CN110592222A - Triml1作为肝癌的分子标记物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了TRIML1作为肝癌的分子标记物的应用。本发明还公开了用于肝癌检测的试剂盒,所述试剂盒包括特异性扩增TRIML1的引物序列。利用本发明的试剂盒进行肝癌的辅助诊断,对后续临床治疗具有指导意义。另外,还可将TRIML1抑制剂用来制备预防或治疗肝癌的药物组合物以用于肝癌的基因治疗、药物治疗等临床应用。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤分子生物学技术领域,具体涉及TRIML1作为肝癌的分子标记物的应用。
背景技术
肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,其预后差、易复发、致死率高和发病率高严重威胁人类的生活与健康,每年大约都会发现有超过50万名成人死于肝癌。肝癌发生的机制多种多样,具体的分子机制尚不完全清楚,其中炎症是肝癌发生的关键因素。此外,有研究证明,自分泌的IL-6会促进恶性肿瘤细胞生长。
现代医学主要研究采用手术肿瘤切除、放化疗、血管肿瘤介入综合治疗等手术方法,但治疗效果并不理想,年平均生存率仅8%~10%。尽管HCC的诊断和治疗有一定进展,但由于耐药和易于复发,HCC在很大程度上仍然无法治愈。因此研究人类肝癌早期发生及其发展的主要分子机制,对于不断寻求新的肝癌治疗疗法方式等也有着深远的现实意义。
TRIM(tripartite motif containing protein,三重基序蛋白)是一类结构保守、进化快速的E3泛素蛋白连接酶,参与诸多重要的生命过程。有文献报道,TRIM家族在许多类型的癌症中发挥重要作用,其中TRIM11、TRIM31、TRIM52和TRIM59等可以促进肝癌细胞的发生发展;TRIM16、TRIM26和TRIM50等可以抑制肝癌的发生发展。
TRIML1(tripartite motif family-like 1,三重基序家族样1)编码一种与TRIM家族高度相似的蛋白,区别在于TRIML1缺少B-box结构域。TRIML1最初发现于小鼠胚胎中,在小鼠胚胎发育的两个细胞胚胎到囊胚阶段均有表达。目前已知USP5是肝癌的促癌基因,可以促进肝癌的发生发展,而TRIML1可与USP5相互作用。
我们做过Huh7肝癌细胞的基因芯片,发现Huh7细胞中TRIML1有表达。因此,探究TRIML1在肝癌细胞中的作用应该也可以对肝癌的诊断和治疗等有所助益。
发明内容
为解决上述问题,本发明一个目的是提供肝癌的分子标记物TRIML1在制备肝癌检测或治疗产品中的应用,其中所述分子标记物为TRIML1基因或蛋白,其具有NCBI数据库的基因ID:339976所示人TRIML1的NM_178556.5或NP_848651.2所示序列。本发明人通过实验发现,所述分子标记物TRIML1能够明显促进肝癌细胞在体内和体外的恶性增长。
如本发明所用,术语TRIML1(三重基序家族样1,类E3泛素蛋白连接酶)是指人TRIML1基因或蛋白、或其同源物、或具有其生物活性的变体形式。
在本发明上述应用的一些实施方案中,所述产品为用于肝癌检测的芯片或试剂盒。
在本发明上述应用的一些实施方案中,所述检测为根据所检测对象的生物样本中的TRIML1表达水平来判断对象中肝癌的疾病状况,优选所述生物学样本为肝癌组织或肝癌细胞。
本发明另一个方面提供了用于肝癌检测的试剂盒,其包含特异性扩增人TRIML1基因的引物对,其中正向引物为如SEQ ID NO.1(AAGCTCAGGCTGTACTAACCC)所示的序列,反向引物为如SEQ ID NO.2(AGGACTCAATCTGTGCGATCAT)所示的序列。进一步地,所述试剂盒还包括RNA提取试剂、反转录试剂,以及PCR反应常用试剂如逆转录酶、缓冲液、dNTP、MgCl2、DEPC水和Taq酶等,还可以含有标准品和/或对照品。
本发明又一个方面提供了TRIML1抑制剂在制备预防或治疗肝癌的药物组合物中的应用,其中所述TRIML1抑制剂为能降低TRIML1表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸;或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸的构建物。在本发明上述应用的一些实施方案中,所述TRIML1抑制剂为siRNA或shRNA。
进一步地,在本发明上述应用的一些实施方案中,所述TRIML1抑制剂为siRNA-806#GGA、siRNA-1071#GCA和/或siRNA-1287#GCA,其中siRNA-806#具有如SEQ ID NO.3(GCACAGATTGAGTCCTCAA)所示的基因序列,siRNA-1071#具有如SEQ ID NO.4(CCGACAACCCGGAAAGATT)所示的基因序列,以及siRNA-1287#具有如SEQ ID NO.5(GGGTCTCGTCACCTTTGAA)所示的基因序列。
在本发明上述应用的一些实施方案中,所述药物组合物包括有效量的TRIML1抑制剂和药学上可接受的载体,进一步地所述药物组合物还包括预防或治疗肝癌的其他药剂。
本发明一个方面提供了一种预防或治疗肝细胞癌的药物组合物,其包含有效量的TRIML1抑制剂。在一些实施方案中,所述药物组合物包含有效量的TRIML1抑制剂siRNA-806#GGA、siRNA-1071#GCA和/或siRNA-1287#GCA,以及药学上可接受的载体和任选的其他治疗肝癌的药物,其中siRNA-806#具有如SEQ ID NO.3所示的基因序列,siRNA-1071#具有如SEQ ID NO.4所示的基因序列,以及siRNA-1287#具有如SEQ ID NO.5所示的基因序列。
如本文所用,所述“有效量”是指可对哺乳动物(优选人)产生功能或活性的且可被哺乳动物(优选人)所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释剂;所述载体本身并不是必要的活性成分,且施用后没有过分的毒性。所述合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。所述药物组合物中的药学上可接受的载体可含有液体如水、盐水、缓冲液,并且还可能存在辅助性物质如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述载体中还可以含有细胞(如宿主细胞)转染试剂。
本发明可以采用本领域熟知的多种方法来将TRIML1抑制剂、或其编码基因、或其药物组合物施用于患者如哺乳动物,优选人。包括但不限于:皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等;优选的,所述给药方式是非肠道给予的。
也可选择采用基因治疗的手段进行肝癌的治疗,如直接将TRIML1抑制剂通过诸如注射等方法施用于患者;或者,可通过一定的途径将携带TRIML1抑制剂的表达单位如表达载体或病毒等递送到靶点上,并使之表达具有活性的TRIML1抑制剂,具体情况需视所述的药剂类型而定,这些均是本领域技术人员所熟知的。
本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种抗癌剂。在具体的实施方案中,药物组合物包含至少一种抑制TRIML1基因表达的化合物和至少一种化疗剂。
本发明的药物组合物还可与其他治疗肝癌的药物联用,其他治疗性化合物可以与主要活性成分同时给药,甚至在同一组合物中同时给药。
本发明的药物组合物还可以以单独的组合物或与主要活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要活性成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药,而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中,可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答,调整本发明药物组合物的剂量。
有益效果:
本发明人发现TRIML1能够明显促进肝癌细胞在体内和体外的恶性增长,因此可以将TRIML1用作肝癌辅助诊断的分子标志物,以及制备用于肝癌检测和/或治疗的产品。本发明提供的用于检测肝癌的试剂盒,可以用于肝癌的辅助诊断;另外,还可将TRIML1抑制剂用来制备预防或治疗肝癌的药物组合物以用于肝癌的基因治疗、药物治疗等临床应用。
附图说明
图1所示为过表达TRIML1的HepG2混合稳定株的鉴定。
图2所示为过表达TRIML1对HepG2细胞生长曲线的影响。
图3所示为过表达TRIML1对HepG2细胞软琼脂糖克隆形成的影响。
图4所示为过表达TRIML1对HepG2细胞裸鼠成瘤能力的影响。
图5所示为过表达TRIML1对HepG2细胞分泌IL-6的影响。
图6所示为Huh7肝癌细胞敲低TRIML1的鉴定。
图7所示为敲低TRIML1对Huh7细胞分泌IL-6的影响。
图8所示为敲低TRIML1对Huh7细胞成球能力的影响。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
主要试剂和实验动物
胎牛血清,DMEM和F12购自美国HyClone公司;RIPA蛋白裂解液和MTT细胞增殖分析试剂盒购自碧云天生物公司;LipofectamineTM 2000转染试剂盒购自美国Gibco公司;LipofectamineTM RNA iMaX Reagent购自美国Invitrogen公司;TRIML1抗体购自美国Proteintech公司;GFP抗体购自日本MBL公司;GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)抗体购自美国Santa Cruz公司;辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥公司;ECL发光液购自美国Thermo公司;人IL-6(hIL-6)ELISA试剂盒购自美国Abcam公司;X光片、显影液、定影液购自美国Kodak公司;PVDF膜购自美国Millipore公司;pEGFP-N1质粒和TRIML1-pEGFP-N1质粒为本实验室构建存放;Agar购自美国Sigma公司;蛋白Marker购自GenStar公司;G418购自Invitrogen公司;CCK8试剂盒购自美国Biotool公司;siRNA由GenePharma公司合成;BALB/c雄性裸鼠,6~8周龄,购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
主要仪器设备
CO2培养箱购自美国Thermo公司;低温高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司;酶标仪购自瑞士Tecan sunrise公司;紫外分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司;SDS-PAGE蛋白电泳及转印仪购自美国Bio-Rad公司;游标卡尺购自桂林精宓量具量仪有限责任公司。
统计学分析
使用SPSS16.0软件进行数据处理分析,实验数据以`x±s表示,组间均值比较采用t检验,以P<0.05判定差异有统计学意义。
实施例1:HepG2和Huh7细胞培养
HepG2和Huh7肝癌细胞采用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基(含100U/mL青霉素钠和100U/mL硫酸链霉素),于37℃、5%CO2细胞培养孵箱中培养。
待细胞长到80%左右,先用0.9%生理盐水洗3次,再用0.25%胰酶消化1min,接着用含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化。然后以2000rpm离心5min,弃上清、重悬;计数、传代,以用于后续实验操作。
实施例2:筛选和鉴定TRIML1过表达细胞株
将培养的正常HepG2细胞接种到6孔板上,生长到40%-60%时,分别转染pEGFP-N1质粒和TRIML1-pEGFP-N1质粒。转染24h后换加入G418的完全培养基进行筛选,G418的工作浓度为600μg/mL。
G418筛选2周后,细胞基本不再死亡,流式分选带有GFP绿色荧光的HepG2细胞,即得到过表达GFP-TRIML1和GFP的稳定细胞株。可在扩大培养后冻存于液氮,以用于后续试验。
利用Western blot鉴定分选的带绿色荧光HepG2细胞。将生长状态良好的稳定过表达TRIML1的HepG2肝癌细胞和稳定表达GFP的对照HepG2肝癌细胞按5×105/孔接种到6孔板中,于37℃、5%CO2细胞孵箱中培养24h。
利用RIPA蛋白裂解液获得蛋白样品,用紫外分光光度计定量蛋白浓度,加入4×上样缓冲液,100℃水浴10min使蛋白充分变性,-20℃冻存。
准备10%聚丙烯酰胺凝胶,上样,电泳分离后转印至PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭1h,一抗(TRIML1、GFP和GAPDH)4℃孵育过夜。次日,0.1%TBST洗膜3次,每次15min,二抗室温孵育1h,0.1%TBST洗膜3次,每次15min。ECL发光液显影。
如图1所示,通过Western blot鉴定过表达TRIML1的HepG2混合稳定株,左上图是内参GAPDH;左下图是TRIML1抗体杂交的结果,其中上面的条带是外源的GFP-TRIML1融合蛋白,下面的条带是内源的TRIML1;右图是GFP抗体杂交的结果,分别显示出外源的GFP和GFP-TRIML1蛋白。综合图1中内参GAPDH、TRIML1和GFP来看,可以确定分选得到的HepG2细胞为过表达TRIML1稳定株。
实施例3:过表达TRIML1对细胞生长曲线的影响
将生长状态良好的稳定过表达GFP-TRIML1的HepG2肝癌细胞(GFP-TRIML1组)和稳定表达GFP的对照HepG2肝癌细胞(GFP组)的细胞浓度调整为3×104/mL,然后在96孔板每孔加100μL,即96孔板每孔种3×103个细胞,每组细胞设8个平行孔。
于96孔板在37℃、5%CO2细胞孵箱中培养。分别在细胞被接种到96孔板0h、24h、48h和72h后加入CCK8试剂,每孔10μL。
37℃孵育0.5-4h直至培养液变为橘黄色,酶标仪检测450nm处的OD值,计算平均值,绘制细胞生长曲线。
如图2所示的HepG2细胞生长曲线,两组生长曲线均呈S型,符合体外细胞培养的生长特点。培养24h后,GFP-TRIML1组的细胞数明显高于GFP组,并且持续到72h,表明过表达TRIML1能促进HepG2细胞的体外生长。注:n=9;**.P<0.01。
实施例4:过表达TRIML1对HepG2细胞软琼脂克隆形成的影响
分别取0.6g和1.2g Agar溶解于100mL双蒸水中,高压灭菌制备0.6%Agar和1.2%Agar,4℃冰箱保存,使用前微波炉加热融化。
按照4.5mL:4.5mL:1mL的比例将2×DMEM、1.2%Agar和血清混合制备下层胶,混合过程要轻柔,避免产生气泡,动作要迅速,防止凝胶凝固。于6孔板每孔加入1.5mL混合液,轻摇使其铺匀,4℃促凝20min。
促凝期间,将生长状态良好的稳定过表达GFP-TRIML1的HepG2肝癌细胞(GFP-TRIML1组)和稳定表达GFP的对照HepG2肝癌细胞(GFP组)的细胞浓度调整为1×104/mL备用,再将细胞调整为103/孔,制备细胞悬液。
按照1.4mL:1.4mL:0.35mL:0.35mL的比例将2×DMEM、0.6%Agar、血清和细胞悬液混合制备上层胶,混合过程要轻柔,避免产生气泡。于6孔板每孔加入1mL,轻摇使其铺匀,4℃促凝20min。
待上层胶充分凝固后,于6孔板每孔加入1mL含10%胎牛血清的1×DMEM完全培养基。37℃,5%CO2细胞孵箱中培养2-3周,弃去上层培养基,每孔加入1mL MTT,37℃孵育4h观察集落形成。
如图3所示,将GFP组和GFP-TRIML1组的细胞分别种入Agar琼脂,14天后用MTT染色4h,可以观察到,两组均有集落形成。计数细胞克隆个数并进行统计分析,结果显示GFP-TRIML1组的细胞集落形成数量明显高于GFP组。注:n=3;**.P<0.01。
实施例5:过表达TRIML1对HepG2细胞裸鼠成瘤能力的影响
取适应性饲养1周后的裸鼠8只,取生长状态良好的稳定表达GFP-TRIML1蛋白(GFP-TRIML1组)的HepG2肝癌细胞和稳定表达GFP蛋白(GFP组)的对照HepG2肝癌细胞,将细胞密度调整为107/mL,分别皮下接种于裸鼠的左、右前肢腋下,每只200μL。
从细胞注射开始,每天观察裸鼠生长情况和成瘤状况,用游标卡尺测量瘤子的长短经,计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。
成瘤过程中,1只裸鼠对照细胞未成瘤,1只裸鼠死亡。第17天处死裸鼠,分离瘤体并称重。
如图4所示,注射8天后有明显瘤块形成,第17天实验结束时,GFP-TRIML1组的平均瘤体体积为(3.655±0.1563)cm3,明显大于GFP组的平均瘤体体积(2.618±0.1306)cm3。同时,GFP-TRIML1组的平均瘤体重量为(2.226±0.1795)g,明显大于GFP组的平均瘤体重量(1.106±0.2058)g。以上结果表明,过表达TRIML1能促进HepG2细胞的体内成瘤能力。注:n=6;**.P<0.01。
实施例6:过表达TRIML1对HepG2细胞分泌IL-6的影响
将生长状态良好的稳定表达GFP-TRIML1蛋白(GFP-TRIML1组)的HepG2肝癌细胞和稳定表达GFP蛋白(GFP组)的对照HepG2肝癌细胞接种于24孔板中,每孔2×105,每组设2个平行孔,置于37℃、5%CO2细胞培养箱培养24h。在实验组细胞中加入重组小鼠TNF-α,刺激8h,对照组不加TNF-α;收细胞上清冻存于-80℃冰箱冻存,用于后续ELISA检测。
按照ELISA试剂盒说明书操作,在酶标仪450nm和570nm波长读取吸光度ODA450nm和ODA570nm,使用Prism软件分析计算。
取细胞上清进行ELISA检测,结果如图5所示,TNF-α刺激前后,GFP-TRIML1组(过表达TRIML1)的人IL-6分泌量均明显高于GFP组(Control)。注:n=6;**.P<0.01。
实施例7:TRIML1敲低对Huh7细胞生长及IL-6分泌的影响
为反向验证TRIML1对于肝癌细胞分泌IL-6的影响,在Huh7细胞中利用siRNA敲低TRIML1。
将Huh7肝癌细胞按2×105/孔接种至12孔板中,培养24h后,用LipofectamineTMRNA iMaX Reagent转染siRNA。TRIML1 siRNA序列为:siRNA-806#GGA,siRNA-1071#GCA与siRNA-1287#GCA,以非靶点对照RNA(siRNA NC)为对照,其中siRNA-806#具有如SEQ IDNO.3所示的基因序列,siRNA-1071#具有如SEQ ID NO.4所示的基因序列,以及siRNA-1287#具有如SEQ ID NO.5所示的基因序列。
转染48h后,收Huh7细胞上清做ELISA,收蛋白做Western blot验证。如图6所示,Western blot结果表明,3种siRNA均可敲低TRIML1。取Huh7细胞上清做ELISA检测,如图7所示的结果显示,相比NC对照组,TRIML1敲低后(806组、1071组和1287组),Huh7细胞IL-6的分泌量显著下降。注:n=3;**.P<0.01。
实施例8:TRIML1敲低对Huh7细胞成球的影响
将上述实施例7中转染siRNA的Huh7细胞,在转染48h后,胰酶消化,计数。用DMEM/F12培养基(含20ng/mL表皮生长因子,10ng/mL肝细胞生长因子,20ng/mL成纤维细胞生长因子和1×B27)重悬细胞,调整浓度为103/mL;再加入1%的甲基纤维素,防止细胞聚集,保证形成的球体(spheres)是来自单个的细胞。
按照100/孔将细胞接种至96孔低附板,放入37℃、5%CO2培养箱中培养7-14天后,取出低附板计数直径大于75μm的球体数,球体形成能力用球体数/初始细胞数×100%表示。
如图8所示的悬浮培养球体形成实验结果表明,相比NC对照组,TRIML1敲低后(806组、1071组和1287组)Huh7细胞的成球率明显更低。因此,敲低TRIML1也会抑制Huh7细胞的球体形成。注:n=6;**.P<0.01。
实施例9:用于肝癌检测的试剂盒
基于设计出的扩增人TRIML1基因的引物对,组装本发明所述的用于肝癌相关检测的试剂盒。
可根据所检测患者的肝癌组织样本中TRIML1表达水平来判断对象中肝癌的疾病状况。
也可用于例如,对肝癌组织或细胞施用TRIML1抑制剂或促进剂后,检测TRIML1的表达水平。例如,HepG2细胞转染TRIML1 siRNA 48h后,用TRIzol提取总RNA,反转录成cDNA后做荧光定量PCR,检测TRIML1的mRNA水平。又例如,293T细胞分别转染GFP和GFP-TRIML1质粒24h后,用TRIzol提取总RNA,反转录成cDNA后做荧光定量PCR,检测TRIML1的mRNA水平。
所述试剂盒包括以下表1中所示的特异扩增人TRIML1基因的引物对(SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物),以及特异扩增管家基因(GAPDH)的引物对。
表1:特异扩增人TRIML1基因的引物序列
所述试剂盒还包括SYBR Green聚合酶链式反应体系,如PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTP。所述PCR缓冲液的成分为25mM KCl,2.5mM MgCl2,200mM(NH4)2SO4;还包括肝脏正常组织cDNA:作为阴性对照与待检测样本cDNA共同定量PCR检测,每个反应体系使用与检测样本cDNA相同量。优选PCR反应体系如表2所示:
表2:PCR反应体系
最佳反应条件为:95℃预变性5min,(95℃变性15sec,60℃退火45sec,72℃延伸35sec)×40个循环,72℃延伸15min。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> TRIML1作为肝癌的分子标记物的应用
<130> P190304
<141> 2019-10-30
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
aagctcaggc tgtactaacc c 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
aggactcaat ctgtgcgatc at 22
<210> 3
<211> 19
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<400> 3
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<210> 4
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<400> 4
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<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
gggtctcgtc acctttgaa 19
Claims (10)
1.TRIML1作为肝癌的分子标记物在制备肝癌检测或治疗产品中的应用,其特征在于,所述分子标记物为TRIML1基因或蛋白,其具有NCBI数据库的基因ID:339976所示人TRIML1的NM_178556.5或NP_848651.2所示序列,所述分子标记物TRIML1能够明显促进肝癌细胞在体内和体外的恶性增长。
2.如权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述产品为用于肝癌检测的芯片或试剂盒。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述检测为根据所检测对象的生物样本中的TRIML1表达水平来判断对象中肝癌的疾病状况。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述生物学样本为肝癌组织或肝癌细胞。
5.用于肝癌检测的试剂盒,其特征在于,包含特异性扩增人TRIML1基因的引物对,其中正向引物为如SEQ ID NO.1所示的序列,反向引物为如SEQ ID NO.2所示的序列。
6.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括RNA提取试剂、反转录试剂、定量PCR试剂。
7.TRIML1抑制剂在制备预防或治疗肝癌的药物组合物中的应用,其特征在于,TRIML1抑制剂为能降低TRIML1表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸;或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸的构建物。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述药物组合物包括有效量的TRIML1抑制剂和药学上可接受的载体。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述TRIML1抑制剂为siRNA-806#GGA、siRNA-1071#GCA和/或siRNA-1287#GCA,其中siRNA-806#具有如SEQ ID NO.3所示的基因序列,siRNA-1071#具有如SEQ ID NO.4所示的基因序列,以及siRNA-1287#具有如SEQ ID NO.5所示的基因序列。
10.预防或治疗肝细胞癌的药物组合物,其特征在于,包含有效量的TRIML1抑制剂siRNA-806#GGA、siRNA-1071#GCA和/或siRNA-1287#GCA,以及药学上可接受的载体和任选的其他治疗肝癌的药物,其中siRNA-806#具有如SEQ ID NO.3所示的基因序列,siRNA-1071#具有如SEQ ID NO.4所示的基因序列,以及siRNA-1287#具有如SEQ ID NO.5所示的基因序列。
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Cited By (3)
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CN113908280A (zh) * | 2021-09-14 | 2022-01-11 | 深圳先进技术研究院 | Trim11抑制剂和二甲双胍的组合物在治疗肝细胞癌中的应用 |
CN114107500A (zh) * | 2021-11-24 | 2022-03-01 | 南方医科大学南方医院 | 与肝癌易感性及预后相关的单核苷酸多态性分子标记及其检测引物和试剂盒 |
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Citations (1)
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---|---|---|---|---|
WO2019141806A1 (en) * | 2018-01-19 | 2019-07-25 | Evox Therapeutics Ltd | Intracellular delivery of target-silencing protein |
-
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---|---|---|---|---|
WO2019141806A1 (en) * | 2018-01-19 | 2019-07-25 | Evox Therapeutics Ltd | Intracellular delivery of target-silencing protein |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
TIAN, LIYUAN; WU, XIAOJIE; LIN, YANLI; 等: "Characterization and Potential Function of a Novel Pre-Implantation Embryo –Specific RING Finger Protein:TRIML1", 《MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113908280A (zh) * | 2021-09-14 | 2022-01-11 | 深圳先进技术研究院 | Trim11抑制剂和二甲双胍的组合物在治疗肝细胞癌中的应用 |
CN114107500A (zh) * | 2021-11-24 | 2022-03-01 | 南方医科大学南方医院 | 与肝癌易感性及预后相关的单核苷酸多态性分子标记及其检测引物和试剂盒 |
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