ES2327593B1 - Metodo de identificacion de especies bacterianas de los generos anaplasma/ehrlichia y bartonella. - Google Patents

Metodo de identificacion de especies bacterianas de los generos anaplasma/ehrlichia y bartonella. Download PDF

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Abstract

Método de identificación de especies bacterianas de los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella.
La presente invención, referida a un método de detección e identificación de las especies bacterianas pertenecientes a los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella. Junto con este método, la invención también proporciona los cebadores y sondas necesarios para llevarlo a cabo.

Description

Método de identificación de especies bacterianas de los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella.
La presente invención, se refiere a un método de detección e identificación de las especies bacterianas pertenecientes a los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella. Junto con este método, la invención también proporciona los cebadores y sondas necesarios para llevarlo a cabo.
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Estado de la técnica anterior
Actualmente, hay descritas unas 200 enfermedades zoonóticas (bartonelosis, leptospirosis, borreliosis de Lyme...) que el hombre puede padecer y que en países en vías de desarrollo constituyen una importante causa de mortandad y suponen cuantiosas pérdidas económicas. La convivencia con animales, la ausencia de infraestructuras sanitarias y el bajo nivel cultural continúan siendo los principales aliados de estas enfermedades.
Del mismo modo, en los países desarrollados determinadas zoonosis, que se extienden en aquéllos que se encuentran en vías de desarrollo, tienden a difundirse como consecuencia del aumento tráfico internacional de animales y viajeros, la concentración de la población en zonas urbanas y periurbanas, etc. Estas circunstancias, entre otras, conllevan un creciente riesgo de introducción de enfermedades exóticas en nuestro entorno.
Además, el hecho frecuente del hallazgo de artrópodos infectados por más de un patógeno, ocasiona que más de una zoonosis pueda ser transmitida a través de una única picadura. En este sentido, cada vez son más comunes las hospitalizaciones de individuos que presentan cuadros clínicos producidos por el contacto con animales o artrópodos, tales como mosquitos, garrapatas, pulgas, piojos, ácaros, etc., los cuales actúan como vectores o como reservorios de patógenos. Dichos cuadros clínicos, debido a su gran similitud, no permiten una identificación rápida y fiable del agente causante de la patología, no siendo posible la aplicación rápida de tratamientos específicos, que ocasiones llegan demasiado tarde. Esta circunstancia justifica la necesidad de un método integrado de detección e identificación de especies bacterianas causantes de zoonosis.
Hasta el momento, los métodos moleculares de diagnósticos disponibles se limitan básicamente a la detección de los patógenos mediante tecnología de anticuerpo. Este tipo de análisis, generalmente retrospectivo y en ocasiones de baja sensibilidad, suelen ser de escasa ayuda en para tratamiento de enfermedades en fase aguda.
Otra de las alternativas para la detección e identificación de patógenos está basada en la aplicación de medios cultivo. Este tipo de técnicas son de escasa aplicabilidad para determinadas especies de géneros como Bartonella y Anaplasma/Ehrlichia, debido a que éstas no crecen generalmente en los medios de cultivo habituales e incluso pueden llegar a necesitar cultivos celulares. Por estas circunstancias ocasionan que estas metodologías estén apartadas de las prácticas habituales en los laboratorios de microbiología de los hospitales. Una de las alternativas más eficaces a este tipo de metodologías la constituye el análisis directo de material genético, fundamentado en la tecnología PCR. Esta tecnología, aunque muy efectiva, encuentra su mayor limitación en la dificultad para encontrar marcadores o regiones especificas, así como cebadores y sondas, que permitan un análisis fiable de las
muestras.
Recientemente, se ha publicado un trabajo (Blaskovic D. et al. 2005. FEMS Microbiology Letters 243:273-8), que describe un método basado en el análisis de ADN ribosomal, aunque emplea cebadores universales, que amplifican material genético tanto de bacterias diana como de otras que no los son, lo que ocasiona que su sensibilidad sea bastante reducida.
Otros métodos como los descritos por las patentes americanas US 6,300,072 y 6,518,020 son capaces de detectar e identificar bacterias del género Bartonella, mediante el empleo de la misma región 16S-23S, aunque sin embargo el número de especies dentro de este género ha aumentado sensiblemente desde el depósito de dichas patentes y su aproximación, que consiste en una discriminación entre especies según el tamaño del amplicón obtenido en una PCR, no es útil para determinadas especies del género actualmente conocidas que comparten un tamaño de fragmento amplificado similar.
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Breve descripción de la invención
La presente invención propone el empleo de los genes 16S y msp2 y el espacio intergénico 16S-23S para la detección e identificación de diferentes especies y grupos de especies bacterianas zoonóticas, aportando mejoras respecto de los procedimientos descritos anteriormente, puesto que éste es capaz de detectar específicamente un número muy elevado especies bacterianas, mediante el empleo de sondas y cebadores con unos niveles de sensibilidad bastante elevados.
Así, la presente invención consigue resolver el problema de lo tedioso y complicado que resulta detectar un elevado número de especies bacterianas zoonóticas, que pueden ser clínica y/o epidemiológicamente indistinguibles, mediante el desarrollo de un método y un Kit de detección basado en la tecnología PCR. Concretamente, la invención permite analizar diferentes regiones del ADN bacteriano de los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella para llevar a cabo identificaciones de género y especie, según se muestra en la siguiente tabla (Tabla 1).
En la mayoría de los casos, las especies identificadas se corresponden a especies cultivadas y en otros se refieren a especies aisladas por primera vez (especies no cultivadas). Dichas especies han sido obtenidas a partir de muestras de las especies Meles meles (tejón), Ixodes ricinus y Apodemus sylvaticus y han sido caracterizadas por las secuencias AJ269792, SEQ ID NO:44-46, según se muestra en la tabla 3.
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TABLA 1
2 
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Breve descripción de las figuras
Figura 1.- Esta figura muestra dos membranas de hibridación para la validación de los cebadores y sondas empleados en las detecciones del género Bartonella. En la membrana de la izquierda se observa la ausencia de reactividad cruzada entre las diferentes sondas dentro del género. En la membrana de la derecha puede observarse como no existe reactividad cruzada de las sondas con muestras ajenas al propio género Bartonella. La sonda S-CI2 hace referencia a la sonda empleada como CIA.
Figura 2.- Esta figura muestra dos membranas de hibridación para la validación de los cebadores y sondas empleados en las detecciones del género Anaplasma/Ehrlichia. En la membrana de la izquierda se observa la ausencia de reactividad cruzada entre las diferentes sondas dentro del género. En la membrana de la derecha puede observarse como no existe reactividad cruzada de las sondas con muestras ajenas al propio género Anaplasma/Ehrlichia. La sonda S-CI2 hace referencia a la sonda empleada como CIA.
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Descripción detallada de la invención
De acuerdo con un primer aspecto de la invención, ésta se refiere a un método (en adelante, método de la invención) para la detección e identificación, preferentemente de manera simultanea, de cualquiera de las especies y géneros bacterianos, según se indica en las tablas 2 y 3, que comprende los siguientes pasos:
a.
amplificar cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que comprende SEQ ID NO:1-17, 47 y/o sus secuencias complementarias mediante cebadores específicos,
b.
detectar la amplificación de las secuencias del paso a), siendo dicha amplificación indicativa de la presencia o ausencia de los géneros o especies bacterianas causantes de zoonosis, según se indica en las tablas 2 y 3.
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Los cebadores para llevar a cabo el método de la invención pueden ser diseñados por alineamiento múltiple de las secuencias que comprenden las SEQ ID NO:1-17 y 47 con programas informáticos como CLUSTAL X, permiten la identificación de regiones muy conservadas que servirán molde para el diseño de los cebadores, que deben ser validados posteriormente empíricamente.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores son capaces de hibridar con diferentes regiones nucleotídicas de los genes 16S, mp2 y espacio intergénico 16S-23S (tablas 2 y 3), aunque preferentemente dichos cebadores tienen las secuencias seleccionadas del grupo SEQ ID NO:18-25 y/o sus secuencias complementarias, siendo éstos capaces de amplificar las SEQ ID NO:1-17, 47 y/o sus secuencias complementarias, preferentemente de manera simultanea. Estos cebadores, además de facilitar la manejabilidad del método, tienen la ventaja de presentan una baja o nula reactividad frente a muestras procedentes de otras especies (ver tabla 5).
En una realización aun más preferida de este aspecto de la invención, la detección de las secuencias SEQ ID NO:1-17, 47 y/o sus complementarias puede ser realizada con metodologías sobradamente conocidas en el estado de la técnica, preferentemente mediante sondas. En una realización aun más preferida, estas sondas son capaces de hibridar entre las posiciones de los genes 16S, msp2 y espacio intergénico 16S-23S, según se indica en las tablas 2 y 3, aunque preferentemente dichas sondas comprenden las secuencias seleccionadas del grupo que comprende las SEQ ID NO:26-42, 48 y/o sus complementarias.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a cebadores capaces de amplificar las secuencias seleccionadas del grupo que comprende las SEQ ID NO:1-17, 47 y sus secuencias complementarias. Preferentemente, dichos cebadores son capaces de hibridar entre las posiciones nucleotídicas de los genes 16S, mp2 y el espacio intergénico 16S-23S, según se indica en las tablas 2 y 3 (columna 3). En una realización todavía más preferida, los cebadores comprenden las secuencias seleccionadas del grupo SEQ ID NO:18-25 y/o sus secuencias complementarias. En adelante estos cebadores serán denominados como cebadores de la invención.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a sondas capaces de detectar específicamente cualquiera de las especies y géneros bacterianos, según se indica en las tablas 2 y 3 (columna 6), donde dichas sondas son capaces de hibridar entre las posiciones nucleotídicas de los genes 16S, mp2 y el espacio intergénico 16S-23S, según se indica en las mencionadas tablas 2 y 3. En una realización todavía más preferida, las sondas tienen las secuencias seleccionadas del grupo SEQ ID NO:26-47, 48 y/o sus secuencias complementarias. En adelante estas sondas serán denominadas como sondas de la invención.
Un cuarto aspecto de la invención está referido a un kit de análisis para llevar a cabo la identificación de cualquiera de los géneros o especies bacterianos, según se indica en las tablas 2 y 3, donde dicho kit comprende cualquiera de los cebadores y sondas de la invención. Además, este kit puede comprender sin ningún tipo de limitación todos aquellos reactivos, tampones, soportes, etc. que permitan la puesta a punto del mismo.
1
3
\text{*}
B. chomeli/schoenbuchensis/capreoil/birtlesii.
Breve explicación de las tablas 2 y 3
\sqbullet
En la columna 1 (organismo) se indica la especie o grupo de especies bacterianas que es detectado en cada caso. El grupo Bartonella sp. hace referencia a un conjunto de especies de este género con un alto grado de similitud y que son detectadas conjuntamente por el método de la invención.
\sqbullet
En la columna 2 (gen) se indica el gen o región del genoma que es empleada para la detección de la especie o grupo de especies bacterianas de la columna 1.
\sqbullet
En la columna 3 (cebador) se indica la secuencia del par de cebadores necesario para llevar a cabo la amplificación de regiones variables del gen o espacio intergénico indicado en cada tabla (columna 2), además de la secuencia con la que éstos hibridan.
\sqbullet
En la columna 4 (sonda) se indica la secuencia de las sondas que son empleadas para la detección de las especies o grupo de especies bacterianas referidas en la columna 1 de cada tabla.
\sqbullet
En la columna 5 (secuencia 5'-3') se indican las referencias de las secuencias de las regiones variables que son amplificadas para llevar a cabo la detección de cada la especie o grupo de especies bacterianas.
\sqbullet
En la columna 6 se indica un código de secuencia referente a una región del gen o región genómica referido en la columna 2, así como la posición concreta de dicha secuencia en donde hibrida la sonda indicada en la columna 4.
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Exposición detallada y modos de realización
La presente invención ha permitido desarrollar un método de análisis para la detección e identificación de diferentes géneros y especies bacterianos por tecnología PCR o PCR múltiple. Para el diseño de la metodología fue necesario analizar el espacio intergénico 16S-23S rRNA y los genes 16S y msp2. Estas regiones se analizaron combinado diferentes paquetes informáticos y por comparación en bases de datos, hasta que finalmente se detectaron aquellas regiones candidatas que eran susceptibles de ser utilizadas para llevar a cabo el método.
Las regiones candidatas se utilizaron para las construcción de un elevado número de cebadores y sondas, la mayoría de los cuales, aproximadamente el 90%, fueron descartados por ensayos de hibridación, hasta que finalmente se seleccionaron aquellos que no mostraban reactividad cruzada con muestras de diferentes orígenes (Figuras 1 y 2, Tabla 5) y, además, aportaban un alto grado de sensibilidad.
A continuación, se detallan los materiales y métodos que han sido empleados para el desarrollo de la presente invención, así como ejemplos de realización de la misma. Dichos ejemplos no limitan la invención, sino que su finalidad es ilustrarla, poniendo de manifiesto eficiencia del método de la invención.
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Ejemplo 1
Amplificación, hibridación y validación
En este paso se procede a realizar el análisis experimental de las zonas variables detectadas anteriormente (regiones candidatas) por PCR para su validación. El ADN aislado se amplificó por PCR, aplicando el siguiente cuadro de ciclos de temperatura y composición de la mezcla de reacción, junto con los cebadores específicos que previamente habían sido diseñados.
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4 
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Composición de la mezcla de reacción de PCR para un volumen final de 50 \muL:
-
H_{2}O: En función del volumen de ADN
-
Buffer Taq Gold LD: 9 \muL
-
Cl_{2}Mg [3 mM]: 6 \muL
-
dNTPs [200 mM]: 1 \muL x 4
-
BSA [0,8 ug/uL]: 4 \muL
-
8 Cebadores específicos (SEQ ID 18-25) [50 pm/\muL]: 0,5 \muL de cada uno (7 \muL)
-
Taq Gold LD: 0,5 \muL [2,5 unidades]
-
ADN problema: máximo de 800 ng.
Los amplicones se secuenciaron para su validación, comprobándose que la secuencia amplificada coincidía con las secuencias variables deducidas de los estudios bioinformáticos.
Posteriormente, los amplicones se hibridaron con las sondas específicas siguiendo el protocolo de RLB descrito por Sjoerd G. T. Rijpkema et al., Journal of Clinical Microbiology, Dec. 1995, p. 3091-3095, aunque aplicando las siguientes modificaciones (Figuras 1 y 2):
-
Sustrato: Super Signal West Dura (Pierce, Ref: 34075)
-
Sondas: se utilizan a una concentración entre 0,2 y 3,2 picomoles/microlitro
-
Incubación: a 55ºC
-
Lavados: a 52ºC.
El resultado de las hibridaciones es mostrado en las figuras 1 y 2 donde se aprecia como cada una de las sondas de la invención se unen específicamente a cada uno de los amplicones de las especies bacterianas, que se detectan mediante el método de la invención.
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Preparación de muestras y PCR múltiple
Una de las ventajas de los sistemas de identificación, basados en las tecnologías PCR y RLB, consiste en que no es necesario partir de cultivos bacterianos puros. De este modo, y una vez realizada la validación de los cebadores y las sondas con muestras de ADN de las diferentes especies y grupos de especies citados en las tablas 2 y 3 (Figuras 1 y 2), se procedió a la realización de un análisis por PCR múltiple de una mezcla de ADN de control, que contenía ADN de las diferentes especies y grupos de especies citados en las tablas 2 y 3, preparada en laboratorio, seguida de un ensayo RLB, empleando los cebadores y sondas especificas diseñados, los ciclos de temperatura y la composición de mezcla de reacción, indicados anteriormente.
Sorprendentemente, la selección de cebadores y sondas realizada consiguió la detectar simultáneamente todos los géneros y especies bacterianas propuestas, con un elevado grado de sensibilidad (10 equivalentes de genoma o copia de los fragmentos insertados en un plásmido vector) y sin que se produjese reactividad cruzada entre las diferentes especies.
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Detección de inhibidores de PCR
Para la detección de inhibidores de PCR, se construyó un control de interno de amplificación (CIA) que fue amplificado junto los ADN diana, utilizando cebadores específicos (Tabla 4), diseñados a partir de regiones conservadas de la secuencia AB183705 perteneciente al gen de la THC sintasa de Cannabis sativa. Concretamente, el amplicón que actúa como
5
CIA se corresponde con una secuencia de 371 pares de bases para la cual se diseñó también una sonda para su detección durante el RLB.
Especificidad del método
La alta especificidad del presente método está basada el diseño y selección de los cebadores y sondas que utiliza, los cuales fueron probados con otra serie de organismos (Tabla 5), siguiendo el método descrito anteriormente, comprobándose que en ningún caso se detectó inespecíficamente la formación de amplicones (Figuras 1 y 2, membrana derecha).
6
<110> Instituto de salud Carlos III
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<120> Método de detección simultánea de especies bacterianas de los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella 
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<130> ES1613.3
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<160> 52
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<170> PatentIn version 3.4
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Anaplasma phagocytophium 
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ggtcttgaag cgctcgtaac c 
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21 
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<210> 2
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Ehrlichia ruminantium 
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<400> 2
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gccgargcta taaataactg tcc 
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23 
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<210> 3
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Ehrlichia sennetsu 
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<400> 3
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gcaagcagct ttgattcc 
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18 
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Ehrlichia risticii 
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20 
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> Ehrlichia muris 
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cgaacggata gctacccata gc 
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22 
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<210> 6
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Anaplasma platys 
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catagcaagc tacgacaaaa atc 
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23 
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Ehrlichia canis/Ehrlichia ovina 
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gccagaggct ataaataatt gtcc 
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> Bartonella sp.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatgctggca actaagggcg ag 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bartonella talpae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gattaaatgg acctaaaggg actg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bartonella phoceensis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagagacgct tttccctttg g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bartonella rattimasiliensis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggtgttttg aggcaaagtg c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bartonella rochalimae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aacagggaaa agagcaggcc a 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bartonella sp. * (B. chomeli/schoenbuchensis/capreoli/birtlesii)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagcaaactt atcagcaatc ataa 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bartonella sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccttttctcc tttttagggg c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bartobella sp de Meles Meles 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatgttttgt aaaagtgcgt cg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bartonella sp. de Ixodes ricinus 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgctcgtcta tcgcttgata 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bartonella sp. de Ixodes ricinus 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcaggcactc ggcataagc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccagcgttta gcaagataag ag 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcccagtaac aacatcataa gc 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagaacgaac gctrgcggya rg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcrttackca cccgtctgcc ac 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccttcagttm ggctggatc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccyccttgc ggttagcaca gca 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgataagcg tgaggtcgga gg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caaagcaggt gctctcccag 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (sonda -MSP2-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggttacgagc gcttcaagac c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (sonda -S-RUM-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggacagttat ttatagcytc ggc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (sonda -SEM-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaatcaaag ctgcttgc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (sonda -S-RIS-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaatcaggg ctgcttgcag 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (sonda -S-MUR-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgaacggata gctacccata gc 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (sonda -S-PLA-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatttttgtc gtagcttgct atg 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (sonda -S-CANOVIN-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggacaattat ttatagcctc tggc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (sonda -S-BARTOGEN2-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcgccctta gttgccagca tt 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (sonda -S-TOPO-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagtcccttt aggtccattt aatc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (sonda -S-PHO-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccaaagggaa aagcgtctct c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (sonda -S-RAT-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcactttgcc tcaaaacacc g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (sonda -S-ROC-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggcctgctc ttttccctgt t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (sonda -CHOSCA-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttatgattgc tgataagttt gctg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (sonda -S-APO38-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcccctaaaa aggagaaaag g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (sonda -S-TEJ-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgacgcactt ttacaaaaca tc 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (sonda -S-G-13)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tatcaagcga tagacgagcg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (sonda -S-G-41)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcttatgccg agtgcctgc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 452
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bartonella talpae (fragmento del espacio intergénico 16S-23S)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
7 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 427
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bartonella asilada de Melus Meles (fragmento del espacio intergénico 16S-23S)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
8 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 201
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Bartonella asilada de zxodes ricinus 13 (fragmento del espacio intergénico 16S-23S)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
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\hskip0,8cm
9 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
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<211> 186
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<212> DNA
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<213> Bartonella asilada de zxodes ricinus 41 (fragmento del espacio intergénico 16S-23S)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
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\hskip0,8cm
10 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Género Anaplasma/Ehrlichia 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catgcaagtc gaacggatta t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Género Anaplasma/Ehrlichia (sonda -AE-GEN-)
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<400> 48
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\hskip-.1em\dddseqskip
adrkycgttc gacttgcatg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
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<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Cannabis sativa (THC sintasa)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctcctccac taaagtgtcc ac 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (sonda -S-CI-2-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtggacactt tagtggagga gg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (cebador, CI-F)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgatgctga gggtatgtcc tac 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (cebador, CI-R)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gttttctcct ccaccaccac g 
\hfill
21

Claims (9)

1. Método para la detección simultánea de especies bacterianas causantes de zoonosis, pertenecientes a los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella, que comprende los siguientes pasos:
a.
Poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reacción que comprenda cebadores específicos que amplifiquen las secuencias seleccionadas del grupo que comprende SEQ ID NO: 1-17 y 47 ó sus respectivas secuencias complementarias.
b.
Amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa.
c.
Identificar la formación de productos del paso anterior, siendo dicha formación indicativa de la presencia o ausencia de bacterias causantes de zoonosis.
2. Método para la detección simultánea de especies bacterianas según reivindicación 1, donde los cebadores consisten en las secuencias seleccionadas del grupo que comprende SEQ ID NO:18-25 y sus secuencias complementarias.
3. Método para la detección simultánea de especies bacterianas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde la detección de los productos de amplificación se realiza mediante sondas que consisten en las secuencias seleccionadas del grupo que comprende SEQ ID NO:26-42 y 48 y sus secuencias complementarias.
4. Cebadores cuya secuencia consiste en cualquiera de las secuencias SEQ ID NO:20-21 y sus secuencias complementarias, donde dichos cebadores permiten la amplificación de cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que comprende SEQ ID NO: 2-7 y 47.
5. Cebadores cuya secuencia consiste en cualquiera de las secuencias SEQ ID NO:22-23 y sus secuencias complementarias, donde dichos cebadores permiten la amplificación de la secuencia que comprende la SEQ ID NO: 8.
6. Sondas cuya secuencia consiste en cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que comprende SEQ ID NO:26-42 y 48 y sus secuencias complementarias, donde dichas sondas son capaces de hibridar con las secuencias seleccionadas del grupo que comprende SEQ ID NO:1-17 y 47 y su secuencias complementarias, según se indica en las tablas 2 y 3.
7. Kit de análisis capaz de llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
8. Kit según la reivindicación anterior que comprende cebadores según las reivindicaciones 4 y 5.
9. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 7-8 que comprende sondas según la reivindicaciones 6.
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