ES2344753T3 - Procedimiento para la deteccion especifica de legionella pneumophila. - Google Patents
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Abstract
Método para la detección específica de la presencia de Legionella pneumophila en una muestra que se sospecha que contiene L. pneumophila, y que comprende además uno o más microorganismos distintos, caracterizado por el hecho de que (i) la muestra se analiza para identificar la presencia de un gen fis (factor de estimulación de la inversión) de Legionella pneumophila; y (ii) se evalúa la cantidad del gen fis de Legionella pneumophila presente en la muestra y si la muestra comprende el gen fis de Legionella pneumophila es una prueba de que Legionella pneumophila está presente en la muestra; en donde el gen fis de Legionella pneumophila es un gen fis seleccionado del grupo de genes fis que consiste en: (a) un gen fis que comprende una secuencia de ADN que tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 1-282 de la SEC ID Nº 1 (denominada "fis1"); (a1) un gen fis que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 95% con el polipéptido mostrado en las posiciones 1-93 de la SEC ID Nº 2 (denominada "FIS1"); (b) un gen fis que comprende una secuencia de ADN que tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 1-297 de la SEC ID Nº 3 (denominada "fis2"); (b1) un gen fis que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 95% con el polipéptido mostrado en las posiciones 1-98 de la SEC ID Nº 4 (denominada "FIS2"); (c) un gen fis que comprende una secuencia de ADN que tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 1-288 de la SEC ID Nº 5 (denominada "fis3"); y (c1) un gen fis que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 95% con el polipéptido mostrado en las posiciones 1-95 de la SEC ID Nº 6 (denominada "FIS3").
Description
Procedimiento para la detección específica de
Legionella pneumophila.
La presente invención se refiere a un método
para la detección específica de la presencia de Legionella
pneumophila en una muestra que se sospecha que contiene L.
pneumophila y que comprende además uno o más microorganismos
distintos.
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La Legionella pneumophila es una bacteria
gram negativa en forma de bacilo que es el agente causal de un alto
porcentaje de neumonías tanto intrahospitalarias como
extrahospitalarias. Cuando aparece la legionelosis, puede ser
mortal si el diagnóstico y el tratamiento no se establecen
rápidamente, particularmente en ancianos y pacientes
inmunocomprometidos. Por lo tanto, son necesarios métodos de
diagnóstico y detección rápidos para mejorar el desenlace de los
pacientes infectados. Dentro del género Legionella hay varias
especies distintas de L. pneumophila que no están dando
problemas de virulencia significativos para seres humanos.
En la actualidad, la detección de
Legionella se está realizando tanto ambiental como
clínicamente.
En el entorno, se encuentra típicamente en
varios entornos acuáticos incluyendo los más directamente
relacionados con actividades humanas tales como torres de
refrigeración y sistemas de distribución de agua potable de uso
domésticos. Más recientemente, se ha demostrado la presencia de esta
bacteria en aguas subterráneas.
En muestras clínicas, la Legionella puede
obtenerse directamente de esputo, lavado broncoalveolar o
aspiración traqueal. En la legionelosis avanzada, también puede
cultivarse a partir de muestras de sangre.
Recientemente, la detección molecular por medio
de técnicas basadas en PCR se ha convertido en un procedimiento
común para la identificación rápida de Legionella. Se han
puesto en práctica protocolos de PCR tanto a tiempo real modernos
como convencionales, que se dirigen a varios genes que contienen
secuencias únicas distintivas.
Los métodos basados en PCR descritos hasta la
fecha se dirigen a varios genes filogenéticos y funcionales e
incluyen oligonucleótidos que se dirigen específicamente a regiones
del operón ribosómico tales como el espaciador
23S-5S (Herpers, B. L, et al, (2003), J.
Clin. Microbiol., 41, 4815-4816) o el ARNr 16S
(Lisby et al, (1994) Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 13,
225-231).
No obstante, los genes funcionales implicados en
la virulencia y la infectividad son actualmente los marcadores de
elección para la mayoría de procedimientos de PCR. Los genes usados
más ampliamente hasta la fecha son mip (potenciador de la
infectividad de macrófagos) y dotA (defecto en el transporte
de orgánulos). El gen mip fue de hecho la primera diana
molecular (ADN) para la detección por PCR de Legionella y
codifica una proteína de 24 kDa (Mip), un factor de
virulencia que consiste en una proteína de superficie que facilita
que L. pneumophila parasite macrófagos humanos y cause
neumonía en animales de experimentación. Mip contiene
secuencias específicas que pueden usarse para distinguir especies de
Legionella entre sí (Mahbubani, et al, (1990), Mol
Cell Probes, 4, 175-187). El gen dotA
(defecto en el transporte de orgánulos) codifica una proteína que
regula el transporte del fagosoma de L. pneumophila (Roy,
et al, (1998), Mol Microbiol, 28, 663-674).
El documento US5935782 describe el uso de los genes frgA y
hbp para la detección de L. pneumophila. Los genes
frgA y hbp están funcionalmente relacionados con
mip y por lo tanto también pueden caracterizarse como genes
implicados en la virulencia y la infectividad.
Sin embargo, todos estos genes relacionados con
factores de virulencia y patogénicos (por ejemplo, mip y
dotA) es probable que estén inactivos durante la vida
ambiental normal de este microorganismo, y por lo tanto, no
puedan usarse para la determinación de bacterias viables en muestras
ambientales.
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El problema a resolver por la presente invención
es proporcionar un método para detectar específicamente
Legionella pneumophila, en el cual el método proporciona la
posibilidad de determinar si existe Legionella
pneumophila viable en, por ejemplo, muestras
ambientales.
La solución se basa en que los presentes
inventores han identificado que un grupo específico de genes de
Legionella conocidos con el término fis (factor para
la estimulación de la inversión) comprende suficientes secuencias
específicas que pueden usarse para detectar específicamente
Legionella pneumophila en una muestra que comprende además
uno o más microorganismos distintos tales como una o más especies
distintas de Legionella aparte de L. pneumophila.
El gen fis pertenece a la familia de
genes de "transcripción", categoría K. Se conocen genes
fis en diferentes organismos tales como, por ejemplo, E.
coli y Salmonella. También se sabe que están presentes
en Legionella pneumophila (véase a continuación para más
detalles). Un gen de "transcripción" tal como fis es
crítico para el desarrollo celular y puede denominarse gen
"constitutivo". Los expertos en la materia saben que dichos
genes "constitutivos" están generalmente muy conservados entre
especies diferentes de un género. Sin embargo, como se ha dicho
anteriormente, sorprendentemente los genes fis de
Legionella pneumophila como se describen en la presente
memoria comprenden secuencias específicas suficientes que pueden
usarse para distinguir específicamente Legionella pneumophila
de otras especies de Legionella diferentes. Véanse, por
ejemplo, los resultados 2.3 de los ejemplos de trabajo del presente
documento, en los cuales se demuestra que Legionella
pneumophila puede distinguirse específicamente de varias
especies diferentes de Legionella y también de otros
microorganismos relevantes. Los resultados proporcionados en la
sección de resultados 2.3 se basan en PCR convencional usando ADN
genómico y cebadores orientados hacia un gen fis de
Legionella pneumophila como se describe en la presente
memoria.
Además, los genes fis
"constitutivos" como se describen en la presente memoria
tienen, como los genes "constitutivos" normales, niveles de
expresión detectables durante las fases latentes de su ciclo de
vida. Por consiguiente, midiendo los niveles de expresión de ARNm se
puede determinar si está presente Legionella pneumophila
viable en muestras ambientales. Véanse los resultados 2.7 de los
ejemplos de trabajo de la presente memoria, en los cuales se
demuestra esto basándose en el uso de PCR con transcripción inversa
(RT).
Ésta es una ventaja muy importante sobre el uso
de la técnica anterior de genes de factores de virulencia y
patogenicidad (por ejemplo, mip y dotA) que
generalmente sólo tienen un nivel de expresión significativo
durante la virulencia y por lo tanto su viabilidad sólo puede
determinarse en muestras clínicas humanas y no en muestras
ambientales (por ejemplo, en entornos acuáticos obtenidos de
edificios).
Además, los genes funcionales como los
enumerados en la sección de antecedentes anterior están sometidos
normalmente a una fuerte variabilidad, principalmente debido a
mutaciones silenciosas en la tercera base del codón. Esto significa
que, por ejemplo, en un oligonucleótido de 21 pares de bases, hasta
siete posiciones están en riesgo de ser inespecíficas, debido a la
variabilidad genética natural de poblaciones bacterianas, que puede
comprometer la especificidad del sistema de PCR. Por alguna razón,
el gen fis como se analiza en la presente memoria, no
muestra esta variabilidad, convirtiéndolo en una diana ideal porque
(i) es un gen funcional con expresión de ARNm detectable y
cuantificable, y (ii) tiene una secuencia altamente conservada.
La secuencia genómica completa de Legionella
pneumophila subesp. pneumophila cepa Philadelphia 1 se
describe en [Chien, et al (2004), The genomic sequence of the
accidental pathogen Legionella pneumophila, Science, 305,
1966-1968]. La secuencia genómica completa tiene el
número de acceso de GenBank AE017354. Los tres genes fis de
Legionella pneumophila descritos en la presente memoria se
describen en Chien, et al. Los genes fis son:
- el gen denominado en la presente memoria fis1. Tiene el número de acceso de GenBank: "AE017354 REGIÓN: 585004..585285" y la secuencia de ADN se muestra en la SEC ID Nº 1. La secuencia de aminoácidos correspondiente se denomina en la presente memoria FIS1 y tiene la ID de proteína: AAU26638.1 y la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID Nº 2;
- el gen denominado en la presente memoria fis2. Tiene el número de acceso de GenBank: "AE017354 REGIÓN: complementaria (1516880..1517176)" y la secuencia de ADN se muestra en la SEC ID Nº 3. La secuencia de aminoácidos correspondiente se denomina en la presente memoria FIS2 y tiene la ID de proteína: AAU27452.1 y la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID Nº 4; y
- el gen denominado en la presente memoria fis3. Tiene el número de acceso de GenBank: "AE017354 REGIÓN: complementaria (1945064..1945351)" y la secuencia de ADN se muestra en la SEC ID Nº 5. La secuencia de aminoácidos correspondiente se denomina en la presente memoria FIS2 y tiene la ID de proteína: AAU27822.1 y la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID Nº 6.
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El experto en la materia sabe que pueden haber
algunas diferencias de secuencia relativamente minoritarias entre
genes similares dentro de subespecies (o serogrupos) diferentes de
la especie de interés (en la presente memoria Legionella
pneumophila). Basándose en los conocimientos generales comunes y
en la bioinformática disponible en la actualidad es rutinario para
el experto en la materia identificar dicha diferencia de secuencia
relativamente minoritaria y determinar si un gen de interés en una
subespecie específica es equivalente a un gen similar en otra
subespecie.
Por consiguiente, un primer aspecto de la
invención se refiere a un método para la detección específica de la
presencia de Legionella pneumophila en una muestra que se
sospecha que contiene L. pneumophila y que comprende además
uno o más microorganismos distintos, caracterizado por el hecho de
que
- (i)
- la muestra se analiza para identificar la presencia de un gen fis (factor de estimulación de la inversión) de Legionella pneumophila; y
- (ii)
- se evalúa la cantidad del gen fis de Legionella pneumophila presente en la muestra y si la muestra comprende el gen fis de Legionella pneumophila es una prueba de que Legionella pneumophila está presente en la muestra;
en el cual el gen fis de Legionella
pneumophila es un gen fis seleccionado del grupo de genes
fis que consiste en:
- (a)
- un gen fis que comprende una secuencia de ADN que tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 1-282 de la SEC ID Nº 1 (denominada "fis1");
- (a1)
- un gen fis que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 95% con el polipéptido mostrado en las posiciones 1-93 de la SEC ID Nº 2 (denominada "FIS1");
- (b)
- un gen fis que comprende una secuencia de ADN que tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 1-297 de la SEC ID Nº 3 (denominada "fis2");
- (b1)
- un gen fis que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 95% con el polipéptido mostrado en las posiciones 1-98 de la SEC ID Nº 4 (denominada "FIS2");
- (c)
- un gen fis que comprende una secuencia de ADN que tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 1-288 de la SEC ID Nº 5 (denominada "fis3"); y
- (c1)
- un gen fis que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 95% con el polipéptido mostrado en las posiciones 1-95 de la SEC ID Nº 6 (denominada "FIS3").
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La expresión "muestra que se sospecha que
contiene L. pneumophila" se refiere al objetivo del método
de la presente invención, que es analizar si la muestra comprende
L. pneumophila o, en una realización preferida, L.
pneumophila viable. Dicho en otras palabras, si se tiene una
certeza del 100% de que la muestra comprende L. pneumophila
o L. pneumophila viable no existe una razón significativa
para analizarla para determinar su presencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1: Alineamiento de las tres secuencias de
proteína Fis codificadas en el genoma de L. pneumophila. *
indica las posiciones absolutamente conservadas.
Fig. 2: Ensayo de especificidad con varios
moldes de ADN de Legionella spp. Carriles
1-8: L pneumophila; 9: L gormanii;
10: L. longbeacheae; 11: L. anisa; 12: L.
oakridgensis; 13: L. fairfieldensis; 14: L.
feelei; 15: L. dumofii; 16: L. micdadei; 17: L.
jordanis; 18: L. wadsworthii; 19: L. bozemanii;
20-26: L. pneumophila; 27: L.
gormanii; 28: L. longbeacheae; 29: L. anisa; 30:
L. oakridgensis; 31: L. fairfieldensis; 32: L.
feelei; 33: L. dumofii; 34: L. micdadei; 35:
L. jordanis; 36: L. wadsworthii; 37: L.
bozemanii; 38: Control sin molde.
Fig. 3: Geles de agarosa que muestran el
resultado del ensayo de RT + PCR en células en desarrollo activo de
Legionella pneumophila. Carriles: L, marcador de 100 pb;
1-3, muestra por triplicado; 4, mezcla sin ARN; 5,
mezcla sin RT; 6, control sin molde; 7, control positivo.
\vskip1.000000\baselineskip
La muestra, por ejemplo, puede ser una muestra
clínica (preferiblemente obtenida de un ser humano) o ser una
denominada muestra ambiental. Preferiblemente, la muestra es una
muestra ambiental.
Preferiblemente, la "muestra ambiental" es
una muestra obtenida de un entorno acuático. Preferiblemente, el
entorno acuático está situado en un lugar importante en la presente
memoria tal como un edificio [preferiblemente un edificio doméstico
(incluyendo hoteles, hospitales, centros de entrenamiento, etc.)],
una torre de refrigeración, un sistema de distribución de agua
potable de uso doméstico, un sistema de agua caliente (por ejemplo,
tuberías), aguas subterráneas o un manantial urbano u otras fuentes
de agua generadoras de aerosoles.
Como se ha dicho anteriormente, la muestra
comprende además uno o más microorganismos distintos.
Los ejemplos de otros microorganismos incluyen
uno o más microorganismos seleccionados del grupo que consiste en
otras especies de Legionella distintas de L.
pneumophila, E. coli, Salmonella, Shigella, Enterobacter,
Micrococcus, Bacillus, Staphylococcus, Pseudomonas, Serratia,
Proteus, Enterococcus, Arthrobacter y
Listeria.
Como se ha dicho anteriormente, una ventaja de
la presente invención es que la Legionella pneumophila puede
distinguirse específicamente de varias especies distintas de
Legionella.
Por consiguiente, en una realización preferida,
el uno o más microorganismos distintos comprendidos en la muestra
es una o más especies de Legionella distintas de L.
pneumophila.
Los ejemplos de otras especies de
Legionella distintas de L. pneumophila incluyen una o
más especies de Legionella seleccionadas del grupo que
consiste en L gormanii, L. longbeacheae, L. anisa, L.
oakridgensis, L. fairfieldensis, L. feelei, L. dumofii, L. micdadei,
L. jordanis, L. wadsworthii y L. bozemanii.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha explicado anteriormente, el gen
fis pertenece a la familia de genes de "transcripción",
categoría K. Se conocen genes fis en diferentes organismos
incluyendo Legionella pneumophila.
El término gen fis es ampliamente
conocido para el experto en la materia y, basándose en su
conocimiento general normal, el experto en la materia puede
determinar de forma rutinaria si un gen de interés es o no un gen
fis. Son ejemplos de esto las anotaciones de fis en
GenBank en las referencias de GenBank fis1 a fis2
proporcionadas anteriormente.
A continuación se describe cierta información
relevante de gen fis pertinente, que se observará como una
mera ilustración del conocimiento general normal con respecto al gen
fis.
El gen fis (factor para la estimulación
de la inversión), codifica un regulador pleiotrópico de la
expresión de polimerasas, proteínas relacionadas con la división
celular y muchos genes ribosómicos, y está implicado en la
replicación y recombinación del ADN. La proteína Fis es un miembro
del grupo de proteínas conocidas como proteínas similares a
histonas o proteínas asociadas a nucleoide. Desempeña un papel
crítico en muchas funciones celulares que varían desde el control
de genes de virulencia en E. coli y Salmonella, hasta
la potenciación de la expresión de algunos
genes.
genes.
Fis es una proteína similar a histonas cuya
característica funcional principal es la regulación de la
transcripción por medio de una interacción física con la molécula de
ADN cromosómico. No obstante, esta proteína puede definirse de
muchas formas, como puede encontrarse en la bibliografía. Estas
definiciones alternativas son:
- -
- Regulador (positivo) de operones de ARN estables (transcripción de ARN).
- -
- Proteína de unión a nucleoide.
- -
- Proteína asociada a nucleoide (reguladora).
- -
- Proteína similar a histonas.
- -
- Proteína de plegamiento del ADN (dimérica pequeña).
- -
- Proteína transactivadora.
- -
- Proteína de la arquitectura del ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Fis es una proteína de plegamiento del ADN
básica pequeña que se ha demostrado principalmente que tanto
estimula las inversiones de ADN como activa la transcripción de ARN
ribosómico en Escherichia coli por interacción con el
promotor. También funciona en muchas otras reacciones incluyendo la
recombinación específica de sitio de fago lambda, la activación
transcripcional de ARNr y la represión de operones de ARNt de su
propia síntesis y replicaciones de ADN dirigidas por
oriC.
Otras funciones de FIS incluyen la regulación de
la expresión de factores de virulencia en E. coli
enteropatogénica, así como en Shigella o Salmonella,
así como el aumento de la expresión de determinados genes que
actúan como un activador de Clase I. Se demostró por primera vez que
FIS actuaba plegando el ADN cuando se describió que esta proteína
se une a y pliega el oriC. Fis determina la topología del ADN
tanto por regulación de la actividad de la topoisomerasa como, como
se ha insinuado anteriormente, reorganizando directamente el ADN.
Se ha propuesto que FIS está implicada en el acoplamiento de la
fisiología celular a la topología de la célula bacteriana. La
proteína actual estabilizando un microbucle de ADN cuya topología
está acoplada a las transiciones topológicas locales generadas
durante el inicio de la transcripción. En resumen, Fis modula la
topología del ADN de una forma dependiente de la fase de crecimiento
que funciona homeostáticamente para contrarrestar niveles excesivos
de superhelicidad negativa. Por lo tanto, esta proteína forma
estructuras de ADN firmemente plegadas, o microbucles, que son
necesarios para la expresión óptima del promotor. La expresión del
gen fis responde claramente a alteraciones en la topología
del ADN in vivo, siendo máxima a altos niveles de
superenrollamiento negativo. Además, se ha descubierto que es
claramente dependiente de la tasa de crecimiento de E. coli.
Esta propiedad es de interés con el fin determinante de esta
patente, puesto que la expresión del gen puede amplificarse en un
factor de 6 (por estimulación de la tasa de crecimiento), que puede
llevar a niveles detectables menores densidades de células viables
después de que se haya aplicado el método de estimulación de la
expresión apropiado.
\newpage
Por consiguiente, en una realización preferida
se añaden compuestos nutricionales de cultivo de Legionella
a la muestra antes de analizar la presencia de ARNm de acuerdo con
la etapa (i) del primer aspecto para estimular la tasa de
crecimiento de la Legionella pneumophila.
Con respecto al primer aspecto de la invención,
se dice de los genes fis pertinentes que tendrán una
identidad de al menos el 95% con las secuencias de referencia
pertinentes. Para todos los genes fis pertinentes del primer
aspecto de la invención el porcentaje de identidad es
preferiblemente de una identidad de al menos el 97,5% con las
secuencias de referencia pertinentes.
En los resultados 2.3 de los ejemplos de trabajo
de la presente memoria el gen fis1 se usa para distinguir
específicamente a Legionella pneumophila de varias especies
distintas de Legionella.
Por consiguiente, el gen fis de
Legionella pneumophila es preferiblemente un gen fis
seleccionado de un grupo de genes fis que consiste en:
- (a)
- un gen fis que comprende una secuencia de ADN que tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 1-282 de la SEC ID Nº 1 (denominada "fis1"); y
- (a1)
- un gen fis que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 95% con el polipéptido mostrado en las posiciones 1-93 de la SEC ID Nº 2 (denominada "FIS1").
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización incluso más preferida, el gen
fis de Legionella pneumophila es un gen fis
seleccionado de un grupo de genes fis que consiste en:
- (a)
- un gen fis que comprende una secuencia de ADN que es idéntica a la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 1-282 de la SEC ID Nº 1 (denominada "fis1"); y
- (a1)
- un gen fis que codifica un polipéptido que es idéntico al polipéptido mostrado en las posiciones 1-93 de la SEC ID Nº 2 (denominada "FIS1").
\vskip1.000000\baselineskip
En línea con esto, para los genes fis2 y
fis3, se prefiere seleccionarlos de un grupo de genes
fis que consiste en
- (b)
- un gen fis que comprende una secuencia de ADN que es idéntica a la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 1-297 de la SEC ID Nº 3 (denominada "fis2");
- (b1)
- un gen fis que codifica un polipéptido que es idéntico al polipéptido mostrado en las posiciones 1-98 de la SEC ID Nº 4 (denominada "FIS2");
- (c)
- un gen fis que comprende una secuencia de ADN que es idéntica a la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 1-288 de la SEC ID Nº 5 (denominada "fis3"); y
- (c1)
- un gen fis que codifica un polipéptido que es idéntico al polipéptido mostrado en las posiciones 1-95 de la SEC ID Nº 6 (denominada "FIS3").
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha dicho anteriormente, en los ejemplos
de trabajo de la presente memoria el gen fis1 se usa para
distinguir específicamente Legionella pneumophila de varias
especies distintas de Legionella. Sin embargo, basándose en
su conocimiento general normal y en las instrucciones basadas en la
secuencia proporcionadas en la presente memoria, es un trabajo
rutinario para el experto en la materia preparar, por ejemplo, un
sistema basado en PCR similar basado en los genes fis2 o
fis3 para generar un sistema alternativo para detectar
específicamente Legionella
pneumophila.
pneumophila.
Un alineamiento de las secuencias proteicas de
los tres genes fis muestra que la FIS1 y la FIS3 son las
secuencias más similares, compartiendo una homología del 48%. A su
vez, FIS2 tiene una similitud del 40% con FIS1 y FIS3. Además, el
alineamiento de las tres secuencias de fis pone de manifiesto
que la homología es superior para la segunda mitad de las
secuencias, poniendo de manifiesto entonces la posible presencia de
restos críticos para la función de la proteína (véase la Figura 1).
Por consiguiente, esta segunda mitad de las secuencias podría ser
una buena base, por ejemplo, para generar cebadores de PCR
específicos de Legionella pneumophila.
\vskip1.000000\baselineskip
En la etapa (i) del primer aspecto, la muestra
se analiza para identificar la presencia de un gen fis
(factor para la estimulación de la inversión) de Legionella
pneumophila.
\newpage
Como se ha explicado anteriormente, una ventaja
de usar genes fis como se describe en la presente memoria se
refiere a que por medición de los niveles de expresión de ARNm se
puede determinar si está presente Legionella pneumophila
viable, por ejemplo, en muestras ambientales.
Por consiguiente, una realización preferida de
la invención es en la que el método, como se describe en la
presente memoria, es un método para la detección de Legionella
pneumophila viable en una muestra, caracterizado por el hecho
de que
- (i)
- la muestra se analiza para identificar la presencia de ARNm expresado a partir de un gen fis (factor de estimulación de la inversión) de Legionella pneumophila; y
- (ii)
- se evalúa la cantidad del ARNm expresado a partir del gen fis de Legionella pneumophila presente en la muestra y si la muestra comprende el ARNm del gen fis de Legionella pneumophila es una prueba de que está presente Legionella pneumophila viable en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha dicho anteriormente, una ventaja de
la presente invención es que la Legionella pneumophila puede
distinguirse específicamente de otros microorganismos (por ejemplo,
otras especies de Legionella) presentes en la muestra.
Por consiguiente, en una realización preferida
la muestra se analiza por una técnica adecuada capaz de identificar
específicamente el gen fis (factor para la estimulación de la
inversión) de Legionella pneumophila analizado o el ARNm
expresado a partir del gen y no identificar cantidades medibles de
secuencias de genes fis del uno o más microorganismos
distintos (por ejemplo, otras especies de Legionella)
comprendidos además en la muestra.
La expresión "cantidades medibles" debería
entenderse como la entendería el experto en la materia en el
presente contexto, es decir, como una cantidad que no da origen a
una cantidad significativa de lo que de acuerdo con la técnica
puede denominarse "falsos positivos". Por ejemplo, si se usa
una técnica de PCR para el análisis, entonces no debería haber
cantidades medibles significativas de una banda de PCR amplificada
de otros organismos, por ejemplo, con un tamaño similar al de la
banda de PCR amplificada "positiva" de Legionella
pneumophila.
La realización de los análisis como se describen
en la presente memoria puede realizarse de forma rutinaria de
varias formas. Sin embargo, puesto que, por ejemplo, una muestra
ambiental comprende generalmente una cantidad relativamente pequeña
de Legionella, generalmente se prefiere usar una técnica de
amplificación para amplificar la secuencia génica pertinente del
ARNm expresado a partir de la misma.
La técnica describe varios procedimientos de
amplificación de este tipo incluyendo tecnologías basadas en
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o reacción en cadena de la
ligasa (LCR). También se describen técnicas que puede decirse que
están basadas en la amplificación en condiciones isotérmicas, tales
como NASBA (amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico,
descrita en la Publicación PCT Nº WO 91/02818) o el método de
"Amplificación por Desplazamiento de Cadena", denominado SDA,
que se describe en el documento US5270184.
El uso de cualquiera de dichas técnicas de
amplificación es una tarea de rutina para el experto en la materia
y representan ejemplos adecuados de las técnicas de amplificación
relevantes en la presente memoria.
Por consiguiente, en una realización preferida,
el método, como se describe en la presente memoria, es en el cual
el análisis, para identificar la presencia de un gen fis
(factor para la estimulación de la inversión) de Legionella
pneumophila o de ARNm expresado a partir del gen fis de
acuerdo con la etapa (i) del método, se realiza mediante una
técnica de amplificación génica adecuada [por ejemplo, reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa
(LCR), NASBA (amplificación basada en la secuencia de ácido
nucleico) o Amplificación por Desplazamiento de Cadena (SDA)] para
amplificar el gen pertinente o el ARNm expresado a partir del
gen.
Además, se prefiere particularmente cuando la
técnica de amplificación se realiza de una forma en la que es capaz
de amplificar específicamente el gen fis (factor para la
estimulación de la inversión) de Legionella pneumophila
analizado o el ARNm expresado a partir del gen y no amplificar
cantidades medibles de secuencias de genes fis del uno o más
microorganismos distintos comprendidos además en la muestra.
Preferiblemente, la técnica de amplificación
génica adecuada es PCR (preferiblemente PCR a tiempo real) y en la
cual los cebadores de PCR se construyen de un modo tal que los
cebadores de PCR amplifiquen específicamente el gen fis
(factor para la estimulación de la inversión) de Legionella
pneumophila analizado o el ARNm expresado a partir del gen y no
amplifiquen cantidades medibles de secuencias de genes fis
del uno o más microorganismos distintos comprendidos además en la
muestra.
En una realización preferida, el análisis se
realiza mediante el uso de una técnica de PCR con transcripción
inversa (RT), en la que se usan cebadores de PCR adecuados. En una
realización aún más preferida se usa una técnica de PCR a tiempo
real. Como sabe el experto en la materia, la RT-PCR
es una técnica en la que el ARNm expresado se convierte en ADNc
(uso de una enzima transcriptasa inversa) y después el ADNc de
interés puede amplificarse por PCR mediante el uso de cebadores
apropiados.
Por consiguiente, en una realización preferida
la técnica de PCR es PCR con transcripción inversa (RT) y se
realiza la detección de la presencia de Legionella
pneumophila viable en la muestra amplificando específicamente
el ARNm expresado a partir del gen fis (factor para la
estimulación de la inversión) de Legionella pneumophila
analizado.
Preferiblemente se usa una PCR a tiempo real
combinada con técnicas de hibridación fluorescentes adecuadas para
añadir sensibilidad a los métodos de detección y, por ejemplo,
acortar considerablemente el tiempo por análisis.
Además, el uso de técnicas tales como PCR
permite además una estimación de la carga bacteriana en una muestra
dada por aproximación del número total por medio de la
cuantificación del número de copias genómicas del gen diana. A este
respecto, una ventaja adicional es que normalmente existe una sola
copia por genoma de los genes fis de L. pneumophila,
como se describe en la presente memoria.
En una realización preferida, los cebadores de
PCR se construyen de un modo en el cual los cebadores de PCR
amplifican el ARNm expresado a partir de un gen fis de
Legionella pneumophila y no amplifican el ARNm de genes
fis de una o más especies diferentes de
Legionella.
Como se ha explicado en la presente memoria,
basándose en su conocimiento normal y en la información
proporcionada en la presente memoria es un trabajo rutinario para el
experto en la materia generar dichos cebadores específicos de gen
fis de Legionella pneumophila. Véanse, por ejemplo,
los ejemplos de trabajo de la presente memoria en los cuales se
generan para el gen fis1.
En el ejemplo de trabajo 1 de la presente
memoria se usan los cebadores mostrados en la SEC ID Nº 7
(denominado Fis41 F) y SEC ID Nº 8 (denominado Fis171R). Por
consiguiente, en una realización preferida, los cebadores de PCR se
seleccionan del grupo de cebadores de PCR que consiste en:
- SEC ID Nº 7 (denominado Fis41 F): 5'-CAC TAG CCG AAA GCG TGA CTC-3'; y
- SEC ID Nº 8 (denominado Fis171 R): 5'-ATG TTC CAT TAC TGC ACG AAA TAG AG-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
La identidad de la secuencia de ADN a la que se
hace referencia en la presente memoria se determina como el grado
de identidad entre dos secuencias indicando una desviación de la
primera secuencia de la segunda secuencia.
En la fecha de presentación de la presente
invención, la información del National Center for Biotechnology
(NCBI) ofrecida en el sitio de internet
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) permite la posibilidad de
realizar una búsqueda de homología de secuencia por ordenador BLAST
convencional.
El programa BLAST se describe en [Altschul et
al (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new
generation of protein database search programs", Nucleic Acids
Res. 25:3389-3402].
En el presente contexto, un programa de búsqueda
de homología por ordenador preferido es una búsqueda "BLAST
nucleótido-nucleótido [blastn] convencional"
según se especificaba, en la fecha de presentación de la presente
solicitud, en el sitio de internet del NCBI con ajustes de filtro:
Baja complejidad; Esperado: 10, Tamaño de palabra: 11.
La secuencia de referencia se introduce en el
programa y el programa identifica fragmentos de otra secuencia (por
ejemplo, una secuencia publicada) junto con el porcentaje de
identidad con un fragmento correspondiente de la secuencia de
referencia.
De acuerdo con el entendimiento común del
experto en la materia, cuando se analiza en la presente memoria una
identidad de una secuencia de referencia específica con otra
secuencia, dicha otra secuencia debería tener una longitud que sea
comparable con la secuencia de referencia. Por ejemplo, si la
longitud de la secuencia de referencia es de 200 pb, una longitud
comparable de la otra secuencia podría ser, por ejemplo, de
150-250 pb. Lo mismo se aplica para la identidad de
las secuencias de aminoácidos que se describen en la presente
memoria.
\vskip1.000000\baselineskip
De forma similar al análisis de homología de
nucleótidos, en el presente contexto, un programa de búsqueda de
homología por ordenador preferido es una búsqueda "BLAST
proteína-proteína [blastp] convencional" según
se especificaba, en la fecha de presentación de la presente
solicitud, en el sitio de internet del NCBI con ajustes de
Parámetros estadísticos basados en la composición: sí, filtro: Baja
complejidad; Esperado: 10, Tamaño de palabra: 3, Matriz: BLOSUM 62,
Coste de huecos: Existencia 11 Extensión 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha explicado anteriormente, el gen
fis pertenece a la familia de genes de "transcripción",
categoría K, de acuerdo con COG (Agrupaciones de Grupos de
Ortólogos) de la anotación de categorías funcionales de proteínas
(Tatusov, et al (2001), Nucl. Acids Res., 29,
22-28). En L. pneumophila, este grupo
está representado por 109 genes.
Sin quedar limitado a teoría alguna, se cree que
una cantidad sustancial de genes de categoría K cumplirían los
criterios analizados en la presente memoria para ser un buen gen
diana para detectar un microorganismo viable de interés.
Por consiguiente, un aspecto independiente
distinto de la invención se refiere a un método para la detección
específica de la presencia de un microorganismo viable de interés en
una muestra que se sospecha que contiene el microorganismo viable
de interés, y que comprende además uno o más microorganismos
distintos, caracterizado por el hecho de que
- (i)
- la muestra se analiza para identificar la presencia de ARNm expresado a partir de un gen de categoría K del microorganismo de interés; y
- (ii)
- se evalúa la cantidad del ARNm del gen de categoría K del microorganismo de interés presente en la muestra y si la muestra comprende el ARNm pertinente es una prueba de que el microorganismo viable de interés se ha detectado en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, la muestra se
analiza por una técnica adecuada capaz de identificar
específicamente ARNm expresado a partir de un gen de un
microorganismo de interés específico en una muestra que comprende
ARNm de un gen de categoría K de una o más especies distintas del
mismo género que el microorganismo de interés.
En una realización preferida, el microorganismo
de interés es una especie de interés dentro de un género
seleccionado del grupo que consiste en Legionella, Escherichia,
Shigella y Salmonella.
En una realización preferida, el gen de
categoría K es un gen de categoría K seleccionado del grupo que
consiste en:
- nusG: proteína antiterminación de la transcripción NusG;
- rpoB: subunidad B de ARN polimerasa;
- rpoN: factor sigma-54 de ARN polimerasa (sigma-L);
- rpoS: factor sigma de ARN polimerasa RpoS;
- birA: biotin-[acetilCoA carboxilasa] holoenzima sintetasa y represor del operón de biotina;
- mfd: factor de acoplamiento de reparación de la transcripción;
- relA: GTP pirofosfoquinasa;
- recG: ADN helicasa dependiente de ATP RecG;
- hypB: proteína de incorporación de níquel en hidrogenasa HypB;
- greA: factor de elongación de la transcripción GreA; y
- rho: factor de terminación de la transcripción Rho.
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las realizaciones preferidas individuales
descritas anteriormente (por ejemplo, uso de tecnología de PCR,
etc.) con respecto al primer aspecto de la invención también son
realizaciones individuales preferidas individualmente con respecto
al aspecto independiente distinto de la invención descrito en esta
sección.
\newpage
Se usaron quince serogrupos de Legionella
pneumophila para ensayar la especificidad de los cebadores y la
sonda Taqman usada. Además, se han usado un total de 30 especies
bacterianas diferentes pertenecientes a todos los linajes
filogenéticos principales, incluyendo 11 especies de
Legionella spp., como controles de especificidad
negativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrajo ADN de muestras clínicas usando el
kit NucleoSpin Blood según se especificaba por el fabricante
(Macherei-Nagel). Se determinó la concentración de
ADN por el método PicoGreen^{TM} (Molecular Probes) por
comparación de los valores de fluorescencia con los de una curva de
calibración construida a partir de una dilución seriada de ADN de
esperma de salmón (Sigma chemicals).
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron y alinearon secuencias parciales
del gen fis1 de todos los serogrupos de Legionella
pneumophila, obteniéndose como resultado que eran idénticas.
Después, se usó este fragmento para diseñar dos conjuntos de
cebadores. El primero estaba destinado a usarse en ensayos de PCR
convencional para los ensayos que requieran una determinación
presuntiva (presencia/ausencia) de L. pneumophila. Se
evaluaron los cebadores tanto directo Fis41F
(5'-CAC TAG CCG AAA GCG TGA CTC-3')
(SEC ID Nº 7) como inverso Fis171R (5'-ATG TTC CAT
TAC TGC ACG AAA TAG AG-3') (SEC ID Nº 8) con el
programa informático NetPrimer (PREMIER Biosoft International, Palo
Alto, California) para determinar la formación de estructuras
diméricas de cebadores y horquillas. El segundo conjunto de
cebadores estaba diseñado para la determinación cuantitativa de
L. pneumophila por PCR a tiempo real. Después de introducir
la secuencia consenso de fis1 en el programa informático
Primer Express^{TM} v. 2.0 (Applied Biosystems, Forster City
California) se obtuvo un conjunto de cebadores óptimo y sonda
Taqman^{TM}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una PCR convencional en mezclas de
reacción de 20 \mul (volumen total) usando un termociclador
(modelo 9600 P.E. Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados
Unidos). Las condiciones de PCR eran de 95ºC durante 10 min; 40
ciclos que consistían en 94ºC durante 35 s, 60ºC durante 35 s y 72ºC
durante 35 s; y una etapa de extensión final que consistía en 72ºC
durante 10 min. Las mezclas de reacción contenían
50-100 ng de molde de ADN, MgCl_{2} 2,5 mM, 0,25
\muM de cada cebador, mezcla de dNTP 0,8 mM y 0,5 U de TaqGold
(P.E. Applied Biosystems, Forster City, CA, Estados Unidos). Se
añadió un control de amplificación interno que consistía en
aproximadamente 100 copias de amplicón a una reacción en paralelo
para controlar los falsos negativos, asegurándose de que no se
estaba produciendo inhibición de la PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Se secuenciaron los productos de PCR
amplificados en ambas direcciones con los mismos cebadores usados
para la PCR. Se secuenció el ADN según se especificaba por el
fabricante en un Secuenciador de ADN 310 (Applied Biosystems,
Foster City, CA, Estados Unidos) usando el kit de secuenciación
cíclica con terminadores marcados con colorante dRodamina (Applied
Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un alineamiento múltiple de
secuencias de secuencias parciales con ClustalW y se refinó
adicionalmente de forma manual. Se construyeron los árboles
filogenéticos usando métodos de distancia, máxima probabilidad y
máxima parsimonia. Se generaron los árboles de distancia evolutiva
mínima a partir de una matriz de distancia obtenida con el
algoritmo de unión de vecinos con 100 repeticiones de
bootstrap usando el programa informático MEGA v.2.1 (Kumar
et al. 2001). También se construyeron los árboles de máxima
parsimonia con MEGA, con 100 repeticiones de bootstrap,
aunque manteniendo un consenso de norma mayoritaria del 50%. Las
relaciones filogenéticas se dedujeron adicionalmente usando la
estrategia de máxima probabilidad con 100 repeticiones de
bootstrap. La deducción se realizó mediante el elemento de
análisis Quartet Puzzling del programa informático Treepuzzle
(Heiko et al., (1999), TREE-PUZZLE. Korbinian
Strimmer y Arndt von Haeseler Heiko, A. Schmidt Theoretical
Bioinformatics Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ, Heidelberg,
Alemania).
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema analítico se dirige específicamente
al gen fis1, que a diferencia de otros marcadores de
elección usados en otros sitios (mip, dotA) no es único para
Legionella pneumophila. Es un gen ampliamente distribuido
entre eubacterias cuyas funciones no están relacionadas con o no
dependen de actividades inducibles tales como la patogénesis. En su
lugar, la proteína codificada por el gen fis1 es esencial
para mantener la vida y la viabilidad celular. Tanto las secuencias
génicas como proteicas se han comparado con las de organismos
relacionados, mostrando distancias filogenéticas relativamente altas
que facilitaban considerablemente la tarea de encontrar
oligonucleótidos específicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñó primero un conjunto de cebadores
degenerados que se dirigía a un fragmento de aproximadamente 300 pb
del gen fis1 y se usó en una PCR con ADN genómico de los 15
serogrupos de Legionella pneumophila. Se obtuvieron
productos de PCR del tamaño esperado y se secuenciaron para los 15
serogrupos. Las secuencias obtenidas se usaron para diseñar un
nuevo conjunto de cebadores no degenerados que flanqueaban una
región de 130 pb del gen fis1. Los cebadores no degenerados
eran: Fis41 F y Fis171 R. Se obtuvo un producto de PCR de
aproximadamente 130 pb para cada uno de los 15 serogrupos de
Legionella pneumophila ensayados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una PCR (se usaron los cebadores no
degenerados anteriores) usando ADN genómico de varias
Legionella spp y otras bacterias de varios subgrupos de las
proteobacterias como molde. Los resultados eran positivos en todas
las L. pneumophila ensayadas incluyendo todos los serogrupos
de 1 a 15 (Tabla 1). Se obtuvieron resultados negativos para
Legionella spp., así como para el resto de especies
bacterianas que representaban diferentes taxones y linajes
filogenéticos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de la PCR convencional en
diferentes Legionella spp. usando los cebadores de elección
eran positivos para todos los serogrupos ensayados de Legionella
pneumophila y negativos en el resto. Estos resultados negativos
estaban representados por ausencia de producto de PCR o por una o
más bandas inespecíficas de un tamaño diferente al esperado (Figura
2).
Se usó ADN genómico previamente cuantificado de
Legionella pneumophila SG1 como diana sobre un intervalo de
concentraciones de ADN para determinar el límite de detección de
este método. Se observó amplificación de PCR convencional desde tan
pocas como 600 copias del gen fis diana usando 1 \mul del
extracto de molde.
Puesto que la reacción de PCR admite 10 \mul
de extracto de ADN como molde (véase a continuación), los métodos
presentados por la presente memoria permiten detectar tan pocas como
60 copias genómicas en 1 \mul de extracto ADN. Puesto que el
método de extracción termina con un volumen de extracto de 50
\mul, se puede concluir que el método que es capaz de detectar
tan pocas como 300 copias de genomas de L. pneumophila por
muestra sometida a extracción de ADN.
También se realizó un ensayo de
reproducibilidad. Se realizaron diez réplicas de una muestra de
orina previamente determinada como positiva de un paciente al que
se le había diagnosticado legionelosis. Se obtuvieron resultados
positivos en todas las reacciones.
Para evaluar el efecto del uso de diferentes
cantidades de molde en la reacción de PCR de 20 \mul, también se
realizó un ensayo usando 1, 5 y 10 \mul de ADN genómico de
muestras clínicas positivas. Los resultados indican que la reacción
no se inhibe aún cuando se usa tanto como 10 \mul de ADN
purificado como molde. Esto tiene implicaciones importantes sobre
los niveles de detección de los oligonucleótidos usados.
Como se ha mencionado anteriormente, el gen
fis1 es esencial para mantener la actividad celular y, por
lo tanto, su expresión debería mantenerse dentro de ciertos límite
incluso en células inactivas o latentes, las denominadas viables
pero no cultivables. Por lo tanto, puede detectarse Legionella
pneumophila viable mediante PCR a tiempo real después de una
etapa de trascripción inversa previa para retrotraducir el ARNm en
ADNc. Esto se ha ensayado con éxito como se muestra en la Figura
3.
De acuerdo con la bibliografía disponible, la
expresión de este gen puede aumentarse espectacularmente en ciertas
condiciones fisiológicas (por ejemplo, adición de compuestos
nutricionales de cultivo), que pueden usarse como amplificador
cuando la actividad celular disminuya por debajo del límite de
detección de la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet US 5935782 A [0008]
- \bullet US 5270184 A [0050]
- \bullet WO 9102818A [0050]
- \bullet EP 05110953 A [0092]
\bulletHerpers, B. L. et al.
J. Clin. Microbiol., 2003, vol. 41,
4815-4816 [0007]
\bulletLisby et al. Eur J
Clin Microbiol Infect Dis, 1994, vol, 13,
225-231 [0007]
\bulletMahbubanl et al. Mol
Cell Probes, 1990, vol. 4, 175-187
[0008]
\bulletRoy et al. Mol
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[0008]
\bulletChien et al. The
genomic sequence of the accidental pathogen Legionella
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\bulletAltschul et al. Gapped
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database search programs. Nucleic Acids Res., 1997,
VOl. 25, 3389-3402 [0064]
\bulletTatusov et al. Nucl.
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\bulletHeiko et al.
TREE-PUZZLE. Korbinian Strimmer and Arndt vori
Haeseler Heiko, A. Schimidt Theoretical Bioinformatics Deutsches
Krebsforschungszentrum DKFZ, 1999 [0081]
<110> Universitat de Girona
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para la detección específica
de Legionella pneumophila
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P639PC00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP05110953.6.
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
18-11-2005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 282
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Legionella pneumophila
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(282)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> GenBank/AE017354 REGIÓN:
585004..585285
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
24-09-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (1)..(282)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Legionella pneumophila
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 297
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Legionella pneumophila
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(297)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> GenBank/AE017354 REGIÓN:
complementaria (1516880..1517175)
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
24-09-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (1)..(297)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Legionella pneumophila
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Legionella pneumophila
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(288)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> GenBank/AE017354 REGIÓN:
complementaria (1945064..1945351)
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
24-09-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (1)..(288)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Legionella pneumophila
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcactagccga aagcgtgact c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgttccatt actgcacgaa atagag
\hfill26
Claims (10)
1. Método para la detección específica de la
presencia de Legionella pneumophila en una muestra que se
sospecha que contiene L. pneumophila, y que comprende además
uno o más microorganismos distintos, caracterizado por el
hecho de que
- (i)
- la muestra se analiza para identificar la presencia de un gen fis (factor de estimulación de la inversión) de Legionella pneumophila; y
- (ii)
- se evalúa la cantidad del gen fis de Legionella pneumophila presente en la muestra y si la muestra comprende el gen fis de Legionella pneumophila es una prueba de que Legionella pneumophila está presente en la muestra;
en donde el gen fis de Legionella
pneumophila es un gen fis seleccionado del grupo de genes
fis que consiste en:
- (a)
- un gen fis que comprende una secuencia de ADN que tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 1-282 de la SEC ID Nº 1 (denominada "fis1");
- (a1)
- un gen fis que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 95% con el polipéptido mostrado en las posiciones 1-93 de la SEC ID Nº 2 (denominada "FIS1");
- (b)
- un gen fis que comprende una secuencia de ADN que tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 1-297 de la SEC ID Nº 3 (denominada "fis2");
- (b1)
- un gen fis que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 95% con el polipéptido mostrado en las posiciones 1-98 de la SEC ID Nº 4 (denominada "FIS2");
- (c)
- un gen fis que comprende una secuencia de ADN que tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 1-288 de la SEC ID Nº 5 (denominada "fis3"); y
- (c1)
- un gen fis que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 95% con el polipéptido mostrado en las posiciones 1-95 de la SEC ID Nº 6 (denominada "FIS3").
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método de la reivindicación 1, en el cual
el uno o más microorganismos distintos comprendidos dentro de la
muestra es uno o más microorganismos seleccionados del grupo que
consiste en otras especies de Legionella distintas de L.
pneumophila, E. coli, Salmonella, Shigella, Enterobacter,
Micrococcus, Bacillus, Staphylococcus, Pseudomonas, Serratia,
Proteus, Enterococcus, Arthrobacter y Listeria.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
el uno o más microorganismos comprendidos dentro de la muestra es
una o más especies de Legionella distintas de L.
pneumophila, tal como en particular una o más especies de
Legionella seleccionadas del grupo que consiste en L
gormanii, L. longbeacheae, L. anisa, L. oakridgensis, L.
fairfieldensis, L. feelei, L. dumofii, L. micdadei, L. jordanis, L.
wadsworthii y L. bozemanii.
4. El método de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el cual el método es un método para
la detección de Legionella pneumophila viable en una
muestra, caracterizado por el hecho de que
- (i)
- la muestra se analiza para identificar la presencia de ARNm expresado a partir de un gen fis (factor de estimulación de la inversión) de Legionella pneumophila; y
- (ii)
- se evalúa la cantidad del ARNm expresado a partir del gen fis de Legionella pneumophila presente en la muestra y si la muestra comprende el ARNm del gen fis de Legionella pneumophila es una prueba de que está presente Legionella pneumophila viable en la muestra.
5. El método de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el cual la muestra es una muestra
ambiental obtenida de un entorno acuático, preferiblemente en el
cual el entorno acuático está situado en un lugar relevante tal
como un edificio, una torre de refrigeración, un sistema de
distribución de agua potable para uso doméstico o aguas
subterráneas.
6. El método de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el cual el gen fis de
Legionella pneumophila es un gen fis seleccionado de
un grupo de genes fis que consiste en:
- (a)
- un gen fis que comprende una secuencia de ADN que tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 1-282 de la SEC ID Nº 1 (denominada "fis1"); y
- (a1)
- un gen fis que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 95% con el polipéptido mostrado en las posiciones 1-93 de la SEC ID Nº 2 (denominada "FIS1").
O más preferiblemente, en el cual el gen
fis de Legionella pneumophila es un gen fis
seleccionado de un grupo de genes fis que consiste en:
- (a)
- un gen fis que comprende una secuencia de ADN que es idéntica a la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 1-282 de la SEC ID Nº 1 (denominada "fis1"); y
- (a1)
- un gen fis que codifica un polipéptido que es idéntico al polipéptido mostrado en las posiciones 1-93 de la SEC ID Nº 2 (denominada "FIS1").
\vskip1.000000\baselineskip
7. El método de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el cual el análisis para identificar
la presencia de un gen fis (factor para la estimulación de
la inversión) o de ARNm expresado de Legionella pneumophila
a partir del gen fis de acuerdo con la etapa (i) del método,
se realiza mediante una técnica de amplificación génica adecuada
[por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en
cadena de la ligasa (LCR), NASBA (amplificación basada en la
secuencia de ácido nucleico) o Amplificación por Desplazamiento de
Cadena (SDA)] para amplificar el gen pertinente o el ARNm expresado
a partir del gen, y en el cual la técnica de amplificación se
realiza de manera que es capaz de amplificar específicamente el gen
fis (factor para la estimulación de la inversión) analizado
o el ARNm expresado de Legionella pneumophila a partir del
gen y de no amplificar cantidades medibles de secuencias de genes
fis de uno o más microorganismos distintos comprendidos
adicionalmente en la muestra.
8. El método de la reivindicación 7, en el cual
la técnica de amplificación génica adecuada es PCR (preferiblemente
PCR a tiempo real) y en el cual los cebadores de PCR se construyen
de tal manera que los cebadores de PCR amplifiquen específicamente
el gen fis (factor de estimulación de la inversión) de
Legionella pneumophila analizado o el ARNm expresado a
partir del gen y no amplifiquen cantidades medibles de secuencias de
genes fis del uno o más microorganismos distintos
comprendidos además en la muestra.
9. El método de la reivindicación 8, en el cual
los cebadores de PCR se seleccionan del grupo de cebadores de PCR
que consiste en:
- SEC ID Nº 7 (denominado Fis41 F): 5'-CAC TAG CCG AAA GCG TGA CTC-3'; y
- SEC ID Nº 8 (denominado Fis171 R): 5'-ATG TTC CAT TAC TGC ACG AAA TAG AG-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
10. El método de las reivindicaciones 8 ó 9, en
el cual la técnica de PCR es PCR con transcripción inversa (RT) y
se realiza la detección de la presencia de Legionella
pneumophila viable en la muestra amplificando específicamente
ARNm expresado a partir del gen fis (factor para la
estimulación de la inversión) de Legionella pneumophila
analizado.
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| EP05110953A EP1788389A1 (en) | 2005-11-18 | 2005-11-18 | A method for specific detection of Legionella pneumophila |
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