PT103277B

PT103277B - Fragmentos de dna e primers para a detecção e identificação de espécies de cândida clinicamente relevantes

Info

Publication number: PT103277B
Application number: PT103277A
Authority: PT
Inventors: Agostinho Alberico Rodrigues Carvalho; Fernando Jose Dos Santos Rodrigues
Original assignee: Univ Do Minho
Priority date: 2005-05-17
Filing date: 2005-05-17
Publication date: 2007-03-30
Also published as: CA2608742A1; EP1888745A2; WO2006123295A3; PT103277A; US20100311040A1; WO2006123295A2

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO DESCREVE UM NOVO MÉTODO MOLECULAR BASEADO NA REACÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) NUMA VARIANTE MULTIPLEX PARA A DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE CANDIDA RELEVANTES NA PRÁTICA CLÍNICA, NOMEADAMENTE C. ALBICANS, O. GLABRATA, C. KRUSEI, C. PARAPSILOSIS, C. TROPICALIS, C. GUILLIERMONDII, C. LUSITANÍAE E C. DUBLÍNIENSIS. A ESTRATÉGIA APROVEITA A EXISTÊNCIA DE SEQUÊNCIAS, QUER CONSERVADAS, QUER VARIÁVEIS, NOS GENES RIBOSSOMAIS FÚNGICOS E NO USO DE UMA COMBINAÇÃO DE PRIMERS UNIVERSAIS ESPECÍFICOS PARA FUNGOS E PRIMERS INTERNOS ESPECÍFICOS PARA CADA UMA DAS ESPÉCIES DE CANDIDA. DESTA FORMA, AMPLIFICAM-SE DOIS FRAGMENTOS DAS REGIÕES ESPAÇADORAS INTERNAMENTE TRANSCRITAS (ITS) DO RNA RIBOSSOMAL (RRNA) POR PCR MULTIPLEX, PERMITINDO A FÁCIL IDENTIFICAÇÃO DA(S) ESPÉCIE(S) EM CAUSA. ESTA METODOLOGIA PERMITE A IDENTIFICAÇÃO RÁPIDA, EFICAZ E DE BAIXO CUSTO DE ESPÉCIES DE CANDIDA COM INTERESSE CLÍNICO, TRAZENDO CLARAS VANTAGENS EM RELAÇÃO AOS MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO ACTUALMENTE DISPONÍVEIS.

Description

FRAGMENTOS DE DNA, PRIMERS, MÉTODO PARA AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA E KIT INCLUINDO OS REFERIDOS PRIMERS, PARA A DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE CANDIDA CLINICAMENTE RELEVANTES

ÂMBITO DA INVENÇÃO

A invenção descrita inclui-se no domínio da detecção e identificação de fungos clinicamente importantes. Mais particularmente, esta relaciona-se com a identificação de espécies de Candida com relevância clínica, nomeadamente C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. guilliermondii, C. lusitaniae e C. dubliniensis.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Nos últimos anos, observou-se uma alteração no perfil epidemiológico das doenças infecciosas caracterizada pelo aumento das infecções fúngicas relativamente às bacterianas, claramente evidenciado pelo aumento de 400% de fungémias de 1990 a 2000 (Kao et al., Clin. Infect. Dis. 29:1164-70 (1999)), com o consequente elevado custo para o sistema de saúde público (Edmond et al., Clin. Infect. Dis. 29:239-244 (1999)). As infecções fúngicas invasivas, nomeadamente a candidémia, assumem uma importância particular nas infecções hospitalares (Jarvis et al., Clin. Infect. Dis. 20:1526-30 (1995); Fridkin et al., Clin. Microbiol. Rev. 9:499-511 (1996)).

Apesar da espécie C. albicans permanecer o agente etiológico mais comum nas infecções fúngicas, a frequência de outras espécies, incluindo C. glabrata, C. tropicalis,

C. parapsilosis, C. krusei, C. guilliermondii, C. lusitaniae e C. dubliniensis, tem vindo a aumentar de forma expressiva (Pfaller et al., J. Clin. Microbiol. 40:3551-57 (2002); Diekema et al., J. Clin. Microbiol. 40:1298-302 (2002) ) . Assim, tendo em consideração que este tipo de infecções apresenta elevadas taxas de morbilidade e mortalidade, um diagnóstico rápido e preciso do agente infeccioso em questão assume grande relevância na prática clínica. Por outro lado, e uma vez que a susceptibilidade às drogas antifúngicas disponíveis varia entre as diferentes espécies de Candida, o conhecimento da espécie envolvida na infecção é fundamental para o estabelecimento de uma terapia antifúngica adequada (Nguyen et al., Am. J. Med. 100:617-23 (1996)). Desta forma, um método de diagnóstico rápido e eficiente beneficiaria não só os pacientes, mas também as instituições de saúde, eliminando risco de terapias inadequadas e de tempos de hospitalização prolongados, diminuindo os custos associados ao tratamento deste tipo de infecções.

O diagnóstico laboratorial e o tratamento de infecções fúngicas são geralmente problemáticos e continuam a ser um grande desafio tanto para clínicos como para microbiologistas. Os fungos são dificilmente cultiváveis a partir de amostras como urina ou sangue e tendo em conta a ubiquidade destes, uma cultura positiva apresenta um valor clínico limitado devido à grande probabilidade de contaminação. Actualmente, o método estandardizado para o diagnóstico de candidémia passa por recuperar o microorganismo por hemocultura (Kiehn et al., J. Clin. Microbiol. 14:681-83 (1981); Roberts et al., J. Clin. Microbiol. 1:309-10 (1975)). O isolamento de Candida a partir de sangue é um facto altamente preditivo de infecção invasiva, pese embora o cultivo apresente uma taxa de sucesso inferior a 20% dos doentes com candidémia. Além disso, é necessário ter em conta o tempo necessário para a cultura e identificação da levedura, um processo geralmente muito demorado.

A presença de anticorpos específicos contra Candida no soro é também usada como critério de diagnóstico, determinando para tal o titulo de anticorpos presentes no soro. Contudo, a sensibilidade desta metodologia é muito baixa (geralmente inferior a 50%), tendo em conta que os doentes imunocomprometidos têm dificuldade em gerar respostas imunes adequadas. As lacunas, quer dos métodos culturais, quer da detecção de anticorpos, levou a que a atenção dos investigadores se centrasse em testes que antigénios ou metabolitos fúngicos nos fluidos detectavam corporais.

Um grande problema desta técnica é a natureza dos antigénios no soro, sendo a sensibilidade transiente geralmente muito reduzida para a maioria dos testes de antigénios.

nenhum dos métodos acima mencionados permite a identificação do fungo ao nível da espécie, necessária para o tratamento eficaz da infecção fúngica.

Recentemente, várias técnicas baseadas na reacção de PCR têm sido usadas para a identificação de fungos ao nível da espécie. Buchman et al. foi o primeiro grupo a descrever o uso de PCR para identificar C. albicans em amostras clinicas (Buchman et al., Surgery 108:338-47 (1990)). Estes investigadores usaram o PCR para amplificar uma porção de um gene específico codificante da citocromo lanosterol 14alfa demetilase. O produto de PCR previsto era de aproximadamente 240 pb, contudo padrões de amplificação inexplicáveis eram vistos em várias amostras clínicas contendo DNA de C. albicans. Adicionalmente, o conjunto de primers usado por Buchman et al. amplificava DNA de espécies que não C. albicans, originando produtos de PCR com o tamanho previsto de 240 pb.

A US6017699 descreve um conjunto de primers que, quando utilizados com a reacção de PCR, permitem amplificar e especiar DNA de 5 espécies de Candida clinicamente relevantes. Os produtos de PCR amplificados podem ser usados para criar sondas de DNA específicas que podem permitir também a detecção e identificação de 5 espécies de Candida.

Actualmente, os genes ribossomais são alvos comuns no desenho de estratégias para identificação de fungos. Apesar do elevado nível de conservação entre as sequências maduras de rRNA, as sequências espaçadoras transcritas e não transcritas são geralmente pouco conservadas e, desta forma, passíveis de serem utilizadas como sequências alvo para a detecção de divergências evolutivas. Os genes de rRNA de fungos são organizados em unidades, em que cada uma codifica três subunidades maduras: 18S, 5.8S e 28S. Estas

subunidades	são separadas por duas regiões espaçadoras
internamente	transcritas, ITS-1 e ITS-2, de aproximadamente
300 pb. As	sequências altamente variáveis das regiões
espaçadoras	internamente transcritas ITS-1 e ITS-2,
flanqueadas	pelas regiões codificantes relativamente

conservadas dos genes nucleares de rRNA 18S, 5.8S e 28S, têm sido usadas em vários formatos na identificação com base em PCR de leveduras do género Candida.

A WO9323568 divulga métodos de diagnóstico de infecções fúngicas através da detecção de regiões distintas do genoma de fungos patogénicos, tais como do género Candida, incluindo a região 5S do rRNA e as regiões ITS do rRNA. Adicionalmente, são descritos métodos de detecção de fungos a partir destas regiões, nomeadamente pelo uso de sondas de DNA ou primers específicos para estas regiões.

A US5426027 descreve ácidos nucleicos isolados consistindo essencialmente de sequências nucleotídicas específicas da região ITS-2 de C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata e C. krusei e, adicionalmente, um método para diagnosticar candidémia consistindo dos passos: colheita de sangue, lise das células de Candida e precipitação de DNA, amplificação do DNA precipitado com primers fúngicos universais derivados das regiões ITS e detecção de DNA de Candida amplificado por sondas que hibridizam selectivamente, indicando desta forma a presença de candidémia.

Williams et al. (1995) demonstrou a possibilidade de identificar espécies de Candida através da amplificação por PCR e análise dos fragmentos de DNA resultantes do uso de enzimas de restrição nas regiões ITS amplificadas (Williams et al., J. Clin. Microbiol. 33:2476-79 (1995)). Fujita et al. descreveram sondas de DNA não isotópicas marcadas com digoxigenina para a região ITS-2 de diferentes espécies de Candida (Fujita et al., J. Clin. Microbiol. 33:962-67 (1995)). Estas sondas foram usadas num método de microtitulação em placa para rapidamente detectar e identificar DNA genómico de C. albicans em sangue. Já por seu turno, Shin et al. (1999) descreveu a detecção e identificação de três espécies de Candida diferentes numa única reacção, usando amplificação com os primers universais ITS3 e ITS4 e hibridização com sondas para a região ITS-2 (Shin et al., J. Clin. Microbiol. 35:1454-59 (1997)). Finalmente, Chang et al. (2001) aplicou um método de PCR multiplex na identificação de Candida em hemoculturas positivas, embora apenas conseguisse a identificação de seis espécies no máximo, necessitando para tal de duas reacções independentes de PCR multiplex (Chang et al., J. Clin. Microbiol. 39:3466-71 (2001)).

Apesar dos métodos genotipicos disponíveis apresentarem uma especificidade maior, são geralmente de custo mais elevado ou têm necessidade de tecnologia sofisticada que não existe prontamente ou não é facilmente implementada em laboratórios de diagnóstico. Adicionalmente, os métodos convencionais de identificação não permitem distinguir e identificar duas ou mais espécies de Candida presentes em infecções múltiplas, facto que ocorre com alguma frequência e que pode afectar a terapia antifúngica administrada. Por outro lado, espécies que partilhem muitas características bioquímicas facilmente são confundidas pelos métodos convencionais, situação que se verifica entre C. albicans e C. dubliniensis (Bikandi et al., J. Clin. Microbiol. 36:2428-33 (1998)). Finalmente, a maioria dos métodos genotipicos de identificação baseia-se no uso de DNA purificado da espécie a identificar, o que leva invariavelmente à necessidade de implementação de métodos demorados de isolamento de DNA. Como consequência, o desenvolvimento de um método que seja rápido, eficaz, de baixo custo e facilmente aplicável reveste-se de grande importância, permitindo a implementação de regimes terapêuticos eficazes e a monitorização da progressão do paciente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção visa responder à necessidade existente de um método rápido, preciso e de baixo custo comparativamente aqueles disponíveis actualmente, quer em termos clínicos, quer ao nível da investigação. Assim, é descrito um método baseado em PCR multiplex para a detecção e identificação das espécies de Candida com maior interesse na prática clínica. Mais particularmente, a estratégia usada tira partido essencialmente de três factores: (i) o número elevado de cópias dos genes de rRNA (cerca de 100 cópias por genoma) de fungos, (ii) as diferenças em termos de tamanho das regiões ITS e (iii) a elevada variabilidade das sequências destas regiões entre as diferentes espécies de Candida. Assim, esta técnica baseia-se na amplificação de fragmentos de DNA específicos das regiões internamente transcritas 1 (ITS—1) e 2 (ITS-2) por PCR multiplex. A metodologia faz uso da combinação de dois primers universais e sete primers específicos para cada uma das espécies de Candida em estudo, numa única reacção de PCR, originando dois fragmentos de tamanhos diferentes para cada espécie, com excepção de C. glabrata (Figura 1; Figura 2A). Neste último caso, o tamanho das regiões ITS-1 e ITS-2, incluindo a região codificante 5.8S de rRNA, é suficiente para discriminar C. glabrata das restantes espécies. O método apresentado permite a detecção e diferenciação de espécies de Candida de forma rápida, precisa e específica, caracterizando-se como uma ferramenta útil no diagnóstico clinico de infecções fúngicas. Além disso, esta metodologia pode ser usada na monitorização das infecções fúngicas e para guiar uma terapia antifúngica apropriada. A estratégia descrita pode também ser aplicada em laboratórios de investigação para estudar as diferentes espécies de fungos e a sua proximidade filogenética. As espécies de Candida detectadas e identificadas pelo método da invenção incluem as espécies com maior relevância clínica, nomeadamente C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. guilliermondii, C. lusitaniae e C. dubliniensis.

A simplicidade e eficácia deste método são também evidenciadas por outras características apresentadas pela invenção descrita. A estratégia desenhada possibilita o uso de células inteiras directamente na reacção de

PCR, eliminando os demorados e trabalhosos procedimentos necessários ao isolamento de

DNA e reduzindo o tempo necessário para a identificação (Figura 2B). Além disso, um método baseado em PCR tem a possibilidade de detectar tanto células viáveis como células mortas, aumentando em muitas vezes a sequência alvo a amplificar, constituindo uma grande vantagem em relação aos métodos culturais.

Por outro lado, o facto de também ser possível detectar e identificar leveduras presentes em sangue periférico assume grande importância clínica, uma vez que não é necessário esperar que a hemocultura se torne positiva ultrapassando assim os tempos geralmente demorados que os métodos de subcultura implicam. De facto, com o método proposto na

presente	invenção	são	necessárias 1,5	horas	para	se
proceder	à ruptura	das	células do sangue	e isolar DNA	de
Candida,	2 horas	para	a amplificação	do DNA	por	PCR
multiplex	e 1 hora	para	a electroforese em	gel de	agarose e

visualização dos resultados. Desta forma, a espécie pode identificar-se em cerca de 4,5 horas, em contraste com os métodos fenotipicos que podem demorar vários dias. 0 número mínimo de células de Candida detectado por esta metodologia é cerca de 800 CFU/ml, um valor aceitável tendo em conta que quando uma hemocultura se torna positiva, o número de células geralmente presente ronda 10⁵ CFU/ml. Contudo, este valor poderia ainda ser diminuído no caso de se proceder a uma purificação do DNA isolado, de forma a eliminar possíveis factores inibitórios da reacção de PCR (Panaccio et al., Nucleic Acid Res. 19:1151 (1991); Maaroufi et al., J. Clin. Microbiol. 42:3159-63 (2004)).

Além disso, os agentes etiológicos intervenientes em infecções polifúngicas de Candida não são identificados separadamente pelos métodos convencionais, incluindo os sistemas de identificação comerciais, enquanto que o método aqui descrito permite não só a identificação de espécies de Candida isoladamente, mas também em combinações umas com as outras (Figura 2C). De facto, este método tem a capacidade de detectar infecções polifúngicas de forma discriminatória a partir de uma hemocultura, contrariamente ao que ocorre com os métodos convencionais de isolamento por subcultura, em que a razão da proliferação dos diferentes tipos celulares tem um forte impacto na identificação. No caso particular de culturas microbianas mistas (crescimento fúngico e bacteriano simultâneo), não foram obtidos produtos de PCR detectáveis usando DNA de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Bacillus subtilis, apesar das espécies de Candida serem identificadas sem qualquer interferência.

Também em termos económicos, esta estratégia revela-se extremamente atractiva, tendo em conta que os principais gastos são efectuados ao nível dos componentes da mistura de PCR, não sendo necessárias sondas de DNA ou enzimas de restrição de elevado custo. Finalmente, uma das principais vantagens que esta metodologia apresenta é a reprodutibilidade da técnica quando efectuada por diferentes pessoas e usando máquinas diferentes, o que por si só facilita sobremaneira a sua implementação em laboratórios de diagnóstico. Adicionalmente, a sua execução requer apenas equipamento comum geralmente em uso na maioria dos laboratórios clínicos e se não, facilmente implementado. No seu conjunto, as características apresentadas por esta nova técnica aliadas à facilidade de interpretação dos resultados apontam para uma aplicabilidade altamente vantajosa no que se refere à identificação do agente etiológico nas infecções por Candida, tanto na prática clínica como em estudos epidemiológicos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Tabela I descreve os primers universais e específicos para cada espécie de Candida usados na metodologia de PCR multiplex apresentada, a respectiva sequência nucleotidica e o tamanho previsto dos fragmentos visualizados após electroforese em gel de agarose.

A FIG. 1 ilustra a estratégia de PCR multiplex apresentada. Particularmente, a FIG. 1 representa a organização dos genes ribossomais fúngicos e indicação do local alvo dos primers universais (UNI1 e UNI2) e específicos (Calb, Cgla, Ckru, Cpar, Ctro, Cgui, Clus e Cdub).

A FIG. 2 (2A, 2B e 2C) mostra os resultados experimentais obtidos por electroforese em gel de agarose após amplificação por PCR multiplex. Mais especificamente, a FIG. 2A representa a amplificação de DNA isolado de Candida, a FIG. 2B representa a amplificação usando células inteiras de Candida e finalmente, a FIG. 2C mostra o resultado obtido quando se usam culturas polifúngicas de Candida {lane 1 - marcador padrão de 100 pb; lane 2 - C. albicans; lane 3 - C. glabrata; lane 4 - C. krusei; lane 5 - C. parapsilosis; lane 6 - C. tropicalis; lane 7 - C. guilliermondii; lane 8 - C. lusitaniae; lane 9 - C. dublininiensis; lane Ml - C. albicans+C. glabrata; lane M2

C. albicans+C. krusei; lane M3 - C. albicans+C. parapsilosis; lane M4 - C. albicans+C. tropicalis; e lane M5 - C. albicans+C. glabrata+C. krusei, respectivamente.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece na sua forma mais generalizada, um método para detectar e identificar rápida e precisamente espécies de Candida com importância clinica numa determinada amostra, compreendendo os seguintes passos:

(i) libertação, isolamento e/ou concentração dos ácidos nucleicos dos fungos possivelmente presentes na amostra, (ii) amplificação por PCR multiplex de fragmentos específicos das regiões ITS nos ácidos nucleicos do passo (i) , de acordo com a espécie de Candida em causa, (iii) visualização dos produtos da amplificação do passo (ii) por electroforese em gel de agarose.

A amplificação dos ácidos nucleicos é efectuada através da reacção de PCR (Saiki et al., Science 239:487-91 (1988)). Na amplificação do passo (ii) são usados os seguintes primers na reacção de PCR: GTCAAACTTGGTCATTTA (UNI1 - Seq

ID n° 1), TTCTTTTCCTCCGCTTATTGA	(UNI2 -	Seq	ID n°	2)
AGCTGCCGCCAGAGGTCTAA	(Calb	Seq	ID	n°	3)
GATTTGCTTAATTGCCCCAC	(Ctro	Seq	ID	n°	4)
GTCAACCGATTATTTAATAG	(Cpar	Seq	ID	n°	5)

CTGGCCGAGCGAACTAGACT	(Ckru	-	Seq	ID	n°	6),
TTCGGAGCAACGCCTAACCG	(Clus	-	Seq	ID	n°	7),
TTGGCCTAGAGATAGGTTGG	(Cgui	-	Seq	ID	n°	8) ,
CTCAAACCCCTAGGGTTTGG	(Cdub -	Seq ID n° 9) .	As	sequências
apresentadas como Seq	ID n°	1 e 2	representam	os primers
universais e têm como	alvo a	região	terminal	da	unidade 18S

e a região inicial da unidade 25S, respectivamente, de todos os fungos pertencentes ao género Candida. 0 termo primers universais significa que este par de primers amplifica as regiões ITS-1 e ITS-2 na íntegra da maioria, ou mesmo da totalidade, das espécies de fungos. As sequências dos primers universais são filogeneticamente conservadas de forma a permitir a amplificação de DNA de diferentes géneros de fungos e têm como alvo os genes de rRNA que flanqueiam as regiões ITS, i.e., os genes de rRNA 18S e 25S. Os primers universais usados no método relatado na presente invenção foram descritos por Trost et al. (Trost et al., J. Microbiol. Methods 56:201-11 (2004)).

Os produtos de PCR resultantes da amplificação usando os primers universais (SEQ ID NO 1, 2) apresentam tamanhos que variam desde 433 pb (C. lusitaniae) até 929 pb (C. glabrata). Contudo, desta forma, a maioria das espécies de Candida não é facilmente discriminada apenas com base nestes fragmentos. Por isso, variações exclusivas nas regiões ITS-1 e ITS-2 de cada espécie de Candida foram usadas para o desenho de primers com o intuito de amplificar um segundo fragmento de menor tamanho, que facilitasse a discriminação da espécie em causa. Neste sentido, variações específicas nas regiões ITS-1 e ITS-2 das estirpes de referência e todos os isolados clínicos disponíveis na base de dados da EMBL/GenBank foram analisadas através de alinhamentos intra-espécies, de forma a encontrar blocos de regiões conservadas entre as diferentes estirpes. A seguir, estas sequências foram comparadas entre espécies de forma a encontrar regiões variáveis que permitissem o desenho de primers específicos para cada espécie de Candida. Este estudo in silico concluiu com o desenho de primers em regiões variáveis entre espécies, mas ao mesmo tempo conservadas entre estirpes (SEQ ID NO: 3-9), excluindo desta forma, a possibilidade de ocorrer variabilidade intra-espécie. Para o caso particular de C. glabrata, foi desenhada uma estratégia de apenas um fragmento, uma vez que o tamanho do fragmento obtido por amplificação com os primers universais (929 pb) permitia a fácil distinção desta espécie. As sequências apresentadas como Seq ID n° 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9 representam os primers específicos para cada uma das espécies de Candida, e que têm como alvo, como ilustrado a seguir na secção dos Exemplos (ver Tabela I): a região ITS1 de C. albicans (Seq ID n° 3), a região ITS-1 de C. tropicalis (Seq ID n° 4), a região ITS-1 de C. parapsilosis (Seq ID n° 5), a região ITS-2 de C. krusei (Seq ID n° 6) , a região ITS-2 de C. lusitaniae (Seq ID n° 7), a região ITS-1 de C. guilliermondii (Seq ID n° 8), e a região ITS-2 de C. dubliniensis (Seq ID n° 9). De realçar que todos os primers específicos amplificam na direcção oposta ao primer UNI2, com excepção do primer Clus (Seq ID n° 7), que amplifica na direcção oposta ao primer UNI1. Um mínimo de um par de bases de diferença entre sequências é suficiente para o desenho de um primer discriminatório. Os primers usados nesta invenção e sua sequência, e os tamanhos dos produtos de PCR a obter estão descritos na Tabela I.

Tabela I - primers universais e específicos para cada uma das diferentes espécies de Candida usados na metodologia de

PCR multiplex de acordo com a presente invenção, a respectiva sequência nucleotídica, e o tamanho previsto dos fragmentos visualizados após electroforese em gel de agarose.

Espécie	Nomenclatura do primer	Sequência nucleotídica (5'3' )	Tamanho do fragmento (pb)
			Trost et
Todos os	UNI1	GTCAAACTTGGTCATTTA	al.,
fungos	UNI2	TTCTTTTCCTCCGCTTATTG	(2004)
C. albicans	Calb	AGCTGCCGCCAGAGGTCTAA	583/446
C. glabrata	-	-	929/-
C. tropicalis	Ctro	GATTTGCTTAATTGCCCCAC	583/507
C.
parapsilosis	Cpar	GTCAACCGATTATTTAATAG	570/370
C.. krusei	Ckru	CTGGCCGAGCGAACTAGACT	590/169
C. lusitaniae	Clus	TTCGGAGCAACGCCTAACCG	433/329
C.
guilliermondii	Cgui	TTGGCCTAGAGATAGGTTGG	668/512
C.
dubliniensis	Cdub	CTCAAACCCCTAGGGTTTGG	591/217

A metodologia aqui apresentada foi optimizada com base em DNA de estirpes tipo de Candida e testada em várias estirpes isoladas de amostras clínicas. Assim, as estirpes de Candida usadas para validar o método foram isoladas de amostras clinicas em duas instituições hospitalares de Portugal, uma da região Norte (Hospital de São João, Porto) e outra da região Sul do país (Hospital de Santa Maria, Lisboa), num total de 386 isolados clínicos (245 C. albicans, 61 C. parapsilosis, 25 C. tropicalis, 19 C. krusei, 18 C. glabrata, 13 C. guilliermondii e 5 C.

lusitaniae) e 8 estirpes tipo (C. albicans ATCC 18804, C. glabrata ATCC 2001, C. tropicalis ATCC 750, C. parapsilosis ATCC 22019, C. krusei ATCC 6258, C. lusitaniae ATCC 34449, C. guilliermondii ATCC 6260 e C. dubliniensis ATCC MYA646). A identificação primária dos isolados clínicos foi levada a cabo nas instituições hospitalares através de sistemas de identificação comerciais com base em caracteristicas bioquímicas e posteriormente confirmada usando a estratégia de PCR multiplex de acordo com a presente invenção. Além disso, todas as identificações cujos resultados eram diferentes daqueles disponibilizados pelas instituições de referência foram confirmadas usando um método de fingerprinting molecular (Correia et al., J. Clin. Microbiol. 42:5899-903 (2004)).

A amplificação de ácidos nucleicos para a sua detecção tem como óbvia vantagem o facto de aumentar a sensibilidade de detecção. Além disso, usando primers universais, podem amplificar-se conjuntamente as regiões ITS de várias espécies de Candida, enquanto a posterior amplificação com os primers específicos permite a identificação de múltiplas espécies simultaneamente presentes na mesma amostra. É importante referir que as regiões ITS, a partir das quais foram desenhados os primers específicos, não possuem correspondência em termos de sequência de DNA em mamíferos, bactérias ou vírus. Este facto é importante na medida em que se evita a amplificação falsamente positiva de DNA mamífero que irá estar presente nas amostras clinicas. Todos os primers usados foram sintetizados pela MWG Biotech.

A presente invenção apresenta ainda a clara possibilidade da preparação de kits contendo os elementos necessários para levar a cabo o processo. 0 kit deve compreender um sistema de transporte compartimentalizado em pequenas células para receber em confinamento apertado, os reagentes necessários. Os reagentes usados na invenção devem ser fornecidos no kit em quantidades predeterminadas para o uso no processo de identificação das espécies de Candida. Uma ou mais células deverão conter a mistura de prímers e restantes reagentes, incluindo a enzima Taq polimerase, a usar nas reacções de PCR, na forma liofilizada ou numa solução tampão apropriada.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Isolamento de DNA de células de Candida em cultura

As células de Candida eram crescidas durante a noite em meio YEPD líquido a 26°C com arejamento num agitador mecânico (150 rpm). As células eram colhidas por centrifugação e o sedimento suspendido em 200 μΐ de tampão de lise (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM TrisHcl e 1 mM EDTA, pH 8,0). Para a ruptura celular, 200 μΐ de esferas de vidro com diâmetro 0,5 mm e 200 μΐ de fenol/clorofórmio (1:1) eram adicionados e os tubos agitados durante três intervalos de 60 s intervalados com períodos de arrefecimento em gelo. Após os detritos celulares serem removidos por uma centrifugação de 5 minutos a 18.000xgr, o sobrenadante era colhido e 1 ml de álcool absoluto frio era adicionado antes de misturar por inversão. Os tubos eram centrifugados a 18.000*g durante 3 minutos e o sedimento suspendido em 400 μΐ de tampão TE (100 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). Um tratamento de 5 minutos com RNase A (1 mg/ml) a 37°C era levado a cabo antes da adição de 10 μΐ de acetato de sódio 3 Μ. O DNA era novamente precipitado pela adição de 1 ml de álcool absoluto frio, misturado por inversão e sujeito a nova centrifugação. Finalmente, o DNA era seco à temperatura

ambiente e	suspendido	em	50 μΐ de água	esterilizada	. 0
conteúdo de	DNA e a	sua	pureza eram	determinados	por
espectrofotometria a	260	e 280 nm e diluído para	uma
concentração	final de	100	ng/ μΐ a fim	de ser usado	de
acordo com o	Exemplo 2

EXEMPLO 2

Amplificação por PCR multiplex

A amplificação por PCR multiplex foi efectuada num volume de 20 μΐ consistindo de 0,8* tampão de PCR [160 mM (NH₄)₂SO₄, 670 mM Tris-HCl (pH 8,8)], 3,5 mM MgCl₂, mistura de dNTPs (200 μΜ cada), mistura de primers (SEQ ID NO 1 e 2, 0,55 μΜ cada; SEQ ID 3 e 6, 0,15 μΜ cada; SEQ ID NO 4 e 7, 0,2 μΜ; SEQ ID NO 5, 0,3 μΜ; SEQ ID NO 8, 0,05 μΜ; SEQ ID NO 9, 0,4 μΜ) , 1 U Taq DNA polimerase e 100 ng de DNA genómico, com o restante volume constituído por água esterilizada. Para a amplificação por multiplex PCR usando células inteiras, parte de uma colónia isolada era suspendida directamente no tubo de reacção. A reacção foi levada a cabo rotineiramente usando um termociclador Biometra Tpersonal (whatman Biometra) sob as seguintes condições: 40 ciclos de 15 s a 94°C, 30 s a 55°C, e 45 s a 65°C, após um período inicial de 10 minutos para a desnaturação e activação da enzima a 94°C. Reacções de controlo negativo eram efectuadas em simultâneo com cada teste substituindo o DNA por água esterilizada na mistura de PCR. Uma alíquota de 10 μΐ de cada um dos produtos de amplificação era separada por electroforese num gel de agarose 2%. O uso de brometo de etídio (0,5 pg) permitia a visualização dos fragmentos de DNA com um sistema digital de imagem (Alpha Innotech Corporation) e a identificação da espécie de Candida em causa era possível por comparação com um marcador padrão de 100 pb (Fermentas).

EXEMPLO 3

Detecção e identificação de Candida em sangue periférico

De forma a estipular o limite de detecção do método, sangue periférico humano foi semeado com células de várias espécies de Candida isoladamente, entre as quais C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis e C. tropicalis até atingir uma concentração de 2,5*10⁵ CFU/ml. 0 número de células (CFU/ml) foi estimado por contagem em hemacitómetro e confirmada por plaqueamento de diluições seriadas de sangue semeado com Candida em placas de meio Sabouraud sólido e contagem de unidades formadoras de colónias após 2 dias de incubação a 30°C. O sangue semeado era depois diluído várias vezes com sangue não semeado (concentrações variavam entre 2,5*10⁵ e l,25*10³ CFU/ml) e 200 μΐ das amostras diluídas eram sujeitas a isolamento de DNA, de acordo com o Exemplo 4.

EXEMPLO 4

Isolamento de DNA de Candida presente em sangue periférico Para isolar DNA de Candida presente em sangue periférico, recorreu-se a um método baseado no uso de calor, detergente e ruptura mecânica das células de Candida, de acordo com o descrito por Shin et al. (1997). Assim, a 200 μΐ de amostra obtida de acordo com o descrito em Exemplo 3 eram adicionados 800 μΐ de tampão TXTE (10 mM Tris-HCl, lmM EDTA, 1% Triton X-100, pH 8,0) num tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml. A seguir, a mistura era incubada a 25°C durante 10 minutos para ocorrer lise das células sanguíneas. Os detritos resultantes da ruptura das células do sangue eram removidos por centrifugação a 18.000xg durante 8 minutos. De seguida, o sedimento obtido era lavado três vezes com o tampão TXTE, as células de Candida eram suspendidas em 300 μΐ de tampão TXTE e 200 μΐ de esferas de vidro com diâmetro 0,5 mm eram adicionadas. Após fervura durante 15 minutos em banho-maria, a mistura era agitada durante 20 minutos recorrendo a um vórtex. Finalmente, os tubos eram centrifugados a 18.000xg durante 20 s e o sobrenadante era usado na amplificação de PCR, como descrito em Exemplo 2.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Claims

1. Um fragmento de DNA isolado das regiões ITS-1 e ITS-2 de Candida, caracterizado por conter uma sequência nucleotídica idêntica a qualquer uma seleccionada de entre seguintes:

a) Seq ID n° 3: 5' -AGCTGCCGCCAGAGGTCTAA-3', b) Seq ID n° 4: 5'-GATTTGCTTAATTGCCCCAC-3', c) Seq ID n° 5: 5'-GTCAACCGATTATTTAATAG-3' , d) Seq ID n° 6: 5'-CTGGCCGAGCGAACTAGACT-3', e) Seq ID n° 7: 5'-TTCGGAGCAACGCCTAACCG-3' , f) Seq ID n° 8: 5'-TTGGCCTAGAGATAGGTTGG-3', g) Seq ID n° 9: 5'-CTCAAACCCCTAGGGTTTGG-3',

e sequências complementares a estas.

2. Um primer caracterizado por consistir numa sequência nucleotídica idêntica a qualquer uma seleccionada de entre as Seq ID n° 3-9 de acordo com a reivindicação 1.

3. Um conjunto de primers, caracterizado por compreender primers universais para fungos e pelo menos um primer de acordo com a reivindicação 2.

4. Um método para a amplificação de fragmentos de DNA com sequência nucleotídica idêntica a qualquer uma seleccionada de entre as Seq ID n° 3-9 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a realização de uma PCR usando o conjunto de primers de acordo com a reivindicação 3.

5. 0 método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a PCR realizada ser a PCR multiplex.

6. Um método para a detecção e identificação selectiva de espécies de Candida presentes em amostras clinicas, caracterizado por compreender os seguintes passos:

a) amplificação por PCR multiplex do DNA das espécies de Candida presentes na amostra usando o conjunto de primers de acordo com a reivindicação 3; e

b) detecção dos produtos da amplificação.

7. 0 método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o DNA das espécies de Candida presentes na amostra ser DNA isolado, de células inteiras ou extractos celulares de Candida, ou de uma cultura polifúngica de Candida.

8. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado por o conjunto de primers usado compreender o primer com sequência nucleotidica idêntica à Seq ID n° 3 e o fungo identificado ser da espécie Candida albicans.

9. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado por o conjunto de primers usado compreender o primer com sequência nucleotidica idêntica à Seq ID n° 4 e o fungo identificado ser da espécie Candida tropicalis.

10. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado por o conjunto de primers usado compreender o primer com sequência nucleotidica idêntica à Seq ID n° 5 e o fungo identificado ser da espécie Candida parapsilosis.

11. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado por o conjunto de primers usado compreender o primer com sequência nucleotídica idêntica à Seq ID n° 6 e o fungo identificado ser da espécie Candida krusei.

12. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado por o conjunto de primers usado compreender o primer com sequência nucleotídica idêntica à Seq ID n° 7 e o fungo identificado ser da espécie Candida lusitaniae.

13. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado por o conjunto de primers usado compreender o primer com sequência nucleotídica idêntica à Seq ID n° 8 e o fungo identificado ser da espécie Candida guilliermondii.

14. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado por o conjunto de primers usado compreender o primer com sequência nucleotídica idêntica à Seq ID n° 9 e o fungo identificado ser da espécie Candida dubliniensis.

15. Um kit para a detecção e identificação selectiva de espécies de Candida presentes em amostras clínicas segundo o método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 14, caracterizado por compreender o conjunto de primers de acordo com a reivindicação 3.