ES2299727T3 - Procedimiento para la determinacion cuantitativa de polinucleotidos en una mezcla. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la determinación de unas cantidades o proporciones relativas de más de una secuencia de polinucleótidos individuales o sus subgrupos en una mezcla de polinucleótidos que utiliza una hibridación en solución facilitada por afinidad cuantitativa en combinación con el fraccionamiento basado en el tamaño o la masa para la obtención de la resolución, caracterizado porque el procedimiento comprende las etapas siguientes: (a) proporcionar uno o más pool organizados con un número opcional predeterminado de sondas de polinucleótidos solubles, siendo complementaria cada sonda de una secuencia de polinucleótidos diana individual en una muestra, que está presente en un exceso molar comparado con las secuencias de polinucleótidos diana, y que presenta aproximadamente el mismo número de nucleótidos que hibridan, cuyas sondas se pueden distinguir proporcionando a dichas sondas una o más etiquetas que permiten la resolución, separación o sistemas de grabación sin interferir con la reacción de hibridación o de captura; (b) proporcionar a las secuencias de polinucleótidos diana aisladas de la muestra que comprende una muestra de secuencias de ribopolinucleótidos diana por lo menos una etiqueta de afinidad, y a continuación (c) realizar las etapas (i) y (ii) simultáneamente, o secuencialmente en el orden (i) y (ii), en el que las etapas (i) y (ii) comprenden (i) permitir que la reacción de hibridación tenga lugar entre el exceso molar de las sondas solubles de la etapa (a) y las secuencias de ribopolinucleótidos diana de la etapa (b) que conduce a la formación de unos híbridos solubles; (ii) recuperar los híbridos, que se han formado cuantitativamente en la etapa (i) mediante la captura de dichos híbridos en una herramienta que facilita la separación provista de un par de afinidad de la etiqueta de afinidad de las secuencias de polinucleótidos diana; (d) liberar cuantitativamente las sondas en una forma no modificada de los híbridos capturados a la herramienta que facilita la separación; (e) separar y registrar las cantidades o proporciones relativas de las sondas, que se han diferenciado cuya cantidad corresponde a la cantidad de secuencias de ribopolinucleótido en la mezcla de polinucleótidos en la muestra.
Description
Procedimiento para la determinación cuantitativa
de polinucleótidos en una mezcla.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para llevar a cabo una determinación cuantitativa, en
el que las cantidades o proporciones relativas de más de una
secuencia ribopolinucleótida diana individual presente se
determinan simultáneamente de una mezcla de secuencias
polinucleótidas utilizando una mezcla de sondas de polinucleótido
que presentan aproximadamente el mismo número de nucleótidos. El
procedimiento permite la determinación cuantitativa de las
variaciones dinámicas, de una multitud de organismos individuales
así como las subpoblaciones relacionadas presentes en una muestra
que contiene una mezcla de organismos, es decir una población
diana. La invención se basa en la hibridación en solución facilitada
por afinidad cuantitativa combinada con la resolución que
proporciona el fraccionamiento. La invención está estrechamente
relacionada con la solicitud de patente internacional WO 02/055734,
en la que las secuencias polinucleotídicas individuales de la
mezcla de sondas presenta unos tamaños distintos y distinguibles.
Por el contrario, las sondas de reconocimiento de la presente
invención presentan aproximadamente el mismo número de nucleótidos.
El procedimiento es útil en la atención sanitaria, la investigación
medioambiental, la industria farmacéutica y la industria alimenticia
y es aplicable para muchos otros fines diagnósticos, biotécnicos y
científicos.
La acumulación rápida de la información genética
combinada con la química combinatoria y la bioinformática que
permiten la manipulación de unas cantidades enormes de información
ha originado una demanda de unos procedimientos más precisos, que
permitan los estudios simultáneos y/o secuenciales de las
situaciones dinámicas y las variaciones en los entornos naturales.
Por consiguiente, se necesitan unos enfoques totalmente nuevos para
llevar a cabo la investigación en biología molecular, atención
sanitaria, epidemiología, industria farmacéutica y alimenticia.
En la atención médica como en la industria
farmacéutica y alimenticia, especialmente, los médicos que ejercen,
las consultas medioambientales, los higienistas industriales, los
agentes de seguridad, los inspectores sanitarios, las consultas
medioambientales, los veterinarios y/u otras personas que trabajan
con o son responsables de las evaluaciones de posibles riesgos
sanitarios o epidemiológicos necesitan unas herramientas nuevas y
eficaces para la valoración de los efectos de las medidas
curativas, sanitarias u otras medidas en todas las poblaciones de
organismos. Existe, por ejemplo, una demanda creciente de
procedimientos y herramientas para la valoración de los efectos de
las modalidades de tratamiento nuevas y las convencionales, que
incluyen las medidas sanitarias y curativas.
Continuamente se están desarrollando nuevos
procedimientos fundamentados en la información acumulada que incluye
la disponibilidad de elementos genéticos clave y el conocimiento de
su papel y funciones biológicos. Una nueva herramienta poderosa es
la tecnología de chip de oligómero. Las características comunes de
las técnicas de micromatrices y la característica que la diferencia
de la invención presente es que las sondas o secuencias de
polinucleótidos utilizadas como reactivos están inmovilizadas o
acopladas a un vehículo sólido. La inmovilización de las sondas
actúa como impedimento estérico y evita que se de la hibridación de
un modo estequiométrico dando, de este modo, como resultado un
rendimiento bajo. La tecnología de chip de oligómero permite la
manipulación simultánea de una gran cantidad de muestras, pero los
resultados no son cuantitativos y no permiten una comparación
cuantitativa en un intervalo ampliamente dinámico.
Los principios de hibridación en solución
facilitada por afinidad son bien conocidos y han sido descritos,
por ejemplo, en las patentes US nº 6.136.531 y US nº 4.968.602. Se
han descrito los diagnósticos y detección de ADN que utilizan
procedimientos de espectroscopia de masas, por ejemplo en la patente
US nº 6.043.031 y en la solicitud de patente internacional WO
99/37663.
La patente US nº 5.807.682 da a conocer un
procedimiento, que aplica la hibridación en solución facilitada por
afinidad y el fraccionamiento para la detección de uno o más sitios
de mutación en el mismo gen. Por lo tanto, las sondas son unas
secuencias de oligonucleótidos cortas, y la temperatura de
hibridación es crítica lo que hace difícil utilizar gran número de
sondas simultáneamente ya que varias sondas son susceptibles de
presentar diferentes temperaturas de fusión. Se separan y se
identifican una o más de dichas sondas modificando selectivamente
las sondas con un polímero no cargado producido sintéticamente, que
altera la carga/arrastre fraccional, lo que permite que las sondas
se muevan a unas velocidades de movilidad diferentes en un medio no
selectivo.
Ninguno de los procedimientos descritos
anteriormente aborda el problema de proporcionar un procedimiento
para una determinación cuantitativa de varios polinucleótidos
diferentes simultáneamente.
En la solicitud de patente internacional
WO02/055734 se describe un procedimiento y un kit de ensayo para
superar el problema de obtener unos resultados cuantitativos. Dicha
solicitud de patente describe un procedimiento y un kit de ensayo,
que incluye los reactivos para la determinación cuantitativa de los
polinucleótidos o variaciones en sus cantidades en unas células o
en una muestra tisular. El procedimiento y el kit de ensayo aplican
unos depósitos organizados de sondas de polinucleótidos solubles con
unos tamaños diferentes, distinguibles que varían de 16 a varios
miles de pares de bases. El procedimiento cuantitativo permite la
valoración comparativa de variaciones, por ejemplo en los perfiles
de transcripción y en los patrones de expresión. Dicho procedimiento
se basa en los tamaños variantes y diferentes de unas sondas de
polinucleótidos solubles. La diferencia en el tamaño de las sondas
es lo que permite la valoración de las secuencias de ácidos
nucleicos individuales.
Es conocido que las sondas de regiones más o
menos conservadas o variables permiten la clasificación y
organización de diferentes organismos a los niveles filogenéticos
que incluyen grupos, géneros, especies o subespecies. Una
evaluación cuantitativa de las cantidades de organismos
individuales, sus subpoblaciones en una mezcla que utiliza dichas
sondas permitirá los estudios de variación dinámica en las
poblaciones diana. Dichas evaluaciones pueden tener muchas
aplicaciones útiles. Desafortunadamente, el procedimiento descrito
en el documento WO 02/055734 no es aplicable a sondas, que son
secuencias de polinucleótidos que presentan aproximadamente el mismo
número de nucleótidos, porque no se consigue una resolución
suficiente para la lectura de los resultados.
Por consiguiente, el objetivo de la presente
invención es proporcionar una herramienta nueva y efectiva para
permitir a los especialistas que son responsables de las
investigaciones y evaluaciones de los posibles riesgos para la
salud y la necesidad de reparación u otras medidas curativas obtener
unos datos cuantitativos para la evaluación de riesgos y
remedios.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar un procedimiento y un kit de ensayo no sólo para la
determinación cuantitativa de las cantidades y proporciones
relativas de los organismos individuales o de determinados grupos
en una población, sino que también permite las valoraciones
comparativas de las variaciones secuenciales en el tiempo debido al
mecanismo de control interno o inherente que tiene lugar en la
célula o las medidas o intervenciones seleccionadas aplicadas
externamente en los organismos o poblaciones de organismos o sus
polinucleótidos. Con este procedimiento también se pueden realizar
las valoraciones comparativas de la población en una muestra
obtenida de diferentes sitios. Simultáneamente, el objetivo es
proporcionar un ensayo muy sensible, que permite la determinación
cuantitativa de cantidades muy pequeñas de polinucleótidos del
analito, que de otro modo se situarían por debajo del límite de
detección. Esto se consigue mediante amplificación por PCR de las
sondas, que corresponde a la cantidad de polinucleótidos del
analito que presenta una secuencia complementaria a la de la sonda
en la muestra. Debido al hecho que las sondas están presentes en
exceso comparado con los polinucleótidos del analito, se pueden
recuperar cuantitativamente y se pueden liberar antes de la
amplificación por PCR.
Las ventajas relacionadas con la presente
invención así como los procedimientos y los kits de ensayo descritos
en el documento WO 02/055734, incluyen el hecho que la cantidad de
la preparación de polinucleótidos, especialmente el ARN que se va a
analizar, no es crítica. Por ejemplo, se sabe que el ARN necesita un
tratamiento especial, debido a su inestabilidad, se puede utilizar
son la adición de ninguna etiqueta que permitan la resolución para
la valoración cuantitativa. La fabricación de los kits de ensayo,
que no necesita incluir las etapas de inmovilización y determinados
reactivos disponibles comercialmente permite la preparación de unos
ensayos hechos a medida fácilmente adaptables en el momento de la
realización, que centran la atención en determinados subgrupos de
genes en un organismo determinados u organismos relacionados.
El procedimiento se puede utilizar como
ensamblajes completamente automáticos o semiautomáticos. El proceso
se puede interrumpir en varias etapas. Las muestras y los productos
de la reacción se pueden conservar hasta que se hayan recogido
suficientes datos o que sea más conveniente continuar el proceso y
guardar los resultados.
A modo de sumario, la presente invención permite
el registro cuantitativo, simultáneo de los cambios y variaciones
de las cantidades y/o proporciones relativas de más de una secuencia
de ribonucleótido individual en una mezcla. El procedimiento
permite la determinación de cantidades y/o proporciones relativas de
organismos individuales o sus subgrupos de una muestra o un grupo
de población mezclada, que se han tomado de diferentes sitios o a
tiempos diferentes, antes y después de determinados tratamientos o
intervenciones internos o externos. Esto resulta útil,
especialmente, cuando se estudian los efectos y el impacto de varios
estímulos físicos y químicos aplicados en una población diana, que
incluyen el tratamiento antibiótico, las medidas higiénicas y otras
intervenciones. La invención permite también la evaluación de
cambios inherentes en la población. La invención permite la
valoración comparativa simultánea de varios fenómenos
biológicos.
El procedimiento de la presente invención no es
sólo cuantitativo, también puede ser muy sensible y permite la
detección cuantitativa de secuencias de polinucleótidos presentes en
unas cantidades diminutas. Los rasgos característicos del
procedimiento de la presente invención así como sus aplicaciones son
tal como se define en las reivindicaciones.
La Figura 1 muestra la separación de unos
fragmentos de ADN de una sola hebra y los polinucleótidos con
diferentes fluoróforos mediante electroforesis por capilaridad.
La Fig. 2A ilustra el proceso de hibridación
entre las sondas marcadas (estrella) de trazador (P) y la afinidad
por secuencias de analito de ARN de una sola hebra marcado con
biotina (B) y la formación de híbridos (H) entre los analitos (A) y
las sondas (P).
La Fig. 2B ilustra el proceso de hibridación
entre las sondas (P) con etiquetas de marcador (estrella) que actúan
simultáneamente como etiquetas que permiten la resolución y la
afinidad o polinucleótidos de doble cadena marcados con biotina (B)
o secuencias de analito ARN y la formación de híbridos (H) entre los
analitos (A) y las sondas (P). Las sondas, que no coinciden con las
secuencias de analito o que están presentes en exceso molar,
permanecen libres en solución.
La Fig. 3A representa la captura de los híbridos
(H) por afinidad marcados (B) por una herramienta que facilita la
separación sólida (SAT) cubierta por el homólogo de la etiqueta de
afinidad (B).
La Fig. 3B representa la captura de los híbridos
(H) por afinidad marcados (B) por una herramienta que facilita la
separación sólida (SAT) cubierta por el homólogo de la etiqueta de
afinidad (B). Las secuencias de sonda marcada con el trazador, que
no se hibridan con la secuencia de analito marcada por afinidad, no
se capturan. Naturalmente, las herramientas que facilitan la
separación (SAT) se unen a la etiqueta de afinidad libre así como a
los analitos marcados por afinidad a los que no se ha hibridado
ninguna secuencia de una sonda.
La Fig. 4 representa la liberación utilizando la
elución de las sondas marcadas con un trazador (P) de una
herramienta que facilita la separación sólida (SAT)/abandonando la
secuencia de analito que marca la afinidad (A) con un herramienta
que facilita la separación (SAT) y una sonda marcada con un trazador
(P) en solución.
La Fig. 5 A-B representa un
enfoque de ARNr 16S en ecología microbiana.
La Fig. 5A representa un operón de un gen de ARN
ribosómico que incluye ARNr 16S, 23S y 5S con las regiones variables
1-9 del ARNr 16S marcado.
La Fig. 5B representa la estructura del ARNr 16S
con las regiones variables que permite la identificación de especies
y las regiones más o menos conservadas que permiten la
identificación de grupos microbianos.
La Fig. 6 representa un árbol filogenético de
los clostridios y las bacterias relacionadas.
La Fig. 7 muestra los resultados, que se pueden
registrar a partir de un electroferograma y a partir de un archivo
de dato cuando se lleva a cabo un proceso comparativo de la
invención según el ejemplo 1. Todas las sondas son funcionales en la
hibridación con C. symbiosum E981051 ARN. Las sondas Bact y
Erec presentan unos tamaños diferentes (18 y 19 bases,
respectivamente) y unas movilidades diferentes. La movilidad
electroforética de la sonda Erec-5A es diferente de
la de la sonda Erec debido a la adición de una cola A.
Las Figs 8A-B muestran el
resultado, que se puede registrar a partir de un electroferograma y
a partir del archivo de datos obtenido cuando se lleva a cabo el
proceso comparativo de la invención según el Ejemplo 2.
La Fig. 8A muestra el resultado con las sondas
Bact y Chis. La sonda Chis identifica solo la cepa C.
tyrobutyricum E99908, mientras que la sonda Bact identifica
todas las cepas bacterianas. Ninguna de las sondas identifica el
hongo Trichoderma reesei.
La Fig. 8B muestra el resultado con las sondas
Bact y Erec. La sonda Erec identifica solo la cepa C.
symbiosum E981051, mientras que la sonda Bact identifica todas
las cepas bacterianas. Ninguna de las sondas identifica el hongo
Trichoderma reesei.
La Fig. 9 muestra el resultado, que se puede
registrar a partir de un electroferograma y a partir del archivo de
datos obtenidos cuando se lleva a cabo el proceso cuantitativo de la
invención según el ejemplo 3. Las intensidades de señal de la sonda
Bact y Chis corresponden a la cantidad de ARN E908 C.
tyrobutyricum utilizado en la hibridación.
La Fig. 10 A-B muestra el
resultado, que se puede registrar a partir de un electroferograma y
a partir del archivo de datos obtenidos cuando se lleva a cabo el
proceso cuantitativo de la invención según el ejemplo 4.
La Fig. 10A representa el resultado cuando se
utiliza ARN de C. symbiosum E1051 con las sondas Bact y Erec,
ARN de C. tyrobutyricum E908 con las sondas Bact y Chis, y
una población microbiana que comprende ARN de C. butyricum
E908, C. symbiosum E1051 y C. lituseburense E1853 con
las sondas Bact, Chis y Erec. La sonda Bact identifica todas las
cepas, mientras que la sonda Chis sólo identifica la cepa E908 y la
sonda Erec identifica sólo la cepa E1051. El nivel de fluoróforos,
cuya etiqueta de las sondas Bact y Chis es igual, mientras que la
sonda Erec es inferior. La proporción de ARN de cada cepa se
proporciona como porcentaje del ARN total utilizado en la
hibridación.
La Fig. 10B describe el resultado cuando se
analiza una población microbiana que comprende C.
tyrobutyricum E908, C. symbiosum E1051 con las sondas
Bact y Chis. La sonda Bact identifica ambas cepas, mientras que la
sonda Chis sólo identifica la cepa E908. La proporción de ARN de
cada cepa se proporciona como porcentaje del ARN total utilizado en
la hibridación.
La Fig. 11 muestra una realización
semiautomática del procedimiento como un diagrama de flujo.
La Fig. 12 muestra el resultado, que se puede
registrar a partir de un electroferograma y a partir del archivo de
datos obtenidos cuando se lleva a cabo el proceso cuantitativo de la
invención según el ejemplo 5. Las intensidades de señal de las
sondas Bact y Chis corresponden a sus concentraciones en la
muestra.
La Fig. 13 es una representación esquemática de
la preparación de sondas por PCR.
La Fig. 14 muestra unos electroferogramas que
representan las áreas (unidades de fluorescencia) de sondas de
ensayos con la misma cantidad de ARNm sin (=o amplificado) y con
amplificación por PCR (=15 ciclos de PCR) y un control negativo. Las
muestras se hacen correr en un analizador genético ABI 130.
Los términos utilizados en la presente invención
tienen el significado que tienen normalmente en los campos de
tecnología de ADN recombinante y en la tecnología de hibridación del
ácido nucleico. Algunos términos en la presente invención, sin
embargo, se utilizan en un modo más amplio o algo diferente. Por
consiguiente, algunos de los términos se definen a continuación con
más detalle.
La expresión "población diana" significa
una mezcla de vario organismos individuales variantes presente en
una muestra que comprende organismos individuales diferentes más o
menos relacionados, que se pueden organizar en grupos o
subpoblaciones, por ejemplo, según su relación filogenético. Los
ejemplos de dichas poblaciones diana mezcladas se encuentran en
todas las muestras crudas que contienen o deben contener cualquier
organismo vivo o muerto, que incluye las bacterias, las levaduras,
plantas y animales, etc.. Los estudios medioambientales se pueden
realizar por ejemplo a partir de muestras de suelo. Las poblaciones
bacterianas que habitan los intestinos pueden ser el foco de
interés para los higienistas. Las cantidades o proporciones
relativas de Salmonella, Shigella y E. coli en una
muestra indican los estándares higiénicos y los posibles riesgos
para la salud en la industria alimenticia, los restaurantes y las
cocinas. Las poblaciones de levaduras se pueden verificar mediante
la presencia de Saccharomyces, Torulopsis, Candida, etc. La
información es importante por ejemplo para la exclusión de la
presencia de contaminantes. Las cantidades o proporciones relativas
de Aspergillus, Penicilium, Trichoderma y otros hongos se
pueden utilizar como la indicación de la contaminación fúngica en
los edificios. Otra aplicación útil del procedimiento que
eventualmente proporciona una seguridad de vida rápida es la
valoración del efecto de determinados antibióticos en una muestra de
un paciente que padece una enfermedad causada por la resistencia
bacteriana a un antibiótico.
Incluso las plantas y animales incluyendo las
poblaciones de personas, que se pueden agrupar y ensayar mediante el
procedimiento de la presente invención.
Los organismos pueden incluir organismos
unicelulares o multicelulares con unos genomas caracterizados,
parcialmente caracterizados o no caracterizados, que
preferentemente incluyen unas regiones conservadas, parcialmente
conservadas o hipervariables, que permiten la identificación de los
organismos y su organización en grupos o subpoblaciones. La
población diana se puede originar a partir de cualquier espécimen
que contiene o ha contenido organismos vivos, que incluyen
microorganismos, plantas, animales así como seres humanos. Los
genomas de E. coli, S. cerevisiae y los seres humanos
representan organismos con genomas que en la actualidad están más o
menos completamente caracterizados. La presencia de polimorfismos
resulta un tema particularmente interesante de la presente
invención.
En la presente invención, la población se valora
en forma de una mezcla de polinucleótidos aislados de una muestra
que comprende dicha población. La muestra de mezcla de
polinucleótidos comprende secuencias de polinucleótido individuales
y sus grupos, que se pueden identificar con unas sondas comunes más
o menos conservadas. La población se puede dividir en
subpoblaciones, que representan unos niveles filogenéticos
diferentes, que incluye grupos, géneros, especies o subespecies. Al
valorar las cantidades o proporciones relativas de dichas secuencias
polinucleótidas individuales y sus subgrupos, es posible evaluar la
variación dinámica en las cantidades y/o proporciones relativas de
organismo o secuencias polinucleótidas individuales que tiene lugar
en una mezcla de secuencias polinucleótidas o en una población
diana al tomar muestras secuenciales o por comparación de muestras
de diferentes sitios o lugares.
Se debe destacar que las secuencias de
polinucleótidos en la muestra, por ejemplo, los analitos pueden
tener cualquier tamaño. Generalmente, existen secuencias
polinucleótidas más o menos fragmentadas. En la presente invención
los reactivos o sondas utilizados para la identificación son
secuencias de polinucleótidos, que presentan aproximadamente el
mismo número de nucleótidos. Las sondas de polinucleótidos se hacen
diferenciables con unos tamaños distinguibles al proporcionarles
unas etiquetas que permiten la resolución, que son, por ejemplo,
secuencias de polinucleótidos, que pueden actuar como etiquetas de
afinidad, etiquetas de cebadores o simplemente como etiquetas
trazadoras que permiten la resolución. En la presente invención, los
oligonucleótidos comprendes de 2-12 pares de bases,
mientras que las sondas que presentan más de 15, por ejemplo se
prefieren 18-35 pares de bases. Especialmente en
las formas de realización más sensibles del procedimiento de la
presente invención, en los que se utiliza la amplificación por PCR,
las sondas pueden tener más pares de bases, preferentemente por lo
menos 30 pares de bases. Por consiguiente, las sondas de la presente
invención se definen como secuencias de polinucleótidos.
Principalmente, no existe un límite por la parte superior, pero
resulta bastante evidente que las sondas cortas resultan más
económicas y más fáciles de preparar y manejar. Las sondas largas
también son más difíciles de hacer distinguibles por adición de
unas etiquetas cortas que permiten la resolución. Por lo tanto, el
problema particular, que se resuelve por el rasgo característico de
la presente invención no es la longitud de las sondas de
polinucleótidos sino como obtener una secuencia de polinucleótidos
que presente aproximadamente el mismo número de nucleótidos
suficientemente distinguible para permitir el registro preciso de
los resultados.
El término "pool" se refiere a una mezcla,
subconjunto o biblioteca de sondas de polinucleótidos soluble o
solubilizable, es decir unos polinucleótidos relativamente cortos
que presentan aproximadamente el mismo número de nucleótidos, es
decir le mismo tamaño, que son complementarios y por lo tanto
capaces de identificar las secuencias de polinucleótidos diana
deseados en la muestra. Cada pool comprende un número definido
adicional de sondas de polinucleótidos. Un número conveniente
adicional es, por ejemplo, aproximadamente 10 sondas. Sin embargo,
se puede utilizar el procedimiento con tan sólo dos o tres sondas,
pero el número de sondas más conveniente es de cinco o más sondas
en cada pool. Se pueden preparar kits de ensayo con pools que
comprenden cientos de sondas solubles y se pueden utilizar en el
procedimiento cuantitativo y/o comparativo de la presente
invención. Incluso si fuera posible preparar pools que comprenden
miles de sondas, un límite superior preferido parece ser de
aproximadamente 300-500 sondas diferentes con el fin
de obtener una resolución satisfactoria cuando se registran los
resultados. En otras palabras, debe ser posible distinguir unas
sondas de otras mediante espectroscopia de masas, técnicas de
cromatografía o de electroforesis. Si dice que los pool están
"organizados" porque los contenidos de cada pool son conocidos
y se colocan de uno modo organizado, definido y reconocible en sus
propios recipientes, que se pueden marcar y darles un nombre que
permite su identificación. Por ejemplo, cuando se preparan las
series de pool en unas placas de micropocillos idénticas, cada
pocillo se caracteriza no sólo por su contenido sino también por su
lugar. Por lo tanto, se permite una identificación precisa.
En la presente invención, la expresión "pool
de sondas de polinucleótidos" significa un conjunto o mezcla de
secuencias de polinucleótidos solubles, es decir unos fragmentos
ADN, que se forman a partir de sondas de polinucleótidos
seleccionadas, capaces de identificar el grupo de organismos deseado
que presenta una secuencia de polinucleótidos, en común, por
ejemplo unos grupos conservados. Dichas secuencias de
polinucleótidos comunes son bien conocidas y comprenden más o menos
regiones conservadas, que se pueden encontrar, especialmente en un
ARN ribosómico (ARNr), etc., pero también están presenten en otros
tejidos y orgánulos que contienen secuencias de polinucleótidos.
Los ribosomas están presentes en todas las
células vivas y es sabido que comprenden proteínas y ARN ribosómico
(ARNr). Dichos ARN a su vez comprende unas regiones conservadas y
variables alternantes con nueve regiones variables que se
encuentran, por ejemplo, en el ARNr 16S bacteriano (Fig. 5). Los
genes ARNr (ADNr) se organizan en operones rrn, en los que
lo genes ADNr están separados por regiones espaciadoras
hipervariables. La mayoría de organismos presentan varios operones
rrn en sus genomas y en la mayoría de los casos las
secuencias intragenómicas del ARNr estructural son altamente
similares. El análisis de los resultados de las secuencias ADNr,
especialmente las de las subunidades de ADNr pequeñas ha revelado
unas regiones variables en las secuencias de genes que contienen
una información específica para diferentes niveles filogenéticos;
grupos, géneros, especies o subespecies (Fig. 6). De este modo, se
pueden encontrar las secuencias únicas en determinados organismos.
Esto se ha utilizado para diseñar sondas de ácidos nucleicos
específicas de especies y grupos para la detección e identificación
de bacterias y otros microorganismos. Dichas regiones o regiones más
o menos conservadas que son más o menos comunes para una multitud
de otros organismos permite organizar los organismos individuales
en una población diana en determinados grupos o subpoblaciones. Por
consiguiente, también permite la identificación y la valoración
comparativa de variaciones de organismos individuales y subgrupos en
la población diana. El ADN y ARN de otras fuentes también contienen
unas regiones más o menos variable o conservadas, que se pueden
utilizar para una identificación específica de organismos
individuales o subgrupos determinados en unas poblaciones diana.
Las sondas de polinucleótido para otros genes el ARN mensajero
(ARNm) correspondiente se pueden utilizar para monitorizar las
propiedades funcionales como una resistencia a antibióticos en
bacterias y polimorfismo alélico en genes.
El término "surplus" significa que las
sondas polinucleótidas están presentes en un exceso molar comparado
con los polinucleótidos del analito en la muestra para conseguir un
registro preciso, que es prerrequisito para la determinación
cuantitativa. Para un registro preciso, las sondas de
polinucleótidos solubles deben estar presentes en un exceso molar o
surplus y deben ser distinguibles, por ejemplo por la masa.
En la presente invención, la
"diferenciación" se consigue dotando a las sondas de las
denominadas "etiquetas que permiten la resolución". Las sondas
de polinucleótidos de la presente invención, que permiten la
identificación de los grupos relacionados de organismos que
resultan especialmente útiles en la aplicación de la presente
invención, generalmente, presentan aproximadamente mismo número de
nucleótidos. Antes de la utilización, dichas secuencias de
polinucleótidos se pueden modificar y dotar de características, que
las hacen distinguibles en una separación basada en el tamaño, un
sistema de fraccionamiento o registro. Esto se puede conseguir
poniendo a la cola de las secuencias de polinucleótidos unas
"etiquetas que permiten la resolución", que cambian la masa de
las sondas y por lo tanto proporcionándoles diferentes movilidades
en los sistemas de fraccionamiento, separación o registro
utilizados. Preferentemente, las etiquetas que permiten la
resolución deben funcionar simultáneamente como etiquetas de
afinidad, trazadoras o cebadoras. Preferentemente dichas etiquetas
deben presentar más de una de las funciones deseadas.
Por ejemplo, las sondas de polinucleótidos, que
están presentes en exceso al compararlas con los polinucleótidos
diana, que se cuantifican, pueden estar provistas de secuencias
polinucleótidas que incluyen polinucleótidos mezclados de poliA,
poliT, poliU, poliC, poliG , por ejemplo, poliATs, poliGCs u otras
combinaciones de nucleótidos u otras secuencias de polinucleótidos
que incluyen una de sus mezclas. Además de ser unas etiquetas que
permiten la resolución, dichas secuencias de polinucleótidos pueden
actuar como etiquetas de afinidad y etiquetas de cebador. Las
etiquetas de cebador o etiquetas, por ejemplo los fluoróforos de
diferentes tamaños no sólo permiten la detección, también pueden
resultar útiles como etiquetas que permiten la resolución, si
presentan diferencias suficientes en tamaño o masa. Los aminoácidos
o péptidos que no interfieren en la reacción de hibridación se
pueden utilizar como etiquetas de etiquetas que permiten la
resolución, pero también pueden funcionar como etiquetas de
afinidad y etiquetas trazadoras. Existen varias estrategias
descritas para la síntesis de conjugados de
oligonucleótido-péptido que todas ya son adaptables
para la presente invención. Sin embargo, cuando se utilizan los
cebadores como etiquetas, se sitúan naturalmente a ambos lados de la
sonda.
"Etiquetas trazadoras", significa una
etiqueta o un marcador, que permite la detección y/o grabación de la
sonda. En la forma de realización básica de la presente invención
la etiqueta trazadora es un marcador o etiqueta detectable o
registrable como un fluoróforo. Se debe destacar que la etiqueta
trazadora se coloca preferentemente en uno de los extremos de la
sonda. La sonda se etiqueta en el extremo para evitar que l trazador
interfiera a las reacciones de hibridación entre la sonda y el
analito. En la presente invención, la etiqueta trazadora puede
función también como una etiqueta que permite la resolución al
proporcionar a las sondas con masas diferentes y por ello
diferentes
movilidades.
movilidades.
El término "etiquetas trazadoras" significa
etiqueta o marcadores, que son visibles o de otro modo detectables,
es decir que se pueden registrar directamente o que se hacen
detectables o registrables cuando se ponen en contacto con otros
reactivos. Las etiquetas trazador, registrables por su magnetismo o
electroquímica, que incluye las propiedades de espectroscopia de
masas, fluorescencia, luminiscencia, absorción infrarrojo,
reacciones de radioactividad o enzimáticas, son especialmente
adecuados. Sin embargo, resulta evidente que se puede utilizar
cualquier otra etiqueta trazadora no mencionado en el documento
presente, cuyas etiquetas son fácilmente registrables por medios
automáticos o instrumentos. Se debe destacar que no se necesita una
etiqueta trazadora cuando se utilizan técnicas de espectroscopia de
masa o cromatografía para la grabación, pero las sondas de
polinucleótidos que presentan el mismo número de nucleótidos debe
dotarse de otros grupos que permiten la resolución por tamaño o
masa.
Los colorantes fluoróforos como
ácido-2-(yodoacetil)amino)etil)aminonaftileno-1-sulfónico)
(1,5-IEDANS), fluoresceína, bodipy, FTC, rojo
texas, ficoeritrina, rodaminas, carboxitetrametilrodamina, DAPI,
colorantes indopiros, azul cascada, verde de oregón, eosinas,
eritrosina, piridiloxazoles, benzoxadiazoles, aminonaftalenos,
pirenos, maleimidas, cumarinas, amarillo lucifer, yoduro de
propidio, porfirinas, CY3, CY5, CY9, lantánidos, criptatos,
quelatos de lantánidos o derivados o análogos de dichas moléculas
trazador son ejemplos de etiquetas-trazador
adecuadas. Las sondas de polinucleótidos fluorescentes resultan
especialmente útiles en una grabación automática o semiautomática
de los resultados combinados con los sistemas e instrumentos de
flujo continuo. Los fluoróforos con tamaños o masas que difieren a
tal grado que hacen que las sondas de polinucleótidos distinguibles
se encuentran entre las mencionadas anteriormente. Especialmente,
se pueden utilizar las fosforamiditas como
6-FAM^{TM}, VIC^{TM}, NED^{TM,} ROX^{TM} y
PET^{TM} (todas registradas por Applied Biosystems) para marcar en
el extremo las sondas de polinucleótidos.
En determinadas formas de realización de la
presente invención se deben identificar unas cantidades muy pequeñas
del nucleótido analito y se necesita un ensayo muy sensible. En
dichos casos la sonda está provista de un par de secuencias de
cebador terminal o "etiquetas de cebador", que permiten la
amplificación de las sondas recuperadas cuantitativamente.
Asimismo, en dicho caso las sondas pueden estar provistas además de
etiquetas trazadoras opcionales, por ejemplo de fluoróforos de
diferentes tamaños, especialmente durante un proceso de
amplificación por PCR. Dichas etiquetas de cebador en los extremos
terminales 3' y 5' de la sonda permiten la amplificación de sondas
tras la recuperación cuantitativa de las sondas que hibridan con los
analitos marcados por afinidad. Una de las secuencias de cebador
puede ser muy corta mientras que la otra puede ser más larga y
actúa simultáneamente como una etiqueta de afinidad y una etiqueta
que permite la resolución. En dicha forma de realización las sondas
pueden estar provistas de una etiqueta trazadora opcional durante o
después de la amplificación. Si se utiliza la espectrometría de
masa para la grabación no son necesarios los trazadores, es
suficiente que las sondas individuales estén provistas de etiquetas,
que permiten la resolución, por ejemplo unos oligonucleótidos que
actúan como cebadores o etiquetas de afinidad.
Los aminoácidos y los péptidos, que no
interfieren en la reacción de hibridación se pueden enganchar,
preferentemente se etiquetan en el extremo a las sondas de
polinucleótido. Existen varias estrategias descritas para la
síntesis de conjugados de oligonucleótido-péptido
que todas ya son adaptables para la presente invención. (Ver por
ejemplo, Lonnberg, H, Annu. Rep. Prog. Chem. sección B 1999, 95,
207-234 y 2001, 97, 177-208). Se
pueden utilizar los procedimientos químicos similares para la
preparación de sondas de diferentes tamaños para unir también los
otros residuos químicos orgánicos a los polinucleótidos. Dichas
secuencias de aminoácidos o de péptidos pueden actuar
simultáneamente como "etiquetas de afinidad" y/o "etiquetas
trazadoras". El aminoácido histidina es un ejemplo útil. Los
péptidos, incluido los ligandos se pueden utilizar como "etiquetas
de afinidad". Los péptidos con actividad enzimática pueden
actuar como "etiquetas trazador". Los péptidos que actúan como
pares anticuerpo-antígeno muden actuar como etiqueta
afinidad y trazador así como permitir la resolución.
El término "analitos" significa las
secuencias polinucleótidas, que se obtiene a partir de una muestra
que comprende la población diana. LA mezcla de las secuencias de
polinucleótidos a partir de la población diana puede incluir
cualquier secuencia nucleótida, (ADN o ARN), que incluye el ARN
mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), pero el ARN
ribosómico (ARNr) o los genes que lo codifican resultan
especialmente útiles. La población diana se puede muestrear en
diferentes sitios o lugares, y en diferentes puntos del tiempo, por
ejemplo antes y después de un tratamiento, que podría tener un
efecto sobre la población diana. Las secuencias de polinucleótidos
en la muestra de la población diana se aíslan por los procedimientos
conocidos per se, por ejemplo (Sambrook, J. y Russel, D.,
Molecular cloning, A Laboratory Manual, tercera edición, (2001)). La
preparación de la muestra que comprende las secuencias de
polinucleótidos analito se puede modificar para incluir una etiqueta
de afinidad adecuada.
Los polinucleótidos de analito pueden ser un
etiquetado de afinidad por una reacción química, en el que por
ejemplo los residuos de biotina se unen covalentemente a las
moléculas de polinucleótidos o ácido nucleico que se van a estudiar
dando como resultado unos analitos de polinucleótidos modificados en
unos analitos de polinucleótidos biotinilados. Con el fin de evitar
que los impedimentos estéricos interfieran en la reacción de las
sondas etiquetadas del trazador y los analitos de polinucleótidos,
los analitos de polinucleótido se etiquetan con un homólogo más
pequeño de un par de afinidad, mientras que su homólogo más grande
se une a un soporte sólido o una herramienta que facilita la
separación. Para el análisis de la composición de poblaciones
cuando representan unas secuencias de polinucleótidos, las
secuencias de polinucleótidos del analito etiquetado por afinidad
pueden ser unas secuencias de polinucleótidos de cualquier tipo, que
incluyen el ARN total o el ARNr o unas preparaciones de genes. La
etiqueta de afinidad y su homólogo o pareja proporcionan una
denominada pareja-afinidad que permite la captura
de las sustancias etiquetadas por afinidad a un soporte sólido, que
en dicho caso se denomina herramienta que facilita la
separación.
La "hibridación en solución facilitada por
afinidad" es un procedimiento bien conocido, en el que la
reacción de hibridación entre la sonda y la secuencia de nucléotido
analito puede tener lugar sin ningún impedimento estérico en
solución. La etiqueta de afinidad permite que los híbridos sean
capturados en una fase sólida, que permite la separación y el
lavado de los ácidos nucleicos recogidos y después se pueden liberar
y mediar los híbridos o sondas capturados.
Las "etiquetas de afinidad" aplicable
también como etiquetas que permiten la resolución se encuentran
entre los residuos de oligonucléotidos, residuos de aminoácidos
como histidina, residuos de péptidos o azúcares y también puede
incluir haptenos como biotina. Algunas de estas etiquetas pueden
funcionar también como etiquetas trazadoras. Por ejemplo, los
residuos de oligonucleótidos etiquetados o no etiquetados se pueden
utilizar como etiquetas de afinidad, etiquetas trazadoras o
etiquetas que permiten la resolución. El termino "etiquetas de
afinidad" significa que los polinucleótidos del analito presentan
una etiqueta o marcador, que presenta una gran afinidad por otra
sustancia. En otras palabras, la etiqueta de afinidad es susceptible
de formar un enlace fuerte con su homólogo o pareja de afinidad.
Los enlaces fuertes formados entre los homólogos de afinidad
permiten que los pares de afinidad actúen como medio para la captura
de las sustancias deseadas. Una pareja de afinidad útil es, por
ejemplo biotina-avidina o
biotina-estreptavidina pero también se pueden
aplicar otras "parejas de afinidad" sintéticas o no sintéticas
o sustancias de unión. Las "parejas de afinidad" adecuadas se
pueden encontrar entre los receptores y ligandos, antígenos o
anticuerpos así como entre sus fragmentos. Las "etiquetas de
afinidad" preferidas de la presente invención incluyen moléculas
más pequeñas como biotina, oilgonucleótidos de histidina, haptenos,
glicanos, etc., mientras que los homólogos de las "etiquetas de
afinidad" preferidos incluyen moléculas mayores como avidina,
estreptavidina, quelatos de metales, anticuerpos, lectinas, etc. se
utilizan para cubrir la "herramienta que facilita la
separación". En la presente invención, las etiquetas de afinidad
preferidas son polinucleótidos, como poli(dA),
poli(dT), poli(dG), poli(dC) y sus mezclas.
Además de ser etiquetas de afinidad proporcionan unas etiquetas que
permiten el etiquetado de diferentes tamaños.
La expresión "herramienta que facilita la
separación" significa preferentemente un soporte sólido, como
microbolas, partículas de látex, partículas magnéticas, hilos,
clavijas, bastones, micropocillos, columnas de afinidad que
presentan o están cubiertas por el homólogo o pareja de afinidad de
la "etiqueta de afinidad". Opcionalmente, la herramienta que
facilita la separación incluye por ejemplo una separación de fase o
un medio eletroforético, que son dependientes de la presencia del
homólogo de la etiqueta de afinidad.
Los pool de "las sondas de polinucleótido
soluble" se preparan preferentemente a partir de una biblioteca
más o menos caracterizada de las secuencias de polinucleótidos
utilizando diferentes procedimientos incluido el aislamiento de
procedimientos naturales o sintéticos, técnicas de PCR o técnicas de
ADN recombinante o sus combinaciones (Sambrook, J. y Russel, D.,
Molecular cloning, A Laboratory Manual, tercera edición, (2001)).
Las sondas de polinucleótidos diferentes capaces de demostrar un
subgrupo específico o individual, se sitúan o colocan en pool de
modo que todas las moléculas de la sonda de polinucleótidos que
representan una subpoblación determinada presentan un tamaño o masa
distinta o característica, que permite su identificación cuando se
utiliza cromatografía, electroforesis en gel o espectrometría de
masa.
Incluso resulta preferible el uso de sondas
caracterizadas es posible preparar unos pool de sondas para los
genomas más pobremente caracterizados de la misma manera explicada
en el documento WO 02/055734 y después dotar dichas sondas de
polinucleótidos con unas etiquetas que permiten la resolución
definidas anteriormente lo que permite su separación y registro.
La expresión "secuencias de polinucleótidos
modificadas" significa que el conjunto de sondas de
polinucleótidos preparadas sintéticamente se pueden modificar
convenientemente, por ejemplo el esqueleto fosfato azúcar de las
secuencias de nucleótidos se puede sustituir por unos enlaces
péptido o se puede formar a partir de los denominados análogos de
nucleósidos cerrados. Los polinucleótidos modificados son, por
ejemplo, ácidos nucleicos-péptido (PNA) descritos
por ejemplo en el documento WO 96/20212 o los ácidos nucleicos
cerrados (LNA) descritos por ejemplo en el documento WO 99/14226.
Dichas sondas de polinucleótidos modificados se pueden aplicar
convenientemente en los procedimientos y los kits de ensayo de la
presente invención. Se pueden copiar utilizando ADN genómico o ADNc
como modelos. A menudo, presenta unas propiedades mejoradas que
incluyen una estabilidad mejorada y también pueden presentar la
ventaja que resulta más fácil dotarlos de unas etiquetas trazadoras
que las sondas de ADN no modificadas.
El "pool organizado soluble" que comprende
unas "sondas de polinucleótido soluble o solubilizado" puede
ponerse en cualquier tipo de recipientes, que está completamente
separado o conectado ya sea de un modo no fijo o bien fijado
rígidamente. En su forma más simple, un pool organizado comprende
uno o más recipientes, por ejemplo unos tubos de ensayo o botellas,
que pueden conectarse entre sí de un modo no fijo por ejemplo en una
rejilla de tubos de ensayo. Un ejemplo práctico de pool organizados
colocados en unos recipientes, que están conectados entre sí de un
modo fijado rígidamente está provisto de unos compartimentos o pozos
de una placa o en una placa de microtitulación. Tal como se ha
mencionado anteriormente los pool solubles se colocan
preferentemente de un modo organizado, por ejemplo en los pocillos
de una placa de microtitulación. Los pool solubles se organizan de
modo que cada pool y cada sonda de polinucleótidos en dicho pool son
claramente identificables. Las placas de microtitulación con sus
pocillos son formas de realización típicas, disponibles
comercialmente que permiten la organización y manejo simultáneo de
muchos pool organizados. Naturalmente, se pueden desarrollar y
construir otros pool hechos a medida más convenientemente
organizados con varios compartimientos y dotarlos de las marcas
adecuadas y de unas instrucciones de utilización.
Los resultados se registran por unos medios
opcionales automáticos o semiautomáticos que incluyen las técnicas
de cromatografía así como espectrometría de masa. Todo el sistema se
puede automatizar completamente o parcialmente. Las técnicas para
distinguir las sondas incluyen la separación o fraccionamiento en un
medio de selección o no con o sin electroforesis. Los medios de
selección incluyen la separación cromatográfica en una matriz, como
un gel que separa las sondas en base al tamaño o masa. Las cargas
eléctricas no son esenciales para la separación incluso si pueden
aumentar la velocidad de movilidad de las sondas. En un medio no
selectivo en el que no hay una matriz, que selecciona la sustancia
que se va a fraccionar, las sondas con una proporción constante
entre la masa y la carga, independientemente del tamaño todas se
mueven a la misma velocidad. En las secuencias polinucleótidas, la
adición de oligonucleótidos no cambia esta masa para cargar la
proporción. Por lo tanto, con el fin de conseguir unas movilidades
diferentes en un medio no selectivo, las sondas deben estar
provistas con unas sustancias no cargadas que les permiten moverse a
unas velocidades diferentes. Esta diferencia en la movilidad no se
consigue por la adición de unas etiquetas de cebador o unas
etiquetas de afinidad que consisten en unas secuencias de
nucleótido de diferentes tamaños o por la adición de sustancias que
no cambian la relación masa/carga comparación con la proporción
normal en las secuencias de nucleótidos.
Por consiguiente, los procedimientos para el
fraccionamiento y separación de las sondas recuperadas
cuantitativamente en la presente invención se pueden adaptar en
vista a los factores descritos anteriormente. Los procedimientos
preferidos para distinguir las sondas de la presente invención es,
por lo tanto, la espectrometría de masa o la separación
cromatográfica en un medio de selección. Si se consigue la
separación por electroforesis por capilaridad, el procedimiento
preferido es utilizar un medio de selección que retrase la movilidad
de las sondas con una masa molecular superior. La electroforesis en
gel convencional en por ejemplo gel de poliacrilamida es también un
procedimiento preferido. La característica esencial del pool
organizado de las sondas es que todas las sondas en un pool único
se pueden separar y cuantificar por el procedimiento de
fraccionamiento seleccionado, el principio por el cual se consigue
el fraccionamiento no es esencial.
La presente invención se refiere a un
procedimiento, que permite la determinación cuantitativa simultánea
de unas cantidades o proporciones relativas de más de un
poliribonucleótido individual o sus subgrupos en una mezcla de
secuencias de polinucleótidos utilizando unas sondas de
polinucleótidos que presentan aproximadamente el mismo tamaño. En
una forma de realización de la presente invención la secuencia de
ribopolinucleótidos representa unos organismos individuales,
subgrupos, géneros, especies o cepas que están en una muestra que
representa la población diana de unos organismos más o menos
relacionados. Se pueden valorar las variaciones en las cantidades
de los subgrupos u organismos individuales en la población debido a
las causas inherentes, como el envejecimiento, los estímulos
externos, tales como tratamiento antibiótico, medidas higiénicas. En
otra forma de realización de la invención se pueden determinar las
variaciones en las cantidades o las proporciones relativas de
transcriptos de las secuencias polinucleótidas en un organismo
único. Esto permite, por ejemplo, la demostración de las
diferencias en la expresión de genes alélicos no homólogos en un
cromosoma y puede explicar las razones de las diferentes
manifestaciones de determinadas enfermedades. También permite el
estudio del polimorfismo en un organismo. El procedimiento y el kit
de ensayo son aplicables a los estudios del medio ambiente y de la
población. Los principios básicos del procedimiento de la presente
invención comprenden una reacción de hibridación que puede tener
lugar en una solución y el híbrido formado se recoge o captura en
un soporte sólido provisto de o cubierto del homólogo o par de
afinidad de una etiqueta de afinidad. El recubrimiento se consigue
por unos medios químicos, por ejemplo por coagulación. Algunas veces
la afinidad entre la(s) superficie(s) de la
herramienta que facilita la separación sólida y el homólogo de la
etiqueta de afinidad es suficiente para formar una unión estable.
Las sondas de polinucleótidos etiquetadas con trazador,
preferentemente etiquetadas en el extremo de un pool (biblioteca)
previamente caracterizado, parcialmente caracterizado o no
caracterizado se ponen en contacto con las secuencias de
polinucleótidos analito etiquetado por afinidad de la muestra a
analizar.
Uno o más pool solubles están previstos en
número predeterminado, pero opcional, comprendido preferentemente
entre 2 y 500, más preferentemente entre 5 y 400, más
preferentemente entre 10 y 300 de unas secuencias de
polinucleótidos solubles. Un prerrequisito para el procedimiento es
que las sondas de polinucleótidos, que presentan aproximadamente el
mismo tamaño, se hagan distinguibles mediante la unión o adición el
extremo de las sondas de polinucleótidos con unas "etiquetas que
permiten la resolución" que permiten su separación o
fraccionamiento y permiten la resolución de las sondas de
polinucleótidos individuales en un modo que permite obtener una
identificación precisa y un cálculo de resultados, por ejemplo las
técnicas electroforéticas, espectrometría de masa o
cromatografía.
Las sondas de polinucleótidos solubles se pueden
identificar sin ninguna etiqueta trazadora utilizando la
espectrometría de masa. Alternativamente, se pueden dotar de unas
etiquetas trazadoras, que en la forma de realización de la presente
invención son directamente detectables o registrables y los
marcadores que pueden actuar simultáneamente como etiquetas que
permiten la resolución. En una forma de realización más avanzada de
la invención que permite una detección ultrasensible o una
evaluación comparativa, resulta preferible utilizar las sondas de
polinucleótidos y unos oligonucleótidos no tan cortos y dotar dichas
sondas de polinucleótidos con un par de etiquetas de cebador
terminales, que permiten que tenga lugar una reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) tras la recuperación cuantitativa de las
sondas. Durante el proceso de amplificación las sondas se pueden
dotar de etiquetas trazadoras utilizando por ejemplo cebadores
etiquetados o nucleótidos marcados. En este caso la etiqueta que
permite la resolución no debe ser una etiqueta trazadora. Los pool
solubles se colocan de un modo organizado en sus recipientes
propios que pueden estar separados, ligeramente conectados o
desmontables. Los pool organizados también se pueden colocar en una
estructura más compacta en la que los recipientes están más o menos
rígidamente unidos como los pocillos en una placa de
microtitulación.
En la forma de realización básica de la presente
invención las etiquetas que permiten la resolución, que proporcionan
a las sondas de nucleótidos diferencias en tamaño o masa para la
proporción de carga eléctrica pueden hibridar con o sin etiquetas
trazadora o de cebador con el analito de preparación de nucleótidos
obtenida por aislamiento de la muestra que contiene la población
diana. Las secuencias de polinucleótidos analito, presentes en la
población diana muestreada se aíslan utilizando los procedimientos
conocidos per se. Generalmente, los polinucleótidos analito
que se van a determinar a partir de la población diana son ARN
ribosómico (ARNr), ARN mensajero (ARNm) o sus genes
correspondientes (ADN). Dichos analitos están provistos de por lo
menos una etiqueta de afinidad, como biotina, histidina, secuencias
de oilgonucleótidos, como oligo(dT), -(dA), -(dC), -(dG) o
sus mezclas, así como haptenos o glicanos. Los polinucleótidos
analito se etiquetan preferentemente con biotina.
Tras estas etapas de preparación de los
reactivos, la reacción de hibridación entre las sondas y los
analitos puede tener lugar. Los híbridos se forman de un modo
preciso molecularmente cuantitativo entre las sondas de
polinucleótido soluble y los analitos etiquetados por afinidad.
Debido a que las sondas de polinucleótidos diferentes presentes en
los pool son conocidas y porque existe un exceso de cada sonda
comparado con los analitos, resulta evidente que la reacción de
hibridación entre los analitos y las sondas, que da como resultado
un híbrido es estequiométrica y la cantidad de sonda recuperada
corresponde a la cantidad de polinucleótidos analito presentes en
la muestra. Naturalmente, no es necesario que la secuencia de
analito sea una secuencia ARNr. Es posible mediante el
procedimiento presente cuantificar cualquier secuencia de una sola
hebra así como cualquier secuencia de doble hebra, tras una etapa
de desnaturalización que convierte el analito de doble hebra en una
sola hebra.
Tal como se ha descrito anteriormente mediante
la hibridación en solución se formarán los híbridos ADN:ARN
(ADN:ADN). Generalmente, la hibridación en solución se lleva a cabo
en unas condiciones, que conduce la hibridación hacia la formación
de híbridos que incluyen ADN:ADN, ADN:ARN, ARN:ARN, PNA:ADN,
PNA:ARN, LNA:ADN, LNA:ARN, etc. Las condiciones más preferidas
varían dependiendo de las sondas de nucleótido, los analitos, etc. A
continuación, los híbridos gracias a la ayuda de las secuencias de
polinucleótidos analito que presentan la etiqueta de afinidad
debido a su afinidad por su homólogo se recogen o se capturan en la
herramienta que facilita la separación mediante dicho homólogo de
la etiqueta de afinidad. Sólo las sondas de polinucleótido, que han
sido capaces de hibridar con las secuencias de analito se recogen
en la herramienta que facilita la separación y se pueden recuperar
cuantitativamente, opcionalmente amplificadas y registradas. Los
híbridos capturados y recogidos se eliminan o separan de la
solución de hibridación y se pueden lavar para quedar sin los otros
reactivos y las sondas que no han reaccionado. Las sondas de
polinucleótidos que no han formado híbridos con los polinucleótidos
analitos etiquetados por afinidad que permanecen en las soluciones
de hibridación o de lavado y por consiguiente son eliminadas. Los
híbridos capturados y recogidos se pueden lavar del exceso de
sondas, que incluye dichas sondas que no han sido capaces de
hibridarse con una secuencia analito etiquetada por afinidad. En
dichos casos, una secuencia de analito que representa un organismo
individual o subgrupo determinado en la población diana y que
corresponde a la sonda de polinucleótido no estaba presente en la
muestra. Las sondas de polinucleótidos recogidas, que se pueden
separar o liberar del analito están opcionalmente provistas de una
etiqueta trazadora. En este caso la etiqueta que permite la
resolución no debe ser una etiqueta trazadora. Las etiquetas de
afinidad redundantes y las secuencias de analito etiquetadas por
afinidad, que no han sido capaces de hibridarse, porque las sondas
que no están presentes las sondas correspondientes en el pool son
capturadas naturalmente en la herramienta sólida que facilita la
separación, pero se puede separar de los híbridos durante la elución
y los procesos de separación posteriores. Asimismo dichos analitos
etiquetados por afinidad, que no tienen una hebra complementaria
entre las sondas son capturadas en la herramienta que facilita la
separación, pero no interfieren en la estequiometría del
procedimiento de hibridación y no interfieren en las etapas
analíticas posteriores. Pueden ser, por ejemplo, destruidos o
eliminados cuando las sondas se aíslan o se liberan del híbrido y/o
de la herramienta que facilita a la separación.
Las herramientas que facilitan la separación
(SAT) son necesarias en el procedimiento de la presente invención
para recuperar los híbridos formados entre las sondas etiquetadas
como trazador opcionalmente y los analitos marcados por afinidad.
Las herramientas que facilitan la separación, que son soportes
sólidos, como microbolas, partículas de látex, partículas
magnéticas, hilos, clavijas, bastones, micropocillos, columnas de
afinidad que presentan o están cubiertas por el(los)
homólogo(s) o pareja(s) de afinidad de la "etiqueta
de afinidad". La herramienta que facilita la separación puede
comprender un medio para la separación de fases o un medio
electromagnéticos para la captura del homólogo de la etiqueta de
afinidad.
Los híbridos recuperados en la herramienta que
facilita la separación se liberan posteriormente de la herramienta
primero por elución, y después por la rotura de los enlaces de
hidrógeno de los híbridos y se aíslan las sondas individuales
etiquetadas opcionalmente que se han liberado de los híbridos, se
separan por sus tamaños y se registran con medios que permiten su
cuantificación. Debido a que cada sonda representa una secuencia
polinucleótida de analito en la muestra, las cantidades o
proporciones relativas de unas secuencias polinucleótidas
individuales que representan unos organismos individuales se pueden
cuantificar según una base molecular. Alternativamente, los enlaces
del híbrido se rompen primero y después el soporte sólido y la
solución que contiene las sondas se separan unas de las otras
utilizando un procedimiento adecuado dependiendo de la herramienta
que facilita la separación utilizada. Después, por ejemplo por
centrifugación, las sondas se separan en base a su tamaño y se
registran utilizando medios que permiten su cuantificación. Las
sondas purificadas y aisladas en las herramientas que facilitan la
separación se eluyen, como NaOH, NH_{4}OH o formamida capaces de
romper los enlaces entre las hebras de polinucleótido.
Por consiguiente, sólo estas sondas de
polinucleótido, que han sido capaces de hibridar a un polinucleótido
analito que representa un determinado organismo individual o un
subgrupo de organismos en la población diana, es decir sólo
aquellas sondas de polinucleótido, que presentan una secuencias de
polinucleótido analito con hebras complementarias presenten en la
muestra serán capturadas por la herramienta que facilita la
separación y se podrán recuperar para el registro. Esto significa
que las sondas opcionalmente etiquetas como trazador detectables o
registrables automática o semiautomáticamente, que son
identificables por sus diferentes tamaños o que se pueden hacer
distinguibles, son capturadas o recuperadas y posteriormente
liberadas o aisladas para el registro. Resulta evidente para un
experto en la materia que el orden de realización de las etapas se
puede cambiar en un caso
determinado.
determinado.
Si falta la etiqueta trazadora falta, las sondas
se pueden registrar directamente con espectrometría de masa. Si la
etiqueta es un trazador, por ejemplo una sustancia fluorescente, la
sonda también se puede registrar directamente, cuando se ha
separado del polinucleótido analito, que no presenta ninguna
etiqueta trazadora Las sondas reactivas etiquetadas opcionalmente
como trazador están ahora presentes en forma aislada y libre y sus
cantidades corresponden exactamente a la cantidad de ácido nucleico
analito que se ha hibridado previamente.
Si la etiqueta es un par de cebadores
terminales, opcionalmente con una etiqueta trazadora, la sonda se
puede amplificar después de la separación de la secuencia de
polinucleótido analito y dotarse de una etiqueta trazadora, ya sea
durante o después de la amplificación. Por ejemplo, después de un
número opcional de ciclos de amplificación, las sondas de
polinucleótido se pueden dotar de una etiqueta trazadora y se pueden
registrar. Alternativamente, los cebadores complementarios pueden
presentar unas etiquetas trazadoras, por lo que las sondas están
provistas de unas etiquetas trazadoras durante la amplificación. La
amplificación permite el registro de subpoblaciones o secuencias de
polinucleótidos presentes en unas cantidades tan mínimas que están
por debajo del límite de detección cuando se utilizan otros
procedimientos. En dicha forma de realización de la presenten
invención, que permite una valoración más sensible de los
polinucleótidos analito, las etiquetas en las sondas son secuencias
de cebador terminales. Las sondas etiquetadas con cebadores
terminales pueden hibridar con los polinucleótidos etiquetados por
afinidad del mismo modo que en la forma de realización básica de la
presente invención. Tras la reacción estequiométrica de
hibridación, se capturan los híbridos en la herramienta que facilita
la separación y se recuperan las sondas etiquetadas con cebador
utilizando los procedimientos conocidos per se. La cantidad
de las sondas recuperadas, que corresponden a la cantidad de
polinucleótidos analito presentes en la muestra se puede amplificar
un número opcional de veces utilizando las técnicas de PCR conocidas
per se. Después o durante la amplificación por PCR, las
sondas se dotan opcionalmente con unos trazadores y se registra la
cantidad de las sondas. Debido a que la recuperación de la sonda
etiquetada con cebador es cuantitativa y corresponde al número de
moléculas de analito y se sabe, con la ayuda de moléculas incluidas
en una cantidad conocida, cuantas veces se han amplificado las
sondas, es decir multiplicado o copiado, es fácil calcular la
cantidad de analito en la muestra original. Esto permite la
valoración cuantitativa de dichos nucleótidos de analito, que sin
la amplificación estarían por debajo del límite de detección y por
lo tanto no serían registrables. Pro consiguiente, la sensibilidad
del procedimiento de la presente invención se puede aumentar mucho.
Esta gran ventaja, si se necesita un ensayo muy sensible, por
ejemplo cuando la población de la muestra, por ejemplo una muestra
de biopsia, contiene sólo algunos organismos o células.
De este modo, el perfil de la sonda de afinidad
seleccionada se puede valorar por unos sistemas de registro
sensibles automáticos o parcialmente automáticos, cuantitativos, que
incluyen la electroforesis por capilaridad o gel así como la
espectrometría de masa. La sonda de polinucleótidos, que se hace
registrable al proporcionarle un tamaño o masa distinguibles y que
está presente en un pool específico, corresponde siempre a la
molécula de analito complementaria, que puede ser identificada por
la sonda conocida. Por lo tanto, los polinucleótidos individuales
en una mezcla de polinucleótidos o una población diana mezclada se
puede deducir de forma precisa.
Una valoración cuantitativa comparativa de las
variaciones en la cantidad de varios polinucléotidos presentes en
células o muestras titulares como respuesta a los cambios debidos a
los mecanismos de control inherentes o como respuesta a los
estímulos externos, que incluyen fármacos, estados patológicos que
requieren por lo menos dos pool organizados solubles, pero
preferentemente por lo menos un pool organizado para cada muestra
que se va a ensayar. Cada pool comprende unas sondas de
polinucleótidos idénticas, pero los pool organizados, por ejemplo
cada uno en su pocillo en una placa de microtitulación, se dota
opcionalmente de una etiqueta trazadora registrable. Si se utilizan
las etiquetas trazadoras resulta ventajoso utilizar unos trazadores
distinguibles, por ejemplo unos fluoróforos que presentan unas
longitudes de onda de emisión diferentes. En una forma de
realización de los pool solubles se presentan en unas placas de
microtitulación. Cada placa de microtitulación es de lo contrario
idéntica pero cada una presenta sus propios trazadores registrables
específicos, que si son fluoróforos emiten preferentemente a unas
longitudes de onda de emisión distinguibles diferentes, que
permiten el registro simultáneo de las variaciones. Es posible
comparar las cantidades son las etiquetas trazadoras utilizando la
espectrometría de masa y permitiendo los sistemas automático con
ordenador para calcular y comparar los resultados registrado.
El diagrama de flujo siguiente del procedimiento
describe como llevar a cabo la presente invención:
\vskip1.000000\baselineskip
Caso 1
Los fragmentos de ADNr se seleccionan para
representar las regiones más o menos conservadas o variables que
representan determinadas especies o grupos de bacterias o
microorganismos. Los fragmentos de ADN están provistos de unas
etiquetas que permiten la resolución o colas o etiquetas que
permiten una buena resolución en el estadio de fragmentación por
tamaño.
- (a)
- colas de polinucleótido (ver etapa 2)
- (b)
- etiquetado del trazador (ver etapa 2)
- (c)
- colas de proteínas (ver etapa 2)
\vskip1.000000\baselineskip
Caso 2
Los polinucleótidos se seleccionan para
representar otros genes, por ejemplos genes de resistencia a
antibióticos o sus ARNm correspondientes. Se pueden seleccionar las
secuencias de polinucleótidos capaces de distinguir entre alelos
diferentes del mismo gen.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, se preparan dos (o más)
conjuntos de ADN con tintes distinguibles. Esto permite unos
estudios comparativos simultáneos de las variaciones en las
cantidades de polinucleótido, particularmente en las cantidades de
ARNr debido a los cambios en las poblaciones o mecanismos internos,
por ejemplo las etapas patológicas o debido a unos estímulos
externos, como fármacos. Las etapas 1 y 2 son preparativas y las
bases para los kits de ensayo comercialmente valiosos. Los pool de
ADN se pueden preparar en grandes cantidades para un gran número de
experimentos. Por consiguiente, no debería haber ninguna necesidad
de repetir esta fase tan tediosa frecuentemente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ácidos nucleótidos se aíslan a partir de un
pool de una población mezclada a través de los procedimientos
conocidos per se. El aislamiento del ARN de las células se
utiliza en unas condiciones experimentales adecuadas que utilizan
los procedimientos conocidos, por ejemplo Sambrook J. y Russel D.,
Molecular cloning, - A laboratory Manual, Tercera edición (2001).
Si el analito polinucleótido es de doble hebra, se debe
desnaturalizar el analito para proporcionar las secuencias de cadena
simple en el procedimiento de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.930000\baselineskip
El ADN o ARN aislado se etiqueta por afinidad,
por ejemplo biotinilado utilizando unos procedimientos químicos no
enzimáticos. El reactivo fotobiotina fotoactivado resulta adecuado
para este propósito y está comercialmente disponible. Como el ARN
se transcribirá en ADNc o bien se modificará automáticamente para el
etiquetado, el ARN se puede preparar y se mantendrá en unos
detergentes fuertes como SDS. Las ARNasas se inhiben mediante SDS
por lo que es fácil aislar el ARN intacto. Sin embargo, la
fragmentación no es un problema, si no es muy fuerte. El tamaño de
los fragmentos de ARN no afectará a la capacidad de captura.
\vskip1.000000\baselineskip
Poner en contacto cada uno de los pool de sondas
etiquetadas como trazador solubles (ADN) con una alícuota de la
preparación de analito etiquetado por afinidad (ARN). Dejar que
tenga lugar la hibridación en la solución libre en el pequeño
volumen presente en cada compartimiento de pool correspondiente.
Esto proporciona una reacción rápida y cuantitativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Añadir las microbolas u otra herramienta que
facilita la separación para llevar el par de afinidad, por ejemplo
avidina para capturar las moléculas de ARN. Lavar para deshacerse
del ADN libre.
\vskip1.000000\baselineskip
Eluir con una solución que rompe el híbrido
ADN-ARN como formamida o NaOH. Si es necesario,
concentrar las sondas por evaporación de la solución de elución o
precipitar y lacar el ADN de una sola hebra. Poner el ADN de una
sola hebra en una muestra de electroforesis o en una solución
tampón. Resulta preferible que se utilicen dichas condiciones que
la electroforesis del eluato se lleva a cabo directamente y las
diferentes sondas se registren simultáneamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Determinar el tamaño y la cantidad de ADN eluido
a partir de los híbridos ADN:ADN o ADN:ARN por cromatografía o
electroforesis en gel. Asimismo se puede utilizar la espectrometría
de masa. Las diferencias entre las dos preparaciones ADN/ARN se
observan fácilmente por hibridación de los fragmentos de ADN
aislados con diferentes marcadores y mezclando los ADN antes de la
electroforesis.
\vskip1.000000\baselineskip
En el caso 1, la composición de la población se
ha determinado directamente con respecto a las subpoblaciones cuyas
sondas están incluidas en el pool. De forma similar, en el caso 2 la
presencia de determinadas propiedades funcionales (presencia o
expresión de genes) en un organismo individual o una población se
determina directamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Si se necesita un ensayo muy sensible las
secuencias de polinucleótido reactivo, es decir las sondas
etiquetadas de trazador eluido de la herramienta que facilita en la
separación se pueden amplificar por PCR tras una etapa de selección
cuantitativa. Si se utiliza este enfoque, las secuencias de
polinucleótido reactivo, es decir las sondas, se puede modificar
para contener una secuencia terminal común que permite la
amplificación de todas las ondas en el mismo pool con el mismo par
de cebador de PCR, dotado de una etiqueta trazadora.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Cuando las sondas están provistas de etiquetas o
colas que permiten su separación por tamaño o movilidad por
electroforesis en gel o cromatografía. También se puede registrar en
base a sus masas utilizando espectrometría de masa. En este caso,
no se necesita una etiqueta trazadora y permite una mayor mejora del
procedimiento. Al omitir la utilización de las etiquetas
trazadoras, el procedimiento se puede simplificar y se puede evitar
la necesidad de las etiquetas registrables caras. De otra forma, el
procedimiento corresponde completamente al procedimiento descrito
anteriormente y comprende las etapas posteriores siguientes:
- (a)
- proporcionar unos pool más o menos organizados con un número predeterminado opcional de unas secuencias de polinucleótidos de sonda solubles con diferentes tamaños que permiten su identificación o registro, dichos pool se colocan de una forma organizada en sus propios recipientes que están separados o unidos;
- (b)
- aislar las secuencias de polinucleótidos analito presentes en la célula o muestra tisular del organismo diana y dotar dichos analitos con por lo menos una etiqueta de afinidad;
- (c)
- hacer que tenga lugar la reacción de hibridación entre los sondas solubles de la etapa (a) y el analito de la etapa (b) que conduce a la formación de los híbridos sonda soluble:analito etiquetado por afinidad;
- (d)
- aislar la sonda: híbridos-analito formados en la etapa (c) por captura de dicho híbrido en una herramienta que facilita la separación provista de un par de afinidad de la etiqueta de afinidad del analito;
- (e)
- recuperar la sonda de la herramienta que facilita la separación; y
- (f)
- registrar el tamaño y la cantidad de sonda con unas técnicas electroforéticas o espectrometría de masa.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere asimismo a un
kit de ensayo para la realización de la determinación cuantitativa.
El kit de ensayo comprende uno o más pool organizados con un número
predeterminado opcional de unas secuencias de polinucleótidos de
sonda solubles que hibridan con las secuencias de nucleótidos
analito complementarias que comprende unas regiones más o menos
conservadas, que son comunes a toda la población o específicas de
un determinado subgrupo de organismos. Alternativamente, el kit de
ensayo comprende sondas, que hibridan con genes específicos que
codifican para determinadas funciones y sus ARNm correspondientes
como los de resistencia a antibióticos. Las sondas de
polinucleótidos están provistas opcionalmente de etiquetas, ya sea
etiquetas trazadoras o un par de secuencias de etiqueta de cebador
terminal. Preferentemente, las etiquetas trazadoras son unas
etiquetas trazadoras etiquetadas en el extremo detectable, como un
fluoróforo que proporciona a las sondas de polinucleótidos tamaños
diferentes.
El kit de ensayo comprende unos pool organizados
solubles, cada pool presenta más de uno, preferentemente más de
diez, más preferiblemente aproximadamente cien o más sondas. Los
pool se colocan preferiblemente de un modo organizado en sus
recipientes, por ejemplo tubos de ensayo, botellas o en los pocillos
o compartimientos de una placa de microtitulación. Incluso si el
kit de ensayo para la realización de la determinación cuantitativa
presente es preferentemente una placa de microtitulación o la
correspondiente estructura hecha a medida, el kit de ensayo puede
ser un número opcional de tubos de ensayo, botellas, etc. que se
pueden organizar en unas distribuciones más o menos fijas, que
incluyen estantes y/o otras estructuras rígidas. Los kit de ensayo
se pueden personalizar o hacer a medida y dotar de las marcas
adecuadas y de unas instrucciones de utilización.
Los pool solubles de las sondas de
polinucleótidos solubles para los kit de ensayo se pueden preparar a
partir de fragmentos de ADN. Pueden ser polinucleótidos sintéticos
y ADN modificados. Cuando el kit de ensayo se prepara para el
estudio de los genomas caracterizados, los pool del kit de ensayo
comprenden preferentemente por lo menos un fragmento de
polinucleótido (sonda) para cada gen que se va a estudiar en el
genoma. También cuando se estudian genomas no caracterizados, los
pool se pueden preparar ventajosamente en cantidades mayores, no se
excluye de ninguna manera la producción comercial, para unos
estudios más generales o más específicos.
Si las sondas de polinucleótido reactivos
derivan de un genoma caracterizado, es conocido que cada molécula
de sonda corresponde a un gen determinado, y cada sonda identifica
se identifica específicamente por su tamaño y pool. Las variaciones
en las cantidades o proporciones relativas de organismos o sus
subgrupos en una población mezclada determinada se pueden, de este
modo, comparar directamente y se calculan automáticamente a partir
de unos resultados registrados automáticamente. Si las sondas de
polinucleótido reactivo están poco caracterizadas, derivan por
ejemplo de un organismo, cuyo genoma no está secuenciado, todavía se
pueden obtener resultados valiosos.
Una forma de realización preferida del kit de
ensayo se puede preparar en una placa de microtitulación. En dicha
forma de realización práctica de la invención, se pueden utilizar
los pool de fragmentos de ADN de unas secuencias conocidas o no
conocidas de levadura, clostridio, bacterias que intoxican los
alimentos, etc. para la preparación de los kits de ensayo. Si cada
pool comprende por ejemplo aproximadamente de 10-100
sondas o fragmentos, proporciona una resolución suficientemente
buena. Si cada sonda en el pool representa unas especies
bacterianas determinadas, se pueden colocar sondas de miles de
especies en una sola placa de microtitulación y todavía existe
sitio para varios controles. Las sondas de ADN capturado son
identificadas parcialmente por el pool o el pocillo de
microtitulación al que pertenecen, y parcialmente por su tamaño.
La etiqueta trazadora opcional registrable se
selecciona ventajosamente de un grupo de trazadores detectables por
fluorescencia, absorción de infrarrojo, propiedades
electromagnéticas, radioactividad y actividad enzimática. La
etiqueta trazadora preferida registrable por fluorescencia es un
fluorocromo o un fluoróforo. La espectrometría de masa es otro modo
preferido, que permite el registro y la cuantificación sin etiquetas
trazadoras. Incluso si las etiquetas trazadoras son unas formas de
realización preferida no resultan esenciales para el procedimiento
de la presente invención, el único prerrequisito para el kit de
ensayo de la presente invención es que las sondas en los pool
organizados solubles presenten unos tamaños diferentes o se hagan
distinguibles. Se etiquetan opcionalmente ya sea con unas etiquetas
trazadoras o unas etiquetas de cebador terminal. Por consiguiente,
un kit de ensayo que funciona está provisto de un pool organizado de
sondas etiquetadas con un cebador terminal incluso si no dispone de
trazador.
El kit de ensayo de la presente invención es en
su forma más simple un pool organizado de sondas etiquetadas
solubles con tamaños diferentes. Se debe destacar que dicho kit de
ensayo es completo por lo que se puede complementar con unos
trazadores opcionales, unos homólogos de afinidad y/o unas
herramientas que facilitan la separación. Sin embargo, dichos
reactivos auxiliares no son prerrequisito. Dichos reactivos
auxiliares y los medios para la realización del procedimiento de la
invención están incluso disponibles comercialmente en varias
fuentes. De este modo, el procedimiento y el kit de ensayo de la
presente invención se puede hacer a medida según las necesidades
específicas del usuario final, especialmente, puede ser aplicable
para el manejo automático o semiautomático.
El modo de fabricación del kit de ensayo, según
la necesidad no necesita incluir unas etapas de inmovilización,
permite una adaptación fácil de los ensayos hechos a medida, que se
dirigen su atención a unos subconjuntos determinados o
subpoblaciones en una población determinada. El kit de ensayo puede
comprender una etiqueta de afinidad opcional para el etiquetado de
polinucleótidos en la célula o la muestra tisular y una herramienta
que facilita la separación opcional que presenta o está recubierta
de un homólogo de la etiqueta de afinidad para el etiquetado del
analito. Los pares de afinidad opcionales que proporcionan las
etiquetas de afinidad para los analitos y los homólogos para las
herramientas que facilitan la separación incluyen, pero no se
limitan a, por ejemplo, biotina y avidina o estreptavidina,
histidina y quelatos de metales, haptenos y anticuerpos o glicanos y
lectinas.
La herramienta que facilita la separación
opcional, que se puede incorporar en los kit de ensayo o se puede
proporcionar separadamente, se selecciona de entre un grupo de
soportes sólidos que consiste en microbolas, partículas de látex,
partículas magnéticas, hilos, clavijas, bastones, micropocillos,
columnas de afinidad. La herramienta que facilita la separación
puede incluir un medio para la separación de fase o medio
electroforético para la captura del homólogo de la etiqueta de
afinidad.
Para la valoración comparativa de las
variaciones de las cantidades o proporciones relativas de
polinucleótidos individuales o sus subgrupos en una mezcla de
secuencias de polinucleótidos, se pueden proporcionar unos pool
organizados con unos conjuntos idénticos de las sondas. En cada
caso, cada pool organizado o kit de ensayo se dota opcionalmente de
unas etiquetas trazadoras opcionalmente diferentes o distinguibles,
cuyas etiquetas son distinguibles en base a sus tamaños o
movilidades y emiten preferentemente a unas longitudes de onda de
emisión diferentes.
Si las etiquetas son unas etiquetas de cebador
terminal que actúan simultáneamente como etiquetas que permiten la
resolución, los kit de ensayo son idénticos pero tras la
amplificación las sondas recuperadas y/o amplificadas se pueden
dotar opcionalmente de unas etiquetas trazadoras distinguibles.
Alternativamente, los pares de afinidad complementarios se pueden
dotar de una etiqueta trazadora, que permite el etiquetado del
trazador durante la amplificación. Dichos reactivos auxiliares se
pueden incorporar en el kit de ensayo o se puede proporcionar a
partir de otras fuentes comerciales o no comerciales. Para permitir
una valoración comparativa simple de las variaciones, de las
cantidades de polinucleótidos en una muestra, resulta conveniente
preparar unos kit de ensayo con una etiqueta trazadora diferente y
distinguible que emite a unas longitudes de emisión diferentes y se
puede registrar con unos instrumentos automáticos o
semiautomáticos.
Los kits de ensayo para una valoración
cuantitativa comparativa de las variaciones en la cantidad de varios
polinucléotidos individuales u organismos o sus subgrupos en una
mezcla de polinucleótidos o una población diana como respuesta a
los cambios inherentes o a los estímulos externos, que incluyen
antibióticos, estados patológicos, situaciones epidemiológicas,
comprenden convenientemente por lo menos dos soportes sólidos o
placas de microtitulación. Cada soporte sólido o placa de
microtitulación está provisto de unos pool idénticos de sondas de
polinucleótidos, provistos opcionalmente de etiquetas trazadoras.
Cada soporte sólido o placa de microtitulación puede estar provisto
opcionalmente de su propia etiqueta trazadora distinguible, que
permite el registro simultáneo de las muestras de células o
tisulares obtenidas a diferentes tiempos, por ejemplo antes o
después del tratamiento farmacológico. El perfil de la población, es
decir el análisis de las diferencias en dos o más preparaciones de
polinucleótido analito, se registran fácilmente mediante la
hibridación de muestras de analito con las sondas de polinucléotido
reactivo etiquetadas en el extremo con etiquetas trazadoras
diferentes, distinguibles y registrables automáticamente. Tras la
etapa de hibridación se pueden mezclar opcionalmente las diferentes
muestras y sus diferencias se pueden observar directamente por
medición de la proporción de etiquetas trazadoras de cada uno en
cada pico. El kit de ensayo puede estar provisto también de por lo
menos un par de cebadores para la amplificación de las sondas de
trazador etiquetadas obtenidas en la ultima etapa, para aumentar la
sensibilidad del ensayo.
El procedimiento de la presente invención
resulta útil para la valoración cuantitativa y comparativa de las
variaciones de las cantidades de determinado organismo o sus
subgrupos en una muestra de población mezclada seleccionada.
El aparato gastrointestinal humano es
probablemente el ecosistema microbiano más complejo descrito y se ha
calculado que por lo menos 400 especies bacterianas residen en el
intestino grueso humano. Con el fin de estudiar este ecosistema
extremadamente complejo se necesitan unas herramientas analíticas de
alto rendimiento convenientes como la que se ha descrito en la
invención. La presente invención permite el cribado simultáneo de la
presencia de numerosos grupos bacterianos y especies y su
cuantificación relativa en las muestras gastrointestinales. Por
ejemplo, en los estudios de alimentos funcionales, el seguimiento de
los cambios en las poblaciones microbianas intestinales reviste un
interés particular. Las bifidobacterias y los lactobacilos
pertenecen a una población microbiana endógena del intestino humano
y se consideran como los organismos marcadores de una microbiota
intestinal bien equilibrada. A menudo se monitorizan las
bifidobacterias y los lactobacilos en las intervenciones
nutricionales. Las sondas específicas de género o de grupo así como
muchas sondas específicas de especies están disponibles para
bifidobacterias y lactobacilos y de este modo, la invención descrita
resulta fácilmente adaptable para la detección de dichas bacterias.
La enumeración de clostridios resulta molesta debido a un medio
selectivo inadecuado, pero la invención descrita proporciona un
enfoque independiente del cultivo para la monitorización
cualitativa y cuantitativa de clostridios así como otros grupos
microbianos.
La invención descrita se puede utilizar en
microbiología clínica, por ejemplo en la valoración de la eficacia
de un tratamiento antibiótico sobre las poblaciones bacterianas. Con
el fin de encontrar un tratamiento antibiótico correcto en
situaciones de urgencia por infecciones causadas por bacterias
resistentes a antibióticos, los procedimientos de cribado rápido
resultan especialmente valiosos.
En el suministro de agua potable y de alimentos,
son necesarias las medidas higiénicas de producción de alimentos y
un buen control. Basándose en la invención descrita se pueden
diseñar los kits de ensayo para el control de la calidad microbiana
del agua potable y los productos alimenticios. En la industria
alimentaria los ensayos fiables para los microbios patógenos como
Salmonella, Listeria, Bacillus y E. coli adquieren
prioridad pero también a menudo son necesarios los ensayos para
microbios no patógenos que deterioran los alimentos como los
lactobacilos y las levaduras.
Otro campo de aplicación de la invención son los
kits de ensayo para la detección de hongos, que pueden crecer en
estructuras de edificios y por ello causar problemas sanitarios
graves a los humanos mediante la liberación de toxinas y esporas al
aire. Los microbios también pueden dañar los edificios y artefactos
históricamente importantes como pinturas murales antiguas,
esculturas, etc. Se pueden diseñar los kits en ensayo adecuados
para la identificación de cuáles son los microbios causantes y la
monitorización de la eficacia de las medidas de control.
En la ecología microbiana independiente de
cultivo los procedimientos de monitorización son esenciales, porque
las condiciones de crecimiento en el laboratorio a veces no logran
mimetizar los entornos naturales de los microbios y por
consiguiente, en el medio del laboratorio sólo se puede recuperar
una fracción de microbios en las muestras medioambientales. Los
diferentes ensayos se pueden diseñar para la monitorización de
poblaciones microbianas no cultivadas en diferentes muestras de
suelo y agua, que permite la evaluación de los efectos de la
contaminación, la agricultura y otras acciones de los humanos en los
ecosistemas naturales y la eficacia de las medidas correctivas de
los daños medioambientales como el vertido de aceite. En la
investigación ecológica fundamental, resulta interesante la
monitorización de las variaciones estacionales naturales en los
ecosistemas microbianos y la comparación de los ecosistemas
similares en las diferentes localizaciones geográficas.
Los kits de ensayo comprenden las sondas de
polinucleótidos, que pueden discriminar entre determinados alelos
de los genes. Dichos kits se pueden utilizar para los estudios de
población para estudiar la distribución de determinados alelos de
los genes, por ejemplo. De forma similar se pueden utilizar en los
kits los polinucleótidos que reconocen mutaciones puntuales en
varios genes.
Además de las aplicaciones presentadas
anteriormente, el procedimiento y los kits de ensayo se pueden
utilizar para los estudios evolutivos y para evaluar las
relaciones. En arqueología, se puede utilizar para estudiar las
causas de la degradación de las pinturas murales antiguas y las
estatuas y otros artefactos por los microbios y la monitorización
del efecto de medidas preventivas.
El procedimiento y los kits de ensayo se pueden
utilizar para la detección de unas mutaciones puntuales con unos
efectos potencialmente perjudiciales sobre la salud de los humanos y
animales y para los estudios poblacionales que incluyen la
distribución de determinados alelos de genes en la población.
El kit de ensayo de la presente invención en su
forma más simple y más barata es de otra forma el mismo que los
kits de ensayo descritos anteriormente y comprende un o más pool
organizados con un número opcional predeterminado de sondas
solubles de secuencias de polinucleótido dotadas de diferentes
tamaño que permiten su identificación y el registro con
espectrometría de masa. Las sondas pueden estar provistas de unas
etiquetas de cebador terminales para permitir la amplificación
antes de la mediación cuantitativa con medios espectrográficos o
espectrométricos. Dichas sondas de pool no etiquetados se colocan
de un modo organizado en sus recipientes, que están separados o
unidos.
El kit de ensayo que incluye los reactivos de la
presente invención es preferentemente aplicable para llevar a cabo
los procedimientos automáticos o semiautomáticos, una muestra de los
cuales se muestra en el diagrama de flujo de la Figura 11. El
procedimiento se pueden interrumpir y los reactivos se transfieren
en los soportes sólidos si los dispositivos automáticos no son
bastante compatibles. Las primeras etapas se llevan a cabo
ventajosamente en estación de pipeteado automático, en el que la
muestra de ARN biotinilado se pipetea en cada pool que contiene las
sondas con tamaños diferentes en sus pool. Después, el kit de ensayo
se puede secar utilizando un liofilizador. El secado se puede
realizar para eliminar la influencia de cualquier diferencia en los
volúmenes. La liofilización opcional permite que se pare el trabajo
hasta que sea conveniente seguir trabajando.
El trabajo se puede retomar añadiendo un tampón
de hibridación adecuado a los pool en una estación de pipeteado
automática. La placa se sella con los medios adecuados, por ejemplo
una película o papel de aluminio para evitar la evaporación en la
etapa posterior. Cuando el kit de ensayo presenta un sellador
térmico adecuado, se coloca en un bloque térmico automatizado, en
el que la temperatura se puede regular hacia arriba o hacia abajo
según sea necesario para permitir la desnaturalización e hibridación
de las sondas. Tras la hibridación, la solución que contiene los
híbridos sonda:analito se coloca en un procesador de partículas
magnético para llevar a cabo la captura por afinidad, las etapas de
lavado y de elución moviendo las bolas magnéticas recubiertas de
estreptavidina/avidina de una etapa a la otra, por ejemplo en una
placa KingFisher según el protocolo programado. Los eluatos se
puede transferir opcionalmente a una nueva placa, si las estaciones
automatizadas utilizan diferentes tipos de placas de
microtitulación. Los pocillos se pueden lavar con un tampón de
elución para la transferencia cuantitativa y después las soluciones
combinadas se evaporan en un liofilizador, que permite la
conservación de las muestras y que realiza el registro en un periodo
de tiempo más conveniente. En otras palabras, el procedimiento se
puede adaptar fácilmente a los diferentes horarios y protocolos para
la realización de la determinación. Los fragmentos de la sonda, el
estándar de tamaño y los estándares de concentración se inyectan
automáticamente en un analizador automático ya sea directamente o
bien tras una etapa conveniente. Las intensidades de las etiquetas
unidas a los fragmentos de la sonda se determinan como alturas de
picos o áreas. Las áreas de los estándares de concentración, con
unas cantidades conocidas, se utilizan después para determinar las
cantidades absolutas de cada fragmento de la sonda.
El diseño experimental y los principios
generales de la presente invención se describen con mayor detalle
utilizando las cepas bacterianas disponibles en el laboratorio de
los inventores y los polinucleótidos sintéticos. Las cepas y los
polinucleótidos se utilizan sólo con fines ilustrativos. La
invención no se limita de ningún modo a dichas cepas y
polinucleótidos o a las soluciones de reacción.
Los principios de la invención se pueden
verificar colocando el constructo usado en los ejemplos por otras
cepas o secuencias polinucleótidos y sondas, que están disponibles
en abundancia. Los expertos en la materia pueden adaptar fácilmente
los principios de la invención en diferentes aplicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrajo el ARN total de Clostridium
symbiosum cepa VTT E-981051^{T} (de ahora en
adelante E1051) y se hibridó con las sondas Bact etiquetadas para
ARNr 16S (Amann, R.I., et al., Appl. Environ. Microbiol.
56:1919-1925, 1990) y Erec (Franks, A.H. et
al., Appl. Environ. Microbiol. 64:3336-3345,
1998). La sonda Bact es específica para la bacteria (anteriormente
eubacteria) (Amann, et al., 1990) mientras que la sonda Erec
es específica de las bacterias que pertenecen al grupo
Clostridium coccoides - Eubacterium rectale (Franks, A.H.
et al., Appl. Environ. Microbiol.
64:3336-3345, 1998). Las especies Clostridium
symbiosum pertenece al grupo Clostridium coccoides-
Eubacterium rectale y por lo tanto su ARNr/ADNr fue reconocido
por ambas sondas Bact y Erec. Además, se utilizó
Erec-5A - una versión modificada de la sonda Erec
con una cola 5A unida (cinco adenosinas adicionales) en el
experimento modelo. El experimento sigue las etapas que se exponen a
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizan los tubos de microcentrífuga
desechables libres de ARNasa, las puntas de pipeta, los reactivos,
etc, en las etapas preparativas y las analíticas siempre que sea
necesario.
Sondas de oligonucleótidos etiquetadas ARNr
16S
| 5' GCTGCCTCCCGTAGGAGT 3' | (SEC ID nº 1) |
| 5' GCTTCTTAGTCARGTACCG 3' | (SEC ID nº 2) y |
| 5' GCTTCTTAGTCARGTACCGAAAAA 3' | (SEC ID nº 3), |
\newpage
en la que R= A/G se presenta en la Tabla 1 y el
fluoróforo etiquetado con 6-FAM^{TM} en el extremo
5' se adquirieron de Applied Biosystems:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Clostridium symbiosum E1051 se hace
crecer en un cultivo puro en un caldo clostridial reforzado (Difco)
en unas condiciones anaeróbicas a una temperatura de 37ºC. El ARN
total de E1051 se extrajo según Zoetendal, E, G, et al.,
Appl. Envorin. Microbiol. 64:3854-3859 (1998).
\vskip1.000000\baselineskip
El ARN se etiquetó por afinidad con PHOROPROBE®
Biotin SP-1000 según las instrucciones del
fabricante (VECTOR Laboratories). Por consiguiente, el ARN
biotinilado se purifica de la biotina libre con un mini kit de
RNeasy por aplicación del protocolo para la limpieza del ARN según
las instrucciones del fabricante (Qiagen).
\vskip1.000000\baselineskip
Una alícuota de una muestra de ARN (102 ng) se
mezcló con una sonda de polinucleótido (1 pmol) en una solución de
hibridación a una concentración final de 5 x SSC (NaCl 0,75M -
citrato sódico 75 mM, pH 7,0) SDS 0,1% (p/v) y Denhardt's Ficoll 1
x (0,02% (p/v), polivinilpirrolidona 0,02% (p/v), albúmina bovina
sérica 0,02% (p/v)). El volumen de la mezcla de hibridación fue de
20 \mul. La mezcla de la reacción se incubó a una temperatura de
70ºC durante 2 minutos y después a una temperatura de 40ºC durante
30 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la hibridación, se utilizó el procesador de
partículas magnético KingFisher (ThermoLabsystems) para llevar a
cabo la captura por afinidad, las etapas de lavado y elución
moviendo las bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina de una
etapa a otra en una placa de microtitulación KingFisher y el proceso
se llevó a cabo a temperatura ambiente.
Las reacciones de hibridación se transfieren a
los pocillos específicos en la(s) placa(s) KingFisher.
Para ajustar la concentración de NaCl adecuada para la captura por
afinidad (1M) y para transferir la mezcla de hibridación
cuantitativamente en los pocillos KingFisher, los tubos/pocillos de
la hibridación se enjuagaron con 40 \mul de una solución de
lavado y la solución de lavado se añade posteriormente a los mismos
pocillos KingFisher con las mezclas de hibridación. La solución de
lavado consiste en una parte de NaCl 2M y Tris-HCl
10 mM (pH 7,5)- EDTA 1 mM y 2,33 partes de la solución de
hibridación (ver Etapa 2).
El ARN biotinilado y los híbridos
ARN-oligonucleótido se recogen en las partículas
magnéticas recubiertas de estreptavidina Dynabeads®
M-280 (50 \mug, Dynal A.S, Noruega) durante 30
minutos. Tras la captura de las partículas se lavaron tres veces
con 150 \mul 1x SCC (NaCl 0,15M - citrato sódico 15 mM, pH 7,0),
SDS 0,1% y dos veces con 150 \mul de agua (desionizada,
ultrafiltrada, libre de ARNasa) y las sondas se eluyeron con 30
\mul de formamida. Por consiguiente, la formamida se evaporó en un
liofilizador y las sondas se resuspendieron en 10 \mul de
agua.
Las sondas eluidas se analizaron utilizando un
equipo de electroforesis por capilaridad ABI310 (Applied
Biosystems). Las sondas eluidas se identificaron basándose en su
comportamiento de migración. Con antelación, las sondas libres se
hicieron correr en el mismo equipo en las mismas condiciones y se
determinaron sus comportamientos de migración. Con el fin de
facilitar la comparación de los recorridos individuales (es decir,
las muestras) se añadieron los estándares de tamaño a las muestras.
Los resultados se leyeron a partir de un electroferograma y a partir
del archivo de datos como se muestra en la Fig. 7.
Tal como se puede apreciar en la Fig. 7 las
sondas de oligonucleótidos que difieren en tamaño por sólo un
nucleótido se separaron como unos picos individuales en las
electroforesis por capilaridad y la adición de una sonda Erec con
una cola 5A alteró significativamente su comportamiento de
migración. A pesar de la modificación de la sonda Erec por la unión
de una cola 5A se reconoce el ARN diana de la cepa E1051.
\vskip1.000000\baselineskip
La especificidad de las dos sondas Chis y Erec
(Franks, A.H. et al., Appl. Environ. Microbiol.
64:3336-3345, 1998) en las condiciones de reacción
especificadas se aseguraron por hibridación de las sondas con varias
cepas bacterianas. La sonda Bact se utilizó como un control interno
en la hibridación para asegurar la integridad del ARNr bacteriano.
Chis es específico para las bacterias que pertenecen al grupo
Clostridium histolyticum (Franks, A.H. et al., Appl.
Environ. Microbiol. 64:3336-3345, 1998). Las sondas
Bact y Erec se describieron previamente en el Ejemplo 1. El
experimento sigue las etapas expuestas a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Chis 5' TTATGCGGTATTAATCTRCCTTT 3' (SEC ID nº
4), en la que R =C/T , Franks, A.H. et al., Appl. Environ.
Microbiol. 64:3336-3345, 1998) etiquetado con
6-FAM^{TM} en el extremo 5' se adquirió en Applied
Biosystems, Las sondas Bact y Erec se han descrito previamente en la
etapa preparativa 1 en el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo puro de los diferentes
microorganismos de una colección de cultivo VTT (Tabla 2) se hizo
crecer en un medio nutritivo adecuado y el ARN total de la bacteria
se extrajo como describe Zoetendal, E, G, et al., Appl.
Environ. Microbiol. 64:3854-3859 (1998) o con un
mini kit de RNeasy por aplicación del protocolo para el aislamiento
del ARN total de las bacterias según las instrucciones del
fabricante (Qiagen). El ARN total de Trichoderma reesei se
extrajo utilizando el procedimiento TRIZol® Reagent (Life
Technologies, Gibco BRL).
\vskip1.000000\baselineskip
El ARN se etiquetó por afinidad con biotina en
la etapa analítica 1 en el Ejemplo 1. Tras la biotinilación, el ARN
biotinilado se purifica de la biotina libre con un protocolo
proporcionado por VECTOR Laboratories o con mini kit de RNeasy por
aplicación del protocolo para la limpieza del ARN según las
instrucciones del fabricante (Qiagen).
\vskip1.000000\baselineskip
Una alícuota de una muestra de ARN (50 a 80 ng)
se mezcló con una solución de hibridación (ver la etapa analítica 2
en el Ejemplo 1) que contiene unas sondas de oligonucleótidos Bact y
Chis o Bact y Erec (1 pmol de cada). El volumen final de la mezcla
de hibridación fue de 20 \mul. La mezcla de la reacción se incubó
a una temperatura de 70ºC durante 2 minutos y después a una
temperatura de 50ºC durante 30 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
La captura por afinidad, los lavados y la
elución se llevaron a cabo utilizando un procesador de partículas
magnético KingFisher (ThermoLabsystems) como se ha descrito en la
etapa analítica 1 en el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas eluidas se analizaron utilizando un
equipo de electroforesis por capilaridad ABI310 (Applied Biosystems)
tal como se ha descrito en la etapa analítica 4 en el Ejemplo 1.
Tal como se puede apreciar en la Fig. 8 las
sondas de oligonucleótidos Chis y Erec muestran la especificidad
esperada (Tabla 2) en las condiciones de hibridación especificadas y
proporcionaron una señal sólo con unas cepas que pertenecen a sus
grupos diana. Las sondas mostraron la especificidad esperada sólo
con las cepas E-00022^{T} y
E-022088 que no están incluidas en la Fig. 8.
Además, la sonda Bact también mostró la especificidad deseada y no
produce una señal con el ARN Trichoderma reesei. El ARN de la
cepa E-021850 se degradó parcialmente pero todavía
dio una señal con la sonda Bact lo que muestra que el procedimiento
se puede utilizar también para analizar el ARN que se ha compartido
en el ejemplo durante las etapas preparativas. Las condiciones de
hibridación especificadas son las mismas con las tres sondas y por
lo tanto, dichas sondas se pueden utilizar como pool de sondas.
\vskip1.000000\baselineskip
El ARN total se extrajo de Clostridium
tyrobutyricum VTT E-99908 (de ahora en adelante
E908) y las diferentes cantidades del ARN (0,01-10
ng) se hibridaron con las sondas Bact y Chis. El experimento sigue
las etapas expuestas a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron en el experimento las sondas Bact
y Chis descritas anteriormente en la etapa preparativa 1 en el
ejemplo 1 y la etapa preparativa 1 del ejemplo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.930000\baselineskip
E908 se hizo crecer en un cultivo puro en un
medio nutritivo adecuado (Difco) en unas condiciones anaerobias a
una temperatura de 37ºC y el ARN total de la bacteria se extrajo con
un mini kit de RNeasy por aplicación del protocolo para el
aislamiento del ARN total de las bacterias según las instrucciones
del fabricante (Qiagen).
\vskip1.000000\baselineskip
El ARN se etiquetó por afinidad con biotina tal
como se ha descrito en la etapa analítica 1 en el Ejemplo 1. Tras la
biotinilación, el ARN biotinilado se purifica de la biotina libre
según el protocolo proporcionado por VECTOR Laboratories.
\vskip1.000000\baselineskip
El extracto de ARN total de E908 se diluyó
adecuadamente y una alícuota de una muestra de ARN (0,01; 0,05;
0,1; 0,5; 1,0 y 10,0 ng) se mezcló con una solución de hibridación
(ver la etapa analítica 2 en el Ejemplo 1) que contiene unas sondas
de oligonucleótidos Bact y Chis (1 pmol de cada). El volumen final
de la mezcla de hibridación fue de 20 \mul. La mezcla de la
reacción se incubó a una temperatura de 70ºC durante 2 minutos y
después a una temperatura de 50ºC durante 30 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
La captura de afinidad, los lavados y la elución
se llevaron a cabo utilizando un procesador de partículas magnético
KingFisher (ThermoLabsystems) como se ha descrito en la etapa
analítica 1 en el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas eluidas se analizaron utilizando un
equipo de electroforesis por capilaridad ABI310 (Applied Biosystems)
tal como se ha descrito en la etapa analítica 4 en el Ejemplo 1.
Tal como se puede ver en la Fig. 9 la intensidad
de la señal de la sonda (altura del pico y el área) se correlacionan
bine con la cantidad de ARN utilizada en la hibridación. Ambas
sondas presentan unos sitios diana dentro de la molécula ARNr16S
pero en diferentes regiones de la molécula. Las sondas Bact y chis
presentan un nivel igual de etiquetado de fluoróforo y por lo tanto,
al intensidad de la señal de las sondas fue comparable.
\vskip1.000000\baselineskip
El ARN total se extrajo de las cepas E1051, E908
y Clostridium lituseburense VTT E-021853 (de
ahora en adelante E1853). Las diferentes cantidades del ARN de estas
cepas se mezclaron y se hibridaron con un pool de sondas que
consiste en las sondas Bact, Erec y Chis. El experimento sigue las
etapas expuestas a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron en el experimento las sondas Bact,
Erec y Chis descritas anteriormente en la etapa preparativa 1 en el
ejemplo 1 y la etapa preparativa 1 del ejemplo 2.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El ARN total de los cultivos puros de E1051,
E908 y E1853 se extrajo tal como se ha descrito en la etapa
preparativa 2 en el Ejemplo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
El ARN se etiquetó por afinidad con biotina tal
como se ha descrito en la etapa analítica 1 en el Ejemplo 1. Tras la
biotinilación, el ARN biotinilado se purifica de la biotina libre
tal como se ha descrito en la etapa analítica 1 en el Ejemplo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cantidades específicas del ARN de diferentes
bacterias (Tabla 3) se mezclaron y se añadió una solución de
hibridación (ver la etapa analítica 2 en el Ejemplo 1) que contiene
unas sondas de oligonucleótidos Bact, Chis y Erec (1 pmol de cada).
El volumen final de la mezcla de hibridación fue de 20 \mul. La
mezcla de la reacción se incubó a una temperatura de 70ºC durante 2
minutos y después a una temperatura de 50ºC durante 30 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
La captura por afinidad, los lavados y la
elución se llevaron a cabo utilizando un procesador de partículas
magnético KingFisher (ThermoLabsystems) tal como se ha descrito en
la etapa analítica 1 en el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas eluidas se analizaron utilizando un
equipo de electroforesis por capilaridad ABI310 (Applied Biosystems)
tal como se ha descrito en la etapa analítica 4 en el Ejemplo 1.
Tal como se puede ver en la Fig. 10 A la señal
de la sonda Erec fue inferior a la señal de la sonda Bact cuando se
analiza el ARN de C. symbiosum E1051. Esto se debe al nivel
más bajo de etiquetado del fluoróforo de la sonda Erec cuando se
compara con la sonda Bact. El nivel de etiquetado del fluoróforo de
las sondas Bact y Chis fue igual y por lo tanto, la intensidad de
la señal de las sondas Bact y Chis son iguales cuando se analiza el
ARN de C. tyrobutyricum E908. De este modo, el nivel de la
sonda de etiquetado se puede utilizar para ajustar el límite de
detección a un nivel adecuado. En los análisis cuantitativos de la
población microbiana que comprende el ARN de C.
tyrobutyricum E908, C. symbiosum E1051 y C.
lituseburense E1853 la señal de todas las sondas Bact, Chis y
Erec dieron una señal como se esperaba. La sonda Bact identificó
todas las sondas, mientras que Chis sólo identificó la cepa E908 y
Erec identificó sólo la cepa E1051.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Como se puede observar en la Fig. 10B las sondas
Bact y Chis, que presentan un nivel igual de etiquetado por el
fluoróforo se puede utilizar para cuantificar la proporción relativa
de la bacteria que pertenece al grupo C. histolyticum (C.
tyrobutyricum E908) en una población bacteriana mezclada (C.
tyrobutyricum E908 y C. symbiosum E1051). La sonda Bact
identifica ambas cepas, mientras que Chis identificó sólo la cepa
E908.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cuantificó en una muestra la proporción
relativa de Bact etiquetadas para ARNr 16S (Amann, R.I., et
al., Appl. Environ. Microbiol. 56:1919-1925,
1990) y Chis (Franks, A.H. et al., Appl. Environ. Microbiol.
64:3336-3345, 1998) utilizando espectrometría de
masa. La organización experimental mimetiza una situación par la
detección de la sonda en la que la bacteria que pertenece al grupo
C. histolyticum forma una proporción de la población
bacteriana total. La sonda Bact reconoció todas las bacterias
(anteriormente eubacterias) (Amann, R.I., et al., Appl.
Environ. Microbiol. 56:1919-1925, 1990) mientras que
la sonda Chis reconoció las bacterias que pertenecen al grupo de
Clostridium histolyticum (Franks, A.H. et al., Appl.
Environ. Microbiol. 64:3336-3345, 1998). El
experimento sigue las etapas expuestas a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron en el experimento las sondas
etiquetadas para ARNr 16S Bact, y Chis descritas anteriormente en la
etapa preparativa 1 en el ejemplo 1 y la etapa preparativa 1 del
ejemplo 2.
Se preparó una muestra que contiene 1 \muM de
la sonda Bact y 0,1 \muM de la sonda Chis.
\vskip1.000000\baselineskip
La muestra que contiene las sondas Bact y Chis
se analizó utilizando la deserción asistida por una
matriz/espectro-
metría de masa con trayectoria de ionización (MALDI-TOF MS) según las instrucciones del fabricante (Sequenom). Las sondas se identificaron según sus masas y la cantidad relativa en la muestra cuantificada por la intensidad de la señal (altura del pico).
metría de masa con trayectoria de ionización (MALDI-TOF MS) según las instrucciones del fabricante (Sequenom). Las sondas se identificaron según sus masas y la cantidad relativa en la muestra cuantificada por la intensidad de la señal (altura del pico).
Tal como se puede apreciar en la Fig. 12 las
sondas Bact y Chis se podrían identificar como unos picos
individuales en espectrometría de masa. La sonda Chis se representa
por dos picos porque la sonda presenta dos secuencias diferentes
(la sexta base del extremo 3' es bien C o T), que por consiguiente
presenta unas masas diferentes. La señal de la sonda Bact era
aproximadamente diez veces mayor que la señal combinada para los dos
picos de la sonda Chis. Las intensidades de señal de las sondas se
correlacionan bien con sus proporciones relativas en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron el ADN genómico y oligonucleótidos
para crear unas sondas específicas de unos tamaños distintivos.
Las células Saccharomyces cerevisiae
VTT-H1346 (tipo salvaje) se hicieron crecen, se
extrajeron y el ADN genómico se aisló de las células como se
describe en el Suplemento 39, Current Protocols in Molecular Biology
(1997) 13.11.1-13.11.4, John Wiley & Sons.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron unas secuencias de sondas
específicas para un conjunto de genes utilizando unos procedimientos
y el programa informático descrito en Kivioja et al.,
Bioinformatics, 2002, julio; 18 Supl I:S199-206
(las sondas para los genes de S. cerevisiae
YAL054c-ACS 1, YCR005c-CIT2,
YMR083w-ADH3 y YBL015w-ACH1) o
utilizando los programas EBI Genomes Server (2001) en
http://www.ebi.ac.uk/genomes/. para descargar las secuencias que
codifican (CDS) para el genoma de S. cerevisiae; Steve Rozen,
Helen J. Skaletsky (1998) Primer 3. Código disponible en
http://www.genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html para
encontrar los cebadores únicos en el CDC y
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ para verificar la singularidad de
los cebadores y los productos preparados in silico en el
genoma/CDS (sonda para el gen de S. cerevisiae
YFL039c-ACT1).
Las secuencias de cebador directo y reverso
obtenidas fueron (en la dirección 5'-3').
\vskip1.000000\baselineskip
YAL054c- ACS1:
| ACAATGCCAGGGTTTGACAATG | (SEC ID nº 5) y |
| AAAGACATCGGGCCATTTGC | (SEC ID nº 6) |
\vskip1.000000\baselineskip
YCR005c-CIT2:
| TTAGCACGCCCATGAAGTGG | (SEC ID nº 7) y |
| AGGATGAAGATTTCGTGGACTTGA | (SEC ID nº 8), |
\vskip1.000000\baselineskip
YMR083w-ADH3:
| AAGCTACCAAAGGTGGCCCTC | (SEC ID nº 9) y |
| AGGCTTCTCTCGTATCAGCTCTGT | (SEC ID nº 10), |
\vskip1.000000\baselineskip
YBL015w-ACH1:
| GCCCTCTGACGACATGTCCAG | (SEC ID nº 11) y |
| ATTGGCGTGCGCGTAAATGT | (SEC ID nº 12) y |
\vskip1.000000\baselineskip
YFL039c- ACT1:
| GCCCCAGAAGAACACCCTGT | (SEC IN nº 13) y |
| ACCGGCCAAATCGATTCTCA | (SEC IN nº 14) correspondiente. |
\vskip1.000000\baselineskip
Cada par de cebador obtenido para un gen
determinado, denominado secuencias de cebador universal se unió a
los cebadores sentido y los inversos. La secuencia
5'-tgctaggcgcgccgtc-3' (SEC ID nº:
15) a un cebador sentido y la secuencia
5'-ggatgcggccgctctc-3' (SEC ID nº:
15) al cebador inverso del par cebador. De este modo, por ejemplo
para el gen YBL015w-ACH1 el cebador sentido completo
era
| 5'-tgctaggcgcgccgtcGCCCTCTGACGACATGTCCAG-3' | (SEC ID nº 17) |
\vskip1.000000\baselineskip
y el cebador inverso completo era
| 5'-ggatgcggccgctctcATTGGCGTGCGCGTAAATGT-3' | (SEC ID nº 18) |
\newpage
Los tamaños finales de las sondas producidas
utilizando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los
cebadores que contienen ambas secuencias específica y universal
fueron los siguientes:
YAL054c-ACS1: 193 bases
YCR005c-CIT2: 207 bases
YMR083w-ADH3: 248 bases
YFL039c-ACT1: 290 bases; y
YBL015w-ACH1: 453 bases.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores que consisten en unas partes
universales y específicas se adquirieron en
Sigma-Genosys Ltd Universal primers,
5'-tgctaggcgcgccgtc-3' (SEC ID nº
15) y 5'-ggatgcggccgctctc-3' (SEC ID
nº 16) con fluoróforo 6FAM^{TM} unido a 5' se adquirieron en
ThermoElectron Corporation.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo una reacción en cadena de la
polimerasa PCR para amplificar las secuencias de sondas específicas
del ADN genómico (de la etapa 1). Las condiciones del tampón se
ajustaron a los requerimientos de la ADN polimerasa, corregida (3'-
5' actividad exonucleasa) termoestable utilizada. Se utilizó el
programa de PCR consiste en 98ºC, 30 s, 10 ciclos a una temperatura
de 98ºC 10 s, 70ºC 20 s (-0,5ºC/ ciclo), 72ºC 25s, 20 ciclos de 98ºC
10 s, 65ºC 20s, 72ºC 25 s, 72ºC 10 minutos.
Posteriormente se purificaron las reacciones de
PCR utilizando el Qiaquick PCR Purification Kit Protocol
(QIAquick^{R} Spin Handbook, marzo 2001, QIAGEN). Los fragmentos de sondas se hacen correr en unos gel de azarosa al 2,5-4% (teñido con bromuro de etidio) en un gel de electroforesis horizontal a 75 V durante 12 h, se aislaron y se purificaron más utilizando el QIAquick Gel Extraction Kit Protocol (QIAquick^{R} Spin Handbook, marzo 2001, QIAGEN).
(QIAquick^{R} Spin Handbook, marzo 2001, QIAGEN). Los fragmentos de sondas se hacen correr en unos gel de azarosa al 2,5-4% (teñido con bromuro de etidio) en un gel de electroforesis horizontal a 75 V durante 12 h, se aislaron y se purificaron más utilizando el QIAquick Gel Extraction Kit Protocol (QIAquick^{R} Spin Handbook, marzo 2001, QIAGEN).
La etiqueta fluorescente se introdujo en las
sondas durante una segunda reacción de PCR. Los cebadores
universales los fluoróforos unidos en 5', 6FAM^{TM}, se
utilizaron para amplificar las sondas purificadas bajo dichas
condiciones esencialmente similares a las descritas anteriormente.
Posteriormente las reacción de PCR se purificaron utilizando el
QIAquick PCR Purification Kit Protocol (QIAquick^{R} Spin
Handbook, marzo 2001, QIAGEN). Después se analizaron las sondas en
un secuenciador de ADN por electroforesis por capilaridad, ABI
PRISM^{R} 310, Analizador genético (Applied Biosystems) que
utiliza un programa informático de análisis GeneScan^{R} (Applied
Biosystems). Las muestras de sondas se diluyeron a una concentración
adecuada y se mezclaron con una cantidad adecuada de estándar de
tamaño GeneScan-500 (Applied Biosystems) y se añadió
la formamida para obtener un volumen de inyección
adecuado.
adecuado.
Se utilizaron Agilent 2100 Bionalyzer^{R} y el
kit ADN 500 LabChip (# 5064-8284, Agilent) para
monitorizar la calidad y la cantidad de los productos purificados
después de cada PCR.
La preparación de las sondas por PCR se describe
en la Fig. 13.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células de S. cerevisiae
VTT-H2217 se hicieron crecer en un medio de
levaduras con nitrógeno base (Difco, #291940) con aminoácidos
esenciales (modificación de Sherman et al., Methods in yeast
genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983) y con glucosa al 3%,
a una D.O de 3,5-4,0 y se aisló el ARN mensajero
según el protocolo descrito en Promega Notes Magazine nº 41, p. 14
(1993). Se comprobaron el rendimiento y la integridad de ARNm
utilizando un Agilent 2100 Bioanalyzer^{R} y el ARN 6000 Nano
Labchip Kit (# 5064-4476, Agilent).
El experimento sigue las etapas expuestas a
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Los ensayos de hibridación se ensamblaron en una
placa de PCR (#AB-0600, Abgene) que combina 2x una
solución de hibridación: NaCl 1,2 M - citrato sódico 0,12 M, pH 7),
SDS 0,2% (p/v), formamida al 40% (p/v) y ficoll al 0,4% (p/v),
polivinilpirrolidona 0,04% (p/v), albúmina bovina sérica 0,04% (p/v)
(2 x Solución de Denhardt), la mezcla de la sonda (que contiene 100
fmol de cada sonda etiquetada con 6FAM^{TM}), 200, 400 ó 600 ng
de ARNm (cada cantidad duplicada en A y B), 3,5 fmol/(ng de ARNm) de
una sonda oligo(dT) biotinilada (Z5261, Promega) y agua
libre de ARNasa para diluir la solución de hibridación a 1x en el
volumen final. El volumen final típico de un ensayo es de
30-60 \mul.
\vskip1.000000\baselineskip
Las placas de PCR se sellaron utilizando un
papel termosellado despegable (EASY Peel, AB-0745
Abgene) y Thermosealer (AB-0384/240 Abgene). Las
mezclas de ensayo ensambladas se incubaron en un bloque térmico (DNA
Engine^{TM} PCT200, MJ Research) a una temperatura de 75ºC
durante 5 minutos, a una temperatura de 58ºC durante 8 horas y a
una temperatura de 45ºC durante 8 horas. Finalmente, las reacciones
de hibridación se incubaron a temperatura ambiente durante 10
minutos (para hibridar la sonda Oligo (dT) biotinilada a los
ARNm).
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la hibridación, se utilizó el procesador de
partículas magnético KingFisher (ThermoLabsystems) para llevar a
cabo la captura por afinidad, los lavados y la elución moviendo las
partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina de una etapa a
otra en una placa de microtitulación KingFisher según el protocolo
programada. Las soluciones de cada etapa se pipetearon antes a unos
pocillos específicos en la placa de microtitulación y el proceso se
llevó a cabo a temperatura ambiente.
Las reacciones de hibridación de los pocillos de
incubación se pasaron a unos pocillos específicos en una placa
KingFisher. Para transferir las mezclas de hibridación
cuantitativamente en unos pocillos de KingFisher, se lavaron los
pocillos de incubación en la etapa 2 una con una solución de un
volumen de hibridación 1,5 x de SSC 0,5 x (NaCl 0,075 M - citrato
sódico 7,5 mM, pH 6,5), SDS 0,1% y se añadieron las soluciones de
lavado a los mismos pocillos KingFisher con las mezclas de
hibridación.
Los Oligo(dT) biotinilados: los híbridos
ARNm - sonda se recogieron en partículas magnéticas recubiertas de
estreptavidina (Strepavidin MagneSphere^{R} Paramagnetic
Particles, Z5241, Promega) durante 30 minutos. Tras la captura de
las partículas se lavaron tres veces con 0,2 X SCC -SDS 0,1% y dos
veces con 0,1 X SCC- SDS 0,1% y las sondas se eluyeron con 30
\mul de formamida. Por consiguiente, la formamida se evaporó en un
liofilizador y las sondas se resuspendieron en 5 \mul de agua.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas eluidas se analizaron en una
secuenciador de ADN por electroforesis por capilaridad, ABI
PRISM^{R} 310, Analizador genético (Applied Biosystems) que
utiliza un programa informático de análisis GeneScan^{R} (Applied
Biosystems). Las muestras resuspendidas se mezclaron con una
cantidad conocida de estándar de tamaño GeneScan-500
(Applied Biosystems) y se añadió la formamida para obtener un
volumen de inyección adecuado.
Las sondas eluidas se identificaron basándose en
su comportamiento de migración en la electroforesis por capilaridad,
comparada con el estándar de tamaño y el desplazamiento de las
sondas únicas en la etapa preparativa 3 con las mismas condiciones
de desplazamiento. La cantidad de sondas eluidas se determinó según
el área del pico (unidades de área de fluorescencia, AU). El
resultado se leyó en un electroferograma y del archivo de datos. Se
calculó la proporción de fluorescencia (AU) de las sondas YBL015w-
ACH1 (tamaño 453 bases) y YCR005c- CIT2 (tamaño 207 bases) en todos
los ensayos (cantidades de ARNm 200, 400 y 600 ng) (duplicados A y
B) se muestran en la Tabla 4, así como la media y la desviación
estándar de las proporciones en los seis ensayos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las etapas preparativas se realizaron tal como
se describe en el Ejemplo 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Las etapas analíticas de las sondas difieren de
las del Ejemplo 6 como se describe a continuación en el diseño
experimental para detectar unas cantidades muy pequeñas de ARN.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ensayos de hibridación se ensamblaron tal
como se ha descrito en la etapa analítica 1 en el Ejemplo 6
(cantidades de cada ARNm 200, 400 y 600 mg por duplicado C y D).
\vskip1.000000\baselineskip
La desnaturalización y la hibridación se
realizaron tal como se ha descrito en la etapa analítica 2 en el
Ejemplo 6.
\vskip1.000000\baselineskip
La captura por afinidad, los lavados y la
elución tal como se ha descrito en la etapa analítica 3 en el
Ejemplo 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas eluidas (resuspendidas en 5 ul de
agua) se amplificaron utilizando unos cebadores etiquetados con
fluoróforo (descrito en la etapa preparativa 2 en el Ejemplo 6) en
una reacción de PCR. Las condiciones del tampón se ajustaron a los
requerimientos de la ADN polimerasa, corregida
(3'-5' actividad exonucleasa) termoestable
utilizada. Se utilizó el programa de PCR consiste en por ejemplo
98ºC, 30 s, 15 ciclos a una temperatura de 98ºC 10 s, 70ºC 20 s. Se
realizó un control negativo (sin molde) utilizando el mismo programa
de PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Posteriormente se purificaron las reacciones e
PCR utilizando el QIAquick PCR Purification Kit Protocol
(QIAquick^{R} Spin Handbook, marzo 2001, QIAGEN).
(QIAquick^{R} Spin Handbook, marzo 2001, QIAGEN).
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas purificadas se diluyeron en agua
1:100. El control negativo no se diluyó.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas diluidas se identificaron y se
analizaron en un secuenciador de ADN por electroforesis por
capilaridad, ABI PRISM^{R} 310, Analizador genético (Applied
Biosystems) con un programa informático de análisis GeneScan^{R}
(Applied Biosystems) con las mismas condiciones que las de las
sondas eluidas en la etapa analítica 4 en el Ejemplo 6. Se
mezclaron 0,5 \mul de las muestras diluidas o 1 \mul del control
negativo no diluido con una cantidad conocida de estándar de tamaño
GeneScan-500 (Applied Biosystems) y se añadió la
formamida para obtener un volumen de inyección adecuado.
Las sondas amplificadas y diluidas se
identificaron basándose en su comportamiento de migración en la
electroforesis por capilaridad, comparada con el estándar de tamaño
y el desplazamiento de las sondas únicas en la etapa preparativa 3
con las mismas condiciones de desplazamiento. La cantidad de sondas
amplificadas y diluidas se determinó según el área del pico (AU).
El resultado se leyó en un electroferograma y del archivo de
datos.
Los electroferogramas de los ensayos ensamblados
con 600 ng de ARNm (etapa analítica 1) sin amplificación (Ejemplo
6) y con amplificación y amplificación de un control negativo se
muestran en la Figura 14. En la muestra no amplificada sólo se
puede ver claramente el pico de la sonda
YCR005c-CIT2 (207 bases). En los ensayos
amplificados (y diluidos) YCR005c-CIT2 se puede ver
como un pico fuerte y también se ven claramente los picos de las
sondas YAL054c-ACS1 (193 bases) y
YFL039c-ACT1 (tamaño 290 bases) así como trazas de
picos de los genes de las sondas YMR083w-ADH3 (248
bases). El control negativo de la PCR no mostró amplificación de las
sondas en este punto.
Se calculó la proporción de sonda de
fluorescencia (AU) de las sondas YBL015w- ACH1 (tamaño 453 bases) y
YCR005c-CIT2 (tamaño 207 bases) en todos los ensayos
amplificados (cantidades de ARNm 200, 400 y 600 ng) (duplicados C y
D) como se muestra en la Tabla 5, así como la media y la desviación
estándar de las proporciones en los seis ensayos. Las proporciones
medias de las dos sondas calculadas a partir de los ensayos
amplificados (Tabla 5) y de los ensayos no amplificados (Tabla 4) se
pudieron comparar bien teniendo en cuenta que la purificación, la
dilución y la falta de precisión en el pipeteado de volúmenes
pequeños puede producir un sesgo en la cuantificación.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Valtion Teknillinen tutkimuslaitos
(VTT)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la determinación
cuantitativa de polinucleótidos en una mezcla
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> A2469PC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FI20021325
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-07-05
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Bact, una secuencia ARNr bacteriana
conservada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amann et al., 1990
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgcctccc gtaggagt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Erec, secuencia ARNr, grupo
filogenético bacteriano Clostridium
cocoides-Eubacterium rectale
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Franks et al., 1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcttcttagt cargtaccg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Erec-5A, una
secuencia ARNr con una extensión de cinco As adicionales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> R = A/G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcttcttagt cargtaccga aaaa
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Chis, secuencia ARNr, grupo
filogenético bacteriano Clostridium histolyticum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Franks et al., 1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> R = C/T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttatgcggta ttaatctrcc ttt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaatgccag ggtttgacaa tg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagacatcg ggccatttgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttagcacgcc catgaagtgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggatgaaga tttcgtggac ttga
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagctaccaa aggtggccct c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggcttctct cgtatcagct ctgt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccctctgac gacatgtcca g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattggcgtgc gcgtaaatgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccccagaag aacaccctgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccggccaaa tcgattctca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctaggcgc gccgtc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatgcggcc gctctc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctaggcgc gccgtcgccc tctgacgaca tgtccag
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatgcggcc gctctcattg gcgtgcgcgt aaatgt
\hfill36
Claims (35)
1. Procedimiento para la determinación de unas
cantidades o proporciones relativas de más de una secuencia de
polinucleótidos individuales o sus subgrupos en una mezcla de
polinucleótidos que utiliza una hibridación en solución facilitada
por afinidad cuantitativa en combinación con el fraccionamiento
basado en el tamaño o la masa para la obtención de la resolución,
caracterizado porque el procedimiento comprende las etapas
siguientes:
- (a)
- proporcionar uno o más pool organizados con un número opcional predeterminado de sondas de polinucleótidos solubles, siendo complementaria cada sonda de una secuencia de polinucleótidos diana individual en una muestra, que está presente en un exceso molar comparado con las secuencias de polinucleótidos diana, y que presenta aproximadamente el mismo número de nucleótidos que hibridan, cuyas sondas se pueden distinguir proporcionando a dichas sondas una o más etiquetas que permiten la resolución, separación o sistemas de grabación sin interferir con la reacción de hibridación o de captura;
- (b)
- proporcionar a las secuencias de polinucleótidos diana aisladas de la muestra que comprende una muestra de secuencias de ribopolinucleótidos diana por lo menos una etiqueta de afinidad, y a continuación
- (c)
- realizar las etapas (i) y (ii) simultáneamente, o secuencialmente en el orden (i) y (ii), en el que las etapas (i) y (ii) comprenden
- (i)
- permitir que la reacción de hibridación tenga lugar entre el exceso molar de las sondas solubles de la etapa (a) y las secuencias de ribopolinucleótidos diana de la etapa (b) que conduce a la formación de unos híbridos solubles;
- (ii)
- recuperar los híbridos, que se han formado cuantitativamente en la etapa (i) mediante la captura de dichos híbridos en una herramienta que facilita la separación provista de un par de afinidad de la etiqueta de afinidad de las secuencias de polinucleótidos diana;
- (d)
- liberar cuantitativamente las sondas en una forma no modificada de los híbridos capturados a la herramienta que facilita la separación;
- (e)
- separar y registrar las cantidades o proporciones relativas de las sondas, que se han diferenciado cuya cantidad corresponde a la cantidad de secuencias de ribopolinucleótido en la mezcla de polinucleótidos en la muestra.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque para la determinación de las variaciones
dinámicas de las cantidades o proporciones relativas de los
transcritos de polinucleótidos o sus subgrupos en un organismo
individual, las sondas solubles están diseñadas a partir de
secuencias de ribopolinucleótidos específicas de especies o grupos
que hibridan con unas regiones más o menos conservadas o
hipervariables seleccionadas de entre las secuencias intragenómicas
específicas de subgrupos, especies o subespecies de transcriptos
expresados en el organismo.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque las secuencias de ribopolinucleótidos
diana aisladas de entre la muestra que comprende la población diana
mezclada son ARN mensajero (ARNm).
4. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque para la determinación de las variaciones
dinámicas en las cantidades o proporciones relativas de las
secuencias de ribopolinucleótidos que representan sus organismos o
subpoblaciones individuales en una población diana, las sondas
solubles están diseñadas a partir de las secuencias de
ribopolinucleótidos específicos de especies o grupos que hibridan
con unas regiones seleccionadas más o menos conservadas o
hipervariables de entre las secuencias intragenómicas específicas
y/o que representan diferentes niveles filogenéticos que permiten la
identificación de subgrupos, especies, subespecies en una población
diana mezclada.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque las secuencias de polinucleótidos diana
aisladas de la muestra que comprende la población diana mezclada son
ARN ribosómico.
6. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la etiqueta que permite la resolución
actúa simultáneamente como etiqueta trazadora, de afinidad y/o de
cebador.
7. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la etiqueta que permite la resolución se
puede separar en un medio de selección.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque la etiqueta que permite la resolución
que actúa asimismo como etiqueta de afinidad y/o de cebador es un
residuo de oligonucleótido.
9. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque la etiqueta que permite la resolución
que puede actuar asimismo como etiqueta de afinidad y/o etiqueta
trazadora es un aminoácido o un péptido.
\newpage
10. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque la etiqueta que permite la resolución
que puede actuar asimismo como etiqueta trazadora se selecciona de
entre el grupo constituido por etiquetas registrables por
fluorescencia, luminiscencia, absorción de infrarrojos, propiedades
electromagnéticas, radioactividad y actividad enzimática.
11. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el número opcional predeterminado de
sondas solubles en el pool es más de uno, preferentemente más de
cinco, más preferentemente más de diez.
12. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la cantidad de sondas individuales
liberadas y capturadas cuantitativamente se registra con un sistema
de grabación completa o parcialmente automático, que se selecciona
basándose en las etiquetas que permiten la resolución aplicada.
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque el sistema de registro se selecciona
basándose en las etiquetas que permiten la resolución y comprende la
espectrometría de masas, las técnicas electroforéticas o
cromatográficas.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la cantidad de
sondas cebador marcadas recuperadas cuantitativamente se liberan y
se amplifican posteriormente y opcionalmente son marcadas por un
trazador antes, después o durante la reacción de PCR y a
continuación se registran con un sistema de grabación seleccionado
basado en las etiquetas que permiten la resolución.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque las sondas cebador marcadas presentan
unos cebadores con unas partes específicas y universales.
16. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque las sondas son fragmentos de ADN
estable, secuencias de polinucleótidos sintéticas o recombinantes o
secuencias de polinucleótidos modificadas.
17. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende una valoración comparativa,
cuantitativa de las variaciones en las cantidades de unas secuencias
de polinucleótidos individuales u organismos y sus subgrupos en una
población o mezcla de secuencias de polinucleótidos proporcionando
un conjunto de varios kits de ensayo, por lo menos un kit de ensayo
para cada muestra que se va a comparar, en el que cada uno de dichos
kits de ensayo está provisto de uno o más pool organizados idénticos
con un número opcional predeterminado de sondas solubles, siendo
complementaria cada sonda a la secuencia de ribopolinucleótido diana
en la muestra que está presente en exceso molar comparado con las
secuencias de polinucleótidos diana en las muestras, y presentando
aproximadamente el mismo número de nucléotidos que hibridan, cuyas
sondas se diferencian al proporcionar a cada sonda una o más
etiquetas que permiten la resolución, que cambian el tamaño o la
masa y de este modo proporcionan a las sondas unas movilidades
diferentes en los sistemas de fraccionamiento, separación o registro
sin interferir en la reacción de hibridación o captura, estando
colocado cada pool de sondas de un modo organizado en sus propios
recipientes, que están separados o unidos.
18. Procedimiento según la reivindicación 17,
caracterizado porque presenta unos kits de ensayo
individuales, en el que la etiqueta que permite la resolución no es
una etiqueta trazadora, estando provisto un conjunto de kits de
múltiples ensayos de unas etiquetas trazadoras diferenciándose de
las otras por la señal emitida.
19. Utilización de un kit de ensayo para llevar
a cabo un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 18,
caracterizada porque el kit de ensayo comprende uno o más
pool organizados, con un número opcional predeterminado de sondas
solubles, siendo complementaria cada sonda de la secuencia de
ribopolinucleótido diana individual, que está presente en un exceso
molar comparado con las secuencias de ribopolinucleótidos diana en
las muestras, y presentando aproximadamente el mismo número de
nucléotidos que hibridan, cuyas sondas se diferencian al
proporcionar a cada sonda una o más etiquetas que permiten la
resolución, que cambian el tamaño o la masa y proporcionando de este
modo a las sondas unas movilidades diferentes en los sistemas de
fraccionamiento, separación o registro sin interferir en la reacción
de hibridación o captura, estando colocado cada pool de sondas de un
modo organizado en sus propios recipientes, que están separados o
unidos.
20. Utilización según la reivindicación 19,
caracterizada porque para la determinación de las variaciones
dinámicas en las cantidades o proporciones relativas de los
transcriptos de polinucleótidos o sus subgrupos en un organismo
individual, las sondas solubles están diseñadas a partir de unas
secuencias de polinucleótido específicas de especies o grupos que
hibridan con una región seleccionada más o menos conservada o
hipervariable procedente de secuencias intragenómicas específicas
para subgrupos, especies, subespecies de transcritos expresados en
el organismo.
21. Utilización según la reivindicación 19,
caracterizada porque las secuencias de polinucleótidos diana
aisladas de la muestra que comprende la población diana mezclada son
ARN mensajero (ARNm).
22. Utilización según la reivindicación 19,
caracterizada porque para la determinación de las variaciones
dinámicas en las cantidades o las proporciones relativas de las
secuencias de ribonucleótidos que representan unos organismos
individuales o sus subpoblaciones en la población diana, las sondas
solubles están diseñadas a partir de secuencias de
ribopolinucleótidos específicas de especies o grupos que hibridan
con unas regiones seleccionadas más o menos conservadas o
hipervariables de las secuencias intragenómicas específicas y/o que
representan diferentes niveles filogenéticos que permiten la
identificación de subgrupos, especies, subespecies dentro de la
población diana mezclada.
23. Utilización según la reivindicación 22,
caracterizada porque las secuencias de polinucleótidos diana
aisladas de la muestra que comprende la población diana mezclada son
ARN ribosómico.
24. Utilización según la reivindicación 19,
caracterizada porque la etiqueta que permite la resolución
puede actuar simultáneamente como una etiqueta trazadora, de
afinidad o de cebador.
25. Utilización según la reivindicación 24,
caracterizada porque la etiqueta que permite la resolución se
puede separar en un medio de selección.
26. Utilización según la reivindicación 25,
caracterizada porque la etiqueta que permite la resolución
que además puede actuar como una etiqueta de afinidad y/o de
etiqueta de cebador es un residuo de oligonucleótido.
27. Utilización según la reivindicación 25,
caracterizada porque la etiqueta que permite la resolución
que además puede actuar como una etiqueta de afinidad y/o de
etiqueta trazadora es un aminoácido o un péptido.
28. Utilización según la reivindicación 25,
caracterizada porque la etiqueta que permite la resolución
que además puede actuar como una etiqueta trazadora se selecciona de
entre el grupo constituido por etiquetas registrables por
fluorescencia, luminiscencia, absorción de infrarrojos, propiedades
electromagnéticas, radioactividad y actividad enzimática.
29. Utilización según la reivindicación 19,
caracterizada porque el número opcional predeterminado de
sondas solubles en el pool es más de uno, preferentemente más de
cinco, más preferentemente más de diez.
30. Utilización según la reivindicación 19,
caracterizada porque los pool solubles de sondas se colocan
en unos pocillos en una placa de microtitulación.
31. Utilización según la reivindicación 19,
caracterizada porque las sondas son fragmentos de ADN
estables, secuencias de polinucleótidos sintéticas, recombinantes o
modificadas.
32. Utilización según la reivindicación 19,
caracterizada por la valoración comparativa, cuantitativa
in vitro de las variaciones en las cantidades de secuencias
de ribonucleótidos individuales u organismos y sus subgrupos en una
población o mezcla de secuencias de polinucleótidos comprende un
conjunto de kits de ensayo, presentando por lo menos un kit de
ensayo idéntico unos pool de sondas idénticos de cada muestra que se
va a comparar.
33. Utilización según la reivindicación 32,
caracterizada porque cada kit de ensayo individual en el
conjunto de varios kits de ensayo está provisto de unas etiquetas
trazadoras, que se diferencian las unas de las otras por la señal
emitida.
34. Utilización según la reivindicación 32 para
la valoración in vitro de las condiciones higiénicas y las
situaciones epidemiológicas, los efectos de estímulos externos o
modalidades de tratamiento en una población microbiana.
35. Utilización según la reivindicación 34, en
la que los estímulos externos o el tratamiento se selecciona de
entre el grupo constituido por un tratamiento con antibióticos o
medidas higiénicas.
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