JP2002537824A - 細菌の同定 - Google Patents

細菌の同定

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JP2002537824A JP2000602813A JP2000602813A JP2002537824A JP 2002537824 A JP2002537824 A JP 2002537824A JP 2000602813 A JP2000602813 A JP 2000602813A JP 2000602813 A JP2000602813 A JP 2000602813A JP 2002537824 A JP2002537824 A JP 2002537824A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 試料中の細菌を同定する方法を提供するものである。 【解決手段】 配列５’ＧＣＧＡＴＴＴＣＹＧＡＡＹＧＧＧＧＲＡＡＣＣＣをもつ１つ以上のオリゴヌクレオチドから本質的になる１つのプライマー、および配列５’ＴＴＣＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＣＧＧＴＡＣＴをもつオリゴヌクレオチドから本質的になる第２のプライマーからなる１対のプライマーを用いて試料中に存在する２３ＳｒＤＮＡの部分を増幅し、次いで生じたアンプリコンを、これらの各アンプリコンにハイブリダイズすることによって試料中に存在し得る細菌を同定するために設計したオリゴヌクレオドの組みをプローブすることによって、試験することを特徴とする試料中の細菌を同定する。 【効果】 本方法は、単一の試験で少なくとも８つ、および相当それ以上の、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐｐ．）肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ）およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌を含む細菌種の同定を可能にする。本試験で使用するための１つまたはそれ以上の新規オリゴヌクレオチドは、固体担体上に固定化し、病院および他の環境での使用のための診断試験キットに組み入れられる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌の同定、さらにとりわけ排他的ではないが、たとえば血液など
の生物学的試料中の臨床的に重要な細菌の同定に関する。本発明は、陽性血液培
養瓶および新鮮な血液標本を含む病院実験室内で単離され、臨床標本より直接得
られた臨床的に重要な細菌の同定のための特別な適用である。便宜上、本発明は
第一に臨床的な必要性に関連して記述するが、本領域外の広い応用があることが
理解されるであろう。
【０００２】
【発明の背景、従来の技術】
患者集団によって変化するけれども、血液培養単離物の６５％より８つの細菌
種が計数される。典型的に、これらは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）（〜２０％）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅ
ｕｓ）（〜２０％）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
）（７％）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）（５％）、クレブ
シエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）（〜５％）、エンテロバクター（Ｅ
ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）（〜４％）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ
ｓｐｐ．）および肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ）（〜３％）である。さ
らに、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌はよく脈管内器具を使用する患者より単離さ
れるが、これらの単離物の多くは臨床的にはほんの僅かである。血液培養単離物
の残りの３５％は５０にものぼる異なる種を含む。単一試験でのこれらの多くの
種の迅速な検出はとても有用であり得る。
【０００３】 近年、たくさんの努力が、簡単なＰＣＲ反応で微生物を同定するのに使用でき
る種特異的プライマーの産出に注がれてきた。予想される大きさのＰＣＲ産物が
これらのプライマーの組で産出されれば、標的細菌の存在がほぼ確実に予測でき
る。残念ながら、このアプローチは、多くの病原体の１つを含んでいる可能性の
ある試料を解析することに対して葉理想的ではない。このアプローチを用いたそ
のような種の解析には、複雑なプライマー混合、存在するであろうそれぞれの種
を検出ための平行して実施する別々のＰＣＲ反応系列、連続して実施するＰＣＲ
反応系列を含む多重ＰＣＲを必要とする。血液より単離されうる潜在的に多くの
異なる細菌種のために、これらの方法は一般的な細菌学的種の通常のスクリーニ
ングのためには不十分である。
【０００４】 よりよいアプローチは、さまざまな微生物からのＤＮＡを増幅するための単一
のプライマー組を使用し、次いで本来の種を決定するために得られた産物の配列
を解析することである。ＤＮＡの保存された鎖に対するプライマーは、アンプリ
コン、たとえばほぼすべての細菌種からのＰＣＲ産物を産出する可能性がある。
通常選択される領域は、１６Ｓ ｒＤＮＡまたは１６Ｓ ２３Ｓ ｒＤＮＡスペ
ーサー領域である。１６Ｓ ２３Ｓ ｒＤＮＡスペーサー領域は、多くの種内で
とても変化しやすく、よくｔＲＮＡ遺伝子を含み、増幅された産物の長さおよび
配列は、単一種内の株を分類するのに使用できる。反対に、１６ｓ ｒＤＮＡは
とても保存されており、多くの配列データが、公的なコンピュータデータベース
で入手可能であるので、配列データにより多くの場合に細菌の種の最終的な同定
を得ることができる。残念なことに、臨床的に重要であるいくつかの種は、この
領域のみを用いて決定することが不可能であるか、または困難である同一または
とても類似した１６ｓ ｒＤＮＡを持っている。
【０００５】 本発明者らは現在、本明細書以下で特定化する、新規の特別に設計したオリゴ
ヌクレオチドプライマーで大きなリボソームサブユニット（２３ｓ ｒＤＮＡ）
を標的にすること、およびこのＤＮＡの位置部分を増幅することによって、本発
明者らが単一試験、または悪くてとても少数の試験の方法によって多くの細菌を
同定することができることを発見した。便宜上、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）の方法による増幅を、以下の記述を通して言及する。しかしながら、たとえば
転写仲介増幅（ＴＭＡ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴＰＣＲ）、Ｑ
−ベータレプリカーゼ増幅および単一鎖置換増幅のような他の増幅技術も代替え
的に使用できることが理解されるであろう。ＰＣＲに使用したプライマーのいく
つかの改変が、これらの代替方法を使用する際に必要である可能性がある。ＴＭ
Ａ法の場合、そのような改変は通常、本発明のプライマーへのプロモーター配列
および認識配列の添加を必要とするであろう。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は試料中の細菌を同定する方法を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明にしたがって、細菌種は細菌２３ｓ ｒＤＮＡの増幅によって検出し、
逆ハイブリッド系で１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドをプローブするた
めに、増幅した産物（アンプリコン）を使用することで同定する。万能プライマ
ーによる増幅の後、アンプリコンの配列を決定しなければならない。直接シーク
エンシングは複雑であり、高価である。配列変異は、制限消化によって同定でき
るが、これは広い範囲の変異体を検出するのに実用的な方法ではない。本発明に
したがって、標識化したアンプリコンは、好ましくはたとえばナイロン膜のよう
な固相に固定されたか、またはシリコンオブラート上でその場で合成したオリゴ
ヌクレオチドのパネルまたはアレイにハイブリッド形成させる。対象およびプロ
ーブ両方が、サザンブロットで典型的なものよりもとても高濃度で存在するので
、これらのハイブリッド形成反応は、とても短時間で実施できる（１時間より少
ない）。本方法は、逆ハイブリッド形成と呼ぶ。逆ハイブリッド形成により、と
ても多くの配列変異体系列を、明確に同定でき、それ自身を自動化できる。
【０００８】 本発明は、２３ｓ ｒＤＮＡの一部分を増幅するプライマーを含む。これらの
プライマーのＤＮＡ配列は以下に列記する。 ５’から３’への配列 フォワードプライマー ＳＴ２３ＳＰ６ 配列番号１ ＧＣＧＡＴＴＴＣＹＧＡＡＹＧＧＧＧＲＡＡＣＣＣ リバースプライマー ＳＴ２３ＳＰ１０ 配列番号２ ＴＴＣＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＣＧＧＴＡＣＴ プライマーおよびオリゴヌクレオチドの配列は、本明細書で与えられ、標準の
ＩＵＢ／ＩＵＰＡＣ核酸コードで表現される。プライマー、とりわけリバースプ
ライマーは好ましくは、たとえば（以下に示す実施例でのように）ジゴキシゲニ
ン（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、ビオチンまたはフルオレセインで標識化される
。他の標識化系も使用できる。ハイブリッド形成もまた、分子標識を形成するた
めにオリゴヌクレオチドを使用することで検出できる。
【０００９】 以上で与えられたフォワードプライマーは記号ＹおよびＲを含む。変性配列で
の使用に関する標準技術にしたがって、ＹはヌクレオチドＣまたはＴを表し、Ｒ
はＡまたはＧを表す。記号ＹおよびＲは、配列の「揺らぎ」領域での塩基順列の
変動を示すために使用する。フォワードプライマー剤はしたがって、揺らぎ点で
の挿入に好ましいヌクレオチドの混合物を用いて変性プライマー組として調製す
る。
【００１０】 さまざまな医学的に重要なグラム陽性およびグラム陰性菌培養液から、これら
のプライマーによって産出されたＰＣＲ産物を、分類学的群を同定するために設
計したオリゴヌクレオチドのアレイとのハイブリッド形成によって特性化する。
一般的に４時間より少ない時間でのこの手順を使用し、本発明者らは、広い範囲
の属および種を同定することができた。このアプローチにより、病院病原体およ
び病原体の混合物を、原因剤または剤類の先行知識の必要性なしに分子的方法に
よって同定できる。
【００１１】 その配列は以下に列記するが、オリゴヌクレオチドプライマーを、特定の個々
の種の同定のために別々に、または多くの異なる種の同定のためのパネルまたは
アレイで使用できる。使用するオリゴヌクレオチド標的の数、および同定できる
種の数に理論的に制限はない。
【００１２】 理想的には、使用したオリゴヌクレオチドは、１つの細菌種、およびその種の
すべてのメンバーにのみハイブリッド形成すべきである。したがって、理想的な
アレイで、種特異的スポットからなる固有の特性がみられ、種レベルまでの同定
が得られる。実際には、２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドスポットが、
多くの種で必要である可能性があり、いくつかの場合、いくつかのそのようなス
ポットは、種内の変異の同定を許容する可能性がある。さらに、いくつかの同定
は、個々の種の個々のオリゴヌクレオチドへのハイブリッド形成の相対的な強度
を比較することによって行いうる。ハイブリッド形成の査定は、視覚的または自
動方法によって定量できる。
【００１３】 たとえば、２７オリゴヌクレオチドを、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａ
ｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、プロテウス ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂ
ｉｌｉｓ）、エンテロコッカス ファシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅ
ａｃｉｕｍ）およびエンテロコッカス フェアカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｆｅａｃａｌｉｓ）、同様に黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ ａｕｒｅｕｓ）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒ
ｉａ）種、ステノトロホモナス マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏ
ｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、バルコホルデリア セパシア（Ｂｕｒｋｈ
ｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｉｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）の明白な同定のために使用した。したがって、通常、８、１０または
それ以上の、通常病院試料または他の状況で試験している試料に起こる微生物に
対してのみでなく、遭遇する可能性のある他の生物をプローブするためのオリゴ
ヌクレオチドも提供することが望ましいであろう。好ましくは、少なくとも３０
の異なる種の微生物に対するプローブが試験で使用する支持基質上に存在する可
能性がある。
【００１４】 増幅したＤＮＡ中の短い配列の検出は、大規模な平行したスケールで実施する
ことができる明白な手順である。これは、標識化ＰＣＲ産物を固体支持体、たと
えば膜、ガラススライドまたはマイクロタイタートレイ上に固定化した、または
シリコンオブラート上でｉｎ ｓｉｔｕに合成したオリゴヌクレオチドのアレイ
にハイブリッド形成することで実施してよい。
【００１５】 本アッセイは、アッセイの実施の複雑さを増加させることなしに、オリゴヌク
レオチドの添加で広い範囲の細菌種を同定するために簡単に拡張することができ
る。
【００１６】
【表１】
【００１７】
【表２】
【００１８】
【表３】
【００１９】
【表４】
【００２０】
【表５】
【００２１】
【表６】
【００２２】 プライマーおよびオリゴヌクレオチドプライマーの配列もまた、本明細書以後
で、記述形式での配列表として提供し、コンピュータ読み込み可能形式で提供す
る。コンピュータ読みとり可能形式で記録した情報は、記述配列表と同一である
。
【００２３】
【発明の実施の態様】
方法論 本発明者らが使用した方法を以下のように記述する。
【００２４】 細菌株 使用した保存株を表１に列記する。微生物はグリセロール培養液中で−７０℃
にて保存した。
【００２５】 血液培養 血液培養は、たとえばバイタル（Ｖｉｔａｌ）（登録商標）自動化系（Ｂｉｏ
Ｍｅｒｉｏｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）のような濃縮技術を用いることで行ってよい
。本方法によって１０ｍＬまでの血液を好気性および嫌気性両方のＶｉｔａｌ血
液培養瓶に入れる。ついで瓶をＶｉｔａｌ機内でインキュベートし、細菌増殖の
兆候を連続してモニタする。増殖の可能性が同定されたらば、瓶をインキュベー
ターより取り出し、試料をグラム染色し、アガープレートに継代培養する。２５
日間かけて、ＤＮＡ抽出のための１００マイクロリットルの追加試料を、以下に
記述したように１１６非選択陽性血液培養瓶よりとった。ＤＮＡアッセイを患者
詳細または初期グラム染色の結果を知ることなしに実施した。
【００２６】 純粋な細菌培養からの細菌ＤＮＡの抽出 保存微生物をコロンビア ブラッド アガー（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｂｌｏｏｄ
Ａｇａｒ）プレート（Ｏｘｏｉｄ，ＵＫ）上に継代培養した。３７℃で一晩培
養したものの単一コロニーを、１マイクロリットルの１ｍｇ／ｍｌ リソスタフ
ィン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．ＵＫ）溶液を含む滅菌水、１００
マイクロリットル中に懸濁させ、３７℃にて１０分間培養した。ついでチューブ
をサーモ−サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ２４００ Ｇｅｎｅ ａｍ
ｐ ＰＣＲ系）へ移し、９５℃まで１０分間熱した。最終的に、これをマイクロ
遠心機にて２分間、１３，０００ｒｐｍで遠心し、１ｍｌの上清を以下に記述し
た２３Ｓ ＰＣＲで使用した。
【００２７】 Ｖｉｔａｌ血液培養瓶から直接的な細菌ＤＮＡ抽出 ＤＮＡを以下のプロトコールを使用してクラスＩＩ安全キャビネット内で、す
べての陽性血液培養瓶より抽出した。２〜４滴の培養液を、グラム染色および継
代のための吸引時に０．５ｍｌの滅菌蒸留水中に移した。チューブをマイクロ遠
心機にて２分間、１３，０００ｒｐｍにて遠心し、上清を捨てた。ペレットを、
１マイクロリットルの１ｍｇ／ｍｌ リソスタフィン（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）溶液
を含む１００マイクロリットルの蒸留水中に再懸濁させ、乾燥ブロック（Ｓｃｏ
ｔｌａｂ，ＵＫ）中で３７℃にて２０分間インキュベートした。ついで温度を９
５℃まで上げ、チューブをさらに１５分間インキュベートした。最終的に、チュ
ーブをマイクロ遠心機にて２分間、１３，０００ｒｐｍで遠心し、１マイクロリ
ットルの上清を以下に記述した２３Ｓ ＰＣＲで使用した。
【００２８】 ２３Ｓ 細菌ｒＤＮＡを増幅するためのプライマーの設計 ファワードプライマー ＳＴ２３ＳＰ６ ５’ ＧＣＧＡＴＴＴＣＹＧＡＡＹＧＧＧＧＲＡＡＣＣＣ リバースプライマー ＳＴ２３ＳＰ１０ ５’ジオキシゲニン−ＴＴＣＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＣＧＧＴＡＣＴ
【００２９】 プライマーは商業的に合成した（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ａ
ｍｅｒｃｈａｍ，ＵＫ）。１×ＤｎａＺｙｍｅ緩衝液（Ｆｌｏｗｇｅｎ，ＵＫ）
、１μＭプライマーＳＴ２３ＳＰ６、２μＭプライマーＳＰ２３ＳＰ１０および
１５０μＭの各ｄＮＴＰを含むＰＣＲマスターミックスを５ｍｌ容量で作製した
。４０マイクロリッターのマスターミックス分液を１００マイクロリッターＰＣ
Ｒチューブ内に分配した。ＤＮＡ抽出物が得られた場合、１マイクロリッターの
好ましい抽出物および１ユニットのＤｎａＺｙｍｅ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｌ
ｏｗｇｅｎ，ＵＫ）をそれぞれのチューブに加えた。ＰＣＲ混合液を９５℃で１
５秒間、５５℃１５秒間および７２℃で１５秒間の５サイクルにかけ、続いて９
５℃で１５秒間および６５℃で３０秒間の２５サイクルにかけた。ＰＣＲ産物の
存在は、５マイクロリットルのアガロース電気泳動によって確認し、臭化エチジ
ウムによって視覚化した。
【００３０】 原発病原体の配列決定と潜在的逆ハイブリッド形成標的の同定 種情報が得られない場合、本発明者らは微生物集団中の選択した単離物からの
ＰＣＲ産物を配列決定した。このことは、初期オリゴヌクレオチドアレイとハイ
ブリッド形成できなかったか、または誤った同定をされた産物からの配列データ
により補足された。すべての選択したオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ産物の可変
領域内の配列にて標的化した。この配列情報を使用して、同様の計算した融解温
度を持つオリゴヌクレオチドのパネルを設計した。
【００３１】 これらの配列を、参照微生物から作製したアンプリコンを使用してアレイ中で
試験した。低いハイブリッド形成強度のために、アレイ中でプローブとして理想
的でないオリゴヌクレオチドは、合成の間にオリゴヌクレオチドの３’末端へ少
数（＜２０）のチミン残基を添加することで改変した。これらの改変はハイブリ
ッド形成強度を増加させる。したがって、いくつかのチミン残基を調製すること
によって、本技術を、アレイのハイブリッド形成強度を等しくするのに使用した
。
【００３２】 本技術を用いて、アレイに組み込むために好適であるハイブリッド形成特性を
持つオリゴヌクレオチドを産出した。このことにより、低いハイブリッド形成の
強度によって、アレイへの組み込みに不都合であったオリゴヌクレオチドを、同
一の簡単に解釈可能なアレイに組み込むことができる。
【００３３】 ハイブリッド形成膜の産出 標的オリゴヌクレオチドの設計の１つの形式を図１に示す。オリゴヌクレオチ
ドを合成し、それぞれ０．３マイクロリットルの水中の５０ｐｇを、ナイロン膜
（ＭＡＧＮＡ Ｍｉｃｒｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｉｎｃ． ＭＡ，ＵＳ
Ａ）上の特定の位置にスポットした。スポットをより正確な位置に配置させるた
めに、３ｍｍ格子をバブルジェットプリンターで膜上に印刷した。ストリップを
２０のバッチ内で作製した。いったんすべてのストリップに適用したオリゴヌク
レオチドを乾燥させ、Ａｍｐｌｉｒａｄ光箱（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｅｓｓｅｘ，ＵＫ）内で短波長ＵＶに曝露した。
曝露の長さは、得られるスポットの強度に明らかな影響を持つことがわかり、本
発明者らのＵＶイルミネーター３０秒間が最適なスポット強度を与えることがわ
かった。オリゴヌクレオチドを膜に架橋した後、非結合オリゴヌクレオチドを、
０．５×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中での３７℃で２分間の２回の洗浄によって取
り除いた。ストリップを乾燥させ、使用の準備ができるまで室温にて保存した。
【００３４】 ハイブリッド形成プロトコール ジゴキシゲニン標識化２３Ｓ ｒＤＮＡアンプリコンを以下のプロトコールを
用いてオリゴヌクレオチドアレイにハイブリッド形成させた。それぞれの膜に番
号をつけ、０．５ｍｌの５×ＳＳＣ＋０．１％Ｎ−ラウリルサルコシン、０．０
２％ＳＤＳおよび１％ブロッキング剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む別々の２．５ｍｌの先端にスクリューのついたマイ
クロ遠心チューブに入れた。ジゴキシゲニンＰＣＲ産物をサーマルサイクラー内
で９５℃まで熱し、好ましいＰＣＲ産物を直接それぞれのチューブに加えた。ハ
イブリッド形成を４５分間、５０℃にて穏やかに攪拌しながら続けた。次いでス
トリップをチューブより取り除き、それぞれ２０ストリップに対して２５ｍｌの
０．２５×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で４回、３７℃にて２分間洗浄した。ハイ
ブリッド形成を、アルカリホスファターゼに共役した抗ジゴキシゲニン抗体を用
いて検出し、比色計にて検出した（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
系）。色発展は１５分〜１時間の間ではっきりと認識できた。
【００３５】 プライマーの査定 プライマーの効力を、２８の種を示している７９の保存細菌単離物（表１）か
らのＤＮＡ抽出物でまず査定した。すべての試験した単離物は産物を産出した。
およそ４２０ｂｐのバンドがグラム陽性菌で産出され、グラム陰性菌に対して３
９０ｂｐの１つが産出された。カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌ
ｂｉｃａｎｓ）もまた、同様のプロトコールを用いて処理したが、なんのＰＣＲ
産物も見られなかった。ＤＮＡ陰性増幅対照ではなんのバンドも見られなかった
。
【００３６】 濃縮培養液からのハイブリッド形成 試験の進行上、４０８の培養陽性Ｖｉｔｅｃ瓶からの試料を、陽性になった日
にＰＣＲにかけた。
【００３７】 ハイブリッド形成アッセイより得られた結果を、従来の微生物学（培養後表現
型同定）によって続けて得られたものと比較した。３５０の瓶（８３．７％）は
正確な同定を産出した。これらには、混合培養が正確に同定された９つ（２．２
％）が含まれた。同定された混合液には、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａ
ｅｒｕｇｉｎｏｓａ）＋エンテロコッカス フェアカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｆｅａｃａｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉ
ｎｏｓａ）＋ステノトロホモナス マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍ
ｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）＋エンテロコッカス フェアカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｆｅａｃａｌｉｓ）、ＣＮＳ＋緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびＣＮＳ＋エンテロコッカス フェアカリス（Ｅｎ
ｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅａｃａｌｉｓ）が含まれた。ブドウ球菌ＤＮＡは、
６つの瓶で同定されたが、微生物は続いて増殖はせず、このことはおそらく、濃
縮瓶のブドウ球菌ＤＮＡの汚染を示している。残りの４３（１０．５％）の瓶は
、オリゴヌクレオチドが標的とした細菌を含んでいないか、ＰＣＲ産物を持って
いなかったかどちらかである。
【００３８】 アッセイプロトコール 必要な溶液 （１）ポリメラーゼ連鎖反応混合液 フォワードプライマー ＳＴ２３ＳＰ６ リバースプライマー ＳＴ２３ＳＰ１０ ＰＣＲマスターミックスを、ＤＮＡポリメラーゼを除くＰＣＲに対するすべて
の成分、１２．５マイクロリットルの各プライマー、１マイクログラム／マイク
ロリットル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、５マイクロリットルの各ｄＮＴＰ、１００
ｍＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、２５０マイクロリットルの１０×ＤｎａＺｙｍｅ
緩衝液（Ｆｌｏｗｇｅｎ，Ｓｔａｆｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）、２．２ｍｌ
の水を含めて２．５ｍｌ容量で作製した。次いでこの混合液を２００マイクロリ
ットル反応チューブ内に４５マイクロリットル分液で分注し、１ユニット（０．
５マイクロリットル）のＴａｑポリメラーゼ（ＤｎａＺｙｍｅ）を必要とする直
前にこのチューブに添加した。
【００３９】 （２）マレイン酸緩衝液 ｐＨ（７．５）：５００ｍｌの水中、４．１３ｇ塩
化ナトリウムおよび５．５３ｇのマレイン酸、５Ｍ ＮａＯＨにてｐＨ調節。
【００４０】 （３）検出緩衝液 ｐＨ（９．５）：５００ｍｌの水中、６．０５ｇのトリス
塩基および２．９７ｇ ＮａＣｌ、１０Ｎ ＨＣｌにてｐＨ調節。
【００４１】 （４）ブロッキング溶液：５ｍｌの検出緩衝液中、０．１ｇ Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍブロッキング溶液：必要とする２時間前に作製。
【００４２】 （５）ＳＳＣ：（２０×）３Ｍ ＮａＣｌ＋０．３Ｍクエン酸ナトリウム。０
．２５×ＳＳＣに希釈し、使用の準備ができるまで３７℃にて保存。
【００４３】 （６）ＢＣＩＰ：１００％ジメチルホルムアミド中、５０ｍｇ／ｍｌ ５−ブ
ロモ−４−クロロ−３インドリル トルイジニウムリン酸塩。
【００４４】 （７）ＮＢＴ：７０％ジメチルホルムアミド中、７５ｍｇ／ｍｌ ニトロブル
ーテトラゾリウム塩
【００４５】 方法 本手順は、陽性Ｖｉｔｅｃｈ血液培養瓶（Ｂｉｏ−Ｍｅｒｉｏｕｘ，Ｆｒａｎ
ｃｅ）からの細菌を同定する可能性がある。グラム染色および継代のための培養
液の吸引時に、２〜４滴の陽性Ｖｉｔｅｃ培養液を２ｍｌの、０．５ｍｌの滅菌
水を含むスクリューが先端についたチューブに加え、チューブにチューブ番号を
表示した。
【００４６】 ＤＮＡ抽出（汚染レベル３研究室で実施すること） （１）スクリューが先端についたチューブを、密封ローター遠心器にて高速度
（１０，０００ｇ）で４分間遠心する。
【００４７】 （２）クラス１フードにおいて、ローターおよびチューブを開き、上清を捨て
る。
【００４８】 （３）水中で作製したリソスタフィン、１マイクログラム／ｍｌ溶液（Ｓｉｇ
ｍａ ＵＫ）を１００マイクロリットル加える。
【００４９】 （４）チューブをふたをした乾燥ブロック内におき、３７℃にて２０分間イン
キュベートする。
【００５０】 （５）乾燥ブロックを９５℃にし、１５分間放置する。 ＰＣＲおよびハイブリッド形成を、この時点で、実験室のオープンベンチにて
実施してよい。
【００５１】 ハイブリッド形成ストリップの調製 ストリップを、取扱説明書にしたがって（以下の工程１，２および３を置き換
えて）９６スポットを３８４ウェルマイクロタイタープレートより同時に印刷可
能にするＶＰ科学的（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）多重印刷系、または
以下の手順を使用して手動でのいずれかによって作製した。
【００５２】 ハイブリッド形成ストリップの手動産出 （１）バブルジェトプリンターを使用し、ナイロン膜（Ｍａｇｎａ ナイロン
、ＭＳＩ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏ ＭＡまたはＮｙｔｒａｎ Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇ
ｅ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ ＧｍｂＨ
，Ｇｅｒｍａｎｙ）の１８ｃｍ×３ｃｍ上に２０ストリップのグリッドを印刷す
る。
【００５３】 （２）次いでそれぞれのストリップ間の垂直部分を、解剖用メスにて切断し、
ストリップ間のスポットのにじみを避けるべきである。
【００５４】 （３）次いでおよそ０．３マイクロリッターの各オリゴヌクレオチド（水中１
ｍｇ／ｍｌ溶液）をそれぞれのストリップ上の好ましい位置にスポットすべきで
ある（図１を参照のこと）。
【００５５】 （４）いったん乾いたならば、膜をＡｍｐｌｉｒａｄ（ＧＲＩ ｉｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔｓ，ＵＫ）内で３０秒間、短波長ＵＶに曝露することによって架橋すべ
きである。
【００５６】 （５）次いで膜を２回、５０ｍｌの０．５×ＳＳＣ中で２分間洗浄し、空乾す
べきである。
【００５７】 （６）膜をこの時点で室温にて使用の準備ができるまで保存できる。
【００５８】 ＰＣＲ増幅 １マイクロリットルのＤＮＡ抽出物を、２００マイクロリットルＰＣＲチュー
ブ中の０．５マイクロリットルのＤｎｙａＺｙｍｅ（Ｆｌｏｗｇｅｎ）を含むＰ
ＣＲ４５マイクロリットルを混合液に加える。細菌ＤＮＡを含んでいないＰＣＲ
陰性対照をそれぞれのＰＣＲ反応の組と平行して実施しなければならない。 ＰＥサーマル２４００サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｌｔｄ．）に
おいて、９５℃で３０分間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間の５サイクル
、続いて９５℃で１５秒間、６５℃で３０秒間の２５サイクルを実施する。
【００５９】 ハイブリッド形成 （１）ＰＣＲ産物をサーマルサイクラー中で５分間９５℃まで熱する。 （２）いくつかのハイブリッド形成ストリップを標識化し、解剖用メスにて切
り取り、０．５ｍｌのハイブリッド形成溶液（５×ＳＳＣ、０．０１％ ＳＤＳ
、０．０１％ Ｎ−ラウリルサルコシン、１％ブロッキング剤（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙ））を含むスクリューが末端につい
たチューブに入れる。 （３）ＰＣＲ反応液を好ましいチューブにピペットで移す。 （４）ハイブリッド反応液を５０℃にて４５秒間、穏やかに攪拌しながら保持
する。
【００６０】 ハイブリッド形成の検出 （１）ストリップを４回、２５ｍｌの０．２５×ＳＳＣ＋０．１％ ＳＤＳ中
、３７℃にて２分間洗浄する。 （２）ストリップに５ｍｌのブロッキング溶液を注ぎ、１５分間放置する。 （３）ブロッキング溶液を流しとり、１マイクロリットルの抗ジゴキシゲニン
抗体共役物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含
む５ｍｌのマレイン酸緩衝液に置換する。１０分間放置する。 （４）ストリップを４回、２５ｍｌのマレイン酸緩衝液中で１分間、洗浄する
。 （５）ストリップを検出緩衝液に浸す。 （６）４５マイクロリットルのＢＣＩＰと３５マイクロリットルのＮＢＴを５
ｍｌの検出緩衝液に加えることで５ｍｌの検出溶液を調製する。 （７）検出緩衝液をストリップより流しとり、以上で調製した検出溶液で置換
する。 （８）次いで、ストリップを１５分間暗所に放置し、検出可能なハイブリッド
形成を試験する。結果を記録し、４５分後、ストリップを滅菌水で洗浄して現像
を終了させる。
【００６１】 本発明の方法は、以上で記述したもの以外の設定、臨床および非臨床両方、お
よび非医学的、農学、たとえば水供給の試験などの環境適用で、および単離後の
純粋な培養液にて細菌を同定するのに使用できる。本方法は、以上で記述した他
の同様の分子診断技術の問題を克服する。血液または血液培養液、または脳脊髄
液、尿、関節液、綿棒標本および膿瘍のような他の臨床的標本中のそのような細
菌の迅速な診断を可能にする。潜在的に細菌２３Ｓ ｒＤＮＡの特徴的な配列を
増幅するのに使用することができる万能プライマーの組および実験条件を提供す
る。とりわけ、臨床的に重要な細菌の同定のためのハイブリッド形成アッセイで
同時に使用できる特異的オリゴヌクレオチド標的の系列を提供する。
【００６２】
【表７】
【００６３】
【表８】
【００６４】 脚注 ＳＴＨ＝セントトーマス病院（Ｓｔ．Ｔｏｍａｓ’ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、Ｇ
Ｈ＝ガイ病院（Ｇｕｙ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、ＬＨ＝ルイスハム病院（Ｌｅ
ｗｉｓｈａｍ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、ＣＦ＝嚢胞性線維症、ＮＣＴＣ＝基準培養
株国際基金、ＶＲＥ＝バンコマイシン耐性腸球菌、ＭＲ＝メチオニン耐性、ＭＳ
＝メチオニン感受性
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、保持ストリップに結合した１つのとても一般的なオリゴヌクレオチド
プローブのパターンを示している。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年３月５日（２００１．３．５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項３２】 配列番号１３の配列をもつ、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を同定するためのオリゴヌクレオチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】 広い範囲の医学的に重要なグラム陽性およびグラム陰性菌培養液より、これら のプライマーによって産出されたＰＣＲ産物を、分類学群を同定するように設計 されたオリゴヌクレオチドのアレイに対するハイブリッド形成によって特性化す る。一般的には４時間未満かかるこの手順を用いて、本発明者らは、広範囲の族 および種を同定できた。このアプローチは、細菌および細菌の混合物を、原因病 原体または病原体群の先行知識の必要なしに、分子滴方法によって同定すること を可能にする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】 まとめると、本方法は、１つのプライマーとして、配列 ５’ＧＣＧＡＴＴＴＣＹＧＡＡＹＧＧＧＧＲＡＡＣＣＣ を持っているＤＮＡから本質的になる１つまたはそれ以上のＤＮＡ分子を含む分 子変性プライマー組、配列 ５’ＴＴＣＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＣＧＧＴＡＣＴ を持っているＤＮＡから本質的になる他のプライマーを用いて試料中に存在する ２３Ｓ ｒＤＮＡの一部分を増幅すること、および得られたアンプリコンを、試 料中に存在する可能性のある１つまたはそれ以上の細菌を同定するように設計し た１つまたはそれ以上のハイブリッド形成にて試験することを含む、試料中の細 菌を同定するための方法を含む。本方法での使用に好適であるオリゴヌクレオチ ドの組において、オリゴヌクレオチドは、単一試験で、したがって、ハイブリッ ド形成条件の単一の設定の下で増幅反応の産物をハイブリット形成するように設 計する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】 国際特許明細書第ＷＯ８８／０９３９７号は、１６および２３Ｓリボソーム核 酸の特定の領域にハイブリッド形成する多くのオリゴヌクレオチドの調製を記述 している。国際特許明細書第ＷＯ９０／１４４４４号および米国特許第５，５９ ２，９７８号、第５，５２１，３００号、第５，２９２，８７４号は、１つの微 生物またはその１つの属または亜属種に特異的であるリボソーム核酸の特定の領 域に結合する個々のプローブの調製を記述している。しかしながら、本発明と対 照的に、これらの発行物のどれもが、概念で、そして実際に、細菌核酸の増幅プ ライマーの１つの特定の対での増幅の後に、２３Ｓリボソーム核酸の固有の特定 領域にハイブリッド形成することによって同時に働くように設計したオリゴヌク レオチドの組を開示はしていない。本発明にしたがって、使用してもよいオリゴ ヌクレオチドの組は、同一のハイブリッド形成条件下で広範囲のアンプリコンと 平行してハイブリッド形成し、したがって広範囲の異なる微生物の同定のための 単一試験において使用することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】 以下に列記する配列の、オリゴヌクレオチドプローブは、一般的に病院で実施 される試験においてさまざまな組合せで使用する場合に、かなり好結果であるこ とが証明された。これらは、多くの異なる種の同定のためのパネルまたはアレイ で使用できる。理論的に、使用したオリゴヌクレオチドの数および同定できる種 の数に制限はない。理想的には、使用したオリゴヌクレオチドは、それぞれの１ つの微生物種に、そしてその種のすべてのメンバーにのみハイブリッド形成すべ きである。したがって理想的なアレイによって、種特異的スポットからなる固有 のプロフィールが見られ、種レベルまでの同定を可能にする。実際には、２つま たはそれ以上のオリゴヌクレオチドスポットが多くの種に対して必要である可能 性があり、いくつかの場合、いくつかのそのようなスポットが、種内の変異体の 同定を可能にする可能性がある。さらに、いくつかの同定は、個々の種の個々の オリゴヌクレオチドへのハイブリッド形成の相対的な強度を比較することで実施 できる。ハイブリッド形成の査定は、視覚または自動化方法にて定量できる。 たとえば、２７のオリゴヌクレオチドを、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、プロテウス ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａ ｂｉｌｉｓ）、エンテロコッカス フェアシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅａｃｉｕｍ）、エンテロコッカス フェアカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕ ｓ ｆｅａｃａｌｉｓ）、同様に黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ ｓ ａｕｒｅｕｓ）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒ ｉａ）種、ステノトロホモナス マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏ ｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、ブルクホルデリア カパシア（Ｂｕｒｋｈ ｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ ｏｌｉ）の同定のために使用した。したがって、通常、一般的に病院試料または 他の状況で試験する試料中に存在する８、１０またはそれ以上の微生物のみでな く、遭遇する可能性のある他の微生物に対してもプローブするオリゴヌクレオチ ドを提供することが望ましい可能性がある。好ましくは、少なくとも３０の異な る微生物種に対するプローブが、試験時に使用する支持基質上に存在している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｂ 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 フレンチ，ゲーリー ローレンス イギリス国ロンドン エスイー３ ０エイ ディー モーデン ロード 19，フラット ５ (72)発明者 アンソニー，リチャード マイケル イギリス国ケント ティーエヌ１ １エル ジェイ タンブリッジ ウェルズ リム ヒル ロード 19，フラット １ (72)発明者 ブラウン，チモシー ジェームス イギリス国ロンドン エスダブリュー18 ４エスエイ ラベンスバリー ロード 47 Ｆターム(参考） 4B024 AA13 CA09 HA11 4B029 AA21 AA23 BB20 CC08 FA03 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ42 QR08 QR32 QR55 QR62 QR82 QS25 QS34 QX01

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 試料中の細菌を同定する方法であって、１つのプライマーと
    して、配列 ５’ＧＣＧＡＴＴＴＣＹＧＡＡＹＧＧＧＧＲＡＡＣＣＣ をもつＤＮＡから本質的になる１以上のＤＮＡ分子を含む変性プライマーの組、
    配列 ５’ＴＴＣＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＣＧＧＴＡＣＴ をもつＤＮＡから本質的になる他のプライマーを用いて試料中に存在する２３Ｓ
    ｒＤＮＡの一部分を増幅すること、および得られたアンプリコンを、試料中に
    存在する可能性のある１以上の細菌を同定するように設計した１以上のオリゴヌ
    クレオチドへのハイブリッド形成にて試験することを含む、試料中の細菌を同定
    する方法。
  2. 【請求項２】 少なくとも８つの細菌種を試験する、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 試験する微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
    ｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、緑
    膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒ
    ｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．
    ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、プロテウス（
    Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐｐ．）肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ）およびコアグ
    ラーゼ陰性ブドウ球菌の少なくとも１つを含む、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 少なくとも１０の細菌種を試験する、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 試験する微生物に、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅ
    ｒｕｇｉｎｏｓａ）、プロテウス ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉ
    ｌｉｓ）、エンテロコッカス フェアシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅ
    ａｃｉｕｍ）、エンテロコッカス フェアカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
    ｆｅａｃａｌｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒ
    ｅｕｓ）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、
    ステノトロホモナス マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍ
    ａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、ブルクホルデリア カパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ
    ｉａ ｃｅｐａｃｉａ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の
    少なくとも１つを含む、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 オリゴヌクレオチドプローブまたはプローブ類が、配列番号
    ３〜７、９〜１３、１５〜１９、２１〜２８、３０〜３２、３９〜４１、４４〜
    ４９、５１および５３〜５８からなる群より選択した配列（群）をもつ請求項１
    記載の方法。
  7. 【請求項７】 オリゴヌクレオチドプローブまたはプローブ類が、配列番号
    ８、１４、２０、２９、３３〜３８、４２、４３、５０、５２および５９からな
    る群より選択した配列（群）を持つ、請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 オリゴヌクレオチドプローブまたはプローブ類が、配列番号
    ３〜５９からなる群より選択した配列（群）を持つ、請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 オリゴヌクレオチドプローブまたはプローブ数が、配列番号
    ６０〜６３からなる群より選択した配列（群）を持つ、請求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】 増幅をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施する
    、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
  11. 【請求項１１】 増幅を転写仲介増幅によって実施する、請求項１〜９のい
    ずれか１項記載の方法。
  12. 【請求項１２】 多数のオリゴヌクレオチドプローブを支持体物質へ接着さ
    せて使用する、上記請求項のいずれか１項記載の方法。
  13. 【請求項１３】 配列 ５’ＧＣＧＡＴＴＴＣＹＧＡＡＹＧＧＧＧＲＡＡＣＣＣ をもつＤＮＡを本質的に含む変性プライマー組。
  14. 【請求項１４】 配列 ５’ＴＴＣＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＣＧＧＴＡＣＴ をもつＤＮＡを本質的に含む変性プライマー組。
  15. 【請求項１５】 標識化した配列を持つ、請求項１３または１４記載のＤＮ
    Ａ配列。
  16. 【請求項１６】 請求項１５記載のジゴキシゲニン標識化ＤＮＡ配列。
  17. 【請求項１７】 請求項６で定義した配列をもつ１以上のＤＮＡ分子から本
    質的になる、１以上のオリゴヌクレオチド。
  18. 【請求項１８】 請求項７で定義した配列をもつ１以上のＤＮＡ分子から本
    質的になる、１以上のオリゴヌクレオチド。
  19. 【請求項１９】 請求項８で定義した配列をもつ１以上のＤＮＡ分子から本
    質的になる、１以上のオリゴヌクレオチド。
  20. 【請求項２０】 請求項９で定義した配列をもつ１以上のＤＮＡ分子から本
    質的になる、１以上のオリゴヌクレオチド。
  21. 【請求項２１】 固体担体上に固定した、請求項１７〜２０のいずれか１項
    記載の１以上のオリゴヌクレオチド。
  22. 【請求項２２】 請求項６、７、８、または９に定義した1以上のオリゴヌ
    クレオチドプローブを所持する固体支持体物質。
  23. 【請求項２３】 いくつかのまたはすべてのプローブを、化学的改変または
    追加塩基の方法によって基質へ結合させる、請求項２２記載の支持体物質。
  24. 【請求項２４】 ハイブリッド形成強度を増加させるために、追加チミン塩
    基をプローブの３プライム末端に接着させる、請求項２３記載の支持体物質。
  25. 【請求項２５】 請求項１に定義した１以上の増幅プライマーを含む、細菌
    の同定用診断キット。
  26. 【請求項２６】 請求項６、７、８、または９に定義した１以上のオリゴヌ
    クレオチドプローブを含む細菌の同定用診断キット。
  27. 【請求項２７】 請求項６、７、８、または９で定義した１以上オリゴヌク
    レオチドプローブを保持している固体支持体物質を含む細菌の同定用診断キット
    。
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