
リダイズする配列（試料からのＤＮＡまたはＲＮＡ）との間の相補性度は、少な
くとも無関係細菌からの核酸とのハイブリダイゼーションを除外するのに十分で
あるべきである。本発明は、緊縮条件下で非選択的にハイブリダイズする核酸か
ら選択的にハイブリダイズする核酸を識別するのに必要な相補性度が各核酸に関
して明瞭に確定され得るように、これらの核酸の例を提供する。
る」という用語は、時折無作為にハイブリダイズする核酸を除外し、そして背景
ハイブリダイゼーションとして当業界で認識されるものをさらに区別する。本明
細書中で用いる場合、「特異的」ハイブリダイゼーションとは、核酸が参照核酸
とだけ高緊縮度でハイブリダイズすることを意味する。本発明のハイブリダイズ
する核酸は、それがハイブリダイズする配列のセグメントおよび鎖との少なくと
も９０％、９１％、９２％、９３％、９４％９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％および１００％相補性を有し得る。プローブとして用いられる核酸は、典
型的には、長さが１８、１９、２０、２１または２２ヌクレオチドである。しか
しながら、核酸がプライマーとしてまたはその他の目的のために用いられるか否
かによって、それはより長かったり、より短かったりし得る。典型的には、１６
Ｓ ｒＲＮＡプローブは、長いプローブは、それらが透過性化細胞に容易に入る
ことができないようにin-situ （全細胞）ハイブリダイゼーションには有効でな
いので、２０塩基の範囲で保持される。プライマーとして用いられる場合、本発
明は、所望の領域を増幅するために異なる領域と選択的にハイブリダイズする少
なくとも２つの核酸を含む組成物を提供する。プローブまたはプライマーの長さ
によって、それは、９０％相補性〜完全相補性の範囲であり得るし、緊縮条件下
でなおハイブリダイズする。例えば。粘着集落性菌株の存在を検出する目的のた
めには、ハイブリダイズする核酸（プローブまたはプライマー）とそれがハイブ
リダイズする配列（試料からのＤＮＡまたはＲＮＡ）との間の相補性度は、少な
くとも無関係細菌からの核酸とのハイブリダイゼーションを除外するのに十分で
あるべきである。本発明は、緊縮条件下で非選択的にハイブリダイズする核酸か
ら選択的にハイブリダイズする核酸を識別するのに必要な相補性度が各核酸に関
して明瞭に確定され得るように、これらの核酸の例を提供する。
【００２９】 「緊縮条件」とは、ハイブリダイゼーションプロトコールに用いられる洗浄条
件を指す。特定レベルの緊縮度を得るのに必要な温度および塩条件は、フィルタ
ー上で固定化された参照ＲＮＡの試料またはガラススライド上に固定化された透
過性化全細胞が当該プローブとハイブリダイズされ、次に異なる緊縮度の条件下
で洗浄される実験で経験的に容易に確定される。緊縮条件の例を以下に説明する
。 粘着集落性菌株の検出 プラントの始動中の不十分なスラッジ圧縮および脱水には、そして粘性塊形成
のエピソードには、粘着集落クラスターが伴う。しかしながら、それらは選別機
を用いる処理系でも一般に観察され、必ずしもスラッジ特質問題と関係があると
いうわけではない。異なる廃水処理プラントにおける比較プロービングは、いく
つかの粘着集落性菌株が他のものより問題となる傾向がある、ということを示す
ことはあるかもしれない。改良型モニタリング法は、活性スラッジ法性能問題の
より特異的診断をもたらし得るし、そして工程制御戦略におけるさらなる柔軟性
を可能にし得る。
件を指す。特定レベルの緊縮度を得るのに必要な温度および塩条件は、フィルタ
ー上で固定化された参照ＲＮＡの試料またはガラススライド上に固定化された透
過性化全細胞が当該プローブとハイブリダイズされ、次に異なる緊縮度の条件下
で洗浄される実験で経験的に容易に確定される。緊縮条件の例を以下に説明する
。 粘着集落性菌株の検出 プラントの始動中の不十分なスラッジ圧縮および脱水には、そして粘性塊形成
のエピソードには、粘着集落クラスターが伴う。しかしながら、それらは選別機
を用いる処理系でも一般に観察され、必ずしもスラッジ特質問題と関係があると
いうわけではない。異なる廃水処理プラントにおける比較プロービングは、いく
つかの粘着集落性菌株が他のものより問題となる傾向がある、ということを示す
ことはあるかもしれない。改良型モニタリング法は、活性スラッジ法性能問題の
より特異的診断をもたらし得るし、そして工程制御戦略におけるさらなる柔軟性
を可能にし得る。
【００３０】 以下の：ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、廃水の試
料からのＲＮＡを、配列番号：１の核酸を包含する核酸と接触させ、そしてｂ）
粘着集落クラスターの存在を示すハイブリダイゼーションの存在を検出する工程
から成る廃水試料中の粘着集落クラスターの存在の検出方法が提供される。 前記のような、しかし配列番号：５の核酸を包含する核酸を用いる、廃水試料
中の粘着集落クラスターの存在の検出方法も提供される。
料からのＲＮＡを、配列番号：１の核酸を包含する核酸と接触させ、そしてｂ）
粘着集落クラスターの存在を示すハイブリダイゼーションの存在を検出する工程
から成る廃水試料中の粘着集落クラスターの存在の検出方法が提供される。 前記のような、しかし配列番号：５の核酸を包含する核酸を用いる、廃水試料
中の粘着集落クラスターの存在の検出方法も提供される。
【００３１】 配列番号：５の標的特異性のために、廃水試料中のタウエラ種単離物ｍｚ１ｔ
またはｍｚ２ｔの存在の検出方法が提供される。その方法は、以下の：ａ）特異
的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、廃水の試料からのＲＮＡを、
配列番号：５の核酸を包含する核酸と接触させ、そしてｂ）タウエラ種単離物ｍ
ｚ１ｔまたはｍｚ２ｔの存在を示すハイブリダイゼーションの存在を検出する工
程から成る。
またはｍｚ２ｔの存在の検出方法が提供される。その方法は、以下の：ａ）特異
的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、廃水の試料からのＲＮＡを、
配列番号：５の核酸を包含する核酸と接触させ、そしてｂ）タウエラ種単離物ｍ
ｚ１ｔまたはｍｚ２ｔの存在を示すハイブリダイゼーションの存在を検出する工
程から成る。
【００３２】 ロドプローブを用いて検出されるある種の細菌がスラッジ脱水問題と関連する
ために、スラッジ脱水問題と関連するスラッジ中の細菌の検出方法が提供される
。その方法は、以下の：ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下
で、細菌からのＤＮＡを、配列番号：１の核酸を包含する核酸と接触させ、そし
てｂ）スラッジ脱水問題に関連する細菌の存在を示すハイブリダイゼーションの
存在を検出する工程から成る。
ために、スラッジ脱水問題と関連するスラッジ中の細菌の検出方法が提供される
。その方法は、以下の：ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下
で、細菌からのＤＮＡを、配列番号：１の核酸を包含する核酸と接触させ、そし
てｂ）スラッジ脱水問題に関連する細菌の存在を示すハイブリダイゼーションの
存在を検出する工程から成る。
【００３３】 ＭＺ１プローブにより検出されるある種の細菌はスラッジ脱水問題と関連があ
るため、前記のような、しかし配列番号：５の核酸を包含する核酸を用いるスラ
ッジ脱水問題と関連があるスラッジ中の細菌の検出方法も提供される。 本発明は、以下の：ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で
、細菌からのＤＮＡを、配列番号：１の核酸および配列番号：５の核酸と接触さ
せ、そしてｂ）スラッジ脱水問題に関連する細菌の存在を示すハイブリダイゼー
ションの存在を検出する工程から成る、スラッジ脱水問題に関連したスラッジ中
の細菌の検出方法も提供する。
るため、前記のような、しかし配列番号：５の核酸を包含する核酸を用いるスラ
ッジ脱水問題と関連があるスラッジ中の細菌の検出方法も提供される。 本発明は、以下の：ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で
、細菌からのＤＮＡを、配列番号：１の核酸および配列番号：５の核酸と接触さ
せ、そしてｂ）スラッジ脱水問題に関連する細菌の存在を示すハイブリダイゼー
ションの存在を検出する工程から成る、スラッジ脱水問題に関連したスラッジ中
の細菌の検出方法も提供する。
【００３４】 前記の方法は、配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４の核酸を用い
て、スラッジ脱水問題に関連した粘着集落性細菌およびその他のある種の細菌の
存在を検出し得る。 本明細書中に記載した蛍光プロービングおよびドットブロットハイブリダイゼ
ーションのために用いられ得る条件は、実施例に記載されている。ロドおよびＭ
Ｚ１プローブの両方に関するプローブと標的間の単一誤対合識別のための実験的
に確定されるホルムアミド濃度は、４０％である。特異的ハイブリダイゼーショ
ン溶液中の塩濃度によって、これには多少の変動性が存在し得る。実施例に示し
たように、最高緊縮度でハイブリダイゼーションを実行するのが常に望ましいわ
けではない。それは、主要目標が何であるかによる。例えば、いくつかの場合に
は、シグナル強度が特異性より重要である。特に、未だ同定されていない小（１
塩基）配列差を有するタウエラ種が存在し得る。一般的に、緊縮度の問題は、シ
グナル強度の論議に関する。これはより一般的論点である。一誤対合識別を成し
遂げるのに必要な緊縮は、標的菌株に対するシグナルをより弱くさせ得る。強力
で容易に検出可能なシグナルを有することがしばしば望ましく、特異性のわずか
な損失は問題でない。
て、スラッジ脱水問題に関連した粘着集落性細菌およびその他のある種の細菌の
存在を検出し得る。 本明細書中に記載した蛍光プロービングおよびドットブロットハイブリダイゼ
ーションのために用いられ得る条件は、実施例に記載されている。ロドおよびＭ
Ｚ１プローブの両方に関するプローブと標的間の単一誤対合識別のための実験的
に確定されるホルムアミド濃度は、４０％である。特異的ハイブリダイゼーショ
ン溶液中の塩濃度によって、これには多少の変動性が存在し得る。実施例に示し
たように、最高緊縮度でハイブリダイゼーションを実行するのが常に望ましいわ
けではない。それは、主要目標が何であるかによる。例えば、いくつかの場合に
は、シグナル強度が特異性より重要である。特に、未だ同定されていない小（１
塩基）配列差を有するタウエラ種が存在し得る。一般的に、緊縮度の問題は、シ
グナル強度の論議に関する。これはより一般的論点である。一誤対合識別を成し
遂げるのに必要な緊縮は、標的菌株に対するシグナルをより弱くさせ得る。強力
で容易に検出可能なシグナルを有することがしばしば望ましく、特異性のわずか
な損失は問題でない。
【００３５】 ドットブロットハイブリダイゼーションは、実施例で参照される標準プロトコ
ールの後に続く。単一誤対合識別に関して確定される温度条件は、およそ６０〜
６５℃である。in-situ （全細胞）ハイブリダイゼーションにおける特異性の主
要制御因子はホルムアミド濃度であるが、一方ドットブロットハイブリダイゼー
ションにおける制御因子は温度である。
ールの後に続く。単一誤対合識別に関して確定される温度条件は、およそ６０〜
６５℃である。in-situ （全細胞）ハイブリダイゼーションにおける特異性の主
要制御因子はホルムアミド濃度であるが、一方ドットブロットハイブリダイゼー
ションにおける制御因子は温度である。
【００３６】 粘着集落クラスターは脱水問題を引き起こし得るが、しかし常に問題を引き起
こすわけではない。問題がクラスターを形成する異なる種に関連があるか、クラ
スターの総量に関連があるか、または多糖合成の発現レベルに関連があるかは分
からない。粘着集落は、クラスター（非晶質形態）または指様突起を形成し得る
。どちらの場合も、識別特徴は、個々の細胞がゼラチン状マトリックス中で容易
に目に見えることである。典型的スラッジフロックでは、個々の細胞は見にくく
、マトリックスはより不透明である。両方の種類の粘着集落（非晶質および指様
）が、脱水問題を引き起こし得る。脱水問題は、流入廃水中の窒素またはリン不
足とも関連し得る。この場合、粘着集落クラスターまたは指様物は存在しないこ
とがある。 新規のハイフォミクロビウム種 Ｍ３と呼ばれる新しいハイフォミクロビウム種が、本明細書中で提供される。
これらの菌株は、以下でさらに説明するように、それらの新規の核酸およびその
他の特徴により同定され得る。 ハイフォミクロビウム種核酸 本発明は、ハイフォミクロビウム種Ｍ３の新規の核酸を提供する。Ｍ３と呼ば
れる細菌株に特異的な核酸またはそれと相補的な核酸も提供される。これらの核
酸はＭ３タンパク質をコードし得るか、またはそれらはｒＤＮＡまたはｒＲＮＡ
（例えば１６Ｓ ｒＲＮＡ）であり得るか、またはそれらはＭ３の核酸と相補的
であり得る（例えばプローブまたはプライマー）。Ｍ３特異的核酸のＭ３特異的
領域の核酸と特異的にハイブリダイズする核酸も提供される。
こすわけではない。問題がクラスターを形成する異なる種に関連があるか、クラ
スターの総量に関連があるか、または多糖合成の発現レベルに関連があるかは分
からない。粘着集落は、クラスター（非晶質形態）または指様突起を形成し得る
。どちらの場合も、識別特徴は、個々の細胞がゼラチン状マトリックス中で容易
に目に見えることである。典型的スラッジフロックでは、個々の細胞は見にくく
、マトリックスはより不透明である。両方の種類の粘着集落（非晶質および指様
）が、脱水問題を引き起こし得る。脱水問題は、流入廃水中の窒素またはリン不
足とも関連し得る。この場合、粘着集落クラスターまたは指様物は存在しないこ
とがある。 新規のハイフォミクロビウム種 Ｍ３と呼ばれる新しいハイフォミクロビウム種が、本明細書中で提供される。
これらの菌株は、以下でさらに説明するように、それらの新規の核酸およびその
他の特徴により同定され得る。 ハイフォミクロビウム種核酸 本発明は、ハイフォミクロビウム種Ｍ３の新規の核酸を提供する。Ｍ３と呼ば
れる細菌株に特異的な核酸またはそれと相補的な核酸も提供される。これらの核
酸はＭ３タンパク質をコードし得るか、またはそれらはｒＤＮＡまたはｒＲＮＡ
（例えば１６Ｓ ｒＲＮＡ）であり得るか、またはそれらはＭ３の核酸と相補的
であり得る（例えばプローブまたはプライマー）。Ｍ３特異的核酸のＭ３特異的
領域の核酸と特異的にハイブリダイズする核酸も提供される。
【００３７】 例えば、配列番号：６および配列番号：７は、それぞれＭ３複製１（６Ｍ３）
および複製２（３Ｍ３）の５‘−３’塩基３０〜１４９０ ｒＤＮＡである。配
列番号：８、９、１０、１１、１２、１３および１４は、スラッジから得られる
推定上のハイフォミクロビウム種配列である（７つの部分配列−１０６０〜１４
９２）。配列番号：１５は、スラッジから単離されたハイフォミクロビウム種Ｍ
３である６Ｍ３および３Ｍ３からのコンセンサス配列である。本発明は、Ｍ３に
対して特異的な核酸と特異的にハイブリダイズするその他の非相補的核酸も提供
する。
および複製２（３Ｍ３）の５‘−３’塩基３０〜１４９０ ｒＤＮＡである。配
列番号：８、９、１０、１１、１２、１３および１４は、スラッジから得られる
推定上のハイフォミクロビウム種配列である（７つの部分配列−１０６０〜１４
９２）。配列番号：１５は、スラッジから単離されたハイフォミクロビウム種Ｍ
３である６Ｍ３および３Ｍ３からのコンセンサス配列である。本発明は、Ｍ３に
対して特異的な核酸と特異的にハイブリダイズするその他の非相補的核酸も提供
する。
【００３８】 配列番号：１６の核酸から成る単離核酸も提供される。配列番号：１７の核酸
から成る単離核酸も提供される。これらの核酸は、縮重ハイフォミクロビウム種
プローブ−5'-GCTGC（C/G ）CATTGTCACCGCC-3'を提供する。これは、実際には２
つのプローブ：配列番号：１６−GCTGCCCATTGTCACCGCC ；および配列番号：１７
−GCTGCGCATTGTCACCGCC である。細菌試料は、標的器官が標的領域の１つ又はそ
れ以上の塩基位置で何らかの変動性を有する場合に、両プローブでプロービング
され得る。あるいは、塩基類似体がＣまたはＧの代わりに用いられて、この位置
での変動性の影響を最小限にし得る。別の代替的戦略は、同一効果を達成するた
めにあるプローブが用いられる場合に、緊縮度を下げることである。このプロー
ブは、Hyphomicrobium vulgaris およびH.菌株Ｈｙｐ３５３（Illinois１６Ｓ
ｒＲＮＡ活性スラッジデータベース）、処理プラントから単離されるハイフォミ
クロビウム種、および同一処理プラントでスラッジから抽出されるＤＮＡからの
１６Ｓ ｒＲＮＡの直接増幅により得られる１６Ｓ ｒＤＮＡ配列由来のハイフ
ォミクロビウム様ＲＮＡ配列を含むよう設計された。データベースハイフォミク
ロビウム種は、縮重位置に（Ｃ）のみを用いることによってより特異的に標的化
される。その他のある種のハイフォミクロビウム種単離物およびスラッジ配列は
、同一位置に（Ｇ）を用いることによってより特異的に標的化される。したがっ
て、それぞれ配列番号：３および配列番号：４の核酸は、ハイフォミクロビウム
属の核酸と特異的にハイブリダイズする。
から成る単離核酸も提供される。これらの核酸は、縮重ハイフォミクロビウム種
プローブ−5'-GCTGC（C/G ）CATTGTCACCGCC-3'を提供する。これは、実際には２
つのプローブ：配列番号：１６−GCTGCCCATTGTCACCGCC ；および配列番号：１７
−GCTGCGCATTGTCACCGCC である。細菌試料は、標的器官が標的領域の１つ又はそ
れ以上の塩基位置で何らかの変動性を有する場合に、両プローブでプロービング
され得る。あるいは、塩基類似体がＣまたはＧの代わりに用いられて、この位置
での変動性の影響を最小限にし得る。別の代替的戦略は、同一効果を達成するた
めにあるプローブが用いられる場合に、緊縮度を下げることである。このプロー
ブは、Hyphomicrobium vulgaris およびH.菌株Ｈｙｐ３５３（Illinois１６Ｓ
ｒＲＮＡ活性スラッジデータベース）、処理プラントから単離されるハイフォミ
クロビウム種、および同一処理プラントでスラッジから抽出されるＤＮＡからの
１６Ｓ ｒＲＮＡの直接増幅により得られる１６Ｓ ｒＤＮＡ配列由来のハイフ
ォミクロビウム様ＲＮＡ配列を含むよう設計された。データベースハイフォミク
ロビウム種は、縮重位置に（Ｃ）のみを用いることによってより特異的に標的化
される。その他のある種のハイフォミクロビウム種単離物およびスラッジ配列は
、同一位置に（Ｇ）を用いることによってより特異的に標的化される。したがっ
て、それぞれ配列番号：３および配列番号：４の核酸は、ハイフォミクロビウム
属の核酸と特異的にハイブリダイズする。
【００３９】 配列番号：１６の核酸を包含する単離核酸も提供される。ヌクレオチドは、配
列番号：１６の５‘または３’末端に付加され、その結果生じる核酸は、配列番
号：１６プローブが特異的にハイブリダイズする生物体の群の少なくとも１つを
検出するその能力に関して試験され得る。 配列番号：１７の核酸を包含する単離核酸も提供される。ヌクレオチドは、配
列番号：１７の５‘または３’末端に付加され、その結果生じる核酸は、配列番
号：１７プローブが特異的にハイブリダイズする生物体の群の少なくとも１つを
検出するその能力に関して試験され得る。
列番号：１６の５‘または３’末端に付加され、その結果生じる核酸は、配列番
号：１６プローブが特異的にハイブリダイズする生物体の群の少なくとも１つを
検出するその能力に関して試験され得る。 配列番号：１７の核酸を包含する単離核酸も提供される。ヌクレオチドは、配
列番号：１７の５‘または３’末端に付加され、その結果生じる核酸は、配列番
号：１７プローブが特異的にハイブリダイズする生物体の群の少なくとも１つを
検出するその能力に関して試験され得る。
【００４０】 本発明のハイフォミクロビウム核酸およびプローブは、コード鎖またはその相
補的鎖のヌクレオチド配列、あるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖のヌクレオ
チド配列を包含する核酸であり得る。したがって、本発明のプローブは、ＤＮＡ
またはＲＮＡであり得るし、そして生物試料中のＤＮＡまたはＲＮＡを結合し得
る。プローブのヌクレオチド配列は、種々のハイブリダイゼーション条件下で生
物試料中の標的核酸（単数または複数）とのプローブのハイブリダイゼーション
を可能にするのに十分なスラッジ試料中の核酸配列との相補性を有する任意の配
列であり得る。理想的には、プローブは試料中の当該核酸標的（単数または複数
）とのみハイブリダイズし、試料中の非標的核酸とは非特異的にはハイブリダイ
ズしない。ハイブリダイゼーション条件は、特定のハイブリダイゼーションプロ
トコールにおいて望ましい緊縮程度（例えば、in-situ 溶液ハイブリダイゼーシ
ョン、ブロット等）によって、変わり得る。例えば、ハイブリダイゼーション条
件が、高温および低塩条件を用いる高緊縮に対してである場合、プローブはそれ
が非常に高度の相補性を有する試料中の核酸配列とだけ結合する。低温および高
塩を用いる低緊縮ハイブリダイゼーション条件は、多少の相補性を有するがしか
し高緊縮性で生じるためのハイブリダイゼーションに必要とされるのと同様に高
度にプローブ配列と相補的であるわけではない試料中の核酸配列とのプローブの
ハイブリダイゼーションを可能にする。ハイブリダイゼーション条件は、生物試
料、プローブの種類および標的（単数または複数）によって変わる。本発明の核
酸の特定の適用のためのハイブリダイゼーション条件の最適化方法を、当業者は
知っている。ハイブリダイゼーション条件の例は、本明細書中に提示される実施
例に記載されている。
補的鎖のヌクレオチド配列、あるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖のヌクレオ
チド配列を包含する核酸であり得る。したがって、本発明のプローブは、ＤＮＡ
またはＲＮＡであり得るし、そして生物試料中のＤＮＡまたはＲＮＡを結合し得
る。プローブのヌクレオチド配列は、種々のハイブリダイゼーション条件下で生
物試料中の標的核酸（単数または複数）とのプローブのハイブリダイゼーション
を可能にするのに十分なスラッジ試料中の核酸配列との相補性を有する任意の配
列であり得る。理想的には、プローブは試料中の当該核酸標的（単数または複数
）とのみハイブリダイズし、試料中の非標的核酸とは非特異的にはハイブリダイ
ズしない。ハイブリダイゼーション条件は、特定のハイブリダイゼーションプロ
トコールにおいて望ましい緊縮程度（例えば、in-situ 溶液ハイブリダイゼーシ
ョン、ブロット等）によって、変わり得る。例えば、ハイブリダイゼーション条
件が、高温および低塩条件を用いる高緊縮に対してである場合、プローブはそれ
が非常に高度の相補性を有する試料中の核酸配列とだけ結合する。低温および高
塩を用いる低緊縮ハイブリダイゼーション条件は、多少の相補性を有するがしか
し高緊縮性で生じるためのハイブリダイゼーションに必要とされるのと同様に高
度にプローブ配列と相補的であるわけではない試料中の核酸配列とのプローブの
ハイブリダイゼーションを可能にする。ハイブリダイゼーション条件は、生物試
料、プローブの種類および標的（単数または複数）によって変わる。本発明の核
酸の特定の適用のためのハイブリダイゼーション条件の最適化方法を、当業者は
知っている。ハイブリダイゼーション条件の例は、本明細書中に提示される実施
例に記載されている。
【００４１】 プローブは、所望の特異性を達成するよう設計されている。プローブ標的（単
数または複数）に隣接する領域が保存領域である場合、塩基の付加はプローブ特
異性を低減する傾向があり、即ち、識別を付与する塩基の割合は低減される。識
別を成し遂げることはできるがしかし、より大きい割合の識別を提供しない塩基
で選択性を達成することは難しくなる。さらに、in-situ ハイブリダイゼーショ
ン実験では、長さが増大した場合、プローブは透過性化細胞にあまり入りそうに
ない。隣接領域が非常に可変性である場合には、プローブ長の増大はそれをより
特異的にする。この場合、プローブの「群別化機能」は危うくされ、そしていく
つかの所望の標的配列はハイブリダイズし得ない。好ましい場合には、本発明に
開示されたオリゴヌクレオチドを包含する核酸は長さが約１６〜２２ヌクレオチ
ドの範囲であることが予測される。
数または複数）に隣接する領域が保存領域である場合、塩基の付加はプローブ特
異性を低減する傾向があり、即ち、識別を付与する塩基の割合は低減される。識
別を成し遂げることはできるがしかし、より大きい割合の識別を提供しない塩基
で選択性を達成することは難しくなる。さらに、in-situ ハイブリダイゼーショ
ン実験では、長さが増大した場合、プローブは透過性化細胞にあまり入りそうに
ない。隣接領域が非常に可変性である場合には、プローブ長の増大はそれをより
特異的にする。この場合、プローブの「群別化機能」は危うくされ、そしていく
つかの所望の標的配列はハイブリダイズし得ない。好ましい場合には、本発明に
開示されたオリゴヌクレオチドを包含する核酸は長さが約１６〜２２ヌクレオチ
ドの範囲であることが予測される。
【００４２】 本発明は、本明細書中に記載したハイブリダイゼーション条件下で、配列番号
：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号
：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、
配列番号：１６または配列番号：１７のとして記載される配列と選択的または特
異的にハイブリダイズする単離核酸も提供する。例えば、ハイブリダイズする核
酸は、１つ又はそれ以上の例示鎖のＲＮＡとハイブリダイズするプローブであり
得る。ハイブリダイズする核酸は、前記の条件下でハイブリダイゼーションを妨
げない非現実的塩基置換も含み得る。
：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号
：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、
配列番号：１６または配列番号：１７のとして記載される配列と選択的または特
異的にハイブリダイズする単離核酸も提供する。例えば、ハイブリダイズする核
酸は、１つ又はそれ以上の例示鎖のＲＮＡとハイブリダイズするプローブであり
得る。ハイブリダイズする核酸は、前記の条件下でハイブリダイゼーションを妨
げない非現実的塩基置換も含み得る。
【００４３】 核酸を説明するために本明細書中で用いる場合、「選択的にハイブリダイズす
る」という用語は、時折無作為にハイブリダイズする核酸を除外する。それは、
背景ハイブリダイゼーションとして当業界で認識されるものも除外する。本明細
書中で用いる場合、「特異的」ハイブリダイゼーションとは、核酸が参照核酸と
だけ高緊縮度でハイブリダイズすることを意味する。本発明のハイブリダイズす
る核酸は、それがハイブリダイズする配列のセグメントおよび鎖との少なくとも
９０％、９１％、９２％、９３％、９４％９５％、９６％、９７％、９８％、９
９％および１００％相補性を有し得る。プローブとして用いられる核酸は、典型
的には、長さが１８、１９、２０、２１または２２ヌクレオチドである。しかし
ながら、核酸がプライマーとしてまたはその他の目的のために用いられるか否か
によって、それはより長かったり、より短かったりし得る。典型的には、１６Ｓ
ｒＲＮＡプローブは、長いプローブは、それらが透過性化細胞に容易に入るこ
とができないようにin-situ （全細胞）ハイブリダイゼーションには有効でない
ので、２０塩基の範囲で保持される。プライマーとして用いられる場合、本発明
は、所望の領域を増幅するために異なる領域と選択的にハイブリダイズする少な
くとも２つの核酸を含む組成物を提供する。プローブまたはプライマーの長さに
よって、それは、９０％相補性〜完全相補性の範囲であり得るし、緊縮条件下で
なおハイブリダイズする。例えば。ハイフォミクロビウム種の存在を検出する目
的のためには、ハイブリダイズする核酸（プローブまたはプライマー）とそれが
ハイブリダイズする配列（試料からのＤＮＡまたはＲＮＡ）との間の相補性度は
、少なくとも無関係細菌からの核酸とのハイブリダイゼーションを除外するのに
十分であるべきである。本発明は、緊縮条件下で非選択的にハイブリダイズする
核酸から選択的にハイブリダイズする核酸を識別するのに必要な相補性度が各核
酸に関して明瞭に確定され得るように、これらの核酸の例を提供する。
る」という用語は、時折無作為にハイブリダイズする核酸を除外する。それは、
背景ハイブリダイゼーションとして当業界で認識されるものも除外する。本明細
書中で用いる場合、「特異的」ハイブリダイゼーションとは、核酸が参照核酸と
だけ高緊縮度でハイブリダイズすることを意味する。本発明のハイブリダイズす
る核酸は、それがハイブリダイズする配列のセグメントおよび鎖との少なくとも
９０％、９１％、９２％、９３％、９４％９５％、９６％、９７％、９８％、９
９％および１００％相補性を有し得る。プローブとして用いられる核酸は、典型
的には、長さが１８、１９、２０、２１または２２ヌクレオチドである。しかし
ながら、核酸がプライマーとしてまたはその他の目的のために用いられるか否か
によって、それはより長かったり、より短かったりし得る。典型的には、１６Ｓ
ｒＲＮＡプローブは、長いプローブは、それらが透過性化細胞に容易に入るこ
とができないようにin-situ （全細胞）ハイブリダイゼーションには有効でない
ので、２０塩基の範囲で保持される。プライマーとして用いられる場合、本発明
は、所望の領域を増幅するために異なる領域と選択的にハイブリダイズする少な
くとも２つの核酸を含む組成物を提供する。プローブまたはプライマーの長さに
よって、それは、９０％相補性〜完全相補性の範囲であり得るし、緊縮条件下で
なおハイブリダイズする。例えば。ハイフォミクロビウム種の存在を検出する目
的のためには、ハイブリダイズする核酸（プローブまたはプライマー）とそれが
ハイブリダイズする配列（試料からのＤＮＡまたはＲＮＡ）との間の相補性度は
、少なくとも無関係細菌からの核酸とのハイブリダイゼーションを除外するのに
十分であるべきである。本発明は、緊縮条件下で非選択的にハイブリダイズする
核酸から選択的にハイブリダイズする核酸を識別するのに必要な相補性度が各核
酸に関して明瞭に確定され得るように、これらの核酸の例を提供する。
【００４４】 「緊縮条件」とは、ハイブリダイゼーションプロトコールに用いられる洗浄条
件を指す。特定レベルの緊縮度を得るのに必要な温度および塩条件は、フィルタ
ー上で固定化された参照ＤＮＡまたはＲＮＡの試料が当該プローブまたは１６
ｒＲＮＡコード核酸とハイブリダイズされ、次に異なる緊縮度の条件下で洗浄さ
れる実験で経験的に容易に確定される。 ハイフォミクロビウム種の検出方法 廃水試料中のハイフォミクロビウム種の存在の検出方法が提供される。方法は
、以下の：ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、廃水の試
料からのＤＮＡを、配列番号：１６の核酸を包含する核酸と接触させ、そしてｂ
）ハイフォミクロビウム種の存在を示すハイブリダイゼーションの存在を検出す
る工程を包含する。
件を指す。特定レベルの緊縮度を得るのに必要な温度および塩条件は、フィルタ
ー上で固定化された参照ＤＮＡまたはＲＮＡの試料が当該プローブまたは１６
ｒＲＮＡコード核酸とハイブリダイズされ、次に異なる緊縮度の条件下で洗浄さ
れる実験で経験的に容易に確定される。 ハイフォミクロビウム種の検出方法 廃水試料中のハイフォミクロビウム種の存在の検出方法が提供される。方法は
、以下の：ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、廃水の試
料からのＤＮＡを、配列番号：１６の核酸を包含する核酸と接触させ、そしてｂ
）ハイフォミクロビウム種の存在を示すハイブリダイゼーションの存在を検出す
る工程を包含する。
【００４５】 前記のような、しかし配列番号：１７の核酸を包含する核酸を用いた廃水試料
中のハイフォミクロビウム種の存在の検出方法も提供される。配列番号：６、配
列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、
配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４および配列番号：１５の核酸
も、ハイフォミクロビウム種の検出方法において、全体でまたは断片として利用
され得る。
中のハイフォミクロビウム種の存在の検出方法も提供される。配列番号：６、配
列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、
配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４および配列番号：１５の核酸
も、ハイフォミクロビウム種の検出方法において、全体でまたは断片として利用
され得る。
【００４６】 本発明のハイフォミクロビウム種プローブを用いるハイブリダイゼーション条
件は実施例で提供される。特異的ドットブロットハイブリダイゼーションのため
の温度は、５５℃である。特異的in-situ ハイブリダイゼーションのためのホル
ムアミド濃度は４５％である。 ハイフォミクロビウム種がスラッジ圧縮問題と関連があるため、スラッジ圧縮
問題と関連があるスラッジ中の細菌の検出方法が適用される。方法は、以下の：
ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、細菌からのＤＮＡを
、配列番号：３の核酸を包含する核酸と接触させ、そしてｂ）スラッジ圧縮問題
と関連する細菌の存在を示すハイブリダイゼーションの存在を検出する工程を包
含する。
件は実施例で提供される。特異的ドットブロットハイブリダイゼーションのため
の温度は、５５℃である。特異的in-situ ハイブリダイゼーションのためのホル
ムアミド濃度は４５％である。 ハイフォミクロビウム種がスラッジ圧縮問題と関連があるため、スラッジ圧縮
問題と関連があるスラッジ中の細菌の検出方法が適用される。方法は、以下の：
ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、細菌からのＤＮＡを
、配列番号：３の核酸を包含する核酸と接触させ、そしてｂ）スラッジ圧縮問題
と関連する細菌の存在を示すハイブリダイゼーションの存在を検出する工程を包
含する。
【００４７】 前記のような、しかし配列番号：４の核酸を包含する核酸を用いたスラッジ圧
縮問題に関連があるスラッジ中の細菌の検出方法も提供される。 スラッジフロックの主体から伸びるフィラメント（ハイフォミクロビウム種は
クラスターとしてよりむしろフィラメントとして増殖する）はスラッジフロック
を離して保持するので、ハイフォミクロビウム種は、浄化器中のスラッジの圧縮
に伴う問題に関連がある。これは糸状塊形成（スラッジ中の多の生物体によって
も引き起こされる）と呼ばれ、薄い嵩高のスラッジで満たされる浄化器（沈澱池
）を生じる。未精留の場合、スラッジブランケット（浄化器の底）はついには浄
化器の上部に延びて、スラッジは上部から流出し、流出液が捨てられている受入
れ水（局所性の川）に入る。 粘着集落とハイフォミクロビウムの平衡の保持 典型的には、粘着集落クラスターとハイフォミクロビウムにより引き起こされ
る問題は、別々に起きる。しかしながら、ある場合には、これら２つの集団は２
つの極端な条件を代表するように見えるし、プロセス制御決定は、中間的立場の
発見に連動されるべきである。両方の種類の菌株に対する適切なプラントプロセ
ス制御応答が知られており、そこで両者に対するプローブによるモニタリングが
有益である。同一ハイブリダイゼーション混合物中の両菌株に対してプローブを
用いることも可能であるべきであり、特に異なるマーカーは異なるプローブに用
いられる。
縮問題に関連があるスラッジ中の細菌の検出方法も提供される。 スラッジフロックの主体から伸びるフィラメント（ハイフォミクロビウム種は
クラスターとしてよりむしろフィラメントとして増殖する）はスラッジフロック
を離して保持するので、ハイフォミクロビウム種は、浄化器中のスラッジの圧縮
に伴う問題に関連がある。これは糸状塊形成（スラッジ中の多の生物体によって
も引き起こされる）と呼ばれ、薄い嵩高のスラッジで満たされる浄化器（沈澱池
）を生じる。未精留の場合、スラッジブランケット（浄化器の底）はついには浄
化器の上部に延びて、スラッジは上部から流出し、流出液が捨てられている受入
れ水（局所性の川）に入る。 粘着集落とハイフォミクロビウムの平衡の保持 典型的には、粘着集落クラスターとハイフォミクロビウムにより引き起こされ
る問題は、別々に起きる。しかしながら、ある場合には、これら２つの集団は２
つの極端な条件を代表するように見えるし、プロセス制御決定は、中間的立場の
発見に連動されるべきである。両方の種類の菌株に対する適切なプラントプロセ
ス制御応答が知られており、そこで両者に対するプローブによるモニタリングが
有益である。同一ハイブリダイゼーション混合物中の両菌株に対してプローブを
用いることも可能であるべきであり、特に異なるマーカーは異なるプローブに用
いられる。
【００４８】 実施例１ 粘性スラッジ中の粘着集落クラスターの分子分析 要約 １６Ｓ ｒＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブ（ＺＲＡおよびＺＢＥ）による
プロービングは、ある処理プラントにおける粘着集落クラスターを形成する微生
物が、他の廃水処理系から単離され、これまでに分類されたZoogloea ramigera
株（プロテオバクテリウムのβサブクラスの成員）と同一でないことを示した。
プロービングは、ある処理プラントにおける粘着集落クラスターを形成する微生
物が、他の廃水処理系から単離され、これまでに分類されたZoogloea ramigera
株（プロテオバクテリウムのβサブクラスの成員）と同一でないことを示した。
【００４９】 マイクロマニピュレーター分離、培養および１６Ｓ ｒＲＮＡ分析を用いて、
粘着集落クラスター形成に関与する微生物を同定した。単離菌株のディスタンス
マトリックスツリー分析は、ｍｚｔおよびｍｚＬと呼ばれる２つの種類の微生物
の存在を明示した。ｍｚｔ単離物は、タウエラ属の成員と最も密接に集団を成し
た。ｍｚＬ単離物は、ブラキモナス属の成員とより密接に集団を成した。入れ子
式プローブアプローチを用いて、２つの１６Ｓ ｒＲＮＡプローブを設計した。
プローブＭＺ１は、ｍｚｔ菌株を標的にし、タウエラ属の成員と相補的である。
プローブロドは、ｍｚｔ単離物からZ. ramigera 型菌株ＡＴＣＣ１９５４４まで
の範囲の種を標的にし、タウエラ属、ズーグレア属、アゾアルクス属およびロド
シクルス属の成員と相補的である。フルオレセイン標識化１６Ｓ ｒＲＮＡプロ
ーブおよびエピ蛍光顕微鏡を用いた全細胞ハイブリダイゼーションは、これらの
プローブの両方が廃水バイオソリッド中に存在する粘着集落クラスターとハイブ
リダイズすることを示した。 廃水処理プラント特性 化学会社廃水処理施設から、活性スラッジ混合液を得た。流入廃水有機基層は
、主に短鎖アルコールおよび低分子量有機酸から成る。プラントは３つの別々の
曝気槽を直列で包含し、変法段階供給流形状で操作される。第一、第二および第
三曝気槽間の典型的流入流分流は、それぞれ０／８０／２０または５０／３０／
２０パーセントである（Bullard and Barber, 1994）。試料は、第三曝気槽から
の混合液体懸濁固体（ＭＬＳＳ、即ちバイオマス）を絶えず循環させる、処理プ
ラント実験室中でサンプリングバルブにより動かされる連続サンプリングループ
から採取した。 粘着集落クラスターの単離および培養 オリンパス倒立顕微鏡（Tokyo ）上に載せたマイクロマニピュレーター（Nari
shige ＭＮ−１５１型、Tokyo ）を用いて、廃水処理施設から得られた活性スラ
ッジから、粘着集落クラスターを分離した。プラント流入廃水と同一の基本無機
構成成分を含有する滅菌合成廃水媒質（ＥＡＳＭ）１滴中にスラッジ１滴を入れ
ることにより、滅菌ガラス顕微鏡スライド上で活性スラッジを希釈した。培地は
以下のものを含有する（ｍｇ／Ｌ）：ＣａＳＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ、７４０；Ｎａ2 Ｓ
Ｏ4 、３２０；ＮａＣｌ、８０；ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１００；３−Ｎ−モル
ホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、５０；ＫＨ2 ＰＯ4 、４；Ｋ2 ＨＰＯ 4 、１４；ＦｅＥＤＴＡ、１３；（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、２２０；ＭｎＳＯ4 ・Ｈ 2 Ｏ、１０；Ｎａ2 ＥＤＴＡ、０２５；Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ、０．０５；
ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、０．００１；ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．０５；ＣｕＳ
Ｏ4 ・５Ｈ2 Ｏ、０．０１。
粘着集落クラスター形成に関与する微生物を同定した。単離菌株のディスタンス
マトリックスツリー分析は、ｍｚｔおよびｍｚＬと呼ばれる２つの種類の微生物
の存在を明示した。ｍｚｔ単離物は、タウエラ属の成員と最も密接に集団を成し
た。ｍｚＬ単離物は、ブラキモナス属の成員とより密接に集団を成した。入れ子
式プローブアプローチを用いて、２つの１６Ｓ ｒＲＮＡプローブを設計した。
プローブＭＺ１は、ｍｚｔ菌株を標的にし、タウエラ属の成員と相補的である。
プローブロドは、ｍｚｔ単離物からZ. ramigera 型菌株ＡＴＣＣ１９５４４まで
の範囲の種を標的にし、タウエラ属、ズーグレア属、アゾアルクス属およびロド
シクルス属の成員と相補的である。フルオレセイン標識化１６Ｓ ｒＲＮＡプロ
ーブおよびエピ蛍光顕微鏡を用いた全細胞ハイブリダイゼーションは、これらの
プローブの両方が廃水バイオソリッド中に存在する粘着集落クラスターとハイブ
リダイズすることを示した。 廃水処理プラント特性 化学会社廃水処理施設から、活性スラッジ混合液を得た。流入廃水有機基層は
、主に短鎖アルコールおよび低分子量有機酸から成る。プラントは３つの別々の
曝気槽を直列で包含し、変法段階供給流形状で操作される。第一、第二および第
三曝気槽間の典型的流入流分流は、それぞれ０／８０／２０または５０／３０／
２０パーセントである（Bullard and Barber, 1994）。試料は、第三曝気槽から
の混合液体懸濁固体（ＭＬＳＳ、即ちバイオマス）を絶えず循環させる、処理プ
ラント実験室中でサンプリングバルブにより動かされる連続サンプリングループ
から採取した。 粘着集落クラスターの単離および培養 オリンパス倒立顕微鏡（Tokyo ）上に載せたマイクロマニピュレーター（Nari
shige ＭＮ−１５１型、Tokyo ）を用いて、廃水処理施設から得られた活性スラ
ッジから、粘着集落クラスターを分離した。プラント流入廃水と同一の基本無機
構成成分を含有する滅菌合成廃水媒質（ＥＡＳＭ）１滴中にスラッジ１滴を入れ
ることにより、滅菌ガラス顕微鏡スライド上で活性スラッジを希釈した。培地は
以下のものを含有する（ｍｇ／Ｌ）：ＣａＳＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ、７４０；Ｎａ2 Ｓ
Ｏ4 、３２０；ＮａＣｌ、８０；ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１００；３−Ｎ−モル
ホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、５０；ＫＨ2 ＰＯ4 、４；Ｋ2 ＨＰＯ 4 、１４；ＦｅＥＤＴＡ、１３；（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、２２０；ＭｎＳＯ4 ・Ｈ 2 Ｏ、１０；Ｎａ2 ＥＤＴＡ、０２５；Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ、０．０５；
ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、０．００１；ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．０５；ＣｕＳ
Ｏ4 ・５Ｈ2 Ｏ、０．０１。
【００５０】 個々の粘着集落クラスターをガラスミクロピペット中に吸い取り、ピペットの
外側を９５％エタノールで洗浄して、クラスターを滅菌合成廃水の新鮮な一滴中
に射出した。次にミクロピペットを９５％エタノールおよび滅菌蒸留水で濯いだ
後、クラスターをミクロピペット中に吸い戻した。合計３回、分離手順を反復し
た後、クラスターを、ＥＡＳＭ液体培地を含有するエッペンドルフ管中に射出し
た。合計７つの粘着集落クラスターを単離した。粘着集落クラスターを含有する
エッペンドルフ管を、目で見える濁りが出現するまで、室温でインキュベートし
た。単純有機酸およびアルコールを添加したＲ２Ａ寒天平板（Americal Public
Health Association, 1989. Standard Methods for Examination of Water and
Wastewater 17th Edition, Clesceri, L.S., A.E. Greenberg, and R. Rhodes T
russell （eds.）Washington, D.C.）に培養を画線し（Ｒ２Ａ／Ｓ培地）、１６
Ｓ ｒＤＮＡ分析の前に純度のために個々のコロニー型を再画線した。 系統発生分析およびプローブ設計 １６Ｓ ｒＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のために、寒天平板
上の個々のコロニーを接種ループを用いて無菌的にエッペンドルフ管に移した。
増幅は、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼならびにプライマー２７ｆおよび
１４９２ｒを含有するパーキン−エルマーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ試薬キットを
用いて実行した（Lane, 1991）。緩衝剤、ヌクレオチドプライマーおよび単一細
菌コロニーを含有するＰＣＲ試料を１００℃で５分間加熱して、ＤＮＡポリメラ
ーゼを付加し、以下のプロトコールを用いて３０サイクル、ＰＣＲ増幅を実施し
た：９４℃で１分、４５℃で１分および７２℃で１分。全長ＰＣＲ生成物を確保
するための最終延長を、７２℃で１０分間実施した。１．５ｋｂバンドの存在を
示すアガロースゲル電気泳動により、首尾よく増幅されたことが立証された。
外側を９５％エタノールで洗浄して、クラスターを滅菌合成廃水の新鮮な一滴中
に射出した。次にミクロピペットを９５％エタノールおよび滅菌蒸留水で濯いだ
後、クラスターをミクロピペット中に吸い戻した。合計３回、分離手順を反復し
た後、クラスターを、ＥＡＳＭ液体培地を含有するエッペンドルフ管中に射出し
た。合計７つの粘着集落クラスターを単離した。粘着集落クラスターを含有する
エッペンドルフ管を、目で見える濁りが出現するまで、室温でインキュベートし
た。単純有機酸およびアルコールを添加したＲ２Ａ寒天平板（Americal Public
Health Association, 1989. Standard Methods for Examination of Water and
Wastewater 17th Edition, Clesceri, L.S., A.E. Greenberg, and R. Rhodes T
russell （eds.）Washington, D.C.）に培養を画線し（Ｒ２Ａ／Ｓ培地）、１６
Ｓ ｒＤＮＡ分析の前に純度のために個々のコロニー型を再画線した。 系統発生分析およびプローブ設計 １６Ｓ ｒＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のために、寒天平板
上の個々のコロニーを接種ループを用いて無菌的にエッペンドルフ管に移した。
増幅は、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼならびにプライマー２７ｆおよび
１４９２ｒを含有するパーキン−エルマーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ試薬キットを
用いて実行した（Lane, 1991）。緩衝剤、ヌクレオチドプライマーおよび単一細
菌コロニーを含有するＰＣＲ試料を１００℃で５分間加熱して、ＤＮＡポリメラ
ーゼを付加し、以下のプロトコールを用いて３０サイクル、ＰＣＲ増幅を実施し
た：９４℃で１分、４５℃で１分および７２℃で１分。全長ＰＣＲ生成物を確保
するための最終延長を、７２℃で１０分間実施した。１．５ｋｂバンドの存在を
示すアガロースゲル電気泳動により、首尾よく増幅されたことが立証された。
【００５１】 メーカーのプロトコールにしたがって、ＴＡクローニング系（Invitrogen Cor
poration, San Diego, CA ）を用いて増幅１６Ｓ ｒＤＮＡをクローン化した。
アンピシリンまたはカナマイシンを含有するＬＢ培地中に、白色コロニーが増殖
し、Promega Technical Bulletin .009 （Promega, Madison, WI）に記載されて
いるような基本的アルカリ溶解手法を用いてプラスミドを抽出した。ＤＮＡ抽出
物をＲＮアーゼ処理し、等容量のクロロホルムで抽出して、イソプロパノールで
沈澱させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄して、乾燥させた。ＥｃｏＲＩ
消化およびゲル電気泳動により、プラスミド挿入物を立証した。
poration, San Diego, CA ）を用いて増幅１６Ｓ ｒＤＮＡをクローン化した。
アンピシリンまたはカナマイシンを含有するＬＢ培地中に、白色コロニーが増殖
し、Promega Technical Bulletin .009 （Promega, Madison, WI）に記載されて
いるような基本的アルカリ溶解手法を用いてプラスミドを抽出した。ＤＮＡ抽出
物をＲＮアーゼ処理し、等容量のクロロホルムで抽出して、イソプロパノールで
沈澱させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄して、乾燥させた。ＥｃｏＲＩ
消化およびゲル電気泳動により、プラスミド挿入物を立証した。
【００５２】 全長挿入物を含有する精製ＴＡクローニングベクターから、１６Ｓ ｒＤＮＡ
をシーケンシングした。プライマー配列１４９２ｒおよび単一プライマー延長部
分を用いて、１６Ｓ ｒＤＮＡ領域１１００〜１４９２に、約４００塩基対をシ
ーケンシングした。付加的配列は、プライマー配列５３０ｆまたは９０７ｒを用
いて領域５００〜９００で確定された（Lane, 1991）。シーケンシングは、Retr
ogen, Inc.（San Diego, CA ）およびMolecular Biology Resource Facility at
the University of Tennessee（Knoxville, TN ）により実施された。
をシーケンシングした。プライマー配列１４９２ｒおよび単一プライマー延長部
分を用いて、１６Ｓ ｒＤＮＡ領域１１００〜１４９２に、約４００塩基対をシ
ーケンシングした。付加的配列は、プライマー配列５３０ｆまたは９０７ｒを用
いて領域５００〜９００で確定された（Lane, 1991）。シーケンシングは、Retr
ogen, Inc.（San Diego, CA ）およびMolecular Biology Resource Facility at
the University of Tennessee（Knoxville, TN ）により実施された。
【００５３】 マイクロマニピュレーター単離物の配列を、プログラム類似性等級Similarity
Rank （Maidak et al., 1994 ）を用いてイリノイ１６Ｓリボソームデータベー
スプロジェクト（ＲＤＰ）における他の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と、そしてＢｌａ
ｓｔＮプログラム（Altshul et al., 1990）を用いてＮＣＢ１ ＧｅｎＢａｎｋ
の配列と比較した。ＧＣＧ分析プログラムを用いてディスタンスマトリックスツ
リーを構築して、活性スラッジ単離物の互いとの、Similarity Rank 分析により
示されるような密接に関連する菌株との、そして前記の活性スラッジ粘着集落性
菌株からの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列との関連性を確定した。
Rank （Maidak et al., 1994 ）を用いてイリノイ１６Ｓリボソームデータベー
スプロジェクト（ＲＤＰ）における他の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と、そしてＢｌａ
ｓｔＮプログラム（Altshul et al., 1990）を用いてＮＣＢ１ ＧｅｎＢａｎｋ
の配列と比較した。ＧＣＧ分析プログラムを用いてディスタンスマトリックスツ
リーを構築して、活性スラッジ単離物の互いとの、Similarity Rank 分析により
示されるような密接に関連する菌株との、そして前記の活性スラッジ粘着集落性
菌株からの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列との関連性を確定した。
【００５４】 マイクロマニピュレーター単離物と既知の粘着集落性菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ
配列の可視的比較により、プローブを設計した。廃水処理プラントからの活性ス
ラッジから、ならびに以前に報告された粘着集落性菌株から、マイクロマニピュ
レーター単離物間または群を区別するために、入れ子式プローブアプローチを用
いてプローブ配列を設計した。プログラムプローブチェックProbe Check を用い
てプローブ配列を分析して、選定配列が１６Ｓ ｒＲＮＡ配列が利用可能である
他の既知の微生物を標的にするか否かを確定した。
配列の可視的比較により、プローブを設計した。廃水処理プラントからの活性ス
ラッジから、ならびに以前に報告された粘着集落性菌株から、マイクロマニピュ
レーター単離物間または群を区別するために、入れ子式プローブアプローチを用
いてプローブ配列を設計した。プログラムプローブチェックProbe Check を用い
てプローブ配列を分析して、選定配列が１６Ｓ ｒＲＮＡ配列が利用可能である
他の既知の微生物を標的にするか否かを確定した。
【００５５】 全細胞ハイブリダイゼーション実験のために、ＤＮＡ合成機を用いてオリゴヌ
クレオチドプローブを合成し、フルオレセインで５‘末端標識して、逆相ＨＰＬ
Ｃ（Genosys, The Woodlands, TX）により精製した。プローブを使用前にＴＥ緩
衝液中に再懸濁し、−２０℃で保存した。スロットブロットハイブリダイゼーシ
ョン実験のために、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Life Technologies, Gaith
ersburg, MD ）および［γ−３２Ｐ］ｄＡＴＰを用いて、オリゴヌクレオチドを
それらの５’末端で標識化した。標識化プローブを、Stratagene（La Jolla, CA
）Ｎｕｃｔｒａｐプッシュカラムを用いて精製した。 １６Ｓ ｒＲＮＡプロービング 蛍光１６Ｓ ｒＲＮＡプローブを用いる全細胞ハイブリダイゼーション実験の
ための手法を、IgepalＣＡ−６３０をNonidet Ｐ−４０の代わりに置換し、パラ
ホルムアルデヒド中での固定後に氷水浴中での５分間の音波処理を付加すること
により、Amann 等（1990a,b ）の方法から変更した。音波処理の前にスラッジ試
料を１０ｍＭのＥＤＴＡ中に再懸濁してプローブ浸透に対するフロックの透過性
を増強した。フルオレセイン標識化プローブとのハイブリダイゼーション後、エ
ピ蛍光のために高圧水銀球およびフィルターセットを装備したＮｉｋｏｎオプチ
フォト顕微鏡およびNikon Ｆエクス−３５Ａカメラを用いて、試料を検査した。
以下でさらに説明するように、Hertel等（1991）およびRossello-Mora 等（1995
）の方法にしたがって、核酸抽出、ナイロン膜上での固定化およびドットブロッ
トハイブリダイゼーションを実施した。
クレオチドプローブを合成し、フルオレセインで５‘末端標識して、逆相ＨＰＬ
Ｃ（Genosys, The Woodlands, TX）により精製した。プローブを使用前にＴＥ緩
衝液中に再懸濁し、−２０℃で保存した。スロットブロットハイブリダイゼーシ
ョン実験のために、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Life Technologies, Gaith
ersburg, MD ）および［γ−３２Ｐ］ｄＡＴＰを用いて、オリゴヌクレオチドを
それらの５’末端で標識化した。標識化プローブを、Stratagene（La Jolla, CA
）Ｎｕｃｔｒａｐプッシュカラムを用いて精製した。 １６Ｓ ｒＲＮＡプロービング 蛍光１６Ｓ ｒＲＮＡプローブを用いる全細胞ハイブリダイゼーション実験の
ための手法を、IgepalＣＡ−６３０をNonidet Ｐ−４０の代わりに置換し、パラ
ホルムアルデヒド中での固定後に氷水浴中での５分間の音波処理を付加すること
により、Amann 等（1990a,b ）の方法から変更した。音波処理の前にスラッジ試
料を１０ｍＭのＥＤＴＡ中に再懸濁してプローブ浸透に対するフロックの透過性
を増強した。フルオレセイン標識化プローブとのハイブリダイゼーション後、エ
ピ蛍光のために高圧水銀球およびフィルターセットを装備したＮｉｋｏｎオプチ
フォト顕微鏡およびNikon Ｆエクス−３５Ａカメラを用いて、試料を検査した。
以下でさらに説明するように、Hertel等（1991）およびRossello-Mora 等（1995
）の方法にしたがって、核酸抽出、ナイロン膜上での固定化およびドットブロッ
トハイブリダイゼーションを実施した。
【００５６】 それぞれ、スロットブロットまたは全細胞ハイブリダイゼーション実験におけ
る単一塩基誤対合識別を成し遂げるのに必要な温度またはホルムアミド濃度を確
定することにより、プローブ特異性を最適化した。標的配列との０、１、２およ
び３つの誤対合を有する菌株を、プログラムプローブチェックProbe Check を用
いて同定した。対照菌株は、アメリカ培養細胞コレクション（ＡＴＣＣ；Rockvi
lle, Md ）から得た。Zoogloea ramigera ＡＴＣＣ１９５４４、Z. ramigera Ａ
ＴＣＣ２５９３５および菌株ｍｚ１ｔをストークス培地上で培養した（Wagner,
1995）。ＡＴＣＣの推奨にしたがって、シュードモナス属のPseudomonas fluore
scenseＡＴＣＣ１３５２５、コマモナス属のComamonas testosteroniＡＴＣＣ１
１９９６およびアルカリゲネス属のAlcaligenes eutrophus ＡＴＣＣ１７６９７
を培養した。活性スラッジ試料を用いる全てのハイブリダイゼーション実験に、
陽性および陰性対照菌株を用いた。 既知の粘着集落性菌株に関するプロービング ３２Ｐ標識化ＺＲＡを用いたスロットブロットハイブリダイゼーション実験、
またはフルオレセイン標識化ＺＢＥおよびＺＲＡを用いた全細胞ハイブリダイゼ
ーションにおける活性スラッジ試料からのＲＮＡ抽出物のプロービング（Rossel
lo-Mora et al., 1995）は、検出可能なハイブリダイゼーションを生じなかった
。３２Ｐ標識化ＥＵＢ３３８（全ての真正細菌に特異的な対照プローブ。Wagner
et al., 1993, Appl. Environ. Microbiol. 59:1520-1525 ）との陽性反応は、
ＲＮＡ抽出手法が有効であることを示し、そしてフルオレセイン標識化ＥＵＢ３
３８でプローブ処理された粘着集落クラスターの顕微鏡検査は、プローブの侵入
およびクラスターを形成する生物体とのハイブリダイゼーションがうまくいった
ことを示した。 粘着集落クラスターの単離および培養 活性スラッジのマイクロマニピュレーションから得られた粘着集落クラスター
は、サイズにより識別可能な２つの主な種類のコロニーを産生した。ｍｚｔ菌株
はＲ２Ａ／Ｓ寒天平板上に小コロニーを形成して、ＥＡＳＭおよびＲ２Ａ／Ｓ液
体培地中でフロックとして増殖したが、一方ｍｚＬはＲ２Ａ／Ｓ寒天平板上に大
型コロニーを形成し、ＥＡＳＭ培地中では不十分に増殖し、そしてＲ２Ａ／Ｓ中
では分散細胞として増殖した。大型の種類のコロニーの３つの代表からの１６Ｓ
ｒＤＮＡ遺伝子（ｍｚ１Ｌ、ｍｚ２Ｌおよびｍｚ３Ｌ）ならびに２つの小型の
種類（ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔ）が増幅され、クローン化されて、塩基対領域１
１００〜１４９２でシーケンシングされた。以前に開発されたZoogloea種プロー
ブの標的領域との直接比較のために、これらの塩基対領域５００〜９００でのｍ
ｚ１ｔ１６Ｓ ｒＤＮＡの付加的シーケンシングを実施した。 系統発生分析およびプローブ設計 ｍｚ１ｔのシーケンシング化１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の両方とプログラムSimila
rity Rank を用いたイリノイ大学１６Ｓリボソームデータベースプロジェクト（
ＲＤＰ）における配列との比較（June 9, 1997, 20:05:02）は、シュードモナス
種菌株Ｋ１７２、クローンＫ１との最も近い対合（０．８２）を生じた（Thauer
a aromatica; Anders et al., 1995）。GenBank との比較は、菌株ｍＸｙＮ１（
未分類。Rabus and Widdel, 1995）およびThauera aromaticaからのプロテオバ
クテリウム１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子との９７％類似性を生じた。１６Ｓ ｒＲＮ
Ａ領域１１００〜１４９２におけるｍｚ２Ｌに関する類似性等級分析は、Brachy
monas denitrificans 菌株ＡＳ−Ｐ１（Hiraishi et al., 1995 ）との最も近い
対合（０．８４）を生じた。ディスタンスマトリックスツリー分析は、ｍｚｔ株
（ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔ）は、ｍｚＬ株（ｍｚ１Ｌ、ｍｚ２Ｌおよびｍｚ３Ｌ
）より密接にZ. ramigera ＡＴＣＣ１９５４４に関連しており、そしておそらく
はタウエラ属の成員であろうということを示す。ｍｚ１ｔおよびZ. ramigera Ａ
ＴＣＣ１９５４４ １６Ｓ ｒＲＮＡ配列の比較は、ＺＲＡプローブ標的領域に
おける３つの塩基対誤対合を示す。
る単一塩基誤対合識別を成し遂げるのに必要な温度またはホルムアミド濃度を確
定することにより、プローブ特異性を最適化した。標的配列との０、１、２およ
び３つの誤対合を有する菌株を、プログラムプローブチェックProbe Check を用
いて同定した。対照菌株は、アメリカ培養細胞コレクション（ＡＴＣＣ；Rockvi
lle, Md ）から得た。Zoogloea ramigera ＡＴＣＣ１９５４４、Z. ramigera Ａ
ＴＣＣ２５９３５および菌株ｍｚ１ｔをストークス培地上で培養した（Wagner,
1995）。ＡＴＣＣの推奨にしたがって、シュードモナス属のPseudomonas fluore
scenseＡＴＣＣ１３５２５、コマモナス属のComamonas testosteroniＡＴＣＣ１
１９９６およびアルカリゲネス属のAlcaligenes eutrophus ＡＴＣＣ１７６９７
を培養した。活性スラッジ試料を用いる全てのハイブリダイゼーション実験に、
陽性および陰性対照菌株を用いた。 既知の粘着集落性菌株に関するプロービング ３２Ｐ標識化ＺＲＡを用いたスロットブロットハイブリダイゼーション実験、
またはフルオレセイン標識化ＺＢＥおよびＺＲＡを用いた全細胞ハイブリダイゼ
ーションにおける活性スラッジ試料からのＲＮＡ抽出物のプロービング（Rossel
lo-Mora et al., 1995）は、検出可能なハイブリダイゼーションを生じなかった
。３２Ｐ標識化ＥＵＢ３３８（全ての真正細菌に特異的な対照プローブ。Wagner
et al., 1993, Appl. Environ. Microbiol. 59:1520-1525 ）との陽性反応は、
ＲＮＡ抽出手法が有効であることを示し、そしてフルオレセイン標識化ＥＵＢ３
３８でプローブ処理された粘着集落クラスターの顕微鏡検査は、プローブの侵入
およびクラスターを形成する生物体とのハイブリダイゼーションがうまくいった
ことを示した。 粘着集落クラスターの単離および培養 活性スラッジのマイクロマニピュレーションから得られた粘着集落クラスター
は、サイズにより識別可能な２つの主な種類のコロニーを産生した。ｍｚｔ菌株
はＲ２Ａ／Ｓ寒天平板上に小コロニーを形成して、ＥＡＳＭおよびＲ２Ａ／Ｓ液
体培地中でフロックとして増殖したが、一方ｍｚＬはＲ２Ａ／Ｓ寒天平板上に大
型コロニーを形成し、ＥＡＳＭ培地中では不十分に増殖し、そしてＲ２Ａ／Ｓ中
では分散細胞として増殖した。大型の種類のコロニーの３つの代表からの１６Ｓ
ｒＤＮＡ遺伝子（ｍｚ１Ｌ、ｍｚ２Ｌおよびｍｚ３Ｌ）ならびに２つの小型の
種類（ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔ）が増幅され、クローン化されて、塩基対領域１
１００〜１４９２でシーケンシングされた。以前に開発されたZoogloea種プロー
ブの標的領域との直接比較のために、これらの塩基対領域５００〜９００でのｍ
ｚ１ｔ１６Ｓ ｒＤＮＡの付加的シーケンシングを実施した。 系統発生分析およびプローブ設計 ｍｚ１ｔのシーケンシング化１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の両方とプログラムSimila
rity Rank を用いたイリノイ大学１６Ｓリボソームデータベースプロジェクト（
ＲＤＰ）における配列との比較（June 9, 1997, 20:05:02）は、シュードモナス
種菌株Ｋ１７２、クローンＫ１との最も近い対合（０．８２）を生じた（Thauer
a aromatica; Anders et al., 1995）。GenBank との比較は、菌株ｍＸｙＮ１（
未分類。Rabus and Widdel, 1995）およびThauera aromaticaからのプロテオバ
クテリウム１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子との９７％類似性を生じた。１６Ｓ ｒＲＮ
Ａ領域１１００〜１４９２におけるｍｚ２Ｌに関する類似性等級分析は、Brachy
monas denitrificans 菌株ＡＳ−Ｐ１（Hiraishi et al., 1995 ）との最も近い
対合（０．８４）を生じた。ディスタンスマトリックスツリー分析は、ｍｚｔ株
（ｍｚ１ｔおよびｍｚ２ｔ）は、ｍｚＬ株（ｍｚ１Ｌ、ｍｚ２Ｌおよびｍｚ３Ｌ
）より密接にZ. ramigera ＡＴＣＣ１９５４４に関連しており、そしておそらく
はタウエラ属の成員であろうということを示す。ｍｚ１ｔおよびZ. ramigera Ａ
ＴＣＣ１９５４４ １６Ｓ ｒＲＮＡ配列の比較は、ＺＲＡプローブ標的領域に
おける３つの塩基対誤対合を示す。
【００５７】 領域１１００〜１４９２を用いて、Z. ramigera ＡＴＣＣ１９５４４およびｍ
ｚｔ菌株を包含するよう、プローブを設計した（ロド：5'-ATCCGGACTACGATCGGC-
3'）。プログラムProbe Check を用いたＲＤＰのプロービングは、ロドプローブ
が、主としてタウエラ属、アゾアルクス属、ズーグレア属およびロドシクルス属
の成員を含めた２８の列挙した配列の１６Ｓ ｒＲＮＡ領域と相補的である、と
いうことを示した。Z. ramigera プローブＺＲＡ（塩基対６４７〜６６４）によ
り標的化される領域でも、ｍｚｔ菌株に関してプローブを設計した。このプロー
ブ（ＭＺ１；5'-TCTGCCGTACTCTAAGCCTT-3'）は、標的領域にZ. ramigera ＡＴＣ
Ｃ１９５４４との３つの塩基対誤対合を有する（表２参照）。このプローブとＲ
ＤＰにおける既知の配列とのProbe Check を用いた比較は、４つの相補的１６Ｓ
ｒＲＮＡ配列が存在することを示した。これらは、アゾアルクス属の一成員（
A.種ＢＨ７２；Hurek et al., 1993）、タウエラ属の２つの既知の代表菌（T. s
elenatisおよびT. aromatica）、および未分類菌株（env. ＡＸ３９）を含む。
過去にシーケンシングされたアゾアルクス種の多くが、このプローブと１つの誤
対合を有する。
ｚｔ菌株を包含するよう、プローブを設計した（ロド：5'-ATCCGGACTACGATCGGC-
3'）。プログラムProbe Check を用いたＲＤＰのプロービングは、ロドプローブ
が、主としてタウエラ属、アゾアルクス属、ズーグレア属およびロドシクルス属
の成員を含めた２８の列挙した配列の１６Ｓ ｒＲＮＡ領域と相補的である、と
いうことを示した。Z. ramigera プローブＺＲＡ（塩基対６４７〜６６４）によ
り標的化される領域でも、ｍｚｔ菌株に関してプローブを設計した。このプロー
ブ（ＭＺ１；5'-TCTGCCGTACTCTAAGCCTT-3'）は、標的領域にZ. ramigera ＡＴＣ
Ｃ１９５４４との３つの塩基対誤対合を有する（表２参照）。このプローブとＲ
ＤＰにおける既知の配列とのProbe Check を用いた比較は、４つの相補的１６Ｓ
ｒＲＮＡ配列が存在することを示した。これらは、アゾアルクス属の一成員（
A.種ＢＨ７２；Hurek et al., 1993）、タウエラ属の２つの既知の代表菌（T. s
elenatisおよびT. aromatica）、および未分類菌株（env. ＡＸ３９）を含む。
過去にシーケンシングされたアゾアルクス種の多くが、このプローブと１つの誤
対合を有する。
【００５８】
【表２】
【００５９】 プログラムProbe Check を用いて、プローブＺＲＡ、ロドおよびＭＺ１との０
、１および３つの誤対合を伴う１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を有する菌株を同定した（
表３参照）。個々の標的菌株および各々がプローブする誤対合の数は、表２に示
されている。蛍光標識化プローブを用いた全細胞ハイブリダイゼーションは、１
０％のホルムアミド濃度が２つの誤対合識別を生じ、一方、誤対合識別１つを成
し遂げるには４０％の濃度が必要であることを示した。
、１および３つの誤対合を伴う１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を有する菌株を同定した（
表３参照）。個々の標的菌株および各々がプローブする誤対合の数は、表２に示
されている。蛍光標識化プローブを用いた全細胞ハイブリダイゼーションは、１
０％のホルムアミド濃度が２つの誤対合識別を生じ、一方、誤対合識別１つを成
し遂げるには４０％の濃度が必要であることを示した。
【００６０】
【表３】
【００６１】 蛍光プローブを用いた全細胞ハイブリダイゼーション ４０％のホルムアミド濃度で、フルオレセイン標識化プローブＥＵＢ、ＺＲＡ
、ＭＺ１およびロドを用いて、活性スラッジの全細胞（in-situ ）ハイブリダイ
ゼーションを実施した。顕微鏡検査は、可視的粘着集落クラスターが蛍光プロー
ブＥＵＢ、ＭＺ１およびロドにより強陽性をプローブすることを示した。これら
は、フロックと結合する化またはその中に包埋される粘着集落クラスター、なら
びに廃水中の別個のクラスターとして見出されるものを包含した。ＭＺ１および
ロドプローブを用いていくつかの大型糸状形態から、弱蛍光が観察された。ＺＲ
Ａプローブとのハイブリダイゼーションは観察されなかった。ＥＵＢによるプロ
ービングは、フロック構造内の粘着集落クラスター、フィラメントおよび個々の
細胞からの強蛍光ハイブリダイゼーションシグナルを生じた。 新規の粘着集落性菌株 選択的濃厚化および分離技法は、一般に、活性スラッジ中に粘着集落クラスタ
ーを形成すると考えられる微生物を単離するために利用されてきた（Unz and Do
ndero, 1967; Unz and Farrah, 1972; Unz, 1984）。これらのアプローチの大き
な限界は、単離された生物体が元の試料中でクラスターを形成しているものであ
ることを立証するのが難しいことである。これは、Zoogloea属の成員を識別する
ために用いられる生化学的特性の欠乏、フロックとして増殖する微生物の能力、
培養条件に影響されるフロック形成傾向、ならびに原因生物が容易に培養できな
い可能性のためである。個々の種の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は、増殖形態（クラス
ター、フィラメントまたは分散細胞）または培養条件とは無関係に保存され、そ
して標的株がうまく単離されたことを立証するために用いられ得る。このアプロ
ーチは、粘着集落クラスター形成に関与する生物体の単離および同定のために、
本試験において用いられ、観察された２つの種類の生物体（ｍｚｔおよびｍｚＬ
菌株）間を識別するのに重要であった。
、ＭＺ１およびロドを用いて、活性スラッジの全細胞（in-situ ）ハイブリダイ
ゼーションを実施した。顕微鏡検査は、可視的粘着集落クラスターが蛍光プロー
ブＥＵＢ、ＭＺ１およびロドにより強陽性をプローブすることを示した。これら
は、フロックと結合する化またはその中に包埋される粘着集落クラスター、なら
びに廃水中の別個のクラスターとして見出されるものを包含した。ＭＺ１および
ロドプローブを用いていくつかの大型糸状形態から、弱蛍光が観察された。ＺＲ
Ａプローブとのハイブリダイゼーションは観察されなかった。ＥＵＢによるプロ
ービングは、フロック構造内の粘着集落クラスター、フィラメントおよび個々の
細胞からの強蛍光ハイブリダイゼーションシグナルを生じた。 新規の粘着集落性菌株 選択的濃厚化および分離技法は、一般に、活性スラッジ中に粘着集落クラスタ
ーを形成すると考えられる微生物を単離するために利用されてきた（Unz and Do
ndero, 1967; Unz and Farrah, 1972; Unz, 1984）。これらのアプローチの大き
な限界は、単離された生物体が元の試料中でクラスターを形成しているものであ
ることを立証するのが難しいことである。これは、Zoogloea属の成員を識別する
ために用いられる生化学的特性の欠乏、フロックとして増殖する微生物の能力、
培養条件に影響されるフロック形成傾向、ならびに原因生物が容易に培養できな
い可能性のためである。個々の種の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は、増殖形態（クラス
ター、フィラメントまたは分散細胞）または培養条件とは無関係に保存され、そ
して標的株がうまく単離されたことを立証するために用いられ得る。このアプロ
ーチは、粘着集落クラスター形成に関与する生物体の単離および同定のために、
本試験において用いられ、観察された２つの種類の生物体（ｍｚｔおよびｍｚＬ
菌株）間を識別するのに重要であった。
【００６２】 活性スラッジ試験に一般的に利用される３つのZoogloea種のうち、Z. ramiger
a ＡＴＣＣ１９５４４だけが、共通発生を示すことが立証されており、高有機負
荷と関連する傾向がある（Rossello-Mora et al., 1995）。しかしながら、個々
に提示した結果は、粘着集落クラスターを形成するいくつかの菌株が今までのと
ころ同定されていない、ということを示す。ｍｚ１ｔ菌株は、比較１６Ｓ ｒＲ
ＮＡ配列分析により確定した場合、前記のZoogloea種とは有意に異なり、タウエ
ラ属に入るべきであると思われる。前記のタウエラ種は２つだけ、即ちT. selen
atis（Macy et al., 1993 ）およびT. aromatica（Anders et al., 1995 ）が存
在する。T. aromaticaは、非常に種々の有機酸および芳香族化合物を、電子受容
体としての硝酸塩とともに、好気的に利用し得る。密接に関連する菌株ｍＸｙＮ
１は、脱窒条件下で、トルエン、ｍ−キシレン、フェニルアセテートおよびアセ
テート上で増殖する（Rabus and Widdel, 1995）。これらの生物体が活性スラッ
ジ中で粘着集落クラスターを形成することは、従来報告されていない。 粘着集落形成クラスターの貧排水可能性との関連 粘着集落クラスターの存在の、貧スラッジ脱水性との相関、ならびに全細胞ハ
イブリダイゼーションを介したクラスター形成生物体としてのｍｚｔ菌株の蛍光
プローブによる立証は、これが、少なくとも１つの廃水処理プラントで観察され
たスラッジ排水問題における原因生物体である、ということを示す。全試験期間
を通して、脱水能力が菌株ｍｚ１ｔの存在と相関し得るか否かを確定するための
保管スラッジ試料のＲＮＡ抽出、ならびにＭＺ１およびロドプローブを用いたス
ロットブロットハイブリダイゼーションにより、さらなる確証が可能である。ｍ
ｚ１ｔは完全に特性化されてはおらず、相対的非特性化タウエラ属の一成員であ
ると思われるが、同定だけからは、その増殖に関与する環境または操作条件、な
らびにその存在に関連した脱水問題を確定することはできない。プラント操作条
件により確定した場合に粘着集落クラスター普及が単純有機酸上での競合的増殖
により専ら確定されるか否か、あるいは好気性条件下での芳香族分解のためのさ
らなる属特異的能力が関与因子であるか否かは、分からない。しかしながら、原
因生物体の純粋培養を得ることができることが、観察されたスラッジ特質問題の
生態学的基礎を説明するためのさらなる実験の実行を可能にする。 プロービング戦略 ズーグレア種プローブロドおよびＭＺ１を設計するに際しては、入れ子式アプ
ローチを用いた。粘着集落クラスターを包含する種の同一性が不明である場合、
考え得る最も広範なプローブを用いるのが望ましい。ロドプローブは、ともに活
性スラッジ中でのクラスター形成に関与することが目下実証されているズーグレ
ア型菌株Z. ramigera ＡＴＣＣ１９５４４およびｍｚ１ｔとハイブリダイズする
。しかしながら、それが同一または類似の配列を有する非標的種（即ち、クラス
ターを形成しない種）とハイブリダイズし得るのは、その広範な特異性によると
考えられる。ＭＺ１プローブはなおさら特異的であり、結果は、必要な場合には
、単一誤対合識別が達成され得ることを示す。しかしながら、このレベルの緊縮
は、標的菌株からの蛍光シグナルの減少を生じ得る。単一誤対合非標識菌株の存
在は、大半の廃水処理プラントにおける問題ではあり得ず、可能性のある単一誤
対合標的としては、主に、密接に関連するアゾアルクス属の成員が挙げられる（
Zhou et al., 1995 ）。使用するための適切なプローブおよび所望レベルの緊縮
は、結局、用途による（Stahl and Amann, 1991 ）。 その他の新規のスラッジ菌株 ｍｚＬ菌株からの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は、この廃水処理プラントからの全Ｄ
ＮＡ抽出物からのＰＣＲ増幅１６Ｓ ｒＤＮＡから得られるその他の１６Ｓ ｒ
ＲＮＡ配列に類似する（データは示されていない）。これらの菌株の役割は、今
までのところ不確実である。蛍光プローブを用いてスラッジフロック中のそれら
の位置を確定し、それらが粘着集落クラスターに関連があるか否かを確定し得る
。
a ＡＴＣＣ１９５４４だけが、共通発生を示すことが立証されており、高有機負
荷と関連する傾向がある（Rossello-Mora et al., 1995）。しかしながら、個々
に提示した結果は、粘着集落クラスターを形成するいくつかの菌株が今までのと
ころ同定されていない、ということを示す。ｍｚ１ｔ菌株は、比較１６Ｓ ｒＲ
ＮＡ配列分析により確定した場合、前記のZoogloea種とは有意に異なり、タウエ
ラ属に入るべきであると思われる。前記のタウエラ種は２つだけ、即ちT. selen
atis（Macy et al., 1993 ）およびT. aromatica（Anders et al., 1995 ）が存
在する。T. aromaticaは、非常に種々の有機酸および芳香族化合物を、電子受容
体としての硝酸塩とともに、好気的に利用し得る。密接に関連する菌株ｍＸｙＮ
１は、脱窒条件下で、トルエン、ｍ−キシレン、フェニルアセテートおよびアセ
テート上で増殖する（Rabus and Widdel, 1995）。これらの生物体が活性スラッ
ジ中で粘着集落クラスターを形成することは、従来報告されていない。 粘着集落形成クラスターの貧排水可能性との関連 粘着集落クラスターの存在の、貧スラッジ脱水性との相関、ならびに全細胞ハ
イブリダイゼーションを介したクラスター形成生物体としてのｍｚｔ菌株の蛍光
プローブによる立証は、これが、少なくとも１つの廃水処理プラントで観察され
たスラッジ排水問題における原因生物体である、ということを示す。全試験期間
を通して、脱水能力が菌株ｍｚ１ｔの存在と相関し得るか否かを確定するための
保管スラッジ試料のＲＮＡ抽出、ならびにＭＺ１およびロドプローブを用いたス
ロットブロットハイブリダイゼーションにより、さらなる確証が可能である。ｍ
ｚ１ｔは完全に特性化されてはおらず、相対的非特性化タウエラ属の一成員であ
ると思われるが、同定だけからは、その増殖に関与する環境または操作条件、な
らびにその存在に関連した脱水問題を確定することはできない。プラント操作条
件により確定した場合に粘着集落クラスター普及が単純有機酸上での競合的増殖
により専ら確定されるか否か、あるいは好気性条件下での芳香族分解のためのさ
らなる属特異的能力が関与因子であるか否かは、分からない。しかしながら、原
因生物体の純粋培養を得ることができることが、観察されたスラッジ特質問題の
生態学的基礎を説明するためのさらなる実験の実行を可能にする。 プロービング戦略 ズーグレア種プローブロドおよびＭＺ１を設計するに際しては、入れ子式アプ
ローチを用いた。粘着集落クラスターを包含する種の同一性が不明である場合、
考え得る最も広範なプローブを用いるのが望ましい。ロドプローブは、ともに活
性スラッジ中でのクラスター形成に関与することが目下実証されているズーグレ
ア型菌株Z. ramigera ＡＴＣＣ１９５４４およびｍｚ１ｔとハイブリダイズする
。しかしながら、それが同一または類似の配列を有する非標的種（即ち、クラス
ターを形成しない種）とハイブリダイズし得るのは、その広範な特異性によると
考えられる。ＭＺ１プローブはなおさら特異的であり、結果は、必要な場合には
、単一誤対合識別が達成され得ることを示す。しかしながら、このレベルの緊縮
は、標的菌株からの蛍光シグナルの減少を生じ得る。単一誤対合非標識菌株の存
在は、大半の廃水処理プラントにおける問題ではあり得ず、可能性のある単一誤
対合標的としては、主に、密接に関連するアゾアルクス属の成員が挙げられる（
Zhou et al., 1995 ）。使用するための適切なプローブおよび所望レベルの緊縮
は、結局、用途による（Stahl and Amann, 1991 ）。 その他の新規のスラッジ菌株 ｍｚＬ菌株からの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は、この廃水処理プラントからの全Ｄ
ＮＡ抽出物からのＰＣＲ増幅１６Ｓ ｒＤＮＡから得られるその他の１６Ｓ ｒ
ＲＮＡ配列に類似する（データは示されていない）。これらの菌株の役割は、今
までのところ不確実である。蛍光プローブを用いてスラッジフロック中のそれら
の位置を確定し、それらが粘着集落クラスターに関連があるか否かを確定し得る
。
【００６３】 実施例２ 粘性スラッジ中のハイフォミクロビウム種の分子分析 ＤＮＡの抽出および精製 変法Ogram ＤＮＡ抽出法により、スラッジからのＤＮＡを抽出した（Ogram et
al., 1987）。スラッジ試料（１５０ｍｌ）を、Ｊ−２１シリーズベックマン遠
心分離器のＪＡ−１４固定角ローター中で６０００ｘｇで１０分間、回転させた
。得られたペレットを５０ｍｌの０．１２Ｍピロリン酸ナトリウム緩衝液（Ｎａ 4 Ｐ2 Ｏ7 ・Ｈ2 Ｏ）、ｐＨ８．０および２．５ｍｌの５％（ｗ／ｖ）ドデシル
硫酸ナトリウム（Ｃ12Ｈ25ＯＳＯ3 Ｎａ）で処理した後、７０℃水浴中に１時間
入れて、１０分毎に手で反転させた。次に、２分間オン、１分間オフそして２分
間オンのパターンで５分間、ビーズビーター中の５ｇの０．１ｍｍガラスビーズ
を用いて、細菌を機械的に粉砕した。次に試料を氷上で冷却し、試料／ガラスビ
ーズ混合物を１０°Ｃで２５分間、６０００ｘｇで遠心分離し、上清を回収した
。５０ｍｌの緩衝液の付加および前記のような遠心分離により、０．１２Ｍピロ
リン酸ナトリウム、ｐＨ８．０で沈渣を連続抽出して、ＤＮＡのさらなる回収を
実行した。上清をプールした。抽出物を、０．１容量の２Ｍ酢酸ナトリウム（Ｎ
ａＣ2 Ｈ3 Ｏ2 ・３Ｈ2 Ｏ）および０．８容量のイソプロパノールを用いて、−
２０℃で沈澱させた。 Savant Speed Vac 濃縮機を用いて沈殿物を遠心分離（１
０，０００ｘｇ、４℃で３０分間）し、乾燥して、残留アルコールを除去した。
乾燥試料をトリスエチレンジアミン四酢酸（ＴＥ）［１０ｍＭトリス、１ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５〜８．０）］緩衝液で再懸濁し、１Ｘ（ＴＥ）緩衝液に対
して透析管（ｍｏｌ重量カットオフ６０００〜８０００）中で一夜透析し（塩の
ような不純物を除去するため）、フェノールで、その後クロロホルム／イソ−ア
ミルアルコール（２４：１）で抽出して、タンパク質を変性した。酢酸ナトリウ
ム（０．１容量の２Ｍ溶液）を付加し、試料を−２０℃でインキュベートして、
ほとんどの腐植土物質を沈澱させた（Ogram et al., 1987）。遠心分離後、上清
を除去し、２容量の無水エタノールを付加して、精製ＤＮＡを沈澱させた。Spee
d Vac 中で試料を遠心分離（１０，０００ｘｇ、４℃で３０分間）し、乾燥して
、エタノールを除去した。乾燥試料を１ｍｌの滅菌ＴＥ緩衝液中に再懸濁した。
Elu-Quick ＤＮＡ精製キット（Schleicher and Schuell, New Hampshire ）を用
いて、ＤＮＡをさらに精製した。精製ＤＮＡをＲＮアーゼで処理し、その後、Ｐ
ＣＲ増幅のために用いた。
al., 1987）。スラッジ試料（１５０ｍｌ）を、Ｊ−２１シリーズベックマン遠
心分離器のＪＡ−１４固定角ローター中で６０００ｘｇで１０分間、回転させた
。得られたペレットを５０ｍｌの０．１２Ｍピロリン酸ナトリウム緩衝液（Ｎａ 4 Ｐ2 Ｏ7 ・Ｈ2 Ｏ）、ｐＨ８．０および２．５ｍｌの５％（ｗ／ｖ）ドデシル
硫酸ナトリウム（Ｃ12Ｈ25ＯＳＯ3 Ｎａ）で処理した後、７０℃水浴中に１時間
入れて、１０分毎に手で反転させた。次に、２分間オン、１分間オフそして２分
間オンのパターンで５分間、ビーズビーター中の５ｇの０．１ｍｍガラスビーズ
を用いて、細菌を機械的に粉砕した。次に試料を氷上で冷却し、試料／ガラスビ
ーズ混合物を１０°Ｃで２５分間、６０００ｘｇで遠心分離し、上清を回収した
。５０ｍｌの緩衝液の付加および前記のような遠心分離により、０．１２Ｍピロ
リン酸ナトリウム、ｐＨ８．０で沈渣を連続抽出して、ＤＮＡのさらなる回収を
実行した。上清をプールした。抽出物を、０．１容量の２Ｍ酢酸ナトリウム（Ｎ
ａＣ2 Ｈ3 Ｏ2 ・３Ｈ2 Ｏ）および０．８容量のイソプロパノールを用いて、−
２０℃で沈澱させた。 Savant Speed Vac 濃縮機を用いて沈殿物を遠心分離（１
０，０００ｘｇ、４℃で３０分間）し、乾燥して、残留アルコールを除去した。
乾燥試料をトリスエチレンジアミン四酢酸（ＴＥ）［１０ｍＭトリス、１ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５〜８．０）］緩衝液で再懸濁し、１Ｘ（ＴＥ）緩衝液に対
して透析管（ｍｏｌ重量カットオフ６０００〜８０００）中で一夜透析し（塩の
ような不純物を除去するため）、フェノールで、その後クロロホルム／イソ−ア
ミルアルコール（２４：１）で抽出して、タンパク質を変性した。酢酸ナトリウ
ム（０．１容量の２Ｍ溶液）を付加し、試料を−２０℃でインキュベートして、
ほとんどの腐植土物質を沈澱させた（Ogram et al., 1987）。遠心分離後、上清
を除去し、２容量の無水エタノールを付加して、精製ＤＮＡを沈澱させた。Spee
d Vac 中で試料を遠心分離（１０，０００ｘｇ、４℃で３０分間）し、乾燥して
、エタノールを除去した。乾燥試料を１ｍｌの滅菌ＴＥ緩衝液中に再懸濁した。
Elu-Quick ＤＮＡ精製キット（Schleicher and Schuell, New Hampshire ）を用
いて、ＤＮＡをさらに精製した。精製ＤＮＡをＲＮアーゼで処理し、その後、Ｐ
ＣＲ増幅のために用いた。
【００６４】 ５０μｇ／ｍｌでの二重鎖ＤＮＡの精製溶液の、２６０ｎｍでの光学密度は、
１．０である（Becker et al., 1990 ）。したがって、Beckman ＤＵ−７０分光
光度計を用いて２６０ｎｍでの吸光度を測定することにより、ＤＮＡ濃度を概算
した。 元々褐色であった試料は、ビーズビーティング後は暗褐色に代わったが、これ
は、ＳＤＳとビーズビーティング中に遊離された熱との組合せにより有機炭素が
放出されたためであると思われる（Ogram et al., 1987）。フェノール−クロロ
ホルムによりＤＮＡをさらに抽出し、そしてエタノール沈澱により濃縮した。暗
褐色の色は劇的に低減されたが、しかしＤＮＡ試料は依然として淡褐色の色を有
しており、これは夾雑物、おそらくは腐植土物質の存在を示す。したがって、El
u-Quick ＤＮＡ精製キットを用いてＤＮＡをさらに精製して、２６０ｎｍおよび
２８０ｎｍで許容可能比の吸光度を得た。分光光度計を用いてＤＮＡを定量する
前に、ＲＮアーゼ処理により試料中のＲＮＡを除去した（Becker et al., 1990
）。１月および１１月スラッジ試料に関するＤＮＡ収量は低く、Ａ２６０／Ａ２
８０比は１．５以下であったが、これは試料中の不純物の存在またはサンプリン
グ後の期間中のＤＮＡの分解のいずれかを示す。 総ＤＮＡの精製のためのQiagenプロトコール： 凍結乾燥法によりスラッジ試料から抽出したＤＮＡを、Qiagenプロトコール（
Qiagen, Chatsworth, CA）により精製した。ＮａＣｌ、７５０ｍＭ；ＭＯＰＳ、
５０ｍＭ；エタノール、１５％；トリトンＸ−１００、０．１５％、ｐＨ７．０
を含有する平衡緩衝液（ＱＢＴ）１０ｍｌを、Qiagenかラムに通した。１０ｍｌ
のＴＥ緩衝液中に再懸濁したＤＮＡを、次にカラムに通した。次にカラムを１５
ｍｌの洗浄１緩衝液（ ＮａＣｌ、５０ｍＭ；ＭＯＰＳ、５０ｍＭ；エタノール
、１５％；ｐＨ７．０）で３回、１５ｍｌの洗浄２緩衝液（ ＮａＣｌ、１００
０ｍＭ；ＭＯＰＳ、５０ｍＭ；エタノール、１５％；ｐＨ７．０）で１回、そし
て１５ｍｌの洗浄３緩衝液（ ＮａＣｌ、１６００ｍＭ；ＭＯＰＳ、５０ｍＭ；
エタノール、１５％；ｐＨ７．０）で１回、洗浄した。各洗浄工程後に溶出液を
保存し、０．７容量のイソプロパノールを用いてＤＮＡを沈澱させ、３０分間遠
心分離した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥して、さらなる分析の
ために１ｍｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。精製の前と後に、２００〜３００
ｎｍの吸光度範囲でＤＮＡ濃度を測定した。 １６Ｓ ｒＤＮＡのＰＣＲ増幅： ほとんどの生物体の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５‘および３’領域中の保存領
域に相補的なプライマーを用いて、ＰＣＲにより活性スラッジ試料の精製ゲノム
ＤＮＡから、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを増幅した。Oligo 1000ＤＮ
Ａ合成機（Beckman, Fullerton, CA）を用いて、プライマー２７ｆ：5'-AGA GTT
TGA TCM TGG CTC AG-3'（配列番号：２１）および１４９２ｒ：5'-TAC GGY TAC
CTT GTT ACG ACT-3' （配列番号：２２）を合成し、そして反応器カラムの固体
支持体から合成プライマーを切り離した。オリゴマーの反応性ホスホリルおよび
アミノ基を遮断する保護基を、ＤＮＡUltra Fasi切断および脱保護キットを用い
て除去した。９９℃で５分間、試料を変性し、その後３８サイクルの変性（９４
℃／１分）、アニーリング（４５℃／１Ｙ分）および伸張（７２℃／１分）＋７
２℃で最終１０分間の伸張による付加サイクルによって、自動熱サイクル機（Pe
rkin Elmer-Cetus）中の１００μｌの反応混合物中で増幅を実施して、ＰＣＲ生
成物の収量を増大し、ＰＣＲ生成物の真下のゲル（Promega, Madison,WI ）上に
観察される微量のスミアを低減した。増幅試料を４℃で保存した。鋳型ＤＮＡを
付加しない陰性対照も含まれた。 表４：１６Ｓ ｒＲＮＡシーケンシングプライマーおよびそれらの特異性。ｍ１
３ｆ（−４０）およびｍ１３ｒに関する配列は、Invitrogenマニュアルから再生
された。他の配列はすべて、Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systemati
cs（Stackebrandt et al., 1991 ）から再生された。プライマー２７ｆ、１４９
２ｒおよび１５２５ｒは、総ＤＮＡからの１６Ｓ ｒＤＮＡの増幅のために用い
られた。プライマー５３０ｆ、９０７ｒ、９２６ｆ、１４９２ｒ、ｍ１３ｆ（−
４０）およびｍ１３ｒは、１６Ｓ ｒＤＮＡシーケンシングのために用いられた
。
１．０である（Becker et al., 1990 ）。したがって、Beckman ＤＵ−７０分光
光度計を用いて２６０ｎｍでの吸光度を測定することにより、ＤＮＡ濃度を概算
した。 元々褐色であった試料は、ビーズビーティング後は暗褐色に代わったが、これ
は、ＳＤＳとビーズビーティング中に遊離された熱との組合せにより有機炭素が
放出されたためであると思われる（Ogram et al., 1987）。フェノール−クロロ
ホルムによりＤＮＡをさらに抽出し、そしてエタノール沈澱により濃縮した。暗
褐色の色は劇的に低減されたが、しかしＤＮＡ試料は依然として淡褐色の色を有
しており、これは夾雑物、おそらくは腐植土物質の存在を示す。したがって、El
u-Quick ＤＮＡ精製キットを用いてＤＮＡをさらに精製して、２６０ｎｍおよび
２８０ｎｍで許容可能比の吸光度を得た。分光光度計を用いてＤＮＡを定量する
前に、ＲＮアーゼ処理により試料中のＲＮＡを除去した（Becker et al., 1990
）。１月および１１月スラッジ試料に関するＤＮＡ収量は低く、Ａ２６０／Ａ２
８０比は１．５以下であったが、これは試料中の不純物の存在またはサンプリン
グ後の期間中のＤＮＡの分解のいずれかを示す。 総ＤＮＡの精製のためのQiagenプロトコール： 凍結乾燥法によりスラッジ試料から抽出したＤＮＡを、Qiagenプロトコール（
Qiagen, Chatsworth, CA）により精製した。ＮａＣｌ、７５０ｍＭ；ＭＯＰＳ、
５０ｍＭ；エタノール、１５％；トリトンＸ−１００、０．１５％、ｐＨ７．０
を含有する平衡緩衝液（ＱＢＴ）１０ｍｌを、Qiagenかラムに通した。１０ｍｌ
のＴＥ緩衝液中に再懸濁したＤＮＡを、次にカラムに通した。次にカラムを１５
ｍｌの洗浄１緩衝液（ ＮａＣｌ、５０ｍＭ；ＭＯＰＳ、５０ｍＭ；エタノール
、１５％；ｐＨ７．０）で３回、１５ｍｌの洗浄２緩衝液（ ＮａＣｌ、１００
０ｍＭ；ＭＯＰＳ、５０ｍＭ；エタノール、１５％；ｐＨ７．０）で１回、そし
て１５ｍｌの洗浄３緩衝液（ ＮａＣｌ、１６００ｍＭ；ＭＯＰＳ、５０ｍＭ；
エタノール、１５％；ｐＨ７．０）で１回、洗浄した。各洗浄工程後に溶出液を
保存し、０．７容量のイソプロパノールを用いてＤＮＡを沈澱させ、３０分間遠
心分離した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥して、さらなる分析の
ために１ｍｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。精製の前と後に、２００〜３００
ｎｍの吸光度範囲でＤＮＡ濃度を測定した。 １６Ｓ ｒＤＮＡのＰＣＲ増幅： ほとんどの生物体の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５‘および３’領域中の保存領
域に相補的なプライマーを用いて、ＰＣＲにより活性スラッジ試料の精製ゲノム
ＤＮＡから、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを増幅した。Oligo 1000ＤＮ
Ａ合成機（Beckman, Fullerton, CA）を用いて、プライマー２７ｆ：5'-AGA GTT
TGA TCM TGG CTC AG-3'（配列番号：２１）および１４９２ｒ：5'-TAC GGY TAC
CTT GTT ACG ACT-3' （配列番号：２２）を合成し、そして反応器カラムの固体
支持体から合成プライマーを切り離した。オリゴマーの反応性ホスホリルおよび
アミノ基を遮断する保護基を、ＤＮＡUltra Fasi切断および脱保護キットを用い
て除去した。９９℃で５分間、試料を変性し、その後３８サイクルの変性（９４
℃／１分）、アニーリング（４５℃／１Ｙ分）および伸張（７２℃／１分）＋７
２℃で最終１０分間の伸張による付加サイクルによって、自動熱サイクル機（Pe
rkin Elmer-Cetus）中の１００μｌの反応混合物中で増幅を実施して、ＰＣＲ生
成物の収量を増大し、ＰＣＲ生成物の真下のゲル（Promega, Madison,WI ）上に
観察される微量のスミアを低減した。増幅試料を４℃で保存した。鋳型ＤＮＡを
付加しない陰性対照も含まれた。 表４：１６Ｓ ｒＲＮＡシーケンシングプライマーおよびそれらの特異性。ｍ１
３ｆ（−４０）およびｍ１３ｒに関する配列は、Invitrogenマニュアルから再生
された。他の配列はすべて、Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systemati
cs（Stackebrandt et al., 1991 ）から再生された。プライマー２７ｆ、１４９
２ｒおよび１５２５ｒは、総ＤＮＡからの１６Ｓ ｒＤＮＡの増幅のために用い
られた。プライマー５３０ｆ、９０７ｒ、９２６ｆ、１４９２ｒ、ｍ１３ｆ（−
４０）およびｍ１３ｒは、１６Ｓ ｒＤＮＡシーケンシングのために用いられた
。
【００６５】
【表４】
【００６６】 ＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動 ＰＣＲ増幅生成物（２０μｌ）および２．５μｌの体質染料［５０％グリセロ
ール、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．２５％ブロモフェノールブルーお
よび０．２５％キシレンシアノール］をウエルに入れて、１ＸＴＢＥ［１０ＸＴ
ＢＥストック溶液（トリス塩基１０８ｇ；ホウ酸、５５ｇ；ＥＤＴＡ、二ナトリ
ウム塩（Ｃ10Ｈ14Ｏ8 Ｎ2 Ｎａ2 ・２Ｈ2 Ｏ）、０．５Ｍ；および蒸留水、１リ
ットル；ｐＨ８．０）から調製］中の１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上を、８０
Ｖで焼く２時間走行させて（Sambrook et al., 1989 ）、それを同一ゲル上を走
行させたＤＮＡ分子量マーカーと比較することにより、約１５００ｂｐの１６Ｓ
ｒＤＮＡ断片の存在に関して検査した。次にゲルを臭化エチジウム（０．５μ
ｇ／ｍｌ）で２０分間染色し、脱イオン水で２０〜３０分間脱色した。次に、脱
色ゲルをFotoＵＶ３００ＤＮＡトランスイルミネーター（Fotodyne, New Berlin
, WI）で可視化して、臭化エチジウム−ＤＮＡ複合体をポラロイドカメラで撮影
した。以下に記載するように、増幅１６Ｓ ｒＤＮＡのさらなる精製のために、
いくつかのアプローチを比較した。 ＰＣＲ増幅１６Ｓ ｒＤＮＡの精製のためのAgarACE プロトコール： AgarACE プロトコール（Promega, Madison,WI ）により、ＰＣＲ増幅１６Ｓ
ｒＤＮＡをさらに精製した。１Ｘ ＴＢＥ溶液中の１％（ｗ／ｖ）アガロースゲ
ル上を、８０Ｖで約２時間、ＰＣＲ増幅生成物を走行させた。１５００ｂｐの１
６Ｓ ｒＤＮＡ断片の正面にスロットを切り、スロットを１．８％ＬＭＰアガロ
ースで充填した。必要なバンドがＬＭＰアガロースに入り込むまで８０Ｖでゲル
を再び走行させて、これを切断し、６５℃でエッペンドルフ管中で溶融させた。
１単位のAgarACE （５μｌ）を溶融アガロースに付加し、一夜インキュベートし
た。AgarACI 処理ＰＣＲ生成物をフェノール／クロロホルム抽出により精製し、
０．１容量の酢酸ナトリウムおよび２容量のエタノール中で２時間、沈澱させた
。沈澱生成物を１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離（４℃）して、Speed Va
c で２０分間乾燥した。乾燥試料を２００μｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁し、さら
なる分析のために用いた。 ＰＣＲ増幅１６Ｓ ｒＤＮＡの精製のためのスピンカラムプロトコール： １Ｘ ＴＢＥ溶液中の１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上を、８０Ｖで約２時間
、ＰＣＲ増幅生成物を走行させた。１５００ｂｐの１６Ｓ ｒＤＮＡ断片を切り
取り、上面にフィルターを備えたバイアル中で冷蔵庫で一夜保存した。次に、Ｐ
ＣＲ生成物を１４，０００ｘｇで４℃で１５分間遠心分離した。管の底の液体を
収集後、上面フィルターを除去した。酢酸カリウム（０．１容量）およびエタノ
ール（３容量）を管の底の概算容量に付加し、少なくとも３０分間、冷凍庫中で
保存した。次に沈澱試料を１４，０００ｘｇで１５分間遠心分離（４℃）して、
７０％エタノールで洗浄し、Speed Vac で乾燥した。乾燥試料を１０μｌの滅菌
ＴＥ緩衝液中に再懸濁し、さらなる分析のために用いた。 ＰＣＲ増幅１６Ｓ ｒＤＮＡの精製のための電気溶離プロトコール： 並んだ２つのウエル中で０．８％アガロースゲル上を、８０Ｖで、ＰＣＲ増幅
生成物（各々３５μｌ）を走行させた。１５００ｂｐバンド周囲のゲルを切り取
り、１ｍｌのＴＥ緩衝液を含有する透析袋中に移した。切り出したゲル中の所望
のバンドがＴＥ緩衝液中に移動するまで、ゲルを再び走行させた。ＰＣＲ生成物
を含有するＴＥ緩衝液は、さらなる分析のために用いられた。 １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング： Original TA クローニングキット（Invitrogen, San Diego, CA ）を用いるこ
とにより、ＰＣＲで増幅された１６Ｓ ｒＤＮＡ断片をプラスミドベクターに結
紮した。蒸留水、５μｌ；結紮緩衝液、１μｌ；ベクター、２μｌ；鋳型ＤＮＡ
、１μｌ；およびＤＮＡリガーゼ、０．５μｌから成る反応混合物（１０μｌ）
を１２℃で一夜インキュベートし、一段階ＴＡクローニング戦略を用いてプラス
ミドでＩＮＶαＦ‘コンピテント細胞を形質転換した。凍結ワンショットコンピ
テント細胞（５０μ）を２μｌの０．５Ｍβ−メルカプトエタノールおよび２μ
ｌの結紮反応物と混合した。反応混合物を氷上で３０分間インキュベートし、４
２℃水浴中で正確に４５秒間（その後メーカーにより３０秒に変更された）、熱
ショック処理を細胞に施し、次に細胞懸濁液を氷上に２分間置いた。２５０μｌ
のＳＯＣ培地（室温）中の細胞懸濁液のアリコートを、アンピシリン（５０μｇ
／ｍｌ）および２５μの４０ｍｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌを含有するルリアベルター
ニ（ＬＢ）寒天培地（トリプシン、１０ｇ／ｌ；酵母菌抽出物、５ｇ／ｌ；Ｎａ
Ｃｌ、１０ｇ／ｌ；寒天１７％蒸留水１リットル、ｐＨ７．５）上に載せて、３
７℃で３０分間平衡させ、３７℃で一夜インキュベートした。適正な発色のため
に寒天平板を４℃に２〜３時間移した後、分析のためにコロニーを選択した。 クローンからの１６Ｓ ｒＤＮＡのＰＣＲ増幅： 滅菌爪楊枝を用いて摘み取った白色コロニーを、アンピシリンを含有するＬＢ
寒天上に画線した。次に画線化コロニーを、ＳＰ６およびＴ７プライマーを用い
て１６Ｓ ｒＤＮＡのＰＣＲ増幅により全長（１５００ｂｐ）１６Ｓ ｒＤＮＡ
挿入物を含有するプラスミドに関してスクリーニングして、ＴＡクローニング挿
入物と大腸菌からの１６Ｓ ｒＤＮＡとを区別した。前記のようにプライマーを
合成し、精製した。増幅生成物を、前記のように１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル
上を走行させて、陽性クローンが１６Ｓ ｒＤＮＡプラスミド挿入物を有するこ
とを立証した。 挿入物を有する菌株からのMidprep プラスミド調製 １６Ｓ ｒＤＮＡのその後の配列分析に必要な大量のプラスミドＤＮＡを調製
した。プラスミドを含有する細菌を大規模（１２５ｍｌ）に増殖させて、収穫し
、変法Promega midiprepプラスミド調製法（Promega, Madison, WI）により溶解
した。
ール、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．２５％ブロモフェノールブルーお
よび０．２５％キシレンシアノール］をウエルに入れて、１ＸＴＢＥ［１０ＸＴ
ＢＥストック溶液（トリス塩基１０８ｇ；ホウ酸、５５ｇ；ＥＤＴＡ、二ナトリ
ウム塩（Ｃ10Ｈ14Ｏ8 Ｎ2 Ｎａ2 ・２Ｈ2 Ｏ）、０．５Ｍ；および蒸留水、１リ
ットル；ｐＨ８．０）から調製］中の１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上を、８０
Ｖで焼く２時間走行させて（Sambrook et al., 1989 ）、それを同一ゲル上を走
行させたＤＮＡ分子量マーカーと比較することにより、約１５００ｂｐの１６Ｓ
ｒＤＮＡ断片の存在に関して検査した。次にゲルを臭化エチジウム（０．５μ
ｇ／ｍｌ）で２０分間染色し、脱イオン水で２０〜３０分間脱色した。次に、脱
色ゲルをFotoＵＶ３００ＤＮＡトランスイルミネーター（Fotodyne, New Berlin
, WI）で可視化して、臭化エチジウム−ＤＮＡ複合体をポラロイドカメラで撮影
した。以下に記載するように、増幅１６Ｓ ｒＤＮＡのさらなる精製のために、
いくつかのアプローチを比較した。 ＰＣＲ増幅１６Ｓ ｒＤＮＡの精製のためのAgarACE プロトコール： AgarACE プロトコール（Promega, Madison,WI ）により、ＰＣＲ増幅１６Ｓ
ｒＤＮＡをさらに精製した。１Ｘ ＴＢＥ溶液中の１％（ｗ／ｖ）アガロースゲ
ル上を、８０Ｖで約２時間、ＰＣＲ増幅生成物を走行させた。１５００ｂｐの１
６Ｓ ｒＤＮＡ断片の正面にスロットを切り、スロットを１．８％ＬＭＰアガロ
ースで充填した。必要なバンドがＬＭＰアガロースに入り込むまで８０Ｖでゲル
を再び走行させて、これを切断し、６５℃でエッペンドルフ管中で溶融させた。
１単位のAgarACE （５μｌ）を溶融アガロースに付加し、一夜インキュベートし
た。AgarACI 処理ＰＣＲ生成物をフェノール／クロロホルム抽出により精製し、
０．１容量の酢酸ナトリウムおよび２容量のエタノール中で２時間、沈澱させた
。沈澱生成物を１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離（４℃）して、Speed Va
c で２０分間乾燥した。乾燥試料を２００μｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁し、さら
なる分析のために用いた。 ＰＣＲ増幅１６Ｓ ｒＤＮＡの精製のためのスピンカラムプロトコール： １Ｘ ＴＢＥ溶液中の１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上を、８０Ｖで約２時間
、ＰＣＲ増幅生成物を走行させた。１５００ｂｐの１６Ｓ ｒＤＮＡ断片を切り
取り、上面にフィルターを備えたバイアル中で冷蔵庫で一夜保存した。次に、Ｐ
ＣＲ生成物を１４，０００ｘｇで４℃で１５分間遠心分離した。管の底の液体を
収集後、上面フィルターを除去した。酢酸カリウム（０．１容量）およびエタノ
ール（３容量）を管の底の概算容量に付加し、少なくとも３０分間、冷凍庫中で
保存した。次に沈澱試料を１４，０００ｘｇで１５分間遠心分離（４℃）して、
７０％エタノールで洗浄し、Speed Vac で乾燥した。乾燥試料を１０μｌの滅菌
ＴＥ緩衝液中に再懸濁し、さらなる分析のために用いた。 ＰＣＲ増幅１６Ｓ ｒＤＮＡの精製のための電気溶離プロトコール： 並んだ２つのウエル中で０．８％アガロースゲル上を、８０Ｖで、ＰＣＲ増幅
生成物（各々３５μｌ）を走行させた。１５００ｂｐバンド周囲のゲルを切り取
り、１ｍｌのＴＥ緩衝液を含有する透析袋中に移した。切り出したゲル中の所望
のバンドがＴＥ緩衝液中に移動するまで、ゲルを再び走行させた。ＰＣＲ生成物
を含有するＴＥ緩衝液は、さらなる分析のために用いられた。 １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング： Original TA クローニングキット（Invitrogen, San Diego, CA ）を用いるこ
とにより、ＰＣＲで増幅された１６Ｓ ｒＤＮＡ断片をプラスミドベクターに結
紮した。蒸留水、５μｌ；結紮緩衝液、１μｌ；ベクター、２μｌ；鋳型ＤＮＡ
、１μｌ；およびＤＮＡリガーゼ、０．５μｌから成る反応混合物（１０μｌ）
を１２℃で一夜インキュベートし、一段階ＴＡクローニング戦略を用いてプラス
ミドでＩＮＶαＦ‘コンピテント細胞を形質転換した。凍結ワンショットコンピ
テント細胞（５０μ）を２μｌの０．５Ｍβ−メルカプトエタノールおよび２μ
ｌの結紮反応物と混合した。反応混合物を氷上で３０分間インキュベートし、４
２℃水浴中で正確に４５秒間（その後メーカーにより３０秒に変更された）、熱
ショック処理を細胞に施し、次に細胞懸濁液を氷上に２分間置いた。２５０μｌ
のＳＯＣ培地（室温）中の細胞懸濁液のアリコートを、アンピシリン（５０μｇ
／ｍｌ）および２５μの４０ｍｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌを含有するルリアベルター
ニ（ＬＢ）寒天培地（トリプシン、１０ｇ／ｌ；酵母菌抽出物、５ｇ／ｌ；Ｎａ
Ｃｌ、１０ｇ／ｌ；寒天１７％蒸留水１リットル、ｐＨ７．５）上に載せて、３
７℃で３０分間平衡させ、３７℃で一夜インキュベートした。適正な発色のため
に寒天平板を４℃に２〜３時間移した後、分析のためにコロニーを選択した。 クローンからの１６Ｓ ｒＤＮＡのＰＣＲ増幅： 滅菌爪楊枝を用いて摘み取った白色コロニーを、アンピシリンを含有するＬＢ
寒天上に画線した。次に画線化コロニーを、ＳＰ６およびＴ７プライマーを用い
て１６Ｓ ｒＤＮＡのＰＣＲ増幅により全長（１５００ｂｐ）１６Ｓ ｒＤＮＡ
挿入物を含有するプラスミドに関してスクリーニングして、ＴＡクローニング挿
入物と大腸菌からの１６Ｓ ｒＤＮＡとを区別した。前記のようにプライマーを
合成し、精製した。増幅生成物を、前記のように１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル
上を走行させて、陽性クローンが１６Ｓ ｒＤＮＡプラスミド挿入物を有するこ
とを立証した。 挿入物を有する菌株からのMidprep プラスミド調製 １６Ｓ ｒＤＮＡのその後の配列分析に必要な大量のプラスミドＤＮＡを調製
した。プラスミドを含有する細菌を大規模（１２５ｍｌ）に増殖させて、収穫し
、変法Promega midiprepプラスミド調製法（Promega, Madison, WI）により溶解
した。
【００６７】 振盪インキュベーター（Labline Instruments Inc., Melrose Park, IL）中で
、３７℃でカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）の存在下で１２５ｍｌのＬＢブロス
中で、細菌を一夜増殖させた。−８０℃で３０％滅菌グリセロール０．５ｍｌを
有する極低温管中に細胞（０．５ｍｌ）を保存し、残りの試料を、１０°Ｃで１
０分間、８，０００ｘｇで遠心分離した。得られたペレットを３ｍｌの冷溶解緩
衝液中に再懸濁した。６ｍｌの新たに調製した０．２Ｎ水酸化ナトリウム（Ｎａ
ＯＨ）、１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｃ12Ｈ25ＯＳＯ3 Ｎａ）および３．７５
ｍｌの５Ｍ酢酸カリウム（ＫＣ2 Ｈ3 Ｏ2 ）を付加し、混合物を１０，０００ｘ
ｇで３０分間遠心分離した。等容量のイソプロパノールを上清に付加し、試料を
１０，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。ペレットを７０％エタノールで洗浄
し、Speed Vac で乾燥した。乾燥ペレットをＲＮアーゼ処理し、フェノールクロ
ロホルム抽出により精製した。精製プラスミドを乾燥し、２００μｌのＴＥ緩衝
液中に再懸濁して、−８０℃で保存した。 １６Ｓ ｒＤＮＡシーケンシング： １４９２ｒプライマーを用いて、単一プライマー伸長法により、約４００ｂｐ
の１．５ｋｂ １６Ｓ ｒＤＮＡ分子に関して、挿入物を含有するプラスミド３
０μｌをシーケンシングした（表４）。活性スラッジ単離物から増幅された全長
（１５００ｂｐ）１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を、プライマーｍ１３ｆ（配列番号：４
１）、５３０ｆ（配列番号：３０）、９０７ｒ（配列番号：３３）およびｍ１３
ｒ（配列番号：４２）を用いて確定した（表４）。プライマーはすべて、Oligo
1000ＤＮＡ合成機を用いて合成した。 １６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析： 異なるソフトウエアパッケージを用いて、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を分析した。
リボソームデータベースプロジェクトRibosomal Database Projectに利用可能な
SIMILARITY RANK ソフトウエアを用いて、小サブユニット原核細胞（SSU −Prok
）ｒＲＮＡデータベース中の全生物体に対して、配列を等級分けした（Maidak e
t al., 1997, Van de Peer et al., 1997 ）。Genetics Computer Group （ＧＣ
Ｇ）配列分析ソフトウエアパッケージ（UNIXでバージョン８．１）を用いて、類
似性により配列を群分けして、系統樹を作った。積み上げ関数を用いて、漸進的
対方式整列を用いた関連配列の一群からの多配列整列を作製した。次に、多配列
フォーマット（ｍｓｆ）ファイルを分析して、所望の標的菌株に特異的なオリゴ
ヌクレオチドプローブを作製した。
、３７℃でカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）の存在下で１２５ｍｌのＬＢブロス
中で、細菌を一夜増殖させた。−８０℃で３０％滅菌グリセロール０．５ｍｌを
有する極低温管中に細胞（０．５ｍｌ）を保存し、残りの試料を、１０°Ｃで１
０分間、８，０００ｘｇで遠心分離した。得られたペレットを３ｍｌの冷溶解緩
衝液中に再懸濁した。６ｍｌの新たに調製した０．２Ｎ水酸化ナトリウム（Ｎａ
ＯＨ）、１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｃ12Ｈ25ＯＳＯ3 Ｎａ）および３．７５
ｍｌの５Ｍ酢酸カリウム（ＫＣ2 Ｈ3 Ｏ2 ）を付加し、混合物を１０，０００ｘ
ｇで３０分間遠心分離した。等容量のイソプロパノールを上清に付加し、試料を
１０，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。ペレットを７０％エタノールで洗浄
し、Speed Vac で乾燥した。乾燥ペレットをＲＮアーゼ処理し、フェノールクロ
ロホルム抽出により精製した。精製プラスミドを乾燥し、２００μｌのＴＥ緩衝
液中に再懸濁して、−８０℃で保存した。 １６Ｓ ｒＤＮＡシーケンシング： １４９２ｒプライマーを用いて、単一プライマー伸長法により、約４００ｂｐ
の１．５ｋｂ １６Ｓ ｒＤＮＡ分子に関して、挿入物を含有するプラスミド３
０μｌをシーケンシングした（表４）。活性スラッジ単離物から増幅された全長
（１５００ｂｐ）１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を、プライマーｍ１３ｆ（配列番号：４
１）、５３０ｆ（配列番号：３０）、９０７ｒ（配列番号：３３）およびｍ１３
ｒ（配列番号：４２）を用いて確定した（表４）。プライマーはすべて、Oligo
1000ＤＮＡ合成機を用いて合成した。 １６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析： 異なるソフトウエアパッケージを用いて、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を分析した。
リボソームデータベースプロジェクトRibosomal Database Projectに利用可能な
SIMILARITY RANK ソフトウエアを用いて、小サブユニット原核細胞（SSU −Prok
）ｒＲＮＡデータベース中の全生物体に対して、配列を等級分けした（Maidak e
t al., 1997, Van de Peer et al., 1997 ）。Genetics Computer Group （ＧＣ
Ｇ）配列分析ソフトウエアパッケージ（UNIXでバージョン８．１）を用いて、類
似性により配列を群分けして、系統樹を作った。積み上げ関数を用いて、漸進的
対方式整列を用いた関連配列の一群からの多配列整列を作製した。次に、多配列
フォーマット（ｍｓｆ）ファイルを分析して、所望の標的菌株に特異的なオリゴ
ヌクレオチドプローブを作製した。
【００６８】 ディスタンスマトリックス法を基礎にした系統発生樹を整列配列から構築した
。α、β、γおよびδサブクラスのプロテオバクテリウム、サイトファガレス／
フラボバクター／フレキシバクター群、ならびに低（Ｇ＋Ｃ）含量を有するグラ
ム陽性生物から成る細菌領域の種族に属する生物体が、活性スラッジの分析した
３つの試料すべてに見出された。分析した月別試料中の細菌集団に差異が見出さ
れた。４月は、プロテオバクテリウムのαサブクラスに属する生物体（５０％）
が、βサブクラス（２３％）、γサブクラス（３．８５％）、サイトファガレス
（１１．５４％）、低Ｇ＋Ｃ（３．８５％）、ならびに未知の生物体（７．７％
）より優勢であった。しかしながら、１月は、βサブクラスのプロテオバクテリ
ウム（４４％）を示すクローンが、α（２０％）およびγ（２０％）サブクラス
、サイトファガレス群（４％）、δサブクラス（４％）および未知群（８％）よ
り優勢であった。１１月は、プロテオバクテリウムのαサブクラスの成員（３１
．２５％）が、β（１８．７５％）およびγ（３．８５％）サブクラス、サイト
ファガレス群（２５％）、低Ｇ＋Ｃ群（１２．５％）および未知群（１２．５％
）より優勢であった。
。α、β、γおよびδサブクラスのプロテオバクテリウム、サイトファガレス／
フラボバクター／フレキシバクター群、ならびに低（Ｇ＋Ｃ）含量を有するグラ
ム陽性生物から成る細菌領域の種族に属する生物体が、活性スラッジの分析した
３つの試料すべてに見出された。分析した月別試料中の細菌集団に差異が見出さ
れた。４月は、プロテオバクテリウムのαサブクラスに属する生物体（５０％）
が、βサブクラス（２３％）、γサブクラス（３．８５％）、サイトファガレス
（１１．５４％）、低Ｇ＋Ｃ（３．８５％）、ならびに未知の生物体（７．７％
）より優勢であった。しかしながら、１月は、βサブクラスのプロテオバクテリ
ウム（４４％）を示すクローンが、α（２０％）およびγ（２０％）サブクラス
、サイトファガレス群（４％）、δサブクラス（４％）および未知群（８％）よ
り優勢であった。１１月は、プロテオバクテリウムのαサブクラスの成員（３１
．２５％）が、β（１８．７５％）およびγ（３．８５％）サブクラス、サイト
ファガレス群（２５％）、低Ｇ＋Ｃ群（１２．５％）および未知群（１２．５％
）より優勢であった。
【００６９】 データベース中の既知の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列のいずれかと同一のクローンは
なかった。 ハイフォミクロビウム種プローブ設計： 積み上げ関数を用いて、漸進的対方式整列を用いた関連配列の一群からの多配
列整列を作製した。置換／１００塩基として表される整列化配列間の対方式進化
距離を、ＧＣＧパッケージの距離関数から得た。次に、１６Ｓ ｒＤＮＡスラッ
ジライブラリー中のクローン化配列のすべての多配列整列を含有する多配列フォ
ーマット（ｍｓｆ）ファイルを分析して、オリゴヌクレオチドプローブを作製し
た。ＲＤＰから回収されたHyphomicrobium vulgareおよびハイフォミクロビウム
様生物体１６Ｓ ｒＤＮＡ配列に関する特徴ヌクレオチド［5' GCT GC （C/G ）
CAT TGT CAC CGC C 3'］を同定した。活性スラッジの試料から作製された１６Ｓ
ｒＤＮＡライブラリー中、ならびに多配列整列により確定されたようなＲＤＰ
配列で観察されたようなハイフォミクロビウム菌株の縮重を包含するよう、プロ
ーブの縮重を設計した。 ハイフォミクロビウム種からの１６Ｓ ｒＤＮＡの配列分析 配列結果をさらに確認するために、活性スラッジから単離したハイフォミクロ
ビウムＭ３の３つの同一試料から、１６Ｓ ｒＤＮＡを増幅した。最初に、陽性
クローンからの１６Ｓ ｒＤＮＡを、 ｍ１３ｆ（配列番号：４１）、９２６ｆ
（配列番号：３４）およびｍ１３ｒ（配列番号：４２）プライマーを用いて、部
分的にシーケンシングした。配列は、ほんの４５％の類似性で、Hyphomicrobium
vulgareを整列させた。
なかった。 ハイフォミクロビウム種プローブ設計： 積み上げ関数を用いて、漸進的対方式整列を用いた関連配列の一群からの多配
列整列を作製した。置換／１００塩基として表される整列化配列間の対方式進化
距離を、ＧＣＧパッケージの距離関数から得た。次に、１６Ｓ ｒＤＮＡスラッ
ジライブラリー中のクローン化配列のすべての多配列整列を含有する多配列フォ
ーマット（ｍｓｆ）ファイルを分析して、オリゴヌクレオチドプローブを作製し
た。ＲＤＰから回収されたHyphomicrobium vulgareおよびハイフォミクロビウム
様生物体１６Ｓ ｒＤＮＡ配列に関する特徴ヌクレオチド［5' GCT GC （C/G ）
CAT TGT CAC CGC C 3'］を同定した。活性スラッジの試料から作製された１６Ｓ
ｒＤＮＡライブラリー中、ならびに多配列整列により確定されたようなＲＤＰ
配列で観察されたようなハイフォミクロビウム菌株の縮重を包含するよう、プロ
ーブの縮重を設計した。 ハイフォミクロビウム種からの１６Ｓ ｒＤＮＡの配列分析 配列結果をさらに確認するために、活性スラッジから単離したハイフォミクロ
ビウムＭ３の３つの同一試料から、１６Ｓ ｒＤＮＡを増幅した。最初に、陽性
クローンからの１６Ｓ ｒＤＮＡを、 ｍ１３ｆ（配列番号：４１）、９２６ｆ
（配列番号：３４）およびｍ１３ｒ（配列番号：４２）プライマーを用いて、部
分的にシーケンシングした。配列は、ほんの４５％の類似性で、Hyphomicrobium
vulgareを整列させた。
【００７０】 ハイフォミクロビウムプローブの考え得る標的部位の後ろに９２６ｆプライマ
ーを用いて得られた配列を欠失することにより、配列を編集し、この配列を、１
４９２コンセンサス領域までｍ１３ｒプライマーを用いて得られた配列の相補的
鎖と置き換えた。これは、同一単離物からの複製配列間の（７５％から９９％に
）、そしてＲＤＰデータベース［ハイフォミクロビウム様生物体（ＵＳ３５３菌
株）とHyphomicrobium vulgareの両方に対して７０％を上回る］中の発表済みの
配列とも、類似性％の猛烈な増大をもたらした。
ーを用いて得られた配列を欠失することにより、配列を編集し、この配列を、１
４９２コンセンサス領域までｍ１３ｒプライマーを用いて得られた配列の相補的
鎖と置き換えた。これは、同一単離物からの複製配列間の（７５％から９９％に
）、そしてＲＤＰデータベース［ハイフォミクロビウム様生物体（ＵＳ３５３菌
株）とHyphomicrobium vulgareの両方に対して７０％を上回る］中の発表済みの
配列とも、類似性％の猛烈な増大をもたらした。
【００７１】 次に、５３０ｆおよび９０７ｒシーケンシングプライマーを用いて２つの陽性
クローン（３Ｍ３および６Ｍ３）をシーケンシングして、１６Ｓ ｒＤＮＡの完
全（〜１５００ｂｐ）配列を得た。これらのクローンのＲＤＰデータベース中の
参照細菌との比較は、 ハイフォミクロビウム様生物体ＵＳ３５３菌株およびHy
phomicrobium vulgareとのそれらの関連性を示した。 蛍光in-situ ハイブリダイゼーション 生物体： ハイフォミクロビウムＭ３株を活性スラッジから単離した。ハイフォミクロビ
ウムＭＣ−７５０（ＡＴＣＣ２７５００）およびZoogloea ramigera （ＡＴＣＣ
２５９３５）はアメリカ培養細胞コレクション（ＡＴＣＣ）から、Sphingomonas
capsulatea （ＡＴＣＣ１４６６６）はCenter for Environmental Biotechnolo
gy, University of Tennessee, Knoxvilleから入手した。Bradyrhizobium japon
icum（ＵＳＤＡ１１０）は、Dept. of Microbiology, University of Tennessee
, Knoxville から入手した。スフィンゴモナス種Ａ８ＡＮ３株および大腸菌は、
Center for Environmental Biotechnology, University of Tennessee, Knoxvil
leの培養コレクションから入手した。本発明のハイブリダイゼーション法は、そ
の他の細菌に適用可能である。 細胞の培養： ＡＴＣＣ培地６５６［ＫＨ2 ＰＯ4 、１．３６ｇ／ｌ；Ｎａ2 ＨＰＯ4 、２．
１５ｇ／ｌ；（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、０．５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．
２ｇ／ｌ；微量元素溶液（ＣｕＣｌ2 、０．１５ｇ；ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０
．１ｇ；ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ、０．０３５ｇ；Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ、０．
０５ｇ；蒸留水、１００ｍｌ）５．０ｍｌ／ｌ；フィルター滅菌処理塩酸メチル
アミン、３．３８ｇ／ｌ；Agar Noble（Difco 0142）、１８．０ｇ／ｌ；蒸留水
、１リットル；ｐＨ７．１］上で、３０℃でハイフォミクロビウム菌株を、ＲＤ
Ｙ培地［酵母菌抽出物、１ｇ／ｌ；Ｋ2 ＨＰＯ4 、０．１２ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ4 、０．１ｇ／ｌ；微量元素（Ｈ3 ＢＯ3 、３ｇ／ｌ；ＭｎＳＯ4 ・４Ｈ2 Ｏ、２
．２３ｇ／ｌ；ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．２９ｇ／ｌ；ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ
、０．１２５ｇ／ｌ；ＣｏＣｌ2 、０．０６５ｇ／ｌ；Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ、０．１２ｇ／ｌ；１ｍＭのＦｅＣｌ3 ）、１ｍｌ／ｌ；Ｌ−グルタメート、
１．０ｇ／ｌ；Ｎａ−グルコノエート、５．０ｇ／ｌ；蒸留水、１リットル；ｐ
Ｈ７．０］上で３０℃でBradyrhizobium japonicumを増殖させた。Sphingomonas
capsulateおよびスフィンゴモナスＡ８ＡＮ３株は、栄養ブロス（８．０ｇ／ｌ
のペプトン）、ｐＨ７．０上で、室温で増殖させた。Zoogloea ramigera ２５９
３５株は、ストークス培地［ペプトン、５ｇ；１００Ｘストック（ＭｇＳＯ4 ・
７Ｈ2 Ｏ、２０ｇ；ＮＨ4 ＳＯ4 、７．５ｇ；クエン酸ナトリウム、１０ｇ；Ｃ
ａＣｌ2 、５ｇ；ＭｎＳＯ4 、５ｇ；ＦｅＣｌ3 ・６Ｈ2 Ｏ、１ｇ；ＦｅＳＯ4 、７．５ｇ；蒸留水、１リットル）、２ｒｎｌ；ｐＨ７．２］上で３０℃で増殖
させた。大腸菌は、ＬＢ寒天上で３７℃で増殖させた。 培養細胞の固定： 指数増殖期中に細胞を収穫して、ｒＲＮＡ含量を最適化した。培養細胞（１．
７ｍｌ）を１４，０００ｘｇで５分間回転させた。７５０μｌの上清を取り出し
て、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中の等容量の４％パラホル
ムアルデヒド（Sigma, MO ）を用いて４℃で３〜２４時間、細菌細胞を固定した
（Amann et al., 1990）。
クローン（３Ｍ３および６Ｍ３）をシーケンシングして、１６Ｓ ｒＤＮＡの完
全（〜１５００ｂｐ）配列を得た。これらのクローンのＲＤＰデータベース中の
参照細菌との比較は、 ハイフォミクロビウム様生物体ＵＳ３５３菌株およびHy
phomicrobium vulgareとのそれらの関連性を示した。 蛍光in-situ ハイブリダイゼーション 生物体： ハイフォミクロビウムＭ３株を活性スラッジから単離した。ハイフォミクロビ
ウムＭＣ−７５０（ＡＴＣＣ２７５００）およびZoogloea ramigera （ＡＴＣＣ
２５９３５）はアメリカ培養細胞コレクション（ＡＴＣＣ）から、Sphingomonas
capsulatea （ＡＴＣＣ１４６６６）はCenter for Environmental Biotechnolo
gy, University of Tennessee, Knoxvilleから入手した。Bradyrhizobium japon
icum（ＵＳＤＡ１１０）は、Dept. of Microbiology, University of Tennessee
, Knoxville から入手した。スフィンゴモナス種Ａ８ＡＮ３株および大腸菌は、
Center for Environmental Biotechnology, University of Tennessee, Knoxvil
leの培養コレクションから入手した。本発明のハイブリダイゼーション法は、そ
の他の細菌に適用可能である。 細胞の培養： ＡＴＣＣ培地６５６［ＫＨ2 ＰＯ4 、１．３６ｇ／ｌ；Ｎａ2 ＨＰＯ4 、２．
１５ｇ／ｌ；（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、０．５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．
２ｇ／ｌ；微量元素溶液（ＣｕＣｌ2 、０．１５ｇ；ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０
．１ｇ；ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ、０．０３５ｇ；Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ、０．
０５ｇ；蒸留水、１００ｍｌ）５．０ｍｌ／ｌ；フィルター滅菌処理塩酸メチル
アミン、３．３８ｇ／ｌ；Agar Noble（Difco 0142）、１８．０ｇ／ｌ；蒸留水
、１リットル；ｐＨ７．１］上で、３０℃でハイフォミクロビウム菌株を、ＲＤ
Ｙ培地［酵母菌抽出物、１ｇ／ｌ；Ｋ2 ＨＰＯ4 、０．１２ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ4 、０．１ｇ／ｌ；微量元素（Ｈ3 ＢＯ3 、３ｇ／ｌ；ＭｎＳＯ4 ・４Ｈ2 Ｏ、２
．２３ｇ／ｌ；ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．２９ｇ／ｌ；ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ
、０．１２５ｇ／ｌ；ＣｏＣｌ2 、０．０６５ｇ／ｌ；Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ、０．１２ｇ／ｌ；１ｍＭのＦｅＣｌ3 ）、１ｍｌ／ｌ；Ｌ−グルタメート、
１．０ｇ／ｌ；Ｎａ−グルコノエート、５．０ｇ／ｌ；蒸留水、１リットル；ｐ
Ｈ７．０］上で３０℃でBradyrhizobium japonicumを増殖させた。Sphingomonas
capsulateおよびスフィンゴモナスＡ８ＡＮ３株は、栄養ブロス（８．０ｇ／ｌ
のペプトン）、ｐＨ７．０上で、室温で増殖させた。Zoogloea ramigera ２５９
３５株は、ストークス培地［ペプトン、５ｇ；１００Ｘストック（ＭｇＳＯ4 ・
７Ｈ2 Ｏ、２０ｇ；ＮＨ4 ＳＯ4 、７．５ｇ；クエン酸ナトリウム、１０ｇ；Ｃ
ａＣｌ2 、５ｇ；ＭｎＳＯ4 、５ｇ；ＦｅＣｌ3 ・６Ｈ2 Ｏ、１ｇ；ＦｅＳＯ4 、７．５ｇ；蒸留水、１リットル）、２ｒｎｌ；ｐＨ７．２］上で３０℃で増殖
させた。大腸菌は、ＬＢ寒天上で３７℃で増殖させた。 培養細胞の固定： 指数増殖期中に細胞を収穫して、ｒＲＮＡ含量を最適化した。培養細胞（１．
７ｍｌ）を１４，０００ｘｇで５分間回転させた。７５０μｌの上清を取り出し
て、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中の等容量の４％パラホル
ムアルデヒド（Sigma, MO ）を用いて４℃で３〜２４時間、細菌細胞を固定した
（Amann et al., 1990）。
【００７２】 インキュベート処理細胞を氷水浴中で５分間音波処理し、６，０００ｘｇで５
分間回転させた。ペレットを９００μｌの１ＸＰＢＳ（３０ｍＭのＮａＰＯ4 緩
衝液、ｐＨ７．２中の１３０ｍＭのＮａＣｌ）および１００μｌの０．１Ｉ％イ
ゲパル中に再懸濁し、６，０００ｘｇで５分間回転させた。細胞を５００μｌの
０．１％イゲパル中に再び再懸濁し、かき混ぜて、６，０００ｘｇで５分間回転
させた。ペレットを２００μｌの２Ｘ保存緩衝液［４０ｍＭのトリス、ｐＨ７．
５、０．２％イゲパルＣＡ−６３０（Sigma, MO ）］中に再懸濁し、少なくとも
１分間掻き混ぜて、等容量の９６％エタノールと混合し、−２０℃で保存した。 スラッジ試料の固定： 活性スラッジ試料（１０ｍｌ）を滅菌corex 管中で２０，０００ｘｇで５分間
遠心分離した。１ｍｌの上清を１．７ｍｌのエッペンドルフ管中にピペット分取
して、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離した。上清（７５０μｌ）を除去し、
０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中の等容量（７５０μｌ）の４
％パラホルムアルデヒド（Sigma, MO ）と置き換えて、細胞を固定した。ホルム
アルデヒド処理細胞を１分間掻き混ぜて、４℃で３〜２４時間、インキュベート
した。
分間回転させた。ペレットを９００μｌの１ＸＰＢＳ（３０ｍＭのＮａＰＯ4 緩
衝液、ｐＨ７．２中の１３０ｍＭのＮａＣｌ）および１００μｌの０．１Ｉ％イ
ゲパル中に再懸濁し、６，０００ｘｇで５分間回転させた。細胞を５００μｌの
０．１％イゲパル中に再び再懸濁し、かき混ぜて、６，０００ｘｇで５分間回転
させた。ペレットを２００μｌの２Ｘ保存緩衝液［４０ｍＭのトリス、ｐＨ７．
５、０．２％イゲパルＣＡ−６３０（Sigma, MO ）］中に再懸濁し、少なくとも
１分間掻き混ぜて、等容量の９６％エタノールと混合し、−２０℃で保存した。 スラッジ試料の固定： 活性スラッジ試料（１０ｍｌ）を滅菌corex 管中で２０，０００ｘｇで５分間
遠心分離した。１ｍｌの上清を１．７ｍｌのエッペンドルフ管中にピペット分取
して、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離した。上清（７５０μｌ）を除去し、
０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中の等容量（７５０μｌ）の４
％パラホルムアルデヒド（Sigma, MO ）と置き換えて、細胞を固定した。ホルム
アルデヒド処理細胞を１分間掻き混ぜて、４℃で３〜２４時間、インキュベート
した。
【００７３】 インキュベート処理細胞を１４，０００ｘｇで５分間遠心分離し、上清を１０
ｍＭのＥＤＴＡと置き換えた。次に、氷水浴中で１０分間、細胞を音波処理し、
３，０００ｘｇで５分間回転させた。ペレットを９００μｌの１ＸＰＢＳ（３０
ｍＭのＮａＰＯ4 緩衝液、ｐＨ７．２中の１３０ｍＭのＮａＣｌ）および１００
μｌの０．１％イゲパル中に再懸濁し、３，０００ｘｇで５分間回転させた。細
胞を５００μｌの０．１％イゲパル中に再び再懸濁し、かき混ぜて、３，０００
ｘｇで５分間回転させた。ペレットを２００μｌの２Ｘ保存緩衝液中に再懸濁し
、少なくとも１分間掻き混ぜて、等容量の９６％エタノールと混合し、−２０℃
で保存した。 ハイブリダイゼーション： 固定細胞の各試料３ｍｌをポリリシン被覆スライド上に載せ、風乾して、エタ
ノールシリーズ（５０、８０および１００％）中で各々３分間脱水して、風乾し
た。５ＭのＮａＣｌ、１Ｍのトリス、ｐＨ７．２、１０％ＳＤＳおよび蒸留水、
ｐＨ７．２から成り、種々の濃度（０、１０、２５、３０、３５、４５および７
５％）のホルムアミド［ホルムアミドのストック溶液は、ホルムアミド（４０ｍ
ｌ）と５ｇの混合床イオン交換樹脂（２５〜５０メッシュ、Bio-Rad AG 501-X8
）とを室温で３０分間攪拌して調製した。樹脂処理ホルムアミドをWhatman Ｎｏ
．１濾紙に２回通して濾過した］を含有するハイブリダイゼーション溶液（９μ
ｌ）を付加した。平衡緩衝液［３０％ホルムアミド、０．９ＭのＮａＣｌ、０．
１％ＳＤＳ、１００ｍＭのトリス、ｐＨ７．２］で早期に平衡させた１ＭのWhat
man 濾紙を含有するハイブリダイゼーション小室にスライドを映した。スライド
を、３７℃で３０分間インキュベートした（Poulsen et al., 1993）。 Whatman
濾紙を用いてハイブリダイゼーション工程中の乾燥を防止した。次に、予備ハイ
ブリダイズ化細胞を、フルオレセイン（Genosys, The Woodlands, TX）で標識し
た１μｌの２５〜５０ｎｇ／μｌ縮重ハイフォミクロビウムプローブ［5'GCT GC
（C/G ）CAT TGT CAC CGC C 3'］に曝露して、３７℃で一夜インキュベートした
。０、１０、２５、３０、３５、４５および７５％のホルムアミド濃度を用いて
、所望のプローブ特異性を達成するのに必要な適切なホルムアミド濃度を確定し
た。 洗浄： ハイブリダイズ化細胞を蒸留水で濯ぎ、適切な濃度のハイブリダイゼーション
溶液（３７℃に予熱した）１００ｍｌを入れたcoplinジャー中で２０分間インキ
ュベートし、蒸留水で濯遺伝子、１００ｍｌの洗浄溶液［４ｍｌの５Ｍ ＮａＣ
ｌ、１０ｍｌの０．５Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ストック：２８ｍｌの０．
５Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 および７２ｍｌの０．５Ｍ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）、１ｍｌの
１０％ＳＤＳ、１ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡおよび８４ｍｌの蒸留水］を含有す
るcoplinジャー中で３７℃で１５分間インキュベートした。洗浄済みスライドを
１００ｍｌの蒸留水に浸漬し、風乾した。
ｍＭのＥＤＴＡと置き換えた。次に、氷水浴中で１０分間、細胞を音波処理し、
３，０００ｘｇで５分間回転させた。ペレットを９００μｌの１ＸＰＢＳ（３０
ｍＭのＮａＰＯ4 緩衝液、ｐＨ７．２中の１３０ｍＭのＮａＣｌ）および１００
μｌの０．１％イゲパル中に再懸濁し、３，０００ｘｇで５分間回転させた。細
胞を５００μｌの０．１％イゲパル中に再び再懸濁し、かき混ぜて、３，０００
ｘｇで５分間回転させた。ペレットを２００μｌの２Ｘ保存緩衝液中に再懸濁し
、少なくとも１分間掻き混ぜて、等容量の９６％エタノールと混合し、−２０℃
で保存した。 ハイブリダイゼーション： 固定細胞の各試料３ｍｌをポリリシン被覆スライド上に載せ、風乾して、エタ
ノールシリーズ（５０、８０および１００％）中で各々３分間脱水して、風乾し
た。５ＭのＮａＣｌ、１Ｍのトリス、ｐＨ７．２、１０％ＳＤＳおよび蒸留水、
ｐＨ７．２から成り、種々の濃度（０、１０、２５、３０、３５、４５および７
５％）のホルムアミド［ホルムアミドのストック溶液は、ホルムアミド（４０ｍ
ｌ）と５ｇの混合床イオン交換樹脂（２５〜５０メッシュ、Bio-Rad AG 501-X8
）とを室温で３０分間攪拌して調製した。樹脂処理ホルムアミドをWhatman Ｎｏ
．１濾紙に２回通して濾過した］を含有するハイブリダイゼーション溶液（９μ
ｌ）を付加した。平衡緩衝液［３０％ホルムアミド、０．９ＭのＮａＣｌ、０．
１％ＳＤＳ、１００ｍＭのトリス、ｐＨ７．２］で早期に平衡させた１ＭのWhat
man 濾紙を含有するハイブリダイゼーション小室にスライドを映した。スライド
を、３７℃で３０分間インキュベートした（Poulsen et al., 1993）。 Whatman
濾紙を用いてハイブリダイゼーション工程中の乾燥を防止した。次に、予備ハイ
ブリダイズ化細胞を、フルオレセイン（Genosys, The Woodlands, TX）で標識し
た１μｌの２５〜５０ｎｇ／μｌ縮重ハイフォミクロビウムプローブ［5'GCT GC
（C/G ）CAT TGT CAC CGC C 3'］に曝露して、３７℃で一夜インキュベートした
。０、１０、２５、３０、３５、４５および７５％のホルムアミド濃度を用いて
、所望のプローブ特異性を達成するのに必要な適切なホルムアミド濃度を確定し
た。 洗浄： ハイブリダイズ化細胞を蒸留水で濯ぎ、適切な濃度のハイブリダイゼーション
溶液（３７℃に予熱した）１００ｍｌを入れたcoplinジャー中で２０分間インキ
ュベートし、蒸留水で濯遺伝子、１００ｍｌの洗浄溶液［４ｍｌの５Ｍ ＮａＣ
ｌ、１０ｍｌの０．５Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ストック：２８ｍｌの０．
５Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 および７２ｍｌの０．５Ｍ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）、１ｍｌの
１０％ＳＤＳ、１ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡおよび８４ｍｌの蒸留水］を含有す
るcoplinジャー中で３７℃で１５分間インキュベートした。洗浄済みスライドを
１００ｍｌの蒸留水に浸漬し、風乾した。
【００７４】 １滴の曇り防止溶液（蛍光用Vectashield マウント媒質、Ｈ−１０００、Vect
or Laboratories, Inc., Burlingame, CA ）をハイブリダイズ化細胞に付加し、
細胞をカバーガラスで被覆した。油浸対物レンズ（１０００ｘ）を用いて、細菌
細胞を可視化した。蛍光顕微鏡検査用に取り付けた顕微鏡で蛍光を検出し、写真
を撮った。曝露時間は、位相差顕微鏡に関しては０．０１〜０．０５秒、蛍光顕
微鏡に関しては２０〜４０秒であった。 光学顕微鏡検査： Reichertウルトラミクロトームを用いて、ガラスナイフで切断することにより
、包埋試料から厚い切片（１μｍ）を得た。次に切片を、ゼラチン被覆ガラスス
ライド上で１滴の１０％アセトンで処理した。スライドウォーマー上でスライド
を乾燥し、１％ボラックス中の１％トルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡下で
観察した。 陰性染色 グロー放電カーボン被覆formvar グリッド上に１分間、スラッジ試料を置き、
次に０．２５％ホスホタングステン酸（ＫＯＨでｐＨ７．０）および２％酢酸ウ
ラニル、ｐＨ４．５を含有する染色液１滴で処理して、乾燥し、日立Ｈ−６００
透過型電子顕微鏡で観察した。 蛍光in-situ ハイブリダイゼーション結果： スラッジからの従来の未報告ハイフォミクロビウム種Ｍ３、およびＡＴＣＣか
ら入手したHyphomicrobium vulgareの培養菌株を用いて、標的配列とハイブリダ
イズする縮重蛍光ハイフォミクロビウムプローブの能力を調べた。縮重プローブ
は、スラッジ中のハイフォミクロビウム種も標的にした。プローブの結合は、す
べてのホルムアミド濃度で観察された。標的配列内に既知の誤対合を有する形態
学的に別個の菌株の混合物とのハイブリダイゼーションにより、プローブの特異
性および感受性をさらに評価した。ＲＤＤデータベースのCheck Probe 用具から
確定した場合のプローブ標的領域中の０、１、２、４および８つの誤対合を有す
る生物体を選択して、プローブ特異性を検査した。プローブ標的領域内に誤対合
を有する生物体間を弁別するためのハイブリダイゼーションの緊縮度は、温度を
３７℃で一定に保持しながら、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミド
濃度を増大することにより確定した。プローブのハイフォミクロビウムＭ３およ
びHyphomicrobium vulgareとの有効な結合は、すべてのホルムアミド濃度で観察
された。誤対合識別実験の結果を表５に要約する。 表５：種々の緊縮度レベルでの１６Ｓ ｒＲＮＡの５‘ＧＣＴ ＧＣ（Ｃ／Ｇ）
ＣＡＴ ＴＧＴ ＣＡＣ ＣＧＣ Ｃ ３’領域を標的化するハイフォミクロビ
ウムプローブとの対照菌株のゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション
or Laboratories, Inc., Burlingame, CA ）をハイブリダイズ化細胞に付加し、
細胞をカバーガラスで被覆した。油浸対物レンズ（１０００ｘ）を用いて、細菌
細胞を可視化した。蛍光顕微鏡検査用に取り付けた顕微鏡で蛍光を検出し、写真
を撮った。曝露時間は、位相差顕微鏡に関しては０．０１〜０．０５秒、蛍光顕
微鏡に関しては２０〜４０秒であった。 光学顕微鏡検査： Reichertウルトラミクロトームを用いて、ガラスナイフで切断することにより
、包埋試料から厚い切片（１μｍ）を得た。次に切片を、ゼラチン被覆ガラスス
ライド上で１滴の１０％アセトンで処理した。スライドウォーマー上でスライド
を乾燥し、１％ボラックス中の１％トルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡下で
観察した。 陰性染色 グロー放電カーボン被覆formvar グリッド上に１分間、スラッジ試料を置き、
次に０．２５％ホスホタングステン酸（ＫＯＨでｐＨ７．０）および２％酢酸ウ
ラニル、ｐＨ４．５を含有する染色液１滴で処理して、乾燥し、日立Ｈ−６００
透過型電子顕微鏡で観察した。 蛍光in-situ ハイブリダイゼーション結果： スラッジからの従来の未報告ハイフォミクロビウム種Ｍ３、およびＡＴＣＣか
ら入手したHyphomicrobium vulgareの培養菌株を用いて、標的配列とハイブリダ
イズする縮重蛍光ハイフォミクロビウムプローブの能力を調べた。縮重プローブ
は、スラッジ中のハイフォミクロビウム種も標的にした。プローブの結合は、す
べてのホルムアミド濃度で観察された。標的配列内に既知の誤対合を有する形態
学的に別個の菌株の混合物とのハイブリダイゼーションにより、プローブの特異
性および感受性をさらに評価した。ＲＤＤデータベースのCheck Probe 用具から
確定した場合のプローブ標的領域中の０、１、２、４および８つの誤対合を有す
る生物体を選択して、プローブ特異性を検査した。プローブ標的領域内に誤対合
を有する生物体間を弁別するためのハイブリダイゼーションの緊縮度は、温度を
３７℃で一定に保持しながら、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミド
濃度を増大することにより確定した。プローブのハイフォミクロビウムＭ３およ
びHyphomicrobium vulgareとの有効な結合は、すべてのホルムアミド濃度で観察
された。誤対合識別実験の結果を表５に要約する。 表５：種々の緊縮度レベルでの１６Ｓ ｒＲＮＡの５‘ＧＣＴ ＧＣ（Ｃ／Ｇ）
ＣＡＴ ＴＧＴ ＣＡＣ ＣＧＣ Ｃ ３’領域を標的化するハイフォミクロビ
ウムプローブとの対照菌株のゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション
【００７５】
【表５】
【００７６】 プローブは、１０％ホルムアミド濃度で、スフィンゴモナスＡ８ＡＮ３および
大腸菌をハイフォミクロビウムＭ３から識別した。Zoogloea ramigera およびBr
adyrhizobium japonicumは、それぞれ３０％および７０％のホルムアミド濃度で
ハイフォミクロビウム種から識別された。意外になことに、１０％のホルムアル
デヒド濃度では、プローブは、８つの不適正を有するZoogloea ramigera と結合
したが、４つの不適正を有するスフィンゴモナスＡ８ＡＮ３とは結合しなかった
。結合プローブの量は、予測通り、ホルムアルデヒド濃度の増大により次第に減
少したが、しかしプローブは、７０％のホルムアルデヒド濃度で、依然としてHy
phomicrobium vulgareおよびSphingomonas capsulataとの結合を示した。 活性スラッジの顕微鏡検査 １６Ｓ ｒＲＮＡ分析により得られた系統発生樹の正統性（ハイフォミクロビ
ウム種の存在）をさらに確証するために、光学顕微鏡、透過型電子顕微鏡（ＴＥ
Ｍ）、および走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて、形態学的特性に関する電子
顕微鏡的検査を実行した。
大腸菌をハイフォミクロビウムＭ３から識別した。Zoogloea ramigera およびBr
adyrhizobium japonicumは、それぞれ３０％および７０％のホルムアミド濃度で
ハイフォミクロビウム種から識別された。意外になことに、１０％のホルムアル
デヒド濃度では、プローブは、８つの不適正を有するZoogloea ramigera と結合
したが、４つの不適正を有するスフィンゴモナスＡ８ＡＮ３とは結合しなかった
。結合プローブの量は、予測通り、ホルムアルデヒド濃度の増大により次第に減
少したが、しかしプローブは、７０％のホルムアルデヒド濃度で、依然としてHy
phomicrobium vulgareおよびSphingomonas capsulataとの結合を示した。 活性スラッジの顕微鏡検査 １６Ｓ ｒＲＮＡ分析により得られた系統発生樹の正統性（ハイフォミクロビ
ウム種の存在）をさらに確証するために、光学顕微鏡、透過型電子顕微鏡（ＴＥ
Ｍ）、および走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて、形態学的特性に関する電子
顕微鏡的検査を実行した。
【００７７】 種々の形態を有する生物体を観察した。光学顕微鏡下で観察されにくい細胞隔
膜は、透過型電子顕微鏡下では見ることができた。ハイフォミクロビウムに似た
生物体［尖端を有する棒状、卵形または豆形の形状で、種々の長さの一極性また
は双極性のフィラメント状派生物（突起物）または菌糸）を生じ、そして増殖の
ためにメタンのようなある炭素化合物を利用できる細胞（０．５〜１．０ｘ１．
３μｍ）から成るグラム陰性（Holm et al., 1996 ）生物体の一群］、ズーグレ
ア種および糸状細菌が観察された。出芽およびプロステーカ細菌（ハイフォミク
ロビウム、ハイフォモナス、ペドミクロピウム）としての単離物の同定は、出芽
形態および突起物を生じるそれらの能力を基礎にした（Staley et al., 1988 ）
。
膜は、透過型電子顕微鏡下では見ることができた。ハイフォミクロビウムに似た
生物体［尖端を有する棒状、卵形または豆形の形状で、種々の長さの一極性また
は双極性のフィラメント状派生物（突起物）または菌糸）を生じ、そして増殖の
ためにメタンのようなある炭素化合物を利用できる細胞（０．５〜１．０ｘ１．
３μｍ）から成るグラム陰性（Holm et al., 1996 ）生物体の一群］、ズーグレ
ア種および糸状細菌が観察された。出芽およびプロステーカ細菌（ハイフォミク
ロビウム、ハイフォモナス、ペドミクロピウム）としての単離物の同定は、出芽
形態および突起物を生じるそれらの能力を基礎にした（Staley et al., 1988 ）
。
【００７８】 参考文献
【表６】
【００７９】
【表７】
【００８０】
【表８】
【００８１】
【表９】
【００８２】
【表１０】
【００８３】
【表１１】
【００８４】
【表１２】
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 レイトン，アリス シー. アメリカ合衆国，テネシー 37922，ノッ クスビル，コロネード ロード 1620 (72)発明者 セイラー，ゲイリー エス. アメリカ合衆国，テネシー 37709，ブレ イン，マックキンニー ロード，ボックス 60，ルート ２ (72)発明者 ステープルトン，レイモンド アメリカ合衆国，テネシー 37921，ノッ クスビル，サリバン ロード 5033
Claims (25)
- 【請求項１】 配列番号：１の核酸を包含する単離核酸。
- 【請求項２】 配列番号：２の核酸を包含する単離核酸。
- 【請求項３】 配列番号：１の核酸から成る単離核酸。
- 【請求項４】 配列番号：２の核酸から成る単離核酸。
- 【請求項５】 廃水試料中の粘着集落クラスターの存在の検出方法であって
、以下の： ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で廃水の試料からのＤ
ＮＡを請求項１の核酸と接触させ、そして ｂ）粘着集落クラスターの存在を示すハイブリダイゼーションの存在を検出す
る 工程から成る方法。 - 【請求項６】 廃水試料中の粘着集落クラスターの存在の検出方法であって
、以下の： ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で廃水の試料からのＤ
ＮＡを請求項２の核酸と接触させ、そして ｂ）粘着集落クラスターの存在を示すハイブリダイゼーションの存在を検出す
る 工程から成る方法。 - 【請求項７】 廃水試料中のタウエラ種単離物ｍｚ１ｔの存在の検出方法で
あって、以下の： ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で廃水の試料からのＤ
ＮＡを請求項２の核酸と接触させ、そして ｂ）タウエラ種単離物ｍｚ１ｔの存在を示すハイブリダイゼーションの存在を
検出する 工程から成る方法。 - 【請求項８】 廃水試料中のタウエラ種単離物ｍｚ２ｔの存在の検出方法で
あって、以下の： ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で廃水の試料からのＤ
ＮＡを請求項２の核酸と接触させ、そして ｂ）タウエラ種単離物ｍｚ２ｔの存在を示すハイブリダイゼーションの存在を
検出する 工程から成る方法。 - 【請求項９】 スラッジ脱水問題に関連があるスラッジ中の細菌の検出方法
であって、以下の： ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で細菌からのＤＮＡを
請求項１の核酸と接触させ、そして ｂ）スラッジ脱水問題に関連がある細菌の存在を示すハイブリダイゼーション
の存在を検出する 工程から成る方法。 - 【請求項１０】 スラッジ脱水問題に関連があるスラッジ中の細菌の検出方
法であって、以下の： ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で細菌からのＤＮＡを
請求項２の核酸と接触させ、そして ｂ）スラッジ脱水問題に関連がある細菌の存在を示すハイブリダイゼーション
の存在を検出する 工程から成る方法。 - 【請求項１１】 スラッジ脱水問題に関連があるスラッジ中の細菌の検出方
法であって、以下の： ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で細菌からのＤＮＡを
配列番号：１の核酸および配列番号：２の核酸と接触させ、そして ｂ）スラッジ脱水問題に関連がある細菌の存在を示すハイブリダイゼーション
の存在を検出する 工程から成る方法。 - 【請求項１２】 廃水試料中の粘着集落クラスターの存在の検出方法であっ
て、以下の： ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で廃水の試料からのＤ
ＮＡを請求項３の核酸と接触させ、そして ｂ）粘着集落クラスターの存在を示すハイブリダイゼーションの存在を検出す
る 工程から成る方法。 - 【請求項１３】 廃水試料中の粘着集落クラスターの存在の検出方法であっ
て、以下の： ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で廃水の試料からのＤ
ＮＡを請求項４の核酸と接触させ、そして ｂ）粘着集落クラスターの存在を示すハイブリダイゼーションの存在を検出す
る 工程から成る方法。 - 【請求項１４】 廃水試料中のタウエラ種単離物ｍｚ１ｔの存在の検出方法
であって、以下の： ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で廃水の試料からのＤ
ＮＡを請求項４の核酸と接触させ、そして ｂ）タウエラ種単離物ｍｚ１ｔの存在を示すハイブリダイゼーションの存在を
検出する 工程から成る方法。 - 【請求項１５】 廃水試料中のタウエラ種単離物ｍｚ２ｔの存在の検出方法
であって、以下の： ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で廃水の試料からのＤ
ＮＡを請求項４の核酸と接触させ、そして ｂ）タウエラ種単離物ｍｚ２ｔの存在を示すハイブリダイゼーションの存在を
検出する 工程から成る方法。 - 【請求項１６】 スラッジ脱水問題に関連があるスラッジ中の細菌の検出方
法であって、以下の： ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で細菌からのＤＮＡを
請求項３の核酸と接触させ、そして ｂ）スラッジ脱水問題に関連がある細菌の存在を示すハイブリダイゼーション
の存在を検出する 工程から成る方法。 - 【請求項１７】 スラッジ脱水問題に関連があるスラッジ中の細菌の検出方
法であって、以下の： ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で細菌からのＤＮＡを
請求項４の核酸と接触させ、そして ｂ）スラッジ脱水問題に関連がある細菌の存在を示すハイブリダイゼーション
の存在を検出する 工程から成る方法。 - 【請求項１８】 配列番号：３の核酸から成る単離核酸。
- 【請求項１９】 配列番号：４の核酸から成る単離核酸。
- 【請求項２０】 核酸がハイフォミクロビウム属の核酸と特異的にハイブリ
ダイズする請求項１８の核酸。 - 【請求項２１】 核酸がハイフォミクロビウム属の核酸と特異的にハイブリ
ダイズする請求項１９の核酸。 - 【請求項２２】 廃水試料中のハイフォミクロビウム種の存在の検出方法で
あって、以下の： ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で廃水の試料からのＤ
ＮＡを請求項１８の核酸と接触させ、そして ｂ）ハイフォミクロビウム種の存在を示すハイブリダイゼーションの存在を検
出する 工程から成る方法。 - 【請求項２３】 廃水試料中のハイフォミクロビウム種の存在の検出方法で
あって、以下の： ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で廃水の試料からのＤ
ＮＡを請求項１９の核酸と接触させ、そして ｂ）ハイフォミクロビウム種の存在を示すハイブリダイゼーションの存在を検
出する 工程から成る方法。 - 【請求項２４】 スラッジ圧縮問題に関連があるスラッジ中の細菌の検出方
法であって、以下の： ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で細菌からのＤＮＡを
請求項１８の核酸と接触させ、そして ｂ）スラッジ圧縮問題に関連がある細菌の存在を示すハイブリダイゼーション
の存在を検出する 工程から成る方法。 - 【請求項２５】 スラッジ圧縮問題に関連があるスラッジ中の細菌の検出方
法であって、以下の： ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で細菌からのＤＮＡを
請求項１９の核酸と接触させ、そして ｂ）スラッジ圧縮問題に関連がある細菌の存在を示すハイブリダイゼーション
の存在を検出する 工程から成る方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/953,171 US6124094A (en) | 1997-10-17 | 1997-10-17 | Zoogloeal and hyphomicrobium spp. nucleic acids |
| US08/953,171 | 1997-10-17 | ||
| PCT/US1998/020791 WO1999020796A1 (en) | 1997-10-17 | 1998-10-02 | Zoogloeal and hyphomicrobium spp. nucleic acids |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000517114A Pending JP2001520053A (ja) | 1997-10-17 | 1998-10-02 | 粘着集落性種およびハイフォミクロビウム種核酸 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP1023462A1 (ja) |
| JP (1) | JP2001520053A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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- 1997-10-17 US US08/953,171 patent/US6124094A/en not_active Expired - Fee Related
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- 1998-10-02 AU AU96002/98A patent/AU9600298A/en not_active Abandoned
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