CN102906277A - 用于肝细胞癌预后的单核苷酸多态性 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于肝细胞癌预后的单核苷酸多态性（SNP），其中，所述SNP呈现出与MTA1过表达的显著相关性，所述MTA1是对肝细胞癌外科手术后的复发或低生存率进行预测的有用的预后因子。因此，可将所述SNP用来开发用于肝细胞癌预后的微阵列或诊断试剂盒，并可用来筛选用于改善肝细胞癌预后的药物，从而改善外科手术后肝细胞癌的预后不良。
Description
技术领域
本发明涉及用于对肝细胞癌的预后(prognosis)进行预测的单核苷酸多态性(SNP)，其中，所述SNP表现出与转移性肿瘤抗原1(MTA1)过表达的显著相关性，所述MTA1是对肝细胞癌外科手术后的复发(recurrence)或低生存率(poor survival)进行预测的有用的预后因子；本发明还涉及利用所述SNP对肝细胞癌的预后进行预测的微阵列或测试试剂盒；以及筛选改善肝细胞癌预后的药物的方法。
背景技术
从癌症发育和死亡的角度来看，在韩国，肝细胞癌(HCC)是所有恶性肿瘤中第三常见且严重的癌症。肝细胞癌是最富血管性的肿瘤之一。
对HCC进行治疗的最有效的方式是外科切除术或肝移植。然而，由于不能移除的肿瘤的大小和数量、肝功能不良、各种肝内转移或肝外转移等原因，只有10％-20％的肝细胞癌患者能进行手术。即使对于可进行手术的肝细胞癌患者来说，频繁的术后复发也是长期生存率的主要限制因素。
肝细胞癌的发育和快速发展涉及多种机制。其中，通过缺氧促进血管生成起了非常重要的作用。另外，在肝中的缺氧环境下，转移性肿瘤抗原1(MTA1)通过在结构上使缺氧诱导因子1(HIF1)稳定来增强血管内皮生长因子(VEGF)的表达，从而有助于恶性肿瘤的血管生成(MoonEJ等，2004；Moon EJ等，2006)。
本发明人从如下研究中发现MTA1与肿瘤大小、肿瘤的宏观形状(macroscopic shape)、肿瘤的组织分化以及对肿瘤周围组织和微血管的侵袭密切相关：针对总共506例进行根治性外科切除术后的患者进行研究，以证实上述MTA1表达与肝细胞癌的临床性质之间的相关性。另外，发现随着MTA1的强烈表达，根治性外科切除术后的再发(relapse)率高且生存率低。
综上所述，MTA1被认为在肝细胞癌的发育、发展、肝中再发和远处转移过程中起到非常重要的作用，并且还发现MTA1是可以预测肝细胞癌患者在根治性外科切除术后的复发和生存的有用的预后因子(RyuSH等，2007)。
同时，在感染乙型肝炎病毒后，约有5％-10％变成慢性乙型肝炎，其中一些可能会发展成肝硬化、或者极少地发展成为肝细胞癌。像这样，可以理解的是，感染乙型肝炎病毒后所表现出的各种临床发展取决于每个个体的遗传易感性(genetic predisposition)的差异和病毒自身的差异。
遗传易感性意味着在个体间的不同基因中存在细微差异。近年来，通过基因组研究报道了不同个体间的差异水平。在遗传变异中，已知单核苷酸多态性(SNP)改变基因功能，并且迄今为止在人类基因组中已报道了约1100万个SNP中的710,000个多态性(NCBI，dbSNP)。
近年来，为了确定碱基序列中的细微变化是否确实影响对某些疾病的敏感性(susceptibilities)、以及为了发现对疾病易感的遗传变异，正在积极地进行着大量研究(Ludwig JA和Weinstein JN，2005；Suh Y和VijgJ，2005；Chanock S，2001)。
发明内容
技术问题
为解决传统技术中的上述问题，本发明人设法鉴定了肝癌组织中MTA1表达与血管生成中的重要基因(如MTA1、VEGF、IGF2、HIF-1α和FGF2)的SNP之间的关系，其中，MTA1为与血管生成有关的蛋白质，并被认为与肝细胞癌的复发或生存率以及经由肝细胞癌的肿瘤形成有关。另外，本发明人分析了血管生成基因的SNP对肝细胞癌患者在根治性外科切除术后的预后(如复发或生存率)的影响。由此，完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供表现出与MTA1过表达具有显著相关性的单核苷酸多态性(SNP)，所述MTA1是对肝细胞癌手术后复发和低生存率进行预测的有用的预后因子。
另外，本发明的另一目的是提供利用单核苷酸多态性(SNP)对肝细胞癌的预后进行预测的微阵列。
另外，本发明的又一目的是提供对肝细胞癌的预后进行预测的测试试剂盒。
另外，本发明的又一目的是提供利用单核苷酸多态性(SNP)对肝细胞癌的预后进行预测的方法。
另外，本发明的又一目的是提供利用单核苷酸多态性(SNP)筛选用于改善肝细胞癌预后的药物的方法。
技术方案
为实现上述目的，本发明的示例性实施方式提供了用于对肝细胞癌的预后进行预测的单核苷酸多态性(SNP)，其中，所述SNP包括选自于由下列多核苷酸或者它们的互补核苷酸所组成的组中的至少一种多核苷酸：MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)[SEQ ID NO.1]中的GA基因型或AA基因型；FGF2基因的24684C/G(rs11938826)[SEQ ID NO.2]中的GG基因型、-989C/G(rs308395)[SEQ ID NO.3]中的GG基因型或16578A/G(rs308428)[SEQ ID NO.4]中的GG基因型；以及IGF2基因的-13021C/T(rs3741208)[SEQ ID NO.5]中的CC基因型或CT基因型。
另外，本发明的示例性实施方式提供了用于对肝细胞癌的预后进行预测的微阵列，其中，所述微阵列包含用于对肝细胞癌的预后进行预测的单核苷酸多态性(SNP)的多核苷酸、由该多核苷酸编码的多肽或其cDNA。
另外，本发明的示例性实施方式提供了用于对肝细胞癌的预后进行预测的测试试剂盒，所述试剂盒包含所述微阵列。
另外，本发明的实施方式提供了用于对肝细胞癌的预后进行预测的测试试剂盒，所述试剂盒利用单碱基延伸(SBE)反应对SNP进行基因分型。
对利用单碱基延伸反应来预测肝细胞癌的预后的测试试剂盒进行设计，以证实是否存在下述基因型：MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)[SEQ ID NO.1]中的GA基因型或AA基因型；以及FGF2基因的24684C/G(rs11938826)[SEQ ID NO.2]中的GG基因型、-989C/G(rs308395)[SEQID NO.3]中的GG基因型或16578A/G(rs308428)[SEQ ID NO.4]中的GG基因型。
本发明的实施方式提供了利用单碱基延伸反应对肝细胞癌的预后进行预测的测试试剂盒，所述试剂盒包含用于扩增FGF2基因的16578A/G(rs308428)区的正向引物、用于扩增FGF2基因的16578A/G(rs308428)区的反向引物、用于对FGF2基因的16578A/G(rs308428)区进行基因分型的引物；用于扩增MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)区的正向引物、用于扩增MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)区的反向引物、用于对MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)区进行基因分型的引物；用于扩增FGF2基因的-989C/G(rs308395)区的正向引物、用于扩增FGF2基因的-989C/G(rs308395)区的反向引物、用于对FGF2基因的-989C/G(rs308395)区进行基因分型的引物；用于扩增FGF2基因的24684C/G(rs11938826)区的正向引物、用于扩增FGF2基因的24684C/G(rs11938826)区的反向引物和用于对FGF2基因的24684C/G(rs11938826)区进行基因分型的引物。
根据实施方式，在用于对肝细胞癌的预后进行预测的测试试剂盒中，用于扩增FGF2基因的16578A/G(rs308428)区的正向引物可为引物SEQID NO.12；用于扩增FGF2基因的16578A/G(rs308428)区的反向引物可为引物SEQ ID NO.13；用于对FGF2基因的16578A/G(rs308428)区进行基因分型的引物可为引物SEQ ID NO.33；用于扩增MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)区的正向引物可为引物SEQ ID NO.21；用于扩增MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)区的反向引物可为引物SEQ ID NO.22；用于对MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)区进行基因分型的引物可为引物SEQ ID NO.23；用于扩增FGF2基因的-989C/G(rs308395)区的正向引物可为引物SEQ ID NO.34；用于扩增FGF2基因的-989C/G(rs308395)区的反向引物可为引物SEQ ID NO.35；用于对FGF2基因的-989C/G(rs308395)区进行基因分型的引物可为引物SEQ ID NO.36；用于扩增FGF2基因的24684C/G(rs11938826)区的正向引物可为引物SEQ ID NO.37；用于扩增FGF2基因的24684C/G(rs11938826)区的反向引物可为引物SEQ ID NO.38；以及用于对FGF2基因的24684C/G(rs11938826)区进行基因分型的引物可为引物SEQ ID NO.39。
另外，本发明提供了用于对肝细胞癌的预后进行预测的方法，所述方法包括从临床样本中获得核酸样品的步骤；以及测定选自于由下列多核苷酸或者它们的互补核苷酸所组成的组中的至少任何一种多核苷酸的多态性区的核苷酸序列的步骤：MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)中的GA基因型或AA基因型；FGF2基因的24684C/G(rs11938826)中的GG基因型、-989C/G(rs308395)中的GG基因型或16578A/G(rs308428)中的GG基因型；以及IGF2基因的-13021C/T(rs3741208)中的CC基因型或CT基因型。
测定多态性区的核苷酸序列的步骤可包括如下步骤：使所述核酸样品与固定有多核苷酸或其互补核苷酸的微阵列进行杂交的步骤；以及对由此得到的杂交结果进行检测的步骤。
另外，本发明提供了筛选用于改善肝细胞癌预后的药物的方法，所述方法包括如下步骤：使多肽与候选材料相接触的步骤，所述多肽由对肝细胞癌的预后进行预测的单核苷酸多态性(SNP)的多核苷酸或其互补核苷酸编码；以及对所述候选材料是否具有增强或抑制该多肽功能的活性进行测定的步骤。
技术效果
根据本发明，通过提供表现出与MTA1过表达具有显著相关性的单核苷酸多态性(SNP)，可开发出利用SNP对肝细胞癌的预后进行预测的微阵列或测试试剂盒，所述MTA1为对肝细胞癌手术后的复发或低生存率进行预测的有用的预后因子；并且通过筛选用于改善肝细胞癌的预后的药物，可改善肝细胞癌手术后的预后不良。
附图说明
图1示出了取决于MTA1表达水平的肝细胞癌累积复发率；
图2示出了取决于MTA1表达水平的肝细胞癌累积生存率；以及
图3-图5示出了根据本发明的实施方式，使用对肝细胞癌的预后进行预测的测试试剂盒进行基因分型的结果。
具体实施方式
为实现上述目的，本发明提供了用于对肝细胞癌的预后进行预测的单核苷酸多态性(SNP)，所述SNP包括选自于由下列多核苷酸或者它们的互补核苷酸所组成的组中的至少一种多核苷酸：MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)[SEQ ID NO.1]中的GA基因型或AA基因型；FGF2基因的24684C/G(rs11938826)[SEQ ID NO.2]中的GG基因型、-989C/G(rs308395)[SEQ ID NO.3]中的GG基因型或16578A/G(rs308428)[SEQID NO.4]中的GG基因型；以及IGF2基因的-13021C/T(rs3741208)[SEQID NO.5]中的CC基因型或CT基因型。
所述单核苷酸多态性(SNP)表现出与转移性肿瘤抗原1(MTA1)过表达的显著相关性。
另外，肝细胞癌的预后可能与用根治性外科切除术治疗的肝细胞癌患者的预后相关，而且可能与选自肝细胞癌中的肿瘤发生率、复发风险率或生存率中的任何一个指标相关。
另外，本发明提供了用于对肝细胞癌的预后进行预测的微阵列，所述微阵列包含用于对肝细胞癌的预后进行预测的单核苷酸多态性(SNP)的多核苷酸、由所述多核苷酸编码的多肽或其cDNA。
可通过本领域技术人员已知的通用方法制造用于对肝细胞癌的预后进行预测的微阵列，例如，可将包含于对肝细胞癌的预后进行预测的微阵列中的多核苷酸固定至包被有活性基团的基底上，所述活性基团选自于由氨基硅烷、聚-L-赖氨酸和醛所组成的组，并且所述基底可选自于由硅片、玻璃、石英、金属和塑料所组成的组。将多核苷酸固定至基底的方法可包括：采用压电方式的微量移液方法、采用针式点样器(spotter ofpin type)的方法等。
另外，本发明提供了对肝细胞癌的预后进行预测的测试试剂盒，所述试剂盒包含所述微阵列。
除包含本发明的微阵列外，本发明的测试试剂盒可进一步包含引物组，所述引物用于从临床样本中分离和扩增出包含相关SNP的DNA。参考本发明的序列，本领域普通技术人员可容易地设计出合适的引物组。
另外，本发明的实施方式提供了对肝细胞癌的预后进行预测的测试试剂盒，所述试剂盒利用单碱基延伸(SBE)反应来对SNP进行基因分型。在这种情况下，应该为所述单碱基延伸(SBE)设计用于扩增(正向和反向)和延伸(基因分型)的引物。
利用单碱基延伸反应对肝细胞癌的预后进行预测的测试试剂盒可为利用SNaPshot法对基因型进行分析的测试试剂盒。
对利用单碱基延伸反应来预测肝细胞癌的预后的测试试剂盒进行设计，以证实是否存在如下基因型：MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)[SEQ ID NO.1]中的GA基因型或AA基因型；以及FGF2基因的24684C/G(rs11938826)[SEQ ID NO.2]中的GG基因型、-989C/G(rs308395)[SEQID NO.3]中的GG基因型或16578A/G(rs308428)[SEQ ID NO.4]中的GG基因型。
本发明的实施方式提供了用于对肝细胞癌的预后进行预测的测试试剂盒，所述试剂盒包含如下引物，并利用了单碱基延伸反应：用于扩增FGF2基因的16578A/G(rs308428)区的正向引物、用于扩增FGF2基因的16578A/G(rs308428)区的反向引物、用于对FGF2基因的16578A/G(rs308428)区进行基因分型的引物；用于扩增MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)区的正向引物、用于扩增MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)区的反向引物、用于对MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)区进行基因分型的引物；用于扩增FGF2基因的-989C/G(rs308395)区的正向引物、用于扩增FGF2基因的-989C/G(rs308395)区的反向引物、用于对FGF2基因-989C/G(rs308395)区进行基因分型的引物；用于扩增FGF2基因的24684C/G(rs11938826)区的正向引物、用于扩增FGF2基因的24684C/G(rs11938826)区的反向引物和用于对FGF2基因的24684C/G(rs11938826)区进行基因分型的引物。
根据实施方式，在用于对肝细胞癌的预后进行预测的测试试剂盒中，用于扩增FGF2基因的16578A/G(rs308428)区的正向引物可为引物SEQID NO.12；用于扩增FGF2基因的16578A/G(rs308428)区的反向引物可为引物SEQ ID NO.13；用于对FGF2基因的16578A/G(rs308428)区进行基因分型的引物可为引物SEQ ID NO.33；用于扩增MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)区的正向引物可为引物SEQ ID NO.21；用于扩增MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)区的反向引物可为引物SEQ ID NO.22；用于对MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)区进行基因分型的引物可为引物SEQ ID NO.23；用于扩增FGF2基因的-989C/G(rs308395)区的正向引物可为引物SEQ ID NO.34；用于扩增FGF2基因的-989C/G(rs308395)区的反向引物可为引物SEQ ID NO.35；用于对FGF2基因的-989C/G(rs308395)区进行基因分型的引物可为引物SEQ ID NO.36；用于扩增FGF2基因的24684C/G(rs11938826)区的正向引物可为引物SEQ ID NO.37；用于扩增FGF2基因的24684C/G(rs11938826)区的反向引物可为引物SEQ ID NO.38；以及用于对FGF2基因的24684C/G(rs11938826)区进行基因分型的引物可为引物SEQ ID NO.39。
另外，本发明提供了对肝细胞癌的预后进行预测的方法，所述方法包括从临床样本中得到核酸样品的步骤；以及测定选自于由下列多核苷酸或它们的互补核苷酸所组成的组中的至少任何一种多核苷酸的多态性区的核苷酸序列的步骤：MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)中的GA基因型或AA基因型；FGF2基因的24684C/G(rs11938826)中的GG基因型、-989C/G(rs308395)中的GG基因型或16578A/G(rs308428)中的GG基因型；以及IGF2基因的-13021C/T(rs3741208)中的CC基因型或CT基因型。所述核酸可包括DNA、mRNA或从mRNA合成的cDNA。
测定多态性区的核苷酸序列的步骤可包括如下步骤：使核酸样品与固定有多核苷酸或其互补核苷酸的微阵列杂交的步骤；以及对由此得到的杂交结果进行检测的步骤。
例如，从对象的组织、体液或者细胞中分离DNA；通过PCR进行扩增；然后对SNP进行分析。可通过使用已知的通用方法进行SNP分析。例如，可通过使用实时PCR系统或者通过用双脱氧法直接测定核酸的核苷酸序列来进行SNP分析。或者，可通过测量含SNP区序列的探针或其互补探针与所述DNA杂交得到的杂交度来测定多态性区的核苷酸序列，从而进行SNP分析；或可通过使用等位基因特异性探针杂交、等位基因特异性扩增、测序、5’核酸酶消化、分子信标检测法、寡核苷酸连接检测法、大小分析(size analysis)、单链构象多态性等来进行SNP分析。
此外，本发明提供了筛选用于改善肝细胞癌预后的药物的方法，所述方法包括使多肽与候选材料相接触的步骤，所述多肽由对肝细胞癌的预后进行预测的单核苷酸多态性(SNP)的多核苷酸或其互补核苷酸编码；以及对所述候选材料是否具有改善或抑制该多肽功能的活性进行测定的步骤。
在本发明的筛选方法中，可通过使用用于测定蛋白-蛋白之间的反应和蛋白-化合物之间的反应是否发生的通用方法对多肽与候选材料之间的反应进行测定。例如，可以采用测量蛋白与候选材料反应后的活性的方法；酵母双杂交；结合至蛋白的噬菌体展示肽克隆的回收；使用天然物质、化学文库等的高通量筛选(HTS)；药物命中高通量筛选(drug hitHTS)；基于细胞的筛选或使用DNA阵列进行筛选的方法等。
在本发明的筛选方法中，所述候选材料可为单独的核酸、蛋白质、其它提取物、天然物质或化合物等，所述候选材料被认为具有成为用于肝细胞癌预后的诊断试剂的潜力或根据通用选择方法被随机选择。
实施例
以下，将参考下列实施例对本发明进行更加详细的描述。但是，本发明并不限于下列实施例。
实施例1SNP选择
对包含在血管生成相关基因(即，VEGF、HIF1a、IGF2、FGF2或MTA1)±2kb中的双等位SNP进行了研究。对于基因的SNP的位置，参考已知的基因信息(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/project/SNP)对5’-非翻译区、启动子区、外显子区和基因座位区进行选择。
进行研究的SNP的ID如下：
rs699947、rs25648、rs3025000、rs3025010、rs3025035、rs3025040、rs10434、rs998584、rs45533131/rs1957757、rs2301113、rs2057482/rs2585、rs3802971、rs3213221、rs3741212、rs2239681、rs3741208、rs1004446、rs7924316、rs3842748、rs2070762/rs308395、rs308428、rs11938826、rs17472986、rs308442、rs308379、rs308381、rs6534367、rs1048201、rs3747676/rs4983413和DL1002505。
在上述SNP中，选择单倍型(haplotype)频率等于或高于5％的SNP，并通过使用PHASE软件v2.1对单倍型频率进行分析。此外，通过使用Haploview program v3.2(http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/index.php)对连锁不平衡进行分析。
实施例2SNP基因型分析
1.SNP基因型分析
通过使用primer express软件设计出可扩增含实施例1的SNP的区域的引物组和含SNP区的TaqMan探针。对于TaqMan探针，根据SNP的序列设计适用于野生型和突变型等位基因的各探针。
通过在TaqMan探针的一侧加上荧光染料并在另一侧加上能抑制该荧光染料颜色的淬灭剂来制造探针。在这种情况下，为野生型和突变型等位基因分别加上具有不同颜色的各荧光染料。
将在下表1中公开的三类引物混合在一起，然后通过使用经混合的引物进行PCR反应，从而根据Taq聚合酶的核酸外切酶活性性质区分出单核苷酸对的错配。
[表1]
在对由两个以上研究人员独立读出的结果的一致性(compatibility)进行验证后，确定最终的SNP标记结果。根据单核苷酸多态性等位基因，各个SNP标记的结果由主要等位基因纯合子、杂合子或次要等位基因纯合子表示。通过主要等位基因频率与次要等位基因频率的比例以及三种基因型的频率对所有研究对象的结果进行分析。通过Hardy-Weinberg平衡对结果进行验证。
进行学生t检验和卡方检验，并对比值比(odds ratio)进行计算以对肝细胞癌组织中MTA1表达与SNP之间的相关性进行分析。
2.结果
MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)中的GA基因型或AA基因型表现出与MTA1阳性的显著相关性(p＝0.003)。MTA1阳性率分别在以下情况中显著地高：FGF2基因的24684C/G(rs11938826)中的GG基因型(p＝0.027)、-989C/G(rs308395)中的GG基因型(p＝0.007)或16578A/G(rs308428)中的GG基因型(p＝0.007)。IGF2基因的-13021C/T(rs3741208)中的CC基因型或CT基因型表现出与MTA1过表达的显著相关性(p＝0.03)。同时，其它SNP和单倍型未表现出与MTA1表达程度的显著相关性。
实施例3患者特征
对1998年至2003年间Asan医院中的506名肝细胞癌复发的患者进行实验。在下表2中示出了506名患者的临床特征。根治性外科切除术后，以43个月的平均周期(1-96个月)对患者进行随访。
[表2]
通过使用随访最后一天的医疗记录确定生存率和肝癌的复发。对于3个月未跟踪到的患者的情况，通过拜访该患者的附近居民来进行评价。
实施例4 MTA1免疫组化染色的评价
1.人肝细胞癌组织中的MTA1免疫组化染色
通过使用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法对肝细胞癌组织进行MTA1免疫组化染色，用3，3’-二氨基联苯胺和LSAB试剂盒(DAKO，Carpentaria，CA，USA)对颜色反应进行测定。
将从肝细胞癌和肝细胞癌周围的非肿瘤区中获得的组织的经石蜡包埋的微切样本用二甲苯进行处理以除去石蜡，然后用浓度逐步增加的醇进行复水。将所制备的肝组织切片用3％的过氧化氢处理10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。
为了增强免疫组化染色的反应，通过在蒸汽炉中使用柠檬酸缓冲液(pH 6.0)进行10分钟的抗原修复。将抗MTA1的一级抗体(Santa CruzBiochemistry，Santa Cruz，CA，USA)稀释成1∶200使用，然后用生物素化的二级抗体和抗生物素蛋白-生物素复合物试剂进行染色。用哈里斯苏木精(Harris hematoxylin)进行阴性染色。
将阴性对照按如下所述进行制备并加以使用：将组织样本放入含有2％山羊血清的Tris缓冲生理盐水中，并用1％牛血清白蛋白来代替一级抗体。在各免疫组化染色切片中，选择表现出最强染色反应并同时最能充分代表整个组织标记的区，然后进行评价。
将MTA1染色的强度确定为总细胞中表现出免疫染色阳性的细胞的比例，并对其定义如下：1)当总细胞全部未被染色时，定义为“无”；2)当一些细胞表现出阳性染色，但比例未超过50％时，定义为1+(+)；以及3)当在免疫组化染色中超过总细胞50％的细胞表现出阳性染色时，定义为2+(++)。
至少两名观察者不知道对方的结果，并对染色强度进行评价。当观察者彼此的评价不同时，通过重新评价对得分进行调整。
使用Kaplan-Meier法和对数秩检验(log-rank test)，以对累积复发和累积生存率进行分析。
2.结果
如图1中所示，MTA1阳性肝细胞癌在1年、3年和5年的累积复发显著高于MTA1阴性肝细胞癌的累积复发。具有高水平MTA1表达(++)的患者在1年和3年的累积复发分别为41％和71％，相比于具有+水平MTA1表达的患者(39％，54％)和MTA1表达阴性的患者(25％，39％)，所述累积复发处于明显高的水平。
如图2中所示，MTA1阳性肝细胞癌的患者在1年和3年的累积生存率(54％，39％)明显低于MTA1阴性肝细胞癌的患者(89％，72％)。实施例5对肝细胞癌的预后进行预测的测试试剂盒和对用于预测肝细胞癌的预后的单核苷酸多态性进行分析的方法
在下表3中示出在对rs308428、DL1002505、rs308395和rs11938826(其均为表现出与MTA1阳性具有显著相关性的单核苷酸多态性区)的单核苷酸多态性进行基因分型中用于扩增(正向和反向)和延伸(基因分型)的引物序列。下述SEQ ID NO.35(5’-AACACATAWTGTTGAGTGTGTGG-3’)可为含有约1∶1的SEQ IDNO.40(5’-AACACATAATGTTGAGTGTGTGG-3’)和SEQ ID NO.41(5’-AACACATATTGTTGAGTGTGTGG-3’)的引物组。
[表3]
1)PCR扩增
首先，用多重PCR对包含单核苷酸多态性的区进行扩增。在下表4和表5中示出了用于PCR反应的PCR反应溶液的组成和PCR反应条件。更具体而言，将DNA从临床样品中分离出，并作为PCR反应的DNA模板加以使用。通过如下条件进行PCR反应：在95℃下预变性约15分钟(1个循环)；在约94℃下变性约30秒，在约55℃下退火约1分30秒，以及在约72℃下延伸约1分30秒，将之作为1个循环(共35个循环)；以及最后在约72℃下终延伸约10分钟。将反应物储存在约4℃下。在上述PCR反应中，将在上述表3中所述的针对各单核苷酸多态性的正向引物和反向引物用作PCR反应的引物。
[表4]
[表5]
2)PCR产物纯化：SAP和Exo I处理(10μl)
对PCR产物进行纯化，以完成引物延伸的PCR反应(SNaPshot反应)。即，用下述SAP和Exo I处理PCR产物。在下表6和表7中分别示出了纯化反应材料的组成和产物的反应条件。
[表6]
| 材料 | 体积(μL) |
| SAP(1单位/μL) | 5 |
| Exo I(10单位/μL) | 0.2 |
| PCR产物 | 4 |
| 蒸馏水 | 0.8 |
| 总计 | 10 |
[表7]
| 反应温度 | 反应时间 |
| 37℃ | 1小时 |
| 72℃ | 15分钟 |
3)SNaPshot反应：单碱基延伸的PCR反应
将SNaPshot反应预混液和上表3中针对各单核苷酸多态性的基因分型引物与经纯化的PCR产物混合，然后进行PCR反应。在下表8和表9中分别示出了SNaPshot反应材料的组成和反应条件。通过如下条件进行PCR反应：在约96℃下变性约10秒，在约50℃下退火约5秒，以及在约60℃下延伸约30秒，将之作为1个循环(共25个循环)。
[表8]
[表9]
| 反应温度 | 反应时间 |
| 96℃ | 10秒 |
| 50℃ | 5秒 |
| 60℃ | 30秒 |
| 25个循环 | - |
4)SAP处理：去除未反应寡核苷酸的过程
向SNaPshot反应产物中加入SAP并进行处理，以去除未反应的寡核苷酸。在下表10和表11中分别示出了SAP处理反应材料的组成和反应条件。
[表10]
| 材料 | 体积(μL) |
| SAP(1单位/μL) | 1 |
| 蒸馏水 | 1 |
[表11]
| 反应温度 | 反应时间 |
| 37℃ | 1小时 |
| 72℃ | 15分钟 |
5)运行(Running)
通过使用自动测序仪、如ABI3730XL(Applied Biosystems，CA，USA)进行分析。此时，根据分析结果的荧光颜色确定单核苷酸多态性位置处的核苷酸序列。
6)数据分析
如图3-图5中所示，通过对利用自动测序仪ABI3730XL进行单碱基延伸的产物进行分析，只有标记部分被检测出显示峰。通过对显示成峰的荧光颜色进行分析可确定单核苷酸多态性的序列(各碱基使用由颜色彼此不同的荧光染料标记的ddNTP)。
当根据本发明的实施方式(实施例5)使用对肝细胞癌的预后进行预测的测试试剂盒时和使用对用于预测肝细胞癌的预后的单核苷酸多态性进行分析的方法时，可对rs308428、rs308395和rs11938826的单核苷酸多态性进行多重分析。然而，DL1002505为显示出与肝细胞癌的预后具有显著相关性的单核苷酸多态性，不能对其进行多重分析，需要进行单独分析。
根据本发明，可通过使用显示出与MTA1过表达具有显著相关性的单核苷酸多态性(SNP)开发出用于对肝细胞癌的预后进行预测的微阵列或测试试剂盒，所述MTA1是对肝细胞癌根治性外科切除术后的复发和低生存率进行预测的有用的预后因子；并且通过筛选用于改善肝细胞癌预后的药物可改善肝细胞癌的预后不良。
[序列表]
SEQ ID NO.1表示人MTA1基因的IVS4-81(DL1002505)的序列；
SEQ ID NO.2表示人FGF2基因的24684C/G(rs11938826)的序列；
SEQ ID NO.3表示人FGF2基因的-989C/G(rs308395)的序列；
SEQ ID NO.4表示人FGF2基因的16578A/G(rs308428)的序列；
SEQ ID NO.5表示人IGF2基因的-13021C/T(rs3741208)的序列；
SEQ ID NO.6表示rs1048201的正向引物的序列；
SEQ ID NO.7表示rs1048201的反向引物的序列；
SEQ ID NO.8表示rs1048201的基因分型引物的序列；
SEQ ID NO.9表示rs6534367的正向引物的序列；
SEQ ID NO.10表示rs6534367的反向引物的序列；
SEQ ID NO.11表示rs6534367的基因分型引物的序列；
SEQ ID NO.12表示rs308428的正向引物的序列；
SEQ ID NO.13表示rs308428的反向引物的序列；
SEQ ID NO.14表示rs308428的基因分型引物的序列；
SEQ ID NO.15表示rs3741208的正向引物的序列；
SEQ ID NO.16表示rs3741208的反向引物的序列；
SEQ ID NO.17表示rs3741208的基因分型引物的序列；
SEQ ID NO.18表示rs2585的正向引物的序列；
SEQ ID NO.19表示rs2585的反向引物的序列；
SEQ ID NO.20表示rs2585的基因分型引物的序列；
SEQ ID NO.21表示DL1002505的正向引物的序列；
SEQ ID NO.22表示DL1002505的反向引物的序列；
SEQ ID NO.23表示DL1002505的基因分型引物的序列；
SEQ ID NO.24表示rs308395的正向引物的序列；
SEQ ID NO.25表示rs308395的反向引物的序列；
SEQ ID NO.26表示rs308395的基因分型引物的序列；
SEQ ID NO.27表示rs11938826的正向引物的序列；
SEQ ID NO.28表示rs11938826的反向引物的序列；
SEQ ID NO.29表示rs11938826的基因分型引物的序列；
SEQ ID NO.30表示rs3213221的正向引物的序列；
SEQ ID NO.31表示rs3213221的反向引物的序列；
SEQ ID NO.32表示rs3213221的基因分型引物的序列；
SEQ ID NO.33表示rs308428的基因分型引物的序列；
SEQ ID NO.34表示rs308395的正向引物的序列；
SEQ ID NO.35表示rs308395的反向引物的序列；
SEQ ID NO.36表示rs308395的基因分型引物的序列；
SEQ ID NO.37表示rs11938826的正向引物的序列；
SEQ ID NO.38表示rs11938826的反向引物的序列；
SEQ ID NO.39表示rs11938826的基因分型引物的序列；
SEQ ID NO.40表示rs308395的反向引物的序列；以及
SEQ ID NO.41表示rs308395的反向引物的序列。
Claims (8)
1.一种对肝细胞癌的预后进行预测的单核苷酸多态性（SNP），所述SNP包括选自于由下列多核苷酸或者它们的互补核苷酸所组成的组中的至少一种多核苷酸：MTA1基因的IVS4-81（DL1002505）中的GA基因型或AA基因型；FGF2基因的24684C/G（rs11938826）中的GG基因型、-989C/G（rs308395）中的GG基因型或16578A/G（rs308428）中的GG基因型；和IGF2基因的-13021C/T（rs3741208）中的CC基因型或CT基因型。
2.根据权利要求1所述的对肝细胞癌的预后进行预测的单核苷酸多态性（SNP），其中，所述单核苷酸多态性（SNP）与转移性肿瘤抗原1（MTA1）的过表达具有显著相关性。
3.根据权利要求1或2所述的对肝细胞癌的预后进行预测的单核苷酸多态性（SNP），其中，所述肝细胞癌的预后与用肝细胞癌根治性外科切除术治疗的患者的预后相关，并通过使用选自于肝细胞癌中的肿瘤发生率、复发风险率或生存率中的任何一个指标进行评价。
4.一种对肝细胞癌的预后进行预测的测试试剂盒，所述测试试剂盒利用了单碱基延伸反应，并包含以下引物：
用于扩增FGF2基因的16578A/G（rs308428）区的正向引物；
用于扩增FGF2基因的16578A/G（rs308428）区的反向引物；
用于对FGF2基因的16578A/G（rs308428）区进行基因分型的引物；
用于扩增MTA1基因的IVS4-81（DL1002505）区的正向引物；
用于扩增MTA1基因的IVS4-81（DL1002505）区的反向引物；
用于对MTA1基因的IVS4-81（DL1002505）区进行基因分型的引物；
用于扩增FGF2基因的-989C/G（rs308395）区的正向引物；
用于扩增FGF2基因的-989C/G（rs308395）区的反向引物；
用于对FGF2基因的-989C/G（rs308395）区进行基因分型的引物；
用于扩增FGF2基因的24684C/G（rs11938826）区的正向引物；
用于扩增FGF2基因的24684C/G（rs11938826）区的反向引物；和
用于对FGF2基因的24684C/G（rs11938826）区进行基因分型的引物。
5.根据权利要求4所述的对肝细胞癌的预后进行预测的测试试剂盒，其中，
用于扩增FGF2基因的16578A/G（rs308428）区的正向引物为引物SEQ ID NO.12；
用于扩增FGF2基因的16578A/G（rs308428）区的反向引物为引物SEQ ID NO.13；
用于对FGF2基因的16578A/G（rs308428）区进行基因分型的引物为引物SEQ ID NO.33；
用于扩增MTA1基因的IVS4-81（DL1002505）区的正向引物为引物SEQ ID NO.21；
用于扩增MTA1基因的IVS4-81（DL1002505）区的反向引物为引物SEQ ID NO.22；
用于对MTA1基因的IVS4-81（DL1002505）区进行基因分型的引物为引物SEQ ID NO.23；
用于扩增FGF2基因的-989C/G（rs308395）区的正向引物为引物SEQID NO.34；
用于扩增FGF2基因的-989C/G（rs308395）区的反向引物为引物SEQID NO.35；
用于对FGF2基因的-989C/G（rs308395）区进行基因分型的引物为引物SEQ ID NO.36；
用于扩增FGF2基因的24684C/G（rs11938826）区的正向引物为引物SEQ ID NO.37；
用于扩增FGF2基因的24684C/G（rs11938826）区的反向引物为引物SEQ ID NO.38；和
用于对FGF2基因的24684C/G（rs11938826）区进行基因分型的引物为引物SEQ ID NO.39。
6.一种对肝细胞癌的预后进行预测的方法，所述方法包括：
从临床样本中获得核酸样品的步骤；以及
测定选自于由下列多核苷酸或者它们的互补核苷酸所组成的组中的至少任何一种多核苷酸的多态性区的核苷酸序列的步骤：MTA1基因的IVS4-81（DL1002505）中的GA基因型或AA基因型；FGF2基因的24684C/G（rs11938826）中的GG基因型、-989C/G（rs308395）中的GG基因型或16578A/G（rs308428）中的GG基因型；以及IGF2基因的-13021C/T（rs3741208）中的CC基因型或CT基因型。
7.根据权利要求6所述的对肝细胞癌的预后进行预测的方法，其中，所述测定多态性区的核苷酸序列的步骤包括如下步骤：使所述核酸样品与固定有所述多核苷酸或者它们的互补核苷酸的微阵列进行杂交的步骤；以及对由此得到的杂交结果进行检测的步骤。
8.一种筛选用于改善肝细胞癌预后的药物的方法，所述方法包括如下步骤：
使多肽与候选材料相接触的步骤，所述多肽由权利要求1或2所述的对肝细胞癌的预后进行预测的单核苷酸多态性（SNP）的多核苷酸或其互补核苷酸编码；以及
对所述候选材料是否具有增强或抑制所述多肽功能的活性进行测定的步骤。
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