CN114107500B - 与肝癌易感性及预后相关的单核苷酸多态性分子标记及其检测引物和试剂盒 - Google Patents

与肝癌易感性及预后相关的单核苷酸多态性分子标记及其检测引物和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学和医学领域，公开了一种与肝癌易感性及预后相关的单核苷酸多态性分子标记及其检测引物和试剂盒。该单核苷酸多态性分子标记rs2074890G/T位于TRIM16基因的编码区，并与肝癌易感性及预后显著相关。基于该分子标记，可开发得到相应特异性引物、试剂盒和检测方法用于辅助性诊断，为肝癌的风险预警和预后提供了一个新的途径。

Description

与肝癌易感性及预后相关的单核苷酸多态性分子标记及其检 测引物和试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学和医学领域，具体涉及一种与肝癌易感性及预后相关的单核苷酸多态性分子标记及其检测引物和试剂盒。
背景技术
肝细胞癌(肝癌)是最一种常见的恶性肿瘤，引发肝癌的常见危险因素包括有慢性乙肝病毒(HBV)或丙肝病毒(HCV)感染、过度饮酒、黄曲霉毒素污染的食物、肥胖、吸烟和2型糖尿病等。虽然已知宿主遗传易感性也与肝癌患病风险有关，但具体而言有关的基因和遗传变异在很大程度上仍然是不清楚的。
单核苷酸多态性(SNP)是人类最常见的遗传变异类型之一，SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，它是人类可遗传的基因组变异中最常见的一种，占所有己知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500-1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。目前，SNP是研究人类常见疾病遗传变异的重要依据。根据已有的研究，某些SNP与癌症风险和/或预后有关，然而迄今发现的SNP并不能完全解释肝癌的遗传易感性和预后。
Tripartite-motif(TRIM)蛋白家族被定义为E3泛素连接酶亚家族之一，其在细胞凋亡、固有免疫、细胞内信号转导、自噬、蛋白质量控制和癌变等多种细胞过程中发挥作用。而TRIM16已被证实为神经母细胞瘤、乳腺癌和肝癌的肿瘤抑制因子，但目前尚不清楚这个TRIM家族成员的遗传变异是否与包括肝癌在内的癌症的发病和/或进展有关。
因此，本发明希望对TRIM相关基因展开研究，以期探寻TRIM基因与肝癌易感性及预后的潜在关系，从而更好的揭示肝癌的发生发展机理，并为寻找更多与肝癌相关的预防、诊断和治疗措施提供参考和帮助。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种与肝癌易感性及预后相关的单核苷酸多态性分子标记及其检测引物和试剂盒。该单核苷酸多态性分子标记位于TRIM16基因的编码区，并与肝癌易感性及预后显著相关。基于该分子标记，可开发得到相应特异性引物、试剂盒和检测方法用于辅助性诊断，为肝癌的风险预警和预后提供了一个新的途径。
本发明提供了一种与肝癌易感性及预后相关的单核苷酸多态性分子标记，所述单核苷酸多态性分子标记为rs2074890G/T。
本发明通过对TRIM16编码序列(CDS)区域的遗传变异与肝癌的患病风险及预后进行分析研究。首先在千人基因组计划数据库中识别TRIM16 CDS区潜在的功能性SNPs，并对候选潜在的肝癌风险及预后相关SNP进行了评估。结果发现TRIM16基因CDS区的SNP位点rs2074890与肝癌的患病风险以及预后显著相关，具体体现为：当rs2074890携带有G等位基因时，个体的肝癌患病风险上升，如果患有肝癌，其预后亦不佳；其中G等位基因纯合子的携带者患病风险要高于相应杂合子的携带者，携带G等位基因纯合子的肝癌患者的预后要差于相应杂合子的携带者；而T等位基因纯合子的携带者肝癌患病风险较低，且如果患有肝癌，其预后较好。这可能是由于SNP位点rs2074890的单核苷酸突变，导致121号密码子的氨基酸发生替换，由谷氨酸转变为天冬氨酸，使得蛋白质结构和功能发生改变，最终导致肝癌的患病风险及预后发生变化。
本发明还提供了一种用于检测上述单核苷酸多态性分子标记的引物，所述引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’-TGAATGGTCCCCAAGCACTC-3’(SEQ ID NO:1)，
下游引物：5’-GAGGAACAGGACAGCGACTC-3’(SEQ ID NO:2)。
本发明还提供了一种用于检测上述单核苷酸多态性分子标记的试剂盒，所述试剂盒包含上述引物。
本发明还提供了一种上述单核苷酸多态性分子标记的检测方法，所述检测方法为非疾病诊断目的，包括以下步骤：
(1)提取待测样品DNA；
(2)以步骤(1)所述待测样品DNA为模板，使用上述引物进行PCR反应，得到PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)所述PCR扩增产物进行测序分析。
优选的，步骤(1)中所述提取待测样品DNA的方法为：采用QIAamp Blood Mini Kit250试剂盒从人血液中提取基因组DNA。
优选的，步骤(2)中所述PCR反应的反应体系为：
灭菌双蒸水12.5μL，10×LA Buffer 2μL，2.5mM的dNTPs 3μL，LA-Taq 0.2μL，上游引物0.2μL，下游引物0.2μL，待测样品DNA 2μL。
优选的，步骤(2)中所述PCR反应的反应程序为：94℃变性10分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环35次；72℃延伸5分钟；最后保持在4℃。
优选的，步骤(2)中采用ABI PCR仪器ABI SimpliAmp 96孔梯度PCR仪进行所述PCR反应。
本发明还提供了上述单核苷酸多态性分子标记在制备检测肝癌发病风险及预后制剂中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明所提出的单核苷酸多态性分子标记rs2074890G/T可应用于肝癌高危人群筛查以及肝癌预后判断，能够根据基因分型结果评判个体肝癌易感性以及预后情况，从而有利于疾病的预防、早期诊断和治疗。
(2)本发明所提供的引物和试剂盒能特异性和高效的检测出单核苷酸多态性分子标记rs2074890G/T。
附图说明
图1为TRIM16 rs2074890位点与肝癌易感性之间的关联性统计数据；
图2为TRIM16 rs2074890位点与肝癌预后之间的关联性统计数据；
图3为1号病人TRIM16 rs2074890位点的检测结果；
图4为2号病人TRIM16 rs2074890位点的检测结果；
图5为3号病人TRIM16 rs2074890位点的检测结果。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
本实施例提供一种与肝癌易感性及预后相关的单核苷酸多态性分子标记，该单核苷酸多态性分子标记为rs2074890G/T，位于TRIM16基因的编码区。根据网址为http://genome.uscs.edu/的UCSC Genome Browser Gateway数据库提供的序列信息，可得TRIM16基因部分序列如下所示(此序列为反向互补碱基序列结果)：
CGCCCTCTCCCAAATGGATGAATGGTCCCCAAGCACTCACCTCCTTGTCCCTGCGGGCTGCATCCAGGGAGACTATGGTGTGGCCACTGTGCTCCTGGCAACAGTCCTGGCAGATGCACTGCTGATCAGGGCAGCAGAAGGCAGACAGTGGGCTGTGGTGGGCAGGGCAGTATCGCCAGTTGTGGTCCTTCACTGGNTCGGTCAGCAGGTGGCTTTGCAGTTTGATGTTCACCTGATGCGGCTGCAAGTGCTCTTCACAGTAATTCACCATGCAGGTTAGACAGGACTTCACTGCCTTCACTCTTCTGGTGTCATCAAGGCAGAAGTCACACAGGACCTCTTTCCCCTCACCAGCAGGATCCCCCTGCTCTGCAGAGTCGCTGT(SEQ ID NO:3)。
其中，上述核苷酸序列中核苷酸N的碱基为C或A。但由于上述序列为反向互补碱基序列结果，因此SNP位点rs2074890的等位基因应为G/T。
本发明我们首先通过在千人基因组计划数据库中，筛查位于TRIM16基因编码区且改变氨基酸的SNP位点，发现只有一个SNP位点rs2074890符合筛选TRIM16基因候选SNP的标准。rs2074890的单核苷酸突变会导致121号密码子的氨基酸替换，TRIM16由谷氨酸转变为天冬氨酸(E121D)，使得蛋白质结构和功能发生改变。接着我们通过在包含1156例肝癌病例和1349例对照的全基因组基因的分型数据，以及另一个队列(包括207例随访超过3年的肝癌患者)的肝癌预后数据中，对TRIM16基因的rs2074890位点与肝癌的发病风险以及预后进行关联分析，发现TRIM16基因的rs2074890位点与肝癌的患病风险以及预后显著关联。
图1所示为TRIM16 rs2074890位点与肝癌易感性之间的关联性统计数据，由图1中结果可知：rs2074890与肝癌风险显著相关，与rs2074890G等位基因纯合子携带者相比，rs2074890T等位基因携带者的肝癌风险较低。
图2所示为TRIM16 rs2074890位点与肝癌预后之间的关联性统计数据，由图2中结果可知：rs2074890与肝癌预后显著相关，与rs2074890G等位基因纯合子携带者相比，携带rs2074890T等位基因的肝癌患者的预后较好。
实施例2
本实施例提供一种用于检测实施例1中单核苷酸多态性分子标记rs2074890G/T的引物的，其核苷酸序列为：
上游引物：5’-TGAATGGTCCCCAAGCACTC-3’(SEQ ID NO:1)，
下游引物：5’-GAGGAACAGGACAGCGACTC-3’(SEQ ID NO:2)。
实施例3
本实施例提供一种用于检测实施例1中单核苷酸多态性分子标记rs2074890G/T的试剂盒，包括实施例2中所包含的引物。
实施例4
本实施例提供一种实施例1中单核苷酸多态性分子标记rs2074890G/T的检测方法，包括以下步骤：
(1)抽取受试者的外周静脉血2-3mL，然后采用QIAamp Blood Mini Kit 250(购置于QIAGEN公司)试剂盒按说明书方法提取受试者的基因组DNA，使用Nano Drop分光光度计测定所提取DNA的浓度及纯度，确定符合提取标准(A260/A280>1.8)，并将其保存于-20℃冰箱待用。
(2)根据Takara LA Taq PCR酶(Code No.:RR52A)配置PCR反应体系，体系中加入受试者的基因组DNA和实施例2中的上、下游引物，PCR反应体系的具体配置如表1所示：
表1PCR反应体系
其中，10×LA Buffer、dNTPs和LA-taq从TARARA公司购买，引物在华大基因公司合成。
(3)使用上述PCR反应体系，在ABI PCR仪器ABI SimpliAmp 96孔梯度PCR仪(购置于ABI公司)上设置反应程序，进行PCR扩增，循环参数如表2所示：
表2反应程序
(4)将PCR产物送到北京六合华大基因科技有限公司进行测序，测序结果为产物的碱基序列和碱基序列图。
本实施例以3份病人血作为待测样品，以上述方法进行检测，并利用MEGA-11软件对得到的序列与TRIM16正常基因组的标准序列(NCBI Accession number)进行比对，以确定TRIM16 rs2074890是否含有杂合或纯合突变，检测结果如图3-5(分别对应1号病人、2号病人和3号病人)所示。由图3-5可知：1号病人的测序结果在框记处为rs2074890位点的碱基，测得的是反向互补碱基序列结果，所以rs2074890位点的碱基是A，发生了G→T纯合突变。同样可以观察到2号病人和3号病人在rs2074890位点的碱基为C，测得的是反向互补碱基序列结果，因此未发生突变，均为G纯合子。
其中，由于引物在扩增测序DNA时在开头的几个碱基检测不稳定以及不可信，导致图2-4中SNP位点与第150位的标记有所不对应。且第150位的标记并非是DNA核苷酸分子的实际编号，而是用序列分析的软件自动从产物序列进行的识别排位，最终形成图3-5的结果呈现。
上面结合附图对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学南方医院
<120> 与肝癌易感性及预后相关的单核苷酸多态性分子标记及其检测引物和试剂盒
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgaatggtcc ccaagcactc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaggaacagg acagcgactc 20
<210> 3
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (197)..(197)
<223> n is a or c
<400> 3
cgccctctcc caaatggatg aatggtcccc aagcactcac ctccttgtcc ctgcgggctg 60
catccaggga gactatggtg tggccactgt gctcctggca acagtcctgg cagatgcact 120
gctgatcagg gcagcagaag gcagacagtg ggctgtggtg ggcagggcag tatcgccagt 180
tgtggtcctt cactggntcg gtcagcaggt ggctttgcag tttgatgttc acctgatgcg 240
gctgcaagtg ctcttcacag taattcacca tgcaggttag acaggacttc actgccttca 300
ctcttctggt gtcatcaagg cagaagtcac acaggacctc tttcccctca ccagcaggat 360
ccccctgctc tgcagagtcg ctgt 384

Claims (1)

1.检测单核苷酸多态性分子标记的引物在制备辅助检测肝癌发病风险及预后制剂中的应用，其特征在于，所述单核苷酸多态性分子标记为rs2074890G/T，用于检测所述单核苷酸多态性分子标记的引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’-TGAATGGTCCCCAAGCACTC-3’（SEQ ID NO:1），
下游引物：5’-GAGGAACAGGACAGCGACTC-3’（SEQ ID NO:2）。
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