CN109735645A - 一种检测球形孢子丝菌的实时荧光pcr引物、探针及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测球形孢子丝菌的实时荧光PCR引物、探针及试剂盒。通过对孢子丝菌复合体的ITS序列比对，发现具有差异碱基的序列，针对该序列设计实时荧光PCR引物和探针，其序列如SEQ ID NO.1‑2、SEQ ID NO.3所示。本发明的引物和探针能够特异、灵敏、准确地检测球形孢子丝菌，对球形孢子丝菌的检测限达到10fg，优于现有技术对球形孢子丝菌的检测灵敏度，具有良好的标本检测能力。

Description

一种检测球形孢子丝菌的实时荧光PCR引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于鉴别球形孢子丝菌的荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该引物和探针进行球形孢子丝菌检测的方法和试剂盒。

背景技术

孢子丝菌病(Sporotrichosis)是由双相真菌申克孢子丝菌复合体(Sporothrixschenckii complex)侵犯皮肤及皮下组织引起的慢性感染性疾病。病程长，皮损可固定于局部，或延淋巴管走行，严重者可通过血行系统播散，引起内脏器官的感染，也有报道称吸入的孢子可直接引起肺部感染。早期人们对申克孢子丝菌认识有限，认为其为单一物种。随着基因组学以及分子检测手段的不断发展，发现申克孢子丝菌是由多个亲缘种构成的复合体，其中球形孢子丝菌、申克孢子丝菌和巴西孢子丝菌构成了孢子丝菌属中主要的临床致病菌，其余孢子丝菌多为环境菌株，基本不致病。其中，球形孢子丝菌作为主要的临床致病菌，主要分布在亚洲地区，尤其是我国东北地区。许多研究学者对国内不同地区分离获得的孢子丝菌进行分子生物学鉴定，发现我国分布的基本全是球形孢子丝菌，仅在江西地区出现过一次发现申克孢子丝菌的报道。随着对孢子丝菌复合体研究的深入，发现不同种之间在致病力及药物敏感性方面存在明显差异，因此在孢子丝菌病的诊断及治疗过程中，对病原菌鉴定到种是十分必要的。

目前，临床上常用的孢子丝菌诊断方法包括直接镜检、培养、组织病理检查等。除培养外，都不能对其鉴定到种水平。由于种内形态十分相似，常需要经验丰富的真菌学专家进行鉴定，由于局部皮损真菌含量少，直接镜检阳性率较低。组织真菌培养是检测的金标准，但耗时较长，至少需要2-4周时间，因此无法作为临床快速诊断的依据。随着分子生物学技术发展，核酸检测技术逐渐应用到孢子丝菌的分型和检测中，常用的分子鉴定手段主要包括对目的片段扩增及测序、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)以及特异性引物普通PCR检测等。目前常用的孢子丝菌检测及分型的靶基因主要有内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)、钙调蛋白(calmodulin,CAL)、延长因子(elongation factors,EF)等，通过设计针对靶基因的特异性引物，扩增获得长度不同的目的片段，进一步运用琼脂糖凝胶电泳对其进行区分，从而对孢子丝菌进行种内鉴定。2015年，Rodrigues(参考文献：Rodrigues,A.M.et al.2015,9(12),e0004190.)建立了普通单重PCR检测技术可检测并区分球形孢子丝菌、申克孢子丝菌以及巴西孢子丝菌，是目前最灵敏和特异的致病孢子丝菌核酸检测技术。该方法使用普通PCR技术，检测的灵敏度和特异性相对较低，对每种致病孢子丝菌均需单独扩增，并进行凝胶电泳对扩增产物进行鉴定和检测，总检测时间至少需要三个小时以上。因此，建立更加灵敏、特异、便捷的区分不同种致病性孢子丝菌的检测技术非常必要。

实时荧光定量PCR方法在目标物检测灵敏度水平具有普通单重PCR不可逾越的优势，然而针对球形孢子丝菌(Sporothrix globosa)的实时荧光定量PCR至今未见报道。内转录间隔区(600-800bp)在进化过程中承受的自然选择压力非常小,因此能容忍更多的变异。在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性,即为种内相对一致,种间差异比较明显。然而，对于孢子丝菌属，由于申克孢子丝菌具有高度的同源重组性，其种内的变化差异很大，这一特点使其与同属内非常相近的球形孢子丝菌很难区分，但是由于ITS区具有高拷贝数的优点，在每个单倍染色体基因组中拷贝数超过200个，这能够极大的提高检测的灵敏度。另外，荧光定量PCR对于特异性引物和探针的设计具有较高的要求和需满足的原则，其要求目标核苷酸序列长度在100-150bp左右，在较小的片段中不仅要设计出适合的引物，也要设计出符合要求的特异性探针。将球形孢子丝菌内转录间隔区序列目标序列输入软件中，无法找到符合荧光PCR要求特异性的引物及探针。只能根据经验，进行人工调整及较对。因此，对于球形孢子丝菌(SG)实时荧光PCR鉴定球形孢子丝菌来说，采用公知的引物设计软件并不能获得满足要求的引物和探针。

发明内容

本发明的目的在于提供检测球形孢子丝菌的荧光定量PCR方法以及用于该方法的特异性引物和探针。

为实现上述目的，发明人首先对NCBI数据库中报道的孢子丝菌所有种属基因组进行比对，选取孢子丝菌种特异性ITS序列进一步进行分析，对NCBI数据库中具有代表性的孢子丝菌复合体的ITS序列使用Vector NTI Suite 6软件序列比对，找出SG特异性碱基差异的序列(见图1)，将此段序列作为球形孢子丝菌实时荧光PCR检测靶序列使用。该序列如SEQID NO.4所示。

使用Primer Express Version软件设计球形孢子丝菌(以下简称SG)特异性扩增引物和探针，并建立实时荧光PCR检测体系，适用于SG的快速核酸检测。

本发明首先提供了一种用于检测球形孢子丝菌(Sporothrix globosa)的靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了上述靶序列在检测球形孢子丝菌(Sporothrix globosa)中的应用。

本发明提供了用于检测所述靶序列的检测试剂在检测球形孢子丝菌(Sporothrixglobosa)中的应用。

本发明提供了一种用于检测球形孢子丝菌(Sporothrix globosa)的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

本发明还提供了与上述特异性引物对配合使用的探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。探针SEQ ID NO.3的5’分别标记荧光基团，3’标记淬灭基团。所示荧光基团选自但不限于FAM、VIC或CY5，所示淬灭基团选自但不限于BHQ1、MGB。

本发明提供一种寡核苷酸组合，含有所述的特异性引物对(SEQ ID NO.1-2)和所述的探针(SEQ ID NO.3)。

本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒含有所述的特异性引物对(SEQ ID NO.1-2)和所述的探针(SEQ ID NO.3)。

本发明提供的试剂盒是以待测样品总DNA为模板，利用SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对和SEQ ID NO.3所示的探针进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线和荧光信号判定结果。

具体地，实时荧光定量PCR的25μl反应体系为：

所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，62℃退火30s，45个循环。

本发明提供了SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对和SEQ ID NO.3所示的探针在非疾病诊断目的的鉴别球形孢子丝菌(Sporothrix globosa)中的应用。

本发明提供了上述试剂盒在非疾病诊断目的的鉴别球形孢子丝菌(Sporothrixglobosa)中的应用。

本发明每次检测标本时必须设立NTC对照(无模板对照)、NEG(阴性对照)和POS对照(阳性对照)，三种对照对于结果判读起决定性作用：有效扩增：NTC(-)、NEG(-)、POS(+)；

无效扩增：NTC(-)、NEG(-)、POS(-)提示试剂失效；

无效扩增：NTC(-)、NEG(+)、POS(+)提示加样污染；

无效扩增：NTC(+)、NEG(+)、POS(+)提示体系污染。

只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否则试验需要重复。

在检测中三种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：

CT值小于等于38的标本为阳性结果；

CT值大于40的标本为阴性结果；

CT值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如CT值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。

本发明通过NCBI数据库已报道的具有代表性的孢子丝菌复合体的ITS序列比对，发现了SG中一段具有差异碱基的序列，针对该目标序列设计了多组特异性检测探针和引物，通过实验室条件优化和筛选，最终选定其中灵敏度高的引物和探针组合体体系。该体系可以对靶序列进行特异性的扩增，相比以往的分子检测手段，更加灵敏，操作简单，用时短。本发明是目前已知最灵敏的检测球形孢子丝菌病原体的实时荧光PCR方法，对球形孢子丝菌的检测限达到10fg。对巴西孢子丝菌、申克孢子丝菌、常见28种其他种属的真菌、3种细菌、人类基因组以及小鼠基因组均无非特异扩增，显示出良好的特异性。经浓度梯度质粒定量检测，本发明的检测灵敏度优于已报道其他分子检测体系，也优于相同荧光定量PCR方法下的其他引物探针组合对SG检测的灵敏度，具有良好的临床标本检测能力。

附图说明

图1为本发明球形孢子丝菌ITS序列的特异性碱基差异序列，其中浅色框线区域为引物设计区，深色框线区域为探针设计区。

图2为分别以球形孢子丝菌、申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌为模板，空白对照的扩增曲线。

图3分别以球形孢子丝菌、申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌为模板，引物探针组合1的扩增曲线。

图4为分别以球形孢子丝菌、申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌为模板，引物探针组合2的扩增曲线。

图5为分别以球形孢子丝菌、申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌为模板，引物探针组合3的扩增曲线。

图6为引物探针组合2的实时荧光定量PCR扩增体系退火温度扩增曲线。

图7为引物探针组合3的实时荧光定量PCR扩增体系退火温度扩增曲线。

图8为引物探针组合2对SG实时荧光PCR体系检测限。

图9为引物探针组合3对SG实时荧光PCR体系检测限。

图10为引物探针组合2的荧光PCR体系对球形孢子丝菌扩增的标准曲线图。图中1：10ng，2：1ng，3：100μg，4：10μg，5：1μg，6：100fg，7：10fg，8：1fg，9：NTC。

图11为引物探针组合3的荧光PCR体系对球形孢子丝菌扩增的标准曲线图。图中1：10ng，2：1ng，3：100μg，4：10μg，5：1μg，6：100fg，7：10fg，8：1fg，9：NTC。

图12为现有技术的特异性引物普通PCR方法检测限显示图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1球形孢子丝菌内转录间隔区(ITS)基因序列比对与靶序列确定

将NCBI数据库中具有代表性的孢子丝菌复合体的ITS序列使用Vector NTI Suite6软件序列比对，找出SG特异性碱基差异的序列(图1)，将此段序列作为球形孢子丝菌实时荧光PCR检测靶序列使用。靶序列如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

实施例2针对靶序列的引物和探针的设计

针对实施例1确定的靶序列(SEQ ID NO.4)，发明人设计了多个引物与探针组合。

表1引物及探针序列

组合1：F1-R-P

组合2：F1-R-PM

组合3：F2-R-PM

反应体系及反应条件，遵循荧光PCR一般反应要求，探针标记FAM荧光(SG-P：FAM-AACCACTAGAAAACCGTCTGAGGAAA ACAAACA-BHQ1；SG-PM:FAM-TCTGAGGAAAACAAAC-MGB)，以下，对检测结果进行分析，扩增体系遵循实施例3的优化后的体系：

1、NTC:阴性对照的三种荧光都是阴性，说明体系没有污染，且不会发生非特异性扩增，是合格的扩增体系。见图2。

2、组合1与巴西孢子丝菌和申克孢子丝菌出现非特异性扩增，弃用组合1，见图3。

3、组合2及组合3均未发生孢子丝菌属内非特异性扩增，荧光信号值稳定，扩增效果良好，见图4及图5。组合2与组合3仅相差不到1个CT值，因此将组合2与组合3同时优化反应体系。

实施例3SG实时荧光PCR检测实验参数的优化与方法建立

(1)体系退火温度优化：体系退火温度从57℃-65℃改变，结果显示组合2退火温度58-63℃体系扩增效果最好(图6)，组合3退火温度为60-63℃体系扩增效果最好(图7)。

(2)体系镁离子浓度优化：将体系中MgCl₂从0.5μl依次递增为6μl，每次增幅0.5μl，每个浓度梯度做3个平行样。结果显示组合2及组合3，均在MgCl₂添加量为2μl(MgCl₂终浓度为4mM)时体系扩增效果最好。

荧光定量PCR扩增体系及扩增条件的优化

扩增条件：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，62℃退火30s，45个循环。

每次检测标本时必须设立NTC对照(无模板对照)、NEG(阴性对照)和POS对照(阳性对照)，三种对照对于结果判读起决定性作用：有效扩增：NTC(-)、NEG(-)、POS(+)；

无效扩增：NTC(-)、NEG(-)、POS(-)提示试剂失效；

无效扩增：NTC(-)、NEG(+)、POS(+)提示加样污染；

无效扩增：NTC(+)、NEG(+)、POS(+)提示体系污染。

只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否则试验需要重复。

在检测中三种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：

CT值小于等于38的标本为阳性结果；

CT值大于40的标本为阴性性结果；

CT值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如CT值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。

实施例4SG实时荧光PCR检测体系的灵敏度、特异度及检出限评价

1.灵敏度评价

用本发明实施例3优化了的组合2及组合3SG实时荧光PCR方法，分别检测10株球形孢子丝菌(经测序验证的临床分离株)和10例临床确诊为球形孢子丝菌感染的患者皮损组织样本。结果，除NTC对照外，20份阳性模板的检测结果均呈阳性，灵敏度均达100％。

2.特异度评价

用本发明实施例3优化了的组合2及组合3SG实时荧光PCR方法，分别检测常见30种其他真菌(包括巴西孢子丝菌及申克孢子菌)、3种细菌、人类基因组以及小鼠基因组，均无非特异扩增(表2)，以SG为阳性对照。结果除阳性对照外，其余35种非SG模板均为阴性。

表2用于检测SG，SS，SB多重荧光PCR体系特异性的病原模板

BMU：北京大学第一医院真菌保藏库

ATCC：美国模式培养物集存库

CBS:荷兰微生物菌种保藏中心

3.检测限的评价

检测下限即以已优化的检测方法从一系列倍比稀释的阳性核酸模板中检测，结果为阳性的能力。以梯度浓度2ng/μl到0.2fg/μl(共计8个梯度浓度)的SG基因组DNA为模板，每个浓度梯度取5μl检测。按照优化的反应体系和反应条件进行荧光PCR，每个浓度梯度做3个平行样。结果显示，本发明建立的SG实时荧光PCR体系组合2及组合3检测限均为10fg(图8，图9)。

实施例5 SG实时荧光PCR体系标准曲线的制作

以标准浓度模板的SG基因组DNA(2ng/μl)依次进行10倍稀释共计8个浓度梯度，上样标准品各5μl扩增，模板量为10ng-1fg，绘制组合2及组合3SG实时荧光PCR体系的标准曲线(图10、图11)。

实施例6本发明SG实时荧光PCR方法与文献报道的特异性引物扩增方法的比较

本发明SG实时荧光PCR方法与文献报道(Messias R A,Sybren D H G,Pires D CZ,et al.Molecular Diagnosis of Pathogenic Sporothrix Species.PLOS NeglectedTropical Diseases,2015,9(12):e0004190.)的使用特异性引物通过普通PCR技术扩增不同长度目的片段的方法相比，以标准浓度模板的SG基因组DNA(2ng/μl)10倍稀释8个浓度梯度作为模板，每个浓度梯度取5μl检测，每个浓度梯度重复3次，比较两种方法最低检测限。

SG实时荧光PCR体系检测限为10fg(见实施例5)，相同模板量的情况下，文献报道的特异性引物普通PCR方法检测限为1μg(图12)。本发明的组合2及组合3检测限均比目前报道的检测方法更灵敏，并且在实验操作、耗时等方面均明显优于目前报道(表3)。

表3 SG实时荧光PCR方法与目前报道特异性引物普通PCR方法对比

综合上述实施例，组合2及组合3均能够特异性的检出球形孢子丝菌，其灵敏度与检测下限相同，均优于目前已知的分子检测方法。两个组合的区别主要在于不同的上游引物，相比之下，组合3在检测高浓度模板时，检测曲线起峰早，比组合2小1个CT值(图4-图7)，但由于组合2检测效率高于组合3，因此在检测低浓度模板时，其CT值基本没有差别(图8-图11)。对于临床标本检测，其病原菌含量往往较低。因此，选用检测效率较高的组合2进行保护。

即组合2的引物和探针组合分别为：

SG-F1：GGGCCCTACGAACCTTTGTAT

SG-R：CGGAGCGAGGGAGAACGT

SG-PM：TCTGAGGAAAACAAAC。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种检测球形孢子丝菌的实时荧光PCR引物、探针及试剂盒

<130> KHP181118451.0

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggccctacg aacctttgta t 21

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cggagcgagg gagaacgt 18

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctgaggaaa acaaac 16

<210> 4

<211> 520

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgttgcttct ggcggggggg acgggggggc gcccgagacg gccccctccg ccccgcccgc 60

caggggcggc gggccctacg aacctttgta tctcaaccac tagaaaaccg tctgaggaaa 120

acaaacaaaa taatcaaaac tttcaacaac ggatctcttg gctctggcat cgatgaagaa 180

cgcagcgaaa tgcgatacgt aatgtgaatt gcagaattca gcgaaccatc gaatctttga 240

acgcacattg cgcccgccag cattctggcg ggcatgcctg tccgagcgtc atttcccccc 300

tcacgcgccc cgttgcgcgc tggtgttggg gcgcctccgc ctggcggagg cccccgaaag 360

cgagtggcgg gccctgtgga tggctccgag cgcagtaccg aacgcaacgt tctccctcgc 420

tccggacgcc ccccaggtgc cctgccgtga aaacgcgcat gacgtgcaac tcttacccaa 480

ggttgacctc ggatcaggta ggactacccg ctgaacttaa 520

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgaacctttg tatctcaacc actagaa 27

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaccactaga aaaccgtctg aggaaaacaa aca 33

Claims (10)

1.一种用于检测球形孢子丝菌(Sporothrix globosa)的靶序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.权利要求1所述的靶序列在检测球形孢子丝菌(Sporothrix globosa)中的应用。

3.用于检测权利要求1所述靶序列的检测试剂在检测球形孢子丝菌(Sporothrixglobosa)中的应用。

4.一种用于检测球形孢子丝菌(Sporothrix globosa)的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

5.与权利要求4所示的特异性引物对配合使用的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.一种寡核苷酸组合，其特征在于，含有权利要求4所述的特异性引物对和权利要求5所述的探针。

7.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求4所述的特异性引物对和权利要求5所述的探针。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，以待测样品总DNA为模板，利用权利要求4所述的特异性引物对和权利要求5所述的探针进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线和荧光信号判定结果。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，实时荧光定量PCR的25μl反应体系为：

10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，62℃退火30s，45个循环。