KR20080104118A - 패혈증 관련 질환 원인 세균의 감별 및 동정을 위한올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이와 이를이용한 검출 방법 - Google Patents

패혈증 관련 질환 원인 세균의 감별 및 동정을 위한올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이와 이를이용한 검출 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20080104118A
KR20080104118A KR1020087017688A KR20087017688A KR20080104118A KR 20080104118 A KR20080104118 A KR 20080104118A KR 1020087017688 A KR1020087017688 A KR 1020087017688A KR 20087017688 A KR20087017688 A KR 20087017688A KR 20080104118 A KR20080104118 A KR 20080104118A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
bacteria
nos
species
sepsis
Prior art date
Application number
KR1020087017688A
Other languages
English (en)
Inventor
김철민
박희경
장현정
송은실
Original Assignee
주식회사 진인
박희경
김철민
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 진인, 박희경, 김철민 filed Critical 주식회사 진인
Priority to KR1020087017688A priority Critical patent/KR20080104118A/ko
Publication of KR20080104118A publication Critical patent/KR20080104118A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/629—Detection means characterised by use of a special device being a microfluidic device
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 패혈증(Sepsis) 관련 질환 원인 세균의 검출 및 감별 진단에 유용한 올리고뉴클레오티드와 이를 이용한 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 패혈증 관련 질환 원인 세균의 과변이 염기서열인 ITS 표적 부위로부터 고안된 그람양성(gram positive)세균 특이적과 그람음성(gram negative) 세균 특이적 올리고뉴클레오티드와 패혈증 관련 질환 원인 세균의 속 특이적이고 종 특이적인 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나 이상을 프로브로 포함하는 마이크로어레이, 그리고 이를 이용한 검출 방법 및 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 세균에 공통적으로 존재하는 염기서열로 증폭하여 패혈증 관련 질환 원인 세균의 존재 유무와 함께 그람양성과 그람음성을 구별하고 속과 종을 동시에 정확히 감별함으로써 패혈증을 일으키는 감염원을 정확하게 제거할 수 있는 항생제 치료가 가능하게 하고, 빈번히 발생하는 항생제의 오남용을 예방할 수 있게 하며, 환자의 병원 체류기간의 절감과 이에 따른 진료비 비용의 감소가 가능하고, 더 나아가서는 합병증 예방과 사망률 감소 효과도 이룰 수 있는 장점이 있다.

Description

패혈증 관련 질환 원인 세균의 감별 및 동정을 위한 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이와 이를 이용한 검출 방법 {OLIGONUCLEOTIDE FOR DETECTION OF BACTERIA ASSOCIATED WITH SEPSIS AND MICROARRAYS AND METHODS FOR DETECTION OF THE BACTERIA USING THE OLIGONUCLEOTIDE}
본 발명은 패혈증(Sepsis) 관련 질환 원인 세균의 검출 및 감별 진단에 유용한 올리고뉴클레오티드와 이를 이용한 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 패혈증 관련 질환 원인 세균의 과변이 염기서열인 ITS 표적 부위로부터 고안된 그람양성(gram positive)세균 특이적과 그람음성(gram negative) 세균 특이적 올리고뉴클레오티드와 패혈증 관련 질환 원인 세균의 속 특이적이고 종 특이적인 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나 이상을 프로브로 포함하는 마이크로어레이, 그리고 이를 이용한 검출 방법 및 진단 키트에 관한 것이다.
패혈증(Sepsis)이란 전신적인 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRD)이 여러 미생물로부터 발생했을 때를 의미한다. 패혈증은 위장관이나 피부로부터 인접한 조직에 공생하는 미생물의 유입으로 발생하여, 비뇨생식기, 담즙, 폐, 또는 위장관 등의 부분적 감염이 혈액 감염을 유발할 수 있다. 또한 정맥주사 등을 통해 직접적으로 혈액으로 침투될 수도 있다. 즉 이런 미생물 의 감염에 의해서 숙주(host)인 사람의 반응이 다양한 형태로 나타나게 되는데, 고열이나 저열, 오한, 빈맥(tachycardia), 빈호흡(tachypnea) 등의 염증 반응으로 예고되는 것을 말한다. 패혈증은 원인을 조기에 신속하고 정확하게 진단하지 못할 경우에는 중증 패혈증(severe sepsis)이나 패혈성 쇽(septic shock), 또는 합병증으로서 폐, 신장, 간, 순환기 등의 기능장애가 초래되는 다장기 기능장애 증후군(multiple organ dysfuntion syndrome, MODS)으로 발전하게 되고 사망까지 이르게 되는 매우 치명적인 질환이다. 그러므로 패혈증의 정확한 진단을 위해서는 혈액이나 감염 부위로부터 원인 미생물을 정확하게 분리해 내는 것이 매우 중요하다.
패혈증은 미생물에 감염된 모든 사람들에게서 발생할 수 있으나, 그 중에서도 특히 매우 어린 신생아나 나이든 노인, 면역력이 약해진 경우, 화상이나 교통사고 등으로 인한 상처를 가진 사람, 또는 알콜중독이나 약물중독자, 병원내 카테터(catheter)를 이용한 치료를 받고 있는 사람 등 병원내 입원환자에서 더 높은 빈도로 나타난다.
패혈증은 20-50％의 사망률을 보이는 대표적인 난치병으로써, 전세계적으로 매년 1,800 만 명이상이 중증 패혈증으로 발전하는 원인이 되며, 매일 약 1,400 여명이 사망하는 주요 원인으로 그 빈도는 직장암이나 유방암의 5-10 배에 이르는 것으로 보고 된다. 매년 미국에서는 215,000 명 이상, 유럽에서는 135,000 명 이상이 사망하고 있고, 미국에서는 암 등을 포함한 전체 사망 원인의 10 가지 안에 들고 있다. 이러한 심각성은 노령화나 만성 질환자의 수명 연장, 에이즈 등의 문제 때문이며 우리나라에서도 계속해서 증가할 것으로 예상된다. 따라서 패혈증 관련 질환 원인균을 조기에 발견하여 예방하기 위한 빠르고 정확한 진단방법 개발이 시급한 실정이다((Ann Internal Med, 115(6):457-469(1991), International Sepsis Forum : second edition(2003), 생화학.분자생물학소식, 11(2):32-34(2004), Crit Care Med, 29(7):S109-S116(2001), Crit Care Med, 29(7):1303-1310(2001), N Engl J Med, 348:1546-1554(2003)).
패혈증은 여러 가지 미생물로 인해 나타나는데, 진균이나 바이러스 등에 의해서도 일어나지만 대부분의 원인 미생물은 세균이다. 패혈증의 30-60％와 패혈성 쇽의 60-80％의 환자가 혈액 배양시에 3 분의 2 정도는 그람음성세균이고 10-20％가 그람양성세균이다. 최근에는 그람음성세균보다 그람양성세균이 증가하는 추세에 있다. 이런 그람음성세균과 그람양성세균은 세포벽 구조가 다름에 따라 면역 활성이 차이가 나게 되고, 이에 따른 항생제 처방이 다르게 되므로 일차적으로 그람음성세균과 그람양성세균을 구분하는 것이 중요하고, 나아가서는 감염된 균종을 정확하게 동정하는 것이 패혈증의 조기치료에서 가장 주요한 문제이다((Crit Care Med, 27(8):1608-1616(1999)).
현재까지 패혈증 진단을 위한 방법에는 혈액이나 감염 부위로부터의 채취물을 배양하는 방법이 가장 널리 알려져 있다. 그러나 이는 임상 검체에서 양성 결과율이 현저히 낮고 위음성 결과를 초래하기 쉽다. 최근들어 배양을 위한 자동화 기기에 의하여 24 시간에서 48 시간 내에 검출이 가능하지만 가격이 고가이며 세균마다 요구하는 배지가 다르고, 특히 항생제를 투여 받은 경험이 있거나, 증식 속도가 매우 느려 천천히 배양되거나, 배양조건이 까다로운 세균은 검출이 더욱더 어려운 한계가 있다(Clin Microbiol Rev, 10(3):444-465(1997)).
이에 최근들어 프로브 혼성화 원리를 이용하여 수십개부터 수만개의 아주 적은 양의 유전물질을 고형지지체에 고밀도로 붙일 수 있게 되어 동시에 많은 유전자를 분석할 수 있는 DNA 칩이 아주 유용한 기술로 각광받고 있다. 이러한 분자생물학적 진단 기술을 이용한 동정 방법은 증식 속도가 매우 느리거나 배양조건이 까다로운 세균 또는 알려져 있지 않은 세균 등을 배양 및 임상 검체에서 한번에 빠르고 민감하며 정확하게 검출할 수 있는 기술적으로 매우 진보적인 방법이다.
상업적으로 알려져있는 방법으로는 국내의 주식회사 비엠에스에서 많은 시간과 고난도 기술을 요구하는 sequencing 방법보다는 빠르고 간편한 pyrosequencing 으로 질병 유발 병원성 미생물을 동정하는 방법을 제공하는데, 이는 종 구분을 위한 표적 부위로써 세균의 매우 보존적인 염기서열인 16S rDNA 유전자를 이용하고 있어 다양한 미생물을 동정하는데 한계가 있고, 한번에 한가지의 미생물 검출만 가능하고 동시에 여러 미생물을 검출할 수 없는 단점이 있다.
국내특허로 출원된 병원성 미생물을 검출하는 선행 기술로 특허출원번호 10-2002-0016679 는 multiplex PCR 법을 이용하여 9 종의 병원성 미생물을 검출할 수 있으나 본 발명에서의 동정 가능한 균종보다 현저히 적은 수이고, 주 목적이 식중독을 일으키는 병원균의 검출인데다 방법상으로는 다수의 프라이머(primer)에 의한 번거로운 조작으로 인해 오염문제나 검출결과에 영향을 미치게 되는 단점이 있다.
다른 국내특허로 특허출원번호 10-2003-0005341 는 본 발명과 같은 ITS 부위로부터 세균성 감염질환 원인균을 검출하는 DNA 칩 기술을 나타내는데, 이는 12 종 의 균 검출이 가능하나 본 발명의 패혈증 관련 질환 원인 세균과 동일한 균종은 하나도 없다. 또 다른 특허인 특허출원번호 10-2005-7018087 는 본 발명과 같은 DNA 칩 기술을 이용하여 44 종 이상의 병원성 균을 검출하는 핵산 탐침에 관한 것으로, 본 발명과 같은 ITS 표적 부위에서는 패혈증 관련 질환 원인 세균과 동일한 균종은 전혀 없고, 본 발명과 동일하게 검출 가능한 몇몇의 균종에서도 ITS 표적 부위가 아닌 염기서열 다양성이 적은 23S rDNA 유전자를 이용하고 있다. 이는 균종만 검출이 가능하기 때문에 본 발명의 세균 특이적, 그람양성과 그람음성의 특이적 구분과 속과 종을 특이적으로 한번에 구분할 수 있는 것과는 확연히 다르고 검출의 정확성에 한계가 있다.
여러 문헌에서 감염세균 동정을 위한 표적 부위로 세균의 매우 보존적인 염기서열인 16S rDNA(J Microbiol Methods, 55:541-555(2003), Pediatrics, 95:165-169(1995), J Medi Microbiol, 52:685-691(2003), J Clin Microbiol, 32:335-351(1994), Microbiol, 148:257-266(2002), Pediatr Res 58:143-148(2005))를 기초로 하고 있는 것은 염기서열 변이 영역이 매우 작아서 동정 가능한 균종에는 한계가 있다. 또한 최근에는 아직 염기서열이 많이 밝혀지지 않은 23S rDNA(J Clin Microbiol, 38:781-788(2000), J Microbiol Methods, 53:245-252(2003), J Clin Microbiol, 42:1048-1057(2004))를 기초로 세균을 검출하는 방법이 있으나 이 기술로는 서로 다른 몇몇 세균만을 검출하거나 한 속에서 몇 종의 원인균 만을 검출하는 방법이라는 한계가 있다.
Technical Problem
상기와 같은 문제점을 해결하고자 본 발명은 염기서열 변이가 많은 과변이 영역(hypervariable region)을 보유한 ITS(internal transcribed spacer region, 내부전사지역) 영역 유래의 패혈증 관련 질환 원인 세균의 그람양성(gram positive)과 그람음성(gram negative)을 구분하는 올리고뉴클레오티드, 또한 패혈증 관련 질환 원인 세균의 속 특이적이고 종 특이적인 올리고뉴클레오티드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 프로브로 포함하는 패혈증 관련 질환 원인 세균의 감별 진단용 마이크로어레이를 제공하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 본 발명의 마이크로어레이를 이용한 패혈증 관련 질환 원인 세균의 감별 및 검출을 위한 동정방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 본 발명의 마이크로어레이를 이용한 패혈증 관련 질환 원인 세균의 감별 및 검출을 위한 진단키트를 제공하는데 있다.
Technical Solotion
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 2 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 패혈증 관련 질환 원인 세균 중 그람양성세균 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3 내지 6 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 패혈증 관련 질환 원인 세균 중 그람음성세균 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 7 내지 30 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 패혈증 관련 질환 원인 세균의 속 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 31 내지 104 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 패혈증 관련 질환 원인 세균의 종 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드는 세균의 ITS 과변이 염기서열 영역의 다중서열정렬(multiple alignment)에 의거하여 고안하였고, 이는 그람양성세균과 그람음성세균에 특이적이고, 세균의 속과 종 특이적인 감별을 위한 특이적 핵산 분자 증폭 방법에 유용한 프라이머 서열로 사용될 수 있고, 또한 혼성화 방법에 유용한 프로브 서열로도 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 패혈증 관련 질환 원인 세균의 감별을 위한 그람양성세균 특이적 및 그람음성세균 특이적 프로브와 원인 세균 속 특이적 및 종 특이적 프로브 세트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 패혈증 관련 질환 원인 세균의 그람양성세균 특이적 및 그람음성세균 특이적 감별과 원인 세균 속 특이적 및 종 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 진단키트에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 방사성(radioactive) 또는 비방사성(non-radioactive) 표지될 수 있으며, 비방사성 표지는 통상의 바이오틴(biotin), Dig(digoxigenin), FRET(fluorescence resonance energy transfer), 형광(Cy5, Cy3 등) 표지 등을 포함한다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브로 사용될 수 있으며, 별도의 표적 DNA 증폭을 위한 프라이머가 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 패혈증 관련 질환 원인 세균의 그람양성세균 특이적 및 그람음성세균 특이적 감별과 원인 세균 속 특이적 및 종 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 프로브로 이용하여 이를 지지체에 부착하여 포함하는 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 프로브는 데옥시뉴클레오티드(DNA), 리보뉴클레오티드(RNA) 같은 전통적인 핵산뿐만 아니라, 펩타이드뉴클레오티드(PNA), 락크드뉴클레오티드(LNA) 및 디-헥시톨뉴클레오티드(HNA)에서 선택된 핵산유사체도 될 수 있다. 상기 핵산유사체는 핵산분해효소(nuclease)등 효소에 안정하고, 구조상으로 염기서열에 매우 특이적 결합을 하며, 열에 안정적인 장점이 있다.
본 발명의 마이크로어레이에서, 상기 프로브는 센스(sense) 또는 안티센스(antisense)용으로 제작될 수 있다. 따라서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 서열번호들의 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 마이크로 어레이에 있어서, 상기 프로브는 당업계에 널리 알려진 세균에만 공통적으로 존재하는 세균 특이적 뉴클레오티드를 더 포함할 수 있으며, 예컨대 한국특허출원 제 2004-68313 호의 서열번호 46 과 같은 세균의 23S rDNA 염기서열에서 세균에만 공통적으로 존재하는 세균 특이적 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 지지체는 슬라이드글라스, 플라스틱, 멤브레인, 반도체 칩(semiconductive chip), 실리콘, 젤(gel), 나노(nano) 재료, 세라믹, 금속재료, 광섬유 또는 이들을 조합하여 만들어지는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 마이크로어레이는 당업계에 알려진 통상의 핀 마이크로어레이(pin microarray)(Microarray printing technology, Don Rose, Ph.D., Cartesian Technologies, Inc., Anal Biochem, 320(2):281-91(2003)), 잉크젯(ink jet)(Nat Biotech, 18;438-441(2000), Bioconjug Chem, 13(1);97-103(2002)), 포토리소그래피(photolithography)(Cur Opinion Chem Biol, 2;404-410(1998), Nature genetics supplement, 21:20-24(1999)), 또는 전기어레이(electric array)(Ann Biomed Eng. 20(4):423-37(1992), Psychiatric Genetics, 12;181-192(2002)) 방법등으로 제작될 수 있다.
본 발명의 마이크로어레이는 진단키트의 형태로 제공될 때, 본 발명의 마이크로어레이외에 표적 DNA 를 분리하기 위한 추출용 시약, 표적유전자를 증폭하기 위한 프라이머가 포함된 PCR 키트, 혼성화 반응용액, 비혼성화 반응 DNA 세척용 용액, 커버슬립, 염료, 비염료 결합 세척용 용액 및 사용설명서 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시료에 존재하는 핵산을 분리하는 단계, 상기 분리된 핵산 중 표적 DNA 를 증폭하는 단계, 상기 증폭된 DNA 를 마이크로어레이 상의 프로브와 혼성화시키는 단계, 및 상기 형성된 하이브리드의 시그날을 검출하는 단계를 포함하는 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 상기 표적 DNA 를 증폭하는 단계는 일반적인 PCR 반응뿐만 아니라, Hot-start PCR, Nested PCR, Multiplex PCR, RT-PCR(reverse transcriptase PCR), DOP(degenerate oligonucleotide primer) PCR, Quantitative RT-PCR, In-Situ PCR, Micro PCR, 또는 Lab-on a chip PCR 반응과 같은 변형된 PCR 반응과 RCA(rolling circle amplification) 등의 등온증폭(isothermal amplification)방법을 이용할 수도 있다.
또한 위의 증폭단계를 거치거나 또는 거치지 않고 tyramide signal amplification(Nucleic Acids Res. 30;e4(2002))이나 gold nanoparticle probe 와 Ramanactive dye(Science, 297:1536-1540(2002)), branched DNA 와 같은 probe amplification 과 signal amplification 반응을 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 시료는 혈액, 체액, 조직, 객담, 변, 뇨 또는 고름 등일 수 있으며, 핵산의 분리는 통상의 DNA 또는 RNA 분리방법이나 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, DNA 증폭은 통상의 PCR 방법으로 수행될 수 있으며, PCR 검출 방법은 통상의 아가로즈 겔을 이용하여 전기영동 분석 방법으로 수행하거나, 마이크로어레이 시그날 검출은 통상의 Cy5 또는 Cy3 등 형광 염료 결합 및 시그날 검출용 스캐너를 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 그람양성세균(서열번호 1 번에서 2 번) 및 그람음성세균(서열번호 3 번에서 6 번), 박테로이즈 속(서열번호 7 번에서 10 번) 및 종(서열번호 31 번에서 40 번), 엔테로코커스 속(서열번호 11 번에서 12 번) 및 종(서열번호 41 번에서 47 번), 엔테로박터 속(서열번호 17 번) 및 종(서열번호 48 번에서 55 번), 에스케리키아 콜리 종(서열번호 56 번에서 58 번), 헤모필러스 속(서열번호 13 번) 및 종(서열번호 59 번에서 66 번), 클렙시엘라 속(서열번호 14 번에서 17 번) 및 종(서열번호 67 번에서 72 번), 리스테리아 속(서열번호 18 번에서 20 번) 및 종(서열번호 73 번에서 81 번), 슈도모나스 속(서열번호 21 번에서 24 번) 및 종(서열번호 82 번에서 86 번), 세라티아 속(서열번호 25 번에서 26 번) 및 종(서열번호 87 번에서 90 번), 스타필로코커스 속(서열번호 27 번에서 28 번) 및 종(서열번호 91 번에서 95 번), 스트렙토코커스 속(서열번호 29 번에서 30 번) 및 종(서열번호 96 번에서 104 번)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 세균을 동시에 탐지하는 것을 특징으로 하는 패혈증 관련 질환 원인 세균의 감별 및 검출 방법을 제공할 수 있다. 따라서 본 발명은 단일 검체로부터 패혈증 관련 질환 원인 세균의 그람양성과 그람음성 감별과 함께 하나 또는 여러 세균의 검출이 동시에 가능한 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 패혈증 관련 질환 원인 세균의 그람양성세균 특이적 및 그람음성세균 특이적 감별과, 원인 세균의 속 특이적 및 종 특이적 감별을 위해 고안된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 하나의 염기서열 차이를 기본으로 하는 SBE(Single base extension), Sequencing, RFLP(Restriction fragment length polymorphism), REA(Restriction endonuclease analysis) 등을 이용한 검출 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 마이크로어레이를 이용하여 패혈증 관련 질환 원인 세균의 존재 유무, 그람양성세균 및 그람음성세균 감별, 원인균 속 및 종을 감별하는 방법은 하기 단계로 구성된다 :
(
Figure 112008051883209-PCT00001
) 필요한 경우, 배양 또는 임상 검체 등에서 다중 핵산의 분리,
(
Figure 112008051883209-PCT00002
) 필요한 경우, 하나 이상의 적합한 프라이머 쌍으로 상기 세균의 표적 서열 또는 그 일부의 증폭,
(
Figure 112008051883209-PCT00003
) 단계 (
Figure 112008051883209-PCT00004
) 및/또는 (
Figure 112008051883209-PCT00005
)에서 확보된 다중 핵산과, 표 1 내지 표 4 에 나타낸 그람양성세균 및 그람음성세균 특이적 올리고뉴클레오티드와 원인 세균의 속 및 종 특이적 올리고뉴클레오티드 즉, 프로브 서열, 프로브 역서열 또는 프로브 상보 서열로 반응할 수 있는 하나 이상의 프로브의 혼성화,
(
Figure 112008051883209-PCT00006
) 단계 (
Figure 112008051883209-PCT00007
)에서 형성된 하이브리드의 검출,
(
Figure 112008051883209-PCT00008
) 단계 (
Figure 112008051883209-PCT00009
)에서 얻은 혼성화 시그날로부터, 상기 패혈증 관련 질환 원인 세균의 감염 가능성에 관한 추정.
본 발명의 마이크로어레이의 바람직한 구현 예에 따르면, 단계 (
Figure 112008051883209-PCT00010
)에서 지지체를 구성하고 있는 프로브 구성의 다양성과 하나 이상의 프로브들의 조합인 것을 특징으로 한다. 보다 자세하게는, 동시에 그람양성세균과 그람음성세균을 감별하고, 원인균 속과 종을 검출할 수 있는 동일한 혼성화 및 세척 조건하에서, 상기 프로브들이 그들의 표적 부위들에 동시에 혼성화하도록 최적화된 것을 특징으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 지지체에 부착된 패혈증 관련 질환 원인 세균의 그람양성세균과 그람음성세균의 감별 및 원인 세균의 속과 종의 감별을 위한 프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이는 단 1 회의 실험으로 하나의 검체로부터 동시에 그람양성 또는 그람음성세균을 구분하고, 원인균 속 및 종의 감별이 가능한 신속하고 정확한 마이크로어레이를 제공한다.
또한 본 마이크로어레이에 포함되지 않은 종일 경우 최소한 속 레벨에서 검출이 가능하고, 포함되지 않은 속의 종일 경우 세균 존재 여부의 검출이 가능하다.
도 1 은 본 발명의 전체 흐름도를 간략하게 나타낸 도면이다.
도 2 는 생물학적 시료에서 패혈증 관련 질환 원인 세균을 증폭하는데 사용되는 표적 부위와 프라이머 및 프로브의 위치를 보여주는 도면이다.
도 3 은 본 발명의 구체예의 패혈증 관련 질환 원인 세균을 감별하기 위한 세균 공통적(universal) 프로브와 속 특이적(genus-specific)이고 종 특이적(species-specific)인 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체를 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이다.
도 4 는 패혈증 관련 질환 원인 세균 중 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis) 종에 대한 세균 공통 프로브와 속 특이적이고 종 특이적 프로브에 대한 혼성화 반응 결과이다.
도 5 는 패혈증 관련 질환 원인 세균 중 스타필로코커스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus) 종에 대한 세균 공통 프로브와 속 특이적이고 종 특이적 프로브에 대한 혼성화 반응 결과이다.
도 6 은 패혈증 관련 질환 원인 세균 중 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) 종에 대한 세균 공통 프로브와 속 특이적이고 종 특이적 프로브에 대한 혼성화 반응 결과이다.
도 7 은 패혈증 관련 질환 원인 세균 중 리스테리아 모노사이토겐즈(Listeria monocytogenes) 종에 대한 세균 공통 프로브와 속 특이적이고 종 특이적 프로브에 대한 혼성화 반응 결과이다.
도 8 은 패혈증 관련 질환 원인 세균 중 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 종에 대한 세균 공통 프로브와 종 특이적 프로브에 대한 혼성화 반응 결과이다.
도 9 는 패혈증 관련 질환 원인 세균 중 엔테로박터 에어로겐즈(Enterobacter aerogenes) 종에 대한 세균 공통 프로브와 속 특이적이고 종 특이적 프로브에 대한 혼성화 반응 결과이다.
도 10 은 패혈증 관련 질환 원인 세균 중 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae) 종에 대한 세균 공통 프로브와 속 특이적이고 종 특이적 프로브에 대한 혼성화 반응 결과이다.
도 11 은 패혈증 관련 질환 원인 세균 중 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 종에 대한 세균 공통 프로브와 속 특이적이고 종 특이적 프로브에 대 한 혼성화 반응 결과이다.
도 12 는 패혈증 관련 질환 원인 세균 중 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 종에 대한 세균 공통 프로브와 속 특이적이고 종 특이적 프로브에 대한 혼성화 반응 결과이다.
도 13 은 패혈증 관련 질환 원인 세균 중 박테로이즈 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron) 종에 대한 세균 공통 프로브와 속 특이적이고 종 특이적 프로브에 대한 혼성화 반응 결과이다.
도 14 는 패혈증 관련 질환 원인 세균은 아니지만 스트렙토코커스 속에 속하는 스트렙토코커스 인터미디우스(Streptococcus intermedius) 종에 대한 세균 공통 프로브와 스트렙토코커스 속 특이적 프로브에만 혼성화 반응한 결과이다.
도 15 는 패혈증과 관련되지 않은 병원성 세균인 살모넬라 본고리(Salmonella bongori) 종에 대한 세균 공통 프로브에만 혼성화 반응한 결과이다.
도 16 은 패혈증과 관련되지 않은 병원성 세균인 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 종에 대한 세균 공통 프로브에만 혼성화 반응한 결과이다.
도 17 은 본 발명의 구체예의 패혈증 관련 질환 원인 세균을 더 구체적으로 감별하기 위한 세균 공통적(universal) 프로브, 그람양성(gram-positive) 특이적이고 그람음성(gram-negative) 특이적인 프로브, 그리고 속 특이적(genus-specific)이고 종 특이적(species-specific)인 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체를 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이다.
도 18 은 패혈증 관련 질환 원인 세균 중 그람양성세균에 속하는 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae) 종에 대한 세균 공통 프로브, 그람양성 특이적 프로브, 속 특이적이고 종 특이적 프로브에 대한 혼성화 반응 결과이다.
도 19 는 패혈증과 관련되지 않은 세균 중 그람양성세균에 속하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 종에 대한 세균 공통 프로브와, 그람양성 특이적 프로브에 대한 혼성화 반응 결과이다.
도 20 은 패혈증 관련 질환 원인 세균 중 그람음성세균에 속하는 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 종에 대한 세균 공통 프로브, 그람음성 특이적 프로브, 속 특이적이고 종 특이적 프로브에 대한 혼성화 반응 결과이다.
도 21 은 패혈증 관련 질환 원인 세균 중 그람음성세균에 속하는 슈도모나스 스투제리(Pseudomonas stuzeri) 종에 대한 세균 공통 프로브, 그람음성 특이적 프로브, 속 특이적이고 종 특이적 프로브에 대한 혼성화 반응 결과이다.
도 1은 본 발명의 전체 흐름도를 간략하게 나타낸 도면이다. 본 발명의 패혈증 관련 질환 원인 세균의 그람양성 및 그람음성세균을 구분하는 특이적 프로브와 원인 세균의 속 및 종 특이적 프로브를 디자인 한 후 배양 및 임상검체에서 DNA를 추출하여 PCR 등으로 핵산을 증폭하여 마이크로어레이 방법으로 패혈증 관련 질환 원인 세균의 존재 유무와 함께 그람양성 및 그람음성세균을 감별하고 원인 세균의 속과 종을 한번에 정확하게 동정함을 보여주는 전체 흐름도이다.
도 2는 세균을 생물학적 시료에서 증폭하는데 사용되는 표적 부위와 증폭용 프라이머 및 프로브의 위치를 보여주는 도면이다. 세균의 유전자 구조에서 염기서 열 과변이 영역인 ITS와 이 부위를 증폭할 수 있는 세균에 공통적으로 존재하는 프라이머 위치와 본 발명에서 디자인한 패혈증 관련 질환 원인 세균의 그람양성 및 그람음성세균 특이적 프로브, 원인 세균의 속 및 종 특이적 프로브 위치를 대략적으로 나타낸다.
본 발명에서 개발한 패혈증 관련 질환 원인 세균의 그람양성세균 특이적 프로브용 신규 올리고뉴클레오티드는 표 1과 같다.
[표 1]
패혈증 관련 질환 그람양성세균 특이적 감별을 위한 신규 프로브
Figure 112008051883209-PCT00011
본 발명에서 개발한 패혈증 관련 질환 원인 세균의 그람음성세균 특이적 프로브용 신규 올리고뉴클레오티드는 표 2와 같다.
[표 2]
패혈증 관련 질환 그람음성세균 특이적 감별을 위한 신규 프로브
Figure 112008051883209-PCT00012
본 발명에서 개발한 패혈증 관련 질환 원인 세균의 속 특이적 감별을 위한 프로브용 신규 올리고뉴클레오티드는 표 3과 같다.
[표 3]
패혈증 관련 질환 원인 세균 속 특이적(genus-specific) 감별을 위한 신규 프로브
Figure 112008051883209-PCT00013
본 발명에서 개발한 패혈증 관련 질환 원인 세균의 종 특이적 감별을 위한 프로브용 신규 올리고뉴클레오티드는 표 4와 같다.
[표 4]
패혈증 관련 질환 원인 세균 종 특이적(species-specific) 감별을 위한 신규 프로브
Figure 112008051883209-PCT00014
Figure 112008051883209-PCT00015
Figure 112008051883209-PCT00016
Best Mode for Carrying Out the Invention
이하, 본 발명의 구체적인 형태를 예시한 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시 예1: 세균의 배양 및 DNA 추출
본 연구에 사용된 56 여종 균주는 ATCC(American Type Culture Collection, Virginia, U.S.A)와 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, Taejon, Korea)에서 구입하였다. 각 세균의 배양을 위한 배지와 배양 조건은 ATCC 와 KCTC 에서 제공하는 각 방법에 따라 선택하였다. 배양된 균주는 인스타진 매트릭스(InstaGene matrix, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, USA)가 100 ㎕ 분주된 1.5 ㎖ 튜브에 집락을 백금이로 따서 넣고 10 초 진탕 후, 항온 수조에서 56℃로 30 분간 반응하였다. 다시 10 초 진탕 후 100℃로 8 분간 열처리하고 10 초 진탕 후, 12,000 rpm 에서 3 분간 원심 분리하여 DNA 를 회수하였다.
실험에 사용된 균주는 다음 표 5 와 같다:
[표 5]
Figure 112008051883209-PCT00017
Figure 112008051883209-PCT00018
실시 예 2: 프로브 고안
본 발명에 사용된 패혈증 관련 질환 원인 세균 검출을 위한 모든 프로브는 GenBank 에 공개된 패혈증 관련 질환 원인 세균의 ITS 표적 염기서열을 선별하여 다중염기서열정렬(multiple alignment)과 BLAST 검색으로 프로브의 특이성 여부를 확인하였다. 본 발명에 사용된 패혈증 관련 질환 원인 세균의 그람양성세균 특이적 프로브는 선정한 그람양성세균에 해당하는 종에서만 보존적이고 다른 종과는 매우 낮은 유사성을 나타내는 염기서열을 선정하였고, 그람음성세균 특이적 프로브는 선정한 그람음성세균에 해당하는 종에서만 보존적이고 다른 종과는 매우 낮은 유사성을 나타내는 염기서열을 선정하였다. 또한 본 발명에 사용된 패혈증 관련 질환 원 인 세균의 속 특이적 프로브는 각 속에 해당하는 종에서만 보존적이고 다른 속의 종과는 매우 낮은 유사성을 나타내는 염기서열을 선정하였고, 종 특이적 프로브는 각각의 종에서만 보존적이고 다른 종과는 매우 낮은 유사성을 나타내는 염기서열을 선정하였다. 고안한 그람양성세균, 그람음성세균, 속 및 종 특이적인 프로브는 표 1 부터 표 4 에 기재하였다. 위의 모든 프로브는 표 1 부터 표 4 의 염기서열에 한정된 것이 아니라 이를 포함한 염기서열로 이루어진 프라이머 및 프로브로 고안하여 이용할 수 있다.
실시 예 3: 표적 DNA 준비
패혈증 관련 질환 원인 세균의 감별을 위한 ITS 표적 부위의 증폭을 위해 이미 알려져 있는 16S rDNA 의 공통 프라이머 (전방향 16S-1387F : 5'-biotin-GCC TTG TAC ACW CCG CCC-3')(Applied and Environmental Microbiology, 64(2), p.795-799, 1998)와 본 발명자가 직접 개발하여 이미 특허 출원중인 23S rDNA 의 공통 프라이머 (역방향 23S-520R : 5'-biotin -NAG AAC CTG AAA CCG TGT GC-3')(특허출원 제 04-68313 호, 서열번호 54)에 각각 바이오틴을 표지하여 사용하였다. PCR 반응은 다음과 같은 조건으로 수행하였다. 반응 조성물은 10×PCR 완충액(100 mM KCl, 20 mM Tris HCl (pH 9.0), 15 mM MgCl2) 5 ㎕, dNTP(deoxynucleoside triphosphates) 혼합물 (dATP, dGTP, dTTP, and dCTP 각각 10 mM) 1 ㎕, 전방향과 역방향의 프라이머 (각각 10 pmole) 각 1 ㎕, Taq polymerase (5 units/㎕, QIAGEN, Inc., Valencia, USA) 0.2 ㎕, 주형 DNA 4 ㎕를 첨가 후 총 부피가 25 ㎕ 가 되도록 물을 첨가하였다. 반응 조건은 첫 번째로 94℃에서 3 분간 열변성시킨 후 두 번째로 94℃에서 1 분간 열변성하여, 교잡(annealing) 반응은 50℃에서 1 분, 연장(extension) 반응은 72℃에서 1 분간 수행하였으며, 이를 35 회 반복하였다. 이후 72℃에서 10 분간 연장반응을 수행하였다.
실시 예 4: 지지체에 프로브 부착
실시 예 2 에서 고안된 프로브는 5' 말단에 9 개의 구아닌(Guanine) 염기, 스페이서(spacer)인 3 개의 아민(Amine) 염기 및 15-25 개의 염기서열을 갖는 프로브로 합성하였다. 실험에 사용한 세균의 존재 유무를 알 수 있는 공통적인 프로브는 본 발명자가 직접 개발하여 이미 특허 출원중인 염기서열(Uni-459 : 5'-CCG ATA GTG AAC CAG TAC C-3')(특허출원 제 04-68313 호, 서열번호 46)을 사용하였다. 슬라이드는 guanine 을 인식하여 생체분자를 표면에 고정화하는 BMT Guanine Chip™(바이오메트릭스 테크놀로지(주), Korea)을 이용하여 지지체 위의 표면에 모든 프로브가 고정화하도록 한 후 고정되지 않은 프로브를 세척하여 제작하였다.
실시 예 5: 염료 결합 및 혼성화 반응(Hybridization)
실시 예 3 에서 제조된 바이오틴으로 표지화된 표적 DNA 를 단일 가닥으로 사용하기 위해 95℃ 이상 열을 가한 후 4℃로 냉각시켰다. PCR 산물과 프로브와의 결합유무를 확인하기 위해, Cy5-streptavidin 또는 Cy3-streptavidin(Amersham pharmacia biotech, USA)을 포함하는 반응용액과 1 ∼ 5 ㎕의 표적 DNA 를 포함하는 혼성화 반응용액 60 ㎕를 제조하였다. 프로브 부착과 세척을 마친 슬라이드에 혼성화 반응용액을 분주하고 커버씰(cover seal)을 덮고 40℃에서 30 분간 반응시 켰다.
실시 예 6: 결합되지 않은 DNA 의 세척
혼성화 반응을 하지 않은 잔여의 DNA 를 세척하기 위해 2 × SSC(300 mM NaCl, 30 mM Na-Citrate, pH 7.0) 용액을 이용하여 커버 글라스를 제거한 후 2 × SSC 와 0.2 × SSC 용액 순으로 슬라이드를 세척하고 원심분리기를 이용하여 슬라이드의 물기를 제거하였다.
실시 예 7: 결과 분석
혼성화 반응 결과는 비공초점 레이져 스캐너(non-confocal laser scanner)인 GenePix 4000A(Axon Instruments, Inc., Union city, USA)를 이용하여 분석하였다. 그 결과는 아래의 표 6 에 나타내었다.
[표 6] 본 발명의 프로브에 대한 특이적 혼성화 반응 결과
Figure 112008051883209-PCT00019
Figure 112008051883209-PCT00020
도 3 은 본 발명의 바람직한 실시예인 패혈증 관련 질환 원인 세균의 존재 유무와 속 특이적이고 종 특이적인 감별을 위한 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체를 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이다.
도 4 는 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis) 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 세균 공통 프로브(특허출원 제 04-68313 호, 서열번호 46)와 함께 스트렙토코커스 속 특이적 프로브(서열번호 29)와 스트렙토코커스 보비스 종 특이적 프로브(서열번호 102)에만 특이적으로 반응한 스켄 이미지를 나타낸 도면이다.
도 5 는 스타필로코커스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus) 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 세균 공통 프로브(특허출원 제 04-68313 호, 서열번호 46)와 함께 스타필로코커스 속 특이적 프로브(서열번호 27)와 스타필로코커스 사프로피티쿠스 종 특이적 프로브(서열번호 94)에만 특이적으로 반응한 스켄 이미지를 나타낸 도면이다.
도 6 은 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 세균 공통 프로브(특허출원 제 04-68313 호, 서열번호 46)와 함께 엔테로코커스 속 특이적 프로브(서열번호 11)와 엔테로코커스 페시움 종 특이적 프로브(서열번호 43)에만 특이적으로 반응한 스켄 이미지를 나타낸 도면이다.
도 7 은 리스테리아 모노사이토겐즈(Listeria monocytogenes) 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 세균 공통 프로브(특허출원 제 04-68313 호, 서열번호 46)와 함께 리스테리아 속 특이적 프로브(서열번호 18)와 리스테리아 모노사이 토겐즈 종 특이적 프로브(서열번호 73)에만 특이적으로 반응한 스켄 이미지를 나타낸 도면이다.
도 8 은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 세균 공통 프로브(특허출원 제 04-68313 호, 서열번호 46)와 함께 에스케리키아 콜라이 종 특이적 프로브(서열번호 56)에만 특이적으로 반응한 스켄 이미지를 나타낸 도면이다.
도 9 는 엔테로박터 에어로겐즈(Enterobacter aerogenes) 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 세균 공통 프로브(특허출원 제 04-68313 호, 서열번호 46)와 함께 클렙시엘라와 엔테로박터 속 특이적 프로브(서열번호 17)와 엔테로박터 에어로겐즈 종 특이적 프로브(서열번호 50)에만 특이적으로 반응한 스켄 이미지를 나타낸 도면이다.
도 10 은 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae) 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 세균 공통 프로브(특허출원 제 04-68313 호, 서열번호 46)와 함께 클렙시엘라와 엔테로박터 속 특이적 프로브(서열번호 17)와 클렙시엘라 뉴모니에 종 특이적 프로브(서열번호 67)에만 특이적으로 반응한 스켄 이미지를 나타낸 도면이다.
도 11 은 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 세균 공통 프로브(특허출원 제 04-68313 호, 서열번호 46)와 함께 세라티아 속 특이적 프로브(서열번호 25)와 세라티아 마르세센스 종 특이적 프로브(서열번호 87)에만 특이적으로 반응한 스켄 이미지를 나타낸 도면이다.
도 12 는 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 세균 공통 프로브(특허출원 제 04-68313 호, 서열번호 46)와 함께 슈도모나스 속 특이적 프로브(서열번호 21)와 슈도모나스 에루기노사 종 특이적 프로브(서열번호 82)에만 특이적으로 반응한 스켄 이미지를 나타낸 도면이다.
도 13 은 박테로이즈 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron) 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 세균 공통 프로브(특허출원 제 04-68313 호, 서열번호 46)와 함께 박테로이즈 속 특이적 프로브(서열번호 7)와 박테로이즈 테타이오타오미크론 종 특이적 프로브(서열번호 35)에만 특이적으로 반응한 스켄 이미지를 나타낸 도면이다.
도 14 는 패혈증 관련 질환 원인 세균은 아니지만 스트렙토코커스 속에 속하는 스트렙토코커스 인터미디우스(Streptococcus intermedius) 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 세균 공통 프로브(특허출원 제 04-68313 호, 서열번호 46)와 함께 스트렙토코커스 속 특이적 프로브(서열번호 29)에만 특이적으로 반응한 스켄 이미지를 나타낸 도면이다.
도 15 는 패혈증과 관련되지 않은 병원성 세균인 살모넬라 본고리(Salmonella bongori) 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 패혈증 관련 질환 원인 세균 검출용 속과 종 특이적 프로브에는 반응되지 않고 세균 공통 프로브(특허출원 제 04-68313 호, 서열번호 46)에만 특이적으로 반응한 스켄 이미지를 나타낸 도면이다.
도 16 은 패혈증과 관련되지 않은 병원성 세균인 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 패혈증 관련 질환 원인 세균 검출용 속과 종 특이적 프로브에는 반응되지 않고, 세균 공통 프로브(특허출원 제 04-68313 호, 서열번호 46)에만 특이적으로 반응한 스켄 이미지를 나타낸 도면이다.
도 17 은 본 발명의 바람직한 실시예인 패혈증 관련 질환 원인 세균을 더 구체적으로 감별하기 위한 세균의 존재 유무와 그람양성과 그람음성의 감별을 위한 프로브, 그리고 속 특이적이고 종 특이적인 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체를 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이다.
도 18 은 패혈증 관련 질환 원인 세균 중 그람양성세균에 속하는 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae) 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 세균 공통 프로브(특허출원 제 04-68313 호, 서열번호 46) 및 그람양성 특이적 프로브(서열번호 1 과 2)와 함께 스트렙토코커스 속 특이적 프로브(서열번호 29)와 스트렙토코커스 뉴모니에 종 특이적 프로브(서열번호 98)에만 특이적으로 반응한 스켄 이미지를 나타낸 도면이다.
도 19 는 패혈증과 관련되지 않은 세균 중 그람양성세균에 속하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 패혈증 관련 질환 원인 세균 검출용 속과 종 특이적 프로브에는 반응되지 않고, 세균 공통 프로브(특허출원 제 04-68313 호, 서열번호 46)와 그람양성 특이적 프로브(서열번호 1 과 2)에만 특이적으로 반응한 스켄 이미지를 나타낸 도면이다.
도 20 은 패혈증 관련 질환 원인 세균 중 그람음성세균에 속하는 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 세균 공통 프로브(특허출원 제 04-68313 호, 서열번호 46) 및 그람음성 특이적 프로브(서열번호 3)와 함께 세라티아 속 특이적 프로브(서열번호 25)와 세라티아 마르세센스 종 특이적 프로브(서열번호 87)에만 특이적으로 반응한 스켄 이미지를 나타낸 도면이다.
도 21 은 패혈증 관련 질환 원인 세균 중 그람음성세균에 속하는 슈도모나스 스투제리(Pseudomonas stuzeri) 균종의 마이크로어레이 혼성화 반응 결과로, 세균 공통 프로브(특허출원 제 04-68313 호, 서열번호 46) 및 그람음성 특이적 프로브(서열번호 3)와 함께 슈도모나스 속 특이적 프로브(서열번호 21)와 슈도모나스 스투제리 종 특이적 프로브(서열번호 84)에만 특이적으로 반응한 스켄 이미지를 나타낸 도면이다.
이것은 본 발명에서 고안한 신규 올리고뉴클레오티드 중 대표적인 프로브 구획의 한 예에 불과하므로 각 프로브 구성 및 구획의 위치(layout)는 변동될 수 있다.
본 발명은 구체예와 실시예로 본 발명을 설명하고 있으나 이에 본 발명을 국한시키고자 함은 아니다. 또한, 여기에서 설명을 하는 것에 추가하여 다양한 변형 및 변화가 가능함을 당업자는 인지할 것이다. 이와 같은 변형 또한 첨부된 특허청구범위의 범위에 속한다.
이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명은 패혈증 관련 질환 원인 세균의 검출 및 감별을 위해 세균의 염기서열 과변이 영역인 ITS 로부터 그람양성과 그람음성 특이적이고, 속과 종 특이적인 프로브를 디자인 및 조합하여 이를 포함하는 마이크로어레이와 진단 키트를 개발하였고, 이의 특이성을 확인하였다. 이는 세균에 공통적으로 존재하는 염기서열로 증폭하여 패혈증 관련 질환 원인 세균의 존재 유무와 함께 그람양성과 그람음성을 구별하고 속과 종을 동시에 정확히 감별함으로써 패혈증을 일으키는 감염원을 정확하게 제거할 수 있는 항생제 치료가 가능하게 하고, 빈번히 발생하는 항생제의 오남용을 예방할 수 있게 하며, 환자의 병원 체류기간의 절감과 이에 따른 진료비 비용의 감소가 가능하고, 더 나아가서는 합병증 예방과 사망률 감소 효과도 이룰 수 있는 장점이 있다.
Sequence Listing
전자파일 첨부

Claims (19)

  1. 서열번호 1 내지 2 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 패혈증 관련 질환 원인 세균의 그람양성세균 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드.
  2. 서열번호 3 내지 6 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 패혈증 관련 질환 원인 세균의 그람음성세균 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드.
  3. 서열번호 7 내지 30 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 패혈증 관련 질환 원인 세균의 속 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드.
  4. 서열번호 31 내지 104 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 패혈증 관련 질환 원인 세균의 종 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 패혈증 관련 질환 원인 세균 증폭용 프라이머 세트.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 패혈증 관련 질환 원인 세균 감별용 프로브 세트.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 진단 키트.
  8. 제 1 항에 따른 패할증 관련 질환 원인 그람양성세균 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 한 세트의 프라이머로 포함하는 PCR 키트.
  9. 제 2 항에 따른 패혈증 관련 질환 원인 그람음성세균 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 한 세트의 프라이머로 포함하는 PCR 키트.
  10. 제 3 항에 따른 패혈증 관련 질환 원인 세균 속 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 한 세트의 프라이머로 포함하는 PCR 키트.
  11. 제 4 항에 따른 패혈증 관련 질환 원인 세균 종 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 한 세트의 프라이머로 포함하는 PCR 키트.
  12. 제 1 항에 따른 패혈증 관련 질환 원인 그람양성세균 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 프로브로 이용하여 이를 지지체에 부착하여 포함하는 마이크로어레이.
  13. 제 2 항에 따른 패혈증 관련 질환 원인 그람음성세균 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 프로브로 이용하여 이를 지지체에 부착하여 포함하는 마이크로어레이.
  14. 제 3 항에 따른 패혈증 관련 질환 원인 세균 속 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 프로브로 이용하여 이를 지지체에 부착하여 포함하는 마이크로어레이.
  15. 제 4 항에 따른 패혈증 관련 질환 원인 세균 종 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 프로브로 이용하여 이를 지지체에 부착하여 포함하는 마이크로어레이.
  16. 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 데옥시뉴클레오티드(DNA), 리보뉴클레오티드(RNA), 또는 펩타이드뉴클레오티드(PNA), 락크드뉴클레오티드(LNA) 및 디-헥시톨뉴클레오티드(HNA)에서 선택된 핵산유사체인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  17. 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지체는 슬라이드글라스, 플라스틱, 멤브레인, 반도체 칩(semiconductive chip), 실리콘, 젤(gel), 나노(nano) 재료, 세라믹, 금속재료, 광섬유 또는 이들을 조합하여 만들어지는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  18. 시료에 존재하는 핵산을 분리하는 단계, 상기 분리된 핵산 중 표적 DNA 를 증폭하는 단계, 상기 증폭된 DNA 를 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 마이크로어레이상의 프로브와 혼성화시키는 단계, 및 상기 형성된 하이브리드의 시그날을 검출하는 단계를 포함하는 패혈증 관련 질환 원인 세균의 감별 및 검출 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 그람양성세균(서열번호 1 번에서 2 번) 및 그람음성세균(서열번호 3 번에서 6 번), 박테로이즈 속(서열번호 7 번에서 10 번) 및 종(서열번호 31 번에서 40 번), 엔테로코커스 속(서열번호 11 번에서 12 번) 및 종(서열번호 41 번에서 47 번), 엔테로박터 속(서열번호 17 번) 및 종(서열번호 48 번에서 55 번), 에스케리키아 콜리 종(서열번호 56 번에서 58 번), 헤모필러스 속(서열번호 13 번) 및 종(서열번호 59 번에서 66 번), 클렙시엘라 속(서열번호 14 번에서 17 번) 및 종(서열번호 67 번에서 72 번), 리스테리아 속(서열번호 18 번에서 20 번) 및 종(서열번호 73 번에서 81 번), 슈도모나스 속(서열번호 21 번에서 24 번) 및 종(서열번호 82 번에서 86 번), 세라티아 속(서열번호 25 번에서 26 번) 및 종(서열번호 87 번에서 90 번), 스타필로코커스 속(서열번호 27 번에서 28 번) 및 종(서열번호 91 번에서 95 번), 스트렙토코커스 속(서열번호 29 번에서 30 번) 및 종(서열번호 96 번에서 104 번)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 세균을 동시에 탐지하는 것을 특징으로 하는 패혈증 관련 질환 원인 세균의 감별 및 검출 방법.
KR1020087017688A 2008-07-18 2006-01-20 패혈증 관련 질환 원인 세균의 감별 및 동정을 위한올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이와 이를이용한 검출 방법 KR20080104118A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020087017688A KR20080104118A (ko) 2008-07-18 2006-01-20 패혈증 관련 질환 원인 세균의 감별 및 동정을 위한올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이와 이를이용한 검출 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020087017688A KR20080104118A (ko) 2008-07-18 2006-01-20 패혈증 관련 질환 원인 세균의 감별 및 동정을 위한올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이와 이를이용한 검출 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20080104118A true KR20080104118A (ko) 2008-12-01

Family

ID=40365963

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087017688A KR20080104118A (ko) 2008-07-18 2006-01-20 패혈증 관련 질환 원인 세균의 감별 및 동정을 위한올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이와 이를이용한 검출 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20080104118A (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015037769A1 (ko) * 2013-09-16 2015-03-19 엠앤디(주) 패혈증 진단용 조성물 및 그 방법 및 키트

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015037769A1 (ko) * 2013-09-16 2015-03-19 엠앤디(주) 패혈증 진단용 조성물 및 그 방법 및 키트

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100850193B1 (ko) 모든 세균의 감별을 위한 세균 특이적, 속 특이적 및 종특이적 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 진단 키트, 및이를 이용한 검출 방법
CA2080812C (en) Hybridization probes derived from the spacer region between the 16s and 23s rrna genes for the detection of non-viral microorganisms
US20090286691A1 (en) Oligonucleotide for Detection of Bacteria Associated with Sepsis and Microarrays and Method for Detection of the Bacteria Using the Oligonucleotide
US20100075305A1 (en) Detection of bacterium by utilizing dnaj gene and use thereof
JP2010537650A (ja) 細菌及び真菌の検出方法
CN101558168A (zh) 利用DnaJ基因的细菌检测及其应用
US5536638A (en) Hybridization probes derived from the spacer region between the 16S and 23S rRNA genes for the detection of Neisseria gonorrhoeae
KR20100061438A (ko) 치주 질환 관련 세균의 검출 및 동정용 마이크로어레이 및 이를 이용한 세균 감염성 구강 질환 진단방법
WO2008135931A2 (en) Kit and method for the detection and identification of clinically relevant yeasts, using an isothermal dna amplification followed by the hybridisation to species- specific oligonucleotide probes, and respective applications
JP4972104B2 (ja) 病原体の同定のためのオリゴヌクレオチドマイクロアレイ
US9109260B1 (en) Identification of bacteria by amplification and probing
WO2021201091A1 (ja) クレブシエラ属細菌の検出のためのプライマーセット及びプローブ
Hu et al. Simultaneous analysis of foodborne pathogenic bacteria by an oligonucleotide microarray assay
JP2014501494A (ja) 核酸標的の定量的多重同定
JP2010515451A (ja) 大腸菌検出用ｄｎａチップ
US20090197775A1 (en) Nuclease on chip
CA2075186A1 (en) Hybridization probes for the detection of branhamella catarrhalis strains
KR20080104118A (ko) 패혈증 관련 질환 원인 세균의 감별 및 동정을 위한올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이와 이를이용한 검출 방법
US20050272044A1 (en) Method and kit for the detection and/or quantification of homologous nucleotide sequences on arrays
KR101518561B1 (ko) 아시네토박터 균종 검출을 위한 종-특이 ｐｃｒ 기법 개발
JP2004534536A (ja) グラム陽性菌の検出方法
CN110512013B (zh) 一种应用高分辨率熔解曲线法鉴别三种棒状杆菌的方法
WO2009087688A2 (en) Method for detection of nucleic acid of mycobacterium and uses thereof
ES2711509T3 (es) Detección de Streptococcus pneumoniae
EP2107124A1 (en) Nuclease on chip

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application