JP5621992B2

JP5621992B2 - カンジダ種を検出および同定するための方法

Info

Publication number: JP5621992B2
Application number: JP2011523755A
Authority: JP
Inventors: ヘンフォンセオウ; タンティアンルンレスリエ; ペイペイチョン
Original assignee: ユニヴァースィティプトラマレーシア
Priority date: 2008-08-18
Filing date: 2009-07-31
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2029-07-31
Also published as: JP2012500019A; EP2315853A1; WO2010021534A1; US20130034856A1; EP2315853B1; EP2315853A4

Description

本発明は、カンジダ種の検出および同定のために使用される増幅オリゴヌクレオチドの設計および使用、ならびにカンジダ種の迅速な検出・同定方法に関する。より具体的には、本発明は、１０種のカンジダ種の検出および同定に適用できるカスタム設計のプライマー配列、ならびに１０種のカンジダ種を検出および同定するための迅速な半ネステッドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法に関する。

カンジダは、通常内部共生生物または片利共生生物である広範な種を含む酵母の属である。しかしながら、カンジダ属には、病原性であり、ヒトやその他の動物、特に免疫不全患者でカンジダ症または鵞口瘡を引き起こすかなりの数の種が確かに含まれる。｛がこうそう｝カンジダ種は、現在、米国における院内血流感染症の４番目に多い原因である。

この属により引き起こされる多くの種類の疾患のうちの１つは、侵襲性カンジダ症である。侵襲性カンジダ症は、カンジダ種が血中に入って、血流を引き起こし、その後、全身に広がるときに発生する真菌感染症である。これは、「播種性カンジダ症」、「全身性カンジダ症」、または「血行性カンジダ症」としても知られる。抗新生物剤や免疫抑制剤、広範囲の抗生物質、補綴装置、移植や侵襲性の高い手術を使用することで、これらの感染症症例の発生率が上昇していることが報告されている。さらに、火傷患者、好中球減少症の患者、ＨＩＶ感染患者、および膵炎患者などの要素も、これらの症例の上昇傾向の一因である。

カンジダ属には、侵襲性カンジダ症を引き起こす多くの種、すなわち、Ｃ．アルビカンス、Ｃ．トロピカリス、Ｃ．グラブラタ、Ｃ．パラプシロシス、およびＣ．クルセイが存在する。これらの種は各々、抗真菌薬に対して異なる感受性パターンを有し、いくつかの種は、これらの薬に対して抵抗性ですらあるので、望ましくない副作用をもたらす抗真菌薬投与を誤って選択しないように、これらの薬を識別することが必須である。

これらの酵母に対するより強力な抗真菌薬を探索する努力の他に、診断は、不要な副作用、病院出費、および死亡を減らす上で常にその役割を果たしてきた。今日まで、真菌診断の最も信頼できる方法は、培養と顕微鏡法である。血液からカンジダを検出する従来の検出方法は血液培養によるものであり、これは５８％の感度を有すると報告された。血清学的方法も侵襲性カンジダ症を診断する手段の１つである。様々な感度と特異性を有するこれらの方法に関する多くの出版物が出されている。それでもやはり、従来の方法から最新の方法までの様々な方法の組合せによって診断結果の転帰を実際に改善することができることを記載した出版物が出される傾向にある。分子的検出の登場により、侵襲性カンジダ症の診断は極めて顕著に改善している。

カンジダ種の検出と同定の方法に関する従来技術に優るいくつかの特許化された技術がある。これらの方法のほとんどは、最も一般的なカンジダ種（すなわち、Ｃ．アルビカンス）のみを検出するための方法に関する。

米国特許ＵＳ５９１０４０９号には、生体試料中の真菌病原体を検出するための方法および試薬が開示されている。この発明は、生体試料をＣ．アルビカンスの存在について高感度にかつ選択的にスクリーニングするための材料および方法を提供している。この発明には、ＤＮＡ増幅のための核酸、試薬、およびプライマーが開示されている。増幅は、ＤＮＡを含むＣ．アルビカンス由来の５２６塩基対のヌクレオチド配列を特異的に標的とする。

Ｃ．アルビカンスの別の検出方法は、米国特許ＵＳ５５４５５２５号により具現化されている。この発明によれば、ＤＮＡプローブは、検出用のＰＣＲ標的として使用するのに適している。生物の存在は、電気泳動ゲルでのアンプリコン検出またはハイブリダイゼーションにより決定される。しかしながら、この発明されたプローブと方法は、Ｃ．アルビカンスの２５ＳｒＲＮＡを標的とするよう設計されている。これは、微量のＣ．ステラトイデアも検出する。

カンジダ種を検出および同定するための方法および組成物に関連して興味深いのは、米国特許ＵＳ２００８１０２４４９号である。発明された組成物は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用のフォワードプライマーとリバースプライマーの対を含むオリゴヌクレオチドの組合せであり、各々のプライマー対は、この種のうちの１つだけに特異的なアンプリコンの合成を開始することができる。この発明には、これらのアンプリコンを検出することができるプローブや、アンプリコン中のヌクレオチド配列を決定するためのシークエンシングプライマーも開示されている。この発明の別の実施形態は、核酸を単離し、ヌクレオチドを増幅し、アンプリコンの存在を確認するためにプロービングし、ヌクレオチド配列を決定するための方法である。しかしながら、開示された方法は、Ｃ．アルビカンス、Ｃ．グラブラタ、Ｃ．パラプシロシス、およびＣ．トロピカリスを含む、４つの種のみを特異的に同定するために使用することができる。

米国特許ＵＳ５４２６０２６号に具現化されている１つのプライマー対と４つの種特異的プローブとを用いる、４つの医学的に重要なカンジダ種の別のＰＣＲ同定がある。この発明では、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｃ．アルビカンス、Ｃ．グラブラタ、Ｃ．パラプシロシス、およびＣ．トロピカリスを増幅および識別することができる。しかしながら、開示された同定法は、アンプリコンの長さの比較を唯一の拠り所にしている。種特異的プローブはＰＣＲ増幅産物によって作製される。

別の米国特許ＵＳ６０１７６９９号には、ＰＣＲによる重要なカンジダ種の同定と定量化のプロセスも開示されている。この発明は、ＰＣＲとともに利用された場合に、５つの医学的に重要なカンジダ種に由来するＤＮＡを増幅および識別することができる１組のＤＮＡプライマーに関する。この発明の別の実施形態では、プライマーにより生成されたＰＣＲ増幅産物は、５つのカンジダ種を検出および確認することもできる特異的プローブを作製するために使用することもできる。この方法は、試料中のカンジダの量を定量的に測定し、Ｃ．アルビカンス、Ｃ．パラプシロシス、Ｃ．トロピカリス、Ｃ．グラブラタ、およびＣ．クルセイによって引き起こされる感染を治療するための抗真菌剤の適切な投薬量または種類を選択する技術であるので、これにより感染の早期診断と治療が可能になる。

Ｃ．アルビカンスの検出に関するさらに別の発明が、カナダ特許ＣＡ２６０８７４２号に開示されている。この発明では、カンジダの内部転写スペーサー−１（ＩＴＳ１）領域と内部転写スペーサー−２（ＩＴＳ２）領域から単離されたＤＮＡフラグメントが使用されている。分子的方法は、保存された配列または変化する配列が真菌リボソーム遺伝子に存在することと、１つ１つのカンジダに特異的な内部プライマーとを利用して、より広範なカンジダ種を検出および同定するために、多重変異体中でのＰＣＲをベースとしている。

これらの特許化された技術によって開示されている方法には広範な分子的手法が含まれるが、特異的に同定されるカンジダ種はほんの数種類しかない。感染の早期診断と治療を確実にするために、臨床的に重要なカンジダ種を検出および同定するためのより革新的な方法であって、それぞれの特許化された技術よりも迅速でかつ使い易い方法が本発明により開発される必要性があることが明白である。

本発明の第１の目的は、カンジダ種を種特異的に検出および同定するための増幅オリゴヌクレオチドまたはプライマーのセットを開発することである。

本発明の別の目的は、１０種の臨床的に重要なカンジダ種の検出および同定のためのプライマーセットを有する診断キットを提供することである。

本発明のさらに別の目的は、Ｃ．アルビカンス、Ｃ．デュブリニエンシス、Ｃ．グラブラタ、Ｃ．ギリエルモンディイ、Ｃ．ケフィル、Ｃ．クルセイ、Ｃ．ルシタニアエ、Ｃ．パラプシロシス、Ｃ．ルゴサ、およびＣ．トロピカリスを含む、１０種の臨床的に重要なカンジダ種を種特異的に検出および同定するための方法である。

本発明はまた、カンジダ種のＩＴＳ１およびＩＴＳ２を標的とするカスタム設計の増幅オリゴヌクレオチドまたはプライマーを用いてカンジダ種を種特異的に検出および同定するための迅速な半ネステッドＰＣＲ法を提供することを目的とする。

前述の目的のうちの少なくとも１つが、完全にまたは部分的に、本発明により達成されるが、本発明の実施形態の１つには、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、もしくは配列番号１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号２２からなる群から選択される任意のその相補配列を含む単離されたオリゴヌクレオチドが記載されている。

本発明の別の実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、もしくは配列番号１０からなる群から選択される増幅ヌクレオチド配列、または配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号２２からなる群から選択される任意のその相補配列を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの増幅のためのプライマーである。

本発明のさらに別の実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、もしくは配列番号１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号２２からなる群から選択される任意のその相補配列を有するプライマーのうちの少なくとも１つを含む、生体試料中のカンジダ種を検出および同定するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの増幅キットである。

さらなる実施形態では、本発明は、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号１２のヌクレオチド配列を有するプライマーセットを用いて生体試料中のカンジダ種の保存ＤＮＡ断片を増幅する工程と、増幅した保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するプライマーセットと接触させる工程とを含む、カンジダ種を検出および同定するための方法を開示する。

本発明の好ましい実施形態の１つは、増幅した保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補配列を有するプライマーセットと接触させることによって、カンジダ・アルビカンスを種特異的に検出および同定するための方法を開示する。

本発明の別の好ましい実施形態は、増幅した保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号２のヌクレオチド配列またはその相補配列を有するプライマーセットと接触させることによって、カンジダ・デュブリニエンシスを種特異的に検出および同定するための方法を開示する。

本発明のさらに別の好ましい実施形態は、増幅した保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号３のヌクレオチド配列またはその相補配列を有するプライマーセットと接触させることによって、カンジダ・グラブラタを種特異的に検出および同定するための方法を開示する。

本発明のさらに別の好ましい実施形態は、増幅した保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号４のヌクレオチド配列またはその相補配列を有するプライマーセットと接触させることによって、カンジダ・ギリエルモンディイを種特異的に検出および同定するための方法である。

本発明はまた、増幅した保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号５のヌクレオチド配列またはその相補配列を有するプライマーセットと接触させることによって、カンジダ・ケフィルを種特異的に検出および同定するための方法を開示する。

本発明の別の好ましい実施形態は、増幅した保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号６のヌクレオチド配列またはその相補配列を有するプライマーセットと接触させることによって、カンジダ・クルセイを種特異的に検出および同定するための方法である。

好ましくは、カンジダ・ルシタニアエは、増幅した保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号７のヌクレオチド配列またはその相補配列を有するプライマーセットと接触させることによって、種特異的に検出および同定することができる。

好ましくは、カンジダ・パラプシロシスは、増幅した保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号８のヌクレオチド配列またはその相補配列を有するプライマーセットと接触させることによって、種特異的に検出および同定することができる。

好ましくは、カンジダ・ルゴサは、増幅した保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号９のヌクレオチド配列またはその相補配列を有するプライマーセットと接触させることによって、種特異的に検出および同定することができる。

好ましくは、カンジダ・トロピカリスは、増幅した保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号１０のヌクレオチド配列またはその相補配列を有するプライマーセットと接触させることによって、種特異的に検出および同定することができる。

発明された増幅オリゴヌクレオチドは、血液、血液由来試料、組織、組織由来試料、その他の体液および体試料などのヒト由来試験試料中のカンジダ核酸の存在を検出するために有用である。

本発明では、半ネステッドＰＣＲ法が適用されるが、半ネステッドＰＣＲによって偽陽性の発生が排除され、第１ラウンドのＰＣＲ時に試料中に見られる任意の阻害因子が希釈されるので、アッセイ感度を高めることができる。

当業者であれば、本発明が、目的を実行し、言及された結果および利点、ならびに本発明に内在する結果および利点を得るのによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に記載される実施形態は、本発明の範囲に対する限定を意図するものではない。

本発明の理解を容易にするために、付随する図面に好ましい実施形態が示されているが、これらの好ましい実施形態を検討することにより、以下の説明と結び付けて考えたとき、本発明、その構成および作用、ならびにその利点の多くは、容易に理解され、認められるであろう。

本発明の好ましい実施形態により説明されるカンジダ種の検出および同定のために使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。Ｃ．アルビカンスの半ネステッドＰＣＲ検出の感度試験の結果を示す。レーン：１、１０^６細胞；２、１０^５細胞；３、１０^４細胞；４、１０^３細胞；５、１０^２細胞；６、１０^１細胞；７、１０^０細胞；Ｎ１、鋳型なし対照の第１ラウンドＰＣＲ；Ｍ、１００ｂｐＤＮＡラダーマーカー；およびＮ２、鋳型なし対照の第２ラウンドＰＣＲ。Ｃ．デュブリニエンシスの半ネステッドＰＣＲ検出の感度試験の結果を示す。レーン：１、１０^６細胞；２、１０^５細胞；３、１０^４細胞；４、１０^３細胞；５、１０^２細胞；６、１０^１細胞；７、１０^０細胞；Ｎ１、鋳型なし対照の第１ラウンドＰＣＲ；Ｍ、１００ｂｐＤＮＡラダーマーカー；およびＮ２、鋳型なし対照の第２ラウンドＰＣＲ。Ｃ．グラブラタの半ネステッドＰＣＲ検出の感度試験の結果を示す。レーン：１、１０^６細胞；２、１０^５細胞；３、１０^４細胞；４、１０^３細胞；５、１０^２細胞；６、１０^１細胞；７、１０^０細胞；Ｎ１、鋳型なし対照の第１ラウンドＰＣＲ；Ｎ２、鋳型なし対照の第２ラウンドＰＣＲおよびＭ、１００ｂｐＤＮＡラダーマーカー。Ｃ．ギリエルモンディイの半ネステッドＰＣＲ検出の感度試験の結果を示す。レーン：１、１０^６細胞；２、１０^５細胞；３、１０^４細胞；４、１０^３細胞；５、１０^２細胞；６、１０^１細胞；７、１０^０細胞；Ｎ１、鋳型なし対照の第１ラウンドＰＣＲ；Ｎ２、鋳型なし対照の第２ラウンドＰＣＲおよびＭ、１００ｂｐＤＮＡラダーマーカー。Ｃ．ケフィルの半ネステッドＰＣＲ検出の感度試験の結果を示す。レーン：１、１０^６細胞；２、１０^５細胞；３、１０^４細胞；４、１０^３細胞；５、１０^２細胞；６、１０^１細胞；７、１０^０細胞；Ｎ１、鋳型なし対照の第１ラウンドＰＣＲ；Ｎ２、鋳型なし対照の第２ラウンドＰＣＲおよびＭ、１００ｂｐＤＮＡラダーマーカー。Ｃ．クルセイの半ネステッドＰＣＲ検出の感度試験の結果を示す。レーン：１、１０^６細胞；２、１０^５細胞；３、１０^４細胞；４、１０^３細胞；５、１０^２細胞；６、１０^１細胞；７、１０^０細胞；Ｎ１、鋳型なし対照の第１ラウンドＰＣＲ；Ｍ、１００ｂｐＤＮＡラダーマーカーおよびＮ２、鋳型なし対照の第２ラウンドＰＣＲ。Ｃ．ルシタニアエの半ネステッドＰＣＲ検出の感度試験の結果を示す。レーン：１、１０^６細胞；２、１０^５細胞；３、１０^４細胞；４、１０^３細胞；５、１０^２細胞；６、１０^１細胞；７、１０^０細胞；Ｎ１、鋳型なし対照の第１ラウンドＰＣＲ；Ｎ２、鋳型なし対照の第２ラウンドＰＣＲおよびＭ、１００ｂｐＤＮＡラダーマーカー。Ｃ．パラプシロシスの半ネステッドＰＣＲ検出の感度試験の結果を示す。レーン：１、１０^６細胞；２、１０^５細胞；３、１０^４細胞；４、１０^３細胞；５、１０^２細胞；６、１０^１細胞；７、１０^０細胞；Ｎ１、鋳型なし対照の第１ラウンドＰＣＲ；Ｍ、１００ｂｐＤＮＡラダーマーカー；およびＮ２、鋳型なし対照の第２ラウンドＰＣＲ。Ｃ．ルゴサの半ネステッドＰＣＲ検出の感度試験の結果を示す。レーン：１、１０^６細胞；２、１０^５細胞；３、１０^４細胞；４、１０^３細胞；５、１０^２細胞；６、１０^１細胞；７、１０^０細胞；Ｎ１、鋳型なし対照の第１ラウンドＰＣＲ；Ｍ、１００ｂｐＤＮＡラダーマーカー；およびＮ２、鋳型なし対照の第２ラウンドＰＣＲ。Ｃ．トロピカリスの半ネステッドＰＣＲ検出の感度試験の結果を示す。レーン：１、１０^６細胞；２、１０^５細胞；３、１０^４細胞；４、１０^３細胞；５、１０^２細胞；６、１０^１細胞；７、１０^０細胞；Ｎ１、鋳型なし対照の第１ラウンドＰＣＲ；Ｍ、１００ｂｐＤＮＡラダーマーカー；およびＮ２、鋳型なし対照の第２ラウンドＰＣＲ。

以下、本発明は、本発明の好ましい実施形態に従って、付随する説明および図面を参照することにより、説明されるものとする。しかしながら、この説明を本発明の好ましい実施形態および図面に限定するのは、単に本発明の議論を容易にするためであることが理解されるべきであり、当業者であれば、添付の特許請求の範囲の範囲を逸脱することなく、様々な改良を考案し得ることが想定される。

本明細書の全体を通じて使用される以下の用語は、異なる意味を有することが明示的に示されない限り、示された意味を有する。

「標的核酸」により、標的ヌクレオチド配列を有する核酸を意味する。

「オリゴヌクレオチド」により、共有結合した３つ以上のヌクレオチドサブユニットでできた一本鎖ヌクレオチドポリマーを意味する。好ましくは、存在するヌクレオチドユニットの数は、１０〜１００の範囲であり、最も好ましくは１２〜５０の範囲である。ヌクレオチドサブユニットの糖基は、デオキシリボースである。オリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニットは、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合によって、またはオリゴヌクレオチドの増幅を妨げない、その他の稀なもしくは天然に存在しない結合によって連結されていてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、一般的でないヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分を有していてもよい。本明細書で定義されるオリゴヌクレオチドは、核酸のＤＮＡである。定義された配列の増幅オリゴヌクレオチドは、当業者に公知の技術によって、例えば、化学合成によって、生成されてもよい。本開示により意図されるように、オリゴヌクレオチドは、野生型の染色体ＤＮＡまたはそのインビボ転写産物からなるものではない。

「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、または「標的配列」により、一本鎖核酸分子のヌクレオチド配列の全部または一部を含む特定のデオキシリボヌクレオチド配列、およびそれに相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を意味する。

「相補的」により、２つの一本鎖核酸のよく似た領域、または同じ一本鎖核酸の２つの異なる領域のヌクレオチド配列が、厳しい増幅条件下、これらの一本鎖を結合させて、安定な二本鎖の水素結合領域にするヌクレオチド塩基組成を有することを意味する。ＡがＴと対を形成し、ＣがＧと対を形成するように、一方の一本鎖領域の連続するヌクレオチド配列が、もう一方の一本鎖領域の類似するヌクレオチド配列と一連の水素結合塩基対を形成することができる場合、ヌクレオチド配列は相補的である。

「増幅オリゴヌクレオチド」により、標的核酸配列に結合し、核酸合成を開始するための核酸合成用プライマーとして働くことができるオリゴヌクレオチドを意味する。増幅オリゴヌクレオチドは、プライマー伸張を妨げるかまたはプライマー伸張の量を減らすように修飾されている３’末端を有していてもよいし、有していなくてもよい。本明細書で定義される増幅オリゴヌクレオチドは、好ましくは１０〜５０ヌクレオチド長、最も好ましくは１５〜２５ヌクレオチド長である。本発明の増幅オリゴヌクレオチドは化学合成されてもよいが、そのようなオリゴヌクレオチドは天然の核酸ではない。

「核酸増幅」または「標的増幅」により、少なくとも１つの標的核酸配列を有する核酸分子の数を増加させることを意味する。

「アンチセンス」または「ネガティブセンス」により、参照核酸配列の核酸配列に相補的な核酸配列を有することを意味する。

「センス」、「同一センス」、または「ポジティブセンス」により、参照核酸配列の核酸配列に類似する核酸配列を有することを意味する。

「系統学的に近縁関係にある」とは、生物が進化論的な意味で互いに近縁関係にあり、それゆえ、より遠縁関係にある生物よりも高い全体の核酸配列相同性を有することを意味する。系統樹上で隣接位置および隣接位置のとなりを占める生物は近縁関係にある。系統樹上で隣接位置または隣接位置のとなりよりもさらに離れた位置を占める生物は、それらが相当な全体の核酸配列相同性を有する場合には、やはり近縁関係にある。

本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、もしくは配列番号１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号２２からなる群から選択される任意のその相補配列を含む単離されたオリゴヌクレオチドを開示する。

発明された増幅オリゴヌクレオチドは、血液、血液由来試料、組織、組織由来試料、その他の体液および体試料などのヒト由来生体試験試料中のカンジダ核酸の存在を検出するために有用である。

本発明の別の実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、もしくは配列番号１０からなる群から選択される増幅ヌクレオチド配列、または配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号２２からなる群から選択される任意のその相補配列を含む、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの増幅のためのプライマーである。これらのプライマーは、増幅条件下で核酸ポリメラーゼと接触させたときに、それらの相補配列を有する核酸領域と結合するかまたは該領域からの伸張を生じさせる。

有用な増幅オリゴヌクレオチドは、カンジダのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）もしくはリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）ヌクレオチド配列の特定領域、または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０を含む、カンジダ種のｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡヌクレオチド配列、ならびに配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２を含む、その相補配列に由来する特定の部分に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドに相補的となるように設計されている。

これらの増幅オリゴヌクレオチドは病原性カンジダのｒＲＮＡに由来するので、遺伝子の多コピー性のために、優れた検出アッセイが得られる。増幅オリゴヌクレオチドは、増幅条件下で標的カンジダのＩＴＳ１およびＩＴＳ２ｒＲＮＡおよび／またはｒＤＮＡ遺伝子配列を増幅することによって機能する。好ましい実施形態では、本明細書に記載される増幅オリゴヌクレオチドは、一緒に使用したときに、血液または組織などの臨床試料中に見られるその他の微生物から、およびカンジダ属の種の中から、カンジダ種を識別することができる。したがって、増幅オリゴヌクレオチドは、カンジダ種由来の核酸を特異的に検出および／または増幅するためのアッセイで使用し得る。

本発明の別の態様は、カンジダ種を検出するための組成物を含み、この組成物は、本発明のオリゴヌクレオチドとカンジダ種由来のヌクレオチドポリマーの特定領域との間に形成された核酸ハイブリッドである。一般に、ヌクレオチドポリマーは、本発明のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体に実質的に対応する核酸配列を含み、カンジダ種のリボソームＲＮＡをコードするｒＤＮＡに由来する。これらの組成物中に存在するオリゴヌクレオチドは、増幅オリゴヌクレオチドである。したがって、本発明の組成物は、１つまたは複数の増幅オリゴヌクレオチドを含む。

その標的配列を増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを含む本発明のヌクレオチド組成物は、プライマーの３’末端でポリメラーゼの開始部位を作り出すために、および／または標的配列の３’末端を伸張させるための鋳型を提供するために有用である。

本発明はまた、キット形態の診断システムを企図している。本発明の診断システムは、包装材料中に、少なくとも１回のアッセイに十分な量で、本発明の増幅プライマーを含むキットを含み得る。典型的には、キットには、包装されたプライマーを使用するための取扱説明書も含まれる。

生体試料中のカンジダ種を検出および同定するためのＰＣＲベースの増幅キットは、本発明の別の実施形態に記載されている。このキットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、もしくは配列番号１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号２２からなる群から選択される任意のその相補配列を有するプライマーのうちの少なくとも１つを含む。

ＰＣＲキットは、増幅オリゴヌクレオチドまたはプライマーセットを含む１つまたは複数の本発明のオリゴヌクレオチドを含む。本発明の好ましい実施形態によれば、本発明のキットは、Ｃ．アルビカンス、Ｃ．デュブリニエンシス、Ｃ．グラブラタ、Ｃ．ギリエルモンディイ、Ｃ．ケフィル、Ｃ．クルセイ、Ｃ．ルシタニアエ、Ｃ．パラプシロシス、Ｃ．ルゴサ、またはＣ．トロピカリスとその他の微生物を特異的に識別することができる少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチドを含む。

診断キットの様々な構成要素は、様々な形態で提供し得る。例えば、必要とされる酵素、ヌクレオチド三リン酸、プライマーは、凍結乾燥試薬として提供し得る。これらの凍結乾燥試薬は、適切な割合の各構成要素を含む、アッセイですぐに使用できる完全な混合物を形成するように、凍結乾燥前に予め混合し得る。さらに、本発明の診断システムは、キットの凍結乾燥試薬を再構成するための再構成試薬を含み得る。

本発明の好ましい実施形態によれば、酵素、ヌクレオチド、三リン酸、および必要とされる酵素補因子は、再構成されたときに、本発明の方法で使用される適切な試薬を形成する単一の凍結乾燥試薬として提供される。これらの好ましいキットでは、凍結乾燥されたプライマー剤も提供し得る。典型的な包装材料としては、定められた範囲内に本発明の増幅プライマーを保持することができる、ガラス、プラスチック、紙、ホイル、微粒子などのような、固体マトリックスが挙げられる。したがって、例えば、包装材料でできた包装は、サブミリグラム（すなわち、ピコグラム、ナノグラムなど）の分量の企図されるプライマーを入れるために使用されるガラスバイアルであることができるか、または本発明のプライマーが機能するように固定されている、すなわち、本発明の検出方法で関与することができるように結合しているマイクロタイタープレートウェルであることができる。

本明細書で具現化される配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号１２のヌクレオチド配列は、保存ＤＮＡ断片を標的とするように設計されているので、全ての真菌に対する共通配列として使用することができる。それゆえ、この増幅オリゴヌクレオチドまたはプライマーセットは、カンジダ種の保存ＤＮＡ断片を増幅するために使用することができる。本発明で使用されるオリゴヌクレオチドまたはプライマーセットは全て、市販で得られる。

半ネステッドＰＣＲ法が適用されるが、この方法によって偽陽性の発生が排除され、第１ラウンドのＰＣＲ時に試料中に見られる任意の阻害因子が希釈されるので、アッセイ感度を高めることができる。それゆえ、第２ラウンドのＰＣＲは、配列番号１１と配列番号１２のヌクレオチド配列によって開始される第１ラウンドのＰＣＲから得られた増幅ＤＮＡフラグメントを用いて実行される。

さらに、本発明は、最適化された増幅アッセイ条件下で優先的に増幅することができる、カンジダ種の標的核酸に対する核酸プライマーと、試験試料を、最適化された増幅条件下で接触させることによって、カンジダ種の存在を検出するための方法を企図している。しかしながら、当業者であれば、正確なアッセイ条件、使用されるプライマーが、使用される特定のアッセイ形式や試料の供給源によって変わることを理解するであろう。

カンジダ・デュブリニエンシスの検出と同定は、配列番号１を配列番号２と置き換えることによって行なうことができる。同様に、Ｃ．グラブラタ、Ｃ．ギリエルモンディイ、Ｃ．ケフィル、Ｃ．クルセイ、Ｃ．ルシタニアエ、Ｃ．パラプシロシス、Ｃ．ルゴサ、およびＣ．トロピカリスの増幅は、配列番号１を、それぞれ、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０と置き換えることによって行なうことができる。

前述の説明で示したように、本発明の増幅オリゴヌクレオチドまたはプライマーセットは、特定のカンジダＩＴＳ１領域とＩＴＳ２領域に対するものである。本明細書に記載され、特許請求された増幅オリゴヌクレオチドは、２組の増幅オリゴヌクレオチドを含む。増幅オリゴヌクレオチドの組のメンバーは、以下のヌクレオチド配列、すなわち、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０のうちの１つを有するか、またはこれらのヌクレオチド配列のうちの１つに実質的に対応する核酸と結合することができる。

好ましい実施形態では、これらの増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２を含む、これらの相補配列を有するか、またはこれらの相補配列に実質的に対応する。

増幅した標的配列を検出するために、多種多様な方法が利用可能である。例えば、ヌクレオチド基質またはプライマーは、新たに合成されたＤＮＡに取り込まれる検出可能標識を含むことができる。次に、得られた標識増幅産物を未使用の標識ヌクレオチドまたは標識プライマーから分離し、分離された産物画分中で標識を検出する。

有用な検出可能標識としての役割を果たすことができる基質は当該技術分野で周知であり、放射性同位体、蛍光化合物、発光化合物、発色団、および直接検出することはできないが、標識された形態のその特異的結合パートナー、例えば、それぞれ、アビジンや抗体との反応によって容易に検出することができる、ビオチンやハプテンなどのリガンドを含む。

本開示は、添付の特許請求の範囲に含まれるもの、および前述の説明に含まれるものを含む。本発明は、ある程度の特定性を伴って、その好ましい形態で記載されているが、この好ましい形態の開示が例として行なわれているに過ぎないことや、構成の詳細と部分の組合せおよび配置とにおける数々の変更が、本発明の範囲から逸脱することなく行なわれ得ることが理解されるであろう。

本発明の様々な態様および実施形態を説明するために以下に実施例を示す。これらの実施例は、いかなる意味においても、開示された発明を限定することが意図されるものではなく、この開示された発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。

カンジダ・アルビカンスに特異的な増幅オリゴヌクレオチドまたはプライマーは、カンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣ番号１４０５３）、カンジダ・デュブリニエンシス（ＡＴＣＣ番号ＭＹＡ−１７８）、カンジダ・グラブラタ（ＡＴＣＣ番号２００１）、カンジダ・ギリエルモンディイ（ＡＴＣＣ番号６２６０）、カンジダ・ケフィル（ＡＴＣＣ番号６６０２８）、カンジダ・クルセイ（ＡＴＣＣ番号６２５８）、カンジダ・ルシタニアエ（ＡＴＣＣ番号６６０３５）、カンジダ・パラプシロシス（ＡＴＣＣ番号２２０１９）、カンジダ・ルゴサ（ＡＴＣＣ番号１０５７１）、カンジダ・トロピカリス（ＡＴＣＣ番号７５０）、アスペルギルス・フラブス（ＡＴＣＣ番号１０１２４）、アスペルギルス・フミガーツス（ＡＴＣＣ番号３６６０７）、アスペルギルス・レンツルス（ＡＴＣＣ番号ＭＹＡ−３５６６）、アスペルギルス・ニデュランス（ＡＴＣＣ番号１００７４）、アスペルギルス・ニゲル（ＡＴＣＣ番号１６８８８）、アスペルギルス・テレウス（ＡＴＣＣ番号１０１２）、および臨床分離株クリプトコックス・ネオフォルマンスの１８ＳｒＤＮＡに相補的なプライマーを用いて候補標的領域中で決定された配列を用いて設計された。変化する領域を決定するために、系統学的に近い近縁種由来の核酸配列も、カンジダ・アルビカンス由来の核酸配列との比較物として使用した。

実施例１ＡＴＣＣ株および臨床分離株
全１０種のカンジダ種をＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。それらを参照株として使用した。１０種の異なるカンジダ種の２６種の臨床分離株を試験した。

実施例２増殖条件およびＤＮＡ抽出
対数期半ばに達するまで、カンジダ細胞を、振盪インキュベーター中、３７℃で一晩、３ｍＬのサブローデキストロースブロス（ＳＤＢ）中で増殖させた。カンジダ細胞を含むブロス培養物をＤＮＡ抽出に使用した。従来のフェノール−クロロホルム抽出法を用いてカンジダ細胞のゲノムＤＮＡを抽出した。１ｍＬのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４を用いて、１３，２００ｒｐｍで２分間の遠心分離により細胞を２回洗浄した。振盪インキュベーター中、３７℃で、５００μＬの溶解緩衝液（１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ＭＥＤＴＡ、０．５％ｖ／ｖ β−メルカプトエタノール）を添加することにより、細胞壁を破壊した。その後、５０μＬの１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加することにより細胞を溶解し、核からＤＮＡを放出させ、２．５μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを用いて細胞残屑を変性させた。等容量（約５５３μＬ）のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを添加して、ヒストンやタンパク質からＤＮＡを分離した。１／１０容量（５０μＬ）の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と等容量のイソプロパノール（５００μＬ）とを添加することにより、放出されたＤＮＡを沈殿させ、濃縮し、室温で１０分間インキュベートした。１３，２００ｒｐｍで１５分間の遠心分離でＤＮＡをペレット化し、７０％の冷エタノールで洗浄し、１３，２００ｒｐｍで５分間回転させ、最後に、長期保存用に、滅菌蒸留水またはＴＥ緩衝液、ｐＨ７．４（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。

実施例３ポリメラーゼ連鎖ポリメラーゼ
ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（登録商標）グラジエントＰＣＲ装置をＤＮＡ増幅プロセスに使用した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用の反応混合液は、ＰＣＲ緩衝液、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、フォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびにＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素からなる。ＰＣＲ反応成分は全て、ＦｅｒｍｅｎｔａｓＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ製である。第１ラウンドのＰＣＲは、配列番号１１（ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ）と配列番号１２（ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ）のプライマーを用いて行なった。表１は、第１ラウンドおよび第２ラウンドの半ネステッドＰＣＲプロセスで用いられるプライマーのリストを示す。配列番号１１と配列番号１２をプライマーとして用いる第１ラウンドのＰＣＲ用のＰＣＲ反応混合液を表２に示し、一方、ＰＣＲプログラムをそれぞれ表５に示す。種に応じた第２ラウンドのＰＣＲのために、配列番号１１はそのまま残し、それぞれの種に対する１０個の異なる種特異的リバースプライマー（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）を適宜使用した。１マイクロリットルの第１ラウンドＰＣＲ産物を第２ラウンドＰＣＲの鋳型として使用した。それぞれの種のＰＣＲ反応用のＰＣＲ反応混合液とＰＣＲプログラムの詳細を表３と表５に示す。得られる全てのＰＣＲ産物を７２ボルトで４５分間のアガロースゲル電気泳動にかけ、その後、ゲルドキュメンテーションシステムを用いて見る。

＃「X」は、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５または配列番号６または配列番号７または配列番号８または配列番号９または配列番号１０であることができる。

・ＰＣＲサイクルは３４サイクル繰り返され、１サイクルは１ラウンドの変性とアニーリングと伸長の工程として定義される。

実施例４特異性および感度
特異性検査については、１０種のカンジダ種（ＡＴＣＣ株）、６種のアスペルギルス種（ＡＴＣＣ株）、およびクリプトコックス・ネオフォルマンス（非ＡＴＣＣ株）のＤＮＡを用いて決定された。ＰＣＲの鋳型のＤＮＡ量は、１５０ｎｇ／μＬに標準化する。感度検査については、１００万細胞／分生子から抽出した１０倍連続希釈ＤＮＡを用いてＰＣＲを行なうことにより決定された。

最適化された種特異的な半ネステッドＰＣＲ増幅条件では、検査された全ての種、すなわち、１０種のカンジダ種（Ｃ．アルビカンス、Ｃ．デュブリニエンシス、Ｃ．グラブラタ、Ｃ．ギリエルモンディイ、Ｃ．ケフィル、Ｃ．クルセイ、Ｃ．ルシタニアエ、Ｃ．パラプシロシス、Ｃ．ルゴサ、およびＣ．トロピカリス）、６種のアスペルギルス種（Ａ．フラブス、Ａ．フミガーツス、Ａ．レンツルス、Ａ．ニデュランス、Ａ．ニゲル、Ａ．テレウス）、クリプトコックス・ネオフォルマンス、およびヒトＤＮＡについて、標的とされたもの以外にアンプリコンは観察されなかった。２６種のカンジダ臨床分離株も検査されたが、これらは、種と一致して正確に同定された。全てのこれらの結果により、種特異的な半ネステッドＰＣＲが、よく見られる医学的に重要な真菌の間で正確な種を識別および同定し、ヒトＤＮＡを増幅する可能性を排除し、偽陽性の結果を回避することができることが示された。さらに、検査したもの以外の他の真菌ＤＮＡやヒトＤＮＡに対する種特異的プライマーの交差増幅がなく、したがって、全１０種のカンジダ種に対する半ネステッドの特異性が確認されたことを詳述することができる。

フェノール：クロロホルム法を用いて抽出された１０種の医学的に重要なカンジダ細胞の１００万個の細胞のＤＮＡを感度検査にかけた。感度検査については、それぞれの種から得られる１００万細胞／分生子から抽出した１０倍連続希釈ＤＮＡを用いてＰＣＲを行なうことにより決定された。この検査では、１細胞（カンジダ・パラプシロシスおよびカンジダ・ルゴサ）、１０細胞（カンジダ・アルビカンス、カンジダ・デュブリニエンシス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ルシタニアエ、およびカンジダ・トロピカリス）、ならびに１００細胞（カンジダ・ギリエルモンディイおよびカンジダ・ケフィル）程度でＰＣＲアンプリコンが見られることが分かった。これらの結果を表６および図２〜１１に示す。

上記の実施例で示したデータにより、本明細書に記載され、特許請求された新規の増幅オリゴヌクレオチドが、１０種の医学的に重要なカンジダ種の核酸を増幅することができ、かつそれらのカンジダ種の中で、および知られているうちで最も近い系統学的近縁種と互いに識別するためのアッセイで使用することができることが確認される。本明細書に記載された実施例はどれも、本発明を本開示の実施形態に限定することを意図するものではなく、本発明は以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims

配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号１２のヌクレオチド配列を含有するプライマーセットを用いて生体試料中のカンジダ種の保存ＤＮＡ断片を増幅する工程と、増幅された保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含有するプライマーセットと接触させる工程とを含む、カンジダ種を検出および同定するための方法。
請求項１に記載の増幅された保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号１のヌクレオチド配列を含有するプライマーセットと接触させることによって、カンジダ・アルビカンスを種特異的に検出および同定するための方法。
請求項１に記載の増幅された保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号２のヌクレオチド配列を含有するプライマーセットと接触させることによって、カンジダ・デュブリニエンシスを種特異的に検出および同定するための方法。
請求項１に記載の増幅された保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号３のヌクレオチド配列を含有するプライマーセットと接触させることによって、カンジダ・グラブラタを種特異的に検出および同定するための方法。
請求項１に記載の増幅された保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号４のヌクレオチド配列を含有するプライマーセットと接触させることによって、カンジダ・ギリエルモンディイを種特異的に検出および同定するための方法。
請求項１に記載の増幅された保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号５のヌクレオチド配列を含有するプライマーセットと接触させることによって、カンジダ・ケフィルを種特異的に検出および同定するための方法。
請求項１に記載の増幅された保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号６のヌクレオチド配列を含有するプライマーセットと接触させることによって、カンジダ・クルセイを種特異的に検出および同定するための方法。
請求項１に記載の増幅された保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号７のヌクレオチド配列を含有するプライマーセットと接触させることによって、カンジダ・ルシタニアエを種特異的に検出および同定するための方法。
請求項１に記載の増幅された保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号８のヌクレオチド配列を含有するプライマーセットと接触させることによって、カンジダ・パラプシロシスを種特異的に検出および同定するための方法。
請求項１に記載の増幅された保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号９のヌクレオチド配列を含有するプライマーセットと接触させることによって、カンジダ・ルゴサを種特異的に検出および同定するための方法。
請求項１に記載の増幅された保存ＤＮＡ断片を、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号１０のヌクレオチド配列を含有するプライマーセットと接触させることによって、カンジダ・トロピカリスを種特異的に検出および同定するための方法。
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって生体試料中のカンジダ種を検出および同定するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの増幅キットであって、当該キットが、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号１２のヌクレオチド配列を含有するプライマーセットと、配列番号１１のヌクレオチド配列および配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含有するプライマーセットとを使用することを特徴とするキット。