CN110177571A - 工程化抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开文本涉及共结合靶细胞上的细胞类型选择性(或特异性)抗原(指导物)和信号传导受体(效应子)的工程化抗体。在一些情况下，所述工程化抗体能够调节靶细胞上的信号传导途径。在其他实施方案中，将本公开文本的工程化抗体给予受试者以治疗疾病或病症。

Description

工程化抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年11月18日提交的美国临时申请号62/424,337的权益，将其内容以其整体并入本文并用于所有目的。
关于联邦政府资助
研究或开发的声明
本发明是在通过美国国立卫生研究院授予的批准号R01 CA118919、R01 CA129491和R01 CA171315下由政府支持完成的。政府对本发明拥有一定的权利。
对“序列表”、表格或计算机程序清单附录的引用作为ASCII文件提交
将以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：048536_594001WO_SEQLIST.txt，记录日期：2017年11月17日，大小：177,513个字节)。
背景技术
细胞信号传导途径对于维持内稳态以及调节细胞生长和存活是重要的。正常细胞和患病细胞通常使用重叠途径，从而产生对治疗靶向的障碍。患病细胞对途径调节的选择性敏感性可允许靶向某些途径用以进行治疗，从而证明临床适用性。在这一方面，单克隆抗体已经作为癌症治疗剂出现，部分原因在于其在靶标结合中的高特异性和亲和力，以及易于化学和分子修饰，使得能够开发更多复杂的基于抗体的治疗剂。双特异性抗体已作为可能的治疗剂出现。例如，双特异性T细胞衔接器(BiTE)博纳吐单抗具有用于肿瘤靶向T细胞募集和激活的抗CD19和抗CD3单链可变片段(scFv)。其他例子包括含有与抗IGF-1R IgG的重链C末端融合的抗ErbB3scFv的IgG-scFv，以及具有针对VEGF-A和血管生成素-2的两条重链和轻链的异二聚体对的CrossMAb。前述抗体中的双特异性被设计为引入新活性(在BiTE的情况下)或阻断对细胞生长和存活至关重要的两种途径，而没有细胞类型选择性。然而，在这些共靶向策略中毒性是一个问题，因为两种抗体均与对细胞生长和存活至关重要的信号传导受体结合。根据本公开文本的各种实施方案克服了上述缺点，并提供了一种新的且有效的途径，其允许双特异性抗体的模块化开发，目的是实现对靶细胞(例如肿瘤)的最大作用，而对正常细胞没有作用或作用最小。此外，本文公开的系统和平台不限于某种途径和/或细胞类型，而是通常可应用于多种信号传导途径和靶细胞类型。在一些情况下，患病细胞对途径调节的选择性敏感性允许靶向某些途径用以进行治疗。
发明内容
在一个方面，本文提供的公开文本涉及工程化抗体，其具有第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区与在细胞表面上表达的指导物抗原结合且所述第二抗原结合区与在相同细胞表面上表达的效应子抗原结合，并且其中所述指导物抗原的特征在于密度比所述效应子抗原的密度高至少四倍。
在一些实施方案中，所述指导物抗原的特征在于密度比效应子抗原的密度高至少五倍。
在一些实施方案中，所述指导物抗原的特征在于密度比效应子抗原的密度高至少十倍。
在一些实施方案中，所述指导物抗原的特征还在于在细胞表面上至少15,000个拷贝的表达。
在一些实施方案中，所述指导物抗原的特征还在于在细胞表面上至少20,000个拷贝的表达。
在另一个方面，本文提供的公开文本涉及工程化抗体，其具有第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区与在细胞表面上表达的指导物抗原结合且所述第二抗原结合区与在相同细胞表面上表达的效应子抗原结合，并且其中所述指导物抗原的特征在于在细胞表面上至少15,000个拷贝的表达。
在一些实施方案中，所述指导物抗原的特征在于在细胞表面上至少20,000个拷贝的表达。
在一些实施方案中，所述指导物抗原的特征还在于密度比效应子抗原的密度高至少四倍。
在一些实施方案中，所述指导物抗原的特征还在于密度比效应子抗原的密度高至少五倍。
在一些实施方案中，所述指导物抗原的特征还在于密度比效应子抗原的密度高至少十倍。
在一些实施方案中，所述工程化抗体与所述效应子抗原的结合导致所述细胞中信号传导途径的调节。
在一些实施方案中，所述信号传导途径选自AKT途径，c-MET途径，NF-kB途径，Notch信号传导途径，p53途径，Ras-Raf-MEK-ERK途径，STAT信号传导途径，Wnt信号传导途径，YAP/Wnt信号传导途径，包括但不限于表皮生长因子受体(EGFR)家族、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族、胰岛素样生长因子受体(IGFR)家族、血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族和血小板源性生长因子受体(PDGFR)家族的受体酪氨酸激酶(RTK)信号传导途径家族，NK(自然杀伤)激活途径，NK抑制途径，巨噬细胞调节途径，树突细胞信号传导途径，T细胞调节途径和检查点抑制途径。
在一些实施方案中，所述信号传导途径是Wnt信号传导途径。
在一些实施方案中，所述效应子抗原是肿瘤抗原。
在一些实施方案中，所述效应子抗原是肿瘤相关抗原。
在再另一个方面，本文提供的公开文本涉及一种包含第一抗原结合区和第二抗原结合区的工程化抗体，其中所述第一抗原结合区结合靶细胞表面上的效应子抗原，其中所述效应子抗原与信号传导途径相关且所述第二抗原结合区结合所述靶细胞表面上的指导物抗原，其中所述靶细胞中所述指导物抗原的密度显著高于所述效应子抗原的密度，并且其中所述双特异性抗体与所述靶细胞的结合导致所述靶细胞中信号传导途径的调节。
在一些实施方案中，所述工程化抗体是双特异性抗体。
在一些实施方案中，与使用对所述效应子抗原单特异性的抗体时所述效应子抗原的占用率水平相比，使用所述双特异性抗体时所述效应子抗原的占用率水平较高。
在一些实施方案中，所述抗体选自M10A12、RYR、H3和PD32。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合区具有表5中列出的序列和/或其任何片段。
在一些实施方案中，所述靶细胞中所述指导物抗原与所述效应子抗原的密度比为约5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
在一些实施方案中，存在于所述靶细胞表面上的指导物抗原的表达水平阈值的范围为每个细胞约15,000与约20,000个拷贝之间。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合区具有与肿瘤特异性抗原结合的单链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中，所述效应子抗原是LRP6。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合区具有含有三个互补决定区(CDR)的重链可变区，其中来自所述重链可变区的CDR选自表3或表4。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合区具有含有三个互补决定区(CDR)的轻链可变区，其中来自所述轻链可变区的CDR选自表3或表4。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合区具有含有三个互补决定区(CDR)的重链可变区和含有三个互补决定区(CDR)的轻链可变区，其中来自所述重链可变区的CDR和来自所述轻链可变区的CDR选自表3或表4。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合区具有重链可变区，所述重链可变区与选自表3或表4的重链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合区具有轻链可变区，所述轻链可变区与选自表3或表4的轻链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合区具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与选自表3或表4的重链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性，所述轻链可变区与选自表3或表4的轻链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合区具有含有选自表3或表4的序列的重链可变区和含有选自表3或表4的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述指导物抗原是细胞类型选择性细胞表面抗原。
在一些实施方案中，所述指导物抗原是肿瘤相关抗原。
在一些实施方案中，所述指导物抗原是肿瘤特异性抗原。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合区具有含有三个互补决定区(CDR)的重链可变区，其中来自所述重链可变区的CDR选自表5。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合区具有含有三个互补决定区(CDR)的轻链可变区，其中来自所述轻链可变区的CDR选自表5。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合区具有含有三个互补决定区(CDR)的重链可变区和含有三个互补决定区(CDR)的轻链可变区，其中来自所述重链可变区的CDR和来自所述轻链可变区的CDR选自表5。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合区具有重链可变区，其与选自表5的重链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合区具有轻链可变区，其与选自表5的轻链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合区具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与选自表5的重链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性，所述轻链可变区与选自表5的轻链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合区具有含有选自表5的序列的重链可变区和含有选自表5的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体与所述靶细胞的结合导致所述信号传导途径的下调。
在一些实施方案中，与对所述效应子抗原单特异性的抗体的IC50值相比，所述双特异性抗体的IC50值降低至少100倍。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体与所述靶细胞的结合导致信号传导途径的上调。
在一些实施方案中，与使用对所述效应子抗原单特异性的抗体相比，使用所述双特异性抗体时所述信号传导途径的活性增加至少10倍，其中所述信号传导途径的活性通过响应于所述信号传导途径的报告基因测定来测量。
在再另一个方面，本文提供的公开文本涉及包含工程化抗体和赋形剂的药物组合物。
在一些实施方案中，所述工程化抗体被配制用于肠胃外给予。
在再另一个方面，本文提供的公开文本涉及治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的工程化或双特异性抗体。
在一些实施方案中，所述疾病或病症与所述细胞中信号传导途径的调节异常有关。
在一些实施方案中，所述信号传导途径选自AKT途径，c-MET途径，NF-kB途径，Notch信号传导途径，p53途径，Ras-Raf-MEK-ERK途径，STAT信号传导途径，Wnt信号传导途径，YAP/Wnt信号传导途径，NK(自然杀伤)激活途径，NK抑制途径和检查点抑制途径，包括但不限于表皮生长因子受体(EGFR)家族、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族、胰岛素样生长因子受体(IGFR)家族、血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族和血小板源性生长因子受体(PDGFR)家族的受体酪氨酸激酶(RTK)信号传导途径家族，NK(自然杀伤)激活途径，NK抑制途径，巨噬细胞调节途径，树突细胞信号传导途径，T细胞调节途径和检查点抑制途径。
在再另一个方面，本文提供的公开文本涉及生成工程化抗体的方法。该方法包括a)选择在细胞表面上表达多种指导物抗原和效应子抗原的细胞；b)确定所述多种指导物抗原与效应子抗原的密度比；以及c)如果所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少4:1，则制备具有与所述指导物抗原结合的第一抗原结合区和与所述细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区的工程化抗体。
在一些实施方案中，所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少5:1。
在一些实施方案中，所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少10:1。
在一些实施方案中，所述细胞在细胞表面上表达指导物抗原的至少15,000或更多个拷贝。
在一些实施方案中，所述细胞在细胞表面上表达指导物抗原的至少20,000或更多个拷贝。
在再另一个方面，本文提供的公开文本涉及生成工程化抗体的方法。所述方法包括a)选择在细胞表面上表达多种指导物抗原和效应子抗原的细胞；b)确定细胞表面上表达的指导物抗原的拷贝数；c)如果所述细胞表达指导物抗原的至少15,000个拷贝，则制备具有与所述指导物抗原结合的第一抗原结合区和与所述细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区的工程化抗体。
在一些实施方案中，所述细胞在细胞表面上表达指导物抗原的至少20,000或更多个拷贝。
在一些实施方案中，所述方法还包括确定指导物抗原与效应子抗原的密度比。
在一些实施方案中，所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少4:1。
在一些实施方案中，所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少5:1。
在一些实施方案中，所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少10:1。
在再另一个方面，本文提供的公开文本涉及通过以下过程产生的工程化抗体：a)选择在细胞表面上表达多种指导物抗原和效应子抗原的细胞；b)确定所述多种指导物抗原与效应子抗原的密度比；以及c)如果所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少4:1，则制备具有与所述指导物抗原结合的第一抗原结合区和与所述细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区的工程化抗体。
在一些实施方案中，所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少5:1。
在一些实施方案中，所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少10:1。
在一些实施方案中，所述细胞在细胞表面上表达指导物抗原的至少15,000或更多个拷贝。
在一些实施方案中，所述细胞在细胞表面上表达指导物抗原的至少20,000或更多个拷贝。
在再另一个方面，本文提供的公开文本涉及通过以下过程产生的工程化抗体：a)选择在细胞表面上表达多种指导物抗原和效应子抗原的细胞；b)确定细胞表面上表达的指导物抗原的拷贝数；c)如果所述细胞表达指导物抗原的至少15,000个拷贝，则制备具有与所述指导物抗原结合的第一抗原结合区和与所述细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区的工程化抗体。
在一些实施方案中，所述细胞在细胞表面上表达指导物抗原的至少20,000或更多个拷贝。
在一些实施方案中，所述过程还包括确定指导物抗原与效应子抗原的密度比。
在一些实施方案中，所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少4:1。
在一些实施方案中，所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少5:1。
在一些实施方案中，所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少10:1。
在再另一个方面，本文提供的公开文本涉及包括工程化抗体的抗体-细胞复合物，其中所述工程化抗体具有与细胞上的指导物抗原结合的第一抗原结合区和与所述细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区，其中所述细胞的特征在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约4:1。
在一些实施方案中，所述细胞的特征在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约5:1。
在一些实施方案中，所述细胞的特征在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约10:1。
在一些实施方案中，所述细胞具有在细胞表面上表达的指导物抗原的约15,000或更多个拷贝。
在一些实施方案中，所述细胞具有在细胞表面上表达的指导物抗原的约20,000或更多个拷贝。
在再另一个方面，本文提供的公开文本涉及包括工程化抗体的抗体-细胞复合物，其中所述工程化抗体具有与细胞上的指导物抗原结合的第一抗原结合区和与所述细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区，其中所述细胞具有在细胞表面上表达的指导物抗原的约15,000或更多个拷贝。
在一些实施方案中，所述癌症细胞具有在细胞表面上表达的指导物抗原的约20,000或更多个拷贝。
在一些实施方案中，所述细胞的特征还在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约4:1。
在一些实施方案中，所述细胞的特征还在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约5:1。
在一些实施方案中，所述细胞的特征还在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约10:1。
附图说明
将通过参考以下阐述了说明性实施方案和附图的详细描述获得对本公开文本的某些特征和优点的理解，在所述说明性实施方案中利用了本公开文本的原理，在所述附图中：
图1A至图1D描绘了这样的结果，其说明对LRP6亚结构域特异的scFv抗体的鉴定和抗Wnt信号传导活性验证。图1A描绘了LRP6的细胞外E1E2和E3E4结构域的示意图，这两个细胞外结构域各自包括两个β螺旋桨(BP)和EGF样结构域。纯化每种Fc融合物并将其用于以下scFv噬菌体展示选择。图1B描绘了STF报告基因测定的结果，该STF报告基因测定筛选针对LRP6E1E2或LRP6E3E4结构域的拮抗性scFv噬菌体抗体。将用STF报告基因和Wnt3a或Wnt1表达构建体转染的HEK293细胞用单独扩增的噬菌体抗体处理。通过噬菌体抗体处理确定针对Wnt/β连环蛋白报告基因活性的激动性(蓝色或B)或拮抗性(红色或R)作用。通过将萤火虫萤光素酶(FL)报告基因活性除以共转染的海肾萤光素酶(RL)活性来描述相对萤光素酶活性。图1C描绘了使用scFv-Fc融合物的STF报告基因测定的结果。分别测试纯化的E34N19或E12N21scFv-Fc(100nM)的Wnt3a或Wnt1特异性报告基因抑制。误差条表示n＝3的SD(标准差)。图1D描绘了这样的结果，其说明对E34N19或E12N21scFv-Fc的β连环蛋白报告基因抑制效力的评估。将HEK293细胞用STF报告基因和Wnt3a或Wnt1表达构建体转染，并分别用不同浓度的E34N19或E12N21scFv-Fc处理。每个值表示n＝3的平均值±SD。
图2A至图2D描绘了这样的结果，其说明指导物抗体赋予双特异性抗LRP6抗体有效的抗Wnt信号传导活性。图2A描绘了双特异性串联scFv-Fc构建体的示意性设计。通过SDS-PAGE在还原条件下分析纯化的E34N19scFv-Fc(约60kDa)和TaFv-Fc(约90kDa)融合物。图2B描绘了携带指导物scFv抗体的基于IgG的双特异性抗体(bsIgG)的示意性设计。保留E34N19IgG的重链，并采用到C末端的抗ALCAM H3scFv修饰轻链。在还原条件下，E34N19IgG的SDS-PAGE分析显示了两条单独的重链(约50kDa)和轻链(约25kDa)，而E34N19/H3bsIgG展示了两个条带，均为约50kDa。图2C描绘了STF报告基因测定的结果，以比较单特异性或双特异性抗LRP6E3E4抗体的效力。通过将不同浓度的每种抗体与Wnt3a转染的HEK293细胞一起孵育来评价报告基因活性。值表示平均值±SD。图2D描绘了用于测试针对LRP6E1E2结构域的抗体的效力的STF报告基因测定结果。在用Wnt1表达质粒和报告基因构建体转染的HEK293细胞中滴定每种抗体。单独地分析了相对萤光素酶报告基因活性。值表示重复测定中的平均值±SD。
图3A至图3F描绘了这样的结果，其说明抗LRP6 bsAb以指导物抗原选择性方式有效地抑制Wnt/β连环蛋白报告基因活性。图3A描绘了EphA2选择性Wnt3a/β连环蛋白信号传导抑制RYR/E34N19的结果。使用亲本HEK293细胞或HEk293-EphA2细胞进行STF报告基因测定。将细胞用报告基因和Wnt3a表达构建体转染，然后用不同浓度的RYR/E34N19处理。基于曲线拟合计算IC50值。CM；细胞膜。图3B描绘了这样的结果，其说明RYR/E34N19的有效抗Wnt3a/β连环蛋白信号传导活性。将HEK293细胞用报告基因质粒、Wnt3a和EphA2表达构建体瞬时转染，并用于比较指定抗体的STF报告基因抑制效力。基于曲线拟合估算IC50值。图3C描绘了这样的结果，其说明ICAM-1选择性Wnt3a/β连环蛋白信号传导阻断M10A12/E34N19。用亲本HEK293细胞或瞬时过表达ICAM-1的HEK293细胞(HEK293-ICAM-1高)进行STF报告基因测定。在抗体处理后评价M10A12/E34N19的报告基因抑制效力，并基于曲线拟合计算IC50。图3D描绘了Wnt3a/β连环蛋白信号传导有效阻断M10A12/E34N19的结果。用瞬时表达高水平ICAM-1的HEK293细胞进行STF报告基因测定。用不同浓度的指定抗体处理转染的HEK293细胞。从每个非线性曲线拟合估算IC50值。图3E描绘了EphA2拷贝数与RYR/E34N19的相应Wnt/β连环蛋白报告基因抑制功效之间的相关分析。通过瞬时转染制备具有不同拷贝数的EphA2的HEK293细胞，并将所述细胞用RYR/E34N19(10nM)处理。在将细胞与抗体一起孵育后分析STF报告基因活性，并同时通过流式细胞术检测EphA2拷贝数。图3F描绘了ICAM-1拷贝数与M10A12/E34N19的相应Wnt/β连环蛋白报告基因抑制功效之间的相关分析的结果。类似于E中所述，用ICAM-1瞬时转染的HEK293细胞用于STF报告基因确定和ICAM-1拷贝数确定。将10nM的M10A12/E34N19处理至转染的细胞，然后同时分析Wnt/β连环蛋白报告基因活性和ICAM-1拷贝数。绘制E和F中的每个相对报告基因活性，并从图中计算Pearson相关系数(r)。误差条表示重复的SD。
图4A至图4C描绘了这样的结果，其说明通过RYR/E34N19的LRP6周转抑制Wnt1介导的β连环蛋白信号传导。图4A描绘了这样的结果，其证明LRP6与内化或非内化bsAb共定位。将亲本HEK293细胞和HEK293-EphA2细胞单独地与H3/E34N19或RYR/E34N19一起孵育。用二级抗人IgG-FITC(绿色)染色膜结合的或内化抗体，然后通过647标记的E12N21IgG(红色)检测LRP6。在共聚焦显微镜下观察染色的细胞。比例尺，10μm。图4B描绘了诱导bsAb介导的内化之后细胞表面指导物抗原和效应子抗原密度。将HEK293-EphA2细胞与RYR/E34N19、H3/E34N19或C10/E34N19一起孵育并洗涤以除去未结合的抗体。使用单独的647标记的抗体(其识别每种抗原上的另一个表位)确定细胞表面上EphA2、ALCAM或LRP6的拷贝数。将计算的拷贝数(ABC)针对从没有用任何抗体处理的细胞测量的每种抗原的ABC值归一化。数据表示重复测定的平均值±SD。*P<0.05。图4C描绘了通过LRP6周转对Wnt1诱导的信号传导的抑制。用报告基因和Wnt1表达构建体转染HEK293-EphA2细胞，然后用不同浓度的每种指定的TaFv-Fc处理。值表示重复测定的平均值±SD。*P<0.05。
图5A至图5C描绘了这样的结果，其说明指导的抗LRP6 bsAb在体外最大化了抗肿瘤发生活性。图5A描绘了用于评价β连环蛋白的核转位的免疫染色分析的结果。用20％Wnt3a-CM和/或每种抗体(100nM)处理A549细胞。将没有与Wnt3a-CM和/或抗体一起孵育的细胞用作对照。在抗体孵育后将细胞β连环蛋白(红色)和细胞核(蓝色)染色并合并以确定β连环蛋白的细胞核定位。使用ImageJ定量细胞核β连环蛋白信号，并将其用背景荧光(右)归一化。比例尺表示100μm。*P<0.05并且**P<0.01。图5B描绘了这样的结果，其说明通过H3/E34N19有效抑制肿瘤球形成。将A549细胞的单一细胞群在补充有或没有10％Wnt3a-CM和每种抗体(50μg/ml)的球形成培养基中孵育2周。将每个孔中直径>100μm的肿瘤球的数目定量。数据表示重复测定的平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01并且***P<0.001。图5C描绘了用于评价bsAb的迁移抑制活性的伤口愈合测定的结果。刮擦A549单层并用20％Wnt3a-CM和不同浓度的每种IgG或bsIgG处理。使用ImageJ定量伤口面积并针对阳性对照(XAV939，50μM)归一化。数据表示重复测定的平均值±SD。图5D描绘了用于验证bsAb在细胞浸润中的抑制功效的transwell测定的结果。将接种在transwell小室的上隔室上的PC3细胞与每种TaFv-Fc一起孵育，并在下隔室中补充20％Wnt3a-CM。在孵育24h后用结晶紫染色浸润的细胞，并以10x放大率拍摄显微镜图像。评估来自每个实验组的五个视野中的细胞数，并针对没有抗体处理的对照组(左)进行归一化。显示了染色的transwell的代表性图像(右)。*P<0.05。
图6A至图6D描绘了这样的结果，其说明指导的抗LRP6 bsAb抑制由RSPO1刺激的β连环蛋白活性。图6A描绘了用于确定RSPO1刺激的β连环蛋白激活和bsAb对信号传导的抑制的STF报告基因测定的结果。用或不用重组RSPO1(100ng/ml)和/或每种TaFv-Fc(10μg/ml)处理用STF报告基因和Wnt3a或Wnt1表达构建体转染的HEK293细胞。值表示重复测定的平均值±SD。图6B描绘了这样的结果，其说明在通过bsAb抑制RSPO1诱导的Wnt3a/β连环蛋白信号传导中的抗原拷贝数依赖性。将表达不同水平的指导物抗原EphA2或ALCAM的HEK293-EphA2细胞用STF报告基因和Wnt3a表达构建体转染，然后用重组RSPO1(100ng/ml)和不同浓度的每种b2scFv-Fc处理。值表示n＝3的平均值±SD。图6C描绘了在A549癌细胞中通过H3/E34N19对RSPO1诱导的Wnt3a/β连环蛋白信号传导的有效抑制。将细胞用STF报告基因和Wnt3a表达构建体转染，然后用重组RSPO1(100ng/ml)和每种抗体(10nM)处理。误差条表示重复测定的SD。图6D描绘了这样的结果，其说明在Wnt3a/RSPO1诱导的信号传导刺激下bsAb的抗浸润作用。将PC3细胞接种在具有每种抗体的transwell的上隔室上，并向下隔室提供20％Wnt3a-CM和重组RSPO1(100ng/ml)。孵育24h后，通过结晶紫染色将浸润的细胞可视化。将来自每个实验组的五个视野的染色细胞的数目定量，并针对没有抗体治疗的对照组进行归一化。图中的*、**和***分别表示P值<0.05、<0.01和<0.001。
图7A至图7E描绘了这样的结果，其说明抗LRP6scFv和衍生的bsAb的表征。图7A描绘了通过流式细胞术分析进行抗LRP6scFv噬菌体筛选的结果。从针对LRP6E1E2或LRP6E3E4结构域的第3轮淘选输出单独地扩增单个scFv噬菌体克隆。将scFv噬菌体颗粒与亲本HEK293或LRP6转染的HEK293细胞一起孵育，并通过生物素化抗M13 IgG和PE标记的链霉亲和素检测。将相对MFI值(结合LRP6+细胞的噬菌体相对于LRP6-细胞的倍数)绘制在图上。图7B和图7C描绘了对于E34N19(B)或E12N21(C)scFv-Fc与HEK293细胞的结合动力学的流式细胞术分析的结果。基于Prism 5程序的非线性曲线拟合计算表观KD。图7D描绘了单特异性或双特异性抗LRP6抗体的细胞结合分析的结果。通过流式细胞术分析E34N19scFv-Fc、E34N19IgG、H/6TaFv-Fc、6/H bsIgG或H3 IgG(每种均为100nM)与最初表达ALCAM的HEK293细胞的结合。图7E描绘了TaFv-Fc与不同指导物抗体的结合特异性的结果。将HEK293细胞用ICAM-1或EphA2表达构建体瞬时转染，然后与每种指导的抗LRP6 bsAb一起孵育。亲本HEK293细胞仅高度表达指导物抗原ALCAM，并用作对于RYR/E34N19或M10A12/E34N19TaFv-Fc的对照细胞系。
图8A至图8D描绘了这样的结果，其说明指导的抗LRP6 bsAb的改善的结合和Wnt信号传导阻断。图8A和图8B描绘了这样的结果，其说明双特异性抗LRP6TaFv-Fc的亲和力测量。将HEK293细胞与不同浓度的H3/E34N19(A)或PD32/E34N19(B)TaFv-Fc一起孵育，并通过流式细胞术分析。基于非线性曲线拟合计算表观KD值。图8C描绘了HEK293细胞上的STF报告基因测定。评估E34N19IgG和E34N19/H3bsIgG对Wnt3a转染的HEK293细胞的β连环蛋白报告基因抑制功效。从曲线拟合估算IC50(E34N19IgG：5.2nM，E34N19/H3bsIgG：44.6pM)。值表示n＝3的平均值±SD。图8D描绘了当被双特异性与单特异性抗体结合时的LRP6占用率。将HEK293细胞与双特异性H3/E34N19或单特异性E34N19一起孵育，并通过生物素标记的E34N19scFv-Fc检测未占用的LRP6结合位点。来自在总位点中未占用位点的归一化MFI用于计算未占用的效应子抗原LRP6的百分比，从中计算占用率(100％-未占用％)。仅与抗指导物抗体(H3)一起孵育对效应子抗原(LRP6)的占用率没有影响。数据点表示重复测定的平均值±SD。
图9A至图9D描绘了这样的结果，其说明指导的抗LRP6 bsAb的改善的结合和Wnt信号传导阻断。图9A描绘了这样的结果，其说明H3 IgG、H3/E12N21或H3/E34N19TaFv-Fc以及E12N21或E34N19scFv-Fc(每种均为100nM)与最初表达ALCAM的A549细胞的结合活性。图9B和图9C描绘了A549细胞上的STF报告基因测定。将细胞用STF报告基因和Wnt3a(B)或Wnt1表达(C)构建体转染，然后分别用不同浓度的H3/E34N19和E34N19(B)或H3/E12N21或E12N21(C)处理。从曲线拟合估算IC50值。图9D描绘了这样的结果，其说明通过与抗体一起孵育得到的效应子抗原LRP6的受体占用率。将A549细胞与不同浓度的每种scFv-Fc或TaFv-Fc一起孵育16h。收集细胞并使用冷的PBS洗涤三次以去除剩余的抗体。使用Alexa647标记的E34N19IgG通过FACS确定未占用的LRP6表位的量。将MFI值针对没有与抗体孵育的对照组进行归一化，以产生未占用的效应子抗原LRP6的比率，由其得到占用率(100％-未占用％)。值表示重复测定的平均值±SD。
图10A和图10B描绘了这样的结果，其说明用bsAb拮抗Wnt3a以指导物抗原依赖性方式有效地抑制体外克隆形成活性。在图10A中，将球体培养的HEK293细胞解离成单细胞，并以每孔200个细胞的密度接种在24孔低附着板中。将球体细胞用包括每种指定的抗体(50μg/ml)的10％Wnt3a-CM处理并孵育2周。将每个孔中的球体(>100μm)的数目计数(左和中)，然后将球体解离并用钙黄绿素-AM(2μM)染色1h。来自球体的活细胞在FACS图上进行门控，并且对每个实验组中的数目进行定量。图10B描绘了用于确定bsAb的指导物抗原特异性抗Wnt信号传导效力的肿瘤球形成测定的结果。将由ALCAM高HCT116或ALCAM低HT29结肠癌细胞系产生的二级球体解离成单细胞并如A中所述接种，然后将细胞在补充有10％Wnt3a-CM的球体形成培养基中与每种抗体(50μg/ml)或XAV939(50μM)一起孵育。将每个孔中的球体数(>100μm)单独计数(左)，并显示代表性的完整孔图像(右)。N.S，不显著的。A和B中的值表示计数的球体数或活细胞数的平均比例。误差条表示n＝3的SD。*P<0.05并且**P<0.01。
图11描绘了这样的结果，其说明E34N19/H3bsIgG有效地抑制癌细胞迁移。图11描绘了来自伤口愈合迁移测定的代表性图像。刮擦接种在96孔板上的汇合的A549细胞并将其用不同浓度的指定抗体或XAV939在20％Wnt3a-CM内处理48h。在每个时间点拍摄细胞图像，并通过ImageJ定量伤口面积。
图12A至图12C描绘了这样的结果，其说明H3/E34N19通过使β连环蛋白去稳定化而显示出有效的抗增殖活性。将表达指导物抗原ALCAM的A549(A)或HCT116细胞(B)接种在96孔板上，并分别用10％Wnt3a-CM和指定浓度的H3/E34N19TaFv-Fc或E34N19scFv-Fc处理。将细胞孵育4天并用钙黄绿素-AM染色。测量细胞活力并用无抗体处理的对照组归一化。图12C描绘了这样的结果，其说明通过H3/E34N19处理抑制β连环蛋白和c-Myc水平。将A549细胞与10％Wnt3a-CM和/或H3/E34N19一起孵育。孵育24h后，分别分析来自膜或细胞质级分的磷酸化LRP6(p-LRP6)或细胞质β连环蛋白和c-Myc水平。
图13A至图13C描绘了这样的结果，其说明指导的bsAb在抑制Wnt3a/RSPO1诱导的Wnt信号传导刺激方面是有效的。图13A描绘了用于在提供有Wnt3a/RSPO1的条件下确定H3/E34N19的抗Wnt信号传导效力的STF报告基因测定的结果。将HEK293细胞用STF报告基因和Wnt3a表达构建体转染，然后用重组RSPO1(100ng/ml)和不同浓度的每种TaFv-Fc处理。对于H3/E34N19所测量的IC50为327pM，并且对于RYR/E34N19或C10/E34N19的IC50值分别估算为约50nM或多于约100nM。值表示n＝3的平均值±SD。图13B描绘了用于在提供有Wnt3a/RSPO1的条件下确定bsAb的抗Wnt信号传导活性的western印迹分析的结果。将A549细胞与Wnt3a-CM、重组RSPO1(100ng/ml)和每种指定的抗体(20μg/ml)一起孵育24h。将细胞分级分离成膜(针对p-LRP6)和细胞质(针对β连环蛋白和β肌动蛋白)级分。将每次确定中p-LRP6和β连环蛋白的条带强度针对每种β肌动蛋白水平归一化并在每个条带下描述。图13C描绘了对PC3细胞的transwell浸润测定的结果。来自每个重复测定的代表性图像，对应于图6D。将细胞接种在transwell小室的上隔室上，并分别用RYR/E34N19、H3/E34N19和C10/E34N19(50μg/ml)处理。在下隔室中提供20％Wnt3a-CM，然后孵育24h以诱导细胞浸润。用结晶紫染色浸润的细胞，并以10x放大率拍摄显微镜图像。
图14描绘了指导物/效应子细胞模型的示意图。
图15A至15F描绘了这样的结果，其说明指导的双特异性不抑制在表达低水平指导物抗原的正常细胞和正常干细胞上的Wnt信号传导。A)发现抗LRP6E3E4抗体E34N19与人和鼠LRP6二者结合。将重组人LRP6E3E4-Fc(hLRP6E3E4)、LRP6E1E2-Fc(hLRP6E1E2，作为对照)和小鼠全长LRP6-Fc(mLRP6，R&D系统)在PBS中稀释至5μg/ml，并在4℃下在96孔MaxisorpELISA板(Nunc)上包被过夜。将板在室温下通过在PBS中的2％脱脂牛奶封闭1h，进一步在室温下与均为5μg/ml的生物素化E34N19和同型对照非结合抗体(Ctrl Ab)一起孵育1h，用0.1％PBS-吐温20洗涤三次，并且在室温下与HRP缀合的链霉亲和素(Sigma Aldrich)一起孵育1h。将TMB底物(Thermo Scientific)用于比色反应，并在3min后添加1N Hcl(100μl/孔)以停止反应。通过读板器Synergy HT(BioTek)测定450nm处的O.D.值。B)抗指导物抗体RYR与人和鼠抗原二者结合。对表达EphA2的鼠结肠癌细胞系CT26进行FACS分析。图(C)和图(D)分别显示了对MC3T3-E1和C3H/10T1/2上指导物抗原表达的评价。通过FACS分析RYR(抗EphA2)和E34N19(抗LRP6)(每种均为100nM)的结合。MFI值(在减去背景后)用于计算直方图下所示的指导物与效应子比率。图(E)和图(F)分别显示了对MC3T3-E1和C3H/10T1/2的STF报告基因测定的结果。将两种细胞系用STF报告基因质粒转染，并用Wnt3a-CM中指定浓度的抗体处理。使用Tukey方法通过单向ANOVA分析重复测定中的数据，其显示任何研究组之间没有显著差异。
具体实施方式
由于抗体对靶标结合的特异性和亲和力以及易于化学和分子修饰，基于抗体的治疗剂已作为有效的癌症治疗选择出现。例如，批准的基于抗体的疗法具有单克隆抗体，如利妥昔单抗、托西莫单抗和曲妥珠单抗；以及双特异性T细胞衔接器，如博纳吐单抗。
在一些情况下，靶细胞上的低受体拷贝数或对抗原的低亲和力阻碍了基于抗体的疗法的治疗效果。在一些情况下，抗体对靶抗原的非特异性或癌细胞和非癌细胞二者中靶标的存在进一步限制了基于抗体的疗法的使用。
在某些实施方案中，本文所述涉及这样的平台技术，其针对识别两种不同细胞表面抗原的双特异性抗体、组合物、工程化抗体和产生此类抗体的设计方法。在一些情况下，工程化抗体共结合靶细胞上的细胞类型选择性抗原(指导物)和信号传导受体(效应子)。在一些情况下，工程化抗体利用指导物/效应子双特异性系统以细胞特异性或细胞选择性方式调节例如信号传导途径。
在一些实施方案中，本文描述了工程化抗体，其相对于单特异性抗体具有增强的结合亲和力和/或效力的指导物/效应子双特异性系统。在其他实施方案中，本文描述了具有指导物/效应子双特异性系统的工程化抗体，所述工程化抗体表现出与靶细胞的协同相互作用。
在另外的实施方案中，本文还描述的内容包括具有工程化抗体的药物组合物、使用所述工程化抗体的方法、工程化抗体-细胞复合物和具有工程化抗体的试剂盒。
定义
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与要求保护的主题所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。应理解，详细描述仅是示例性和解释性的，并不是对所要求保护的任何主题的限制。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。必须指出，如在说明书中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地规定。在本申请中，除非另外陈述，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”的使用是非限制性的。
尽管本发明的各种特征可以在单个实施方案的上下文中描述，但所述特征也可以单独提供或以任何合适的组合提供。相反，尽管为了清楚起见，本文可以在单独的实施方案的上下文中描述本发明，但是本发明也可以在单个实施方案中实现。
在说明书中对“一些实施方案”、“实施方案”、“一个实施方案”或“其他实施方案”的提及意指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本公开文本的至少一些实施方案中，但不必包括在本公开文本的所有实施方案中。
如本文所用，范围和量可表示为“约”特定值或范围。约也包括确切的量。因此，“约5μL”意指“约5μL”并且也意指“5μL”。通常，术语“约”包括预期在实验误差内的量。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以表示通过肽键彼此连接的线性系列的氨基酸残基，其包括蛋白质、多肽、寡肽、肽及其片段。蛋白质可以由天然存在的氨基酸和/或合成的(例如修饰的或非天然存在的)氨基酸组成。因此，本文所用的“氨基酸”或“肽残基”意指天然存在的和合成的氨基酸二者。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”包括融合蛋白，其包括但不限于在有或没有N末端甲硫氨酸残基情况下的具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列的融合物；免疫标记的蛋白质；具有可检测的融合配偶体的融合蛋白，例如包括作为融合配偶体、荧光蛋白、β半乳糖苷酶、萤光素酶等的融合蛋白；等等。此外，应注意，氨基酸残基序列的起点或末端的破折号表示与一个或多个氨基酸残基的另一序列的肽键或与羧基或羟基末端基团的共价键。然而，不存在破折号不应理解为不存在与羧基或羟基末端基团的这种肽键或共价键，因为在氨基酸序列的表示中省略这种破折号是常规的。
本文的“核酸”意指DNA或RNA，或含有脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的分子。核酸可以是天然存在的或通过合成制备，因此包括天然存在的多核苷酸的类似物，其中一个或多个核苷酸是在天然存在的核苷酸的基础上进行修饰。
术语“缀合的”和“连接”通常是指将近端地将一个分子与第二分子缔合的共价或非共价的化学键。
术语“分离的”旨在意指化合物与自然界中伴随它的所有或一些组分分离。“分离的”也指化合物在制造过程(例如，化学合成、重组表达、培养基等)中伴随它的所有或一些组分分离的状态。
术语“纯化的”旨在意指感兴趣的化合物已经在自然界或制造期间伴随它的组分分离并以富集形式提供。
在本文的化合物的上下文中使用的“有效的”或“效力”是指化合物表现出所需活性的能力和能耐。
在分子如肽片段的上下文中使用的术语“密度”是指在给定区域上测量和/或估算的分子数。例如，细胞表面上存在的抗原密度可以表示为每个细胞约10,000个拷贝，这意味着细胞表面上存在的分子的测量和/或估算数目为约10,000个。
在分子如肽片段的上下文中使用的术语“浓度”是指给定体积中存在的分子的量。在一些实施方案中，分子浓度以摩尔浓度给出，其中指示给定体积的溶液中存在的分子的摩尔数。
术语“抗原”和“表位”可互换地指分子(例如，多肽)的一部分，其被免疫系统的组分(例如，抗体)特异性地识别。如本文所用，术语“抗原”包括抗原表位，例如作为抗原表位的抗原片段。
术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体，其中抗体可以是任何一类感兴趣的抗体(例如，IgG、IgM及其亚类)，以及杂交体抗体、改变的抗体、F(ab′)2片段、F(ab)分子、Fv片段、噬菌体上展示的单链可变片段(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、双抗体、嵌合抗体、人源化抗体及其片段。在一些实施方案中，抗体片段可以是表现出亲本抗体分子的免疫结合特性的功能片段。本文所述的抗体可以被例如用放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白等可检测地标记。可用于体内成像的可检测标记是令人感兴趣的。所述抗体可以进一步与其他部分如细胞毒性分子或其他分子、特异性结合对的成员等缀合。
已知典型的抗体结构单元(特别是当其为全长形式时)包括四聚体。每种四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端限定了约100至110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。
“抗原结合位点”或“结合部分”是指参与抗原结合的抗体分子或其片段的部分。抗原结合位点由N末端可变重链(VH)和可变轻链(VL)的氨基酸残基形成。在重链和轻链的可变区内的三个高度发散的区段被称为“高变区”，其插入称为“框架区”或“FR”的更保守的侧翼区段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白中高变区之间和附近的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此布置以形成抗原结合“表面”。该表面介导靶抗原的识别和结合。每条重链和轻链的三个高变区称为“互补决定区”或“CDR”。CDR主要负责结合抗原的表位。
根据本公开文本的抗体及其片段包括双特异性抗体及其片段。双特异性抗体可以类似于单一抗体(或抗体片段)，但具有两个不同的抗原结合位点。双特异性抗体可以对于至少两种不同的表位具有结合特异性。双特异性抗体和片段也可以是异抗体的形式。异抗体是两种或更多种抗体或连接在一起的抗体结合片段(例如，Fab)，每种抗体或片段具有不同的特异性。
还提供了抗体缀合物。缀合物包括本公开文本的任何抗体和药剂。所述药剂可选自治疗剂、显像剂、标记剂或可用于治疗和/或标记目的的药剂。
抗体(或其片段)与特异性抗原(或表位)之间免疫结合相互作用的强度或亲和力可以用相互作用的解离常数(KD)表示，其中较小的KD表示较大的亲和力。可以使用本领域公知的方法定量选择的多肽的免疫结合特性。一种这样的方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力以及同样影响两个方向上的速率的几何参数。因此，“缔合速率常数”(kon)和“解离速率常数”(koff)二者均可以通过计算浓度和实际的缔合和解离速率来确定。koff/kon的比率使得能够消除与亲和力无关的所有参数，因此等于平衡解离常数KD(通常参见Davies等人Ann.Rev.Biochem.1990,59:439-15 473)。
在抗体特性的上下文中，术语“抗体的特异性结合”或“抗原特异性抗体”是指抗体优先结合存在于不同抗原的混合物中的特定抗原的能力。在某些实施方案中，特异性结合相互作用将区分样品中期望的抗原与不期望的抗原(或“靶”抗原和“非靶”抗原)，在一些实施方案中多于约10至100倍或更多倍(例如，多于约1000或10,000倍)。在某些实施方案中，当抗体与抗原在抗体-抗原复合物中特异性地结合时，它们之间的亲和力的特征在于KD(解离常数)小于10-6M、小于10-7M、小于10-8M、小于10-9M、小于10-9M、小于10-11M或小于约10-12M或更小。
术语“单克隆抗体”是指具有同质抗体群的抗体组合物。该术语包括完整抗体分子以及Fab分子、F(ab′)2片段、Fv片段、噬菌体上展示的单链可变片段(scFv)、具有抗体和非抗体蛋白的抗原结合部分的融合蛋白和其他表现出亲本单克隆抗体分子的免疫结合特性的分子。制备和筛选多克隆和单克隆抗体的方法是本领域已知的。
术语“衍生物”和“变体”是指但不限于任何化合物或抗体，所述化合物或抗体具有衍生自本公开文本的化合物和抗体的结构或序列，并且其结构/序列与本文公开的那些充分相似，并且基于该相似性本领域技术人员可以预期其表现出与要求保护的和/或提及的化合物或抗体相同或相似的活性和实用性，从而也可以互换地称为“功能等同物”。获得“衍生物”或“变体”的修饰包括例如通过添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基。功能等同物或功能等同物的片段可具有一个或多个保守氨基酸取代。术语“保守氨基酸取代”是指将氨基酸取代为具有与原始氨基酸相似特性的另一种氨基酸。保守氨基酸组如下：
组 氨基酸的名称
脂肪族 Gly,Ala,Val,Leu,Ile
羟基或含硫/硒 Ser,Cys,Thr,Met
环状 Pro
芳香族 Phe,Tyr,Trp
碱性 His，Lys，Arg
酸性氨基酸及其酰胺 Asp,Glu,Asn,Gln
可以在优选的预定肽或其片段的任何位置引入保守取代。然而，还可能需要引入非保守取代，特别是但不限于在任何一个或多个位置的非保守取代。导致形成肽的功能等同片段的非保守取代将例如在极性、电荷和/或空间体积方面显著不同，同时保持衍生物或变体片段的功能性。
“序列同一性百分比”通过在比较窗中比较两个最佳比对序列来确定，其中为了两个序列的最佳比对，与参考序列(其不具有添加或缺失)相比，多核苷酸或多肽序列在比较窗中的部分可以具有添加或缺失(即，空位)。百分比是通过以下方式来计算的：确定两个序列中出现一致核酸碱基或氨基酸残基的位置数，以得到匹配位置数；用匹配位置数除以比较窗中的位置总数，并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中的术语“相同”或“同一性”百分比是指当在比较窗口或如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和视觉检查测量的指定区域中为了最大一致进行比较和比对时，相同的或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在特定区域例如整个多肽序列或多肽的各个结构域上60％同一性，任选65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的两个或更多个序列或子序列。然后，此类序列被称为“基本上相同”。该定义还涉及测试序列的互补体。任选地，同一性存在于长度为至少约5至50个核苷酸或多肽序列的区域上，或更优选地存在于长度为100至500或1000个或更多个核苷酸或多肽序列的区域上。
对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，将测试序列与其相比较。在使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机(如果需要，指定子序列坐标)，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。随后序列比较算法基于程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所用的“比较窗口”包括对选自以下项的连续位置数目的任何一个的区段的提及：全长序列或20至600、约50至约200或约100至约150个氨基酸或核苷酸，其中可以在两个序列最佳比对后将序列与具有相同的连续位置数目的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。用于比较的最佳的序列比对可以通过以下方法进行，例如通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机实现(在Wisconsin Genetics软件包，Genetics Computer Group，575Science Dr.，麦迪逊，威斯康星州中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过手动比对和视觉检查(参见例如Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊))。
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述于Altschul等人(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410。用于进行BLAST分析的软件是可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
本文使用的“感兴趣的一个或多个细胞”或“一个或多个靶细胞”可互换地指其中期望调节一个或多个信号传导途径的一个细胞或多个细胞。在一些实施方案中，一个或多个靶细胞包括但不限于一个或多个癌细胞。在一些其他实施方案中，一个或多个靶细胞包括免疫效应细胞，如自然杀伤细胞、T细胞、树突细胞和巨噬细胞。
如本文所用的“癌细胞”是指表现出肿瘤细胞表型的细胞，其特征可以在于例如异常细胞生长、异常细胞增殖、密度依赖性生长抑制的丧失、锚定非依赖性生长潜力、在免疫受损的非人动物模型中促进肿瘤生长和/或发育的能力和/或细胞转化的任何适当的指示物。“癌细胞(Cancer cell)”在本文中可以与“肿瘤细胞”或“癌细胞(cancerous cell)”互换使用，并且包括实体瘤、半实体瘤、原发性肿瘤、转移性肿瘤等的癌细胞。
在疾病或病症的上下文中的“治疗”意指至少实现了与折磨个体的病症相关的症状的改善，其中改善用于广义以指至少减小与正在治疗的病症(例如,癌症)相关的参数例如症状的量级。因此，治疗还包括这样的情况，其中病理状况或至少与其相关的症状被完全抑制，例如预防发生或停止(例如终止)，使得宿主不再患有病症，或至少不再患有具有病症特征的症状。因此，治疗包括：(i)预防，即降低临床症状发展的风险，包括使临床症状不发展，例如预防疾病进展为有害状态；(ii)抑制，即阻止临床症状的发展或进一步发展，例如减轻或完全抑制活动性疾病，例如以便减少肿瘤负荷，这种减少可以包括消除可检测的癌细胞，或以便保护使免受细菌感染引起的疾病，这种保护可以包括消除可检测的细菌细胞；和/或(iii)缓解，即导致临床症状消退。
本文提供的组合物的术语“有效量”旨在意指用于提供所需的实用性的非致死但足够的量的组合物。例如，为了在感兴趣的一个或多个细胞(“靶细胞”)中引发有利的反应，如调节信号传导途径，(活性的、有效的，有效力的或功能性的)抗体的有效量是这样的量，其导致与不使用抗体或使用对照(无活性的、无效的或非功能性的)抗体时相比，信号传导途径的活性水平显著且大量变化，包括信号传导途径的下调和上调。可以通过本领域已知的各种方法测量信号传导途径的活性水平的变化。在另一个例子中，为了在受试者中引发对治疗疾病(例如，癌症)的有利反应，有效量是这样的量，其减轻、消除或消减与障碍相关的症状，例如以便提供对于癌症转移的控制以消除癌细胞和/或类似物。如本领域普通技术人员所理解的，取决于受试者的物种、年龄和总体状况、所治疗的病症或疾病的严重程度、使用的特定组合物、其给予模式等，所需的确切量将因受试者而异。因此，不可能指定确切的“有效量”。然而，本领域普通技术人员可以仅使用常规实验确定合适的有效量。
如本文所用的术语“药学上可接受的赋形剂”是指提供用于向受试者给予一种或多种化合物的药学上可接受的化合物的任何合适的物质。“药学上可接受的赋形剂”可以包括称为药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的添加剂和药学上可接受的载体的物质。
术语“个体”或“受试者”旨在包括人类、哺乳动物和其他动物。术语“个体”或“受试者”在本文中可互换使用，是指本公开文本中其抗体或抗体片段被使用的任何哺乳动物受试者。
如本文所用，术语“细胞信号传导途径”、“信号传导途径”、“细胞信号传导”和“信号转导”可互换地指通过沿信号传导途径募集蛋白质复合物以化学修饰的形式传递分子信号，这最终会触发细胞中的生化事件。当细胞外信号传导分子激活位于细胞表面或细胞内的特异性受体时，发生信号转导。反过来，这种受体触发细胞内的生化事件链-称为信号传导级联，其最终引发反应。根据细胞，反应会改变细胞的新陈代谢、形状、基因表达或分裂能力。所述信号可以在任何步骤放大；因此，一个信号传导分子可以产生涉及数百至数百万个分子的反应。本公开文本中有关的信号传导途径的一些例子包括但不限于AKT途径，c-MET途径，NF-kB途径，Notch信号传导途径，p53途径，Ras-Raf-MEK-ERK途径，STAT信号传导途径，Wnt信号传导途径，YAP/Wnt信号传导途径，包括但不限于表皮生长因子受体(EGFR)家族、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族、胰岛素样生长因子受体(IGFR)家族、血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族和血小板源性生长因子受体(PDGFR)家族的受体酪氨酸激酶(RTK)信号传导途径家族，NK(自然杀伤)激活途径，NK抑制途径，巨噬细胞调节途径，树突细胞信号传导途径，T细胞调节途径和检查点抑制途径。
如本文所用，术语信号传导途径的“调节”(即细胞信号传导途径或信号转导)意指抗体、其抗原结合片段或重组蛋白能够上调(增强、刺激、促进、激活或增加)或下调(压制、抑制、降低、减少或消减)感兴趣的一个细胞或多个细胞(即“一个或多个靶细胞”)中信号传导途径的活性。在一些实施方案中，使用双特异性抗体调节信号传导途径包括与无抗体或使用单特异性抗体相比信号传导途径活性变化至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或99.9％。在一些实施方案中，信号传导途径的上调包括开启或启动关闭的或基本上无活性的途径。在一些实施方案中，靶信号传导途径的下调可以包括关闭或基本上阻断开启的或基本上活性的途径。
某些实施方案的特征在于双特异性抗体、其抗原结合片段或重组蛋白，它们能够调节感兴趣的细胞中的一种或多种信号传导途径的活性。一种或多种信号传导途径的调节可以导致一个或多个靶细胞的行为的某些变化，如刺激或减少细胞增殖、细胞生长、细胞分化、细胞存活、细胞分泌、粘附的调节和/或细胞的运动性。
缩写
LRP6-低密度脂蛋白受体相关蛋白6
RSPO1-R-脊椎蛋白1
GSK-糖原合酶激酶
FZD-卷曲蛋白
TCF/LEF-T细胞因子/淋巴增强因子
STF-SuperTopFlash
BiTE-双特异性T细胞衔接器
TaFv-串联scFv
ICAM-1-细胞间细胞粘附分子-1
Wnt-无翅型MMTV整合位点家族
ALCAM-激活的白细胞粘附分子
EphA2-肝配蛋白A型受体2
EC50-半数最大有效浓度
IC50-半数最大抑制浓度
ErbB3-表皮生长因子受体3
IGF-1R-胰岛素样生长因子1受体
VEGF-A-血管内皮生长因子A
MESF-等效可溶性荧光染料的分子
ABC-抗体结合能力
工程化抗体
本文提供的公开文本涉及对两种单独抗原即第一抗原(“指导物抗原”)和第二抗原(“效应子抗原”)具有特异性的工程化抗体(例如，双特异性抗体)。在一些情况下，工程化抗体利用指导物/效应子双特异性系统，其可以选择性地增强表达指导物抗原的一个或多个靶细胞中的信号途径调节。依赖于指导物/效应子系统的增强效力对于双特异性抗体是显著的。在其他情况下，工程化抗体利用指导物/效应子双特异性系统来增强工程化抗体对靶细胞的亲和力、增强抗体的效力和/或增强抗体的特异性。
在一些实施方案中，本文所述的工程化抗体具有第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区与在细胞表面上表达的指导物抗原结合且所述第二抗原结合区与在相同细胞表面上表达的效应子抗原结合，并且其中所述指导物抗原的特征在于密度比所述效应子抗原的密度高至少四倍。在其他实施方案中，本文所述的工程化抗体具有第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区与在细胞表面上表达的指导物抗原结合且所述第二抗原结合区与在相同细胞表面上表达的效应子抗原结合，并且其中所述指导物抗原的特征在于在细胞表面上至少15,000个拷贝的表达。在一些情况下，所述指导物抗原的特征在于密度比效应子抗原的密度高至少五倍。在一些情况下，所述指导物抗原的特征在于密度比效应子抗原的密度高至少十倍。在一些情况下，所述指导物抗原的特征在于在细胞表面上至少15,000个拷贝的表达。在一些情况下，所述指导物抗原的特征在于在细胞表面上至少20,000个拷贝的表达。
在一些情况下，本文所述的工程化抗体调节表达指导物抗原的靶细胞中的信号传导途径。在一些情况下，工程化抗体通过与参与信号传导途径的靶细胞上存在的效应子抗原相互作用来直接调节信号传导途径。在其他情况下，工程化抗体通过与效应子抗原相互作用间接地调节信号传导途径，然后该效应子抗原触发信号传导事件。例如，工程化抗体可以与肿瘤细胞表面抗原如CD38相互作用，然后CD38可以与自然杀伤(NK)细胞结合并在NK细胞中启动后续的信号传导事件以启动抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些情况下，工程化抗体上调表达指导物抗原的靶细胞中的信号传导途径。在其他情况下，工程化抗体下调表达指导物抗原的靶细胞中的信号传导途径。
上调信号传导途径-激动剂
在一些方面，工程化抗体充当激动剂并激活感兴趣的信号传导途径(或靶信号传导途径)。在某些实施方案中，充当靶信号传导途径的激动剂的工程化抗体与使用对第一和第二抗原的任一种具有特异性的抗体相比，使靶信号传导途径的活性上调(例如，刺激、增强、促进或增加)至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000倍或更多倍或中间的任何倍数值。在一些实施方案中，靶信号传导的活性经由响应于信号传导途径的激活的报告测定来测量。例如，当涉及Wnt信号传导途径时，可以如本领域所述使用Wnt响应报告，例如Top Flash(TF)或Super Top Flash(STF)测定。参见例如Chen Zhao,“Wnt Reporter Activity Assay”,Bio-protocol,第4卷,第14期,第4页(2014年7月20日)
信号传导途径的下调-拮抗剂
在另一个例子中，工程化抗体可以充当拮抗剂并下调(例如，压制、减少、抑制、消减或降低)感兴趣的信号传导途径(“靶信号传导途径”)。在某些实施方案中，充当靶信号传导途径的拮抗剂的工程化抗体与使用对第一和第二抗原的任一种具有特异性的抗体相比，使靶信号传导途径的活性降低至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000倍或更多倍或中间的任何倍数值。在一些实施方案中，经由测量IC50值来确定靶信号传导途径的下调。半数最大抑制浓度(IC50)是在抑制特定的生物功能或生化功能中物质的有效性的量度。此定量量度指示需要多少特定物质(抑制剂，如工程化抗体)来一半地抑制给定的生物过程如信号转导。该值通常表示为摩尔浓度。在某些实施方案中，在下调量化的靶信号传导途径中测量的工程化抗体的IC50值与对第一和第二抗原的任一种具有特异性的抗体的IC50值相比，可以降低至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000倍或更多倍或中间的任何倍数值。可替代地或与IC50的测量组合地，在Wnt信号传导中响应于信号传导途径的抑制的报告测定，例如Top Flash(TF)或Super Top Flash(STF)测定可用于确定信号传导途径的下调及其水平。
示例性信号传导途径
本文公开的工程化抗体可以是调节信号传导途径的抗体。可以用本文描述的工程化抗体调节各种靶信号传导途径。在一些实施方案中，靶信号传导途径包括这样的细胞过程，其可涉及通过沿信号传导途径募集蛋白质复合物以化学修饰的形式传递分子信号，这最终会触发细胞中的生化事件。示例性信号传导途径包括但不限于AKT途径，c-MET途径，NF-kB途径，Notch信号传导途径，p53途径，Ras-Raf-MEK-ERK途径，STAT信号传导途径，Wnt信号传导途径，YAP/Wnt信号传导途径，包括但不限于表皮生长因子受体(EGFR)家族、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族、胰岛素样生长因子受体(IGFR)家族、血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族和血小板源性生长因子受体(PDGFR)家族的受体酪氨酸激酶(RTK)信号传导途径家族，NK(自然杀伤)激活途径，NK抑制途径，巨噬细胞调节途径，树突细胞信号传导途径，T细胞调节途径和检查点抑制途径。
抗原
工程化抗体如双特异性抗体可以对两种单独的抗原具有特异性。双特异性抗体可以包括至少两种组分即第一组分和第二组分，每种组分分别与其各自的抗原(或表位)即第一抗原(“效应子抗原”)和第二抗原(“指导物抗原”)结合。第一组分可以包括第一抗原的结合位点(即抗原结合位点)，并且第二组分可以包括第二抗原的第二结合位点。
在一些实施方案中，本文所述工程化抗体调节信号传导途径，所述信号传导途径具有AKT途径，c-MET途径，NF-kB途径，Notch信号传导途径，p53途径，Ras-Raf-MEK-ERK途径，STAT信号传导途径，Wnt信号传导途径，YAP/Wnt信号传导途径，包括但不限于表皮生长因子受体(EGFR)家族、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族、胰岛素样生长因子受体(IGFR)家族、血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族和血小板源性生长因子受体(PDGFR)家族的受体酪氨酸激酶(RTK)信号传导途径家族，NK(自然杀伤)激活途径，NK抑制途径，巨噬细胞调节途径，树突细胞信号传导途径，T细胞调节途径和检查点抑制途径。在一些情况下，本文所述的工程化抗体调节AKT途径。在一些情况下，本文所述的工程化抗体调节c-MET途径。在一些情况下，本文所述的工程化抗体调节NF-KB途径。在一些情况下，本文所述的工程化抗体调节p53途径。在一些情况下，本文所述的工程化抗体调节Ras-Raf-MEK-ERK途径。在一些情况下，本文所述的工程化抗体调节Wnt信号传导途径。在一些情况下，本文所述的工程化抗体调节YAP/Wnt信号传导途径。在一些情况下，本文所述的工程化抗体调节受体酪氨酸激酶(RTK)信号传导途径家族，其包括但不限于表皮生长因子受体(EGFR)家族、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族、胰岛素样生长因子受体(IGFR)家族、血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族和血小板源性生长因子受体(PDGFR)家族。在一些情况下，本文所述的工程化抗体调节NK激活途径。在一些情况下，本文所述的工程化抗体调节NK抑制途径。在一些情况下，本文所述的工程化抗体调节巨噬细胞调节途径。在一些情况下，本文所述的工程化抗体调节树突细胞调节途径。在一些情况下，本文所述的工程化抗体调节T细胞调节途径和检查点抑制途径。
效应子抗原
在一些实施方案中，由本文所述的工程化抗体识别的效应子抗原是在感兴趣的细胞表面上表达的分子。在一些实施方案中，由本文所述的工程化抗体识别的效应子抗原是与感兴趣的信号传导途径(例如，靶信号传导途径)相关的分子。在一些情况下，效应子抗原包括肿瘤抗原(例如，肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原)。在一些情况下，效应子抗原包括细胞表面抗原，其中其密度(或在细胞表面上的表达)比同一细胞上的指导物抗原的密度低至少4倍、5倍、10倍。在一些情况下，效应子抗原包括细胞表面抗原，其在细胞表面上具有少于50,000、40,000、30,000、20,000、10,000、5,000或更低的拷贝。
在一些实施方案中，效应子抗原具有靶信号传导途径的受体和/或共受体。例如，当靶信号传导是Wnt信号传导时，效应子抗原可以是LRP6、R-脊椎蛋白、ROR1、ROR2、或卷曲蛋白受体家族的任何成员。在另一个例子中，当靶信号传导是YAP/Wnt信号传导时，效应子抗原可以是ROR1、ROR2、Erb3或IGFR1R、EGFR、TRAIL受体、PDL1、PDL2、CD38或CD47。在再另一个例子中，当靶途径是NK细胞激活或抑制途径时，效应子抗原可以是CD16、CD38、NKG2D、NKG2A、NKp46或杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)。在靶信号传导途径是检查点抑制途径(其可以在T细胞中有活性)的另一个例子中，效应子抗原可以是PD1、CTLA4或Tim3。
在另一个例子中，当靶信号传导是YAP/Wnt信号传导时，效应子抗原可以是ROR1、ROR2和卷曲蛋白家族成员。在再另一个例子中，当靶途径调节细胞生长时，效应子抗原可以是Erb3、胰岛素样生长因子受体家族成员(例如，IGF1R)和EGFR。在再另一个例子中，当靶途径调节细胞死亡时，效应子抗原可以是TRAIL受体。在再另一个例子中，当靶途径是检查点抑制(在肿瘤细胞表面开始)时，效应子抗原可以是PD-L1和/或PD-L2。在再另一个例子中，当靶途径是先天免疫调节(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP))时，效应子抗原可以是CD38或CD47。
指导物抗原
在一些实施方案中，由工程化抗体识别的指导物抗原是用作细胞类型相关抗原的分子。细胞类型相关抗原通常是指这样的分子，其中与一个或多个非靶细胞相比，在某种类型的一个或多个感兴趣的细胞(“一个或多个靶细胞”)中表达水平显著更高。在一些情况下，指导物抗原可以是在靶细胞上过表达的任何细胞表面抗原。例如，存在在癌细胞中过表达的分子，如细胞间粘附分子1(ICAM-1)、肝配蛋白A型受体2(EphA2)和激活的白细胞。在一些情况下，指导物抗原是细胞粘附分子(ALCAM)并且这些分子可被认为是癌症或肿瘤相关抗原。癌症或肿瘤相关指导物抗原的一些其他例子包括CD30、CD33、PSMA、间皮素、CD44、CD73、CD38、Muc1和Muc16。在另一个例子中，当靶细胞是NK细胞时，指导物抗原是细胞表面抗原，其中其密度(或在细胞表面上的表达)比同一细胞上的效应子抗原的密度高至少4倍、5倍、10倍。
在一些实施方案中，指导物抗原是肿瘤抗原，其相对于非肿瘤细胞在肿瘤细胞表面上过表达。在一些实施方案中，指导物抗原是相对于非肿瘤细胞在肿瘤细胞表面上过表达的肿瘤相关抗原。在其他实施方案中，指导物抗原是相对于非肿瘤细胞在肿瘤细胞中过表达的肿瘤特异性抗原。
在一些实施方案中，在癌细胞中过表达的示例性指导物抗原包括细胞间粘附分子1(ICAM-1)、肝配蛋白A型受体2(EphA2)、肝配蛋白A型受体3(EphA3)、肝配蛋白A型受体4(EphA4)或激活的白细胞粘附分子(ALCAM)。在其他例子中，示例性指导物抗原(例如癌症或肿瘤相关指导物抗原)包括CD30、CD33、PSMA、间皮素、CD44、CD73、CD38、粘蛋白1细胞表面相关(MUC1)、粘蛋白2寡聚体粘液凝胶形成(MUC2)和MUC16(CA-125)。在一些实施方案中，指导物抗原具有CD30、CD33、癌胚抗原(CEA)、间皮素、组织蛋白酶G、CD44、CD73、CD38、Muc1、Muc2、Muc16、优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)、CD52、EpCAM、CEA、gpA33、粘蛋白、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、碳酸酐酶IX、PSMA、叶酸结合蛋白、神经节苷脂、路易斯-Y、未成熟层粘连蛋白受体、BING-4、钙激活氯通道2(CaCC)、gp100、滑膜肉瘤X断点2(SSX-2)或SAP-1。在一些实施方案中，指导物抗原具有CD30、CD33、癌胚抗原(CEA)、间皮素、组织蛋白酶G、CD44、CD73、CD38、Muc1、Muc16、优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)、CD52、EpCAM、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、碳酸酐酶IX、PSMA、叶酸结合蛋白、神经节苷脂或路易斯-Y。在一些情况下，指导物抗原是ICAM-1。在一些情况下，指导物抗原是EphA2。在一些情况下，指导物抗原是ALCAM。
在一些实施方案中，通过特异性地识别和结合细胞类型相关的指导物抗原，可以将工程化抗体募集至与指导物抗原相关的靶细胞，从而导致例如靶细胞中信号传导途径的调节。
在一些实施方案中，本公开文本的工程化抗体的指导物抗原不仅用作细胞类型选择剂，而且还用作效力增强剂，导致例如靶信号传导途径的有效和选择性抑制。在某些实施方案中，靶细胞表面上的指导物抗原的表达存在阈值水平，这导致(1)工程化抗体与靶细胞的结合亲和力的增强和(2)工程化抗体对效应子抗原的占用率的提高。
效应子/指导物系统
在一些实施方案中，本文所述的工程化抗体利用效应子/指导物系统来增强抗体与效应子抗原的结合。在其他实施方案中，本文所述的工程化抗体利用效应子/指导物系统来协同加强抗体与效应子抗原的结合。在一些情况下，第一抗原结合区与靶细胞表面上的指导物抗原的结合增强第二抗原结合区与存在于同一靶细胞表面上的效应子抗原的结合。在其他情况下，第一抗原结合区与靶细胞表面上的指导物抗原的结合协同加强第二抗原结合区与存在于同一靶细胞表面上的效应子抗原的结合。
在一些实施方案中，本公开文本的工程化抗体不应被认为仅仅是两种单特异性抗体的组合，其中每种单特异性抗体分别对指导物抗原和效应子抗原具有特异性。如上文和本文其他地方所公开的，在一些情况下，在两个抗原结合区之间观察到协同作用，例如，第一抗原结合区与指导物抗原的结合增强第二抗原结合区与效应子抗原的结合，并且在单特异性抗体情况下未观察到这种协同作用。在另外的例子中，与单特异性抗体的占用率相比，双特异性抗体对效应子抗原的占用率增加。当需要这种调节时，双特异性抗体的结合亲和力的这些非线性和显著增强以及其在调节靶信号传导途径中的有效性提供了优异且出乎意料的优点。
例如，在一些情况下，相对于在不存在第一抗原结合区的情况下第二抗原结合区与效应子抗原的结合，第二抗原结合区与效应子抗原的结合增强了约10倍、约50倍、约100倍、约200倍、约300倍、约400倍、约500倍、约1000倍或更多倍。在一些实施方案中，将结合测量为结合亲和力。在一些情况下，通过第二抗原结合区与效应子抗原的相互作用，工程化抗体的结合亲和力相对于单特异性的抗体增强了约10倍、约50倍、约100倍、约200倍、约300倍、约400倍、约500倍、约1000倍或更多倍。在一些情况下，将结合进一步测量为IC50值。在一些情况下，通过第二抗原结合区与效应子抗原的相互作用，工程化抗体的IC50值相对于单特异性的抗体降低了约10倍、约50倍、约100倍、约200倍、约300倍、约400倍、约500倍、约1000倍或更多倍。
在一些实施方案中，能够对本公开文本的双特异性抗体表现出协同活性的靶细胞表面上的指导物抗原表达的阈值水平可以根据靶信号传导的性质以及靶细胞的性质和细胞及其周围环境而变化。可以根据本文提供的公开文本以及本领域可获得的知识来确定每种情况下指导物的合适阈值水平。因此，虽然未在此明确指出指导物的任何表达水平，但其仍应被认为在本公开文本的范围内，只要这样的阈值能够提供在调节靶信号传导途径中双特异性抗体活性相对于单特异性抗体活性的增加(例如，至少10倍或更多倍)即可。靶细胞表面上指导物抗原的表达水平阈值的一些例子的范围为约100、500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、5,500、6,000、6,500、7,000、7,500、8,000、8,500、9,000、9,500、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、25,000、30,000、40,000、50,000、100,000、200,000或更多个拷贝/细胞或任何中间数目的拷贝/细胞。在一些实施方案中，靶细胞表面上的指导物抗原的表达水平阈值范围为约1,000至5,000个拷贝/细胞、5,000至10,000个拷贝/细胞、10,000至15,000个拷贝/细胞或15,000至20,000个拷贝/细胞。在一些实施方案中，靶细胞表面中指导物抗原的表达水平阈值为多于约10,000个拷贝/细胞。在一些实施方案中，靶细胞表面中指导物抗原的表达水平阈值为多于约15,000个拷贝/细胞。在一些实施方案中，靶细胞表面中指导物抗原的表达水平阈值为多于约20,000个拷贝/细胞。
在一些情况下，能够对本公开文本的工程化抗体表现出协同活性的靶细胞表面上的指导物与效应子抗原密度的比率根据靶信号传导的性质以及靶细胞的性质及其周围环境而变化。可以根据本文提供的公开文本以及本领域可获得的知识来确定每种情况下合适的指导物与效应子密度比率。因此，虽然未在此明确指出指导物与效应子抗原密度之间的比率，但其仍应被认为在本公开文本的范围内，只要这样的比率能够提供在调节靶信号传导途径中工程化双特异性抗体活性相对于单特异性抗体活性的增加(例如，至少10倍或更多倍)。靶细胞表面上指导物与效应子密度之间的比率的一些例子的范围为约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1或更大。在一些实施方案中，指导物的密度显著高于效应子的密度，使得靶细胞表面上的指导物与效应子密度之间的比率范围为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1或更大，并且在某些特定实施方案中，比例范围为约5:1至10:1。在指导物的密度显著高于效应子的密度的一些其他实施方案中，靶细胞表面上的指导物与效应子密度之间的比率范围大于10:1。
在一些实施方案中，指导物抗原密度影响工程化抗体的效应子抗原的占用率。例如，当指导物与效应子抗原密度的比率达到能够表现出与单特异性抗体相比工程化抗体的效力增加的合适范围时，工程化抗体对效应子抗原的占用率水平可能提高。这种提高可以例如经由占用例如靶细胞表面上50％或85％的效应子抗原所需的抗体浓度的差异来证明。在一些例子中，能够实现约50％或约85％的效应子抗原占用率的工程化抗体的浓度与显示相同或相似占用率的单特异性抗体的浓度相比可以降低至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000倍或更多倍或任何中间的倍数值。在某些例子中，能够实现约50％或约85％的效应子抗原占用率的工程化抗体的浓度可以是在约1pM至1000pM、约1nM至100nM、约100nM至约1000nM之间的任何值或高于约1000nM的浓度。
在某些方面，本公开文本的工程化抗体以10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M或更小(越低意味着越高的结合亲和力)的亲和力(Kd)与其特异性效应子抗原结合。在某些方面，本公开文本的工程化抗体与其特异性指导物抗原结合，以10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M或更小(越低意味着越高的结合亲和力)的亲和力(Kd)与其特异性指导物抗原结合。
如本文其他地方所述，根据本公开文本的效应子/指导物系统不限于某种类型的细胞中的某种信号传导途径，而是可以适用于任何类型的细胞中的任何信号传导途径。在一些实施方案中，效应子/指导物系统应用于这样的环境，其中满足某些条件，例如指导物与效应子密度比率以及指导物表达水平阈值达到本公开文本别处所述的某个所需水平，不管抗原的分子识别或靶细胞类型如何，工程化抗体可以在调节靶信号传导途径中表现出效力。因此，工程化抗体及其根据本公开文本的用途不受某些信号传导途径和/或细胞类型的限制，但应被认为通常适用于任何信号传导途径和任何类型的细胞。
抗体形式
在一些实施方案中，本文所述的工程化抗体具有人源化抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、Fab、Fab’、F(ab’)2、F(ab’)3、scFv、sc(Fv)2、dsFv、双抗体、迷你抗体和纳米抗体或其结合片段。在一些情况下，本文所述的工程化抗体具有全长免疫球蛋白。在一些情况下，本文所述的工程化抗体具有Fab、Fab’、F(ab’)2、F(ab’)3、scFv、sc(Fv)2、dsFv和双抗体或其结合片段。
在一些实施方案中，本文所述的工程化抗体是双特异性IgG(BsIgG)、附加有另外的抗原结合部分的IgG、双特异性抗体(BsAb)片段、双特异性融合蛋白或BsAb缀合物。在一些实施方案中，本文所述的工程化抗体是BsIgG。在一些实施方案中，BsIgG通过在单个宿主细胞中共表达两条轻链和两条重链来产生。在一些实施方案中，BsIgG通过在第一宿主细胞中表达第一轻链和第一重链以及在第二宿主细胞中表达第二轻链和第二重链来产生，其中将表达的第一轻链/第一重链和表达的第二轻链/第二重链纯化并在体外组装成BsIgG。在一些实施方案中，本文所述的工程化抗体是附加有另外的抗原结合部分的IgG。在一些实施方案中，另外的抗原结合部分是单结构域抗体(例如，未配对的可变轻链(VL)或可变重链(VH))、配对的抗体可变结构域(例如Fv或scFv)或工程化蛋白支架。在一些实施方案中，附加有另外的抗原结合部分的IgG是双重可变结构域IgG(DVD-Ig)。在一些实施方案中，本文所述的工程化抗体是BsAb片段。在一些实施方案中，BsAb片段具有重链、轻链和短肽接头序列。在一些实施方案中，BsAb片段是scFv、串联scFv、双抗体、四价串联双抗体(TandAb)、双特异性T细胞结合(BiTE)、单结构域抗体片段(dAb)或纳米抗体。在一些实施方案中，BsAb片段不具有Fc区。在一些实施方案中，本文所述的工程化抗体是双特异性融合蛋白。在一些实施方案中，对接锁定(Dock-and-Lock)方法(DNL)用于产生双特异性抗体。在一些实施方案中，本文所述的工程化抗体BsAb与人血清白蛋白或白蛋白结合蛋白融合。在一些实施方案中，本文所述的工程化抗体是BsAb缀合物。
在一些实施方案中，本文所述的工程化抗体具有在Spiess等人MolecularImmunology 67(2015)95-106中所公开的双特异性抗体。
在一些实施方案中，本文所述的工程化抗体具有图表1中所示的双特异性抗体。
图表1.
BslgG 150kDa
附加的IgG＞150kDa
BsAb片段
双特异性融合蛋白
BsAb缀合物
示例性工程化抗体
在一个方面，作为非限制性例子，本公开文本提供靶向Wnt信号传导途径的抗体。在一些实施方案中，靶向Wnt信号传导途径的抗体对癌细胞具有细胞类型特异性或选择性。抗体的这种双特异性通过具有两种组分即第一组分和第二组分来实现，所述每种组分特异性地识别并结合它们各自的抗原。第一抗原(“效应子”抗原)与Wnt信号传导途径相关，并且第二抗原(“指导物”抗原)与癌细胞相关。
在某些实施方案中，靶向Wnt信号传导途径的双特异性抗体的效应子抗原是Wnt受体或共受体中的任何一种。在一些实施方案中，这种效应子抗原是LRP6、Wnt受体LRP6或其一个或多个片段。在一些实施方案中，结合LRP6或其一个或多个片段的双特异性抗体也可以结合癌症或肿瘤相关的指导物抗原，因而是指抗LRP6/抗癌症(或肿瘤)相关的指导物抗原。此类癌症或肿瘤相关指导物抗原的一些例子包括在癌细胞中过表达的细胞间粘附分子1(ICAM-1)、肝配蛋白A型受体2(EphA2)和激活的白细胞粘附分子(ALCAM)及其片段。因此，在某些实施方案中，本文提出的双特异性抗体包括抗LRP6/抗ICAM-1抗体、抗LRP6/抗EphA2抗体和抗LRP6/抗ALCAM抗体。
在一个方面，作为非限制性例子，本公开文本的抗LRP6抗体(包括单特异性和双特异性抗体)结合LRP6的E1和/或E2区。在某些实施方案中，对LRP6的E1和/或E2区具有特异性的抗LRP6抗体，即“抗LRP6E1E2抗体”可以包括选自表3中鉴定的那些CDR序列的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。
在一个方面，抗LRP6E1E2抗体可以具有重链可变结构域(VH)序列，其与表3中鉴定的任何一个VH序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，相对于参考序列，具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列具有取代(例如，如下所公开的保守取代)、插入或缺失，但具有该序列的抗LRP6抗体保留与LRP6E1和/或E2区结合的能力。在某些实施方案中，在与表3中鉴定的任何一个VH序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列中，总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即FR中)。
在一个方面，抗LRP6E1E2抗体可以包括这样的轻链可变结构域(VL)序列，其与表3中鉴定的任何一个VL序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，相对于参考序列，具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列含有取代(例如，如下文公开的保守取代)、插入或缺失，但具有该序列的抗LRP6抗体保留与LRP6E1和/或E2区结合的能力。在某些实施方案中，在与表3中鉴定的任何一个VL序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列中，总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即FR中)。
在一个方面，作为非限制性例子，本公开文本的抗LRP6抗体(包括单特异性和双特异性抗体)与LRP6的E3和/或E4区结合。在某些实施方案中，对LRP6的E3和/或E4区具有特异性的抗LRP6抗体，即“抗LRP6E3E4抗体”可以包括选自表4中鉴定的那些CDR序列的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。
在一个方面，抗LRP6E3E4抗体可以包括与表4中鉴定的任何一个VH序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参考序列，具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列具有取代(例如，如下所公开的保守取代)、插入或缺失，但具有该序列的抗LRP6抗体保留与LRP6E3和/或E4区结合的能力。在某些实施方案中，在与表4中鉴定的任何一个VH序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列中，总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即FR中)。
在一个方面，抗LRP6E3E4抗体可以包括与表4中鉴定的任何一个VL序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列。在某些实施方案中，相对于参考序列，具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列含有取代(例如，如下文公开的保守取代)、插入或缺失，但具有该序列的抗LRP6抗体保留与LRP6E3和/或E4区结合的能力。在某些实施方案中，在与表4中鉴定的任何一个VL序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列中，总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即FR中)。
在一个方面，作为非限制性例子，抗LRP6抗体(例如抗LRP6E1F2抗体和抗LRP6E3E4抗体)可以具有如上文提供的任何实施方案中的VH和如上文提供的任何实施方案中的VL。
在某些实施方案中，本公开文本的抗体(包括单特异性和双特异性抗体)对某种类型的细胞如癌细胞具有特异性或选择性。在此类实施方案中，抗体特异性地结合与癌症或肿瘤相关的抗原(“指导物”抗原)，从而结合与癌症或肿瘤相关的指导物抗原。
在一些实施方案中，作为非限制性例子公开的癌症或肿瘤相关指导物抗原是细胞间粘附分子1(ICAM-1)或其片段。因此，此类实施方案中的抗体是抗ICAM-1。在某些实施方案中，抗ICAM-1抗体可以包括选自表5中鉴定的针对M10A12的CDR序列的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。
作为非限制性例子，本公开文本进一步提供了抗ICAM-1抗体，其可以包括与表5中鉴定的针对M10A12的VH序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参考序列，具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列具有取代(例如，如下所公开的保守取代)、插入或缺失，但具有该序列的抗ICAM-1抗体保留与ICAM-1或其片段结合的能力。在某些实施方案中，在与表5中鉴定的针对M10A12的VH序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列中，总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即FR中)。
作为非限制性例子，本公开文本还提供了抗ICAM-1，其可以包括与表5中鉴定的针对M10A12的VL序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列。在某些实施方案中，相对于参考序列，具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列具有取代(例如，如下所公开的保守取代)、插入或缺失，但具有该序列的抗ICAM-1抗体保留与ICAM-1或其片段结合的能力。在某些实施方案中，在与表5中鉴定的针对M10A12的VL序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列中，总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即FR中)。
作为非限制性例子，本公开文本还提供了抗ICAM-1抗体，其中所述抗体可以包括如上文提供的任何实施方案中的VH和如上文提供的任何实施方案中的VL。
在某些实施方案中，作为非限制性例子，抗ICAM-1抗体可以包括与ICAM-1或其片段特异性地结合的scFV片段。作为抗ICAM-1的scFV片段的一些例子包括在本领域中是已知的M10A12。参见美国专利申请号11/972,130，该专利申请公布为美国专利号7582736，其通过引用并入。本公开文本的抗ALCAM抗体可以具有这样的片段，其与表5中鉴定的M10A12的scFV片段具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在一些实施方案中，癌症或肿瘤相关的指导物抗原是肝配蛋白A型受体2(EphA2)或其片段。因此，作为非限制性例子公开的此类实施方案中的抗体是抗EphA2。在某些实施方案中，抗EphA2抗体可以包括选自表5中鉴定的针对RYR的CDR序列的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。
作为非限制性例子，本公开文本还提供了抗EphA2抗体，其可以包括与表5中鉴定的针对RYR的VH序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参考序列，具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列具有取代(例如，如下所公开的保守取代)、插入或缺失，但具有该序列的抗EphA2抗体保留与EphA2或其片段结合的能力。在某些实施方案中，在与表5中鉴定的针对RYR的VH序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列中，总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即FR中)。
作为非限制性例子，本公开文本还提供了抗EphA2，其可以包括与表5中鉴定的针对RYR的VL序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列。在某些实施方案中，相对于参考序列，具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列具有取代(例如，如下所公开的保守取代)、插入或缺失，但具有该序列的抗EphA2抗体保留与EphA2或其片段结合的能力。在某些实施方案中，在与表5中鉴定的针对RYR的VL序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列中，总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即FR中)。
作为非限制性例子，本公开文本还提供了抗EphA2抗体，其中所述抗体可以包括如上文提供的任何实施方案中的VH和如上文提供的任何实施方案中的VL。
在某些实施方案中，作为非限制性例子公开的抗EphA2抗体可以包括与EphA2或其片段特异性地结合的scFV片段。作为抗EphA2的scFV片段的一些例子包括本领域已知的RYR。参见美国临时申请号62/023,689和PCT公开号WO 201600774，其每一篇均通过引用并入。RYR在前述参考文献中被鉴定为HCA-F1。本公开文本的抗EphA2抗体可以具有这样的片段，其与表5中鉴定的RYR的scFV片段具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在一些实施方案中，作为非限制性例子公开的癌症或肿瘤相关的指导物抗原是激活的白细胞粘附分子(ALCAM)或其片段。因此，此类实施方案中的抗体是抗ALCAM。在某些实施方案中，抗ALCAM抗体可以包括选自表5中鉴定的针对H3(585II41)及其变体(例如585II41.1)以及PD32的CDR序列的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。
作为非限制性例子，本公开文本还提供了抗ALCAM抗体，其可以包括与表5中鉴定的针对H3(585II41)及其变体(例如585II41.1)以及PD32的任何VH序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参考序列，具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列具有取代(例如，如下所公开的保守取代)、插入或缺失，但具有该序列的抗ALCAM抗体保留与ALCAM或其片段结合的能力。在某些实施方案中，在与表5中鉴定的针对H3(585II41)及其变体(例如585II41.1)以及PD32的任何VH序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列中，总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域中(即FR中)。
作为非限制性例子，本公开文本还提供了抗ALCAM，其可以包括与表5中鉴定的针对H3(585II41)及其变体(例如585II41.1)以及PD32的任何VL序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列。在某些实施方案中，相对于参考序列，具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列具有取代(例如，如下所公开的保守取代)、插入或缺失，但具有该序列的抗ALCAM抗体保留与ALCAM或其片段结合的能力。在某些实施方案中，在与表5中鉴定的针对H3(585II41)及其变体(例如585II41.1)以及PD32的任何VL序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列中，总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即FR中)。
作为非限制性例子，本公开文本还提供了抗ALCAM抗体，其中所述抗体可以包括如上文提供的任何实施方案中的VH和如上文提供的任何实施方案中的VL。
在某些实施方案中，作为非限制性例子公开的抗ALCAM抗体可以包括与ALCAM或其片段特异性地结合的scFV片段。作为抗ICAM-1的scFV片段的一些例子包括H3(585II41)及其变体(例如585II41.1)以及本领域已知的PD32。参见例如Ruan等人Molecular&CellularProteomics 5.12:2364-2373(2006)；Liu等人,J.Mol Med.85:1113-1123(2007)；美国专利申请号14/486,943，其被公开为U.S.20150071937；以及美国专利申请号13/172,759，其被公布为美国专利号9145462，其中PD32被鉴定为GPD32，这些文献中的每一个均通过引用并入。本公开文本的抗ALCAM抗体可以具有这样的片段，其与表5中鉴定的H3、任何变体H3(例如585II41.1)或PD32的scFV片段具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
作为非限制性例子，本公开文本还提供了双特异性抗体，其结合LRP6(或其任何一个或多个片段)和癌症或肿瘤相关抗原(如ICAM-1、EphA2和ALCAM(或其片段))(即，抗LRP6/抗ICAM-1、EphA2或ALCAM双特异性抗体)。在一些实施方案中，取决于抗体识别的片段，抗LRP6可以进一步定义如上所述的抗LRP6E1E2或抗LRP6E3E4。因此，在某些实施方案中，术语“抗LRP6A”的范围包括“抗LRP6E1E2”和“抗LRP6E3E4”。双特异性抗体具有两种不同的组分，其中的每一种具有两种不同的结合特异性。例如而非通过限制的方式，本发明公开的主题提供了包含第一组分和第二组分的双特异性抗体，所述第一组分具有存在于LRP6或其片段上的第一抗原的结合位点(例如，抗原结合位点)，所述第二组分具有存在于ICAM-1、EphA2或ALCAM(或其片段)上的第二抗原的另一个结合位点。
作为非限制性例子，本公开文本还提供了双特异性抗体，其是抗LRP6/抗ICAM-1。
在一些实施方案中，作为非限制性例子公开的抗LRP6/抗ICAM-1双特异性抗体可以包含负责结合LRP6或其片段的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。对LRP6或其片段具特异性的所述至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR中的每一个可以选自上文在抗LRP6抗体的CDR的上下文中提供的任何实施方案。在一些实施方案中，除对LRP6或其片段具特异性的一个至六个CDR之外，抗LRP6/抗ICAM-1双特异性抗体还可以包含负责结合ICAM-1或其片段的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。对ICAM-1或其片段具特异性的所述至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR中的每一个可以选自上文在抗ICAM-1抗体的CDR的上下文中提供的任何实施方案。
作为非限制性例子，本公开文本还提供了抗LRP6/抗ICAM-1双特异性抗体，其可以包含负责结合LRP6或其片段的重链可变结构域(VH)序列。对LRP6或其片段具特异性的VH序列可以选自上文在抗LRP6抗体的VH序列的上下文中提供的任何实施方案。在一些实施方案中，除对LRP6或其片段具特异性的VH序列之外，抗LRP6/抗ICAM-1双特异性抗体还可以包含负责结合ICAM-1或其片段的VH序列。对ICAM-1或其片段具特异性的VH序列中的每一个可以选自上文在抗ICAM-1抗体的VH序列的上下文中提供的任何实施方案。
作为非限制性例子，本公开文本还提供了抗LRP6/抗ICAM-1双特异性抗体，其可以包含负责结合LRP6或其片段的轻链可变结构域(VL)序列。对LRP6或其片段具特异性的VL序列可以选自上文在抗LRP6抗体的VL序列的上下文中提供的任何实施方案。在一些实施方案中，除对LRP6或其片段具特异性的VL序列之外，抗LRP6/抗ICAM-1双特异性抗体还可以包含负责结合ICAM-1或其片段的VL序列。对ICAM-1或其片段具特异性的VL序列中的每一个可以选自上文在抗ICAM-1抗体的VL序列的上下文中提供的任何实施方案。
在一个方面，作为非限制性例子，双特异性抗体可以是抗LRP6/抗ICAM-1双特异性抗体，其中双特异性抗体可以包含如上文提供的任何实施方案中的VH和如上文提供的任何实施方案中的VL。
作为非限制性例子，本公开文本还提供了双特异性抗体，其是抗LRP6/抗EphA2。
在一些实施方案中，作为非限制性例子公开的抗LRP6/抗EphA2双特异性抗体可以包含负责结合LRP6或其片段的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。对LRP6或其片段具特异性的所述至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR中的每一个可以选自上文在抗LRP6抗体的CDR的上下文中提供的任何实施方案。在一些实施方案中，除对LRP6或其片段具特异性的一个至六个CDR之外，抗LRP6/抗EphA2双特异性抗体还可以包含负责结合EphA2或其片段的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。对EphA2或其片段具特异性的所述至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR中的每一个可以选自上文在抗EphA2抗体的CDR的上下文中提供的任何实施方案。
作为非限制性例子，本公开文本还提供了抗LRP6/抗EphA2双特异性抗体，其可以包含负责结合LRP6或其片段的重链可变结构域(VH)序列。对LRP6或其片段具特异性的VH序列可以选自上文在抗LRP6抗体的VH序列的上下文中提供的任何实施方案。在一些实施方案中，除对LRP6或其片段具特异性的VH序列之外，抗LRP6/抗EphA2双特异性抗体还可以包含负责结合EphA2或其片段的VH序列。对EphA2或其片段具特异性的VH序列中的每一个可以选自上文在抗EphA2抗体的VH序列的上下文中提供的任何实施方案。
作为非限制性例子，本公开文本还提供了抗LRP6/抗EphA2双特异性抗体，其可以包含负责结合LRP6或其片段的轻链可变结构域(VL)序列。对LRP6或其片段具特异性的VL序列可以选自上文在抗LRP6抗体的VL序列的上下文中提供的任何实施方案。在一些实施方案中，除对LRP6或其片段具特异性的VL序列之外，抗LRP6/抗EphA2双特异性抗体还可以包含负责结合EphA2或其片段的VL序列。对EphA2或其片段具特异性的VL序列中的每一个可以选自上文在抗EphA2抗体的VL序列的上下文中提供的任何实施方案。
作为非限制性例子，本公开文本还提供了抗LRP6/抗EphA2双特异性抗体，其中双特异性抗体可以包含如上文提供的任何实施方案中的VH和如上文提供的任何实施方案中的VL。
本披露还提供了双特异性抗体，其是抗LRP6/抗ALCAM。
在一些实施方案中，作为非限制性例子公开的抗LRP6/抗ALCAM双特异性抗体可以包含负责结合LRP6或其片段的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。对LRP6或其片段具特异性的所述至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR中的每一个可以选自上文在抗LRP6抗体的CDR的上下文中提供的任何实施方案。在一些实施方案中，除对LRP6或其片段具特异性的一个至六个CDR之外，抗LRP6/抗ALCAM双特异性抗体还可以包含负责结合ALCAM或其片段的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。对ALCAM或其片段具特异性的所述至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR中的每一个可以选自上文在抗ALCAM抗体的CDR的上下文中提供的任何实施方案。
作为非限制性例子，本公开文本还提供了抗LRP6/抗ALCAM双特异性抗体，其可以包含负责结合LRP6或其片段的重链可变结构域(VH)序列。对LRP6或其片段具特异性的VH序列可以选自上文在抗LRP6抗体的VH序列的上下文中提供的任何实施方案。在一些实施方案中，除对LRP6或其片段具特异性的VH序列之外，抗LRP6/抗ALCAM双特异性抗体还可以包含负责结合ALCAM或其片段的VH序列。对ALCAM或其片段具特异性的VH序列中的每一个可以选自上文在抗ALCAM抗体的VH序列的上下文中提供的任何实施方案。
作为非限制性例子，本公开文本还提供了抗LRP6/抗ALCAM双特异性抗体，其可以包含负责结合LRP6或其片段的轻链可变结构域(VL)序列。对LRP6或其片段具特异性的VL序列可以选自上文在抗LRP6抗体的VL序列的上下文中提供的任何实施方案。在一些实施方案中，除对LRP6或其片段具特异性的VL序列之外，抗LRP6/抗ALCAM双特异性抗体还可以包含负责结合ALCAM或其片段的VL序列。对ALCAM或其片段具特异性的VL序列中的每一个可以选自上文在抗ALCAM抗体的VL序列的上下文中提供的任何实施方案。
作为非限制性例子，本公开文本还提供了抗LRP6/抗ALCAM双特异性抗体，其中双特异性抗体可以包含如上文提供的任何实施方案中的VH和如上文提供的任何实施方案中的VL。
在某些方面，本公开文本的作为抗LRP6和抗癌症(或肿瘤)相关抗原的双特异性抗体(例如抗LRP6/抗ICAM-1、抗LRP6/抗EphA2和抗LRP6/抗ALCAM)以10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M或更低的亲和力(Kd)与LRP6或其片段结合(更低意味着结合亲和力更高)。在某些方面，本公开文本的作为抗LRP6和抗癌症(或肿瘤)相关抗原的双特异性抗体(例如抗LRP6/抗ICAM-1、抗LRP6/抗EphA2和抗LRP6/抗ALCAM)以10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M或更低的亲和力(Kd)与癌症(或肿瘤)相关抗原或其片段结合。
根据某些实施方案，与单特异性的抗体对仅一种抗原的结合亲和力相比，本公开文本的双特异性抗体(如抗LRP6/抗ICAM-1、抗LRP6/抗EphA2和抗LRP6/抗ALCAM抗体)以高至少2-50倍、10-100倍、2倍、5倍、10倍、25倍、50倍或100倍、或20％-50％、50％-100％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更高的亲和力与其效应子抗原(例如LRP6或其片段)和/或其指导物抗原(例如ICAM-1、EphA2、ALCAM或其片段)结合(例如，优先结合)。
设计指导物/效应子双特异性系统的方法
在某些实施方案中，本文公开了设计指导物/效应子双特异性系统的方法。在一些实施方案中，设计指导物/效应子双特异性系统包括：(1)确定指导物抗原与效应子抗原的密度比，(2)确定指导物抗原的密度阈值，以及(3)确定指导物抗原和效应子抗原是否在靶细胞上表达。
在一些实施方案中，本文公开的用于产生工程化抗体的方法包括(a)选择在细胞表面上表达多种指导物抗原和效应子抗原的细胞；(b)确定所述多种指导物抗原和效应子抗原的密度比；以及(c)如果指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少4:1，则制备具有与细胞上的指导物抗原结合的第一抗原结合区和与细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区的工程化抗体。
在一些实施方案中，产生工程化抗体的方法包括(a)选择在细胞表面上表达多种指导物抗原和效应子抗原的细胞；(b)确定在细胞表面上表达的指导物抗原的拷贝数；以及(c)如果细胞表达指导物抗原的至少15,000个拷贝，则制备具有与细胞上的指导物抗原结合的第一抗原结合区和与细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区的工程化抗体。
在一些实施方案中，产生工程化抗体包括确定靶细胞上指导物抗原与效应子抗原的密度比。在一些实施方案中，信号途径调节的效力可以随着指导物抗原的密度比效应子抗原的密度(密度比)的增加而增加。在一些实施方案中，指导物抗原的密度显著高于效应子抗原的密度，使得靶细胞表面上的指导物抗原与效应子抗原之间的密度比范围为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1或更大，并且在一些特定实施方案中，比率范围为约5:1至10:1。在一些实施方案中，靶细胞表面上的指导物抗原与效应子抗原之间的密度比为4:1。在一些实施方案中，靶细胞表面上的指导物抗原与效应子抗原之间的密度比为5:1。在一些实施方案中，靶细胞表面上的指导物抗原与效应子抗原之间的密度比为10:1。在指导物抗原的密度显著高于效应子抗原的密度的一些其他实施方案中，靶细胞表面上的指导物抗原与效应子抗原之间的密度比范围大于10:1。在一些例子中，当密度比大于10:1时，能以靶细胞特异性方式实现约一千倍的效力增强。
在一些实施方案中，产生工程化抗体包括确定指导物抗原的密度阈值。在一些情况下，细胞表面指导物抗原密度的某种(例如高)水平的阈值增强细胞类型选择性效力。在一些实施方案中，细胞表面指导物抗原密度的阈值范围为约100、500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、5,500、6,000、6,500、7,000、7,500、8,000、8,500、9,000、9,500、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、25,000、30,000、40,000、50,000、100,000、200,000个或更多个拷贝或任何中间拷贝数/细胞。在一些实施方案中，细胞表面指导物抗原密度的阈值范围为约1,000至5,000个拷贝/细胞、5,000至10,000个拷贝/细胞、10,000至15,000个拷贝/细胞或15,000至20,000个拷贝/细胞。在一些实施方案中，靶细胞表面中指导物抗原的表达水平阈值为多于约10,000个拷贝/细胞。在一些实施方案中，靶细胞表面中指导物抗原的表达水平阈值为多于约15,000个拷贝/细胞。在一些实施方案中，靶细胞表面中指导物抗原的表达水平阈值为多于约20,000个拷贝/细胞。指导物抗原密度的确切阈值可以根据信号传导途径的性质和/或靶细胞的性质而变化，并且可以根据本公开文本中提供的指导确定这个阈值。如在本公开文本的实施例中所示，当指导物抗原以高水平表达时(例如约100、500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、5,500、6,000、6,500、7,000、7,500、8,000、8,500、9,000、9,500、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、25,000、30,000、40,000、50,000、100,000、200,000个或更多个拷贝/细胞，特别是15,000至20,000个拷贝或更多个拷贝/细胞)，指导物在双特异性抗体中的作用是明显的。
在一些实施方案中，设计指导物/效应子双特异性系统包括确定指导物抗原和效应子抗原是否在靶细胞上表达。在一些实施方案中，靶细胞是T细胞或NK细胞。在其他情况下，靶细胞是癌细胞。
调节信号传导途径的方法
在一些实施方案中，本文所述的工程化抗体调节信号传导途径，包括其上调和下调。在一些实施方案中，工程化抗体可以充当激动剂并上调(增强、刺激、促进、激活或增加)感兴趣的信号传导途径，即靶途径。在某些实施方案中，双特异性抗体是与无抗体或单特异性抗体相比使靶途径的活性提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或99.9％的抗体。在一些其他实施方案中，靶信号传导途径的上调包括开启或启动关闭的或基本上无活性的途径。在另一个例子中，工程化抗体可以充当拮抗剂并下调(压制、抑制、减少、降低或消减)靶途径。在某些实施方案中，工程化抗体是与无抗体或单特异性抗体相比使靶途径的活性降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或99.9％的抗体。在一些实施方案中，靶信号传导途径的下调包括关闭或基本上阻断开启的或基本上有活性的途径。
本公开文本的工程化抗体对靶途径的特异性由抗体对其第一抗原或效应子抗原的结合亲和力决定。效应子抗原与靶途径相关，例如通过成为靶途径的信号传导级联的组分。在工程化抗体与其存在于靶细胞上的特异性效应子抗原结合后，靶途径的活性得到调节，即上调或下调。在一些实施方案中，靶信号传导途径与一种或多种细胞行为(如细胞生长、存活、增殖、分化、迁移、细胞外基质重塑、纤维化、转移、炎症和血管生成)相关。因此，本公开文本的工程化抗体的使用可以由于调节靶信号传导途径而导致以下中的至少一种或多种：
i)刺激或压制细胞生长，
ii)刺激或压制细胞存活，
iii)刺激或压制细胞增殖，
iv)刺激或压制细胞分化，
v)刺激或压制细胞迁移，
vi)刺激或压制细胞外基质重塑，
vii)刺激或压制器官纤维化的发展，
viii)刺激或压制组织纤维化的发展，
ix)刺激或压制转移的发展，
x)刺激或压制血管生成，
xi)刺激或压制炎症，和/或
xii)刺激或压制细胞分泌。
在一些实施方案中，本公开文本的工程化抗体以细胞选择性或细胞特异性方式调节靶信号传导途径。换言之，双特异性抗体对靶信号传导途径的调节仅在某种感兴趣的细胞(即靶细胞)上进行或高度优先地进行。本公开文本的双特异性抗体的这种细胞特异性或细胞选择性由抗体对其第二抗原或指导物抗原的结合亲和力决定。指导物抗原与特定细胞类型相关，例如癌症唤起(call)，通过在其上过表达。因此，与其中的指导物抗原的表达水平较低的非靶细胞相比，工程化抗体可以基本上富集到在其表面上过表达指导物抗原的靶细胞表面。
在一些实施方案中，工程化抗体不等同于单特异性抗体(一种对效应子抗原具特异性并且另一种对指导物抗原具特异性)的单纯混合物，但在抗体以细胞特异性或选择性方式调节靶信号传导的效力方面显示出协同改善。在一些实施方案中，根据本公开文本的指导物/效应子设计选择性地增强表达指导物抗原的靶细胞中的信号途径调节。在一些情况下，效力在效应子/指导物双特异性系统下得到增强，其在一些情况下比单特异性抗体强几百到一千倍。如在本文的非限制性实施例部分中所例示，使用在本公开文本中呈现的实施例中的三种不同的指导物抗原(ALCAM、ICAM-1和EphA2)和多种类型的效应子-配体相互作用(即，Wnt3a和Wnt1分别与LRP6E3E4和E1E2结构域结合)以及RSPO1介导的Wnt信号传导放大，观察到这种现象。
如上所公开，本公开文本的指导物/效应子设计的参数包括(1)指导物和效应子在同一细胞(靶细胞)上的共同呈递、以及指导物与效应子抗原密度的某种(例如高)比率。在一些实施方案中，信号途径调节的效力随着指导物与效应子比率的增加而增加。在一些实施方案中，指导物的密度显著高于效应子的密度，使得靶细胞表面上的指导物与效应子密度之间的比率范围为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1或更大，并且在某些特定实施方案中，比例范围为约5:1至10:1。在指导物的密度显著高于效应子的密度的一些其他实施方案中，靶细胞表面上的指导物与效应子密度之间的比率范围大于10:1。在一些例子中，当比率大于10:1时，能以靶细胞特异性方式实现约一千倍的效力增强。
能够产生协同结果的指导物/效应子设计的一个参数是细胞表面指导物抗原密度的某种(例如高)水平的阈值为实现细胞类型选择性效力增强所需。细胞表面指导物抗原密度的阈值的一些例子范围为约100、500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、5,500、6,000、6,500、7,000、7,500、8,000、8,500、9,000、9,500、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000或20,000个或更多个拷贝或任何中间拷贝数/细胞。在一些实施方案中，细胞表面指导物抗原密度的阈值范围为约1,000至5,000个拷贝/细胞、5,000至10,000个拷贝/细胞、10,000至15,000个拷贝/细胞或15,000至20,000个拷贝/细胞。在一些实施方案中，靶细胞表面中指导物抗原的表达水平阈值多于约或20,000个或更多个拷贝/细胞(特别是15,000至20,000个拷贝或更多个拷贝/细胞)，指导物在双特异性抗体中的作用是明显的。这很适合肿瘤靶向，因为已经发现许多细胞表面分子被肿瘤细胞过表达，因此可以用作指导物抗原来重定向双特异性抗体(例如抗LPR6抗体)并增强其在Wnt信号传导抑制中的活性。
治疗疾病或病症的方法
本公开文本提供了使用工程化抗体治疗疾病或病症(例如，癌症)的方法。在一些实施方案中，通过使用本公开文本的工程化活性调节信号传导途径来进行治疗。在一些情况下，所述方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的工程化抗体或包含本文所述的工程化抗体的药物化合物，单独地(例如，作为单一疗法)或与一种或多种另外的药剂(例如药学上可接受的赋形剂)组合(例如，作为组合疗法)。在某些方面，给予受试者的双特异性抗体或药物化合物特异性地靶向其中信号传导途径由于治疗而被调节的细胞。
在一些实施方案中，将本文所述的工程化抗体和缀合物组合物/配制品给予受试者(例如，人类患者)，用于治疗与信号传导途径的调节异常相关的疾病或病症。在一些情况下，信号传导途径选自AKT途径、c-MET途径、NF-kB途径、Notch信号传导途径、p53途径、Ras-Raf-MEK-ERK途径、STAT信号传导途径、Wnt信号传导途径、YAP/Wnt信号传导途径、NK(自然杀伤细胞)激活途径、NK抑制途径和检查点抑制途径。在一些情况下，所述疾病或病症与YAP/Wnt信号传导途径、受体酪氨酸激酶(RTK)信号传导途径家族、NK(自然杀伤细胞)激活途径、NK抑制途径、巨噬细胞调节途径、树突细胞调节途径、T细胞调节途径和检查点抑制途径的调节异常相关。在一些情况下，所述疾病或病症与YAP/Wnt信号传导途径的调节异常相关。在一些情况下，所述疾病或病症与Wnt信号传导途径的调节异常相关。
在一些实施方案中，将本文所述的工程化抗体和缀合物组合物/配制品给予个体(例如人类患者)，以例如降低癌细胞的生存力和/或浸润，例如以减少肿瘤大小或转移、降低肿瘤负荷、和/或改善患者的临床结果。在某些方面，抗体组合物可以用于破坏癌细胞的细胞周期，并促进细胞进入细胞凋亡，例如通过诱导癌细胞进入GO前细胞周期阶段。本文考虑的与癌症有关的方法包括例如使用抗体疗法(单独地或与抗癌疫苗或疗法组合)、以及使用在抗癌疫苗(例如，通过被动免疫)或疗法中使用效应子和/或指导物抗原产生的抗体。所述方法可用于治疗或预防多种多样的癌症的背景下。在一个方面，癌症是指包括原发性癌症和转移性癌症的通用术语。在一些实施方案中，原发性癌症可以意指这样一组肿瘤细胞，其已经获得癌细胞的至少一个特征，但是尚未侵入邻近组织并且在位于原发性起源位置的肿瘤中保持在一起。在一些其他实施方案中，转移性癌症可以意指这样一组肿瘤细胞，其源自原发性癌症的细胞，其已经侵入所述原发性癌症周围的组织、通过身体传播、粘附在新的远的位置并长成新的肿瘤。癌症的例子包括但不限于乳腺癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、胃(stomach)癌、GIST、肝细胞癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、小肠癌、大肠癌、胃(gastric)癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、恶性黑色素瘤、葡萄膜炎黑色素瘤、多发性骨髓瘤、间皮瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、胶质母细胞瘤、肉瘤、神经胶质瘤或其他脑肿瘤、头颈癌、其他胃肠道和生殖细胞肿瘤和血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，血液系统恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，本文考虑的癌症不限于前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、表皮样癌、脑癌、多形性胶质母细胞瘤和Ras转化的癌症。
在某些实施方案中，将抗体组合物用于抗癌疗法，其中癌细胞呈递细胞特异性标记物，其可以作为在细胞外可接近细胞表面上的本公开文本的双特异性抗体的指导物抗原。特别适合使用本公开文本的双特异性抗体治疗的癌症包括通过与指导物抗原结合而被抗体靶向的那些。在一些实施方案中，与过表达指导物抗原的癌细胞相比，这种指导物抗原在正常人组织或细胞中的存在或表达水平可以是瞬时且低丰度的。指导物抗原可能主要存在于异常细胞(如癌细胞)中。由于高水平的指导物抗原的表达可能主要存在于癌细胞中，因此用本公开文本的双特异性抗体或包含所述抗体的组合物治疗可以用于以高特异性或选择性治疗癌细胞，最小化对非癌细胞或健康细胞的非特异性细胞毒性。
在一些实施方案中，治疗方式是使用本公开文本的工程化抗体调节信号传导途径。信号传导途径的调节异常通常与疾病或病症的发生和/或进展相关，因为这种信号传导途径的调节可以导致疾病或病症的有效治疗。在一些例子中，疾病或病症可能与一种或多种信号传导途径的调节异常有关，并且这种调节异常可以通过调节另一种信号传导途径来改善或消减。在这种情况下，使用可以抵消或降低调节异常的信号传导途径的活性的本公开文本的工程化抗体对信号传导途径的上调或下调可以提供有效的治疗手段。
在一些实施方案中，使用本公开文本的工程化抗体或包含所述抗体的组合物进行治疗的细胞不限于癌细胞，而是包括可能需要信号传导调节的任何细胞。此类细胞包括但不限于免疫效应细胞，如一个或多个自然杀伤细胞、一个或多个T细胞、一个或多个树突细胞和一个或多个巨噬细胞。
在一些实施方案中，本公开文本的工程化抗体或包含其的药物组合物可以成功地用于治疗选自以下的任何原发性癌症和/或转移性癌症：乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌、肝细胞癌、其他胃肠道癌症、肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、甲状腺癌和头颈癌、恶性黑色素瘤和其他皮肤癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、胶质母细胞瘤或其他脑肿瘤、生殖细胞肿瘤和血液系统恶性肿瘤。
剂量
在本公开文本的方法中，将有效量的本公开文本的工程化抗体或包含所述抗体的组合物给予有需要的个体。例如，在一些实施方案中，当以有效量给予抗体或其组合物时，双特异性抗体抑制个体中一个或多个癌细胞的生长、转移和/或浸润。给予量根据给予的目标、待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类群(例如，人、非人灵长类动物、灵长类动物等)、所需的分辨度、双特异性抗体或组合物的配方、治疗临床医师对医疗状况的评估以及其他相关因素而变化。预期所述量将落入可以通过常规试验确定的相对宽的范围内。例如，用于抑制癌细胞生长、转移和/或浸润的双特异性抗体或其组合物的量不大于约对受试者可能具有不可逆毒性的量(即，最大耐受剂量)。在其他情况下，所述量大约或甚至远低于毒性阈值，但仍处于免疫有效浓度范围内，或甚至低至阈值剂量。
个体剂量通常不小于对个体产生可测量的效果所需的量，并且可以基于抗体吸收、分布、代谢和排泄(“ADME”)的药代动力学和药理学来确定，并且因此基于组合物在个体中的处置来确定。这包括考虑给予途径以及剂量，其可以针对例如肠胃外(通过除消化道之外的途径施用以用于产生全身或局部效果)施用进行调整。例如，双特异性抗体或其组合物的给予通常通过注射并且经常是静脉内、肌肉内、肿瘤内或其组合。
工程化抗体或其组合物可以通过输注或通过局部注射给予，例如通过以约10mg/h至约200mg/h、约50mg/h至约400mg/h(包括约75mg/h至约375mg/h、约100mg/h至约350mg/h、约150mg/h至约350mg/h、约200mg/h至约300mg/h、约225mg/h至约275mg/h)的速率输注。示例性输注速率可以实现例如约0.5mg/m2/天至约10mg/m2/天(包括约1mg/m2/天至约9mg/m2/天、约2mg/m2/天至约8mg/m2/天、约3mg/m2/天至约7mg/m2/天、约4mg/m2/天至约6mg/m2/天、约4.5mg/m2/天至约5.5mg/m2/天)的所需治疗剂量。给予(例如，通过输注)可以在所需时间段内重复，例如在约1天至约5天的时间段内重复或每隔几天(例如，约5天)重复一次，在约1个月、约2个月内重复等。它也可以在其他治疗干预(如用以除去癌细胞的外科手术)之前、同时或之后给予。双特异性抗体或其组合物也可以作为组合疗法的一部分给予，其中向受试者给予免疫疗法、癌症化学疗法或放射疗法中的至少一种。
给予途径
在实践所述方法时，给予途径(工程化抗体或其组合物进入个体或受试者体内的路径)可以变化。工程化抗体或其组合物可以全身地给予(例如，通过肠胃外给予，例如通过静脉内途径)或者局部地给予(例如，在局部肿瘤部位，例如通过肿瘤内给予(例如，给予进实体瘤、给予进在淋巴瘤或白血病中累及的淋巴结)、给予进为实体瘤提供补给的血管等)。
在一些实施方案中，本文所述的工程化抗体被配制用于肠胃外给予。在一些情况下，工程化抗体被配制用于静脉内、皮下、肌肉内、动脉内、颅内、脑内、脑室内或鞘内给予。在一些情况下，将工程化抗体作为注射液给予受试者。在其他情况下，将工程化抗体作为输注液给予受试者。
适用于肠胃外给予的配制品包括水性和非水性的等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使配制品与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。配制品能以单位剂量或多剂量密封容器(如安瓿和小瓶)呈现，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在使用前立即添加无菌液体赋形剂(例如，水)以供注射。临时注射溶液和悬浮液可以由前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
如本文所用，术语“单位剂型”是指适合作为人和动物受试者的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有经计算足以产生所需效果的量的预定量的本公开文本的化合物以及药学上可接受的稀释剂、载体或运载体。新型单位剂型的规格取决于所用的特定化合物和要实现的效果、连同与个体体内每种化合物相关的药效学以及个体的目标疾病或病症及其阶段。
抗体-细胞复合物
在一些实施方案中，本文公开的还包括抗体-细胞复合物。在一些实施方案中，抗体-细胞复合物包含工程化抗体，其中工程化抗体具有与细胞上的指导物抗原结合的第一抗原结合区和与细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区，其中细胞的特征在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约4:1。在一些实施方案中，抗体-细胞复合物包含工程化抗体，其中工程化抗体具有与细胞上的指导物抗原结合的第一抗原结合区和与细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区，其中细胞具有在细胞表面上表达的指导物抗原的约15,000或更多个拷贝。在一些情况下，细胞的特征在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约5:1。在一些情况下，细胞的特征在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约10:1。在一些情况下，细胞具有在细胞表面上表达的指导物抗原的约15,000或更多个拷贝。在一些情况下，细胞具有在细胞表面上表达的指导物抗原的约20,000或更多个拷贝。
在一些实施方案中，本公开文本提供了包含工程化抗体的抗体-细胞复合物，其中工程化抗体具有与细胞上的指导物抗原结合的第一抗原结合区和与细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区，其中细胞的特征在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约4:1。
在一些实施方案中，在所述复合物中，细胞的特征在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约5:1。
在一些实施方案中，在所述复合物中，细胞的特征在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约10:1。
在一些实施方案中，在所述复合物中，细胞具有在细胞表面上表达的指导物抗原的约15,000或更多个拷贝。
在一些实施方案中，在所述复合物中，细胞具有在细胞表面上表达的指导物抗原的约20,000或更多个拷贝。
在一些实施方案中，本公开文本提供了包含工程化抗体的抗体-细胞复合物，其中工程化抗体具有与细胞上的指导物抗原结合的第一抗原结合区和与细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区，其中细胞具有在细胞表面上表达的指导物抗原的约15,000或更多个拷贝。
在一些实施方案中，在所述复合物中，癌细胞具有在细胞表面上表达的指导物抗原的约20,000或更多个拷贝。
在一些实施方案中，在所述复合物中，细胞的特征还在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约4:1。
在一些实施方案中，在所述复合物中，细胞的特征还在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约5:1。
在一些实施方案中，在所述复合物中，细胞的特征还在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约10:1。
在一些情况下，效应子抗原是肿瘤抗原。在一些情况下，效应子抗原是肿瘤相关抗原。在其他情况下，效应子抗原是肿瘤特异性抗原。在一些情况下，效应子抗原是LRP6。
在一些实施方案中，第二抗原结合区具有含有三个互补决定区(CDR)的重链可变区，其中来自重链可变区的CDR选自表3和表4。在一些情况下，第二抗原结合区具有含有三个互补决定区(CDR)的轻链可变区，其中来自轻链可变区的CDR选自表3和表4。在一些情况下，第二抗原结合区具有含有三个互补决定区(CDR)的重链可变区和含有三个互补决定区(CDR)的轻链可变区，其中来自重链可变区的CDR和来自轻链可变区的CDR选自表3和表4。在一些情况下，第二抗原结合区具有这样的重链可变区，其与选自表3和表4的重链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。在一些情况下，第二抗原结合区具有这样的轻链可变区，其与选自表3和表4的轻链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。在一些情况下，第二抗原结合区具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与选自表3和表4的重链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性，所述轻链可变区与选自表3和表4的轻链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。在一些情况下，第二抗原结合区具有含有选自表3和表4的序列的重链可变区和含有选自表3和表4的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述指导物抗原是细胞类型选择性细胞表面抗原。在一些实施方案中，所述指导物抗原是肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，所述指导物抗原是肿瘤特异性抗原。
在一些实施方案中，第一抗原结合区具有含有三个互补决定区(CDR)的重链可变区，其中来自重链可变区的CDR选自表5。在一些情况下，第一抗原结合区具有含有三个互补决定区(CDR)的轻链可变区，其中来自轻链可变区的CDR选自表5。在一些情况下，第一抗原结合区具有含有三个互补决定区(CDR)的重链可变区和含有三个互补决定区(CDR)的轻链可变区，其中来自重链可变区的CDR和来自轻链可变区的CDR选自表5。在一些情况下，第一抗原结合区具有这样的重链可变区，其与选自表5的重链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。在一些情况下，第一抗原结合区具有这样的轻链可变区，其与选自表5的轻链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。在一些情况下，第一抗原结合区具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与选自表5的重链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性，所述轻链可变区与选自表5的轻链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。
制备双特异性抗体的方法
下文呈现了制备根据本公开文本的抗体的示例性方法。
可以使用本领域已知的多种多样的技术制备抗体，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。例如，可以使用噬菌体展示方法制备和分离抗体。还可以从用包含抗原(例如效应子抗原或指导物抗原)的免疫原性组合物免疫的动物宿主的血清中分离抗体，其包括完整蛋白质及其片段。示例性抗体包括能够特异性地结合抗原或其片段的分离的抗体。
包被用于噬菌体展示淘选的孔的抗原或用于产生本公开文本的抗体的免疫原性组合物可以包括一种或多种抗原的聚集体。所述方法可以涉及使抗原暴露于聚集条件以形成聚集体。因此，上述产生方法还可以包括形成分离的抗原的聚集体的步骤。聚集条件的例子包括加热、添加促进聚集的赋形剂等。
用于包被噬菌体淘选用的孔或产生本公开文本的抗体的抗原可以与另一种分子缀合。例如，抗原可以与第二分子缀合，所述第二分子是例如肽、多肽、脂质、碳水化合物等，其例如通过靶向特定细胞(例如，神经元、白细胞等)或细胞位置(例如，溶酶体、内体、线粒体等)、组织或其他身体位置(例如，血液、神经组织、特定器官等)而有助于溶解性、储存或其他处理特性、细胞渗透性、半衰期、控制释放和/或分布等。
与第二分子缀合的抗原的特定实施方案是其中第二分子是免疫调节剂。“免疫调节剂”是直接或间接改变免疫应答的分子。一类特定的免疫调节剂包括刺激或有助于刺激免疫应答的那些。例子包括抗原和抗原载体，如毒素或其衍生物，包括破伤风类毒素。
噬菌体展示
噬菌体展示用于蛋白质相互作用的高通量筛选。噬菌体可以用于展示从库(repertoire)或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。可以用感兴趣的蛋白酶选择或鉴定表达结合感兴趣的蛋白酶的抗原结合结构域的噬菌体，例如使用结合或捕获到固体表面或珠上的标记的效应子或指导物抗原或其片段。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，其包含从Fab、Fv(来自轻链或重链的单个Fv区)或二硫键稳定的Fv抗体结构域与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合的噬菌体表达的fd和M13结合结构域。示例性方法例如在以下文献中陈述：EP 368 684B1；美国专利号5,969,108；Hoogenboom,H.R.和Chames,Immunol.Today 2000,21:371；Nagy等人Nat.Med.2002,8:801；Huie等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001,98:2682；Lui等人,J.Mol.Biol.2002,315:1063，将其中的每一个通过引用并入本文。一些出版物(例如，Marks等人,Bio/Technology 1992,10:779-783)已经描述了通过链改组产生高亲和力人抗体，并且将组合感染和体内重组作为构建大噬菌体文库的策略。在另一个实施方案中，核糖体展示可以用于替代噬菌体作为展示平台(参见例如，Hanes等人,Nat.Biotechnol.2000,18:1287；Wilson等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001,98:3750；或Irving等人,J.Immunol.Methods 2001,248:31)。可以针对抗体对细胞表面文库进行筛选(Boder等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000,97:10701；Daugherty等人,J.Immunol.Methods 2000,243:211)。此类程序为用于分离和随后克隆单克隆抗体的传统杂交瘤技术提供了替代方案。参见下文的实施例部分。
在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。例如，从动物cDNA文库(例如，淋巴组织的人或鼠cDNA文库)或合成的cDNA文库中扩增或以其他方式分离编码重链可变(VH)和轻链可变(VL)区的DNA序列。可以通过PCR将编码VH和VL区的DNA通过scFv接头连接在一起并克隆到噬菌粒载体(例如，pCANTAB6或pComb 3HSS)中。将载体在大肠杆菌(E.coli)中电穿孔，并用辅助噬菌体感染大肠杆菌。VH或VL区通常与噬菌体基因III或基因VIII重组融合。可以用抗原选择或鉴定表达结合感兴趣的抗原的抗原结合结构域的噬菌体，例如使用标记的抗原或者结合或捕获到固体表面或珠上的抗原。
如上文列出的参考文献中所述，在噬菌体选择后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区，并且将其用于产生完整抗体(包括人抗体)或任何其他所需的抗原结合片段，并在任何所需宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中表达。例如，也可以使用本领域已知的方法使用重组产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术。
免疫和抗体产生
在宿主动物体内产生抗体的方法涉及将有效量的感兴趣的抗原(例如效应子或指导物抗原)或其片段作为上述抗原给予宿主动物(即，合适的哺乳动物，如小鼠、兔或豚鼠，或合适的禽类，如鸡)，以引发特异性地结合抗原或其片段的抗体的产生。免疫动物的方法(包括所用的佐剂、加强方案、注射部位、合适的动物等)在本领域是很好地理解的。接下来，产生抗体产生细胞群。在一个实施方案中，使用本领域技术人员公知的杂交瘤方法产生细胞群(参见例如，Harlow Antibodies:A Laboratory Manual,第一版(1988)Cold SpringHarbor,N.Y.)。使细胞与能够在细胞培养物中无限地复制的永生化细胞(如骨髓瘤细胞或转化细胞)融合，从而产生永生的免疫球蛋白分泌细胞系。可以将所用的永生细胞系选择成缺乏利用某些营养素所必需的酶。许多这样的细胞系(如骨髓瘤)是本领域技术人员已知的，并且包括例如：胸苷激酶(TK)或次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)。这些缺陷允许根据它们在例如次黄嘌呤氨基蝶呤胸苷培养基(HAT)上生长的能力来选择融合细胞。在备选实施方案中，可以使用噬菌体展示方法制备表达单克隆抗体的细胞群。
也可以通过基因工程产生抗体(包括抗体的抗原结合片段)。在这种技术中，与标准杂交瘤程序一样，针对所需抗原或免疫原敏化抗体产生细胞。将从免疫脾细胞或杂交瘤中分离的信使RNA用作模板以使用PCR扩增制备cDNA。通过将扩增的免疫球蛋白cDNA的适当区段插入表达载体中，产生载体文库，每个载体含有保留初始抗原特异性的一个重链基因和一个轻链基因。可以通过将重链基因文库与轻链基因文库组合来构建组合文库。这产生共表达重链和轻链的克隆文库(类似于抗体分子的Fab片段或抗原结合片段)。将携带这些基因的载体共转染到宿主(例如细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞或其他合适的蛋白质生产宿主细胞)中。当在转染的宿主中诱导抗体基因合成时，重链和轻链蛋白自组装，以产生可以通过用抗原或免疫原筛选来检测的活性抗体。
噬菌体淘选和筛选
一旦产生抗体产生细胞或噬菌体的群体，便使用各种测定中的一种或组合筛选抗体。通常，这些测定是功能测定，并且可以如下分组：检测抗体的结合亲和力或特异性的测定、以及检测抗体初始化或抑制过程的能力的测定。
例如，将抗原与珠或孔或其他固体支持物偶联，并与展示感兴趣的抗体的噬菌体一起孵育。洗涤后，然后通过接种对数期大肠杆菌细胞回收结合的噬菌体。使细胞生长并用辅助噬菌体扩增。将步骤重复以扩增紧密结合的噬菌体。收获几轮富集后的噬菌体感染的大肠杆菌菌落，并从周质级分中纯化Fab抗体。然后根据本领域已知的方法分析纯化的抗体。下文详述了某些示例性例子。
对从噬菌体感染的细胞或杂交瘤中分离的抗体群体进行进一步分析和/或在体外或在原位(例如在细胞上)针对与所述多种抗原中的单一抗原(即，未与所述多种抗原中的其他抗原混合的抗原)的结合进行筛选。可以根据本领域常规且已知的方法进行免疫特异性结合。可以使用的免疫测定包括但不限于使用诸如western印迹等技术的竞争性和非竞争性测定系统、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定等等。参见例如，Ausubel等人编辑,1994,CurrentProtocols in Molecular Biology,第1卷,John Wiley&Sons,Inc.,New York，将其通过引用以其整体并入。
也可以在体内筛选本公开文本的抗体。所述方法涉及将抗体给予疾病或病症的动物模型，并确定抗体对模型动物的疾病或病症的效果。在本公开文本的一些实施方案中，体内测定包括对照，其中合适的对照包括在不存在抗体的情况下的样品。通常，以不同抗体浓度平行运行多种测定混合物，以获得对各种浓度的差异反应。通常，这些浓度中的一种用作阴性对照，即在零浓度或低于检测水平。
筛选方法
本公开文本提供的筛选方法可以涉及使用噬菌体文库来筛选特异性地结合感兴趣的抗原或其片段的抗体。可以根据上述噬菌体展示方法执行所述方法。
简而言之，可以通过共价或非共价相互作用(如疏水性吸附、生物素-亲和素相互作用和Ni2+-6×His相互作用)将感兴趣的抗原或其片段固定在ELISA板上或珠上。然后将噬菌体文库与固定的抗原/蛋白酶一起孵育，洗涤并回收。在淘选和选择期间，回收结合的噬菌体并在大肠杆菌中扩增。多轮连续选择确保选择展示充当对感兴趣的抗原或其片段具特异性的抗体的多肽的噬菌体。洗涤的严格性随着轮数(例如三轮)增加。可以使用本领域公知的许多技术来提高回收的噬菌体的特异性。例子包括延长的洗涤时间、提高的洗涤剂浓度、提高的盐浓度、以及包含已知的大分子抑制剂(例如，小肽底物、BPTI、大肠杆菌素(Ecotin)和/或先前鉴定的抗体抑制剂)。抑制性抗体的鉴定可以包括ELISA和抑制测定。上文讨论了在选择和分离对感兴趣的抗原具特异性的抗体的方法中进行的测定的细节。
本公开文本还考虑了编码本文所述的候选抗体的核酸构建体的文库。所述文库编码多种候选抗体，其可以具有一个或多个共同的多肽区域(例如重链CDR3)和至少一个在群体中变化的其他多肽区域。
工程化抗体的方法
本文所述的任何抗体也可以呈抗体片段的形式。抗体片段可以包括完整全长抗体的一部分，并且可以包括完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab；Fab′；F(ab′)2；Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；多特异性抗体片段，如双特异性、三特异性等抗体(例如，双抗体、三抗体、四抗体)；迷你抗体；螯合重组抗体；三抗体或二抗体；胞内抗体；纳米抗体；小模块免疫药物(SMIP)；结合结构域免疫球蛋白融合蛋白；骆驼化抗体；含VHH的抗体；以及由抗体片段形成的其他多肽。
制备抗体片段的方法是本领域已知的(参见例如，Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NY,1988，通过引用并入本文)。可以通过抗体的解蛋白水解或通过在编码片段的细胞中表达来制备抗体片段。可以使用常规方法通过例如完整抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化来获得抗体片段。例如，可以通过用胃蛋白酶酶促切割抗体以提供表示为F(ab′)2的5S片段来产生抗体片段。可以使用硫醇还原剂和任选的通过切割二硫键产生的巯基的封闭基团进一步切割这个片段，以产生3.5SFab'单价片段。可替代地，使用胃蛋白酶的酶促切割直接产生两个单价Fab'片段和Fc片段。
也可以使用切割抗体的其他方法，如分离重链以形成单价轻重链片段、进一步切割片段、或者其他酶促、化学或遗传技术，只要片段与被完整抗体识别的抗原结合即可。例如，Fv片段可以包括VH和VL链的缔合。这种缔合可以是非共价的，或者可变链可以通过分子间二硫键连接或通过化学物质(如戊二醛)交联。优选地，Fv片段可以包含通过肽接头连接的VH和VL链。通过构建具有编码通过寡核苷酸连接的VH和VL结构域的DNA序列的结构基因来制备这些单链抗原结合蛋白(sFv)。将结构基因插入表达载体中，随后将其引入宿主细胞(如大肠杆菌)中。重组宿主细胞合成单条多肽链，其具有桥接两个V结构域的接头肽。产生sFv的方法描述于例如Whitlow等人,1991,Methods:A Companion to Methods inEnzymology,2:97；Bird等人,1988,Science 242:423-426；美国专利号4,946,778；和Pack等人,1993,BioTechnology 11:1271-77中。
另一种形式的抗体片段是编码单个互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)通常参与抗原识别和结合。可以通过克隆或构建编码感兴趣的抗体的CDR的基因来获得CDR肽。例如，通过使用聚合酶链式反应从抗体产生细胞的RNA合成可变区来制备此类基因。参见例如，Larrick等人,Methods:a Companion to Methods in Enzymology,第2卷,第106页(1991)。
单链Fv(“scFv”)多肽是共价连接的VH::VL异源二聚体，其可以从包含直接连接或通过肽编码接头连接的VH和VL编码序列的核酸表达(Huston等人(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883)。多种结构可用于将来自抗体V区的轻链和重链多肽链转化成scFv分子，其将折叠成基本上类似于抗原结合位点的结构的三维结构。
重组设计方法可以用于开发合适的化学结构(接头)，用于将来自抗体可变区的两条重链和轻链多肽链转化成scFv分子，其将折叠成基本上类似于天然抗体结构的三维结构。
设计标准包括确定跨越一条链的C末端与另一条链的N末端之间的距离的适当长度，其中接头通常由不易卷曲或形成二级结构的小亲水性氨基酸残基形成。
在这方面，接头设计的第一个一般步骤涉及鉴定待连接的似合理的位点。每个VH和VL多肽结构域上的适当连接位点包括将导致多肽结构域中残基损失最小并且需要具有与分子稳定性需要一致的最小残基数的接头的那些。一对位点定义了待连接的“空位”。将一个结构域的C末端连接到下一个结构域的N末端的接头通常可以包含亲水性氨基酸，其在生理溶液中呈现非结构化构型，并且可以不含具有可能干扰VH和VL链的正确折叠的大侧基的残基。因此，合适的接头通常可以包含交替的甘氨酸和丝氨酸残基组的多肽链，并且可以包含插入的谷氨酸和赖氨酸残基以增强溶解性。一种特定的接头具有氨基酸序列(Gly4Ser)3。另一种特别优选的接头具有含有2个或3个[(Ser)4Gly](如[(Ser)4Gly]3等)重复的氨基酸序列。编码此类接头部分的核苷酸序列可以使用本领域已知的各种寡核苷酸合成技术容易地提供(参见例如Sambrook，同上)。
“肽序列的变体”意指可以例如通过添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基而修饰的肽。其他修饰可以包括诸如酯、糖等衍生物。
根据本公开文本的肽片段的变体可以在相同的变体或其片段内或在不同的变体或其片段中包含至少一个如本公开文本的其他地方所述的取代。
人源化和非人源化抗体
本公开文本考虑了非人(例如鼠)抗体的人和人源化形式。此类人源化抗体是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如抗体的Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或其他抗原结合子序列)，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列(如表位识别序列)。在大多数情况下，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠或兔)的CDR的具有所需的特异性、亲和力和能力的残基替代。含有一种或多种抗体的一个或多个最小序列(如识别本文所述的一种或多种表位的一个或多个序列)的一种或多种人源化抗体是本公开文本的优选实施方案。
在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。通常，人源化抗体将基本上含有至少一个(通常是两个)可变结构域的全部，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还最佳地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。关于进一步的细节，参见：Jones等人,1986,Nature 321,522-525；Reichmann等人,1988,Nature 332,323-329；Presta,1992,Curr Op Struct Biol 2:593-596；Holmes等人,1997,J Immunol 158:2192-2201和Vaswani等人,1998,Annals Allergy,Asthma&Immunol 81:105-115。
在一些实施方案中，通过以下方法产生本公开文本的工程化抗体，所述方法包括a)选择在细胞表面上表达多种指导物抗原和效应子抗原的细胞；b)确定所述多种指导物抗原和效应子抗原的密度比；以及c)如果指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少4:1，则制备具有与细胞上的指导物抗原结合的第一抗原结合区和与细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区的工程化抗体。
在一些实施方案中，在所述方法中，指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少5:1。
在一些实施方案中，在所述方法中，指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少10:1。
在一些实施方案中，在所述方法中，细胞在细胞表面上表达指导物抗原的至少15,000或更多个拷贝。
在一些实施方案中，在所述方法中，细胞在细胞表面上表达指导物抗原的至少20,000或更多个拷贝。
在一些实施方案中，通过以下方法产生本公开文本的工程化抗体，所述方法包括a)选择在细胞表面上表达多种指导物抗原和效应子抗原的细胞；b)确定在细胞表面上表达的指导物抗原的拷贝数；以及c)如果细胞表达指导物抗原的至少15,000个拷贝，则制备具有与细胞上的指导物抗原结合的第一抗原结合区和与细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区的工程化抗体。
在一些实施方案中，在所述方法中，细胞在细胞表面上表达指导物抗原的至少20,000或更多个拷贝。
在一些实施方案中，在所述方法中，所述方法还包括确定指导物抗原与效应子抗原的密度比。
在一些实施方案中，在所述方法中，指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少4:1。
在一些实施方案中，在所述方法中，指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少5:1。
在一些实施方案中，在所述方法中，指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少10:1。
在一些实施方案中，本公开文本提供了通过以下方法产生的工程化抗体：a)选择在细胞表面上表达多种指导物抗原和效应子抗原的细胞；b)确定所述多种指导物抗原和效应子抗原的密度比；以及c)如果指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少4:1，则制备具有与细胞上的指导物抗原结合的第一抗原结合区和与细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区的工程化抗体。
在一些实施方案中，所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少5:1。
在一些实施方案中，所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少10:1。
在一些实施方案中，所述细胞在细胞表面上表达指导物抗原的至少15,000或更多个拷贝。
在一些实施方案中，所述细胞在细胞表面上表达指导物抗原的至少20,000或更多个拷贝。
在一些实施方案中，本公开文本提供了通过以下方法产生的工程化抗体：a)选择在细胞表面上表达多种指导物抗原和效应子抗原的细胞；b)确定在细胞表面上表达的指导物抗原的拷贝数；以及c)如果细胞表达指导物抗原的至少15,000个拷贝，则制备具有与细胞上的指导物抗原结合的第一抗原结合区和与细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区的工程化抗体。
在一些实施方案中，所述细胞在细胞表面上表达指导物抗原的至少20,000或更多个拷贝。
在一些实施方案中，所述过程还包括确定指导物抗原与效应子抗原的密度比。
在一些实施方案中，所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少4:1。
在一些实施方案中，所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少5:1。
在一些实施方案中，所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少10:1。
药物配制品
本公开文本还提供了药物组合物，其包含本文所述的任何双特异性抗体或其任何缀合物或衍生物和药学上可接受的赋形剂(例如药学上可接受的载体)。
含有本公开文本的双特异性抗体或缀合物或衍生物作为活性成分的本公开文本的药物组合物可以含有药学上可接受的赋形剂或添加剂，这取决于给予途径。
本公开文本的药物组合物的配方将根据所选的给予途径而变化(例如，溶液、乳液)。可以在生理学上可接受的运载体或载体中制备包含待给予的抗体的适当组合物。对于溶液或乳液，合适的载体包括例如水性或醇性/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外运载体可以包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内运载体可以包括各种添加剂、防腐剂或液体、营养素或电解质补充剂。
通过将具有所需纯度水平的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，可以制备本公开文本的双特异性抗体的治疗配制品用于储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂；多肽；蛋白质；亲水性聚合物；氨基酸；任何类型的碳水化合物；成盐抗衡离子；金属络合物；和/或非离子表面活性剂。
在一些实施方案中，药学上可接受的盐可以源自有机碱或无机碱。盐可以是单价或多价离子。特别感兴趣的是无机离子锂、钠、钾、钙和镁。有机盐可以用胺制备，特别是铵盐，例如单烷基胺、二烷基胺和三烷基胺或乙醇胺。盐也可以用咖啡因、氨丁三醇和类似的分子形成。
配制作为盐、酯、酰胺、前药等的药物活性剂的方法是本领域技术人员公知的。例如，可以使用常规方法从游离碱制备盐，所述方法通常涉及与合适的酸反应。通常，将药物的碱形式溶解在极性有机溶剂(如甲醇或乙醇)中，并且向其中添加酸。通过添加极性较小的溶剂，所得的盐沉淀或可以从溶液中析出。
用于制备酸加成盐的合适的酸包括但不限于有机酸，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等；以及无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。通过用合适的碱处理，可以将酸加成盐再转化成游离碱。本文的活性剂的某些特别优选的酸加成盐包括卤化物盐，例如可以使用盐酸或氢溴酸制备。相反地，使用药学上可接受的碱(如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三甲胺等)以类似方式制备本发明的活性剂的碱式盐。特别优选的碱式盐包括碱金属盐，例如钠盐和铜盐。
为了制备碱性药物的盐形式，抗衡离子的pKa优选地比药物的pKa低至少约2个pH单位。类似地，为了制备酸性药物的盐形式，抗衡离子的pKa优选地比药物的pKa高至少约2个pH单位。这允许抗衡离子使溶液的pH达到低于pHmax的水平以达到盐平高线，在此处盐的溶解度优于游离酸或碱的溶解度。活性药物成分(API)和酸或碱中可电离基团的pKa单位的差异的一般规则意在使质子转移在能量上有利。当API和抗衡离子的pKa没有显著差异时，可以形成固体复合物，但可以在水性环境中快速地不成比例(即，分解成药物和抗衡离子的各个实体)。优选地，抗衡离子是药学上可接受的抗衡离子。
合适的阴离子盐形式包括但不限于乙酸盐、苯甲酸盐、苄化物、酒石酸氢盐、溴化物、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐(estolate)、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、碘化物、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐(思波酸盐(embonate))、磷酸盐和二磷酸盐、水杨酸盐和二水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘、戊酸盐等，而合适的阳离子盐形式包括但不限于铝、苄星青霉素、钙、乙二胺、赖氨酸、镁、葡甲胺、钾、普鲁卡因、钠、氨丁三醇、锌等。
酯的制备通常涉及存在于抗体分子结构内的羟基和/或羧基的官能化。在某些实施方案中，酯通常是游离醇基团的酰基取代的衍生物，即衍生自式RCOOH的羧酸的部分，其中R是烷基，并且优选地是低级烷基。如果需要，可以通过使用常规的氢解或水解程序将酯再转化成游离酸。
酰胺也可以使用本领域技术人员已知的或相关文献中描述的技术来制备。例如，酰胺可以使用合适的胺反应物由酯制备，或者它们可以通过与氨或低级烷基胺反应由酸酐或酰氯制备。
本文的配制品还可以含有超过一种活性化合物(例如，除双特异性抗体或其缀合物之外的第二活性剂)，其为所治疗的特定适应症(例如，癌症)所必需并且可以选择用于补充活性，这对彼此没有不利影响。此类分子适合地以对预期目的有效的量组合存在。
可以将本公开文本的工程化抗体冻干用于储存，并在使用前在合适的载体中重构。已经证明这种技术对常规免疫球蛋白有效。可以使用任何合适的冻干和重构技术。冻干和重建可能导致不同程度的抗体活性丧失，并且可能必须调整使用水平以进行补偿。
试剂盒/制品
在某些实施方案中，本文公开了与本文所述的一种或多种方法一起使用的试剂盒和制品。此类试剂盒包括载体、包装或容器，其被分隔以容纳一个或多个容器，如小瓶、管等，每个容器具有待用于本文所述方法的单独要素中的一种。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。在一个实施方案中，容器由各种材料(如玻璃或塑料)形成。
本文提供的制品含有包装材料。药物包装材料的例子包括但不限于泡罩包装、瓶、管、袋、容器、瓶、以及适用于所选配制品以及预期给予方式和治疗的任何包装材料。
例如，一个或多个容器包括工程化抗体和与本文公开的工程化抗体一起使用的试剂。此类试剂盒任选地包括与其在本文所述的方法中的使用有关的识别描述或标签或说明。
试剂盒通常包括列出内容物和/或使用说明的标签、以及包含使用说明的包装说明书。通常还将包括一组指令。
在一个实施方案中，标签在容器上或与容器相关。在一个实施方案中，当形成标签的字母、数字或其他字符被贴附、模制或蚀刻到容器本身中时，标签在容器上；当标签存在于容纳容器的器皿或载体内时，标签与容器相关，例如作为包装说明书。在一个实施方案中，标签用于指示内容物将用于特定治疗应用。标签还指示使用内容物的指示，如在本文所述的方法中。
尽管在本文示出和描述了本公开文本的各种实施方案和方面，但是对于本领域技术人员来说清楚的是，此类实施方案和方面仅通过举例的方式提供。在不背离本文提供的公开文本的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应该理解的是，本文所述的本公开文本的实施方案的各种替代方案可以用于实践本公开文本的各种实施方案。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。在本申请中引用的所有文献或文献的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、手册和论文)出于任何目的通过引用明确地以其整体特此并入。
实施例
细胞信号传导途径对于维持体内稳态以及调节细胞生长和存活是关键的。正常细胞和患病细胞通常使用重叠途径，从而产生对治疗靶向的障碍。患病细胞对途径调节的选择性敏感性允许靶向某些途径用以进行治疗。尽管如此，对正常细胞的毒性仍限制了治疗窗口。实现患病细胞和正常细胞常用的信号传导途径的细胞类型选择性调节仍然是一项基本挑战。细胞信号传导途径通常在正常细胞和患病细胞之间共享。如何实现对信号传导途径的细胞类型特异性或选择性的有效抑制可能是一项重要的挑战，对治疗剂开发有影响。
本文公开的包括通过双特异性抗体实现细胞类型选择性或特异性信号传导途径调节的普遍适用的途径。为了说明本公开文本的一些实施方案的目的，使用Wnt/β-连环蛋白途径作为模型系统以证明特异性和效力以及研究的其他变量，如细胞表面上的受体拷贝数和抗体诱导的受体内化。在这个说明性且非限制性的例子中，产生抗LRP6人mAb并将其用于产生bsAb，其中抗LRP6mAb与靶向肿瘤相关抗原的指导物抗体连接，从而产生指导物/效应子双特异性系统。为了拓宽适用性并研究每个细胞的受体拷贝数对bsAb的亲和力、特异性和功能性的影响，测试了几种肿瘤相关细胞表面抗原。本申请的作者先前已经鉴定并表征了靶向细胞间粘附分子1(ICAM-1)、肝配蛋白A型受体2(EphA2)和激活的白细胞粘附分子(ALCAM)的人scFv抗体(Conrad,Ha,Liu 2007)。这些肿瘤相关抗原在多种癌症中过表达(Veitonmaki,Weidle,Tandon)。在本公开文本中提供的说明性例子中，当在肿瘤细胞表面上以高于阈值的水平表达时，靶向那些指导物抗原的抗体充当细胞类型选择剂以及效力增强剂，从而导致对肿瘤细胞中Wnt/β-连环蛋白信号传导的有效且具选择性的抑制。
Wnt/β-连环蛋白信号传导在胚胎发育和疾病发病机制中起关键作用。Wnt信号传导的异常激活已经在许多类型的癌症中观察到，并且在癌症干细胞样细胞的发育中起作用。在经典的Wnt/β-连环蛋白信号传导级联中，Wnt配体结合导致由7次跨膜受体卷曲蛋白(Fzd)和低密度脂蛋白受体相关蛋白5或6(LRP5/6)组成的共受体复合物的组装，接着导致LRP5/6的磷酸化。磷酸化的LRP5/6将GSK-3β/轴蛋白(Axin)复合物螯合至质膜以抑制β-连环蛋白降解，从而允许稳定的β-连环蛋白转位至细胞核，然后其与T细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)转录因子结合，并诱导各种Wnt靶基因(包括细胞周期蛋白D1和原癌基因c-Myc)的表达。
LRP6的细胞外区域具有四个结构域，即E1至E4，每个结构域包含保守的YWTDβ-螺旋桨和EGF样基序。对于Wnt1、Wnt2或Wnt9，配体结合位点分别位于E1-E2结构域上；并且对于Wnt3或Wnt3a，配体结合位点分别位于E3-E4结构域上。除Wnt配体之外，已经显示Norrin或R-脊椎蛋白(RSPO1至4)可通过阻止LRP6的周转来上调Wnt/β-连环蛋白信号传导。LRP6已经被认为是针对Wnt依赖性癌症的治疗剂开发的有希望的靶标，但它也在正常细胞上表达，从而引起了可能限制治疗窗口的低靶向特异性的担忧。
材料和方法
细胞系
人胚肾(HEK)293和293A细胞系、肺癌细胞系A549、结肠癌细胞系HCT116和HT29、前列腺癌细胞系PC3获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。将细胞在含有5％CO2的潮湿气氛中在37℃下维持在补充有10％FBS(Fisher Scientific)、100μg/ml青霉素/链霉素(AxeniaBioLogix)的DMEM或McCoy’s 5A(结肠癌细胞系)中。
质粒
将克隆到pCMV-Entry(Origene)中的全长人LRP6、ICAM-1或EphA2cDNA用于亚克隆或瞬时转染。将pFUSE-hIgG1-Fc2(InvivoGen)用作截短的LRP6E1E2和LRP6E3E4结构域的Fc-融合构建体。对于双特异性串联scFv-Fc构建体，通过在两个scFv融合物之间插入(G4S)5接头来修饰pFUSE-hIgG1-Fc2载体。IgG-Abvec质粒(Ig-γ和Ig-λ)由芝加哥大学的PatrickWilson博士友情提供。将β-连环蛋白反应性萤光素酶报告基因SuperTopFlash(STF)和pRL-SV40海肾萤光素酶构建体(Addgene)用于STF报告基因测定。为了在STF报告基因测定中提供Wnt配体，将pcDNA-Wnt1或-Wnt3a表达质粒(Addgene)用于瞬时转染。
抗LRP6 scFv抗体的产生
噬菌体抗体展示文库由来自PBMC和淋巴结的合并的mRNA构建(Nam-Kyung Lee和Bin Liu，未发表的观察结果)，并用于对LRP6的重组细胞外结构域进行选择。用于噬菌体抗体展示文库构建的方法是本领域已知的(Sheets)。从HEK293A转染子中纯化重组LRP6E1E2或LRP6E3E4Fc-融合物，并用于选择轮次。简而言之，通过在4℃下孵育过夜，将LRP6E1E2或LRP6E3E4Fc包被在SPHEROTM聚苯乙烯磁性颗粒(Spherotech)上。为了在每轮中允许噬菌体抗体结合，将用每种Fc融合物包被的磁珠与用未包被珠耗尽的噬菌体一起孵育1h。然后将珠用PBS/0.1％吐温20和PBS各洗涤5次，并如前所述回收并繁殖结合的噬菌体(Connell,Liu 2000)。在第三轮淘选后，使用全长LRP6转染的HEK293细胞通过流式细胞术筛选单克隆噬菌体结合物。为了检测噬菌体结合物，如(Ha)所述使用生物素标记的抗fd噬菌体抗体(Sigma Aldrich)和链霉亲和素-R-PE(Invitrogen)。为了通过STF萤光素酶报告基因测定来测试噬菌体的抗Wnt信号传导活性，如前所述单独扩增和纯化候选噬菌体克隆(Ruan,Zhu2010,An 2008,Liu 2004)。
重组抗体表达和纯化
为了构建双特异性串联scFv-Fc融合物，将由限制酶位点和接头组成的核苷酸盒[AgeI-SalI-(Gly4Ser)5-NcoI-NotI]插入pFUSE-hIgG1-Fc2中以产生pFUSE-T-scFv-Fc载体。将AgeI和SalI或NcoI和NotI限制酶位点分别用于克隆指导物scFv抗体或抗LRP6scFv抗体。为了产生单特异性scFv-Fc融合物，将scFv基因克隆到未修饰的pFUSE-hIgG1-Fc2质粒中。对于IgG产生，通过PCR扩增抗体的重链和轻链可变片段，并分别亚克隆到Ig-γ和-λ表达载体中，如前所述(Smith 2009)。为了构建IgG-scFv双特异性抗体，用(Gly4Ser)3接头和限制酶位点修饰Ig-λAbvec，用于将指导物scFv克隆到轻链恒定区的C末端。使用抗LRP6IgG作为骨架，并且将指导物scFv H3插入修饰的Ig-λAbvec中以形成VL-CL-(Gly4Ser)3-scFv，类似于如(Orcutt)所述。为了产生上述所有构建体，将质粒DNA与聚乙烯亚胺在Opti-MEM(Life Technologies)中混合，并添加到HEK293A细胞中持续24小时。在将培养基更换为含有Nutridoma-SP(Roche)的无血清DMEM后，将细胞培养6-8天。收集含有分泌的抗体的上清液并按照制造商的说明书，在蛋白A琼脂糖(/Thermo Scientific)上纯化。在SDS-PAGE梯度凝胶(4％-20％)上分析所有纯化的抗体，并用PageBlueTM蛋白质染色溶液(ThermoScientific)染色。
SuperTopFlash(STF)萤光素酶报告基因测定
将在24孔培养板中制备的HEK293或A549细胞用与1.5μl/孔TransIT-2020(MirusBio)混合的200ng/孔的STF萤光素酶报告基因和20ng/孔的pRL-SV40转染，用或不用编码Wnt1和/或Wnt3a基因的质粒。为了在HEK293细胞中同时表达ICAM-1或EphA2，将不同量的ICAM-1或EphA2质粒DNA转染到细胞中。转染后6h(HEK293)或24h(A549)后，用在生长培养基中稀释的测试剂(纯化的噬菌体或抗体)处理细胞，并进一步再孵育16h。使用双萤光素酶报告基因测定系统(Promega)分别测量萤火虫萤光素酶(FL)和海肾萤光素酶(RL)活性，并用相应的RL值归一化每个FL值。归一化的数据表示为相对于没有抗体处理的对照实验的百分比。为了评估EphA2靶向性双特异性抗体，通过慢病毒转导产生稳定表达高水平EphA2的HEK293-EphA2细胞模型，并如上所述进行STF报告基因测定。对于RSPO1介导的报告基因活性刺激，在培养基内另外处理100ng/ml的重组人RSPO1(R&D Systems)，并如上所述进行STF报告基因测定。
抗原拷贝数量化
通过胰蛋白酶消化收获细胞，洗涤并重悬于FACS缓冲液(PBS、1％FBS，pH 7.4)中。为了检测每种指导物或效应子抗原，将细胞与通过Alexa647单克隆抗体标记试剂盒(Molecular Probes)标记的每种抗体荧光团一起孵育1h。用PBS洗涤后，通过BD AccuriC6流式细胞仪(BD Biosciences)分析细胞。根据制造商的推荐，使用QuantumTMAlexa647MESF(Bang’s Laboratory)将MFI(中值荧光强度)值转换成等效可溶性荧光染料分子(Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome，MESF)。为了将MESF转换成抗体结合能力(ABC)，我们根据制造商的说明书，使用Simply抗人IgG(Bang’sLaboratory)测量了每种Alexa647缀合的靶标特异性IgG的有效荧光团/蛋白质(F/P)比。
LRP6占用率量化
在将单特异性或双特异性scFv-Fc构建体预处理至测试细胞后，测定效应子抗原LRP6的受体占用率。如STF报告基因测定中所述，将不同浓度的每种抗体与A549细胞一起孵育16h。将与抗体一起孵育的细胞用冷冻的PBS洗涤两次，并用补充有1％BSA的PBS封闭。将Alexa647缀合的E34N19IgG与细胞在冰上一起孵育1h，并通过流式细胞术检测未占用的LRP6水平。将从每个实验组测量的MFI值相对于没有抗体处理的对照组中的最大MFI信号进行归一化。
表观KD测定
如(An,Zhu)所述，通过FACS在靶细胞上测量表观抗体结合亲和力。简而言之，将3x105个细胞在最终1ml的FACS缓冲液中与不同浓度的抗体一起孵育。在4℃下孵育过夜后，将细胞用冰冷的洗涤，然后重悬于含有Alexa647标记的山羊抗人IgG的100μl FACS缓冲液中。孵育1h后，洗涤细胞并如上所述通过FACS进行分析。如(Benedict,An,Zhu)所述使用MFI值通过曲线拟合方法确定表观KD。
免疫荧光显微术研究
将细胞以1.5x 104/孔接种在Labteck 8孔培养室载玻片(Thermo FisherScientific)上。为了评估抗体-靶标共定位，将细胞与每种抗体在生长培养基中预孵育1h。然后将细胞用4％PFA(多聚甲醛)固定，并在补充有1％FBS/0.2％Triton-X100的PBS中透化。将FITC标记的山羊抗人IgG用于检测预孵育的抗体，并且将通过单克隆抗体标记试剂盒(Invitrogen)产生的Alexa Fluor标记的抗LRP6IgG用于LRP6染色。为了验证细胞核β-连环蛋白转位，将补充有20％Wnt3a条件培养基(Wnt3a-CM)的DMEM/10％FBS中的每种抗体在室孔中孵育24h。使用小鼠抗β-连环蛋白一抗(Cell Signaling Technology)进行β-连环蛋白检测，并用Alexa647标记的兔抗小鼠二级IgG(Jackson ImmunoResearch)处理细胞。使用Hoechst33342(Thermo Scientific)对所有细胞进行复染，然后在具有Olympus 60X相衬水浸物镜的FluoFV10i激光共聚焦显微镜(Olympus)上成像。
细胞增殖测定
将细胞以1.0x 103/孔接种在96孔细胞培养板上。在培养过夜后，对于A549细胞，将不同浓度的每种抗体在DMEM/0.5％FBS/5％Wnt3a-CM中稀释。在处理后4天使用钙黄绿素-AM细胞活力测定试剂盒(Biotium Inc.)测定细胞活力。
免疫印迹
使用补充有蛋白酶/磷酸酶抑制剂(Cell Signaling Technology)的RIPA缓冲液(50mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCl、0.1％SDS、0.5％脱氧胆酸钠、1％NP-40)制备全细胞裂解物或细胞膜级分。对于细胞溶质蛋白质提取，将细胞重悬于低渗缓冲液(10mM Tris-HCl、10mM KCl、蛋白酶抑制剂，pH 7.5)中并通过三次冻融循环裂解。将等量的蛋白质上样到SDS-PAGE梯度凝胶(4％-20％)上，分离，并转移到PVDF膜(Millipore)上。用适当的一抗探测靶蛋白，然后与用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗一起孵育。使用ECL试剂(Millipore)产生化学发光信号，并通过c-DiGiT印迹扫描仪(LI-COR)进行检测。使用ImageJ(Schneider)分析印迹图像以确定条带强度。
细胞迁移和浸润测定
对于伤口愈合迁移测定，将细胞接种在96孔板中并允许其达到汇合。将生长培养基更换为含有10μg/ml丝裂霉素C(Sigma Aldrich)的无血清培养基，并将细胞孵育2h。使用无菌微量移液管尖端在均匀的细胞层上刮擦到每个孔中。在使用PBS洗涤细胞后，将在DMEM/20％Wnt3a-CM中稀释的不同浓度的抗体处理至细胞。将细胞孵育最多48h，并用2μM钙黄绿素-AM(Sigma Aldrich)染色，并在指定的时间点通过CellInsightTMNXT HCS平台(Thermo Scientific)扫描板。使用ImageJ软件测量伤口面积，并且基于相对于对照组的相对伤口面积数据生成IC50值。可替代地，用CultureCoat 24孔高BME插入物(Trevigen)在transwell浸润测定中评估细胞。将重悬于具有不同浓度的抗体的无血清培养基中的细胞添加到transwell插入物的上部隔室中，并将含有20％Wnt3a-CM的培养基用作化学引诱物并置于下部隔室中。孵育24h后，将细胞用4％PFA固定，并用PBS中的0.1％结晶紫(SigmaAldrich)染色。在整个膜上的5个视野中计数每个transwell中的浸润细胞数。
自我更新球体形成测定
为了分析球体形成，将第二代球体彻底用胰蛋白酶消化并通过具有40-μm尼龙网的细胞过滤器(FisherBrand)筛分以制备单细胞悬浮液。将细胞悬浮于由DMEM/F12(Gibco)、20ng/ml EGF、10ng/ml bFGF、10ng/ml IGF、2％B27补充剂(Gibco)和10％Wnt3a-CM组成的无血清培养基(SFM)中，并且将每孔200个细胞接种在超低粘附24孔培养板(Corning)中。添加各种条件的抗体，并且每周两次用100μl SFM喂养细胞。孵育14天后，使用BIOREVO显微镜(BZ-9000；Keyence)扫描并合并每个孔中的63个视野以显示整个孔图像。从图像计数或测量肿瘤球(>100μM)的数量或大小。为了确定球体形成活细胞的总数，通过离心收集球体并通过胰蛋白酶消化解离成单细胞悬浮液。将细胞用PBS洗涤两次，并用2μM钙黄绿素-AM染色1h，然后通过流式细胞术进行分析。
实施例1-抗LRP6 scFv的鉴定
为了抑制由Wnt配体与LRP6结合诱导的Wnt/β-连环蛋白信号传导，使用重组LRP6E1E2-Fc和LRP6E3E4-Fc融合物作为诱饵，通过噬菌体抗体展示产生与LRP6的E1E2和E3E4结构域结合的人scFv(图1A)。首先通过ELISA针对重组LRP6E1E2-和LRP6E3E4-Fc分子对选择输出进行筛选，然后通过FACS针对用全长人LRP6转染的HEK293细胞进行筛选(图7A)。使用纯化的噬菌体鉴定特异性结合物并研究它们调节Wnt诱导的β-连环蛋白信号传导的能力。观察到各种激动剂和拮抗剂活性，其中一些显示出对β-连环蛋白反应性萤光素酶SuperTopFlash(STF)报告基因活性的有效抑制(图1B)。源自噬菌体的可溶性重组scFv-Fc融合物显示出类似的活性。例如，产生作为scFv-Fc融合物的针对LRP6的E1E2结构域的E12N21scFv和针对LRP6的E3E4结构域的E34N19scFv，并且显示其分别强抑制Wnt1和Wnt3a诱导的STF报告基因活性(图1C)。测量了E34N19和E12N21scFv-Fc分子对表达LRP6的HEK293细胞的表观结合亲和力。估计E34N19和E12N21scFv-Fc的表观KD值分别为1.4nM和5.2nM(图7B和7C)。为了确定它们对Wnt诱导的β-连环蛋白信号传导的效力，用编码Wnt配体(Wnt3a或Wnt1)的质粒转染HEK293细胞，并与不同浓度的scFv-Fc(E34N19(对于Wnt3a)或E12N21(对于Wnt1))一起孵育。如图1D所示，scFv-Fc有效抑制β-连环蛋白信号传导，IC50值大约为3.0nM(对于E34N19scFv-Fc)和3.5nM(对于E12N21scFv-Fc)。因此确认了具有低纳摩尔表观结合亲和力的抗LRP6人单克隆抗体的产生及其对LRP6E1E2/Wnt1-和LRP6E3E4/Wnt3a介导的Wnt/β-连环蛋白信号传导的有效抑制。
实施例2-靶向LRP6(效应子)和肿瘤细胞表面抗原(指导物)的双特异性抗体的构建
设计了由抗LRP6E34N19scFv和以下每种抗指导物scFv组成的双特异性串联scFv-Fc(称为TaFv-Fc)：M10A12(抗ICAM-1)、RYR(抗EphA2)、H3(抗ALCAM)和PD32(与H3相比具有降低的亲和力的抗ALCAM)(图2A)。TaFv-Fc在还原条件下显示出约90kDa的预期分子量(图2A)。为了解释潜在的形式差异，我们还通过将抗ALCAM H3scFv与抗LRP6E34N19IgG的轻链C末端融合产生了双特异性IgG-scFv(bsIgG)(Orcutt)(图2B)。测试了双特异性H3/E34N19TaFv-Fc或E34N19/H3bsIgG与表达低水平LRP6但高水平ALCAM的HEK293细胞的结合(表1)。双特异性H3/E34N19TaFv-Fc和E34N19/H3bsIgG显示出与HEK293细胞的强结合，而单特异性E34N19scFv-Fc或IgG由于细胞表面上低水平的LRP6表达而弱结合(图7D)。单特异性抗ALCAM H3 IgG与HEK293强烈结合，与那些细胞上高水平的ALCAM表达一致(图7D)。在表达高水平的适当肿瘤相关指导物抗原的细胞上以这种方式测试了所有设计的双特异性抗体，并确认了其预期的结合模式和水平(类似于单特异性指导物抗体)(图7E)，表明指导物抗体组分在所有双特异性构建体中都有功能。
实施例3-双特异性抗LRP6/抗肿瘤抗体极大地增强了Wnt信号传导抑制的效力
接下来，进行STF报告基因抑制测定，以确定掺入指导物抗体组分的双特异性抗体是否能够比其单特异性对应物更有效地抑制Wnt信号传导。与单特异性E34N19scFv-Fc的STF报告基因抑制相比，靶向LRP6和ALCAM的双特异性TaFv-Fc(H3/E34N19和PD32/E34N19)都显示出显著更强的STF报告基因抑制，与单特异性E34N19的3.43nM相比，IC50分别是15.14pM(对于H3/E34N19)和118.8pM(对于PD32/E34N19)(图2C)。与PD32/E34N19相比，被H3/E34N19更有效的抑制(两者都结合ALCAM)可能是由于与PD32相比指导物抗体H3的更高的亲和力结合(细胞上的表观KD是7.34pM(对于H3)和387.5pM(对于PD32))。为了研究这种效应，测量了双特异性H3/E34N19和PD32/E34N19对HEK293细胞的表观KD。发现H3/E34N19的表观KD比PD32/E34N19的表观KD低约20倍(图8A和8B)，与相应mAb中观察到的亲和力差异一致。由于H3和PD32指导物抗体都结合相同的细胞表面靶标(ALCAM)，这可能表明双特异性形式的Wnt信号传导阻断效力至少部分地由指导物抗体的亲和力决定。与单特异性E34N19IgG相比，E34N19/H3bsIgG(不同的双特异性形式)也显示出显著的STF报告基因抑制作用，表明观察到的效力增强适用于不同的双特异性平台(图8C)。为了拓宽基于双特异性形式的效力增强的适用性，产生了由H3scFv(抗ALCAM)和抗LRP6E1E2E12N21scFv(Wnt1阻断剂)组成的H3/E12N21TaFv-Fc。H3/E12N21在抑制Wnt1诱导的报告基因活性方面的效力是单克隆E12N21的50倍(IC50为46.16pM对2.63nM)(图2D)，表明观察到的效力增强不是E34N19抗体独有的，而是普遍适用的。
实施例4-双特异性抗体的细胞类型选择性Wnt信号传导途径抑制
指导物抗原不仅提供增强的效力，而且更重要的是提供信号传导途径抑制的细胞类型特异性。HEK293细胞表达非常低水平的ICAM-1和EphA2，被认为是ICAM-1阴性/EphA2阴性。通过慢病毒转导产生表达EphA2的HEK293细胞系(命名为HEK293-EphA2)，并在Wnt信号传导阻断中将其用于评估单特异性或双特异性抗体。如图3A所示，双特异性抗EphA2/LRP6E3E4(RYR/E34N19)对Wnt3a诱导的信号传导的抑制在表达指导物抗原的HEK293-EphA2中比亲本HEK293细胞有效得多(325倍)(IC50为约4.15pM(对于HEK293-EphA2)对1.35nM(对于HEK293))。使用对照双特异性和单特异性抗体在HEK293细胞上进一步研究指导物抗原依赖性。如图3B所示，仅针对靶向指导物和效应子抗原的双特异性(RYR/E34N19)观察到有效的抑制作用，而针对(1)抗效应子mAb E34N19；(2)靶向指导物和效应子的mAb的单纯混合物(RYR+E34N19)；(3)不与指导物抗原结合的对照双特异性形式，即C10/E34N19(其中C10为非结合抗体)和M10A12/E34N19(其中M10A12与未被HEK293表达的ICAM-1结合)没有观察到。为了拓宽适用性，使用第二指导物抗原ICAM-1研究细胞类型特异性。用表达ICAM-1的质粒转染HEK293细胞以产生指导物抗原阳性细胞。如图3C所示，双特异性M10A12/E34N19有效抑制HEK293-ICAM-1中的Wnt信号传导，但不抑制HEK293细胞中的Wnt信号传导(IC50值1.13pM对1.18nM，差异为1,044倍)。还研究了对照双特异性和单特异性抗体(图3D)。显著的效力增强被认为取决于与指导物和效应子抗原结合的双特异性形式，并且针对(1)单特异性抗效应子抗体、(2)单特异性抗指导物和抗效应子抗体的单纯混合物、或(3)不与指导物抗原结合的对照双特异性形式(C10/E34N19和EphA2/E34N19，两者均不与表达指导物抗原ICAM-1或HEK293-ICAM-1的细胞结合)没有观察到显著的效力增强。
实施例5-指导物抗原表达水平影响双特异性形式介导的细胞类型特异性Wnt信号传导抑制的效力
接下来，寻求确定指导物抗原的细胞表面表达水平是否影响双特异性形式的效力。如上所述，HEK293细胞表达非常低水平的ICAM-1和EphA2，从而为使用表达不同水平的指导物抗原(ICAM-1或EphA2)的HEK293细胞研究这个问题创造了机会。首先，使用基于FACS的量化方法测量细胞表面抗原拷贝数，所述方法根据中值荧光强度(MFI)确定抗体结合能力(ABC，操作上定义的“抗原密度”)(表1)。进行STF报告基因Wnt信号传导抑制测定，并且在表达ICAM-1的不同细胞表面拷贝的HEK293细胞上测定双特异性M10A12/E34N19的IC50值：484,486(IC50＝1.13pM)、205,962(IC50＝3.76pM)、30,702(IC50＝16.89pM)和10,016(亲本HEK293，IC50＝1.18nM)(表2)。(为了比较，单特异性E34N19的EC50值为3.02nM，如先前在图1D中所示)这些数据显示在一些实施方案中，表达水平阈值(指导物抗原(ICAM-1)的约15,000-20,000个拷贝/细胞)可能为双特异性形式发挥报告基因抑制的协同有效增强所需。高于阈值，随着指导物抗原ICAM-1的拷贝数增加，效力提高(IC50值降低)。对指导物抗原表达水平的依赖性也显示在另一种测定中，其中将给定浓度的双特异性形式与表达不同量的指导物抗原ALCAM或EphA2的HEK293细胞一起孵育(细胞表面拷贝数测量值显示在表2中)。Pearson相关系数分析显示随着指导物抗原的细胞表面拷贝数增加，报告基因抑制的效力提高(图3E和3F)。指导物与效应子抗原密度的比率也显示在表2中。基于在这个实施例中研究的三种指导物抗原，通常优选的是指导物与效应子比>5-10，以在至少一些实施方案中实现效力增强2-3个数量级。
对于本领域普通技术人员容易清楚的是，能够产生双特异性抗体的所需有效水平的指导物抗原与效应子抗原之间的比率可以根据多种因素而变化，例如抗原的类型、靶细胞的一种或多种类型和一个或多个靶细胞周围的环境。考虑到本公开文本提供的指导以及本领域可用的技术，能够确定优选的比率。因此，足以导致双特异性抗体在调节信号传导途径中的所需效力的指导物抗原与效应子抗原之间的任何比率都在本公开文本的范围内。
还评估了指导物抗原密度对双特异性形式的表观KD的影响(表2)。对于ALCAM指导的双特异性形式，增加的指导物抗原密度与提高的效力一致。对于ICAM-1指导的双特异性形式，表观KD值随着指导物抗原密度的增加而降低，但是变化为约10倍，不足以解释效力的1,000倍增强。针对EphA2指导的双特异性形式观察到类似的结果。亲合力驱动的表观KD改善之外的其他机制可能是我们观察到的双特异性现象的原因。假设观察到的双特异性形式的效力增强可能是效应子抗原更有效占用的结果，因为它能够使指导物抗原在同一细胞上结合，这是“邻域”效应的物理基础。为了测试这种假设，在HEK293细胞上研究双特异性和单特异性形式的LRP6占用率。有趣的是，即使在低浓度(0.5nM)下，约80％的表面LRP6仍被双特异性H3/E34N19占用(图8D)。在相同浓度下，仅有约10％的LRP6被单特异性E34N19占用。实现效应子LRP6的50％占用率所需的浓度对于双特异性形式是约50pM，而对于单特异性形式是20nM，大于400倍的差异(图8D)。
总之，数据显示掺入指导物抗原靶向组分的双特异性抗体可以显著增强Wnt途径抑制的效力和特异性。这种现象可能是由双特异性形式诱导的效应子抗原的更高占用率介导的。对于给定的效应子抗原表达水平，总体抑制效力受(1)指导物抗原密度或指导物/效应子比(在一些实施方案中优选地>10:1)和(2)抗指导物抗体的亲和力的影响。在一些实施方案中，可能需要同时满足这两个条件，以便提供对双特异性抗体的效力的显著增强。在一些情况下，随着指导物抗原密度的增加，双特异性形式对靶细胞的表观结合亲和力增加；然而，同时增加可能不足以解释针对双特异性形式观察到的巨大IC50变化。对于所研究的三种指导物抗原，仅有基于ALCAM的双特异性形式显示出表观KD和IC50之间的同时改善。对于ICAM-1指导的双特异性形式，表观KD改善是适度的(约10倍)，而与单克隆抗效应子抗体相比，IC50值降低超过1,000倍。类似地，EphA2指导的双特异性形式的效力的急剧增加不能通过表观结合亲和力的适度改善来解释。这种现象可以通过指导物抗原密度显著影响双特异性形式对效应子抗原的占用的观点来解决。当指导物与效应子抗原密度的比率大于10:1时，双特异性形式的结合导致在远低于双特异性形式的表观KD的浓度下几乎完全的效应子抗原占用。指导物抗原似乎提供局部或社区效应，其中即使当指导物抗原本身仅被部分占用时，效应子抗原也完全且持续地被占用。仅当指导物和效应子抗原在同一靶细胞上以顺式存在时，才能看到这种社区效应，并且这种社区效应是双特异性抗体独有的，而不是单特异性抗体(即，寡克隆抗体)的混合物独有的。这个结果进一步突出了本公开文本的双特异性构型的关键性，这种双特异性构型对于表现出对单特异性抗体的单纯混合物无法实现的双特异性形式的特性的显著改善是必需的。
实施例6-内化指导物抗体通过细胞表面去除LRP6(效应子)抑制多配体Wnt信号传导
内化抗体可以导致细胞表面的受体耗尽，从而阻止配体结合和信号传导。在这个实施例中使用的抗EphA2scFv(RYR)通过巨胞饮作用迅速内化并有效地从细胞表面除去EphA2。在过表达EphA2的HEK293-EphA2细胞系上研究了双特异性RYR/E34N19的内化。RYR/E34N19快速且特异性地被HEK293-EphA2细胞内化，并且它将效应子抗原LRP6与指导物抗原EphA2一起拖入细胞中(图4A)。相比之下，双特异性H3/E34N19(其中H3是与由HEK293表达的指导物抗原ALCAM结合的缓慢内化抗体)主要在具有LRP6的细胞表面上检测到(图4A)。为了定量地评估由RYR/E34N19诱导的这种靶标特异性内化事件，在将HEK293-EphA2细胞与双特异性抗体一起孵育后，研究了效应子和指导物抗原的表面表达水平。如图4B所示，RYR/E34N19的孵育有效地降低了EphA2(指导物)和LRP6(效应子)的细胞表面拷贝数。针对结合缓慢内化指导物抗原(H3/E34N19)或不结合靶细胞表达的任何指导物抗原(C10/E34N19)的对照双特异性抗体没有观察到表面耗尽(图4B)。
效应子抗原的表面去除可以导致多配体作用的阻断。进行下一次研究以测试通过LRP6内化对Wnt1介导的信号传导的抑制是否将由结合LRP6上的Wnt3a结合位点(E3E4)和内化指导物EphA2的双特异性形式诱导。在Wnt1转染的HEK293-EphA2细胞上，H3/E12N21而非H3/E34N19有效抑制STF报告基因活性(图4C)。这与12/-21而非E34N19阻断Wnt-1介导的信号传导的观点一致。H3与难以内化的ALCAM结合，不会导致LRP6表面去除(如图4B所示)。相比之下，双特异性RYR/E34N19对Wnt-1诱导的信号传导显示出显著的抑制作用，即使它与E3E4结合但不与E1E2结构域结合并且不直接干扰Wnt1与LRP6的结合。这表明双特异性RYR/E34N19从细胞表面除去了效应子抗原LRP6，并且因此阻断由配体与效应子LRP6的不同区域结合引发的Wnt信号传导。
实施例7-双特异性设计在肿瘤细胞中对Wnt抑制的应用
超越HEK293模型系统，进行了实验，以确定双特异性指导物/效应子设计的原理是否适用于肿瘤细胞。首先，测试了表达效应子LRP6(7,341个拷贝/细胞，表1)和指导物ALCAM(874,813个拷贝/细胞，表1)的A549肺癌细胞系。双特异性(H3/E34N19和H3/E12N21)和单特异性(E34N19、E12N21和H3)抗体的细胞结合数据显示在图9A中。如补充图9B和9C所示，与单特异性E34N19或E12N21scFv-Fc的效力相比，双特异性H3/E34N19和H3/E12N21在抑制Wnt3a或Wnt1诱导的STF报告基因活性方面分别显示出更强的效力(>100倍)。还在与STF报告基因测定相同的条件下研究了双特异性和单特异性抗体对效应子LRP6的受体占用。类似于在HEK293占用研究中所发现的(图8D)，发现即使在低至0.1nM的浓度下，约85％的表面LRP6仍被双特异性H3/E34N19占用(图9D)。然而，单特异性E34N19在高100倍的浓度(10nM)下仅占用约50％，并且对照H3 IgG未显示出显著影响(图9D)。
为了将观察结果扩展到报告基因测定之外，接下来测试了双特异性抗体是否能以细胞类型选择性方式影响细胞功能。研究了双特异性H3/E34N19和单特异性E34N19对A549细胞中细胞核β-连环蛋白水平的影响。免疫荧光染色结果显示H3/E34N19处理显著减少了细胞核中的β-连环蛋白，并且其效果比单特异性E34N19更有效(图5A)。
由于经典的Wnt信号传导在增强癌症干细胞样细胞的自我更新能力中起重要作用(Holland)，因此还使用肿瘤球形成测定研究了双特异性抗体对ALCAM高细胞(A549和HEK293)的Wnt依赖性自我更新的抗原特异性作用。Wnt3a条件培养基(Wnt3a-CM)增强A549和HEK293细胞的球体形成能力(分别为图5B和图10A)。与单特异性E34N19相比，双特异性H3/E34N19对Wnt3a诱导的A549和HEK293球体生长显示出更强的抑制作用(图5B和图10A)。
除A549(和HEK293)外，还在表达效应子抗原LRP6和不同水平的指导物抗原ALCAM的结肠癌细胞系HCT116和HT29上进一步研究了对Wnt信号传导的双特异性形式介导的细胞类型选择性作用(708,341个拷贝/细胞(对于HCT116)和20,227个拷贝/细胞(对于HT29)，见表1)。如图10B所示，双特异性H3/E34N19特异性地降低了ALCAM高HCT116而非ALCAM低HT29细胞的球体形成能力，表明指导物抗原(ALCAM)在有效且具特异性的Wnt信号传导抑制中起重要作用。
除球体形成之外，还进行了刮擦伤口愈合迁移测定以确定双特异性形式的功能效果。用双特异性E34N19/H3bsIgG和单特异性E34N19IgG处理A549细胞。将端锚聚合酶抑制剂XAV939(Huang)用作阳性对照。与单特异性形式相比，Wnt3a诱导的A549细胞迁移优先地被双特异性形式更有效地抑制(与IC50＝3.53nM(对于单特异性E34N19)相比，IC50＝0.57nM(对于双特异性E34N19/H3))(图5C和图11)。
使用表达高水平的EphA2和ALCAM指导物抗原的PC3前列腺癌细胞系进行浸润测定。H3/E34N19和RYR/E34N19在低浓度(11nM)下均有效抑制PC3细胞的浸润(图5D)。
还使用过表达指导物抗原ALCAM的A549和HCT116肿瘤细胞研究了对Wnt3a依赖性细胞增殖的双特异性作用。在相同浓度(10μg/ml)下测试，与单特异性E34N19相比，双特异性H3/E34N19更有效(图12A针对A549，并且图6B针对HCT116)。H3/E34N19压制A549细胞中的LRP6磷酸化和细胞溶质β-连环蛋白积累，并下调β-连环蛋白/TCF复合物的靶基因c-Myc蛋白(图12C)。
总之，这些结果显示双特异性抗体抑制肿瘤细胞中的Wnt信号传导，从而影响体外β-连环蛋白活性、球体形成/克隆形成活性、迁移/浸润和癌细胞增殖，并且这种效应对表达指导物抗原的细胞具特异性。
实施例7-抗LRP6 bsAb有效地抑制由RSPO1诱导的另外的β-连环蛋白激活
已经显示RSPO1通过阻止DKK1/Kremen或RNF43/ZNRF3介导的细胞表面上LRP6的周转来刺激Wnt/β-连环蛋白信号传导。为了确定抗LRP6 bsAb是否可以拮抗RSPO1刺激的Wnt信号传导，将瞬时表达Wnt3a或Wnt1配体的HEK293细胞分别与RSPO1和抗LRP6E1E2/ALCAM(H3/E34N19)或抗LRP6E3E4/ALCAM(H3/E12N21)bsAb一起孵育。RSPO1放大了Wnt3a或Wnt1介导的报告基因活性(图6A)。然而，用H3/E34N19或H3/E12N21处理分别导致对Wnt3a/RSPO1或Wnt1/RSPO1诱导的报告基因反应的有效抑制(图6A)。ALCAM指导的双特异性H3/E34N19的IC50值为327pM(图13A)，但对照双特异性C10/E34N19的IC50值大于100nM。使用过表达指导物抗原EphA2的HEK293-EphA2系(亲本HEK293细胞系表达EphA2很差)，通过RSPO1诱导的Wnt信号传导获得双特异性作用的指导物抗原依赖性。在支持Wnt3a和RSPO1信号传导的条件下，双特异性抗EphA2/LRP6(RYR/E34N19)在HEK293-EphA2细胞中显示出有效的报告基因抑制(IC50＝9.0pM，图6B)，比在亲本HEK293细胞(IC50＝约50nM，图13A)中高5000多倍。此外，在HEK293-EphA2细胞上，RYR/E34N19(9.0pM)的效力比H3/E34N19高120倍(IC50 9.0pM对1.1nM，如图6B所示)，这归因于指导物抗原密度的差异(5,244,589(对于EphA2)对268,022(对于ALCAM)，表1)。EphA2也快速内化，与缓慢/非内化ALCAM指导的双特异性形式相比，其可以进一步增强EphA2指导的双特异性形式的效力。
超越对基于HEK293细胞的模型的报告基因测定并将发现扩展到肿瘤细胞，在A549癌细胞系上进一步研究了双特异性现象。如图6C所示，在用ALCAM指导的双特异性H3/E34N19而非对照双特异性C10/E34N19或单特异性E34N19处理后，Wnt3a/RSPO1诱导的STF报告基因活性被抑制。Western印迹分析还显示，与对照(C10/E34N19或E34N19处理)相比，H3/E34N19处理后RSPO1增强的磷酸化LRP6和细胞溶质β-连环蛋白的水平显著降低(图13B)。
为了将发现扩展到其他肿瘤细胞并且为了评估指导物抗原内化的影响，研究了表达相似水平的缓慢/非内化指导物抗原ALCAM和快速内化指导物抗原EphA2的前列腺癌PC3细胞的体外浸润测定(关于抗原密度，参见表1)。如图6D所示，ALCAM指导的双特异性H3/E34N19和EphA2指导的双特异性RYR/E34N19均抑制PC3细胞浸润。有趣的是，内化的EphA2指导的RYR/E34N19显示出比缓慢/非内化的ALCAM指导的H3/E34N19更有效的抑制作用，表明LRP6的细胞表面去除是减少RSPO1刺激的Wnt信号传导的重要参数。这些结果表明双特异性抗LRP6抗体可以抑制RSPO1介导的Wnt信号传导放大和下游事件(如肿瘤细胞浸润)，其中指导物抗原提供细胞类型特异性和效力增强。内化抗指导物抗体在从细胞表面去除效应子抗原方面更有效，从而导致与非内化双特异性形式相比更高的效力。
至少上述实施例证明指导物抗原密度以两种方式影响双特异性形式的行为：(1)随着指导物抗原密度增加，双特异性形式对靶细胞的表观结合亲和力增加。然而，同时增加不足以解释针对双特异性形式观察到的巨大IC50变化。对于所研究的三种指导物抗原，仅有基于ALCAM的双特异性形式显示出表观KD和IC50之间的同时改善。对于ICAM-1指导的双特异性形式，表观KD改善是适度的(约10倍)，而与单克隆抗效应子抗体相比，IC50值降低超过1,000倍。类似地，EphA2指导的双特异性形式的效力的急剧增加不能通过表观结合亲和力的适度改善来解释。(2)指导物抗原密度显著影响双特异性形式对效应子抗原的占用。当指导物与效应子抗原密度的比率大于10:1时，双特异性形式的结合导致在远低于双特异性形式的表观KD的浓度下几乎完全的效应子抗原占用。指导物抗原似乎提供局部或社区效应，其中即使当指导物抗原本身仅被部分占用时，效应子抗原也完全且持续地被占用。仅当指导物和效应子抗原在同一靶细胞上以顺式存在时，才能看到这种社区效应，并且这种社区效应是双特异性抗体独有的，而不是单克隆抗体(即，寡克隆抗体)的混合物独有的。
在所述实施例中，根据本公开文本的指导物-效应子系统测试的双特异性抗体具有在同一靶细胞上共同呈递的指导物和效应子抗原。当满足一组条件(即，指导物与效应子比和指导物的表达水平阈值)时，双特异性抗体可以实现对效应子抗原介导的信号传导的显著协同效应，这归因于双特异性形式的有效且持久的效应子抗原占用。在所述实施例中，测试了两种不同的双特异性形式串联scFv-Fc和IgG-scFv，发现针对两者均观察到双特异性现象，表明本公开文本的指导物/效应子设计不受形式限制，应该是适用于其他双特异性形式的。
如上述实施例中所证明，本公开文本的指导物/效应子双特异性设计使得能够进行细胞类型选择性信号传导途径调节，并且应该有助于更有选择性地且有效地抑制对例如肿瘤发生至关重要的信号传导途径的新疗法的开发。上述实施例集中于Wnt信号传导途径作为模型系统，但所述途径可以普遍适用于任何信号传导途径。根据本公开文本的途径允许双特异性抗体的模块化开发，目的是实现对靶细胞(例如肿瘤)的最大作用，而对正常细胞没有作用或作用最小。以上实施例选择ALCAM、ICAM-1和EphA2作为模型指导物抗原来说明原理。对每种指导物抗原的效应阈值表明不需要绝对特异性，因为所述系统可以耐受指导物抗原的某种水平的正常组织表达。取决于效应子抗原的性质和特定的疾病应用，其他肿瘤特异性或细胞类型选择性细胞表面分子可以用作指导物抗原。因此，本公开文本提供了关于细胞表面指导物抗原密度与双特异性形式的效力和特异性之间的关系的新发现。
实施例8-表
表1描绘了在每种细胞系上表达的抗原密度的总结。
表2描绘了细胞模型上的指导物抗原密度和指导物/效应子比以及每种指导的bsAb的表观KD和抗Wnt信号传导活性(IC50)的总结。
在表3-表5中，阴影区域分别表示CDR1(用单线加下划线)、CDR2(用双线加下划线)和CDR3(用虚线加下划线)。表3描绘了与LRP6的E1E2结构域结合的scFv片段的肽序列。
表4描绘了与LRP6的E3E4结构域结合的scFv片段的肽序列。
表5描绘了与各种非限制性示例性指导物抗原结合的scFv片段的肽序列。
实施例9-双特异性形式不影响不表达指导物抗原或表达低水平的指导物抗原的正常细胞中的wnt信号传导
为了扩展关于细胞类型选择性和功能特异性的研究，我们接下来研究了双特异性形式对两种正常细胞系MC3T3-E1(小鼠前成骨细胞系)和C3H/10T1/2(小鼠间充质干细胞系)的影响，所述细胞系通常用于研究由Wnt信号传导控制的成骨细胞分化。我们首先证明了我们的抗效应子(针对LRP6E3E4的E3E4N19)和抗指导物(针对EphA2的RYR)抗体结合鼠和人靶标(图15A和15B)。我们接下来确定MC3T3-E1和C3H/10T1/2细胞均表达低水平的指导物抗原EphA2并且低的指导物与效应子比(图15C和15D)。我们然后进行了STF报告基因测定，并且发现EphA2指导的RYR/E34N19不影响两种细胞系中的wnt信号传导(图15E和15F)，证明双特异性形式是细胞类型选择性的，并且在不表达指导物抗原或表达低水平的指导物抗原的正常细胞中不抑制wnt信号传导。
尽管在本文示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员来说清楚的是，此类实施方案仅通过举例的方式提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应该理解的是，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实践本发明。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。
序列表
<110> LIU, Bin
LEE, Nam-Kyung
SU, Yang
BIDLINGMAIER, Scott
<120> 工程化抗体及其用途
<130> 48536-594001WO
<140> 尚未分配
<141> 2017-11-17
<150> 62/424,337
<151> 2016-11-18
<160> 121
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成序列-E12N21 VH
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-E12N21 VL
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N21
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N12EQV VH
<400> 14
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gln Phe Asn Trp Asn Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N12EQV VL
<400> 15
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Asn Ser Tyr Ala
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Ile Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Lys Ser Gly Asp Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Gly
85 90 95
Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 16
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N12EQV
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gln Phe Asn Trp Asn Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr
130 135 140
Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr
145 150 155 160
Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Asn Ser Tyr Ala Asn Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Ile Arg
180 185 190
Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asp Thr
195 200 205
Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
210 215 220
Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Gly Met Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 17
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N13 VH
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Pro Arg Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N13 VL
<400> 18
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Ser Asp Ser Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Val Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 19
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N13
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Pro Arg Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro
130 135 140
Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly
145 150 155 160
Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ser Asp Ser Arg
180 185 190
Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser
195 200 205
Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Val Val Val Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 20
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N1 VH
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Gly Gly Asp Pro Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Ser Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Lys Leu Thr Gly Asp Pro Ala Thr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Ser Thr Leu Val Thr Val Pro Ser
115 120
<210> 21
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N1 VL
<400> 21
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Glu Asp Lys Tyr Ala
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Arg Asp Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asn Ser Val Arg Gly
85 90 95
Ser Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210> 22
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N1
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Gly Gly Asp Pro Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Ser Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Lys Leu Thr Gly Asp Pro Ala Thr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Ser Thr Leu Val Thr Val Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro
130 135 140
Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly
145 150 155 160
Asp Asn Leu Glu Asp Lys Tyr Ala Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Arg Asp Thr Lys Arg Pro Ser Gly
180 185 190
Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu
195 200 205
Ala Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Ser Tyr Asp Asn Ser Val Arg Gly Ser Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr
225 230 235 240
Lys Val Thr Val Leu
245
<210> 23
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N11 VH
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu His
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Pro Val Phe Lys Ser Pro Ser Ile Ala Gly Leu Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N11 VL
<400> 24
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Asn Ser Tyr Ala
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Ala Lys Thr Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asn Ser Leu Arg Gly
85 90 95
Ser Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 25
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N11
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu His
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Pro Val Phe Lys Ser Pro Ser Ile Ala Gly Leu Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr
130 135 140
Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr
145 150 155 160
Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Asn Ser Tyr Ala Asn Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Ala Lys Thr Asn Arg
180 185 190
Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr
195 200 205
Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asn Ser Leu Arg Gly Ser Arg Val Phe Gly
225 230 235 240
Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 26
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N11R VH
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu His
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Arg
85 90 95
Ala Lys Asp Pro Val Phe Lys Ser Pro Ser Ile Ala Gly Leu Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N11R VL
<400> 27
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Asn Ser Tyr Ala
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Ala Lys Thr Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asn Ser Leu Arg Gly
85 90 95
Ser Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 28
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N11R
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu His
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Arg
85 90 95
Ala Lys Asp Pro Val Phe Lys Ser Pro Ser Ile Ala Gly Leu Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr
130 135 140
Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr
145 150 155 160
Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Asn Ser Tyr Ala Asn Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Ala Lys Thr Asn Arg
180 185 190
Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr
195 200 205
Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asn Ser Leu Arg Gly Ser Arg Val Phe Gly
225 230 235 240
Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 29
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N35 VH
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Pro Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly Leu Phe Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N35 VL
<400> 30
Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr
1 5 10 15
Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly
35 40 45
Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp
65 70 75 80
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Tyr Val
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 31
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N35
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Pro Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly Leu Phe Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro
130 135 140
Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly
145 150 155 160
Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly
180 185 190
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu
195 200 205
Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn
210 215 220
Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Thr Val Leu
<210> 32
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N39 VH
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Pro Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Pro Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly Leu Leu Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N39 VL
<400> 33
Ser Glu Leu Thr His Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr
1 5 10 15
Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly
35 40 45
Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp
65 70 75 80
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Tyr Val
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 34
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 - E12N39
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Pro Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Pro Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly Leu Leu Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr His Asp Pro
130 135 140
Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly
145 150 155 160
Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly
180 185 190
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu
195 200 205
Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn
210 215 220
Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Thr Val Leu
<210> 35
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N45 VH
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ser Ser Gly Trp Pro Arg Ala Glu Tyr Phe Gln His Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N45 VL
<400> 36
Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Pro
1 5 10 15
Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly
35 40 45
Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Asp Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp
65 70 75 80
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Arg His
85 90 95
Ser Asn Tyr Val Phe Gly Ile Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 37
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N45
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ser Ser Gly Trp Pro Arg Ala Glu Tyr Phe Gln His Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro
130 135 140
Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Pro Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly
145 150 155 160
Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly
180 185 190
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asp Thr Ala Ser Leu
195 200 205
Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn
210 215 220
Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Arg His Ser Asn Tyr Val Phe Gly Ile
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245
<210> 38
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N45T VH
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ser Ser Gly Trp Pro Arg Ala Glu Tyr Phe Gln His Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N45T VL
<400> 39
Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Pro
1 5 10 15
Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly
35 40 45
Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Asp Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp
65 70 75 80
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Arg His
85 90 95
Ser Asn Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 40
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E12N45T
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ser Ser Gly Trp Pro Arg Ala Glu Tyr Phe Gln His Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro
130 135 140
Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Pro Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly
145 150 155 160
Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly
180 185 190
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asp Thr Ala Ser Leu
195 200 205
Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn
210 215 220
Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Arg His Ser Asn Tyr Val Phe Gly Thr
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245
<210> 41
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N19 VH
<400> 41
Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Arg Gly His Gly Gly Asn Ser Gly Trp Val Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 - E34N19 VL
<400> 42
Gln Ser Val Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Thr Tyr Tyr Thr
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Leu Tyr
35 40 45
Ala Asn Thr His Arg Pro Ser Ser Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Tyr
85 90 95
Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 43
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N19
<400> 43
Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Arg Gly His Gly Gly Asn Ser Gly Trp Val Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Asp
130 135 140
Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Lys Ile Thr Cys Gln
145 150 155 160
Gly Asp Ser Leu Arg Thr Tyr Tyr Thr Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Leu Tyr Ala Asn Thr His Arg Pro Ser
180 185 190
Ser Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Ala Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
210 215 220
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Thr Val Leu
<210> 44
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N19EQV VH
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Arg Gly His Gly Gly Asn Ser Gly Trp Val Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N19EQV VL
<400> 45
Gln Ser Val Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Thr Tyr Tyr Thr
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Leu Tyr
35 40 45
Ala Asn Thr His Arg Pro Ser Ser Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Tyr
85 90 95
Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 46
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N19EQV
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Arg Gly His Gly Gly Asn Ser Gly Trp Val Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Asp
130 135 140
Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Lys Ile Thr Cys Gln
145 150 155 160
Gly Asp Ser Leu Arg Thr Tyr Tyr Thr Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Leu Tyr Ala Asn Thr His Arg Pro Ser
180 185 190
Ser Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Ala Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
210 215 220
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Thr Val Leu
<210> 47
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N1 VH
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Met Ser Val Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Asp Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 48
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N1 VL
<400> 48
Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr
1 5 10 15
Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly
35 40 45
Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp
65 70 75 80
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 49
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N1
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Met Ser Val Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Asp Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala
130 135 140
Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp
145 150 155 160
Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
165 170 175
Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr
195 200 205
Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser
210 215 220
Arg Asp Ser Ser Gly Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
225 230 235 240
Val Leu
<210> 50
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N2 VH
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Phe Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Arg Tyr Ser Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N2 VL
<400> 51
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Asn
85 90 95
Tyr Ser Trp Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 52
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N2
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Phe Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Arg Tyr Ser Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser
130 135 140
Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val
145 150 155 160
Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala
165 170 175
Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser
180 185 190
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile
195 200 205
Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr
210 215 220
Ala Gly Asn Tyr Ser Trp Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val
225 230 235 240
Leu
<210> 53
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N3 VH
<400> 53
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Thr Pro Glu Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N3 VL
<400> 54
Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr
1 5 10 15
Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Lys Ser Tyr Tyr Ala Ser
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly
35 40 45
Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp
65 70 75 80
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Leu
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 55
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N3
<400> 55
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Thr Pro Glu Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val
130 135 140
Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Lys
145 150 155 160
Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val
165 170 175
Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly
195 200 205
Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser
210 215 220
Ser Gly Asn His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
225 230 235 240
<210> 56
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N4 VH
<400> 56
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Tyr Asp Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 57
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N4 VL
<400> 57
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 58
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N4
<400> 58
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Tyr Asp Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
130 135 140
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile
145 150 155 160
Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
165 170 175
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
195 200 205
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser
210 215 220
Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N5 VH
<400> 59
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Ala Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Asp Tyr Pro Tyr Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 60
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 60
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Ala Gly
20 25 30
Phe Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
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<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N5
<400> 61
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Ala Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Asp Tyr Pro Tyr Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser
130 135 140
Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser
145 150 155 160
Asn Val Gly Ala Gly Phe Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly
165 170 175
Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly
180 185 190
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu
195 200 205
Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Val Thr Val Leu
<210> 62
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 62
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Gly Pro Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Tyr Lys Asn Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Lys Glu Gly Pro Asn Ser Gly Tyr Phe Asp Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 63
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N6 VL
<400> 63
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Ile Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N6
<400> 64
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Gly Pro Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Tyr Lys Asn Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Lys Glu Gly Pro Asn Ser Gly Tyr Phe Asp Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
145 150 155 160
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu
180 185 190
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 65
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N7 VH
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Ser Ser Ser Tyr Pro Ile Ala Ala Arg Arg Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 66
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N7 VL
<400> 66
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Phe Asp Val Ser Asp Arg Pro Ser Arg Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Asn
85 90 95
Asn Asn Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 67
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N7
<400> 67
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Ser Ser Ser Tyr Pro Ile Ala Ala Arg Arg Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser
145 150 155 160
Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn
165 170 175
Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Ile
180 185 190
Ile Phe Asp Val Ser Asp Arg Pro Ser Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln
210 215 220
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Asn Asn
225 230 235 240
Asn Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<210> 68
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N8 VH
<400> 68
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 69
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N8 VL
<400> 69
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Gly Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Glu Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 70
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N8
<400> 70
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Gln Thr Ile Gly Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Thr
165 170 175
Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu
180 185 190
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys
<210> 71
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N9 VH
<400> 71
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Ser Gly Tyr Ser Tyr Gly Tyr Val Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 72
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N9 VL
<400> 72
Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Met Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr
1 5 10 15
Val Asn Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Arg Tyr Phe Pro Ser
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Leu Tyr Gly
35 40 45
Arg Asn Thr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Asn
50 55 60
Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp
65 70 75 80
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ser Arg Gly Ser Ser Gly Thr His Leu
85 90 95
Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 73
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N9
<400> 73
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Ser Gly Tyr Ser Tyr Gly Tyr Val Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala
130 135 140
Met Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Asn Ile Thr Cys Gln Gly Asp
145 150 155 160
Ser Leu Arg Arg Tyr Phe Pro Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
165 170 175
Ala Pro Val Leu Val Leu Tyr Gly Arg Asn Thr Arg Pro Ser Gly Ile
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Thr
195 200 205
Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ser
210 215 220
Arg Gly Ser Ser Gly Thr His Leu Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Thr Val Leu
<210> 74
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N11 VH
<400> 74
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ser Ile Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 75
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N11 VL
<400> 75
Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr
1 5 10 15
Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Phe Asp Ala Ser
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Tyr Gly
35 40 45
Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp
65 70 75 80
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Arg Asp Ser Arg Gly Asn His Leu
85 90 95
Ala Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 76
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N11
<400> 76
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val
130 135 140
Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser
145 150 155 160
Leu Arg Ser Phe Asp Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
165 170 175
Pro Val Val Val Ile Tyr Gly Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro
180 185 190
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile
195 200 205
Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Arg
210 215 220
Asp Ser Arg Gly Asn His Leu Ala Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Thr Val Leu
<210> 77
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N12 VH
<400> 77
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Met Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Arg Ala Lys Ile Ala Ala Arg Ala Gln Gly Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser
115 120
<210> 78
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N12 VL
<400> 78
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
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50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Ser Ser
85 90 95
Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210> 79
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N12
<400> 79
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Met Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Arg Ala Lys Ile Ala Ala Arg Ala Gln Gly Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr
130 135 140
Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser
145 150 155 160
Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Asn
180 185 190
Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
195 200 205
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
210 215 220
Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly
225 230 235 240
Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245
<210> 80
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N13 VH
<400> 80
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Lys Arg Gly Glu Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Gly Pro Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 81
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N13 VL
<400> 81
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 82
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N13
<400> 82
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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Ala Ser Lys Arg Gly Glu Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Gly Pro Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln
130 135 140
Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys
145 150 155 160
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Ser
180 185 190
Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
195 200 205
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
210 215 220
Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Val Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245
<210> 83
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N14 VH
<400> 83
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 84
Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr
1 5 10 15
Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Lys Ser Tyr Tyr Ala Ser
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Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His Leu
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Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 85
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp
130 135 140
Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln
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Gly Asp Ser Leu Lys Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
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Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser
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Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
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His Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His Leu Arg Val Phe Gly Gly Gly
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Thr Lys Val Thr Val Leu
245
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<211> 123
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<220>
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Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly
35 40 45
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50 55 60
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Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His Leu
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Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
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<220>
<223> 合成序列 - E34N14M
<400> 88
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20 25 30
Ala Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp
130 135 140
Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln
145 150 155 160
Gly Asp Ser Leu Lys Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Glu Asn Ser Arg Pro Ser
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Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
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His Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His Leu Arg Val Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Thr Val Leu
245
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<211> 121
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 89
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N15 VL
<400> 90
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Ser Phe Thr
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Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Val Thr Val Leu
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<210> 91
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 91
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ala Ile Thr Gly Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro
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Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
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Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
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Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Pro Ala Ser Thr Leu Gln Ser
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Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr
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Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Leu Gln Asp Tyr Asn Ser Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Val
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Thr Val Leu
<210> 92
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N20 VH
<400> 92
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Asn Lys Tyr
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N20 VL
<400> 93
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
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20 25 30
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Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
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Leu Ser Val Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
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<210> 94
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N20
<400> 94
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Asn Lys Tyr
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln
130 135 140
Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys
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Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr
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Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Ser
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Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
195 200 205
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
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Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Val Val Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245
<210> 95
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N22 VH
<400> 95
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<210> 96
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N22 VL
<400> 96
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65 70 75 80
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<210> 97
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N22
<400> 97
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Leu Trp Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser
130 135 140
Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser
145 150 155 160
Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly
165 170 175
Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly
180 185 190
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu
195 200 205
Ala Ile Thr Gly Leu Leu Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln
210 215 220
Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Val Thr Val Leu
<210> 98
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N26C VH
<400> 98
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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85 90 95
Ala Arg Gly Ala Arg Gly Asn Tyr Val Ser Asn Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 99
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N26C VL
<400> 99
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
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35 40 45
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100 105 110
<210> 100
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N26C
<400> 100
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
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Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Arg Gly Asn Tyr Val Ser Asn Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro
130 135 140
Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr
145 150 155 160
Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Val Ser Gln
180 185 190
Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Asp Asn
195 200 205
Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu Arg Ala Glu Asp Glu Ala Asp
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Asn Trp Val Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245
<210> 101
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N26R VH
<400> 101
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Arg Gly Asn Tyr Val Ser Asn Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 102
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N26R VL
<400> 102
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Asp Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Arg Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Arg Ser Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Asn Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 103
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - E34N26R
<400> 103
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Arg Gly Asn Tyr Val Ser Asn Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro
130 135 140
Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr
145 150 155 160
Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Val Ser Gln
180 185 190
Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Asp Asn
195 200 205
Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu Arg Ala Glu Asp Glu Ala Asp
210 215 220
Tyr Tyr Arg Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Asn Trp Val Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245
<210> 104
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - H3 VH
<400> 104
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Arg Ser Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 105
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - H3 VL
<400> 105
Asn Phe Met Leu Thr Gln Asn Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210> 106
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - H3
<400> 106
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Arg Ser Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Asn Pro Ala Val Ser Val Ala Leu
130 135 140
Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
145 150 155 160
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val
165 170 175
Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
180 185 190
Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln
195 200 205
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly
210 215 220
Asn Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
225 230 235
<210> 107
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - 58541 (H3 variant1) VH
<400> 107
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Arg Ser Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 108
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - 58541 (H3 variant1) VL
<400> 108
Asn Phe Met Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210> 109
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - 58541 (H3 variant1)
<400> 109
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Arg Ser Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu
130 135 140
Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
145 150 155 160
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val
165 170 175
Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
180 185 190
Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln
195 200 205
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly
210 215 220
Asn Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
225 230 235
<210> 110
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - 58541.1 (H3 variant2) VH
<400> 110
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Arg Ser Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 111
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - 58541.1 (H3 变体2) VL
<400> 111
Asn Phe Met Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210> 112
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - 58541.1 (H3 变体2)
<400> 112
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Arg Ser Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu
130 135 140
Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
145 150 155 160
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val
165 170 175
Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
180 185 190
Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln
195 200 205
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly
210 215 220
Asn Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
225 230 235
<210> 113
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - PD32 VH
<400> 113
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Leu Ile Ala Ser His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 114
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - PD32 VL
<400> 114
Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr
1 5 10 15
Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly
35 40 45
Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp
65 70 75 80
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Ile His Leu
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 115
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - PD32
<400> 115
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Leu Ile Ala Ser His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly
130 135 140
Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr
145 150 155 160
Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile
165 170 175
Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala
195 200 205
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Ile
210 215 220
His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
225 230 235
<210> 116
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - M10A12 VH
<400> 116
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Arg Tyr Ser Ser Asn Trp Phe Ser Tyr Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 117
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - M10A12 VL
<400> 117
Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr
1 5 10 15
Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Ile Tyr Gly
35 40 45
Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Asn Thr Ala Phe Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp
65 70 75 80
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Pro
85 90 95
Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210> 118
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - M10A12
<400> 118
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Arg Tyr Ser Ser Asn Trp Phe Ser Tyr Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu
130 135 140
Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg
145 150 155 160
Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Ile Tyr Gly Glu Asn
180 185 190
Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly
195 200 205
Asn Thr Ala Phe Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala
210 215 220
Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Pro Gly Val
225 230 235 240
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245 250
<210> 119
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - RYR VH
<400> 119
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Arg Leu Pro Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Pro Asn Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 120
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - RYR VL
<400> 120
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 121
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - RYR
<400> 121
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Arg Leu Pro Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Pro Asn Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val
130 135 140
Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr
145 150 155 160
Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val
165 170 175
His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu
210 215 220
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly
225 230 235 240
His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250

Claims (80)

1.一种工程化抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区与在细胞表面上表达的指导物抗原结合且所述第二抗原结合区与在相同细胞表面上表达的效应子抗原结合，并且其中所述指导物抗原的特征在于密度比所述效应子抗原的密度高至少四倍。
2.权利要求1的工程化抗体，其中所述指导物抗原的特征在于密度比所述效应子抗原的密度高至少五倍。
3.权利要求1的工程化抗体，其中所述指导物抗原的特征在于密度比所述效应子抗原的密度高至少十倍。
4.权利要求1的工程化抗体，其中所述指导物抗原的特征还在于在细胞表面上至少15,000个拷贝的表达。
5.权利要求1的工程化抗体，其中所述指导物抗原的特征还在于在细胞表面上至少20,000个拷贝的表达。
6.一种工程化抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区与在细胞表面上表达的指导物抗原结合且所述第二抗原结合区与在相同细胞表面上表达的效应子抗原结合，并且其中所述指导物抗原的特征在于在细胞表面上至少15,000个拷贝的表达。
7.权利要求6的工程化抗体，其中所述指导物抗原的特征在于在细胞表面上至少20,000个拷贝的表达。
8.权利要求6的工程化抗体，其中所述指导物抗原的特征在于密度比所述效应子抗原的密度高至少四倍。
9.权利要求6的工程化抗体，其中所述指导物抗原的特征还在于密度比所述效应子抗原的密度高至少五倍。
10.权利要求6的工程化抗体，其中所述指导物抗原的特征还在于密度比所述效应子抗原的密度高至少十倍。
11.权利要求1-10中任一项的工程化抗体，其中所述工程化抗体与所述效应子抗原的结合导致所述细胞中信号传导途径的调节。
12.权利要求11的工程化抗体，其中所述信号传导途径选自AKT途径，c-MET途径，NF-kB途径，Notch信号传导途径，p53途径，Ras-Raf-MEK-ERK途径，STAT信号传导途径，Wnt信号传导途径，YAP/Wnt信号传导途径，包括但不限于表皮生长因子受体(EGFR)家族、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族、胰岛素样生长因子受体(IGFR)家族、血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族和血小板源性生长因子受体(PDGFR)家族的受体酪氨酸激酶(RTK)信号传导途径家族，NK(自然杀伤)激活途径，NK抑制途径，巨噬细胞调节途径，树突细胞调节途径，T细胞调节途径和检查点抑制途径。
13.权利要求11或12的工程化抗体，其中所述信号传导途径是Wnt信号传导途径。
14.权利要求1-13中任一项的工程化抗体，其中所述效应子抗原是肿瘤抗原。
15.权利要求1-14中任一项的工程化抗体，其中所述效应子抗原是肿瘤相关抗原。
16.一种包含第一抗原结合区和第二抗原结合区的工程化抗体，其中所述第一抗原结合区结合靶细胞表面上的效应子抗原，其中所述效应子抗原与信号传导途径相关且所述第二抗原结合区结合所述靶细胞表面上的指导物抗原，其中所述靶细胞中所述指导物抗原的密度显著高于所述效应子抗原的密度，并且其中所述双特异性抗体与所述靶细胞的结合导致所述靶细胞中信号传导途径的调节。
17.权利要求16的工程化抗体，其中所述工程化抗体是双特异性抗体。
18.权利要求17的双特异性抗体，其中与使用对所述效应子抗原单特异性的抗体时所述效应子抗原的占用率水平相比，使用所述双特异性抗体时所述效应子抗原的占用率水平较高。
19.权利要求17的双特异性抗体，其中所述抗体选自M10A12、RYR、H3和PD32。
20.权利要求17-18中任一项的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合区包含表5中列出的序列和/或其任何片段。
21.权利要求17-18中任一项的双特异性抗体，其中所述靶细胞中所述指导物抗原与所述效应子抗原的密度比为约5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
22.权利要求17-18中任一项的双特异性抗体，其中存在于所述靶细胞表面上的指导物抗原的表达水平阈值的范围为每个细胞约15,000与约20,000个拷贝之间。
23.权利要求17-18中任一项的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合区包含与肿瘤特异性抗原结合的单链可变片段(scFv)。
24.权利要求1-17中任一项的工程化抗体，其中所述效应子抗原是LRP6。
25.权利要求1-18中任一项的工程化抗体，其中所述第一抗原结合区包含含有三个互补决定区(CDR)的重链可变区，其中来自所述重链可变区的CDR选自表3或表4。
26.权利要求1-19中任一项的工程化抗体，其中所述第一抗原结合区包含含有三个互补决定区(CDR)的轻链可变区，其中来自所述轻链可变区的CDR选自表3或表4。
27.权利要求1-20中任一项的工程化抗体，其中所述第一抗原结合区包含含有三个互补决定区(CDR)的重链可变区和含有三个互补决定区(CDR)的轻链可变区，其中来自所述重链可变区的CDR和来自所述轻链可变区的CDR选自表3或表4。
28.权利要求1-21中任一项的工程化抗体，其中所述第一抗原结合区包含重链可变区，所述重链可变区与选自表3或表4的重链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。
29.权利要求1-22中任一项的工程化抗体，其中所述第一抗原结合区包含轻链可变区，所述轻链可变区与选自表3或表4的轻链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。
30.权利要求1-23中任一项的工程化抗体，其中所述第一抗原结合区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与选自表3或表4的重链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性，所述轻链可变区与选自表3或表4的轻链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。
31.权利要求1-24中任一项的工程化抗体，其中所述第一抗原结合区包含含有选自表3或表4的序列的重链可变区和含有选自表3或表4的序列的轻链可变区。
32.权利要求1-25中任一项的工程化抗体，其中所述指导物抗原是细胞类型选择性细胞表面抗原。
33.权利要求1-26中任一项的工程化抗体，其中所述指导物抗原是肿瘤相关抗原。
34.权利要求1-26中任一项的工程化抗体，其中所述指导物抗原是肿瘤特异性抗原。
35.权利要求1-34中任一项的工程化抗体，其中所述第二抗原结合区包含含有三个互补决定区(CDR)的重链可变区，其中来自所述重链可变区的CDR选自表5。
36.权利要求1-38中任一项的工程化抗体，其中所述第二抗原结合区包含含有三个互补决定区(CDR)的轻链可变区，其中来自所述轻链可变区的CDR选自表5。
37.权利要求1-36中任一项的工程化抗体，其中所述第二抗原结合区包含含有三个互补决定区(CDR)的重链可变区和含有三个互补决定区(CDR)的轻链可变区，其中来自所述重链可变区的CDR和来自所述轻链可变区的CDR选自表5。
38.权利要求1-36中任一项的工程化抗体，其中所述第二抗原结合区包含重链可变区，所述重链可变区与选自表5的重链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。
39.权利要求1-36中任一项的工程化抗体，其中所述第二抗原结合区包含轻链可变区，其与选自表5的轻链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。
40.权利要求1-36中任一项的工程化抗体，其中所述第二抗原结合区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与选自表5的重链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性，所述轻链可变区与选自表5的轻链可变序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。
41.权利要求1-40中任一项的工程化抗体，其中所述第二抗原结合区包含含有选自表5的序列的重链可变区和含有选自表5的序列的轻链可变区。
42.权利要求17的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体与所述靶细胞的结合导致所述信号传导途径的下调。
43.权利要求17的双特异性抗体，其中与对所述效应子抗原单特异性的抗体的IC50值相比，所述双特异性抗体的IC50值降低至少100倍。
44.一种药物组合物，其包含权利要求1-43的工程化抗体和赋形剂。
45.权利要求44的药物组合物，其中所述工程化抗体被配制用于肠胃外给予。
46.一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者给予治疗有效量的权利要求1-43的工程化或双特异性抗体。
47.权利要求46的方法，其中所述疾病或病症与所述细胞中信号传导途径的调节异常有关。
48.权利要求46的方法，其中所述信号传导途径选自AKT途径，c-MET途径，NF-kB途径，Notch信号传导途径，p53途径，Ras-Raf-MEK-ERK途径，STAT信号传导途径，Wnt信号传导途径，YAP/Wnt信号传导途径，包括但不限于表皮生长因子受体(EGFR)家族、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族、胰岛素样生长因子受体(IGFR)家族、血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族和血小板源性生长因子受体(PDGFR)家族的受体酪氨酸激酶(RTK)信号传导途径家族，NK(自然杀伤)激活途径，NK抑制途径，巨噬细胞调节途径，树突细胞调节途径，T细胞调节途径和检查点抑制途径。
49.一种产生工程化抗体的方法，其包括：
a)选择在细胞表面上表达多种指导物抗原和效应子抗原的细胞；
b)确定所述多种指导物抗原与效应子抗原的密度比；以及
c)如果所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少4:1，则制备包含与所述指导物抗原结合的第一抗原结合区和与所述细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区的工程化抗体。
50.权利要求49的方法，其中所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少5:1。
51.权利要求49-50中任一项的方法，其中所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少10:1。
52.权利要求49-51中任一项的方法，其中所述细胞在细胞表面上表达所述指导物抗原的至少15,000或更多个拷贝。
53.权利要求49-52中任一项的方法，其中所述细胞在细胞表面上表达所述指导物抗原的至少20,000或更多个拷贝。
54.一种产生工程化抗体的方法，其包括：
a)选择在细胞表面上表达多种指导物抗原和效应子抗原的细胞；
b)确定细胞表面上表达的所述指导物抗原的拷贝数；以及
c)如果所述细胞表达所述指导物抗原的至少15,000个拷贝，则制备包含与所述指导物抗原结合的第一抗原结合区和与所述细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区的工程化抗体。
55.权利要求54的方法，其中所述细胞在细胞表面上表达所述指导物抗原的至少20,000或更多个拷贝。
56.权利要求54-55中任一项的方法，其还包括：确定指导物抗原与效应子抗原的密度比。
57.权利要求54-56中任一项的方法，其中所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少4:1。
58.权利要求54-57中任一项的方法，其中所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少5:1。
59.权利要求54-58中任一项的方法，其中所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少10:1。
60.一种工程化抗体，其通过以下过程产生：
a)选择在细胞表面上表达多种指导物抗原和效应子抗原的细胞；
b)确定所述多种指导物抗原与效应子抗原的密度比；以及
c)如果所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少4:1，则制备包含与所述指导物抗原结合的第一抗原结合区和与所述细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区的工程化抗体。
61.权利要求60的工程化抗体，其中所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少5:1。
62.权利要求60-61中任一项的工程化抗体，其中所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少10:1。
63.权利要求60-62中任一项的工程化抗体，其中所述细胞在细胞表面上表达所述指导物抗原的至少15,000或更多个拷贝。
64.权利要求60-63中任一项的工程化抗体，其中所述细胞在细胞表面上表达所述指导物抗原的至少20,000或更多个拷贝。
65.一种工程化抗体，其通过以下过程产生：
a)选择在细胞表面上表达多种指导物抗原和效应子抗原的细胞；
b)确定细胞表面上表达的所述指导物抗原的拷贝数；以及
c)如果所述细胞表达所述指导物抗原的至少15,000个拷贝，则制备包含与所述指导物抗原结合的第一抗原结合区和与所述细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区的工程化抗体。
66.权利要求65的工程化抗体，其中所述细胞在细胞表面上表达所述指导物抗原的至少20,000或更多个拷贝。
67.权利要求65-66中任一项的工程化抗体，其还包含确定指导物抗原与效应子抗原的密度比。
68.权利要求65-67中任一项的工程化抗体，其中所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少4:1。
69.权利要求65-68中任一项的工程化抗体，其中所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少5:1。
70.权利要求65-69中任一项的工程化抗体，其中所述指导物抗原与效应子抗原的密度比为至少10:1。
71.一种抗体-细胞复合物，其包含：
工程化抗体，其中所述工程化抗体包含与细胞上的指导物抗原结合的第一抗原结合区和与所述细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区，其中所述细胞的特征在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约4:1。
72.权利要求71的抗体-细胞复合物，其中所述细胞的特征在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约5:1。
73.权利要求71-72中任一项的抗体-细胞复合物，其中所述细胞的特征在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约10:1。
74.权利要求71-73中任一项的抗体-细胞复合物，其中所述细胞包含在细胞表面上表达的所述指导物抗原的约15,000或更多个拷贝。
75.权利要求71-74中任一项的抗体-细胞复合物，其中所述细胞包含在细胞表面上表达的所述指导物抗原的约20,000或更多个拷贝。
76.一种抗体-细胞复合物，其包含：
工程化抗体，其中所述工程化抗体包含与细胞上的指导物抗原结合的第一抗原结合区和与所述细胞上的效应子抗原结合的第二抗原结合区，其中所述细胞包含在细胞表面上表达的所述指导物抗原的约15,000或更多个拷贝。
77.权利要求76的抗体-细胞复合物，其中所述癌细胞包含在细胞表面上表达的所述指导物抗原的约20,000或更多个拷贝。
78.权利要求76-77中任一项的抗体-细胞复合物，其中所述细胞的特征还在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约4:1。
79.权利要求76-78中任一项的抗体-细胞复合物，其中所述细胞的特征还在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约5:1。
80.权利要求76-79中任一项的抗体-细胞复合物，其中所述细胞的特征还在于指导物抗原与效应子抗原的密度比为约10:1。
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