KR20160093637A - 종양에 대한 직접적 억제 효과를 갖는 인터페론을 결정하는 방법 및 그의 용도 - Google Patents
종양에 대한 직접적 억제 효과를 갖는 인터페론을 결정하는 방법 및 그의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20160093637A KR20160093637A KR1020167015609A KR20167015609A KR20160093637A KR 20160093637 A KR20160093637 A KR 20160093637A KR 1020167015609 A KR1020167015609 A KR 1020167015609A KR 20167015609 A KR20167015609 A KR 20167015609A KR 20160093637 A KR20160093637 A KR 20160093637A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- rsifn
- cells
- cancer cells
- mcg
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 389
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 title claims abstract description 263
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 title claims abstract description 263
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 title claims abstract description 255
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 161
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims description 61
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 294
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 253
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 114
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 103
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 claims abstract description 75
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 claims abstract description 75
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims abstract description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 102100039799 Frizzled-6 Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 101000885673 Homo sapiens Frizzled-6 Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 101001039199 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor-related protein 6 Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 102100040704 Low-density lipoprotein receptor-related protein 6 Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 101150096411 AXIN2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 claims abstract description 33
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 102100035683 Axin-2 Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 102100037985 Dickkopf-related protein 3 Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 102100023006 Basic leucine zipper transcriptional factor ATF-like 2 Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 101000903615 Homo sapiens Basic leucine zipper transcriptional factor ATF-like 2 Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 28
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 claims abstract description 26
- 101710099550 Dickkopf-related protein 3 Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 claims abstract description 24
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 332
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 53
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 47
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 47
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 44
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 40
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 38
- 102100027642 DNA-binding protein inhibitor ID-2 Human genes 0.000 claims description 30
- 101001081582 Homo sapiens DNA-binding protein inhibitor ID-2 Proteins 0.000 claims description 30
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims description 25
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims description 22
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 17
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 16
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 claims description 16
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 16
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 15
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 15
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 claims description 15
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 13
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 13
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 13
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 13
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 13
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 13
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 12
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 12
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 10
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 10
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 101000951342 Homo sapiens Dickkopf-related protein 3 Proteins 0.000 claims description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000003837 Second Primary Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 claims 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 50
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 abstract description 28
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 abstract description 28
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 abstract description 16
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 abstract description 16
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 abstract description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 9
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 abstract description 8
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 abstract description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 617
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 41
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 41
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 30
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 25
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 15
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 14
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 14
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 13
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 13
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 13
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 11
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 238000011278 co-treatment Methods 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 9
- 102000004091 Caspase-8 Human genes 0.000 description 8
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 101000617830 Homo sapiens Sterol O-acyltransferase 1 Proteins 0.000 description 6
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 6
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 6
- 108010044012 STAT1 Transcription Factor Proteins 0.000 description 6
- 108010081691 STAT2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 6
- 108010017324 STAT3 Transcription Factor Proteins 0.000 description 6
- 102100029904 Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta Human genes 0.000 description 6
- 102100023978 Signal transducer and activator of transcription 2 Human genes 0.000 description 6
- 102100024040 Signal transducer and activator of transcription 3 Human genes 0.000 description 6
- 102100021993 Sterol O-acyltransferase 1 Human genes 0.000 description 6
- 101000697584 Streptomyces lavendulae Streptothricin acetyltransferase Proteins 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 6
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 6
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 208000024719 uterine cervix neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 5
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 5
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 5
- -1 KLF-4 Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 229920000776 Poly(Adenosine diphosphate-ribose) polymerase Polymers 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 4
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 3
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 3
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 3
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 3
- 101710179684 Poly [ADP-ribose] polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102100023712 Poly [ADP-ribose] polymerase 1 Human genes 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 229940090438 infergen Drugs 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 108010010648 interferon alfacon-1 Proteins 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 2
- 101000852870 Homo sapiens Interferon alpha/beta receptor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100036714 Interferon alpha/beta receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 102100021923 Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 2
- 241000242743 Renilla reniformis Species 0.000 description 2
- 102000000887 Transcription factor STAT Human genes 0.000 description 2
- 108050007918 Transcription factor STAT Proteins 0.000 description 2
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 2
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 2
- 102000035025 signaling receptors Human genes 0.000 description 2
- 108091005475 signaling receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000005919 time-dependent effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000010304 tumor cell viability Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- LGFCAXJBAZESCF-ACZMJKKPSA-N Ala-Gln-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O LGFCAXJBAZESCF-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- CRWFEKLFPVRPBV-CIUDSAMLSA-N Ala-Gln-Met Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O CRWFEKLFPVRPBV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FSXDWQGEWZQBPJ-HERUPUMHSA-N Ala-Trp-Asp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N FSXDWQGEWZQBPJ-HERUPUMHSA-N 0.000 description 1
- PXAFZDXYEIIUTF-LKTVYLICSA-N Ala-Trp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PXAFZDXYEIIUTF-LKTVYLICSA-N 0.000 description 1
- XCIGOVDXZULBBV-DCAQKATOSA-N Ala-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O XCIGOVDXZULBBV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- VKKYFICVTYKFIO-CIUDSAMLSA-N Arg-Ala-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N VKKYFICVTYKFIO-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N Arg-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- GXXWTNKNFFKTJB-NAKRPEOUSA-N Arg-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXXWTNKNFFKTJB-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- MFMJRYHVLLEMQM-DCAQKATOSA-N Asp-Arg-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N MFMJRYHVLLEMQM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JUWZKMBALYLZCK-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JUWZKMBALYLZCK-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- QJHOOKBAHRJPPX-QWRGUYRKSA-N Asp-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QJHOOKBAHRJPPX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- DRCOAZZDQRCGGP-GHCJXIJMSA-N Asp-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O DRCOAZZDQRCGGP-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 1
- 101150082143 CD24 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 208000000094 Chronic Pain Diseases 0.000 description 1
- UCSXXFRXHGUXCQ-SRVKXCTJSA-N Cys-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N UCSXXFRXHGUXCQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- NGOIQDYZMIKCOK-NAKRPEOUSA-N Cys-Val-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O NGOIQDYZMIKCOK-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- 108010090461 DFG peptide Proteins 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- MWLYSLMKFXWZPW-ZPFDUUQYSA-N Gln-Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O MWLYSLMKFXWZPW-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- VZRAXPGTUNDIDK-GUBZILKMSA-N Gln-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N VZRAXPGTUNDIDK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KKCUFHUTMKQQCF-SRVKXCTJSA-N Glu-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KKCUFHUTMKQQCF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YLJHCWNDBKKOEB-IHRRRGAJSA-N Glu-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O YLJHCWNDBKKOEB-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- QJCKNLPMTPXXEM-AUTRQRHGSA-N Glu-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O QJCKNLPMTPXXEM-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- MFNUFCFRAZPJFW-JYJNAYRXSA-N Glu-Lys-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MFNUFCFRAZPJFW-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- UMZHHILWZBFPGL-LOKLDPHHSA-N Glu-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O UMZHHILWZBFPGL-LOKLDPHHSA-N 0.000 description 1
- SYOJVRNQCXYEOV-XVKPBYJWSA-N Gly-Val-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SYOJVRNQCXYEOV-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 101001043594 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor-related protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101150047694 ID1 gene Proteins 0.000 description 1
- HPCFRQWLTRDGHT-AJNGGQMLSA-N Ile-Leu-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HPCFRQWLTRDGHT-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- UFRXVQGGPNSJRY-CYDGBPFRSA-N Ile-Met-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N UFRXVQGGPNSJRY-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- HXIDVIFHRYRXLZ-NAKRPEOUSA-N Ile-Ser-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N HXIDVIFHRYRXLZ-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000004163 JAK-STAT signaling pathway Effects 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DZQMXBALGUHGJT-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DZQMXBALGUHGJT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- FMEICTQWUKNAGC-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FMEICTQWUKNAGC-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- KXODZBLFVFSLAI-AVGNSLFASA-N Leu-His-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CC1=CN=CN1 KXODZBLFVFSLAI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- PTRKPHUGYULXPU-KKUMJFAQSA-N Leu-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PTRKPHUGYULXPU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- XWEVVRRSIOBJOO-SRVKXCTJSA-N Leu-Pro-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O XWEVVRRSIOBJOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LFSQWRSVPNKJGP-WDCWCFNPSA-N Leu-Thr-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LFSQWRSVPNKJGP-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- VHTIZYYHIUHMCA-JYJNAYRXSA-N Leu-Tyr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O VHTIZYYHIUHMCA-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 108010015179 Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein-6 Proteins 0.000 description 1
- 102100021926 Low-density lipoprotein receptor-related protein 5 Human genes 0.000 description 1
- BXPHMHQHYHILBB-BZSNNMDCSA-N Lys-Lys-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O BXPHMHQHYHILBB-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- LMMBAXJRYSXCOQ-ACRUOGEOSA-N Lys-Tyr-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O LMMBAXJRYSXCOQ-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- OHMKUHXCDSCOMT-QXEWZRGKSA-N Met-Asn-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OHMKUHXCDSCOMT-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- HGKJFNCLOHKEHS-FXQIFTODSA-N Met-Cys-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O HGKJFNCLOHKEHS-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- RVYDCISQIGHAFC-ZPFDUUQYSA-N Met-Ile-Gln Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O RVYDCISQIGHAFC-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- WYPVCIACUMJRIB-JYJNAYRXSA-N Phe-Gln-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N WYPVCIACUMJRIB-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- CZQZSMJXFGGBHM-KKUMJFAQSA-N Phe-Pro-Gln Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O CZQZSMJXFGGBHM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- GFHXZNVJIKMAGO-IHRRRGAJSA-N Pro-Phe-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GFHXZNVJIKMAGO-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000242739 Renilla Species 0.000 description 1
- VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CO VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XQAPEISNMXNKGE-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Cys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O XQAPEISNMXNKGE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HHJFMHQYEAAOBM-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HHJFMHQYEAAOBM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N Ser-Ser-Ser-Ser Chemical compound OCC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(O)=O JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- SKHPKKYKDYULDH-HJGDQZAQSA-N Thr-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SKHPKKYKDYULDH-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- KRGDDWVBBDLPSJ-CUJWVEQBSA-N Thr-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O KRGDDWVBBDLPSJ-CUJWVEQBSA-N 0.000 description 1
- IJVNLNRVDUTWDD-MEYUZBJRSA-N Thr-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O IJVNLNRVDUTWDD-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- ZSPQUTWLWGWTPS-HJGDQZAQSA-N Thr-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZSPQUTWLWGWTPS-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- KZURUCDWKDEAFZ-XVSYOHENSA-N Thr-Phe-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)O KZURUCDWKDEAFZ-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- LVFZXRQQQDTBQH-IRIUXVKKSA-N Tyr-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LVFZXRQQQDTBQH-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009109 downstream regulation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 235000020680 filtered tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000012632 fluorescent imaging Methods 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010079547 glutamylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- IBIKHMZPHNKTHM-RDTXWAMCSA-N merck compound 25 Chemical compound C1C[C@@H](C(O)=O)[C@H](O)CN1C(C1=C(F)C=CC=C11)=NN1C(=O)C1=C(Cl)C=CC=C1C1CC1 IBIKHMZPHNKTHM-RDTXWAMCSA-N 0.000 description 1
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000005195 poor health Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910000679 solder Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010005652 splenotritin Proteins 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
- G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
- G01N33/6866—Interferon
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
Abstract
본 발명은 rSIFN-co (고형 종양에 대한 치료 효과를 갖는 인터페론)과 대비하여 시험 화합물의 효력을 결정하거나 또는 비교하는 신규 방법; 시험 인터페론과 rSIFN-co 사이의 실질적 동등성을 확립하는 방법; Wnt-관련 수용체 또는 보조-수용체, 예컨대 LRP6/FZD6의 발현의 하향조절; Wnt-관련 표적 유전자, 예컨대 Axin2, CD24, 서바이빈 및/또는 ID2의 발현의 하향조절; 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제; 베타-카테닌의 발현의 억제; 종양 억제 유전자, 예컨대 DKK-3, BATF2 및/또는 KLF4의 상향조절; 시험관내 종양 세포 생존율의 억제; 생체내 종양 성장 및 전이의 억제; 시험관내 종양 세포 이동, 위족 형성 및 콜로니 형성의 억제를 위한 방법; 뿐만 아니라 시험 인터페론의 효력을 결정하는 방법, 이러한 방법의 결정을 위한 키트 및 상기 활성을 갖는 인터페론 또는 인터페론 대체물을 제공한다.
Description
본 발명은 rSIFN-co와 대비하여 시험 인터페론의 효력을 결정하는 신규 방법, 시험 인터페론과 rSIFN-co 사이의 실질적 동등성을 확립하는 방법, 암 세포 이동, 위족 형성, 베타-카테닌/TCF 매개 전사 활성 및 베타-카테닌 단백질 수준을 억제하는 방법, Wnt-관련 수용체 또는 보조-수용체의 발현을 하향조절하는 방법, Wnt 신호전달 경로의 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법, 종양 억제 유전자를 상향조절하는 방법, 뿐만 아니라 임의의 및 모든 이러한 방법의 수행을 위한 검정 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 활성을 갖는 인터페론 또는 인터페론 대체물에 관한 것이다.
슈퍼 인터페론 (이하, "rSIFN-co" 또는 "SIFN-I", 고형 종양에 대한 치료 효과를 갖는 인터페론)은 미국 특허 번호 7,364,724 (재조합 슈퍼-화합물 인터페론) 및 미국 특허 번호 7,585,647 (재조합 인터페론을 코딩하는 핵산)에 기재된 바 있다. rSIFN-co는 미국 특허 번호 4,695,623에 개시된 컨센서스 인터페론 알파인 인퍼젠(INFERGEN)® (인터페론 알파콘-1)과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 조작된 유전자 구축물로부터 발현된다. 그러나, rSIFN-co는 인퍼젠®을 코딩하는 핵산 서열과 상이한 신규 핵산 서열에 의해 코딩된다. 인퍼젠®과 비교하여, rSIFN-co 단백질은 신규 3차 구조를 갖고, 또한 개선된 생물학적 특성을 갖는다.
rSIFN-co는 또한 고형 종양에 대한 직접적 억제 효과, 뿐만 아니라 미국 특허 번호 8,114,395, 미국 특허 번호 8,287,852 및 미국 특허 번호 8,425,896에 기재된 바와 같은 항바이러스 활성을 포함한, 인퍼젠®과 비교하여 보다 광범위한 생물학적 활성을 갖는다.
다른 상업적으로 입수가능한 인터페론과 비교되는 rSIFN-co의 고유한 생물학적 활성 및 인간 용도를 위한 rSIFN-co의 잠재력을 고려하여, 예를 들어 제조 공정 동안 품질 대조 목적을 위해서나 또는 다르게는 최종 생성물이 목적 활성을 유지하거나 또는 가지고 있으며 상업적으로 입수가능한 인터페론과 상이하다는 것을 보장하기 위해 rSIFN-co 및 다른 시험 인터페론의 생물학적 활성 및/또는 효력을 평가하는 방법을 제공하는 것이 바람직하다. rSIFN-co 및 목적 활성을 갖는 인터페론 또는 인터페론 대체물의 추가의 용도를 제공하는 것이 또한 바람직하다.
한 측면에서, 본 발명은 (1) 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물을 제공하는 단계; 및 (2) 각각 동일한 명시된 조건 하에 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 상에서의 하기 활성: (a) 어느 1종 이상의 종양-보유 동물 모델에서의 생체내 암 세포 성장의 억제; (b) 암 세포 생존율의 감소; (c) 암 세포 이동의 억제; (d) 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제; (e) 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현의 하향조절; (f) 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈(Survivin) 및 ID2 중 어느 1종 이상의 발현의 억제; (g) 암 세포에서의 위족 형성의 억제; (h) 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제; 및 (i) 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 1종 이상의 발현의 상향조절 중 어느 1종 이상을 결정하는 단계를 포함하며, 이에 의해 통계적으로 유의한 방식으로 (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f)에 명시된 활성 중 어느 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6종이 시험 인터페론에 존재한다는 것 및/또는 (g), (h) 및 (i)에 명시된 활성 중 어느 1종 이상이 시험 인터페론에 존재한다는 것은 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖는다는 것, 즉 그들이 실질적으로 동일한 유효성을 갖거나 또는 실질적으로 동일한 결과를 생성할 수 있다는 것을 의미하는 것인, rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물과 대비하여 시험 인터페론의 효력을 결정하거나 또는 비교하는 방법을 제공한다. 본원에서의 목적상, "실질적으로 동일한"은 적어도 약 70% 동일한 것; 임의로, 적어도 약 80% 동일한 것; 여전히 임의로, 적어도 약 90% 동일한 것; 추가로 임의로, 적어도 약 95% 동일한 것을 의미한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (1) 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물을 제공하는 단계; 및 (2) 각각 동일한 명시된 조건 하에 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 상에서의 하기 활성: (a) 어느 1종 이상의 종양-보유 동물 모델에서의 생체내 암 세포 성장의 억제; (b) 암 세포 생존율의 감소; (c) 암 세포 이동의 억제; (d) 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제; (e) 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현의 하향조절; (f) 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 1종 이상의 발현의 억제; (g) 암 세포에서의 위족 형성의 억제; (h) 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제; 및 (i) 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 1종 이상의 발현의 상향조절 중 어느 1종 이상을 결정하는 단계를 포함하며, 이에 의해 통계적으로 유의한 방식으로 (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f)에 명시된 활성 중 어느 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6종이 시험 인터페론에 존재한다는 것 및/또는 (g), (h) 및 (i)에 명시된 활성 중 어느 1종 이상이 시험 인터페론에 존재한다는 것은 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적 동등성이라는 것을 의미하는 것인, 시험 인터페론과 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 사이의 실질적 동등성을 확립하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 활성을 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포, 결장암 세포, 자궁경부암 세포, 간암 세포, 유방암 세포 및 췌장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 활성을 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포, Hela 세포, CL-1 세포, Huh-7 세포, SW480 세포, MDA-MB-231 세포, Calu-1 세포, SMMC-7721 세포, PANC-1 세포, SW620 세포, SPC-A4 세포, H1299 세포, H460 세포 및 HT-29 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 활성 (a), 생체내 암 세포 성장의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 간암 세포, 자궁경부암 세포, 결장암 세포 및 폐암 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (a)를 결정하는데 사용된 암 세포는 SMMC-7721 세포, Hela 세포, HT-29 세포, SPC-A4 세포 및 A549 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 임의로, HT-29 세포, SPC-A4 세포 및 A549 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 추가로 임의로, A549 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생리 염수 또는 PBS는 활성 (a)에서의 억제를 결정하는데 대조군으로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서 종양-보유 동물 모델에게 투여된 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 약 0.02 mg 내지 약 0.30 mg; 임의로, 약 0.05 mg 내지 약 0.15 mg의 범위로 투여된다. 일부 실시양태에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서 종양-보유 동물 모델에게 투여된 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 격일로 투여된다. 일부 실시양태에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서 종양-보유 동물 모델에게 투여된 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 약 2주 내지 약 6주; 임의로, 약 3주 내지 약 4주 동안 투여된다.
일부 실시양태에서, 활성 (b), 암 세포 생존율의 감소를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 각각 약 6.25 mcg/ml 내지 약 25 mcg/ml; 임의로, 약 10 mcg/ml 내지 약 18 mcg/ml; 보다 임의로, 약 10 mcg/ml 내지 약 15 mcg/ml의 범위의 농도에서 암 세포 생존율의 약 50% 감소를 야기한다. 일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 각각 적어도 약 25 mcg/ml; 임의로, 적어도 약 50 mcg/ml; 추가로 임의로, 적어도 약 75 mcg/ml; 보다 임의로, 적어도 약 100 mcg/ml의 범위의 농도에서 암 세포 생존율의 실질적으로 검출불가능한 수준으로의 감소를 야기한다. 일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물의 농도는 약 0.2 mcg/ml 내지 약 100 mcg/ml의 범위의 농도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 암 세포는 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 적어도 약 1일; 임의로, 적어도 약 2일 동안 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포, 결장암 세포, 자궁경부암 세포, 간암 세포, 유방암 세포 및 췌장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 임의로, 폐암 세포, 결장암 세포, 간암 세포, 유방암 세포 및 췌장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포, Hela 세포, CL-1 세포, Huh-7 세포, SW480 세포, MDA-MB-231 세포, Calu-1 세포, SMMC-7721 세포 및 PANC-1 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 임의로, A549 세포, CL-1 세포, Huh-7 세포, SW480 세포, MDA-MB-231 세포, Calu-1 세포, SMMC-7721 세포 및 PANC-1 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 1일 내지 약 10일; 임의로, 약 1일 내지 약 6일 동안 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포 및 SW620 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 활성 (c), 암 세포 이동의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (c)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포 및 SW620 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (c)에서의 암 세포 이동의 억제는 트랜스웰(Transwell) 방법을 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 활성 (c)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (c)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 임의로, 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다.
일부 실시양태에서, 활성 (d), 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (d)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포, H1299 세포, H460 세포, HT-29 세포 및 SW620 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 임의로, A549 세포, H1299 세포, H460 세포 및 SW620 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (d)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 임의로, 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (d)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 베타-카테닌/TCF의 전사 활성은 리포터 시스템의 사용에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 리포터 시스템은 탑플래쉬(TOPFlash) 또는 pSV40-RL 플라스미드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 활성 (e), 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현의 하향조절을 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (e)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포, H460 세포, SW620 세포 및 HT-29 중 어느 1종 이상을 포함하고; 임의로, A549 세포, SW620 세포 및 HT-29 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 보다 임의로, HT-29 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (e)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 임의로, 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (e)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (e)를 결정하는데 있어서, LRP6 및/또는 FZD6의 발현은 LRP6 및/또는 FZD6의 mRNA 수준을 결정함으로써 결정된다.
일부 실시양태에서, 활성 (f), Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 1종 이상의 발현의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포를 포함하고; 임의로, A549 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (f)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 임의로, 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (f)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (f)를 결정하는데 있어서, Axin2, CD24, 서바이빈 및/또는 ID2의 발현은 그의 상응하는 mRNA 수준을 결정함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, 활성 (f)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론이 대조군과 비교하여 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 1종 이상의 발현을 적어도 약 30%; 임의로, 적어도 약 40%; 보다 임의로, 적어도 약 50%; 보다 더 임의로, 적어도 약 60% 감소시키는 경우에, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 실질적으로 동일한 효력 또는 실질적 동등성을 갖는 것으로 간주된다.
일부 실시양태에서, 활성 (g), 위족 형성의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포; 임의로, A549 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (g)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 4일; 임의로, 적어도 약 8일 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (g)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다.
일부 실시양태에서, 활성 (h), 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (h)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포 및 SW480 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (h)를 결정하는데 있어서, 베타-카테닌 발현의 억제는 웨스턴 블롯(Western Blot)의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 활성 (h)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 48시간; 임의로, 적어도 약 72시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (h)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다.
일부 실시양태에서, 활성 (i), 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 1종 이상의 발현의 상향조절을 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (i)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포, H460 세포, SW620 세포 및 HT-29 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 임의로, A549 세포 및 SW620 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (i)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 임의로, 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (i)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (i)를 결정하는데 있어서, DKK-3, KLF-4 및/또는 BATF2의 발현은 그의 상응하는 mRNA 수준을 결정함으로써 결정된다.
일부 실시양태에서, 통계적 유의성은 대조군과 비교하는 경우에 0.05 이하, 또는 0.01 이하, 또는 0.005 이하, 또는 0.001 이하, 또는 0.0005 이하, 또는 0.0001 이하의 p 값을 의미한다.
일부 실시양태에서, 대조군은 시험 인터페론 또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리되지 않거나, 또는 생리 염수 또는 PBS로 처리되거나, 또는 IFNα-2b로 처리되거나, 또는 대조군은 비처리 대조군 (모의)이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 복수의 농도의 시험 인터페론을 제공하는 단계; (b) 복수의 농도의 시험 인터페론을 사용하여, 명시된 조건 하에 제1 암 세포 세트의 생존율에 대한 시험 인터페론의 제1 용량 반응을 결정하는 단계; (c) 복수의 농도의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물을 제공하는 단계; (d) 복수의 농도의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물을 사용하여, 동일한 명시된 조건 하에 제2 암 세포 세트의 생존율에 대한 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물의 제2 용량 반응을 결정하는 단계; 및 (e) 제1 용량 반응을 제2 용량 반응과 비교하는 단계를 포함하는, 화합물, 예컨대 시험 인터페론의 효력을 결정하거나 또는 비교하는 방법을 제공한다. 이러한 방식으로, rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물과 대비하여 화합물, 예컨대 시험 인터페론의 효력이 결정된다.
일부 실시양태에서, rSIFN-co는 명시된 비활성을 포함하고, 비활성은 약 4 x 108 IU/mg 내지 약 1 x 109 IU/mg의 범위에 있다. 일부 실시양태에서, 비활성은 약 4.4 x 108 IU/mg 내지 약 9 x 108 IU/mg의 범위에 있다. 일부 실시양태에서, 비활성은 약 5 x 108 IU/mg 내지 약 8 x 108 IU/mg의 범위에 있다. 일부 실시양태에서, 비활성은 약 6 x 108 IU/mg 내지 약 7.5 x 108 IU/mg의 범위에 있다. 임의로, 비활성은 약 4 x 108 IU/mg 내지 5 x 108 IU/mg의 범위에 있다.
일부 실시양태에서, 화합물의 효력을 결정하거나 또는 비교하는 방법에 있어서, 시험 인터페론 또는 rSIFN-co의 농도는 약 0.2 mcg/ml 내지 약 100 mcg/ml의 범위에 있다. 일부 실시양태에서, 시험 인터페론 또는 rSIFN-co의 농도는 0.2 mcg/ml, 0.39 mcg/ml, 0.78 mcg/ml, 1.56 mcg/ml, 3.13 mcg/ml, 6.25 mcg/ml, 12.5 mcg/ml, 25 mcg/ml, 50 mcg/ml 및 100 mcg/ml 중 적어도 2종 이상이다.
일부 실시양태에서, 암 세포는 적어도 약 20시간, 임의로, 적어도 약 24시간, 여전히 임의로, 적어도 약 48시간, 및 보다 임의로, 적어도 약 72시간 동안 시험 인터페론 또는 rSIFN-co로 처리된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 rSIFN-co가 암 세포 유형에 따라 약 6.25 mcg/ml 내지 약 25 mcg/ml의 범위의 농도에서 암 세포 생존율을 50% 감소시킬 수 있는 효력을 갖는 것인, 본원에 기재된 바와 같은 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, rSIFN-co는 약 6.25 mcg/ml 내지 12.5 mcg/ml의 범위의 농도에서 세포 생존율을 50% 감소시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, rSIFN-co는 약 12.5 mcg/ml 내지 25 mcg/ml의 범위의 농도에서 세포 생존율을 50% 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, rSIFN-co의 IC50은 약 10 mcg/ml 내지 약 18 mcg/ml, 임의로, 약 10 mcg/ml 내지 약 15 mcg/ml의 범위에 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 복수의 암 세포를 제공하는 단계; (b) 명시된 조건 하에 일정량의 시험 인터페론으로 제1 암 세포 세트를 처리하여 제1 생존율 데이터 세트를 생성하는 단계; (c) 동일한 명시된 조건 하에 유효량의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 제2 암 세포 세트를 처리하여 제2 생존율 데이터 세트를 생성하는 단계; 및 (d) 제1 생존율 데이터 세트를 제2 생존율 데이터 세트와 비교하는 단계를 포함하며, 이에 의해 시험 인터페론의 효력이 결정되는 것인, rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물과 대비하여 화합물, 예컨대 시험 인터페론의 효력을 결정하거나 또는 비교하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 암 세포는 약 1일 내지 약 6일의 범위 동안 처리된다. 일부 실시양태에서, rSIFN-co는 약 6.25 mcg/ml 내지 약 50 mcg/ml; 임의로, 약 7 mcg/ml 내지 약 25 mcg/ml; 추가로 임의로, 약 8 mcg/ml 내지 약 12.5 mcg/ml의 범위; 여전히 임의로, 약 10 mcg/ml의 농도로 사용된다. 일부 실시양태에서, rSIFN-co는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위의 농도로 사용된다. 일부 실시양태에서, rSIFN-co는 명시된 비활성을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 사용된 암 세포는 인간 종양 세포 및 동물 종양 세포 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 폐 종양 세포 또는 자궁경부 종양 세포 또는 간 종양 세포 또는 결장 종양 세포 또는 유방 종양 세포 또는 췌장 종양 세포 또는 전립선 종양 세포 또는 바이러스-유발 종양 세포 또는 바이러스로 형질전환된 세포이다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 A549 세포, SPC-A4 세포, Calu-1 세포, CL-1 세포, H460 세포, H1299 세포, Hela 세포, HT-29 세포, Huh-7 세포, MDA-MB-231 세포, PANC-1 세포, RAW264.7 세포, SMMC-7721 세포, SW480 세포 및 SW620 세포 중 적어도 1종으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 시험 인터페론은 또한 rSIFN-co와 상이한 제조 로트로부터 수득된 인터페론을 포함한 인터페론이다. 일부 실시양태에서, 시험 인터페론의 아미노산 서열은 rSIFN-co의 아미노산 서열 (서열 1)에 대해 적어도 90%, 임의로, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, 시험 인터페론을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 rSIFN-co를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 2)에 대해 적어도 90%, 임의로, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, 시험 인터페론 및 rSIFN-co는 동일한 아미노산 서열 (서열 1)을 갖고, 동일한 뉴클레오티드 서열 (서열 2)에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 시험 인터페론 및 rSIFN-co는 실질적으로 동일한 비활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 비활성은 약 4 x 108 IU/mg 내지 약 1 x 109 IU/mg의 범위에 있다. 일부 실시양태에서, 시험 인터페론은 서열 2에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 이. 콜라이(E. coli) 내로 도입하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득가능하다. 일부 실시양태에서, 시험 인터페론은 이. 콜라이 숙주에서, 임의로 이. 콜라이 숙주에서의 프로모터 PBAD의 제어 하에 폴리뉴클레오티드 (서열 2)의 발현에 의해 제조된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하며, 이에 의해 세포 이동이 억제되는 것인, 세포 이동, 예컨대 종양 전이에서 발생하는 세포 이동을 억제하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 유효량의 rSIFN-co는 약 5 mcg/ml 내지 약 100 mcg/ml; 임의로, 약 8 mcg/ml 내지 약 50 mcg/ml; 여전히 임의로, 약 10 mcg/ml 내지 약 25 mcg/ml; 추가로 임의로, 약 12 mcg/ml 내지 약 18 mcg/ml를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유효량의 rSIFN-co는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml; 임의로, 약 10 mcg/ml를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하며, 이에 의해 위족 형성이 억제되는 것인, 암 세포에서의 위족 형성을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 유효량의 rSIFN-co는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml; 임의로, 약 10 mcg/ml를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하는, 세포에서의 베타-카테닌/TCF-매개 전사 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 베타-카테닌/TCF-매개 전사 활성은 리포터 시스템, 임의로 루시페라제 리포터 시스템을 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 리포터 시스템은 탑플래쉬 리포터이다. 일부 실시양태에서, 플라스미드 pSV40-RL이 사용된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하는, 세포에서의 베타-카테닌 단백질 수준을 감소시키는 방법을 추가적으로 제공한다. 일부 실시양태에서, 베타-카테닌의 단백질 수준은 그의 특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, GAPDH는 대조군으로서 사용된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하며, 이에 의해 Wnt-관련 수용체 또는 보조-수용체가 하향조절되는 것인, 세포에서의 Wnt-관련 수용체 또는 보조-수용체의 발현을 하향조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, Wnt-관련 수용체 또는 보조-수용체는 LRP 단백질, 예컨대 LRP6을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt-신호전달 수용체 또는 보조-수용체는 FZD 단백질, 예컨대 FZD6을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt-관련 수용체 또는 보조-수용체의 발현을 결정하는 것은 이러한 수용체 또는 보조-수용체의 mRNA 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 mRNA 수준을 결정하기 위해 이러한 mRNA에 상응하는 cDNA가 제조된다.
추가 측면에서, 본 발명은 세포에서 Wnt-신호전달 경로의 적어도 1종의 표적 유전자를 포함한 특정 유전자의 발현을 억제하는 방법, 예컨대 표적 유전자가 과다활성인 질환 또는 상태의 치료를 위한 상기 방법을 제공한다. 이러한 하향조절된 유전자는 Axin2, CD24, 서바이빈 및/또는 ID2를 포함한다. 방법은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하며, 이에 의해 표적 유전자의 발현이 억제된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, rSIFN-co에의 세포의 노출에 대해 명시된 기간은 적어도 약 12시간; 임의로, 적어도 약 20시간; 추가로 임의로, 적어도 약 24시간; 보다 임의로, 적어도 약 36시간 동안; 여전히 임의로, 적어도 약 48시간 동안; 또한 여전히 임의로, 적어도 약 72시간이다. 일부 실시양태에서, rSIFN-co에 의해 처리되는 세포는 암 세포이다.
추가 측면에서, 본 발명은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하며, 이에 의해 적어도 1종의 종양 억제 유전자의 발현의 상향조절이 일어나는 것인, 세포에서 적어도 1종의 종양 억제 유전자를 포함한 특정 유전자의 발현을 상향조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상향조절된 유전자는 DKK3, KLF4 및 BATF2 중 적어도 1종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상향조절된 유전자의 발현은 이러한 mRNA 수준을 측정함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, cDNA가 이러한 mRNA로부터 합성되고, 이러한 측정 목적을 위해 임의로 증폭된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 어느 1종 이상의 종양-보유 동물 모델에서의 생체내 암 세포 성장의 억제; (b) 암 세포 생존율의 감소; (c) 암 세포 이동의 억제; (d) 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제; (e) 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현의 하향조절; (f) 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 1종 이상의 발현의 억제; (g) 암 세포에서의 위족 형성의 억제; (h) 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제; 및 (i) 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 1종 이상의 발현의 상향조절 중 적어도 1종, 임의로 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9종의 활성을 비교하고 실질적으로 동일한 반응을 제시하는 것을 포함하는, 상기 활성에서의 시험 화합물과 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 사이의 실질적 동등성을 확립하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 상기 언급된 활성 중 적어도 2종에 있어서 실질적 동등성을 확립하는 것을 제공하고; 임의로, 본 발명은 상기 언급된 활성 중 적어도 3종; 임의로, 상기 언급된 활성 중 적어도 4종; 여전히 임의로, 상기 언급된 활성 중 적어도 5종; 추가로 임의로, 상기 언급된 활성 중 적어도 6종; 여전히 추가로 임의로, 상기 언급된 활성 중 적어도 7 또는 8 또는 9종에 있어서 실질적 동등성을 확립하는 것을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 및 (b) 본원에 기재된 방법 중 1종 이상을 수행하기 위한 지침서 및 이러한 방법을 수행하기 위한 시약 중 적어도 1종을 포함하는, 적어도 1종의 Wnt-관련 표적 유전자의 발현의 억제, 종양 억제 유전자의 상향조절 및/또는 LRP6 및/또는 FZD6의 발현의 하향조절에 대한 시험 인터페론의 효력을 평가하기 위한 검정 키트를 제공한다. 시약은 포스페이트 완충 염수 (PBS) 또는 완충제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 검정 키트에서의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 명시된 비활성을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 어느 1종 이상의 종양-보유 동물 모델에서의 생체내 암 세포 성장의 억제; 암 세포 생존율의 감소; 암 세포 이동의 억제; 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제; 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현의 하향조절; 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 1종 이상의 발현의 억제; 암 세포에서의 위족 형성의 억제; 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제; 및 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 1종 이상의 발현의 상향조절로부터 선택된 어느 1종 이상의 활성, 임의로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9종의 활성을 포함하는 인터페론 또는 인터페론 대체물을 제공한다.
도 1은 MMC (5 mg/kg) 또는 0.15 mg/마우스, 0.10 mg/마우스 또는 0.05 mg/마우스의 rSIFN-co로 처리하였거나 또는 비히클 생리 염수 (NS) (0.15 ml/마우스)로 주사한 군 각각에 대해, 처리 시작 후 21일 기간에 걸쳐 평균 상대 종양 부피 (RTV)로 나타낸, 실시예 1에 기재된 바와 같은 누드 마우스에서의 인간 간세포암 종양 SMMC-7721의 성장 곡선을 보여준다.
도 2는 MMC (5 mg/kg) 또는 0.15 mg/마우스, 0.10 mg/마우스 또는 0.05 mg/마우스의 rSIFN-co로 처리하였거나 또는 비히클 생리 염수 (0.15 ml/마우스)로 주사한 군 각각에 대해, 28일 처리 기간에 걸쳐 RTV로 나타낸, 실시예 2에 기재된 바와 같은 누드 마우스에서의 인간 자궁경부 종양의 성장 곡선을 보여준다.
도 3은 MMC (5 mg/kg) 또는 0.15 mg/마우스, 0.10 mg/마우스 또는 0.05 mg/마우스의 rSIFN-co 또는 0.15 mg/마우스의 IFN알파-2b로 처리하였거나 또는 비히클 생리 염수 (0.15 ml/마우스)로 주사한 군 각각에 대해, 28일 처리 기간에 걸쳐 RTV로 나타낸, 실시예 3에 기재된 바와 같은 누드 마우스에서의 인간 결장 종양 HT-29의 성장 곡선을 보여준다.
도 4는 MMC (5 mg/kg) 또는 0.15 mg/마우스, 0.10 mg/마우스 또는 0.05 mg/마우스의 rSIFN-co 또는 0.15 mg/마우스의 IFN알파-2b로 처리하였거나 또는 비히클 생리 염수 (0.15 ml/마우스)로 주사한 군 각각에 대해, 21일 처리 기간에 걸쳐 RTV로 나타낸, 실시예 4에 기재된 바와 같은 누드 마우스에서의 인간 폐 종양 SPC-A4의 성장 곡선을 보여준다.
도 5는 0, 0.2, 0.39, 0.78, 1.56, 3.13, 6.25, 12.50, 25, 50 및 100 mcg/ml (μg/ml)로 나타낸 농도의 rSIFN-co 또는 IFN알파-2b (IFNα-2b)로 48시간 동안 처리 후의 상이한 종양 세포의 생존율에 대한 용량 반응 곡선을 보여준다. 시험된 세포는 다음과 같다: A549 폐 종양 세포 (도 5A); Hela 자궁경부 종양 세포 (도 5B); CL-1 간 종양 세포 (도 5C); Huh-7 간 종양 세포 (도 5D); SW480 결장 종양 세포 (도 5E); MDA-MB-231 유방 종양 세포 (도 5F); Calu-1 폐 종양 세포 (도 5G); SMMC-7721 간 종양 세포 (도 5H); 및 PANC-1 췌장 종양 세포 (도 5I). 결과는 대조군 세포 대비 세포 생존율의 백분율로서 표현되고, 적어도 2개의 독립적 실험의 평균을 나타낸다.
도 6은 1, 2, 3, 4, 5 및 6일로 나타낸 일수 동안 처리 후의 A549 세포 (도 6A) 및 SW620 세포 (도 6B)의 생존율에 대한, 각각 10 mcg/ml의 IFN알파-2b 처리 및 rSIFN-co 처리의 효과를 보여주는 생존율 곡선이다. 세포 생존율은 MTT 검정에 의해 평가하였다. 결과는 대조군 세포 대비 세포 생존율의 백분율로서 표현되고, 적어도 2개의 독립적 실험의 평균을 나타낸다. (**p<0.01)
도 7은 3D 배양 중, 폐암 세포 A549 상에서, 4일 후 콜로니 형성 (1행) (100배 확대됨) 및 8일 후 침습적 발 (위족) 형성 (2행 및 3행) (400배 확대됨)에 대한, 각각 rSIFN-co 처리 (도 7, 칼럼 C) 및 IFN알파-2b 처리 (도 7, 칼럼 B)의 효과를 모의 대조군 (도 7, 칼럼 A)과 비교하여 보여주는 현미경사진이다. 칼럼 A 및 B에서 흑색 화살표는 암 세포로부터 돌출되는 위족을 가리킨다. 칼럼 C에서 별형을 가진 화살표는 위족이 없는 세포를 가리킨다.
도 8, A-E는 상이한 폐암 세포: A549 (도 8A); H1299 (도 8B); 및 H460 (도 8C); 및 상이한 결장암 세포: HT-29 (도 8D); 및 SW620 (도 8E)에서 베타-카테닌/TCF-매개 전사 활성에 대한, 각각 rSIFN-co 처리 및 IFN알파-2b 처리의 효과를 모의 대조군과 비교하여 보여주는 막대형 다이어그램이다. 값은 3개 실험의 평균이었다. (*p<0.05, **p<0.01).
도 9, A 및 B는 상이한 암 세포: A549, H460, SW620 및 HT-29에서 GAPDH의 발현 대비 mRNA 수준에 의해 측정된 Wnt-관련 수용체 또는 보조-수용체 LRP6 (도 9A) 및 FZD6 (도 9B)의 발현에 대한, 각각 rSIFN-co 처리 및 IFN알파-2b 처리의 효과를 모의 대조군과 비교하여 보여주는 막대형 다이어그램이다. 실험은 3중으로 수행하였고, 결과는 모의 대조군을 사용하여 정규화하였다.
도 10, A 및 B는 웨스턴 블롯이고, 각각 24, 48 및 72시간의 처리 후의 암 세포: A549 (도 10A) 및 SW480 (도 10B)에서의 베타-카테닌 단백질 수준에 대한, 각각 rSIFN-co 처리 및 IFN알파-2b 처리의 효과를 모의 대조군과 비교하여 보여준다. GAPDH 발현은 대조군으로서 사용하였다. 실험은 3중으로 수행하였다.
도 11, A - D는 A549 폐암 세포를 rSIFN-co 또는 IFN알파-2b로 24시간 동안 처리한 후에 Wnt-신호전달 경로의 하류인 4개의 유전자: Axin2 (도 11A); CD24 (도 11B); 서바이빈 (도 11C); 및 ID2 (도 11D)의 상대 mRNA 발현 수준을 모의 대조군과 비교하여 보여주는 막대형 다이어그램이다. 실험은 3중으로 수행하였고, 모의 대조군을 사용하여 정규화하였다.
도 12, A - C는 rSIFN-co 또는 IFN알파-2b로 처리한 상이한 종양 세포: A549, H460, SW620 및 HT-29에서의 3종의 종양 억제 유전자: DKK-3 (도 12A); BATF2 (도 12B); 및 KLF4 (도 12C)의 상대 mRNA 발현 수준을 모의 대조군과 비교하여 보여주는 막대형 다이어그램이다. 실험은 3중으로 수행하였고, 모의 대조군을 사용하여 정규화하였다.
도 13, A 및 B는 A549 세포 (도 13A) 및 SW620 세포 (도 13B)에 대해, IFN알파-2b 또는 rSIFN-co로 처리 후의 종양 세포 이동을 모의 대조군과 비교하여 보여주는 막대형 다이어그램이다. 결과는 이러한 처리 후의 필드당 이동 세포 수의 평균 ± SD로서 제공된다. (**p<0.01)
도 14는 각각 모의 대조군 및 5FU-처리 세포와 비교하여, 24시간 또는 48시간 동안 IFN알파-2b 또는 rSIFN-co로 처리한 후의 A549 세포 (도 14A) 및 SW620 세포 (도 14B)로부터, 프로카스파제-3, 절단된 카스파제-3, 프로카스파제-8, 절단된 카스파제-8, PARP 및 베타-튜불린 (β-튜불린)에 대한 특이적 항체로 염색한 웨스턴 블롯이다.
도 15는 A549 세포를 10 mcg/ml의 IFN알파-2b (도 15A) 또는 10 mcg/ml의 rSIFN-co (도 15B)로 처리한 후에, 또는 Hela 세포를 10 mcg/ml의 IFN알파-2b (도 15C) 또는 10 mcg/ml의 rSIFN-co (도 15D)로 처리한 후에, P-STAT1, STAT1, P-STAT2, STAT2, P-STAT3, STAT3 및 GAPDH에 대한 특이적 항체로 염색한 웨스턴 블롯이다.
도 16은 처리 개시 후 27일의 기간에 걸쳐 IFN알파-2b 또는 rSIFN-co에 의한 처리 후의 종양 성장의 억제를 PBS-처리 대조군과 비교하여 보여주는 종양 성장 곡선이다. 데이터는 평균 종양 부피 (mm3) ± SD로서 제공된다 (n=8).
도 2는 MMC (5 mg/kg) 또는 0.15 mg/마우스, 0.10 mg/마우스 또는 0.05 mg/마우스의 rSIFN-co로 처리하였거나 또는 비히클 생리 염수 (0.15 ml/마우스)로 주사한 군 각각에 대해, 28일 처리 기간에 걸쳐 RTV로 나타낸, 실시예 2에 기재된 바와 같은 누드 마우스에서의 인간 자궁경부 종양의 성장 곡선을 보여준다.
도 3은 MMC (5 mg/kg) 또는 0.15 mg/마우스, 0.10 mg/마우스 또는 0.05 mg/마우스의 rSIFN-co 또는 0.15 mg/마우스의 IFN알파-2b로 처리하였거나 또는 비히클 생리 염수 (0.15 ml/마우스)로 주사한 군 각각에 대해, 28일 처리 기간에 걸쳐 RTV로 나타낸, 실시예 3에 기재된 바와 같은 누드 마우스에서의 인간 결장 종양 HT-29의 성장 곡선을 보여준다.
도 4는 MMC (5 mg/kg) 또는 0.15 mg/마우스, 0.10 mg/마우스 또는 0.05 mg/마우스의 rSIFN-co 또는 0.15 mg/마우스의 IFN알파-2b로 처리하였거나 또는 비히클 생리 염수 (0.15 ml/마우스)로 주사한 군 각각에 대해, 21일 처리 기간에 걸쳐 RTV로 나타낸, 실시예 4에 기재된 바와 같은 누드 마우스에서의 인간 폐 종양 SPC-A4의 성장 곡선을 보여준다.
도 5는 0, 0.2, 0.39, 0.78, 1.56, 3.13, 6.25, 12.50, 25, 50 및 100 mcg/ml (μg/ml)로 나타낸 농도의 rSIFN-co 또는 IFN알파-2b (IFNα-2b)로 48시간 동안 처리 후의 상이한 종양 세포의 생존율에 대한 용량 반응 곡선을 보여준다. 시험된 세포는 다음과 같다: A549 폐 종양 세포 (도 5A); Hela 자궁경부 종양 세포 (도 5B); CL-1 간 종양 세포 (도 5C); Huh-7 간 종양 세포 (도 5D); SW480 결장 종양 세포 (도 5E); MDA-MB-231 유방 종양 세포 (도 5F); Calu-1 폐 종양 세포 (도 5G); SMMC-7721 간 종양 세포 (도 5H); 및 PANC-1 췌장 종양 세포 (도 5I). 결과는 대조군 세포 대비 세포 생존율의 백분율로서 표현되고, 적어도 2개의 독립적 실험의 평균을 나타낸다.
도 6은 1, 2, 3, 4, 5 및 6일로 나타낸 일수 동안 처리 후의 A549 세포 (도 6A) 및 SW620 세포 (도 6B)의 생존율에 대한, 각각 10 mcg/ml의 IFN알파-2b 처리 및 rSIFN-co 처리의 효과를 보여주는 생존율 곡선이다. 세포 생존율은 MTT 검정에 의해 평가하였다. 결과는 대조군 세포 대비 세포 생존율의 백분율로서 표현되고, 적어도 2개의 독립적 실험의 평균을 나타낸다. (**p<0.01)
도 7은 3D 배양 중, 폐암 세포 A549 상에서, 4일 후 콜로니 형성 (1행) (100배 확대됨) 및 8일 후 침습적 발 (위족) 형성 (2행 및 3행) (400배 확대됨)에 대한, 각각 rSIFN-co 처리 (도 7, 칼럼 C) 및 IFN알파-2b 처리 (도 7, 칼럼 B)의 효과를 모의 대조군 (도 7, 칼럼 A)과 비교하여 보여주는 현미경사진이다. 칼럼 A 및 B에서 흑색 화살표는 암 세포로부터 돌출되는 위족을 가리킨다. 칼럼 C에서 별형을 가진 화살표는 위족이 없는 세포를 가리킨다.
도 8, A-E는 상이한 폐암 세포: A549 (도 8A); H1299 (도 8B); 및 H460 (도 8C); 및 상이한 결장암 세포: HT-29 (도 8D); 및 SW620 (도 8E)에서 베타-카테닌/TCF-매개 전사 활성에 대한, 각각 rSIFN-co 처리 및 IFN알파-2b 처리의 효과를 모의 대조군과 비교하여 보여주는 막대형 다이어그램이다. 값은 3개 실험의 평균이었다. (*p<0.05, **p<0.01).
도 9, A 및 B는 상이한 암 세포: A549, H460, SW620 및 HT-29에서 GAPDH의 발현 대비 mRNA 수준에 의해 측정된 Wnt-관련 수용체 또는 보조-수용체 LRP6 (도 9A) 및 FZD6 (도 9B)의 발현에 대한, 각각 rSIFN-co 처리 및 IFN알파-2b 처리의 효과를 모의 대조군과 비교하여 보여주는 막대형 다이어그램이다. 실험은 3중으로 수행하였고, 결과는 모의 대조군을 사용하여 정규화하였다.
도 10, A 및 B는 웨스턴 블롯이고, 각각 24, 48 및 72시간의 처리 후의 암 세포: A549 (도 10A) 및 SW480 (도 10B)에서의 베타-카테닌 단백질 수준에 대한, 각각 rSIFN-co 처리 및 IFN알파-2b 처리의 효과를 모의 대조군과 비교하여 보여준다. GAPDH 발현은 대조군으로서 사용하였다. 실험은 3중으로 수행하였다.
도 11, A - D는 A549 폐암 세포를 rSIFN-co 또는 IFN알파-2b로 24시간 동안 처리한 후에 Wnt-신호전달 경로의 하류인 4개의 유전자: Axin2 (도 11A); CD24 (도 11B); 서바이빈 (도 11C); 및 ID2 (도 11D)의 상대 mRNA 발현 수준을 모의 대조군과 비교하여 보여주는 막대형 다이어그램이다. 실험은 3중으로 수행하였고, 모의 대조군을 사용하여 정규화하였다.
도 12, A - C는 rSIFN-co 또는 IFN알파-2b로 처리한 상이한 종양 세포: A549, H460, SW620 및 HT-29에서의 3종의 종양 억제 유전자: DKK-3 (도 12A); BATF2 (도 12B); 및 KLF4 (도 12C)의 상대 mRNA 발현 수준을 모의 대조군과 비교하여 보여주는 막대형 다이어그램이다. 실험은 3중으로 수행하였고, 모의 대조군을 사용하여 정규화하였다.
도 13, A 및 B는 A549 세포 (도 13A) 및 SW620 세포 (도 13B)에 대해, IFN알파-2b 또는 rSIFN-co로 처리 후의 종양 세포 이동을 모의 대조군과 비교하여 보여주는 막대형 다이어그램이다. 결과는 이러한 처리 후의 필드당 이동 세포 수의 평균 ± SD로서 제공된다. (**p<0.01)
도 14는 각각 모의 대조군 및 5FU-처리 세포와 비교하여, 24시간 또는 48시간 동안 IFN알파-2b 또는 rSIFN-co로 처리한 후의 A549 세포 (도 14A) 및 SW620 세포 (도 14B)로부터, 프로카스파제-3, 절단된 카스파제-3, 프로카스파제-8, 절단된 카스파제-8, PARP 및 베타-튜불린 (β-튜불린)에 대한 특이적 항체로 염색한 웨스턴 블롯이다.
도 15는 A549 세포를 10 mcg/ml의 IFN알파-2b (도 15A) 또는 10 mcg/ml의 rSIFN-co (도 15B)로 처리한 후에, 또는 Hela 세포를 10 mcg/ml의 IFN알파-2b (도 15C) 또는 10 mcg/ml의 rSIFN-co (도 15D)로 처리한 후에, P-STAT1, STAT1, P-STAT2, STAT2, P-STAT3, STAT3 및 GAPDH에 대한 특이적 항체로 염색한 웨스턴 블롯이다.
도 16은 처리 개시 후 27일의 기간에 걸쳐 IFN알파-2b 또는 rSIFN-co에 의한 처리 후의 종양 성장의 억제를 PBS-처리 대조군과 비교하여 보여주는 종양 성장 곡선이다. 데이터는 평균 종양 부피 (mm3) ± SD로서 제공된다 (n=8).
정의
달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 과학 기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 그에게 주어진 의미 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다.
추가로, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수대상을 포괄할 것이고, 복수 용어는 단수대상을 포괄할 것이다.
또한, 본원에 사용된 용어 "또는"은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미할 것이다.
본원에 사용된 용어 "화합물"은 임의의 단백질 (임의의 항체, 임의의 활성 항체 단편, 및 임의의 이량체 또는 다량체 단백질 포괄), 폴리펩티드, 소분자, 및 1종 이상의 생물학적 활성을 갖는 다른 분자를 의미할 것이다.
본원에 사용된 용어 "포함하다" 또는 "포함하는"은 광범위하게 제한 없이 해석될 것이고, "있다" 또는 "있는"을 포괄할 것이다.
본원에 사용된 용어 "상태" 및 "질환"은 상호교환가능하게 또는 함께, 질병, 감염, 염증, 암, 치료에 의해 유발된 부작용, 또는 대상체에서의 불량한 건강의 다른 원인을 나타내는 것으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 목적하는 효과를 생성하는, 예컨대 세포 생존율의 감소, 단백질의 발현 또는 활성의 하향조절 또는 상향조절, 또는 질환 또는 상태의 치료를 위한 양을 의미할 것이다.
본원에 사용된 용어 "실질적 동등성을 확립하는 것"은 특정 시험 또는 시험들을 실시하여 실험 오차 한계 (예컨대 ± 표준 편차 (SD)) 내에서 실질적으로 동일한 수준의 반응, 활성, 유효성 또는 결과를 입증하는 것을 의미할 것이다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 동일한"은 적어도 약 70% 동일; 임의로, 적어도 약 80% 동일; 여전히 임의로, 적어도 약 90% 동일; 추가로 임의로, 적어도 약 95% 동일을 의미할 것이다.
본원에 사용된 용어 "약 ~의 범위" 또는 "약 ~내지~의 범위"는 범위 플러스 모든 단위로 명시된 수 및 이러한 명시된 범위 중간의 소수점을 의미할 것이다. 예를 들어, "약 4 x 108 IU/mg 내지 약 5 x 108 IU/mg의 범위"는 4 x 108 IU/mg, 4.1 x 108 IU/mg, 4.2 x 108 IU/mg, 4.3 x 108 IU/mg, 4.4 x 108 IU/mg 등을 포괄할 것이고, "8 mcg/ml 내지 20 mcg/ml"는 9 mcg/ml, 10 mcg/ml 등을 포괄할 것이다.
본원에 사용된 용어 "포괄하다" 또는 "포괄하는"은 비-제한적으로 해석될 것이고, 명시된 요소 뿐만 아니라 비-명시된 요소를 구현한다.
본원에 사용된 용어 "인터페론" 또는 "IFN"은 "컨센서스 인간 백혈구 인터페론"의 표제 하에 미국 특허 번호 4,695,623에 기재된 바와 같은 컨센서스 인터페론 알파 뿐만 아니라 rSIFN-co를 포괄하는, 임의의 자연 발생 또는 인공 생성 인터페론을 의미할 것이다.
본원에 사용된 용어 "인터페론 활성"은 자연 발생 인터페론 및 rSIFN-co를 특징화하는 1종 이상의 생물학적 활성, 예컨대 예를 들어 항종양 활성 및/또는 항바이러스 활성을 의미할 것이다.
본원에 사용된 용어 "rSIFN-co"는, 문맥이 요구하는 바와 같이, 미국 특허 번호 7,364,724, 미국 특허 번호 7,585,647에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 핵산 분자, 또는 그의 활성 단편을 의미할 것이다. 미국 특허 번호 7,364,724 및 미국 특허 번호 7,585,647에 기재된 바와 같은 상기 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 하기와 같다:
본원에 사용된 용어 "rSIFN-co 대체물"은 그의 효력이 rSIFN-co에 대해 측정되었거나 측정되어, 시험 화합물의 효력 또는 활성의 결정에서 비교 목적으로 rSIFN-co 대신 사용될 수 있는 임의의 화합물을 의미할 것이다. rSIFN-co 대체물은 인터페론 또는 인터페론 특성을 갖는 화합물일 수 있다.
본원에 사용된, 비활성은 생물학적 활성 및 단백질 함량의 비이다. 생물학적 활성은 관련 기술분야에서 통상적인 것으로서 임의의 관련 생물학적 활성, 예컨대 문헌 [Appendix X C in Chinese Pharmacopoeia (the 3rd book), 2010 edition]에서 공개된 세포 병변 억제 방법에 의해 측정된 생물학적 활성일 수 있다. 단백질 함량은 관련 기술분야에서 통상적인 임의의 방법, 예컨대 문헌 [Appendix VI B in Chinese Pharmacopoeia (the 3rd book), 2010 edition]에서 공개된 로우리 방법에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 질환의 완전 또는 부분 치유를 생성하는 것, 질환을 정지 또는 질환의 비-진행을 유도하는 것, 질환 또는 증상의 중증도를 개선 또는 감소시키는 것, 질환의 재발을 방지하는 것, 질환의 재발 빈도를 감소시키는 것, 질환의 부작용을 감소시키는 것, 질환을 완화상태로 두는 것, 건강이 개선된 일반적 느낌을 생성하는 것 등을 포괄할 것이다.
용어 "Wnt-관련 수용체 또는 보조-수용체"는 개별적으로 또는 함께 Wnt 패밀리 단백질에 결합하여 세포내 정규 Wnt 신호전달 경로 또는 비-정규 Wnt 신호전달 경로에서 신호전달을 개시시키는 1종 이상의 분자를 포괄할 것이다. 이 용어는, 예를 들어 Wnt-보조수용체인 DKK1 및 Wnt 신호전달에 대한 수용체인 FZD6과 상호작용하는 것으로 공지되어 있고 Wnt-4 리간드에 대한 수용체인 것으로 여겨지는, 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 6인 LRP6을 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "Wnt 신호전달 활성"은 프리즐드 (FZD) 패밀리 수용체 및 LRP5/LRP6 보조-수용체에의 결합을 통해 전달되는 Wnt 신호전달 캐스케이드를 지칭하며, 이는 베타-카테닌의 방출 및 세포 활성화를 위한 그의 핵 내로의 이동으로 이어진다.
본 발명자들은 본원에서 rSIFN-co의 투여 또는 처리로부터 발생하는 특정 생물학적 효과를 발견하였고, 이들 생물학적 효과는, 특히 제조 과정 동안 효력면에서 일관성이 요구되는 경우에 또는 약물 개발 과정에서 효력면에서 개선이 추구되는 경우에, rSIFN-co 및 유사한 특성을 가질 수 있는 다른 화합물의 효력을 평가하는데 사용될 수 있다. 본 발명자들은 추가로, rSIFN-co를 사용한 처리 시 지금까지 공지되지 않은 특정 생물학적 효과를 발견하였고, 이러한 생물학적 효과는 특정 유전자의 상향조절 또는 하향조절이 바람직한 다른 상태 또는 질환의 치료를 위한 것을 포괄하여 rSIFN-co의 추가 용도를 위해 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 (1) 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물을 제공하는 단계; 및 (2) 각각 동일한 명시된 조건 하에 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물의 하기 활성: (a) 어느 1종 이상의 종양-보유 동물 모델에서의 생체내 암 세포 성장의 억제; (b) 암 세포 생존율의 감소; (c) 암 세포 이동의 억제; (d) 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제; (e) 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현의 하향조절; (f) 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 1종 이상의 발현의 억제; (g) 암 세포에서의 위족 형성의 억제; (h) 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제; 및 (i) 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 1종 이상의 발현의 상향조절 중 어느 1종 이상을 결정하는 단계를 포함하며, 이에 의해 통계적으로 유의한 방식으로 (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f)에 명시된 활성 중 어느 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6종이 시험 인터페론에 존재한다는 것 및/또는 (g), (h) 및 (i)에 명시된 활성 중 어느 1종 이상이 시험 인터페론에 존재한다는 것은 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖는다는 것을 의미하는 것인, rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물과 대비하여 시험 인터페론의 효력을 결정하거나 또는 비교하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (1) 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물을 제공하는 단계; 및 (2) 각각 동일한 명시된 조건 하에 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물의 하기 활성: (a) 어느 1종 이상의 종양-보유 동물 모델에서의 생체내 암 세포 성장의 억제; (b) 암 세포 생존율의 감소; (c) 암 세포 이동의 억제; (d) 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제; (e) 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현의 하향조절; (f) 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 1종 이상의 발현의 억제; (g) 암 세포에서의 위족 형성의 억제; (h) 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제; 및 (i) 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 1종 이상의 발현의 상향조절 중 어느 1종 이상을 결정하는 단계를 포함하며, 이에 의해 통계적으로 유의한 방식으로 (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f)에 명시된 활성 중 어느 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6종이 시험 인터페론에 존재한다는 것 및/또는 (g), (h) 및 (i)에 명시된 활성 중 어느 1종 이상이 시험 인터페론에 존재한다는 것은 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적 동등성이라는 것을 의미하는 것인, 시험 인터페론과 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 사이의 실질적 동등성을 확립하는 방법을 제공한다. 임의로, 모두 시험 인터페론의 처리 또는 투여 시, 예컨대 A549 세포, H1299 세포, H460 세포 및 HT-29 세포 중 어느 1종 이상에서 통계적으로 유의한 방식으로 베타-카테닌/TCF의 전사 활성이 억제된다는 것과 함께 예컨대 A549 세포 및/또는 SW620 세포에서 시험관내 종양 세포 생존율의 감소가 존재한다는 것, 및 임의로, JAK/STAT 신호전달이 추가로 존재한다는 것은 시험 인터페론 및 rSIFN-co 사이의 실질적 동등성을 나타낸다. 추가로 임의로, 세포 생존율의 결정은 적절한 세포를 약 1 내지 약 6일 동안 예를 들어 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론으로 처리하여 실시할 수 있다. 임의로, 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제는 암 세포: A549, H1299, H460, 또는 HT-29 중 어느 1종 이상에서, 예를 들어 이들 세포를 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론으로 약 24시간 동안 처리하는 것에 의해 결정된다. 임의로, JAK/STAT 신호전달은 예컨대 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론으로 다양한 시간, 예컨대 약 5, 15, 30, 60, 120, 및/또는 240분 동안 A549 세포 또는 Hela 세포의 처리 시 STAT 단백질, 예컨대 STAT1, STAT2 및/또는 STAT3의 인산화의 존재를 결정하는 것에 의해 결정된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (2)에서, 동일한 명시된 조건 하에 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 대해 상기 언급된 활성 중 적어도 2종, 예컨대 (a) 및 (b); (a) 및 (c); (a) 및 (d); (a) 및 (e); (a) 및 (f); (a) 및 (g); (a) 및 (h); (a) 및 (i); (b) 및 (c); (b) 및 (d); (b) 및 (e); (b) 및 (f); (b) 및 (g); (b) 및 (h); (b) 및 (i); (c) 및 (d); (c) 및 (e); (c) 및 (f); (c) 및 (g); (c) 및 (h); (c) 및 (i); (d) 및 (e); (d) 및 (f); (d) 및 (g); (d) 및 (h); (d) 및 (i); (e) 및 (f); (e) 및 (g); (e) 및 (h); (e) 및 (i); (f) 및 (g); (f) 및 (h); (f) 및 (i); (g) 및 (h); (g) 및 (i); (h) 및 (i)가 결정된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (2)에서, 동일한 명시된 조건 하에 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 대해 상기 언급된 활성 중 적어도 3종, 예컨대 (a), (b) 및 (c); (a), (b) 및 (d); (a), (b) 및 (e); (a), (b) 및 (f); (a), (b) 및 (g); (a), (b) 및 (h); (a), (b) 및 (i); (a), (c) 및 (d); (a), (c) 및 (e); (a), (c) 및 (f); (a), (c) 및 (g); (a), (c) 및 (h); (a), (c) 및 (i); (a), (d) 및 (e); (a), (d) 및 (f); (a), (d) 및 (g); (a), (d) 및 (h); (a), (d) 및 (i); (a), (e) 및 (f); (a), (e) 및 (g); (a), (e) 및 (h); (a), (e) 및 (i); (a), (f) 및 (g); (a), (f) 및 (h); (a), (f) 및 (i); (a), (g) 및 (h); (a), (g) 및 (i); (a), (h) 및 (i); (b), (c) 및 (d); (b), (c) 및 (e); (b), (c) 및 (f); (b), (c) 및 (g); (b), (c) 및 (h); (b), (c) 및 (i); (b), (d) 및 (e); (b), (d) 및 (f); (b), (d) 및 (g); (b), (d) 및 (h); (b), (d) 및 (i); (b), (e) 및 (f); (b), (e) 및 (g); (b), (e) 및 (h); (b), (e) 및 (i); (b), (f) 및 (g); (b), (f) 및 (h); (b), (f) 및 (i); (b), (g) 및 (h); (b), (g) 및 (i); (b), (h) 및 (i); (c), (d) 및 (e); (c), (d) 및 (f); (c), (d) 및 (g); (c), (d) 및 (h); (c), (d) 및 (i); (c), (e) 및 (f); (c), (e) 및 (g); (c), (e) 및 (h); (c), (e) 및 (i); (c), (f) 및 (g); (c), (f) 및 (h); (c), (f) 및 (i); (c), (g) 및 (h); (c), (g) 및 (i); (c), (h) 및 (i); (d), (e) 및 (f); (d), (e) 및 (g); (d), (e) 및 (h); (d), (e) 및 (i); (d), (f) 및 (g); (d), (f) 및 (h); (d), (f) 및 (i); (d), (g) 및 (h); (d), (g) 및 (i); (d), (h) 및 (i); (e), (f) 및 (g); (e), (f) 및 (h); (e), (f) 및 (i); (e), (g) 및 (h); (e), (g) 및 (i); (e), (h) 및 (i); (f), (g) 및 (h); (f), (g) 및 (i); (g), (h) 및 (i)가 결정된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (2)에서, 동일한 명시된 조건 하에 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 대해 상기 언급된 활성 중 적어도 4종, 예컨대 (a), (b), (c) 및 (d); (a), (b), (c), 및 (e); (a), (b), (c) 및 (f); (a), (b), (c) 및 (g); (a), (b), (c) 및 (h); (a), (b), (c) 및 (i); (a), (c), (d) 및 (e); (a), (c), (d) 및 (f); (a), (c), (d) 및 (g); (a), (c), (d) 및 (h); (a), (c), (d) 및 (i); (a), (d), (e) 및 (f); (a), (d), (e) 및 (g); (a), (d), (e) 및 (h); (a), (d), (e) 및 (i); (a), (e), (f) 및 (g); (a), (e), (f) 및 (h); (a), (e), (f) 및 (i); (a), (f), (g) 및 (h); (a), (f), (g) 및 (i); (a), (g), (h) 및 (i); (b), (c), (d) 및 (e); (b), (c), (d) 및 (f); (b), (c), (d) 및 (g); (b), (c), (d) 및 (h); (b), (c), (d) 및 (i); (b), (d), (e) 및 (f); (b), (d), (e) 및 (g); (b), (d), (e) 및 (h); (b), (d), (e) 및 (i); (b), (e), (f) 및 (g); (b), (e), (f) 및 (h); (b), (e), (f) 및 (i); (b), (f), (g), 및 (h); (b), (f), (g), 및 (i); (b), (g), (h), 및 (i); (c), (d), (e), 및 (f); (c), (d), (e), 및 (g); (c), (d), (e), 및 (h); (c), (d), (e), 및 (i); (c), (d), (f) 및 (g); (c), (d), (f) 및 (h); (c), (d), (f) 및 (i); (c), (d), (g), 및 (h); (c), (d), (g) 및 (i); (c), (d), (h), 및 (i); (c), (e), (f) 및 (g); (c), (e), (f) 및 (h); (c), (e), (f) 및 (i); (c), (f), (g) 및 (h); (c), (f), (g) 및 (i); (c), (g), (h) 및 (i); (d), (e), (f) 및 (g); (d), (e), (f) 및 (h); (d), (e), (f) 및 (i); (d), (f), (g), 및 (h); (d), (f), (g), 및 (i); (d), (g), (h) 및 (i); (e), (f), (g) 및 (h); (e), (f), (g) 및 (i); (e), (g), (h) 및 (i); (f), (g), (h) 및 (i)가 결정된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (2)에서, 동일한 명시된 조건 하에 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 대해 상기 언급된 활성 중 적어도 5종, 예컨대 (a), (b), (c), (d), 및 (e); (a), (b), (c), (d), 및 (f); (a), (b), (c), (d), 및 (g); (a), (b), (c), (d), 및 (h); (a), (b), (c), (d), 및 (i); (a), (c), (d), (e) 및 (f); (a), (c), (d), (e) 및 (g); (a), (c), (d), (e) 및 (h); (a), (c), (d), (e) 및 (i); (a), (d), (e), (f) 및 (g); (a), (d), (e), (f) 및 (h); (a), (d), (e), (f) 및 (i); (a), (e), (f), (g) 및 (h); (a), (e), (f), (g) 및 (i); (a), (f), (g), (h) 및 (i); (b), (c), (d), (e) 및 (f); (b), (c), (d), (e) 및 (g); (b), (c), (d), (e) 및 (h); (b), (c), (d), (e) 및 (i); (b), (d), (e), (f) 및 (g); (b), (d), (e), (f) 및 (h); (b), (d), (e), (f) 및 (i); (b), (e), (f), (g) 및 (h); (b), (e), (f), (g) 및 (i); (b), (f), (g), (h) 및 (i); (c), (d), (e), (f) 및 (g); (c), (d), (e), (f) 및 (h); (c), (d), (e), (f) 및 (i); (c), (e), (f), (g) 및 (h); (c), (e), (f), (g) 및 (i); (c), (f), (g), (h) 및 (i); (d), (e), (f), (g), 및 (h); (d), (e), (f), (g), 및 (i); (d), (f), (g), (h) 및 (i)가 결정된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (2)에서, 동일한 명시된 조건 하에 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 대해 상기 언급된 활성 중 적어도 6종, 예컨대 (a), (b), (c), (d), (e), 및 (f); (a), (b), (c), (d), (e), 및 (g); (a), (b), (c), (d), (e), 및 (h); (a), (b), (c), (d), (e), 및 (i); (a), (c), (d), (e), (f), 및 (g); (a), (c), (d), (e), (f), 및 (h); (a), (c), (d), (e), (f), 및 (i); (a), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (a), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (a), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (b), (c), (d), (e), (f), 및 (g); (b), (c), (d), (e), (f), 및 (h); (b), (c), (d), (e), (f), 및 (i); (b), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (b), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (b), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (c), (d), (e), (f), (g), 및 (h); (c), (d), (e), (f), (g), 및 (i); (c), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i)가 결정된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (2)에서, 동일한 명시된 조건 하에 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 대해 상기 언급된 활성 중 적어도 7종, 예컨대 (a), (b), (c), (d), (e), (f), 및 (g); (a), (b), (c), (d), (e), (f), 및 (h); (a), (b), (c), (d), (e), (f), 및 (i); (a), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (a), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (a), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (b), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i)가 결정된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (2)에서, 동일한 명시된 조건 하에 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 대해 상기 언급된 활성 중 적어도 8종, 예컨대 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (b), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (b), (c), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (b), (c), (d), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (b), (c), (d), (e), (g), (h) 및 (i); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (h) 및 (i); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (i)가 결정된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (2)에서, 동일한 명시된 조건 하에 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 대해 상기 언급된 모든 9종의 활성, 예컨대 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i)가 결정된다.
일부 실시양태에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서, 대조군과 비교하였을 때, 통계적으로 유의한 방식 (예컨대 p<0.05, 임의로 p<0.01, 추가로 임의로 p<0.005, 보다 임의로 p<0.001, 여전히 임의로 p<0.0005, 여전히 보다 임의로 p<0.0001)으로 (a)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖고/거나 실질적 동등성이라는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 활성 (a)를 결정하는데 사용된 종양-보유 동물 모델은 마우스, 임의로 누드 마우스, 보다 임의로 BALB/cA nu/nu 마우스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 마우스, 예컨대 BALB/cA nu/nu 마우스는 약 3주령 내지 약 7주령 마우스를 포함하고, 임의로, 약 4주령 내지 약 6주령 마우스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 마우스 예컨대 BALB/cA nu/nu 마우스의 체중은 약 15±2 g 내지 약 30±2 g 범위이고; 임의로, 약 19±2 g 내지 약 23±2 g 범위이다.
일부 실시양태에서, 활성 (a), 생체내 암 세포 성장의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 간암 세포, 자궁경부암 세포, 결장암 세포 및 폐암 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (a)를 결정하는데 사용된 암 세포는 SMMC-7721 세포, Hela 세포, HT-29 세포, SPC-A4 세포 및 A549 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 임의로, HT-29 세포, SPC-A4 세포 및 A549 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 추가로 임의로, A549 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 생리 염수 또는 PBS, 임의로 생리 염수는 활성 (a)에서의 억제를 결정하는데 대조군으로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서 종양-보유 동물 모델에게 투여된 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 약 0.02 mg 내지 약 0.30 mg; 임의로, 약 0.05 mg 내지 약 0.15 mg; 추가로 임의로, 약 0.075 mg 내지 약 0.10 mg의 범위로 투여된다. 일부 실시양태에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서 종양-보유 동물 모델에게 투여된 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 격일로 투여된다. 일부 실시양태에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서 종양-보유 동물 모델에게 투여된 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 약 2주 내지 약 6주; 임의로, 약 3주 내지 약 4주 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서 종양-보유 동물 모델에 투여되는 대조군은 약 0.05 ml 내지 약 0.30 ml; 임의로, 약 0.10 ml 내지 약 0.20 ml의 범위로 투여된다. 일부 실시양태에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서 종양-보유 동물 모델에 투여되는 대조군은 격일로 투여된다. 일부 실시양태에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서 종양-보유 동물 모델에 투여되는 대조군은 약 2주 내지 약 6주; 임의로, 약 3주 내지 약 4주 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 시험 인터페론 및/또는 대조군은 종양내로 투여된다.
일부 실시양태에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서, SMMC-7721 세포를 활성 (a)를 결정하는데 사용한 경우에, 대조군 (예컨대 생리 염수)과 비교하여 통계적으로 유의한 방식 (예컨대 약 0.05mg 및 약 0.10 mg의 경우에 p<0.05, 임의로, 약 0.15 mg의 경우에 p<0.01)으로 (a)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖고/거나 실질적 동등성이라는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 격일로 약 0.02 mg 내지 약 0.30 mg; 임의로, 약 0.05 mg 내지 약 0.15 mg; 추가로 임의로, 약 0.075 mg 내지 약 0.10 mg의 범위로 약 3주 동안 투여된다.
일부 실시양태에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서, Hela 세포를 활성 (a)를 결정하는데 사용한 경우에, 대조군 (예컨대 생리 염수)과 비교하여 통계적으로 유의한 방식 (예컨대 약 0.15 mg의 경우에 p<0.05, 임의로, 약 0.05 mg 및 약 0.10 mg의 경우에 p<0.01)으로 (a)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖고/거나 실질적 동등성이라는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 격일로 약 0.02 mg 내지 약 0.30 mg; 임의로, 약 0.05 mg 내지 약 0.15 mg; 추가로 임의로, 약 0.075 mg 내지 약 0.10 mg의 범위로 약 4주 동안 투여된다.
일부 실시양태에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서, HT-29 세포를 활성 (a)를 결정하는데 사용한 경우에, 대조군 (예컨대 생리 염수)과 비교하여 통계적으로 유의한 방식 (예컨대 약 0.10 mg 및 0.15 mg의 경우에 p<0.01, 임의로, 약 0.05 mg의 경우에 p<0.001)으로 (a)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖고/거나 실질적 동등성이라는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 격일로 약 0.02 mg 내지 약 0.30 mg; 임의로, 약 0.05 mg 내지 약 0.15 mg; 추가로 임의로, 약 0.075 mg 내지 약 0.10 mg의 범위로 약 4주 동안 투여된다.
일부 실시양태에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서, SPC-A4 세포를 활성 (a)를 결정하는데 사용한 경우에, 대조군 (예컨대 생리 염수)과 비교하여 통계적으로 유의한 방식 (예컨대 약 0.05 mg, 약 0.10 mg 및 약 0.15 mg의 경우에 p<0.01)으로 (a)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖고/거나 실질적 동등성이라는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 격일로 약 0.02 mg 내지 약 0.30 mg; 임의로, 약 0.05 mg 내지 약 0.15 mg; 추가로 임의로, 약 0.075 mg 내지 약 0.10 mg의 범위로 약 3주 동안 투여된다.
일부 실시양태에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서, A549 세포를 활성 (a)를 결정하는데 사용한 경우에, 대조군 (예컨대 PBS)과 비교하여 통계적으로 유의한 방식 (예컨대 p<0.0001)으로 (a)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖고/거나 실질적 동등성이라는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 격일로 약 0.02 mg 내지 약 0.30 mg; 임의로, 약 0.05 mg 내지 약 0.15 mg의 범위, 보다 임의로, 약 0.10 mg으로 적어도 약 3주 동안 투여된다.
일부 실시양태에서, 활성 (b), 암 세포 생존율의 감소를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론이 약 6.25 mcg/ml 내지 약 25 mcg/ml; 임의로, 약 10 mcg/ml 내지 약 18 mcg/ml; 보다 임의로, 약 10 mcg/ml 내지 약 15 mcg/ml의 범위의 농도에서 암 세포 생존율의 약 50% 감소를 야기하는 경우에, 이는 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖고/거나 실질적 동등성이라는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론이 적어도 약 25 mcg/ml; 임의로, 적어도 약 50 mcg/ml; 추가로 임의로, 적어도 약 75 mcg/ml; 보다 임의로, 적어도 약 100 mcg/ml의 범위의 농도에서 암 세포 생존율의 실질적으로 검출불가능한 수준으로의 감소를 야기하는 경우에, 이는 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖고/거나 실질적 동등성이라는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물의 농도는 약 0.2 mcg/ml 내지 약 100 mcg/ml의 범위의 농도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물의 농도는 하기: 0.2 mcg/ml, 0.39 mcg/ml, 0.78 mcg/ml, 1.56 mcg/ml, 3.13 mcg/ml, 6.25 mcg/ml, 12.5 mcg/ml, 25 mcg/ml, 50 mcg/ml, 및 100 mcg/ml 중 적어도 2종 이상이다. 일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 암 세포는 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 적어도 약 1일; 임의로, 적어도 약 2일 동안 처리된다.
일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포, 결장암 세포, 자궁경부암 세포, 간암 세포, 유방암 세포 및 췌장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 임의로, 폐암 세포, 결장암 세포, 간암 세포, 유방암 세포 및 췌장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포, Hela 세포, CL-1 세포, Huh-7 세포, SW480 세포, MDA-MB-231 세포, Calu-1 세포, SMMC-7721 세포 및 PANC-1 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 임의로, A549 세포, CL-1 세포, Huh-7 세포, SW480 세포, MDA-MB-231 세포, Calu-1 세포, SMMC-7721 세포 및 PANC-1 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론이 약 6.25 mcg/ml 내지 약 12.5 mcg/ml의 범위의 농도에서 SW480 세포, MDA-MB-231 세포, 및 PANC-1 세포 중 어느 1종 이상의 생존율의 약 50% 감소를 야기하는 경우에, 이는 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖고/거나 실질적 동등성이라는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론이 약 12.5 mcg/ml 내지 약 25 mcg/ml의 범위의 농도에서 A549 세포, Hela 세포, CL-1 세포, Huh-7 세포, Calu-1 세포, 및 SMMC-7721 세포 중 어느 1종 이상의 생존율의 약 50% 감소를 야기하는 경우에, 이는 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖고/거나 실질적 동등성이라는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, A549 세포 및/또는 SW620 세포를 활성 (b)를 결정하는데 사용한 경우에, 대조군 (예컨대 IFNα-2b)과 비교하여 통계적으로 유의한 방식 (예컨대 p<0.01)으로 (b)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖고/거나 실질적 동등성이라는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 1일 내지 약 10일; 임의로, 약 1일 내지 약 6일 동안 처리된다.
일부 실시양태에서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 암 세포 생존율은 Am-블루 방법 또는 MTT 방법에 의해 결정된다.
일부 실시양태에서, 활성 (c)를 결정하는데 있어서, 대조군과 비교하였을 때, 통계적으로 유의한 방식 (예컨대 p<0.01)으로 (c)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖고/거나 실질적 동등성이라는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 대조군은 비처리 대조군 (모의)이다.
일부 실시양태에서, 활성 (c), 암 세포 이동의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (c)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포 및 SW620 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (c)에서의 암 세포 이동의 억제는 트랜스웰 방법을 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 활성 (c)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (c)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 임의로, 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다.
일부 실시양태에서, 활성 (d)를 결정하는데 있어서, 대조군과 비교하였을 때, 통계적으로 유의한 방식 (예컨대 p<0.05, 임의로 p<0.01)으로 (d)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖고/거나 실질적 동등성이라는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 대조군은 비처리 대조군 (모의)이다.
일부 실시양태에서, 활성 (d), 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (d)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포, H1299 세포, H460 세포, HT-29 세포 및 SW620 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 임의로, A549 세포, H1299 세포, H460 세포 및 SW620 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (d)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 임의로, 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (d)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 베타-카테닌/TCF의 전사 활성은 리포터 시스템의 사용에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 리포터 시스템은 탑플래쉬 또는 pSV40-RL 플라스미드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 활성 (e)를 결정하는데 있어서, 대조군과 비교하였을 때, 통계적으로 유의한 방식 (예컨대 p<0.005, 임의로 p<0.001, 추가로 임의로 p<0.0005)으로 (e)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖고/거나 실질적 동등성이라는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 대조군은 비처리 대조군 (모의)이다.
일부 실시양태에서, 활성 (e), 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현의 하향조절을 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (e)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포, H460 세포, SW620 세포 및 HT-29 중 어느 1종 이상을 포함하고; 임의로, A549 세포, SW620 세포 및 HT-29 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 보다 임의로, HT-29 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (e)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 임의로, 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (e)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (e)를 결정하는데 있어서, LRP6 및/또는 FZD6의 발현은 LRP6 및/또는 FZD6의 mRNA 수준을 결정함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, mRNA 수준을 결정하는 경우에, GAPDH가 대조군으로서 사용된다.
일부 실시양태에서, 활성 (f)를 결정하는데 있어서, 대조군과 비교하였을 때, 통계적으로 유의한 방식 (예컨대 p<0.0005, 임의로 p<0.0001)으로 (f)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖고/거나 실질적 동등성이라는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 대조군은 비처리 대조군 (모의)이다.
일부 실시양태에서, 활성 (f), Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 1종 이상의 발현의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포를 포함하고; 임의로, A549 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (f)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 임의로, 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (f)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (f)를 결정하는데 있어서, Axin2, CD24, 서바이빈 및/또는 ID2의 발현은 그의 상응하는 mRNA 수준을 결정함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, mRNA 수준을 결정하는 경우에, GAPDH가 대조군으로서 사용된다.
일부 실시양태에서, 활성 (f)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론이 대조군과 비교하여 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 1종 이상의 발현을 적어도 약 30%; 임의로, 적어도 약 40%; 보다 임의로, 적어도 약 50%; 여전히 보다 임의로, 적어도 약 60% 감소시키는 경우에, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 실질적으로 동일한 효력 및/또는 실질적 동등성을 갖는 것으로 간주된다.
일부 실시양태에서, 활성 (g)를 결정하는데 있어서, 암 세포에서의 위족 형성이 시험 인터페론에 의해 실질적으로 억제되는 경우에, 이는 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖고/거나 실질적 동등성이라는 것을 의미한다. 본원의 목적상, "실질적으로 억제되는"은 적어도 약 60% 억제; 임의로, 적어도 약 70% 억제; 여전히 임의로, 적어도 약 80% 억제; 추가로 임의로, 적어도 약 90% 억제; 여전히 추가로 임의로, 적어도 약 95% 억제를 의미한다.
일부 실시양태에서, 활성 (g), 위족 형성의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포; 임의로, A549 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (g)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 4일; 임의로, 적어도 약 8일 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (g)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (g)를 결정하는데 사용된 암 세포는 매트리겔 중에서 배양된다.
일부 실시양태에서, 활성 (h)를 결정하는데 있어서, 암 세포 내 베타-카테닌의 수준이 시험 인터페론에 의해 유의하게 감소되는 경우에, 이는 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖고/거나 실질적 동등성이라는 것을 의미한다. 본원의 목적상, 암 세포 내 베타-카테닌의 수준은, 처리 후에 예를 들어 웨스턴 블롯 상의 단백질을 나타내는 밴드가 처리 전과 비교하여 희미해지거나 부재하는 경우에, 유의하게 감소된 것이다.
일부 실시양태에서, 활성 (h), 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (h)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포 및 SW480 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (h)를 결정하는데 있어서, 베타-카테닌 발현의 억제는 웨스턴 블롯의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 활성 (h)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 48시간; 임의로, 적어도 약 72시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (h)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다.
일부 실시양태에서, 활성 (i)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론이 암 세포에서 IFNα-2b와 비교하여 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 1종 이상의 발현을 보다 효과적으로 상향조절할 수 있는 경우에, 이는 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖고/거나 실질적 동등성이라는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 활성 (i), 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 1종 이상의 발현의 상향조절을 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (i)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포, H460 세포, SW620 세포 및 HT-29 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 임의로, A549 세포 및 SW620 세포 중 어느 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 (i)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 임의로, 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (i)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 활성 (i)를 결정하는데 있어서, DKK-3, KLF-4 및/또는 BATF2의 발현은 그의 상응하는 mRNA 수준을 결정함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, mRNA 수준을 결정하는 경우에, GAPDH가 대조군으로서 사용된다.
일부 실시양태에서, 통계적 유의성은 대조군과 비교하는 경우에 0.05 이하, 또는 0.01 이하, 또는 0.005 이하, 또는 0.001 이하, 또는 0.0005 이하, 또는 0.0001 이하의 p 값을 의미한다.
일부 실시양태에서, 대조군은 시험 인터페론 또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리되지 않거나, 또는 생리 염수 또는 PBS로 처리되거나, 또는 IFNα-2b로 처리되거나, 또는 대조군은 비처리 대조군 (모의)이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 복수의 농도의 시험 인터페론을 제공하는 단계; (b) 복수의 농도의 시험 인터페론을 사용하여, 명시된 조건 하에 제1 암 세포 세트의 생존율에 대한 시험 인터페론의 제1 용량 반응을 결정하는 단계; (c) 복수의 농도의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co의 대체물 (이하, "rSIFN-co 대체물")을 제공하는 단계; (d) 복수의 농도의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물을 사용하여, 동일한 명시된 조건 하에 제2 암 세포 세트의 생존율에 대한 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물의 제2 용량 반응을 결정하는 단계; 및 (e) 제1 용량 반응을 제2 용량 반응과 비교하는 단계를 포함하는, 화합물, 예컨대 시험 인터페론의 효력을 결정하거나 또는 비교하는 방법을 제공한다. 이러한 방식으로, rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물과 대비하여 화합물, 예컨대 시험 인터페론의 효력이 결정된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, rSIFN-co (서열 1)는 미국 특허 번호 7,364,724 (재조합 슈퍼-화합물 인터페론)에 기재된 바와 같이, 임의로 이. 콜라이 숙주에서 프로모터 PBAD의 제어 하에, 이. 콜라이 숙주에서의 신규 폴리뉴클레오티드 (서열 2)의 발현에 의해 제조된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, rSIFN-co는 이. 콜라이 내로 서열 2에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 도입하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, rSIFN-co는 서열 1의 아미노산 서열을 갖고, 서열 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되며, 여기서 인터페론은 서열 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되지 않은 인터페론, 예컨대 인터페론 알파콘-1 (인퍼젠®)과 비교하여 B형 간염 바이러스의 B형 간염 표면 항원 (HBsAg) 및 B형 간염 e 항원 (HBeAg)의 발현에 대해 증가된 억제 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원의 방법에 사용된 rSIFN-co는 명시된 비활성을 포함하고, 비활성은 예를 들어 약 4 x 108 IU/mg 내지 약 1 x 109 IU/mg의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비활성은 약 4.4 x 108 IU/mg 내지 약 9 x 108 IU/mg의 범위에 있다. 일부 실시양태에서, 비활성은 약 5 x 108 IU/mg 내지 약 8 x 108 IU/mg의 범위에 있다. 일부 실시양태에서, 비활성은 약 6 x 108 IU/mg 내지 약 7.5 x 108 IU/mg의 범위에 있다. 임의로, 비활성은 약 4 x 108 IU/mg 내지 5 x 108 IU/mg의 범위에 있다.
일부 실시양태에서, 화합물의 효력을 결정하거나 또는 비교하는 방법에 있어서, 시험 인터페론 또는 rSIFN-co의 농도는 약 0.2 mcg/ml 내지 약 100 mcg/ml의 범위에 있다. 일부 실시양태에서, 시험 인터페론 또는 rSIFN-co의 농도는 0.2 mcg/ml, 0.39 mcg/ml, 0.78 mcg/ml, 1.56 mcg/ml, 3.13 mcg/ml, 6.25 mcg/ml, 12.5 mcg/ml, 25 mcg/ml, 50 mcg/ml 및 100 mcg/ml 중 적어도 2종 이상이다.
일부 실시양태에서, rSIFN-co의 효과를 결정하는 본원의 방법에 사용된 세포는 인간 세포이든 동물 세포이든 관계없이 암 세포이다. 세포는 달리 언급되지 않는 한 표준 배양 조건 하에 완전 배지에서 37℃에서 5% CO2 분위기 하에, 시험 인터페론 또는 rSIFN-co에 의해 적어도 약 24시간, 임의로 적어도 약 48시간, 및 여전히 임의로 적어도 약 72시간 동안 처리된다. 배양 배지는 종양 세포의 배양에 적합한 임의의 표준 완전 배지, 예컨대 상하이 셀 콜렉션(Shanghai Cell Collection) (중국 상하이)에서 입수가능하고 10% 소 태아 혈청 (바이오크롬(Biochrom), 독일), 4 mM 글루타민, 50 U/ml 페니실린 및 50 mg/ml 스트렙토마이신이 보충된 것일 수 있다. IFN알파-2b는 상하이 후아-신 하이 바이오테크놀로지, 인크.(Shanghai Hua-xin High Biotechnology, Inc.) (중국, 상하이)로부터 수득될 수 있고, rSIFN-co는 쓰촨 후이양 라이프-엔지니어링 캄파니, 리미티드(Sichuan Huiyang Life-Engineering Co., Ltd.) (중국 청두)로부터 수득될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 암 세포 유형에 따라 약 6.25 mcg/ml 내지 약 25 mcg/ml의 범위의 농도에서 암 세포 생존율을 50% 감소시키는 능력을 갖는 rSIFN-co를 제공한다. 일부 실시양태에서, rSIFN-co는 약 6.25 mcg/ml 내지 12.5 mcg/ml의 범위의 농도에서 세포 생존율을 50% 감소시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, rSIFN-co는 약 12.5 mcg/ml 내지 25 mcg/ml의 범위의 농도에서 세포 생존율을 50% 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, rSIFN-co의 IC50은 약 10 mcg/ml 내지 약 18 mcg/ml의 범위에 있다.
일부 실시양태에서, 시험 인터페론은 또한 인터페론이지만, 비교에 사용된 rSIFN-co와 상이한 제조 로트로부터 수득된다.
따라서, 예를 들어, 화합물, 예컨대 시험 인터페론의 효력을 결정하는데 있어서, 시험 인터페론은 다양한 농도로 희석되고, 사용될 용기에 적절한 특정한 수의 제조된 세포, 예컨대 100 마이크로리터의 완전 배지 중 5 x 103개의 세포가 이러한 다양한 농도의 시험 인터페론과 함께 특정 시간 동안, 예컨대 48시간 동안 인큐베이션된다. 인큐베이션 후에, 세포의 생존율이 결정되고, 유사하게 처리되었지만 시험 인터페론 대신 rSIFN-co로 처리된 세포의 생존율과 비교된다. 각각의 시험 인터페론-처리된 세포 및 rSIFN-co-처리된 세포에 대한 용량 반응 곡선이 결과로부터 생성되어 비교될 수 있다. 이러한 방식으로, 시험 인터페론의 효력이 50% 유효 용량 또는 IC50과 관련하여 rSIFN-co의 효력과 대비하여 결정될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 복수의 암 세포를 제공하는 단계; (b) 명시된 조건 하에 일정량의 시험 인터페론으로 제1 암 세포 세트를 처리하여 제1 생존율 데이터 세트를 생성하는 단계; (c) 동일한 명시된 조건 하에 유효량의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 제2 암 세포 세트를 처리하여 제2 생존율 데이터 세트를 생성하는 단계; 및 (d) 제1 생존율 데이터 세트를 제2 생존율 데이터 세트와 비교하는 단계를 포함하며, 이에 의해 시험 인터페론의 효력이 결정되는 것인, rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물과 대비하여 화합물, 예컨대 시험 인터페론의 효력을 결정하거나 또는 비교하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 암 세포는 약 1일 내지 약 6일의 범위 동안 처리된다. 일부 실시양태에서, rSIFN-co는 약 6.25 mcg/ml 내지 약 50 mcg/ml; 임의로, 약 7 mcg/ml 내지 약 25 mcg/ml; 추가로 임의로, 약 8 mcg/ml 내지 약 12.5 mcg/ml의 범위; 여전히 임의로, 약 10 mcg/ml의 농도로 사용된다. 일부 실시양태에서, rSIFN-co는 명시된 비활성을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 사용된 암 세포는 인간 종양 세포 및 동물 종양 세포 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 폐 종양 세포 또는 자궁경부 종양 세포 또는 간 종양 세포 또는 결장 종양 세포 또는 유방 종양 세포 또는 췌장 종양 세포 또는 전립선 종양 세포 또는 바이러스-유발 종양 세포 또는 바이러스로 형질전환된 세포이다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 A549 세포, Calu-1 세포, CL-1 세포, H460, H1299, Hela 세포, HT29, Huh-7 세포, MDA-MB-231 세포, PANC-1, RAW264.7, SMMC-7721 세포, SW480 세포, 및 SW620 세포 중 적어도 1종으로부터 선택된다.
따라서, 예를 들어, 시험 용기에 적합한 적절한 부피로의 특정한 수의 암 세포, 예컨대 100 마이크로리터의 완전 배지 중 2 x 103개의 세포를 96 웰 플레이트에 넣고, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 동안 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 또는 rSIFN-co로 처리하거나 또는 대조군으로서 비처리로 남기고, 비처리 대조군의 생존율과 대비하여 처리된 세포의 생존율을 매일 결정할 수 있다. 실험의 마지막에, 비처리 대조군의 생존율과 대비하여 처리된 세포의 생존율을 인터페론 처리 일수에 대해 플롯팅할 수 있다. 이러한 방식으로, 시험 화합물이 암 세포의 생존율을 감소시키는 능력을 비교할 수 있고, 그의 효력을 rSIFN-co의 효력과 대비하여 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 세포를 유효량의 rSIFN-co에 명시된 기간 동안 노출시켜 세포 이동을 억제시키는 것을 포함하는, 예컨대 종양 전이에서 발생하는 세포 이동을 억제하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 언급된 바와 같은 세포, 예컨대 종양 세포의 rSIFN-co에 대한 노출은 세포를 유효량의 rSIFN-co의 존재 하에 37℃에서 예컨대 24시간의 시간 동안 인큐베이션하는 것에 의해, 또는 특정 농도의 rSIFN-co가 목적하는 효과, 예컨대 전이에서 종양 세포 이동의 억제, 또는 위족 형성의 억제, 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제, 베타-카테닌 단백질 발현의 억제, Wnt-관련 수용체 및/또는 보조-수용체의 하향조절, Wnt 신호전달 하류 표적 유전자의 하향조절, 종양 억제 유전자의 상향조절, 및 본원에 기재된 바와 같은 다른 것을 수득하는데 충분한 시간 동안 유지되도록 유효량의 rSIFN-co를 동물 또는 대상체에 투여하는 것에 의해, 시험관내 또는 생체내에서 이루어질 수 있다.
세포 이동 검정은 임의의 적합한 상업적으로 입수가능한 키트를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 벡톤-디킨슨 바이오사이언시즈(Becton-Dickinson Biosciences) (미국 뉴저지주)로부터의 24-웰 플레이트 내에 놓인 미세다공성 막을 함유하는 8 마이크로미터 삽입물을 본원에서 사용할 수 있다. 검정을 위해, FBS 무함유 37℃의 가온된 비카르보네이트 기반 배양 배지를 삽입물의 내부 및 웰의 하부에 첨가하고, 가습 조직 배양 인큐베이터 내에서 37℃에서 5% CO2 분위기 하에 약 2시간 동안 재수화되게 할 수 있다. 재수화 후에 배지를 조심스럽게 제거할 수 있고, FBS-무함유 배지 중에 현탁된 약 500 마이크로리터의 제조된 세포 (예컨대 rSIFN-co로 37℃에서 24시간 동안 사전처리된 세포)를 삽입물 필터의 상부 측면 상에 약 0.5 x 104개 세포/삽입물의 밀도로 시딩할 수 있다. 이어서 500 마이크로리터의 10% FBS 함유 완전 배지를 24-웰 플레이트의 하부 구획에 첨가할 수 있다. 이어서 세포/삽입물/플레이트를 37℃에서 약 24시간 동안 인큐베이션하고, 챔버 막의 상부 측면 상의 비-이동 세포를 예컨대 면봉으로 제거할 수 잇다. 이동 세포를 함유하는 배양 삽입물의 하부 표면을 예컨대 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 2% 크리스탈 바이올렛으로 염색할 수 있다. 챔버 막의 반대 측면 상의 이동 세포의 수를 계수하고, 필드당 이동 세포의 평균 수를 결정할 수 있다. 이러한 방식으로, 시험 인터페론이 종양 세포 이동을 억제하는 능력을 입증할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유효량의 rSIFN-co는 약 5 mcg/ml 내지 약 100 mcg/ml; 임의로, 약 8 mcg/ml 내지 약 50 mcg/ml; 여전히 임의로, 약 10 mcg/ml 내지 약 25 mcg/ml; 추가로 임의로, 약 12 mcg/ml 내지 약 18 mcg/ml를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하며, 이에 의해 위족 형성이 억제되는 것인, 암 세포에서의 위족 형성을 억제하는 방법을 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하는, 세포에서의 베타-카테닌/TCF-매개 전사 활성을 억제하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 베타-카테닌/TCF-매개 전사 활성은 루시페라제 리포터 시스템을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 리포터 시스템은 탑플래쉬 리포터이다. 일부 실시양태에서, 플라스미드 pSV40-RL이 사용된다. 따라서, 예를 들어, 평가되는 세포는 96-웰 플레이트 상에 예컨대 웰당 약 1 x 104개 세포로 플레이팅되고 37℃에서 약 12시간 동안 인큐베이션될 수 있고, 그 후 이는 약 100 ng의 탑플래쉬 (밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation), 미국 매사추세츠주 빌러리카)에 의해 일시적으로 형질감염된다. 형질감염 효율의 정규화를 위해, 세포를 SV40 프로모터 (pRL-SV40) (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨) 하에 구동되는 내부 제어 리포터 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis) 루시페라제 1 ng으로 추가로 공동-형질감염시킬 수 있다. 형질감염 6시간 후에, 시험관내 분석을 위한 세포를 이어서 rSIFN-co로 약 24시간 동안 처리할 수 있다. 시험관내 분석을 위한 rSIFN-co 처리 후 또는 생체내 분석을 위한 형질감염 후에, 루시페라제 검정을 이중 루시페라제 검정 시스템 키트를 제조업체의 프로토콜 (Cat#: E1960, 프로메가)을 사용하여 수행할 수 있다. 상대 루시페라제 활성을 반딧불이/레닐라 루시페라제 활성의 비로서 결정할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하는, 세포에서의 베타-카테닌 단백질 수준을 감소시키는 방법을 추가적으로 제공한다. 일부 실시양태에서, 베타-카테닌의 단백질 수준은 그의 특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, GAPDH가 대조군으로서 사용된다.
시험관내 배양물로부터의 또는 생체내 종양 샘플로부터의 세포에서 베타-카테닌의 수준을 결정하기 위한 웨스턴 블롯 분석을 위해, 표준 절차를 사용할 수 있다. 예를 들어, 추출 시약 (Cat#: P0013)을 제조업체의 프로토콜 (베요타임(Beyotime), 중국)에 따라 사용하여 전체 세포성 단백질을 추출할 수 있다. 단백질 농도는 바이오-라드 로우리 단백질 검정 시스템을 사용하여 결정할 수 있다. 전체 단백질을 10% - 12% 겔 상에서의 SDS-PAGE에 의해 분리할 수 있고, 이어서 이를 0.45 마이크로미터 니트로셀룰로스 막 (밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠주 빌러리카)으로 옮길 수 있다. 막을 차단 완충제 (5% 소 혈청 알부민, 10 mmol/L 트리스-HCl, ph 8.0, 150 mol/L NaCl, 및 0.05% 트윈 20)로 4℃에서 밤새 차단시킨 다음, 1차 항체 (1:1000 희석)에 이어 2차 HRP-접합된 항체와 함께 인큐베이션할 수 있다. 항체는 임의의 판매업체로부터의 것일 수 있고, 예를 들어 하기 항체가 사용될 수 있다: 마우스 모노클로날 항-베타-카테닌 (1:1000, 산타 크루즈 테크놀로지(Santa Cruz Technology), 캘리포니아주 산타 크루즈), 마우스 모노클로날 항-GAPDH (1:2000, 강웨이 바이오테크놀로지(Kangwei Biotechnology), 중국), 및 항-마우스 HRP-접합된 2차 항체 (1:2000, 산타 크루즈 테크놀로지). 블롯은 발광/형광 영상화 LAS4000 시스템 (지이 헬스케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences), 미국)을 슈퍼 신호 웨스트 피코 화학발광 기질 키트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 미국)와 함께 사용하여 가시화할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하며, 이에 의해 Wnt-관련 수용체 또는 보조-수용체가 하향조절되는 것인, 세포에서의 Wnt-관련 수용체 또는 보조-수용체의 발현을 하향조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, Wnt-관련 수용체 또는 보조-수용체는 LRP 단백질, 예컨대 LRP6을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt-신호전달 수용체 또는 보조-수용체는 FZD 단백질, 예컨대 FZD6을 포함한다. 상기 언급된 바와 같이, 세포를 rSIFN-co에 노출시키는 방법은 시험관내 방법 또는 생체내 방법일 수 있다.
일부 실시양태에서, Wnt-관련 수용체 또는 보조-수용체의 발현을 결정하는 것은 이러한 수용체 또는 보조-수용체의 mRNA 수준을 결정하는 것을 포함한다. 이러한 mRNA 수준은 임의의 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 mRNA 수준을 결정하기 위해 이러한 mRNA에 상응하는 cDNA가 제조된다. 예를 들어, 트리졸(TRIZOL) 시약 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)을 제조업체의 지침에 따라 사용하여 전체 mRNA를 단리할 수 있다. RT-PCT 키트 (Cat#: FSQ-101, 토요보(TOYOBO), 일본)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 상보적 DNA (cDNA)를 합성한 다음, SYBR 그린 PCR 키트 (Cat#: QPK-201, 토요보, 일본)와 함께 정량적 PCR (qPCR)에 적용할 수 있다. 적합한 프라이머를 사용할 수 있다. 예를 들어, LRP6의 경우에 프라이머는 센스 프라이머: 5'-TGAAGAACCAGCACCACAGG-3' (서열 4); 안티센스 프라이머: 5'-CATAACCAAGAGGCACAGAAGC-3' (서열 5)일 수 있고, FZD6의 경우에 프라이머는 센스 프라이머: 5'-GCGGAGTGAAGGAAGGATTAGTC-3' (서열 6); 및 안티센스 프라이머: 5'-TGAACAAGCAGAGATGTGGAACC-3' (서열 7)일 수 있다. 증폭 프로토콜은 95℃에서의 1분 인큐베이션, 40 사이클 (15초 동안 95℃, 15초 동안 60℃, 및 30초 동안 72℃)일 수 있다. PCR 산물 내로의 SYBR 그린 염료의 도입은 바이오-라드 검출 시스템에 의해 실시간으로 모니터링될 수 있고, 이어서 바이로-라드 CFX 매니저 2.1 소프트웨어를 사용하여 분석될 수 있다. 샘플을 각각의 조건에 대해 풀링하고, 이중으로 구동시킬 수 있다. 인터페론-처리된 샘플을 2-△△Ct 방법을 사용하여 모의 비처리 샘플과 비교하고, 배수 변화로서 플롯팅할 수 있다. GAPDH를 정규화 대조군으로서 사용할 수 있다. 이러한 2-△△Ct 방법은 실시간 정량적 PCR 실험으로부터 유전자 발현에서의 상대 변화를 분석하는데 통상적으로 사용된다.
추가 측면에서, 본 발명은 세포에서 Wnt-신호전달 경로의 적어도 1종의 표적 유전자를 포괄하는 특정 유전자의 발현을 하향조절하는 방법, 예컨대 표적 유전자가 돌연변이되거나 과다활성인 질환 또는 상태의 치료를 위한 상기 방법을 제공한다. 이러한 하향조절된 유전자는 예를 들어 Axin2, CD24, 서바이빈 및/또는 ID2 중 1종 이상을 포괄한다. 방법은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하며, 이에 의해 표적 유전자의 발현이 억제된다. 하향조절의 정도는 표준 기술에 의해, 예컨대 이전에 언급된 바와 같은 qPCR에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 이러한 qPCR을 위해, Axin2의 경우에 센스 프라이머: 5'-CGTGGATACCTTAGACTT-3' (서열 8) 및 안티센스 프라이머: 5'-GCTGTTGTTCTCAATGTA-3' (서열 9)를 사용할 수 있고; CD24의 경우에 센스 프라이머: 5'-TGAAGAACATGTGAGAGGTTTGAC-3' (서열 10) 및 안티센스 프라이머: 5'-GAAAACTGAATCTCCATTCCACAA-3' (서열 11)를 사용할 수 있고; 서바이빈의 경우에, 센스 프라이머: 5'-ACCGCATCTCTACATTCAAG-3' (서열 12) 및 안티센스 프라이머: 5'-CAAGTCTGGCTCGTTCTC-3'(서열 13)를 사용할 수 있고; ID2의 경우에, 센스 프라이머: 5'-CACAACAACAACAACAAC-3' (서열 14) 및 안티센스 프라이머: 5'-CACAGTCCAAGTAAGAGA-3' (서열 15)를 사용할 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, rSIFN-co에의 세포의 노출에 대해 명시된 기간은 적어도 약 12시간; 임의로, 적어도 약 24시간; 추가로 임의로, 적어도 약 36시간 동안; 여전히 임의로, 적어도 약 48시간 동안; 또한 여전히 임의로, 적어도 약 72시간이다. 일부 실시양태에서, rSIFN-co에 의해 처리되는 세포는 암 세포이다.
추가 측면에서, 본 발명은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하며, 이에 의해 적어도 1종의 종양 억제 유전자의 발현의 상향조절이 일어나는 것인, 세포에서 적어도 1종의 종양 억제 유전자를 포괄하는 특정 유전자의 발현을 상향조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상향조절된 유전자는 DKK3, KLF4 및 BATF2 중 적어도 1종을 포함한다. 이러한 유전자의 상향조절의 정도는 표준 기술에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상향조절된 유전자의 발현은 mRNA 수준을 측정함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, cDNA가 이러한 mRNA로부터 합성되고, 이러한 측정 목적을 위해 임의로 증폭된다. 예로서, 증폭 목적을 위해, 하기 프라이머를 사용할 수 있다: BATF2의 경우에, 센스 프라이머: 5'-CAGAGCAGGGAGCACAAACC-3' (서열 16) 및 안티센스 프라이머: 5'-TGAGCAGAGGAGAGCAGAGG-3' (서열 17); DKK3의 경우에, 센스 프라이머: 5'-GGAGCCTGACTGAAGAGATGG-3'(서열 18) 및 안티센스 프라이머: 5'-ACGCCTAAAGCACACACCTG-3' (서열 19); KLF4의 경우에, 센스 프라이머: 5'-CCTTCAACCTGGCGGACATCAAC-3' (서열 20) 및 안티센스 프라이머: 5'-GGCTGCTGCGGCGGAATG-3' (서열 21).
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 어느 1종 이상의 종양-보유 동물 모델에서의 생체내 암 세포 성장의 억제; (b) 암 세포 생존율의 감소; (c) 암 세포 이동의 억제; (d) 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제; (e) 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현의 하향조절; (f) 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 1종 이상의 발현의 억제; (g) 암 세포에서의 위족 형성의 억제; (h) 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제; 및 (i) 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 1종 이상의 발현의 상향조절 중 적어도 1종, 임의로 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9종의 활성을 비교하고 실질적으로 동일한 반응을 제시하는 것을 포함하는, 상기 활성에서의 시험 화합물과 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 사이의 실질적 동등성을 확립하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 상기 언급된 활성 중 적어도 2종, 예컨대 (a) 및 (b); (a) 및 (c); (a) 및 (d); (a) 및 (e); (a) 및 (f); (a) 및 (g); (a) 및 (h); (a) 및 (i); (b) 및 (c); (b) 및 (d); (b) 및 (e); (b) 및 (f); (b) 및 (g); (b) 및 (h); (b) 및 (i); (c) 및 (d); (c) 및 (e); (c) 및 (f); (c) 및 (g); (c) 및 (h); (c) 및 (i); (d) 및 (e); (d) 및 (f); (d) 및 (g); (d) 및 (h); (d) 및 (i); (e) 및 (f); (e) 및 (g); (e) 및 (h); (e) 및 (i); (f) 및 (g); (f) 및 (h); (f) 및 (i); (g) 및 (h); (g) 및 (i); (h) 및 (i)에 있어서 실질적 동등성을 확립하는 것을 제공하고; 임의로, 본 발명은 상기 언급된 활성 중 적어도 3종, 예컨대 (a), (b) 및 (c); (a), (b) 및 (d); (a), (b) 및 (e); (a), (b) 및 (f); (a), (b) 및 (g); (a), (b) 및 (h); (a), (b) 및 (i); (a), (c) 및 (d); (a), (c) 및 (e); (a), (c) 및 (f); (a), (c) 및 (g); (a), (c) 및 (h); (a), (c) 및 (i); (a), (d) 및 (e); (a), (d) 및 (f); (a), (d) 및 (g); (a), (d) 및 (h); (a), (d) 및 (i); (a), (e) 및 (f); (a), (e) 및 (g); (a), (e) 및 (h); (a), (e) 및 (i); (a), (f) 및 (g); (a), (f) 및 (h); (a), (f) 및 (i); (a), (g) 및 (h); (a), (g) 및 (i); (a), (h) 및 (i); (b), (c) 및 (d); (b), (c) 및 (e); (b), (c) 및 (f); (b), (c) 및 (g); (b), (c) 및 (h); (b), (c) 및 (i); (b), (d) 및 (e); (b), (d) 및 (f); (b), (d) 및 (g); (b), (d) 및 (h); (b), (d) 및 (i); (b), (e) 및 (f); (b), (e) 및 (g); (b), (e) 및 (h); (b), (e) 및 (i); (b), (f) 및 (g); (b), (f) 및 (h); (b), (f) 및 (i); (b), (g) 및 (h); (b), (g) 및 (i); (b), (h) 및 (i); (c), (d) 및 (e); (c), (d) 및 (f); (c), (d) 및 (g); (c), (d) 및 (h); (c), (d) 및 (i); (c), (e) 및 (f); (c), (e) 및 (g); (c), (e) 및 (h); (c), (e) 및 (i); (c), (f) 및 (g); (c), (f) 및 (h); (c), (f) 및 (i); (c), (g) 및 (h); (c), (g) 및 (i); (c), (h) 및 (i); (d), (e) 및 (f); (d), (e) 및 (g); (d), (e) 및 (h); (d), (e) 및 (i); (d), (f) 및 (g); (d), (f) 및 (h); (d), (f) 및 (i); (d), (g) 및 (h); (d), (g) 및 (i); (d), (h) 및 (i); (e), (f) 및 (g); (e), (f) 및 (h); (e), (f) 및 (i); (e), (g) 및 (h); (e), (g) 및 (i); (e), (h) 및 (i); (f), (g) 및 (h); (f), (g) 및 (i); (g), (h) 및 (i)에 있어서; 임의로, 상기 언급된 활성 중 적어도 4종, 예컨대 (a), (b), (c) 및 (d); (a), (b), (c), 및 (e); (a), (b), (c) 및 (f); (a), (b), (c) 및 (g); (a), (b), (c) 및 (h); (a), (b), (c) 및 (i); (a), (c), (d) 및 (e); (a), (c), (d) 및 (f); (a), (c), (d) 및 (g); (a), (c), (d) 및 (h); (a), (c), (d) 및 (i); (a), (d), (e) 및 (f); (a), (d), (e) 및 (g); (a), (d), (e) 및 (h); (a), (d), (e) 및 (i); (a), (e), (f) 및 (g); (a), (e), (f) 및 (h); (a), (e), (f) 및 (i); (a), (f), (g) 및 (h); (a), (f), (g) 및 (i); (a), (g), (h) 및 (i); (b), (c), (d) 및 (e); (b), (c), (d) 및 (f); (b), (c), (d) 및 (g); (b), (c), (d) 및 (h); (b), (c), (d) 및 (i); (b), (d), (e) 및 (f); (b), (d), (e) 및 (g); (b), (d), (e) 및 (h); (b), (d), (e) 및 (i); (b), (e), (f) 및 (g); (b), (e), (f) 및 (h); (b), (e), (f) 및 (i); (b), (f), (g), 및 (h); (b), (f), (g), 및 (i); (b), (g), (h), 및 (i); (c), (d), (e), 및 (f); (c), (d), (e), 및 (g); (c), (d), (e), 및 (h); (c), (d), (e), 및 (i); (c), (d), (f) 및 (g); (c), (d), (f) 및 (h); (c), (d), (f) 및 (i); (c), (d), (g), 및 (h); (c), (d), (g) 및 (i); (c), (d), (h), 및 (i); (c), (e), (f) 및 (g); (c), (e), (f) 및 (h); (c), (e), (f) 및 (i); (c), (f), (g) 및 (h); (c), (f), (g) 및 (i); (c), (g), (h) 및 (i); (d), (e), (f) 및 (g); (d), (e), (f) 및 (h); (d), (e), (f) 및 (i); (d), (f), (g), 및 (h); (d), (f), (g), 및 (i); (d), (g), (h) 및 (i); (e), (f), (g) 및 (h); (e), (f), (g) 및 (i); (e), (g), (h) 및 (i); (f), (g), (h) 및 (i)에 있어서; 여전히 임의로, 상기 언급된 활성 중 적어도 5종, 예컨대 (a), (b), (c), (d), 및 (e); (a), (b), (c), (d), 및 (f); (a), (b), (c), (d), 및 (g); (a), (b), (c), (d), 및 (h); (a), (b), (c), (d), 및 (i); (a), (c), (d), (e) 및 (f); (a), (c), (d), (e) 및 (g); (a), (c), (d), (e) 및 (h); (a), (c), (d), (e) 및 (i); (a), (d), (e), (f) 및 (g); (a), (d), (e), (f) 및 (h); (a), (d), (e), (f) 및 (i); (a), (e), (f), (g) 및 (h); (a), (e), (f), (g) 및 (i); (a), (f), (g), (h) 및 (i); (b), (c), (d), (e) 및 (f); (b), (c), (d), (e) 및 (g); (b), (c), (d), (e) 및 (h); (b), (c), (d), (e) 및 (i); (b), (d), (e), (f) 및 (g); (b), (d), (e), (f) 및 (h); (b), (d), (e), (f) 및 (i); (b), (e), (f), (g) 및 (h); (b), (e), (f), (g) 및 (i); (b), (f), (g), (h) 및 (i); (c), (d), (e), (f) 및 (g); (c), (d), (e), (f) 및 (h); (c), (d), (e), (f) 및 (i); (c), (e), (f), (g) 및 (h); (c), (e), (f), (g) 및 (i); (c), (f), (g), (h) 및 (i); (d), (e), (f), (g), 및 (h); (d), (e), (f), (g), 및 (i); (d), (f), (g), (h) 및 (i)에 있어서; 추가로 임의로, 상기 언급된 활성 중 적어도 6종, 예컨대 (a), (b), (c), (d), (e), 및 (f); (a), (b), (c), (d), (e), 및 (g); (a), (b), (c), (d), (e), 및 (h); (a), (b), (c), (d), (e), 및 (i); (a), (c), (d), (e), (f), 및 (g); (a), (c), (d), (e), (f), 및 (h); (a), (c), (d), (e), (f), 및 (i); (a), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (a), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (a), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (b), (c), (d), (e), (f), 및 (g); (b), (c), (d), (e), (f), 및 (h); (b), (c), (d), (e), (f), 및 (i); (b), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (b), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (b), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (c), (d), (e), (f), (g), 및 (h); (c), (d), (e), (f), (g), 및 (i); (c), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i)에 있어서; 여전히 추가로 임의로, 상기 언급된 활성 중 적어도 7종, 예컨대 (a), (b), (c), (d), (e), (f), 및 (g); (a), (b), (c), (d), (e), (f), 및 (h); (a), (b), (c), (d), (e), (f), 및 (i); (a), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (a), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (a), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (b), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i)에 있어서; 또한 추가로 임의로, 상기 언급된 활성 중 적어도 8종, 예컨대 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (b), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (b), (c), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (b), (c), (d), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (b), (c), (d), (e), (g), (h) 및 (i); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (h) 및 (i); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (i)에 있어서; 또는 임의로, 상기 언급된 활성 중 모든 9종, 예컨대 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i)에 있어서 실질적 동등성을 확립하는 것을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 및 (b) 본원에 기재된 방법 중 1종 이상을 수행하기 위한 지침서 및 이러한 방법을 수행하기 위한 시약 중 적어도 1종을 포함하는 검정 키트를 제공한다. 시약은 포스페이트 완충 염수 (PBS) 또는 완충제를 포괄할 수 있다. 일부 실시양태에서, 검정 키트에서의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 명시된 비활성을 포함한다.
일부 실시양태에서, 시험 인터페론은 또한 암 세포에서 JAK/STAT 신호전달 경로를 통해 신호전달하고/거나 rSIFN-co와 공통 IFNAR1/2 수용체를 공유하며, 따라서 rSIFN-co와 실질적 동등성이거나 또는 rSIFN-co와 실질적으로 동일한 효력을 갖는다. 일부 실시양태에서 JAK/STAT 경로를 통한 신호전달은 STAT 패밀리, 예컨대 STAT1, STAT2 및/또는 STAT3으로부터 인산화된 단백질의 존재를 검출하는 방법에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 이러한 검출을 위해 웨스턴 블롯이 사용된다. 일부 실시양태에서, 이러한 검출을 위해 암 세포 A549 및/또는 Hela 세포가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 또는 rSIFN-co에 의해 처리된다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 시험 인터페론 또는 rSIFN-co에 의해 약 5, 15, 30, 60, 120, 및/또는 240분 동안 처리된다. 일부 실시양태에서, 인터페론에 의한 처리 후에, 웨스턴 블롯 분석을 위해 세포성 단백질이 수집된다. 일부 실시양태에서, GAPDH가 대조군으로서 사용된다.
일부 실시양태에서, rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 대한 동등성 또는 효력을 확립하기 위해 수행될 시험 또는 활성은 임의의 통상적인 방식으로 실시될 수 있고, 본원에 개시된 방식으로 제한되지 않는다.
실시예
본 발명은 본원에서 하기 실시예에 의해 추가로 설명되나, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하고자 의도되지 않는다. 본 발명은 구체적으로 언급되지 않지만 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 유용한 것으로 인지되는, 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 존재 또는 부재 하에 실시될 수 있다. 또한, 본 발명의 설명은 본원에서 제한하고자 의도되지 않으나, 달리 명시되지 않는 한, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 기재된 특색, 요소 또는 제한, 또는 그의 부분의 등가물 또는 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 다양한 다른 실시양태는 본원에 제공된 일반적 설명에 기초하여 실시될 수 있을 것으로 이해된다. 본 발명의 다른 대상, 특색 및 이점은 상기, 및 상세한 설명 및 실시예 및 첨부된 청구범위, 또한 함께 첨부된 도면으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다.
모든 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 나타낸다. t-검정 (및 비모수적 검정)을 적용하여 상이한 변수 사이의 관계를 분석하였다. p<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 1. 인간 간세포암에 대한 rSIFN-co의 활성.
본 연구는 인간 간세포암에 대한 rSIFN-co의 활성 및 효능을 입증하기 위해, 생체내 시스템에서 모델로서 인간 간세포암 SMMC-7721을 사용하여 수행하였다. 시험 물품인 rSIFN-co의 활성을 미토마이신 C ("MMC")의 활성과 비교하였다. 1 mg/ml 농도의 무색 액체인 rSIFN-co는, 후이양 라이프 사이언스 앤 테크놀로지 코포레이션(Huiyang Life Science and Technology Corp.) (중국 청두)으로부터 제공받았다. 시험 물품은 희석하지 않고 사용하였다. 이는 주사하기 위해 해동될 때까지 4℃에 저장하였다. 2 mg/바이알 농도의 미토마이신 C ("MMC"), 로트 # 505 AGB는 교와 핫코 고교 캄파니, 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) (일본)로부터 제공받았다. MMC는 주사 시점에 생리 염수로 희석하였다.
동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 가이드에 따라 수행하였다.
사용된 동물은 약 23 ± 2 g 체중의 4-6주령 수컷 BALB/cA nu/nu 마우스로, 상하이 인스티튜드 오브 마테리아 메디카(Shanghai Institute of Materia Medica) (중국 상하이)에서 입수하였다. 연구 프로토콜은 상하이 인스티튜드 오브 마테리아 메디카의 동물의 사용 및 관리에 대한 위원회가 규정을 준수하여 검토하였으며, 연구 개시 전에 위원회 승인을 받았다. 가능한 모든 경우에, 본 연구에 사용된 절차는 동물에 대한 불편, 곤란, 및 통증을 방지하거나 최소화하도록 설계되었다. 완화될 수 없는 중증의 또는 만성 통증 또는 곤란을 경함한 동물은 규정에 따라 고통없이 안락사시켰다. 동물을 케이지에 6마리 하우징시켰다. 이들의 귀를 이어 홀 펀치(ear hole punch) 식별표시로 표시하였다. 실온은 25℃ ± 1℃에서 유지하였다. 조명은 12시간 켜고 12시간 끄도록 설정하였다. 음식은 임의로 제공하였다. 5 마이크로미터 (μm) 필터로 여과된 수돗물을 동물에게 물병을 통해 임의로 제공하였다. 연구 감독관 또는 후이양 라이프 사이언스 앤 테크놀로지 코포레이션 그 누구도 음식 또는 물에서 본 연구의 의도 및 목적을 방해하거나 또는 이에 영향을 미칠 어떠한 오염물도 알아차리지 못하였다.
시험 물품 (rSIFN-co) 및 비히클 대조군을 각각 종양내로 (i.t.) 투여하였다. 시험 물품을 동물이 할당된 군에 따라, 처리마다 마우스당 0.05 ml-0.15 ml의 부피로 투여하였다. MMC를 10 마이크로리터 (μl)/g에서 정맥내로 (i.v.) 투여하였다. 생리 염수를 마우스당 0.15 ml의 부피로 주사하였고, 이를 비히클 대조군으로 사용하였다.
동물을 처리군에 무작위로 할당하였다. 처음에, 모든 동물을 하나의 큰 동물 케이지에 넣었다. 연구로의 할당을 위해, 이들을 나중에 처리군마다 케이지당 6마리 동물로 따로 하우징하였다. 각각의 군에 대한 용량 및 투여 요법은 표 1에 제시된다. 군 1 및 2는 대조군으로, 이들 군의 동물에게는 비히클을 각각 제1 처리 후에 격일로 투여하였다. 군 3의 동물에게는 MMC를 5 mg/kg의 용량으로 처리 시작 후 제1일 및 제6일에 제공하였다. 군 4, 5 및 6의 동물 각각에게는 rSIFN-co를 각각 0.15 mg/마우스 (군 4) 또는 0.10 mg/마우스 (군 5) 또는 0.05 mg/마우스 (군 6)로 제1 처리 후에 격일로 제공하였다. 각각의 종양의 길이 및 폭을 연구 과정 동안 1주에 2회 측정함으로써 종양 성장을 모니터링하였다. 또한 각각의 동물의 체중을 연구 과정 동안 1주에 2회 측정하였다.
종양인 인간 간세포암 SMMC-7721 이종이식편을, 5 x 106개 세포를 각각의 마우스에 피하로 (s.c.) 접종함으로써, 각각의 동물에서 확립시켰다. 본 연구의 개시 전에, 이종이식편을 누드 마우스에서 2회 계대접종하였다. 멸균 조건 하에, 잘-성장한 종양을 1.5 mm3 단편으로 자르고, 이러한 하나의 단편을 각각의 연구 동물의 우측 측복부에 투관침 바늘로 주사하였다. 종양이 100 mm3 - 200 mm3 범위의 부피에 도달하였을 때, 마우스를 대조군 또는 처리군으로 무작위로 분류하고, 각각의 군에게 비히클 (군 1 및 2), rSIFN-co (군 4, 5 및 6) 또는 MMC (군 3)를 3주의 기간 동안 표 1에 제시된 용량으로 그러한 스케줄 하에 제공하였다. 개별 종양 크기 (길이 및 폭)를 마이크로캘리퍼로 1주에 2회 측정하였다. 하기 식을 사용하여 종양 부피 (V)를 계산하였다: V = (길이 x 폭2)/2. 하기 식을 사용하여 개별 상대 종양 부피 (RTV)를 계산하였다: RTV = Vt/V0 (식 중 Vt는 측정일에서의 종양 부피이고, V0은 제1 처리일에서의 종양 부피이다). 시험 물품 또는 대조 물품의 치료 효과는, 하기 식을 사용하여 T/C (%)로 표현하고: T/C (%) = (처리군의 평균 RTV/대조군의 평균 RTV) x 100%; 하기 식을 사용하여 % 억제로 표현하였다: % 억제 = 100% - T/C%.
[표 1]
결과는 표 2 및 도 1에 제시된다. 표 2는, 각각의 처리군에 대한, 제0일에서의 최초 종양 크기, 제21일에서의 최종 종양 크기 뿐만 아니라 계산된 평균 RTV, T/C% 및 % 억제를 보여준다.
[표 2]
표 2는 rSIFN-co가 시험된 모든 3가지 용량에서 인간 간세포암 세포의 성장을 억제하는데 있어서 활성이며 효과적이었음을 보여준다. 제21일 (D21)에서의 평균 RTV는 비히클 대조군의 경우 9.36 ± 3.9, MMC 처리군의 경우 5.05 ±2.1, 0.15 mg rSIFN-co-처리군의 경우 4.13 ± 1.9, 0.10 mg rSIFN-co-처리군의 경우 4.57 ± 2.3, 및 0.05 mg rSIFN-co-처리군의 경우 4.97 ± 1.7이었다. 제21일 (D21)에서의 % 억제는 MMC 처리군의 경우 47.18%, 0.15 mg rSIFN-co-처리군의 경우 56.80%, 0.10 mg rSIFN-co-처리군의 경우 52.20%, 및 0.05 mg rSIFN-co-처리군의 경우 48.10%였다. 각각의 처리군 및 비히클 대조군 사이의 RTV의 차이는 통계적으로 유의한 것으로 결정되었다.
도 1은 처리 시작 후 제3일, 제7일, 제10일, 제14일, 제17일 및 제21일에 이루어진 종양 측정을 반영하여, 각각의 처리군에 대해 21일 연구 기간에 걸쳐 RTV로 나타낸, 누드 마우스에서의 인간 간세포암, SMMC-7721의 성장의 진행을 보여준다. 결과는 제7일에 각각의 MMC-처리군 및 rSIFN-co-처리군에서 종양 성장이 지연되었으며, 제21일까지 유지되었음을 보여준다. 결과는 또한 rSIFN-co의 용량이 높을수록 억제가 커지는 경향을 보여준다.
시험 물품으로 처리된 모든 동물에서 시험된 투여량은 독성 징후 또는 체중 감소없이 잘 허용되었다. 비히클 군, MMC-처리군, 0.15 mg rSIFN-co-처리군, 0.10 mg rSIFN-co-처리군, 및 0.05 mg rSIFN-co-처리군에서의 동물의 평균 체중 (그램 단위)은 각각 제0일 (및 제21일)에: 22.7 (24.8); 23.9 (25.4); 23.7 (25.3); 24.3 (26.2); 및 22.6 (24.4)이었다.
실시예 2. 인간 자궁경부암에 대한 rSIFN-co의 활성.
본 연구는 모델로서 Hela 세포를 사용하여, 인간 자궁경부 종양의 치료에 대한 rSIFN-co의 활성 및 효능을 입증한다. 결과는 rSIFN-co가 인간 자궁경부암 세포의 성장을 억제하는데 있어서 활성이며 효과적이었음을 보여준다. 연구는 달리 특별히 지시한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 같이 수행하였다. 우선 인간 자궁경부암 이종이식편을, 5 x 106개 Hela 세포를 누드 마우스에 피하로 접종하고 잘-성장한 이종이식편을 누드 마우스에서 2회 계대접종함으로써, 실시예 1에서와 유사한 방식으로 확립시켜 준비하였다. 이어서, 동물에게 s.c. 이식하기 위해 1.5 mm3 단편을 준비하였다. 동물의 체중은 투여 시작시에 평균 19 ± 2 g이었다. 실시예 1과 대조적으로, 사용된 동물은 모두 암컷이었다. 각각의 처리군에 대한 용량 및 투여 요법은, MMC를 제0일에 처리를 시작한 후 제1일 및 제13일에 주사하고 연구를 처리 시작 후에 28일 기간에 걸쳐 지속하는 것을 제외하고는, 실시예 1에서와 유사하였다.
결과는 표 3 및 도 2에 제시된다. 표 3은 제0일 및 제28일에서의 계산된 평균 TV 뿐만 아니라 계산된 평균 RTV, T/C (%) 및 % 억제를 보여준다. 제28일 (D28)에서의 RTV는 비히클 대조군의 경우 12.45 ± 4.46, MMC 처리군의 경우 4.97 ± 1.85, 0.15 mg rSIFN-co-처리군의 경우 7.42 ± 1.91, 0.10 mg rSIFN-co-처리군의 경우 6.64 ± 2.04, 및 0.05 mg rSIFN-co-처리군의 경우 6.64 ± 1.60이었다. 제28일에서의 % 억제는 MMC 처리군의 경우 60.08%, 0.15 mg rSIFN-co-처리군의 경우 40.40%, 0.10 mg rSIFN-co-처리군의 경우 46.67%, 및 0.05 mg rSIFN-co-처리군의 경우 46.67%였다. MMC-처리군, 0.15 mg rSIFN-co-처리군, 0.10 mg rSIFN-co-처리군, 및 0.05 mg rSIFN-co-처리군에 해당하는 T/C (%)는 각각 39.92%, 59.60%, 53.33% 및 53.33%였다. 각각의 처리군과 비히클 대조군 사이의 RTV의 차이는 통계적으로 유의한 것으로 결정되었다. 결과는 rSIFN-co가 시험 동물에서 인간 자궁경부암의 성장을 억제하는데 있어서 효과적이었음을 보여주었다.
[표 3]
도 2는 처리 시작 후 제4일, 제7일, 제11일, 제14일, 제18일, 제21일, 제25일 및 제28일에 이루어진 종양 측정을 반영하여, 각각의 처리군에 대해 28일 연구 기간에 걸쳐 RTV의 진행을 보여준다. 결과는 제7일에 각각의 MMC-처리군 및 rSIFN-co-처리군에서 인간 자궁경부 종양 성장이 지연되었으며, 제28일까지 유지되었음을 보여주었다.
연구된 모든 동물에서 rSIFN-co 처리는 독성 징후 없이 허용되었다. 28일 처리 기간에 걸쳐 매우 적은 평균 체중 변화가 관찰되었다.
실시예 3. 인간 결장암에 대한 rSIFN-co의 활성.
본 연구는 모델로서 HT-29를 사용하여, 인간 결장암의 치료에 대한 rSIFN-co의 활성 및 효능을 입증하기 위해 수행하였다. 결과는 인간 결장암 세포의 성장을 억제하는데 있어서 rSIFN-co가 활성이며 효과적이었음을 보여주었다. 본 연구는 달리 특별히 지시한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 같이 수행하였다. 우선 인간 결장암 이종이식편을, 5 x 106개 HT-29 세포를 누드 마우스에 피하로 접종하고 잘-성장한 이종이식편을 누드 마우스에서 2회 계대접종함으로써, 실시예 1에서와 유사한 방식으로 확립시켜 준비하였다. 이어서, 시험 동물에게 s.c. 이식하기 위해 1.5 mm3 단편을 준비하였다. 동물의 체중은 투여 시작시에 평균 20 ± 2 g이었다. 실시예 1과 대조적으로, 본 연구에 사용된 동물은 모두 암컷이었다. 각각의 처리군에 대한 용량 및 투여 요법은, MMC를 제1일 및 제10일에 군 3에게 투여하고, 군 내의 각각의 마우스를 0.15 ml의 부피 및 0.15 mg/마우스 용량의 IFN알파-2b로, rSIFN-co-처리군에서와 같이 격일로 처리하고, 그러한 처리를 총 4주 동안 수행하는 추가의 군인 군 7을 부가하는 것을 제외하고는, 실시예 1에 제시된 바와 같다. 1.41 mg/ml 농도의 이러한 IFN-알파-2b는 후이양 라이프 사이언스 앤 테크놀로지 코포레이션으로부터 제공받았다. 결과는 표 4 및 도 3에 제시된다.
[표 4]
표 4는 제0일에서의 계산된 최초 평균 TV 및 제28일에서의 최종 평균 TV 뿐만 아니라 계산된 평균 RTV, T/C (%) 및 % 억제를 보여준다. 제28일 (D28)에서의 RTV는 비히클 대조군의 경우 8.41 ± 2.82, MMC 처리군의 경우 3.12 ± 1.19, 0.15 mg rSIFN-co-처리군의 경우 4.51 ± 1.25, 0.10 mg rSIFN-co-처리군의 경우 4.22 ± 0.87, 0.05 mg rSIFN-co-처리군의 경우 3.28 ± 1.25, 및 IFN알파-2b-처리군의 경우 6.26 ± 1.43이었다. 제28일에서의 % 억제는 MMC 처리군의 경우 62.9%, 0.15 mg rSIFN-co-처리군의 경우 46.37%, 0.10 mg rSIFN-co-처리군의 경우 49.82%, 0.05 mg rSIFN-co-처리군의 경우 61%, 및 IFN알파-2b-처리군의 경우 25.56%였다. MMC-처리군, 0.15 mg rSIFN-co-처리군, 0.10 mg rSIFN-co-처리군, 0.05 mg rSIFN-co-처리군, 및 IFN알파-2b-처리군에 해당하는 T/C (%)는 각각 37.10%, 53.63%, 50.18%, 39.00% 및 74.44%였다. 결과는 rSIFN-co가 인간 결장암 세포의 성장을 억제하는데 있어서 IFN알파-2b보다 더 효과적이었음을 보여주었다. 각각의 처리군 및 비히클 대조군 사이의 RTV의 차이는 통계적으로 유의한 것으로 결정되었다.
도 3은 처리 시작 후 제3일, 제7일, 제10일, 제14일, 제17일, 제21일, 제24일 및 제28일에 이루어진 종양 측정을 반영하여, 각각의 처리군에 대해 28일 연구 기간에 걸쳐 RTV로 나타낸, 인간 결장 종양의 성장의 억제를 보여준다. 결과는 제7일에 각각의 MMC-처리군 및 rSIFN-co-처리군에서 인간 결장 종양 성장이 지연되었으며, 제28일까지 유지되었음을 보여주었다. 3가지 용량의 rSIFN-co는 각각 종양 성장을 IFN알파-2b보다 더 억제하였다.
실시예 1 및 2에서와 같이, 모든 rSIFN-co-처리된 동물에서 시험된 투여량이 허용되었고, 약물 독성 징후는 나타나지 않았으며 최소의 체중 변화가 나타났다.
실시예 4. 인간 폐암에 대한 rSIFN-co의 활성.
본 연구는 모델로서 SPC-A4를 사용하여, 인간 폐암의 치료에 대한 rSIFN-co의 활성 및 효능을 입증하기 위해 수행하였다. 결과는 rSIFN-co에 의한 인간 폐 종양 성장의 유의한 억제, 및 rSIFN-co가 IFN알파-2b보다 훨씬 더 효과적이었음을 보여주었다. 연구는 달리 특별히 지시한 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 수행하였다. 우선 시험 동물에게 주사하기 위한 인간 이종이식편을, 2.5 x 106개 SPC-A4 세포를 누드 마우스에 피하로 (s.c.) 접종하고 잘-성장한 종양을 누드 마우스에서 2회 계대접종함으로써, 실시예 1에서와 유사한 방식으로 확립시켜 준비하였다. 이어서, 시험 동물에게 s.c. 이식하기 위해 1.5 mm3 단편을 사용하였다. 동물의 체중은 투여 시작시에 평균 22 ± 2 g이었다. 실시예 3과 대조적으로, 본 연구에 사용된 동물은 모두 수컷이었고, 연구는 21일 처리 기간에 걸쳐 수행하였다. 각각의 처리군에 대한 용량 및 투여 요법은, MMC를 제1일 및 제6일에 군 3에게 투여하는 것을 제외하고는, 실시예 3에 제시된 바와 같다. 결과는 표 5 및 도 4에 제시된다.
[표 5]
도 4는 처리 시작 후 제4일, 제7일, 제11일, 제14일, 제18일, 및 제21일에 이루어진 종양 측정을 반영하여, 각각의 처리군에 대해 21일 연구 기간에 걸쳐 RTV로 나타낸, 누드 마우스에서의 인간 폐 종양의 성장의 억제를 보여준다. 결과는 제7일에 각각의 MMC-처리군 및 rSIFN-co-처리군에서 종양 성장이 지연되었으며, 연구가 종료되는 제21일까지 유지되었음을 보여주었다. IFN알파-2b 처리군에서는 종양 억제가 제11일까지 보이지 않았다. IFN알파-2b에 의한 종양 성장의 억제는 어떠한 rSIFN-co-처리군에 의한 것보다도 적었으며, 통계적으로 유의하지 않았다 (p>0.05). 따라서, rSIFN-co는 인간 폐암 세포의 성장을 억제하는데 있어서 IFN알파-2b보다 더 효과적이었다.
실시예 1 - 3에서와 같이, 모든 동물에서 시험 물품의 시험된 투여량이 허용되었고, 독성 징후 또는 체중 감소가 관찰되지 않았으나, 예외적으로 0.05 mg rSIFN-co-처리군의 1마리의 마우스가 알려지지 않은 이유로 제17일에 사망하였다.
실시예 5. rSIFN-co는 다양한 인간 고형 암 세포의 생존율을 감소시켰다.
세포 배양 및 시약. 인간 폐암 세포주 (A549, H1299, H460, Calu-1), 인간 간암 세포주 (SMMC-7721, Huh-7, CL-1), 인간 자궁경부 암종 세포주 (Hela), 인간 유방암 세포주 (MDA-MB-231), 인간 췌장암 세포주 (PANC-1) 및 인간 결장암 세포주 (SW620, HT29, SW480)를 상하이 셀 콜렉션 (중국 상하이)으로부터 구입하였다. 상기 세포주를, 4 mM 글루타민, 50 U/ml 페니실린 및 50 mg/ml 스트렙토마이신이 보충되고 10% 열-불활성화 소 태아 혈청 (바이오크롬(Biochrom), 독일)이 포함된, 상하이 셀 콜렉션에서 만든 해당하는 완전 성장 배지 중에서 5% CO2 하에 37℃에서 배양하였다. 완전 성장 배지는 A549의 경우 F-12K (로트 # GNM21127; 항저우 지노 바이오-메디칼 테크놀로지 리미티드(Hangzhou Gino Bio-Medical Technology Ltd.)); SW620 및 MDA-MB-231의 경우 L-15 (로트 # 41300-039, 깁코(GIBCO)); SMMC-7721, Hela, Huh-7, CL-1, 및 PANC-1의 경우 DMEM (로트 # C11995, 깁코); H460, H1299, 및 SW480의 경우 RMPI-1640 (로트 # C11875, 깁코); HT-29의 경우 Macro5a (로트 # M4892, 시그마(Sigma)); 및 Calu-1의 경우 DMEM+10%FBS였다.
웰당 100 μl 완전 배지 중 약 5 x 103개 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 밤새 인큐베이션하고, 이어서 각각 100 μg/ml, 50 μg/ml, 25 μg/ml, 12.5 μg/ml, 6.25 μg/ml, 3.13 μg/ml, 1.56 μg/ml, 0.78 μg/ml, 0.39 μg/ml, 및 0.20 μg/ml의 농도의 IFNα-2b 또는 rSIFN-co로 약 48시간 동안 처리하고, 이 시점에 세포를 분석을 위해 수거하였다. 세포 생존율을 선바이오 에이엠-블루(SunBio Am-Blue) 검정 키트 (Cat#: SBAB8025, 상하이 SBO 메디칼 바이오테크놀로지 캄파니, 리미티드(Shanghai SBO Medical Biotechnology Co., Ltd), 중국 상하이)로 평가하였다. 그의 프로토콜에 따라, 10 μl 에이엠-블루를 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 세포를 5% CO2 하에 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 30초 동안 진탕시킨 후에, 각각의 웰에 대한 흡광도를 써모 사이언티픽 마이크로플레이트 판독기 (써모 피셔 사이언티픽, 인크.(Thermo Fisher Scientific, Inc.), 매사추세츠주 로웰)로 570 nm 및 595 nm 둘 다에서 판독하였다. 상대 세포 생존율을 다음과 같이 계산하였다: 세포 생존율 = (처리군(OD570 - OD595) 마이너스 블랭크(OD570 - OD595))/(대조군(OD570 - OD595) 마이너스 블랭크(OD570 - OD595)) x 100% (여기서, 대조군은 해당 비처리 세포이다). 결과는 도 5에 제시되며, 여기서 종양 세포의 생존율은 비처리 대조군 세포 대비 백분율로서 표현하였다. 각각의 데이터 점은 적어도 2회의 독립적 실험의 평균을 나타낸다.
도 5는 암 세포의 생존율을 감소시킴에 있어서, rSIFN-co 또는 IFNα-2b로 처리된 각각의 암 세포주, (A) 내지 (I)에 대한 용량 반응 곡선을 보여준다. (A) A549 세포; (B) Hela 세포; (C) CL-1 세포; (D) Huh-7 세포; (E) SW480 세포; (F) MDA-MB-231 세포; (G) Calu-1 세포; (H) SMMC-7721 세포; (I) PANC-1 세포.
결과는 IFNα-2b가 심지어는 시험된 최고 농도 (100 μg/ml)에서도 A549 세포, Hela 세포, CL-1 세포, SW480 세포, 및 SMMC-7721 세포의 생존율을 감소시키는데 있어서 그 효과가 전혀 없거나 또는 매우 적다는 것을 보여주었다. 100 mcg/ml (μg/ml)의 IFNα-2b를 사용하여 Huh-7 세포, MDA-MB-231 세포, Calu-1 세포, 및 PANC-1 세포를 처리한 경우에 생존율의 50% 미만의 감소가 보였다. 대조적으로, rSIFN-co는 종양 세포 생존율을 훨씬 더 낮은 용량에서 용량 의존성 방식으로 감소시킬 수 있었으며, SW480 세포, MDA-MB-231 세포, 및 PANC-1 세포의 경우 6.25 μg/ml 내지 12.5 μg/ml의 농도에서, A549 세포, Hela 세포, CL-1 세포, Huh-7 세포, Calu-1 세포, 및 SMMC-7721 세포의 경우 12.5 μg/ml 내지 25 μg/ml의 농도에서 세포 생존율이 거의 50% 감소하였다. 일반적으로, 세포 생존율을 감소시키는데 있어서 rSIFN-co에 대한 IC50은 상이한 암 세포에 대해 약 10 mcg/ml 내지 18 mcg/ml 범위였다. 100 mcg/ml의 rSIFN-co에서, 세포 생존율은 어떠한 암 세포주에서도 검출할 수 없었다. 따라서, rSIFN-co는 종양 세포 생존율을 감소시키는데 있어서 각각의 시험된 농도에서 IFN알파-2b보다 더 효과적이었다.
실시예 6A. rSIFN-co는 세포 생존율을 감소시키는데 있어서 IFN알파-2b보다 더 효과적이었다.
rSIFN-co가 세포 생존율을 감소시키는 능력을 입증하기 위해, A549 및 SW620 종양 세포를 각각 웰당 100 μl의 완전 배지 중 2 x 103개로 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 1-6일 동안 각각 10 μg/ml의 rSIFN-co 또는 IFN알파-2b로 처리하였다. 세포 생존율을 표준 MTT 검정 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 검정, 시그마, 미주리주 세인트 루이스]에서 평가하였다. 검정을 위해, 약 20 μl MTT (4 mg/ml)를 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 각각의 웰의 상청액을 조심스럽게 따라내고, 이어서 동등 부피 (150 마이크로리터)의 디메틸 술폭시드 (DMSO)를 각각의 웰에 첨가하고, 진탕기 상에서 15분 동안 철저하게 혼합하였다. 플레이트로부터 흡광도를 써모 사이언티픽 마이크로플레이트 판독기 (써모 피셔 사이언티픽 인크., 매사추세츠주 로웰)로 595 nm에서 판독하였다. 상대 세포 생존율을 다음과 같이 계산하였다: 세포 생존율 = (처리군(OD595) 마이너스 블랭크(OD595))/(대조군(OD595) 마이너스 블랭크(OD595)) x 100%.
결과는 비처리 대조군 세포 대비 백분율로서 표현된다. 각각의 데이터 점은 적어도 두번 (2회)의 독립적 실험의 평균을 나타낸다. 도 6에 제시된 바와 같이, rSIFN-co는, 존재한다 하더라도 매우 적은 시간-의존성 효과는 나타내는 IFN알파-2b와는 대조적으로, SW620 세포의 세포 생존율을 시간-의존성 방식으로 강하게 감소시켰다. rSIFN-co의 시간 의존성 효과는 또한 A549 세포의 경우 단지 처리시 처음 약 3일 동안에만 뚜렷하였다. 각각의 세포주에 대한 각각의 시점에서의 rSIFN-co 및 IFN알파-2b 사이의 효과의 차이는 통계적으로 유의하였다 (p<0.01). 이들 데이터는 시간-의존성 방식의 rSIFN-co의 강한 항종양 효과를 보여주었다.
실시예 6B. rSIFN-co는 생체내에서 종양 성장을 억제하였다.
본 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 가이드에 따라 수행하였다. 4-5주령의 암컷 BALB/c 누드 마우스를 상하이 실험 동물 센터(Shanghai Experimental Animal Center) (중국 상하이)로부터 입수하였다. 약 5 x 106개 A549 세포를 각각의 마우스에 피하로 주사하여 이종이식 종양을 확립시켰다. 동물을 무작위로 세(3)개의 군으로 분류하고 (군당 8마리 마우스), PBS (1 X PBS, pH 7.2-7.4), rSIFN-co (마우스당 100 μg/100 μl) 또는 IFNα-2b (또한 마우스당 100 μg/100 μl)로 종양내로 처리하였다 (격일로 12회). 종양을 삼(3)일마다 측정하고, 종양 부피를 다음과 같이 계산하였다: 종양 부피 (mm3) = (길이 x 폭2)/2. 결과는 도 16에 제시된다. 데이터는 평균 ± SD (n = 8)로서 제시된다. 결과는 rSIFN-co가 PBS-처리군과 비교하여 확립된 종양의 성장을 거의 완전히 억제할 수 있었음을 입증한다 (p<0.0001). 그러나, IFNα-2b는 종양 성장의 주목할만한 억제를 나타내지 못하였다. 결과는 rSIFN-co가 생체내에서 종양 성장을 억제하는데 있어서 IFNα-2b보다 더 효과적이었음을 나타내었다.
실시예 6C. rSIFN-co는 3차원 배양 시스템에서 종양 세포에 의한 콜로니 형성 및 침습적 발 형성 (위족 형성)을 억제하였다.
매트리겔 (BD 코포레이션(BD Corporation), Cat#: 356234)을 4℃ 냉장고에서 밤새 얼음 상에서 해동시키고, 24-웰 플레이트를 -20℃에서 밤새 동결시켰다. 그 후에, 동결된 24-웰 플레이트의 각각의 웰을 150 μl의 매트리겔을 사용하여 1.0 mg/ml로 코팅하였다. 이어서, 매트리겔 코팅된 플레이트를 37℃에서 20-30분 동안 인큐베이션하였다. 폐암 세포인 A549를 트립신처리하고, 계수하였다. 2% 매트리겔, 및 10 mcg/ml의 IFN알파-2b 또는 rSIFN-co 함유, 또는 인터페론-무함유 (대조군) 조건화 배지 중 약 5 x 103개 세포를 매트리겔 코팅된 웰 상에 시딩하였다. 세포를 37℃에서 적어도 약 8일 동안 인큐베이션하였다. 약 200 μl의 상기 조건화 배지를 3일마다 첨가하여 배지가 마르지 않도록 하였다. 제4일 또는 제8일에, 사진을 촬영하여 콜로니 크기 및 침습적 발 (위족) 형성을 관찰하였다. 실험을 3중으로 수행하였다.
결과는 도 7에 제시된다. 4일 후에, rSIFN-co 처리군 (도 7C)은 비처리군 (도 7A)보다 작은 콜로니를 갖는 것으로 밝혀졌다. 8일 후에, rSIFN-co-처리군은 3개의 군 중에서 가장 작은 콜로니를 가질 뿐만 아니라, 세포 주변에 돌출된 위족이 거의 없는 것으로 밝혀진 반면 (도 7C, 2행 및 3행), 비처리군 (도 7A, 2행 및 3행) 및 IFN알파-2b 처리군 (도 7B, 2행 및 3행)의 세포에서는 위족 형성이 분명하였다. 이러한 실험은 rSIFN-co가 암 세포 콜로니의 성장을 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 전이에 필수적인 특색인 암 세포에서의 침습적 발 형성을 억제할 수 있었음을 보여준다.
실시예 7. rSIFN-co에 의한 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제.
베타-카테닌/TCF 전사 리포터 검정. Wnt/베타-카테닌 신호전달에 대한 rSIFN-co의 효과를 시험관내에서 결정하였다. 암 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 (웰당 1x104개 세포), 12시간 동안 인큐베이션하고, 그 후에 이들을 100 ng 탑플래쉬 (밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation), 미국 매사추세츠주 빌러리카)로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 효율을 정규화하기 위해, 세포를 SV40 프로모터인 pRL-SV40 (프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨) 하에 구동되는 내부 대조군 리포터 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis) 루시페라제 1 ng과 공동-형질감염시키고, 이어서 6시간 동안 형질감염 후에 10 mcg/ml 인터페론, rSIFN-co 또는 IFN알파-2b로 처리하거나 또는 대조군 (모의)으로서 처리하지 않고 두었다. 24시간 동안 인터페론 처리 후에, 2중 루시페라제 검정 시스템 키트를 제조업체의 프로토콜 (Cat# :E1960, 프로메가)에 따라 사용하여 루시페라제 검정을 수행하였다. 상대 루시페라제 활성을 반딧불이/레닐라 루시페라제 활성의 비로 보고하였다. 실험을 3중으로 수행하였다.
도 8에 제시된 결과는 rSIFN-co가 인간 고형 암 세포에서 베타-카테닌/TCF 매개 전사 활성을 감소시켰음을 나타내었다. 24시간 동안 처리 후에, 베타-카테닌/TCF-매개 전사 활성은 3가지 폐암 세포 (A549, H1299, H460) 및 2가지 결장암 세포 (HT-29, SW620)에서 rSIFN-co에 의해 유의하게 억제되었다 (*, p<0.05, **, p<0.01). 그러나, A549 세포, H1299 세포, H460 세포 및 HT-29 세포에서 IFN알파-2b의 억제 효과는 나타나지 않았고, 억제 대신 증대를 초래하였다.
간략하게, 대조군, IFN알파-2b-처리군 및 rSIFN-co-처리군에 대한 반딧불이/레닐라 비는 각각 (A) A549 세포의 경우: 약 310, 약 350, 및 약 100; (B) H1299 세포의 경우: 약 800, 약 1000, 및 약 500; (C) H460 세포의 경우: 약 450, 약 500, 및 약 280; (D) HT-29 세포의 경우: 약 300, 약 600, 및 약 200; (E) SW620 세포의 경우: 약 1500, 약 1200, 및 약 100 미만이었다. 본 연구는 rSIFN-co가 Wnt/TCF 신호전달의 억제, 및 그에 따른 그의 항종양 효과에 있어서 IFNα-2b보다 우수하였음을 보여준다.
실시예 8. rSIFN-co는 암 세포에서 베타-카테닌 단백질 수준을 감소시켰다.
암 세포인 A549 및 Sw480을 약 85% 전면생장률까지 배양하고, 6웰 플레이트에 넣었다. 세포를 각각 24시간, 48시간, 또는 72시간 동안 10 mcg/ml IFNα-2b 또는 rSIFN-co로 처리하거나 또는 대조군 (모의)으로서 처리하지 않고 두었다. 처리 후에, 세포를 수거하여, 내인성 로딩 대조군으로서의 GAPDH와 함께 그의 특이적 항체를 사용하는 웨스턴 블롯을 수행함으로써 베타-카테닌 단백질 수준을 검출하였다. 실험을 3중으로 수행하였다.
웨스턴 블롯 분석. 다양한 단백질의 발현을 결정하기 위해, 세포를 플레이트로부터 수거하고, 추출 시약 (Cat#: P0013)을 제조업체의 프로토콜 (베이오타임(Beyotime), 중국)에 따라 사용하여 총 세포 단백질을 추출하였다. 총 단백질 농도를 로우리(Lowry) 단백질 검정 키트 (바이오-라드(Bio-Rad), 미국)로 결정하였다. 총 단백질을 소듐 도데실술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 10% - 12% 겔 상에서 분리하고, 0.22 또는 0.45 μm PVDF 막 (밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠주 빌러리카)에 전사시켰다. 막을 5% 탈지유, 소 혈청 알부민, 10 mmol/L 트리스-HCl (pH 8.0), 150 mmol/L NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 밤새 4℃에서 차단시켰다. 이어서, 차단된 막을 1차 항체와 인큐베이션한 후에 (1:1000 희석), 2차 HRP-접합 항체와 인큐베이션하였다. 블롯을 슈퍼 시그널 웨스트 피코(super signal west pico) 화학발광 기질 키트 (써모 사이언티픽, 미국)와 발광/형광 영상화 LAS4000 시스템 (지이 헬스케어 라이프 사이언시스, 미국)을 사용하여 시각화하였다.
이러한 결정을 위해, 사용된 1차 항체는 마우스 모노클로날 항-베타-카테닌 항체 (1:1000; 산타 크루즈 테크놀로지, 캘리포니아주 산타 크루즈) 및 마우스 모노클로날 항-GAPDH 항체 (1:2000) (캉웨이 바이오테크놀로지(Kangwei Biotechnology), 중국)였다. 항-마우스 HRP-접합 2차 항체 (산타 크루즈 테크놀로지, 캘리포니아주 산타 크루즈)를 1:2000의 농도로 사용하였다. 도 10에 제시된 결과는, A549 세포와 관련하여, rSIFN-co가 2일 (48시간) 동안 처리 후에 베타-카테닌 단백질 수준을 현저하게 감소시켰음을 입증한다. 이들 세포에서, 3일 (72시간) 동안 처리 후에 추가 감소가 관찰되었다. SW480 세포에서의 베타-카테닌 단백질 수준의 감소는 rSIFN-co로의 72시간 처리 후에 분명하였다. 베타-카테닌의 하향-조절은 폐암 A549 세포 및 결장암 SW480 세포 둘 다에서 뚜렷하게 시간 의존성이었다. 대조적으로, IFN알파-2b는 베타-카테닌 수준의 어떠한 뚜렷한 감소도 유발하지 않았으며, 이는 이것이 베타-카테닌의 하향-조절에 영향을 미치지 않았음을 시사한다.
실시예 9. rSIFN-co는 Wnt 경로 매개 표적 유전자의 전사 하향-조절을 유도하였다.
폐암 A549 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하고, 각각 10 μg/ml의 IFN알파-2b 또는 rSIFN-co로 처리하거나 또는 대조군 (모의)으로서 처리하지 않고 두었다. 24시간 처리 후에, 트리졸 시약을 사용하여 총 세포 mRNA를 단리하고, cDNA를 합성하고, 4가지 Wnt 신호전달 하류 유전자인 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2의 특이적 프라이머를 사용하여 qPCR에 추가로 적용하였다. 실험을 3중으로 수행하고, 모의 군을 사용하여 정규화하였다.
정량적 PCR (qPCR) 분석. 트리졸 시약 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)을 제조업체의 지침에 따라 사용하여 총 mRNA를 단리하였다. RT-PCR 키트 (Cat#: FSQ-101, 토요보, 일본)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 상보적 DNA (cDNA)를 합성하고, 이어서 SYBR 그린 PCR 키트 (Cat#: QPK-201, 토요보, 일본)를 사용하여 qPCR에 적용하였다. 4가지 Wnt 경로 표적 유전자의 프라이머는 다음과 같았다: Axin2 센스 프라이머: 5'-CGTGGATACCTTAGACTT-3' (서열 8) 및 안티센스 프라이머: 5'-GCTGTTGTTCTCAATGTA-3' (서열 9); CD24 센스 프라이머: 5'-TGAAGAACATGTGAGAGGTTTGAC-3' (서열 10) 및 안티센스 프라이머: 5'-GAAAACTGAATCTCCATTCCACAA-3' (서열 11）; 서바이빈 센스 프라이머: 5'-ACCGCATCTCTACATTCAAG-3' (서열 12) 및 안티센스 프라이머: 5'-CAAGTCTGGCTCGTTCTC-3' (서열 13) 및 ID2 센스 프라이머: 5'-CACAACAACAACAACAAC-3' (서열 14) 및 안티센스 프라이머: 5'-CACAGTCCAAGTAAGAGA-3' (서열 15).
증폭 프로토콜은 1분 동안 95℃, 40 사이클 (15초 동안 95℃, 15초 동안 60℃, 30초 동안 72℃) 인큐베이션으로 이루어졌다. PCR 생성물로의 SYBR 그린 염료의 혼입을 바이오-라드 검출 시스템을 사용하여 실시간으로 모니터링하고, 이후에 바이오-라드 CFX 매니저 2.1 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 샘플을 각각의 조건에 대해 풀링하고, 2중으로 실행하였다. 처리된 샘플을 2-△△Ct 방법을 사용하여 모의 군과 비교하고, 배수 변화로서 플롯팅하였다. GAPDH를 정규화 대조군으로서 사용하였다.
도 11에 제시된 결과는 rSIFN-co가 Wnt 경로 매개 표적 유전자인 Axin2, CD24, 서바이빈, 및 ID2의 하향-조절을 유도하였음을 입증한다. 이들 유전자의 mRNA 수준은 rSIFN-co 처리 후에 유의하게 감소하였으나, 인터페론 IFN알파-2b 처리 후에는 그렇지 않았다.
간략하게, 모의 대조군에 대한 상대 발현 수준을 1로 설정하였을 때, Axin2 유전자의 경우 (도 11A), IFN알파-2b 처리는 1을 약간 넘어서는 수준을 생성한 반면, rSIFN-co 처리는 약 0.4의 수준을 생성하였다 (p<0.0001, rSIFN-co 처리를 비처리와 비교함). 각각 모의 비처리 세포, IFN알파-2b-처리 세포 및 rSIFN-co-처리 세포에 해당하는 수준은 CD24 유전자의 경우 (도 11B)에 각각 1, 약 0.9 및 약 0.4이고 (p<0.0001); 서바이빈 유전자의 경우 (도 11C)에 각각 1, 약 0.9, 및 약 0.4이고 (p<0.0005); ID2 유전자의 경우 (도 11D)에 각각 1, 약 1, 및 약 0.4이다 (p<0.0001).
실시예 10. rSIFN-co는 여러 세포에서 Wnt-관련 수용체 또는 보조-수용체 LRP6/FZD6 mRNA 수준을 하향-조절할 수 있었다.
rSIFN-co에 의한 LRP6/FZD6의 조절을 연구하였다. 이는 실시예 9에서 수행된 바와 같은 qPCR에 의해 수행하였다. 암 세포인 A549, H460, SW620 및 HT-29를 6-웰 플레이트에 시딩하고, 10 μg/ml IFN알파-2b 또는 rSIFN-co로 처리하거나 또는 대조군 (모의)으로서 처리하지 않고 두었다. 24시간 처리 후에, 트리졸 시약을 사용하여 총 세포 mRNA를 단리하고, cDNA를 LRP6 및 FZD6의 특이적 프라이머를 사용하여 qPCR에 적용하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같았다: LRP6 센스 프라이머: 5'-TGAAGAACCAGCACCACAGG-3' (서열 4) 및 안티센스 프라이머: 5'-CATAACCAAGAGGCACAGAAGC-3' (서열 5), 및 FZD6 센스 프라이머: 5'-GCGGAGTGAAGGAAGGATTAGTC-3' (서열 6) 및 안티센스 프라이머: 5'-TGAACAAGCAGAGATGTGGAACC-3' (서열 7). 실험을 3중으로 수행하고, 모의 대조군을 사용하여 정규화하였다. 결과를 GAPDH 대비 LRP6 또는 FZD6의 상대 mRNA 수준으로 기록하였다.
도 9에 제시된 결과는 LRP6 및 FZD6이 둘 다 4가지 암 세포주에서 rSIFN-co에 의해 다양한 정도로 하향-조절되었다는 것을 나타내었다. 도 9A는 A549 세포 (p<0.005), SW620 세포 (p<0.005) 및 HT-29 세포 (p<0.005)에서의 rSIFN-co 처리 후의 LRP6 mRNA의 상대 발현의 유의한 감소를 보여주나, IFN알파-2b 처리시에는 유의한 감소가 보이지 않았다. 도 9B는 모든 4가지 세포주, A549 (p<0.001), H460 (p<0.0005), SW620 (p<0.001), 및 HT-29 (p<0.0005)에서의 rSIFN-co로의 처리 후의 FZD6 mRNA의 상대 발현의 유의한 감소를 보여준다. 다른 인터페론인 IFN알파-2b는 HT-29 세포에서 FZD6 mRNA 발현의 증대를 유발하였으나, A549 세포, H460 세포 및 SW620 세포에서는 rSIFN-co와 동일한 정도는 아니더라도 FZD6 mRNA 발현의 약간의 감소를 유도하였다. 결과는 rSIFN-co에 의한 Wnt 신호전달 경로의 억제가 Wnt 관련 세포 표면 수용체 LRP6 및 FZD6의 발현의 억제로부터 발생하였을 수 있음을 나타낸다. rSIFN-co는, 베타-카테닌/TCF-매개 전사 활성 및 베타-카테닌 단백질 수준 뿐만 아니라 Wnt 신호전달 경로 관련 수용체, 보조-수용체 및 표적 유전자의 하향-조절을 포함한, 시험된 인간 암 세포, 예컨대 인간 폐암 및 인간 결장암 세포에서의 Wnt 경로의 억제에 있어서, 인터페론 IFNa-2b보다 우수한 것으로 밝혀졌다.
실시예 11. rSIFN-co는 종양 억제 유전자의 발현을 상향-조절하였다.
종양 억제 유전자의 상향-조절에 대한 rSIFN-co의 효과가 본 연구에서 입증되었다. 암 세포인 A549, H460, SW620 및 HT-29를 6-웰 플레이트에 시딩하고, 10 mcg/ml의 IFN알파-2b 또는 rSIFN-co로 처리하거나 또는 모의 대조군으로서 처리하지 않고 두었다. 24시간 처리 후에, 트리졸 시약을 사용하여 총 세포 mRNA를 단리하고, cDNA를 합성하고, DKK3, KLF4 및 BATF2에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 qPRC에 추가로 적용하였다. 하기 프라이머가 사용되었다: BATF2의 경우, 센스 프라이머: 5'-CAGAGCAGGGAGCACAAACC-3' (서열 16) 및 안티센스 프라이머: 5'-TGAGCAGAGGAGAGCAGAGG-3' (서열 17); DKK3의 경우, 센스 프라이머: 5'-GGAGCCTGACTGAAGAGATGG-3' (서열 18) 및 안티센스 프라이머: 5'-ACGCCTAAAGCACACACCTG-3' (서열 19); KLF4의 경우, 센스 프라이머: 5'-CCTTCAACCTGGCGGACATCAAC-3' (서열 20) 및 안티센스 프라이머: 5'-GGCTGCTGCGGCGGAATG-3' (서열 21).
실험을 3중으로 수행하고, 모의 대조군을 사용하여 정규화하였다. 도 12에 제시된 결과는 GAPDH에 대해 상대 mRNA 발현 수준으로 표현하였다. A549 세포의 경우, rSIFN-co로의 처리는 모든 3가지 종양 억제 유전자인 DKK-3 (도 12A), BATF2 (도 12B), 및 KLF4 (도 12C)의 발현을 현저하게 증가시켰으며, IFN알파-2b보다 훨씬 더 효과적이었다. SW620 세포에서, rSIFN-co 처리 후에 KLF4 발현의 상향-조절이 또한 대조군 및 IFN알파-2b 처리와 비교하여 현저하게 증가하였다. IFN알파-2b 처리는 H460 세포에서 DKK-3 발현을 현저하게 증대시켰다.
실시예 12. rSIFN-co는 암 세포 이동을 억제하였다.
rSIFN-co가 종양 세포 이동을 억제하는 능력은, 비처리 대조군 (모의)과 비교하여 폐암 A549 세포 및 결장암 SW620 세포가 IFN알파-2b 또는 rSIFN-co로 24시간 동안 처리한 후에 미세다공성 막을 가로질러 이동하는 능력을 결정함으로써 입증되었다. 세포 이동 검정을 24-웰 플레이트 (벡톤-디킨슨 바이오사이언시스, 미국 뉴저지주)에서 8 μm 세포 배양 삽입물을 사용하여 수행하였다. FBS를 함유하지 않는 따뜻한 (37℃) 비카르보네이트 기재 배양 배지를 삽입물의 내부에 또는 웰의 바닥에 첨가하고, 5% CO2 하의 37℃의 습윤화된 조직 배양 인큐베이터에서 2시간 동안 재수화시켰다. 재수화 후에, 배양 배지를 조심스럽게 제거하였다. 이후에, FBS-무함유 배지 중에 현탁된 (10 μg/ml의 IFN알파-2b 또는 10 μg/ml의 rSIFN-co로의 처리 후의, 또는 전혀 처리된 적이 없는) 준비된 세포 500 μl를 삽입물 필터의 상부에 0.5 x 104개 세포/삽입물의 밀도로 시딩하였다. 24-웰 플레이트의 하부 구획에 10% FBS를 함유하는 완전 배지 500 μl를 넣었다. 정규 배양 조건 하에 37℃에서 24시간 후에, 챔버 막의 상부에 있는 비-이동된 세포를 면봉으로 제거하였다. 배양 삽입물의 하부를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 2% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 세포가 올려진 곳으로부터 챔버 막의 반대편 상에서 이동된 세포의 수를 3중 웰 각각에서 계수하였다. 각각의 실험을 적어도 2회 반복하였고, 매회마다 3중 웰에서 수행하였다.
도 13에 제시된 결과는 각각의 모의, IFN알파-2b-처리 세포, 및 rSIFN-co-처리 세포에 대하여 필드당 이동 세포의 평균 수를 보여주었다. 막을 가로질러 이동한 A549 세포의 경우, 필드당 약 30개의 세포가 비처리 모의 군에서 관찰되었고, 약 110개 세포가 IFN알파-2b 군에서 보이고, 약 10개 세포가 rSIFN-co-처리군에서 보였다. IFN알파-2b 처리에 의해 유발된 이동 증대 및 rSIFN-co 처리에 의해 유발된 이동 억제는 통계적으로 유의하였다 (p<0.01). rSIFN-co에 의한 유의한 억제가 또한 SW620 세포에서 관찰되었다. 대조적으로, IFN알파-2b 처리는 SW620 세포에서 종양 세포 이동을 증대시켰다. 따라서, rSIFN-co는 종양 세포 이동을 억제하는데 효과적이었으며, IFN알파-2b보다 훨씬 더 효과적이었다.
실시예 13. rSIFN-co는 아폽토시스 경로를 통해 그의 효과를 발휘하지 않았다.
본 연구는 rSIFN-co가 아폽토시스 이외의 경로에 의해 종양 세포의 생존율을 감소시키는데 그의 효과를 발휘한다는 것을 보여주기 위해 수행하였다. 종양 세포인 A549 및 SW620을 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, 밤새 인큐베이션하고, 이어서 24시간 또는 48시간 동안 10 mcg/ml의 IFN알파-2b, 또는 10 mcg/ml의 rSIFN-co 또는 5FU로 처리하거나 또는 (모의 대조군으로서) 처리하지 않고 두었다. 그 후에, 아폽토시스-관련 분자 마커를 웨스턴 블롯에 의해 모니터링하였다. 사용된 1차 항체는 마우스 모노클로날 항-베타-튜불린 (1:2000, Cat#: CW0098A) 및 마우스 모노클로날 항-GAPDH (1:2000, Cat#: CW0100A) (캉웨이 바이오테크놀로지, 중국); 마우스 모노클로날 항-PARP (1:1000, Cat#: sc-2007, 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인크.); 토끼 모노클로날 항-프로카스파제 3 (1:1000, Cat#: 9665), 및 토끼 폴리클로날 항-절단된 카스파제 3 (1:1000, Cat#: 9661) (셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology), 미국); 염소 폴리클로날 항-프로카스파제 8 (1:1000, Cat#: sc-6136, 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인크); 토끼 모노클로날 항-절단된 카스파제 8 (1:1000, Cat#: 9496) (셀 시그널링 테크놀로지, 미국)이었다.
결과는 A549 세포의 경우 도 14A에, SW620 세포의 경우 도 14B에 제시된다. 웨스턴 블롯은, 아폽토시스를 유발하는 것으로 알려져 있는 약물인 5FU로의 처리 후에, 세포가 프로카스파제-3, 프로카스파제-8 및 PARP의 수준의 유의한 감소를 나타내었으나, 절단된 카스파제-3 및 절단된 카스파제-8의 증대된 수준을 나타내었음을 보여주었다. 대조적으로, 인터페론, IFN알파-2b 또는 rSIFN-co 중 어떠한 것도, 프로카스파제-3 또는 프로카스파제-8 또는 PARP의 수준의 어떠한 감소도 유발하지 않거나, 또는 절단된 카스파제-3 또는 절단된 카스파제-8의 수준의 어떠한 증대도 유도하지 않았다. 따라서, 결과는 2가지 인터페론, 특히 rSIFN-co가 아폽토시스를 통하는 것과 상이한 메카니즘에 의해 종양 세포 생존율의 감소를 유발하였을 수 있음을 나타내었다.
실시예 14. rSIFN-co는 STAT 인산화를 유도하였다.
본 실험은 rSIFN-co가 꼭 IFN알파-2b와 같이 JAK/STAT 신호전달 경로를 사용한다는 것을 밝히기 위해 수행하였다. 본 연구에서, A549 세포 및 Hela 세포를 3.3 cm 접시에 각각 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하고, 이어서 10 μg/ml의 IFN알파-2b 또는 rSIFN-co로 각각 0, 5, 15, 30, 60, 120 및 240분 동안 처리하였다. 처리 후에, 세포를 수집하고, 세포 단백질을 추출하고, 웨스턴 블롯 분석을 위해 SDS-PAGE 아가로스 상에 로딩하여, STAT1 (Tyr701), STAT2 (Tyr690), 및 STAT3(Tyr705)의 인산화를 관찰하였다. GAPDH를 로딩 대조군으로서 사용하였다.
사용된 1차 항체는 다음과 같다: STAT1 (1:1000, Cat#: 9175S), Tyr701 인산화-STAT1 (1:1000, Cat#: 9167S), STAT2 (1:500, Cat#4594), Tyr690 인산화-STAT2 (1:1000, Cat#: 441S), STAT3 (1:1000, Cat#: 9132), Tyr705 인산화-STAT3 (1:1000, Cat#: 9145S). 항-마우스 (Cat#:sc-2005) 또는 토끼 (Cat#: sc-2004) 또는 염소 (Cat#: sc-2020) HRP-접합 2차 항체 (산타 크루즈 테크놀로지, 캘리포니아주 산타 크루즈)를 1:2000의 농도로 사용하였다. 블롯을 슈퍼 시그널 웨스트 피코 화학발광 기질 키트 (써모 사이언티픽, 미국)와 발광/형광 영상화 LAS4000 시스템 (지이 헬스케어 라이프 사이언시스, 미국)을 사용하여 시각화하였다.
도 15에 제시된 결과는 2가지 인터페론인 IFN알파-2b 및 rSIFN-co가 A549 세포 및 Hela 세포 둘 다에서 STAT1, STAT2 및 STAT3에 대한 그의 인산화 패턴에 있어서 유사하게 거동하였음을 입증한다. 따라서, rSIFN-co-매개 JAK/STAT 신호전달 수준은 IFN알파-2b에 의해 매개된 것과 다르지 않았으며, 이는 rSIFN-co 및 IFN알파-2b가 공통의 IFNAR1/2 수용체를 공유할 수 있음을 시사한다.
산업상 적용성
본원에 기재된 방법 및 검정 키트는 시험 화합물, 예컨대 인터페론 효력의 결정, 및 베타-카테닌, 또는 LRP6, FZD6, Axin2, CD24, 서바이빈 중 어느 1종 이상의 과다-활성 또는 과다-발현, 및 ID2 또는 DKK3, BATF2 또는 KLF4의 하향-조절이 부정적인 영향을 미치는 특정 질환 또는 상태의 치료에 유용하다.
SEQUENCE LISTING
<110> Superlab Far East Limited
<120> METHODS OF DETERMINING INTERFERON HAVING DIRECT INHIBITORY
EFFECTS ON TUMORS AND USES THEREOF
<130> 1749-PCT
<140>
<141>
<150> US 61/903,937
<151> 2013-11-13
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 167
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of recombinant interferon
<400> 1
Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys
20 25 30
Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln
35 40 45
Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln
50 55 60
Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu
65 70 75 80
Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp
85 90 95
Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu
100 105 110
Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile
115 120 125
Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val
130 135 140
Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln
145 150 155 160
Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu
165
<210> 2
<211> 504
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence encoding recombinant interferon
<400> 2
atgtgcgacc tgccgcagac ccactccctg ggtaaccgtc gtgctctgat cctgctggct 60
cagatgcgtc gtatctcccc gttctcctgc ctgaaagacc gtcacgactt cggtttcccg 120
caggaagaat tcgacggtaa ccagttccag aaagctcagg ctatctccgt tctgcacgaa 180
atgatccagc agaccttcaa cctgttctcc accaaagact cctccgctgc ttgggacgaa 240
tccctgctgg aaaaattcta caccgaactg taccagcagc tgaacgacct ggaagcttgc 300
gttatccagg aagttggtgt tgaagaaacc ccgctgatga acgttgactc catcctggct 360
gttaaaaaat acttccagcg tatcaccctg tacctgaccg aaaaaaaata ctccccgtgc 420
gcttgggaag ttgttcgtgc tgaaatcatg cgttccttct ccctgtccac caacctgcag 480
gaacgtctgc gtcgtaaaga ataa 504
<210> 3
<211> 504
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence encoding recombinant interferon
<400> 3
tacacgctgg acggcgtctg ggtgagggac ccattggcag cacgagacta ggacgaccga 60
gtctacgcag catagagggg caagaggacg gactttctgg cagtgctgaa gccaaagggc 120
gtccttctta agctgccatt ggtcaaggtc tttcgagtcc gatagaggca agacgtgctt 180
tactaggtcg tctggaagtt ggacaagagg tggtttctga ggaggcgacg aaccctgctt 240
agggacgacc tttttaagat gtggcttgac atggtcgtcg acttgctgga ccttcgaacg 300
caataggtcc ttcaaccaca acttctttgg ggcgactact tgcaactgag gtaggaccga 360
caatttttta tgaaggtcgc atagtgggac atggactggc ttttttttat gaggggcacg 420
cgaacccttc aacaagcacg actttagtac gcaaggaaga gggacaggtg gttggacgtc 480
cttgcagacg cagcatttct tatt 504
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense primer
<400> 4
tgaagaacca gcaccacagg 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer
<400> 5
cataaccaag aggcacagaa gc 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense primer
<400> 6
gcggagtgaa ggaaggatta gtc 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer
<400> 7
tgaacaagca gagatgtgga acc 23
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense primer
<400> 8
cgtggatacc ttagactt 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer
<400> 9
gctgttgttc tcaatgta 18
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense primer
<400> 10
tgaagaacat gtgagaggtt tgac 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer
<400> 11
gaaaactgaa tctccattcc acaa 24
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense primer
<400> 12
accgcatctc tacattcaag 20
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer
<400> 13
caagtctggc tcgttctc 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense primer
<400> 14
cacaacaaca acaacaac 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer
<400> 15
cacagtccaa gtaagaga 18
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense primer
<400> 16
cagagcaggg agcacaaacc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer
<400> 17
tgagcagagg agagcagagg 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense primer
<400> 18
ggagcctgac tgaagagatg g 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer
<400> 19
acgcctaaag cacacacctg 20
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense primer
<400> 20
ccttcaacct ggcggacatc aac 23
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer
<400> 21
ggctgctgcg gcggaatg 18
Claims (98)
- (1) 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물을 제공하는 단계; 및
(2) 각각 동일한 명시된 조건 하에 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 상에서의 하기 활성:
(a) 어느 1종 이상의 종양-보유 동물 모델에서의 생체내 암 세포 성장의 억제;
(b) 암 세포 생존율의 감소;
(c) 암 세포 이동의 억제;
(d) 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제;
(e) 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현의 하향조절;
(f) 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈(Survivin) 및 ID2 중 어느 1종 이상의 발현의 억제;
(g) 암 세포에서의 위족 형성의 억제;
(h) 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제; 및
(i) 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 1종 이상의 발현의 상향조절
중 어느 1종 이상을 결정하는 단계
를 포함하며, 이에 의해 통계적으로 유의한 방식으로 (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f)에 명시된 활성 중 어느 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6종이 시험 인터페론에 존재한다는 것 및/또는 (g), (h) 및 (i)에 명시된 활성 중 어느 1종 이상이 시험 인터페론에 존재한다는 것은 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력을 갖는다는 것을 의미하는 것인,
rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물과 대비하여 시험 인터페론의 효력을 결정하거나 또는 비교하는 방법. - (1) 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물을 제공하는 단계; 및
(2) 각각 동일한 명시된 조건 하에 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 상에서의 하기 활성:
(a) 어느 1종 이상의 종양-보유 동물 모델에서의 생체내 암 세포 성장의 억제;
(b) 암 세포 생존율의 감소;
(c) 암 세포 이동의 억제;
(d) 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제;
(e) 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현의 하향조절;
(f) 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 1종 이상의 발현의 억제;
(g) 암 세포에서의 위족 형성의 억제;
(h) 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제; 및
(i) 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 1종 이상의 발현의 상향조절
중 어느 1종 이상을 결정하는 단계
를 포함하며, 이에 의해 통계적으로 유의한 방식으로 (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f)에 명시된 활성 중 어느 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6종이 시험 인터페론에 존재한다는 것 및/또는 (g), (h) 및 (i)에 명시된 활성 중 어느 1종 이상이 시험 인터페론에 존재한다는 것은 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적 동등성이라는 것을 의미하는 것인,
시험 인터페론과 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 사이의 실질적 동등성을 확립하는 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 1종 이상의 활성을 결정하는데 사용된 암 세포가 폐암 세포, 결장암 세포, 자궁경부암 세포, 간암 세포, 유방암 세포 및 췌장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 활성을 결정하는데 사용된 암 세포가 A549 세포, Hela 세포, CL-1 세포, Huh-7 세포, SW480 세포, MDA-MB-231 세포, Calu-1 세포, SMMC-7721 세포, PANC-1 세포, SW620 세포, SPC-A4 세포, H1299 세포, H460 세포 및 HT-29 세포 중 어느 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (a), 생체내 암 세포 성장의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포가 간암 세포, 자궁경부암 세포, 결장암 세포 및 폐암 세포 중 어느 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (a)를 결정하는데 사용된 암 세포가 SMMC-7721 세포, Hela 세포, HT-29 세포, SPC-A4 세포 및 A549 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 임의로, HT-29 세포, SPC-A4 세포 및 A549 세포 중 중 어느 1종 이상을 포함하고; 추가로 임의로, A549 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 생리 염수 또는 PBS가 활성 (a)에서의 억제를 결정하는데 대조군으로서 사용되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서 종양-보유 동물 모델에게 투여된 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 약 0.02 mg 내지 약 0.30 mg; 임의로, 약 0.05 mg 내지 약 0.15 mg의 범위로 투여되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서 종양-보유 동물 모델에게 투여된 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 격일로 투여되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서 종양-보유 동물 모델에게 투여된 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 약 2주 내지 약 6주; 임의로, 약 3주 내지 약 4주 동안 투여되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (b), 암 세포 생존율의 감소를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 각각 약 6.25 mcg/ml 내지 약 25 mcg/ml; 임의로, 약 10 mcg/ml 내지 약 18 mcg/ml; 보다 임의로, 약 10 mcg/ml 내지 약 15 mcg/ml의 범위의 농도에서 암 세포 생존율의 약 50% 감소를 야기하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 각각 적어도 약 25 mcg/ml; 임의로, 적어도 약 50 mcg/ml; 추가로 임의로, 적어도 약 75 mcg/ml; 보다 임의로, 적어도 약 100 mcg/ml의 범위의 농도에서 암 세포 생존율의 실질적으로 검출불가능한 수준으로의 감소를 야기하는 것인 방법.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물의 농도가 약 0.2 mcg/ml 내지 약 100 mcg/ml의 범위의 농도를 포함하는 것인 방법.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 암 세포가 적어도 약 1일; 임의로, 적어도 약 2일 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리되는 것인 방법.
- 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포가 폐암 세포, 결장암 세포, 자궁경부암 세포, 간암 세포, 유방암 세포 및 췌장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 임의로, 폐암 세포, 결장암 세포, 간암 세포, 유방암 세포 및 췌장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포가 A549 세포, Hela 세포, CL-1 세포, Huh-7 세포, SW480 세포, MDA-MB-231 세포, Calu-1 세포, SMMC-7721 세포 및 PANC-1 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 임의로, A549 세포, CL-1 세포, Huh-7 세포, SW480 세포, MDA-MB-231 세포, Calu-1 세포, SMMC-7721 세포 및 PANC-1 세포 중 어느 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포가 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포가 약 1일 내지 약 10일; 임의로, 약 1일 내지 약 6일 동안 처리되는 것인 방법.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포가 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포가 A549 세포 및 SW620 세포 중 어느 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (c), 암 세포 이동의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포가 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (c)를 결정하는데 사용된 암 세포가 A549 세포 및 SW620 세포 중 어느 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (c)에서의 암 세포 이동의 억제가 트랜스웰(Transwell) 방법을 사용하여 결정되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (c)를 결정하는데 사용된 암 세포가 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (c)를 결정하는데 사용된 암 세포가 적어도 약 20시간; 임의로, 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (d), 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포가 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (d)를 결정하는데 사용된 암 세포가 A549 세포, H1299 세포, H460 세포, HT-29 세포 및 SW620 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 임의로, A549 세포, H1299 세포, H460 세포 및 SW620 세포 중 어느 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (d)를 결정하는데 사용된 암 세포가 적어도 약 20시간; 임의로, 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (d)를 결정하는데 사용된 암 세포가 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 베타-카테닌/TCF의 전사 활성이 리포터 시스템의 사용에 의해 결정되는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 리포터 시스템이 탑플래쉬(TOPFlash)를 포함하는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 리포터 시스템이 pSV40-RL 플라스미드를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (e), 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현의 하향조절을 결정하는데 사용된 암 세포가 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (e)를 결정하는데 사용된 암 세포가 A549 세포, H460 세포, SW620 세포 및 HT-29 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 임의로, A549 세포, SW620 세포 및 HT-29 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 보다 임의로, HT-29 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (e)를 결정하는데 사용된 암 세포가 적어도 약 20시간; 임의로, 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (e)를 결정하는데 사용된 암 세포가 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (e)를 결정하는데 있어서, LRP6 및/또는 FZD6의 발현이 LRP6 및/또는 FZD6의 mRNA 수준을 결정함으로써 결정되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (f), Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 1종 이상의 발현의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포가 폐암 세포를 포함하고; 임의로, A549 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (f)를 결정하는데 사용된 암 세포가 적어도 약 20시간; 임의로, 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (f)를 결정하는데 사용된 암 세포가 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (f)를 결정하는데 있어서, Axin2, CD24, 서바이빈 및/또는 ID2의 발현이 그의 상응하는 mRNA 수준을 결정함으로써 결정되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (f)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론이 대조군과 비교하여 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 1종 이상의 발현을 적어도 약 30%; 임의로, 적어도 약 40%; 보다 임의로, 적어도 약 50%; 보다 더 임의로, 적어도 약 60% 감소시키는 경우에, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효력 또는 실질적 동등성을 갖는 것으로 간주되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (g), 위족 형성의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포가 폐암 세포; 임의로, A549 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (g)를 결정하는데 사용된 암 세포가 적어도 약 4일; 임의로, 적어도 약 8일 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (g)를 결정하는데 사용된 암 세포가 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (h), 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포가 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (h)를 결정하는데 사용된 암 세포가 A549 세포 및 SW480 세포 중 어느 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (h)를 결정하는데 있어서, 베타-카테닌 발현의 억제가 웨스턴 블롯(Western Blot)에 의해 결정되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (h)를 결정하는데 사용된 암 세포가 적어도 약 48시간; 임의로, 적어도 약 72시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (h)를 결정하는데 사용된 암 세포가 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (i), 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 1종 이상의 발현의 상향조절을 결정하는데 사용된 암 세포가 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (i)를 결정하는데 사용된 암 세포가 A549 세포, H460 세포, SW620 세포 및 HT-29 세포 중 어느 1종 이상을 포함하고; 임의로, A549 세포 및 SW620 세포 중 어느 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (i)를 결정하는데 사용된 암 세포가 적어도 약 20시간; 임의로, 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (i)를 결정하는데 사용된 암 세포가 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 임의로, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 의해 처리되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 (i)를 결정하는데 있어서, DKK-3, KLF-4 및/또는 BATF2의 발현이 그의 상응하는 mRNA 수준을 결정함으로써 결정되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 통계적 유의성이 대조군과 비교하는 경우에 0.05 이하, 또는 0.01 이하, 또는 0.005 이하, 또는 0.001 이하, 또는 0.0005 이하, 또는 0.0001 이하의 p 값을 의미하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 대조군이 시험 인터페론 또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리되지 않거나, 또는 생리 염수 또는 PBS로 처리되거나, 또는 IFNα-2b로 처리되거나, 또는 대조군이 비처리 대조군 (모의)인 방법.
- (a) 복수의 농도의 시험 인터페론을 제공하는 단계;
(b) 복수의 농도의 시험 인터페론을 사용하여, 명시된 조건 하에 제1 암 세포 세트의 생존율에 대한 시험 인터페론의 제1 용량 반응을 결정하는 단계;
(c) 복수의 농도의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물을 제공하는 단계;
(d) 복수의 농도의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물을 사용하여, 동일한 명시된 조건 하에 제2 암 세포 세트의 생존율에 대한 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물의 제2 용량 반응을 결정하는 단계; 및
(e) 제1 용량 반응을 제2 용량 반응과 비교하는 단계
를 포함하며, 이에 의해 시험 인터페론의 효력이 결정되는 것인,
rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물과 대비하여 시험 인터페론의 효력을 결정하거나 또는 비교하는 방법. - 제58항에 있어서, 시험 인터페론 또는 rSIFN-co의 농도가 약 0.2 mcg/ml 내지 약 100 mcg/ml의 범위의 농도를 포함하는 것인 방법.
- 제58항 또는 제59항에 있어서, 암 세포가 폐암 세포, 결장암 세포, 자궁경부암 세포, 간암 세포, 유방암 세포 및 췌장암 세포 중 어느 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포가 A549 세포, Hela 세포, CL-1 세포, Huh-7 세포, SW480 세포, MDA-MB-231 세포, Calu-1 세포, SMMC-7721 세포 및 PANC-1 세포 중 어느 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, rSIFN-co의 효력이 약 6.25 mcg/ml 내지 약 25 mcg/ml의 농도 범위로 처리 후에 세포 생존율의 약 50% 감소를 야기하도록 하는 것인 방법.
- 제62항에 있어서, rSIFN-co의 효력이 약 6.25 mcg/ml 내지 약 12.5 mcg/ml의 농도 범위로 처리 후에 세포 생존율의 약 50% 감소를 야기하도록 하는 것인 방법.
- 제62항에 있어서, rSIFN-co의 효력이 약 12.5 mcg/ml 내지 25 mcg/ml의 농도 범위로 처리 후에 세포 생존율의 약 50% 감소를 야기하도록 하는 것인 방법.
- (a) 복수의 암 세포를 제공하는 단계;
(b) 명시된 조건 하에 시험 인터페론으로 제1 암 세포 세트를 처리하여 제1 생존율 데이터 세트를 생성하는 단계;
(c) 동일한 명시된 조건 하에 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 제2 암 세포 세트를 처리하여 제2 생존율 데이터 세트를 생성하는 단계; 및
(d) 제1 생존율 데이터 세트를 제2 생존율 데이터 세트와 비교하는 단계
를 포함하며, 이에 의해 시험 인터페론의 효력이 결정되는 것인,
rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물과 대비하여 시험 인터페론의 암 세포 생존율에 대한 효력을 결정하거나 또는 비교하는 방법. - 제65항에 있어서, rSIFN-co가 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml; 임의로, 약 10 mcg/ml의 농도로 사용되는 것인 방법.
- (a) 복수의 암 세포를 제공하는 단계; 및
(b) 암 세포를 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 단계
를 포함하며, 이에 의해 암 세포 이동이 억제되는 것인,
암 세포 이동을 억제하는 방법. - 제67항에 있어서, rSIFN-co가 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml; 임의로, 약 10 mcg/ml의 농도로 사용되는 것인 방법.
- (a) 복수의 암 세포를 제공하는 단계; 및
(b) 암 세포를 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 단계
를 포함하며, 이에 의해 위족 형성이 억제되는 것인,
암 세포에서의 위족 형성을 억제하는 방법. - 제69항에 있어서, rSIFN-co가 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml; 임의로, 약 10 mcg/ml의 농도로 사용되는 것인 방법.
- (a) 복수의 암 세포를 제공하는 단계; 및
(b) 암 세포를 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 단계;
를 포함하며, 이에 의해 세포에서의 베타-카테닌/TCF의 전사 활성이 억제되는 것인,
암 세포에서의 베타-카테닌/TCF-매개 전사 활성을 억제하는 방법. - 제71항에 있어서, 베타-카테닌/TCF의 전사 활성이 리포터 시스템의 사용에 의해 결정되는 것인 방법.
- 제72항에 있어서, 리포터 시스템이 탑플래쉬를 포함하는 것인 방법.
- 제72항에 있어서, 리포터 시스템이 pSV40-RL 플라스미드를 포함하는 것인 방법.
- (a) 복수의 암 세포를 제공하는 단계; 및
(b) 암 세포를 rSIFN-co에 노출시키는 단계
를 포함하며, 이에 의해 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현이 하향조절되는 것인,
암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현을 하향조절하는 방법. - 제75항에 있어서, LRP6 및/또는 FZD6의 발현이 LRP6 및/또는 FZD6의 mRNA 수준을 결정함으로써 결정되는 것인 방법.
- (a) 복수의 암 세포를 제공하는 단계; 및
(b) 암 세포를 rSIFN-co에 노출시키는 단계
를 포함하며, 이에 의해 세포에서의 적어도 1종의 Wnt-관련 표적 유전자의 발현이 억제되는 것인,
암 세포에서의 적어도 1종의 Wnt-관련 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법. - 제77항에 있어서, Wnt-관련 표적 유전자가 Axin2, CD24, 서바이빈 및/또는 ID2를 포함하는 것인 방법.
- 제77항에 있어서, 세포가 적어도 약 20시간; 임의로, 적어도 약 24시간 동안 rSIFN-co에 노출되는 것인 방법.
- (a) 복수의 암 세포를 제공하는 단계; 및
(b) 암 세포를 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 단계
를 포함하며, 이에 의해 암 세포에서의 종양 억제 유전자의 발현이 상향조절되는 것인,
암 세포에서의 종양 억제 유전자를 상향조절하는 방법. - 제80항에 있어서, 종양 억제 유전자가 DKK-3, KLF4 및 BATF2 중 적어도 1종인 방법.
- (a) 복수의 암 세포를 제공하는 단계; 및
(b) 암 세포를 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 단계
를 포함하며, 이에 의해 암 세포에서의 베타-카테닌의 발현이 하향조절되는 것인,
암 세포에서의 베타-카테닌의 발현을 하향조절하는 방법. - (a) 어느 1종 이상의 종양-보유 동물 모델에서의 생체내 암 세포 성장의 억제;
(b) 암 세포 생존율의 감소;
(c) 암 세포 이동의 억제;
(d) 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제;
(e) 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현의 하향조절;
(f) 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 1종 이상의 발현의 억제;
(g) 암 세포에서의 위족 형성의 억제;
(h) 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제; 및
(i) 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 1종 이상의 발현의 상향조절
중 적어도 1종, 임의로 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9종의 활성을 비교하고 실질적으로 동일한 반응을 제시하는 것을 포함하는, 상기 활성에서의 시험 화합물과 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 사이의 실질적 동등성을 확립하는 방법. - (a) 비활성을 갖는 일정량의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물; 및 (b) 검정을 수행하기 위한 지침서 및 검정을 수행하기 위한 시약 중 적어도 1종을 포함하는, 시험 인터페론의 효력을 평가하기 위한 키트.
- (a) 비활성을 갖는 일정량의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물; 및 (b) 검정을 수행하기 위한 지침서 및 검정을 수행하기 위한 시약 중 적어도 1종을 포함하는, 암 세포에서의 적어도 1종의 Wnt-관련 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 키트.
- 제85항에 있어서, 표적 유전자가 Axin2, CD24, 서바이빈 및/또는 ID2를 포함하는 것인 키트.
- 제85항 또는 제86항에 있어서, Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 1종 이상에 대한 프라이머를 추가로 포함하는 키트.
- (a) 비활성을 갖는 일정량의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물; 및 (b) 검정을 수행하기 위한 지침서 및 검정을 수행하기 위한 시약 중 적어도 1종을 포함하는, 암 세포에서의 종양 억제 유전자의 상향조절을 위한 키트.
- 제88항에 있어서, 종양 억제 유전자가 DKK-3, KLF4 및/또는 BATF2를 포함하는 것인 키트.
- 제88항 또는 제89항에 있어서, DKK3, KLF4 및/또는 BATF2 중 1종 이상에 대한 프라이머를 추가로 포함하는 키트.
- (a) 비활성을 갖는 일정량의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물; 및 (b) 검정을 수행하기 위한 지침서 및 검정을 수행하기 위한 시약 중 적어도 1종을 포함하는, 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현을 상향조절하기 위한 키트.
- 제91항에 있어서, LRP6 및/또는 FZD6 중 1종 이상에 대한 프라이머를 추가로 포함하는 키트.
- 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 인터페론의 아미노산 서열이 rSIFN-co의 아미노산 서열 (서열 1)에 대해 적어도 90%, 임의로, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 동일한 것인 방법.
- 제1항 내지 제66항 및 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 인터페론을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 rSIFN-co를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 2)에 대해 적어도 90%, 임의로, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 동일한 것인 방법.
- 제1항 내지 제66항, 제93항 및 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 인터페론 및 rSIFN-co가 동일한 아미노산 서열 (서열 1)을 갖고, 동일한 뉴클레오티드 서열 (서열 2)에 의해 코딩되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제66항 및 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 인터페론 및 rSIFN-co가 실질적으로 동일한 비활성을 갖는 것인 방법.
- 제96항에 있어서, 비활성이 약 4 x 108 IU/mg 내지 약 1 x 109 IU/mg의 범위에 있는 것인 방법.
- 어느 1종 이상의 종양-보유 동물 모델에서의 생체내 암 세포 성장의 억제; 암 세포 생존율의 감소; 암 세포 이동의 억제; 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제; 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현의 하향조절; 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 1종 이상의 발현의 억제; 암 세포에서의 위족 형성의 억제; 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제; 및 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 1종 이상의 발현의 상향조절로부터 선택된 1종 이상의 활성, 임의로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9종의 활성을 포함하는 인터페론 또는 인터페론 대체물.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201361903937P | 2013-11-13 | 2013-11-13 | |
| US61/903,937 | 2013-11-13 | ||
| PCT/CN2014/090859 WO2015070751A1 (en) | 2013-11-13 | 2014-11-12 | Methods of determining interferon having direct inhibitory effects on tumors and uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20160093637A true KR20160093637A (ko) | 2016-08-08 |
| KR102230547B1 KR102230547B1 (ko) | 2021-03-22 |
Family
ID=53056769
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020167015609A Active KR102230547B1 (ko) | 2013-11-13 | 2014-11-12 | 종양에 대한 직접적 억제 효과를 갖는 인터페론을 결정하는 방법 및 그의 용도 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10677782B2 (ko) |
| EP (1) | EP3068420B1 (ko) |
| JP (1) | JP6768507B2 (ko) |
| KR (1) | KR102230547B1 (ko) |
| CN (1) | CN105722525B (ko) |
| AU (1) | AU2014350714B2 (ko) |
| CA (1) | CA2929893C (ko) |
| ES (1) | ES2768702T3 (ko) |
| MY (1) | MY182258A (ko) |
| SG (1) | SG10201709273WA (ko) |
| TW (1) | TWI670494B (ko) |
| WO (1) | WO2015070751A1 (ko) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI726291B (zh) | 2013-01-07 | 2021-05-01 | 英屬維爾京群島商遠東超級實驗室有限公司 | 通過干擾素的經皮和/或經粘膜給藥治療骨癌、皮膚癌、皮下癌、粘膜癌和/或粘膜下癌的方法和組合物 |
| CA2985524C (en) * | 2015-05-12 | 2023-10-17 | Superlab Far East Limited | Methods of determining interferon having direct inhibitory effects on tumors and uses thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130273527A1 (en) * | 2012-04-13 | 2013-10-17 | Superlab Far East Limited | Method for inducing cell senescence by recombinant interferon with altered spatial configuration |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6936694B1 (en) | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| CN1245215C (zh) | 2001-02-28 | 2006-03-15 | 四川省生物工程研究中心 | 重组高效复合干扰素用作乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制剂 |
| US7611700B2 (en) * | 2002-09-09 | 2009-11-03 | Hanall Pharmaceuticals, Co., Ltd. | Protease resistant modified interferon alpha polypeptides |
| CN101001644B (zh) * | 2003-08-28 | 2011-09-21 | 辉阳科技美国公司 | 空间构象改变的干扰素及其应用 |
| ES2473622T3 (es) * | 2003-08-28 | 2014-07-07 | Superlab Far East Limited | Usos de interferones con estructura espacial alterada |
| US7585647B2 (en) | 2003-08-28 | 2009-09-08 | Guangwen Wei | Nucleic acid encoding recombinant interferon |
| EP2749290A3 (en) * | 2005-03-09 | 2015-02-18 | Guangwen Wei | Uses of recombinant super-compound interferons |
| CN101951954A (zh) * | 2007-11-02 | 2011-01-19 | 诺瓦提斯公司 | 调节低密度脂蛋白受体相关蛋白6(lrp6)的分子和方法 |
| CA2786745A1 (en) * | 2010-01-12 | 2011-07-21 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Wnt-binding agents and uses thereof |
-
2014
- 2014-11-12 WO PCT/CN2014/090859 patent/WO2015070751A1/en active Application Filing
- 2014-11-12 MY MYPI2016701720A patent/MY182258A/en unknown
- 2014-11-12 TW TW103139243A patent/TWI670494B/zh active
- 2014-11-12 EP EP14861341.7A patent/EP3068420B1/en active Active
- 2014-11-12 SG SG10201709273WA patent/SG10201709273WA/en unknown
- 2014-11-12 ES ES14861341T patent/ES2768702T3/es active Active
- 2014-11-12 KR KR1020167015609A patent/KR102230547B1/ko active Active
- 2014-11-12 US US15/035,749 patent/US10677782B2/en active Active
- 2014-11-12 CA CA2929893A patent/CA2929893C/en active Active
- 2014-11-12 CN CN201480061720.7A patent/CN105722525B/zh active Active
- 2014-11-12 AU AU2014350714A patent/AU2014350714B2/en active Active
- 2014-11-12 JP JP2016531672A patent/JP6768507B2/ja active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130273527A1 (en) * | 2012-04-13 | 2013-10-17 | Superlab Far East Limited | Method for inducing cell senescence by recombinant interferon with altered spatial configuration |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Liu et al., PNAS, Vol. 107, No. 11, 2010, pp. 5136-5141. * |
| Thompson et al., Journal of Hepatology, Vol. 54, No. 3, 2010, pp. 506-512. * |
| Wei Li et al., PLOS ONE, Vol. 7, No. 10, 2012, pp. 1-9. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2014350714B2 (en) | 2019-05-02 |
| CA2929893C (en) | 2023-03-14 |
| TWI670494B (zh) | 2019-09-01 |
| MY182258A (en) | 2021-01-18 |
| EP3068420A1 (en) | 2016-09-21 |
| US20160258930A1 (en) | 2016-09-08 |
| CA2929893A1 (en) | 2015-05-21 |
| CN105722525B (zh) | 2019-12-27 |
| US10677782B2 (en) | 2020-06-09 |
| CN105722525A (zh) | 2016-06-29 |
| EP3068420A4 (en) | 2017-09-20 |
| JP6768507B2 (ja) | 2020-10-14 |
| HK1223857A1 (en) | 2017-08-11 |
| AU2014350714A1 (en) | 2016-06-23 |
| ES2768702T3 (es) | 2020-06-23 |
| KR102230547B1 (ko) | 2021-03-22 |
| WO2015070751A1 (en) | 2015-05-21 |
| EP3068420B1 (en) | 2019-10-23 |
| JP2017502263A (ja) | 2017-01-19 |
| TW201525460A (zh) | 2015-07-01 |
| SG10201709273WA (en) | 2018-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110592222B (zh) | Triml1作为肝癌的分子标记物的应用 | |
| WO2017063196A1 (zh) | c-Rel特异性siRNA及其用于防治自身免疫性银屑病的应用 | |
| KR102230547B1 (ko) | 종양에 대한 직접적 억제 효과를 갖는 인터페론을 결정하는 방법 및 그의 용도 | |
| US20210270808A1 (en) | Methods of determining interferon having direct inhibitory effects on tumors and uses thereof | |
| Jiang et al. | MLN4924 alleviates autoimmune myocarditis by promoting Act1 degradation and blocking Act1-mediated mRNA stability | |
| WO2022095976A1 (zh) | 小分子sr9009在抗衰老以及减轻衰老引起的慢性炎症中的用途 | |
| Liu et al. | Adenovirus-mediated overexpression of interleukin-21 regulates the development of oral squamous cell carcinoma in vitro | |
| CN114470196B (zh) | CCL3/CCR4中和抗体、NF-κB抑制剂在制备NEC治疗药物中的用途 | |
| HK1223857B (en) | Methods of determining interferon having direct inhibitory effects on tumors and uses thereof | |
| HK1250214B (en) | Methods of determining interferon having direct inhibitory effects on tumors and uses thereof | |
| KR20150123213A (ko) | 카드헤린―１１ 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 대장암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물 | |
| CN118717782A (zh) | 人参皂苷ck或其药物组合物在制备治疗黑色素瘤药物中的应用 | |
| CN115957328A (zh) | 一种用于治疗白血病的药物组合物以及白血病的治疗方法 | |
| HK1225284A1 (en) | Methods of determining interferon having direct inhibitory effects on tumors and uses thereof | |
| CN115990253A (zh) | 一种降低癌症患者耐药性的方法 | |
| Lv et al. | TET3 Renders Pathogenic Macrophages Vulnerable to Targeted Elimination |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0105 | International application |
Patent event date: 20160613 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| A201 | Request for examination | ||
| PA0201 | Request for examination |
Patent event code: PA02012R01D Patent event date: 20191104 Comment text: Request for Examination of Application |
|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20210112 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20210316 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20210316 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20240313 Start annual number: 4 End annual number: 4 |