JP2021113824A - スキルス性胃癌の治療剤、及び胃癌の予後の予測方法 - Google Patents
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Abstract
Description
しかしながら、スキルス性胃癌における胃癌細胞が産生する骨髄細胞誘導シグナルについては解明できていないため、従来の技術では、骨髄間質細胞の胃癌細胞間質への誘導を抑制することによって、スキルス性胃癌を治療する方策が確立できていないのが現状である。
項1. CXCL1、CXCR2、CCL20、CCR6、及びLipocalin-2よりなる群から選択される少なくとも1種の標的分子に対する発現抑制及び/又は機能阻害が可能な物質を有効成分とすることを特徴とする、スキルス性胃癌の治療剤。
項2. 前記標的分子に対する発現抑制が可能な物質が、前記標的分子に対するsiRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、及びアンチセンス核酸よりなる群から選択される少なくとも1種の核酸医薬である、スキルス性胃癌の治療剤。
項3. 前記標的分子に対する機能阻害が可能な物質が、前記標的分子に対して機能阻害する低分子化合物、前記標的分子に対する抗体、及び当該抗体の断片よりなる群から選択される少なくとも1種である、項1に記載のスキルス性胃癌の治療剤。
項4. 前記標的分子の機能阻害が可能な物質がSB225002である、項1に記載のスキルス性胃癌の治療剤。
項5. 前記標的分子の機能阻害が可能な物質が前記標的分子に対する抗体又はその断片である、項1に記載のスキルス性胃癌の治療剤。
項6. 胃癌患者から採取された胃癌組織を用いて、癌間質細胞のCD271、癌細胞のCXCL1、及び癌間質細胞のCXCR2よりなる群から選択される少なくとも1種の発現量を検出することを特徴とする、胃癌患者の予後の予測方法。
項7. CD271を検出する試薬、CXCL1を検出する試薬、及びCXCR2を検出する試薬よりなる群から選択される少なくとも1種を含むことを特徴とする、胃癌患者の予後検査薬。
本発明の治療剤は、スキルス性胃癌を治療するために使用される治療剤であって、CXCL1、CXCR2、CCL20、CCR6、及びLipocalin-2よりなる群から選択される少なくとも1種の標的分子に対する発現抑制及び/又は機能阻害が可能な物質を有効成分とすることを特徴とする。以下、本発明の治療剤について詳述する。
本発明の治療剤では、有効成分として、CXCL1、CXCR2、CCL20、CCR6、及びLipocalin-2よりなる群から選択される少なくとも1種の発現抑制及び/又は機能阻害が可能な物質を使用する。スキルス性胃癌における間質細胞が、当該胃癌細胞の増殖や転移を促進することが知られているが、本発明では、当該間質細胞の起源となる骨髄間質細胞がスキルス性胃癌の間質に誘導するのを抑制し、スキルス性胃癌を効果的に治療することを可能にする。
たものであってもよい。具体的には、当該RNA分子をコードしているDNAを哺乳動物細胞用の発現ベクターに挿入したものであってもよい。このような発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターや、動物細胞発現プラスミド等が挙げられる。
本発明の治療剤は、スキルス性胃癌の治療を目的としてスキルス性胃癌患者に適用される。また、本発明の治療剤は、スキルス性胃癌患者からスキルス性胃癌を摘出した後に、再発や転移を予防する目的で投与してもよく、スキルス性胃癌の切除後の患者における予後の改善剤又は癌の転移予防剤としても使用することもできる。
本発明の治療剤の投与方法としては、本発明の治療剤を生体内でスキルス性胃癌にデリバリーできることを限度として特に制限されないが、例えば、血管内(動脈内又は静脈内)注射、持続点滴、皮下投与、局所投与、筋肉内投与等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは動静脈内投与が挙げられる。
また、本発明の治療剤は、その製剤形態に応じて、薬学的に許容される担体や添加剤を加えて製剤化される。例えば、固形製剤の場合であれば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を用いて製剤化することができる。また、液状製剤の場合であれば、生理食塩水、緩衝液等を用いて製剤化することができる。
後述する試験例13に示すように、癌間質細胞におけるCD271の発現量が高い胃癌の患者は、スキルス性胃癌患者が多く、胃癌の切除後に予後が悪化し易い傾向があることが明らかにされている。更に、後述する試験例14に示すように、癌細胞におけるCXCL1の発現量、及び/又は癌間質細胞におけるCXCR2の発現量が高い胃癌の患者は、胃癌の切除後に予後が悪化し易い傾向があることが明らかにされている。従って、本発明は、更に、胃癌患者から採取された胃癌組織を用いて、癌間質細胞のCD271、癌細胞のCXCL1、及び癌間質細胞のCXCR2よりなる群から選択される少なくとも1種の発現量を検出することを特徴とする、胃癌患者の予後の予測方法を提供する。
6穴プレートに、8μm孔のメンブレンを有するチャンバーを挿入し、上部のチャンバーに5×103cells/wellの骨髄間質細胞(marrow stromal cell; MSC)を播種し、下部のチャンバーにスキルス性胃癌由来の癌細胞(OCUM-2M及びOCUM-2MD3)の培養上清を添加し、37℃で28時間インキュベートした。その後、8μm孔のメンブレンの上面を綿棒にて拭い、メンブレンに付着している細胞を固定した。メンブレンの下面に侵入しているMSCをDiff Quickを用いて染色し、細胞数を計測した。また、コントロールとして、前記培養上清に代えて培地(無血清DMEM)を使用し、前記と同条件で試験を行った。
スキルス性胃癌由来の癌細胞(KATO-3、NUGC3、NUGC4、OCUM8、及びOCUM9)の培養上清を使用して、前記試験例1と同様の方法で、double chamber chemotaxis assayを行った。
96穴プレートに4×103cell/wellのMSCを播種し、終夜培養し、コンフルエントの細胞単層を形成した後に、細胞単層に対してピペットの先端を用いて線状剥離を行い、創傷(wound)を作成した。次いで、各穴に、癌細胞の培養上清を添加し、3時間毎に創傷内へ遊走した細胞をIncucyte ZOOMを用いて撮影し、創傷内の細胞密度を測定した。なお、癌細胞の培養上清としては、スキルス性胃癌由来の癌細胞(OCUM-2M及びOCUM-2MD3)、及び非スキルス性胃癌由来の癌細胞(MKN45及びMKN74)を用いて調製したものを使用した。また、コントロールとして、前記培養上清に代えて培地(無血清DMEM)を使用し、前記と同条件で試験を行った。
Human XL cytokine array kitを使用して、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清に含まれるサイトカインの分析を行った。具体的には、各種サイトカインに対する抗体をプロットしているメンブレン上に、スキルス性胃癌由来の癌細胞(OCUM-2MD3、OCUM12、KATO-3、及びNUGC3)の培養上清を添加し、4℃で終夜反応させた。その後、Detection antibody cocktail及びStreptoavidin-HRPをこの順でmembraneに添加し、更にChemi Reagent Mixを添加して、その1分後より撮影を行った。
前記試験例4においてスキルス性胃癌由来の癌細胞による産生が認められた各種サイトカイン(CXCL1、Lipocalin-2、CXCL8、CXCL5、Dkk-1、CCL20、anglogenin、EMPRIN)を使用して、double chamber chemotaxis assayを行った。本試験では、各サイトカインを所定濃度(CXCL1; 200 ng/mL, CXCL5; 10 ng/mL, CXCL8; 2.5 ng/mL, Lipocalin-2; 10 ng/mL, Dkk-1; 100 ng/mL, Angiogenin; 10 ng/mL, EMMPRIN; 5 μg/mL, CCL20; 1 ng/mL)又はその10倍濃度(CXCL8; 25 ng/mL, Lipocalin-2; 100 ng/mL, Dkk-1; 1 μg/mL, Angiogenin; 100 ng/mL)(図中、×10)で含む無血清DMEMを下部のチャンバーに添加したこと以外は、前記試験例1と同様の方法で行った。また、比較のために、スキルス性胃癌由来の癌細胞(OCUM-2M及びOCUM2MD3)の培養上清を使用して、同様に試験を行った。なお、コントロールとしては、下部のチャンバーに培地(無血清DMEM)を使用して、前記と同条件で試験を行った。
前記試験例4においてスキルス性胃癌由来の癌細胞による産生が認められた各種サイトカイン(CXCL1、Lipocalin-2、CXCL8、CXCL5、Dkk-1、CCL20、anglogenin、EMPRIN)を使用して、創傷治癒アッセイを行った。本試験では、96穴プレートの各穴に各サイトカインを(CXCL1; 200 ng/mL, CXCL5; 10 ng/mL, CXCL8; 25 ng/mL, Lipocalin-2; 100 ng/mL, Dkk-1; 1 μg/mL, Angiogenin; 100 ng/mL, EMMPRIN; 5 μg/mL, CCL20; 1 ng/mL)含む無血清DMEMを添加したこと以外は、前記試験例3と同様の方法で行った。また、比較のために、スキルス性胃癌由来の癌細胞(OCUM12)の培養上清を使用して、前記試験例3と同様の条件で試験を行った。なお、コントロールとして、培地(無血清DMEM)を使用して、前記と同条件で試験を行った。
CXCL1の受容体であるCXCR2、及びCCL20の受容体であるCCR6をノックダウンしたMSCを以下の方法に従って作製した。先ず、6穴プレートの各穴に2×105cell/wellのMSCを播種した。別途、150μlのOptimenと9μlのlipofectamin RNAiMAX reagentの混合液と、150μlのOptimenと9μlのsiRNA(siCCR6又はsiCXCR2)との混合液とを混合し、室温で5分間放置した後に、これを前記MSCを播種した各穴に添加し、37℃で48時間インキュベートした。斯して、CXCR2をノックダウンしたMSC(siCXCR2 MSC)及びCCR6をノックダウンしたMSC(siCCR6 MSC)を作製した。
前記試験例7で作成したsiCXCR2 MSC及びsiCCR6 MSCを用いて、double chamber chemotaxis assayを行った。本試験では、上部のチャンバーにsiCXCR2 MSC又はsiCCR6 MSCを播種し、下部のチャンバーにスキルス性胃癌由来の癌細胞(OCUM-2MD3及びOCUM12)の培養上清を添加したこと以外は、前記試験例1と同様の方法で行った。比較のために、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清の代わりに培地(無血清DMEM)を使用して、同様に試験を行った。なお、コントロールとしては、CXCR2及びCCR6をノックダウンしていないMSC(negative MSC)を使用し、下部のチャンバーにスキルス性胃癌由来の癌細胞(OCUM-2MD3及びOCUM12)の培養上清又は培地(無血清DMEM)を使用して、同様に試験を行った。
抗CCL20抗体及び抗CXCL1抗体を用いて、MSCに対するdouble chamber chemotaxis assayを行った。本試験では、上部のチャンバーにMSCを播種し、下部のチャンバーにスキルス性胃癌由来の癌細胞(OCUM-2MD3及びOCUM12)の培養上清と共に抗CCL20抗体を5μg/ml、抗CXCL1抗体を200ng/mL添加したこと以外は、前記試験例1と同様の方法で行った。比較のために、下部のチャンバーにスキルス性胃癌由来の癌細胞(OCUM-2MD3及びOCUM12)の培養上清のみ又は培地(無血清DMEM)のみを添加して同様に試験を行った。
抗Dkk-1抗体及び抗lipocalin-2抗体を用いて、MSCに対するdouble chamber chemotaxisassayを行った。本試験では、上部のチャンバーにMSCを播種し、下部のチャンバーにスキルス性胃癌由来の癌細胞(OCUM-2MD3及びOCUM12)の培養上清と共に抗Dkk-1抗体を25μg/mL、抗lipocalin-2抗体を25μg/mL添加したこと以外は、前記試験例1と同様の方法で行った。比較のために、下部のチャンバーにDkk-1を100 ng/mL、lipocalin-2を25ng/mlを含む無血清DMEMを添加して同様に試験を行った。また、コントロールとして、下部のチャンバーに無血清DMEMを添加して同様に試験を行った。
ヌードマウス(BALB/c nu/nu、4週齢、雌)の胃壁に、スキルス性胃癌由来の癌細胞(OCUM-2MLN)1×107cell/100μlを30ゲージ針を用いて同所移植した。移植翌日から、CXCR2阻害剤であるSB225002を1回の投与当たり1mg/kg又は3mg/kgとなるように、5回/週の頻度で腹腔内投与した。移植から4週間後に、胃腫瘍のサイズ、重量、リンパ節転移・肝転移の個数、及び体重を測定する。また、コントロールとして、SB225002の投与を行わないこと以外は、前記と同条件で試験を行った。また、本試験では、各群10匹のヌードマウスを使用して行った。
ピューロマイシン耐性遺伝子及びGFPを含むウイルスベクターに、CXCR2に対するsingleguide RNA(CXCR2 sgRNA)を組み込み、これをMSCに感染させた。感染開始から48時間後に、培地をピューロマイシン含有培地へ入れ替え、CXCR2欠損MSCの選択を行った。ピューロマイシン含有培地での培養を48時間行った後に、CXCR2がノックダウンしたMSCを回収した。得られたMSCにおいて、CXCR2がノックダウンしていることについては、RT-PCR及びウエスタンブロットによって確認した(図20の左上図及び左下図)。また、CXCR2 sgRNAの代わりに、陰性コントロールsingle guide RNA(negative sgRNA)を導入したMSCについても作成した。
外科的手術を受けた279名の胃癌患者(内、スキルス性胃癌患者は28名)において摘出された胃癌組織に対して、MSCのマーカーであるCD271の発現を測定し、癌間質細胞における陽性細胞の割合および染色強度を用いて染色スコアを0〜8で算出し4以上をCD271陽性、3以下をCD271陰性に分類した。なお、染色スコアは、陽性細胞の割合によるスコア(スコア0:0%、スコア1:<20%、スコア2:20〜49%、スコア3:50〜69%、スコア4:>69%)と染色強度によるスコア(スコア1:軽度、スコア2:中等度以上)の積によって算出した。また、CD271陽性とCD271陰性に分類した胃癌患者について、術後生存年数との関係を図22に示す。この結果から、CD271陽性の胃癌患者では、CD271陰性の胃癌患者に比べて、術後の生存率が低く、予後が悪いことが明らかとなった。
外科的手術を受けた300名の胃癌患者において摘出された胃癌組織に対して、抗CXCL1抗体、及び抗CXCR2抗体を用いて免疫組織化学染色を行った。具体的には、Target Retrieval Solutionに浸したスライドグラスを105℃で10分間加熱し、内因性ペルオキシダーゼをブロッキングした後、それぞれの抗体を常温で1時間反応させた。次いで、癌細胞におけるCXCL1の発現、癌間質細胞におけるCXCR2の発現を染色比率・染色強度でスコア化し、CXCL1とCXCR2の発現について、陽性又は陰性に分類した。なお、染色スコアは0〜7で算出して、CXCL1については5以上を、CXCL1陽性、4以下をCXCL1陰性に分類し、またCXCR2に関しては、4以上をCXCR2陽性、3以下をCXCR2陰性に分類した。また、染色スコアは、陽性細胞の割合によるスコア(CXCL1:スコア0:0%、スコア1:<30%、スコア2:30〜69%、スコア3:70〜89%、スコア4:>89%、CXCR2:スコア0:0%、スコア1:<30%、スコア2:30〜49%、スコア3:50〜69%、スコア4:>69%)と染色強度によるスコア(スコア1:軽度、スコア2:中等度以上)の積によって算出した。そして、胃癌患者について、CXCL1陰性且つCXCR2陰性、CXCL1陰性且つCXCR2陽性、CXCL1陽性且つCXCR2陰性、及びCXCL1陽性且つCXCR2陽性の4つのグループに分類した。
Claims (2)
- 胃癌患者から採取された胃癌組織を用いて、癌間質細胞のCD271、癌細胞のCXCL1、及び癌間質細胞のCXCR2よりなる群から選択される少なくとも1種の発現量を検出することを特徴とする、胃癌患者の予後の予測方法。
- CD271を検出する試薬、CXCL1を検出する試薬、及びCXCR2を検出する試薬よりなる群から選択される少なくとも1種を含むことを特徴とする、胃癌患者の予後検査薬。
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