CN101951954A - 调节低密度脂蛋白受体相关蛋白6(lrp6)的分子和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了LRP6激动或拮抗结合分子(例如抗体或Fab片段)和它们分别促进或抑制Wnt途径信号传导的用途。所述LRP6激动或拮抗结合分子可以分别用来例如诊断、改善其症状、防御和治疗与Wnt途径信号传导的异常低水平或异常高水平相关的Wnt信号传导病症。与Wnt信号传导的异常上调相关的可治疗病症的非限制性实例是癌症(例如结肠癌)。可以诊断、防御和治疗的病症的非限制性实例包括癌症、骨病症(例如骨质疏松症和骨关节炎)、糖尿病、神经变性疾病如阿尔茨海默病、和纤维化病症。

Description

调节低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的分子和方法
发明背景
Wnt基因家族编码一大类涉及Int1/Wnt1原癌基因和果蝇属无翅基因(“Wg”)(果蝇属的Wnt1相应物)的分泌蛋白质(Cadigan等人(1997)Genes& Development 11：3286-3305)。Wnt表达于多种组织和器官且为许多发育过程所需，这些过程包括果蝇属中的分节；秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的内胚层发育；哺乳动物的肢极性建立、神经脊分化、肾形态发生、性别决定和脑发育(Parr等人(1994)Curr.Opinion Genetics & Devel.4：523-528)。在胚胎发生过程和成熟生物体中，Wnt途径都是动物发育的主要调节物(Eastman等人(1999)Curr Opin Cell Biol 11：233-240；Peifer等人(2000)Science 287：1606-1609)。
Wnt信号通过七跨膜结构域受体的Frizzled家族(“Fz”)转导(Bhanot等人(1996)Nature 382：225-230)。Frizzled细胞表面受体(Fzd)在典型和非典型Wnt信号传导中都发挥主要作用。在典型途径中，紧随Wnt蛋白质激活Fzd和LRP5/6(低密度脂蛋白受体相关蛋白5和6)，产生阻止“β-联蛋白破坏复合体”对β-联蛋白进行磷酸化和降解的信号，允许稳定的β-联蛋白转位并积累在细胞核内，从而使Wnt信号转导。(Perrimon(1994)Cell 76：781-784)(Miller，J.R.(2001)Genome Biology；3(1)：1-15)。对非典型Wnt信号传导途径知之较少：已提出了至少两条非典型Wnt信号传导途径，包括平面细胞极性(PCP)途径、Wnt/Ca++途径和会聚伸展途径。
糖原合酶激酶3(GSK3，在果蝇属中称为shaggy)、肿瘤抑制基因产物APC(腺瘤结肠息肉)(Gumbiner(1997)Curr.Biol.7：R443-436)和支架蛋白Axin都是Wnt途径的负调节物，并一起形成“β-联蛋白破坏复合体”。在无Wnt配体时，这些蛋白质形成复合体并促进β-联蛋白的磷酸化和降解，而Wnt信号传导钝化该复合体并阻止β-联蛋白降解。结果稳定的β-联蛋白转运至细胞核，在此结合TCF(T细胞因子)转录因子(也称为淋巴样细胞增强子结合因子-1(LEF1))，并作为TCF/LEF诱导的转录的辅激活物(Bienz等人(2000)Cell 103：311-320；Polakis等人(2000)Genes Dev 14：1837-1851)。
Wnt信号传导通过典型和非典型机制发生。在典型途径中，紧随Wnt蛋白质激活Fzd和LRP5/6，稳定的β-联蛋白在细胞核中积累并导致TCF靶基因的激活(如上所述)。(Miller，J.R.(2001)Genome Biology；3(1)：1-15)。对非典型Wnt信号传导途径知之较少：已提出了至少两种非典型Wnt信号传导途径，包括平面细胞极性(PCP)途径和Wnt/Ca++途径。
通过β-联蛋白的稳定化，异常高的Wnt途径激活在许多结肠直肠癌的肿瘤发生中起关键作用。据估计，80％的结肠直肠癌(CRC)在肿瘤抑制APC中具有失活突变，其允许不间断的Wnt信号传导。此外，越来越多证据表明，Wnt途径的激活可涉及黑素瘤、乳腺癌、肝癌、肺癌和胃癌。在Wnt、正常发育和癌症之间存在公认已久的联系，c-Myc原癌基因被确认为Wnt信号传导的靶基因，从而更进一步确立了这种联系(He等人(1998)Science281：1509-3512)。
此外，与Wnt信号传导的病理性的高或低水平相关的其他病症包括但不限于骨质疏松症、骨关节炎、多囊肾病、糖尿病、精神分裂症、血管病、心脏病、非致癌的增生性疾病和神经变性疾病如阿尔茨海默病。Wnt信号传导的异常上调与癌症、骨关节炎和多囊肾病相关，而Wnt信号传导的异常下调与骨质疏松症、肥胖症、糖尿病、纤维化疾病和神经元变性疾病相关。
目前开发Wnt信号传导相关病症(如结肠直肠癌)的疗法的范例是依赖靶向于β-联蛋白或β-联蛋白下游的Wnt途径组分。然而，最近的研究表明，Wnt受体Frizzled和LRP5/6介导的自分泌Wnt信号传导可以在调节肿瘤生长和存活中起关键作用。存在对下述药物和方法的需要，所述药物和方法通过沿着其他关键结合点调节Wnt途径的激活来抑制或增强Wnt信号转导活性，从而治疗、诊断、预防和/或改善Wnt信号传导相关病症。
发明概述
本发明涉及LRP6的表位、LRP6结合分子和使用这些分子的方法。LRP6结合分子与LRP6相互作用，从而能够调节LRP6的功能。LRP6激动或拮抗结合分子可分别用来促进或抑制Wnt途径信号传导；因此LRP6激动或拮抗结合分子可分别用来例如诊断、改善其症状、防御和治疗与Wnt途径信号传导的异常低水平或异常高水平相关的Wnt信号传导病症。与Wnt信号传导的异常上调相关的病症的非限制性实例是癌症(例如乳腺癌、肺癌和结肠癌)。与Wnt信号传导的异常下调相关的病症的非限制性实例是特征为低骨矿物质密度(BMD)的骨相关病症(例如骨质疏松症)。
在多个方面，本发明提供调节(例如抑制或促进)LRP6的一种或多种生物学功能的LRP6结合分子。例如，LRP6结合分子可调节β-联蛋白的磷酸化和随后的降解。作为另一个实例，LRP6结合分子可干扰LRP6结合Wnt途径所有成员的能力，所述成员例如DKK1(dickkopf 1)、DKK2、DKK4、SOST1、SOSD1(USAG1)、sFRP(可溶性Fzd相关蛋白)1-4、Wise(USAG1的小鼠版本)或Wnt配体本身。
LRP6结合分子包括，例如结合LRP6的抗体(例如在LRP6的特定结构域或表位内，如结合至LRP6胞外域的第一或第三螺旋桨，或结合至任意螺旋桨内的特异结构域(例如EGF重复、YWTD样基序或其他))，和包含这类抗体的抗原结合部分的多肽。LRP6结合分子还包括其中结合部分不是源自抗体的分子，例如源自具有免疫球蛋白样折叠的多肽的LRP6结合分子，其中抗原结合部分通过随机化、选择和亲和力成熟而改造为结合LRP6。
因此，在一方面，本发明涉及包含结合(例如特异地结合)至LRP6的抗体的抗原结合部分的LRP6结合分子，其中抗原结合部分结合至人LRP6螺旋桨1(SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：1的残基20-326)内的表位，该表位在以下之一内或与之重叠：(a)SEQ ID NO：1的氨基酸286-324(即在以下序列内或与之重叠的表位：NATNPCGIDN GGCSHLCLMS PVKPFYQCACPTGVKLLENG KTCK(SEQ ID NO：3))；(b)SEQ ID NO：1的氨基酸66-69(即在以下序列内或与之重叠的表位：YWSD)；(c)SEQ ID NO：1的氨基酸110-113(即在以下序列内或与之重叠的表位：YWTD)；(d)SEQ IDNO：1的氨基酸153-156(即在以下序列内或与之重叠的表位：YWTD)；(e)SEQ ID NO：1的氨基酸197-200(即在以下序列内或与之重叠的表位：YWAD)；和(f)SEQ ID NO：1的氨基酸238-241(即在以下序列内或与之重叠的表位：YWTD)。
在另一方面，本发明涉及包含结合(例如特异地结合)至LRP6的抗体的抗原结合部分的LRP6结合分子，其中抗原结合部分结合至人LRP6螺旋桨1(SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：1的残基20-326)内的表位，该表位在以下之一内或与之重叠：(a)SEQ ID NO：1的氨基酸20-65；(b)SEQ ID NO：1的氨基酸70-109；(c)SEQ ID NO：1的氨基酸114-152；(d)SEQ ID NO：1的氨基酸157-196；和(e)SEQ ID NO：1的氨基酸201-237；和(f)SEQ ID NO：1的氨基酸242-326。
因此，在一方面，本发明涉及包含结合(例如特异地结合)至LRP6的抗体的抗原结合部分的LRP6结合分子，其中抗原结合部分结合至人LRP6螺旋桨3(SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：1的残基631-932)内的表位，该表位在以下之一内或与之重叠：(a)SEQ ID NO：1的氨基酸889-929(即在以下序列内或与之重叠的表位：GW NECASSNGHC SHLCLAVPVGGFVCGCPAHY SLNADNRTC(SEQ ID NO：5))；(b)SEQ ID NO：1的氨基酸677-680(即在以下序列内或与之重叠的表位：YWTD)；(c)SEQ ID NO：1的氨基酸720-723(即在以下序列内或与之重叠的表位：YWAD)；(d)SEQ IDNO：1的氨基酸763-766(即在以下序列内或与之重叠的表位：YWTE)；(e)SEQ ID NO：1的氨基酸806-809(即在以下序列内或与之重叠的表位：YWTD)；和(f)SEQ ID NO：1的氨基酸846-849(即在以下序列内或与之重叠的表位：YWTD)。
在另一方面，本发明涉及包含结合(例如特异地结合)至LRP6的抗体的抗原结合部分的LRP6结合分子，其中抗原结合部分结合至人LRP6螺旋桨3(SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：1的残基631-932)内的表位，该表位在以下之一内或与之重叠：(a)SEQ ID NO：1的氨基酸631-676；(b)SEQ IDNO：1的氨基酸681-719；(c)SEQ ID NO：1的氨基酸724-762；(d)SEQ IDNO：1的氨基酸767-805；和(e)SEQ ID NO：1的氨基酸810-845；和(f)SEQ IDNO：1的氨基酸850-932。
在多个实施方案中，LRP6结合分子(例如抗-LRP6拮抗抗体)以这样的方式结合至人LRP6内的表位(例如结合至人LRP6螺旋桨1、螺旋桨3、或结合至其组件结构域或基序)以阻止某些Wnt配体类似地结合。作为非限制性实例，拮抗Wnt信号传导途径的LRP6结合分子阻止Wnt1或Wnt3a配体结合LRP6。例如，Wnt3或Wnt3a特异的信号传导活性可最有效地被Wnt3a特异的LRP6拮抗结合分子抑制。作为另一个非限制性实例，Wnt1、Wnt2、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和Wnt10特异的信号传导活性可最有效地被Wnt1特异的LRP拮抗结合分子抑制。
在多个实施方案中，LRP6结合分子(例如抗-LRP6拮抗抗体)能够结合至一个以上的LRP6螺旋桨(例如同时地结合至螺旋桨1、螺旋桨3、或结合至其组件结构域或基序)。在一些情况下，所述同时结合的LRP6结合分子能够阻止某些Wnt配体类似地结合LRP6。作为非限制性实例，所述同时结合的LRP6结合分子能够阻止Wnt1或Wnt3a配体结合LRP6。作为非限制性实例，所述同时结合的LRP6结合分子能够抑制Wnt3和Wnt3a特异的信号传导活性。作为另一个非限制性实例，所述同时结合的LRP6结合分子能够抑制Wnt1、Wnt2、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和Wnt10特异的信号传导活性。
在多个实施方案中，结合至人LRP6的螺旋桨1、螺旋桨3、或其组件结构域或基序内的表位的LRP6结合分子(例如抗-LRP6激动或拮抗抗体)与非人类灵长动物(例如食蟹猴或猕猴)的LRP6蛋白质(或其部分)交叉反应。在多个实施方案中，LRP6结合分子与啮齿动物物种的LRP6(例如鼠LRP6、大鼠LRP6)交叉反应。在多个实施方案中，LRP6结合分子与人LRP5交叉反应。
在多个实施方案中，LRP6结合分子(例如抗-LRP6拮抗抗体)能够结合至并调节(例如抑制)磷酸化的LRP6(磷酸-LRP6)。
在多个实施方案中，抗原结合部分结合至线性表位。
在多个实施方案中，抗原结合部分结合至非线性表位。在一个实例中，抗原结合部分结合至非线性表位，该表位包含或由以下每种线性表位的至少一个部分组成：(a)SEQ ID NO：1的氨基酸286-324；(b)SEQ ID NO：1的氨基酸66-69；(c)SEQ ID NO：1的氨基酸110-113；(d)SEQ ID NO：1的氨基酸153-156；(e)SEQ ID NO：1的氨基酸197-200；和(f)SEQ ID NO：1的氨基酸238-241。在另一个实例中，抗原结合部分结合至非线性表位，该表位包含或由以下两个或三个线性表位的至少一个部分组成：(a)SEQ IDNO：1的氨基酸889-929；(b)SEQ ID NO：1的氨基酸677-680；(c)SEQ IDNO：1的氨基酸720-723；(d)SEQ ID NO：1的氨基酸763-766；(e)SEQ IDNO：1的氨基酸806-809；和(f)SEQ ID NO：1的氨基酸846-849。
在多个实施方案中，LRP6结合分子的抗原结合部分以等于或小于1nM、0.5nM、0.25nM或0.1nM的解离常数(KD)结合至LRP6。
在多个实施方案中，LRP6结合分子的抗原结合部分以等于或小于1nM、0.5nM、0.25nM或0.1nM的KD结合至非人类灵长动物(例如食蟹猴或黑猩猩)的LRP6，。
在多个实施方案中，抗原结合部分以等于或小于1nM、0.5nM、0.25nM或0.1nM的KD结合至小鼠LRP6。
抗体可以是嵌合(例如人源化)抗体或人抗体。
在一个实施方案中，抗原结合部分是人抗体的抗原结合部分。
抗原结合部分可以是单克隆抗体或多克隆抗体的抗原结合部分。
LRP6结合分子包括例如抗体的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2或Fv片段。LRP6结合分子还包括例如完全抗体，例如二价IgG抗体。在一些实施方案中，能够拮抗LRP6的Fab或其他单价抗体片段可以转化为能够激动LRP6的二价完全抗体，例如二价IgG抗体。
在其他实施方案中，将LRP6结合分子与药物缀合或偶联来增加所述结合分子。在一些情况下，将LRP6结合分子与人血清白蛋白(HSA)结合蛋白质缀合。在一些实施方案中，将LRP6结合分子聚乙二醇化(例如用美国专利US 5,840,526、US 5,874,541、US 6,005,079、和US 6,765,087(“Hamers专利”)、和包含PCT公开物WO97/49805的专利族中任意一篇描述的专有技术)。在一些实施方案中，LRP6结合分子是聚乙二醇化的Fab片段。可用来制备LRP6结合分子的所述缀合物的技术的非限制性实例可见于包含以下一项或多项的专利族：美国专利号US 5,840,526、US 5,874,541、US6,005,079和US 6,765,087(“Hamers专利”)；PCT公开物WO97/49805；欧洲专利EP1517921B1；美国专利6,267,974；美国公开物US2003-0175921。
在一个实施方案中，LRP6结合分子是人抗体。
在一个实施方案中，LRP6结合分子包含单链Fv。
在一个实施方案中，LRP6结合分子包含双价抗体(例如单链双价抗体或具有两条多肽链的双价抗体)。
在一些实施方案中，抗体的抗原结合部分产生自以下同种型之一的抗体：IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，抗体的抗原结合部分产生自IgA或IgE同种型的抗体。
LRP6结合分子(例如结合至LRP6胞外域的第一或第三螺旋桨内的表位、或结合至所述螺旋桨内的特异结构域(例如EGF重复或YWTD样基序)的LRP6结合分子)可以显示大量生物学活性中的一种或多种。在多个实施方案中，LRP6结合分子抑制LRP6结合至多个Wnt信号传导途径成员(例如DKK1(dickkopf1)、DKK2、DKK4、SOST1、SOSD1(USAG1)、sFRP(可溶性Fzd相关蛋白)1-4、Wise或Wnt配体本身)。例如，相对于对照(例如相对于无LRP6结合分子时的结合)，LRP结合分子抑制LRP6结合至Wnt信号传导途径成员至少5％、10％、15％、25％或50％。
在一个实施方案中，LRP6结合分子与Wnt信号传导途径成员(例如DKK1(dickkopf1)、DKK2、DKK4、SOST1、SOSD1(USAG1)、sFRP(可溶性Fzd相关蛋白)1-4、Wise或Wnt配体本身)竞争结合LRP6，从而调节Wnt途径信号传导的生物学活性和结果。作为非限制性实例，拮抗LRP6结合分子可通过与Wnt信号传导途径成员竞争结合LRP6来抑制、减弱或阻止Wnt途径激活和信号传导。作为另一个非限制性实例，Wnt1特异的拮抗LRP6结合分子可阻止通过Wnt1、Wnt2、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和Wnt10中任意一种的Wnt途径激活和信号传导。作为另一个实例，拮抗LRP6结合分子(例如在LRP6的第一螺旋桨内结合的结合分子)可抑制、减弱或阻止通过Wise或Wnt配体的Wnt途径激活和信号传导。作为另一个实例，拮抗LRP6结合分子(例如在LRP6的第三螺旋桨内结合的结合分子)可抑制、减弱或阻止通过例如DKK1和Wnt配体(如Wnt3和Wnt3a)的Wnt途径激活和信号传导。
在一些实施方案中，LRP6结合分子能够激活、增强或保全Wnt信号传导途径，或使细胞对Wnt信号传导敏感。作为非限制性实例，激动LRP6结合分子能够结合至LRP6(例如结合至第三螺旋桨)并引起β-联蛋白破坏复合体的溶解，从而使β-联蛋白稳定，转运至细胞核并结合转录因子。
在一些实施方案中，激动LRP6结合分子能够通过寡聚化LRP6来激活、增强或保全Wnt信号传导途径，或使细胞对Wnt信号传导敏感。已知可通过使LRP6寡聚化形成(例如Fzd-LRP6异寡聚体)的药物来取消对Wnt配体的需要，所述药物包括本发明的LRP6结合分子。(Cong等人(2004)Development 131(20)：5103)。在一些实施方案中，所述LRP6结合分子是如本文所述的二价IgG抗体。
在一些实施方案中，LRP6结合分子通过调节LRP6以直接或间接方式正常地调节下游生物学活性(例如调节β-联蛋白磷酸化和降解)。例如，相对于对照(例如相对于无拮抗LRP6结合分子时的活性)，拮抗LRP6结合分子允许β-联蛋白磷酸化和降解的程度高至少5％、10％、15％、25％或50％。
在一个实施方案中，通过阻止通过Wnt1、Wnt2、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和Wnt10中任意一种的Wnt途径激活和信号传导，Wnt1特异的拮抗LRP6结合分子允许β-联蛋白磷酸化和降解的程度相对于对照高至少5％、10％、15％、25％或50％。在另一个实施方案中，通过阻止通过Wnt3或Wnt3a的Wnt途径激活和信号传导，Wnt3a特异的拮抗LRP6结合分子允许β-联蛋白磷酸化和降解的程度相对于对照高至少5％、10％、15％、25％或50％。在另一个实施方案中，通过阻止Wise结合至LRP6，Wnt1特异的拮抗LRP6结合分子允许β-联蛋白磷酸化和降解的程度相对于对照高至少5％、10％、15％、25％或50％。在另一个实施方案中，通过阻止DKK1、Wnt配体(如Wnt3和Wnt3a)等结合至LRP6，Wnt3a特异的拮抗LRP6结合分子允许β-联蛋白磷酸化和降解的程度相对于对照高至少5％、10％、15％、25％或50％。
相反地，例如，相对于对照(例如相对于无激动LRP6结合分子时的活性)，激动LRP6结合分子稳定β-联蛋白蛋白质水平的程度高至少5％、10％、15％、25％或50％。
本发明还涉及非抗体的LRP6结合分子。非抗体LRP6结合分子包含LRP6结合结构域，该结构域具有源自非抗体多肽的免疫球蛋白样(Ig样)折叠的氨基酸序列，所述非抗体多肽例如以下之一：腱糖蛋白、N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白、ICAM、纤连蛋白、肌联蛋白、GCSF受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生素色蛋白、髓鞘质膜粘附分子P0、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T-细胞抗原受体、CD1、C2和VCAM-1的I-set结构域、肌球蛋白结合蛋白质C的I-set免疫球蛋白结构域、肌球蛋白结合蛋白质H的I-set免疫球蛋白结构域、端蛋白的I-set免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生长激素受体、促红细胞生成素受体、催乳素受体、干扰素-γ受体、β-半乳糖苷酶/葡糖醛酸糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、转谷氨酰胺酶、T-细胞抗原受体、超氧化物岐化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿色荧光蛋白、GroEL或竹芋蛋白。一般而言，相对于免疫球蛋白样折叠的氨基酸序列，改变LRP6结合结构域的氨基酸序列以使LRP6结合结构域特异地结合至LRP6(即，其中免疫球蛋白样折叠不能特异地结合至LRP6)。
在多个实施方案中，LRP6结合结构域的氨基酸序列与纤连蛋白、细胞因子受体或钙粘蛋白的免疫球蛋白样折叠的氨基酸序列至少60％相同(例如至少65％、75％、80％、85％或90％相同)。
在多个实施方案中，LRP6结合结构域的氨基酸序列与以下之一的免疫球蛋白样折叠的氨基酸序列至少60％、65％、75％、80％、85％或90％相同：腱糖蛋白、N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白、ICAM、肌联蛋白、GCSF受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生素色蛋白、髓鞘质膜粘附分子P0、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T-细胞抗原受体、CD1、C2和VCAM-1的I-set结构域、肌球蛋白结合蛋白质C的I-set免疫球蛋白结构域、肌球蛋白结合蛋白质H的I-set免疫球蛋白结构域、端蛋白的I-set免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生长激素受体、促红细胞生成素受体、催乳素受体、干扰素-γ受体、β-半乳糖苷酶/葡糖醛酸糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、转谷氨酰胺酶、T-细胞抗原受体、超氧化物岐化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿色荧光蛋白、GroEL或竹芋蛋白。
在多个实施方案中，LRP6结合结构域以等于或小于1nM(例如0.5nM、0.1nM)的KD结合至LRP6。
在一些实施方案中，Ig样折叠是纤连蛋白的Ig样折叠，例如III型纤连蛋白的Ig样折叠(例如纤连蛋白III的组件10的Ig样折叠)。
本发明还提供对应于LRP6抗原性表位的肽。在一个方面，本发明涉及由与以下氨基酸序列之一至少90％相同的氨基酸序列组成的肽：LRP6的第一螺旋桨(SEQ ID NO：2)；NATNPCGIDN GGCSHLCLMSPVKPFYQCAC PTGVKLLENG KTCK(SEQ ID NO：3)；LRP6的第三螺旋桨(SEQ ID NO：4)；或GW NECASSNGHC SHLCLAVPVGGFVCGCPAHY SLNADNRTC(SEQ ID NO：5)。
在另一个方面，本发明提供对动物施用该组合物时导致特异地结合至LRP6的抗体的组合物。该组合物包含例如以下肽之一：LRP6的第一螺旋桨(SEQ ID NO：2)；NATNPCGIDN GGCSHLCLMS PVKPFYQCACPTGVKLLENG KTCK(SEQ ID NO：3)；LRP6的第三螺旋桨(SEQ IDNO：4)；或GW NECASSNGHC SHLCLAVPVG GFVCGCPAHYSLNADNRTC(SEQ ID NO：5)；具有少于5个氨基酸改变的肽；或它们的片段(例如包含5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸的片段)。可以修饰该肽来提高抗原性，例如通过偶联至载体蛋白质。
本发明还涉及包含本文所述LRP6结合分子的药物组合物。所述组合物包含例如LRP6结合分子和可药用的载体。
本发明还涉及使用本文所述LRP6结合分子的方法。
在一方面，本发明涉及抑制肿瘤细胞生长的方法。该方法包括将肿瘤细胞与拮抗LRP6结合分子(例如包含特异地结合至LRP6的抗体的抗原结合部分的LRP6结合分子)接触，从而稳定β-联蛋白破坏复合体，引起β-联蛋白磷酸化和降解，阻止肿瘤细胞内的Wnt途径信号转导。
在另一个方面，本发明涉及在肿瘤细胞中诱导凋亡的方法。该方法包括将肿瘤细胞或宿主细胞环境与拮抗LRP6结合分子(例如包含特异地结合至LRP6的抗体的抗原结合部分的LRP6结合分子)接触，从而稳定β-联蛋白破坏复合体，引起β-联蛋白磷酸化和降解，阻止肿瘤细胞内的Wnt途径信号转导。
在另一个方面，本发明涉及侵蚀癌性肿瘤基质支持的方法。该方法包括将肿瘤细胞与拮抗LRP6结合分子(例如包含特异地结合至LRP6的抗体的抗原结合部分的LRP6结合分子)接触，从而杀伤肿瘤所依赖的血管(血管发生或其他方式)和/或其他结构组分。
在上述情况下，可分别以对抑制肿瘤细胞生长或在肿瘤细胞中诱导凋亡有效的量施用拮抗LRP6结合分子。相对于施用组合物前的所述比例，个体的癌细胞与健康细胞的比例可降低至少10％(例如癌细胞与健康细胞的比例降低至少25％、30％、50％、60％、75％或100％)。在一些实施方案中，个体还接受化疗剂的治疗。
在一个方面，本发明的LRP6激动或拮抗结合分子可用来例如诊断、改善其症状、防御和治疗本文所定义的骨相关病症。
在一个方面，本发明涉及提高个体骨矿物质密度的方法。该方法包括以对提高骨矿物质密度有效的量对个体施用激动LRP6结合分子(例如包含特异地结合至LRP6的抗体的抗原结合部分的LRP6结合分子)。在一些实施方案中，所述激动LRP6结合分子干扰LRP6和Sclerostin间的结合事件，并能够激活、增强或保全Wnt信号传导途径，或使细胞对Wnt信号传导敏感。Sclerostin是由SOST基因编码的蛋白质，是涉及骨相关病症的Wnt信号传导途径的负调节物(Wnt信号传导对正常生理条件下的骨形成是很重要的)。
作为非限制性实例，激动LRP6结合分子能够结合至LRP6(例如结合至LRP6的第三螺旋桨)并引起β-联蛋白破坏复合体的溶解，从而使β-联蛋白稳定，转运至细胞核并结合转录因子，从而以此过程提高骨矿物质密度。作为其他非限制性实例，激动LRP6结合分子能够结合至LRP6的第三螺旋桨之外的区域。在这些情况下，所述LRP6激动抗体能够寡聚化LRP6，以激活、增强或保全Wnt信号传导或使细胞对Wnt信号传导敏感。
在另一个方面，本发明涉及降低个体骨矿物质密度的方法。该方法包括以对降低骨矿物质密度有效的量对个体施用拮抗LRP6结合分子(例如包含特异地结合至LRP6的抗体的抗原结合部分的LRP6结合分子)。在一些实施方案中，所述拮抗LRP6结合分子模拟Sclerostin的作用，从而能够以类似的方式负调节Wnt途径。
在一些实施方案中，拮抗LRP6结合分子是Wnt1特异的，并结合至LRP6的第一螺旋桨。在一些其他实施方案中，拮抗LRP6结合分子是Wnt1特异的，结合至LRP6的第一螺旋桨并阻止配体Wnt1、Wnt6和/或Wnt7与LRP6相互作用和启动Wnt途径。
在其他方面，本发明涉及改善或预防代谢综合征和/或冠状动脉病症状的方法。该方法包括以对改善或预防代谢综合征和/或冠状动脉病症状有效的量对个体施用激动LRP6结合分子(例如包含特异地结合至LRP6的抗体的抗原结合部分的LRP6结合分子)。在一些实施方案中，所述激动LRP6分子能够激活、增强或保全Wnt信号传导途径，或使细胞对Wnt信号传导敏感。作为非限制性实例，所述激动LRP6结合分子能够结合至LRP6(例如结合至LRP6的第三螺旋桨)，诱导LRP6的寡聚化，引起β-联蛋白破坏复合体的溶解，从而使β-联蛋白稳定，转运至细胞核并结合转录因子，从而以此过程改善或预防代谢综合征和/或冠状动脉病的症状。
在一些实施方案中，在静脉内施用组合物。
本发明的一个或多个实施方案的细节在以下所附的图和描述中给出。可从描述和图以及权利要求书中明白本发明的其他特征、目的和优点。
附图简述
本专利或申请文件包含至少一幅彩图。收到请求和支付必要的费用后，办公室将提供本专利或专利申请公开的带有彩图的拷贝。
图1是鉴定优先抑制Wnt1诱导的Wnt信号传导的抗-LRP6拮抗Fab的图示。
图2是鉴定优先抑制Wnt3A诱导的Wnt信号传导的抗-LRP6拮抗Fab的图示。
图3是鉴定抗-LRP6激动Fab的图示。
图4显示产生LRP6平截突变体进行LRP6结构域作图的位置。图4B以每幅图对应于不同突变体显示平截突变体的FACS分析。上一排从左至右涉及LRP6全长、LRP6缺失I和LRP6缺失II。下一排从左至右涉及LRP6缺失III、LRP缺失I和II、和LRP6缺失I和III。用抗-Flag抗体染色细胞。图4C显示以每幅图对应于不同突变体显示平截突变体的FACS分析。排列与图4B中相同，用Fab005、Fab021、Fab010、Fab004、Fab002、Fab026、Fab025和对照(抗-溶酶体Fab)染色细胞。
图5是大量Fab转化为IgG时活性变化的图示。图5A显示由Wnt1诱导，图5B显示由Wnt3A诱导。
图6是抗-LRP6结合分子抑制磷酸化的LRP6(磷酸-LRP6)的能力的图示。图6A显示PA-1(卵巢畸胎瘤)细胞中的磷酸-LRP6抑制，图6B显示NCI-H929(多发性骨髓瘤)细胞中的磷酸-LRP6抑制。
发明详述
本发明提供了结合至LRP6(低密度脂蛋白受体相关蛋白6)的分子(“LRP6结合分子”)，尤其是结合至人LRP6并调节其功能的人抗体和其部分。本文还提供LRP6的表位和结合这些表位的药物。
人LRP6(hLRP6)的全长序列见于
Figure GPA00001127558200141
检索号GI：148727288、gb|NP_002327，其在表I中显示为SEQ ID NO：1。编码hLRP6的mRNA序列见于检索号GI：148727287、NM_002336。
表1：人LRP6氨基酸序列
1    MGAVLRSLLA CSFCVLLRAA PLLLYANRRD LRLVDATNGK ENATIVVGGL EDAAAVDFVF
61   SHGLIYWSDV SEEAIKRTEF NKTESVQNVV VSGLLSPDGL ACDWLGEKLY WTDSETNRIE
121  VSNLDGSLRK VLFWQELDQP RAIALDPSSG FMYWTDWGEV PKIERAGMDG SSRFIIINSE
181  IYWPNGLTLD YEEQKLYWAD AKLNFIHKSN LDGTNRQAVV KGSLPHPFAL TLFEDILYWT
241  DWSTHSILAC NKYTGEGLRE IHSDIFSPMD IHAFSQQRQP NATNPCGIDN GGCSHLCLMS
301  PVKPFYQCAC PTGVKLLENG KTCKDGATEL LLLARRTDLR RISLDTPDFT DIVLQLEDIR
361  HAIAIDYDPV EGYIYWTDDE VRAIRRSFID GSGSQFVVTA QIAHPDGIAV DWVARNLYWT
421  DTGTDRIEVT RLNGTMRKIL ISEDLEEPRA IVLDPMVGYM YWTDWGEIPK IERAALDGSD
481  RVVLVNTSLG WPNGLALDYD EGKIYWGDAK TDKIEVMNTD GTGRRVLVED KIPHIFGFTL
541  LGDYVYWTDW QRRSIERVHK RSAEREVIID QLPDLMGLKA TNVHRVIGSN PCAEENGGCS
601  HLCLYRPQGL RCACPIGFEL ISDMKTCIVP EAFLLFSRRA DIRRISLETN NNNVAIPLTG
661  VKEASALDFD VTDNRIYWTD ISLKTISRAF MNGSALEHVV EFGLDYPEGM AVDWLGKNLY
721  WADTGTNRIE VSKLDGQHRQ VLVWKDLDSP RALALDPAEG FMYWTEWGGK PKIDRAAMDG
781  SERTTLVPNV GRANGLTIDY AKRRLYWTDL DTNLIESSNM LGLNREVIAD DLPHPFGLTQ
841  YQDYIYWTDW SRRSIERANK TSGQNRTIIQ GHLDYVMDIL VFHSSRQSGW NECASSNGHC
901  SHLCLAVPVG GFVCGCPAHY SLNADNRTCS APTTFLLFSQ KSAINRMVID EQQSPDIILP
961  IHSLRNVRAI DYDPLDKQLY WIDSRQNMIR KAQEDGSQGF TVVVSSVPSQ NLEIQPYDLS
1021 IDIYSRYIYW TCEATNVINV TRLDGRSVGV VLKGEQDRPR AVVVNPEKGY MYFTNLQERS
1081 PKIERAALDG TEREVLFFSG LSKPIALALD SRLGKLFWAD SDLRRIESSD LSGANRIVLE
1141 DSNILQPVGL TVFENWLYWI DKQQQMIEKI DMTGREGRTK VQARIAQLSD IHAVKELNLQ
1201 EYRQHPCAQD NGGCSHICLV KGDGTTRCSC PMHLVLLQDE LSCGEPPTCS PQQFTCFTGE
1261 IDCIPVAWRC DGFTECEDHS DELNCPVCSE SQFQCASGQC IDGALRCNGD ANCQDKSDEK
1321 NCEVLCLIDQ FRCANGQCIG KHKKCDHNVD CSDKSDELDC YPTEEPAPQA TNTVGSVIGV
1381 IVTIFVSGTV YFICQRMLCP RMKGDGETMT NDYVVHGPAS VPLGYVPHPS SLSGSLPGMS
1441 RGKSMISSLS IMGGSSGPPY DRAHVTGASS SSSSSTKGTY FPAILNPPPS PATERSHYTM
1501 EFGYSSNSPS THRSYSYRPY SYRHFAPPTT PCSTDVCDSD YAPSRRMTSV ATAKGYTSDL
1561 NYDSEPVPPP PTPRSQYLSA EENYESCPPS PYTERSYSHH LYPPPPSPCT DSS (SEQ I
(SEQ ID NO：1)
人LRP6蛋白质序列(SEQ ID NO：1)内的结构域定位如下：信号肽可见于SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-19；四个YWTD(酪氨酸、色氨酸、苏氨酸和天冬氨酸)-型β-螺旋桨结构域(其每一个形成六瓣式β-螺旋桨结构(Springer(1998)J.Mol.Biol.；283：837；Jeon等人(2001)Nat.Struct.Biol.22：1172))可见于SEQ ID NO：1的氨基酸20-326、SEQ ID NO：1的氨基酸327-630、SEQ ID NO：1的氨基酸631-932、SEQ ID NO：1的氨基酸933-1246。人HRP6在N42、N81、N281、N433、N486、N692、N859、N865、N926和N1039处N-糖基化。
小鼠LRP6的氨基酸序列具有GenBank检索号GI：148727327、NP_032540。果蝇属的Arrow序列见于检索号GI：24653390、NP_524737，非洲爪蟾属(Xenopus)的LRP6序列见于检索号GI：10280605、AAG15429。人LRP6是通过其与LRP5的同源性而鉴定的，LRP5最初是通过其与LDLR(低密度脂蛋白受体)的同源性而分离的。Arrow/LRP5/LRP6是分别具有1678、1615和1613个氨基酸残基的I型单跨膜蛋白质。LRP5和LRP6在胞外域和胞内域中分别具有73％和64％的同一性，而Arrow同等地与LRP5和LRP6相关(40％相同)。事实上，在培养的果蝇细胞中，LRP6在Wg信号传导过程中替换Arrow(Schweizer等人(2003)BMC Cell Biol.4，4)，组成性活化的Arrow在哺乳动物细胞和非洲爪蟾胚胎中激活Wnt/β-联蛋白信号传导(Tamai等人(2004)Nature 407：530)。
定义
如本文所用，术语“Wnt信号传导相关病症”指与异常Wnt信号传导相关的疾病和病症，其包括但不限于癌症，例如结肠直肠癌(CRC)、黑素瘤、乳腺癌、肝癌、肺癌和胃癌；其他非致癌的增生性疾病，如增生性皮肤病(例如牛皮癣、皮炎)；骨质疏松症；骨关节炎；纤维化病症；精神分裂症；血管病；心脏病；异常的头发生长或生发困难；创伤愈合；再生性需要(肝、肺、肢)；和神经变性疾病，如阿尔茨海默病。Wnt信号传导的异常上调与癌症、骨关节炎和多囊肾病相关，而Wnt信号传导的异常下调与骨质疏松症、肥胖症、糖尿病和神经元变性疾病相关。
如本文所用，“Wnt信号传导相关癌症”包括但不限于结肠直肠癌(CRC)、黑素瘤、乳腺癌、肝癌、肺癌和胃癌。如本文所用，术语“Wnt相关癌症”还包含恶性髓母细胞瘤和其他原发性CNS恶性神经外胚层瘤、横纹肌肉瘤、肺癌、肠源肿瘤(包括但不限于食道、胃、胰腺和胆管系统的癌症)；前列腺癌和膀胱癌；结肠癌；白血病和其他血液癌症(例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)和骨髓增生异常综合征(MDS))；和淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)。
如本文所用，“调节”指直接或间接地控制或影响的能力，作为非限制性实例，可以选择地表示抑制或刺激、激动或拮抗、妨碍或促进以及加强或减弱。
如本文所用，“拮抗”指抑制或阻止例如信号传导途径(如Wnt)的能力。作为实例，通过例如干扰LRP6结合Wnt途径成员(例如DKK1(dickkopf1)、DKK2、DKK4、SOST1、SOSD1(USAG1)、sFRP(可溶性Fzd相关蛋白)1-4、Wise或Wnt配体)的能力，本发明的拮抗LRP6结合分子可以阻止经由Wnt信号传导途径的信号转导，从而促进β-联蛋白的磷酸化和降解。
如本文所用，“激动”指引起、促进、增强或帮助例如信号传导途径(如Wnt)的能力。作为实例，通过例如促进LRP6结合Wnt途径成员(例如DKK1(dickkopf1)、DKK2、DKK4、SOST1、SOSD1(USAG1)、sFRP(可溶性Fzd相关蛋白)1-4、Wise或Wnt配体)的能力，本发明的激动LRP6结合分子可以促进或增强经由Wnt信号传导途径的信号转导，从而阻止β-联蛋白的磷酸化和降解(从而允许β-联蛋白到达细胞核并结合转录因子)。
如本文所用，“骨相关病症”包含其中骨矿物质密度(BMD)相对于健康个体异常和/或病理性地偏高的病症，和其中骨矿物质密度(BMD)相对于健康个体异常和/或病理性地偏低的病症。表征为高BMD的病症包括但不限于硬化性狭窄病、Van Buchem病、骨质增生病症和过度生长综合征(SGBS)。表征为低BMD和/或骨脆性的病症包括但不限于原发性和继发性骨质疏松症、骨质减少、骨软化症、骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征(OPPG)、成骨不全(OI)、无血管性坏死(骨坏死)、骨折和植入物愈合(牙植入物和髋植入物)和由其他病症引起的骨丢失(例如与HIV感染、癌症或关节炎相关的)。其他“骨相关病症”包括但不限于类风湿性关节炎、骨关节炎、骨折、关节炎和溶骨性病变的形成和/或存在。
如本文所用，“纤维化病症”指人类中的任何纤维化病症，其特征为过度的成纤维细胞或肌成纤维细胞增殖和结缔组织基质(包括胶原、纤连蛋白和糖胺聚糖(GAG))的产生。所述病症包括但不限于：皮肤瘢痕形成；进行性系统性硬化病(PSS)；肝硬化；特发性和药理性诱发的肺纤维化；慢性移植物抗宿主病；硬皮病(局部的和系统性的)；佩罗尼病；做膀胱镜后的尿道狭窄；手术后的内部粘连；特发性和药理性诱发的腹膜后纤维化；和骨髓纤维化。
如本文所用，“纤维化病症”还包括但不限于肺纤维化病症(例如辐射诱发的纤维化以及与哮喘、COPD和结节病相关的纤维化)；肝纤维化病症(例如酒精性、丙肝相关性和原发性胆汁性纤维化，以及非酒精性脂肪变性、硬化性胆管炎和源自血吸虫病的纤维化)；肾纤维化病症(例如糖尿病肾病、狼疮性肾小球硬化症、奥尔波特综合征和慢性肾移植排斥)；心血管纤维化病症(例如心肌梗塞后瘢痕形成、心脏肥大、动脉再狭窄和动脉粥样硬化)；皮肤纤维化病症(例如肥厚性瘢痕形成、灼伤瘢痕形成和肾源性纤维化皮肤病)；眼纤维化病症(例如玻璃体视网膜病变和眼球后纤维化)。
本发明的LRP6结合分子的“治疗有效剂量”可导致疾病症状的严重度的降低(例如与异常高的Wnt信号传导相关的病症症状的降低(例如肿瘤细胞数目、生长速率或恶性程度的降低)，或与异常低的Wnt信号传导相关的病症症状的降低(例如LDL和甘油三酯水平的增加))、无疾病症状时期的频率和持续时间的增加、或预防由于遭受疾病而使功能缺损或失能。
术语“个体”旨在包括患有或遭受与异常的Wnt信号传导相关的疾病、病症或病状的生物体，例如真核生物。个体的实例包括哺乳动物，例如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在某些实施方案中，个体是人，例如患有、具有罹患风险的或可能能够患上癌症(例如结肠癌)和其他增生性疾病、骨质疏松和精神分裂症、和本文所述的其他疾病或病状(例如Wnt信号传导相关病症)的人。
如本文所用，术语“抗体”指完整抗体或其抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链(即轻链或重链)。完整抗体是包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个结构域组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由CL一个结构域组成。VH和VL区可进一步再分为高变区(称为互补决定区(CDR))，其与更保守的区域(称为框架区(FR))互相间隔。每条VH和VL由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”指完整抗体的一个或多个片段，其保持了特异结合至给定抗原(例如hLRP6)的能力。抗体的抗原结合功能可以通过完整抗体的片段执行。包含于术语抗体的“抗原结合部分”的结合片段的实例包含Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，其是包含通过铰链区二硫键连接的两个Fab片段(一般一个来自重链，一个来自轻链)的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；单结构域抗体(dAb)片段(Ward等人1989 Nature 341：544-546)，其由VH结构域组成；和分离的互补决定区(CDR)。
此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由独立的基因编码，但可用重组方法，通过人工肽连接体将它们连接，使它们能被制备为单蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见如Bird等人1988 Science 242：423-426；和Huston等人1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。这类单链抗体包含抗体的一个或多个“抗原结合部分”。这些片段用本领域技术人员已知的常规技术获得，并以与完整抗体相同的方式，筛选这些片段的效用。
还可将抗原结合部分掺入单结构域抗体、大抗体(maxibodies)、微抗体(minibodies)、细胞内抗体、二价抗体、三价抗体、四价抗体、v-NAR和双-scFv中(参见如Hollinger和Hudson，2005，Nature Biotechnology，23，9，1126-1136)。抗体的抗原结合部分可以移植到基于多肽(如III型纤连蛋白(Fn3))的框架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽单价抗体)。
抗原结合部分可以掺入包含一对串联Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人1995 Protein Eng.8(10)：1057-1062；和美国专利号5,641,870)。
如本文所用，术语“骆驼抗体”指完整抗体蛋白质的一个或多个片段，所述完整抗体蛋白质获得自骆驼和单峰骆驼(双峰驼(Camelus bactrianus)和Calelus dromaderius)科的成员，包括新大陆的成员例如美洲驼羊(Llama)种(美洲驼(Lama paccos)、大羊驼(Lama glama)和小羊驼(Lama vicugna))。可以通过基因工程获得被鉴定为VHH的小的、单可变结构域的骆驼抗体区域，以产生对靶标具有高度亲和力的小蛋白质，得到低分子量的来自抗体的被称为“骆驼纳米抗体(nanobody)”的蛋白质。见美国专利号5,759,808；还见Stijlemans等人2004 J.Biol.Chem.279：1256-1261；Dumoulin等人2003 Nature 424：783-788；Pleschberger等人2003 Bioconjugate Chem.14：440-448；Cortez-Retamozo等人2002 Int.J.Cancer 89：456-62；和Lauwereys.等人1998 EMBO J.17：3512-3520。
如本文所用，“分离的LRP6结合分子”指基本不含对LRP6以外的抗原具有抗原特异性的分子的结合分子(例如分离的特异结合hLRP6的抗体基本不合特异结合hLRP6以外抗原的抗体)。然而，分离的特异结合hLRP6的结合分子可以对其他抗原具有交叉反应性，例如来自其他物种的LRP6分子。若基本不含细胞物质，则结合分子是“纯化的”。
如本文所用，术语“单克隆抗体组合物”指单分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物针对具体表位显示单一结合特异性和亲和力。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包含具有其中框架区和CDR区均源自人源序列的可变区的抗体。此外，若抗体包含恒定区，则恒定区也源自该人序列，例如人种系序列、或人种系序列的突变版本。本发明的人抗体可以包含不是由人序列编码的氨基酸残基(例如通过在体外随机或位点专一诱变或通过在体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”并不旨在包含其中源自其他哺乳动物物种的种系(如小鼠)的CDR序列已被移植至人框架序列中的抗体。
术语“人单克隆抗体”指显示单一结合特异性的抗体，其具有其中框架区和CDR区均源自人序列的可变区。在一个实施方案中，通过杂交瘤产生人单克隆抗体，该杂交瘤包含与永生化细胞融合的获自转基因非人类动物(例如转基因小鼠，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组)的B细胞。
如本文所用，术语“重组人抗体”包含通过重组方法制备、表达、产生或分离的任何人抗体，例如分离自人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或从其制备的杂交瘤的抗体；分离自经转化表达人抗体的宿主细胞的抗体，例如分离自转染瘤；分离自重组的组合人抗体文库的抗体；通过包括剪接人免疫球蛋白基因的全部或部分序列至另一DNA序列的任何其他方法而制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人抗体具有可变区，其中框架区和CDR区源自人种系的免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，这类重组人抗体可进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，从而使重组抗体VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，虽然其源自和涉及人种系的VH和VL序列，但可以不是天然存在于人中的人抗体种系的所有成分中。
如本文所用，“同种型”指重链恒定区基因编码的抗体种类(例如IgM、IgE、IgG(如IgG1或IgG4))。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合至抗原的抗体”可互换使用。
如本文所用，“特异结合至LRP6”的LRP6结合分子(例如抗体或其抗原结合部分)是指以1×10-7M或更小的KD结合至LRP6的LRP6结合分子。“与抗原交叉反应”的LRP6结合分子(例如抗体)是指以1×10-6M或更小的KD结合该抗原的LRP6结合分子。与给定抗原“不发生交叉反应”的LRP6结合分子(例如抗体)是指这样的LRP6结合分子，其不能以可检测的水平结合至给定抗原，或者以1×10-5M或更大的KD结合给定抗原。在某些实施方案中，在标准结合测定中，这类不与抗原交叉反应的结合分子针对这些蛋白质具有基本不可检测的结合。
如本文所用，当提到IgG抗体时，术语“高亲和力”指抗体对靶抗原具有10-9M或更小的KD。
若核苷酸序列被改变为使用生产细胞或生物中优选的密码子来编码氨基酸序列，则所述核苷酸序列称作“优化的”，所述生产细胞或生物一般是真核细胞，例如酵母细胞如毕赤酵母(Pichia)、昆虫细胞、哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞。优化的核苷酸序列被改造为编码与最初的原始核苷酸序列(也称作“亲本”序列)所编码的氨基酸序列相同或几乎相同的氨基酸序列。
在以下部分中更详细地描述本发明的多个方面。
本领域已知用来评价分子结合至多个物种的LRP6和LRP6特定表位的能力的标准测定，包括例如ELSA和蛋白质印记。可使用肽表位竞争测定来测定LRP6结合分子是否结合至LRP6的特异表位。例如，在肽的饱和浓度下，将LRP6结合分子与对应于LRP6目的表位的肽孵育。例如通过分析，对预孵育的LRP6结合分子与固定化的LRP6的结合进行测试。与肽的预孵育对LRP6结合的抑制表明LRP6结合分子结合至该肽表位(参见如美国专利公开物20070072797)。还可通过本领域已知的标准测定来评价结结合动力学，例如通过
Figure GPA00001127558200212
分析或通过FACS分析表观结合。下文更详细地描述了评估LRP6结合分子对LRP6功能特性的影响的测定法。
因此，如根据本领域已知的和本文所述的方法测定，“抑制”一种或多种这些LRP6功能特性(例如生化、细胞、生理或其他生物学活性等)的LRP6结合分子应理解为，相对于无结合分子时所观察到的(例如在具有不相关的特异性的对照分子存在时)，在具体的功能特性中产生统计学上显著的降低。抑制LRP6活性的LRP6结合分子造成所测量参数降低至少5％这样的统计学显著的降低。在某些实施方案中，与对照相比，拮抗抗体或其他LRP6结合分子可以在所选择的功能特性中产生至少10％、20％、30％或50％的降低。
在一些实施方案中，通过测量Wnt信号传导途径中的蛋白质或蛋白质稳定性水平(例如Wnt、Wise、DKK1、DKK2、DKK4、SOST1、SOSD1(USAG1)、sFRP(可溶性Fzd相关蛋白)1-4、Axin或β-联蛋白)来测定LRP6抑制。在其他实施方案中，生物学、生理学和/或形态学变化表明LRP6结合分子抑制LRP6，例如抑制肿瘤细胞的生长或在肿瘤细胞中诱导凋亡；或降低骨矿物质密度。
相反，激动或促进LRP6活性的LRP6结合分子造成所测量参数增加至少5％这样的统计学显著的增加。在某些实施方案中，与对照相比，激动抗体或其他LRP6结合分子可以在所选择的功能特性中产生至少10％、20％、30％或50％的增加。
在一些实施方案中，通过测量Wnt信号传导途径下游mRNA信使或蛋白质的表达或稳定性水平(例如Axin、Axin2、β-联蛋白、VEGF、cMyc、细胞周期蛋白D1、SNAIL)来测定LRP6抑制。在其他实施方案中，生物学、生理学和/或形态学变化表明LRP6结合分子抑制Wnt信号传导，例如低于正常的骨矿物质密度或胰岛素分泌。
抗体
本文所述抗-LRP6抗体包含人单克隆抗体。在一些实施方案中，将结合至LRP6的抗体的抗原结合部分(例如VH和VL链)被“混合和搭配”，产生其他抗-LRP6的结合分子。可以使用前述结合测定法(例如FACS、ELISA)测试这类“混合和搭配”的抗体的结合。当选择VH与特定VL序列混合和搭配时，通常选择在结构上与其在与VL配对中所代替的VH相似的VH。类似地，一般用结构上类似的全长重链序列代替来自具体全长重链/全长轻链配对的全长重链序列。类似地，应当用结构上类似的VL序列代替来自具体VH/VL配对的VL序列。类似地，应当用结构上类似的全长轻链序列代替来自具体全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列。在本文中，鉴定结构相似性是本领域公知的方法。
在其他方面，本发明提供包含一个或多个LRP6结合抗体的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3(以各种组合)的抗体。考虑到这些抗体中的每一个都能够结合至LRP6，且抗原结合特异性主要由CDR1、2和3区域提供，所以可以将VH CDR1、2和3序列与VL CDR1、2和3“混合和搭配”(即来自不同抗体的CDR可以混合和搭配)。可以使用本文所述的结合测定法(例如ELISA)来测试这类“混合和搭配”的抗体的LRP6结合。当混合和搭配VH CDR序列时，应当用结构上类似的CDR序列代替来自具体VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。类似地，当混合和搭配VL CDR序列时，应当用结构上类似的CDR序列代替来自具体VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。在本文中，鉴定结构相似性是本领域公知的方法。
如本文所用，人抗体包含重链或轻链可变区或全长重链或轻链，若抗体的可变区或全长链获得自用人种系的免疫球蛋白基因作为序列来源的体系，则所述重链或轻链可变区或全长重链或轻链是具体种系序列的“产物”或者“源自”或“产生自”具体的种系序列。在一个这样的体系中，人抗体产生于带有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠中。用目的抗原(例如本文所述的hLRP6表位)免疫转基因小鼠。或者，提供展示于噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库并用目的抗原(例如本文所述的hLRP6或hLRP6表位)筛选文库来鉴定人抗体。
作为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或者“源自”或“产生自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体可以如下鉴定：将人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列比较，并选择在序列上与人抗体序列最接近(即最大的同一性百分数)的人种系免疫球蛋白序列。作为具体人种系免疫球蛋白序列的“产物”或者“源自”或“产生自”具体人种系免疫球蛋白序列的人抗体可以包含与该种系编码的序列相比不同的氨基酸，这归因于例如天然存在的体细胞突变或人工位点定向突变。然而，选择的人抗体通常具有与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，并包含与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠种系序列)比较时人抗体被鉴定为属于人的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体在氨基酸序列上可与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少60％、70％、80％、90％，或至少95％，或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。
为了两条序列的最佳比对，要考虑需要引入的缺口数和每个缺口的长度，两条序列之间的同一性百分数是序列共享的相同位置数目的函数(即，同一性％＝相同位置数/总位置数x 100)。使用PAM120权重残数表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分，用E.Meyers和W.Miller(1988 Comput.Appl.Biosci.，4：11-17)的算法来确定序列的比较和两条序列间同一性百分数的测定，所述算法已被引入ALIGN程序(2.0版)。
通常，产生自具体人种系序列的人抗体的VH或VL将显示与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过10个氨基酸的差异。在某些情况下，人抗体的VH或VL可显示与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过5个，或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸的差异。
骆驼抗体
已经针对大小、结构复杂性和对人类个体的抗原性，表征了从骆驼和单峰骆驼(双峰驼和Calelus dromaderius)科的成员获得的抗体蛋白质，所述成员包括新大陆的成员，例如美洲驼羊物种(美洲驼、大羊驼和小羊驼)。在该科哺乳动物中天然存在的某些IgG抗体缺乏轻链，因此在结构上与其他动物抗体的两条重链和两条轻链的典型四链的四级结构不同。参见WO 94/04678。
可以通过遗传工程获得被鉴定为VHH的小的、单可变结构域的骆驼抗体区，以产生对靶标具有高亲和力的小蛋白质，得到低分子量的、产生自抗体的、称作“骆驼纳米抗体”的蛋白质。见美国专利号5,759,808；还见Stijlemans等人2004 J.Biol.Chem.279：1256-1261；Dumoulin等人2003Nature 424：783-788；Pleschberger等人2003 Bioconjugate Chem.14：440-448；Cortez-Retamozo等人2002 Int.J.Cancer 89：456-62；和Lauwereys等人1998 EMBO J.17：3512-3520。经改造的骆驼抗体和抗体片段文库可从商业上获自例如Ablynx，Ghent，比利时。与非人来源的其他抗体一样，可以通过重组方法改变骆驼抗体的氨基酸序列，获得更类似于人序列的序列，即可以将纳米抗体“人源化”。因此，可以进一步降低骆驼抗体对人的天然低抗原性。
骆驼纳米抗体具有约为人IgG分子十分之一的分子量，且蛋白质仅具有几纳米的物理直径。小尺寸的一个结果是骆驼纳米抗体能结合对更大的抗体蛋白质在功能上不可见的抗原位点的能力，即骆驼纳米抗体适合用作检测使用经典免疫学技术时以其他方式隐藏的抗原的试剂，且适合用作可能的治疗剂。因此，小尺寸的另一个结果是骆驼纳米抗体由于结合至靶蛋白的沟或窄裂口中的特异位点而能够抑制，并因此可发挥与经典抗体相比更类似于经典低分子量药物功能的能力。
低分子量和致密尺寸进一步导致骆驼纳米抗体的极端耐热、对极端pH和蛋白水解消化稳定且免疫原性弱。另一结果是骆驼纳米抗体易于从循环系统移动进入组织甚至穿过血脑屏障，并且能够治疗影响神经组织的病症。纳米抗体可进一步促进药物转运穿过血脑屏障。见2004年8月19日公开的美国专利公开号20040161738。这些特征与在人中的低抗原性结合，表明巨大的治疗潜能。另外，这些分子可在原核细胞例如大肠杆菌中充分表达。
因此，本发明的一种特征是对LRP6具有高亲和力的骆驼抗体或骆驼纳米抗体。在本文的某些实施方案中，骆驼抗体或纳米抗体天然产生于骆驼科动物中，即，使用本文针对其他抗体所述的技术，在用LRP6或其肽片段免疫后由骆驼产生。或者，改造抗-LRP6骆驼纳米抗体，即以本文所述的LRP6或LRP6表位为靶标而使用淘选方法，从展示恰当突变的骆驼纳米抗体蛋白质的噬菌体文库中选择产生。可以通过遗传工程进一步定制改造的纳米抗体，将在受体个体中的半衰期从45分钟增加至两周。
双价抗体
双价抗体是二价的、双特异性的分子，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，通过连接体连接，该连接体很短因而不允许同一条链上的两个结构域间配对。VH和VL结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger等人1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak等人1994 Structure 2：1121-1123)。可以通过在同一细胞中表达具有结构VHA-VLB和VHB-VLA(VH-VL构型)或VLA-VHB和VLB-VHA(VL-VH构型)的两条多肽链而产生双价抗体。其中大部分可以以可溶形式在细菌中表达。
通过用约15个氨基酸残基的连接体将形成双价抗体的两条多肽链连接，产生单链双价抗体(scDb)(见Holliger和Winter，1997 Cancer Immunol.Immunother.，45(3-4)：128-30；Wu等人1996 Immunotechnology，2(1)：21-36)。可以以可溶的活性单体形式在细菌中表达scDb(见Holliger和Winter，1997Cancer Immunol.Immunother.，45(34)：128-30；Wu等人1996 Immunotechnology，2(1)：21-36；Pluckthun和Pack，1997Immunotechnology，3(2)：83-105；Ridgway等人1996 Protein Eng.，9(7)：617-21)。
双价抗体可以与Fc融合，产生“双-双价抗体”(见Lu等人2004 J.Biol.Chem.，279(4)：2856-65)。
经改造和经修饰的抗体
可以使用具有一个或多个VH和/或VL序列的抗体作为起始材料来改造经修饰的抗体，从而制备本发明的抗体，所述经修饰的抗体可具有相对于起始抗体改变的特性。可以通过修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)内，例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内的一个或多个残基，来改造抗体。此外或备选地，可以通过修饰恒定区内的残基来改造抗体，例如改变抗体的效应物功能。
可以进行的一种可变区改造是CDR移植。抗体主要通过位于六个重链和轻链CDR中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，CDR中的氨基酸序列比CDR外的序列在各抗体之间的差异更大。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，所以可能通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包含来自特定天然存在的抗体的CDR序列，所述CDR序列被移植到来自具有不同特性的不同抗体的框架序列(参见例如Riechmann等人1998 Nature 332：323-327；Jones等人1986 Nature 321：522-525；Queen等人1989 Proc.Natl.Acad，见美国86：10029-10033；美国专利号5,225,539和美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370)。
框架序列可获得自包含种系抗体基因序列的公共DNA数据库或出版的参考文献。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于“Vbase”人种系序列数据库(可在因特网上www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase处获得)中，以及Kabat等人1991 Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，美国卫生和人类服务部，NIH Publication No.91-3242；Tomlinson等人1992 J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox等人1994 Eur.J.Immunol.24：827-836；其中每篇参考文献的内容在此明确引用作为参考。
可以将VH CDR1、2和3序列和VL CDR1、2和3序列移植至框架区，所述框架区具有与在框架序列所源自的种系免疫球蛋白基因中的框架区相同的序列，或者可以将CDR序列移植至与种系序列相比包含一个或多个突变的框架区。例如，已发现在某些情况下框架区内的残基突变对维持或增强抗体的抗原结合能力是有益的(参见例如美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370)。
也可以将CDR移植入免疫球蛋白结构域以外的多肽框架区中。适当的支架形成构象稳定的框架，所述框架展示移植的残基，以使它们形成定位的表面并结合目的靶标(例如LRP6)。例如，可以将CDR移植至支架上，其中框架区基于纤连蛋白、锚蛋白、脂质运载蛋白、新制癌菌素、细胞色素b、CP1锌指、PST1、卷曲螺旋、LACI-D1、Z结构域或淀粉酶抑肽(参见例如Nygren和Uhlen，1997 Current Opinion in Structural Biology，7，463-469)。
另一种类型的可变区修饰是使VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区中的氨基酸残基突变，从而改进目的抗体的一个或多个结合特性(例如亲和力)，这称作“亲和力成熟”。可进行位点定向诱变或PCR介导的诱变以引入突变，并且可如本文所述在体外或体内测定中评估对抗体结合或其他目的功能特性的影响。可以引入保守修饰。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。此外，通常改变CDR区中不超过一个、两个、三个、四个或五个的残基。
本发明的经改造的抗体包含对其中VH和/或VL内的框架残基进行了修饰例如以改进抗体特性的抗体。通常进行这类框架修饰来降低抗体的免疫原性。例如，一种途径是将一个或多个框架残基“回复突变”为相应的种系序列。更具体而言，经历过体细胞突变的抗体可包含与产生抗体的种系序列不同的框架残基。可以通过比较抗体框架序列与产生抗体的种系序列来鉴定这类残基。为了将框架区序列回复为其种系构型，可以通过例如位点定向诱变或PCR介导的诱变，将体细胞突变“回复突变”为种系序列。这类“回复突变的”抗体也涵盖在本发明中。
框架修饰的另一种类型涉及框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基的突变，以去除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。该途径也称作“去免疫化”，并且在Carr等人的美国专利公开号20030153043中进一步详细描述。
除了在框架或CDR区内进行的修饰以外或备选地，可以将本发明的抗体改造为在Fc区内包含修饰，通常来改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性的细胞毒性。此外，本发明的抗体可以进行化学修饰(例如可将一个或多个化学部分连接至抗体)，或修饰改变其糖基化，进而改变抗体的一种或多种功能特性。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区以改变铰链区中半胱氨酸残基的数量，例如增加或减少。此方法进一步描述于Bodmer等人的美国专利号5,677,425中。改变CH1铰链区中的半胱氨酸残基数，从而例如帮助轻链和重链的组装，或提高或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，突变抗体的Fc铰链区以降低抗体的生物半衰期。更明确地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中，使抗体相对于天然Fc-铰链结构域的葡萄球菌蛋白质A(SpA)结合而言具有受损的SpA结合。此方法在Ward等人的美国专利号6,165,745中进一步详细描述。
在另一个实施方案中，修饰抗体以提高其生物半衰期。多种途径是可能的。例如，美国专利号6,277,375描述了提高其体内半衰期的IgG中的以下突变：T252L、T254S、T256F。备选地，为了提高生物半衰期，可以在CH1或CL区内将抗体改变为包含补救受体结合表位，所述补救受体结合表位取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。
还在其他实施方案中，通过用不同的氨基酸残基代替至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应物功能。例如，可以用不同的氨基酸残基代替一个或多个氨基酸，使抗体针对效应物配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。与之亲和力改变的效应物配体可以是例如Fc受体或补体的C1成分。此途径在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中进一步详细描述。
在另一个实施方案中，可以用不同的氨基酸残基代替一个或多个选自氨基酸残基的氨基酸，使抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。此途径在Idusogie等人的美国专利号6,194,551中进一步详细描述。
在另一个实施方案中，改变一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体结合补体的能力。此途径在Bodmer等人的WO 94/29351中进一步描述。
还在另一个实施方案中，通过修饰一个或多个氨基酸来修饰Fc区，以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力，和/或提高抗体对Fcγ受体的亲和力。此途径在Presta的WO 00/42072中进一步描述。此外，已对人IgG1上针对FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点进行了作图，并描述了具有改进的结合的变体(见Shields，R.L.等人2001 J.Biol.Chem.276：6591-6604)。
还在另一个实施方案中，改变了抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化来例如提高抗体对抗原的亲和力。可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现这类糖类修饰。例如，可以进行导致一个或多个可变区框架糖基化位点消除的一个或多个氨基酸取代，从而消除该位点上的糖基化。这种无糖基化可提高抗体对抗原的亲和力。该途径在Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细描述。
此外或备选地，可以产生具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有减少的岩藻糖残基含量的低岩藻糖基化抗体，或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。这类改变的糖基化模式已显示提高抗体的ADCC能力。可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现这类糖修饰。具有改变的糖基化机制的细胞是本领域中已描述过的，并且可以用作在其中表达本发明重组抗体的宿主细胞，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了下述细胞系，该细胞系具有功能性断裂的编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因，使得在该细胞系中表达的抗体显示低岩藻糖基化。Presta的PCT公开号WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其具有降低的将岩藻糖连接至连接Asn(297)的糖类的能力，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(还见Shields，R.L.等人2002 J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的WO 99/54342描述了改造为表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如β(1，4)-N乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在经改造的细胞系中表达的抗体显示增加的二等分GlcNac结构，其导致抗体的提高的ADCC活性(也见Umana等人1999 Nat.Biotech.17：176-180)。
本发明关注的本文中抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以使抗体聚乙二醇化，以例如提高抗体的生物(例如血清)半衰期。为了将抗体聚乙二醇化，通常将抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛衍生物，在一个或多个PEG部分成为与抗体或抗体片段结合的条件下反应。可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行聚乙二醇化。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在包含用于衍生化其他蛋白质的任意形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，进行聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。聚乙二醇化蛋白质的方法是本领域已知的，并可应用于本发明的抗体。见例如Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。
此外，通过引入非天然氨基酸，可以在本发明的LRP6结合多肽的任何部分中实现聚乙二醇化。可以通过Deiters等人J Am Chem Soc 125：11782-11783，2003；Wang和Schultz，Science 301：964-967，2003；Wang等人Science 292：498-500，2001；Zhang等人Science 303：371-373，2004或美国专利号7,083,970中所述的技术引入某些非天然氨基酸。简言之，这些表达体系中的一些涉及位点定向诱变，从而将无义密码子例如琥珀TAG引入编码本发明多肽的开放读码框中。然后将这类表达载体引入宿主中，所述宿主能够利用对所引入的无义密码子特异且带有选择的非天然氨基酸的tRNA。对将部件与本发明多肽缀合的目的而言，有益的具体非天然氨基酸包含具有乙炔和叠氮基侧链的氨基酸。然后可以将包含这些新氨基酸的多肽在蛋白质中这些选定位点上聚乙二醇化。
改造抗体的方法
如上文所讨论，可以使用抗-LRP6抗体，通过修饰全长重链和/或轻链序列、VH和/或VL序列或与之连接的恒定区，来产生新的抗-LRP6抗体。例如，可以将抗体的一个或多个CDR区与已知的框架区和/或其他CDR重组组合，产生新的、重组改造的抗-LRP6抗体。其他修饰类型包含前一部分中所述的修饰。改造方法的起始材料是一条或多条VH和/或VL序列，或其一个或多个CDR区。为了产生经改造的抗体，不必实际地制备(即作为蛋白质表达)具有一个或多个VH和/或VL序列或其一个或多个CDR区的抗体。相反，将序列中包含的信息用作起始材料，产生源自最初序列的“第二代”序列，然后制备“第二代”序列并表达为蛋白质。
可使用标准分子生物学技术制备和表达改变的抗体序列。改变的抗体序列所编码的抗体是保留了其所源自的抗LRP6抗体的一种、一些或所有功能特性的抗体，所述功能特性包括但不限于特异地结合至LRP6、干扰LRP6结合Wnt途径成员(例如DKK1(dickkopf1)、DKK2、DKK4、SOST1、SOSD1(USAG1)、sFRP(可溶性Fzd相关蛋白)1-4、Wise或Wnt配体)的能力和调节β-联蛋白磷酸化和降解。可以使用本领域中可获得的和/或本文所述的标准测定法(例如ELISA)来评价改变的抗体的功能特性。
在本发明的改造抗体的方法的某些实施方案中，可以沿着抗-LRP6抗体编码序列的整体或部分，随机地或选择性地引入突变，并可如本文所述，针对结合活性和/或其他功能特性(例如特异地结合至LRP6、干扰LRP6结合Wnt途径成员(例如DKK1(dickkopf1)、DKK2、DKK4、SOST1、SOSD1(USAG1)、sFRP(可溶性Fzd相关蛋白)1-4、Wise或Wnt配体)的能力和调节β-联蛋白磷酸化和降解)筛选所得到的经修饰的抗-LRP6抗体。在本领域中已描述了突变方法。例如，Short的PCT公开WO 02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接组装或其组合产生和筛选抗体突变的方法。备选地，Lazar等人的WO 03/074679描述了使用计算筛选方法优化抗体的物理化学特性的方法。
非抗体的LRP6结合分子
本发明还提供显示抗体的功能特性，但其框架和抗原结合部分产生自其他多肽(例如抗体基因编码的多肽或通过抗体基因体内重组产生的多肽以外的多肽)的LRP6结合分子。通过定向进化方法产生这些结合分子的抗原结合结构域(例如LRP6结合结构域)。见美国专利号7,115,396。具有与抗体可变结构域的折叠类似的总体折叠(“免疫球蛋白样”折叠)的分子是适当的支架蛋白质。适合用于衍生抗原结合分子的支架蛋白质包括纤连蛋白或纤连蛋白二聚体、腱糖蛋白、N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白、ICAM、肌联蛋白、GCSF-受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生素色蛋白、髓鞘质膜粘附分子P0、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T-细胞抗原受体、CD1、C2和VCAM-1的I-set结构域、肌球蛋白结合蛋白质C的I-set免疫球蛋白结构域、肌球蛋白结合蛋白质H的I-set免疫球蛋白结构域、端蛋白的I-set免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生长激素受体、促红细胞生成素受体、催乳素受体、干扰素-γ受体、β-半乳糖苷酶/葡糖醛酸糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、转谷氨酰胺酶、T-细胞抗原受体、超氧化物岐化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿色荧光蛋白、GroEL和竹芋蛋白。
非抗体结合分子的抗原结合结构域(例如免疫球蛋白样折叠)可以具有小于10kD或大于7.5kD的分子量(例如7.5-10kD之间的分子量)。用来产生抗原结合结构域的蛋白质是天然存在的哺乳动物蛋白质(例如人蛋白质)，并且与其所源自的蛋白质的免疫球蛋白样折叠相比，抗原结合结构域包含至多50％(例如至多34％、25％、20％或15％)的突变氨基酸。具有免疫球蛋白样折叠的结构域一般包括50-150个氨基酸(例如40-60个氨基酸)。
为了产生非抗体结合分子，建立克隆文库，其中形成抗原结合表面的支架蛋白质区(例如在位置和结构上与抗体可变结构域CDR的免疫球蛋白折叠相似的区域)中的序列被随机化。针对与目的抗原(例如hLRP6)的特异性结合和其他功能(例如LRP6生物活性的抑制)来测试文库克隆。选择的克隆可以用作进一步随机化和选择的基础，产生对抗原具有更高亲和力的衍生物。选择方案的一个实例描述于美国专利号6,207,446中。
例如使用纤连蛋白III(10Fn3)的第十模块作为支架，产生高亲和力结合分子。针对10FN3的残基23-29、52-55和78-87处的三个CDR样环中的每一个构建文库。为了构建每个文库，通过寡核苷酸合成，将与每个CDR样区域重叠的DNA区段编码序列随机化。用于产生可选择的10Fn3文库的技术描述于美国专利号6,818,418和7,115,396；Roberts和Szostak，1997Proc.Natl.Acad.Sci USA 94：12297；美国专利号6,261,804；美国专利号6,258,558；和Szostak等人WO98/31700。
非抗体结合分子可以作为二聚体或多聚体产生，以提高对靶抗原的亲合力。例如，将抗原结合结构域表达为与抗体恒定区(Fc)的融合物，其形成Fc-Fc二聚体。参见例如美国专利号7,115,396。
编码本发明抗体的核酸分子
本发明的另一个方面涉及编码本发明的LRP6结合分子的核酸分子。核酸可存在于完整细胞中、细胞裂解液中，或者可以是部分纯化或基本上纯形式的核酸。当通过标准技术从其他细胞成分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)中纯化出时，核酸是“分离的”或“基本上纯的”，所述标准技术包含碱/SDS处理、CsCl区带离心、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他方法。见F.Ausubel等编辑，1987 Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，且可以包含或不包含内含子序列。在一个实施方案中，核酸是cDNA分子。核酸可以存在于载体例如噬菌体展示载体中，或存在于重组质粒载体中。
可使用标准分子生物学技术获得本发明的核酸。对于杂交瘤(例如从带有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤，如下文进一步描述)表达的抗体，可以通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术，获得编码杂交瘤产生的抗体轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库(例如使用噬菌体展示技术)获得的抗体，可以从文库成员的多个噬菌体克隆中回收编码抗体的核酸。
一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，即可通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段有效连接至另一DNA分子，或有效连接至编码另一蛋白质如抗体恒定区或柔性连接体的片段。如本文所使用，术语“有效连接”是指两条DNA片段以功能性方式接合，例如使得两条DNA片段编码的氨基酸序列保持符合读框，或者使得蛋白质在期望的启动子控制下表达。
可以通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子有效连接，将分离的编码VH区的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列为本领域已知(见例如Kabat等人1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生和人类服务部，NIH Publication No.91-3242)，并且可以通过标准PCR扩增获得包含这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以有效连接至仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
可以通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子有效连接，将分离的编码VL区的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列为本领域已知(见例如Kabat等人1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生和人类服务部，NIH Publication No.91-3242)，并且可以通过标准PCR扩增获得包含这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ和λ恒定区。
为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段与编码柔性连接体例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段有效连接，使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白质，其中VL和VH区通过柔性连接体连接(见例如Bird等人1988 Science 242：423-426；Huston等人1988 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人1990 Nature 348：552-554)。
单克隆抗体的产生
可以通过多种技术来产生单克隆抗体(mAb)，所述技术包含常规的单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein(1975 Nature，256：495)的标准体细胞杂交技术，或者使用文库展示方法，例如噬菌体展示。
用于制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。在小鼠中产生杂交瘤是良好建立的方法。免疫方案和分离用于融合的经免疫的脾细胞的技术是本领域已知的。融合伙伴(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合流程也是已知的。
可以根据按上述制备的鼠单克隆抗体的序列，制备本发明的嵌合抗体或人源化抗体。可从目的鼠杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并使用标准分子生物学技术将其改造为包含非鼠(例如人)的免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法(见例如Cabilly等的美国专利号4,816,567)，将鼠可变区连接至人恒定区。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人的框架中。参见例如美国专利号5,225,539和美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370。
在某个实施方案中，本发明的抗体是人单克隆抗体。可以使用带有人免疫系统部分而不是小鼠免疫系统的转基因小鼠或转染色体小鼠产生这类针对LRP6的人单克隆抗体。这些转基因小鼠和转染色体小鼠包括在本文中分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠，并且在本文中集体称作“人Ig小鼠”的小鼠。
HuMAb
Figure GPA00001127558200361
(Medarex，Inc.)包含人免疫球蛋白基因微基因座(miniloci)以及使内源性μ和κ链基因座失活的定向突变，所述微基因座编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列(见例如Lonberg等人1994 Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠显示降低的小鼠IgM或κ表达，并且在免疫应答中，引入的人重链和轻链转基因经历类型转换和体细胞突变，产生高亲和力的人IgGκ单克隆(Lonberg，N.等，1994，见上文；综述于Lonberg，N.，1994 Handbook of Experimental Pharmacology113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.，1995 Intern.Rev.Immunol.13：65-93；和Harding，F.和Lonberg，N.，1995 Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMAb小鼠的制备和应用，以及这类小鼠带有的基因组修饰进一步描述于Taylor，L.等人1992 Nucleic Acids Research20：6287-6295；Chen，J.等人1993 International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：3720-3724；Choi等人1993 Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等人1993 EMBO J.12：821-830；Tuaillon等人1994 J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.等人1994International Immunology 579-591；和Fishwild，D.等人1996 NatureBiotechnology 14：845-851，所述所有参考文献的内容在此明确地整体引入作为参考。还参见美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299和5,770,429，均属于Lonberg和Kay；Surani等的美国专利号5,545,807；PCT公开号WO92103918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97113852、WO 98/24884和WO 99/45962，均属于Lonberg和Kay；和Korman等的PCT公开号WO 01/14424。
在另一个实施方案中，可以使用在转基因和转染色体上带有人免疫球蛋白序列的小鼠来产生本发明的人抗体，例如带有人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠。WO 02/43478中详述了在本文中称为“KM小鼠”的这类小鼠。
再进一步而言，表达人免疫球蛋白基因的备选的转基因动物系统是本领域内可获得的，并且可以用来产生本发明的抗-LRP6抗体。例如，可以使用称作
Figure GPA00001127558200371
(Abgenix，Inc.)的备选转基因系统。这类小鼠描述于例如Kucherlapati等的美国专利号5,939,598、6,075,181、6,114,598、6，150,584和6,162,963中。
此外，表达人免疫球蛋白基因的备选的转染色体动物系统是本领域内可获得的，并且可以用来产生本发明的抗-LRP6抗体。例如，可以使用带有人重链转染色体和人轻链转染色体二者的称作“TC小鼠”的小鼠；这类小鼠描述于Tomizuka等人2000 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中。此外，带有人重链和轻链转染色体的母牛已在本领域描述(Kuroiwa等人2002 Nature Biotechnology 20：889-894)并且可以用来产生本发明的抗-LRP6抗体。
也可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备本发明的人单克隆抗体。已在本领域内建立了这类用于分离人抗体的噬菌体展示方法。见例如Ladner等的美国专利号5,223,409、5,403,484和5,571,698；Dower等的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty等的美国专利号5,969,108和6,172,197；和Griffiths等的美国专利号5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915和6,593,081。可以针对与全长LRP6或LRP6的具体表位的结合来筛选文库。
也可以使用SCID小鼠制备本发明的人单克隆抗体，所述SCID小鼠中已重建了人免疫细胞，使得在免疫后可以产生人抗体应答。这类小鼠描述于例如Wilson等的美国专利号5,476,996和5,698,767中。
在人Ig小鼠中产生人单克隆抗体
可以用在原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如哺乳动物细胞，例如HEK293细胞)中表达的纯化的重组人LRP6作为抗原。可以将蛋白质缀合至载体，例如钥孔槭血蓝蛋白(KLH)。
使用HuMab转基因小鼠的HCo7、HCo12和HCo17品系和转基因转染色体小鼠的KM品系(其均表达人抗体基因)制备LRP6的完全人单克隆抗体。在这些小鼠品系的每个中，可按Chen等人1993EMBO J.12：811-820中所述，纯合地破坏内源的小鼠κ轻链基因，并如WO 01109187的实施例1中所述，纯合地破坏内源的小鼠重链基因。如Fishwild等人1996Nature Biotechnology 14：845-851中所述，这些小鼠品系的每一个带有人κ轻链转基因KCo5。如美国专利号5,545,806、5,625,825和5,545,807中所述，HCo7品系带有HCo7人重链转基因。如WO 01/09187的实施例2中所述，HCo12品系带有HCo12人重链转基因。HCo17品系带有HCo17人重链转基因。如WO 02/43478中所述，KNM品系包含SC20转染色体。
为了产生LRP6的全人单克隆抗体，用纯化的重组LRP6、LRP6片段或其缀合物(例如LRP6-KLH)作为抗原免疫HuMab小鼠和KM小鼠。针对HuMab小鼠的一般免疫方案描述于Lonberg，N.等人1994 Nature368(6474)：856-859；Fishwild，D.等人1996 Nature Biotechnology14：845-851和WO 98/24884中。第一次输注抗原时小鼠为6-16周龄。使用纯化的抗原重组制剂(5-50μg)，在腹腔内、皮下(Sc)或通过足垫注射来免疫HuMab小鼠和KM小鼠。
用完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原，在腹腔中(IP)、皮下(Sc)或通过足垫(FP)免疫转基因小鼠两次，之后3-21天用不完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原进行IP、Sc或FP免疫(至多总计11次免疫)。通过眼眶后采血监测免疫反应。通过ELISA筛选血浆，将具有足够的抗-LRP6人免疫球蛋白效价的小鼠用于融合。在处死前3天和2天用抗原对小鼠进行静脉内强化，并取出脾。通常，针对每种抗原进行10-35次融合。针对每种抗原免疫几十只小鼠。用LRP6免疫HCo7、HCo12、HCo17和KM小鼠品系的总计82只小鼠。
为了选择产生结合LRP6的抗体的HuMab或KM小鼠，可以如Fishwild，D.等，1996所述，通过ELISA测试来自经免疫的小鼠的血清。简言之，用PBS中1-2μg/ml的纯化的重组LRP6以50μl/孔4℃孵育过夜来包被微量滴定板，然后用在PBS/Tween(0.05％)中的5％鸡血清以200μl/孔封闭。向每个孔中加入来自经LRP6免疫小鼠的血浆的稀释液，并在室温下孵育1-2小时。用PBS/Tween洗涤平板，然后用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊-抗-人IgG Fc多克隆抗体在室温下孵育1小时。洗涤后用ABTS底物(Sigma，A-1888，0.22mg/ml)使平板显色，并通过分光光度计在OD 415-495下分析。将显示最高的抗-LRP6抗体效价的小鼠脾细胞用于融合。进行融合并通过ELISA测试杂交瘤上清的抗-LRP6活性。
根据标准方案，用PEG将从HuMab小鼠和KM小鼠中分离的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后针对抗原特异性抗体的产生，筛选得到的杂交瘤。用50％PEG(Sigma)，将来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与四分之一数量的SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1581)融合。将细胞以大约1×105/孔接种于平底微量滴定板内，然后在选择培养基中孵育约两周，所述选择培养基在DMEM(Mediatech，CRL 10013，含高葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠)中含有10％胎牛血清、10％ P388D1(ATCC，CRL TIB-63)条件培养基、3-5％
Figure GPA00001127558200391
(IGEN)，加入5mMHEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50μg/ml庆大霉素和1x HAT(Sigma，CRLP-7185)。1-2周后，将细胞培养于用HT代替HAT的培养基中。然后针对人抗-LRP6单克隆IgG抗体，通过ELISA筛选各个孔。一旦发生了广泛的杂交瘤生长，通常在10-14天后监测培养基。将分泌抗体的杂交瘤重新铺板，再次筛选，若对人IgG仍然为阳性，则通过有限稀释将抗-LRP6单克隆抗体亚克隆至少两次。然后在体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生小量抗体，用于进一步鉴定。
产生人单克隆抗体的杂交瘤的产生
为了得到产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，可以分离来自经免疫小鼠的脾细胞和/或淋巴结细胞，并与适当的永生化化细胞系例如小鼠骨髓瘤细胞系融合。可以针对抗原特异性抗体的产生筛选得到的杂交瘤。例如，可以用50％PEG将来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与六分之一数量的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)融合。将细胞以约2×145铺于平底微量滴定板中，然后在选择培养基中孵育两周，所述选择培养基含有20％胎克隆血清、18％“653”条件培养基、5％
Figure GPA00001127558200401
(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0：055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素、50μg/ml庆大霉素和1X HAT(Sigma；融合后24小时加入HAT)。约两周后，将细胞培养于用HT代替HAT的培养基中。然后针对人单克隆IgM和IgG抗体，通过ELISA筛选各个孔。一旦发生了广泛的杂交瘤生长，通常在10-14天后观察培养基。可将分泌抗体的杂交瘤重新铺板，再次筛选，若对人IgG仍然为阳性，则可以通过有限稀释法将单克隆抗体亚克隆至少两次。然后在体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生小量抗体用于表征。
为了纯化人单克隆抗体，可以在两升的转瓶中培养选择的杂交瘤，用于单克隆抗体纯化。可以过滤和浓缩上清液，然后用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。可以通过凝胶电泳和高效液相色谱检查洗脱的IgG以确保纯度。可以将缓冲溶液更换为PBS，并使用1.43的消光系数于OD280测定浓度。可以将单克隆抗体分为等分并保存于-80℃。
产生单克隆抗体的转染瘤的生成
也可以使用如本领域公知的例如重组DNA技术和基因转染方法的组合，在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体(例如Morrison，1985 Science229：1202)。
例如，为了表达抗体或其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如使用表达目的抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并可以将该DNA插入表达载体中，使得基因有效连接至转录和翻译控制序列。在本文中，术语“有效连接”旨在指抗体基因连接入载体，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节抗体基因转录和翻译的预期功能。选择与使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入分别的载体，或更普遍地将两个基因均插入同一个表达载体中。通过标准方法(例如抗体基因片段和载体上互补的限制位点的连接，或如果不存在限制位点时的平末端连接)将抗体基因插入表达载体中。可以如下使用本文所述抗体的轻链和重链可变区产生任意抗体同种型的全长抗体基因：将本文所述抗体的轻链和重链可变区插入已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段有效连接至载体内的CH区段，VL区段有效连接载体内的CL区段。此外或备选地，重组表达载体可以编码帮助抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆入载体中，使得信号肽与抗体链基因的氨基端符合读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或者是异源的信号肽(即来自非免疫球蛋白的蛋白质的信号肽)。
除了抗体链基因外，本发明的重组表达载体带有控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调控序列。术语“调控序列”旨在包含启动子、增强子和控制抗体链基因转录或翻译的其他表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。这类调控序列描述于例如Goeddel(Gene Expression Technology.1990Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA)中。本领域技术人员应当理解，表达载体的设计，包括调控序列的选择可取决于例如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包含指导哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件，例如产生自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/或增强子。备选地，可使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或P-珠蛋白启动子。更进一步，由来自不同来源的序列组成的调节元件，例如SRa启动子系统，其包含来自SV40早期启动子和1型人T细胞白血病病毒的长末端重复的序列(Takebe等人1988 Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
除了抗体链基因和调控序列以外，本发明的重组表达载体可带有额外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有助于选择引入载体的宿主细胞(见例如美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017，均属于Axel等)。例如，通常选择标记基因赋予已引入载体的宿主细胞对药物例如G418、潮霉素或氨甲喋呤的抗性。选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于进行氨甲喋呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染入宿主细胞。术语“转染”的多种形式旨在包含通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。理论上可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体。讨论抗体在真核细胞、尤其是哺乳动物宿主细胞中的表达是因为这类真核细胞、尤其是哺乳动物细胞比原核细胞更可能组装和分泌正确折叠和具有免疫活性的抗体。据报道，抗体基因的原核表达对活性抗体的高产率生产是不够有效的(Boss和Wood，1985 Immunology Today 6：12-13)。
用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包含中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，在Urlaub和Chasin，1980 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中描述，其与例如Kaufman和Sharp，1982Mol.Biol.159：601-621中所述的DH FR选择标记一起使用)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。具体地，用于与NS0骨髓瘤细胞一起使用的另一表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中所示的GS基因表达系统。将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一段时间来产生抗体，这段时间足以允许抗体在宿主细胞中表达或分泌抗体到宿主细胞生长的培养基中。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
双特异性分子
在另一方面，本发明涉及包含本发明的LRP6结合分子(例如抗-LRP6抗体或其片段)的双特异性分子。本发明的LRP6结合分子可以衍生或连接至另一功能性分子，例如另一肽或蛋白质(例如另一抗体或针对受体的配体)，产生与至少两种不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。本发明的LRP6结合分子事实上可以衍生或连接至多于一种的其他功能性分子，产生结合至两种以上不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；这类多特异性分子也被涵盖于本文所用术语“双特异性分子”。为了产生本发明的双特异性分子，可以将本发明的抗体功能性连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或以其他方式)至一个或多个其他结合分子，例如另一抗体、抗体片段、肽或结合拟肽，从而得到双特异性分子。
因此，本发明包含双特异性分子，其至少包含一种针对一个LRP6表位的第一结合特异性和针对LRP6上或其他蛋白质靶点上的第二靶表位的第二结合特异性。作为非限制性实例，本发明的双特异性分子能够结合至LRP6的螺旋桨1和螺旋桨3二者。
在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段的结合特异性，所述抗体片段包含例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链Fv。抗体也可以是轻链或重链二聚体，或其任意最小片段例如Fv或单链构建体，如Ladner等的美国专利号4,946,778中所述，所述专利的内容明确引入作为参考。
可以使用本领域已知的方法，通过缀合组成性结合特异性制备本发明的双特异性分子。例如，可以独立地产生双特异性分子的每种结合特异性，然后将其彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用多种偶联或交联剂进行共价缀合。交联剂的实例包含蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5’-二巯基双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC)(见例如Karpovsky等人1984 J.Exp.Med.160：1686；Liu等人1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括Paulus，1985Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan等人1985 Science 229：81-83和Glennie等人1987 J.Immunol.139：2367-2375中所述方法。缀合剂是SATA和磺基-SMCC，均可获得自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。
当结合特异性是抗体时，可以通过两条重链C-端铰链区的巯基成键将它们缀合。在一个具体实施方案中，将铰链区修饰为在缀合前包含奇数个(例如一个)巯基基团。
或者，两种结合特异性可以在同一个载体中编码，并在同一宿主细胞中表达和组装。该方法尤其适用于双特异性分子是mAb x mAb、mAb xFab、Fab x F(ab’)2或配体x Fab融合蛋白的情况。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或者是包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203、5,455,030、4,881,175、5,132,405、5,091,513、5,476,786、5,013,653、5,258,498和5,482,858中。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(REA)、FACS分析、生物测定法(例如生长抑制)或蛋白质印迹试验验证。这些测定法中的每一种通常使用对目的复合体特异性的带标签的试剂(例如抗体)来检测具体的目的蛋白质-抗体复合体的存在。
功能测定法
可以在体外和体内测试LRP6结合分子的功能特征。例如，可针对干扰LRP6结合Wnt途径成员(DKK1(dickkopf1)、DKK2、DKK4、SOST1、SOSD1(USAG1)、sFRP(可溶性Fzd相关蛋白)1-4、Wise或Wnt配体)的能力或调节生物学过程如β-联蛋白磷酸化和降解、肿瘤细胞生长、凋亡、骨矿物质密度调节和胰岛素分泌的能力来测试结合分子。
可通过将所述Wnt途径成员固定化至固相支持物并检测与之结合的可溶的LRP6，用
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来检测结合至Wnt途径成员(例如DKK1(dickkopf1)、DKK2、DKK4、SOST1、SOSD1(USAG1)、sFRP(可溶性Fzd相关蛋白)1-4、Wise或Wnt配体)的LRP6。或者，可以将LRP6固定化，并可以检测与之结合的Wnt途径成员。还可以通过ELISA(例如通过检测结合至固定化Wnt途径成员的LRP6)或通过荧光共振能量转移(FRET)来分析LRP6/Wnt途径成员结合。为了进行FRET，可以检测结合至溶液中的Wnt途径成员的荧光团标记的LRP6(见例如美国专利号5,631,169)。
也可通过“液相结合”方法检测结合至Wnt途径成员(例如DKK1(dickkopf1)、DKK2、DKK4、SOST1、SOSD1(USAG1)、sFRP(可溶性Fzd相关蛋白)1-4、Wise或Wnt配体)的LRP6，即在液相环境而不是固定化环境中测量亲和力。所述方法由例如BioVeris(现在为Roche)提供。
可以通过共免疫沉淀检测结合至所述Wnt途径成员的LRP6(Lagace等人2006 J.Clin.Inv.116(11)：2995-3005)。为了以此方式检测LRP6-Wnt途径成员的结合，在无甾醇培养基中培养HepG2细胞18小时。在0.1mM氯喹存在下将纯化的LRP6加入培养基并孵育细胞1小时。在温和去污剂(1％洋地黄皂苷w/v)中裂解细胞。从细胞裂解液中免疫沉淀LRP6或Wnt途径成员，通过SDS-PAGE分离，并进行免疫印迹来分别检测共免疫沉淀的所述Wnt途径成员或LRP6的存在(Lagace等人，2006 J.Clin.Inv.116(11)：2995-3005)。可以用结合Wnt途径成员的亲和力更高的LRP6突变体形式来进行这些测定(Lagace等人，2006，上文)。
可针对提高或降低所述细胞内Wnt途径成员水平的能力来测试LRP6结合分子。例如，将细胞在无甾醇培养基(补充了100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、1g/l葡萄糖、5％(v/v)新生牛无脂蛋白血清(NCLPDS)、10μM美伐他汀钠和50μM甲羟戊酸钠的DMEM)中培养18小时来诱导Wnt途径成员表达。往培养基中加入纯化的LRP6(5μg/ml)。测定加入LRP6后在0、0.5、1、2和4小时收集的细胞中的Wnt途径成员水平(Lagace等人，2006 J.Clin.Inv.116(11)：2995-3005)。可以通过流式细胞术、FRET、免疫印迹或其他方法测定Wnt途径成员水平。
可针对提高或降低Wnt诱导的LRP6磷酸化和β-联蛋白稳定化、报道基因或靶基因表达的能力来测试LRP6结合分子。
可通过产生含LRP6的细胞膜制剂，并针对结合所述制剂的能力进行测试，与结合不含LRP6的细胞膜制剂的能力相比，来检测结合至Wnt途径成员的LRP6。或通过具有内源性LRP6的细胞或过表达LRP6的细胞的FACS分析。
可通过抗体在小鼠中抑制Wnt-依赖性肿瘤生长的能力测试抗-LRP6抗体。例如，抗-LRP6抗体对WNT1-MMTV肿瘤的肿瘤生长的抑制。肿瘤异种移植模型(例如SCID异种移植模型、原位异种移植模型等)中的肿瘤生长的抑制是另一种情况，其中可通过其抑制Wnt-依赖性肿瘤生长的能力测试抗-LRP6抗体。
可以通过其在体外抑制Wnt依赖性肿瘤生长，例如抑制软琼脂中集落形成的能力来测试抗-LRP6抗体。
药物组合物
在另一方面，本发明提供包含与可药用的载体配制在一起的一种或一组本发明的LRP6结合分子(例如单克隆抗体或其抗原结合部分)的组合物，例如药物组合物。这类组合物可以包含一种或一组(例如两种或更多种不同的)结合分子。例如，本发明的药物组合物可以包含一组结合靶抗原上不同表位或具有互补活性的抗体或药物。
本发明的药物组合物还可以在组合疗法中施用，即与其他药物组合。例如，对于癌症治疗，组合疗法可以包含与至少一种其他化疗剂组合的抗-LRP6抗体(例如拮抗LRP6抗体)。类似地，对于糖尿病治疗，组合疗法可以包含与至少一种其他胰岛素分泌增强剂如那格列奈类或瑞格列奈类组合的抗-LRP6抗体(例如激动LRP6抗体)。类似地，对于骨质疏松症治疗，组合疗法可以包含与至少一种能够增加骨密度的其他药物例如钙、维生素D或二膦酸盐组合的抗-LRP6抗体(例如激动LRP6抗体)。在下文关于本发明药物用途的部分中更详细地描述了可用于组合疗法的治疗剂实例。
如本文所用，“可药用的载体”包含任意和所有生理学上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。载体应适合用于静脉、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮给药(例如通过注射或输注)。取决于给药途径，可将活性化合物包被于材料中，以保护化合物免受酸和其他可以钝化该化合物的自然条件的作用。
本发明的药物化合物可以包括一种或多种可药用盐。“可药用盐”指保持母体化合物的预期生物学活性且不引起任何非预期的毒理学效应的盐(见例如Berge，S.M.等人，1977 J.Pharm.Sci.66：1-19)。这类盐的实例包含酸加成盐类和碱加成盐类。酸加成盐类包含衍生自无毒性无机酸类例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等的盐，以及衍生自无毒性有机酸类例如脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等的盐。碱加成盐类包含衍生自碱土金属类例如钠、钾、镁、钙等的盐，以及衍生自无毒性有机胺类例如N，N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的盐。
本发明的药物组合物还可以包含可药用抗氧化剂。可药用抗氧化剂的实例包含：水溶性抗氧化剂类，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂类，例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂类，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本发明药物组合物的适合的水性和非水性载体的实例包含水、乙醇、多元醇类(如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)及其适合的混合物，植物油类如橄榄油和可注射的有机酯类如油酸乙酯。例如通过包衣材料如卵磷脂的使用、通过在分散体的情况下维持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以维持适合的流动性。
这些组合物还可以包含辅助剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过灭菌操作(在前)和通过纳入多种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等)两种方法确保防止微生物的存在。还可希望将等渗剂如糖、氯化钠等包含于组合物中。此外，可以通过延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶的纳入来达到可注射药物形式的延长吸收。
可药用的载体包含无菌水性溶液或分散体和用于临时配制无菌注射溶液或分散体的无菌粉剂。这类介质和药剂对药物活性物质的用途为本领域已知。除在任何常规介质或药剂与活性化合物不相容这一范围内之外，可考虑将任何常规介质或药剂用于本发明的药物组合物。还可将补充的活性化合物掺入组合物。
治疗组合物通常必须是在生产和保存条件下无菌和稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳剂、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适合的混合物的溶剂或分散剂。例如通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以维持适合的流动性。在许多情况下，可以将等渗剂例如糖类、多元醇类(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠包含于组合物中。可以通过将延迟吸收的药剂例如单硬脂酸盐类和明胶包含于组合物来产生可注射组合物的延长吸收。
可通过将活性化合物以所需量掺入按需要具有一种或一组上文所列成分的适当溶剂中，然后进行灭菌微量过滤，来制备无菌可注射溶液。一般来说，通过将活性成分掺入无菌载体制备分散体，所述无菌载体中包含基本分散介质和所需的来自上文所列成分的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，制备的方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，这些方法从其先前经除菌过滤的溶液中产生活性成分加上任意其他所需成分的粉剂。
根据所治疗的个体和具体的给药方式，可以与载体材料组合产生单一剂型的活性成分量会不同。可以与载体材料组合产生单一剂型的活性成分量一般是产生疗效的组合物量。一般，除100％外，该量为约0.01％-约99％的活性成分、约0.1％-约70％或约1％-约30％的活性成分与可药用的载体组合的范围内。
调整剂量方案以提供最优的期望反应(例如治疗反应)。例如可以施用单次推注、可以随时间施用若干分份剂量或者按治疗情况的紧急需要按比例降低或提高剂量。为了便于施用和剂量均一性，以剂量单位形式配制肠胃外组合物尤其有利。如本文所用，剂量单位形式指对于治疗个体而言适合作为单个剂量的物理上分离的单位；每个单位包含计算为与所需药物载体结合而产生期望疗效的预定量的活性化合物。本发明剂量单位形式的规格指定和直接取决于活性化合物的独特特征和待达到的具体疗效，以及混合这种活性化合物用于个体敏感性治疗的本领域技术的固有限制。
对于抗体的施用，剂量在约0.0001-100mg/kg宿主体重和更普遍地在0.01-5mg/kg宿主体重的范围内。例如剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重，5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需给药每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每个月一次、每三个月一次或每三至六个月一次。本发明LRP6结合分子的剂量方案包括通过静脉给药1mg/kg体重或3mg/kg体重，用以下给药方案之一提供抗体：每四周六个剂量，然后每三个月；每三周；3mg/kg体重一次，然后每三周1mg/kg体重。
在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或多种结合分子(例如单克隆抗体)，在这种情况下，所施用的每种抗体的剂量落在所示的范围内。通常在多个时期施用LRP6结合分子。单个剂量之间的间隔可以是例如每周、每月、每三个月或每年。间隔也可以是通过测量患者LRP6结合分子的血液水平所指示的不定期的。在一些方法中，调整剂量以使LRP6结合分子的血浆浓度达到约1-1000μg/ml和在一些方法中达到约25-300μg/ml。
或者，LRP6结合分子可作为缓释制剂施用，在这种情况下需要较低的给药频率。剂量和频率根据LRP6结合分子在患者中的半衰期而不同。一般，人抗体显示最长的半衰期，其后是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。给药的剂量和频率可以根据治疗是预防性的或是治疗性的而不同。在预防性应用中，在很长的时期内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余生中持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要在相对短的间隔下相对高的剂量，直至疾病的进展减少或终止，或直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可对患者施用预防性方案。
为了获得针对具体患者、组合物和给药方式有效达到预期治疗反应而对患者没有毒性的活性成分量，本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以不同。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，其包含所使用的本发明的具体成分或其酯、盐或酰胺的活性；给药途径；给药时间；所使用的具体化合物的排泄率；治疗持续时间；与所使用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料；所治疗患者的年龄、性别、体重、状态、一般健康和过往病史；和医学领域公知的类似因素。
可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种，通过一种或多种给药途径施用本发明的组合物。如熟练的技术人员所理解，给药的途径和/或方式将取决于期望结果而不同。本发明LRP6结合分子的给药途径包含静脉内、肌内、真皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外给药”指除了肠内和局部给药之外的给药方式，通常通过注射，其包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
或者，可以通过非肠胃外途径如局部、表皮或粘膜给药途径施用本发明的LRP6结合分子，例如鼻内给药、口服给药、阴道给药、直肠给药、舌下给药或局部给药。
可以用防止化合物快速释放的载体制备活性化合物，例如控释制剂，包含植入物、经皮膜片和微囊递药系统。可以使用生物可降解的生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类和聚乳酸。用于制备这类制剂的许多方法已取得专利或普遍为本领域技术人员已知。参见例如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
可以用本领域已知的医疗器械施用治疗组合物。例如，在一个实施方案中，可以用无针的皮下注射器械施用本发明的治疗组合物，例如美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中所显示的器械。用于本发明的公知的植入物和组件的实例包含：美国专利号4,487,603，其显示用于以受控速率给药的可植入式微量输注泵；美国专利号4,486,194，其显示用于通过皮肤施用药物的治疗器械；美国专利号4,447,233，其显示用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其显示用于连续药物递送的变速流可植入式输注器；美国专利号4,439,196，其显示具有多室隔间的渗透性药物递送系统；美国专利号4,475,196，其显示渗透性药物递送系统。这些专利在此引入作为参考。许多其他的这类植入物、递送系统和组件为本领域技术人员已知。
在某些实施方案中，可以配制本发明的LRP6结合分子来确保在体内的适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高亲水性的化合物。为了确保本发明的治疗化合物穿过BBB(若希望的话)，可将其配制到例如脂质体中。制备脂质体的方法见例如美国专利号4,522,811、5,374,548和5,399,331。脂质体可以包含被选择性地转运入特异细胞或器官的一个或多个部分，从而增强靶向药物递送(见例如V.V.Ranade，1989 J.Cline Pharmacol.29：685)。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(见如Low等的美国专利5,416,016)；甘露糖苷类(Umezawa等人，1988 Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体类(P.G.Bloeman等人，1995 FEBS Lett.357：140；M.Owais等人，1995 Antimicrob.Agents Chernother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人，1995 Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等人，1994 J.Biol.Chem.269：9090)；还见K.Keinanen；M.L.Laukkanen，1994 FEBSLett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler，1994 Immunomethods4：273。
本发明的用途和方法
本文所述LRP6结合分子具有体外和体内的诊断和治疗效用。例如，可对培养的(例如体外或体内)或个体(例如体内)的细胞施用这些分子来治疗、预防或诊断多种病症。LRP6结合分子尤其适合于治疗患有“Wnt信号传导相关病症”的人类患者，Wnt信号传导相关病症指与异常的Wnt信号传导相关的疾病和病症。Wnt信号传导的异常上调与癌症、骨关节炎和多囊肾病相关，这些病症尤其适合于通过施用拮抗LRP结合分子治疗。相反，Wnt信号传导的异常下调与骨质疏松症、肥胖症、糖尿病和神经元变性疾病相联系，这些病症尤其适合于通过施用激动LRP结合分子治疗。
在一个实施方案中，通过以Wnt1特异的方式结合至LRP6的第一螺旋桨，LRP6拮抗结合分子可用来诊断、改善其症状、防御和治疗与Wnt途径的异常高水平相关的Wnt信号传导病症。在另一个实施方案中，通过以Wnt3a特异的方式结合至LRP6的第三螺旋桨，LRP6拮抗结合分子可用来诊断、改善其症状、防御和治疗与Wnt途径的异常高水平相关的Wnt信号传导病症。在一个实施方案中，通过结合至LRP6的第三螺旋桨，LRP6激动结合分子可用来诊断、改善其症状、防御和治疗与Wnt途径的异常低水平相关的Wnt信号传导病症。
适合于通过施用本发明的LRP6结合分子治疗的“Wnt信号传导相关癌症”包括但不限于结肠癌(例如结肠直肠癌(CRS))、黑素瘤、乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、恶性髓母细胞瘤和其他原发性CNS恶性神经外胚层瘤、横纹肌肉瘤、肠源肿瘤(包括但不限于食道、胃、胰腺和胆管系统的癌症)以及前列腺癌和膀胱癌。
以相关的方式，本发明的LRP6拮抗结合分子能够抑制肿瘤细胞的生长、或诱导肿瘤细胞的凋亡、或抑制肿瘤细胞的血管发生。作为实例，可以将肿瘤细胞与拮抗LRP6结合分子(例如包含特异结合至LRP6的抗体的抗原结合部分的LRP6结合分子)接触，从而通过稳定β-联蛋白破坏复合体并引起β-联蛋白磷酸化和降解，阻止肿瘤细胞内的Wnt途径信号转导。
本文所述LRP6结合分子尤其适合用于治疗患有骨相关病症的人类患者，例如骨折、其中骨矿物质密度(BMD)相对于健康个体不正常地和/或病理性地高的病症、和其中骨矿物质密度(BMD)相对于健康个体不正常地和/或病理性地低的病症的情况下。
适合于通过施用抗-LRP6拮抗结合分子治疗的特征为高BMD的病症包括但不限于硬化性狭窄病、Van Buchem病、骨质增生病症和过度生长综合征(SGBS)。作为实例，可以按对降低骨矿物质密度有效的量，对个体施用所述拮抗LRP6结合分子(例如包含特异结合至LRP6的抗体的抗原结合部分的LRP6结合分子)。
适合于通过施用抗-LRP6激动结合分子治疗的特征为低BMD和/或骨脆性的病症包括但不限于原发性和继发性骨质疏松症、骨质减少、骨软化症、骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征(OPPG)、成骨不全(OI)、无血管性坏死(骨坏死)、骨折和植入物愈合(牙植入物和髋植入物)和由其他病症引起的骨丢失(例如与HIV感染、癌症或关节炎相关)。所述激动LRP6抗体能够激活、增强或保全Wnt信号传导途径，或使细胞对Wnt信号传导敏感。所述激动LRP6抗体可以结合至LRP6(例如结合至LRP6的第三螺旋桨)并引起β-联蛋白破坏复合体溶解，从而使β-联蛋白稳定化，转运至细胞核并结合转录因子，从而以此过程提高骨矿物质密度。
在一些实施方案中，所述激动LRP6结合分子能够通过寡聚化LRP6激活、增强或保全Wnt信号传导途径，或使细胞对Wnt信号传导敏感。已知可以通过允许形成LRP6寡聚化(例如Fzd-LRP6异寡聚体)的药物消除对Wnt配体的需要，所述药物包括本发明的LRP6结合分子。(Cong等人(2004)Development 131(20)：5103)。在一些实施方案中，所述LRP6结合分子是如本文所述二价IgG抗体。
其他适合于通过施用LRP6结合分子治疗的“骨相关病症”包括但不限于类风湿性关节炎、骨关节炎、关节炎和溶骨性病变的形成和/或存在。
在一个实施方案中，通过以Wnt1特异的方式结合至LRP6的第一螺旋桨，LRP6拮抗结合分子可以用来诊断、改善其症状、防御和治疗特征为异常高的BMD的骨相关病症。在另一个实施方案中，通过以Wnt3a特异的方式结合至LRP6的第三螺旋桨，LRP6拮抗结合分子可以用来诊断、改善其症状、防御和治疗特征为异常高的BMD的骨相关病症。在一个实施方案中，通过结合至LRP6的第三螺旋桨，LRP6激动结合分子可以用来诊断、改善其症状、防御和治疗特征为异常低的BMD的骨相关病症。
本文所述LRP6结合分子尤其适用于治疗患有糖尿病、肥胖症或其他相关的代谢紊乱(例如特征为Wnt信号传导相对于健康个体异常地和/或病理性地偏低的病症)的人类患者。所述病症适合于通过施用抗-LRP6激动结合分子治疗，所述抗-LRP6激动结合分子能够例如通过结合其靶点而增强胰岛素分泌。(Fujino等人(2003)PNAS 100：229)。作为实例，可以按对增强胰岛素分泌有效的量，对个体施用所述激动LRP6结合分子(例如包含特异结合至LRP6的抗体的抗原结合部分的LRP6结合分子)，以预防、改善或治疗所述个体中的糖尿病症状。
在一个实施方案中，通过结合至LRP6的第三螺旋桨，LRP6激动结合分子可以用来诊断、改善其症状、防御和治疗糖尿病、肥胖症或其他相关的代谢紊乱(例如特征为Wnt信号传导率相对于健康个体异常地和/或病理性地偏低的病症)。
当LRP6结合分子与另一种药物一起施用时，这二者可以按任一顺序先后施用或同时施用。在一些实施方案中，对同时接受第二药物治疗的个体施用LRP6结合分子。所述第二药物可以是：在癌症的情况下为化疗剂；在糖尿病或其他代谢紊乱的情况下为胰岛素分泌增强剂，例如那格列奈或瑞格列奈；和在骨相关病症的情况下为能够增加骨密度的药物，例如钙、维生素D或二膦酸盐。组合治疗方案可以是叠加的，或者其可产生协同结果(例如骨矿物质密度或胰岛素分泌或癌细胞凋亡的增加高于这两种药物组合使用的预期)。
在一个实施方案中，可以用本发明的结合分子检测LRP6的水平。这可以例如通过在允许结合分子与LRP6间形成复合体的条件下，将样品(例如体外样品)和对照样品与LRP6结合分子接触来实现。在样品和对照中检测和比较所述分子与LRP6形成的任何复合体。例如，可以使用本发明的组合物进行本领域公知的标准检测方法，例如ELISA和流式细胞术试验。
因此，一方面，本发明还提供了用于检测样品中LRP6(例如hLRP6)的存在、或测量LRP6的量的方法，该方法包括在允许抗体或其片段与LRP6形成复合体的条件下，将样品和对照样品与LRP6结合分子(例如抗体)接触。然后检测复合体的形成，其中样品和对照样品之间相比在复合体形成中的差异表明样品中存在LRP6。
由本发明的组合物和使用说明书组成的试剂盒也在本发明的范围之内。试剂盒还可以包含至少一种另外的试剂，或一种或多种本发明的另外的抗体(例如具有互补活性的抗体，其结合至靶抗原上不同于第一抗体的表位)。试剂盒通常包含指示试剂盒内物品预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式伴随试剂盒的任何书面或记录材料。
本发明已经进行了充分的描述，还通过以下的实施例和权利要求书进一步阐述，所述实施例和权利要求书是阐述性的，并不意味着进一步限制。本领域技术人员使用不超出常规的实验就能了解或者能够明确本文所述特定方法的很多等同物。这类等同物涵盖于本发明和权利要求书的范围内。在本申请中引用的所有参考文献(包括发行的专利和公开的专利申请)的内容在此引入作为参考。
实施例
实施例1：Wnt特异的抗-LRP6拮抗抗体的鉴定
已发现抗-LRP6拮抗Fab优先抑制Wnt1或Wnt3a诱导的Wnt信号传导。用Wnt1或Wnt3a表达质粒与SuperTopflash和SV40-Renilla报告基因一起瞬时转染293T细胞。用LRP6 Fab处理的细胞与用抗-溶菌酶(lyzosome)对照Fab(Fab对照)处理的细胞之间荧光素酶信号的比例绘制和描述于至少图1和2中。
相对本发明的LRP6结合分子，能够进行典型Wnt信号传导的Wnt信号传导途径蛋白质可以分为两类。Wnt3a特异性的LRP6拮抗抗体阻断Wnt3和Wnt3a。Wnt1特异性的LRP6拮抗抗体阻断其他Wnt蛋白质(Wnt1、2、6、7A、7B、9、10A、10B)。
用不同的Wnt和Frizzled构建体与SuperTopflash和SV40-Renilla一起瞬时转染293T细胞并用一组LRP6拮抗Fab处理来进行实验。用LRP6Fab处理的细胞与用抗-溶菌酶对照Fab(Fab对照)处理的细胞之间荧光素酶信号的比例显示于表II：
表II
Wnt3 Wnt3A Wnt1  Wnt2+Fzd8  Wnt6+Fzd8  Wnt7A+Fzd8  Wnt7B+Fzd8   Wnt9A+Fzd10   Wnt10A+Fzd5   Wnt10B+Fzd8
 Fab003  2％  3％  64％  76％  66％  89％  79％   49％   87％   84％
 Fab004  1％  3％  87％  102％  89％  95％  96％   73％   120％   85％
 Fab023  9％  23％  62％  79％  76％  96％  75％   81％   130％   72％
 Fab015  83％  77％  1％  1％  2％  14％  34％   8％   23％   23％
 Fab016  73％  76％  1％  0％  2％  13％  30％   5％   10％   19％
 Fab019  66％  70％  1％  1％  2％  13％  29％   13％   16％   23％
 Fab020  68％  69％  1％  1％  2％  13％  29％   17％   19％   18％
 Fab对照  100％  100％  100％  100％  100％  100％  100％   100％   100％   100％
实施例2：Wnt特异的抗-LRP6抗体的鉴定
鉴定了抗-LRP6激动Fab。用所示抗体(1ug/ml)和0％或5％的Wnt3a条件培养基处理293T-STF细胞过夜，测量荧光素酶活性。在所示Wnt3a浓度下LRP6Fab处理的细胞和用抗-溶菌酶对照Fab(Fab对照)处理的细胞之间荧光素酶信号的比例绘图，如至少在图3中所见。
实施例3：LRP6的结构域作图和表位测定
如在至少图4中所见，使用FACS测定法的LRP6缺失突变体结构域作图显示，Wnt1特异的LRP6拮抗抗体结合至螺旋桨1，Wnt3a特异的LRP6拮抗抗体和激动LRP6抗体结合至螺旋桨3。用N末端带Flag标记的野生型或突变体LRP6表达构建体与MESD一起瞬时转染293T细胞。用抗-Flag抗体(图4B)和所示Fab(图4C)染色细胞并通过FACS分析。红色曲线表示两种激动LRP6抗体(Fab025和Fab026)。紫色曲线表示两种Wnt1特异的LRP6拮抗抗体(Fab010和Fab021)。深蓝色曲线表示两种Wnt3a特异的LRP6拮抗抗体(Fab002和Fab004)。浅蓝色曲线表示抑制Wnt3a和Wnt1二者诱导的信号传导的LRP6拮抗抗体(Fab005)。表III显示抗-LRP6Fab和LRP6平截突变体之间的相对结合能力(此表数据对应于图4A-4C中所示的FACS分析图)。“--”表示无活性，“+”表示活性(符号越多表示活性越高)。
表III
激动剂   Wnt1拮抗剂   Wnt3A拮抗剂  Wnt3A、部分Wnt1拮抗剂
  LRP6全长   +++   +++   +++   +++
  LRP6del I   +++   --   +++   +++
  LRP6del II   +++   +++   +++   +++
  LRP6del III   --   +++   --   ++
  LRP6del I-II   +++   --   +++   +++
  LRP6del I-III   --   --   --   --
如本申请通篇所述和至少图4A-4C中所描述，能够结合至LRP6的螺旋桨1的那些Fab以Wnt1特异性起作用(例如Wnt1特异Fab，Fab010和Fab021)，而结合至LRP6的螺旋桨3的那些Fab以Wnt3A特异性起作用(例如Wnt3A特异的Fab，Fab002和Fab004)。如本文所示，Wnt3和Wnt3a特异的信号传导活性可以最有效地被Wnt3a特异的LRP6拮抗结合分子抑制；Wnt1、Wnt2、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和Wnt10特异的信号传导活性可以最有效地被Wnt1特异的LRP6拮抗结合分子抑制。激动LRP6结合分子(例如Fab025和Fab026)不被认为是Wnt特异性的，其结合LRP6的第三螺旋桨(即，只有在螺旋桨3缺失(表示为LRP6 del III)时它们才丧失LRP6结合能力)。
实施例4：LRP6的寡聚化增强Wnt信号传导
如图5所述，当转化为IgG时，LRP6拮抗抗体显示激动活性。用Wnt1或Wnt3a与SuperTopflash报告基因一起转染293T细胞并用LRP6抗体处理。相对抗溶菌酶对照(Fab对照)标准化荧光素酶活性。一旦转化为IgG，Wnt1特异的拮抗抗体在Wnt3a测定中显示激动活性，而Wnt3a特异的拮抗抗体在Wnt1测定中显示激动活性。这些观测结果与Wnt1和Wnt3a结合至LRP6的不同区域进行信号传导和LRP6的寡聚化增强Wnt信号传导的观测结果是一致的。例如，Wnt1特异性拮抗IgG通过阻断Wnt1和LRP6间的物理相互作用抑制Wnt1信号传导。但是，Wnt1特异性抗体不阻断Wnt3a-LRP6相互作用，而是诱导LRP6的寡聚化。这导致对Wnt3a配体的增强的反应。这些数据表明，内源性LRP6的寡聚化增加Wnt信号传导。
实施例5：LRP6磷酸化和游离β-联蛋白累积的抑制
PA-1细胞是卵巢畸胎瘤细胞。用Fab004、Fab004和Fab012组合刺激6小时来处理这些细胞。用Triton-X缓冲液全细胞裂解作用制备磷酸-LRP6(pLRP6)和LRP6样品。通过在低渗溶液中反复冻融进行细胞分级分离制备β-联蛋白IB样品。
NCI-H929是多发性骨髓瘤细胞。使用了4×106的细胞。将这些细胞与蛋白质预孵育30分钟，然后进行4小时的Wnt3a刺激(50％条件培养基)。在低渗溶液中反复冻融进行细胞分级分离，将膜部分重悬于Triton-X缓冲液。

Claims (38)

1.低密度脂蛋白受体相关蛋白6多肽(LRP6)结合分子，其包含特异结合至LRP6的抗体的抗原结合部分，其中所述抗原结合部分结合至人LRP6(SEQ ID NO：1)的表位，所述表位在以下之一内或与之重叠：
(a)SEQ ID NO：1的氨基酸20-326；
(b)SEQ ID NO：1的氨基酸286-324；
(c)SEQ ID NO：1的氨基酸631-932；或
(d)SEQ ID NO：1的氨基酸889-929。
2.权利要求1的LRP6结合分子，其包含特异结合至LRP6的抗体的抗原结合部分，其中所述抗原结合部分结合至人LRP6(SEQ ID NO：1)的表位，所述表位在以下之一内或与之重叠：
(a)SEQ ID NO：1的氨基酸20-326；或
(b)SEQ ID NO：1的氨基酸286-324。
3.权利要求2的LRP6结合分子，其包含特异结合至LRP6的抗体的抗原结合部分，其中所述抗原结合部分结合至人LRP6(SEQ ID NO：1)的表位，所述表位在以下之一内或与之重叠：
(a)SEQ ID NO：1的氨基酸70-109；
(b)SEQ ID NO：1的氨基酸114-152；
(c)SEQ ID NO：1的氨基酸157-196；
(d)SEQ ID NO：1的氨基酸201-237；或
(e)SEQ ID NO：1的氨基酸242-326。
4.权利要求1的LRP6结合分子，其包含特异结合至LRP6的抗体的抗原结合部分，其中所述抗原结合部分结合至人LRP6(SEQ ID NO：1)的表位，所述表位在以下之一内或与之重叠：
(a)SEQ ID NO：1的氨基酸631-932；或
(b)SEQ ID NO：1的氨基酸889-929。
5.权利要求4的LRP6结合分子，其包含特异结合至LRP6的抗体的抗原结合部分，其中所述抗原结合部分结合至人LRP6(SEQ ID NO：1)的表位，所述表位在以下之一内或与之重叠：
(a)SEQ ID NO：1的氨基酸889-929；
(b)SEQ ID NO：1的氨基酸677-680；
(c)SEQ ID NO：1的氨基酸720-723；
(d)SEQ ID NO：1的氨基酸763-766；
(e)SEQ ID NO：1的氨基酸806-809；或
(f)SEQ ID NO：1的氨基酸846-849。
6.权利要求1-5中任一项的LRP6结合分子，其中所述抗原结合部分能够激动Wnt信号传导途径。
7.权利要求1-5中任一项的LRP6结合分子，其中所述抗原结合部分能够拮抗Wnt信号传导途径。
8.权利要求1、4和5中任一项的LRP6结合分子，其中所述抗原结合部分优选地抑制Wnt3或Wnt3a特异的信号传导活性中的一种或多种。
9.权利要求1、4和5中任一项的LRP6结合分子，其中所述抗原结合部分能够拮抗Wnt1、Wnt2、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b或Wnt10特异的信号传导活性中的一种或多种。
10.权利要求1-9中任一项的LRP6结合分子，其中所述抗原结合部分与非人类灵长动物的LRP6交叉反应。
11.权利要求1-9中任一项的LRP6结合分子，其中所述抗原结合部分与啮齿动物物种的LRP6交叉反应。
12.前述权利要求中任一项的LRP6结合分子，其中所述抗原结合部分与人LRP5交叉反应。
13.前述权利要求中任一项的LRP6结合分子，其中所述抗原结合部分结合至线性表位。
14.权利要求1-12中任一项的LRP6结合分子，其中所述抗原结合部分结合至非线性表位。
15.前述权利要求中任一项的LRP6结合分子，其中所述LRP6结合分子包含所述抗体的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2或Fv片段。
16.前述权利要求中任一项的拮抗LRP6结合分子，其中所述抗原结合部分能够结合和抑制磷酸化的LRP6(磷酸-LRP6)。
17.前述权利要求中任一项的LRP6结合分子，其中所述抗原结合部分以等于或小于1nM的KD结合至LRP6。
18.前述权利要求中任一项的LRP6结合分子，其中所述抗原结合部分是人抗体的抗原结合部分。
19.前述权利要求中任一项的LRP6结合分子，其中所述抗体是人源化抗体。
20.前述权利要求中任一项的LRP6结合分子，其中所述抗原结合部分是单克隆抗体的抗原结合部分。
21.前述权利要求中任一项的LRP6结合分子，其中所述抗原结合部分是多克隆抗体的抗原结合部分。
22.前述权利要求中任一项的LRP6结合分子，其中所述LRP6结合分子是嵌合抗体。
23.前述权利要求中任一项的LRP6结合分子，其中所述抗原结合部分产生自以下同种型之一的抗体：IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
24.前述权利要求中任一项的拮抗LRP6结合分子，其中所述LRP6结合分子抑制LRP6结合至LRP6配体。
25.前述权利要求中任一项的拮抗LRP6结合分子，其中所述LRP6结合分子抑制LRP6结合至以下Wnt信号传导途径成员的一个或多个：dickkopf 1(DKK1)、DKK2、DKK4、SOST1、SOSD1(USAG1)、sFRP(可溶性Fzd相关蛋白)1-4、Wise或Wnt配体。
26.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的LRP6结合分子。
27.治疗Wnt相关病症的方法，所述方法包括对患有或遭受所述Wnt相关病症的个体施用前述权利要求中任一项的LRP6结合分子或包含前述权利要求中任一项的LRP6结合分子的药物组合物。
28.治疗癌症的方法，所述方法包括对患有或遭受癌症的个体施用前述权利要求中任一项的拮抗LRP6结合分子或包含前述权利要求中任一项的拮抗LRP6结合分子的药物组合物。
29.治疗骨关节炎的方法，所述方法包括对患有或遭受骨关节炎的个体施用前述权利要求中任一项的拮抗LRP6结合分子或包含前述权利要求中任一项的拮抗LRP6结合分子的药物组合物。
30.治疗肥胖症或糖尿病的方法，所述方法包括对患有或遭受肥胖症或糖尿病的个体施用前述权利要求中任一项的激动LRP6结合分子或包含前述权利要求中任一项的激动LRP6结合分子的药物组合物。
31.治疗神经变性疾病的方法，所述方法包括对患有或遭受所述神经变性疾病的个体施用前述权利要求中任一项的激动LRP6结合分子或包含前述权利要求中任一项的激动LRP6结合分子的药物组合物。
32.治疗纤维化病症的方法，所述方法包括对患有或遭受所述纤维化病症的个体施用前述权利要求中任一项的激动LRP6结合分子或包含前述权利要求中任一项的激动LRP6结合分子的药物组合物。
33.治疗骨质疏松症的方法，所述方法包括对患有或遭受骨质疏松症的个体施用前述权利要求中任一项的激动LRP6结合分子或包含前述权利要求中任一项的激动LRP6结合分子的药物组合物。
34.低密度脂蛋白受体相关蛋白6多肽(LRP6)结合分子，其能够结合至人LRP6(SEQ ID NO：1)的表位，所述表位在以下序列之一内或与之重叠：
(a)SEQ ID NO：1的氨基酸20-326；
(b)SEQ ID NO：1的氨基酸286-324；
(c)SEQ ID NO：1的氨基酸631-932；或
(d)SEQ ID NO：1的氨基酸889-929。
35.权利要求34的LRP6结合分子，其能够激动Wnt信号传导途径。
36.权利要求34的LRP6结合分子，其能够拮抗Wnt信号传导途径。
37.药物组合物，其包含权利要求34-36中任一项的LRP6结合分子。
38.治疗Wnt相关病症的方法，所述方法包括对患有或遭受所述Wnt相关病症的个体施用权利要求34-36中任一项的LRP6结合分子或包含权利要求34-36中任一项的LRP6结合分子的药物组合物。
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