CN1286989C - 检测致病真菌生物芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测致病真菌生物芯片，在玻片或硅片或高分子材料上固定检测真菌的DNA探针，检测真菌的DNA探针有检测白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、裴氏着色真菌、疣状瓶霉、卡氏枝孢霉、申克孢子丝、总状毛霉、红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌、犬小孢子菌及石膏样小孢子菌的探针，本发明可以快速地检测多种真菌，同一芯片可以同时检测，并具有实时、灵敏、准确和高效等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物芯片，特别是涉及一种检测真菌生物芯片。
背景技术
目前，病原微生物感染性疾病给人类带来的危害有增无减，其中由真菌引起的感染也因免疫受损宿主的不断增多而日渐突出。随着肿瘤的放射治疗、化学治疗、广谱抗生素以及免疫制剂的广泛应用，系统性、机会性真菌感染日益增加，特别是在血液系统恶性疾病、肿瘤和骨髓移植及器官移植中；例如18％-50％的病人在骨髓移植后发生侵袭性真菌感染；器官移植受者和恶性肿瘤患者中真菌感染的患病率高达20％～40％；而且真菌感染往往是致命的感染，病死率呈急剧上升的趋势：在真菌感染中，深部真菌感染危害最大，诊断困难、进展迅速、顽固难治、病死率非常高，如念珠菌血症，若不治疗死亡率可以达到45％～76％，侵袭性曲霉病死亡率高达55％～70％；真菌感染已成为艾滋病患者的主要死亡原因。有人调查在过去20年中深部真菌感染增加了40倍，住院患者出现条件致病性真菌感染，病死率高达29％，而无真菌感染患者病死率仅17％，并多为致病真菌的混合感染，但临床上真菌感染诊断的现状却远远不能满足需要，特别是早期特异诊断一直存在困难，因而使很多患者病情延误导致治疗失败甚或失去了治疗的机会。因此，如何提高真菌病的诊断水平已成为国内外临床工作者们共同关心的热点问题，真菌感染的实验室诊断在治疗中发挥着越来越重要的作用。
此外，致病真菌或条件致病真菌污染中药材也十分普遍。中药材是我国对世界所做出的特有贡献，越来越引起全世界医药卫生界的重视，但是中药材真菌污染问题一直困扰着我国的中草药业发展。从这一点看，也十分需要一种快速的药材真菌快速检测技术。
真菌的检测与鉴定目前包括形态学检测，如直接镜检和培养方法等。直接镜检操作简便、快速、实用，阳性结果可以确定真菌感染，但检测阳性率很低，阴性结果不能排除感染，需与培养法结合使用；体外真菌培养可以进一步提高真菌的检出率，并可鉴定真菌的种属，但操作复杂，费时费力，一般需要4周时间，个别生长缓慢的真菌需要的时间更长，而且培养法的阳性检出率也不高，例如侵袭性念珠菌病血培养的阳性率仅为20％。应用免疫学技术诊断临床真菌感染目前尚有较多问题需要解决，如特异性抗体检测常遇到的问题是，当检测常见条件致病真菌时，由于正常人血清中可能有抗体存在，因此无法区分是真菌在体内定植还是感染；此外，抗体检测交叉反应较严重；特异性抗原检测同样存在假阴性和假阳性问题而限制了其应用。
随着分子生物学技术的发展，核酸杂交及聚合酶链反应(PCR)等技术在临床真菌检测与诊断方面得到了长足发展。人们建立了核酸杂交技术、常规PCR技术、多种改进的PCR技术，如套式PCR、PCR-RFLP(限制性酶切片段多态性)技术、荧光定量PCR技术等。这些技术在真菌感染早期检测与诊断方面显出了较高的应用价值。然而，由于PCR等分子生物学技术缺乏规范化或标准化，检测的特异性与敏感性报道不一，检测过程中易出现假阳性和假阴性结果，以及不能区分是感染还是定植等，所以给阳性PCR结果的解释带来了困难。重要的是，PCR等技术多为针对不同致病真菌的独特基因进行检测，一般一次试验只能检测一种真菌，即使采用多重PCR技术，一次试验检测的真菌数目也不超过3个，但由于临床多为混合真菌感染，而可引起感染的真菌种类又较多，所以PCR技术检测范围较有限，而且，一般情况下还要采用核酸杂交、套式PCR或测序等技术对PCR产物进行验证或确证，增加了操作的复杂性或难度。以PCR为基础的指纹图谱法(如PCR-RFLP等)则存在试验结果不稳定的缺陷，如不同的扩增条件、不同的操作者，甚至同一个操作者的不同检测时间，都会影响扩增结果，或产生不一致的扩增结果。电泳核型分析技术受电泳条件的影响较大，不同脉冲电泳装置，或同一电泳装置不同电泳条件会影响试验结果。rDNA序列分析，对DNA的量和纯度要求较高，仪器设备昂贵，操作技术要求高，检测费用也高。总之，上述的分子生物学方法尚不能很好地满足临床或卫生领域进行快速、准确、大规模、高通量检测与诊断致病真菌的需要。
生物芯片(Biochip，最初的生物芯片即指基因芯片)技术检测致病性真菌或条件致病真菌却具有很多优越性。基因芯片技术由于脱胎于核酸(基因)探针检测技术，因此具有敏感性高、特异性强等特点；又由于芯片技术具有大规模、集成化、自动化等特点，因此，操作简便、快速，而且还具有检测效率高(一次可检测成千上万个目的基因)等优点。基因芯片技术检测致病真菌或条件致病真菌属于临床检验的前沿领域，其科学性在于基因芯片检测致病真菌实质上是微量、微型化的基因探针杂交检测，而后者在致病真菌检测上的科学性已被公认；创新性在于基因芯片技术是20世纪90年代发明的、2000年后蓬勃发展的一项新技术，而截止到目前尚未见到有关采用基因芯片技术检测致病真菌或条件致病真菌的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测致病真菌生物芯片。
本发明的技术方案概述如下：
一种检测致病真菌生物芯片，在玻片或硅片或高分子材料上固定检测真菌的DNA探针，所述探针为：
白色念珠菌 attgcttgcg gcggtagcgt ctaccacgta tatcttcaaa 40
热带念珠菌 aacgcttatt ttgctagtgg ccaccacaat ttatttcata 40
近平滑念珠菌 ttccactcat tggtacaaac tccaaaactt cttccaaa 38
克柔念珠菌 gacgcttggc ggccgagagc gagtgttgcg agacaacaaa 40
光滑念珠菌 taggttttac caactcggtg ttgatctagg gagggataag t 41
新生隐球菌 cctatggggt agtcttcggc ttgctgataa caaccatctc 40
烟曲霉 ggccggcgcc agccgacacc caactttatt tttctaa 37
黄曲霉 ccggcgcttg ccgaacgcaa atcaatcttt ttcca 35
黑曲霉 tgtaggattg gccggcgcct gccgacgttt tccaaccatt 40
构巢曲霉 acccgctcga ttagggccgg ccgggcgcca gccgacgtct 40
裴氏着色真菌 gggactcggt cttctccctc acgggaacac ttttttcta 39
疣状瓶霉 tggacggatt ttggtcgtgt aacaacggcc cctcctaaa 39
卡氏枝孢霉 tggacggttt tggtcgagtg gtctcgaccc ctcctaaa 38
申克孢子丝 ccctgccgtg aaaacgcgca tgacgcgcag ctctttttac 40
总状毛霉 aaagctcttg taattgactt tgatggggcc tcccaaataa 40
红色毛癣菌 ccctggcccc aatctttata tatatatata tctttt 36
须癣毛癣菌 ctctggcctt cccccaaatc tctctgagat atttt 35
絮状表皮癣菌 gctctctggc cctaatttcc gtcgggagga cgaaagg 37
犬小孢子菌 gcaggctggc ctaacgcacc atgtattatt 30
石膏样小孢子菌 tagtttccgt cagagatgta tttctctgca attt 34
真菌共有探针 ttgacctcrr atcaggtagg ratacccgct gaacttaa 38
另一种检测致病真菌生物芯片，在玻片或硅片或高分子材料上固定检测真菌的DNA探针，所述探针为：
白色念珠菌 tctaaccaaa aacattgctt gcggcggtag cgtctaccac gtatatcttc aaa 53
热带念珠菌 ttatccaaaa acgcttattt tgctagtggc caccacaatt tatttcataa ct 52
近平滑念珠菌 taggtttttt ccactcattg gtacaaactc caaaacttct tccaaat 47
克柔念珠菌 tttttttcag ggacgcttgg cggccgagag cgagtgttgc gagacaacaa aaa 53
光滑念珠菌 gggttaaact gtattaggtt ttaccaactc ggtgttgatc tagggaggga taagt 55
新生隐球菌 aataagtttc gctgggccta tggggtagtc ttcggcttgc tgataacaac catctc 56
烟曲霉 acctgctctg taggcccggc cggcgccagc cgacacccaa ctttattttt ctaa 54
黄曲霉 tgtaggcccg gcgcttgccg aacgcaaatc aatctttttc cagg 44
黑曲霉 gtcacatgct ctgtaggatt ggccggcgcc tgccgacgtt ttccaaccat tcttt 55
构巢曲霉 ttgtcccgct cgactagggc cggccgggcg ccagccgacg tctccaa 47
裴氏着色真菌 atcggatgaa gggtgcccgg gactcggtct tctccctcac gggaacactt ttttcta 57
申克孢子 cccccaggcg ccctgccgtg aaaacgcgca tgacgcgcag ctctttttac 50
红色毛癣菌 aggaccggcc gccctggccc caatctttat atatatatat atctttt 47
须癣毛癣菌 tccaggaccg gccgccctgg cctcaaaatc tgttttatct tatc 44
疣状瓶霉 gtgttggacg gattttggtc gtgtaacaac ggcccctcct aaa 43
卡式枝孢霉 tggacggttt tggtcgagtg gtctcgaccc ctcctaaaga c 41
犬小孢子菌 ccgggccggc aggctggcct aacgcaccat gtattattca 40
石膏样小孢子菌 gctctctggc ctagtttccg tcagagatgt atttctctgc aattt 45
絮状表皮癣菌 ggccggctct ctggccctaa tttccgtcgg gaggacgaaa gggggcgacc cct 53
总状毛霉 aaaggaaagc tcttgtaatt gactttgatg gggcctccca aataaatctt tt 52
第三种检测致病真菌生物芯片，在玻片或硅片或高分子材料上固定检测真菌的DNA探针，所述探针为：
白色念珠菌 aaaaacattg cttgcggcgg tagcgtctac cacgtatatc ttcaaa 46
热带念珠菌 atccaaaaac gcttattttg ctagtggcca ccacaattta tttcat 46
近平滑念珠菌 ctcattggta caaactccaa aacttcttcc aaat 34
克柔念珠菌 tcagggacgc ttggcggccg agagcgagtg ttgcgagaca acaaaaa 47
光滑念珠菌 actgtattag gttttaccaa ctcggtgttg atctagggag ggataagt 48
新生隐球菌 cgctgggcct atggggtagt cttcggcttg ctgataacaa ccatctc 47
烟曲霉 gtaggcccgg ccggcgccag ccgacaccca actttatttt tctaa 45
黄曲霉 ttgccgaacg caaatcaatc tttttcca 28
黑曲霉 atgctctgta ggattggccg gcgcctgccg acgttttcca accattcttt 50
构巢曲霉 Cccgctcgac tagggccggc cgggcgccag ccgacgtctc caa 43
裴氏着色真菌 tgaagggtgc ccgggactcg gtcttctccc tcacgggaac acttttttct a 51
申克孢子丝 aggcgccctg ccgtgaaaac gcgcatgacg cgcagctctt tttac 45
红色毛癣菌 ggccgccctg gccccaatct ttatatatat atatatcttt t 41
须癣毛癣菌 ccggccgctc tggccttccc ccaaatctct ctgagatatt ttttt 45
疣状瓶霉 cgtgcttggt gttggacgga ttttggtcgt gtaacaacgg c 41
卡式枝孢霉 tgtgcttggt gttggacggt tttggtcgag tggtctcgac 40
犬小孢子菌 ggccggcagg ctggcctaac gcaccatgta ttattca 37
石膏样小孢子菌 tggcctagtt tccgtcagag atgtatttct ctgcaattt 39
絮状表皮癣菌 gctctctggc cctaatttcc gtcgggagga cgaaaggggg cgacccct 48
总状毛霉 aaagctcttg taattgactt tgatggggcc tcccaaataa atctttt 47
本发明的检测致病真菌生物芯片在检测致病真菌具有实时、灵敏、快速、准确和高效等特点。本发明可以快速地检测多种真菌，同一芯片可以同时检测白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、裴氏着色真菌、疣状瓶霉、卡氏枝孢霉、申克孢子丝、总状毛霉、红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌、犬小孢子菌、石膏样小孢子菌。
附图说明
图1为本发明的探针矩阵排列示意图。
图2为真菌细胞核糖体DNA操纵元结构示意图。
图3为采用genePix4000B芯片扫描仪对第一种检测致病真菌生物芯片结果进行观察分析。
具体实施方式
生物芯片技术是随着人类基因组计划发展起来的。它是指在固相基质上集成各种可以作为受体的生物信息，包括寡核苷酸、cDNA、蛋白质/酶、抗原/抗体、细胞等，利用受体与连接物间的反应(包括核酸杂交反应、抗原-抗体亲和识别反应等)来进行生物学检测的方法。生物芯片技术综合运用了分子生物学技术、集成电路制造技术、计算机技术、半导体技术、共聚焦激光扫描技术、荧光标记技术，使样品的制备、化学反应和分析检测等在生命科学和医学研究中不连续的过程连续化、集成化、微型化、自动化。基因芯片是指将大量寡核苷酸固定在很小面积(一般几平方厘米)的玻璃等固相基质上，成为高密度寡核苷酸微阵列探针，样品中的DNA或RNA经荧光标记后与探针杂交，通过检测杂交信号的强弱达到分析样品中核酸的目的。目前生物芯片，尤其是基因芯片技术主要应用于基因测序研究和生物制药研究。该技术不但具有基因探针技术的高灵敏度和高特异性，而且可以同时检测大量的目的基因。
实施例1
真菌培养条件的建立
1.酵母菌(念珠菌属与隐球菌属)
应用沙堡固体或液体培养基 30℃培养2天
配方：葡萄糖 40g
蛋白胨 10g
琼脂 20g
蒸馏水 1000ml
将上述成分混合，加热至完全溶解，调PH至5.6左右于115℃蒸汽灭菌30分钟备用注：液体培养基不加琼脂
2.丝状真菌与浅部皮肤真菌
应用马铃薯固体或液体培养基进行培养30℃培养5-7天
配方：将去皮切碎的马铃薯200个加水700ml煮沸20分钟，用纱布过滤，保留滤液
加葡萄糖 20g
琼脂 15g
加水至1000ml，
实施例2
真菌DNA提取方法的建立
应用氯化苄提取真菌DNA
1.原理
ROH代表细胞壁中的几丁质，以上为PhcH2cL于各种多糖的反应式
2.方法
(1)刮取0.1-0.3g约100ul体积的菌落于1.5ml离心管中
(2)加入600μl DNA提取液，振荡混匀
(3)加入10％SDS 50ul振荡混匀
(4)加入氯化苄300ul振荡混匀
(5)50-55℃水浴1小时每10分钟混匀一次
(6)每管加入3M的醋酸钠60ul冰浴20分钟
(7)4℃离心，13000rpm 10分钟
(8)取上清，加等体积的酚氯仿，4℃离心13000rpm 10分钟
(9)取上清加1/10醋酸钠及等体积的异丙醇，-20℃1小时
(10)4℃离心12000rpm 10分钟
(11)弃上清加入40ul 75％乙醇清洗管壁
(12)4℃离心10000rpm 10分钟
(13)弃上清，干燥，加入Tris/EDTA-20℃
注：丝状真菌应用液体培养基进行培养，取一个菌丝球到1.5ml管中进行DNA提取，提取液的pH对提取结果很重要，pH太低，破壁反应受抑制，作用不完全，DNA产率低；PH太高，导致DNa变性与降解，所以采用弱碱性。提取液应与菌体充分混合，再加入十二烷基硫酸钠(SDS)，否则导致抽提物混合困难，充分混合对于DNA的产量和质量均有重要影响。
实施例3
靶基因的选择
无论是真菌还是细菌，细胞核糖体核糖核酸(rRNA)基因是常用的分子分析靶点。核糖体核糖核酸(rRNA)基因及其相邻的间隔区合称为rDNA。真菌细胞rDNA有几十甚至数百个拷贝，真菌核糖体DNA(rRNA基因)操纵元包括三个功能基因，即18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA，它们在染色体上头尾相连，串联排列，相互之间由内转录间区(internaltranscribedspacer)分割。包括18S rDNA与5.8S rDNA间的内转录间区1(internaltranscribedspacer-1，ITS-1)，5.8S rDNA与28S rDNA间的内转录2(internaltranscribedspacer-1，ITS-2)。(见图2)
真核生物的核内rDNA是一个多基因蔟，以串联重复单位排列，一个典型的rDNA重复单位约为8-12kb。它们位于核仁组织者区域(NORs)，往往存在于多个染色体位置。不同的选择压力作用于rDNA区域，造成单个重复单位序列的不同保守性。
一般编码区的序列(18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA)在不同的属及种间较保守，而内转录间区(ITS)不仅在不同属间而且在同一属内不同种间变异均较大。并且rRNA基因在真菌中的拷贝数可以达到几十至几百，其多拷贝的特性有助于提高检测的灵敏性。
由于用于扩增间区的引物扩增跨度最好在200-500bp之间，所以我们选择在5.8SrDNA设计上游引物，在28SrDNA设计下游引物，扩增ITS-2序列，在ITS-2区域设计种特异性探针，进行真菌菌种的鉴别。
实施例4
通用引物设计
通用引物序列
| 编号 | 序列(5′--3′) | 所在区域 |
| ITS3ITS4 | gcatcgatgaagaacgcagctcctccgcttattgatatgc | 5.8S rDNA28S rDNA |
实施例5
探针的设计
基因芯片技术是一种反相固相杂交技术，其检测功能依赖于芯片商所固定的探针来实现，所以确定探针的种类、序列是制备基因芯片的关键。
(1)登录GenBanK(http：//ncbi.nlm.nih.gov/entrez)，在核酸数据库中检索相关真菌的目的基因序列，逐个核对后筛选出测序质量较好的序列。
(2)应用vector NTI SUITE 6.0软件中的alignment将筛选出的序列进行多序列比对，得到碱基对齐图。
(3)根据碱基对齐图，在ITS2区域设计种特异性探针
(4)探针设计要遵循以下原则：a、长度一般为15-50bp，常用的是18-40bp。
b、碱基成分中G+C含量40％-60％，超过此范围会增加非特异性的杂交。
C、尽量选择真菌间差异大的序列
D、避免选择能够形成二级结构和自身二聚体的序列
E、所有探针应具有相似的Tm值
(5)根据以上的探针设计原则，找出适于作为探针的所有序列，将候选序列递交到GenBanK进行BLAST比较，筛选出特异性最好的进行合成，合成的探针进行3′端的氨基化修饰。
实施例6
第一种检测致病真菌生物芯片，在玻片或硅片或高分子材料上固定检测真菌的DNA探针，所述探针为：
探针名称 探针序列5′-3′
白色念珠菌 attgcttgcg gcggtagcgt ctaccacgta tatcttcaaa 40
热带念珠菌 aacgcttatt ttgctagtgg ccaccacaat ttatttcata 40
近平滑念珠菌 ttccactcat tggtacaaac tccaaaactt cttccaaa 38
克柔念珠菌 gacgcttggc ggccgagagc gagtgttgcg agacaacaaa 40
光滑念珠菌 taggttttac caactcggtg ttgatctagg gagggataag t 41
新生隐球菌 cctatggggt agtcttcggc ttgctgataa caaccatctc 40
烟曲霉 ggccggcgcc agccgacacc caactttatt tttctaa 37
黄曲霉 ccggcgcttg ccgaacgcaa atcaatcttt ttcca 35
黑曲霉 tgtaggattg gccggcgcct gccgacgttt tccaaccatt 40
构巢曲霉 acccgctcga ttagggccgg ccgggcgcca gccgacgtct 40
裴氏着色真菌 gggactcggt cttctccctc acgggaacac ttttttcta 39
疣状瓶霉 tggacggatt ttggtcgtgt aacaacggcc cctcctaaa 39
卡氏枝孢霉 tggacggttt tggtcgagtg gtctcgaccc ctcctaaa 38
申克孢子丝 ccctgccgtg aaaacgcgca tgacgcgcag ctctttttac 40
总状毛霉 aaagctcttg taattgactt tgatggggcc tcccaaataa 40
红色毛癣菌 ccctggcccc aatctttata tatatatata tctttt 36
须癣毛癣菌 ctctggcctt cccccaaatc tctctgagat atttt 35
絮状表皮癣菌 gctctctggc cctaatttcc gtcgggagga cgaaagg 37
犬小孢子菌 gcaggctggc ctaacgcacc atgtattatt 30
石膏样小孢子菌 tagtttccgt cagagatgta tttctctgca attt 34
真菌共有探针 ttgacctcrr atcaggtagg ratacccgct gaacttaa 38
第二种检测致病真菌生物芯片，在玻片或硅片或高分子材料上固定检测真菌的DNA探针，所述探针为：
白色念珠菌 tctaaccaaa aacattgctt gcggcggtag cgtctaccac gtatatcttc aaa 53
热带念珠菌 ttatccaaaa acgcttattt tgctagtggc caccacaatt tatttcataa ct 52
近平滑念珠菌 taggtttttt ccactcattg gtacaaactc caaaacttct tccaaat 47
克柔念珠菌 tttttttcag ggacgcttgg cggccgagag cgagtgttgc gagacaacaa aaa 53
光滑念珠菌 gggttaaact gtattaggtt ttaccaactc ggtgttgatc tagggaggga taagt 55
新生隐球菌 aataagtttc gctgggccta tggggtagtc ttcggcttgc tgataacaac catctc 56
烟曲霉 acctgctctg taggcccggc cggcgccagc cgacacccaa ctttattttt ctaa 54
黄曲霉 tgtaggcccg gcgcttgccg aacgcaaatc aatctttttc cagg 44
黑曲霉 gtcacatgct ctgtaggatt ggccggcgcc tgccgacgtt ttccaaccat tcttt 55
构巢曲霉 ttgtcccgct cgactagggc cggccgggcg ccagccgacg tctccaa 47
裴氏着色真菌 atcggatgaa gggtgcccgg gactcggtct tctccctcac gggaacactt ttttcta 57
申克孢子丝 cccccaggcg ccctgccgtg aaaacgcgca tgacgcgcag ctctttttac 50
红色毛癣菌 aggaccggcc gccctggccc caatctttat atatatatat atctttt 47
须癣毛癣菌 tccaggaccg gccgccctgg cctcaaaatc tgttttatct tatc 44
疣状瓶霉 gtgttggacg gattttggtc gtgtaacaac ggcccctcct aaa 43
卡式枝孢霉 tggacggttt tggtcgagtg gtctcgaccc ctcctaaaga c 41
犬小孢子菌 ccgggccggc aggctggcct aacgcaccat gtattattca 40
石膏样小孢子菌 gctctctggc ctagtttccg tcagagatgt atttctctgc aattt 45
絮状表皮癣菌 ggccggctct ctggccctaa tttccgtcgg gaggacgaaa gggggcgacc cct 53
总状毛霉 aaaggaaagc tcttgtaatt gactttgatg gggcctccca aataaatctt tt 52
第三种检测致病真菌生物芯片，在玻片或硅片或高分子材料上固定检测真菌的DNA探针，所述探针为：
1.白色念珠菌
aaaaacattgcttgcggcggtagcgtctaccacgtatatcttcaaa
2热带念珠菌
atccaaaaacgcttattttgctagtggccaccacaatttatttcat
3近平滑念珠菌
ctcattggtacaaactccaaaacttcttccaaat
4克柔念珠菌
tcagggacgcttggcggccgagagcgagtgttgcgagacaacaaaaa
5光滑念珠菌
actgtattaggttttaccaactcggtgttgatctagggagggataagt
6新生隐球菌
cgctgggcctatggggtagtcttcggcttgctgataacaaccatctc
7烟曲霉
gtaggcccggccggcgccagccgacacccaactttatttttctaa
8黄曲霉
ttgccgaacgcaaatcaatctttttcca
9黑曲霉
atgctctgtaggattggccggcgcctgccgacgttttccaaccattcttt
10构巢曲霉
Cccgctcgactagggccggccgggcgccagccgacgtctccaa
11裴氏着色真菌
tgaagggtgcccgggactcggtcttctccctcacgggaacacttttttcta
12申克孢子丝
aggcgccctgccgtgaaaacgcgcatgacgcgcagctctttttac
13红色毛癣菌
ggccgccctggccccaatctttatatatatatatatctttt
14须癣毛癣菌
ccggccgctctggccttcccccaaatctctctgagatattttttt
15疣状瓶霉
cgtgcttggtgttggacggattttggtcgtgtaacaacggc
16卡式枝孢霉
tgtgcttggtgttggacggttttggtcgagtggtctcgac
17犬小孢子菌
ggccggcaggctggcctaacgcaccatgtattattca
18石膏样小孢子菌
tggcctagtttccgtcagagatgtatttctctgcaattt
19絮状表皮癣菌
gctctctggccctaatttccgtcgggaggacgaaagggggcgacccct
20总状毛霉
aaagctcttgtaattgactttgatggggcctcccaaataaatctttt
实施例7
探针矩阵排列见图1
在图1中，
1为阳性探针 2为真菌共有探针 3为阴性探针 4为白色念珠菌探针5为热带念珠菌探针 6为近平滑念珠菌探针 7为克柔念珠菌探针8为光滑念珠菌探针 9为新生隐球菌探针 10为烟曲霉探针 11为黄曲霉探针12为黑曲霉探针 13为构巢曲霉探针 14为裴氏着色真菌探针 15为疣状瓶霉探针 16为卡式枝孢霉探针 17为申克孢子丝菌探针 18为总状毛霉探针 19为红色毛癣菌探针 20为须癣毛癣菌探针 21为絮状表皮癣菌探针 22为犬小孢子菌探针 23为石膏样小孢子菌探针
实施例8
杂交实验
1.点样
配置终浓度为100umol/L的探针溶液，取每个探针溶液5ul分别溶于5ul点样液中，将其转移到96孔板中，并将其置于基因芯片点样仪(cartesian technologies)样品台上，启动PixSys5500 Workstation点样控制程序，通过一支羽毛笔式点样针头完成全部点样。点好的玻片放置48小时后使用。
2.玻片的处理
在0.2％SDS中浸泡5分钟，纯水中浸泡5分钟，玻片自然干燥，立即投入使用。
3.荧光标记待测样品的制备
应用不对称PCR进行样品的标记：
第一轮PCR
10*PCR缓冲液 5ul
dNTP混和液 4ul
ITS3引物 1ul
ITS4(CY3标记引物) 1ul
Taq酶 0.5ul
DNA模板 3ul
水 补足到50ul
94℃预变性5min，94℃变性1min，50℃退火1min，72延伸1min，72延伸5min，30个循环。
第二轮PCR
10*PCR缓冲液 5ul
dNTP Mixture 4ul
ITS4(CY3标记) 1ul
Taq酶 0.5ul
第一轮扩增产物 1ul
水 补足到50ul
94℃预变性5min，94℃变性1min，50℃退火1min，72延伸1min，72延伸5min，30个循环。
4.杂交
取第二轮扩增产物2ul与8ul杂交液(UnihybtM Telechem公司)混合，加热到98℃变性5min，后迅速放在冰上，5分钟后，取出10ul点在阵列区域，放入杂交盒中50℃杂交1个小时，然后将玻片放入洗脱液WBA洗涤1min，WBB洗涤1min，WBC洗涤min。
5.杂交结果的检测
采用genePix4000B芯片扫描仪对第一种检测致病真菌生物芯片结果进行观察分析。见图3。
图3中
3-4为白色念珠菌
3-5为热带念珠菌 3-6为近平滑念珠菌 3-7为克柔念珠菌
3-8为光滑念珠菌 3-9为新生隐球菌 3-10为烟曲霉 3-11为黄曲霉
3-12为黑曲霉 3-13为构巢曲霉 3-14为裴氏着色真菌 3-15疣状瓶霉
3-16卡式枝孢霉 3-17为申克孢子丝菌 3-18为总状毛霉 3-19为红色毛癣菌
3-20须癣毛癣菌 3-21为絮状表皮癣菌 3-22犬小孢子菌 3-23为石膏样小孢子菌
采用上述相同的方法，应用第二套和第三套探针对临床常见致病真菌亦进行了检测，得到和第一套探针基本相似的杂交图谱(图略)，第二套和第三套探针也可用于临床常见致病真菌的检测鉴定。
Claims (3)
1.一种检测致病真菌生物芯片，其特征是在玻片或硅片或高分子材料上固定检测真菌的DNA探针，所述探针为：
白色念珠菌 attgcttgcg gcggtagcgt ctaccacgta tatcttcaaa
热带念珠菌 aacgcttatt ttgctagtgg ccaccacaat ttatttcata
近平滑念珠菌 ttccactcat tggtacaaac tccaaaactt cttccaaa
克柔念珠菌 gacgcttggc ggccgagagc gagtgttgcg agacaacaaa
光滑念珠菌 taggttttac caactcggtg ttgatctagg gagggataagt
新生隐球菌 cctatggggt agtcttcggc ttgctgataa caaccatctc
烟曲霉 ggccggcgcc agccgacacc caactttatt tttctaa
黄曲霉 ccggcgcttg ccgaacgcaa atcaatcttt ttcca
黑曲霉 tgtaggattg gccggcgcct gccgacgttt tccaaccatt
构巢曲霉 acccgctcga ttagggccgg ccgggcgcca gccgacgtct
裴氏着色真菌 gggactcggt cttctccctc acgggaacac ttttttcta
疣状瓶霉 tggacggatt ttggtcgtgt aacaacggcc cctcctaaa
卡氏枝孢霉 tggacggttt tggtcgagtg gtctcgaccc ctcctaaa
申克孢子丝 ccctgccgtg aaaacgcgca tgacgcgcag ctctttttac
总状毛霉 aaagctcttg taattgactt tgatggggcc tcccaaataa
红色毛癣菌 ccctggcccc aatctttata tatatatata tctttt
须癣毛癣菌 ctctggcctt cccccaaatc tctctgagat atttt
絮状表皮癣菌 gctctctggc cctaatttcc gtcgggagga cgaaagg
犬小孢子菌 gcaggctggc ctaacgcacc atgtattatt
石膏样小孢子菌 tagtttccgt cagagatgta tttctctgca attt
真菌共有探针 ttgacctcrr atcaggtagg ratacccgct gaacttaa
2.一种检测致病真菌生物芯片，其特征是在玻片或硅片或高分子材料上固定检测真菌的DNA探针，所述探针为：
白色念珠菌 tctaaccaaa aacattgctt gcggcggtag cgtctaccac gtatatcttc aaa
热带念珠菌 ttatccaaaa acgcttattt tgctagtggc caccacaatt tatttcataa ct
近平滑念珠菌 taggtttttt ccactcattg gtacaaactc caaaacttct tccaaat
克柔念珠菌 tttttttcag ggacgcttgg cggccgagag cgagtgttgc gagacaacaa aaa
光滑念珠菌 gggttaaact gtattaggtt ttaccaactc ggtgttgatc tagggaggga taagt
新生隐球菌 aataagtttc gctgggccta tggggtagtc ttcggcttgc tgataacaac catctc
烟曲霉 acctgctctg taggcccggc cggcgccagc cgacacccaa ctttattttt ctaa
黄曲霉 tgtaggcccg gcgcttgccg aacgcaaatc aatctttttc cagg
黑曲霉 gtcacatgct ctgtaggatt ggccggcgcc tgccgacgtt ttccaaccat tcttt
构巢曲霉 ttgtcccgct cgactagggc cggccgggcg ccagccgacg tctccaa
裴氏着色真菌 atcggatgaa gggtgcccgg gactcggtct tctccctcac gggaacactt ttttcta
申克孢子丝 cccccaggcg ccctgccgtg aaaacgcgca tgacgcgcag ctctttttac
红色毛癣菌 aggaccggcc gccctggccc caatctttat atatatatat atctttt
须癣毛癣菌 tccaggaccg gccgccctgg cctcaaaatc tgttttatct tatc
疣状瓶霉 gtgttggacg gattttggtc gtgtaacaac ggcccctcct aaa
卡式枝孢霉 tggacggttt tggtcgagtg gtctcgaccc ctcctaaaga c
犬小孢子菌 ccgggccggc aggctggcct aacgcaccat gtattattca
石膏样小孢子菌 gctctctggc ctagtttccg tcagagatgt atttctctgc aattt
絮状表皮癣菌 ggccggctct ctggccctaa tttccgtcgg gaggacgaaa gggggcgacc cct
总状毛霉 aaaggaaagc tcttgtaatt gactttgatg gggcctccca aataaatctt tt
3.一种检测致病真菌生物芯片，其特征是在玻片或硅片或高分子材料上固定检测真菌的DNA探针，所述探针为：
白色念珠菌 aaaaacattg cttgcggcgg tagcgtctac cacgtatatc ttcaaa
热带念珠菌 atccaaaaac gcttattttg ctagtggcca ccacaattta tttcat
近平滑念珠菌 ctcattggta caaactccaa aacttcttcc aaat
克柔念珠菌 tcagggacgc ttggcggccg agagcgagtg ttgcgagaca acaaaaa
光滑念珠菌 actgtattag gttttaccaa ctcggtgttg atctagggag ggataagt
新生隐球菌 cgctgggcct atggggtagt cttcggcttg ctgataacaa ccatctc
烟曲霉 gtaggcccgg ccggcgccag ccgacaccca actttatttt tctaa
黄曲霉 ttgccgaacg caaatcaatc tttttcca
黑曲霉 atgctctgta ggattggccg gcgcctgccg acgttttcca accattcttt
构巢曲霉 Cccgctcgac tagggccggc cgggcgccag ccgacgtctc caa
裴氏着色真菌 tgaagggtgc ccgggactcg gtcttctccc tcacgggaac acttttttct a
申克孢子丝 aggcgccctg ccgtgaaaac gcgcatgacg cgcagctctt tttac
红色毛癣菌 ggccgccctg gccccaatct ttatatatat atatatcttt t
须癣毛癣菌 ccggccgctc tggccttccc ccaaatctct ctgagatatt ttttt
疣状瓶霉 cgtgcttggt gttggacgga ttttggtcgt gtaacaacgg c
卡式枝孢霉 tgtgcttggt gttggacggt tttggtcgag tggtctcgac
犬小孢子菌 ggccggcagg ctggcctaac gcaccatgta ttattca
石膏样小孢子菌 tggcctagtt tccgtcagag atgtatttct ctgcaattt
絮状表皮癣菌 gctctctggc cctaatttcc gtcgggagga cgaaaggggg cgacccct
总状毛霉 aaagctcttg taattgactt tgatggggcc tcccaaataa atctttt
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