CN1436856A - 测定靶核酸的方法、用途及其所用的导流核酸杂交装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种导流核酸杂交装置，还提供了一种测定标本中是否存在靶核酸序列的方法，分为三步：a、固定核酸探针至膜基质上；b、样品经过导流装置的膜基质，靶序列与探针形成复合物；c、检测形成的复合物，阳性结果提示样品中含有靶序列。同样可以，定量检测经a.b后形成的复合物达到对样品靶序列定量的目的。同时提出了该方法的各种用途。

Description

测定靶核酸的方法、用途及其所用的导流核酸杂交装置

技术领域

本发明涉及一种测定靶核酸的方法、该方法的用途，以及该方法所用的导流核酸杂交装置。

背景技术

DNA杂交技术已成为现代分子生物科学包括基因研究中最为重要的研究方法，通过特定DNA序列的互补特性而进行的溶液杂交复合性过程，揭示了不同基因组核酸序列的复杂性。溶液中互补单链DNA的复合成双链的动力学取决于双分子的碰撞，因此，核酸靶序列的扩散率与浓度直接决定了反应率。虽然溶液杂交对于单个特定基因序列的定量测定已取得令人满意的成果，但是该技术除非经过精细分离并不适于混合标本中多个序列的研究。Southern(Southern E.M.(1975).J.Mol.Biol.98.503-517.)最先发现的膜杂交技术解决了这个难题。待测DNA经限制性核酸内切脢(ER)消化以后，电泳，再固定于硝酸纤维膜(NCM)，特定DNA序列经与放射性标记的互补，DNA探针杂交而得以鉴定。由于在同一张膜上，可使用不同序列名为探针进行多次重复杂交，因此可以获得特定基因或基因家族的结构信息。此外，尚可获取其它相关序列的更多信息。本发明人及同事曾运用等位特异寡核苷酸(ASO)测定了香港中国人群地中海贫血病的基因的点突变(Antonarakis.S.E.et al.，(1988).Brit.J.Haemat.70.357-361.).Southernblotting分析，从而成为了目前最为广泛使用得分子生物学技术。在所谓ZOO BLOT(Miller J.R.and Koopman M.，1990)中，运用不同的限制性内切脢(Restriction Enzyme)与靶DNA探针制备图谱，可在同一膜内对不同来源的同种DNA定位并确定其是否存在。若不考虑某种特定序列的大小及其详细情况，只是检测该序列存在与否，Dot与Slot blot分析则为大量标本快速筛选之首选技术。遗憾的是，Southern blot、Dot及Slot blot均不能于同一张膜上同时研究多个序列，使用不同探针反复杂交相当耗时。此外，目前市场上出售的用于blot分析的膜，一般不能与少于100bp的多核苷酸片段以高亲和力结合。过去我们报道的直接凝胶杂交法尽管省去了印迹过程，减少了操作时间。但于300bp的DNA片段所仍不能被检测出来(Huang C.H.，LamV.M.S.and Tam J.W.O.，(1988).in Birth Defects：Original Article Series.Vol.23#5A.125-131.)。后来Maggio，A，et al(Maggio.A.et al.，(1990).AnimalGenetics.21.77-82.)发展的反相Dot blot技术解决了这些问题。方法中，将大量捕获寡核苷酸共价结合至Biodyne C膜上用于捕获靶DNA分子，然后杂交显色。运用该技术，原则上捕获寡核苷酸的数目只受膜面积限制。因此，该技术对于同一基因的同一位点或不同位点亦或不同基因的多个突变是一种理想检测技术。它已被应用于地中海贫血、血友病及其它疾病的点突变，包括短片段的插入或丢失(Tam J.W.O.and Woo Y.K.，The Proceeding of TheMiami Winter Symposium on the Biotechnology and Gene Technology.1994)，从而为快速发展的核酸诊断市场引入了新的技术途径。但是，与Southern、Dot和Slot blot一样，仍然费时耗试剂。随着诊断学的高速发展，迫切需要更优越的杂交程序，而本发明专利申请描述的独特杂交程序原理与装置，适时地满足了这一要求，在杂交时间与试剂用量的节省上取得了重大突破。

目前，传统杂交技术或反相dot-blot于适当温度在玻璃管或塑料袋里进行完全杂交的时间较长，通常需要几小时到隔夜。如此低的复性(amealling)效率，其原因如下：1、必须足量体积的杂交液覆盖膜表面，探针浓度因此稀释。由于复性动力学是一双分子的碰撞过程，因此，探针的稀释影响了其对靶序列的捕获；2、杂交孵育过程中，大部分杂交液并未与膜接触，从而增加了单链互补的DNA探针的自我复性机会，进一步减少了探针的有效浓度。杂交时间越长，可杂交的单链DNA浓度越低；3、浸没杂交过程中，结合于膜外表面的靶DNA最易与探针结合，但实际上膜外表面仅有少量靶DNA，大量DNA结合在膜的里侧。由于探针扩散到内膜的速度比较慢，因此靶DNA复性速率进一步减慢，最终导致检测灵敏度降低，即使延长时间也无济于事。而本专利中描述的导流杂交过程排除了所有上面的不足。

最近，Felndt.H.H，Mallonee.R.L and Mcfarland E.C申请了寡核苷酸流通杂交分析专利(申请号：93120394.7；刊号：605828A1)。他们应用了免疫分析的流通方法(美国专利号：4366241；4727019；4632901and4818677)测定DNA序列。然而，该法只能用于鉴别非同源序列，即使如此，仍显示高背景噪音，其灵敏度和特异性亦不达要求。欲达到高特异灵敏的核酸杂交，最重要的要求是严格度的准确控制，尤其是鉴别同源性很高，密切相关的序列，如等位变异，同一生物体内基因家族和不同生物体相同的序列，必须严格要求。即便鉴别不同生物体相同功能的基因家族，该流通过程仍不能得到满意的结果。

发明内容

本发明的原理是利用导流杂交机制，单链靶核酸分子可以通过质基体孔并予固定于质基体孔内侧的相应捕获互补的DNA或RNA序列紧密结合，从而高灵敏、高特异地有效检测靶序列。

本发明提供了一种测定样品中靶核酸的方法，其步骤为：

a、将核酸探针结合于质基体上用以和靶序列核酸因杂交而捕捉样品；

b、样品流经置放于导流杂交装置的质基体，让靶序列能和探针杂交成结合体；

c、检测形成的复合物，阳性结果提示样品中含有待测靶核酸序列。

其中c步骤可以进一步为定量检测复合物，从而对样品中靶核酸进行定量检测。

本发明还提供了另一种测定样品中靶核酸的方法，其步骤为：

a、将样品结合至质基体上；

b、探针经过导流杂交装置的质基体，靶序列与探针结合形成复合物；

c、检测形成的复合物，阳性结果提示样品中含有待测靶序列。

其中c步骤可以进一步为定量检测复合物，从而对样品中靶核酸进行定量检测。

上述测定样品中靶核酸的方法所用的标记物可以为生物素、地高辛、荧光素、化学发光素或辐射发光素等。

上述的测定样品中靶核酸的方法，所述的b步骤于1至5分钟内完成。

本发明的方法可以在同一个样品中测验一个或一个以上的靶序列，所述的靶序列还可以是不同突变点的同一已知序列。

本发明的方法的导流杂交的温度为恒温，恒温调控准确度在0.5℃内。

本发明的方法的导流方向、速度、流量可以改变调控，如导流方向可为上下流向、左右横流或由中心向外扩散等。

本发明还提供了一种用于测定样品中靶核酸方法的导流杂交装置，其主体为一杂交室，所述的杂交室包括：一顶盖；一垫圈，所述的垫圈上有用于导流的一个或一个以上的孔或槽；一通孔板；一金属块，所述的金属块有一导流结构，它的温度受恒温控制；二层绝缘层，分别在金属块的上、下表面及四周；一与核酸样品或探针结合的质基体，固定于垫圈的下表面，质基体上有液体流入体内的通道；一有±0.5℃精确度的恒温调控装置；所述的顶盖、垫圈、质基体和有孔金属板按照上下的次序固定在金属块上表面的槽内，所述的恒温调控装置位于杂交室的下部，所有部件都密封连接。

本发明装置的金属块的导流结构可以为，金属块的上表面的一侧有数个储液池，储液池下部连通一个U型的通道，通道开口设在比储液池所在表面低的金属块上表面的台阶上，在金属块中央最低的表面处，开有数个由上而下垂直的空槽，每个空槽连接有排液道，最后连接金属块的流出通道，并有一个流入通道与质基体相连，垫圈上的孔或槽、液体流入质基体内通道、储液池、U型通道、开口、空槽以及排液道的个数一致。

本发明装置还可以在质基体下面再放一个下垫圈，所述的下垫圈一侧设有液体流入通道，另一侧相对应设有液体流出通道，通道的个数与质基体上面垫圈的孔或槽的个数一致。

本发明装置的恒温调控装置可由不同材料制备，最廉价的方法是利用外面水槽循环加热液体保持恒温。另外，还可以将加热和冷却的部件直接安在装置里，本发明人使用了简单的Peltier加热与冷却的部件。这两种模型均为最简单的，而且检验合格。

本发明的恒温调控装置还可以引入一个自动系统装置，包括自动输送液体装置和控制流速装置等。

本发明装置中采用的质基体可以是膜质基体或其它形式的质基体，如Nanotubes，Porous glasses(多孔玻璃板)等，用于固定核酸捕获分子(DNA探针、靶DNA或者寡核苷酸序列，固定形式可以是夹心式，如在质基体上覆盖亲和结合物抗生物素蛋白形成活化质基体，该质基体适合所有的试验。然后将所需特定序列的生物素化的DNA探针加至活化质基体上，捕获靶核苷酸分子。本发明采用的膜可以是各种类型的，只要能以夹心式固定DNA序列或蛋白质结合物，如纤维素膜、尼龙膜、Nytran或Biodynes或其它能被液体流通的质基体，可以是单元或多元体。本发明人实施例中使用了Biodyne C膜，因为它产生的背景低，而且对膜封闭处理要求也低。寡核苷酸探针5’端-NH₂通过EDC(1-Ethyl-3-L3-DIMETHYL-AMIN0PROPYL)-CARBODIIMIDE)化学修饰后，与Biodyne C膜上的-COOH共价结合。

本发明的装置中，样品或探针的流速和方向可通过垫圈、吸附剂、仪器的吸入机制、金属块等的设计变化而得到调控。如导流方向可以通过改变垫圈、金属块的槽和开口的结构而改变为上下流向、左右横流或由中心向外扩散等其它导引方向流动。

本发明的的杂交室的材料及所用的传热材料可以是铝、合金或其他有孔的导热合成材料。

本发明的杂交室的给予液体流通的通孔板的材料可以是铝、合金、纳米孔金属板等。

本发明的装置的金属块还可以连通一个可以调节液体流速的蠕动泵。

进一步，还可以在蠕动泵和膜之间连接一个返回途径。

本装置的恒温调控装置可以由一供电及调节装置供能。

本发明一种测定样品中靶核酸的方法的用途，其特征在于，导流杂交可用于核酸杂交、抗体-抗原反应、受体-配体反应、化学结合物中的离子-配基反应等化学分子结合反应中亲和性配偶的存在与否及其定量多少。

如：本发明的方法可进行下列试验：

1、Southern blotting(包括ZOO BLOT)，进行基因组DNA分析：经限制性脢消化后的5-10ug DNA，凝胶电泳确定各片段大小，转移并固定于膜上，再将膜放进有温度调控装置的导流杂交仪上。通常于68℃，3×SSC中或42℃，用胺缓冲液中预杂交，也适用于其它杂交缓冲液。带有相应已标记核苷酸的待测样品流经膜进行变性，然后显色或化学发光或放射自显影。同样的原理，将RNA结合至膜上，可用于Northern blotting分析。

2、若不需要检测特定序列的片段大小等，则可以通过结合一种或多种特定序列的探针于膜上同时检验多个人序列，而Dot或Slot只能检测某种单一序列。通常先采用PCR扩增具有标记核苷酸底物的靶序列，再经过流通杂交、显示结果。

3、反相Blot分析：

A.检测点突变或短片段序列的插入或丢失。设计试验用的寡核苷酸、制备探针并结合至膜上。在同一轮试验中，所有设计的寡核苷酸其Tm值应非常接近，不同序列的Tm值相关范围应在±2℃以内，这对于避免突变与正常序列交叉、排除假阳性和假阴性结果至关重要，因此要求必须准确控制块的温度。否则在杂交条件下，将难以鉴定实验结果。这正是其它方法包括前面提及的Felndt et al(EPO 605828 A1)的专利方法存在的严重不足之处，而本专利对于该难题提出了独特的解决途径。运用本专利中流通杂交的方法同时能检测和区分多个同源性很高的序列，富创新意义。

B.同时测定无关序列。设计并合成同一生物体或不同生物体特定基因的特定序列(使它们具有相近的Tm值)、制备探针并结合至膜，以捕获相应靶序列。不同靶序列同时与相应标记的核苷酸探针结合以产生灵敏的检测信号。靶序列可经PCR、SDA及其它方法标记或扩增，如放射活性标记寡核苷酸或非放射活性标记地高辛、生物素和S-核苷酸等。流通杂交后经放射或非放射活性标记以脢联免疫吸附分析ELISA检测信号。本发明人曾分别AP和HRP显色和化学发光检测信号，结果满意。

据报道，Chiron(Hendricks-DA，et al，1995 and references therein)发展的分支DNA测验法(Branch DNA test)用于定量测定比较可靠，原因是检测信号的放大直接与PCR、SDA或LCR扩增前的靶序列浓度直接呈比例相关。由于实验中仍然涉及杂交过程，所以本专利提倡的导流杂交方法同样适合以分支DNA测验法而加以定量。

本发明的方法广泛适用于目前文献报道的传统Southern、Northern、Dotblot、Slot blot和反相Dot-blot杂交程序。由于该设备能准确控制反应条件，若将其用于Western blot，可望大大提高其灵敏度和特异性。

附图说明

图1为本发明的导流核酸杂交装置的设计示意图。

图2为本发明同样装置另一流程示意图。垫圈设计的改变有效地改变了样品流向从而达到更灵敏的检测。这样的设计再加上内标则可进行半定量。在此基础上进行一些改建则可形成更加高级的装置达到自动和定量检测。

图3为本发明导流核酸杂交装置的结构示意图。

其中：

1-顶盖                     2、3-垫圈

M-膜片                     4-通孔板

A-杂交室                   60-排液道

71-返回途径。

图4为本发明的恒温杂交室的其中一种设计。

其中：

A-杂交室                  B-电子冷热组件

C-热交换器                D-降温扇

h1-4液体流入通道          h5-8液体流出通道

I-绝缘层                  M-膜片

s-液体流入膜内的通道      1-顶盖

10、11、12、13-储液池     2-垫圈

20、21、22、23、30、31、32、33-开口

3-垫圈                    4-通孔板

5-金属块                  50、51、52、53-空槽

55-58-槽50-53的底部       6-绝缘层

60、61、62、63、64-引进蠕动泵的排液道

7-5的底面                 8-热交换器的顶面。

图5为本发明导流杂交过程的灵敏度测试。杂交条件：68℃，3×SSC，0.1％SDS，10×Denhats’溶液。

图6为本发明单个点突变的检测图。N：正常DNA序列；M：点突变序列；右侧数字代表珠蛋白的基因内点突变位置。杂交条件：42℃，2×SSC，0.1％SDS溶液。

图7为本发明同时检测不同DNA序列图。G：人β-珠蛋白的基因。IR：鼠胰岛素受体基因。TS：猪蛔虫胸腺嘧啶脱氧核苷合成酶基因。PAT：细菌质粒对照。

图8为在严格度低(Low Stringency)下进行杂交的结果。N：正常DNA序列：M：点实变序列、右侧杂交条件：37℃，2XSSC，0.1％SDS溶液。在严格度低的情况下无法得到正确的结果。

图9为本发明用的另半自动装置。其中杂交室、泵及调控系统装成一体。

具体实施方式实施例1    导流核酸杂交装置

结合图3和图4，对本发明的导流核酸杂交装置作进一步说明。

如图3所示，本发明的导流核酸杂交装置，其主体为一有温度调控的导流杂交室A，并连有蠕动泵和直流供电装置及调控器。

图4装置的恒温杂交室的结构示意图；蠕动泵，调控器等可同时装合成一体如图9所示，更可以增加其它自动功能，装成全自动系统。

参见图4简单的排列，便可对本发明一总的印象。实用的机器可设计由简单而至全自动的复合组件均可。主体流通杂交箱体分为两组件：杂交室A和加热-冷却组件B、C、D。“B”是Peltier电子冷热组件，而“D”是降温扇。

杂交室A主要由金属块5构成。其外面的绝热层6是由聚氨基甲酸乙酯制成，阻止热量散发从而保持金属块5均匀恒温。加热与冷却由B控制，而B由供电装置和调节组件PSR供能。B的上表面与块5底面7连接，而B的下表与热交换器C的顶面相连。绝缘层I阻止块5通过7-8传热至热交换器C或反过来传热。为了增加热交换的效率，将降温扇D直接安装在组件B下面。

图4中，金属块5采用具有较好热传导性能的材料，如铝、铜、不锈钢等。通常因为铝有较高的热传导效率而被首选。但因杂交过程中，会有各种溶液与金属面直接接触而可能发生化学反应，因此金属块上需要涂层。该涂层可以是anodisation、Telflon涂料等，现在已有的或将来发明的新方法。实验表明热传导材料越好，膜表面杂交的温度准确控制也越好。简便起见，本发明人在该试验性的装置中采用了不锈钢制备杂交室A，只是不锈钢的热传导率远低于铝，膜试验表面尤其膜边缘的温度可能不均匀，而且杂交前需要更长时间才能达到温度平衡，尽管如此，我们仍然得到了非常满意的实验结果。图4中装置的顶盖1，由同样的热传导金属制成，其它如透明塑料等材料亦可。垫圈2和3由热传导材料GAPPAD7M(Bergquist公司生产)制备。在通孔板4上，开有小孔，使液体可以通过，然后将4直接安放在杂交室A主体块5的内表面。因此，整个装置通过螺钉将1-5装配为一体。凹陷的空槽50-53使得溶液能够通过连接的排液道61至64和60再流经膜。流速可根据需要由与60连接的蠕动泵P(参见图3)控制。为使流通杂交过程更加简单，可在空槽50至53填上吸水纸，液体通过吸水纸的毛细作用输送。该法特别适合滴管输送溶液和样品。当然，这些空槽还可以设计成其它形式，溶液可通过返回途径71(参见图3)进行再循环而连续孵育。使用本流通杂交程序，由于预杂交液、样品或膜洗液需要量很少而且杂交效率也高，可以不需要上面介绍的再循环设计。但是，若对于大量稀释的样品，这样的再循环设计可能十分有用。贮液池10到13(作为金属块5的一部分)，盛装流进的样品和膜洗液等。液体先平衡至所需温度后，经由开口20至23，最后通过开口30至33流经膜。1至3所示装置用于半定量分析，改变垫圈的设计可以产生其它装置形式。此外，空槽数也可以根据需要作不同设计；还可以设计类似ELLSA形式的一系列96个圆孔，每个孔可用作多个分析和控制分析；亦可设计成与一般的Southern blotting杂交类似的膜滤片。

实际使用的装置远不只是图1所示及后面实施例所述。具体描述如下：膜片与捕获核酸探针一起孵育，置于垫圈2的狭缝上，再如上面所述将1至5装配为一体。贮液池10至13盛装SSC等预杂交液，并以10→20→30→h1→s1方向沿着膜片M流经膜，然后液体继续经h5→50并流向吸水物质。流速由蠕动泵P控制流向60出口。接着，待测样品以同样途径流进，用膜洗液洗膜，然后将金属块5的温度加至显色设置温度显色。精确定量的杂交程序还依赖于所选用的显影显色系统。在横向(Lateral Flow)泛导流杂交过程中，所有溶液或样品都将通过膜与探针接触。因此，只要将溶液流速调节至允许足够时间达到探针与靶序列的结合平衡，则可望进行定量分析。其它装置形式也应该可以定量。在后文的实施例中，实际上许多液体流经膜时，并未捕获靶序列而至流失，横向泛流法便可淢少流失，如把溶液再次转向靶分子，将会进一步提高检测灵敏度。虽然目前尚无具体的资料信息证明，根据数学理论，该结论是合理的。

图4是本发明的一个代表性模型，根据本发明的总体原则尚可设计制成更为高级的模型。本发明可应用于所有的核酸杂交过程。若将其用于现在常用的膜免疫分析(Immuno-diagnostic)，将大大提高分析质量。参考下面的实施例将有助于对本发明更完全地了解，但须申明，本发明所述装置并不只限用于下述实施例。实施例2    灵敏度与特异性的检测

本实施例试验用于检测流通杂交装置的性能，实验均在流通杂交装置原始模型上进行。将不同浓度的特定序列DNA(此处使用了球蛋白基因序列的PstI 4.4kb片段)RK1，热变性后结合至NC膜(或用于Southern blotting分析的其它任何膜)，同时设置对照DNA(RK28与pAT)，以同样的量平衡进样于不同的泳道以检测这些不同序列间是否交叉杂交。待测DNA样品经PCR产生：以1ug人基因组DNA为模板，加1单位元高温聚合霉(TaqPoly merase)作用下进行聚合。DNA先于94℃变性后进入循环程序：变性，94℃，1分钟；复性，54℃，1分钟；延伸，72℃，1分钟。30次循环，最后延伸10分钟。所用的两个引物：

5′-d(TCATTCGTCTGTTTCCCATTCTAAA)-3′(SEQ ID NO：1)和

5′-d(GGACAGGTACGGCTGTCACTTA)-3′(SEQ ID NO：2)是位于人β-珠蛋白序列侧翼外显子I与外显子II之间，可产生长760bp的片段，经黥脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物纯度。杂交装置中金属块及所有的杂交溶液保温于68℃。流通杂交过程如下：

(1)用0.5ml封阻溶液(3×SSC，o.1％SDS，10×Denhardt’s溶液和100ug/ml变性鲑鱼精DNA)孵育膜进行预杂交，其它封阻溶液和杂交液同样适用。如果改变封阻液中组分、DNA序列以及温度设置，可以达到改变杂交条件的目的。譬如：采用DIG(Digoxigenin，地高辛)标记的DNA试剂盒进行流通杂交，对封阻溶液由5×SSC、0.1％N-lauryl sarcosine、0.02％SDS及1％封阻溶液组成，温度设置在65℃。

(2)10ul PCR产物与40ul封阻溶液，95℃变性，再用于68℃加入0.5ml反应液，然后将其滴加到膜上。

(3)用0.5ml封阻溶液洗膜两次。

(4)将块温度降至室温(37℃亦可)，滴入0.5ml链霉亲和素-辣根过氧化物(Streptavidin-HRP)结合物。

(5)再用0.5ml反应液(0.1×SSC与0.1％SDS或其它溶液)洗膜。

(6)直接在设备上显色或将膜取出置入塑料盒里显色。

从第1步至第5步，大约需要3-5分钟，第6步需30分钟，如果使用化学发光分析，此第6步过程只需2分钟。若使用胶体金结合物测定则不超过1分钟。实验结果见图5，可见β-珠蛋白序列探针与DNA对照之间完全没有交叉杂交现象，即RK28与pAT无杂交信号。若使用亲和素-HRP，最低DNA检测浓度是3.25×10-16摩尔，而化学发化检测的最低浓度是50pg(1.6×10-17摩尔)。与使用传统Southern杂交程序的平行实验相比较，发现两方法的灵敏度和特异性相差不多，相比之下本导流杂交法甚至优越于传统法。比较其杂交时间，传统法至少6-10小时，而本装置甚至可少于1分钟。其次，使用该导流程式使得样品量和试剂用量减少20-100倍，从而节省了大量的时间和财力。实施例3    流通杂交速率的测试

为了确定导流杂交程序的最优条件，本发明人进行了一系列实验以确定对应于流速的有效灵敏度，其操作步骤同实施例2。每次实验，结合10ng(3.3×10-15摩尔)人β-珠蛋白DNA至膜上，然后将1微克(1ug)人总球蛋白的DNA经30循环PCR扩增产生生物素化的DNA片段，取10微升稀释至0.5毫升加热变性，流经膜与探针结合复性，除特别控制流通时间外，其它条件同实施例2。同时，我们同种膜和相同量的DNA进行了传统的杂交实验以作比较。在68℃，于塑料袋中用封阻溶液(3×SSC，O.1％SDS，10×Denhardt’s溶液和100ug/ml变性鲑鱼精DNA)5ml覆盖膜，预杂交6小时，然后将10ul变性的生物素化DNA加入袋中杂交。一定时间后，洗膜、显色，用BioRad出售的显象装置测定颜色强度，结果见表I。很明显，杂交导流装置一分钟的流量足以达到80％以上的灵敏度，而传统杂交法在杂交30-60分钟后，灵敏度仍然低于20％。因此，亦可见该导流程式在省时和省料方面大大优于传统方法。

表I    相对杂交率

时间(分)	显色强度(％)
				流通杂交法	传统方法
1	80.2	未做
			3	89.2	未做
5	95.5	未做
			30	未做	35.6
360	未做	100

*设定传统杂交6小时至过夜的显色强度为100％。实施例4    多个样品和不同生物体来源多个序列的同步检测

将四种不同序列的DNA混合样品与四个相同空槽上的膜结合，用以捕获标记的DNA探针。这四种DNA是：A、人类β-珠蛋白基因的4.4kb pst I(RK1)基因片段，该片段含有全部球蛋白基因，包括三个外显因子(I、II、III)和两个内含子；B、珠蛋白基因的第三外显因子(E3)；C、867bp的人胰岛素受体(hIR)c DNA(含外显子10-12)；D、鼠胸腺嘧啶脱氧核苷合成霉(TS)cDNA。质粒DNA(pAT)与含有人α-珠蛋白cDNA片段(JW101)的质粒序列，用作阴性对照，检测背景杂交信号。下面PCR扩增的DNA片段用生物素标记的dUTP产生：#1探针—人珠蛋白的序列的外显子E1和E2；#2探针—人珠蛋白的序列的外显子E3；#3探针—280bp的鼠TS cDNA序列；#4探针—216bp的IR cDNA序列。阳性杂交结果理论应是：(1)#1探针只能与RK1杂交；(2)#2探针可与RK1和E3杂交；(3)#3探针只能与hIR杂交；(4)#4探针只能与TS序列杂交。此例中，使用与实施例2相同的程序和杂交条件。第一槽用#1探针杂交。第二槽用#2，#3。第三槽用#4。第四槽用#2，#3，#4。结果见表II，实际与理论结果相符。表明：如果严格控制杂交条件，利用本流通杂交装置，单个甚至多个DNA序列同时存在均不会发生交叉杂交现象。

表II    多个样品多个序列的同步检测

样品	探针
					#1	#2+#3	#4	#2+#3+#4
	PAT	-	-	-					-
JW101					-	-	-	-
	KK1	+	+	-					+
E3					-	+	-	+
	hIR	-	+	-					+
TS					-	-	+	+

实施例5    同一序列多个点突变的同步检测

在实施例中，根据待测特定基因序列合成相应特异的17-24个碱基的互补单链寡核苷酸序列Tm值相差在2℃以内。每一寡核苷酸序列的5’端用H₂N-(CH₂)₃-moiety修饰(H₂N-digos)，然后与含有-COOH的Biodyne C膜反应结合。有关膜处理与结合的方法已经建立(J.W.O TAM 1995或Maggio等1993)；用0.1N HCL处理膜后，双蒸水洗膜，然后用水溶性的EDC(0.8g溶于5ml水)处理15分钟，再用Watman滤纸吸干。将H₂N-oligos溶于0.5MNaHCO3/Na₂CO₃，终浓度为10gM。将1ul oligos点于膜上，静置10-15分钟，然后用0.1N NaOH中和10分钟，水洗并印干。将适量的膜安放在流通杂交装置中，如图1所示。杂交装置与所有溶液均预温于42℃。用0.5ml 2×SSC、0.1％SDS润湿膜(9×7cm)，然后加入0.5ml变性的PCR靶DNA扩增产物。再用0.5ml 2×SSC、0.1％SDS将未结合的生物素化的PCR产物洗去，接着用0.5ml pH7.0、0.1M柠酸钠洗。加入0.5ml 1∶2000稀释的BM公司出品的链霉素-辣根过氧化物，并按厂家说明，用7MB冲洗和显色。此例中，发明人使用了地中海贫血病人人群的四种基因组DNA样品，这些病人的DNA已经过程测序鉴定。它们的β-球蛋白DNA编码区均有点突变或小片段的丢失，普遍见于香港和中国南方的β-地中海贫血病人。下文中的数字表示编码区域碱基位置或密码子数，转录起始点定为1。-28指转录起始点上游(5’方向)28位有单个碱基的置换(如：A被G置换，正常为突变)，17指位于17密码子的单个碱基置换(如：在102位A被7置换)，41指密码子41发生了四个碱基(TCTT)的丢失。结合至膜上的每一道的寡核苷酸如下：第1例是正常序列GCTGGGCATCAGC(SEQ ID NO：3)，靠近-28；第2例是突变序列GCTGGGCATAGAAGTCAG(SEQ IDNO：4)，位于-28附近；第3例是正常序列CTGTGGGGCAAGGTGAA(SEQ ID NO：5)，中心是密码子17；第四例是突变序列CTGTGGGGCTAGGTGAA(SEQ ID NO：6)，位于密码子17附近；第5例是正常序列AAGGACTCAAAGAACCTCT(SEQ ID NO：7)，邻近密码子41；第6例是异常序列CAGAGGTTGAGTCCTTTG(SEQ ID NO：8)，邻近密码子41。所用的两个PCR引物是：5’-GGACAGGTACGGCTGTCATCACTTA3’C(SEQ ID NO：2)与5’-TCATTCGTCTGTTTCCCATTCTAAA3’(SEQ ID NO：1)按实施例2中所述方法扩增产生地中海贫血病人四种生物素化的DNA样品，结果表明：第一种病人存在杂合点突变；一条染色体载有-28位突变，另一条染色体上在密码子17有突变；第二种病人在两条染色体的-28位均有点突变；第三种病人的一条染色体上密码子17处载有点突变，另一条染色体上密码子41处有四个碱基的丢失。正常对照DNA从具有正常球蛋的DNA序列的个体中分离所得。如图6所示，显然实验结果与理论完全一致。在单个点突变的诊断试验中，既未见假阳性也未见假阴性。值得一提的是，如果采用传统的杂交方法，一共需要进行24次试验。Becken Dick inson Sc公司描述的流通杂交方法不能应分这些点突变，因为杂交控制严格度低(Low Stringency)，室温下进行上述同样试验，每孔均产生阳性结果。(见实施例7)。实施例6    寡核苷酸探针同时检测无关来源的多个序列

此导流分析可同时检测不同序列存在与否。此实施例中，发明人将四种不同的募核苷酸探针结合至试验膜上以捕获相应的人β-珠蛋白的(G)，鼠眱岛素受体(IR)，猪蛔虫胸腺嘧啶脱氧核苷合成(TS)及质粒pAT DNA序列。上述四种序列的生物素化DNA样品分别通过PCR获得，使用实施例7中的杂程序。图7显示了四种独立的杂交结果：槽1只与人β-珠蛋白(G)的DNA杂交；槽2只与IR尺杂交；槽3与TS杂交；槽4与所有三种生物素化的DNA序列杂交，实验结果与理论一致。在各种情形下，均未见质粒pAT与其它三种序列交叉杂交现象，可见杂交的高度特导性，每个槽均产生明确肯定的杂交信号，既无假阳性亦无假阴性。同样的试验应用于HLV、HBV、细菌以及寄生虫的病原诊断，同时采用流通杂交装置平行研究各病原并设置对照会未显示资料)。用于捕获HCV和HBV的特定募核苷酸探针序列分别为：H₂N-5’-dCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGTGCA(SEQ ID NO：9)与H₂N-5’-dTGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCGTCC(SEQ ID NO：10)(5’端已被化学修饰)。应用另外两对引物对靶序列进行PCR扩增，以生物来化的的核苷酸作为标记显色。此例再一次证明了进行特定DNA杂交未曾达到的速度和灵敏度。实施例7    导流杂交过程与以前杂交过程的比较

1.特异性：如上所述，严格性是达到导流杂交最重要的要求。严格性要求既未在Fedlt等的专利书EPU605828A，中讨论，而且在以前专利的流通应用过程中亦无任何论据。事实上所有以前处理的核酸杂交都是在特定温度、溶液介质和时间等条件下完成。为了阐明这一点，本发明人进行了实施例5中相同的试验，除温度由42℃变为37℃以外，其它条件均同。图8显示了实验结果。槽1至槽4的每个斑点均显示阳性结果，表明无法区分正常与突变序列。实际上，将温度设置在40℃和室温所得结果仍然一样，提示EPO605828A1专利中描述的流通或模式并不适合絻大多数核酸的杂交。从而促进了杂交妒和杂交室等应之而生。近来，有人申请了“温度调节杂交室”的专利(美国专利号称5466603)，但是这样的装置仍然是为传统的杂交程序而设计的。总之，均不如本专利效果。

2.多样性：本专利所述装置可用于任何杂交过程如Sonthern、Northern和Western blottings。不但适于大的DNA片段，而且同样适于小的寡募核苷酸片段。如上面各例所示，该装置可用作检测序列的微细差导，而且多个样品使用同一膜带。该发明的最大优点是利用最少的时间和材料获得满意的杂交结果。

                SEQUENCE LISTING<110>香港基因科技有限公司<120>测定靶核酸的方法、用途及其所用的导流核酸杂交装置<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>25<212>DNA<213>human<400>1tcattcgtct gtttcccatt ctaaa                                          25<210>2<211>22<212>DNA<213>human<400>2ggacaggtac ggctgtcact ta                                             22<210>3<211>13<212>DNA<213>human<400>3gctgggcatc agc                                                      13<210>4<211>18<212>DNA<213>human<400>4gctgggcata gaagtcag                                                 18<210>5<211>17<212>DNA<213>human<400>5ctgtggggca aggtgaa                                                  17<210>6<211>17<212>DNA<213>human<400>6ctgtggggct aggtgaa                                                   17<210>7<211>19<212>DNA<213>human<400>7aaggactcaa agaacctct                                                 19<210>8<211>18<212>DNA<213>human<400>8cagaggttga gtcctttg                                                  18<210>9<211>27<212>DNA<213>human<400>9ccatggcgtt agta tgagtg tcgtgca                                       27<210>10<211>27<212>DNA<213>human<400>10tgattcctat gggagtgggc ctcgtcc                                       27

Claims (24)

1、一种测定样品中靶核酸的方法，其步骤为：

a、将核酸探针结合于质基体上用以和靶序列核酸因杂交而捕捉样品；

b、样品流经置放于导流杂交装置的质基体，让靶序列能和探针杂交成结合体；

c、检测形成的复合物，阳性结果提示样品中含有待测靶核酸序列。

2、如权利要求1所述的测定样品中靶核酸的方法，其特征在于，c步骤可以进一步为定量检测复合物，从而对样品中靶核酸进行定量检测。

3、一种测定样品中靶核酸的方法，其步骤为：

a.将样品结合至质基体上；

b.探针经过导流杂交装置的质基体，靶序列与探针结合形成复合物；

c.检测形成的复合物，阳性结果提示样品中含有待测靶序列。

4、如权利要求3所述的测定样品中靶核酸的方法，其特征在于，c步骤可以进一步为定量检测复合物，从而对样品中靶核酸进行定量检测。

5、如权利要求1-4中任意一项所述的测定样品中靶核酸的方法，其特征在于，所用的标记物可以为生物素、地高辛，荧光素，化学发光素或辐射发光素等。

6、如权利要求1-4中任意一项所述的测定样品中靶核酸的方法，其特征在于，所述的b步骤于1至5分钟内完成。

7、如权利要求1-4中任意一项所述的测定样品中靶核酸的方法，其特征在于，同一个样品中可测验一个或一个以上的靶序列。

8、如权利要求7所述的测定样品中靶核酸的方法，其特征在于，所述的靶序列可以是不同突变点的同一已知序列。

9、如权利要求1-4中任意一项所述的测定样品中靶核酸的方法，其特征在于，所述的导流杂交的温度为恒温，恒温调控准确度在0.5℃内。

10、如权利要求1-4中任意一项所述的测定样品中靶核酸的方法，其特征在于，所述的导流方向、速度、流量可以改变调控。

11、如权利要求10中所述的测定样品中靶核酸的方法，其特征在于，所述的导流方向可为上下流向、左右横流或由中心向外扩散等。

12、一种用于测定样品中靶核酸方法的导流杂交装置，其主体为一杂交室，其特征在于，所述的杂交室包括：

一顶盖；

一垫圈，所述的垫圈上有用于导流的一个或一个以上的孔或槽；

一通孔板；

一金属块，所述的金属块有一导流结构，它的温度受恒温控制；

二层绝缘层，分别在金属块的上、下表面及四周；

一与核酸样品或探针结合的质基体，固定于垫圈的下表面，质基体上有液体流入体内的通道；

一有±0.5℃精确度的恒温调控装置；

所述的顶盖、垫圈、质基体和有孔金属板按照上下的次序固定在金属块上表面的槽内，所述的恒温调控装置位于杂交室的下部，所有部件都密封连接。

13、如权利要求12所述的导流杂交装置，其特征在于，所述的金属块的导流结构为，金属块的上表面的一侧有数个储液池，储液池下部连通一个U型的通道，通道开口设在比储液池所在表面低的金属块上表面的台阶上，在金属块中央最低的表面处，开有数个由上而下垂直的空槽，每个空槽连接有排液道，最后连接金属块的流出通道，并有一个流入通道与质基体相连，垫圈上的孔或槽、液体流入质基体内通道、储液池、U型通道、开口、空槽以及排液道的个数一致。

14、如权利要求12或13所述导流杂交装置，其特征在于，可以在质基体下面再放一个下垫圈，所述的下垫圈一侧设有液体流入通道，另一侧相对应设有液体流出通道，通道的个数与质基体上面垫圈的孔或槽的个数一致。

15、如权利要求12所述的导流杂交装置，其特征在于，所述的恒温调控装置的加热及制冷组件可用Peltier电子冷热组件或其它加热或制冷组件。

16、如权利要求12所述的导流杂交装置，其特征在于，所述的恒温调控装置还可以引入一个自动系统装置，包括自动输送液体装置和控制流速装置等。

17、如权利要求12所述的导流杂交装置，其特征在于，所述的质基体可以是膜质基体，如硝化纤维膜、尼龙膜，特种尼龙膜(Nytran)，或其它能被液体流通的质基体，可以是单元或多元体。

18、如权利要求12所述的导流杂交装置，其特征在于，所述的样品或探针的流向可以通过改变垫圈、槽和开口的结构而改变为上下流向、左右横流或由中心向外扩散等其它导引方向流动。

19、如权利要求12所述的导流杂交装置，其特征在于，杂交室的材料及所用的传热材料，可以是铝、合金或其他有孔的导热合成材料。

20、如权利要求12所述的导流杂交装置，其特征在于，杂交室的给予液体流通的通孔板的材料，可以是铝、合金、纳米孔金属板等。

21、如权利要求12所述的导流杂交装置，其特征在于，所述的金属块还可以连通一个可以调节液体流速的蠕动泵。

22、如权利要求21所述的导流杂交装置，其特征在于，还可以在蠕动泵和膜之间连接一个返回途径。

23、如权利要求12所述的导流杂交装置，其特征在于，所述的恒温调控装置由一供电及调节装置供能。

24、一种测定样品中靶核酸的方法的用途，其特征在于，导流杂交可用于核酸杂交、抗体-抗原反应、受体-配体反应、化学结合物中的离子-配基反应等化学分子结合反应中亲和性配偶的存在与否及其定量多少。

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