CN101705301B

CN101705301B - 鉴定致病性曲霉的专用探针与基因芯片

Info

Publication number: CN101705301B
Application number: CN2009102372281A
Authority: CN
Inventors: 刘伟; 许辉; 李若瑜
Original assignee: Peking University First Hospital
Current assignee: Peking University First Hospital
Priority date: 2009-11-05
Filing date: 2009-11-05
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2029-11-05
Also published as: CN101705301A

Abstract

本发明公开了一种鉴定致病性曲霉的专用探针与基因芯片。本发明提供的鉴定致病性曲霉专用探针，由如下20个DNA片段中的至少一个组成：核苷酸序列分别是序列表的序列1至序列10的10个DNA片段和核苷酸序列分别是序列表的序列1至序列10的反向互补序列的10个DNA片段。本发明还提供了含有所述专用探针的用于鉴定致病性曲霉的DNA芯片。所述专用探针、DNA芯片或装置均可应用于鉴定致病性曲霉。本发明中将种特异性探针包被在低密度基因芯片膜上，然后将待测致病性曲霉的rDNA的ITS区通过基于导流杂交技术的检测平台，与低密度基因芯片膜上的种特异性探针进行导流杂交并显色，从而最终鉴定出待测致病性曲霉。本发明具有特异性强、快速的特点，可以在检测临床标本中的常见致病性曲霉，以及进行致病性曲霉菌种鉴定时发挥快速、特异的积极作用。

Description

鉴定致病性曲霉的专用探针与基因芯片

技术领域

本发明涉及一种鉴定致病性曲霉的专用探针与基因芯片。

背景技术

近年来，随着抗恶性肿瘤治疗的深入开展，器官移植尤其是同种异体造血干细胞移植(HSCT)的不断实施，由曲霉感染引起的侵袭性曲霉病(Invasiveaspergillosis，IA)已经成为各种重症免疫受损机体中最常见的机会性感染，也是患者致死的最主要原因，如在白血病和HSCT受者中致死率常超过90％。引起IA的病原菌有烟曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、土曲霉和黑曲霉等，这些IA的不同病原菌对不同的抗真菌药物的敏感性具有很大的差异。譬如烟曲霉对二性霉素B敏感，但是土曲霉却对之天然耐药，而黄曲霉则偶然可以表现出对之耐药。因此准确鉴定不同病原性曲霉的菌种，对于临床上选择恰当的抗真菌药物，具有十分重要的意义。

传统用于致病性曲霉的检查手段主要包括真菌镜检、培养、鉴定以及抗真菌药物敏感性测定等，但是这些方法往往需时长，大约需要3-4周；而且检测的阳性率低。快速、敏感、特异地检测致病性曲霉并对其进行种水平的鉴定，已成为临床上迫切需要解决的重要问题，这一问题的解决，对于正确的诊断、合理选择敏感的药物并制定治疗方案具有十分重要的意义。

分子生物学相关的从临床标本中直接检测真菌的技术和方法正在不断发展中，最为活跃的PCR技术较真菌培养等方法具有快速、敏感等特点，该技术可以扩增血清、血浆、全血、尿液、痰液、支气管肺泡灌洗液和脓液等标本中的真菌成份。但是，目前仍然不能快速、特异地检测临床标本中的致病性曲霉并进一步进行菌种鉴定。

导流杂交技术(Flow-through hybridization，US专利号6020187和5741647)是将探针固定在质基体上，检测样品流经置于导流杂交装置的质基体时，靶序列与探针杂交形成复合体，然后通过显色来检测杂交复合体从而反映出被检测样品中的核酸靶分子。这项技术较传统的杂交方法具有特异性强、快速的特点，如果能够将这项技术与高通量低密度基因芯片技术和灵敏性高的PCR技术结合起来，则可以在检测临床标本中的常见致病性曲霉，以及进行致病性曲霉菌种鉴定时发挥快速、特异的积极作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定致病性曲霉的专用探针与基因芯片。

本发明提供了一种鉴定致病性曲霉的专用探针，由如下20个DNA片段中的至少一个组成：核苷酸序列分别是序列表的序列1至序列10的10个DNA片段和核苷酸序列分别是序列表的序列1至序列10的反向互补序列的10个DNA片段。以上20个DNA片段，均是根据不同种的致病性曲霉的保守序列设计的，其中每个DNA片段，或每两个DNA片段、每三个DNA片段、每四个DNA片段，……，直至全部DNA片段的组合，均可用于鉴定致病性曲霉。

本发明还保护用于鉴定致病性曲霉的DNA芯片，含有以上任一所述的专用探针。

本发明同时保护鉴定致病性曲霉的装置，包括以上任一所述的专用探针或以上任一所述的DNA芯片。

所述装置还可包括序列表的序列11和序列表的序列12所示核苷酸组成的引物对。为了便于检测待测DNA与所述探针的杂交结果，所述引物对上可标记有生物素。

以上任一所述的专用探针、以上任一所述的DNA芯片或以上任一所述的装置均可应用于鉴定致病性曲霉。

以上所述专用探针、所述DNA芯片、所述装置或所述应用中，所述致病性曲霉可为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)或土曲霉(Aspergillus terreus)等。

本发明还保护一种鉴定致病性曲霉的方法，是将致病性曲霉的rDNA的ITS区分别与所述专用探针杂交，根据杂交结果鉴定待测致病性曲霉。所述致病性曲霉的rDNA的ITS区具体可为以待测致病性曲霉的总DNA为模板，用序列表的序列11和序列表的序列12所示核苷酸组成的引物对进行PCR扩增得到的；所述方法中，所述致病性曲霉具体可为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)或土曲霉(Aspergillus terreus)等。

本发明还保护一种检测样本中含有致病性曲霉中的哪种或哪几种的方法，其特征在于：所述致病性曲霉具体可为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)或土曲霉(Aspergillusterreus)；所述方法包括如下步骤：(1)以待测样本的总DNA为模板，用序列表的序列11和序列表的序列12所示核苷酸组成的引物对进行PCR扩增，得到目标DNA；(2)将目标DNA分别与序列表的序列1至序列表的序列10所示DNA片段进行杂交，根据杂交结果评判如下：如果序列1(AF1)和/或序列2(AF2)的杂交结果为阳性，所述样本中含有烟曲霉(Aspergillus fumigatus)；如果序列3(AFL1)和/或序列4(AFL2)的杂交结果为阳性，所述样本中含有黄曲霉(Aspergillusflavus)；如果序列5(AN1)和/或序列6(AN2)的杂交结果为阳性，所述样本中含有黑曲霉(Aspergillus niger)；如果序列7(AT1)和/或序列8(AT2)的杂交结果为阳性，所述样本中含有土曲霉(Aspergillus terreus)；如果序列9(A-P-SPEC1)和/或序列10(A-P-SPEC2)的杂交结果为阳性，所述样本中可能含有曲霉。如果仅有一种曲霉菌相应的探针的杂交结果为阳性，则待测样本仅含有该一种曲霉菌，如果几种不同曲霉菌相应的探针的杂交结果均为阳性，则待测样本中含有该几种曲霉菌。

本发明利用PCR法检测真菌最常用的靶序列之一-内转录间区(Internaltranscriptional space，ITS)，这是一个多拷贝的串联重复序列，其28s、5.8s和18s rDNA在种间具有保守性，故可以用于设计通用引物，然后进行PCR扩增；而ITS1和ITS2区具有可变性，因此可以进行种特异性探针的选择。本发明中将种特异性探针包被在低密度基因芯片膜上，然后将上述PCR产物通过基于导流杂交技术的检测平台，与低密度基因芯片膜上的种特异性探针进行导流杂交(Flow-through hybridization，US专利号6020187和5741647)并显色，从而最终实现临床标本中致病性曲霉的快速检测及其准确的菌种鉴定。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中所用的DNA片段如下：

针对致病性曲霉的核酸rDNA的ITS区的特异性探针：

烟曲霉特异性探针：

AF1(Aspergillus fumigatus)：5’-GCCGTTTCGACGGCCGCCGGGGAGG-3’；序列表的序列1。

AF2(Aspergillus fumigatus)：5’-AACATGAACGCTGTTCTGAAAGTATG-3’；序列表的序列2。

黄曲霉特异性探针：

AFL1(Aspergillus flavus)：5’-CGAACGCAAATCAATCTTTCC-3’；序列表的序列3。

AFL2(Aspergillus flavus)：5’-ACGAACTCTGTCTGATCTAGT-3’；序列表的序列4。

黑曲霉特异性探针：

AN1(Aspergillus niger)：5’-GCCGCTTGTCGGCCGCCGG-3’；序列表的序列5。

AN2(Aspergillus niger)：5’-CACGAACACTGTCTGAAAGCGT-3’；序列表的序列6。

土曲霉特异性探针：

AT1(Aspergillus terreus)：5’-CGACGCATTTATTTGCAACTTGT-3’；序列表的序列7。

AT2(Aspergillus terreus)：5’-ATGAACCCTGTTCTGAAAGCTTG-3’；序列表的序列8。

曲霉特异性探针：

A-P-SPEC1：5’-TCCTCGAGCGTATGGGGCT-3’；序列表的序列9。

A-P-SPEC2：5’-CGGCTTGTGTGTTGGG-3’；序列表的序列10。

将上述探针分别包被在基因芯片膜(硝酸纤维素膜)上。

扩增致病性曲霉的rDNA的ITS区的引物对(引物上标记有生物素)：

Forward：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCA-3’；序列表的序列11；

Reverse：5’-CGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCG-3’；序列表的序列12。

以下实施例中所用的致病性曲霉样本分别购自北京大学真菌和真菌病研究中心菌种保藏中心，每个菌种样本的编号如下：

烟曲霉(Aspergillus fumigatus)：AF293；

黄曲霉(Aspergiilus flavus)：BMU002584；

黑曲霉(Aspergillus niger)：BMU02090；

土曲霉(Aspergillus terreus)：BMU00322。

实施例1、致病性曲霉的检测及菌种快速鉴定

分别将含有已知不同菌种的致病性曲霉的样本按照标准方法提取基因组DNA，然后用上述引物对(序列表的序列11和序列12)进行PCR反应(约1.5小时)，之后将PCR产物与标记有不同探针(分别为序列1至序列10所示探针)的硝酸纤维素膜通过医用核酸分子杂交仪进行导流杂交反应，根据反应的结果判断被检测样本中的菌种，所需时间为3.5小时。结果见表1。

表1常见致病性曲霉的鉴定结果

样本	检测结果
		烟曲霉(Aspergillus fumigatus)	AF1、AF2阳性；A-P-SPEC1、A-P-SPEC2阳性；AFL1、AFL2、AN1、AN2、AT1、AT2阴性；
黄曲霉(Aspergillus flavus)	AFL1、AFL2阳性；A-P-SPEC1、A-P-SPEC2阳性；AF1、AF2、AN1、AN2、AT1、AT2阴性；
		黑曲霉(Aspergillus niger)	AN1、AN2阳性；A-P-SPEC1、A-P-SPEC2阳性；AFL1、AFL2、AF1、AF2、AT1、AT2阴性
土曲霉(Aspergillus terreus)	AT1、AT2阳性；A-P-SPEC1、A-P-SPEC2阳性；AFL1、AFL2、AN1、AN2、AF1、AF2阴性

实施例2、致病性曲霉混合菌的检测及菌种的快速鉴定

将含有已知的致病性曲霉的混合菌的样本按照标准方法提取基因组DNA，然后用上述引物对(序列表的序列11和序列12)进行PCR反应(约1.5小时)，之后将PCR产物与标记有不同探针(分别为序列1至序列10所示探针)的硝酸纤维素膜通过医用核酸分子杂交仪进行导流杂交反应(约2小时)，根据反应的结果可以判断被检测样本中所存在的混合的菌种，总共所需时间为3.5小时。结果见表2。

表2致病性曲霉混合样本的鉴定结果

标本	混合菌种标本中的菌种	检测结果
			标本一	烟曲霉、黄曲霉	AF1、AF2、AFL1、AFL2、A-P-SPEC1、A-P-SPEC2阳性，其余为阴性
标本二	烟曲霉、黑曲霉	AF1、AF2、AN1、AN2、A-P-SPEC1、A-P-SPEC2阳性，其余为阴性
			标本三	黄曲霉、黑曲霉	AFL1、AFL2、AN1、AN2、A-P-SPEC1、A-P-SPEC2阳性，其余为阴性
标本四	烟曲霉、黄曲霉、土曲霉	AF1、AF2、AFL1、AFL2、AT1、AT2、A-P-SPEC1、A-P-SPEC2阳性，其余为阴性
			标本五	烟曲霉、黑曲霉、土曲霉	AF1、AF2、AN1、AN2、AT1、AT2、A-P-SPEC1、A-P-SPEC2阳性，其余为阴性
标本六	黄曲霉、黑曲霉、土曲霉	AFL1、AFL2、AN1、AN2、AT1、AT2、A-P-SPEC1、A-P-SPEC2阳性，其余为阴性

序列表

<110>北京大学第一医院

<120>鉴定致病性曲霉的专用探针与基因芯片

<130>CGGNARY92637

<160>12

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gccgtttcga cggccgccgg ggagg 25

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

aacatgaacg ctgttctgaa agtatg 26

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

cgaacgcaaa tcaatctttc c 21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

acgaactctg tctgatctag t 21

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gccgcttgtc ggccgccgg 19

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

cacgaacact gtctgaaagc gt 22

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

cgacgcattt atttgcaact tgt 23

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

atgaaccctg ttctgaaagc ttg 23

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

tcctcgagcg tatggggct 19

<210>10

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

cggcttgtgt gttggg 16

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

tccgtaggtg aacctgcgga aggatca 27

<210>12

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

cgcttattga tatgcttaag ttcagcg 27

Claims

1.鉴定致病性曲霉的装置，包括下述a)和b)：

a)序列表的序列11和序列表的序列12所示核苷酸组成的引物对；

b)鉴定致病性曲霉的专用探针或含有所述专用探针的DNA芯片；所述鉴定致病性曲霉的专用探针，由序列表的序列1至序列10的10个DNA片段组成。

2.如权利要求1所述的装置，其特征在于：所述引物对上标记有生物素。