CN109715206A - 结合蛋白及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了结合蛋白，例如，抗体，其结合GDNF家族受体alpha样(GFRAL)蛋白，包括人GFRAL蛋白，以及它们的使用方法。

Description

结合蛋白及其使用方法
领域
本申请要求2016年3月31日提交的美国临时申请NO.62/316,516的权益，通过引用将其全部内容合并在文本中。
本公开内容一般地涉及结合蛋白，例如抗体，其结合GDNF家族受体Alpha样(GDNFFamily Receptor Alpha Like，GFRAL)蛋白，包括人GFRAL蛋白，以及它们的使用方法。
背景
生长分化因子15(GDF15)是一种属于转化生长因子beta(TGF-β)超家族的蛋白质。GDF15也称为TGF-PL、MIC-1、PDF、PLAB、NAG-1和PTGFB。据报道GDF15 mRNA在肝脏中最为丰富，在某些其他组织中可见较低的水平。在器官例如肝脏、肾脏、心脏和肺的损伤中，它在肝脏中的表达可以显著地上调。
据报道GDF15在受损的组织中和在疾病过程期间在调节炎症性和细胞凋亡途径方面起到作用。已经报道的是，GDF15是各种疾病中的恶病质的介体。然而，恶病质是一种复杂的和未被完全了解的综合征。此外，至少某些肿瘤过量表达并分泌GDF15，升高的血清GDF15水平已经与各种癌症相关联。GDF15已经被描述为巨噬细胞活化的负调节物，通过抑制TNF-α、IL-1、IL-2和MCS-F的释放，从而抑制局部炎症信号转导的正反馈，类似于TGF-β的效果。针对GDF15的单克隆抗体已经作为用于治疗恶病质和癌症的潜在治疗药剂被公开。GDF15的受体是未知的。
对于有效治疗与多种疾病和状况相关的体重损失的治疗药剂存在着显著未被满足的需求，包括消耗性疾病，例如恶病质或肌肉减少症，以及炎症状况，例如全身性炎症或急性炎性反应。对于有效治疗慢性疾病的治疗药剂也存在着显著未被满足的需求，包括癌症、慢性肾脏疾患、慢性阻塞性肺病、AIDS、肺结核、慢性炎症性疾病、全身性炎症和肌肉消耗性疾病，包括涉及不自主的体重损失和/或肌肉质量损失的那些。
概述
本公开内容提供了结合GDNF家族受体Alpha样(GFRAL)蛋白的蛋白质，包括结合蛋白，例如结合GFRAL蛋白的抗体。这样的结合蛋白包括抗体，可以结合GFRAL多肽、GFRAL片段和/或GFRAL表位。这样的结合蛋白，包括抗体，可以是拮抗剂(例如，抑制GDF15蛋白与GFRAL蛋白的结合，抑制RET蛋白与GFRAL蛋白的结合，抑制GDF15蛋白诱导的信号转导，和/或抑制GDF15/GFRAL或GDF15/GFRAL/RET受体复合物的形成)。
本公开内容还提供了结合蛋白，包括抗体(例如，单克隆抗体)或其片段，其(i)结合GFRAL蛋白，(ii)抑制GDF15蛋白与GFRAL蛋白的结合，和/或(iii)抑制RET蛋白与GFRAL蛋白的结合。
在某些实施方式中，所述抗-GFRAL抗体是结合GFRAL多肽、GFRAL片段或GFRAL表位的人源化抗体。在某些实施方式中，抗-GFRAL抗体包含如本文描述的命名为1C1、3P10、12A3、5F12、5A20、8D8、17J16、25M22、2B8、22N5、2I23、6N16、1B3、19K19、2B3、8C10、2A9、24G2、6G9、2B11、1A3、P1B6、P1H8或P8G4的单克隆抗体或其人源化变体的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在某些实施方式中，抗-GFRAL抗体可以进一步包含人免疫球蛋白氨基酸序列或其变体的VH FR1、VH FR2、VH FR3、VH FR4、VL FR1、VL FR2、VL FR3和/或VL FR4。
在某些实施方式中，结合蛋白(例如，抗-GFRAL抗体)包含六个CDR或小于六个CDR。在某些实施方式中，结合蛋白(例如，抗-GFRAL抗体)包含选自VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3的一个、两个、三个、四个、五个、或六个CDR。在某些实施方式中，结合蛋白(例如，抗-GFRAL抗体)包含选自如本文描述的命名为1C1、3P10、12A3、5F12、5A20、8D8、17J16、25M22、2B8、22N5、2I23、6N16、1B3、19K19、2B3、8C10、2A9、24G2、6G9、2B11、1A3、P1B6、P1H8或P8G4的单克隆抗体或其人源化变体的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLCDR1、VL CDR2和/或VL CDR3的一个、两个、三个、四个、五个、或六个CDR。在某些实施方式中，结合蛋白(例如，抗-GFRAL抗体)进一步包含人免疫球蛋白氨基酸序列或其变体的支架区或框架区，包括VH FR1、VH FR2、VH FR3、VH FR4、VL FR1、VL FR2、VL FR3和/或VL FR4。
在某些实施方式中，所述抗体是人源化抗体、单克隆抗体、重组抗体、抗原结合片段或其任何组合。在某些实施方式中，所述抗体是人源化单克隆抗体或其抗原结合片段，其结合GFRAL多肽(例如，细胞表面表达的或可溶的GFRAL)、GFRAL片段或GFRAL表位。
本公开内容还提供了结合蛋白例如抗-GFRAL抗体，(i)其竞争性地阻断(例如，以剂量依赖性方式)本文提供的抗-GFRAL抗体结合GFRAL多肽(例如，细胞表面表达的或可溶的GFRAL)、GFRAL片段或GFRAL表位，和/或(ii)结合被本文提供的抗-GFRAL抗体结合的GFRAL表位。在其他实施方式中，所述结合蛋白例如抗-GFRAL抗体竞争性地阻断(例如，以剂量依赖性方式)本文描述的单克隆抗体25M22、3P10、8D8或5F12或其人源化变体结合GFRAL多肽(例如，细胞表面表达的或可溶的GFRAL蛋白)、GFRAL片段或GFRAL表位。在其他实施方式中，所述结合蛋白例如抗-GFRAL抗体结合被本文描述的单克隆抗体25M22、3P10、8D8或5F12或其人源化变体结合(例如，识别)的GFRAL表位。
本公开内容还提供了结合蛋白，包括抗体或其片段，其(i)结合抗体识别的GFRAL蛋白的表位，所述抗体分别包含具有SEQ ID NO：3、7、11或15的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：4、8、12或16的氨基酸序列的轻链可变区；或(ii)与抗体竞争结合GFRAL蛋白，所述抗体分别包含具有SEQ ID NO：3、7、11或15的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQID NO：4、8、12或16的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，本文提供了结合蛋白，包括抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白(例如，人GFRAL蛋白)的一个或更多个氨基酸的区域，包括表位。在某些实施方式中，结合蛋白，包括抗体或其片段，结合GFRAL蛋白的区域(例如，细胞外结构域的一个或更多个氨基酸残基)，包括，例如，结合：(i)GFRAL蛋白的结构域1(例如，SEQ ID NO：1797的氨基酸残基Q20到S130)；(ii)GFRAL蛋白的结构域2(例如，SEQ IDNO：1797的氨基酸残基C131到C210)；(iii)GFRAL蛋白的结构域3(例如，SEQ ID NO：1797的氨基酸残基C220到C316)；或(iv)GFRAL蛋白的细胞外结构域(例如，SEQ ID NO：1797的氨基酸残基Q20到E351)的那些。
在某些实施方式中，本文提供了结合蛋白，包括抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白的特定表位(例如，一个或更多个氨基酸残基)，包括，例如，结合：(i)包含GFRAL蛋白(SEQID NO：1797)的氨基酸残基SER156、GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、LEU152、LYS153、ALA154、CYS155、PHE174、TYR175、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、LEU186、CYS189、CYS191、ALA192、GLN193、SER194、ASP195、ILE196、PRO197、CYS198、GLN199、GLN200、SER201、LYS202、GLU203、ALA204、LEU205、HIS206、SER207、SER130、CYS131、LEU132、GLU133、VAL134、或ALA135的至少一个(例如，一个或更多个)的GFRAL蛋白的表位；(ii)包含SEQ ID NO：1797的氨基酸残基LEU132、GLU133、VAL134、ALA135、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、PHE174、TYR175、ALA169、ALA170、ILE171、ARG172、PHE173、GLN176、ASN177、ILE178、PRO179、PHE180、ASN181、ILE182、ALA183、GLN184、MET185、LEU186、ALA187、PHE188、或CYS189的至少一个(例如，一个或更多个)的GFRAL蛋白的表位；(iii)包含SEQ ID NO：1797的氨基酸残基LEU164、LYS208、VAL212、ASN213、MET214、VAL215、PRO216、PRO217、PRO218、THR219、CYS220、LEU221、VAL223、TRP245、LEU267、CYS269、GLN28、VAL289、GLN290、CYS291、THR292、CYS293、ARG294、THR295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、CYS304、LYS305、ILE306、PHE307、GLN308、HIS309、MET310、LEU311、HIS312、ARG313、LYS314、SER315、CYS316、或PHE317的至少一个(例如，一个或更多个)的GFRAL蛋白的表位；(iv)包含SEQ ID NO：1797的氨基酸残基CYS233、ARG234、ARG235、HIS236、TYR237、ARG238、THR239、PHE240、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、GLN246、ARG247、VAL248、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、GLU254、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、SER263、LYS264、ASP266、LEU267、THR268、SER272、ASP274、CYS275、ALA278、CYS269、SER270、SER302、LEU303、ILE306、HIS309、LEU311、MET310、SER315、或CYS316的至少一个(例如，一个或更多个)的GFRAL蛋白的表位；(v)包含SEQ ID NO：1797的氨基酸残基GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、或GLN200的至少一个(例如，一个或更多个)的GFRAL蛋白的表位；(vi)包含SEQ IDNO：1797的氨基酸残基GLU136、ALA137、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、PHE173、ASN177、ILE178、PRO179、ASN181、ILE182、或MET185的至少一个(例如，一个或更多个)的GFRAL蛋白的表位；(vii)包含SEQ ID NO：1797的氨基酸残基GLN298或GLU301的至少一个(例如，一个或更多个)的GFRAL蛋白的表位；或(viii)包含SEQID NO：1797的氨基酸残基ARG234、ARG238、GLN241、SER242、LYS243、TRP245、GLN246、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、ASP255、ASN257、CYS258、SER260、THR261、或LEU262的至少一个(例如，一个或更多个)的GFRAL蛋白的表位的那些。在某些实施方式中，上文提供的这样的抗体可以抑制GDF15诱导的信号转导和/或GFRAL/GDF15或RET/GFRAL/GDF15受体复合物的信号转导或活化，例如，在表达GFRAL蛋白的细胞中。另外，在某些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体，例如，人源化的、人类的或嵌合的抗体。
在某些实施方式中，本文提供的所述结合蛋白例如抗-GFRAL抗体轭合到或重组地连接到诊断药剂、可检测药剂(例如，放射性同位素、酶、荧光化合物、生物发光化合物或化学发光化合物)。在某些实施方式中，本文提供的结合蛋白例如抗-GFRAL抗体与治疗药剂一起使用(例如，施用)。在某些方面，所述治疗药剂是药物，包括一种或更多种药物，例如，激活素-A的抑制物、ActRIIB的抑制物、IL-6的抑制物或IL-6R的抑制物、胃饥饿素、胃饥饿素模拟物或GHS-RIa激动剂、SARM、TNFα抑制物、IL-la抑制物、肌肉生长抑制素抑制物、beta-阻断剂、黑皮质素肽抑制物、黑皮质素受体抑制物、或抗癌药剂。
在某些实施方式中，提供了包含本文描述的结合蛋白例如抗-GFRAL抗体的组合物。本文还提供的是包含本文描述的结合蛋白例如GFRAL抗体的药物组合物。
本公开内容还提供了分离的核酸分子，其编码结合GFRAL多肽、GFRAL多肽片段、或GFRAL表位(例如，GFRAL蛋白的一个或更多个氨基酸，包括GFRAL蛋白的细胞外结构域)的结合蛋白(例如，抗-GFRAL抗体)的免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链、VH区、VL区、VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在某些实施方式中，所述核酸分子编码如本文描述的命名为1C1、3P10、12A3、5F12、5A20、8D8、17J16、25M22、2B8、22N5、2I23、6N16、1B3、19K19、2B3、8C10、2A9、24G2、6G9、2B11、1A3、P1B6、P1H8或P8G4的单克隆抗体或其人源化变体的VH区、VL区、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在某些实施方式中，所述核酸分子进一步编码人免疫球蛋白氨基酸序列或其变体的支架区或框架区，包括VH FR1、VH FR2、VH FR3、VH FR4、VL FR1、VL FR2、VL FR3和/或VL FR4。本文还提供的是包含编码结合蛋白例如抗-GFRAL抗体的核酸分子的载体和宿主细胞，以及通过在促进结合蛋白例如抗-GFRAL抗体的生产的条件下培养本文提供的所述宿主细胞来生产结合蛋白例如抗-GFRAL抗体的方法。
本公开内容还提供了治疗、预防或减轻GFRAL介导的疾病、失调或状况，包括GDF15介导的疾病、失调或状况(例如，一种或更多种症状)的方法，包括向对象施用治疗有效量的本文提供的结合蛋白例如抗-GFRAL抗体，包括有需要的对象，从而治疗、预防或减轻所述疾病、失调或状况。在某些实施方式中，所述疾病、失调或状况由GDF15蛋白(例如，人GDF15蛋白)和/或GFRAL蛋白(例如，人GFRAL蛋白)引起或与之相关，例如，与对象中GDF15诱导的信号转导相关的那些。在某些实施方式中，通过降低恶病质、肌肉减少症或肌肉消耗、骨骼消耗、或不自主的体重损失的发生、频率或严重度，所述疾病、失调或状况是可治疗的。在某些实施方式中，所述疾病、失调或状况是恶病质。在某些实施方式中，所述疾病、失调或状况是癌症。在某些实施方式中，所述疾病、失调或状况是心血管疾病.在某些实施方式中，所述疾病、失调或状况是慢性炎症性疾病(例如，慢性肾脏疾患、慢性阻塞性肺病)。在某些实施方式中，所述疾病、失调或状况是由GDF15蛋白诱导的或与GDF15蛋白相关的、具有对化学治疗剂(例如，抗肿瘤抗体，如曲妥珠单抗)的降低的敏感性(例如，抗性)的癌症。
在某些实施方式中，所述疾病、失调或状况是恶病质、肌肉减少症、肌肉消耗或肌肉质量损失、骨骼消耗、不自主的体重损失(例如，与疾病、失调或状况相关的或由于它们的体重损失)，或与之相关。在某些实施方式中，所述疾病、失调或状况选自与恶病质相关的基础疾病的组，包括但不限于癌症、慢性肾脏疾患、慢性阻塞性肺病、AIDS、肺结核、慢性炎症性疾病、脓毒症和其他形式的全身性炎症、肌肉消耗，例如肌营养不良，以及称为神经性厌食的进食障碍。
在某些实施方式中，治疗、预防或改善的方法包括改善体重增加或降低体重损失、或改善肌肉质量获得或降低肌肉质量损失的方法。在某些实施方式中，所述治疗、预防或改善的方法产生治疗癌症的改善的方法，通过防止、最小化或降低恶病质、肌肉减少症或肌肉消耗、骨骼消耗、或不自主的体重损失的发生、频率或严重度。
本公开内容还提供了检测样品中的GFRAL的方法，包括用包含可检测药剂的、本文描述的结合蛋白例如抗-GFRAL抗体接触所述样品的步骤，在某些实施方式中，所述样品包含在其表面表达GFRAL的细胞。
本公开内容还提供了试剂盒，其包含如本文描述的结合GFRAL多肽、GFRAL片段或GFRAL表位的结合蛋白例如抗-GFRAL抗体。
附图的简要说明
附图1显示了各种GFRAL蛋白之间的序列比对。SEQ ID NO在括号中以粗体标注。
附图2显示了各种GDF15蛋白之间的序列比对。SEQ ID NO在括号中以粗体标注。
附图3描述了显示示范性的抗-GFRAL抗体1C1和3P10对GFRAL蛋白的结合亲和力的实验结果。
附图4A-4B显示了示范性的抗-GFRAL抗体的VH和VL序列的比对。SEQ ID NO在括号中以粗体标注。
附图5A-5F显示了结合GFRAL的结构域1(附图5A-5B)、结构域2(附图5C-5D)或结构域3(附图5E-5F)的示范性的抗-GFRAL抗体的VH和VL序列的比对。SEQ ID NO在括号中以粗体标注。
附图6A-6B显示了人源化的1C1抗体的VH和VL序列的比对。SEQ ID NO在括号中以粗体标注。
附图7A-7B显示了人源化的25M22抗体的VH和VL序列的比对。SEQ ID NO在括号中以粗体标注。
附图8A-8B显示了人源化的17J16抗体的VH和VL序列的比对。SEQ ID NO在括号中以粗体标注。
附图9A-9B显示了人源化的5F12抗体的VH和VL序列的比对。SEQ ID NO在括号中以粗体标注。
附图10A-10B显示了人源化的3P10抗体的VH和VL序列的比对。SEQ ID NO在括号中以粗体标注。
附图11描绘了使用人源化GFRAL抗体的受体拮抗剂分析的结果。
附图12描绘了显示人源化抗体的Elk1报告物分析的结果。
附图13A-13C描绘了实验的结果，显示示范性的人源化抗-GFRAL抗体的特异性。
附图14A-14B描绘了实验的结果，显示DIO小鼠中对GDF15诱导的体重损失的抗-GFRAL抗体抑制。对于附图14A，附图中从左至右，施用的治疗分别是PBS、3P10、1C1、17J16、5A20、25M22、5F12和1MO3(分别对于d1、d2和d3)。对于附图14B，附图中从左至右，施用的治疗分别是PBS、8D8和12A3(分别对于d1、d2和d3)。
附图15描绘了实验的结果，显示GDF15诱导的体重损失模型中的抗-GFRAL抗体。
附图16描绘了实验的结果，显示抗-GFRAL抗体对食物摄取的作用。
附图17描绘了实验的结果，显示抗-GFRAL抗体在DIO小鼠中对体重的作用。
附图18描绘了实验的结果，显示抗-GFRAL抗体在DIO小鼠中对食物摄取的作用。
附图19描绘了实验的结果，显示抗-GFRAL抗体对脂肪质量(fat mass)的作用。
附图20描绘了实验的结果，显示在DIO小鼠中抗-GFRAL抗体对GDF15诱导的体重损失和脂肪损失以及瘦质量(lean mass)的作用。
附图21描绘了实验的结果，显示在DIO小鼠中抗-GFRAL抗体对GDF15诱导的能量消耗提高以及GDF15诱导的食物摄取减少的作用。
附图22描绘了实验的结果，显示在瘦体小鼠中抗-GFRAL抗体对GDF15诱导的体重损失和脂肪损失以及瘦质量的作用。
附图23描绘了实验的结果，显示在瘦体小鼠中抗-GFRAL抗体对GDF15诱导的RER改变以及GDF15诱导的食物摄取减少的作用。
附图24描绘了实验的结果，显示在瘦体小鼠中抗-GFRAL抗体(3P10)对体重的作用。
附图25描绘了实验的结果，显示在瘦体小鼠中施用抗-GFRAL抗体对食物摄取的作用。
附图26A-26C描绘了显示饮食腺嘌呤的作用的实验结果。
附图27A描绘了显示饮食腺嘌呤的作用的实验结果。
附图27B描绘了实验的结果，显示示范性的抗-GFRAL抗体(3P10)对带有慢性肾脏损伤的小鼠的作用。
附图28描绘了实验的结果，显示示范性的抗-GFRAL抗体(3P10)对带有慢性肾脏损伤的小鼠的作用。
附图29描绘了实验的结果，显示示范性的人源化抗-GFRAL抗体(h3P10)对GDF15诱导的体重损失的作用。
附图30显示了GFRAL蛋白和GDF15蛋白的复合物的示范性的晶体。
附图31说明示范性的GFRAL电子密度图。
附图32显示在不对称的GFRAL/GDF15晶体单元中形成的GFRAL/GDF15复合物的示范性的带状图。GFRAL蛋白结构域D2和D3表示为GFRAL D2和GFRAL D3。
附图33显示了两个GFRAL/GDF15复合物的二聚体的示范性的带状图。GFRAL蛋白结构域D2和D3表示为GFRAL D2和GFRAL D3。
附图34A-34B显示了两个GFRAL/GDF15复合物的二聚体的不同的表面呈现。
附图35说明与GDF15氨基残基相互作用的GFRAL氨基酸残基。
附图36A-36D说明GFRAL/GDF15界面。GFRAL蛋白结构域D2和D3表示为GFRAL D2和GFRAL D3。
附图37A-37B显示了描绘成带状图的GFRAL蛋白与GFRα1的重叠的不同方面。
附图38A-38D说明在RET/GFRAL/GDF15模型中GFRAL蛋白与RET蛋白的相互作用的不同方面。
附图39A-39B说明GFRAL蛋白的RET蛋白界面上的氨基酸残基。
附图40说明在结晶条件B11、D11和H8下产生的、具有GFRAL蛋白、3P10 Fab和25M22Fab的复合物的示范性的晶体。
附图41说明在结晶条件C6、E11和C2下产生的具有GFRAL蛋白、8D8 Fab和5F12 Fab的复合物的示范性的晶体。
附图42说明在GFRAL/3P10/25M22 Fab的晶体结构中3P10 Fab和25M22 Fab CDR区的示范性的电子密度图。
附图43说明GFRAL/8D8/5F12 Fab复合物的示范性的电子密度。
附图44显示了在不对称的GFRAL/3P10/25M22 Fab复合物晶体单元中形成的GFRAL/3P10/25M22 Fab复合物的示范性的带状图。
附图45显示了涉及3P10 Fab和25M22 Fab结合的3P10 Fab和25M22 Fab CDR序列(上一行)与GFRAL氨基酸残基(下一行)的比对。涉及GFRAL-Fab相互作用的残基是加框的。对于3P10 Fab，显示了Hc，SEQ ID NO：1824的氨基酸残基Q1到S120，显示了Lc，SEQ ID NO：1825的氨基酸残基D1到F120。对于25M22 Fab，显示了Hc，SEQ ID NO：1826的氨基酸残基Q1到S120。
附图46显示了带状图，说明GFRAL 3P10 Fab表位与3P10 Fab重链CDR区的相互作用。
附图47显示了带状图，说明GFRAL 3P10 Fab表位与3P10轻链CDR区的相互作用。
附图48显示了带状图，说明GFRAL 25M22表位与25M22 Fab重链CDR区的相互作用。
附图49显示了GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797的残基S130到N318)以及25M22 Fab重链(HC)残基SEQ ID NO：1826的Q1到P138和G146到P225，和轻链(LC)残基SEQ ID NO：1827的D1到E218的氨基酸序列。灰色背景和白色文字的残基表示GFRAL蛋白和25M22 Fab的核心相互作用界面氨基酸。灰色背景与黑色或白色字体的Fab HC或LC上的残基表示25M22 Fab的示范性的CDR序列。
附图50A-50B说明涉及GFRAL/25M22 Fab相互作用的，GFRAL蛋白和25M22 Fab上的核心相互作用界面氨基酸残基。
附图51说明涉及GFRAL/25M22 Fab相互作用的，GFRAL蛋白上的边界相互作用界面氨基酸残基。
附图52显示了示范性的带状图侧视图，说明作为空间填充表面模型(核心相互作用界面氨基酸)的、GFRAL蛋白上的重叠的25M22 Fab和GDF15表位。
附图53显示了示范性的带状图顶视图，说明作为空间填充表面模型(核心相互作用界面氨基酸)的、GFRAL蛋白上的重叠的25M22 Fab和GDF15表位。
附图54显示了GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797的残基S130到N318)以及3P10 Fab重链(HC)残基SEQ ID NO：1824的Q1到A130和G138到C221，和轻链(LC)残基SEQ ID NO：1825的D1到C218的氨基酸序列。灰色背景和白色文字的残基表示GFRAL蛋白和3P10 Fab的核心相互作用界面氨基酸。灰色背景与黑色或白色字体的Fab HC或LC上的残基表示3P10 Fab的示范性的CDR序列。
附图55A-55B显示了带状图，说明GFRAL/3P10 Fab复合物的晶体结构。相互作用界面残基显示为杆状模型(附图55A)或空间填充表面模型(附图55B)。
附图56A-56B说明GFRAL的带状图中作为空间填充表面模型的GFRAL 3P10 Fab表位的界面残基。附图56A显示了核心相互作用界面残基，附图56B显示了边界相互作用界面残基。
附图57说明GFRAL蛋白的带状图上作为空间填充表面模型的重叠的、结合3P10Fab的GFRAL蛋白残基与结合RET蛋白的GFRAL蛋白残基。
附图58说明结合3P10 Fab和25M22 Fab的GFRAL蛋白的边界相互作用界面残基的组合覆盖。
附图59显示了在不对称的GFRAL/8D8/5F12 Fab复合物晶体单元中形成的GFRAL/8D8/5F12 Fab复合物的示范性的带状图。
附图60显示了GFRAL蛋白上8D8 Fab和5F12 Fab结合位点的示范性的带状图。GFRAL蛋白上对于Fab结合重要的残基显示为杆状模型。
附图61显示了GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797的残基S130到N318)以及8D8 Fab重链(HC)残基SEQ ID NO：1828的Q1到K217，和轻链(LC)残基SEQ ID NO：1829的D1到R211的氨基酸序列。灰色背景和白色文字的残基表示GFRAL蛋白和8D8 Fab的核心相互作用界面氨基酸。灰色背景与黑色或白色字体的Fab HC或LC上的残基表示8D8 Fab的示范性的CDR序列。
附图62A、62B、62C和62D说明GFRAL/8D8 Fab相互作用界面中的核心和边界氨基酸残基。
附图63A、63B、63C和63D说明GFRAL/5F12 Fab相互作用界面中的核心和边界氨基酸残基。
附图64显示了GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797的残基S130到N318)以及5F12 Fab重链(HC)残基SEQ ID NO：1830的Q1到K223，和轻链(LC)残基SEQ ID NO：1831的N1到E217的氨基酸序列。灰色背景和白色文字的残基表示GFRAL蛋白和5F12 Fab的核心相互作用界面氨基酸。灰色背景与黑色或白色字体的Fab HC或LC上的残基表示5F12 Fab的示范性的CDR序列。
详细说明
本文提供了结合蛋白，例如结合GFRAL蛋白包括人GFRAL蛋白的抗体。这样的结合蛋白，包括本文公开的抗体的独特性质是它们的拮抗性质，包括抑制GDF15蛋白的作用，和/或抑制GDF15蛋白与GFRAL蛋白的结合，或抑制RET蛋白与GFRAL蛋白的结合的能力，包括其中抑制结合降低(例如，阻断)GDF15信号转导。显著地和特别地，结合蛋白例如本文公开的针对GFRAL蛋白的抗体(i)结合GFRAL蛋白，(ii)抑制GDF15蛋白与GFRAL蛋白的结合，和/或(iii)抑制RET蛋白与GFRAL蛋白的结合，包括阻断GDF15/GFRAL蛋白质复合物或GDF15/GFRAL/RET蛋白质复合物的形成或GDF15信号转导，包括，例如，根据几种体外的基于细胞的分析所测量的。这样的分析可以包括(1)ELK1-荧光素酶报告物分析(参见，例如，实施例3)；和/或(2)U20S细胞中的ERK-磷酸化分析(参见，例如，实施例4)。因而，结合蛋白例如本文描述的抗-GFRAL抗体预期在体内抑制GDF15活性(例如，与GDF15的信号转导功能相关的)。这种性质使得所述公开的结合蛋白，包括抗-GFRAL抗体，成为用于对象中疾病、失调或状况的治疗的可行的治疗剂，所述疾病、失调或状况由GDF15蛋白(例如，人GDF15蛋白)和/或GFRAL蛋白(例如，人GFRAL蛋白)引起或与之相关，例如，与GDF15诱导的信号转导相关的那些。
本文提供的所述结合蛋白，例如结合GFRAL蛋白的抗体，享有拮抗(i)GDF15蛋白与GFRAL蛋白的结合，和/或(ii)RET蛋白与GFRAL蛋白的结合的共同特征。本文提供的所述抗-GFRAL抗体包括人源化的抗-GFRAL抗体，包括衍生自或基于具有表1-24或附图4-10中描述的CDR序列的1C1、3P10、12A3、5F12、5A20、8D8、17J16、25M22、2B8、22N5、2I23、6N16、1B3、19K19、2B3、8C10、2A9、24G2、6G9、2B11、1A3、P1B6、P1H8和/或P8G4的人源化抗-GFRAL抗体。这样的抗-GFRAL抗体，包括人源化抗-GFRAL抗体，结合GFRAL蛋白的特定结构域，例如，结合：(i)GFRAL蛋白的结构域1(例如，SEQ ID NO：1797的氨基酸残基Q20到S130)；(ii)GFRAL蛋白的结构域2(例如，SEQ ID NO：1797的氨基酸残基C131到C210)；(iii)GFRAL蛋白的结构域3(例如，SEQ ID NO：1797的氨基酸残基C220到C316)；或(iv)GFRAL蛋白的细胞外结构域(例如，SEQ ID NO：1797的氨基酸残基Q20到E351)的那些。
在本公开的某些实施方式中，所述结合蛋白例如抗-GFRAL抗体可以包含免疫球蛋白可变区，所述免疫球蛋白可变区包含如表1-24中描述的一个或更多个互补决定区(CDR)。在这样的结合蛋白(例如，抗-GFRAL抗体)中，所述CDR可以与一个或更多个支架区或框架区连接，它们使所述CDR定向从而实现所述CDR的适当的抗原结合性质。这样的结合蛋白，包括本文描述的抗-GFRAL抗体，可以抑制(例如，阻断)(i)GDF15蛋白与GFRAL蛋白之间，和/或(ii)RET蛋白与GFRAL蛋白之间的相互作用。这样的结合蛋白，包括本文描述的抗-GFRAL抗体，可以抑制(例如，阻断)GDF15信号转导。
在本公开的某些实施方式中，所述结合蛋白例如抗-GFRAL抗体结合：(i)包含GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的氨基酸残基SER156、GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、LEU152、LYS153、ALA154、CYS155、PHE174、TYR175、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、LEU186、CYS189、CYS191、ALA192、GLN193、SER194、ASP195、ILE196、PRO197、CYS198、GLN199、GLN200、SER201、LYS202、GLU203、ALA204、LEU205、HIS206、SER207、SER130、CYS1 31、LEU132、GLU133、VAL134、或ALA135的至少一个(例如，一个或更多个)的GFRAL蛋白的表位；(ii)包含SEQ ID NO：1797的氨基酸残基LEU132、GLU133、VAL134、ALA135、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、PHE174、TYR175、ALA169、ALA170、ILE171、ARG172、PHE173、GLN176、ASN177、ILE178、PRO179、PHE180、ASN181、ILE182、ALA183、GLN184、MET185、LEU186、ALA187、PHE188、或CYS189的至少一个(例如，一个或更多个)的GFRAL蛋白的表位；(iii)包含SEQ ID NO：1797的氨基酸残基LEU164、LYS208、VAL212、ASN213、MET214、VAL215、PRO216、PRO217、PRO218、THR219、CYS220、LEU221、VAL223、TRP245、LEU267、CYS269、GLN28、VAL289、GLN290、CYS291、THR292、CYS293、ARG294、THR295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、CYS304、LYS305、ILE306、PHE307、GLN308、HIS309、MET310、LEU311、HIS312、ARG313、LYS314、SER315、CYS316、或PHE317的至少一个(例如，一个或更多个)的GFRAL蛋白的表位；(iv)包含SEQ ID NO：1797的氨基酸残基CYS233、ARG234、ARG235、HIS236、TYR237、ARG238、THR239、PHE240、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、GLN246、ARG247、VAL248、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、GLU254、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、SER263、LYS264、ASP266、LEU267、THR268、SER272、ASP274、CYS275、ALA278、CYS269、SER270、SER302、LEU303、ILE306、HIS309、LEU311、MET310、SER315、或CYS316的至少一个(例如，一个或更多个)的GFRAL蛋白的表位；(v)包含SEQ ID NO：1797的氨基酸残基GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、或GLN200的至少一个(例如，一个或更多个)的GFRAL蛋白的表位；(vi)包含SEQ ID NO：1797的氨基酸残基GLU136、ALA137、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、PHE173、ASN177、ILE178、PRO179、ASN181、ILE182、或MET185的至少一个(例如，一个或更多个)的GFRAL蛋白的表位；(vii)包含SEQ ID NO：1797的氨基酸残基GLN298或GLU301的至少一个(例如，一个或更多个)的GFRAL蛋白的表位；或(viii)包含SEQ ID NO：1797的氨基酸残基ARG234、ARG238、GLN241、SER242、LYS243、TRP245、GLN246、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、ASP255、ASN257、CYS258、SER260、THR261、或LEU262的至少一个(例如，一个或更多个)的GFRAL蛋白的表位的那些。在某些实施方式中，上文提供的这样的抗体可以抑制GDF15诱导的信号转导和/或GFRAL/GDF15或RET/GFRAL/GDF15受体复合物的信号转导或活化，例如，在表达GFRAL蛋白的细胞中。另外，在本公开内容的某些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体，例如，人源化抗体。
一般技术
本文描述和提及的技术和操作包括本领域技术人员一般充分了解的和/或使用常规的方法通常采用的那些，诸如，例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual 3rd.edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel，etal.eds.，(2003))；Therapeutic Monoclonal Antibodies：From Bench to Clinic，Z.An，ed，Wiley，Hoboken N.J.(2009)；Monoclonal Antibodies：Methods and Protocols，M.Albitar，ed.，Humana Press，Totawa，N.J.(2010)；和Antibody Engineering，2nd Ed.，Vols 1 and 2，Kontermann and Dubel，eds.，Springer-Verlag，Heidelberg，2010中描述的广泛采用的技术。
术语
除非另外描述，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。为了解释本说明书的目的，以下的术语描述将适用，在任何适当的时候，以单数形式使用的术语将还包括复数的，反之亦然。所有专利、申请、公开的申请和其他出版物通过引用将它们完整地合并。在所阐述的术语的任何描述与通过引用合并在本文中的任何文件有冲突的情况下，以下文阐述的术语的描述为准。
术语“GDNF家族受体alpha样”、“生长分化因子15受体”、“GFRAL”或“GFRAL蛋白”和类似的术语是指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物例如灵长类(例如，人类、猕猴(cyno))、犬和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)的多肽(“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换地使用)或任何天然的GFRAL，除非另有陈述，以及在某些实施方式中，包括相关的GFRAL多肽，包括其SNP变体。GFRAL在本领域中也称为“C6orf144”、“染色体6开放阅读框144”、“BA360D14.1”、“IVFI9356”和“UNQ9356”。
全长前体人GFRAL的氨基酸序列在下文提供，其包括信号肽序列(下划线的小写字母残基)：
成熟的人GFRAL多肽的氨基酸序列在下文提供：
在某些实施方式中，GFRAL是指至少55％相同于成熟的人GFRAL的氨基酸序列(SEQID NO：1798)的蛋白质。结合蛋白，例如本文公开的抗-GFRAL抗体，可以结合GFRAL和/或调节信号转导，如本文描述的。在某些实施方式中，本文描述的抗体结合人GFRAL。
人GFRAL具有细胞外结构域(例如，SEQ ID NO：1797的残基20-351)、跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：1797的残基352-371)和细胞质结构域(例如，SEQ ID NO：1797的残基372-394)。
编码前体GFRAL多肽的核酸序列在下文提供：
本文使用的“GFRAL”涵盖人GFRAL及其变体，包括但不限于其直系同源体，例如，鼠GFRAL、大鼠GFRAL、猕猴GFRAL，等。GFRAL不是TGFβRII(NCBI Ref.Seqs.：NM_001024847.2(GI：133908632)；NM_003242.5(GI：133908633))或其直系同源体。GFRAL不同于TGFB3 RI(NCBI Ref.Seqs.：NP_001124388.1(GI：195963412)；NP_004603.1(GI：4759226))或其直系同源体。在某些实施方式中，GFRAL可以是具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同于SEQ ID NO：1797的氨基酸序列的蛋白质。这样的示范性的GFRAL蛋白包括黑猩猩(99％)、猕猴(92％)、大熊猫(82％)、狗(81％)、猫(80％)、猪(77％)、牛(75％)、小鼠(70％)、大鼠(70％)、中国仓鼠(65％)和鸭嘴兽(59％)的，如附图1所示。
来自学名为Macaca fascicularis的猕猴(cyno)的GFRAL蛋白的氨基酸序列在下文提供，其包括信号肽序列(下划线的残基)：
猕猴GFRAL蛋白的编码核酸序列在下文提供：
来自学名为Mus musculus的小鼠的GFRAL蛋白的氨基酸序列在下文提供，其包括信号肽序列(下划线的残基)：
小鼠GFRAL蛋白的编码核酸序列在下文提供：
来自学名为Rattus norvegicus的大鼠的GFRAL蛋白的氨基酸序列在下文提供，其包括信号肽序列(下划线的残基)：
大鼠GFRAL蛋白的编码核酸序列在下文提供：
GFRAL蛋白或GFRAL还指在氨基酸残基中具有一个或更多个改变(例如，在变体和/或物种间不保守的位置上)，同时维持保守的结构域并具有与天然发生的GFRAL相似的生物学活性的蛋白质。GFRAL可以由在一个或更多个碱基上与天然发生的DNA序列有变化的核酸序列编码，但由于遗传密码的简并性仍然翻译成与天然发生的蛋白质相应的氨基酸序列。GFRAL蛋白还指由于一个或更多个保守性替换和/或标签和/或结合物而不同于天然发生的GFRAL序列的蛋白质。
术语“GFRAL”或“GFRAL蛋白”涵盖“全长”的未加工的GFRAL，以及由细胞中的加工产生的任何形式的GFRAL。术语GFRAL或“GFRAL蛋白”还包括：等位变体(例如，SNP变体)；剪接变体；同种型；片段；衍生物；取代、删除和插入变体；融合多肽；以及种间的同源物，优选的，它们保持GFRAL活性和/或足以产生抗-GFRAL免疫应答。本领域技术人员将理解，本文提供的抗-GFRAL抗体可以结合GFRAL蛋白，包括GFRAL多肽片段、GFRAL抗原和/或GFRAL表位。表位可以是更大的GFRAL抗原的部分，所述GFRAL抗原可以是更大的GFRAL多肽片段的部分，所述GFRAL多肽片段随之可以是更大的GFRAL蛋白的部分。GFRAL蛋白可以以天然的或变性的形式存在。本文描述的GFRAL蛋白可以分离自多种来源，例如，来自人类组织类型或来自其他来源，或是通过重组的或合成的方法制备的。GFRAL蛋白可以包含具有与来自大自然的相应GFRAL多肽相同的氨基酸序列的多肽。GFRAL蛋白涵盖截短形式或分泌形式的GFRAL多肽(例如，细胞外结构域序列)，多肽的变体形式(例如，选择性剪接的形式)和等位变体。本文描述的GFRAL多肽(例如，人GFRAL)可以分离自各种来源，例如，来自人类组织类型或来自其他来源，或是通过重组的或合成的方法制备的。
GFRAL蛋白可以相对于天然发生的全长GFRAL多肽缺少至少5个、至少10个、达到至少50个或更多个氨基酸。例如，GFRAL蛋白可以不含有基于天然发生的GFRAL多肽的氨基酸序列的信号序列。GFRAL蛋白还可以含有与天然发生的GFRAL多肽相同的或相似的翻译后修饰，或可以不含有翻译后修饰。例如，所述蛋白可以具有与天然发生的GFRAL多肽相同的或相似的糖基化模式，或可以不含有糖基化。在其他实施方式中，GFRL蛋白包括相对于天然发生的GFRAL蛋白序列的突变，其在天然发生的GFRAL蛋白中不存在的位置处引入糖基化位点。
在某些实施方式中，GFRAL蛋白可以由重组细胞表达，所述重组细胞被遗传修饰以在它的细胞表面表达GFRAL蛋白。所述细胞可以存在于包括分离的GDF15蛋白的组合物中。在某些情况下所述细胞可以另外表达RET蛋白，例如，所述细胞可以内源地表达RET蛋白，没有被遗传修饰以包括编码RET蛋白的外源序列。在其他实施方式中，所述细胞可以不表达可检测水平的RET蛋白，并可以被遗传修饰以表达来自外源序列的RET蛋白。
本文还公开的是GFRAL蛋白的片段，例如，缺少天然GFRAL蛋白中存在的细胞内结构域、或天然GFRAL蛋白中存在的细胞内结构域和跨膜结构域的GFRAL片段，例如附图1中描绘的天然GFRAL。如上所述，GFRAL蛋白的片段可能还缺乏天然GFRAL中存在的信号序列，可以包括或不包括异源信号序列。所述片段可以缺乏天然GFRAL蛋白中存在的细胞内结构域，但包括跨膜结构域。
术语“GFRAL细胞外结构域”(“GFRAL-ECD”)包括全长GFRAL ECD、GFRAL ECD片段和GFRAL ECD变体。如本文使用的，术语“GFRAL ECD”是指缺乏细胞内和/或跨膜结构域的、有或者没有信号肽的GFRAL多肽。在某些实施方式中，GFRAL ECD是指具有氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列至少70％相同于人全长GFRAL ECD的氨基酸序列，所述人全长GFRALECD具有氨基酸序列：
本文使用的术语“全长GFRAL ECD”是指延伸到细胞外结构域的最后一个氨基酸的GFRAL ECD，可以包括或不包括N-末端信号肽。然而，注意的是“全长GFRAL ECD”还涵盖在C-末端上延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸以包括跨膜结构域的氨基酸残基的GFRAL-ECD，条件是所述多肽是可溶的。换句话说，这样的GFRAL ECD缺乏足够长度的跨膜结构域，从而它不能锚定到细胞膜中。用语“全长GFRAL ECD”还涵盖在N-末端延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸以包括信号肽的氨基酸残基的GFRAL-ECD。在某些实施方式中，GFRAL ECD是指至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同于附图1中描绘的连续氨基酸序列，并且缺乏附图1中描绘的GFRAL序列的C-末端的至少30、33、35、40、45、50或55个氨基酸或更多的连续氨基酸序列。
GFRAL ECD不是TGFβ3 RII(Ace.Nos.：NM_001024847.2；nm_003242.5)或其直系同源体的ECD。GFRAL ECD不同于TGFβ3 RI(Ace.Nos.：NP_001124388.1；NP_004603.1)或其直系同源体的ECD。在某些实施方式中，GFRAL ECD可以是具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同于SEQ ID NO：1806的氨基酸序列的蛋白质。
如本文使用的，术语“GFRAL ECD片段”是指一个或更多个残基从全长ECD的N和/或C末端删除并保持了结合GDF15的能力的GFRAL ECD。在某些情况下GFRAL ECD片段可以包括或不包括N-末端信号肽。在某些情况下，GFRAL ECD片段是缺乏以下序列的N-末端存在的1、5、10、15、16、17、18或19个残基的人GFRAL ECD片段：
另一个示范性的GFRAL ECD片段包含以下氨基酸序列，其相应于全长人前体GFRAL蛋白的Q20到C316：
又一个示范性的GFRAL ECD片段包含以下氨基酸序列，其相应于全长人前体GFRAL蛋白的W115到E351：
上述示范性的GFRAL ECD片段被用于实施例中描述的各种方法，包括产生包含GFRAL蛋白与GDF15蛋白的复合物、或GFRAL与示范性的抗-GFRAL抗体的复合物的晶体。
在GFRAL蛋白或GFRAL ECD内存在三个结构域——结构域1(D1)、结构域2(D2)和结构域3(D3)。在某些实施方式中，示范性的D1结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO：1797的残基Q20到S130。在某些实施方式中，示范性的D2结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO：1797的残基C131到C210。在某些实施方式中，示范性的D3结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO：1797的残基C220到C316。GFRAL蛋白的某些性质可以归于这些结构域的活性和/或结合，包括在ECD之内的。例如，如本文描述的，D2内的氨基酸残基被鉴定为是GFRAL蛋白结合GDF15蛋白的核心相互作用界面氨基酸和/或边界相互作用界面氨基酸。同样地，如本文描述的，D3内的氨基酸残基被鉴定为是GFRAL蛋白结合RET蛋白的核心相互作用界面氨基酸和/或边界相互作用界面氨基酸。
术语“核心相互作用界面氨基酸”或其语法上的等同物是指给定蛋白质的氨基酸残基，其有至少一个原子距离相互作用的蛋白质小于或等于(例如，与GDF15蛋白或RET蛋白相互作用的GFRAL蛋白的氨基酸)。的距离允许范德华半径内的原子加上可能的水介导的氢键与相互作用的蛋白质形成键。
术语“边界相互作用界面氨基酸”或其语法上的等同物是指给定蛋白质的氨基酸残基，其有至少一个原子距离所述给定蛋白质上的核心界面氨基酸小于或等于(例如，GFRAL蛋白的氨基酸，其处于与GDF15蛋白或RET蛋白相互作用的GFRAL蛋白的核心相互作用界面氨基酸的之内)。小于或等于的距离容许蛋白质结合到距离给定蛋白质上核心相互作用界面氨基酸小于的残基，从而处于相互作用的蛋白质的范德华半径之内。
如本文使用的，术语“GFRAL ECD变体”是指含有氨基酸添加、删除或取代并且仍然能结合GDF15的GFRAL ECD。这样的变体可以至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％相同于亲本GFRAL ECD。
“生长分化因子15”或“GDF15”在本领域中也称为MIC-1(巨噬细胞抑制细胞因子-1)、PDF(前列腺分化因子)、PLAB(胎盘的骨骼形态发生蛋白)、NAG-1(非甾族抗炎药物(NSAID)活化的基因)、TGF-PL和PTGFB，是转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员。GDF15作为62kDa的细胞内前体蛋白合成，随后被furin样蛋白酶裂解，它作为25kDa的二硫化物连接的蛋白质被分泌(参见，例如，Fairlie et al.，J.Leukoc.Biol 65：2-5(1999))。GDF15 mRNA可见于几种组织中，包括肝脏、肾脏、胰腺、结肠和胎盘，肝脏中的GDF15表达在器官如肝脏、肾脏、心脏和肺的损伤期间可以被显著地上调。
GDF15前体是308个氨基酸的多肽(NCBI Ref.Seq.NP_004855.2；GI：153792495)，含有29个氨基酸的信号肽、167个氨基酸的前体结构域，以及112个氨基酸的成熟结构域，其通过furin样蛋白酶从前体结构域上被切下。
前体人GDF15多肽的氨基酸序列在下文提供：
这个308个氨基酸的GDF15多肽被称为“全长”GDF15多肽；112个氨基酸的GDF15多肽(“全长”GDF15的氨基酸197-308)是“成熟的”GDF15多肽。
本文使用的“GDF15”包括具有一氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列至少65％相同于成熟的人GDF15多肽的氨基酸序列。成熟的人GDF15多肽的氨基酸序列在下文提供：
上述示范性的成熟的人GDF15被用于实施例中描述的各种方法，包括产生包含GFRAL蛋白与GDF15蛋白的复合物的晶体。
除非另有陈述，术语“GDF15”是指112个氨基酸的成熟的人序列(例如，SEQ ID NO：1811)。此外，对具体GDF15残基的数字引述是指112个氨基酸的成熟序列(例如，SEQ ID NO：181的残基1是Ala(A)，残基112是Ile(I))。例如，虽然GDF15前体氨基酸序列预测了三个切割位点，产生三种推定的“成熟”人GDF15形式(例如，110、112和115个氨基酸)，112个氨基酸的成熟序列被认可为正确的。
在本公开内容的上下文中，“GDF15”或“GDF15蛋白”包括来自其他哺乳动物物种的GDF15直系同源体，以及其修饰的形式，包括它们的用途，包括小鼠(NP_035949；GI：170784848)、黑猩猩(XP_009433302.1；GI：694973734)、猩猩(XP_009251261.1 GI：686757768)、恒河猴(EHH29815；GI：355703324)、大熊猫(XP_002912774；GI：301753921)、长臂猿(XP_004089328.1；GI：441627981)、豚鼠(XP_003465238；GI：348558868)、雪貂(AER98997；GI：355689945)、牛(NP_001193227；GL329664989)、猪(NP_001167527；GL291291599)、狗(XP_541938；GL57101740)和鸭嘴兽(Ornithorhynchus anatinus；AFV61279；GL410111209)。这样的示范性的GDF15蛋白在附图2中显示，它包括各种示范性的GDF15蛋白的比对。人GDF15的成熟形式与小鼠直系同源体具有大约67％的氨基酸同一性。
“RET”在本领域中也称为Ret原癌基因、Cadherin相关家族成员16、转染期间重排的(Rearranged During Transfection)、RET受体酪氨酸激酶、Cadherin家族成员12、原癌基因C-Rer、EC 2.7.10.1、CDHF12、CDHR16、RET51、PTC、羟基芳基-蛋白激酶、RET转化序列和受体酪氨酸激酶，是转导细胞生长和分化的信号的细胞表面分子受体酪氨酸激酶之一。RET充当共同受体，已知是在结合GDNF受体alpha(GFRα)共同受体时的、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)配体(人，GDNF，artemin，神经营养因子和persephin)的初级信号转导受体。RET蛋白(例如，RET-ECD)包含4个连续的cadherin样结构域(CLD1-CLD4)，随后是膜近端富胱氨酸结构域(CRD)。如本文公开的，RET蛋白是GFRAL蛋白和GDF15蛋白的共同受体(例如，作为与RET蛋白的共同受体起作用)。本文描述的，受体复合物包括GFRAL蛋白，例如，RET/GFRAL复合物、GFRAL/GDF15复合物和RET/GFRAL/GDF15复合物。
如本文使用的，“Ret”或“RET”是指具有氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列至少75％相同于，例如，77％、79％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同于SEQ ID NO：1813的氨基酸序列。RET不同于TGFβRI和TGFβRII。SEQ ID NO：1812是缺乏信号肽的成熟的人RET9的序列。
全长前体人RET蛋白的氨基酸序列在下文提供，其包括信号肽序列(下划线的小写字母残基)：
因而，本文使用的“RET”或“RET蛋白”涵盖人RET及其变体，包括但不限于其直系同源体，例如鼠RET、猕猴RET，等。在某些实施方式中，RET可以是具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同于SEQ ID NO：1813的氨基酸序列的蛋白质。
在某些实施方式中，提供了分离的RET细胞外结构域(RET-ECD)多肽。当存在于本公开内容的分离的蛋白质复合物中时，RET-ECD可以结合配体例如GFRAL。术语“RET细胞外结构域”(“RET-ECD”)包括全长RET ECD、RET ECD片段和RET ECD变体。如本文使用的，术语“RET ECD”是指缺乏细胞内和/或跨膜结构域的、有或者没有信号肽的RET多肽。在某些实施方式中，RET ECD是指具有氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列至少75％相同于人全长RET ECD的氨基酸序列，所述人全长RET ECD具有氨基酸序列：
在另一个示范性的实施方式中，RET ECD是指具有氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列至少75％相同于人全长RET ECD的氨基酸序列，所述人全长RET ECD具有氨基酸序列：
本文使用的术语“全长RET ECD”是指延伸到细胞外结构域的最后一个氨基酸的RET ECD，可以包括或不包括N-末端信号肽。然而，注意的是“全长RET ECD”还涵盖在C-末端上延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸以包括跨膜结构域的氨基酸残基的RET-ECD，条件是所述多肽是可溶的。换句话说，RET ECD缺乏足够长度的跨膜结构域，从而它不能锚定到细胞膜中。用语“全长RET ECD”还涵盖在N-末端延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸以包括信号肽的氨基酸残基的RET-ECD。在某些实施方式中，RET片段是指至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同于本文描绘的RET的连续氨基酸序列，并且缺乏本文描绘的RET序列的C-末端的至少30、33、35、40、45、50或55个氨基酸或更多的连续氨基酸序列。
如本文使用的，术语“RET ECD片段”是指一个或更多个残基从全长ECD的N和/或C末端删除并保持了结合GFRAL蛋白的能力的RET ECD。在某些情况下，RET ECD片段可以包括或不包括N-末端信号肽。在某些情况下，RET ECD片段是缺乏以下序列的N-末端存在的1、5、10、15、16、17、18或19个残基的人RET ECD片段：
上文的示范性的RET ECD片段被用于实施例中描述的各种方法，包括产生包含RET蛋白、GFRAL蛋白和GDF15蛋白的复合物的模型。
在RET ECD的可选择的实施方式中，RET-ECD包含处在人全长RET ECD SEQ ID NO：1814的RET ECD序列中的C64R、N75Q、N166Q或C183S突变。
用语“调节活性和/或信号转导”在应用于结合蛋白例如结合本公开内容GFRAL的抗体时，是指所述结合蛋白(例如，抗体)模拟或调节由以下诱导的体外或体内生物学效果：(i)GFRAL蛋白；(ii)GDF15蛋白和GFRAL蛋白；或(iii)GDF15蛋白、GFRAL蛋白和RET蛋白。在评估抗-GFRAL抗体的结合和特异性时，例如，当反应等于或小于野生型GFRAL标准物(例如，人GFRAL蛋白的成熟形式)的活性的95％，优选的等于或小于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％时，结合GFRAL蛋白(例如，人GFRAL蛋白)的抗体或其片段被认为诱导生物学反应。当具有一种或更多种以下性质时，结合GFRAL(例如，人GFRAL)的抗体或其片段也被认为诱导生物学反应：在(1)ELK1-荧光素酶报告物分析(参见，例如，实施例3)中；或(2)U20S细胞中的ERK-磷酸化分析(参见，例如，实施例4)中，展现的效力水平等于或小于GFRAL标准物的95％，IC50等于或小于100nM，例如，90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM。
术语“结合蛋白”是指一种蛋白质，其包含结合GFRAL蛋白包括人GFRAL蛋白的部分(例如，一个或更多个结合区例如CDR)，任选地包含容许所述结合部分采取促进结合蛋白与GFRAL多肽、片段或表位结合的构象的支架或框架部分(例如，一个或更多个支架或框架区)。这样的结合蛋白的实例包括抗体，例如，人抗体、人源化抗体；嵌合抗体；重组抗体；单链抗体；双抗体(diabody)；三抗体(triabody)；四抗体(tetrabody)；Fab片段；F(ab′)2片段；IgD抗体；IgE抗体；IgM抗体；IgG1抗体；IgG2抗体；IgG3抗体；或IgG4抗体，以及其片段。所述结合蛋白可以包含，例如，具有移植的CDR或CDR衍生物的可选择的蛋白支架或人工支架。这样的支架包括但不限于，包含被导入以，例如，稳定所述结合蛋白的三维结构的突变的抗体衍生的支架，以及包含例如生物相容的聚合物的完全合成的支架。参见，例如Korndorfer et al.，2003，Proteins：Structure，Function，and Bioinformatics，53(1)：121-129(2003)；Roque et al.，Biotechnol.Prog.20：639-654(2004)。另外，可以使用肽抗体模拟物(“PAM”)，以及利用纤连蛋白成分作为支架的基于抗体模拟物的支架。在本公开内容的情境中，例如，当解离常数(KD)≤10-8M时，结合蛋白被称为特异性结合或选择性结合GFRAL。当KD≤10-9M或KD≤10-10M时，所述结合蛋白(例如，抗体)可以以高亲和力特异性结合GFRAL。在某些实施方式中，所述结合蛋白(例如，抗体)可以结合GFRAL，包括以约10-7M到约10-12M之间的KD，在其他实施方式中，所述结合蛋白(例如，抗体)可以以1-2×10-9M的KD结合。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”或“Ig”在文本中可互换地使用，用于广义上和特别地覆盖，例如，单独的抗-GFRAL单克隆抗体(包括激动性、拮抗性、中和性抗体，全长或完整的单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗-GFRAL抗体组合物，多克隆或单价的抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们展现了期望的生物学活性)，由至少两个完整抗体形成，单链抗-GFRAL抗体，以及抗-GFRAL抗体的片段，如下文所述。抗体可以是人的、人源化的、嵌合的和/或亲和力成熟的，以及来自其他物种例如小鼠、兔等的抗体。术语“抗体”意图包括处在多肽的免疫球蛋白类型之内的B细胞的多肽产物，其能够结合特定的分子抗原并且由两对相同的多肽链组成，其中每对具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，每条链的每个氨基末端部分包括约100到约130个或更多个氨基酸的可变区，每条链的每个羧基末端部分包括恒定区(参见，Borrebaeck(ed.)(1995)AntibodyEngineering，Second Ed.，Oxford University Press.；Kuby(1997)Immunology，ThirdEd.，W.H.Freeman and Company，New York)。在具体的实施方式中，可以被本文提供的抗体结合的所述特定的分子抗原包括GFRAL多肽、GFRAL片段或GFRAL表位。抗体还包括，但不限于，合成的抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、内抗体(intrabodies)、抗独特型(抗-Id)抗体以及上述任一项的功能性片段(例如，抗原结合片段，例如，GFRAL结合片段)，其是指抗体重链或轻链多肽的一部分，保持了衍生出所述片段的抗体的一些或全部结合活性。功能性片段(例如，抗原结合片段，例如GFRAL结合片段)的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性，等)、Fab片段、F(ab′)片段、F(ab)2片段、F(ab′)2片段、二硫化物连接的Fvs(sdFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和迷你抗体。特别是，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如，含有结合GFRAL抗原的抗原结合位点(例如，抗-GFRAL抗体的一个或更多个互补决定区(CDR))的抗原结合结构域或分子。这样的抗体片段可以见于，例如，Harlow and Lane，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1989)；Myers(ed.)，Molec.Biologyand Biotechnology：A Comprehensive Desk Reference，New York：VCH Publisher，Inc.；Huston et al.，Cell Biophysics，22：189-224(1993)；Pluckthun and Skerra，Meth.Enzymol.，178：497-515(1989)以及Day，E.D.，Advanced Immunochemistry，SecondEd.，Wiley-Liss，Inc.，New York，NY(1990)。本文提供的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，任何类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，或任何子类(例如，IgG2a和IgG2b)。抗GFRAL抗体可以是激动性抗体或拮抗性抗体。本文提供的抗体包括针对GFRAL的拮抗性抗体，例如，抑制GFRAL信号转导的抗体。示范性的抗-GFRAL抗体包括具有表1-24中显示的CDR的抗体。
术语“约”或“大约”是指给定的数值或范围的20％之内、15％之内、10％之内、9％之内、8％之内、7％之内、6％之内、5％之内、4％之内、3％之内、2％之内、1％或更低之内。
“抗原”是指抗体可以选择性结合的预定的抗原。目标抗原可以是多肽、碳水化物、核酸、脂质、半抗原或其他天然发生的或合成的化合物。在某些实施方式中，所述目标抗原是多肽。
术语“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”、“抗原结合区”和类似的术语是指抗体的部分，其包含与抗原相互作用的氨基酸残基，并为所述结合药剂赋予其对抗原的特异性和亲和力(例如，互补决定区(CDR)。
术语“结合(binds，binding)”是指分子之间的相互作用(例如，共价的或非共价的)，包括例如形成复合物。复合物还开包括通过共价键或非共价键、相互作用或力保持在一起的两个或更多个分子的结合。相互作用可以是，例如，非共价的相互作用，包括氢键、离子键、疏水性相互作用、和/或范德华相互作用。抗体上的单个抗原结合位点与目标分子例如GFRAL的单个表位之间总的非共价相互作用的强度是抗体或功能片段对该表位的亲和力(affinity)。抗体与单价抗原的缔合(k1)比分离(k-1)的比例(k1/k-1)是结合常数K，其是亲和力的度量。K的值因抗体与抗原的复合物的不同而变化，取决于k1和k-1两者。本文提供的抗体的结合常数K可以使用本文提供的任何方法或本领域技术人员公知的任何其他方法来测定。一个结合位点的亲和力不总是反映抗体与抗原之间的相互作用的真实强度。当复合抗原含有多个重复的抗原决定簇时，例如多价的GFRAL，与含有多个结合位点的抗体接触，在一个位点处抗体与抗原的相互作用将提高在第二个位点处反应的概率。多价抗体与抗原之间这种多相互作用的强度被称为亲合力(avidity)。相比抗体的单个结合位点的亲和力，抗体的亲合力是它的结合能力的更好的度量。例如，高亲合力可以补偿低亲和力，如有时在五聚的IgM抗体中发现的，它可能具有比IgG更低的亲和力，但是来自于它的多价性的IgM的高亲合力允许它有效地结合抗原。
术语“特异性结合GFRAL的抗体”、“特异性结合GFRAL表位的抗体”以及类似用语在本文中也可互换地使用，是指特异性结合GFRAL多肽，例如，GFRAL抗原、或片段、或表位(例如，人GFRAL，例如人GFRAL多肽、抗原或表位)的抗体。特异性结合GFRAL(例如，人GFRAL)的抗体可以结合GFRAL细胞外结构域或衍生自GFRAL的细胞外结构域的肽。特异性结合GFRAL抗原(例如，人GFRAL)的抗体可以与相关的抗原(例如，猕猴GFRAL)交叉反应。在某些实施方式中，特异性结合GFRAL抗原的抗体不与其他抗原交叉反应。通过免疫分析、Biacore或本领域技术人员已知的其他技术可以鉴定特异性结合GFRAL的抗体。如使用实验技术，例如，放射免疫分析(RIA)和酶联免疫吸附分析(ELISA)测定的，当抗体以比任何交叉反应性抗原更高的亲和力结合GFRAL抗原时，抗体特异性结合GFRAL抗原。一般地，特异性或选择性反应将至少两倍于背景信号或噪音，可以超过10倍背景。关于抗体特异性的讨论参见，例如Paul，ed.，1989，Fundamental Immunology Second Edition，Raven Press，New York，见第332336页。“结合”感兴趣的抗原(例如，目标抗原如GFRAL)的抗体是一种抗体，其以足够的亲和力结合所述抗原，从而所述抗体作为靶向表达所述抗原的细胞或组织的治疗药剂是有用的，并且不与其他蛋白质显著地交叉反应。在这样的实施方式中，抗体与“非目标”蛋白质结合的程度将低于抗体与它的特定目标蛋白质的结合的约10％，例如，根据荧光活化的细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)所测定的。关于抗体与目标分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性结合于”或“特异于”特定多肽或特定多肽目标上的表位是指可测量地不同于非特异性相互作用的结合。例如，通过测定与对照分子的结合相比的分子结合，可以测量非特异性结合，对照分子一般是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，特异性结合可以通过与类似目标的对照分子竞争来测定，例如，过量的未标记的目标。在这种情况下，如果标记的目标与探针的结合受到过量的未标记目标的竞争性抑制，表明特异性结合。文本使用的术语“特异性结合”或“特异性结合于”或“特异于”特定多肽或特定多肽目标上的表位，例如，可以通过具有至少约10-4M的对所述目标的Kd的分子来展现，作为选择，至少约10-5M，作为选择至少约10-6M，作为选择至少约10-7M，作为选择至少约10-8M，作为选择至少约10-9M，作为选择至少约10-10M，作为选择至少约10-11M，作为选择至少约10-12M，或更大。在一个实施方式中，术语“特异性结合”是指一种结合，其中分子结合特定的多肽或特定多肽上的表位，而基本上不结合任何其他多肽或多肽表位。在某些实施方式中，结合GFRAL的抗体具有小于或等于10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM的解离常数(Kd)。KD越低，抗-GFRAL抗体的亲和力越高。在某些实施方式中，抗体结合GFRAL的表位，所述表位在来自不同物种的GFRAL之间是保守的(例如，人和猕猴GFRAL之间)。
当在结合或竞争同一表位或目标上的结合位点的抗-GFRAL抗体(例如，结合GFRAL的拮抗性抗体和结合蛋白)的上下文中使用时，术语“竞争”是指通过分析测定的之间的竞争，在其中被研究的抗体(或结合片段)阻止或抑制参考分子(例如，参考配体，或参考抗原结合蛋白，例如，参考抗体)对共同抗原(例如，GFRAL或其片段)的结合。许多种类的竞争性结合分析可以用于确定测试抗体是否与参考抗体竞争GFRAL(例如，人GFRAL)的结合。可以采用的分析的实例包括固相的直接或间接放射免疫分析(RIA)，固相的直接或间接酶免疫分析(EIA)、夹心竞争分析(参见，例如，Stahli et al.，(1983)Methods in Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见，例如，Kirkland et al.，(1986)J.Immunol.137：3614-3619)；固相直接标记分析，固相直接标记夹心分析(参见，例如，Harlow and Lane，(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见，例如，Morel et al.，(1988)Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见，例如，Cheung，etal.，(1990)Virology 176：546-552)；以及直接标记RIA(Moldenhauer et al.，(1990)Scand.J.Immunol.32：77-82)。一般地，这样的分析涉及使用与固体表面结合的纯化的抗原(例如，GFRAL如人GFRAL)，或带有未标记的测试抗原结合蛋白(例如，测试抗-GFRAL抗体)或标记的参考抗原结合蛋白(例如，参考抗-GFRAL抗体)的细胞。可以通过在存在测试抗原结合蛋白的情况下测定与固体表面或细胞结合的标记物的数量来测量竞争性抑制。通常，测试抗原结合蛋白过量存在。通过竞争分析鉴定的抗体(竞争性抗体)包括结合参考抗体的同一表位的抗体，和/或结合距离参考所结合的表位足够近的相邻表位而发生抗体空间位阻的抗体。关于测定竞争性结合和/或对同一表位的结合的方法的其他细节在本文中描述。通常，当竞争性抗体蛋白质过量存在时，它将抑制参考抗体对共同抗原的特异性结合达到至少23％，例如，40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在某些情况下，结合被抑制至少80％、85％、90％、95％、96％或97％、98％、99％或更多。
术语“抗-GFRAL抗体”或“结合GFRAL的抗体”包括能够以足够的亲和力结合GFRAL的抗体，从而所述抗体作为靶向GFRAL的诊断和/或治疗药剂是有用的。在某些实施方式中，抗-GFRAL抗体与不相关的、非GFRAL蛋白结合的程度低于所述抗体对GFRAL的结合的约10％，例如，通过荧光活化的细胞分选(FACS)分析或免疫分析如放射免疫分析(RIA)所测量的。“特异性结合”或“特异于”GFRAL的抗体是本文说明的。在某些实施方式中，如本文描述的，结合GFRAL的抗体具有小于或等于10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM，和/或大于或等于0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方式中，抗体结合GFRAL的表位，所述表位在来自不同物种的GFRAL之间是保守的(例如，人和猕猴GFRAL之间)。
如本文使用的，术语“晶体”和“结晶的”是指以晶体形式存在的一种或更多种蛋白质或其片段。晶体是固态物质的一种形式，其不同于其他的形式如无定形固体状态或液晶状态。晶体由原子、离子、分子(例如，蛋白质如抗体)、或分子的组装物(例如，配体/受体或抗原/抗体复合物)的规则、重复的三维阵列组成。这些三维阵列根据本领域充分了解的特定数学关系排列。在晶体中重复的基本单位或构建块被称为不对称单元。符合给定的明确定义的晶体学对称性的不对称单元在排列中的重复提供了晶体的“晶胞”。在全部三个维度上通过规则平移，晶胞的重复提供了晶体。参见Giege，R.and Ducruix，A.Barrett，Crystallization of Nucleic Acids and Proteins，a Practical Approach，2nd ea.，pp.20 1-16，Oxford University Press，New York，N.Y.，(1999)。
“分离的”抗体基本上没有来自细胞或组织来源的细胞材料或其他污染蛋白，和/或来自衍生所述抗体的其他污染成分，或在化学合成时基本上没有化学前体或其他化学物质。用语“基本上没有细胞材料”包括抗体的制品，其中抗体从细胞的细胞成分分离，所述抗体分离自所述细胞或由所述细胞重组产生。因而，基本上没有细胞材料的抗体包括抗体的制品，其具有小于约30％、25％、20％、10％、5％或1％(干重)的异源蛋白质(本文也称为“污染蛋白质”)。在某些实施方式中，当所述抗体是重组产生的时，它基本上没有培养基，例如，培养基低于所述蛋白制品的体积的约20％、15％、10％、5％或1％。在某些实施方式中，当所述抗体通过化学合成产生时，它基本上没有化学前体或其他化学物质，例如，它与蛋白质合成中涉及的化学前体或其他化学物质分离。因而，这样的抗体制品具有小于约30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％(按干重)的目标抗体以外的化学前体或化合物。污染物成分还可以包括，但不限于，将干扰所述抗体的治疗用途的材料，可以包括酶、激素和其他蛋白的或非蛋白的溶质。在某些实施方式中，所述抗体将被纯化至(1)根据Lowry方法(Lowry etal.J.Bio.Chem.193：265-275，1951)测量的按抗体的重量计算大于95％，例如按重量计算96％、97％、98％或99％，(2)达到通过使用旋转杯测序仪足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)达到通过使用考马斯亮蓝或优选的银黄染色在还原或非还原条件下SDS-PAGE的同质性。分离的抗体包括重组细胞内原位的抗体，因为不存在抗体的天然环境的至少一种成分。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。在具体的实施方式中，本文提供的抗体是分离的。
4链抗体单元是杂四聚的糖蛋白，由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。对于IgG来说，4链单元一般约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键与H链相连，而两个H链取决于H链同种型通过一个或多个二硫键相互连接。每个H和L链也具有有规则地间隔的链内二硫键。每个H链在N-末端具有可变域(VH)，对于每个α和γ链继之以三个恒定域(CH)、对于μ和ε同种型继之以四个CH域。每个L链在N-末端具有可变域(VL)，在另一个末端继之以恒定域(CL)。VL与VH联合，CL与重链的第一个恒定区(CH1)联合。特定的氨基酸残基被认为形成了轻链和重链可变区之间的界面。VH和VL的配对一同形成了单个抗原结合位点。对于不同种类的抗体的结构和性质，参见例如，Basic and Clinical Immunology，8thEdition，Daniel P.Sties，Abba I.Terr and Tristram G.Parsolwparslow(eds.)，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。
术语“可变区”或“可变域”是指抗体的轻链或重链的一部分，其一般位于轻链或重链的氨基末端，重链中长度约120到130个氨基酸，轻链中长度约100到110个氨基酸，用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。重链可变区可以称为“VH”。轻链可变区可以称为“VL”。术语“可变”是指在抗体之中可变区的某些片段在序列上广泛地不同的事实。V区介导抗原结合并确定了特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变区的110个氨基酸跨度上不是均匀分布的。而是，V区由约15-20个氨基酸、称为框架区(FR)的较低可变的(例如，相对不变的)延伸组成，框架区被各约9-12个氨基酸长度、称为“高变区”的更大变异性(例如，极高变异性)的较短的区域分隔。重链和轻链的可变区每个都包含四个FR，主要采取β-片层结构，通过三个高变区连接，高变区形成环形连接，在某些情况下形成β-片层结构的部分。每条链中的高变区通过FR紧密邻近地结合在一起，与来自另一个链的高变区一起，致力于形成抗体的抗原结合位点(见Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)。恒定区不直接涉及抗体与抗原的结合，但是显示出各种效应物功能，例如参与抗体依赖细胞细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。在不同的抗体之间可变区在序列上广泛地不同。序列中的变异性集中在CDR中，可变区中较少变化的部分称为框架区(FR)。轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用。在具体的实施方式中，所述可变区是人可变区。
术语“Kabat中的可变区残基编号”或“Kabat中的氨基酸位置编号”以及其变体，是指在Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)中用于抗体编码的重链可变区或轻链可变区的编号系统。使用这种编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有少数或额外的氨基酸相应于可变域的FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变域可以包括在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)，以及在重链FR残基82之后插入的残基(例如，根据Kabat，残基82a、82b和82c等)。通过在抗体序列同源性的区域与“标准”Kabat编号的序列比对，可以确定给定抗体的残基的Kabat编号。当提及可变域(大致上，轻链的残基1-107，重链的残基1-113)中的残基时，一般使用Kabat编号系统(例如Kabat et al.，Sequences of Immunological Interest.5th Ed.Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，一般使用″EU编号系统″或″EU索引″(例如，上文的Kabatet al.中报道的EU索引)。“Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体中的残基编号。已经描述了其他编号系统，包括，例如，AbM、Chothia、Contact、IMGT和AHon。表1-24中说明各种编号系统。
“完整的”抗体是包含抗原结合位点以及轻链恒定区CL和至少重链区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可以包括人恒定区或其氨基酸序列变体。优选的，完整的抗体具有一种或多种效应物功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选地包含完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括，无限制地，Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体和双-双抗体(参见，例如，Holliger，P.et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：6444-8；Lu，D.et al.，(2005)J.Biol.Chem.280：19665-72；Hudson et al.，Nat.Med.9：129-134(2003)；WO 93/11161；和美国专利No.5,837,242和6,492,123)；单链抗体分子(参见，例如，美国专利No.4,946,778；5,260,203；5,482,858和5,476,786)；双可变域抗体(参见，例如，美国专利No.7,612,181)；单可变域抗体(SdAbs)(参见，例如，Woolven et al.，Immunogenetics 50：98-101，1999；Streltsov et al.，Proc Natl Acad Sci USA.101：12444-12449，2004)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
治疗性抗体的“功能性片段”或“结合片段”或“抗原结合片段”将展现至少一种归因于完整抗体的生物学功能，如果不是展现部分或全部所述功能的话，所述功能至少包含结合目标抗原(例如，GFRAL结合片段或结合GFRAL的片段)。
本文使用的术语“融合蛋白”是指一种多肽，其包含抗体的氨基酸序列和异源多肽或蛋白质(例如，正常不是抗体的一部分的多肽或蛋白质(例如，非抗-GFRAL抗原结合抗体))的氨基酸序列。术语“融合”在与GFRAL或抗-GFRAL抗体相关联地使用时，是指肽或多肽、或其片段、变体和/或衍生物与异源的肽或多肽的连接。在某些实施方式中，所述融合蛋白保持GFRAL或抗-GFRAL抗体的生物学活性。在某些实施方式中，所述融合蛋白包含GFRAL抗体VH区、VL区、VH CDR(一个、两个或三个VH CDR)，和/或VL CDR(一个、两个或三个VLCDR)，其中所述融合蛋白结合GFRAL表位、GFRAL片段和/或GFRAL多肽。
当提及抗体使用时，术语“重链”是指一种约50-70kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约120到130或更多个氨基酸的可变区，羧基末端部分包括恒定区(例如，CH1、CH2、CH3、CH4)。恒定区可以是五种不同的类型(例如，同种型)之一，基于重链恒定区的氨基酸序列，称为alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(λ)和mu(μ)。不同的重链在大小上不同：α、δ和γ含有大约450个氨基酸，而μ和ε含有大约550个氨基酸。当与轻链组合时，这些不同的重链类型产生五种公知的抗体类别(例如，同种型)，分别为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括四种IgG的子类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。重链可以是人类重链。
当提及抗体使用时，术语“轻链”是指约25kDa的多肽链，其中氨基末端包括约100到约110个或更多个氨基酸的可变区，羧基末端部分包括恒定区。轻链的大约长度是211到217个氨基酸。基于恒定区的氨基酸序列，存在两种不同的类型，称为kappa(κ)和lambda(λ)。轻链氨基酸序列是本领域公知的。轻链可以是人轻链。
本文使用的术语“有效量”是指治疗(例如，本文提供的抗-GFRAL抗体或药物组合物；参见，例如，包含如表1-24所示的CDR、VH和/或VL序列的抗体)的数量，其足以降低症状的严重度和/或症状的频率，消除症状和/或底层病因，防止症状和/或它们的底层病因的发生，和/或改善或补救由GDF15介导的疾病、失调或状况引起或与之相关的损伤，例如，不自主的体重减轻、葡萄糖代谢失调或体重失调。这一术语还涵盖降低或改善给定的GDF15介导的疾病、失调或状况的发展或进展，降低或改善GDF15介导的疾病、失调或状况的复发、发展或发作，和/或改善或增强其他治疗(例如，不同于本文提供的抗-GFRAL抗体的治疗)的预防或治疗效果所必需的数量。在某些实施方式中，所述有效量在一个或更多个剂量中施用，包括间歇的剂量，其中一个或更多个剂量在治疗期中给予，随后是不施用抗体的休息期(例如，一个周期的治疗期和休息期可以接续其他周期，一个或更多个治疗期后续一个或更多个休息期)。在某些实施方式中，本文提供的抗体的有效量是约0.1mg/kg(每公斤对象体重的抗体mg数)到约100mg/kg。在某些实施方式中，本文提供的抗体的有效量是约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg或约100mg/kg(或其中的范围)。在某些实施方式中，本文使用的有效量还指本文提供的抗体实现指定的结果(例如，模拟或调节由(i)GFRAL；(ii)GDF15与GFRAL；或(iii)GDF15、GFRAL与RET的结合所诱导的体外或体内生物学效果)的数量。例如，有效量包括有效实现以下的本文描述的抗-GFRAL抗体的数量(例如，在一个或更多个剂量中)：(i)提高体重；(ii)维持体重；(iii)降低体重损失；(iv)提高身体质量(例如，瘦质量或脂肪质量)；(v)维持身体质量(例如，瘦质量或脂肪质量)或(vi)降低身体质量的损失(例如，瘦质量或脂肪质量)。
如本文使用的，术语“宿主细胞”是指可以用核酸分子转染的特定接受细胞，以及这样的细胞的子代或可能的子代。这样的细胞的子代可能由于可能存在于后续世代中的突变或环境影响、或核酸分子向宿主基因组中的整合而不相同于所述核酸分子转染的亲本细胞
术语“免疫调节剂”与其变体包括但不限于，如本文使用的免疫调节剂是指调节宿主的免疫系统的药剂。在某些实施方式中，在本文提供的组合治疗中使用的免疫调节剂不包括抗-GFRAL抗体或抗原结合片段。免疫调节剂包括但不限于小分子、肽、多肽、蛋白质、融合蛋白、抗体、无机分子、模拟药剂和有机分子。术语“小分子”和类似术语包括但不限于肽、肽模拟物、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、分子量小于约10,000克每摩尔的有机或无机化合物(即，包括杂有机化合物和/或有机金属化合物)、分子量小于约5,000克每摩尔的有机或无机化合物、分子量小于约1,000克每摩尔的有机或无机化合物，分子量小于约500克/摩尔的有机或无机化合物，以及这些化合物的盐、酯和其他药学上可接受的形式。在某些实施方式中，免疫调节剂是免疫刺激剂。在某些实施方式中，免疫调节剂是免疫抑制剂。在某些实施方式中，免疫调节剂是调节(例如，抑制或刺激)被称为免疫检查点分子的蛋白质的药剂(例如，共抑制性或共刺激性)，例如，C10orf54、CD86、CD80、PDL-1、PDL-2、CTLA-4、PD1、LAG3、BTNL2、B7-H3、B7-H4、嗜乳脂蛋白、CD48、CD244、TIM-3、CD200R、CD200、CD160、BTLA、HVEM、LAIR1、TIM1、Galectin 9、TIM3、CD48、2B4、CD155、CD112、CD113和TIGIT(例如，共抑制性的)，和/或CD154、TNFRSF25、GITR、4-1BB、OX40、CD27、TMIGD2、ICOS、CD28、CD40、TL1A、GITRL、41BBL、OX40L、CD70、HHLA2、ICOSL、细胞因子、LIGHT、HVEM、CD30、CD30L、B7-H2、CD80、CD86、CD40L、TIM4、TIM1、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112、DR3、GITR、CD2、和CD226(例如，共刺激性的)。
本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群体中获得的抗体，例如，除了可能以少量存在的可能天然发生的突变之外，包含所述群体的单独的抗体是相同的，并每个单克隆抗体一般将识别抗原上的单个表位。在具体的实施方式中，本文使用的“单克隆抗体”是由单个杂交瘤或其他细胞产生的抗体，其中所述抗体仅结合GFRAL表位，例如，通过ELISA或本领域已知的其他抗原结合或竞争结合分析所测定。术语“单克隆”不限于制造所述抗体的任何特定方法。例如，在本公开内容中有用的单克隆抗体可以通过由Kohler et al.，Nature，256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或可以使用在细菌、真核动物或植物细胞中的重组DNA方法制得(参见，例如，美国专利4,816,567)。“单克隆抗体”也可以利用，例如，Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库中分离。制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其他方法是本领域公知的(参见，例如Chapter 11 in：ShortProtocols in Molecular Biology，(2002)5th Ed.，Ausubel et al.，eds.，John Wileyand Sons，New York)。在本文的实施例中提供了生产单克隆抗体的示范性的方法。
当与生物材料例如核酸分子、多肽、宿主细胞等一起使用时，术语“天然”是指在自然中发现并且未被人操纵、修饰或改变(例如，分离、纯化、选择)的那些。
本文提供的抗体可以包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分相同于或同源于衍生自特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列，而所述链的其余部分相同于或同源于衍生自另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列，以及这样的抗体的片段，只要它们展现了期望的生物学活性(参见，例如，美国专利No.4,816,567；和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。
非人类(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是包括人免疫球蛋白(例如，接受者抗体)的嵌合抗体，其中天然的CDR残基被具有期望的特异性、亲和力和能力的、来自非人类物种例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的相应CDR的残基替代。在某些情况下，人免疫球蛋白的一个或更多个FR区残基被相应的非人类残基替代。此外，人源化抗体可以包含接受体抗体或供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步提高抗体性能。人源化抗体重链或轻链可以实质上包含所有的至少一个或更多个可变区，其中所有的或基本上所有的CDR相应于非人类免疫球蛋白的CDR，以及所有的或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。在某些实施方式中，所述人源化抗体将包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般地是人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节参见Jones et al.，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)；Carter et al.，Proc.Natl.Acd.Sci.USA 89：4285-4289(1992)；以及美国专利Nos：6,800,738(2004年10月5日授予)、6,719,971(2005年9月27日授予)、6,639,055(2003年10月28日授予)、6,407,213(2002年6月18日授予)和6,054,297(2000年4月25日授予)。
“人类抗体”是一种具有一氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列相应于人类产生的抗体的氨基酸序列，和/或是利用本文公开的生产人类抗体的任何技术制备的。人类抗体的这种定义特别地排除了包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可以利用本领域已知各种技术来产生，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581(1991))和酵母展示文库(Chao et al.，Nature Protocols 1：755-768(2006))。制备人单克隆抗体可用的还有Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner etal.，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)中描述的方法。还参见van Dijk and van deWinkel，Curr.Opin.Pharmacol.，5：368-74(2001)。可以通过向转基因动物施用抗原来制备人抗体，所述转基因动物已经被修饰以响应抗原攻击产生这样的抗体，但是它们的内源基因座已经失能，例如，小鼠(参见，例如，Jakobovits，A.，Curr.Opin.Biotechnol.1995，6(5)：561-6；Bruggemann and Taussing，Curr.Opin.Biotechnol.1997，8(4)：455-8；以及关于XENOMOUSETM技术的美国专利Nos.6,075,181和6,150,584)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，还参见，例如，Li et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)。
“CDR”是指免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ-片层框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)之一，或抗体VLβ-片层框架的非框架区内的三个高变区(L1、L2或L3)之一。因而，CDR是框架区序列内散布的可变区序列。CDR区是本领域技术人员已知的，已经由例如Kabat定义为抗体可变(V)结构域内最为高变性的区域(Kabat et al.，J.Biol.Chem.252：6609-6616(1977)；Kabat，Adv.Prot.Chem.32：1-75(1978))。CDR区序列还由Chothia在结构上定义为不属于保守的β-片层框架部分的那些残基，因而能够采取不同的构象(Chothia andLesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。两种命名法都是本领域公知的。CDR区序列还被AbM、Contact和IMGT定义。CDR区序列在表1-24中说明。典型的抗体可变区内CDR的位置已经通过比较大量结构来确定(Al-Lazikani et al.，J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；Moreaet al.，Methods 20：267-279(2000))。由于在不同的抗体中高变区内的残基数目不同，相对于典型位置的额外残基通常用a、b、c等紧接着典型可变区编号方案中的残基号来编号(Al-Lazikani et al.，supra(1997))。这样的命名法类似地是本领域技术人员公知的。
在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指在序列上高变的和/或形成结构上限定的环的抗体可变区的区域。一般地，抗体包含六个高变区；三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。多种高变区轮廓都在使用中，并被涵盖在本文中。Kabat互补决定区(CDR)基于序列变异性，是最常用的(参见，例如，Kabat et al.，Sequences ofProteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。Chothia代之以指定结构环的位置(参见，例如，Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。取决于环的长度，当使用Kabat编号规则来编号时，Chothia CDR-H1环的末尾在H32和H34之间可变(这是因为Kabat编号方案将插入物置于H35A和H35B处；如果既不存在35A又不存在35B，环末尾在32处，如果仅存在35A，环末尾在33处；如果35A和35B都存在，环末尾在34处)。AbM高变区代表了KabatCDR与Chothia结构环之间的折中，被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用(参见，例如Martin，in Antibody Engineering，Vol.2，Chapter 3，Springer Verlag)。“contact”高变区基于可用的复合物晶体结构的分析。来自这些高变区或CDR的每一个的残基在下文中标注。
近来，已经发展出一种通用的编号系统并被广泛采用，ImMunoGeneTics(IMGT) Information(Lafranc et al.，Dev.Comp.Immunol.27(1)：55-77(2003))。IMGT 是一种专用于人和其他脊椎动物的免疫球蛋白(IG)、T细胞受体(TR)和主要组织相容性复 合体(MHC)的整合的信息系统。在本文中，就轻链或重链中的氨基酸序列和位置而言提及 CDR。免疫球蛋白可变域的结构内CDR的“位置”在物种之间是保守的，存在于称为环的结构 中，通过使用根据结构特征来比对可变域序列的编号系统，CDR和框架残基可以容易地鉴 定。这种信息可以用于将来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基移植或替换到来自一般为 人类抗体的接受体框架中。Honegger and Pluckthun，J.Mol.Biol.309：657-670(2001)开 发了其他编号系统(AHon)。包括例如Kabat编号系统和IMGT唯一编号系统的编号系统之间 的相应性是本领域技术人员公知的(参见，例如，Kabat，supra；Chothia and Lesk，supra； Martin，supra；Lefranc et al.，supra)，也在表1-24中列出了。本文显示的示范性的系统 组合了Kabat和Chothia。
示范 IMGT Kabat AbM Chothia Contact
V<sub>H</sub> CDR1 26-35 27-38 31-35 26-35 26-32 30-35
V<sub>H</sub> CDR2 50-65 56-65 50-65 50-58 53-55 47-58
V<sub>H</sub> CDR3 95-102 105-117 95-102 95-102 96-101 93-101
V<sub>L</sub> CDR1 24-34 27-38 24-34 24-34 26-32 30-36
V<sub>L</sub> CDR2 50-56 56-65 50-56 50-56 50-52 46-55
V<sub>L</sub> CDR3 89-97 105-117 89-97 89-97 91-96 89-96
高变区可以包括“延长的高变区”，如下：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-96(L3)，以及VH中的26-35A(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。如本文使用的，术语“HVR”和“CDR”可以互换地使用。
术语“恒定区”或“恒定域”是指轻链和重链的羧基末端部分，其不直接涉及抗体与抗原的结合，但展现各种效应物功能，例如，与Fc受体的相互作用。该术语是指相对于免疫球蛋白的其他部分-含有抗原结合位点的可变区，具有更为保守的氨基酸序列的免疫球蛋白分子的部分。恒定区可以含有重链的CH1、CH2和CH3区，以及轻链的CL区。
术语“框架”或“FR”残基是CDR侧翼的那些可变区残基。FR残基存在于例如嵌合的、人源化的、人类的结构域抗体，双抗体、线性抗体和双特异性抗体中。FR残基是高变区残基或CDR残基以外的那些可变域残基。
“亲和力成熟的”抗体是一种抗体，在它的一个或更多个HVR中具有一个或更多个改变(例如，氨基酸序列变异，包括改变、添加和/或删除)，其引起与不拥有这些改变的亲本抗体相比所述抗体对抗原的亲和力的改善。优选的亲合成熟的抗体将具有对于目标抗原的纳摩尔乃至皮摩尔的亲和力。亲和成熟的抗体通过本领域已知的过程产生。对于综述，参见Hudson and Souriau，Nature Medicine 9：129-134(2003)；Hoogenboom，NatureBiotechnol.23：1105-1116(2005)；Quiroz and Sinclair，Revista Ingeneria Biomedia4：39-51(2010)。
“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体是指一种抗体，其抑制或降低它所结合的抗原(例如，本文描述的GFRAL)的生物学活性。例如，阻断性抗体或拮抗性抗体可以实质上或完全地抑制抗原(例如，本文描述的GFRAL)的生物学活性。
“激动性抗体”是一种触发响应的抗体，例如，模拟了目标多肽的至少一种功能活性的响应。激动性抗体包括作为配体模拟物的抗体，例如，其中配体结合细胞表面受体，所述结合经由细胞间的信号转导途径诱导细胞信号转导或活性，以及其中所述抗体诱导相似的细胞信号转导或活化。
GFRAL的“拮抗剂”是指一种分子(例如，抗体)，其能够可检测地抑制或降低GFRAL的一种或更多种生物学活性，例如，在表达GFRAL的细胞中。在某些实施方式中，例如，通过可检测地抑制或降低表达GFRAL的细胞的活化和/或细胞信号转导途径，从而相对于不存在拮抗剂的情况下GFRAL介导的生物学活性，可检测地降低细胞的GFRAL介导的生物学活性，GFRAL的拮抗剂(例如，本文描述的激动性抗体)可以起作用。在某些实施方式中，本文提供的抗体是拮抗性抗-GFRAL抗体，包括抑制包含GFRAL、GDF15和/或RET的复合物的信号转导的抗体。由GFRAL拮抗剂引起的所述抑制或降低不必是完全的，只要它是使用分析可检测的。例如，下文的实施例中描述的基于细胞的分析可以用于分析GFRAL的生物学活性。
“结合亲和力”一般是指分子(例如，结合蛋白，如抗体)的单个结合位点与它的结合配体(例如，抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另外说明，本文使用的“结合亲和力”是指内在的结合亲和力，其反映了结合配对(例如，抗体和抗原)的成员之间1∶1的相互作用。结合分子X对它的结合伴侣Y的亲和力一般可以通过解离常数(KD)来表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文描述的那些。低亲和力抗体一般缓慢地结合抗原，倾向于容易离解，而高亲和力抗体一般更快地结合抗原并倾向于保持结合更久。测量结合亲和力的各种方法是本领域已知的，它们的任一个都可以用于本公开内容内容。具体的说明性的实施方式包括以下的。在一个实施方式中，“KD”或“KD值”可以通过本领域已知的分析来测量，例如通过结合分析。KD可以在放射性标记的抗原结合分析(RIA)中测量，例如，用目标抗体的Fab版本和它的抗原来进行(Chen，et al.，(1999)J.Mol Biol 293：865-881)。KD或KD值还可能使用Biacore的表面胞质团共振分析来测量，使用例如BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)，或通过生物层干涉测量，使用例如OctetQK384系统(ForteBio，Menlo Park，CA)来测量。“on速率”或“结合的速率”或“结合速率”或“kon”也可以使用例如BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)或OctetQK384系统(ForteBio，Menlo Park，CA)用如上文描述的相同的表面胞质团共振或生物层干涉测量技术来测定。
用语“基本上相似的”或“基本上相同的”是指两个数值之间足够高程度的相似性(例如，一个与本公开内容抗体相关，另一个与参考抗体相关)，从而本领域的技术人员将认为这两个值之间的差异在由所述值(例如，KD值)衡量的生物学特征的场景下有很小的或没有生物学和/或统计学的显著性。例如，作为参考抗体的值的函数，两个值之间的差异可以小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％。
本文使用的用语“实质上降低的”或“实质上不同的”是指两个数值之间足够高程度的差异(例如，一个与本公开内容的抗体相关，另一个与参考抗体相关)，从而本领域的技术人员将认为这两个值之间的差异在由所述值衡量的生物学特征的场景下具有统计学的显著性。例如，作为参考抗体的值的函数，所述两个值之间的差异优选地可以大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％、大于约50％。
抗体“效应物功能”是指归因于抗体的Fc区(例如，天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)、随抗体同种型变化的那些生物学的活性。抗体效应物功能的实例包括：Clq结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的负调节；和B细胞活化。
术语“Fc区”在本文中用于限定免疫球蛋白重链的C-末端，包括，例如，天然序列Fc区、重组Fc区和变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，人IgG重链Fc区常常限定为从位置Cys226的氨基酸残基，或从Pro230，延伸到其羧基末端。Fc区的C-末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可以被移除，例如，在抗体的生产或纯化期间，或通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程化。因而，完整抗体的组合物可以包含所有K447残基被移除的抗体群体、K447残基没有被移除的抗体群体、以及有或者没有K447残基的抗体的混合物的抗体群体。
“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应物功能”。示范性的“效应物功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的减量调节等。这样的效应物功能一般需要Fc区与结合区或结合结构域(例如，抗体可变区或可变域)组合，可以使用本文公开的和/或本领域已知的各种分析来评估。
“天然序列Fc区”包含与自然中存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列，并且未被人操纵、修饰和/或改变(例如，分离、纯化、选择，包括或与其他序列例如可变区序列组合)。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区(非A和A同种型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区，以及其天然发生的变体。
“变体Fc区”包含一氨基酸序列，所述氨基酸序列与天然序列Fc区不同在于至少一个氨基酸修饰(例如，取代、添加或删除)，优选的一个或更多个氨基酸取代。优选地，相比天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区，变体Fc区在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸取代，例如，约一个到约十个氨基酸取代，优选地约一个到约五个氨基酸取代。本文的变体Fc区优选地将具有与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区至少约80％的同源性，更优选地至少约90％的同源性，例如，至少约95％的同源性。例如，在人IgG1 Fc序列中的两个位置上两个氨基酸改变为丙氨酸的变体在下文提供的氨基酸序列中以粗体显示：
例如，在截短的人IgG1 Fc序列中两个位置上两个氨基酸变为丙氨酸的变体，其中缺乏C-末端赖氨酸残基(IgG1ΔK Fc)，在下文提供的氨基酸序列中以粗体显示：
例如，人IgG1 Fc序列的截短变体，其中缺乏C-末端赖氨酸残基(IgG1ΔK Fc)，在下文提供的氨基酸序列中显示：
例如，在人IgG4 Fc序列中的位置上氨基酸改变为脯氨酸的变体在下文提供的氨基酸序列中以粗体显示：
例如，在人IgG4 Fc序列中的位置上氨基酸改变为脯氨酸的变体，其中缺乏C-末端赖氨酸(IgG4ΔK Fc)，在下文提供的氨基酸序列中以粗体显示：
例如，在人IgG1 Fc序列中的位置上氨基酸改变为谷氨酰胺的变体在下文提供的氨基酸序列中以粗体显示：
表1-24和附图4A、5A、5C、5E、6A、7A、8A、9A和10A的所有VH结构域可以与本文描述的变体Fc区组合。包含变体Fc区的示范性的重链构建体包括以下构建体，其名称如下显示；可变区序列是粗体的，CDR序列是下划线的：
3P10 Fab Hc：
25M22 Fab Hc：
8D8FabHc：
5F12FabHc：
“轻链恒定区”包括kappa和lambda恒定区。表1-24和附图4B、5B、5D、5F、6B、7B、8B、9B和10B的任何VL结构域可以与本文描述的kappa或lambda恒定域组合。
下文提供了示范性的kappa恒定区：
下文提供了示范性的lambda恒定区：
包含恒定区的示范性的轻链构建体包括以下构建体，其名称如下显示；可变区序列是粗体的，CDR序列是下划线的：
3P10 Fab Lc：
25M22 Fab Lc：
8D8 Fab Lc：
5F12 Fab Lc：
术语“变体”当与GFRAL或抗-GFRAL抗体相关联地使用时，可以指肽或多肽，其与天然的或未修饰的GFRAL序列相比包含一个或更多个(例如，约1个到约25个，约1个到约20个，约1个到约15个，约1个到约10个，或约1个到约5个)氨基酸序列取代、删除和/或添加。例如，GFRAL变体可以产自对天然GFRAL的氨基酸序列的一个或更多个(例如，约1个到约25个，约1个到约20个，约1个到约15个，约1个到约10个，或约1个到约5个)改变。还举例来说，抗-GFRAL抗体的变体可以产自对天然的或早先未修饰的抗-GFRAL抗体的氨基酸序列的一个或更多个(例如，约1个到约25个，约1个到约20个，约1个到约15个，约1个到约10个，或约1个到约5个)改变。变体可以是天然发生的，例如，等位变体或剪接变体，或可以是人工构建的。多肽变体可以从编码所述变体的相应核酸分子制备。在某些实施方式中，GFRAL变体或抗-GFRAL抗体变体至少分别保持了GFRAL或抗-GFRAL抗体功能活性。在某些实施方式中，抗-GFRAL抗体变体结合GFRAL，和/或拮抗GFRAL活性。在某些实施方式中，抗-GFRAL抗体变体结合GFRAL，和/或激动GFRAL活性。在某些实施方式中，所述变体由核酸分子的单核苷酸多态性(SNP)变体编码，所述核酸分子编码GFRAL或抗-GFRAL抗体VH或VL区或亚区，例如，一个或更多个CDR。
术语“载体”是指一种物质，其被用于携带或包括核酸序列，包括例如，为了向宿主细胞倒入核酸序列。适合使用的载体包括，例如，表达载体、质粒、噬菌体载体、病毒载体、游离体和人工染色体，它们可以包括可操作的选择序列或标志物用于稳定整合到宿主细胞的染色体中。另外，所述载体可以包括一个或更多个可选择标记物基因和适当的表达控制序列。例如，可以包括的可选择标记物基因提供了对抗生素或毒素的抗性，补充营养缺陷性缺陷、或供应培养基中不存在的关键营养物。表达控制序列可以包括组成型和可诱导启动子、转录增强子、转录终止子等，这些是本领域公知的。当两个或更多个核酸分子要共表达时(例如，抗体重链和轻链两者，或抗体VH和VL)，两个核酸分子可以插入到例如单个表达载体中，或独立的表达载体中。对于单载体表达，编码核酸可以可操作地连接到一个共同的表达控制序列，或连接到不同的表达控制序列，例如，一个可诱导启动子和一个组成型启动子。核酸分子导入宿主细胞可以使用本领域公知的方法来确认。这样的方法包括，例如，核酸分析，如Northern印迹或聚合酶链式反应(PCR)、mRNA扩增、或基因表达产物的免疫印迹、或其他测试导入的核酸的表达或它的相应基因产物的适合的分析方法。本领域技术人员理解的是，核酸分子以足够的数量表达以产生期望的产物(例如，本文提供的抗-GFRAL抗体)，进一步理解的是表达水平可以使用本领域公知的方法进行优化以获得足够的表达。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞毒性形式，在其中分泌的Ig结合到存在于某些细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、嗜中性细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)上，允许这些细胞毒性效应物细胞特异性地与携带抗原的靶细胞结合，随后用细胞毒素杀死所述靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且是这样的杀伤所绝对需要的。调节ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcyRII和FcγRIII。在造血细胞上的FcR表达是已知的(参见，例如，Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)，表3，第464页)。为评估感兴趣分子的ADCC活性，可以进行体外ACDD分析(参见，例如，美国专利No.5,500,362或5,821,337)。用于这类分析的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。作为选择或另外地，感兴趣分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在动物模型中(参见，例如，Clynes et al.(USA)95：652-656(1998))。可以选择使用有很小或没有ADCC活性的抗体。
“Fc受体”或“FcR”描述了与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人类FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的(gamma受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII子类的受体，包括这些受体的等位变体和选择性剪接的形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(″活化性受体″)和FcγRIIB(″抑制性受体″)，它们具有相似的氨基酸序列，主要在其细胞质结构域中不同(参见，例如，review Daeron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR是已知的(参见，例如，Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel et al.，Immunomethods 4：25-34(1994)；和de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995))。其他FcR，包括那些将来要被鉴定的，也被涵盖在本文的术语“FcR”中。该术语还包括新生儿受体FcRn，其对母亲的IgG向胎儿传递负责(参见，例如，Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))。已经描述了具有改善的或降低的FcR结合的抗体变体(参见，例如，WO 2000/42072；美国专利Nos.7,183,387，7,332,581和7.335,742；Shields et al.J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在存在补体时目标细胞的裂解。经典的补体途径的活化起始于补体系统(C1q)的第一个组分与(适当子类的)抗体结合，所述抗体被结合到它们的相关抗原上。为了评估补体激活，可以进行CDC分析(参见，例如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996))。已经描述了具有改变的Fc区氨基酸序列的多肽变体(具有变体Fc区的多肽)以及提高或降低的C1q结合能力(参见，例如，美国专利No.6,194,551，WO 1999/51642，Idusogie et al.J.Immunol.164：4178-4184(2000))。可以选择使用有很小或没有CDC活性的抗体。
为了计算同一性百分比，被比较的序列可以按照给出序列之间的最大匹配的方式进行对准。可以用于确定同一性百分比的计算机程序是GCG程序，其包括GAP(Devereux etal.，(1984)Nucl.Acid Res.12：387；Genetics Computer Group，University ofWisconsin，Madison，Wis.)。计算机算法GAP被用于对准要确定序列同一性百分比的两个多肽或多核苷酸。序列可以为了它们相应的氨基酸或核苷酸的最佳匹配进行对准(根据该算法确定的“匹配的跨度”)。缺口开放罚分(其被计算为平均对角线的3倍，其中“平均对角线”是所使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是通过特定的比较矩阵分配给每个完美氨基酸匹配的分值或分数)，缺口延伸罚分(其通常是缺口开放罚分的1/10倍)，以及比较矩阵例如PAM250或BLOSUM 62与所述算法一起使用。在某些实施方式中，所述算法还使用标准比较矩阵(PAM250比较矩阵参见Dayhoff et al.，(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure 5：345-352；BLOSUM 62比较矩阵参见Henikoff et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915-10919)。
利用GAP程序确定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的示范性的参数如下：(i)算法：Needleman et al.，1970，J.Mol.Biol.48：443-453；(ii)比较矩阵：BLOSUM 62，来自Henikoff et al.，1992，supra；(iii)缺口罚分：12(但是末端缺口没有罚分)(iv)缺口长度罚分：4；和(v)相似性的阈值：0。
对准两个氨基酸序列的某些对准方案可以产生两个序列的仅有短区域的匹配，这种小的对准区域可能具有非常高的序列同一性，而在两个全长序列之间没有显著的相关性。因而，如果希望产生跨越一定数量的氨基酸的对准，例如，目标多肽的至少50个氨基酸，可以调整所选的对准方法(例如，GAP程序)。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，如有必要，在对准序列和引入缺口之后，以达到最大的序列同一性百分比，并且不将任何保守性替换作为序列同一性的一部分。为了确定氨基酸序列同一性百分比的对准可以用本领域技术人员知道的各种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于对准序列的合适参数，包括在被比较的序列全长上实现最大对准所需的任何算法。
氨基酸残基/位置的“修饰”是指与起始氨基酸序列相比主要氨基酸序列的改变，其中所述改变由涉及所述氨基酸残基/位置的序列改变产生。例如，典型的修饰包括残基用另一个氨基酸(例如，保守性或非保守性取代)取代，邻近所述残基/位置插入一个或更多个(例如，一般少于5个、4个或3个)，和/或所述残基/位置的删除。
“表位”是单独的抗体分子结合的抗原分子表面上的位点，例如，抗原如GFRAL多肽、GFRAL多肽片段或GFRAL表位的表面上的局部区域，其能够被抗体的一个或更多个抗原结合区结合，并且在动物例如哺乳动物(例如人)中具有抗原性或免疫原性，即，能够引发免疫应答。具有免疫原性活性的表位是在动物中引发抗体反应的多肽的部分。具有抗原性活性的表位是根据本领域公知的任何方法，包括例如通过免疫分析来确定的、抗体结合的多肽的部分。抗原性表位不必一定是免疫原性的。表位经常由分子例如氨基酸或糖类侧链的化学活性表面基团组成，并且经常具有特定的三维结构特性，以及特定的电荷特征。术语“表位”具体包括线性表位和构象表位。贡献出表位的多肽区域可以是所述多肽的连续氨基酸，或表位可以从所述多肽的两个或更多个非连续区域合在一起。表位可以或可以不是抗原的三维表面特征。在某些实施方式中，GFRAL表位是GFRAL多肽的三维表面特征。在其他实施方式中，GFRAL表位是GFRAL多肽的线性特征。一般地，抗原具有几种或许多种不同的表位，可以与许多不同的抗体反应。
当两个抗体识别三维空间中相同的、重叠的或邻近的表位时，抗体结合参考抗体的“表位”或“基本上相同的表位”或“相同的表位”。测定两个抗体是否结合三维空间中相同的、重叠的或邻近的表位的最广泛使用的和快速的方法是竞争分析，其可以以许多不同的形式配置，例如，使用标记的抗原或标记的抗体。在某些分析中，抗原被固定在96孔平板上，或在细胞表面表达，未标记的抗体阻断标记的抗体结合的能力使用放射性、荧光或酶标签来测量。
“表位作图”是鉴定抗体在它们的目标抗原上的结合位点或表位的过程。抗体表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由蛋白质中连续的氨基酸序列形成。构象表位由蛋白质序列中不连续的氨基酸形成，但是其在蛋白质折叠成它的三维结构时集合在一起。当蛋白质的三维结构处于改变的构象时，例如，在活化或结合另一个蛋白质或配体时，形成诱导的表位。
“表位分箱(binning)”是根据抗体识别的表位将抗体分组的过程。更具体地，表位分箱包括辨别不同抗体的表位识别性质的方法和系统，使用竞争分析与计算机处理组合，根据抗体的表位识别性质并鉴定具有不同的结合特异性的抗体来对抗体进行聚簇。
“GFRAL-介导的疾病”、“GFRAL-介导的失调”和“GFRAL-介导的状况”可互换地使用，是指完全或部分由GFRAL或GFRAL与GDF15的相互作用引起或作为其结果的任何疾病、失调或状况，和/或作为选择，希望抑制GDF15的体内作用的任何疾病、失调或状况。GFRAL-介导的疾病、失调或状况包括GDF15-介导的疾病、失调或状况。
“GDF15-介导的疾病”、“GDF15-介导的失调”和“GDF15-介导的状况”可互换地使用，是指任何疾病、失调或状况，其：(i)完全或部分由GDF15蛋白(例如，GDF15蛋白的活性，例如，GDF15信号转导或GDF15蛋白的升高水平)、或GFRAL蛋白与GDF15蛋白和/或RET蛋白的相互作用引起；或(ii)作为其结果，作为选择，希望抑制GDF15的体内作用的任何疾病、失调或状况。GDF15-介导的疾病、失调或状况包括不自主的体重损失、恶病质、肌肉减少症、肌肉消耗、骨骼消耗、心血管疾病、慢性炎症性疾病(例如，慢性肾脏疾患、慢性阻塞性肺病)和癌症，包括由GDF15蛋白诱导或与之相关的、具有对化学治疗剂(例如，抗肿瘤抗体如曲妥珠单抗)降低的敏感性(例如，抗性)的癌症。
如本文使用的，术语“治疗有效量”是指药剂(例如，本文描述的抗体或本文描述的任何其他药剂)的数量，其足以降低和/或改善给定疾病、失调或状况和/或与之相关的症状的严重度和/或持续时间。药剂包括治疗药剂的治疗有效量可以是以下所必需的数量：(i)降低或改善给定疾病、失调或状况的进展或发展，(ii)降低或改善给定疾病、失调或状况的复发、发展或发作，和/或(iii)改善或增强其他治疗(例如，施用本文提供的抗体之外的治疗)的预防或治疗效果。本公开内容的物质/分子/药剂(例如，抗-GFRAL抗体)的治疗有效量可以根据一些因素而变化，例如，个体的疾病状况、年龄、性别和体重，所述物质/分子/药剂在个体中引发期望的反应的能力。治疗有效量涵盖一种数量，其中所述物质/分子/药剂的任何毒性或不利影响不超过治疗有益的效果。在某些实施方式中，术语“治疗有效量”是指在对象或哺乳动物中有效“治疗”疾病、失调或状况的抗体或其他药剂(例如，或药物)的数量。
“预防有效量”是指在必需的剂量和时间段下实现期望的预防结果的有效数量。一般地，但不是必然地，由于预防剂量在疾病、失调或状况的之前或早期阶段用于对象，预防有效量可能小于治疗有效量。
“长期”施用是指以连续的方式(例如，持续一段时间，例如，数天、数周、数月或数年)施用药剂，与急性的方式相反，以维持初始的治疗效果(活性)持续延长的时间段。“间歇的”施用是没有中断的不连续进行的治疗，而实际上是循环的。
与一种或更多种进一步的药剂“组合”施用包括以任何顺序同时的(例如，并行地)和连续的施用。在施用其他治疗(例如，其他药剂)的情境下术语“组合”包括使用超过一种治疗(例如，一种药剂)。使用术语″组合″不限制向对象施用的治疗的顺序。第一治疗(例如，药剂)可以在向曾患有、患有或敏感于GDF15-介导的疾病、失调或状况或有GDF15-介导的疾病、失调或状况的风险的对象施用第二治疗(例如，药剂)之前(例如，1分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、8周、9周、10周、11周、或12周)，同时，或之后(例如，1分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、或12周)施用。
任何其他治疗(例如，药剂)可以以任何顺序与其他另外的治疗(例如，药剂)一起施用。在某些实施方式中，所述抗体可以与一种或更多种治疗，例如药剂(例如，治疗剂，包括不是当前施用的抗体的药剂)组合施用，来预防、治疗、管理和/或改善GDF15-介导的疾病、失调或状况，或其症状。可以与抗体组合施用的治疗(例如，药剂)的非限制性实例包括，例如，镇痛剂、麻醉剂、抗生素、或免疫调节剂，或美国药典(U.S.Pharmacopoeia)和/或医师 案头手册(Physician′s Desk Reference)中列出的任何其他药剂。组合治疗中有用的药剂的实例包括但不限于以下的：非甾族抗炎症药物(NSAID)例如阿司匹林、布洛芬和其他丙酸衍生物(阿明洛芬、苯噁洛芬、布氯酸、卡洛芬、芬布芬、非诺洛芬、氟洛芬、吲哚洛芬、酮洛芬、咪洛芬、萘普生、奥沙普秦、吡洛芬、普拉洛芬、舒洛芬、噻洛芬酸和硫噁洛芬)，乙酸衍生物(吲哚氯甲酰、阿西美辛、阿氯芬酸、环氯茚酸、双氯芬酸、芬氯酸、芬克洛酸、芬替酸、fuirofenac、异丁芬酸、伊索克酸、奥西平酸(oxpinac)、舒林酸、硫平酸、托美丁、齐多美辛和佐美酸)，灭酸衍生物(氟芬那酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、尼氟酸与托芬那酸)、二苯基羧酸衍生物(二氟尼柳与氟苯柳)，昔康类(伊索昔康、吡罗昔康、舒多昔康与替诺昔康)，水杨酸盐(乙酰水杨酸、柳氮磺吡啶)以及吡唑酮类(炎爽痛、苄哌立隆、非普拉宗、莫非布宗、羟布宗、苯丁唑酮)。其他组合包括环加氧酶-2(COX-2)抑制物。用于组合的其他药剂包括类固醇，例如泼尼松龙、泼尼松、甲泼尼龙、倍他米松、地塞米松或氢化可的松。这样的组合可能是特别有益的，因为类固醇的一种或更多种副作用可以通过在与当前的抗体组合治疗对象时逐渐减少所需的类固醇剂量来降低甚至消除。用于组合的其他药剂的实例包括细胞因子抑制性抗炎症药物(CSAID)；针对其他人类细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，例如，TNF、LT、IL-1B、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF。药剂的组合可以包括TNF拮抗剂，如嵌合的、人源化的或人的TNF抗体、REMICADE、抗-TNF抗体片段(例如，CDP870)以及可溶的p55或p75 TNF受体，其衍生物，p75TNFRIgG或p55TNFR1gG可溶的IL-13受体(slL-13)，以及TNFα转化酶(TACE)抑制物；类似的IL-1抑制物(例如，白细胞介素-1-转化酶抑制物)可能是有效的。其他组合包括白细胞介素11、抗-P7s和p-选择素糖蛋白配体(PSGL)。在组合治疗中有用的药剂的其他实例包括干扰素-β1a(AVONEX)；干扰素β1bCopaxone；高压氧；静脉内的免疫球蛋白；clabribine；和针对其他的人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂(例如，针对CD40配体和CD80的抗体)。
本文使用的“载体”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其对于在所采用的剂量和浓度下暴露于它们的细胞或哺乳动物是无毒的。通常生理学可接受的载体可以是水性的pH值缓冲的溶液。生理学可接受的载体的实例包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(例如，小于约10个氨基酸残基)多肽；蛋白质，例如，血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成盐平衡离子，例如钠；和/或非离子型表面活性剂，例如TWEENTM、聚乙二醇(PGE)和PLURONICSTM。术语″载体″还可以指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全的或不完全的))、赋形剂、或运载体，治疗药剂与它们一起施用。这样的载体，包括药物载体在内，可以是无菌的液体，例如，水和油，包括石油的、动物的、植物的或合成来源的那些，例如，花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当组合物(例如，药物组合物)被静脉内地施用时，水是示范性的载体。盐水溶液与葡萄糖和甘油水溶液可以被用作液体载体，特别是对于可注射的溶液。适合的赋形剂(例如，药物赋形剂)包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、碳酸钙、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果希望，组合物也可包含少量的湿润剂或乳化剂、或pH缓冲剂。组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、药丸、胶囊、粉未、持续释放制剂等的形式。口服组合物，包括制剂，可以包括标准的载体，例如，药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药物载体的实例在Remington′s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.，Easton，PA中描述了。包括药物化合物的组合物可以含有预防或治疗有效量的抗-GFRAL抗体，例如，以分离的或纯化的形式，与适当数量的载体一起，以提供适合向对象(例如，患者)施用的形式。制剂应当适合施用的方式。
如本文使用的，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准的，或在美国药典、欧洲药典或其他一般公认的药典中列出的用于动物、更特别地用于人类的。
术语“药物制剂”是指一种制剂，其形式使得活性成分(例如，抗GFRAL抗体)的生物活性有效，并且不含对施用所述制剂的对象有不可接受的毒性的其他成分。这样的制剂可以是无菌的。
“无菌的”制剂是无病菌的或没有所有活的微生物和它们的孢子。
本文使用的“多克隆抗体”是指在对具有许多表位的蛋白质的免疫原性反应中产生的抗体群体，因而包括针对所述蛋白质内相同的和不同的表位的多种不同的抗体。产生多克隆抗体的方法是本领域已知的(参见，例如，Short Protocols in Molecular Biology，(2002)5th Ed.，Ausubel et al.，eds.，John Wiley and Sons，New York，第11章)。
“分离的核酸”是一核酸，例如，RNA、DNA或混合聚合物，其基本上从与天然序列天然相伴的其他基因组DNA序列以及蛋白质或复合物如核糖体和聚合酶分离。″分离的″核酸分子是与存在于该核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离了的核酸分子。此外，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，当通过重组技术产生时可以基本上不含其他细胞材料、或培养基，或当化学合成时可以基本上不含化学药品前体或其他化学药品。在具体的实施方式中，编码如本文描述的抗体的一种或更多种核酸分子是分离的或纯化的。该术语包括已经从它们的天然发生环境中移除的核酸序列，包括重组的或克隆的DNA分离物，以及化学合成的类似物或由异源系统生物学合成的类似物。基本上纯的分子可以包括所述分子的分离的形式。
“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换地使用，是指任何长度的核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入到聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和它们的类似物。本文使用的“寡核苷酸”一般是指短的、一般为单链的、一般为合成的多核苷酸，它们的长度一般但不必然地小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不是互相排斥的。上文对多核苷酸的说明同样地和完全适合于寡核苷酸。产生本公开内容的抗-GFRAL抗体的细胞可以包括亲本杂交瘤细胞，以及已经倒入编码所述抗体的核酸的细菌和真核宿主细胞。适合的宿主细胞在下文中公开。
如本文使用的，术语“治疗(treat，treatment，treating)”是指由施用一种或更多种治疗(包括但不限于，施用一种或更多种预防性或治疗性药剂，例如，本文提供的抗体)引起的、GDF15介导的疾病、失调或状况的发展、严重度和/或持续时间的降低或改善。在某些实施方式中，所述药剂是抗-GFRAL抗体。本文使用的治疗包括但不限于：(i)提高体重；(ii)维持体重；(iii)降低体重损失；(iv)提高身体质量(例如，瘦质量或脂肪质量)；(v)维持身体质量(例如，瘦质量或脂肪质量)或(vi)降低身体质量的损失(例如，瘦质量或脂肪质量)，或其任何组合。
如本文使用的，术语“预防药剂”是指任何药剂，其可以完全地或部分地抑制对象中GDF15-介导的疾病、失调或状况和/或与之相关的症状的发展、复发、发作或散播。在某些实施方式中，术语“预防药剂”是指本文提供抗体。在某些实施方式中，术语“预防药剂”是指本文提供抗体以外的药剂。在某些实施方式中，预防药剂是一种药剂，其已知是有用的、或已经、或当前正用于预防GDF15-介导的疾病、失调或状况和/或与之相关的症状，或阻碍GDF15-介导的疾病、失调或状况和/或与之相关的症状的发作、发展、进展和/或严重度。在某些实施方式中，所述预防药剂是全人抗-GFRAL抗体，例如，全人抗-GFRAL单克隆抗体。
如本文使用的，术语“预防药剂”是指任何药剂，其可以完全地或部分地抑制对象中GDF15-介导的疾病、失调或状况和/或其症状的发展、复发、发作或散播。在某些实施方式中，术语“预防药剂”是指本文描述的抗-GFRAL抗体。在某些其他实施方式中，术语“预防药剂”是指本文描述的抗-GFRAL抗体以外的药剂。在某些实施方式中，预防药剂是一种药剂，其已知是有用的、或已经、或当前正用于预防GDF15-介导的疾病、失调或状况和/或其症状，或阻碍GDF15-介导的疾病、失调或状况和/或其症状的发作、发展、进展和/或严重度。在具体的实施方式中，所述预防药剂是人源化的抗-GFRAL抗体，例如，人源化的抗-GFRAL单克隆抗体。
术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用这些治疗产品的适应症，用法，剂量，施用，禁忌症和/或警告的信息。
术语“预防(prevent，preventing，prevention)”是指由施用本文提供的治疗或治疗组合(例如，预防性或治疗性药剂的组合，例如，本文提供的抗体)引起的，GDF15-介导的疾病、失调或状况的发展、复发、发作或散播的完全或部分的抑制。
术语“重组抗体”是指通过重组方式制备、表达、创造或分离的抗体。重组抗体可以是使用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体、从重组的组合抗体文库分离的抗体、从人免疫球蛋白基因的转基因的和/或转染色体的动物(例如，小鼠或奶牛)分离的抗体(参见，例如，Taylor，L.D.et al.(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或通过涉及免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列的剪接的任何其他方式制备、表达、创造或分离的抗体。这样的重组抗体可以具有可变区和恒定区，包括衍生自人类种系免疫球蛋白序列的那些(参见Kabat，E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，FifthEdition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。然而，在某些实施方式中，这样的重组人类抗体可以经历体外诱变(或，当使用人类Ig序列的转基因的动物时，体内的体细胞诱变的)，因而重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是一类序列，其虽然来自于或相关于人类种系VH和VL序列，可能在体内不天然地存在于人类抗体种系全集中。
术语“副作用”涵盖治疗(例如，预防性或治疗性药剂)的不需要的不利的作用。不需要的作用不必然是不利的。治疗(例如，预防性或治疗性药剂)的不利作用可能是有害的或不舒服的或危险的。副作用的实例包括，腹泻、咳嗽、胃肠炎、喘气、恶心、呕吐、厌食、腹部绞痛、发烧、疼痛、体重减轻、脱水、脱发、呼吸困难、失眠、头晕、粘膜炎、神经和肌肉的影响、疲劳、口干和食欲不振，施用部位的皮疹或肿胀，流感样症状，如发烧、畏寒和疲劳，消化道问题和过敏反应。患者经历的其他不希望的作用有许多，并且是本领域已知的。在Physician′s Desk Reference(60th ed.，2006)中描述了很多。
术语“对象”和“患者”在本文中可互换地使用，在本文公开的方法的上下文中，是指作为治疗或预防案例的接受者的动物。如本文使用的，在某些实施方式中，对象是哺乳动物，例如，非灵长类(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠，等)或灵长类(例如，猴和人)。在具体的实施方式中，所述对象是人。在一个实施方式中，所述对象是患有GDF15-介导的疾病、失调或状况的哺乳动物(例如，人)。在另一个实施方式中，所述对象是有风险发生GDF15-介导的疾病、失调或状况的哺乳动物(例如，人)。
“基本上所有的”是指至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或约100％。
术语“治疗药剂”是指可以用于治疗、预防或减轻疾病、失调或状况或其症状的任何药剂，包括用于治疗、预防或减轻GDF15-介导的疾病、失调或状况的一种或更多种症状。在某些实施方式中，治疗药剂是指本文描述的抗-GFRAL抗体。在某些其他实施方式中，治疗药剂是指本文提供的抗体以外的药剂。在某些实施方式中，治疗药剂是一种药剂，其已知有用于、或已经用于、或当前正在用于治疗、预防或减轻GDF15-介导的疾病、失调或状况或其症状的一种或更多种症状。
治疗(例如，使用预防性或治疗性药剂)的组合比任何两种或更多种单一治疗的叠加效果更为有效。例如，预防和/或治疗药剂的组合的协同作用允许使用更低剂量的一种或更多种药剂和/或更低频率向患有GDF15-介导的疾病、失调或状况的对象施用所述药剂。利用更低剂量的预防或治疗性治疗和/或更低频率地施用所述治疗的能力，降低了与向对象施用所述治疗相关的毒性，而不降低所述治疗在预防、管理、治疗或改善GDF15-介导的疾病、失调或状况方面的效力。另外，协同作用可以产生在预防、管理、治疗或改善GDF15-介导的疾病、失调或状况方面改善的治疗效力。最后，治疗(例如，预防性或治疗性药剂)组合的协同作用可以避免或降低与使用任何单一治疗相关的有害的或不需要的副作用。在某些实施方式中，所述组合治疗包含本文提供的抗体和胰岛素(例如，胰岛素补充剂)。在某些实施方式中，所述组合治疗包含抗-GFRAL抗体和胰岛素，其中所述组合治疗包含与仅胰岛素治疗中的正常每日剂量相比更低的每日剂量的胰岛素。在某些实施方式中，所述组合治疗包含，例如，仅胰岛素治疗的正常每日胰岛素剂量的小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于3％、或小于1％。
术语“治疗”是指任何方案、方法和/或药剂，其可以用于预防、管理、治疗和/或改善GDF15-介导的疾病、失调或状况(例如，1型糖尿病或2型糖尿病)。在某些实施方式中，术语“治疗(therapies，therapy)”是指本领域技术人员例如医务人员已知在预防、管理、治疗和/或改善GDF15-介导的疾病、失调或状况方面有用的生物学治疗、支持治疗和/或其他治疗。
术语“可检测的探针”是指提供可检测信号的组合物。该术语无限制地包括任何荧光团、发色团、放射性标记、酶、抗体或抗体片段等，它们经由它们的活性提供可检测信号。
术语“诊断药剂”是指被施用给对象、辅助疾病、失调或状况的诊断的物质。这样的物质可以用于揭示、指定和/或限定引发疾病的过程的位置。在某些实施方式中，诊断药剂包括轭合到本文描述的抗-GFRAL抗体的物质，当它们被施用给对象或接触来自对象的样品时，辅助GDF15-介导的疾病、失调或状况的诊断。
术语“可检测药剂”是指可以用于确定样品或对象中期望的分子例如抗-GFRAL抗体的存在的物质。可检测药剂可以是能够被显现的物质，或能够被测定和/或测量(例如，定量)的物质。
提及核酸分子时使用的术语“编码”或其语法上的等价体，是指核酸分子，处于其天然状态中或通过本领域技术人员公知的方法操纵时，其可以被转录产生mRNA，mRNA然后被翻译成多肽和/或其片段。反义链是这样的核酸分子的互补物，可以从它推断出编码序列。
术语“赋形剂”是指一惰性物质，其通常被用作稀释剂、运载体、防腐剂、结合剂、或稳定剂，包括但不限于，蛋白质(例如，血清白蛋白，等)、氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸，等)，脂肪酸和磷脂(例如，烷基磺酸类、辛酸酯，等)，表面活性剂(例如，SDS、聚山梨酸酯、非离子表面活性剂，等)，糖(例如，蔗糖、麦芽糖、海藻糖，等)和多元醇(例如，甘露醇、山梨醇，等)。还参见，Remington′s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.，Easton，PA，通过引用将其完全合并在本文中。
在肽或多肽的上下文中，本文使用的术语“片段”是指包含少于全长氨基酸序列的肽或多肽。这样的片段可以来自，例如，氨基末端的截短、羧基末端的截短、和/或氨基酸序列的残基的内部删除。例如，片段可以产自选择性RNA剪接，或来自体内蛋白酶活性。在某些实施方式中，片段包括多肽，所述多肽包含GFRAL多肽、或结合GFRAL多肽的抗体的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少550个、至少600个、至少650个、至少700个、至少750个、至少800个、至少850个、至少900个、或至少950个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在某些实施方式中，结合GFRAL多肽的抗体的片段保持了所述抗体的至少1种、至少2种、至少3种或更多种功能。
术语“管理(manage，managing，management)”是指对象从不引起疾病痊愈的治疗(例如，预防性或治疗性药剂)中得到的有益效果。在某些实施方式中，对象被施用一种或更多种治疗(例如，预防性或治疗性药剂，例如，本文提供的抗体)以“管理”GDF15-介导的疾病、失调或状况或其症状，以预防疾病的发展或恶化。
“施用”是指将存在于身体外部的物质(例如，本文描述的抗-GFRAL抗体)注射或物理上递送进入对象的动作，例如，通过粘膜的、真皮内的、静脉内的、肌肉内的递送和/或本文描述的或本领域已知的任何其他物理递送的方法。当疾病、失调或状况，或其症状被治疗时，施用所述物质一般在疾病、失调或状况或其症状发作之后进行。当疾病、失调或状况，或其症状被预防时，施用所述物质一般在疾病、失调或状况或其症状发作之前进行。
在多肽的上下文中，本文使用的术语“模拟物”是指一种多肽，其拥有与GFRAL多肽、GFRAL多肽的片段或抗-GFRAL抗体相似或相同的功能，但是不必包含与GFRAL多肽、GFRAL多肽的片段或抗-GFRAL抗体相似或相同的氨基酸序列，或拥有GFRAL多肽、GFRAL多肽的片段或抗-GFRAL抗体的相似或相同的结构。具有相似的氨基酸序列的多肽是指满足以下至少一条的多肽：(a)具有一氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同于本文描述的GFRAL多肽(例如，SEQ IDNO：500，GFRAL多肽的片段)或抗-GFRAL抗体的氨基酸序列；(b)由一核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列在严格条件下与编码本文描述的GFRAL多肽、GFRAL多肽的片段或抗-GFRAL抗体(或其VH或VL区)的至少5个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少15个氨基酸残基、至少20个氨基酸残基、至少25个氨基酸残基、至少40个氨基酸残基、至少50个氨基酸残基、至少60个氨基残基、至少70个氨基酸残基、至少80 80氨基酸残基、至少90个氨基酸残基、至少100氨基酸残基、至少125个氨基酸残基、或至少150个氨基酸残基的核苷酸序列杂交(参见，例如，Sambrook et al.(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Maniatis et al.(1982)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，NY)；和(c)由一核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同于编码本文描述的GFRAL多肽、GFRAL多肽的片段、或抗-GFRAL抗体(或其VH或VL区)的核苷酸序列。具有与本文描述的GFRAL多肽、GFRAL多肽的片段或抗-GFRAL抗体相似结构的多肽是指一种多肽，其具有本文描述的GFRAL多肽、GFRAL的片段或GFRAL抗体的相似的二级、三级或四级结构。所述多肽的结构可以通过本领域技术人员已知的方法，包括X-射线晶体衍射、核磁共振和结晶电子显微镜来测定。
术语“组合物”意图涵盖以任选的指定数量含有指定成分(例如，本文提供的)的产品，以及直接或间接地产自任选的指定数量的指定成分的组合的任何产品。
在多肽的上下文中，本文使用的术语“衍生物”是指一种多肽，其包含GFRAL多肽、GFRAL多肽的片段、或结合GFRAL多肽的抗体的氨基酸序列，所述序列已经通过导入氨基酸残基取代、删除或添加而被改变。本文使用的术语“衍生物”还指例如通过将任何类型的分子共价附着到多肽上而化学修饰的GFRAL多肽、GFRAL多肽的片段或结合GFRAL多肽的抗体。例如，但不是为了限制，GFRAL多肽、GFRAL多肽的片段或GFRAL抗体可以被化学修饰，例如，通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、用已知的保护/封闭基团衍生、蛋白水解裂解、连接到细胞配体或其他蛋白质，等。在被附着的分子的类型或位置方面，所述衍生物以不同于天然发生或天然起始的肽或多肽的方式被修饰。衍生物进一步包括删除天然存在于所述肽或多肽上的一个或更多个化学基团。GFRAL多肽、GFRAL多肽的片段或GFRAL抗体的衍生物可以被化学修饰，通过利用本领域技术人员已知的技术进行化学修饰，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、衣霉素的代谢合成，等。进一步的，GFRAL多肽、GFRAL多肽的片段或GFRAL抗体的衍生物可以含有一个或更多个非经典氨基酸。多肽衍生物具有与本文描述的GFRAL多肽、GFRAL多肽的片段或GFRAL抗体相似或相同的功能。
术语“不自主的体重损失”是指在许多状况例如，恶病质、肝硬化、甲状腺机能亢进、慢性肾病、帕金森氏病、癌症、进食障碍和肌肉减少症下观察到的非期望的体重减轻。
术语“恶病质”是指在没有积极尝试减肥的人中，以体重减轻、肌肉萎缩、疲劳、虚弱和食欲显著丧失为标志的消耗综合征。恶病质可以极大地促成患有一些慢性疾病(例如，癌症、慢性肾病、慢性炎性疾病、肌肉萎缩，例如肌营养不良症和神经性厌食症)的患者的发病率。例如，在晚期癌症中，恶病质是常见的(发生在大多数终末期癌症患者中)，并且导致所有癌症相关死亡的约四分之一。
组合物和制造组合物的方法
提供了结合蛋白，例如结合GFRAL(例如，人GFRAL)的抗体。本公开内容的抗体是有用的，例如，用于GDF15-介导的疾病、失调或状况的诊断或治疗。在某些实施方式中，本公开的抗体可用于诊断或治疗疾病、失调或状况，例如不自主的体重损失，包括但不限于，患有恶病质或慢性疾病(例如，肝硬化、甲亢、帕金森氏病、癌症、慢性肾脏疾患、慢性阻塞性肺病、AIDS、肺结核、慢性炎症性疾病、脓毒症、肌肉消耗症和神经性厌食症)，或广泛地，希望抑制GDF15的体内作用的任何疾病、失调或状况。
本文提供的是结合GFRAL多肽、GFRAL多肽片段、GFRAL肽或GFRAL表位的抗体(例如，单克隆抗体)。在某些实施方式中，所述抗-GFRAL抗体结合GFRAL的细胞外结构域(ECD)。还提供的是竞争性阻断本文提供的抗-GFRAL抗体结合GFRAL多肽的抗体。本文提供的抗-GFRAL抗体还可以轭合或重组融合到诊断药剂、可检测药剂或治疗制剂。进一步提供的是包含抗-GFRAL抗体的组合物。
本文还提供的是分离的核酸分子，其编码结合GFRAL多肽、GFRAL多肽片段、GFRAL肽或GFRAL表位抗-GFRAL的表位的重链、轻链、VH区、VL区、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLCDR1、VL CDR2和/或VL CDR3进一步提供的是包含核酸分子的载体和宿主细胞，所述核酸分子编码结合GFRAL多肽、GFRAL多肽片段、GFRAL肽或GFRAL表位的抗-GFRAL抗体。还提供的是制造抗体的方法，所述抗体结合GFRAL多肽、GFRAL多肽片段、GFRAL肽或GFRAL表位。
本文提供了使用抗-GFRAL抗体的方法。所述方法包括治疗、预防或减轻GDF15-介导的疾病、失调或状况，包括治疗、预防或减轻对象(例如，患者)中GDF15-介导的疾病、失调或状况的一种或更多种症状。GDF15-介导的疾病、失调或状况的非限制性实例包括不自主的体重损失、消耗疾病、患有恶病质或慢性疾病(例如，肝硬化、甲状腺机能亢进、帕金森氏病、癌症、慢性肾脏疾患、慢性阻塞性肺病、AIDS、肺结核、慢性炎症性疾病、脓毒症、肌肉消耗症和神经性厌食症)的对象中不自主的体重损失。对象可能遭受不自主的体重损失的其他疾病、失调或状况包括进食障碍、肌营养不良或多发性硬化。
抗-GFRAL抗体
在一些实施方式中，本公开内容提供了可以在本文中用作治疗剂的抗GFRAL抗体。示范性的抗体包括多克隆的、单克隆的、人源化的、人的、双特异性的和杂共轭的抗体，以及具有改善的亲和力或其他性质的它们的变体。
在某些实施方式中，本文提供的是结合GFRAL，包括GFRAL多肽、GFRAL多肽片段、GFRAL肽或GFRAL表位的抗体。在某些实施方式中，所述抗-GFRAL抗体是结合GFRAL，包括GFRAL多肽、GFRAL多肽片段、GFRAL肽或GFRAL表位的人源化抗体(例如，包含人恒定区)。
在某些实施方式中，抗-GFRAL抗体包含本文描述的任一单克隆抗体(例如，1C1、3P10、12A3、5F12、5A20、8D8、17J16、25M22、2B8、22N5、2I23、6N16、1B3、19K19、2B3、8C10、2A9、24G2、6G9、2B11、1A3、P1B6、P1H8、或P8G4)，例如，表1-24中描绘的氨基酸序列的VH区、VL区、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3因而，在某些实施方式中，本文提供的分离的抗体或其功能片段包含来自以下的一个、两个和/或三个重链CDR，和/或一个、两个和/或三个轻链CDR：(a)命名为1C1的抗体；(b)命名为3P10的抗体；(c)命名为12A3的抗体；(d)命名为5F12的抗体；(e)命名为5A20的抗体；(f)命名为8D8的抗体；(g)命名为17J16的抗体；(h)命名为25M22的抗体；(i)命名为2B8的抗体；(j)命名为22N5的抗体；(k)命名为2I23的抗体；(I)命名为6N16的抗体；(m)命名为1B3的抗体；(n)命名为19K19的抗体；(o)命名为2B3的抗体；(p)命名为8C10的抗体；(q)命名为2A9的抗体；(r)命名为24G2的抗体；(s)命名为6G9的抗体；(t)命名为2B11的抗体；(u)命名为1A3的抗体；(v)命名为P1B6的抗体；(w)命名为P1H8的抗体；(x)命名为P8G4的抗体；或表1-24中所示命名为1C1到P8G4的抗体。
命名为1C1的抗体包含SEQ ID NO：1的VH序列和SEQ ID NO：2的VL序列。
命名为3P10的抗体包含SEQ ID NO：3的VH序列和SEQ ID NO：4的VL序列。
命名为12A3的抗体包含SEQ ID NO：5的VH序列和SEQ ID NO：6的VL序列。
命名为5F12的抗体包含SEQ ID NO：7的VH序列和SEQ ID NO：8的VL序列。
命名为5A20的抗体包含SEQ ID NO：9的VH序列和SEQ ID NO：10的VL序列。
命名为8D8的抗体包含SEQ ID NO：11的VH序列和SEQ ID NO：12的VL序列。
命名为17J16的抗体包含SEQ ID NO：13的VH序列和SEQ ID NO：14的VL序列。
命名为25M22的抗体包含SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：16的VL序列。
命名为2B8的抗体包含SEQ ID NO：17的VH序列和SEQ ID NO：18的VL序列。
命名为22N5的抗体包含SEQ ID NO：19的VH序列和SEQ ID NO：20的VL序列。
命名为2I23的抗体包含SEQ ID NO：21的VH序列和SEQ ID NO：22的VL序列。
命名为6N16的抗体包含SEQ ID NO：23的VH序列和SEQ ID NO：24的VL序列。
命名为1B3的抗体包含SEQ ID NO：25的VH序列和SEQ ID NO：26的VL序列。
命名为19K19的抗体包含SEQ ID NO：27的VH序列和SEQ ID NO：28的VL序列。
命名为2B3的抗体包含SEQ ID NO：29的VH序列和SEQ ID NO：30的VL序列。
命名为8C10的抗体包含SEQ ID NO：31的VH序列和SEQ ID NO：32的VL序列。
命名为2A9的抗体包含SEQ ID NO：33的VH序列和SEQ ID NO：34的VL序列。
命名为24G2的抗体包含SEQ ID NO：35的VH序列和SEQ ID NO：36的VL序列。
命名为6G9的抗体包含SEQ ID NO：37的VH序列和SEQ ID NO：38的VL序列。
命名为2B11的抗体包含SEQ ID NO：39的VH序列和SEQ ID NO：40的VL序列。
命名为1A3的抗体包含SEQ ID NO：480的VH序列和SEQ ID NO：481的VL序列。
命名为P1B6的抗体包含SEQ ID NO：482的VH序列和SEQ ID NO：483的VL序列。
命名为P1H8的抗体包含SEQ ID NO：484的VH序列和SEQ ID NO：485的VL序列。
命名为P8G4的抗体包含SEQ ID NO：486的VH序列和SEQ ID NO：487的VL序列。
表1：抗体1C1 CDR序列
表2：抗体3P10 CDR序列
表3：抗体12A3 CDR序列
表4：抗体5F12 CDR序列
表5：抗体5A20 CDR序列
表6：抗体8D8 CDR序列
表7：抗体17J16 CDR序列
表8：抗体25M22 CDR序列
表9：抗体2B8 CDR序列
表10：抗体22N5 CDR序列
表11：抗体2I23 CDR序列
表12：抗体6N16 CDR序列
表13：抗体1B3 CDR序列
表14：抗体19K19 CDR序列
表15：抗体2B3 CDR序列
表16：抗体8C10 CDR序列
表17：抗体2A9 CDR序列
表18：抗体24G2 CDR序列
表19：抗体6G9 CDR序列
表20：抗体2B11 CDR序列
表21：抗体1A3 CDR序列
表22：抗体P1B6 CDR序列
表23：抗体P1H8 CDR序列
表24：抗体P8G4 CDR序列
在某些实施方式中，本文提供的抗体包含VH区或VH结构域。在其他实施方式中，本文提供的抗体包含VL区或VL链。在某些实施方式中，本文提供的抗体具有(i)VH结构域或VH区；和/或(ii)VL结构域或VL区的组合。
在某些实施方式中，本文提供的抗体包含或由六个CDR组成，例如，表1-24中鉴定的VH CDR1、VH CDR2 VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在某些实施方式中，本文提供的抗体可以包含少于六个CDR。在某些实施方式中，本文提供的抗体包含或由一个、两个、三个、四个或五个CDR组成，所述CDR选自由表1-24中鉴定的VH CDR1、VH CDR2 VH CDR3、VLCDR1、VL CDR2和/或VL CDR3构成的组。在某些实施方式中，所述抗体包含或由一个、两个、三个、四个或五个CDR组成，所述CDR选自由鼠单克隆抗体的VH CDR1、VH CDR2 VH CDR3、VLCDR1、VL CDR2和/或VL CDR3构成的组，所述鼠单克隆抗体选自以下构成的组：本文描述的(a)命名为1C1的抗体；(b)命名为3P10的抗体；(c)命名为12A3的抗体；(d)命名为5F12的抗体；(e)命名为5A20的抗体；(f)命名为8D8的抗体；(g)命名为17J16的抗体；(h)命名为25M22的抗体；(i)命名为2B8的抗体；(j)命名为22N5的抗体；(k)命名为2I23的抗体；(1)命名为6N16的抗体；(m)命名为1B3的抗体；(n)命名为19K19的抗体；(o)命名为2B3的抗体；(p)命名为8C10的抗体；(q)命名为2A9的抗体；(r)命名为24G2的抗体；(s)命名为6G9的抗体；(t)命名为2B11的抗体；(u)命名为1A3的抗体；(v)命名为P1B6的抗体；(w)命名为P1H8的抗体；或(x)命名为P8G4的抗体。因而，在某些实施方式中，所述抗体包含或由表1-24中鉴定的VHCDR1、VH CDR2 VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3的任一的一个、两个、三个、四个或五个CDR组成。
在某些实施方式中，本文提供的抗体包含或由表1-24中列出的一个或更多个(例如，一个、两个或三个)VH CDR组成。在其他实施方式中，本文提供的抗体包含或由表1-24中列出的一个或更多个(例如，一个、两个或三个)VL CDR组成。在又其他的实施方式中，本文提供的抗体包含或由表1-24中列出的一个或更多个(例如，一个、两个或三个)VH CDR和表-24中列出的一个或更多个VL CDR组成。因而，在某些实施方式中，所述抗体包含VH CDR1，所述VH CDR1具有SEQ ID NO：57、49、57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796、488-493、1795、1796的任一的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述抗体包含VH CDR2，所述VHCDR2具有SEQ ID NO：132-220、497-514的任一的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述抗体包含VH CDR3，所述VH CDR3具有SEQ ID NO：57、49、57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796、488-493、1795、1796的任一的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗体包含VHCDR1和/或VH CDR2和/或VH CDR3，它们独立地选自表1-24中描述的氨基酸序列的任一个中描述的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3。在某些实施方式中，所述抗体包含VL CDR1，所述VLCDR1具有SEQ ID NO：297-372、531-546的任一的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述抗体包含VL CDR2，所述VL CDR2具有SEQ ID NO：373-422的任一的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述抗体包含VL CDR3，所述VL CDR3具有SEQ ID NO：423-479、558-569的任一的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗体包含VL CDR1和/或VL CDR2和/或VL CDR3，它们独立地选自表1-24中描述的氨基酸序列的任一个中描述的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3。
本文还提供的是抗体，其包含表1-24中所列的一个或更多个(例如，一个、两个或三个)VH CDR以及一个或更多个(例如，一个、两个或三个)VL CDR。特别是，本文提供的是抗体，其包含：VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)和VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)和VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)和VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)和VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)；VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)和VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)和VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)和VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)；VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)和VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR3(SEQID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)和VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)和VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)；VH CDR1(SEQID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)和VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)和VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)和VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)、VH CDR2(SEQ IDNO：132-220、497-514)、VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)和VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)和VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VLCDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)和VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR1(SEQ IDNO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)和VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)和VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)和VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)和VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR2(SEQID NO：132-220、497-514)、VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)和VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)和VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)和VLCDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)和VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR2(SEQID NO：132-220、497-514)、VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)和VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VH CDR3(SEQ IDNO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)和VL 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CDR(SEQ ID NO：297-477)的任何组合。
在某些实施方式中，本文描述的抗体或其片段包含人源化的框架区(FR)序列。在某些实施方式中，本文描述的抗体或其片段包含VH区，所述VH区包含表25中描述的VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4氨基酸序列；和/或(b)VL区，所述VL区包含表25中描述的VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4氨基酸序列。
表25：人源化抗-GFRAR抗体的示范性的框架序列
在某些实施方式中，本文描述的抗体或其片段包含VH区，所述VH区包含：(1)具有选自SEQ ID NO：570-578的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有选自SEQ ID NO：579-602的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有选自SEQ ID NO：603-1726的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有选自SEQ ID NO：1727-1728的氨基酸的VH FR4。因而，在某些方面，所述人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有选自SEQ ID NO：570-578的氨基酸序列的VH FR1。因而，在某些方面，所述人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有选自SEQ ID NO：579-602的氨基酸序列的VHFR2。因而，在某些方面，所述人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有选自SEQ ID NO：603-1726的氨基酸序列的VH FR3。因而，在某些方面，所述人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有选自SEQ ID NO：1727-1728的氨基酸的VH FR4。
在某些实施方式中，本文描述的抗体或其片段包含VL区，所述VL区包含：(1)具有选自SEQ ID NO：1729-1750的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有选自SEQ ID NO：1751-1777的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有选自SEQ ID NO：1778-1792的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有选自SEQ ID NO：1793-1794的氨基酸的VL FR4。因而，在某些方面，所述人源化抗体包含VL区，所述VL区包含具有选自SEQ ID NO：1729-1750的氨基酸序列的VL FR1。因而，在某些方面，所述人源化抗体包含VL区，所述VL区包含具有选自SEQ ID NO：1751-1777的氨基酸序列的VL FR2。因而，在某些方面，所述人源化抗体包含VL区，所述VL区包含具有选自SEQID NO：1778-1792的氨基酸序列的VL FR3。因而，在某些方面，所述人源化抗体包含VL区，所述VL区包含具有选自SEQ ID NO：1793-1794的氨基酸的VL FR4。
在某些实施方式中，本文描述的抗体或其片段包含VH区和VL区，其中所述VH区进一步包含：具有选自SEQ ID NO：570-578的氨基酸序列的VH FR1；具有选自SEQ ID NO：579-602的氨基酸序列的VH FR2；具有选自SEQ ID NO：603-1726的氨基酸序列的VH FR3；和/或具有选自SEQ ID NO：1727-1728的氨基酸序列的VH FR4；和其中所述VL区进一步包含：(1)具有选自SEQ ID NO：1729-1750的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有选自SEQ ID NO：1751-1777的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有选自SEQ ID NO：1778-1792的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有选自SEQ ID NO：1793-1794的氨基酸的VL FR4。
本文还提供的是抗体，其包含表25中所列的一个或更多个(例如，一个、两个、三个或四个)VH FR以及一个或更多个(例如，一个、两个、三个或四个)VL FR。特别是，本文提供的是抗体，其包含：VH FR1(SEQ IDNOS：570-578)和VL FR1(SEQ ID NO：1729-1750)；VH FR1(SEQ ID NO：570-578)和VLFR2(SEQ ID NO：1751-1777)；VH FR1(SEQ ID NO：570-578)和VLFR3(SEQ ID NO：1778-1792)；VH FR1(SEQ ID NO：570-578)和VL FR4(SEQ ID NO：1793-1794)；VH FR2(SEQ ID NO：579-602)和VL FR1(SEQ ID NO：1729-1750)；VH FR2(SEQ IDNO：579-602)和VLFR2(SEQ ID NO：1751-1777)；VH FR2(SEQ ID NO：579-602)和VL FR3(SEQID NO：1778-1792)；VH FR2(SEQ ID NO：579-602)和VL FR4(SEQ ID NO：1793-1794)；VHFR3(SEQ ID NO：603-1726)和VL FR1(SEQ ID NO：1729-1750)；VH FR3(SEQ ID NO：603-1726)和VL FR2(SEQ ID NO：1751-1777)；VH FR3(SEQ ID NO：603-1726)和VL FR3(SEQ IDNO：1778-1792)；VH FR3(SEQ ID NO：603-1726)和VL FR4(SEQ ID NO：1793-1794)；VH FR4(SEQ ID NO：1727-1728)和VL FR1(SEQ ID NO：1729-1750)；VH FR4(SEQ ID NO：1727-1728)和VL FR2(SEQ ID NO：1751-1777)；VH FR4(SEQ ID NO：1727-1728)和VL FR3(SEQ IDNO：1778-1792)；VH FR4(SEQ ID NO：1727-1728)和VL FR4(SEQ ID NO：1793-1794)；VH FR1(SEQ ID NO：570-578)、VH FR2(SEQ 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在又一个方面，提供了与所例举的抗体或功能性片段之一竞争结合GFRAL的抗体。这样的抗体还可以结合与本文例举的抗体之一相同的表位，或重叠的表位。与所例举的抗体竞争或结合相同表位的抗体和片段预计将显示相似的功能性质。所述例举的抗原结合蛋白和片段包括具有本文提供的VH和VL区以及CDR的那些，包括表1-24中的那些。因而，作为具体的实例，提供的所述抗体包括与一抗体竞争的那些，所述抗体包含：(a)表1-24中所列抗体的列出的1、2、3、4、5或全部6个CDR；(b)VH和VL，其选自表1-24中所列抗体的列出的VH和VL区；或(c)两条轻链和两条重链，其包含表1-24中所列抗体所指定的VH和VL。
在某些实施方式中，所述组合物的抗体，以及使用本文提供的抗体的方法的抗体，包括本文描述的那些抗-GFRAL单克隆抗体，例如，实施例章节中描述的。任何抗-GFRAL抗体可以用于任何本文提供的方法。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ IDNO：15的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ IDNO：29的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：480的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：482的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ IDNO：484的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：486的氨基酸序列。
在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQID NO：12的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQID NO：28的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：481的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：483的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：485的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VL区或其人源化变体，所述VL区包含SEQ ID NO：487的氨基酸序列。
在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ IDNO：9的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列，所述VL区包含SEQID NO：18的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ IDNO：23的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列，所述VL区包含SEQID NO：32的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ IDNO：37的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：480的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：481的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：482的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：483的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：484的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：485的氨基酸序列。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含VH区或其人源化变体以及VL区或其人源化变体，所述VH区包含SEQ ID NO：486的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO：487的氨基酸序列。
在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQID NO：10的氨基酸.序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的VL区的VLCDR1、VL CDR2和VLCDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：31的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：36的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：40的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：480的氨基酸序列的VH结构域的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：481的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：482的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：483的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：484的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，以及具有SEQ ID NO：485的氨基酸序列的VL区的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的各种方法的某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO：486的氨基酸序列的VH结构域的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及具有SEQ ID NO：487的氨基酸序列的VL区的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3。本文描述的列出的其他VH结构域、VL结构域、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列也期待用于本文提供的各种方法。
1.多克隆抗体
本公开内容的抗体可以包含多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是熟练的技术人员已知的。多克隆抗体可以在哺乳动物中产生，例如，通过免疫剂以及如果需要的佐剂一次或更多次注射。一般地，免疫剂和/或佐剂将通过多次皮下的或腹膜内的注射注射到哺乳动物中。免疫剂可以包括GFRAL多肽或其融合蛋白。可能有用的是将免疫剂与已知在被免疫的哺乳动物为免疫原性的蛋白质轭合，或与所述蛋白质以及一种或更多种佐剂一起免疫所述哺乳动物。这样的免疫原性蛋白的实例包括但不限于钥孔血蓝素、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以采用的佐剂的实例包括Ribi、CpG、Poly 1C、弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰基脂质A，合成的海藻糖二十二烷酸酯)。本领域技术人员无需过度的实验就可以选择免疫方案。然后可以将哺乳动物放血，并分析血清的GFRAL抗体滴度。如果需要，哺乳动物可以进行强化，直到抗体滴度提高或到达平台期。另外地或作为选择，可以从免疫的动物获得淋巴细胞，如下所述用于融合和从杂交瘤制备单克隆抗体。
2.单克隆抗体
本公开内容的抗体作为选择可以是单克隆抗体。例如，单克隆抗体可以通过由Kohler等，Nature，256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利No.4,816,567)。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其他适当的宿主动物，例如仓鼠，引发出淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能产生与用于免疫的蛋白质特异性结合的抗体。作为选择，可以体外免疫淋巴细胞。免疫之后，分离淋巴细胞，然后使用适合的融合药剂例如聚乙二醇与骨髓瘤细胞系融合，来形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles andPractice，PP.59-103(Academic Press，1986))。
如此制备的杂交瘤细胞接种到适合的培养基并在其中生长，所述培养基优选地包含一种或更多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也称为融合伴侣)的生长或生存的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的选择培养基一般将包括次黄嘌呤、氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT-缺陷细胞的生长。
优选的融合伴侣骨髓瘤细胞是那些有效地融合、支持选定的抗体生产细胞以稳定的高水平产生抗体、和对于选择非融合亲本细胞的选择培养基敏感的细胞。优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，例如，可从美国典型培养物保藏所，Manassas，Virginia，USA获得的SP-2及衍生物，例如，X63-Ag8-653细胞，以及可从Salk Institute Cell DistributionCenter，San Diego，California USA获得的衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些。还已经描述了人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系用于人单克隆抗体的生产(Kozbor，J.，Immunol.，133：3001(1984)；和Brodeur et al.，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
分析杂交瘤细胞生长的培养基生产针对所述抗原的单克隆抗体的产量。通过免疫沉淀或通过体外结合分析，例如，放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)来测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。例如通过Munson et al.，Anal.Biochem.，107：220(1980)中描述的Scatchard分析可以测定单克隆抗体的结合亲和性。
一旦鉴定出产生期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，可以通过限制性稀释操作和通过标准方法生产来将所述克隆进行亚克隆(Goding，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。用于这个目的的适合的培养基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以作为动物中的腹腔积液肿瘤来体内生长，例如，通过所述细胞向小鼠的腹膜内注射。
通过常规的抗体纯化步骤，例如亲和层析(例如，使用蛋白A或蛋白G-琼脂糖)或离子交换层析、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析等，适当地将所述亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹腔积液或血清分离。
利用常规程序容易地分离编码单克隆抗体的DNA并测序(例如，通过使用能与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞充当了这种DNA的优选的来源。一旦被分离出来，DNA可以被放入表达载体中，然后将表达载体转染入宿主细胞，例如E.coli细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或那些不产生抗体蛋白质的骨髓瘤细胞，以在所述重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5：256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。
在某些实施方式中，结合GFRAL表位的抗体包含由核苷酸序列编码的VH结构域的氨基酸序列和/或VL结构域的氨基酸序列，所述核苷酸序列在严格条件下(例如，在约45℃下在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与滤器结合的DNA杂交，随后在约50-65℃下在0.2×SSC/0.1％SDS中一次或更多次洗涤)、在高度严格条件下(例如，在约45℃下在6×SSC中与滤器结合的核酸杂交，随后在约68℃下在0.1×SSC/0.2％SDS中一次或更多次洗涤)，或在本领域技术人员已知的其他严格杂交条件下(参见，例如，Ausubel，F.M.et al.，eds.，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.I，Green Publishing Associates，Inc.and John Wiley&Sons，Inc.，New York，第6.3.1-6.3.6和2.10.3页)与编码本文描述的VH和/或VL结构域的任一个的核苷酸序列的互补物杂交。
在某些实施方式中，结合GFRAL表位的抗体包含由核苷酸序列编码的VH CDR的氨基酸序列或VL CDR的氨基酸序列，所述核苷酸序列在严格条件下(例如，在约45℃下在6×SSC中与滤器结合的DNA杂交，随后在约50-65℃下在0.2×SSC/0.1％SDS中一次或更多次洗涤)、在高度严格条件下(例如，在约45℃下在6×SSC中与滤器结合的核酸杂交，随后在约68℃下在0.1×SSC/0.2％SDS中一次或更多次洗涤)，或在本领域技术人员已知的其他严格杂交条件下(参见，例如，Ausubel，F.M.et al.，eds.，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.I，Green Publishing Associates，Inc.and John Wiley&Sons，Inc.，New York，第6.3.1-6.3.6和2.10.3页)与编码表1-24中描述的VH CDR和/或VL CDR的任一个的核苷酸序列的互补物杂交。
在进一步的实施方式中，单克隆抗体或抗体片段可以从抗体噬菌体文库分离，所述抗体噬菌体文库使用例如Antibody Phage Display：Methods and Protocols，P.M.O′Brien and R.Aitken，eds，Humana Press，Totawa N.J.，2002中描述的技术产生。原则上，通过筛选含有噬菌体的噬菌体文库可以选择合成的抗体克隆，所述噬菌体展示与噬菌体衣壳蛋白融合的抗体可变区(Fv)的各种片段。针对期望的抗原筛选这样的噬菌体文库。表达能结合期望抗原的Fv片段的克隆可以吸附到抗原上，因而与文库中的非结合克隆分离。结合的克隆然后可以从抗原上洗脱，可以通过额外的抗原吸附/洗脱循环来进一步富集。
可变域可以功能上地展示在噬菌体上，作为单链Fv(scFv)片段，其中VH和VL通过短的柔性肽共价连接，或作为Fab片段，其中它们各自融合到恒定域并且非共价地相互作用，如Winter et al.，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)中描述的。
VH和VL基因的全集可以通过聚合酶链式反应(PCR)单独地克隆，随机地重新组合到噬菌体文库中，所述文库然后可以如Winter et al.，supra所描述的搜寻结合抗原的克隆。来自被免疫的来源的文库提供了对免疫原高亲和力的抗体，而不需要构建杂交瘤。作为选择，可以克隆天然的全集，来提供针对大范围的非自身和自身抗原的人类抗体的单一来源，而不需任何免疫，如Griffiths et al.，EMBO J，12：725-734(1993)所描述的。最后，如Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所描述的，通过从干细胞克隆未重排的V基因片段，并利用含有随机序列的PCR引物来编码高变的CDR3区来实现体外重排，可以合成地制造天然文库。
文库的筛选可以通过本领域已知的各种技术实现。例如，GFRAL(例如，GFRAL多肽、片段或表位)可以用于包被吸附平板的反应孔，在吸附平板上附着的宿主细胞上表达，或用于细胞分选，或结合于生物素用于使用链霉亲和素包被的珠子进行捕获，或用于淘选展示文库的任何其他方法。具有缓慢的解离动力学(例如，高结合亲和力)的抗体的选择可以通过使用长时洗涤和如Bass et al.，Proteins，8：309-314(1990)和WO 92/09690中描述的单价噬菌体展示，以及如Marks et al.，Biotechnol.，10：779-783(1992)中描述的低密度抗原包被来促成。
通过设计适合的抗原筛选过程来选择目标噬菌体克隆，然后利用来自目标噬菌体克隆的VH和/或VL序列(例如，Fv序列)或来自VH和VL序列的各种CDR序列，以及Kabat etal.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，NIHPublication 91-3242，Bethesda MD(1991)，vols.1-3中描述的合适的恒定区(例如，Fc)序列，构建全长抗-GFRAL抗体克隆，可以获得抗-GFRAL抗体。
3.抗体片段
本公开内容提供了结合GFRAL的抗体和抗体片段。在某些情况下，使用抗体片段而不是完整抗体具有优势。较小的片段大小允许被快速的清除，可产生通向细胞、组织或器官的增加的接触。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson et al.(2003)Nat.Med.9：129-134。
已经开发出各种技术用于产生抗体片段。传统上，通过对完整抗体进行蛋白水解消化来衍生出这些片段(参见，例如Morimoto et al.，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24：107-117(1992)；和Brennan et al.，Science，229：81(1985))。然而，现在可以直接通过重组宿主细胞生产这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都能够在E.coli或酵母细胞中表达和分泌，因而容许容易的产生大量的这些片段。可以从如上所述的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。作为选择，可以直接从E.coli回收Fab′-SH片段，化学地连接形成F(ab′)2片段(Carter et al，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab′)2片段。描述了具有提高的体内半衰期、包含救助受体结合表位残基的Fab和F(ab′)2片段(参见，例如美国专利No.5,869,046)。生产抗体片段的其他技术对于熟练技术人员是显而易见的。在某些实施方式中，抗体是单链Fv片段(scFv)(参见，例如，WO 93/16185；美国专利No.5,571,894和5,587,458)。Fv和sFv可以具有完整结合位点、缺乏恒定区；因而，它们适合于体内使用期间的降低的非特异性结合。可以构建scFv融合蛋白以产生效应物蛋白在scFv的氨基或羧基末端的融合物(参见，例如Antibody Engineering，ed.Borrebaeck，supra)。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如，在上文引用的参考文献中描述的。这样的线性抗体片段可以是单特异性的或多特异性的，例如，双特异性的。
更小的抗体衍生的结合结构是独立的可变域(V结构域)，也称为单可变域抗体(SdAbs)。某些类型的生物，骆驼类和软骨鱼，具有固定在Fc等价结构域结构上的高亲和力单V-样结构域，作为它们的免疫系统的部分。(Woolven et al.，Immunogenetics 50：98-101，1999；Streltsov et al.，Proc Natl Acad Sci USA.101：12444-12449，2004)。V-样结构域(在骆驼类中称为VhH，在鲨鱼中称为V-NAR)一般展示长的表面环，其容许透入目标抗原的空腔。它们还通过遮蔽疏水的表面块来稳定分离的VH结构域。
这些VhH和V-NAR结构域已经用于工程化sdAbs。已经利用从噬菌体文库中选择以及产生稳定的高结合性VL-和VH-衍生结构域的其他方法设计了人V结构域变体。
本文提供的结合GFRAL的抗体包括但不限于，合成的抗体、单克隆抗体、重组生产的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、内抗体(intrabodies)、抗独特型(抗-Id)抗体，以及上述任一种的功能性片段(例如，GFRAL结合片段)。功能性片段(例如，结合GFRAL的片段)的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性，等)、Fab片段、F(ab′)片段、F(ab)2片段、F(ab′)2片段、二硫化物连接的Fvs(sdFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和迷你抗体。
本文提供的抗体包括但不限于免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如，含有结合GFRAL表位的抗原结合位点的分子。本文提供的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类。
抗体的变体和衍生物包括保持了结合GFRAL表位的能力的抗体功能片段。示范性的功能片段包括Fab片段(例如，含有抗原结合结构域、包含由二硫键桥接的轻链与重链部分的抗体片段)；Fab′(例如，含有单个抗原结合结构域、包含Fab和跨过铰链区的重链的额外部分的抗体片段)；F(ab′)2(例如，在重链的绞链区中通过链间的二硫键连接的两个Fab′分子；所述Fab’分子可以针对相同的或不同的表位)；双特异性Fab(例如，具有两个抗原结合结构域的Fab分子，每个抗原结合结构域可以针对不同的表位)；包含可变区的单链Fab链，也称为sFv(例如，通过10-25个氨基酸的链连接在一起的抗体的单个轻链和重链的kB抗原结合决定区)；二硫化物连接的Fv或dsFv(例如，通过二硫键连接在一起的抗体的单个轻链和重链的可变抗原结合决定区)；骆驼化的VH(例如，抗体的单个重链的可变抗原结合决定区，其中在VH界面处的某些氨基酸是天然发生的骆驼抗体的重链中存在的那些)；双特异性sFv(例如，具有两个抗原结合结构域的sFv或dsFv分子，每个抗原结合结构域可以针对不同的表位)；双抗体(例如，二聚化的sFv，当第一个sFv的VH结构域与第二个sFv的VL结构域组合，并且第一个sFv的VL结构域与第二个sFv的VH结构域组合时形成；双抗体的两个抗原结合区可以针对相同的或不同的表位)；以及三抗体(例如，三聚化的sFv，按照与双抗体类似的方式形成，但是其中在单个复合物中创建三个抗原结合结构域；三个抗原结合结构域可以针对相同的或不同的表位)。抗体的衍生物还包括抗体组合位点的一个或更多个CDR序列。当存在两个或更多个CDR序列时，CDR序列可以在支架上连接在一起。在某些实施方式中，所述抗体包含单链Fv(“scFv”)。scFv是包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链上。scFv多肽可以进一步包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其允许scFv形成用于抗原结合的期望的结构。关于sFv的综述参见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg and Mooreeds.Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
4.人源化抗体
本公开内容提供了结合GFRAL，包括人GFRAL的人源化抗体。本公开内容的人源化抗体可以包含表1-24中显示的一个或更多个CDR。将非人类抗体人源化的各种方法是本领域已知的。例如，人源化抗体可以具有被导入其中的、来自非人类来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变区。例如，通过Winter和同事的方法(Jones et al.(1986)Nature 321：522-525；Riechmann et al.(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen et al.(1988)Science 239：1534-1536)，通过将高变区序列替换为相应的人抗体序列，可以进行人源化。
在某些情况下，人源化抗体通过CDR移植来构建，其中亲本非人类抗体(例如，啮齿动物)的六个互补决定区(CDR)被移植到人抗体框架中。例如，Padlan等(FASEB J.9：133-139，1995)确定了CDR中仅约三分之一的残基实际接触抗原，将这些称为“特异性决定残基”或SDR。在SDR移植的技术中，仅SDR残基被移植到人抗体框架上(参见，例如，Kashmiri etal.，Methods 36：25-34，2005)。
在产生人源化抗体时，人类可变域，包括轻链和重链可变域的选择对降低抗原性是非常重要的。例如，根据所谓的“最佳拟合”方法，相对于已知的人类可变域序列的完整文库筛选非人(例如，啮齿动物)抗体的可变域的序列。可以选择最接近啮齿动物序列的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims et al.(1993)J.Immunol.151：2296；Chothia et al.(1987)J.Mol.Biol.196：901)。另一种方法使用了特定的框架，所述框架来源于特定轻链或重链亚群的人类抗体的共有序列。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter etal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285；Presta et al.(1993)J.Immunol.，151：2623)。在某些情况下，所述框架来源于最丰富的人亚类，VL6子群(VL6I)和VH子群III(VHIII)。在其他方法中，在框架区的来源上使用人种系基因。
在基于CDR的比较的可选择的范例中，称为超人源化，FR同源性是无关紧要的。所述方法包括比较非人类序列和功能性人种系基因全集。然后选择编码与鼠序列编码相同的或紧密相关的正则结构的那些基因。接下来，在与非人类抗体共有正则结构的基因中，在CDR内具有最高同源性的那些被选作FR供体。最后，将非人类CDR移植到这些FR上(参见，例如，Tan et al.，J.Immunol.169：1119-1125，2002)。
更进一步一般希望的是，抗体保持着它们对抗原的亲合性及其他有利的生物学性质而被人源化。为了实现这个目标，根据一种方法，通过利用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念上的人源化产物的过程，来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，为本领域技术人员所熟知。图解和显示选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。这些包括，例如，WAM(Whitelegg and Rees，Protein Eng.13：819-824，2000)，Modeller(Sali and Blundell，J.Mol.Biol.234：779-815，1993)，和Swiss PDB Viewer(Guex and Peitsch，Electrophoresis 18：2714-2713，1997)。对这些显示结果的检查，允许分析在候选免疫球蛋白序列的功能中残基可能起的作用，例如，分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。这样，可以从受者和输入序列中选择和组合FR残基，从而获得期望的抗体特性，例如对目标抗原的增加的亲合性。一般地，高变区残基直接地并最为实质上地涉及到对抗原结合的影响。
抗体人源化的另一种方法基于抗体人类性的度量，称为人串列含量(HumanString Content，HSC)。这种方法比较小鼠序列与人种系基因的全集，对差异评分记为HSC。然后通过最大化它的HSC而不是使用全局同一性度量以产生多个各样的人源化变体来将目标序列人源化。(Lazar et al.，Mol.Immunol.44：1986-1998，2007)。
除了上文描述的非之外，经验方法可以用于产生和选择人源化抗体。这些方法包括基于产生大的人源化变体文库、并使用富集技术或高通量筛选技术选择最好的克隆的那些方法。抗体变体可以从噬菌体、核糖体和酵母展示文库分离，以及通过菌落筛选来分离(参见，例如，Hoogenboom，Nat.Biotechnol.23：1105-1116，2005；Dufner et al.，TrendsBiotechnol.24：523-529，2006；Feldhaus et al.，Nat.Biotechnol.21：163-70，2003；Schlapschy et al.，Protein Eng.Des.Sel.17：847-60，2004)。
在FR文库方法中，一系列残基变体在FR中的特定位置引入，随后选择文库来选择最好地支持移植的CDR的FR。要取代的残基可以包括某些或所有的被鉴定为可能有助于CDR结构的“Vernier”残基(参见，例如，Foote and Winter，J.Mol.Biol.224：487-499，1992)，或来自Baca等(J.Biol.Chem.272：10678-10684，1997)鉴定的目标残基的更有限的集合的残基。
在FR改组中，完整的FR与非人类CDR组合，而不是产生选定残基变体的组合文库(参见，例如，Dall′Acqua et al.，Methods 36：43-60，2005)。可以在双步骤的选择过程中筛选文库的结合，首先是将VL人源化，随后是VH。作为选择，可以使用单步骤的FR改组过程。这样的过程已经显示比双步骤筛选更为高效，产生的抗体展现了改善的生物化学和物理化学性质，包括增强的表达、提高的亲和力和热稳定性(参见，例如，Damschroder et al.，Mol.Immunol.44：3049-60，2007)。
“人类化(humaneering)”方法基于必需最小特异性决定簇(MSD)的实验鉴定，以及基于非人类片段向人FR的文库中的连续替换以及结合评估。它从非人类VH和VL链的CDR3区开始，逐渐将非人类抗体的其他区域替换到人FR中，包括VH和VL的CDR1和CDR2。这种方法一般引起表位保留，并从具有不同的人V-片段CDR的多个子类中鉴定出抗体。人类化允许分离出与人种系基因抗体91-96％同源的抗体(参见，例如，Alfenito，Cambridge HealthtechInstitute′s Third Annual PEGS，The Protein Engineering Summit，2007)。
“人工程化”方法涉及改变非人类抗体或抗体片段，例如，小鼠或嵌合抗体或抗体片段，通过对抗体的氨基酸序列进行特定改变以产生具有在人体中降低的免疫原性、但仍然保持了原始非人类抗体的期望结合性质的修饰的抗体。一般地，所述技术涉及将非人类(例如，小鼠)抗体的氨基酸残基分类为“低风险”、“中等风险”或“高风险”残基。使用全局风险/奖励计算进行所述分类，所述计算评估进行特定取代的预计效益(例如，为了人体中的免疫原性)相对于该取代将影响产生的抗体的折叠和/或被人残基取代的风险。在非人类(例如，小鼠)抗体序列的给定位置(例如，低风险或中等风险)上要取代的特定的人氨基酸残基，可以通过比对来自非人类抗体的可变区的氨基酸序列与特定的或共有的人抗体序列来选择。在非人类序列中低风险或中等风险位置处的氨基酸残基可以根据所述比对替换成人抗体序列中的相应残基。制造人工程化的蛋白质的技术在Studnicka et al.，ProteinEngineering，7：805-814(1994)，美国专利5,766,886、5,770,196、5,821,123和5,869,619以及PCT申请公开WO 93/11794中更详细地描述。
5.人抗体
通过组合来自人类衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变域序列与已知的人恒定域序列，可以构建人抗-GFRAL抗体。作为选择，本公开内容的人单克隆GFRAL抗体可以通过杂交瘤方法产生。已经描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂合杂交瘤细胞系，例如Kozbor J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；和Boerneref ai，J.Immunol.，147：86(1991)。
还可能产生转基因的动物(例如，小鼠)，其能在免疫时产生人类抗体的完整全集而没有内源性免疫球蛋白产生。表达人抗体全集的转基因小鼠已经用于针对各种各样的潜在药物靶点产生高亲和力人序列单克隆抗体(参见，例如，Jakobovits，A.，Curr.Opin.Biotechnol.1995，6(5)：561-6；Bruggemann and Taussing，Curr.Opin.Biotechnol.1997，8(4)：455-8；美国专利No.6,075,181和6,150,584；和Lonberg et al，Nature Biotechnol.23：1117-1125，2005)。
作为选择，人类抗体可以通过产生针对目标抗原的人类B淋巴细胞的永生化来制备(例如，这样的B淋巴细胞可以从个体中恢复，或可以在体外被免疫)(参见，例如，Cole etal.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerneret al.，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)；和美国专利No.5,750,373)。
基因改组也可以用于从非人类抗体，例如啮齿动物抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始的非人类相似的亲和力和特异性。根据这种方法，其也称为“表位印记(epitopeimprinting)”或“导向选择(guided selection)”，通过如本文描述的噬菌体展示获得的非人类抗体片段的重链或轻链可变区被替换为人V结构域基因的全集，产生非人类链/人类链scFv或Fab嵌合体的群体。使用抗原选择得到非人类链/人类链嵌合scFv或Fab的分离，其中人类链恢复了在原始噬菌体展示克隆中去除相应非人类链时被破坏的结合位点(例如，所述表位指导(印记)所述人类链伴侣的选择)。当重复该过程以置换剩余的非人类链时，获得了人抗体(参见，例如，PCT WO 93/06213；和Osbourn et al.，Methods.，36，61-68，2005)。不同于通过CDR移植的非人类抗体的传统人源化，这种技术提供了完全人类抗体，其没有非人类来源的FR或CDR残基。进行导向选择来人源化针对细胞表面抗原的小鼠抗体的实例包括，卵巢癌细胞上存在的叶酸盐结合蛋白(参见，例如，Figini et al.，Cancer Res.，58，991-996，1998)和在肝细胞癌上高度表达的CD147(参见，例如，Bao et al.，CancerBiol.Ther，4，1374-1380，2005)。
导向选择方法的潜在缺点是，一条抗体链的改组同时保持另一条恒定可能引起表位漂移。为了维持非人类抗体识别的表位，可以应用CDR保留(参见，例如，Klimka et al.，Br.J.Cancer.，83，252-260，2000；VH CDR2 Beiboer et al.，J.Mol.Biol.，296，833-49，2000)。在这种方法中，非人类VH CDR3通常被保留，因为这个CDR可能处在抗原结合位点的中心，可能是抗体用于抗原识别的最重要的区域。然而在某些情况下，可以保留非人类抗体的VH CDR3与VL CDR3，以及VH CDR3、VL CDR3与VL CFR1。
6.双特异性抗体
双特异性抗体是具有针对至少两个不同抗原的结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方式中，双特异性抗体是人抗体或人源化抗体。在某些实施方式中，结合特异性之一是GFRAL，另一个是任何其他抗原。在某些实施方式中，双特异性抗体可以结合GFRAL的两个不同的表位。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段来制备(例如，F(ab′)2双特异性抗体)。
制造双特异性抗体的方法是本领域已知的，例如，通过两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条重链具有不同的特异性(参见，例如，Milstein and Cuello，Nature，305：537(1983))。产生双特异性抗体的进一步的细节，参见，例如Bispecific Antibodies，Kontermann，ed.，Springer-Verlag，Hiedelberg(2011)。
7.多价抗体
对于表达抗体所结合的抗原的细胞，多价抗体可以比二价抗体更快地被内在化(和/或代谢)。本公开内容的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点(例如，四价抗体)的多价抗体(除了IgM类别之外)，其可以通过编码抗体的多肽链的核酸的重组表达来容易地产生。多价抗体可以包含二聚化结构域以及三个或更多个抗原结合位点。在某些实施方式中，所述二聚化结构域包含(或由以下组成)Fc区或绞链区。在这种情况下，抗体将包含Fc区，以及Fc区的氨基末端的三个或更多个抗原结合位点。在某些实施方式中，多价抗体包含(或由以下组成)三个到约八个抗原结合位点。在一个这样的实施方式中，多价抗体包含(或由以下组成)四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(例如，两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或更多个可变域。例如，多肽链可以包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X和X2代表氨基酸或多肽，n是0或1。例如，多肽链可以包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。在此多价抗体可以进一步包含至少两个(例如，四个)轻链可变域多肽。例如，多价抗体可以包含约两个到约八个轻链可变域多肽。本文期待的轻链可变域多肽包含轻链可变域，以及，任选地，进一步包含CL结构域。
8.Fc工程化
可能希望的是通过Fc工程化来修饰针对GFRAL的抗体，包括，对于效应物功能，例如，以降低或除去抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体的Fc中引入一个或更多个氨基酸取代来实现。例如，使用位置233-236处的IgG2残基和位置327、330和331处的IgG4残基取代到人IgG1中显示了很大地降低ADCC和CDC(参见，例如，Armour et al.，Eur.J.Immunol.29：(8)：2613-24(1999)；Shields et al.，J.BioL.Chem.276(9)：6591-604(2001)。
为了提高抗体的血清半衰期，人们可以将救助受体结合表位合并到抗体(特别是抗体片段)中，例如，美国专利5,739,277中描述的。术语“救助受体结合表位”是指IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位，其对提高IgG分子的体内血清半衰期负责。
9.可选择的结合药剂
本公开内容涵盖特异性结合与本文公开的抗-GFRAL抗体相同的表位的非免疫球蛋白结合药剂。在某些实施方式中，非免疫球蛋白结合药剂被鉴定为在竞争性结合分析中替换本公开内容的抗-GFRAL抗体、或被本公开内容的抗-GFRAL抗体替换的药剂。这些可选择的结合药剂可以包括，例如，任一种本领域已知的工程化的蛋白质支架。这样的支架可以包含表1-24中显示的一个或更多个CDR。这样的支架包括，例如，基于脂质运载蛋白(lipocalin)支架的抗运载蛋白(anticalin)，是一种特征在于刚性的β-圆筒的蛋白质结构，其支撑了形成配体结合位点的四个高变的环。通过环区域中的靶向随机诱变，与功能展示和导向选择结合，可以工程化新的结合特异性(参见，例如，Skerra(2008)FEBS J.275：2677-2683)。其他适合的支架可以包括，例如，adnectins或monobodies，基于人纤连蛋白III的第十个细胞外结构域(参见，例如，Koide and Koide(2007)Methods Mol.Biol.352：95-109)；affibodies，基于葡萄球菌蛋白A的Z结构域(参见，例如，Nygren et al.(2008)FEBS J.275：2668-2676)；DARPins，基于锚蛋白(ankyrin)重复蛋白(参见，例如，Stumpp etal.(2008)Drug.Discov.Today 13：695-701)；fynomers，基于人Fyn蛋白激酶的SH3结构域Grabulovski et al.(2007)J.Biol.Chem.282：3196-3204)；affitins，基于来自Sulfolobus acidolarius的Sac7d(参见，例如，Krehenbrink et al.(2008)J.Mol.Biol.383：1058-1068)；affilins，基于人y-B-晶状体蛋白(参见，例如，Ebersbachet al.(2007)J.Mol.Biol.372：172-185)；avimers，基于膜受体蛋白的A结构域(参见，例如，Silverman et al.(2005)Biotechnol.23：1556-1561)；富半胱氨酸knottin肽(参见，例如，Kolmar(2008)FEBS J.275：2684-2690)；和工程化的Kunitz-型抑制物(参见，例如，Nixon and Wood(2006)Curr.Opin.Drug.Discov.Dev.9：261-268)。综述参见，例如，Gebauerand Skerra(2009)Curr.Opin.Chem.Biol.13：245-255。
抗体变体
在某些实施方式中，本文描述的结合GFRAL的抗体的氨基酸序列修饰是期待的。例如，可能希望的是改善抗体的结合亲和性和/或其他生物学性质，包括但不限于特异性、热稳定性、表达水平、效应物功能、糖基化、降低的免疫原性或溶解性。除了本文描述的抗-GFRAL抗体之外，期待的是可以制备抗-GFRAL抗体变体。例如，通过向编码DNA中引入适当的核苷酸改变，和/或通过合成期望的抗体或多肽，可以制备抗-GFRAL抗体变体。本领域技术人员将理解，氨基酸变化可能改变抗-GFRAL抗体的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数目和位置或改变膜锚定特征。
在某些实施方式中，本文提供的抗体被化学修饰，例如，通过将任何类型的分子与所述抗体缔合，包括共价附着。抗体衍生物可以包括已经被化学修饰的抗体，例如，通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解裂解、连接到细胞配体或其他蛋白，等。可以通过已知的技术进行许多化学修饰的任一种，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成，等等。此外，所述抗体可以含有一个或多个非经典氨基酸。
变异可以是编码所述抗体或多肽的一个或更多个密码子的取代、删除或插入，其引起与天然序列抗体或多肽相比在氨基酸序列中的改变。氨基酸取代可以是一个氨基酸用具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸替换的结果，例如用丝氨酸替换亮氨酸，例如，保守性氨基酸替换。插入或删除任选地可以在约1个到5个氨基酸的范围内。在某些实施方式中，所述取代、删除或插入包括相对于原始分子小于25个氨基酸取代、小于20个氨基酸取代、小于15个氨基酸取代、小于10个氨基酸取代、小于5个氨基酸取代、小于4个氨基酸取代、小于3个氨基酸取代、或小于2个氨基酸取代。在具体的实施方式中，所述取代是保守性氨基酸取代，其在一个或更多个预测的非必需氨基酸残基处进行。通过在序列中系统性地制造氨基酸的插入、删除或取代并测试所产生的变体的由全长或成熟天然序列展现的活性，可以确定容许的变异。
氨基酸序列插入物包括长度从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入物。末端插入物的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-或C-末端与酶(例如，用于抗体指导的酶前体药物治疗)或提高抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
抗体的生物学性质的实质性修饰伴随着选择在它们维持以下的效力上差异显著的取代，(a)在取代区域中多肽主干的结构，例如，片层或螺旋构象，(b)目标位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的部分。作为选择，可以进行保守性(例如，在具有相似性质和/或测量的氨基酸组之内)取代，以维持或不显著改变所述性质。氨基酸可以根据它们的侧链性质方面的相似来分组(参见，例如，A.L.Lehninger，in Biochemistry，2nd Ed.，pp.73-75，Worth Publishers，New York(1975))：(1)非极性：Ala(A)，Val(V)，Leu(L)，lie(I)，Pro(P)，Phe(F)，Trp(W)，Met(M)；(2)不带电极性：Gly(G)，Ser(S)，Thr(T)，Cys(C)，Tyr(Y)，Asn(N)，Gin(Q)；(3)酸性：Asp(D)，Glu(E)；和(4)碱性：Lys(K)，Arg(R)，His(H)。
作为选择，天然发生的残基可以基于常见的侧链性质分入以下的组：(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；和(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代需要交换这些类别或其他类别之一的成员。这种取代的残基也可以被导入保守性取代位点，或导入其余的(非保守性)位点。因而，在一个实施方式中，结合GFRAL表位的抗体或其片段包含氨基酸序列，所述氨基酸序列至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同于本文描述的鼠单克隆抗体的氨基酸序列。在一个实施方式中，结合GFRAL表位的抗体或其片段包含氨基酸序列，所述氨基酸序列至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同于表1-24中描述的氨基酸序列。在又一个实施方式中，结合GFRAL表位的抗体或其片段包含VH CDR和/或VL CDR氨基酸序列，所述氨基酸序列至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同于表1-24中描述的VH CDR氨基酸序列和/或表1-24中描述的VL CDR氨基酸序列。可以使用本领域已知的方法产生变异，例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变。定点诱变(参见，例如，Carter et al.，Nucl.Acids Res.，13：4331(1986)；ZoWer et al.，Nucl.AcidsRes.，10：6487(1987))，盒诱变(参见，例如，Wells et al.，Gene，34：315(1985))，限制性选择诱变(参见，例如，Wells et al.，Philos.Trans.R.Soc.London SerA，317：415(1986))或其他已知的技术可以对克隆的DNA进行，以产生抗-GFRAL抗体变体DNA。
不涉及维持抗-GFRAL抗体的适当构象的任何半胱氨酸残基也可以被取代，例如，用另一个氨基酸如丙氨酸或丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性和防止异常的交联。反之，半胱氨酸键可以添加到抗-GFRAL抗体中来改善它的稳定性(例如，当所述抗体是抗体片段例如Fv片段时)。
在某些实施方式中，本公开内容的抗-GFRAL抗体是“去免疫的”抗体。“去免疫的”抗-GFRAL抗体是一种衍生自人源化或嵌合抗-GFRAL抗体的抗体，其在氨基酸序列中具有一个或更多个改变，引起与相应的原始的非去免疫抗体相比，抗体免疫原性的降低。产生这样的抗体突变体的操作之一涉及鉴定并除去抗体分子的T细胞表位。在第一个步骤中，抗体分子的免疫原性可以通过几种方法测定，例如，通过T细胞表位的体外测定，或计算机预测这样的表位，如本领域已知的。一旦鉴定出T细胞表位功能的关键残基，可以进行突变来除去免疫原性并保持抗体活性。综述参见，例如，Jones et al.，Methods in MolecularBiology 525：405-423，2009。
1.体外亲和成熟
在某些实施方式中，与亲本抗体相比具有改善的性质，例如亲和力、稳定性或表达水平的抗体变体可以通过体外亲和成熟来制备。如同天然的原型一样，体外亲和成熟基于突变和选择的原理。在生物体(例如，噬菌体、细菌、酵母或哺乳动物细胞)的表面上，或与它们的编码mRNA或DNA缔合地(例如，共价或非共价地)，抗体的文库作为Fab、scFv或V结构域片段进行展示。展示的抗体的亲和选择容许分离带有编码所述抗体的遗传信息的生物体或复合物。利用展示方法例如噬菌体展示的两轮或三轮突变和选择通常产生具有低纳摩尔范围内的亲和力的抗体片段。优选的亲和成熟的抗体将具有对于目标抗原的纳摩尔乃至皮摩尔的亲和力。
噬菌体展示是一种用于展示和选择抗体的广泛方法。抗体作为与噬菌体衣壳蛋白的融合物展示在Fd或M13噬菌体的表面。选择涉及暴露于抗原以容许噬菌体展示的抗体结合它们的目标，是一种称为“淘选(panning)”的过程。回收与抗原结合的噬菌体，感染细菌以产生用于下一轮选择的噬菌体。综述参见，例如，Hoogenboom，Methods.Mol.Biol.178：1-37，2002；Bradbury and Marks，J.Immuno.Methods 290：29-49，2004)。
在酵母展示系统中(参见，例如Boder et al，Nat.Biotech.15：553-57，1997；Chaoet al.，Nat.Protocols 1：755-768，2006)，抗体可以作为单链的可变融合物(scFv)展示，其中重链和轻链通过柔性的接头连接。scFv融合到酵母凝集素蛋白Aga2p的粘附亚基，其通过与Agalp的二硫键附着到酵母细胞壁上。经由Aga2p的蛋白质展示使得所述蛋白质突出于细胞表面，使得与酵母细胞壁上的其他分子的潜在相互作用最小化。磁性分离和流式细胞术用于筛选文库，以选择具有改善的亲和力或稳定性的抗体。通过用生物素化的抗原以及二级药剂例如与荧光团结合的链霉亲和素来标记酵母，确定与目标可溶性抗原的结合。抗体的表面表达中的变异可以通过scFv侧翼的血细胞凝集素或c-Myc表位标签的免疫荧光标记来测量。已经显示了表达与所展示的蛋白质的稳定性相关，因而可以就改善的稳定性以及亲和力来选择抗体(参见，例如，Shusta et al.，J.Mol.Biol.292：949-956，1999)。酵母展示的另外的优点是，所展示的蛋白质在真核的酵母细胞的内质网中折叠，利用了内质网侣伴蛋白和质量控制机制。一旦完成了成熟化，在被展示在酵母表面的同时，抗体亲和力可以方便地“滴定”，消除了表达和纯化每个克隆的必要性。酵母表面展示的理论限制是与其他展示方法相比可能更小的功能性文库大小；然而，新近的方案利用了酵母细胞的交配系统来产生大小估计达到1014的组合多样性(参见，例如，美国专利公开2003/0186,374；Blaise et al.，Gene 342：211-218，2004)。
在核糖体展示中，产生抗体-核糖体-mRNA(ARM)复合物用于在无细胞系统中选择。编码特定的抗体文库的DNA文库遗传融合到缺乏终止密码子的间隔区序列上。当被翻译时，这种间隔区序列仍然附着在肽基tRNA上，并占据核糖体的隧道，因而容许目标蛋白质突出于核糖体并折叠。产生的mRNA、核糖体和蛋白质的复合物可以结合表面结合的配体，容许通过利用所述配体的亲和捕获来同时分离抗体和它的编码mRNA。核糖体结合的mRNA然后被逆转录回cDNA，其然后经历诱变并用于下一轮选择(参见，例如，Fukuda et al.，NucleicAcids Res.34，e127，2006)。在mRNA展示中，抗体与mRNA之间的共价键利用嘌呤霉素作为衔接体分子来建立(Wilson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，3750-3755，2001)。
由于这些方法可以完全在体外进行，它们提供了相对于其他选择技术的两个主要优点。首先，文库的多样性不受到细菌细胞的转化效率的限制，而仅受试管中存在的核糖体和不同mRNA分子的数量的限制。第二，可以在每轮选择之后容易地引入随机突变，例如，通过非校正性聚合酶，文库不需在任何多元化步骤之后进行转化。
可以以靶向方式或通过随机导入将多样性引入抗体文库的CDR或完整V基因中。通过高水平或低水平的诱变，或者靶向体细胞超突变的分离的热点(参见，例如，Ho，et al.，J.Biol.Chem.280：607-617，2005)或在实验基础上或结构推理上怀疑影响亲和力的残基，前述方法包括顺序地靶向抗体的所有CDR。利用E.coli突变者菌株、DNA聚合酶的差错复制(参见，例如，Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226：889-896，1992)或RNA复制酶，可以在整个完整的V基因中导入随机突变。还可以通过DNA改组或类似的技术(参见，例如，Lu et al.，J.Biol.Chem.278∶43496-43507，2003；美国专利No.5,565,332；美国专利No.6,989,250)替换天然有多样性的区域来导入多样性。可选择的技术靶向延伸入框架区残基的高变环(参见，例如，Bond et al.，J.Mol.Biol.348：699-709，2005)，采用CDR中的环删除或插入，或利用基于杂交的多样化(参见，例如，美国专利公开No.2004/0005709)。例如，在美国专利No.7,985,840中公开了在CDR中产生多样性的其他方法。
文库的筛选可以通过本领域已知的各种技术实现。例如，GFRAL可以固定在固相支持物、柱、针或纤维素/聚(偏二氟乙烯)膜/其他滤器上，在粘附于吸附平板的宿主细胞上表达，或在细胞分选中使用，或结合到生物素以使用链霉亲和素包被的珠子捕获，或用于淘选展示文库的任何其他方法中。
对于体外亲和成熟方法的综述，参见，例如，Hoogenboom，Nature Biotechnology23：1105-1116，2005和Quiroz and Sinclair，Revista Ingeneria Biomedia 4：39-51，2010以及其中的参考文献。
2.抗-GFRAL抗体的修饰
抗-GFRAL抗体的共价修饰被包括在本公开内容的范围内。共价修饰包括使抗-GFRAL抗体的目标氨基酸残基与有机的衍生化药剂接触，所述药剂能够与抗-GFRAL抗体的选定的侧链或N-或C-末端残基反应。其他修饰包括谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基分别脱酰胺化为相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基基团的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基基团的甲基化(参见，例如，T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，pp.79-86(1983))，N-末端胺的乙酰化，以及C-末端羧基基团的酰胺化。
包括在本公开内容的范围内的抗-GFRAL抗体的其他类型的共价修饰包括改变所述抗体或多肽的天然糖基化模式(参见，例如，Beck et al.，Curr.Pharm.Biotechnol.9：482-501，2008；Walsh，Drug Discov.Today 15：773-780，2010)，以及将所述抗体与多种非蛋白聚合物之一连接，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙烯乙二醇或聚氧化烯，按照例如美国专利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中阐述的方式。
本公开内容的抗-GFRAL抗体还可以被修饰以形成嵌合分子，其包含与另一个异源多肽或氨基酸序列融合的抗-GFRAL抗体，例如，表位标签(参见，例如，Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60：523-533，2003)或IgG分子的Fc区(参见，例如，Aruffo，″Immunoglobulin fusion proteins″in Antibody Fusion Proteins，S.M.Chamow andA.Ashkenazi，eds.，Wiley-Liss，New York，1999，pp.221-242)。
本文还提供的是融合蛋白，其包含与GFRAL抗体结合的本文提供的抗体和异源多肽。在某些实施方式中，抗体融合的所述异源多肽对于将所述抗体靶向具有细胞表面表达的GFRAL的细胞是有用的。
本文还提供的是结合GFRAL抗原的抗体的面板(panels)。在具体的实施方式中，抗体的面板具有对GFRAL抗原的不同的结合速率常数、不同的离解速率常数、不同的亲和力，和/或对GFRAL抗原的不同特异性。在某些实施方式中，所述面板包含或由约10个、约25个、约50个、约75个、约100个、约125个、约150个、约175个、约200个、约250个、约300个、约350个、约400个、约450个、约500个、约550个、约600个、约650个、约700个、约750个、约800个、约850个、约900个、约950个、或约1000个抗体或更多组成。例如，抗体的面板可以用于96孔或384孔平板中，例如，用于分析，如ELISA。
抗-GFRAL抗体的制备
抗-GFRAL抗体可以通过培养用含有抗-GFRAL抗体编码核酸的载体转化或转染的细胞来生产。编码本公开内容的抗体的多肽成分的多核苷酸序列可以使用标准的重组技术获得。期望的多核苷酸序列可以从抗体生产细胞例如杂交瘤细胞分离并测序。作为选择，多核苷酸可以利用核苷酸合成仪或PCR技术合成。一旦获得，编码多肽的序列被插入能够在宿主细胞中复制并表达异源多核苷酸的重组载体中。对于本公开内容来说，可以使用现有的和本领域已知的许多载体。适合的载体的选择将主要取决于将要插入载体中的核酸的大小和要用载体转化的特定宿主细胞。适合于表达本公开内容的抗体的宿主细胞包括原核生物，例如古细菌(Archaebacteria)和真细菌(Eubacteria)，包括革兰氏阴性或格兰氏阳性生物，真核微生物，例如丝状真菌或酵母，无脊椎动物细胞，例如昆虫或植物细胞，以及脊椎动物细胞，例如哺乳动物宿主细胞系。宿主细胞用上文描述的表达载体转化，在为诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而视情况修改的常规营养培养基中培养。所述宿主细胞产生的抗体使用本领域已知的标准的蛋白质纯化方法进行纯化。
生产抗体的方法，包括载体构建、表达和纯化在Pluckthun et al.，(1996)inAntibody Engineering：Producing antibodies in Escherichia coli：From PCR tofermentation(McCafferty，J.，Hoogenboom，H.R.，and Chiswell，D.J.，eds)，1Ed.，pp.203-252，IRL Press，Oxford；Kwong，K.&Rader，C，E.coli expression andpurification of Fab antibody fragments，Current protocols in protein scienceeditorial board John E Coligan et al.，Chapter 6，Unit 6.10(2009)；Tachibana andTakekoshi，″Production of Antibody Fab Fragments in Escherischia coli，″inAntibody Expression and Production，M.Al-Rubeai，Ed.，Springer，New York，2011；Therapeutic Monoclonal Antibodies：From Bench to Clinic(ed Z.An)，John Wiley&Sons，Inc.，Hoboken，NJ，USA中进一步描述。
当然，期待的是，本领域公知的可选择方法可被用来制备抗-GFRAL抗体。例如，适当的氨基酸序列或其部分可以通过利用固相技术的直接肽合成来产生(参见，例如，Stewart et al.，Solid-Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc，85：2149-2154(1963))。可以利用人工技术或通过自动装置进行体外蛋白质合成。可以分别化学合成抗-GFRAL抗体的各个部分，利用化学的或酶学的方法组合来产生期望的抗-GFRAL抗体。作为选择，抗体可以从转基因动物的细胞或体液例如奶中纯化，所述转基因动物被工程化以表达所述抗体，如美国专利No.5,545,807和美国专利No.5,827,690中公开的。
免疫结合物
本公开内容还提供了结合物，其包含与一个或更多个非抗体药剂共价连接，包括通过合成的接头共价连接的本公开内容的任一抗-GFRAL抗体。
用于产生放射性结合抗体的各种放射性同位素是可获得的。实例包括At211、I4、I4、Y4、Re4、Re4、Sm4、Bi4、P4、Pb4以及Lu的放射性同位素。当所述结合物是用于检测时，其可以包含用于闪烁成像研究的放射性原子，例如tc4或I4、或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成象，MRI)的自旋标记物，例如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。所述放射性同位素可以按已知方式掺入所述结合物，例如Reilly，″Theradiochemistry of monoclonal antibodies and peptides，″in Monoclonal Antibodyand Peptide-Targeted Radiotherapy of Cancer，R.M.Reilly，ed.，Wiley，HobokenN.J.，2010中描述的。
在某些实施方式中，本文提供的抗体结合到或重组融合到诊断药剂、可检测药剂或治疗药剂或任何其他分子。结合的或重组融合的抗体可以是有用的，例如，作为临床测试过程的一部分用于β-细胞缺陷性疾病、失调或状况的发作、发展、进展和/或严重度的监视或预后，例如，测定特定治疗的效力。
可以实现这样的诊断和检测，例如，通过将所述抗体偶联到可检测的物质，包括但不限于各种酶，例如但不限于辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，例如但不限于链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光材料，例如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光材料，例如但不限于鲁米诺；生物发光材料，例如但不限于荧光素酶、萤光素和水母发光蛋白；化学发光材料，例如但不限于基于吖啶的化合物或HALOTAG；放射性物质，例如但不限于碘(131l、125l、123l和121l，)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115ln、113ln、112ln、和111ln)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn和117Sn；以及利用各种正电子发射断层照相的正电子发射金属，和非放射性的顺磁性金属离子。
本文还提供的是结合到或重组融合到治疗部分(或一个或更多个治疗部分)的抗体，以及其用途。所述抗体可以结合到或重组融合到治疗部分，包括细胞毒素，例如细胞抑制性或杀细胞性药剂，治疗药剂或放射性金属离子，例如α-发射体。细胞毒素或细胞毒性药剂包括对细胞有害的任何药剂。
进一步的，本文提供的抗体可以结合或重组融合到修饰给定生物学反应的治疗部分或药物部分。治疗部分或药物部分不应被认为限于标准的化学治疗药剂。例如，药物部分可以是具有期望的生物学活性蛋白质、肽或多肽。这样的蛋白质可以包括，例如，毒素，如相思豆毒蛋白(abrin)、篦麻蛋白A、假单胞菌属外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质，例如肿瘤坏死因子、γ-干扰素、α-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、组织纤溶酶原激活物、细胞凋亡剂，例如，TNF-γ、TNF-γ、AMII(参见，例如，国际公开No.WO97/33899)、AMI II(参见，例如，国际公开No.WO97/34911)、Fas配体(参见，例如，eg.Jakahashi etal.，1994，J.Immunol.，6：1567-1574)和VEGF(参见，例如，国际公开No.WO99/23105)、抗血管生成剂，包括例如血管抑素、内皮抑素或凝血途径的成分(例如，组织因子)；或生物反应修饰物，例如，淋巴因子(例如，干扰素gamma、白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-5(“IL-5”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、白细胞介素-7(“IL-7”)、白细胞介素-9(“IL-9”)、白细胞介素-10(“IL-10”)、白细胞介素-12(“IL-12”)、白细胞介素-15(“IL-15”)、白细胞介素-23(“IL-23”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”))，或生长因子(例如，生长激素(“GH”))，或凝血剂(例如，钙、维生素K、组织因子，例如但不限于，哈格曼因子(因子XII)、高分子量激肽原(HMWK)、激肽释放酶原(PK)、凝血蛋白-因子II(凝血酶原)、因子V、Xlla、VIII、Xllla、XI、Xla、IX、IXa、X、磷脂和纤维蛋白单体)。
本文还提供的是抗体，其重组融合或化学结合(共价或非共价的结合)于异源蛋白质或多肽(或其片段，例如，约10个、约20个、约30个、约40个、约50个、约60个、约70个、约80个、约90个或约100个氨基酸的多肽)以产生融合蛋白，以及其用途。特别地，本文提供的是融合蛋白，其包含本文提供的抗体的抗原结合片段(例如，Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab′)2片段、VH结构域、VH CDR、VL结构域或VL CDR)和异源蛋白质、多肽或肽。在一个实施方式中，所述抗体融合的异源蛋白质、多肽或肽用于将所述抗体靶向特定的细胞类型，例如，表达GFRAL的细胞。例如，结合特定细胞类型(例如，免疫细胞)表达的细胞表面受体的抗体可以融合或结合到本文提供的修饰的抗体。
此外，本文提供的抗体可以结合到治疗部分，例如，放射性金属离子，例如，α-发射体，如213Bi，或用于将放射金属离子，包括但不限于131ln、131LU、131Y、131Ho、131Sm结合到多肽的大环螯合剂。在某些实施方式中，大环螯合剂是1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N”’-四乙酸(DOTA)，其可以经由接头分子附着到抗体上。这样的接头分子通常是本领域已知的，例如，在Denardo et al.，1998，Clin Cancer Res.4(10)：2483-90；Peterson etal.，1999，Bioconjug.Chem.10(4)：553-7；和Zimmerman et al.，1999，Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50中描述。
此外，本文提供的抗体可以融合到标志物或“标签”序列，例如肽，以便于纯化。在具体的实施方式中，所述标志物或标签氨基酸序列是六-组氨酸肽，例如，pQE载体(参见，例如，QIAGEN，Inc.)中提供的标签，以及其他，它们中的许多是商业上可获得的。例如，如Gentz et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824中描述的，六-组氨酸提供了纯化融合蛋白的便利。对于纯化有用的其他肽标签包括但不限于，血细胞凝集素(“HA”)标签，其相应于衍生自流感血细胞凝集素蛋白的表位(Wilson et al.，1984，Cell 37：767)，以及“FLAG”标签。
将治疗部分(包括多肽)融合或结合到抗体的方法是公知的，(参见，例如，Arnonet al.，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy″，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom et al.，″Antibodies For DrugDelivery″，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson et al.(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of CVtotoxic Agents InCancer Therapy：A Review″，in Monoclonal Antibodies 84：Biological And ClinicalApplications，Pinchera et al.(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy″，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin etal.(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，Thorpe et al.，1982，Immunol.Rev.62：119-58；美国专利Nos.5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851、5,723,125、5,783,181、5,908,626、5,844,095、和5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；EP 394,827；PCT公开WO 91/06570、WO 96/04388、WO 96/22024、WO 97/34631、和WO 99/04813；Ashkenazi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：10535-10539，1991；Trauneckeret al.，Nature，331：84-86，1988；Zheng et al.，J.Immunol.，154：5590-5600，1995；Vil et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：11337-11341，1992)。
通过基因改组(shulffing)、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(共同称为“DNA改组”)的技术，可以产生其他的融合蛋白。可以采用DNA改组来改变本文提供的抗-GFRAL抗体的活性，包括，例如，具有更高亲和力和更低离解速率的抗体(参见，例如，美国专利Nos.5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252、和5,837,458；Patten et al.，1997，Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33；Harayama，1998，Trends Biotechnol.16(2)：76-82；Hansson et al.，1999，J.Mol.Biol.287：265-76；和Lorenzo and Blasco，1998，Biotechniques 24(2)：308-313)。抗体或编码的抗体可以通过差错PCR、随机核苷酸插入或其他方法在重组之前经历随机诱变来进一步改变。编码本文提供的抗体的多核苷酸可以与一种或多种异源分子的一个或多个成分、基序、段、部分、结构域、片段等等重组。
本文提供的抗体还可以结合到第二抗体来形成抗体杂结合物，例如美国专利No.4,676,980中所描述的。
与结合GFRAL(例如，GFRAL多肽、片段、表位)的本文提供的抗体结合或重组融合的治疗部分或药物应当被选择以实现期望的预防或治疗效果。在某些实施方式中，所述抗体是修饰的抗体。在决定哪一治疗部分或药物将结合或重组融合到本文提供的抗体时，临床医师或其他医务人员可以考虑例如以下的：疾病的性质、疾病严重度以及对象的状况。
本文提供的结合GFRAL的抗体还可以附着于固相支持物，其对于免疫分析或目标抗原的纯化是特别有用的。这种固相支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
接头可以是便于结合的药剂在细胞中释放的“可裂解接头”，但是非可裂解接头也是本文期待的。用于本公开内容的结合物的接头无限制地包括酸不稳定接头(例如，腙接头)、含二硫化物的接头、肽酶敏感性接头(例如，包含氨基酸如缬氨酸和/或谷氨酸，如瓜氨酸-缬氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸的肽接头)、光不稳定接头、二甲基接头(参见，例如，Chariet al.，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)、硫醚接头、或被设计以逃避多药物转运体介导的抗性的亲水性接头(参见，例如，Kovtun et al.，CancerRes.70：2528-2537，2010)。
抗体和药剂的结合物可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来制造，例如，BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SlAB、硫代-SMCC和硫代-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)。本公开内容进一步期待抗体和药剂的结合物可以使用本领域公开的任何适合的方法制备(参见，例如Bioconjugate Techniques，2nd Ed.，G.T.Hermanson，ed.，Elsevier，San Francisco，2008)。
抗体和药剂的常规结合策略基于随机结合化学作用，涉及Lys残基的ε-氨基基团或Cys残基的硫醇基团，产生异源的结合物。近年来发展的技术容许与抗体的位点特异性结合，产生同质的加载并避免具有改变的抗原结合或药物动力学的结合物亚群。这些包括“thiomab”的工程化，其包含处在重链和轻链的位置上的半胱氨酸取代，提供了反应性的硫醇基团并且不破坏免疫球蛋白折叠和组装或改变抗原结合(参见，例如，Junutula et al.，J.Immunol.Meth.332：41-52(2008)；Junutula et al.，Nat.Biotechnol.26：925-932，2008)。在其他方法中，通过重新编码终止密码子UGA从终止到硒代半胱氨酸插入物，硒代半胱氨酸在翻译同时被插入抗体序列中，容许在存在其他天然氨基酸的情况下在硒代半胱氨酸的亲核硒醇基团处位点特异性共价结合，(参见，例如，Hofer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：12451-12456(2008)；Hofer et al.，Biochemistry 48(50)：12047-12057，2009)。
药物制剂
本公开内容的抗-GFRAL抗体可以通过适合于要治疗的疾病、失调或状况的任何途径施用。所述抗体一般胃肠外地施用，例如，输注、皮下、肌肉内、静脉内、真皮内、鞘内和硬膜外。抗体剂量可变，包括取决于对象的疾病或失调以及状况的性质和/或严重度，可以包括1mg到100mg之间的剂量。剂量还可以包括1mg/kg到15mg/kg之间的那些。在某些实施方式中，所述剂量在约5mg/kg到约7.5mg/kg之间。在某些实施方式中，所述剂量是约5mg/kg。在某些实施方式中，所述剂量是约7.5mg/kg。平剂量选自以下构成的组：(va)375-400mg每两周，和(b)550-600mg每三周。在某些实施方式中，平剂量是375-400mg每两周。在某些实施方式中，平剂量是550-600mg每三周。在某些实施方式中，平剂量是400mg每两周。在某些实施方式中，平剂量是600mg每三周。在连续给药的某些实施方式中，第一剂量和第二剂量各自在1mg/kg到15mg/kg之间，所述第二剂量在所述第一剂量之后1到4周之间。在某些实施方式中，所述第一剂量和所述第二剂量各自在5mg/kg到7.5mg/kg之间，所述第二剂量在所述第一剂量之后2到3周之间。在某些实施方式中，所述第一剂量和所述第二剂量各自是5mg/kg，所述第二剂量在所述第一剂量之后2周。在某些实施方式中，所述第一剂量和所述第二剂量各自是7.5mg/kg，所述第二剂量在所述第一剂量之后3周。
为治疗疾病、失调或状况，在某些实施方式中，所述抗体通过静脉内的输注来施用。通过输注施用的剂量在约1μg/m2到约10,000μg/m2每剂量的范围内，一般地每周一剂持续总共一、二、三或四剂。作为选择，剂量范围是约1μg/m2到约1000μg/m2，约1μg/m2到约800μg/m2，约1μg/m2到约600μg/m2，约1μg/m2到约400μg/m2；作为选择，约10μg/m2到约500μg/m2，约10μg/m2到约300μg/m2，约10μg/m2到约200μg/m2和约1μg/m2到约200μg/m2。所述剂量可以每天一次、每周一次、每周多次施用，但是小于每天一次，每月多次但是小于每天一次，每月多次但是小于每周一次，每月一次，或间歇地，以减缓或减轻所述疾病、失调或状况的症状。施用可以以所公开的间隔时间的任一种持续，直到改善疾病、失调或状况，或改善被治疗的疾病、失调或状况的症状。施用可以继续到症状缓解之后或实现症状的减轻，此时这样的症状缓解或减轻通过这样的持续施用而延长。
在一个方面，本公开内容进一步提供了包含本公开内容的至少一种抗-GFRAL抗体的药物制剂。在某些实施方式中，药物制剂包含1)抗-GFRAL抗体，和2)药学上可接受的载体。在某些实施方式中，药物制剂包含1)抗-GFRAL抗体和/或其免疫结合物，以及任选的，2)至少一种其他的治疗药剂。
通过以水溶液的形式或冻干的或其他干燥的制剂的形式，将具有期望的纯度的所述抗体与任选的生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(参见，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980))混合，包含抗体的药物制剂被准备用于储存。本文的制剂还可以含有对于要治疗的特定疾病、失调或状况(例如，特定的指征)所必需的超过一种活性化合物，优选的具有不会不利地相互影响的互补活性的那些。例如，除了抗-GFRAL抗体之外，可能希望的是在所述一种制剂中包括其他的抗体，例如，结合GFRAL多肽上的不同表位的第二抗-GFRAL抗体，或针对其他靶点的抗体。作为选择，或另外地，所述组合物可以进一步包含其他药剂，包括，例如，化学治疗剂、细胞毒性药剂、细胞因子、生长抑制药剂、抗激素药剂和/或心脏保护剂。在某些实施方式中，所述制剂包括烷化剂(例如，苯丁酸氮芥、苯达莫司汀盐酸或环磷酰胺)，核苷模拟物(例如，氟达拉滨、喷司他丁、克拉屈滨或阿糖胞苷)，皮质类固醇(例如，泼尼松、泼尼松龙或甲泼尼龙)，免疫调节药剂(例如，来那度胺)，抗生素(例如，多柔比星、道诺霉素、伊达比星或mitoxentrone)，合成的黄酮(例如，夫拉平度)，Bc12拮抗剂(例如，奥利默森或ABT-263)，低甲基化药剂(例如，氮胞苷或地西他滨)，FLT3抑制物(例如，米哚妥林、索拉非尼和AC220)。这样的分子以对预定目标有效的数量适当地存在于组合物中。
本公开内容的抗体可以配制为任何适合的形式用于递送到靶细胞/组织，例如，作为微囊或宏乳剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Osol，A.Ed.(1980)；Park et al.，Molecules 10：146-161(2005)；Malik eta/.，Curr.Drug.Deliv.4：141-151(2007))；作为持续释放制剂(Putney and Burke，Nature Biotechnol.16：153-157，(1998))或在脂质体中(Maclean et al.，Int.J.Oncol.11：235-332(1997)；Kontermann，Curr.Opin.Mol.Ther 8：39-45(2006))。
本文提供的抗体还可以捕集在处于胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳粒子和毫微囊剂)或大乳剂中的微囊中，所述微囊通过例如凝聚技术或界面聚合作用制备，例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微囊，和聚-(异丁烯酸甲脂)微囊。例如，在Remington′s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.，Easton，PA中公开了这样的技术。
各种递送系统是已知的，可以用于施用预防性或治疗性药剂(例如，本文描述的结合GFRAL的抗体)，包括但不限于，在脂质体中封装，微粒，微囊，能够表达所述抗体的重组细胞，受体介导的内吞作用(参见，例如，Wu and Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))，构建核酸作为逆转录病毒或其他载体的部分，等。在另一个实施方式中，本文提供的预防性或治疗性药剂或组合物可以在控制释放或持续释放系统中递送。在一个实施方式中，可以使用泵来实现控制释放或持续释放(参见，例如，Langer，supra；Sefton，1987，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14：20；Buchwald et al.，1980，Surgery 88：507；Saudek et al.，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一个实施方式中，聚合材料可以用于实现本发明的预防性或治疗性药剂(例如，本文描述的结合GFRAL的抗体)或组合物的控制释放或持续释放(参见，例如，Medical Applications of Controlled Release，Langer and Wise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，DrugProduct Design and Perfbrmance，Smolen and Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger and Peppas，1983，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；还参见Levy etal.，1985，Science 228：190；During et al.，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard et al.，1989，J.Neurosurg.71：105)；美国专利No.5,679,377；美国专利No.5,916,597；美国专利No.5,912,015；美国专利No.5,989,463；美国专利No.5,128,326；PCT公开No.WO 99/15154；和PCT公开No.WO 99/20253)。可以用于持续释放制剂的聚合物的实例包括但不限于，聚(2-羟基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙烯基醋酸酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、聚(交酯-共-乙交酯)(PLGA)，和聚正酯。在一个实施方式中，持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的，没有可浸出的混杂物，储存时稳定，无菌并且生物可降解。
在又一个实施方式中，控制或持续释放系统可以放置于接近治疗目标，例如，鼻部通道或肺部，因而仅需要全身剂量的一部分(参见，例如，Goodson，in MedicalApplications of Controlled Release，supra，vol.2，pp.115-138(1984))。例如，Langer(1990，Science 249：1527-1533)讨论了其他控释系统。本领域技术人员已知的任何技术可以用于产生包含本文描述的结合GFRAL的一种或更多种抗体的持续释放制剂。(参见，例如，美国专利No.4,526,938，PCT公开WO 91/05548，PCT公开WO 96/20698，Ning et al.，1996，″Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenogran Using aSustained-Release Gel，″Radiotherapy&OncolOgy 39：179-189，SOng et al.，1995，″Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions，″PDA Journalof Pharmaceutical Science&Technology 50：372-397，Cleek et al.，1997，″Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for CardiovascularApplication，″Pro.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854，以及Lam etal.，1997，″Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody forLocal Delivery，″Proc.Int′l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760)。
可以用于施用预防性或治疗性药剂(例如，本文描述的结合GFRAL的抗体)的其他递送系统包括但不限于可注射的药物递送设备。用于抗-GFRAL抗体的可注射的药物递送设备包括，例如，手持设备或可穿戴设备。用于抗-GFRAL抗体的手持设备包括自动注射器，例如，FLEXIQ-DV(Elcam Medical)或PRO-JECT(Aptar Pharma)自动注射器。对抗-GFRAL抗体有用的可穿戴设备包括，例如，身上药物递送系统，例如，NEULASTA药物递送套件(Amgen)。用于抗-GFRAL抗体的可注射药物递送设备可以含有所述抗体作为预防或治疗药剂，例如，在预装填的注射器、药筒或小瓶中。用于抗-GFRAL抗体的可注射药物递送装设备(例如，自动注射器)和/或它们的容器(例如，注射器、药筒或小瓶)可以是一次性的。对于抗-GFRAL抗体有用的示范性的可注射设备在WO2014/081780中描述。
在某些实施方式中，其他药物递送系统可以用于施用预防性或治疗性药剂(例如，本文描述的结合GFRAL的抗体)，包括但不限于，渗透泵。用于抗-GFRAL抗体的不同类型的渗透泵系统可以使用，包括例如，单室系统、双室系统和多室系统。对于抗-GFRAL抗体有用的示范性的渗透泵系统在例如Herrlich et al.(2012)Advanced Drug Delivery Reviews64，1617-1627中描述。在某些实施方式中，用于抗-GFRAL抗体的渗透泵可以包括可植入的药物分配渗透泵，例如，DUROS泵。
治疗方法
本公开内容的抗-GFRAL抗体可以用于例如治疗方法中。
在某些实施方式中，本公开内容提供了治疗或预防GDF15-介导的疾病、失调或状况的方法，其中所述方法包括向患有GDF15-介导的疾病、失调或状况的对象施用本文描述的抗-GFRAL抗体或其片段。另外，所述对象可以被施用包含本文描述的抗-GFRAL抗体或其片段的药物组合物。
在某些实施方式中，当前的公开提供了治疗患有不自主体重损失的对象。适合的对象的实例可以是被诊断患有消耗性疾病或恶病质的对象。适合的患者包括患有肝硬化、甲状腺机能亢进、慢性肾病、帕金森氏病、癌症、进食障碍(例如，神经性厌食)、慢性炎症性疾病(例如，类风湿性关节炎)、脓毒症或其他形式的全身性炎症、慢性阻塞性肺病、AIDS、肺结核和肌肉消耗，例如，肌营养不良或多发性硬化)或肌肉减少症。
在某些实施方式中，本公开内容还提供了预防对象中的不自主体重损失的方法，所述对象可能由于慢性疾病存在不自主体重损失的风险，所述慢性疾病例如肝硬化、甲状腺机能亢进、慢性肾病、帕金森氏病、癌症、进食障碍(例如，神经性厌食)、慢性炎症性疾病(例如，类风湿性关节炎)、脓毒症或其他形式的全身性炎症、慢性阻塞性肺病、AIDS、肺结核和肌肉消耗，例如，肌营养不良或多发性硬化)，或肌肉减少症。这样的对象可以包括具有升高的GDF15水平、经历癌症治疗等的对象。
在某些实施方式中，本公开内容提供了治疗患有恶病质的对象的方法。适合的对象的实例是被诊断患有恶病质的对象。本公开内容还提供了预防对象的不自主体重损失的方法，所述对象可能由于恶病质的发作存在不自主体重损失的风险。这样的对象可以包括具有升高的GDF15水平、患有癌症、经历癌症治疗、患有进食障碍等的对象。
还公开的是在具有升高的GDF15活性的患者中调节GDF15活性的方法。如本文使用的，“升高的GDF15活性”是指与正常的对象相比在对象的生物液体中GDF15的提高的活性或数量。许多状况与提高的GDF15血清水平相关，其中提高的GDF15引起许多症状，例如，食欲损失、体重损失，等。与提高的GDF15血清水平相关的状况的实例包括癌症，例如，黑素瘤、胃癌、胰腺癌、前列腺癌；自体免疫疾病，例如，关节炎和炎症；心血管疾病，如动脉粥样硬化、心力衰竭、高血压、心肌梗塞、胸痛和心血管事件；代谢疾病，如贫血、恶病质、厌食、肾脏疾病和地中海贫血，等。
患有任一上述疾病、失调或状况的对象是接受本文描述的抗-GFRAL抗体或其片段、或治疗药剂与所述抗-GFRAL抗体或其片段的组合的适合的候选者。
向这样的对象施用抗-GFRAL抗体或其片段可以降低或预防与GDF15-介导的疾病、失调或状况相关的一种或更多种症状。例如，施用本公开内容的抗-GFRAL抗体或其片段可以提高对象的体重和/或食欲。作为另一个实例，施用本公开内容的抗-GFRAL抗体或其片段可以维持对象的体重或降低对象的体重损失。
在一个方面，提供了治疗疾病、失调或状况的方法，包括向个体施用有效量的抗-GFRAL抗体或其片段。在某些实施方式中，治疗疾病、失调或状况的方法包括向个体施用有效量的药物制剂，所述药物制剂包含抗-GFRAL抗体以及任选的至少一种其他治疗药剂，例如，本文描述的那些。
抗-GFRAL抗体或其片段可以用于治疗目的施用给人类。此外，抗-GFRAL抗体或其片段可以为了兽医学目的或作为人类疾病的动物模型，施用给表达可与所述抗体交叉反应的GFRAL的非人类哺乳动物(例如，灵长类、猪、大鼠或小鼠)。关于后者，这样的动物模型可以用于评估本公开内容的抗体的治疗效力(例如，测试施用的剂量和时程)。
本公开内容的抗体可以在治疗中单独使用或与其他组合物组合使用。例如，本公开内容的抗-GFRAL抗体可以与至少一种其他治疗药剂和/或佐剂共同施用。在某些实施方式中，所述其他化合物是抗-GFRAL抗体之外的治疗性抗体。
上文指出的这种组合治疗涵盖组合的施用(其中两种或更多种治疗药剂被包括在同一或独立的制剂中)，以及独立施用，在这种情况下，本公开内容的抗-GFRAL抗体或其片段的施用可以在施用其他治疗药剂和/或佐剂之前、同时和/或之后进行。本公开内容的抗体还可以与其他治疗方案组合使用，无限制地包括本文描述的那些。
本公开内容的抗-GFRAL抗体(以及任何其他治疗药剂或佐剂)可以通过任何合适的方法施用，包括胃肠外的、皮下的、腹膜内的、肺内的和鼻内的施用，如果希望局部治疗，病灶内的施用。胃肠外输注包括肌肉内的、静脉内的、动脉内的、腹膜内的或皮下的施用。另外，所述抗体或结合物通过脉冲输注适当地施用，特别是剂量渐低的所述抗体或其片段。给药可以通过任何适合的途径，例如，通过注射液，如静脉内的或皮下的注射，部分取决于所述施用是短时的还是长期的。
本公开内容的抗体将按照与良好的医疗实践一致的方式配制、给药和施用。就此而言考虑的因素包括要治疗的具体失调、治疗的具体哺乳动物、个体对象的临床状况、失调的原因、药剂的递送位点、施用方法、施用日程、以及执业医生已知的其他因素。所述抗-GFRAL抗体不必须地、但是任选地与当前用于预防或治疗所讨论的失调的一种或更多种药剂一起配制。这种其他药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体或免疫结合物的数量，失调或治疗的类型，以及上文讨论的其他因素。这些一般按本文描述的相同剂量或施用途径使用，或本文描述的剂量的约1％到99％，或经验上/临床上确定适当的任何剂量以及任何途径。
为了预防或治疗疾病、失调或状况，本公开内容的抗-GFRAL抗体或其片段(当单独使用或与一种或更多种其他治疗药剂例如本文描述的药剂组合使用时)的适当剂量将取决于要治疗的疾病、失调或状况的类型，抗体的类型，所述疾病、失调或状况的严重度和过程，抗体是为预防目的还是治疗目的施用，先前的治疗，对象的临床历史和对抗体的响应，以及主治医师的判断。一次性或在治疗的系列过程中将抗-GFRAL抗体或其片段适当地施用给所述对象。取决于疾病的类型和严重度，约1μg/kg到100mg/kg(例如，0.1mg/kg-20mg/kg，1mg/kg-15mg/kg等)的抗体或其片段可以是向对象施用的起始候选剂量，无论是例如通过一次或更多次单独的使用还是通过连续的输注。一个典型的每日剂量可以从约1μg/kg到100mg/kg或更多，取决于上述因素。对于持续几天或更长时间的重复施用，取决于所述状况，一般将持续进行治疗直到产生期望的对疾病症状的抑制。所述抗体或其片段的示范性的剂量可以是约0.05mg/kg到约10.0mg/kg的范围内。因而，约0.5mg/kg 1.0mg/kg、2.0mg/kg、3.0mg/kg、4.0mg/kg、5.0mg/kg、6.0mg/kg、7.0mg/kg、8.0mg/kg、9.0mg/kg、或10.0mg/kg的一种或更多种剂量(或其任何组合)的抗体可以施用给对象。这样的剂量可以间歇地施用，例如，每周或每三周(例如，使得所述对象接受约二到约二十剂，例如，约六剂的所述抗体)。可以施用初始的更高的加载剂量，随后一个或更多个更低的剂量。示范性的给药方案包括施用初始加载剂量，随后是维持剂量(例如，每周)的所述抗体或其片段。初始加载剂量可以大于维持剂量。然而，其他给药方案也是有用的。可以通过常规技术和分析来容易地监视这种治疗的进展。
在某些实施方式中，本文描述的方法涉及向患者施用抗-GFRAL抗体或其片段，所述患者患有不自主体重损失，或有发生不自主体重损失的风险。所述方法包括向具有升高的GDF15血清水平的对象施用本文公开的抗-GFRAL抗体或其片段。在某些实施方式中，所述抗体或其片段是与GDF15竞争结合GFRAL的细胞外结构域的抗-GFRAL抗体。在某些实施方式中，所述抗体或其片段结合GFRAL的细胞外结构域但是不活化RET。例如，所述抗体或其片段是与GDF15竞争结合GFRAL的细胞外结构域但是在与GFRAL结合时不活化RET的抗-GFRAL抗体。本文描述了这样的抗体。
在本公开内容的方法中，本文描述的抗-GFRAL抗体或其片段或包含所述抗体或其片段的药物组合物可以施用给对象(例如，人类患者)以，例如，达到目标体重和/或维持体重；达到目标体质量指数(BMI)和/或维持BMI；提高食欲；等。正常成年人具有18.5-24.9kg/m2的范围内的BMI。所述治疗方法可以提高对象的体重、BMI、肌肉重量和/或食物摄取至少约5％，例如，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。
本文描述的关于治疗或预防GDF15-介导的疾病、失调或状况(例如，不自主体重损失)的方法包括，例如，使用本文描述的抗-GFRAL抗体或其片段用于单独的治疗/预防，或与其他类型的治疗组合。所述方法涉及向对象施用所述抗-GFRAL抗体或其片段和其他药剂。
在某些实施方式中，所述药剂被施用给经历肌肉质量损失，例如与原发疾病相关的肌肉质量损失的患者。与恶病质相关的基础疾病包括但不限于癌症、慢性肾脏疾患、慢性阻塞性肺病、AIDS、肺结核、慢性炎症性疾病、脓毒症和其他形式的全身性炎症、肌肉消耗，例如肌营养不良，以及称为神经性厌食的进食障碍。在某些实施方式中，所述药剂抑制瘦质量(例如，肌肉质量)和/或脂肪质量的损失至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％。
在某些实施方式中，瘦质量(例如，肌肉质量)的损失伴随着脂肪质量的损失。在某些实施方式中，所述药剂可以抑制脂肪质量的损失至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％。
在某些实施方式中，所述药剂被施用给被诊断患有体重损失(例如，不自主体重损失)的患者。在某些实施方式中，所述药剂可以回复体重损失(例如，不自主体重损失)至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％。
在某些实施方式中，所述药剂被施用给被诊断患有器官质量损失，例如与原发疾病相关的器官质量损失的患者。与恶病质相关的基础疾病包括但不限于癌症、慢性肾脏疾患、慢性阻塞性肺病、AIDS、肺结核、慢性炎症性疾病、脓毒症和其他形式的全身性炎症、肌肉消耗，例如肌营养不良，以及称为神经性厌食的进食障碍。在某些实施方式中，所述药剂可以抑制器官质量的损失至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％。在某些实施方式中，器官质量损失在心脏、肝脏、肾脏和/或脾脏中观察到。在某些实施方式中，器官质量损失伴随着肌肉质量损失、脂肪质量损失和/或不自主体重损失。
肌肉减少症、肌肉消耗失调和显著的肌肉重量损失可能在没有恶病质、食欲降低或体重损失的情况下发生。在某些实施方式中，所述药剂被用于治疗被诊断患有肌肉减少症、肌肉消耗失调和/或显著的肌肉重量损失的对象，无论所述对象是否患有或已被诊断患有恶病质或食欲降低。这样的方法包括向有需要的对象施用治疗有效量一种或更多种药剂。
针对治疗或预防恶病质的各种治疗的任一种可以与使用目标蛋白质的组合物或治疗方法进行组合。
当GFRAL-ECD蛋白与一种或更多种其他治疗组合施用时，所述组合可以同时地，或在施用目标蛋白质之前或之后达到5小时或更久，例如，10小时、15小时、20小时或更久之间任何时候施用。在某些实施方式中，目标蛋白质和其他治疗介入可以顺序地施用或应用，例如，目标蛋白质在另一种治疗处置之前或之后施用。在又其他的实施方式中，目标蛋白质和其他治疗同时地施用，例如，目标蛋白质和第二治疗同时施用，例如，当所述第二治疗是药物时，它可以与目标蛋白质一起作为两个独立的制剂施用，或组合到施用给所述对象的单一组合物中。无论是顺序地还是同时地施用，如上文说明的，对于本公开内容来说，所述治疗被认为是一起或组合地施用。
与恶病质有关的细胞因子包括活化素A(activin A)和IL-6。活化素水平提高已经与癌症相关的恶病质和生殖腺肿瘤相关联。参见，例如，Marino et al.(2013)CYTOKINE&GROWTH FACTOR REV.24：477-484。活化素A是TGF-beta家族的成员，是活化素2型受体ActRIIB的配体。参见，例如，Zhou et al.(2010)CELL 142：531-543。已经显示IL-6的循环水平与癌症患者中的体重损失以及降低的存活相关。参见，例如，Fearon et al.(2012)CELL METABOLISM 16：153-166。
因而，在某些实施方式中，激活素-A或激活素-A受体ActRIIB、IL-6或IL-6受体(IL-6R)的一种或更多种抑制物可以与本文描述的抗-GFRAL抗体或其片段组合(例如，同时施用，在之前施用，或在之后施用)施用。活化素A或ActRIIB的示范性的抑制物包括，例如，抗-活化素-A抗体或其抗原结合片段，抗ActRIIB抗体或其抗原结合片段，活化素-A的小分子抑制物，ActRIIB的小分子抑制物，ActRIIB的受体的“引诱物”，例如，可溶ActRIIB受体以及可溶ActRIIB受体与Fc分子的融合物(ActRIIB-Fc)。参见，例如，Zhou et al.(2010)，同上。IL-6或IL-6R的适合的抑制物包括，抗-IL-6抗体或其抗原结合片段，抗IL-6R抗体或其抗原结合片段，IL-6的小分子抑制物，IL-6R的小分子抑制物，IL-6R的受体的“引诱物”，例如，可溶IL-6R受体以及可溶IL-6R受体与Fc分子的融合物(IL-6R-Fc)。参见，例如，Enomotoet al.(2004)BIOCHEM.AND BIOPHYS.RES.COMM.323：1096-1102；Argiles et al.(2011)EUR.J.PHARMACOL.668：S81-S86；Tuca et al.(2013)ONCOLOGY/HEMATOLOGY 88：625-636。IL-6或IL-6R的适合的抑制物包括，例如，Tocilizumab(Hoffmann-LaRoche)，一种为治疗类风湿性关节炎而批准的人源化抗IL-6R单克隆抗体，以及Sarilumab/REGN88(Regeneron)，一种用于治疗类风湿性关节炎的临床开发中的人源化抗IL-6R抗体；以及Selumetinib/AZD6244(AstraZeneca)，一种MEK的变构抑制剂，已经显示了抑制IL-6产生。Prado et al.(2012)BRITISH J.CANCER 106：1583-1586。
TNFα和IL-1是已知涉及前炎症性反应介导的细胞因子，它们还与肌肉减少、厌食和恶病质相关。TNFα的循环水平提高似乎抑制肌形成。TNFα也称为“cachectin”，刺激白细胞介素-1分泌并且与恶病质的诱导相关。IL-1是急性期炎性反应的强力触发物，已经显示输注IL-1可以引起显著的体重损失和食欲损失。已经显示IL-1在带有鼠结肠-26腺癌的小鼠中促进癌症恶病质的起始(Strassmann et al.(1993)J.IMMUNOL.150：2341)。还参见Mathys and Billiau(1997)NUTRITION 13：763-770；Fong et al.(1989)AM.J.PHYSIOL.-REGULATORY，INTEGRATIVE AND COMPARATIVE PHYSIOL.，256：R659-R665。因而，用于治疗类风湿性关节炎的TNFα抑制物和IL-1抑制物在恶病质的治疗中也是有用的。
因而，在某些实施方式中，TNFα或IL-1的一种或更多种抑制物可以与本文描述的抗-GFRAL抗体或其片段组合(例如，同时施用，在之前施用，或在之后施用)施用。TNFα或IL-1的适合的抑制物包括TNFα抗体或其抗原结合片段，抗IL-1抗体或其抗原结合片段，TNFα或IL-1的小分子抑制物，TNFα或IL-1的受体的“引诱物”，例如，可溶TNFα或IL-1受体，以及TNFα或IL-1的可溶形式与Fc分子的融合物。TNFα的适合的抑制物包括，例如，依那西普(Pfizer/Amgen)、英夫利昔单抗(Janssen Biotech)、阿达木单抗(Abbvie)、戈利木单抗(Johnson and Johnson/Merck)和赛妥珠单抗(UCB)。适合的IL-1抑制物包括，例如，靶向IL-1α的抗体(XBiotech)、anikinra(Amgen)、卡纳单抗(Novartis)和利纳西普(Regeneron)。在某些实施方式中，一般全身施用用于治疗类风湿性关节炎的TNFα抑制物或IL-1抑制物以局部施用或施用到肿瘤位点。
肌肉生长抑制素(myostatin)也称为GDF-8，是TNF-β家族肽的成员，根据肌肉生长抑制素缺陷的哺乳动物中提高的肌肉质量所显示的，其是肌肉质量的负调节物。肌肉生长抑制素是活化素2型受体ActRIIB的配体。
因而，在某些实施方式中，肌肉生长抑制素或它的受体的一种或更多种抑制物可以与本文描述的抗-GFRAL抗体或其片段组合(例如，同时施用，在之前施用，在之后施用)施用。肌肉生长抑制素或ActRIIB的适合的抑制物包括，抗肌肉生长抑制素抗体或其抗原结合片段，抗ActRIIB抗体或其抗原结合片段，肌肉生长抑制素的小分子抑制物，ActRIIB的小分子抑制物，GDF-8的受体的“引诱物”，例如，可溶ActRIIB以及ActRTIB的可溶形式与Fc分子的融合物。参见，例如，Lokireddy et al.(2012)BIOCHEM.J.446(1)：23-26。可能适合于当前方法的肌肉生长抑制素抑制物包括REGN1033(Regeneron)；参见Bauerlein et al.(2013)J.CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE：Abstracts of the 7th Cachexia Conference，Kobe/Osaka，Japan，December 9-11，2013，Abstract 4-06；LY2495655(Lilly)，一种EliLilly的处于临床开发中的人源化抗肌肉生长抑制素抗体；还参见“A PHASE 2 STUDY OFLY2495655IN PARTICIPANTS WITH PANCREATIC CANCER，″可在互联网clinicaltrials.gov/ct2/NCT01505530获得；NML标识号：NCT01505530；ACE-031(Acceleron Pharma)；以及司他芦单抗(stamulumab，Pfizer)。
能够活化GHS受体(GHS-RIa)、也称为胃饥饿素受体的药剂例如胃饥饿素(Ghrelin)或胃饥饿素模拟物，或其他生长激素促分泌素(GHS)，对于提高人的食物摄取和体重可能是有用的。参见Guillory e tal.(2013)in VITAMINS AND HORMONES vol.92，chap.3；and Steinman and DeBoer(2013)VITAMINS AND HORMONES vol.92，chap.8。因而，在某些实施方式中，胃饥饿素或胃饥饿素模拟物、或其他生长激素促分泌素(GHS)可以与本文描述的抗-GFRAL抗体或其片段组合(例如，同时施用，在之前施用，或在之后施用)施用。适合的胃饥饿素模拟物包括阿拉莫林(Helsinn，Lugano，CH)；参见Temel et al.(2013)J.CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE：Abstracts of the 7th Cachexia Conference，Kobe/Osaka，Japan，December 9-11，2013，Abstract5-01。可以鉴定其他适合的GHS分子，例如，利用PCT公开Nos.WO2011/117254和WO2012/113103中描述的生长激素促分泌素受体胃饥饿素竞争分析。
雄激素受体的激动剂，包括小分子和其他选择性雄激素受体调节物(SARM)在治疗恶病质和/或肌肉减少症中可能是有用的。参见，例如，Mohler et al.(2009)J.MED.CHEM.52：3597-3617；Nagataet al.(2011)BIOORGANIC AND MED.CHEM.LETTERS 21：1744-1747；和Chen et al.(2005)MOL.INTERV.5：173-188。理想地，SARM应当在合成代谢目标组织如肌肉和骨骼中作为完全激动剂如睾酮起作用，但是对于前列腺组织应当仅展现部分或单纯的雄激素受体拮抗活性。参见，例如，Bovee et al.(2010)J.STEROID BIOCHEM.&MOL.BIOL.118：85-92。例如，适合的SARM可以通过使用Zhang et al.(2006)BIOORG.MED.CHEM.LETT.16：5763-5766；和Zhang et al.(2007)BIOORG.MED.CHEM.LETT.17：439-443中描述的方法和分析来鉴定。
因而，在某些实施方式中，一种或更多种雄激素受体激动剂可以与本文描述的抗-GFRAL抗体或其片段组合(例如，同时施用，在之前施用，在之后施用)施用。适合的SARM包括，例如，GTx-024(enobosarm，GTx，Inc.)，一种GTx，Inc的处于II期临床开发中的SARM。还参见，Dalton et al.(2011)J.CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE 2：153-161。其他适合的SARM包括2-(2，2，2)-三氟乙基-苯并咪唑(Ng et al.(2007)BIOORG.MED.CHEM.LETT.17：1784-1787)和JNJ-26146900(Allan et al.(2007)J.STEROIDBIOCHEM.&MOL.BIOL.103：76-83)。
已经研究了β-肾上腺素能受体阻断剂，或beta-阻断剂在恶病质对象中对体重的影响，已经与充血性心力衰竭患者中恶病质的部分逆转相关联。参见，例如Hryniewicz etal.(2003)J.CARDIAC FAILURE 9：464-468。Beta-阻断剂MT-102(PsiOxus Therapeutics，Ltd.)已经在癌症恶病质对象的2期临床试验中进行评估。参见，Coats et al.(2011)J.CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE 2：201-207。因而，在某些实施方式中，一种或更多种β-肾上腺素能受体阻断剂或beta-阻断剂可以与本文描述的抗-GFRAL抗体或其片段组合(例如，同时施用，在之前施用，或在之后施用)施用。
黑皮质素信号转导有遗传缺陷的黑皮质素受体-敲除小鼠展现了与恶病质相反的表型：食欲提高、瘦质量提高以及新陈代谢降低。因而，黑皮质素拮抗已经作为与慢性疾病相关的恶病质的潜在治疗出现(DeBoer and Marks(2006)TRENDS IN ENDOCRINOLOGY ANDMETABOLISM 17：199-204)。
因而，在某些实施方式中，黑皮质素肽或黑皮质素受体的一种或更多种抑制物可以与本文描述的抗-GFRAL抗体或其片段组合(例如，同时施用，在之前施用，或在之后施用)施用。黑皮质素或黑皮质素受体的适合的抑制物包括抗黑皮质素肽抗体或其抗原结合片段，抗黑皮质素受体抗体或其抗原结合片段，黑皮质素肽的小分子抑制物，黑皮质素受体的小分子抑制物，黑皮质素受体的“引诱物”受体，例如，可溶黑皮质素受体以及可溶黑皮质素受体与Fc分子的融合物。适合的黑皮质素受体抑制物包括，例如，黑皮质素受体拮抗剂agouri相关肽(AgRP(83-132))，其已经在癌症相关恶病质的小鼠模型中展现了预防恶病质相关的症状(Joppa et al.(2007)PEPTIDES 28：636-642)。
抗癌药剂，特别是可能导致恶病质和GDF15水平升高的那些，例如，顺铂，可以用于本公开内容的方法中与本文描述的抗-GFRAL抗体或其片段组合(例如，同时施用，在之前施用，或在之后施用)。许多癌症患者被放疗和/或化疗的严酷过程削弱，这可能限制了患者耐受这类治疗的能力，因此限制了给药方案。某些癌症药剂本身，六，氟尿嘧啶、亚德里亚霉素、甲氨蝶呤和顺铂可能促进恶病质，例如，通过诱导严重的胃肠并发症。参见，例如，Inui(2002)CANCER J.FOR CLINICIANS 52：72-91。通过本公开内容的方法，当抗癌药剂与本公开内容的抗-GFRAL抗体组合施用时，有可能降低恶病质的发生率和/或严重度，最终提高这类抗癌药剂的最大耐受剂量。因而，通过降低作为剂量限制性副作用的恶病质的发生率，以及通过容许施用更高剂量的给定抗癌药剂，可以改善可能导致恶病质的抗癌药剂的治疗效力。
因而，本文提供的是药物组合物，其包含与选自以下构成的组的药剂组合的本文描述的抗-GFRAL抗体或其片段：活化素-A的抑制物、ActRIIB的抑制物、IL-6的抑制物或IL-6R的抑制物、胃饥饿素、胃饥饿素模拟物或GHS-RIa激动剂、SARM、TNFα抑制物、IL-1α抑制物、肌肉生长抑制素抑制物、beta-阻断剂、黑皮质素肽抑制物、黑皮质素受体抑制物和抗癌药剂。本公开内容还包括在哺乳动物中治疗、预防或最小化恶病质和/或肌肉减少症的方法，包括向有需要的哺乳动物施用药物组合物，所述药物组合物包含与有效量的活化素-A的抑制物、ActRIIB的抑制物、IL-6的抑制物或IL-6R的抑制物、胃饥饿素、胃饥饿素模拟物或GHS-RIa激动剂、SARM、TNFα抑制物、IL-1a抑制物、肌肉生长抑制素抑制物、beta-阻断剂、黑皮质素肽抑制物或黑皮质素受体抑制物组合的，有效量的本公开内容的抗-GFRAL抗体。
在另一个方面，本文提供的是抑制与原发疾病相关的肌肉质量损失的方法，包括向有需要的哺乳动物施用药物组合物，所述药物组合物包含与有效量的活化素-A的抑制物、ActRIIB的抑制物、IL-6的抑制物或IL-6R的抑制物、胃饥饿素、胃饥饿素模拟物或GHS-RIa激动剂、SARM、TNFα抑制物、IL-1a抑制物、肌肉生长抑制素抑制物、beta-阻断剂、黑皮质素肽抑制物或黑皮质素受体抑制物组合的，有效量的本文描述的抗-GFRAL抗体或其片段，以预防或降低肌肉质量损失。所述原发疾病可以选自由癌症、慢性心力衰竭、慢性肾病、慢性阻塞性肺病、AIDS、多发性硬化、类风湿性关节炎、脓毒症和肺结核构成的组。另外，在某些实施方式中，肌肉质量损失伴随着脂肪质量的损失。
在另一个方面，本文提供的是在哺乳动物中抑制或降低不自主体重损失的方法，包括向有需要的哺乳动物施用药物组合物，所述药物组合物包含与有效量的活化素-A的抑制物、ActRIIB的抑制物、IL-6的抑制物或IL-6R的抑制物、胃饥饿素、胃饥饿素模拟物或GHS-RIa激动剂、SARM、TNFα抑制物、IL-la抑制物、肌肉生长抑制素抑制物、beta-阻断剂、黑皮质素肽抑制物或黑皮质素受体抑制物组合的，有效量的本公开内容的抗-GFRAL抗体。
某些抗癌药剂，例如顺铂，具有一种或更多种不希望的副作用，其涉及导致或提高一种或更多种综合征，例如恶病质、肌肉减少症、肌肉消耗、骨骼消耗或不自主体重损失。因而，在另一个方面，本文提供的是在哺乳动物中治疗癌症，同时防止、最小化或降低恶病质、肌肉减少症或肌肉消耗、骨骼消耗或不自主体重损失的发生、频率或严重度的方法，包括向有需要的哺乳动物施用药物组合物，所述药物组合物包含与一种或更多种抗癌药剂组合的、有效量的本文描述的抗-GFRAL抗体或其片段。在某些实施方式中，所述在哺乳动物中治疗癌症，同时防止、最小化或降低恶病质、肌肉减少症或肌肉消耗、骨骼消耗或不自主体重损失的发生、频率或严重度的方法，包括向有需要的哺乳动物施用药物组合物，所述药物组合物包含与已知导致或提高哺乳动物中恶病质、肌肉减少症或肌肉消耗、骨骼消耗或不自主体重损失的发生、频率或严重度的一种或更多种抗癌药剂组合的，有效量的本文描述的抗-GFRAL抗体或其片段。
诊断方法和检测方法
在一个方面，本公开内容的抗-GFRAL抗体和其片段对于检测生物样品中GFRAL的存在是有用的。这样的抗-GFRAL抗体可以包括结合人GFRAL的那些。本文使用的术语“检测”涵盖定量的或定性的检测。在某些实施方式中，生物样品包含细胞或组织。
在一个方面，本公开内容提供了检测生物样品中GFRAL的存在的方法。在某些实施方式中，所述方法包括在允许抗-GFRAL抗体与GFRAL结合的条件下使所述生物样品与抗-GFRAL抗体接触，并检测在所述抗-GFRAL抗体与GFRAL之间是否形成复合物。
在一个方面，本公开内容提供了诊断与GFRAL表达相关的失调的方法。在某些实施方式中，所述方法包括使测试细胞与抗-GFRAL抗体接触；通过检测所述抗-GFRAL抗体与GFRAL的结合来测定所述测试细胞的GFRAL表达水平(定量地或定性地)；以及比较所述测试细胞的GFRAL表达水平与对照细胞(例如，与所述测试细胞相同组织来源的正常细胞，或在水平上与这样的正常细胞可比较的表达GFRAL的细胞)的GFRAL表达水平，其中与所述对照细胞相比所述测试细胞的更高GFRAL表达水平表明存在与GFRAL的提高表达相关的失调。在某些实施方式中，所述测试细胞获自个体，所述个体被怀疑患有与GDF15的表达相关的疾病、失调或状况，和/或其中希望抑制GDF15的体内作用的疾病、失调或状况。在某些实施方式中，所述疾病、失调或状况是，例如，不自主体重损失。这样的示范性疾病、失调或状况可以使用本公开内容的抗-GFRAL抗体诊断。
在某些实施方式中，诊断或检测的方法，例如上文描述的那些方法，包括检测抗-GFRAL抗体与细胞表面表达的GFRAL、或从表面表达GFRAL的细胞获得的膜制品中的GFRAL的结合。在某些实施方式中，所述方法包括在允许抗-GFRAL抗体与GFRAL结合的条件下使细胞与抗-GFRAL抗体接触，和检测所述抗-GFRAL抗体与所述细胞表面上的GFRAL之间是否形成复合物。检测抗-GFRAL抗体与细胞表面上表达的GFRAL的示范性的分析是“FACS”分析。
某些其他方法可以用于检测抗-GFRAL抗体与GFRAL的结合。这样的方法包括但不限于本领域公知的抗原结合分析，例如，Western印迹、放射免疫分析、ELISA(酶联免疫吸附分析)、“夹心”免疫分析、免疫沉淀分析、荧光免疫分析、蛋白A免疫分析和免疫组织化学(IHC)。
在某些实施方式中，抗-GFRAL抗体是标记的。标记物包括但不限于直接检测的标记或部分(例如荧光的、发色团的、电子密度的、化学发光的和放射性的标记)，以及通过酶反应或分子相互作用间接检测的部分，例如酶或配体。示范性的标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125l、3H和131I，荧光团例如稀土螯合物或荧光素以及它的衍生物，罗丹明和它的衍生物，丹磺酰，伞形酮，荧光素酶，例如荧光虫荧光素酶和细菌荧光素酶(参见，例如，美国专利No.4,737,456萤光素，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶，例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与采用过氧化氢来使染料前体如HRP脱氧的酶偶联，乳过氧化物酶或微过氧化物酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记物，噬菌体标记物，稳定的自由基，等等。
在某些实施方式中，抗-GFRAL抗体被固定在不溶的基质上。固定要求从在溶液中维持游离的任何GFRAL中分离抗-GFRAL抗体。这通常通过在分析程序之前使抗-GFRAL抗体不溶，通过吸附到水不溶性的基质或表面(参见，例如，Bennich et al.，U.S.3,720,760)，或通过共价偶联(例如，使用戊二醛交联)，或通过在抗-GFRAL抗体与GFRAL之间形成复合物之后使抗-GFRAL抗体不溶，例如，通过免疫沉淀，来实现。
可以使用本公开内容的免疫结合物代替抗GFRAL抗体或除抗GFRAL抗体之外，进行任何上述诊断或检测实施方式。
分析
本公开内容的抗-GFRAL抗体可以通过本领域已知的各种分析来表征它们的物理/化学性质和/或生物学活性。
1.活性分析
在一个方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的抗-GFRAL抗体的分析。生物学活性可以包括，例如，测量对葡萄糖和/或脂质代谢的作用的分析。例如，可以使用血糖分析。血糖(例如，小鼠尾部剪片中或人血液样品中)可以根据厂家的说明通过ACCU-CHEKActive仪(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)读取ACCU-CHEK Active测试条来测量。另外，例如，可以使用脂质分布分析。可将全血(例如，来自小鼠尾部剪片或来自人血液样品)收集到普通毛细管(BD Clay Adams SurePrep，Becton Dickenson and Co.Sparks，MD)中。血清和血细胞可以通过在Autocrit Ultra 3(Becton Dickinson and Co.Sparks，MD)中旋转试管来分离。血清样品可以根据厂家的说明使用Integra 400Clinical Analyzer(RocheDiagnostics，Indianapolis，IN)来分析脂质分布(甘油三酯、总胆固醇、HDL和非HDL)。
2.结合分析和其他分析
在一个方面，测试抗-GFRAL抗体的抗原结合活性。例如，在某些实施方式中，测试抗-GFRAL抗体与细胞表面上表达的外源或内源GFRAL结合的能力。FACS分析可以用于这样的测试。
针对GFRAL产生的单克隆抗体的面板可以基于它们识别的表位进行分组，称为表位分箱。表位分箱一般利用竞争分析进行，其评估在存在另一个抗体的情况下抗体结合抗原的能力。在示范性的竞争分析中，固定化的GFRAL在溶液中孵育，所述溶液包含结合GFRAL的第一标记的抗体以及要测试其与所述第一抗体竞争结合GFRAL的能力的第二未标记的抗体。所述第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，固定化的GFRAL在包含所述第一标记的抗体、不含所述第二未标记的抗体的溶液中孵育。在允许所述第一抗体与GFRAL结合的条件下孵育之后，除去过量的未结合的抗体，测量与固定的GFRAL相联的标记物的数量。如果相对于对照样品，在测试样品中与固定的GFRAL相联的标记物的数量实质上降低，则表明所述第二抗体与所述第一抗体竞争结合GFRAL。在某些实施方式中，固定的GFRAL存在于细胞表面上，或存在于获自表面表达GFRAL的细胞的膜制品中。
表位分箱的高通量方法也是本领域已知的(参见，例如，Jia et al.，J.Immunol.Methods 2004，288(1-2)：91-98，描述了用于表征单克隆抗体的多路化竞争性抗体分箱的方法；和Milleret al.，J.Immunol.Methods 2011，365(1-2)：118-25，描述了通过多路化配对分析的鼠单克隆抗体表位分箱)。
3.表位作图
表位作图是鉴定抗体在它的目标蛋白抗原上的结合位点或表位的过程(例如，抗-GFRAL抗体在GFRAL上的表位)。抗体表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由蛋白质中连续的氨基酸序列形成。构象表位由蛋白质序列中不连续的氨基酸形成，但是其在蛋白质折叠成它的三维结构时集合在一起。
在目标蛋白质抗原上对抗体表位作图的各种方法是本领域已知的。这些方法包括诱变方法、肽扫描方法、展示方法、涉及质谱法的方法和结构测定。
定点诱变方法涉及靶向的定点诱变，其中通过沿着蛋白质序列系统地引入取代，然后测定每个取代对抗体结合的影响来鉴定关键氨基酸。这可以在人GFRAL中通过例如Cunningham and Wells(1989)Science 244：1081-1085描述的“丙氨酸扫描诱变”，或某些其他形式的氨基酸残基点突变来进行。然而，诱变研究还可以揭示对GFRAL的总体三维结构关键的、但不直接涉及抗体-抗原接触的氨基酸残基，因而可能必需其他方法来确认利用这种方法测定的功能性表位。
猎枪诱变作图利用目标基因的全面的质粒突变文库，文库中的每个克隆带有独特的氨基酸突变，整个文库覆盖目标蛋白质中的每个氨基酸。构成突变文库的克隆独立地布置在微量培养板上，在活的哺乳动物细胞内表达，并测试与目标抗体的免疫反应性。通过反应性的缺失鉴定出对于抗体表位关键的氨基酸，然后作图到蛋白质结构上以显现表位。通过使分析自动化，可以在数天到数周内得到新的表位图。由于它利用了哺乳动物细胞内蛋白质的天然结构，该技术容许在复杂的蛋白质上作图出线性表位和构象表位。(参见，例如，Paes et al.，J.Am.Chem.Soc.131(20)：6952-6954(2009)；Banik and Doranz，GeneticEngineering and Biotechnology News 3(2)：25-28(2010))。
抗-GFRAL抗体结合的表位还可以利用肽扫描方法测定。在肽扫描中，对来自目标蛋白质GFRAL的重叠片段的短肽序列的文库测试它们结合目标抗体的能力。合成所述肽，并通过多种固相筛选方法(参见，例如，Reineke et al.，Curr.Opin.Biotechnol.12：59-64，2001)的任一种，例如“pepscan”方法(参见，例如，WO 84/03564；WO 93/09872)，使用ELISA或BIACORE，或在芯片上，对结合进行筛选。这样的肽筛选方法可能不能检测某些不连续的功能表位，即，涉及沿GFRAL多肽链的一级序列不连续的氨基酸残基的功能表位。
近年来开发的称为CLIPS(chemical linkage of peptides onto scaffolds，支架上肽的化学连接)的技术可以用于对构象表位作图。肽的松散末端被固定在合成的支架上，使得支架化的肽可能采取与完整蛋白质中相应序列相同的立体结构。CLIPS技术被用于将线性肽固定在环状结构(“单环”形式)上，并将蛋白质结合位点的不同部分集合在一起(“双环”、“三环”等形式)，以产生可以用于分析抗体结合的构象表位(参见，例如，美国专利No.7,972,993)。
本公开内容的抗-GFRAL抗体结合的表位还可以利用展示技术来作图，包括例如上文描述的噬菌体展示、微生物展示和核糖体/mRNA展示。在这些方法中，肽片段的文库被展示在噬菌体或细胞的表面。然后利用选择性结合分析通过筛选针对这些片段的抗体对表位作图。已经开发了许多计算机工具，它们容许基于利用噬菌体展示获得的线性的亲和力选择的肽来预测构象表位(参见，例如，May rose et al.，Bioinformatics 23：3244-3246，2007)。通过噬菌体展示检测构象表位的方法也是可获得的。微生物展示系统也可以用于在细胞表面表达正确折叠的抗原片段用于鉴定构象表位(参见，例如，Cochran et al.，J.Immunol.Meth.287：147-158，2004；Rockberg et al.，Nature Methods 5：1039-1045，2008)。
涉及蛋白水解作用和质谱法的方法也可以用于测定抗体表位(参见，例如，Baerga-Ortiz et al.，Protein Sci.2002 June；11(6)：1300-1308)。在有限蛋白水解中，在存在或不存在抗体的情况下通过不同的蛋白酶裂解抗原，通过质谱法鉴定片段。表位是在抗体结合时被保护免于蛋白水解的抗原的区域(参见，例如，Suckau et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：9848-9852，1990)。其他基于蛋白水解的方法包括，例如，选择性化学修饰(参见，例如，Fiedler et al.，Bioconjugate Chemistry 1998，9(2)：236-234，1998)，表位切除(参见，例如，Van de Watered al.，Clin.Immunol.Immunopathol.1997，85(3)：229-235，1997)，以及近年来开发的氢-氘(H/D)交换法(参见，例如，Flanagan，N.，Genetic Engineering and Biotechnology News 3(2)：25-28，2010)。
通过结构方法，例如X-射线晶体结构测定(参见，例如，WO 2005/044853)，分子建模和核磁共振(NMR)光谱学，包括在游离时和在与目标抗体的复合物中结合时不稳定酰胺氢的H-D交换率的NMR测定(参见，例如，Zinn-Justin et al.(1992)Biochemistry 31：11335-11347；Zinn-Justin et al.(1993)Biochemistry 32：6884-6891)，也可以测定本公开内容的抗-GFRAL抗体结合的表位。
通过筛选针对GFRAL产生的抗体的表位结合，通过用包含表位序列的人GFRAL片段的肽免疫动物，或通过利用噬菌体展示选择抗体对表位序列的结合，可以获得结合本公开内容的抗-GFRAL抗体的相同表位的其他抗体。结合相同功能性表位的抗体预计可以展现相似的生物学活性，例如，阻断GFRAL的生物学活性，这样的活性可以通过抗体的功能分析来确认。
4.其他活性分析
在一个实施方式中，本公开内容的抗-GFRAL抗体是抑制GFRAL的生物学活性的拮抗性抗体。可以分析本公开内容的抗-GFRAL抗体来确定它们是否抑制GFRAL的生物学活性。
在一个方面，纯化的抗-GFRAL可以通过一系列分析来进一步表征，包括但不限于N-末端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻高压液相色谱(HPLC)、质谱、离子交换层析和木瓜蛋白酶消化。
在一个实施方式中，本公开内容期待具有一定但非全部效应物功能的改变的抗体，这使得它成为许多应用的期望的候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应物功能(例如补体和ADCC)是不必要的或有害的。在某些实施方式中，测量抗体的Fc活性来确保仅维持了期望的性质。可以进行体外和/或体内细胞毒性分析来确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合分析来确保抗体缺乏FcγR结合(因而缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。例如在美国专利No.5,500,362或5,821,337中描述了评估目标分子的ADCC活性的体外分析。用于这类分析的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。作为选择或另外地，目标分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在Clynes et al.PNAS(USA)95：652-656(1998)中公开的那些动物模型中。还可以进行C1q结合分析来确认抗体不能结合C1q并因此缺乏CDC活性。为评估补体活化，可以进行CDC分析，例如，如在Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中描述的。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定。
虽然已经通过举例和实例的方式为了清楚理解较详细地描述了上述公开内容，所述说明和实例不应被看作是限制本公开内容的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用以它们的整体明确地合并。
实施例
以下是本公开内容的方法和组合物的实施例。
实施例1：抗体的产生
例如，通过用表达GFRAL蛋白的细胞、共表达RET蛋白和GFRAL蛋白的细胞、或在共表达RET蛋白和GFRAL蛋白的细胞上交联GDF15蛋白的细胞免疫小鼠，产生针对GFRAL蛋白的抗体。还用GFRAL ECD、GDF15：GFRAL ECD复合物和/或GFRAL ECD Fc融合物：RET ECD Fc融合物免疫小鼠。
例如，如下制备用于免疫的细胞。293EXPI(Invitrogen)细胞用编码GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的核酸序列瞬时转染，或用编码GFRAL蛋白和RET蛋白(SEQ ID NO：1797和1813)的核酸序列共转染。通过FACS通过相应的特定抗体分析细胞的GFRAL和RET的表达。细胞在PBS中洗涤两次，通过离心团粒化，产生膜制品。用膜制品和佐剂免疫129/B6或NZBW动物。对动物进行强化来诱导适合的滴度。通过ELISA和/或FACS测定滴度。从具有适合滴度的动物的脾脏和导液淋巴结获得淋巴细胞的单细胞悬液。通过电融合以1：12的比例将细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。在存在HAT选择的情况下将融合的细胞平铺在平板中。培养10-14天后，采集上清液，利用GFRAL或过量表达GFRAL和RET的293EXPI细胞，通过CellnSight的细胞成像进行筛选，或利用GFRAL-Fc蛋白或RET与GFRAL-Fc的杂二聚体通过ELISA来确认结合进行筛选。进一步选择阳性克隆并进行亚克隆。
在多场次的免疫与融合之后，筛选了超过十万个杂交瘤克隆，并针对GDF15结合、基于细胞的GDF15诱导的信号转导和基于细胞的GDF15独立性信号转导，选择了超过两千个克隆。选择数百个克隆(例如，250个)用于其他研究，包括结合亲和性、结构域作图和表位特异性的分析。还在功能分析中测试了数千个杂交瘤上清液，包括拮抗和激动活性分析。纯化了数百个克隆用于进一步的测试。
实施例2：抗体的筛选和选择
培养2周后，利用GFRAL或过量表达GFRAL和RET的293EXPI细胞，通过CellnSight的细胞成像，或利用GFRAL-Fc蛋白或RET与GFRAL-Fc的杂二聚体通过ELISA，筛选杂交瘤上清液中结合GFRAL蛋白的单克隆抗体。简要地说，细胞成像的筛选，293EXPI细胞用编码GFRAL的核酸序列瞬时转染，或用编码GFRAL和RET的核酸序列共转染。转染的细胞平铺在具有透明底部的384孔平板上。转染后24小时替换培养基。在48小时时，从平板中吸出培养基，将杂交瘤上清液添加到反应孔中，在室温下孵育30分钟。然后将A647抗小鼠Fc添加到反应孔中，在室温下再孵育30分钟。在A647通道中分析Dapi阳性细胞的信号，阳性的A647信号表明GFRAL结合剂。
简要地说，ELISA筛选，通过ELISA平板上包被的抗人Fc药剂捕获GFRAL-Fc蛋白或RET与GFRAL Fc的杂二聚体。使用PBS/1％BSA封闭平板。将15μL杂交瘤上清液添加到反应孔中，在室温下孵育1小时。在3次洗涤之后，将15μL的HRP-抗小鼠Fc二级添加到反应孔中，在室温下孵育1小时。3次洗涤之后，15μL的TMB用于平板显色。阳性信号表明GFRAL结合剂。
从这些分析中鉴定出数千个抗体是GFRAL的结合剂。这些抗体进行进一步的测试，包括结合亲和性、结构域作图、表位特异性以及激动和拮抗功能的分析。纯化了数百个抗体用于进一步的测试。
另外，测量了抗体对人和小鼠的GFRAL的结合亲和性。例如，通过Biacore的低分辨率KD测量，根据它们对人GFRAL和小鼠GFRAL的结合亲和性对抗体进行排序。简要地说，利用胺偶联药剂(GE Healthcare LifeSciences，Piscataway，NJ)将抗小鼠Fc抗体(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO))固定在CM5芯片的所有四个流动池中。在流动池2、3和4上捕获纯化的抗体(～100RU)，使用流动池1作为参考。随后以70μL/分钟的流动速度注射人或小鼠GFRAL(PBS-P缓冲液中25nM)，在25℃下监视结合动力学。
还在其他基于Biacore的分析中进行了结合亲和性测量。例如，使用纯化的抗体进行平衡解离常数(KD)测量，来评估它们与人GFRAL或小鼠GFRAL的结合。如上所述，利用胺偶联药剂(GE Healthcare LifeSciences，Piscataway，NJ)将抗小鼠Fc抗体(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO))固定在CM5芯片的所有四个流动池中。在流动池2、3和4上捕获纯化的抗体(～100RU)，使用流动池1作为参考。随后以70μL/分钟的流动速度注射人或小鼠GFRAL(PBS-P缓冲液中)，在25℃下评估结合动力学。
对人和小鼠GFRAL的结合亲和性(例如，KD(nM))的代表性结果在下文表26中显示。另外，示范性抗体的结合的解离速率(例如，Koff(1/s)的代表性结果在下文的表26中显示。
表26
NA＝不适用；ND＝未检测到结合
对于示范性抗体1C1和3P10，亲和力主要由非常慢的解离速率驱动(参见，例如，附图3)。上文表26中显示的结合GFRAL的抗体不识别(例如，结合)GNFR alph1，GFRAL的最紧密相关的同源物。
实施例3：功能分析
所产生的针对GFRAL的抗体，例如实施例1中描述的，在基于细胞的报告物分析中测试它们的功能活性。
例如，测量人GDF15(hGDF15)诱导的人GFRAL/RET信号转导的ELK1-荧光素酶报告物分析，利用瞬时转染的HEK293T进行。转染质粒由两个报告物质粒Gal4-Elk1和5×UAS-Luc(Agilent Technologies PathDetect Elk1反式-报告系统Cat#219005)，编码人GFRAL(hGFRAL)、猕猴GFRAL(cynoGFRAL)、小鼠GFRAL(mGFRAL)或大鼠GFRAL(rGFRAL)以及人RET(hRET)、猕猴RET(cynoRET)、小鼠RET(mRET)或大鼠RET(rRET)的质粒组成。在这些分析中，在细胞中重组表达的GFRAL/RET受体复合物的hGDF15诱导的活化触发细胞内信号转导，其引起ERK和然后的Elk1磷酸化。一旦Gal4-Elk1被磷酸化，Gal4-Elk1结合5×UAS启动子区域，开启荧光素酶报告基因转录。然后在荧光素酶酶学分析中测量荧光素酶的活性。
针对GFRAL的抗体抑制人GFRAL/RET信号转导的代表性结果在下文表27中显示。
表27
ND＝分析中未检测到阻断
NP＝未进行分析
WB＝分析中检测到的弱阻断
对于某些实验，利用FuGene6转染药剂(Promega)将上述四种质粒(例如，2个报告物质粒，GFRAL，RET)转染到悬浮液中新收获的细胞中。对来自指定物种的每一对受体，优化转染中GFRAL和RET DNA的比例，在12∶1到60∶1之间变动。转染的细胞播种到384孔平板(7500个细胞/25μL/孔)的正常生长培养基中。37℃孵育过夜之后，添加连续稀释的抗体与固定浓度hGDF15的混合物。在37℃下与抗体孵育6小时后，添加等体积的Bright-Glo药剂(Promega)，使用Enspire读取仪(Perkin Elmer)读取萤光信号。
拮抗hGDF15效果的抗体的同时添加，以剂量依赖性方式阻断了hGDF15信号转导，阻止荧光素酶报告基因表达。
实施例4：其他功能分析
在其他基于细胞的分析中测试抗hGFRAL抗体的hGDF15拮抗活性，例如，稳定表达hGFRAL和hRET的U20S分析。在分析之前一天，以20K/每个96孔板将细胞平铺在90μlDiscoveRx Assay Complete Cell Plating 16药剂(DiscoveRx，Cat#93-0563R16B)中。下一天，细胞用连续稀释的抗体与固定浓度的hGDF15的混合物在37℃下处理10分钟。Cis-bioCellul′erk分析试剂盒(Cat#64ERKPEH)用于根据厂家的方案分析ERK磷酸化水平。与Hek293T Elk1报告物分析类似，hGDF15拮抗性抗体能够以剂量依赖性方式阻止hGDF15诱导的磷酸化。
针对GFRAL的抗体阻止hGDF15诱导的磷酸化的代表性结果在下文的表28中显示。
表28
NP＝未进行分析
实施例5：配体竞争、结构域作图和表位分箱
为结合GFRAL而选择的抗体在配体竞争结合分析、结构域和表位分箱实验中进行评估。
简要地说，通过用抗人Fc将GFRAL-Fc蛋白或RET与GFRAL-Fc-杂二聚体捕获在ELISA平板上，进行配体竞争结合分析。使用PBS/1％BSA封闭平板。将15μL剂量滴定的抗体以10μg/mL开始以3x稀释度加入孔中，并在室温下孵育30分钟。无需洗涤，生物素化的GDF15(GFRAL配体)添加到反应孔中保持另外1小时。洗涤3次之后，15μL的HRP-链霉亲和素二级添加到反应孔中，在室温下孵育1小时。3次洗涤之后，15μL的TMB用于平板显色。阳性信号表明生物素化的GDF15仍然结合平板上捕获的GFRAL，抗体不是配体竞争者。阴性信号表明生物素化的GDF15不再结合平板上捕获的GFRAL，抗体是配体竞争者。
简要地说，结构域作图分析，通过用编码GFRAL(SEQ，GFRAL结构域1、GFRAL结构域2、GFRAL结构域1+2、GFRAL结构域1+3、GFRAL结构域2+3或GFRAL结构域3的核酸序列瞬时转染293EXPI细胞，进行结构域作图分析。
测试了七个GFRAL删除构建体(构建体1到7)，它们包括连续从N-末端到C-末端的以下特征：IgK信号序列(在以下的序列中以小写和下划线字母描述)，FLAG tag序列(下以下的序列中以小写和斜体字母描述)，以及具有各种细胞外结构域组合的GFRAL蛋白序列(结构域1以粗体大小字母描述；结构域2以下划线大写字母描述；结构域3以粗体和下划线字母描述)。结构域1(IgK-2Flag-GFRAL；SEQ ID NO：1817)含有人GDF15多肽(残基Q20到L394)，其中存在结构域1、2和3。构建体2(IgK-2Flag-GFRAL结构域1；SEQ ID NO：1818)含有GFRAL-ΔD2，ΔD3(残基Q20到S130和F317到L394)，其中结构域2和3被删除。构建体3(IgK-2Flag-GFRAL结构域2；SEQ ID NO：1819)含有GFRAL-ΔD1，ΔD3(残基S121到C210和F317到L394)，其中结构域1和3被删除。构建体4(IgK-2Flag-GFRAL结构域1+2；SEQ ID NO：1820)含有GFRAL-ΔD3(残基Q20到C210和F317到L394)，其中结构域3被删除。构建体5(Igk-2Flag-GFRAL结构域1+3；SEQ ID NO：1821)含有GFRAL-ΔD2(残基Q20到S130和C220到L394)，其中结构域2被删除。构建体6(IgK-2Flag-GFRAL结构域2+3；SEQ ID NO：1822)含有GFRAL-ΔD1(残基S121到L394)，其中结构域1被删除。构建体7(IgK-2Flag-GFRAL结构域3；SEQ ID NO：1823)含有GFRAL-ΔD1，ΔD2(残基A211到L394)，其中结构域2和3被删除。
构建体(lgK-2Flag-GFRAL；SEQ ID NO：1817)
构建体2(lgK-2Flag-GFRAL结构域1；SEQ ID NO：1818)
构建体3(lgK-2Flag-GFRAL结构域2；SEQ ID NO：1819)
构建体4(lgK-2Flag-GFRAL结构域1+2；SEQ ID NO：1820)
构建体5(lgK-2Flag-GFRAL结构域1+3；SEQ ID NO：1821)
构建体6(lgK-2Flag-GFRAL结构域2+3；SEQ ID NO：1822)
构建体7(lgK-2Flag-GFRAL结构域3；SEQ ID NO：1823)
细胞在4℃下与1μg/mL的抗体孵育30分钟。在洗涤之后，细胞与荧光染料标记的抗小鼠Fc二级抗体A488或A647在4℃下孵育30分钟。在洗涤之后，通过FACS分析细胞。阳性信号表明抗体与转染的293EXPI细胞过量表达的结构域结合。阴性信号表明抗体不与转染的293EXPI细胞过量表达的结构域结合。
简要地说，通过用2μg/ml的抗体(mAb1)直接包被平板进行表位分箱分析。使用PBS/1％BSA封闭平板。2μg/mL的抗体(mAb2)与50ng/ml的GFRAL-Fc蛋白预孵育30分钟，之后在室温下添加到反应孔中1小时。3次洗涤之后，将15μL的HRP-抗人Fc二级添加到反应孔，在室温下孵育1小时。3次洗涤之后，15μL的TMB用于平板显色。阳性信号表明GFRAL-Fc蛋白仍然结合平板上捕获的抗体(mAb1)，抗体(mAb2)不处于与捕获的抗体(mAb1)相同的表位箱中。阴性信号表明GFRAL-Fc蛋白不再结合平板上捕获的抗体(mAb1)，抗体(mAb2)处于与捕获的抗体(mAb1)相同的表位箱中。
GDF15结合GFRAL的抑制、GFRAL的结构域作图以及表位分箱的代表性结果在下文表29中显示。
表29
NA＝不适用；ND＝未检测到结合
如上文表29所示，鉴定出至少三个子类的抗-GFRAL抗体，包括阻断GDF15结合的抗体(例如，竞争性拮抗剂)，不阻断GDF15结合的抗体(例如，非竞争性拮抗剂)以及GDF15结合的部分阻断剂。抗体还被鉴定为结合GFRAL的结构域1、结构域2或结构域3。结合结构域2的抗体被发现抑制GDF15与GFRAL的结合，或至少部分抑制这种结合。结合结构域1或3的抗体不抑制GDF15与GFRAL的结合。
实施例2-4和中分析的和上文描述的示范性抗-GFRAL抗体的比对在附图4A-4B中显示。
被发现结合结构域1、结构域2或结构域3的抗体的VH和VL结构域的比对分别在附图5A-5F中显示。
实施例6：人源化
从包括如实施例1-5中的描述选择的抗体中，产生人源化抗-GFRAL抗体。产生示范性的人源化抗体，其包含来自表1-24的一个或更多个CDR，包括，例如，命名为1C1的抗体(参见，例如，表1)、命名为25M22的抗体(参见，例如，表8)、命名为17J16的抗体(参见，例如，表7)、命名为5F12的抗体(参见，例如，表4)和命名为3P10的抗体(参见，例如，表2)的CDR。示范性的人源化抗体1C1、25M22、17J16、5F12和3P10的VH和VL区的序列在附图6A-6B、7A-7B、8A-8B、9A-9B和10A-10B中显示。
选自许多抗-GFRAL抗体进行测序和随后进行人源化。进行NCBI免疫球蛋白(Ig)序列blastp检索来鉴定与小鼠VH和VL序列具有显著相似性的人种系序列。潜在的人框架序列的实例在表30中给出。考虑序列相似性、生物物理学性质和潜在的免疫原性，选择IGH和IGK种系序列作为人框架序列。选择的种系序列在表30中以粗体突出显示。为了鉴定最佳匹配的框架4序列，进行类似的方法选择JH和JK种系序列，这些选出的序列也在表30中以粗体突出显示。
表30
将鼠抗体的CDR序列转移(例如，移植)到人IGH和IGK的相应位置，添加相应于框架四的J-区残基。产生的蛋白质序列翻译回DNA序列，为在哺乳动物细胞中表达优化密码子并合成(GeneArt/LifeTechnologies)。随后，合成的DNA片段使用In-Fusion技术(Clontech)克隆到pTT5载体(NRC Biotechnology Research Institute)中产生准备表达的构建体，其含有Kozak序列、hIgK信号肽、随后是期望抗体的人源化的可变区加上抗体的恒定区(hIgG1/hIgK)。同时，选择框架区中的单个残基回复突变为小鼠残基以保持结合亲和力。对Vemier区残基给与特殊考虑。通过定点突变(QuickChange，Agilent)或者从头DNA合成产生这样的变体。这样的表达构建体任何用于在Expi293细胞(Thermo Fischer)中短暂的蛋白质表达，从组织培养上清液纯化出分泌的抗体，测试结合亲和力。为了对结合亲和力和最低数量的必需回复突变进行优化，一般在抗体表达、纯化和结合亲和力测量之后进行第二轮构建体设计。
示范性的人源化抗-GFRAL抗体包括包含以下的抗体：SEQ ID NO：1982(HC-344e)的VH和SEQ ID NO：1997(LC-344h)的VL，SEQ ID NO：1978(HC-344a)的VH和SEQ ID NO：1992(LC-344c)的VL；SEQ ID NO：1978(HC-344a)的VH和SEQ ID NO：1997(LC-344h)的VL；SEQ IDNO：1985(HC-344h)的VH和SEQ ID NO：1997(LC-344h)的VL；SEQ ID NO：1961(HC-375d)的VH和SEQ ID NO：1976(LC-375J)的VL；SEQ ID NO：1962(HC-375e)的VH和SEQ ID NO：1976(LC-375J)的VL；SEQ ID NO：1964(HC-375g)的VH和SEQ ID NO：1967(LC-375a)的VL；或SEQ IDNO：1964(HC-375g)的VH和SEQ ID NO：1976(LC-375J)的VL。
实施例7：人源化抗体的选择
分析实施例6中鉴定的示范性的人源化抗-GFRAL抗体对人GFRAL的结合亲和力。在基于Biacore的分析中进行结合亲和力测量。例如，使用纯化的抗体进行平衡解离常数(KD)测量，来评估它们与人GFRAL的结合。使用实施例II中描述的方法，抗小鼠Fc抗体(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)使用胺偶联药剂(GE Healthcare LifeSciences，Piscataway，NJ)固定在CM5芯片的全部四个流动池中。在流动池2、3和4上捕获纯化的人源化抗-GFRAL抗体(～100RU)，使用流动池1作为参考。随后以70μL/分钟的流动速度注射PBS-P缓冲液中的人GFRAL，在25℃下评估结合动力学。
示范性的人源化抗-GFRAL抗体(例如，人源化的3P10和人源化的5F12)对人GFRAL的结合亲和力(例如，KD(nM)的代表性结果在下文的表31和32中显示。
表31
人源化抗-GFRAL抗体 对人GFRAL的结合亲和力
K<sub>D</sub>(pM)
3P10杂交瘤 ＜10
HC-344a/LC-344c 12
HC-344a/LC-344h ＜10
HC-344h/LC-344c ＜10
HC-344e/LC-344h ＜10
HC-344h/LC-344h ＜10
表32
实施例8：人源化抗体的功能分析
实施例6和7中描述的示范性的人源化抗-GFRAL抗体在与实施例3中描述的类似的基于细胞的报告物分析中测试它们的功能活性。
例如，测量人GDF15(hGDF15)诱导的人GFRAL/RET信号转导的ELK1-荧光素酶报告物分析，利用转染的U20S和HEK293T进行。转染质粒由两个报告物质粒Gal4-Elk1和5×UAS-Luc(Agilent Technologies PathDetect Elk1反式-报告系统Cat#219005)和编码人GFRAL(hGFRAL)和人RET(hRET)的质粒组成。在这些分析中，在细胞中重组表达的GFRAL/RET受体复合物的hGDF15诱导的活化触发细胞内信号转导，其引起ERK和然后的Elk1磷酸化。一旦Gal4-Elk1被磷酸化，Gal4-Elk1结合5×UAS启动子区域，开启荧光素酶报告基因转录。然后在荧光素酶酶学分析中测量荧光素酶的活性。
针对GFRAL的示范性的人源化抗体(例如，3P10和5F12)抑制人GFRAL/RET信号转导的代表性结果在下文的表33和34以及附图11中显示。
表33
人源化的抗-GFRAL抗体 IC<sub>50</sub>(nM)
3P10杂交瘤 4.02
HC-344a/LC-344c 7.26
HC-344a/LC-344h 4.63
HC-344h/LC-344c 29.4
HC-344e/LC-344h 6.95
HC-344h/LC-344h 5.7
表34
人源化的抗GFRAL抗体 IC<sub>50</sub>(nM)
5F12杂交瘤 5.40
HC-375d/LC-375a 3.86
HC-375d/LC-375c 3.28
HC-375d/LC-375g 2.79
HC-375d/LC-375i 2.75
HC-375d/LC-375j 3.11
HC-375e/LC-375a 2.81
HC-375e/LC-375c 2.20
HC-375e/LC-375g 2.27
HC-375e/LC-375j 4.01
HC-375h/LC-375g 3.98
HC-375h/LC-375j 7.29
对于某些实验，利用FuGene6转染药剂(Promega)将上述四种质粒(例如，2个报告物质粒，GFRAL，RET)转染到悬浮液中新收获的细胞中。对来自标明物种的每一对受体，优化转染中GFRAL和RET DNA比例，在12：1到60：1之间变动。转染的细胞播种到384孔平板(7500个细胞/25μL/孔)的正常生长培养基中。37℃孵育过夜之后，添加连续稀释的抗体与固定浓度hGDF15的混合物。在37℃下与抗体孵育6小时后，添加等体积的Bright-Glo药剂(Promega)，使用Enspire读取仪(Perkin Elmer)读取萤光信号。
人源化抗-GFRAL抗体的同时添加，拮抗hGDF15效果，以剂量依赖性方式阻断了hGDF15信号转导，阻止荧光素酶报告基因表达。
实施例9：人源化抗体的其他功能分析
在其他基于细胞的分析中测试示范性的人源化抗hGFRAL抗体的hGDF15拮抗活性，例如，如实施例4中描述的，稳定表达hGFRAL和hRET的U20S分析。在分析之前一天，以20K/每个96孔板将细胞平铺在90μl DiscoveRx Assay Complete Cell Plating 16药剂(DiscoveRx，Cat#93-0563R16B)中。下一天，细胞用连续稀释的抗体与固定浓度的hGDF15的混合物在37℃下处理10分钟。Cis-bio Cellul′erk分析试剂盒(Cat#64ERKPEH)用于根据厂家的方案分析ERK磷酸化水平。
类似于实施例4中描述的Hek293T Elk1报告物分析，人源化抗hGFRAL抗体(例如，人源化的3P10)能够以剂量依赖性方式阻止hGDF15诱导的磷酸化。
人源化抗-GFRAL抗体阻止hGDF15诱导的磷酸化的代表性结果在下文的表35和附图12中显示。
表35
人源化抗GFRAL抗体 IC<sub>50</sub>(nM)
3P10杂交瘤 5.46
HC-344a/LC-344c 5.13
HC-344a/LC-344h 5.02
HC-344h/LC-344c 15.1
HC-344e/LC-344h 3.3
HC-344h/LC-344h 2.18
在对照实验中，GFRα1(结合于芯片表面)显示了结合它的天然配体GDNF(溶液中，50nM)(参见附图13C)。
示范性的人源化抗-GFRAL抗体(例如，HC-344e+LC-344h)不结合受体GFRα1，但是显示了高亲和力结合hGFRAL(附图13A和13B)，表明对GFRAL的特异性。
实施例10：动物研究
在多个动物研究中评估了抗-GFRAL抗体的作用。
A：在DIO小鼠(急性)中抗-GFRAL抗体抑制GDF15诱导的体重损失
为了确定抗-GFRAL抗体是否能够在膳食诱导的肥胖症(DIO)小鼠中中和GDF15诱导的体重降低效应，使用17周龄雄性C57BL/6J DIO小鼠(Jackson Labs West，Sacramento，CA)。小鼠(41.3g±0.4g)随机分配接受示范性的抗-GFRAL抗体(例如，1C1、3P10、17J16、5A20、25M22、5F12、8D8和12A3)或抗GDF15抗体(例如，1MO3)。每个组有6只小鼠。每个处理组有其自己的PBS对照组。抗体剂量是20mg/kg。用PBS或抗体注射一天后，然后小鼠以0.5mg/kg接受GDF15蛋白(例如，具有SEQ ID NO：1811的氨基酸序列)的三次连续的每日注射。记录每天的体重和食物摄取(第1-3天和第7天)。Sartorius秤LE5201用于称重。自动称量记录程序(Sartorius YSW05 Software Wedge，Sartorius Mechatronics Corporation，5OrvilleDrive，Suite 200Bohemia，NY 11716)用于自动地将重量数据传输到Microsoft Excel电子数据表。
数据表示为粗体重、delta体重改变和体重改变百分比的平均值±SEM(即，体重变化相对于基线体重的百分比)。使用学生T-检验(双尾，双末端)。在这些实验中，P＜0.05被认为是统计学上显著的。
示范性的抗-GFRAL抗体1C1、3P10、17J16、5A20、25M22、5F12、8D8和12A3能够逆转GDF15诱导的体重损失和食物摄取减少(附图14A和14B)。在这个模型中，抗GDF15抗体也可以逆转GDF15诱导的体重损失和食物摄取减少。
为了确定非竞争性抗-GFRAL抗体或竞争性抗-GFRAL抗体是否以剂量依赖性方式阻断外源GDF15诱导的体重降低效应，使用19周龄雄性C57BL/6J DIO小鼠。起初，小鼠(43.1g±0.3g)随机分配到PBS组(每组8只小鼠)或GDF15蛋白(例如，具有SEQ ID NO：1811的氨基酸序列)组(0.1mg/kg、1.0 mg/kg或10mg/kg，每组24只小鼠)。确认了GDF15蛋白在第二天剂量依赖性地减少体重和食物摄取。此外，GDF15处理组(0.1mg/kg、1.0mg/kg或10mg/kg)随机分配接受PBS或示范性的抗-GFRAL抗体(例如，1C1或3P10)(每组8只小鼠)。记录每天的体重和食物摄取(第1-3天和第7天)。
示范性的抗-GFRAL抗体逆转了GDF15诱导的体重降低和食物摄取降低(附图15和16)。
B：在DIO小鼠(慢性)中抗-GFRAL抗体促进体重增加
为了确定示范性的抗-GFRAL抗体是否能够在DIO模型中独立于外源的GDF15蛋白提高体重，使用14周龄雄性C57BL/6J DIO小鼠(Jackson Labs West，Sacramento，CA)。小鼠(34.5g±0.8g)随机分配接受PBS或每周10mg/kg的示范性的抗-GFRAL抗体(例如，1C1或3P10)。每组有10只小鼠。记录每天的体重和食物摄取持续28天。Sartorius秤LE5201用于称重。自动称量记录程序(Sartorius YSW05Software Wedge，Sartorius MechatronicsCorporation，5 Orville Drive，Suite 200 Bohemia，NY 11716)用于自动地将重量数据传输到Microsoft Excel电子数据表。还通过EchoMRI评估身体组成。
在DIO小鼠中示范性的抗-GFRAL抗体提高体重(分别6％和7％)和食物摄取(分别3.4％和3.7％)(附图17和18)。示范性的抗-GFRAL抗体的体重提高主要归因于提高的脂肪质量(附图19)。
C：在DIO小鼠中抗-GFRAL抗体逆转GDF-15诱导的身体质量损失
为了确定示范性的抗-GFRAL抗体是否能够在DIO小鼠中中和GDF15诱导的体重降低效应，使用17周龄雄性C57BL/6J DIO小鼠(Jackson Labs West，Sacramento，CA)，并构建了表达GDF15的腺病毒相关病毒(rAAV)。
rAAV的构建如下进行：带有高保真度DNA聚合酶的聚合酶链式反应(PCR)试剂盒购自New England BioLabs(F-530L，Ipswich，MA)。根据厂家的说明书建立PCR反应。含有IgG信号肽和随后的GDF15编码序列的扩增的DNA片段用限制酶Spe I和Not I(限制位点分别被包括在5′或3′PCR引物中)消化，然后与已经用相同限制酶消化的AAV转基因载体连接。用于表达的载体含有可选择标记物和表达盒，表达盒由克隆的编码序列的插入位点5′的强真核启动子、随后的3′非翻译区以及牛生长激素多聚腺苷酸尾部组成。
DIO小鼠经历高脂肪饮食(Research Diets，catalog#D12492NI)。所述高脂肪饮食含有60kcal％脂肪、20kcal％蛋白质和20kcal％碳水化合物。小鼠施用上文描述的rAAV或表达绿色荧光蛋白(GFP)的对照AAV载体的一次尾静脉注射。用1×1010表达GDF15的rAAV注射后42天，小鼠以3mg/kg的剂量施用示范性的抗-GFRAL抗体(3P10)或对照抗体(抗KLH抗体)。每组20只小鼠。在12周内监视小鼠体重、瘦质量和脂肪质量、能量消耗和食物摄取。
如附图20所示，示范性的抗-GFRAL抗体(3P10)在DIO小鼠中逆转GDF15诱导的体重损失以及脂肪质量和瘦质量的损失。另外，如附图21所示，示范性的抗-GFRAL抗体逆转GDF15诱导的能量消耗提高和GDF15诱导的食物摄取减少。
D：在瘦体小鼠(慢性)中抗-GFRAL抗体逆转GDF-15诱导的身体质量损失
为了确定示范性的抗-GFRAL抗体是否能够在瘦体小鼠中中和GDF15诱导的体重降低效应，使用15周龄雄性C57BL/6J小鼠(Jackson Labs West，Sacramento，CA)。小鼠置于Chow Diet中。如实施例11的C部分中描述的，小鼠施用以1×1010表达GDF15的rAAV或表达绿色荧光蛋白(GFP)的对照AAV载体的一次尾静脉注射。用表达GDF15的rAAV注射后28天，小鼠以3mg/kg的剂量施用示范性的抗-GFRAL抗体(3P10)或对照抗体(抗KLH抗体)。每组20只小鼠。在12周内监视小鼠体重、瘦质量和脂肪质量、能量消耗和食物摄取。
如附图22所示，示范性的抗-GFRAL抗体在瘦体小鼠中逆转GDF15诱导的体重损失，其包括脂肪质量损失和瘦质量损失的逆转。另外，如附图23所示，示范性的抗-GFRAL抗体在瘦体小鼠中逆转GDF15诱导的呼吸交换率(RER)改变以及GDF15诱导的食物摄取减少。
E：在瘦体小鼠中抗-GFRAL抗体不独立于GDF15诱导的体重损失提高体重
为了确定示范性的抗-GFRAL抗体是否能够在瘦体小鼠中独立于外源的GDF15蛋白提高体重，使用15周龄雄性C57BL/6J小鼠(Jackson Labs West，Sacramento，CA)。小鼠(26.1g±0.3g)随机分配接受PBS或每周10mg/kg的示范性的抗-GFRAL抗体(例如，1C1或3P10)。每组10只小鼠。在第一周记录每日食物摄取和体重，然后每周记录持续另外3周。Sartorius秤LE5201用于称重。
重复剂量的示范性的抗-GFRAL抗体1C1和3P10不显著改变瘦体小鼠中的体重和食物摄取，而抗体3P10显示了提高体重的微弱倾向(附图24和25)。
F：在患有慢性肾脏损伤的小鼠中抗-GFRAL抗体逆转体重损失和升高的能量消耗
为了确定示范性的抗-GFRAL抗体是否能够在患有慢性肾脏损伤的DIO小鼠中逆转体重减轻和升高的能量消耗，使用15周龄雄性C57BL/6J小鼠(Jackson Labs West，Sacramento，CA)。在HFD+腺嘌呤膳食5周(0.3％@诱导期10天，然后降低到0.1％@维持期另外3周)之后，DIO小鼠(26.1g±0.3g)随机分配接受1mg/kg每周的对照抗体(抗KLH)或示范性抗-GFRAL抗体(例如，3P10)。每组有12只小鼠。在第一周记录每日体重，然后每周记录持续另外8周。Sartorius秤LE5201用于称重。
如附图26A所示，为了验证腺嘌呤对肾脏功能的作用，膳食腺嘌呤(HFD中0.25％腺嘌呤)的10天处理显示了在小鼠中诱导肾脏损伤。膳食腺嘌呤还提高了血清GDF15水平(参见附图26B)并促进体重损失(参见附图26C)。另外，膳食腺嘌呤提高了小鼠中的能量消耗(参见附图27A)。
如附图27B所示，示范性的抗-GFRAL抗体在患有慢性肾脏损伤的小鼠中逆转了升高的能量消耗。另外，如附图28中所示，示范性的抗-GFRAL抗体在患有慢性肾脏损伤的小鼠中逆转了体重损失和脂肪质量与瘦质量的损失。
G：人源化抗-GFRAL抗体以剂量依赖性方式抑制GDF15诱导的体重损失
为了确定人源化抗-GFRAL抗体是否能够在膳食诱导的肥胖症(DIO)小鼠中中和GDF15诱导的体重降低效应，使用17周龄雄性C57BL/6J DIO小鼠(Jackson Labs West，Sacramento，CA)。起初，小鼠(42g±0.4g)随机地分配到PBS(每组8只小鼠)或GDF15蛋白(每组56只小鼠)。确认了GDF15蛋白在第二天剂量依赖性地减少体重和食物摄入。此外，每组8只小鼠被随机分配为接受1.0mg/kg剂量的运载体(抗KLH)或示范性的小鼠抗-GFRAL抗体(例如，m3P10)，或0.1mg/kg、0.3mg/kg、1.0mg/kg、3mg/kg或10mg/kg剂量的示范性的人源化抗-GFRAL抗体(例如，h3P10＝HC-344e+LC-344h)。记录每天的体重(第1-7天)。Sartorius秤LE5201用于称重。自动称量记录程序(Sartorius YSW05 Software Wedge，SartoriusMechatronics Corporation，5 Orville Drive，Suite 200 Bohemia，NY 11716)用于自动地将重量数据传输到Microsoft Excel电子数据表。
数据按照delta体重改变以平均值±SEM呈现。使用学生T-检验(双尾，双末端)。
示范性的人源化抗-GFRAL抗体HC-344e+LC-344h能够以剂量依赖性方式抑制GDF15诱导的体重损失(附图29)。
实施例11：GFRAL/GDF15复合物的晶体结构
A：复合物形成和结晶
通过混合1.2摩尔的过量GFRAL(W115-E351)蛋白与1摩尔GDF15蛋白亚单位(0.5摩尔GDF15，其是由一对二硫键连接的两个GDF15亚基的同二聚体)，制备GFRAL蛋白与GDF15蛋白的复合物。通过空间排阻层析纯化复合物来除去过量的GFRAL。通过在结晶液滴中混合5mg/ml的1μL蛋白质与0.5μL储备溶液以及0.5μL种子来结晶GDF15/GDF15复合物，所述储备溶液含有1.0mL的0.1M Tris pH 6.0、1.5M(NH4)2SO4和10％乙二醇。晶种从包括0.1M Bis-Tris pH 6.0和1.5M(NH4)2SQ4的储备溶液的结晶条件下获得。将结晶装置在Rigaku 24孔三叶草叶板中保持在室温下。在孵育三天后结晶液滴显出小的针形晶体。
GFRAL蛋白与GDF15蛋白的复合物的示范性的小针状晶体在附图30中示出。
GFRAL没有可用的分子模型，因此使用NaBr浸泡来确定晶体相位。如上所述获得的GFRAL/GDF15晶体浸泡在含有0.5M NaBr和0.75M NaBr的储备溶液中。30分钟后，0.5M NaBr浸泡的晶体状态良好，而0.75M NaBr浸泡产生了破碎的晶体。来自两种浸泡的晶体和未浸泡的晶体用30％EG作为冷冻保护剂进行固定。
本文描述的模型提供了GFRAL蛋白以及GFRAL蛋白与GDF15蛋白的结合的首个结构信息。
B：数据收集和结构测定
从0.1M Bis-Tris pH 6.0、1.5M(NH4)2SO4和10％乙二醇储备条件获得并收获GFRAL/GDF15复合物晶体，作为来自0.5M和0.7M NaBr浸泡液的浸泡过或未浸泡的晶体。晶体用补充有20％乙二醇作为防冻剂的母液处理，在液氮中闪冻。然后在同步加速器束线IMCA-CAT，Advanced Photon Source，Argonne National Lab(ALS)检查这些晶体的X射线衍射。晶体衍射达到分辨率。
示范性的GFRAL/GDF15复合物晶体的X射线衍射统计在表36中显示。
表36
括号是中最高分辨率壳。
GFRAL/GDF15的分子置换是使用早先解析的分辨率的GFRAL/GDF15复合物的比例数据集(scaled dataset)作为起始模型，刚体精修(参见，Vagin，A.A.，et al.，(2004)″REFMAC5dictionary：Organization of prior chemical knowledge andguidelines for its use.″Acta Crystallogr.D 60：2284-2295)和起始位置精修在CCP4中实施的REFMAC5中完成。几轮的模型重建产生了GFRAL/GDF15复合物的结构。
GFRAL蛋白与GDF15蛋白的复合物的示范性的结构在例如附图31-39B中示出。
对起始的电子密度图的检查显示了GFRAL和GDF15的明确密度。在刚体精修之后，使用COOT(参见，Emsley，P.and Cowtan，K.(2004)″COOT：model-building tools formolecular graphics.″Acta Crystallogr.D 60：2126-2132)进行几轮模型构建和限制精修。在置换溶剂分子之后，完成最后的精修。
GFRAL/GDF15复合物的X射线衍射图的原子坐标在表49中。
示范性的晶体的精修统计在表37中示出。
表37
示范性的GFRAL/GDF15复合物晶体中GFRAL的清晰的电子密度在附图31中说明。附图31显示了用分辨率数据计算的、在1σ水平上轮廓化的GFRAL分子的电子密度图(2fo-fc)。GFRAL残基是清晰可见的。C：GFRAL/GDF15复合物的晶体结构
测定了GFRAL蛋白与GDF15蛋白的复合物的晶体结构。
核心相互作用界面氨基酸被确定为是有至少一个原子距离GFRAL相互作用蛋白(例如GDF15)小于或等于的氨基酸残基(蛋白质例如GFRAL上)。选自4.5A作为核心区截断距离，以允许范德华半径内的原子加上可能的水介导的氢键。
边界相互作用界面氨基酸被确定为是有至少一个原子距离与GFRAL相互作用蛋白(例如GDF15)作用的GFRAL上的核心相互作用界面氨基酸小于或等于的氨基酸残基(蛋白质例如GFRAL上)。选择小于或等于作为边界区截断距离，因为与距离GFRAL上的核心相互作用界面氨基酸小于的残基的蛋白质结合，将处在GFRAL相互作用蛋白的范德华半径之内。
使用来自CCG(Chemical Computing Group)的Molecular OperatingEnvironment(MOE)程序计算满足这些距离指标的氨基酸。
附图32显示了杂二聚GFRAL/GDF15复合物的示范性说明，在GFRAL/GDF15蛋白质晶体的不对称单元中发现。二聚分子GDF15具有一个分子间二硫键，发现由于辐射损伤它是虚弱的。GDF15分子的一侧可以在不对称单元中形成二聚体。附图33显示了GFRAL/GDF15晶体中GFRAL/GDF15杂二聚体的示范性的二聚化排布。
附图34A-34B说明GFRAL-GDF15界面上蛋白质-蛋白质接触的程度。GFRAL上的接触区用浅灰色箭头指出；GDF15上的接触区用黑色箭头指出。
附图35显示了GFRAL/GDF15界面中涉及GFRAL的三个α-螺旋。看起来多个二硫桥稳定了三个GFRALα-螺旋的结构排布。
附图36A-36D说明GFRAL/GDF15界面的不同方面，以及涉及形成GFRAL/GDF15界面的GFRAL蛋白和GDF15蛋白的核心和边界氨基酸残基。GFRAL蛋白和GDF15蛋白被描述为带状图，带有在空间填充的表面呈现中显示的GFRAL/GDF15界面中的残基。附图36A-36C显示了GFRAL蛋白和GDF15蛋白的核心相互作用界面氨基酸。附图36D显示了边界相互作用界面氨基酸。
全长前体人GFRAL蛋白的氨基酸序列在下文显示：
SEQ ID NO：1797
GFRAL/GDF15复合物的界面处的GFRAL氨基酸在表38中显示。
表38
*GFRAL氨基酸编号基于SEQ ID NO：1797
成熟的人GDF15的氨基酸序列在下文显示：
GFRAL/GDF15复合物的界面处的GDF15残基在表39中显示。
表39
*GDF15氨基酸编号基于SEQ ID NO：1811
D：GFRAL/RET/GDF15复合物的模型
Goodman etal.(2014)CELL REPORTS 8，1894-1904(PDB 4UX8)描述的RET/GFRα1/GDNF三元复合物用作模板来构建GFRAL/GDF15/RET的复合物的模型(来自GFRAL/GDF15结合，参见，例如，实施例11-13)。RET/GFRα1/GDNF模板来自重构的哺乳动物RET(ECD)-GDNF-GFRα1三元复合物的电子显微镜重构(Goodman et al.，supra)。
为了比较来自实施例12的GFRAL/GDF15晶体结构与RET/GFRα1/GDNF模板中GFRα1/GDNF的结构相似性，利用来自CCG的MOE将GFRAL/GDF15晶体中的GFRAL结构与GFRα1/GDNF/RET模型(PDB 4UX8)中的GFRα1重叠。的GFRAL/GFRα1主干残基的RMSD展现了重叠的高质量，以及由此GFRAL/GFRα1与GFRAL/GDF15复合物的结构相似性。这种包括GFRAL/GDF15结构与RET结构的三元复合物模型用于对GFRAL和RET之间的相互作用进行作图。
附图37A-37B说明4XU8中GFRAL与GFRα1的重叠的示范性的方面。主干残基的RMSD是
附图38A-38D说明在RET/GFRAL/GDF15模型中GFRAL蛋白与RET蛋白的相互作用的示范性的方面。在附图38A中，建模的GFRAL/GDF15界面处相互作用的GFRAL和GDF15残基通过杆模型呈现。在附图38B中，GFRAL上的RET相互作用残基在空间填充的界面模型中描述。在附图38C中，核心相互作用残基的空间填充的界面模型在GFRAL和RET上高亮显示。在附图38D中，边界相互作用残基的空间填充的界面模型在GFRAL和RET上高亮显示。
附图39A-39B说明在建模的RET界面处、空间填充的界面模型中鉴定的GFRAL蛋白上的核心与边界氨基酸残基。在附图39A中，建模的GFRAL上的核心残基在空间填充的界面模型中以暗灰色显示。在附图39B中，建模的GFRAL上的边界残基在空间填充的界面模型中以浅灰色显示。
基于这一建模，鉴定出与RET残基相互作用的许多GFRAL残基，如表40A所示。另外，鉴定出与GFRAL残基相互作用的许多RET残基，如表40B所示。
表40A
表40B
实施例12：GFRAL/抗体复合物的晶体结构
A1：GFRAL/3P10/25M22 Fab复合物的复合物形成与结晶
GFRAL蛋白、3P10 Fab与25M22 Fab的复合物(GFRAL/3P10/25M22Fab复合物)通过以GFRAL∶3P10 Fab∶25M22 Fab为1∶1.2∶1.2的摩尔比混合GFRAL(W115-E351)与3P10和25M22的Fabs形成。在空间排阻层析柱上从过量的Fab分子中纯化出复合物。如下浓缩并结晶GFRAL/3P10/25M22 Fab复合物。
1.5mL体积的3P10 Fab：：GFRAL：：25M22 Fab复合物样品通过使用10,000MWCO浓缩器离心到约6.6mg/mL来浓缩。浓缩的样品利用每个实验1μL蛋白质加1μL储备液直接进行结晶筛选。建立第一组96种条件，覆盖了储备液内容物的基于阶乘的配方采样。结晶装备在室温下孵育。Hampton Index和PegRx结晶筛选用于初始轮次的结晶。Hampton Index筛选没有产生任何潜在的命中，而PegRx筛选在以下三种结晶条件B11、D11和H8下产生了晶体：
·B11：0.1M MES pH 6.0，20％PEGMME 2000
·DTL 0.1M咪唑pH 7，0，12％，PEG 20,000
·HJL 0.1M TRIS pH 8.0，16％PEG 10,000，0.2M乙酸铵
在结晶条件B11、D11和H8下获得的GFRAL/3P10/25M22 Fab复合物的示范性晶体在附图40中显示。
为了进一步优化用于X射线衍射的晶体，GFRAL/3P10/25M22复合物浓缩到5.0mg/mL，设置用于结晶和额外的优化，其产生了改进的晶体。某些改进的晶体具有斜方形形式。收获了一些改进的晶体，用相容的防冻剂处理，在液氮中闪冻。相容的防冻剂的鉴定和使用对于维持样品结晶性和采集高质量的X射线衍射数据集是重要的。从包括0.1M咪唑pH 7.0、12％PEG 20,000(D11)的结晶条件获得的改进晶体用35％乙二醇处理。多种晶体在液氮中闪冻，在同步加速器(ALS)中采集X射线衍射数据。一个晶体解析到约分辨率。使用这一晶体采集完全的X射线衍射数据集。
测定了GFRAL/3P10/25M22 Fab复合物晶体结构。根据GFRAL中相比3P10和25M22Fabs中更高的α-螺旋含量，通过分子置换清晰地鉴定出GFRAL成分的位置。在本文描述的示范性晶体中，在不对称晶体单元中一个GFRAL和两个Fab成分(一个3P10 Fab和一个25M22Fab)形成了三元复合物。
分子置换用于鉴定GFRAL/3P10/25M22 Fab复合物中的Fabs。PDB 1F8T是可用于分子置换分析的最接近的GFRAL同源物(与GFRAL～54％的同一性和～79％的相似性)。结构分辨清晰地显示了所有Fab和GFRAL氨基酸位置。1F8T GFRAL同源物结构被用作踏脚石来分辨GFRAL/3P10/25M22三元复合物晶体结构的Fab和GFRAL成分。在这种结构中，其中的化学当量被确定为是1∶1∶1的3P10 Fab：：GFRAL：：25M22 Fab。
A2：GFRAL/8D8/5f12Fab复合物的复合物形成和结晶
GFRAL蛋白、8D8 Fab与5F12 Fab的复合物(GFRAL/8D8/5F12 Fab复合物)通过以GFRAL∶8D8 Fab∶5F12 Fab为1∶1.2∶1.2的摩尔比混合GFRAL(W115-E351)与8D8和5F12的Fabs形成。在空间排阻层析柱上从过量的Fab分子中纯化出复合物。如下浓缩并结晶GFRAL/8D8/5F12 Fab复合物。
GFRAL/5F12/8D8 Fab复合物通过使用10,000 MWCO浓缩器离心进行浓缩。浓缩的样品利用每个实验1μL蛋白质加1μL储备液直接进行结晶筛选。起初建立一组96种条件，覆盖了储备液内容物的基于阶乘的配方采样。结晶装备在室温下孵育。来自初步筛选的阳性前导物进一步进行优化，以产生可进行衍射分析的高质量晶体。1.5ml体积的5F12Fab：：GFRAL：：8D8 Fab复合物样品使用10000MWCO Centricon浓缩器离心到约7.8mg/ml进行浓缩。在完成时，这个样品使用每个实验1μL蛋白质加1μL储备液进行结晶筛选。起初设置一组96种条件，覆盖了储备液内容物的基于阶乘的配方采样。这些装备在室温下孵育。起初，Hampton Index和PegRx结晶筛选用于结晶，Index和PegRx在以下三种结晶条件C6、E11和C2中得到晶体：
·C6：0.1M Bis-Tris pH 6.5,14％PEG 3350
·EH：1.7M AmSO4，0.1M Bis-Tris pH 6.5，3％PEG MME 550
·CZ 0.1M咪唑pH 7.0，20％Jeffamine 2001.
获得的初步的晶体在附图41中显示。
通过产生适合的衍射单晶体的微量播种技术进行PegRx C6和C2结晶条件的优化。这些适合的衍射单晶体具有六角双锥形状，在0.1M咪唑pH7.0、20％Jeffamine 2001pH 7.0的10％乙二醇中获得。收获了一些晶体；用相容的防冻剂处理；在液氮中闪冻。使用相容的防冻剂对于维持样品结晶性是重要的，其产生可使用的数据集。晶体用获自0.1M咪唑pH7.0、20％Jeffamine 2001pH 7.0的20％MPD处理。
B1：GFRAL/3P10/25M22 Fab复合物的数据采集和结构测定
在同步加速器(ALS)中从GFRAL/3P10/25M22 Fab复合物的20种晶体中采集X射线衍射数据。前十种晶体产生了分辨率的一个完整的数据集。十种另外的晶体进一步优化解析达到这个数据集用于结构测定和精修。使用DENZO对X射线衍射数据进行索引，随后使用程序套件HKL2000中的SCALEPACK进行积分和缩放。参见Otwinowski Z.andMinor W.″Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode，″METHODS IN ENZYMOLOGY，Volume 276：Macromolecular Crystallography，part A，p.307-326，1997.C.W.Carter，Jr.&R.M.Sweet，Eds.，Academic Press(New York)。选定晶体的X射线衍射被鉴定为具有斜方晶的Bravais晶格对称。基于沿(h，0，0)、(0，k，0)和(0，0，1)轴的系统缺失，确定空间群为P212121。对Matthew系数的分析表明晶体的不对称单元可以容纳大约124.4kDa的一个组件，相应的溶剂含量为56％。
示范性的GFRAL/3P10/25M22 Fab复合物晶体的X射线衍射统计在表41中显示。
表41
括号是中最高分辨率壳。
通过使用早先分辨的GFRAL的缩放数据集(参见实施例12，C部分)，进行GFRAL/3P10/25M22 Fab复合物的分子置换，1F8T的79％同源的GFRAL结构作为PHASER程序内的起始模型。从分辨率延伸的数据给出了一个GFRAL和一个Fab。在结构分辨中Molrep产生了再一个Fab。该分辨具有处于不对称单元中的一个GFRAL和两个Fab的复合物。该分辨使用REFMAC进行精修。COOT用于模型构建。精修密度清楚地显示Fab和GFRAL中的缺失环。在置换少量溶剂分子之后，完成最后的精修。
GFRAL/3P10/25M22 Fab复合物的X射线衍射图的原子坐标在表50中。
GFRAL/3P10/25M22 Fab复合物晶体结构的示范性的精修统计在表42中显示。
表42
GFRAL/3P10/25M22 Fab复合物中3P10和25M22 Fab片段的每条链中CDR区的清晰的电子密度在附图42中说明(电子密度2mFo-DFc加权，1.0σ等高水平)。在电子密度中清晰地鉴定出3P10和25M22链，除了3P10重链的区域131-137之外(链-H)，其中少数末端残基未在电子密度中鉴定出。
B2：GFRAL/8D8/5F12 Fab复合物的数据采集和结构测定
在同步加速器中在APS下检查晶体。检查二十五种这样的晶体的X射线衍射。十六种晶体第一次送至同步加速器中，的衍射，第二轮优化的晶体解析达到将其用于结构测定和精修。使用DENZO对X射线衍射数据进行索引，随后使用程序套件HKL2000(Otwinowski and Minor，1997)中的SCALEPACK进行积分和缩放。选定晶体的X射线衍射被鉴定为具有斜方晶的Bravais晶格对称。基于沿(h，0，0)轴的系统缺失，空间群被确定为P6522。对Matthew系数的分析表明晶体的不对称单元可以容纳大约246.6kDa的一个组件，相应的溶剂含量为61％。用对应异构空间群P6122检查结构分辨，在刚体和约束精修期间得到非常差的Rfactor和Rfree。
GFRAL/8D8/5F12复合物晶体的X射线衍射统计在表43中显示。
表43
括号是中最高分辨率壳。
通过使用早先分辨fab的缩放数据集进行Fab/受体的分子置换，用于8D8(89％同源性)的pdb：3IU4和用于5F12(84％同源性)的pdb：4M7K用作PHASER程序中的起始模型，使用从延伸的数据得到一个受体与两个Fab的两个组件。该分辨具有处于不对称单元中的两个受体和四个Fab的复合物。该分辨使用REFMAC进行精修，Coot用于建模。
使用对应异构空间群P6122检查结构分辨。Molrep得到两个受体和四个Fab的复合物。Molrep模型进一步提交给Refmac进行精修，在刚体和约束精修期间最终得到非常差的Rfactor和Rfree，确认了当前的空间群是P6522。
GFRAL/8D8/5F12 Fab复合物的X射线衍射图的原子坐标在表51中。
GFRAL/8D8/5F12 Fab复合物晶体结构的示范性的精修统计在表44中显示。
表44
在附图43中说明GFRAL/8D8/5F12 Fab复合物中一个GFRAL蛋白与8D8和5F12 Fab片段(两个Fab链)的清晰的电子密度(电子密度2mFo-DFc加权，1.0σ等高水平)。精修密度清楚地显示Fab和受体分子中的大部分的环。在电子密度中清楚地鉴定出5F12和8D8链，除了链-I(5F12 vH)中氨基酸139-142之间、链-R(8D8 vH)中氨基酸132-136之间以及链-U(8D8vL)中氨基酸131-136之间的区域，以及少数末端残基未在密度中鉴定出。
C1：GFRAL/3P10/25M22 Fab复合物的晶体结构
确定了3P10 Fab：：GFRAL：：25M22 Fab复合物的晶体结构。
3P10 Fab和Fab氨基酸序列在下文中显示，VH和VL序列是粗体的，CDR区是粗体加下划线的。
3P10 Fab Hc：
3P10 Fab Lc：
25M22 Fab Hc：
25M22 Fab Lc：
附图44通过带状图说明3P10 Fab：：GFRAL：：25M22 Fab复合物的一个侧面。在3P10Fab：：GFRAL：：25M22 Fab复合物晶体中，Fab片段与GFRAL的不对称单元相互作用。晶体结构还显示，GFRAL表位残基290-312被呈现给3P10抗体，GFRAL N-末端表位残基130-157被呈现给25M22抗体重链CDR区。
附图45说明与GFRAL相互作用的3P10和25M22 Fabs的CDR区，Fab残基在方框中突出显示。
附图46-48说明在带状图中与3P10和25M22L Fabs的GFRAL相互作用的方面，选定的氨基酸残基以杆模型显示。例如，附图46说明邻近3P10重链CDR区的GFRAL表位的方面。3P10Hc的CDR序列在附图45中显示。作为另一个实例，附图47说明邻近3P10轻链CDR区的GFRAL表位的方面。3P10Lc的CDR序列在附图45中显示。作为另一个实例，附图48说明邻近25M22重链CDR区的GFRAL表位的方面。25M22Lc的CDR序列在附图45中显示。
对3P10 Fab：：GFRAL：：25M22 Fab复合物晶体结构中呈现给25M22 Fab的GFRAL表位的分析显示，25M22的作用机制是竞争性GDF15抑制物的作用机制，涉及阻断GDF15与GFRAL的结合。GFRAL蛋白上以及25M22 Fab CDR上重链和轻链的示范性的核心相互作用界面氨基酸在附图49中显示。
附图50A和50B说明GFRAL/25M22 Fab相互作用界面中的核心氨基酸残基。附图50A说明GFRAL的结构，GFRAL上的核心25M22相互作用界面氨基酸(结合表位)在空间填充的界面模型中突出显示。25M22 CDR上对于GFRAL的核心界面氨基酸也在空间填充的界面模型中突出显示。附图50B说明带状图中GFRAL的结构，GFRAL上的核心25M22 Fab相互作用界面氨基酸(GFRAL表位残基)在空间填充的界面模型中突出显示。
附图51说明GFRAL上用于GFRAL/25M22 Fab结合的边界相互作用界面氨基酸。GFRAL上(用于25M22 Fab结合)的相互作用界面氨基酸的边界在空间填充的界面模型中突出显示。
附图52-53说明GFRAL上用于25M22 Fab和GDF15结合的GFRAL表位的重叠。在附图52的左侧和右侧画面显示了GFRAL带状图的双侧视图。附图53显示了用于25M22 Fab和GDF15结合的重叠GFRAL表位的上视图。GFRAL上用于25M22 Fab和GDF15结合的核心相互作用界面氨基酸残基在空间填充的界面模型中突出显示。浅灰色的表面遮盖代表被25M22Fab覆盖的GFRAL表面，而暗灰色表面遮盖(黑色箭头标出)显示被GDF15覆盖的GFRAL表面。
GFRAL/25M22 Fab复合物的界面处的GFRAL氨基酸在表45中显示。为了比较GFRAL/25M22 Fab和GFRAL/GDF15复合物中的相互作用界面氨基酸，表45进一步列出了GFRAL/GDF15复合物的界面处的GFRAL氨基酸，其也在表38中显示。表45说明，结合GDF15的GFRAL上的全部核心相互作用界面氨基酸残基也是GFRAL/25M22 Fab相互作用中的核心相互作用界面氨基酸。
全长前体人GFRAL蛋白的氨基酸序列如下显示(还参见实施例12，C部分)：
SEQ IDNO：1797
表45
*GFRAL氨基酸编号基于SEQ ID NO：1797
对3P10 Fab：：GFRAL：：25M22 Fab复合物晶体结构中呈现给3P10 Fab的GFRAL表位的分析显示，3P10的作用机制是非竞争性GDF15抑制物的作用机制，不涉及阻断GDF15与GFRAL的结合。GFRAL蛋白上以及3P10 Fab CDR上重链和轻链的示范性核心相互作用界面氨基酸在附图54中显示。
附图55A-55B作为杆模型(附图55A)或空间填充的界面模型(附图55B)说明GFRAL和3P10 Fab上的相互作用界面残基。
附图56A-56B说明空间填充的界面模型中GFRAL上用于3P10Fab结合的核心(附图56A)和边界(附图56B)相互作用界面氨基酸(GFRAL结构3P10结合表位)。
附图57说明GFRAL上3P10 Fab和RET的GFRAL表位的部分重叠。在附图57的左侧和右侧画面显示了GFRAL带状图的双侧视图。GFRAL上用于3P10Fab和RET结合的核心相互作用界面氨基酸残基在空间填充的界面模型中突出显示。
附图58说明GFRAL上用于25M22 Fab和GDF15结合的GFRAL表位的重叠。在附图58的左侧(上视图)和右侧(底视图)画面上显示了GFRAL带状图的上视图和底视图。GFRAL上涉及25M22 Fab和25M22 Fab结合的边界相互作用界面残基显示为空间填充的界面模型。
GFRAL/3P10 Fab复合物的界面处的GFRAL氨基酸在表46中显示。为了比较GFRAL/3P10Fab和GFRAL/RET复合物中的相互作用界面氨基酸，表446进一步列出了GFRAL/RET复合物的界面处的GFRAL氨基酸，其也在表40A中显示。表46以粗体显示了GFRAL上结合RET和3P10 Fab两者的核心相互作用界面氨基酸残基。
表46
以粗体显示了GFRAL上结合RET和3P10 Fab两者的核心相互作用界面氨基酸残基。
C1：GFRAL/8D8/5F12 Fab复合物的晶体结构
确定了8D8 Fab：：GFRAL：：5F12 Fab复合物的晶体结构。
8D8 Fab和5F12 Fab氨基酸序列在下文中显示，VH和VL序列是粗体的，CDR区是粗体加下划线的。
8D8 Fab Hc：
8D8 Fab Lc：
5F12 Fab Hc：
5F12 Fab Lc：
附图59通过带状图说明3P10 Fab：：GFRAL：：25M22 Fab复合物的一个侧面。在3P10Fab：：GFRAL：：25M22 Fab复合物晶体中，Fab片段与GFRAL的不对称单元相互作用。晶体结构还显示，GFRAL表位残基290-312被呈现给3P10抗体，GFRAL N-末端表位残基130-157被呈现给25M22抗体重链CDR区。
附图60说明GFRAL蛋白上的8D8 Fab和5F12 Fab结合位点。GFRAL蛋白上对于Fab结合重要的残基显示为杆状模型。
对8D8 Fab：：GFRAL：：5F12 Fab复合物晶体结构中呈现给8D8 Fab的GFRAL表位的分析显示，8D8的作用机制是竞争性GDF15抑制物的作用机制，涉及阻断GDF15与GFRAL的结合。GFRAL蛋白上以及8D8 Fab CDR上重链和轻链的示范性核心相互作用界面氨基酸在附图61中显示。
附图62A、62B、62C和62D说明GFRAL/8D8 Fab相互作用界面中的核心和边界氨基酸残基。附图62A说明GFRAL的结构，GFRAL上的核心8D8相互作用界面氨基酸(GFRAL表位残基)在空间填充的界面模型中突出显示。附图62B还说明空间填充的界面模型中被8D8覆盖的GFRAL上的核心界面氨基酸。附图62C说明带状图中GFRAL的结构，GFRAL上的边界边界8D8Fab相互作用界面氨基酸(GFRAL表位残基)在空间填充的界面模型中突出显示。附图62D还说明空间填充的界面模型中被8D8覆盖的GFRAL上的边界界面氨基酸。
附图63A、63B、63C和63D说明GFRAL/5F12 Fab相互作用界面中的核心和边界氨基酸残基。附图63A说明GFRAL的结构，GFRAL上的核心5F12相互作用界面氨基酸(GFRAL表位残基)在空间填充的界面模型中突出显示。附图63B还说明空间填充的界面模型中被5F12覆盖的GFRAL上的核心界面氨基酸。附图63C说明带状图中GFRAL的结构，GFRAL上的边界5F12Fab相互作用界面氨基酸(GFRAL表位残基)在空间填充的界面模型中突出显示。附图63D还说明空间填充的界面模型中被5F12覆盖的GFRAL上的边界界面氨基酸。
GFRAL/8D8 Fab复合物的界面处的GFRAL氨基酸在表47中显示。为了比较GFRAL/8D8 Fab和GFRAL/GDF15复合物中的相互作用界面氨基酸，表47进一步列出了GFRAL/GDF15复合物的界面处的GFRAL氨基酸，其也在表38中显示。表47说明，结合GDF15的GFRAL上的核心相互作用界面氨基酸残基与GFRAL/8D8 Fab相互作用中的核心相互作用界面氨基酸重叠。
全长前体人GFRAL蛋白的氨基酸序列如下显示(还参见实施例12，C部分)：
SEQ ID NO：1797
表47
以粗体显示了GFRAL上结合GDF15和8D8 Fab两者的核心相互作用界面氨基酸残基。
对5F12 Fab：：GFRAL：：8D8 Fab复合物晶体结构中呈现给5F12 Fab的GFRAL表位的分析显示，5F12的作用机制是非竞争性GDF15抑制物的作用机制，不涉及阻断GDF15与GFRAL的结合。GFRAL蛋白上以及5F12 Fab CDR上重链和轻链的示范性核心相互作用界面氨基酸在附图64中显示。
GFRAL/5F12 Fab复合物的界面处的GFRAL氨基酸在表48中显示。为了比较GFRAL/5F12 Fab和GFRAL/RET复合物中的相互作用界面氨基酸，表48进一步列出了GFRAL/RET复合物的界面处的GFRAL氨基酸，其也在表40A中显示。表48在蓝色背景的格中显示了GFRAL上结合RET和5F12 Fab两者的核心相互作用界面氨基酸残基。GFRAL上对于GFRAL5F12相互作用关键的残基：GFRAL上的5F12结合表位揭示了阻断GFRAL/RET相互作用的非竞争性抑制作用机制。
表48
以粗体显示了GFRAL上结合RET和5F12 Fab两者的核心相互作用界面氨基酸残基。GFRAL中灰色背景的残基与GFRAL上的3P10结合表位和RET结合表位之间的残基重叠。
本文描述的所有参考文献的内容通过引用合并在本文中。
其他实施方式在以下的权利要求之中。
表49
第1列-记录名称；第2列-原子系列号；第3列-原子名称；第4列-氨基酸残基名称；第5列-链标识符；第6列-氨基酸残基序列号；第7列-以埃为单位的X的正交坐标；第8列-以埃为单位的Y的正交坐标；第9列-以埃为单位的Z的正交坐标；第10列-占用；第11列-温度因素；第12列-段标识符；第13列-元素符号。
表50
第1列-记录名称；第2列-原子系列号；第3列-原子名称；第4列-氨基酸残基名称；第5列-链标识符；第6列-氨基酸残基序列号；第7列-以埃为单位的X的正交坐标；第8列-以埃为单位的Y的正交坐标；第9列-以埃为单位的Z的正交坐标；第10列-占用；第11列-温度因素；第12列-段标识符；第13列-元素符号。
表51
第1列-记录名称；第2列-原子系列号；第3列-原子名称；第4列-氨基酸残基名称；第5列-链标识符；第6列-氨基酸残基序列号；第7列-以埃为单位的X的正交坐标；第8列-以埃为单位的Y的正交坐标；第9列-以埃为单位的Z的正交坐标；第10列-占用；第11列-温度因素；第12列-元素符号。

Claims (106)

1.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白，并且
a.抑制GDF15蛋白与所述GFRAL蛋白的结合；和/或
b.抑制RET蛋白与所述GFRAL蛋白的结合。
2.权利要求1的单克隆抗体或其片段，其结合所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的结构域1内的一个或更多个氨基酸残基。
3.权利要求1的单克隆抗体或其片段，其结合所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的结构域2内的一个或更多个氨基酸残基。
4.权利要求1的单克隆抗体或其片段，其结合所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的结构域3内的一个或更多个氨基酸残基。
5.权利要求1的单克隆抗体或其片段，其抑制包含所述GDF15蛋白、所述GFRAL蛋白和/或所述RET蛋白的复合物的形成。
6.权利要求1的单克隆抗体或其片段，其干扰所述GDF15蛋白与所述GFRAL蛋白之间的相互作用。
7.权利要求1的单克隆抗体或其片段，其干扰所述RET蛋白与所述GFRAL蛋白之间的相互作用。
8.权利要求1的单克隆抗体或其片段，其调节所述GDF15蛋白的活性，或包含所述GDF15蛋白、所述GFRAL蛋白和/或所述RET蛋白的复合物的活性和/或信号转导。
9.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白并包含一种或更多种以下特征：
a.结合所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的结构域1内的一个或更多个氨基酸残基；
b.结合所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的结构域2内的一个或更多个氨基酸残基；
c.结合所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的结构域3内的一个或更多个氨基酸残基；
d.抑制GDF15蛋白与所述GFRAL蛋白的结合；
e.抑制RET蛋白与所述GFRAL蛋白的结合。
f.抑制包含GDF15蛋白、GFRAL蛋白和/或RET蛋白的复合物的形成；
g.干扰GDF15蛋白与所述GFRAL蛋白之间的相互作用；
h.干扰RET蛋白与所述GFRAL蛋白之间的相互作用；
i.调节包含GDF15蛋白、GFRAL蛋白和/或RET蛋白的复合物的活性和/或信号转导。
10.权利要求9的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段结合所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的残基Q20到E351之间并包括残基Q20到E351的氨基酸序列。
11.权利要求9的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段结合所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的残基Q20到S130之间并包括残基Q20到S130的氨基酸序列。
12.权利要求9的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段结合所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的残基C131到C210之间并包括残基C131到C210的氨基酸序列。
13.权利要求9的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段结合所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的残基C220到C316之间并包括残基C220到C316的氨基酸序列。
14.权利要求9的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.重链可变(VH)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：49、57、488、489、490、491、492、493、494、495、496、1795和1796构成的组的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513和514构成的组的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529和530构成的组的氨基酸序列的VH CDR3；
和/或
b.轻链可变(VL)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545和546构成的组的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：547、548、549、550、551、552、553、554、555、556和557构成的组的组织序列的VL CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：558、559、560、561、562、563、534、565、566、567、568和569构成的组的氨基酸序列的VL CDR3。
15.权利要求14的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.重链可变(VH)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：49、57、488、489、490、491、492、493、494、495、496、1795和1796构成的组的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513和514构成的组的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529和530构成的组的氨基酸序列的VH CDR3。
16.权利要求14的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.轻链可变(VL)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545和546构成的组的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：547、548、549、550、551、552、553、554、555、556和557构成的组的组织序列的VL CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：558、559、560、561、562、563、534、565、566、567、568和569构成的组的氨基酸序列的VL CDR3。
17.权利要求14到16的任一项的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段进一步包含：
a.VH区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：570-578构成的组的氨基酸序列的VH FR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：579-602构成的组的氨基酸序列的VH FR2；
iii.具有选自由SEQ ID NO：603-1726构成的组的氨基酸序列的VH FR3和
iv.具有选自由SEQ ID NO：1727和1728构成的组的氨基酸序列的VH FR4；
和/或
b.VL区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：1729-1750构成的组的氨基酸序列的VL FR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：1751-1777构成的组的氨基酸序列的VL FR2；
iii.具有选自由SEQ ID NO：1778-1792构成的组的氨基酸序列的VL FR3和
iv.具有选自由SEQ ID NO：1793和1794构成的组的氨基酸序列的VL FR4。
18.权利要求17的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段进一步包含：
a.VH区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：570-578构成的组的氨基酸序列的VH FR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：579-602构成的组的氨基酸序列的VH FR2；
iii.具有选自由SEQ ID NO：603-1726构成的组的氨基酸序列的VH FR3和
iv.具有选自由SEQ ID NO：1727和1728构成的组的氨基酸序列的VH FR4。
19.权利要求17的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段进一步包含：
a.VL区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：1729-1750构成的组的氨基酸序列的VL FR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：1751-1777构成的组的氨基酸序列的VL FR2；
iii.具有选自由SEQ ID NO：1778-1792构成的组的氨基酸序列的VL FR3和
iv.具有选自由SEQ ID NO：1793和1794构成的组的氨基酸序列的VL FR4。
20.权利要求9的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.重链可变(VH)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：41、42、43、44、45、49、51、52、53、54、55、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、82、83、84、85、100、101、102、103、104、110、111、112、113、114、115、116、117、118和119构成的组的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：132、133、134、135、136、142、143、144、145、146、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、172、173、174、175、176、196、197、198、199、200、201、202、203、204和220构成的组的氨基酸序列的VHCDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：221、222、223、224、229、230、231、232、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、257、258、259、260、277、278、279、280、281、282、283和284构成的组的氨基酸序列的VH CDR3；
和/或
b.轻链可变(VL)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：297、298、299、300、305、306、307、308、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359和360构成的组的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：373、374、375、379、380、381、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、398、399、400、407、410、411、412、413、414和415构成的组的氨基酸序列的VL CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：423、424、425、429、430、431、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、450、451、452、465、466、467、468、469和470构成的组的氨基酸序列的VL CDR3。
21.权利要求20的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.重链可变(VH)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：41、42、43、44、45、49、51、52、53、54、55、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、82、83、84、85、100、101、102、103、104、110、111、112、113、114、115、116、117、118和119构成的组的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：132、133、134、135、136、142、143、144、145、146、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、172、173、174、175、176、196、197、198、199、200、201、202、203、204和220构成的组的氨基酸序列的VHCDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：221、222、223、224、229、230、231、232、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、257、258、259、260、277、278、279、280、281、282、283和284构成的组的氨基酸序列的VH CDR3。
22.权利要求20的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.轻链可变(VL)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：297、298、299、300、305、306、307、308、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359和360构成的组的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：373、374、375、379、380、381、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、398、399、400、407、410、411、412、413、414和415构成的组的氨基酸序列的VL CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：423、424、425、429、430、431、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、450、451、452、465、466、467、468、469和470构成的组的氨基酸序列的VL CDR3。
23.权利要求9的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.重链可变(VH)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：49、60、61、62、63、69、70和71构成的组的氨基酸序列的VHCDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：152、153、154、155、156、161、162、163、164和165构成的组的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：237、238、239、240、245、246、247和248构成的组的氨基酸序列的VH CDR3；
和/或
b.轻链可变(VL)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：313、314、315、316、321、322、323和324构成的组的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：385、386、387、391和392构成的组的氨基酸序列的VL CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：435、436、437、441、442和443构成的组的氨基酸序列的VLCDR3。
24.权利要求9的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.重链可变(VH)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：41、42、43、44、45、49、51、52、53、54、55、64、65、66、67、68、72、73、74、75、76、82、83、84、85、100、101、102、103、104、110、111、112、113、114、115、116、117、118和119构成的组的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：132、133、134、135、136、142、143、144、145、146、157、158、159、160、166、167、168、169、170、172、173、174、175、176、196、197、198、199、200、201、202、203、204和220构成的组的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：221、222、223、224、229、230、231、232、241、242、243、244、249、250、251、252、257、258、259、260、277、278、279、280、281、282、283和284构成的组的氨基酸序列的VH CDR3；
和/或
b.轻链可变(VL)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：297、298、299、300、305、306、307、308、317、318、319、320、325、326、327、328、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359和360构成的组的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：373、374、375、379、380、381、386、388、389、390、393、394、398、399、400、407、410、411、412、413、414和415构成的组的氨基酸序列的VL CDR2；
iii.具有选自由SEQ ID NO：423、424、425、429、430、431、438、439、440、444、445、446、450、451、452、465、466、467、468、469和470构成的组的氨基酸序列的VL CDR3。
25.权利要求24的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.VH区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：72、73、74、75和76构成的组的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：166、167、168、169和170构成的组的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：249、250、251和252构成的组的氨基酸序列的VH CDR3；
和
b.VL区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：325、326、327和328构成的组的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：386、393和394构成的组的氨基酸序列的VL CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：444、445和446构成的组的氨基酸序列的VL CDR3。
26.权利要求24的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.VH区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：64、65、66、67和68构成的组的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：157、158、159、160和220构成的组的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：241、242、243和244构成的组的氨基酸序列的VH CDR3；
和
b.VL区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：317、318、319和320构成的组的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：388、389和390构成的组的氨基酸序列的VL CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：438、439和440构成的组的氨基酸序列的VL CDR3。
27.权利要求20到26的任一项的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段进一步包含：
a.VH区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：570-572和578构成的组的氨基酸序列的VH FR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：579-581、589、590、592、601和602构成的组的氨基酸序列的VH FR2；
iii.具有选自由SEQ ID NO：603-1643、1679-1714、1723-1726构成的组的氨基酸序列的VH FR3和
iv.具有选自由SEQ ID NO：1727和1728构成的组的氨基酸序列的VH FR4；
和/或
b.VL区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：1729-1732、1735-1740、1749和1750构成的组的氨基酸序列的VL FR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：1751-1773、1776和1777构成的组的氨基酸序列的VL FR2；
iii.具有选自由SEQ ID NO：1778-1780和1792构成的组的氨基酸序列的VL FR3和
iv.具有选自由SEQ ID NO：1793和1794构成的组的氨基酸序列的VL FR4。
28.权利要求27的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段进一步包含：
a.VH区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：570-572和578构成的组的氨基酸序列的VH FR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：579-581、589、590、592、601和602构成的组的氨基酸序列的VH FR2；
iii.具有选自由SEQ ID NO：603-1643、1679-1714、1723-1726构成的组的氨基酸序列的VH FR3和
iv.具有选自由SEQ ID NO：1727和1728构成的组的氨基酸序列的VH FR4。
29.权利要求27的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段进一步包含：
a.VL区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：1729-1732、1735-1740、1749和1750构成的组的氨基酸序列的VL FR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：1751-1773、1776和1777构成的组的氨基酸序列的VL FR2；
iii.具有选自由SEQ ID NO：1778-1780和1792构成的组的氨基酸序列的VL FR3和
iv.具有选自由SEQ ID NO：1793和1794构成的组的氨基酸序列的VL FR4。
30.权利要求9的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.重链可变(VH)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：46、47、48、49、50、56、57、58、59、73、75、91、92、93、94、95、96、97、98、99、124、125、126、127、128、129、130和131构成的组的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：137、138、139、140、141、147、148、149、150、151、182、183、184、185、186、187、188、189、190、210、211、212、213、214、215、216、217、218和219构成的组的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：225、226、227、228、233、234、235、236、265、266、267、268、269、270、271、272、289、290、291、292、293、294、295和296构成的组的氨基酸序列的VHCDR3；
和/或
b.轻链可变(VL)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：301、302、303、304、309、310、311、312、341、342、343、344、345、346、347、348、365、366、367、368、369、370、371和372构成的组的氨基酸序列的VLCDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：376、377、378、382、383、384、385、386、403、404、405、406、418、419、420、421和422构成的组的氨基酸序列的VL CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：426、427、428、432、433、434、456、457、458、459、460、461、474、475、476、477、478和479构成的组的氨基酸序列的VL CDR3。
31.权利要求30的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.重链可变(VH)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：46、47、48、49、50、56、57、58、59、73、75、91、92、93、94、95、96、97、98、99、124、125、126、127、128、129、130和131构成的组的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：137、138、139、140、141、147、148、149、150、151、182、183、184、185、186、187、188、189、190、210、211、212、213、214、215、216、217、218和219构成的组的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：225、226、227、228、233、234、235、236、265、266、267、268、269、270、271、272、289、290、291、292、293、294、295和296构成的组的氨基酸序列的VHCDR3。
32.权利要求30的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.轻链可变(VL)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：301、302、303、304、309、310、311、312、341、342、343、344、345、346、347、348、365、366、367、368、369、370、371和372构成的组的氨基酸序列的VLCDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：376、377、378、382、383、384、385、386、403、404、405、406、418、419、420、421和422构成的组的氨基酸序列的VL CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：426、427、428、432、433、434、456、457、458、459、460、461、474、475、476、477、478和479构成的组的氨基酸序列的VL CDR3。
33.权利要求30的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.VH区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：46、47、48、49和50构成的组的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：137、138、139、140和141构成的组的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：225、226、227和228构成的组的氨基酸序列的VL CDR3；
和
b.VL区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：301、302、303和304构成的组的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：376、377和378构成的组的氨基酸序列的VL CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：426、427和428构成的组的氨基酸序列的VL CDR3。
34.权利要求30的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.VH区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：49、56、57、58和59构成的组的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：147、148、149、150和151构成的组的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：233、234、235和236构成的组的氨基酸序列的VH CDR3；
和
b.VL区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：309、310、311和312构成的组的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：382、383和384构成的组的氨基酸序列的VL CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：432、433和434构成的组的氨基酸序列的VL CDR3。
35.权利要求30到34的任一项的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段进一步包含：
a.VH区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：572-577构成的组的氨基酸序列的VH FR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：581-600构成的组的氨基酸序列的VH FR2；
iii.具有选自由SEQ ID NO：1643-1685、1715-1722构成的组的氨基酸序列的VH FR3和
iv.具有选自由SEQ ID NO：1727和1728构成的组的氨基酸序列的VH FR4；
和/或
b.VL区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：1729、1730、1733、1734、1741-1748构成的组的氨基酸序列的VL FR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：1751、1752、1755、1758、1774-1776构成的组的氨基酸序列的VL FR2；
iii.具有选自由SEQ ID NO：1778、1780-1791构成的组的氨基酸序列的VL FR3和
iv.具有选自由SEQ ID NO：1793和1794构成的组的氨基酸序列的VL FR4。
36.权利要求35的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段进一步包含：
a.VH区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：572-577构成的组的氨基酸序列的VH FR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：581-600构成的组的氨基酸序列的VH FR2；
iii.具有选自由SEQ ID NO：1643-1685、1715-1722构成的组的氨基酸序列的VH FR3和
iv.具有选自由SEQ ID NO：1727和1728构成的组的氨基酸序列的VH FR4。
37.权利要求35的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段进一步包含：
a.VL区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：1729、1730、1733、1734、1741-1748构成的组的氨基酸序列的VL FR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：1751、1752、1755、1758、1774-1776构成的组的氨基酸序列的VL FR2；
iii.具有选自由SEQ ID NO：1778、1780-1791构成的组的氨基酸序列的VL FR3和
iv.具有选自由SEQ ID NO：1793和1794构成的组的氨基酸序列的VL FR4。
38.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的结构域2内的一个或更多个氨基酸残基并且抑制GDF15蛋白与GFRAL蛋白的结合。
39.权利要求38的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段结合所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的残基C131到C210之间并包括残基C131到C210的氨基酸序列。
40.权利要求38或39的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.重链可变(VH)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：41、42、43、44、45、49、51、52、53、54、55、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、82、83、84、85、100、101、102、103、104、110、111、112、113、114、115、116、117、118和119构成的组的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：132、133、134、135、136、142、143、144、145、146、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、172、173、174、175、176、196、197、198、199、200、201、202、203、204和220构成的组的氨基酸序列的VHCDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：221、222、223、224、229、230、231、232、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、257、258、259、260、277、278、279、280、281、282、283和284构成的组的氨基酸序列的VH CDR3；
和/或
b.轻链可变(VL)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：297、298、299、300、305、306、307、308、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359和360构成的组的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：373、374、375、379、380、381、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、398、399、400、407、410、411、412、413、414和415构成的组的氨基酸序列的VL CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：423、424、425、429、430、431、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、450、451、452、465、466、467、468、469和470构成的组的氨基酸序列的VL CDR3。
41.权利要求45到48的任一项的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.重链可变(VH)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：49、60、61、62、63、69、70和71构成的组的氨基酸序列的VHCDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：152、153、154、155、156、161、162、163、164和165构成的组的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：237、238、239、240、245、246、247和248构成的组的氨基酸序列的VH CDR3；
和/或
b.轻链可变(VL)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：313、314、315、316、321、322、323和324构成的组的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：385、386、387、391和392构成的组的氨基酸序列的VL CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：435、436、437、441、442和443 构成的组的氨基酸序列的VLCDR3。
42.权利要求45到48的任一项的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段、包含：
a.重链可变(VH)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：41、42、43、44、45、49、51、52、53、54、55、64、65、66、67、68、72、73、74、75、76、82、83、84、85、100、101、102、103、104、110、111、112、113、114、115、116、117、118和119构成的组的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：132、133、134、135、136、142、143、144、145、146、157、158、159、160、166、167、168、169、170、172、173、174、175、176、196、197、198、199、200、201、202、203、204和220构成的组的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：221、222、223、224、229、230、231、232、241、242、243、244、249、250、251、252、257、258、259、260、277、278、279、280、281、282、283和284构成的组的氨基酸序列的VH CDR3；
和/或
b.轻链可变(VL)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：297、298、299、300、305、306、307、308、317、318、319、320、325、326、327、328、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359和360构成的组的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：373、374、375、379、380、381、386、388、389、390、393、394、398、399、400、407、410、411、412、413、414和415构成的组的氨基酸序列的VL CDR2；
iii.具有选自由SEQ ID NO：423、424、425、429、430、431、438、439、440、444、445、446、450、451、452、465、466、467、468、469和470构成的组的氨基酸序列的VL CDR3。
43.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的结构域3内的一个或更多个氨基酸残基并且抑制RET蛋白与GFRAL蛋白的结合。
44.权利要求43的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段结合所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的残基C220到C316之间并包括残基C220到C316的氨基酸序列。
45.权利要求43或44的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.重链可变(VH)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：46、47、48、49、50、56、57、58、59、73、75、91、92、93、94、95、96、97、98、99、124、125、126、127、128、129、130和131构成的组的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：137、138、139、140、141、147、148、149、150、151、182、183、184、185、186、187、188、189、190、210、211、212、213、214、215、216、217、218和219构成的组的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：225、226、227、228、233、234、235、236、265、266、267、268、269、270、271、272、289、290、291、292、293、294、295和296构成的组的氨基酸序列的VHCDR3；
和/或
b.轻链可变(VL)区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：301、302、303、304、309、310、311、312、341、342、343、344、345、346、347、348、365、366、367、368、369、370、371和372构成的组的氨基酸序列的VLCDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：376、377、378、382、383、384、385、386、403、404、405、406、418、419、420、421和422构成的组的氨基酸序列的VL CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：426、427、428、432、433、434、456、457、458、459、460、461、474、475、476、477、478和479构成的组的氨基酸序列的VL CDR3。
46.一种单克隆抗体或其片段，其结合选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197和GLN200构成的组的一个或更多个残基，并且抑制所述GFRAL蛋白与GDF15蛋白的结合。
47.一种单克隆抗体或其片段，其结合选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的SER156、GLN147、SER150、TYR151、ALA154、CYS155、PHE174、TYR175、ALA137、CYS138、ASP141、VAL143、CYS144、LEU186、CYS189、CYS191、ALA192、GLN193、SER194、ASP195、CYS198、GLN199、LYS202、GLU203、HIS206、SER207、SER130、CYS131、LEU132、GLU133和VAL134 构成的组的一个或更多个残基，并且抑制所述GFRAL蛋白与GDF15蛋白的结合。
48.一种单克隆抗体或其片段，其结合选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的SER156、GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、LEU152、LYS153、ALA154、CYS155、PHE174、TYR175、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、LEU186、CYS189、CYS191、ALA192、GLN193、SER194、ASP195、ILE196、PRO197、CYS198、GLN199、GLN200、SER201、LYS202、GLU203、ALA204、LEU205、HIS206、SER207、SER130、CYS131、LEU132、GLU133、VAL134和ALA135构成的组的一个或更多个残基，并且抑制所述GFRAL蛋白与GDF15蛋白的结合。
49.权利要求46到48的任一项的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.VH区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：72、73、74、75和76构成的组的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：166、167、168、169和170构成的组的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：249、250、251和252构成的组的氨基酸序列的VH CDR3；
和
b.VL区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：325、326、327和328构成的组的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：386、393和394构成的组的氨基酸序列的VL CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：444、445和446构成的组的氨基酸序列的VL CDR3。
50.一种单克隆抗体或其片段，其结合选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的GLU136、ALA137、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、PHE173、ASN177、ILE178、PRO179、ASN181、ILE182和MET185构成的组的一个或更多个残基，并且抑制所述GFRAL蛋白与GDF15蛋白的结合。
51.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的LEU132、GLU133、VAL134、ALA135、CYS138、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、PHE174、TYR175、ALA169、ALA170、ILE171、ARG172、GLN176、PHE180、ALA183、GLN184、LEU186、ALA187、PHE188和CYS189构成的组的一个或更多个残基，并且抑制所述GFRAL蛋白与GDF15蛋白的结合。
52.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的LEU132、GLU133、VAL134、ALA135、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、PHE174、TYR175、ALA169、ALA170、ILE171、ARG172、PHE173、GLN176、ASN177、ILE178、PRO179、PHE180、ASN181、ILE182、ALA183、GLN184、MET185、LEU186、ALA187、PHE188和CYS189构成的组的一个或更多个残基，并且抑制所述GFRAL蛋白与GDF15蛋白的结合。
53.权利要求50到52的任一项的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.VH区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：64、65、66、67和68构成的组的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：157、158、159、160和220构成的组的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：241、242、243和244构成的组的氨基酸序列的VH CDR3；
和
b.VL区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：317、318、319和320构成的组的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：388、389和390构成的组的氨基酸序列的VL CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：438、439和440构成的组的氨基酸序列的VL CDR3。
54.一种单克隆抗体或其片段，其结合选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、GLN298和SER299构成的组一个或更多个残基，并且抑制所述GFRAL与RET蛋白的结合。
55.一种单克隆抗体或其片段，其结合选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的ILE224、ARG225、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、VAL248、THR249、HIS253、GLU254、SER263、LYS264、GLN265、ASP266、LEU267、THR268、THR295、ILE296、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、ILE306、PHE307和MET310构成的组的一个或更多个残基，并且抑制所述GFRAL蛋白与RET蛋白的结合。
56.一种单克隆抗体或其片段，其结合选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的ILE224、ARG225、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、GLN246、ARG247、VAL248、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、GLU254、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、SER263、LYS264、GLN265、ASP266、LEU267、THR268、THR295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、ILE306、PHE307和MET310构成的组的一个或更多个残基，并且抑制所述GFRAL蛋白与RET蛋白的结合。
57.一种单克隆抗体或其片段，其结合选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的MET214、PRO216、PRO217、GLN290、CYS291、THR292、CYS293、ARG294、THR295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU301、LYS305、GLN308、HIS309、HIS312和SER315构成的组一个或更多个残基，并且抑制所述GFRAL与RET蛋白的结合。
58.一种单克隆抗体或其片段，其结合选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的GLN298和GLU301构成的组的一个或更多个残基，并且抑制所述GFRAL蛋白与RET蛋白的结合。
59.一种单克隆抗体或其片段，其结合选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的LEU164、LYS208、VAL212、ASN213、VAL215、PRO218、THR219、CYS220、LEU221、VAL223、TRP245、LEU267、CYS269、GLN288、VAL289、GLU300、SER302、LEU303、CYS304、ILE306、PHE307、MET310、LEU311、ARG313、LYS314、CYS316和PHE317构成的组的一个或更多个残基，并且抑制所述GFRAL蛋白与RET蛋白的结合。
60.一种单克隆抗体或其片段，其结合选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的LEU164、LYS208、VAL212、ASN213、MET214、VAL215、PRO216、PRO217、PRO218、THR219、CYS220、LEU221、VAL223、TRP245、LEU267、CYS269、GLN28、VAL289、GLN290、CYS291、THR292、CYS293、ARG294、THR295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、CYS304、LYS305、ILE306、PHE307、GLN308、HIS309、MET310、LEU311、HIS312、ARG313、LYS314、SER315、CYS316、PHE317构成的组的一个或更多个残基，并且抑制所述GFRAL蛋白与RET蛋白的结合。
61.权利要求57到60的任一项的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.VH区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：46、47、48、49和50构成的组的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：137、138、139、140和141构成的组的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：225、226、227和228构成的组的氨基酸序列的VH CDR3；
和
b.VL区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：301、302、303和304构成的组的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：376、377和378构成的组的氨基酸序列的VL CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：426、427和428构成的组的氨基酸序列的VL CDR3。
62.一种单克隆抗体或其片段，其结合选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的ARG234、ARG238、GLN241、SER242、LYS243、TRP245、GLN246、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、ASP255、ASN257、CYS258、SER260、THR261和LEU262构成的组一个或更多个残基，并且抑制所述GFRAL与RET蛋白的结合。
63.一种单克隆抗体或其片段，其结合选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的GLN246、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、ASN257、CYS258、SER260、THR261和LEU262构成的组一个或更多个残基，并且抑制所述GFRAL与RET蛋白的结合。
64.一种单克隆抗体或其片段，其结合选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的CYS233、ARG235、HIS236、TYR237、THR239、PHE240、CYS244、ARG247、VAL248、GLU254、GLU256、ILE259、SER263、LYS264、ASP266、LEU267、THR268、SER272、ASP274、CYS275、ALA278、CYS269、SER270、SER302、LEU303、ILE306、HIS309、LEU311、MET310、SER315和CYS316构成的组的一个或更多个残基，并且抑制所述GFRAL蛋白与RET蛋白的结合。
65.一种单克隆抗体或其片段，其结合选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的CYS233、ARG234、ARG235、HIS236、TYR237、ARG238、THR239、PHE240、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、GLN246、ARG247、VAL248、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、GLU254、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、SER263、LYS264、ASP266、LEU267、THR268、SER272、ASP274、CYS275、ALA278、CYS269、SER270、SER302、LEU303、ILE306、HIS309、LEU311、MET310、SER315和CYS316构成的组的一个或更多个残基，并且抑制所述GFRAL蛋白与GDF15蛋白的结合。
66.权利要求62到65的任一项的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：
a.VH区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：49、56、57、58和59构成的组的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：147、148、149、150和151构成的组的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：233、234、235和236构成的组的氨基酸序列的VH CDR3；
和
b.VL区，其包含：
i.具有选自由SEQ ID NO：309、310、311和312构成的组的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有选自由SEQ ID NO：382、383和384构成的组的氨基酸序列的VL CDR2；和
iii.具有选自由SEQ ID NO：432、433和434构成的组的氨基酸序列的VL CDR3。
67.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白的表位，其中所述表位包含选自由所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197和GLN200构成的组的一个或更多个残基，并且其中所述抗体或其片段抑制所述GFRAL蛋白与GDF15蛋白的结合。
68.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白的表位，其中所述表位包含选自由所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的SER156、GLN147、SER150、TYR151、ALA154、CYS155、PHE174、TYR175、ALA137、CYS138、ASP141、VAL143、CYS144、LEU186、CYS189、CYS191、ALA192、GLN193、SER194、ASP195、CYS198、GLN199、LYS202、GLU203、HIS206、SER207、SER130、CYS131、LEU132、GLU133和VAL134构成的组的一个或更多个残基，并且其中所述抗体或其片段抑制所述GFRAL蛋白与GDF15蛋白的结合。
69.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白的表位，其中所述表位包含选自由所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的SER156、GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、LEU152、LYS153、ALA154、CYS155、PHE174、TYR175、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、LEU186、CYS189、CYS191、ALA192、GLN193、SER194、ASP195、ILE196、PRO197、CYS198、GLN199、GLN200、SER201、LYS202、GLU203、ALA204、LEU205、HIS206、SER207、SER130、CYS131、LEU132、GLU133、VAL134和ALA135构成的组的一个或更多个残基，并且其中所述抗体或其片段抑制所述GFRAL蛋白与GDF15蛋白的结合。
70.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白的表位，其中所述表位包含选自由所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的GLU136、ALA137、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、PHE173、ASN177、ILE178、PRO179、ASN181、ILE182和MET185构成的组的一个或更多个残基，并且其中所述抗体或其片段抑制所述GFRAL蛋白与GDF15蛋白的结合。
71.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白的表位，其中所述表位包含选自由所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的LEU132、GLU133、VAL134、ALA135、CYS138、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、PHE174、TYR175、ALA169、ALA170、ILE171、ARG172、GLN176、PHE180、ALA183、GLN184、LEU186、ALA187、PHE188和CYS189构成的组的一个或更多个残基，并且其中所述抗体或其片段抑制所述GFRAL蛋白与GDF15蛋白的结合。
72.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白的表位，其中所述表位包含选自由所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的LEU132、GLU133、VAL134、ALA135、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、PHE174、TYR175、ALA169、ALA170、ILE171、ARG172、PHE173、GLN176、ASN177、ILE178、PRO179、PHE180、ASN181、ILE182、ALA183、GLN184、MET185、LEU186、ALA187、PHE188和CYS189构成的组的一个或更多个残基，并且其中所述抗体或其片段抑制所述GFRAL蛋白与GDF15蛋白的结合。
73.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白的表位，其中所述表位包含选自由所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、GLN298和SER299构成的组的一个或更多个残基，并且其中所述抗体或其片段抑制所述GFRAL蛋白与RET蛋白的结合。
74.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白的表位，其中所述表位包含选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的ILE224、ARG225、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、VAL248、THR249、HIS253、GLU254、SER263、LYS264、GLN265、ASP266、LEU267、THR268、THR295、ILE296、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、ILE306、PHE307和MET310构成的组的一个或更多个残基，以及其中所述抗体或其片段抑制所述GFRAL蛋白与RET蛋白的结合。
75.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白的表位，其中所述表位包含选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的ILE224、ARG225、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、GLN246、ARG247、VAL248、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、GLU254、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、SER263、LYS264、GLN265、ASP266、LEU267、THR268、THR295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、ILE306、PHE307和MET310构成的组的一个或更多个残基，以及其中所述抗体或其片段抑制所述GFRAL蛋白与RET蛋白的结合。
76.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白的表位，其中所述表位包含选自由所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的MET214、PRO216、PRO217、GLN290、CYS291、THR292、CYS293、ARG294、THR295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU301、LYS305、GLN308、HIS309、HIS312和SER315构成的组的一个或更多个残基，并且其中所述抗体或其片段抑制所述GFRAL蛋白与RET蛋白的结合。
77.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白的表位，其中所述表位包含选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的GLN298或GLU301构成的组的一个或更多个残基，并且其中所述抗体或其片段抑制所述GFRAL蛋白与RET蛋白的结合。
78.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白的表位，其中所述表位包含选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的LEU164、LYS208、VAL212、ASN213、VAL215、PRO218、THR219、CYS220、LEU221、VAL223、TRP245、LEU267、CYS269、GLN288、VAL289、GLU300、SER302、LEU303、CYS304、ILE306、PHE307、MET310、LEU311、ARG313、LYS314、CYS316和PHE317构成的组的一个或更多个残基，以及其中所述抗体或其片段抑制所述GFRAL蛋白与RET蛋白的结合。
79.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白的表位，其中所述表位包含选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的LEU164、LYS208、VAL212、ASN213、MET214、VAL215、PRO216、PRO217、PRO218、THR219、CYS220、LEU221、VAL223、TRP245、LEU267、CYS269、GLN28、VAL289、GLN290、CYS291、THR292、CYS293、ARG294、THR295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、CYS304、LYS305、ILE306、PHE307、GLN308、HIS309、MET310、LEU311、HIS312、ARG313、LYS314、SER315、CYS316、PHE317构成的组的一个或更多个残基，以及其中所述抗体或其片段抑制所述GFRAL蛋白与RET蛋白的结合。
80.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白的表位，其中所述表位包含选自由所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的ARG234、ARG238、GLN241、SER242、LYS243、TRP245、GLN246、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、ASP255、ASN257、CYS258、SER260、THR261和LEU262构成的组的一个或更多个残基，并且其中所述抗体或其片段抑制所述GFRAL蛋白与RET蛋白的结合。
81.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白的表位，其中所述表位包含选自由所述GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的GLN246、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、ASN257、CYS258、SER260、THR261或LEU262构成的组的一个或更多个残基，并且其中所述抗体或其片段抑制所述GFRAL蛋白与RET蛋白的结合。
82.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白的表位，其中所述表位包含选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的CYS233、ARG235、HIS236、TYR237、THR239、PHE240、CYS244、ARG247、VAL248、GLU254、GLU256、ILE259、SER263、LYS264、ASP266、LEU267、THR268、SER272、ASP274、CYS275、ALA278、CYS269、SER270、SER302、LEU303、ILE306、HIS309、LEU311、MET310、SER315和CYS316构成的组的一个或更多个残基，以及其中所述抗体或其片段抑制所述GFRAL蛋白与RET蛋白的结合。
83.一种单克隆抗体或其片段，其结合GFRAL蛋白的表位，其中所述表位包含选自由GFRAL蛋白(SEQ ID NO：1797)的CYS233、ARG234、ARG235、HIS236、TYR237、ARG238、THR239、PHE240、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、GLN246、ARG247、VAL248、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、GLU254、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、SER263、LYS264、ASP266、LEU267、THR268、SER272、ASP274、CYS275、ALA278、CYS269、SER270、SER302、LEU303、ILE306、HIS309、LEU311、MET310、SER315和CYS316构成的组的一个或更多个残基，以及其中所述抗体或其片段抑制所述GFRAL蛋白与RET蛋白的结合。
84.权利要求1到83的任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体以小于或等于5×10- 9M的KD结合GFRAL。
85.权利要求1到84的任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体抑制所述GFRAL蛋白与GDF15蛋白的结构域或RET蛋白的结构域的结合达至少80％。
86.权利要求1到85的任一项的单克隆抗体或片段，其中所述单克隆抗体是人源化的、人的或嵌合的抗体。
87.权利要求1到85的任一项的抗体或其片段，其中所述片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、(scFv)2、单链抗体分子、双可变区抗体、单可变区抗体、线性抗体、V区或由抗体片段形成的多特异性抗体。
88.权利要求1到87的任一项的抗体或片段，其中所述抗体或片段结合到可检测标志物。
89.权利要求88的抗体或片段，其中所述可检测标志物选自放射性同位素、金属螯合物、酶、荧光化合物、生物发光化合物和化学发光化合物。
90.一种产生权利要求1到87的任一项的抗体的转基因动物。
91.一种产生权利要求1到87的任一项的抗体的杂交瘤。
92.一种载体，其包含编码权利要求1到87的任一项的抗体或其片段的多核苷酸。
93.一种药物组合物，其包含权利要求1到87的任一项的抗体或其片段，以及药学上可接受的载体。
94.一种在对象调节GDF15介导的疾病或失调的方法，包括向所述对象施用结合GFRAL的抗体或其片段、或包含所述抗体或其片段的药物组合物。
95.权利要求94的方法，其中所述抗体或其片段是权利要求1到87的任一项的抗体或其片段。
96.一种治疗对象中的不自主体重损失、或预防有不自主体重损失风险的对象中的不自主体重损失的方法，所述方法包括向所述对象施用结合GFRAL的抗体或其片段、或包含所述抗体或其片段的药物组合物。
97.权利要求96的方法，其中所述抗体或其片段是权利要求1到87的任一项的抗体或其片段。
98.权利要求96或97的方法，其中所述对象患有恶病质。
99.权利要求96或97的方法，其中所述对象患有慢性疾病。
100.权利要求98的方法，其中所述慢性疾病选自由肝硬化、甲状腺机能亢进、帕金森氏病、癌症、慢性肾脏疾患、慢性阻塞性肺病、AIDS、肺结核、慢性炎症性疾病、脓毒症、肌肉消耗和神经性厌食构成的组。
101.一种在对象调节GDF15活性的方法，包括向所述对象施用结合GFRAL的抗体或其片段、或包含所述抗体或其片段的药物组合物。
102.权利要求102的方法，其中所述抗体或其片段是权利要求1到87的任一项的抗体或其片段。
103.权利要求101或102的方法，其中所述方法降低GDF15活性，所述对象具有提高的GDF15活性，或有发生提高的GDF15活性的风险。
104.权利要求101或102的方法，其中所述方法提高GDF15活性，所述对象具有降低的GDF15活性，或有发生降低的GDF15活性的风险。
105.权利要求1到87的任一项的抗体或其片段在制造药物中的用途，所述药物在对象中用于GDF15介导的疾病、失调或状况，包括向所述对象施用所述抗体或片段。
106.权利要求93的药物组合物用于在对象中治疗或预防GDF15介导的疾病、失调或状况的用途。
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