ES2711509T3

ES2711509T3 - Detección de Streptococcus pneumoniae

Info

Publication number: ES2711509T3
Application number: ES14792764T
Authority: ES
Inventors: Quintanilla Ana Isabel Moraga; Jaen María Luisa Villahermosa
Original assignee: Genomica SA
Current assignee: Genomica SA
Priority date: 2013-10-17
Filing date: 2014-10-16
Publication date: 2019-05-06
Anticipated expiration: 2034-10-16
Also published as: EP2862942A1; EP3066210A1; CN105683395A; BR112016007807A2; EP3066210B1; CN105683395B; WO2015055768A1

Abstract

Un método para la detección de Streptococcus pneumoniae en una muestra de ensayo, comprendiendo el método: - someter la muestra a una amplificación por PCR dando lugar a productos de la amplificación que incluyen una región que se hibrida con las sondas de las SEQ ID N.º 1 y SEQ ID N.º 2, en donde se introduce un marcador detectable en los productos de amplificación; - transformar cualquiera de los productos de amplificación de la PCR en un ADN de cadena sencilla; - poner en contacto cualquier ADN de cadena sencilla con ambas sondas de las SEQ ID N.º 1 y SEQ ID N.º 2, estando proporcionadas dichas sondas en una micromatriz; y - detectar una señal proporcionada por el marcador detectable de cualquier ADN de cadena sencilla que se ha hibridado con las sondas, en donde: - las señales positivas de igual intensidad en ambas posiciones de la micromatriz correspondientes a las sondas de las SEQ ID N.º 1 y SEQ ID N.º 2 son indicativas de la presencia de Streptococcus pneumoniae en la muestra; - una señal positiva en la posición correspondiente a la sonda de la SEQ ID N.º 1, y una señal en la posición correspondiente a la sonda de SEQ ID N.º 2 que tiene una intensidad de menos del 20 % de la correspondiente a la sonda de SEQ ID N.º 1, es indicativa de la presencia de Streptococcus mitis en la muestra; y - una señal positiva en la posición correspondiente a solo una sonda, o sin señal en ninguna de las posiciones correspondientes a las sondas de SEQ ID N.º 1 y 2, es indicativa de la presencia de otras especies del género Streptococcus.

Description

DESCRIPCION

Deteccion de Streptococcus pneumoniae

Antecedentes de la invencion

Streptococcus pneumoniae es el agente causal de sepsis, y seria conveniente ser capaces de detectar espedficamente su presencia en la sangre. Streptococcus pneumoniae es tambien la principal causa de neumonia adquirida comunitaria. Es de gran importancia ser capaces de distinguir Streptococcus pneumoniae de entre otros miembros del grupo de Estreptococos, con el fin de determinar si cualquiera de los Streptococcus presentes en una muestra se corresponde actualmente con la especie patogena Streptococcus pneumoniae o con otras especies inocuas de Streptococcus que estan presentes constitutivamente en el huesped, y que no producen una enfermedad.

Se han llevado a cabo muchos intentos con el fin de detectar Streptococcus pneumoniae y distinguirlo de otros miembros del grupo de Estreptococos (Wessels et al., J. Clin. Microbiol. April 2012 vol. 50 no. 4 1171-1177). Estos incluyen el ensayo de cultivos y ensayos bioquimicos y fenotipicos convencionales, tales como la morfologia con tincion de Gram, la susceptibilidad a la optoquina, la morfologia de colonias y la alfa hemolisis en agar sangre de oveja. Las tecnicas adicionales que se han utilizado incluyen: MALDI-TOF (espectrometria de masas con desorcion ionizacion por laser asistida por matriz con tiempo de vuelo), analisis de secuencia de varios genes, y analisis molecular que incluye un ensayo de PCR en tiempo real. La mayoria de estas tecnicas, sin embargo, no permite discriminar Streptococcus pneumoniae de otros miembros del grupo de Estreptococos, debido a la alta similitud de secuencia entre las diferentes especies. Otras tecnicas incluyen metodos moleculares basados en la amplificacion de la region del gen rpoB para la deteccion de bacterias del genero Streptococcus. Dos ejemplos particulares de esta estrategia se proporcionan en los documentos EP 1558637 y EP 1694861.

El documento EP 1558637 utiliza fragmentos de 724 pb del gen rpoB (representado en la SEQ ID N.° 12 del documento WO 2004/041841), para la deteccion de bacterias del genero Streptococcus que puede estar presente en una muestra. Dicha deteccion puede tener lugar mediante la amplificacion del fragmento indicado. Sin embargo, no se ha proporcionado una sonda en particular para la deteccion especifica de diferentes especies del genero Streptococcus.

En el documento EP1694861 se amplifica un fragmento del gen rpoB con un par de cebadores que son comunes a todas las especies del genero Streptococcus. Se obtiene de esta manera un producto de amplificacion, independientemente de la especie en particular que puede estar presente en la muestra, como en el documento EP 1558637 anterior. En el presente caso, se proporcionan sondas, que tienen la intencion de la deteccion especifica de Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes (Tabla 3 del documento WO 2005/059156 correspondiente). Las minimas diferencias de secuencia entre algunas de las sondas, sin embargo, puede ser dificil que dichas sondas puedan ser utiles actualmente para una deteccion especifica de las dos especies de Streptococcus diferentes a las que se dirigen (por ejemplo, las sondas de la SEQ ID N.° 4 y SEQ ID N.° 5, se corresponden con el Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae, respectivamente, solo se diferencian en dos nucleotidos). No se proporcionan sondas adicionales correspondientes a otras especies del genero Streptococcus.

En vista de la informacion anterior, existe la necesidad de proporcionar metodos eficaces basados en hibridacion de sondas para la deteccion especifica de Streptococcus pneumoniae vs otras especies del genero Streptococcus. En otras palabras, el altamente deseable proporcionar un metodo que permita la deteccion diferencial del Streptococcus pneumoniae presente en la muestra, es decir la deteccion especifica de Streptococcus pneumoniae distinguida de otras especies del genero Streptococcus.

Sumario de la invencion

El problema que se tiene que resolver por la presente invencion es la provision de un metodo para la deteccion de un Streptococcus pneumoniae presente en una muestra, que permite distinguir especificamente el Streptococcus pneumoniae de otras especies del genero Streptococcus.

La solucion se basa en el uso simultaneo que utiliza las sondas que comprenden o consisten en las SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2 (vease la Tabla 1 posterior) para detectar la presencia de Streptococcus pneumoniae en una muestra. En una realizacion, la sonda consiste en la SEQ ID N.° 1 o SEQ ID N.° 2.

Como se ha indicado anteriormente, existe una alta similitud de secuencia entre las diferentes especies del genero Streptococcus; esta circunstancia constituye una pesada carga cuando se intenta detectar el Streptococcus pneumoniae y distinguirlo especificamente de otras especies de Streptococcus, mediante la hibridacion con sondas. Las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2 y, por lo tanto, los distintos aspectos de la invencion permiten detectar eficazmente el Streptococcus pneumoniae y distinguir el Streptococcus pneumoniae de, al menos, las siguientes especies del genero Streptococcus. Streptococcus (S.) constellatus, S. anginosus, S. mitis, S. gallolyticus, S. dysgalactiae, S. pyogenes, S. suis, S. intermedius, S. sanguinis, S. oralis y S. parasanguinis.

En consecuencia, con distintos aspectos de la invencion, se lleva a cabo la detection simultanea mediante la hibridacion con las dos sondas que se definen en las SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2 para la deteccion espedfica de Streptococcus pneumoniae. Solo cuando el ADN presente en una muestra se corresponde con el Streptococcus pneumoniae, tiene lugar la union de ambas sondas. En los casos en los que ninguna o solo una de las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2 se unen al ADN presente en una muestra, este ADN no se corresponde con el Streptococcus pneumoniae, sino con otra especie del genero Streptococcus. La unica exception es el caso en el que una muestra contenga ADN de Streptococcus mitis, en cuyo caso el ADN de la muestra se une a la sonda de SEQ ID N.° 1 teniendo lugar tambien la union al ADN de la sonda de SEQ ID N.° 2 hasta un cierto nivel, pero con mucha menor extension que a la sonda de SEQ ID N.° 1 (vease el Ejemplo 2, posteriormente). Se entiende que una “extension mucho menor" significa un nivel de union de un 20 % o menor que el que se consigue con la SEQ ID N.° 1.

Tabla 1.

Las sondas que se definen en las SEQ ID N.° 3, SEQ ID N.° 4 y SEQ ID N.° 5 de la Tabla 1 tambien se unen a los acidos nucleicos de Streptococcus pneumoniae. Sin embargo, han probado no ser especificas, ya que tambien se unen arbitrariamente a los acidos nucleicos de otras especies del genero Streptococcus, sin seguir ninguna clase de patron predecible.

Los inventores no tienen conocimiento de que haya nada que sea puntero en el estado de la tecnica ni en las secuencias de las sondas para explicar por que la hibridacion simultanea con las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2 da lugar a la deteccion del Streptococcus pneumoniae, de una manera que permitiria distinguirlo de una manera espedfica de entre las otras especies del genero Streptococcus. No se ha encontrado explication si es por la temperatura de fusion, numero de nucleotidos, % de GC (Tabla 1), o en el numero de nucleotidos por lo que estas sondas diferencian la secuencia del Streptococcus pneumoniae de tipo silvestre (Tabla 2).

Tabla 2. Numero de nucleotidos por los que las sondas de SEQ ID N.° 1 a 5 diferencian la secuencia de Streptococ n m ni i ilv r l n i r i l n r r ptococcus:

Se han detectado a veces diferentes variantes de la secuencia de ciertas especies. Esta es la razon por la que a veces el numero de nucleotidos por los que una cierta sonda diferencia la secuencia de ciertas especies de Streptococcus varia entre dos valores.

Los inventores han descubierto sorprendentemente que la incubacion simultanea con las sondas que se definen por las SEQ ID N.° 1 y la SEQ ID N.° 2 permite detectar y distinguir espedficamente el Streptococcus pneumoniae de otras especies del genero Streptococcus. Por lo tanto, el uso simultaneo de las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2 proporciona una solucion al problema de la deteccion espedfica de Streptococcus pneumoniae en una muestra. Esto es de gran importancia para distinguir el Streptococcus pneumoniae de otros microorganismos; en particular, de las especies de Streptococcus inocuas presentes constitutivamente en el huesped y que no causan enfermedad, en particular, en el tracto respiratorio. Esto tambien es importante para la deteccion de la presencia de Streptococcus pneumoniae en la sangre como agente causante de sepsis.

Uno de los aspectos de la presente invencion se corresponde por lo tanto con un metodo para la deteccion de Streptococcus pneumoniae en una muestra de ensayo, estando definido dicho metodo por la reivindicacion 1.

Las realizaciones de distintos aspectos de la presente invencion se definen por las reivindicaciones dependientes.

Un segundo aspecto de la presente invencion se corresponde con un kit para la deteccion del Streptococcus pneumoniae en una muestra de ensayo, en el que dicho kit comprende un vaso de matriz o conjunto de vasos de matriz, que cada uno comprende una micromatriz en la que se proporcionan ambas sondas de ^sE^qID N.° 1 y SEQ ID N.° 2, y una mezcla de amplificacion con cebadores de amplificacion de PCR que dan lugar a la amplification de productos que incluyen la region que se hibrida con las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2.

Un tercer y cuarto aspectos de la presente invencion se corresponden respectivamente con un conjunto de sondas que comprende las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2, y una micromatriz que comprende este conjunto de sondas. Tambien se describe un acido nucleico aislado que consiste en la SEQ ID N.° 1 y una micromatriz que comprende la SEQ ID N.° 1. La secuencia de acido nucleico aislado se puede marcar con un resto detectable. Adicionalmente se describe una secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID N.° 2 y una micromatriz que comprende la SEQ ID N.° 2. La secuencia de acido nucleico puede estar marcada con un resto detectable. Tambien se desvela una composition que comprende la SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2.

Aspectos adicionales de la presente invencion se corresponden con el uso del kit, micromatriz, secuencia de acido nucleico aislado o conjunto de sondas de la invencion para la deteccion in vitro de Streptococcus pneumoniae, y para el diagnostico de una infection por Streptococcus pneumoniae en una muestra de un paciente. En particular, la infection es una infeccion septica o respiratoria.

Un metodo para el diagnostico de una infeccion por Streptococcus pneumoniae en un paciente comprende poner en contacto una muestra de dicho paciente con las sondas que se definen por la SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2.

Breve description de los dibujos

Figura 1.

La Figura 1 muestra la visualization de la hibridacion de los productos de amplificacion del Ejemplo 1 de la presente invencion, previamente desnaturalizados, con una micromatriz que comprende las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2 de la presente invencion. Los “puntos” rodeados por rectangulos se corresponden con las posiciones de las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2. De los dos “puntos” rodeados por cada rectangulo, el primer se corresponde con la SEQ ID N.° 1 y el segundo con la SEQ ID N.° 2. Los dos “puntos” fuera de los rectangulos que representan una senal, se corresponden con los Marcadores de Position. La muestra del Ejemplo 1, que contiene Streptococcus pneumoniae presenta una senal positiva y de igual intensidad, en ambas posiciones que se corresponden con sondas de las SEQ ID N.° 1 y SEq ID N.° 2. Esto es debido a la union especifica de ambas de estas sondas del ADN amplificado y desnaturalizado de la muestra.

Figura 2.

La Figura 2 representa la visualizacion de la hibridacion de los productos de amplificacion del Ejemplo 2 de la presente invencion, previamente desnaturalizados, con una micromatriz que comprende las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2 de la presente invencion. Los “puntos” rodeados por rectangulos se corresponden con las posiciones de las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2. De los dos “puntos” rodeados por cada rectangulo, el primer se corresponde con la SEQ ID N.° 1 y el segundo con la SEQ ID N.° 2. Los dos “puntos” fuera de los rectangulos que representan una senal, se corresponden con los Marcadores de Posicion. La muestra del Ejemplo 2, que contiene Streptococcus mitis presenta una senal positiva en la posicion que se corresponde con la sonda de la SEQ ID N.° 1, una senal de mucha menor intensidad en la sonda de la SEQ ID N.° 2. La senal que aparece en la posicion de la SEQ ID N.° 2 tiene una intensidad de menos del 20 % de la que aparece en la posicion de la SEQ ID N.° 1.

Figura 3.

La Figura 3 muestra la visualizacion de la hibridacion de los productos de amplificacion del Ejemplo 3 de la presente invencion, previamente desnaturalizados, con una micromatriz que comprende las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2 de la presente invencion. Los “puntos” rodeados por rectangulos se corresponden con las posiciones de las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2. De los dos “puntos” rodeados por cada rectangulo, el primer se corresponde con la SEQ ID N.° 1 y el segundo con la SEQ ID N.° 2. Los dos “puntos” fuera de los rectangulos que representan una senal, se corresponden con los Marcadores de Posicion. La muestra del Ejemplo 3, que contiene Streptococcus oralis presenta una senal positiva solo en la posicion correspondiente a la sonda de la SEQ ID N.° 2, y no presenta senal en la posicion de la sonda de la SEQ ID N.° 1.

Figura 4.

La Figura 4 muestra la visualizacion de la hibridacion de los productos de amplificacion del Ejemplo 4 de la presente invencion, previamente desnaturalizados, con una micromatriz que comprende las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2 de la presente invencion. Los “puntos” rodeados por rectangulos se corresponden con las posiciones de las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2. De los dos “puntos” rodeados por cada rectangulo, el primer se corresponde con la SEQ ID N.° 1 y el segundo con la SEQ ID N.° 2. Los dos “puntos” fuera de los rectangulos que representan una senal, se corresponden con los Marcadores de Posicion. La muestra del Ejemplo 4, que contiene Streptococcus dysgalactiae no presenta ningun tipo de senal en las posiciones de las sondas de la SEQ ID N.° 1 ni de la SEQ ID N.° 2.

Descripcion detallada de la invencion

En los siguientes parrafos, se definen diferentes aspectos de la presente invencion con mas detalle. Cada aspecto asi definido se puede combinar con cualquiera otro aspecto o aspectos a menos de que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier caracteristica que se indique como preferida o especialmente ventajosa se puede combinar con cualquier otra caracteristica o caracteristicas preferidas o ventajosas.

Un primer aspecto de la presente invencion se corresponde con un metodo para la deteccion de Streptococcus pneumoniae en una muestra de ensayo, estando definido el metodo en la reivindicacion 1.

Un segundo aspecto de la presente invencion se refiere a un kit para la deteccion de Streptococcus pneumoniae en una muestra de ensayo, en el que dicho kit comprende un vaso de matriz o conjunto de vasos de matriz , cada uno que comprende una micromatriz en el que se proporcionan ambas sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2, y una mezcla de amplificacion con cebadores de amplificacion por PCR que dan lugar a productos de la amplificacion que incluyen la region que se hibrida con las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2.

El tercer y cuarto aspectos de la presente invencion, respectivamente, se corresponden con un conjunto de sondas que comprenden las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2 y a una micromatriz que comprende este conjunto de sondas. Otros aspectos se refieren a una secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID N.° 1. Otro aspecto se refiere a una secuencia de acido nucleico que consisten en la SEQ ID N.° 2.

Aspectos adicionales de la presente invencion se corresponden con el uso del metodo, kit, micromatriz, secuencia de acido nucleico o conjunto de sondas de la invencion para la deteccion de Streptococcus pneumoniae en un paciente. En particular, la infeccion es una infeccion septica o respiratoria.

Un metodo para el diagnostico de una infeccion por Streptococcus pneumoniae en un paciente comprende poner en contacto la muestra de dicho paciente con sondas como se definen por las SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2. El metodo puede comprender una etapa de amplificacion como se explica adicionalmente despues. Si ambas sondas se hibridan con el ADN presente en la muestra, entonces el paciente se diagnostica de una infeccion por Streptococcus pneumoniae. El metodo se lleva a cabo preferentemente in vitro o ex vivo.

Tambien se desvela un ensayo para la deteccion de Streptococcus pneumoniae en una muestra de ensayo, comprendiendo el metodo la puesta en contacto de la muestra con las sondas de las SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2.

Definiciones

La expresion “sondas de/como se definen por las SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2” como se utiliza en el presente documento se refiere a ambas secuencias de nucleotidos que se representa como las SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2, pero tambien a los equivalentes obvios de las mismas, tales como sus secuencias complementarias o las secuencias que tienen una capacidad de union equivalente a las de la SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2 o de sus secuencias complementarias (por ejemplo, secuencias que se diferencian de las SEQ ID N.° 1 y 2 o de sus secuencias complementarias por 1 mutacion en las mismas).

“Cebador”, “cebador de amplificacion” o “cebador de amplificacion por PCR” como se utilizan en el presente documento “cebador de una reaccion de amplificacion de acido nucleico”. Una “extension de union mucho menor” como se utiliza en el prense documento se entiende que significa un nivel de union del 20 % o menos que el de una referencia. La union del ADN que se va a ensayar y cualquiera de las sondas tiene lugar mediante hibridacion.

En realizaciones preferidas, las sondas se proporcionan en una micromatriz, por ejemplo, inmovilizadas en un soporte solido. Una micromatriz es una coleccion de puntos de oligonucleotido microscopicos. Una micromatriz de ADN (tambien conocida como chip genetico, chip de ADN, o biochip) es una coleccion de puntos de ADN microscopicos unidos a una superficie solida. Las sondas se sintetizan y entonces se unen mediante modification de superficie a una superficie solida mediante enlace covalente de una matriz quimica (mediante epoxi-silano, aminosilano, lisina, poliacrilamida u otros). Las superficies solidas se conocen en la tecnica e incluyen perlas microscopicas.

Por lo tanto, en particular, las sondas de la presente invencion pueden estar inmovilizadas en un soporte solido. Este soporte solido puede ser en fondo de un vaso de matriz o un soporte solido diferente unido en el fondo de un vaso de matriz. Esto significa que la superficie de la micromatriz puede ser el fondo plano del vaso de matriz. De manera alternativa, la superficie de la micromatriz puede ser un soporte solido unido en el fondo del vaso de matriz. Las sondas de la presente invencion se pueden incluir en un vaso de matriz individual o en un conjunto de vasos de matriz.

Se describen en el presente documento y de acuerdo con la invencion, sondas contenidas en una micromatriz, que se pueden colocar en un portaobjetos o estar contenidas en un vaso de reacciones, que entonces se llama un vaso de matriz. Los vasos de matriz pueden tener diferentes formatos de presentacion, que incluyen vasos de matriz individuales, tales como pocillos o tubos, o conjuntos de vasos de matriz dispuestos en tiras de pocillos o de tubos, o placas planas. Habitualmente, las placas consisten en conjuntos de tiras de vasos de matriz. Por lo tanto, la micromatriz de la presente invencion puede estar contenida en un vaso de matriz individual. De manera alternativa, dos o mas micromatrices pueden estar contenidas en una tira de vasos. En una realizacion preferida la tira de vasos esta constituida por 8 vasos. Ademas, tres o mas vasos de matriz pueden estar dispuestos en un conjunto de tiras de vasos. En otra realizacion preferida, el conjunto de tiras de vasos es una placa de microtitulacion. En otra realizacion preferida mas, la placa de microtitulacion esta constituida por 96 vasos de matriz.

Las sondas de la presente invencion se pueden obtener por diferentes metodos, tales como sintesis quimica (por ejemplo, por el metodo del fosfotriester convencional); o tecnicas de modificacion genetica, por ejemplo, por clonacion molecular de plasmidos recombinantes en los que se han insertado las correspondientes secuencias de nucleotidos y que se pueden obtener mas tarde por digestion con nucleasas.

De acuerdo con los metodos y el kit de la presente invencion, la muestra de ensayo puede amplificarse antes de ponerse en contacto con las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2. Este deberia ser el caso, en el que cualquiera de los componentes conocidos por el experto que sean necesarios para la amplificacion de acido nucleico y, en particular para la amplificacion por PCR, tambien pueden estar presentes en la mezcla de amplificacion. Por lo tanto, tambien pueden estar presentes los cebadores de amplificacion por PCR, los trifosfatos de nucleotidos apropiados, tales como dATP, dCTP, dGTP, dTTP, y una enzima adecuada para la polimerizacion en la mezcla de los reactivos de amplificacion. Se puede utilizar cualquier enzima para la polimerizacion conveniente. En particular la ADN polimerasa HotStarTaq del kit QIAGEN Multiplex PCR, funciona particularmente bien. Esta ADN polimerasa es una forma modificada de la ADN polimerasa Taq que no tiene actividad polimerasa a temperatura ambiente, y que se activa mediante una incubacion de 15 minutos a 95 °C. Tambien se puede utilizar preferentemente cualquier otra enzima con estas caracteristicas conocida en el estado de la tecnica.

Se pueden utilizar condiciones de ciclado termico convencionales para llevar a cabo la amplificacion de acuerdo con la presente invencion. Algunas condiciones especialmente preferidas son:

Algunos cebadores especialmente preferidos para la amplificacion por PCR que comprenden cualquiera de las secuencias del grupo formado por la SEQ ID N.° 6 y s Eq ID N.° 7 se presentan en la Tabla 3 posterior. Mas preferentemente, los cebadores de amplificacion por PCR consisten en las secuencias de aminoacidos de SEQ ID N.° 6 y SEQ ID N.° 7.

Tabla 3

No es esencial que los cebadores de amplificacion sean los de las SEQ ID N.° 6 y SEQ ID N.° 7. Se pueden utilizar alternativamente otros pares de cebadores de amplificacion que dan lugar a productos de amplificacion que incluyen la region que se hibrida con las sondas SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2.

La presente invencion es compatible con la presencia de cebadores de amplificacion para otros microorganismos en la misma mezcla de reaccion. Ademas, tambien es compatible con la inclusion de pares de cebadores de amplificacion de, al menos, un control interno, y un control de extraccion.

Despues del proceso de amplificacion, preferentemente, el producto de amplificacion obtenido se transforma en una ADN de cadena sencilla antes de la hibridacion con la sonda correspondiente. El ADN de cadena sencilla se obtiene mas preferentemente mediante desnaturalizacion del producto de amplificacion, mas preferentemente, mediante desnaturalizacion por calor.

En los casos en los que la muestra que se va a ensayar no se amplifica antes de la incubacion con las sondas, el acido nucleico en la muestra se puede marcar por cualquier metodo de marcado de ADN conocido en la tecnica. Tambien, se puede introducir un marcador en el producto de amplificacion de ADN durante la amplificacion para permitir la deteccion posterior, en particular un marcador que proporciona una senal se puede detectar por metodos colorimetricos, por metodos fluorescentes, o por cualquier metodo de marcacion conocido en la tecnica. El marcador puede ser un agente radioactivo, quimioluminiscente, luminiscente y fluorescente. En un aspecto preferido, el marcador que se utiliza en biotina. Sin embargo, se puede utilizar cualquier otra clase de marcador conocida en la tecnica (por ejemplo, digoxigenina). En un aspecto preferido, al menos uno de los cebadores utilizados esta marcado en el extremo 5' con biotina. Ademas, el marcado del ADN amplificado se puede conseguir alternativamente anadiendo nucleotidos modificados que albergan un marcador (por ejemplo, biotinilado derivados de digoxigenina dUTP) a la mezcla de PCR. En ciertas realizaciones, se pueden utilizar marcadores radioactivos, asi como fluoroforos.

Se pueden utilizar metodos alternativos conocidos por el experto, que pueden hacer posible la deteccion de la interaction entre cualquier producto de amplificacion y su sonda correspondiente, incluyendo los metodos que implican el marcado de la sonda.

Los productos de la amplificacion desnaturalizados se pueden incubar con las sondas inmovilizadas en una micromatriz, sea por ellos mismos o mezclados en una solucion de hibridacion que contienen sales y detergentes conocidos por el experto en la tecnica para favorecer las interacciones entre las moleculas de ADN.

Debido al marcado del ADN de la muestra, cualquiera de las moleculas de la muestra interactua con las moleculas de sonda de la superficie en la micromatriz, un reactivo indicador se une al marcador y produce senales visibles que se pueden detectar por un dispositivo de deteccion. La interaccion entre la sonda y las moleculas de la muestra se identifican por la localization de la senal en la superficie de la micromatriz. En el caso particular en el que los productos de amplificacion se marcan con biotina, el agente indicador puede ser peroxidasa de rabano rusticano unida covalentemente con estreptavidina. Esta ultima se une especificamente a la biotina, y la peroxidasa desencadena la precipitation de sustratos como el de tetrametilbencidina (TMB) u o-dianisidina.

Se puede utilizar cualquier otro metodo de deteccion conocido en el estado de la tecnica, tal como fluorescencia, para la deteccion de la interaccion entre los productos de la amplificacion y las sondas correspondientes.

Se puede utilizar igualmente cualquier otra reaction que de como resultado un precipitado en los elementos de la matriz, y que se pueda utilizar para detectar la interaccion entre la diana y las moleculas de la sonda.

En una realization preferida, la visualization de las interacciones entre las moleculas diana y sus sondas especificas o de control correspondientes, consiste en las siguientes etapas:

- Primero, la imagen de la micromatriz se captura utilizando un dispositivo optico;

- Luego, se analiza la imagen;

- Finalmente, se proporciona un informe que contiene una interpretation del resultado.

Preferentemente, la imagen se analiza mediante el software a apropiado. Se puede utilizar cualquier dispositivo adecuado para este procesamiento.

En una realizacion preferida, los tipos de muestras de ensayo que se pueden procesar con la presente invention son exudados nasofaringeos, lavados nasofaringeos, esputo, aspirados bronco-alveolares, y lavados bronquioalveolares. Estos serian las muestras mas adecuadas para las infecciones respiratorias. Las muestras adicionales que se procesan de acuerdo con el presente metodo y el kit son la sangre y muestras de cultivo en sangre, que son mas adecuadas en el caso de pacientes con sintomas de sepsis. Cualquier otro fluido corporal, o tejido obtenido de un individuo tambien se puede someter al metodo o kit de la presente invencion. El individuo es un ser humano. La muestra de ensayo puede ser igualmente material genetico extraido de la muestra original. La extraccion de material genetico se puede llevar a cabo por tecnicas del estado de la tecnica tanto automaticas como manuales. En una realizacion mas preferida, el sistema de extraccion automatico es el NucliSENS easyMAG de BioMerieux (documento EP1694813), que utiliza particulas magneticas en combination con la tecnologia BOOM® de BioMerieux para el aislamiento universal del acido nucleico total de un amplio intervalo de volumenes y tipos de muestra. Se pueden utilizar igualmente otras tecnicas de extraccion automatica.

El experto tambien es consciente de tecnicas y metodos para el procesamiento manual de muestras para la extraccion de acidos nucleicos; y se puede utilizar cualquiera de dichos metodos adecuados.

En un ejemplo en particular, los acidos nucleicos se extraen de la muestra que se va a ensayar. Preferentemente, el volumen inicial esta en el intervalo de desde 200 pl a 1 ml. Despues de la etapa de extraccion, se resuspende un precipitado en un volumen de desde 25 pl a 80 pl de agua libre de RNasa. En una realizacion particular, 5 pl de los 25 a 80 pl que comprende el material genetico extraido de la muestra de ensayo, se anaden a un vaso que contiene los reactivos de amplificacion, en un volumen final de 50 |jl.

“y/o” cuando se utiliza en el presente documento se tiene que tomar como la divulgacion espedfica de cada una de las caracteristicas o componentes especificados con o sin el otro en cada combinacion a menos de que se dicte otra cosa. Por ejemplo, “A, B, y/o C” se toma como la divulgacion de cada uno de (i) A, (ii) B, (iii) C, (iv) A y B, (v) B y C, o (vi) A y B y C, como si cada uno se expusiera individualmente en el presente documento.

Como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “uno", “una" y “el" incluyen las referencias en plural a menos de que el contexto dicte claramente otra cosa.

Los ejemplos que se proporcionan posteriormente simplemente ilustran la presente invencion y de ninguna manera limitan el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1:

Se obtuvo una muestra de sangre de cultivo positivo al Streptococcus pneumoniae, y se extrajo el ADN de esta mediante el kit NucliSENS easyMAG de BioMerieux. El volumen inicial del cultivo de sangre que se utilizo era de 1 ml, mientras que el volumen final despues de la elucion era de 80 jl.

A continuacion, se tomaron 5 j l del volumen eluido y se sometieron a la amplificacion con los siguientes reactivos en la muestra:

Los productos de amplificacion se desnaturalizaron mediante incubacion a 95 °C durante 10 minutos. Despues de esto se incubaron 5 j l del producto de la PCR desnaturalizado, en presencia de una solucion de hibridacion convencional, con una micromatriz que comprende las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2 inmovilizadas en posiciones conocidas.

Despues de una serie de etapas de lavado y bloqueo convencionales, se tomo una imagen con la visualizacion del resultado final que se muestra en la Figura 1.

Ejemplo 2

Se obtuvo una muestra de un cultivo de sangre positivo a Streptococcus mitis, y se sometio al mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1 para Streptococcus pneumoniae. La visualization del resultado final se presenta en la Figura 2.

Ejemplo 3

Se obtuvo una muestra de un cultivo de sangre positivo a Streptococcus oralis, y se sometio al mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1 para Streptococcus pneumoniae. La visualizacion del resultado final se presenta en la Figura 3.

Ejemplo 4

Se obtuvo una muestra de un cultivo de sangre positivo a Streptococcus dysgalactiae, y se sometio al mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1 para Streptococcus.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para la deteccion de Streptococcus pneumoniae en una muestra de ensayo, comprendiendo el metodo:

- someter la muestra a una amplificacion por PCR dando lugar a productos de la amplificacion que incluyen una region que se hibrida con las sondas de las SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2, en donde se introduce un marcador detectable en los productos de amplificacion;

- transformar cualquiera de los productos de amplificacion de la PCR en un ADN de cadena sencilla;

- poner en contacto cualquier ADN de cadena sencilla con ambas sondas de las SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2, estando proporcionadas dichas sondas en una micromatriz; y

- detectar una senal proporcionada por el marcador detectable de cualquier ADN de cadena sencilla que se ha hibridado con las sondas, en donde:

- las senales positivas de igual intensidad en ambas posiciones de la micromatriz correspondientes a las sondas de las SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2 son indicativas de la presencia de Streptococcus pneumoniae en la muestra; - una senal positiva en la posicion correspondiente a la sonda de la SEQ ID N.° 1, y una senal en la posicion correspondiente a la sonda de SEQ ID N.° 2 que tiene una intensidad de menos del 20 % de la correspondiente a la sonda de SEQ ID N.° 1, es indicativa de la presencia de Streptococcus mitis en la muestra; y

- una senal positiva en la posicion correspondiente a solo una sonda, o sin senal en ninguna de las posiciones correspondientes a las sondas de SEQ ID N.° 1 y 2, es indicativa de la presencia de otras especies del genero Streptococcus.

2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que se utilizan dos secuencias de acido nucleico que comprenden respectivamente las SEQ ID N.° 6 y SEQ ID N.° 7 como cebadores de la amplificacion por PCR.

3. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 en el que las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2 estan incluidas en un vaso de matriz individual, o en un conjunto de vasos de matriz.

4. Un kit para la deteccion de Streptococcus pneumoniae en una muestra de ensayo, en donde dicho kit comprende un vaso de matriz o un conjunto de vasos de matriz, comprendiendo cada uno una micromatriz en las que se proporcionan ambas sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2, y una mezcla de amplificacion, que comprende cebadores de amplificacion por PCR y un marcador detectable, para la production de productos de amplificacion marcados que incluyen la region que se hibrida con las sondas de las SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2.

5. El kit de la reivindicacion 4, en donde dicho kit comprende adicionalmente reactivos para su uso en la visualization de la hibridacion de acidos nucleicos con las sondas de la micromatriz.

6. El kit de la reivindicacion 4 o la reivindicacion 5 en el que la mezcla de amplificacion comprende dos secuencias de acido nucleico que comprenden respectivamente las SEQ ID N.° 6 y SEQ ID N.° 7, como cebadores de amplificacion por PCR.

7. Un conjunto de sondas que comprende las sondas de SEQ ID N.° 1 y SEQ ID N.° 2.

8. Una micromatriz que comprende el conjunto de sondas que se definen en la reivindicacion 7.

9. Uso del kit de las reivindicaciones 4 a 6, el conjunto de sondas de la reivindicacion 7 o la micromatriz de la reivindicacion 8 para la deteccion in vitro de Streptococcus pneumoniae.

10. Uso del kit de las reivindicaciones 4 a 6, el conjunto de sondas de la reivindicacion 7 o la micromatriz de la reivindicacion 8 para el diagnostico de una infection por Streptococcus pneumoniae en una muestra de un paciente.

11. Uso de la reivindicacion 10 en el que la infeccion es una infeccion septica o respiratoria.