CN108504765B

CN108504765B - 实时荧光pcr真菌检测引物、探针、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN108504765B
Application number: CN201810536632.8A
Authority: CN
Inventors: 尹华立; 赵西浩; 郑银娜; 裘惠良
Original assignee: Hangzhou Boxin Biotechnology Co ltd; Hangzhou Qianji Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Meilian Medical Co ltd; Hangzhou Qianji Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2038-05-30
Also published as: CN108504765A

Abstract

本发明涉及一种实时荧光PCR真菌检测引物、探针、试剂盒及检测方法，其实时荧光PCR真菌检测引物，所述引物包括：上游引物ITSF1和下游引物ITSR1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1‑2所示。本发明的实时荧光PCR真菌检测试剂盒具有能实现三类真菌的区分检测及念珠菌的种鉴定的优点。

Description

实时荧光PCR真菌检测引物、探针、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及微生物检测技术，特别涉及一种实时荧光PCR真菌检测引物、探针、试剂盒及检测方法

背景技术

近年来，随着广谱抗生素、免疫抑制剂、抗恶性肿瘤药物的广泛应用，以及器官移植、各种侵入性诊疗技术的深入开展，致病真菌感染日益增多。致病真菌主要包括念珠菌、曲霉菌、隐球菌、接合菌等。研究认为，念珠菌、曲霉菌、肺孢子菌和隐球菌是最主要的致病真菌感染病原菌，其中念珠菌居首。全世界每年约1.4million患者因为这四种致病真菌感染死亡，而真菌病中，90％致死率的真菌为隐球菌、念珠菌、曲霉菌和肺孢子菌。据统计数据显示，2014年共收集3310株致病真菌菌株，91.4％为念珠菌、隐球菌6.3％、毛孢子菌1.0％、其他菌属1.3％。其中念珠菌中白念念珠菌占比41.4％、热带念珠菌占比15％、近平滑念珠菌占比16.9％、光滑念珠菌9.3％、季也蒙念珠菌2.6％、克柔念珠菌1.3％。

目前，致病真菌感染的流行病学特征已发生改变，白色念珠菌曾是念珠菌感染的主要菌种类型，然而研究认为，近年来光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌等其他念珠菌的感染率也在逐渐上升；北美及欧洲的许多中心调查显示，以往不常见的真菌，如隐球菌属、镰刀菌属等，现在其发病率也有所提高，尤其隐球菌属发病率仅次于念珠菌属和曲霉菌属。

然而，目前对致病真菌的检测主要还是依赖传统的检测方法，包括培养法、显微镜检查、酶联免疫、血清培养、免疫学等，但是这些方法一般耗时长、敏感性差，而且容易出现假阳性或假阴性结果。再者，培养过程中真菌会在感染部位迅速增殖，等到培养结果出来之前可能就会发生很严重的后果，容易延误病情的诊断与及时预防治疗。另外，大多数学者利用真菌通用引物ITS4和ITS86检测rRNA基因的ITSII序列，可以将致病真菌鉴定到属，但该方法需要借助于测序来鉴定真菌的种类，耗时较长，不利于致病真菌感染的早期诊断。鲁卫平等采用构建通用引物的一次PCR法，并结合纳米金新型基因芯片检测系统，实现了一次对多个临床常见致病酵母菌的检测分析，但是生物芯片技术存在着成本高、复杂、灵敏度低、重复性差等缺点，限制了生物芯片的广泛应用。近年来，质谱技术以其快速准确的优点被用于微生物鉴定，由于质谱鉴定必须是培养后分纯的单克隆菌落，而且设备昂贵，操作难度高等限制了其应用。

实时荧光PCR技术作为一种新兴的检测手段，具有敏感性好、重复性好、避免PCR污染、检测时间短、自动化程度高、线性范围宽等优点，逐渐被应用到病原性真菌检测中。郭强等采用实时荧光定量PCR，建立了快速鉴定白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌的方法，以真菌通用引物ITS4、ITS86为检测引物，最低检测下限达到1-5CFU/mL，可同时检测5种念珠菌。鲁巧云等采用基于TaqMan水解探针的实时荧光定量PCR的方法，建立了真菌通用检测体系、念珠菌检测体系、曲霉检测体系，以血清为标本可将临床常见的曲霉和念珠菌鉴定到属的水平。韩学贞等采用荧光定量PCR染料结合法检测致病真菌，建立的检测体系可检测念珠菌属、曲霉菌属、新型隐球菌。

目前，CN201110417477.6专利公开了一种通过分子信标探针来检测白色念珠菌的试剂盒；CN201410017428.7专利公开了一种提供核酸释放剂和检测白色念珠菌的试剂盒；CN200910098559.1专利公开了一种荧光定量PCR检测肠道近平滑念珠菌的试剂盒；CN200910098556.8和CN 201610589461.6专利分别公开了一种荧光定量PCR检测克柔念珠菌的试剂盒；CN 201510011617.8专利公开了一种检测光滑念珠菌的试剂盒；CN201410017251.0、CN 201710172567.0和CN 201310206320.8专利公开了一种检测隐球菌的试剂盒。以上几篇专利均是单一菌种检测技术，而且仅仅是通过CT值来进行判读结果，不能同时对多个菌同时进行检测。CN 201610765955.5专利则公开了通过分别设计三对引物、三条探针，采用荧光定量PCR法对白色念珠菌、隐球菌、曲霉菌进行检测，由于近年来非白色念珠菌病感染率明显高于白色念珠菌感染，该专利的检测范围明显较窄；CN 200910038182.0专利公开了一种针对氟康唑敏感度不同的念珠菌检测试剂盒，具体检测四种或四种以上的念珠菌；CN 201410820825.8专利公开了通过比对白色假丝酵母、光滑假丝酵母、近平滑假丝酵母、乳酒假丝酵母、清酒假丝酵母、克柔假丝酵母、季也蒙假丝酵母、热带假丝酵母、黑曲霉、黄曲霉、烟曲霉、土曲霉、新生隐球菌、米根霉、卷枝毛霉的保守序列，设计三条引物、两条探针，荧光定量PCR检测念珠菌、隐球菌和曲霉，此方法虽然可以检测八种念珠菌，但只可检测到属，并不能具体检测到哪一种的感染；CN 201710691369.5专利公开了通过设计两对引物、两条探针，多重荧光定量PCR检测隐球菌和曲霉菌属。而以上几篇专利均不能对念珠菌进行鉴定。

另外，CN 200910152072.7和CN 201410503015.X专利公开了一种基因芯片检测念珠菌和隐球菌的试剂盒，通过杂交法对致病真菌进行检测，但该方法不仅耗时长，而且操作繁琐，同时由于开盖操作，造成污染的几率很大，远远不如本发明检测时间短、自动化程度高、避免PCR污染等优点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种实时荧光PCR真菌检测引物、探针、试剂盒及检测方法，可对常见致病真菌进行属的检测，且在此基础上，配合采用熔解曲线分析方法，可对念珠菌进行种鉴定。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种实时荧光PCR真菌检测引物，所述引物包括：

上游引物ITSF1和下游引物ITSR1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示。

一种实时荧光PCR真菌检测探针，所述探针包括探针CaP1、探针CgP1、探针CtP1、探针CkP1、探针CpP1、探针CguP1、探针QMJP1和探针CnP1，其核苷酸序列如SEQ ID No.5-12所示。

一种实时荧光PCR真菌检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括上述的实时荧光PCR真菌检测引物以及上述的实时荧光PCR真菌检测探针。

一种实时荧光PCR真菌检测方法，采用上述的实时荧光PCR真菌检测试剂盒进行检测。

本发明的有益效果在于：

(1)通过实时荧光PCR方法对念珠菌属、曲霉菌属及隐球菌属进行检测。

(2)同时配合采用熔解曲线分析方法，可以对念珠菌属中的白色念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌进行种鉴定。

(3)采用本发明提供的试剂盒可以快速、准确地确定患者感染真菌情况，为病情的判断提供参考依据，为合理用药，制定个体化医疗提供参考依据。

附图说明

图1为本发明实施例的实时荧光PCR真菌检测试剂盒中的念珠菌(Cgu、Ct、Cg、Cp、Ck)基因组DNA检测熔解曲线示意图；

图2为本发明实施例的实时荧光PCR真菌检测试剂盒中的念珠菌(Ca)基因组DNA检测熔解曲线示意图；

图3为本发明实施例的实时荧光PCR真菌检测试剂盒中的隐球菌(Cn)基因组DNA检测熔解曲线示意图；

图4为本发明实施例的实时荧光PCR真菌检测试剂盒中的黑曲霉、黄曲霉、烟曲霉、土曲霉基因组DNA检测熔解曲线示意图；

图5a-c为本发明实施例的实时荧光PCR真菌检测试剂盒中临床痰液样本的检测结果(依次对应FAM通道、cy5通道和ROX通道)。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明的缩略语如下述：

白色念珠菌(Candida albicans，Ca)、光滑念珠菌(Candida glabrata，Cg)、热带念珠菌(Candida tropicalis，Ct)、克柔念珠菌(Candida krusei，Ck)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis，Cp)、季也蒙念珠菌(Candida guilliermondii，Cgu)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans，Cn)、黑曲霉(Aspergillus niger，HEQ)、黄曲霉(Aspergillusflavus，HQ)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus，YQ)、土曲霉(Aspergillus terreus，TQ)。

本发明最关键的构思在于：设计可以对常见致病真菌进行属的检测，且可对念珠菌进行种鉴定的引物或探针序列。

一种实时荧光PCR真菌检测引物，所述引物包括：

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：

进一步的，所述引物还包括：内控上游引物ICF1和内控下游引物ICR1，其核苷酸序列如SEQ ID No.3-4所示。

进一步的，所述探针还包括：内控探针ICP1，其核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。

本发明提供一种实时荧光PCR真菌检测方法，其检测的真菌具体为：白色念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、土曲霉、黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、新型隐球菌、格特隐球菌，共计12种真菌。所述的方法能区分念珠菌属、曲霉菌属及隐球菌属。所述的方法能鉴定6种念珠菌(白色念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌)。

本发明提供的一种实时荧光PCR真菌检测方法，主要是选择真菌的18S-28S rRNA基因片段作为检测区域设计检测引物与检测探针，同时选择人基因组DNA中的管家基因(β-globin)作为内控设计检测引物与检测探针。

本发明共设计2对引物及9条不同荧光标记探针进行真菌检测及鉴定。

本发明提供的一种实时荧光PCR真菌检测试剂盒，其包含反应液。

所述的反应液包含以下引物(5’→3’)：

引物ITSF1:GGTTTCCGTAGGTGAAC(SEQ ID No.1)

引物ITSR1:GCATCCCACGGGCTCTCACC(SEQ ID No.2)

引物ICF1：AATCCAGCTACCATTCTGCTT(SEQ ID No.3)

引物ICR1：TGATAGGCAGCCTGCACTG(SEQ ID No.4)

所述的反应液中含有内控引物ICF1及ICR1，用于监控样本核酸提取及PCR扩增，防止假阴性。

所述的反应液同时包含以下检测探针(5’→3’)：

探针CaP1：ACTTTGACCTCAAATCAGGTA(SEQ ID No.5)

探针CgP1：TGGTAGTGAGTGATACTCTC(SEQ ID No.6)

探针CtP1：CTAGGTTTGTTTGAAAGAAT(SEQ ID No.7)

探针CkP1：ATCGATGAAGAGCGCAGCG(SEQ ID No.8)

探针CpP1：CATTGCGCCCTTTGGTATTCC(SEQ ID No.9)

探针CguP1：CTAGATAGTGCTGTCGAC(SEQ ID No.10)

探针QMJP1：CAACGGATCTCTTGGTTCCGG(SEQ ID No.11)

探针CnP1：CTTTGGTATTCCGAAGGGCAT(SEQ ID No.12)

探针ICP1：TTTTGCTAATCATGTTCATACCTC(SEQ ID No.13)

所述的检测探针荧光标记为：序列为SEQ ID No.5、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11探针的5’端修饰cy5，3’端修饰BHQ3；序列为SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9探针的5’端修饰FAM，3’端修饰BHQ1；序列为SEQ ID No.8、SEQ ID No.12探针5’端修饰ROX，3’端修饰BHQ2；序列为SEQ ID No.13探针5’端修饰HEX，3’端修饰BHQ1。所述的ICP1探针用于核酸提取及PCR扩增监控，防止假阴性。

本发明提供的一种实时荧光PCR真菌检测试剂盒的反应体系为：

10×PCR buffer 2.5ul，5×probe buffer 5ul，20mM dN(U)TP 0.2ul，5U/ulHotstart Taq 0.2ul，2U/ul UDG 0.1ul，10uM ITSF1 1ul，10uM ITSR1 0.1ul，10uM ICF10.1ul，10uM ICR1 0.1ul，5pmol probe(9条探针)，DNA 4ul，total 25ul。

本发明提供的一种实时荧光PCR真菌检测试剂盒的PCR反应及溶解曲线分析程序为：

50℃，2min，1cycle；95℃，3min，1cycle；95℃10s，56℃30s(采集荧光)，72℃30s，50-70cycles；熔解曲线段：95℃2min；40℃-85℃(continuous)采集荧光。

实施例1：PCR扩增引物、探针的设计与筛选

通过NCBI数据库中查找并下载6种念珠菌、4种曲霉菌及2种隐球菌的18S-28SrRNA的ITS基因序列，使用DNAstar megAlign功能进行所有核酸序列进行BLAST比对，针对同源区域设计检测引物，针对不同源区域进行探针设计，保证检测探针的Tm比检测引物的Tm高5-10度左右。为了能有效对念珠菌进行鉴定及三类真菌进行区分，每种菌的检测探针利用Tm计算软件设计成不同Tm(每条探针Tm差3度左右)的检测探针，并由DNA合成公司进行合成。引物探针合成后通过大量的试验筛选及组合测试，筛选灵敏度满足要求的检测引物，及能有效鉴定12种真菌的检测探针。

检测引物的序列如下(5’→3’)：

引物ITSF1:GGTTTCCGTAGGTGAAC(SEQ ID No.1)

引物ITSR1:GCATCCCACGGGCTCTCACC(SEQ ID No.2)

引物ICF1：AATCCAGCTACCATTCTGCTT(SEQ ID No.3)

引物ICR1：TGATAGGCAGCCTGCACTG(SEQ ID No.4)

检测探针序列如下(5’→3’)：

探针CaP1：ACTTTGACCTCAAATCAGGTA(SEQ ID No.5)

探针CgP1：TGGTAGTGAGTGATACTCTC(SEQ ID No.6)

探针CtP1：CTAGGTTTGTTTGAAAGAAT(SEQ ID No.7)

探针CkP1：ATCGATGAAGAGCGCAGCG(SEQ ID No.8)

探针CpP1：CATTGCGCCCTTTGGTATTCC(SEQ ID No.9)

探针CguP1：CTAGATAGTGCTGTCGAC(SEQ ID No.10)

探针QMJP1：CAACGGATCTCTTGGTTCCGG(SEQ ID No.11)

探针CnP1：CTTTGGTATTCCGAAGGGCAT(SEQ ID No.12)

探针ICP1：TTTTGCTAATCATGTTCATACCTC(SEQ ID No.13)

实施例2：PCR扩增体系的确认

利用正交试验的方法，通过大量实验测试不同的引物浓度组合及组分浓度的优化，最终确定PCR反应体系(1人份)如下表1。

表1

名称	量值(ul)
		10×PCR buffer	2.5
5×probe buffer	5
		20mM dN(U)TP	0.2
5U/ul Hotstart Taq	0.2
		2U/ul UDG	0.1
10uM ITSF1	1
		10uM ITSR1	0.1
10uM ICF1	0.1
		10uM ICR1	0.1
10uM Probe	各0.5
		DNA	4
Total	25

实施例3：PCR反应程序确认

经过大量实验优化，最终确定的扩增程序如下表2：

表2

注：在58℃和熔解段采集荧光信号。

实施例4：结果判读标准确认

经过大量的临床样本测试及不同浓度基因组DNA测试，确定12种真菌检测Tm及内控检测Ct之判读标准，详见表3。

表3

HEX通道为IC，Ct≤45(且为光滑S型曲线)。

实施例5：灵敏度的检测

使用外购的白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、烟曲霉菌株进行28℃液体培养2-3天，然后采用真菌核酸提取试剂盒提取基因组DNA，然后进行梯度稀释，对10pg/ul、1pg/ul、0.5pg/ul、0.1pg/ul三个浓度进行检测。各个真菌灵敏度均能达到0.1pg/ul。

实施例6：临床样本检测

收集15例临床痰液样本，按照如下方式进行核酸检测。

1、痰液样本的采集

晨痰、漱口，深咳呼吸道深部痰(非后鼻部分泌物、非唾液)留于无菌容器内。对于痰量少或无痰的患者可采用雾化吸入45℃10％NaCL水溶液，使痰液易于排出。对咳痰少的幼儿，可轻轻压迫胸骨上部的气管，使其咳嗽。

2、痰液样本的处理

1)吸取2mL 4％NaOH溶液，加入1mL左右痰液，剧烈震荡5min，室温静置20min-2h(时间根据液化程度来定)。

2)取1mL完全液化(无粘滞态液体)的溶液，12000r/min离心2min，弃去上清。

3)用1mL生理盐水洗涤沉淀，12000r/min离心后去上清。

4)重复3步骤一次，沉淀留作核酸提取用。

3、核酸提取

采用杭州千基生物科技有限公司生产的《循环游离核酸提取试剂盒》并按照其说明书进行核酸提取。提取的核酸按照实施例中反应体系及反应程序进行检测。

检测结果见图5，此外，本发明的试剂盒在进行上述PCR反应程序之后，念珠菌与隐球菌基因组DNA检测熔解曲线示意图见图1、图2和图3，黑曲霉、黄曲霉、烟曲霉、土曲霉基因组DNA检测熔解曲线示意图见图4。图1-3中标示出的字母即对应的具体致病真菌的种类的缩略语。

核酸检测结果统计对比情况如下表4：

上述检测结果与培养法完全吻合。

总结以上，现有专利没有公开一种能同时检测三类真菌(念珠菌6种、曲霉菌4种、隐球菌2种)及对6种常见念珠菌感染进行种鉴定的实时荧光PCR方法及试剂。而且目前上市的产品中也只有针对某种真菌进行实时荧光检测。

本发明采用实时荧光PCR、不对称扩增及对称扩增技术及熔解曲线分析方法，对三类常见真菌感染进行检测及6种念珠菌进行鉴定，同时采用人基因组中的管家基因(β-globin)作为内控，从样本的核酸提取到扩增进行全程监控，有效防止假阴性。

鉴于实时荧光PCR仪的荧光通道问题，本发明提供的检测及鉴定方法利用实时荧光PCR仪中四个检测通道，同时检测12种真菌(根据不同探针的Tm不同进行鉴定区分)及内控，相比采用基因芯片的方法来说，能有效缩短检测时间，能为患者提供早治疗，而且基因芯片需要开管，易产生气溶胶污染，而本发明提供的检测方法为闭管操作，有效避免污染带来的假阳性。

三类真菌的区分检测及念珠菌的鉴定，能为医生提供临床指导个体化用药治疗，避免抗生素的滥用，减少临床耐药菌株的出现。

综上所述，本发明提供的实时荧光PCR真菌检测引物、探针、试剂盒及检测方法具有能实现三类真菌的区分检测及念珠菌的种鉴定的优点。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种实时荧光PCR真菌检测试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括实时荧光PCR真菌检测引物以及实时荧光PCR真菌检测探针；

所述实时荧光PCR真菌检测引物包括：上游引物ITSF1和下游引物ITSR1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示；

所述实时荧光PCR真菌检测探针包括：探针CaP1、探针CgP1、探针CtP1、探针CkP1、探针CpP1、探针CguP1、探针QMJP1和探针CnP1，其核苷酸序列如SEQ ID No.5-12所示。

2.根据权利要求1所述的实时荧光PCR真菌检测试剂盒，其特征在于，所述引物还包括：内控上游引物ICF1和内控下游引物ICR1，其核苷酸序列如SEQ ID No.3-4所示。

3.根据权利要求1所述的实时荧光PCR真菌检测试剂盒，其特征在于，所述探针还包括：内控探针ICP1，其核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。

4.根据权利要求3所述的实时荧光PCR真菌检测试剂盒，其特征在于，核苷酸序列如SEQID No.13所示的探针，其5’端修饰HEX，3’端修饰BHQ1；

核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.10及SEQ ID No.11所示的探针，其5’端修饰cy5，3’端修饰BHQ3；

核苷酸序列如SEQ ID No.6、SEQ ID No.7及SEQ ID No.9所示的探针，其5’端修饰FAM，3’端修饰BHQ1；

核苷酸序列如SEQ ID No.8、SEQ ID No.12所示的探针，其5’端修饰ROX，3’端修饰BHQ2。

5.根据权利要求4所述的实时荧光PCR真菌检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液的组分含量为：

水：7.2μL；

10×PCR buffer：2.5μL；

5×probe buffer：5μL；

20mM dN(U)TP：0.2μL；

5U/ul Hotstart Taq：0.2μL；

2U/ul UDG：0.1μL；

10uM上游引物ITSF1：1μL；

10uM下游引物ITSR1：0.1μL；

10uM内控上游引物ICF1：0.1μL；

10uM内控下游引物ICR1：0.1μL；

10uM探针CaP1、探针CgP1、探针CtP1、探针CkP1、探针CpP1、探针CguP1、探针QMJP1、探针CnP1和内控探针ICP1各0.5μL；

样本DNA：4μL。