CN109476742A - Tl1a抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

公开了特异性结合受体TNF超家族成员15(TNFSF15)(也称为TL1A)的抗体。还描述了制备和使用抗TL1A抗体的方法。

Description

TL1A抗体及其用途

发明领域

本发明涉及针对TL1A的抗体、以及制备和使用此类抗体的方法。预期所述抗体在治疗免疫系统疾病中特别有用。

发明背景

与肿瘤坏死因子(TNF)结构上相关的蛋白被统称为TNF超家族。TL1A (TNF超家族成员)是一种TNF样细胞因子，其结合死亡结构域受体(DR) 3，并为活化的淋巴细胞提供共刺激信号。通过这种相互作用，TL1A诱导IFN-γ的分泌，且因此可以参与T辅助-1-型效应物应答的发展。

TL1A是II型跨膜蛋白，且已被称为TNF超家族成员15 (TNFSF15)。TL1A主要由内皮细胞和单核细胞表达，且其表达可由TNF-a和IL-1a诱导(Migone等人, Immunity, 16:479-92 (2002))。TL1A被促炎细胞因子TNF和IL-1上调，且也被免疫复合物(IC)上调(Hsu等人,Exp. Cell Res., 292:241-51 (2004))。

TL1A经由其同源受体DR3(一种死亡受体，已知其活化诱导死亡和存活因子两者)介导信号传导。TL1A，与TNF一样，也被假定为作为同三聚可溶形式循环(Kim等人, J.Immunol. Methods, 298(1-2):1-8 (March 2005))。

TL1A以高亲和力结合死亡受体3 (DR3)，所述死亡受体3 (DR3)是含死亡-结构域的TNF受体家族的成员，且也被称为Wsl-1、Apo-3、TRAMP和LARD，且现在被称为TNF受体超家族成员25 (TNFRSF25)。取决于细胞背景，TL1A对DR3的连接可以触发两种信号传导途径(转录因子NF-kB的活化或胱天蛋白酶和细胞凋亡的活化)之一。TL1A在T细胞共刺激和Th1极化中发挥功能。对活化的T细胞，TL1A经由其表面结合的受体DR3特异性地发挥功能，以促进细胞存活和促炎细胞因子的分泌。分泌的诱饵受体3 (DcR3)，肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的可溶性蛋白，阻断TL1A的作用(Kim等人, "Identification of naturally secretedsoluble form of TL1A, a TNF-like cytokine," J Immunol Methods, 298:1-8(2005))。

因此，本领域仍需要可用于治疗多种炎性和免疫疾病和病症(诸如过敏/哮喘、类风湿性关节炎、多发性硬化症、克罗恩氏病、炎性肠病、系统性红斑狼疮(SLE)、银屑病、1型糖尿病和移植排斥)的组合物。涉及针对TL1A的单克隆抗体的本发明满足了这种需求。

发明概述

本发明涉及分离的抗体及其抗原结合片段，其特异性结合人TL1A并阻断与DR3的结合，由此抑制否则将在TL1A表达细胞中发生的免疫刺激信号。

本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，其与抗体10A4竞争结合人TL1A。

本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，其在表位处结合TL1A，所述表位包含残基102-116(SEQ ID NO:16)或166-180(SEQ ID NO:17)中的一个或多个。

本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，其在表位处结合TL1A，所述表位包含¹⁶⁹QAGR¹⁷²的残基中的一个或多个和¹¹³KNQF¹¹⁶的残基中的一个或多个。本发明的一个实施方案包括分离的抗体或其抗原结合片段，其在表位处结合TL1A，所述表位包含序列¹⁶⁹QAGR¹⁷²或¹¹³KNQF¹¹⁶。本发明的一个实施方案包括分离的抗体或其抗原结合片段，其在表位处结合TL1A，所述表位包含序列¹⁶⁹QAGR¹⁷²和¹¹³KNQF¹¹⁶。

本发明包括分离的抗TL1A抗体或其抗原结合片段，其实质上抑制人TL1A与DR3的结合。本发明的一个实施方案包括分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人和食蟹猴TL1A两者。

本发明包括结合TL1A的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO:7中所示的CDRH1序列；SEQ ID NO:8中所示的CDRH2序列；和SEQ ID NO.:9中所示的CDRH3序列。

本发明包括结合TL1A的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:12中所示的CDRL1序列；SEQ ID NO:13中所示的CDRL2序列；和SEQ ID NO.:14中所示的CDRL3序列。

本发明的一个实施方案包括结合TL1A的分离的抗体或其抗原结合片段，其含有包含如SEQ ID NO:7中所示的CDRH1序列；SEQ ID NO:8中所示的CDRH2序列；和SEQ ID NO:9中所示的CDRH3序列的重链可变结构域，以及包含SEQ ID NO:12中所示的CDRL1序列；SEQ IDNO:13中所示的CDRL2序列；和SEQ ID NO:14中所示的CDRL3序列的轻链可变结构域。

本发明包括分离的抗体或抗原结合片段，其包含一条或多条重链和一条或多条轻链，其中所述重链包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少80％序列同一性的重链可变区；且所述轻链包含与SEQ ID NO:11的序列具有至少80％序列同一性的轻链可变区。

本发明包括产生抗TL1A抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在允许产生所述抗体或片段的条件下培养用编码所述抗体或片段的重链和/或轻链可变区的表达载体转化的宿主细胞，和从所述细胞纯化所述抗体。

本发明的一个实施方案包括检测样品中TL1A的存在的方法，其包括在允许本发明的TL1A抗体或抗原结合片段和TL1A之间形成复合物的条件下使所述样品与所述抗体或片段接触，和检测所述复合物的形成。

附图简述

图1显示TL1A CHO细胞上单克隆抗体10A4.F7的滴定。将TL1A抗体的稀释液与10⁵个TL1A CHO细胞于100μl FACS缓冲液中孵育1小时。将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，且抗体结合通过用PE抗人Gig (Face特异性)抗体染色来检测，并通过FACS评估。EC50为0.40 nM。

图2显示抗体10A4.F7对TL1A与hDR3 CHO细胞的结合的抑制。将200 ng/ml (50ul)的TL1A SH6与10A4.F7 (50 ul)抗体或对照IgG1抗体的稀释液(所有试剂都在FACS缓冲液中)一起孵育。将混合物孵育30分钟，且然后添加至100μl FACS缓冲液中的10⁵个hDR3CHO细胞中并孵育1小时。将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次，并通过用PE抗6xHis抗体(R&Dsystems)染色细胞来检测TL1A与DR3 CHO细胞的结合，并通过FACS评估。该实验中的IC50为0.524 nM。

图3显示传感图。Hu-TL1A-His (250、200、150、100和50n)与10A4.F7，其捕获在蛋白G表面上。

图4：显示分箱图。

图5显示通过DSC的10A4.F7的物理稳定性。

图6显示TL1A.2-g4Pκ轻链核苷酸(SEQ ID NO:1)和氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。

图7显示重链核苷酸(SEQ ID NO:3)和氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。

图8显示10A4.F7 VH1区核苷酸(SEQ ID NO:5)和氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。指示了CDRH1 (SEQ ID NO:7)、CDRH2 (SEQ ID NO:8)和CDRH3 (SEQ ID NO:9)。

图9显示10A4.F7 VL1区核苷酸(SEQ ID NO:10)和氨基酸序列(SEQ ID NO:11)。指示了CDRL1 (SEQ ID NO:12)、CDRL2 (SEQ ID NO:13)和CDRL3 (SEQ ID NO:14)。

图10显示10A4的HDX-MS表位作图。表位区域加下划线。氨基酸85-101 (SEQ IDNO:15)、102- 116 (SEQ ID NO:16)和166-180 (SEQ ID NO:17)。

图11显示，两个肽区域(TL1A的氨基酸102-116和166-180)的代表性HDX动力学曲线显示10A4的显著保护(蓝色曲线vs红色曲线)。在另一方面，非表位区域72-84 (SEQ IDNO:18)显示mAb结合后氘摄取没有变化。

图12显示通过HDX鉴定的作图至TL1A结构上的TL1A的两个区域。

图13显示对于10A4 mAb具有FAB模型(红色= H链，粉红色= L链)的TL1A三聚体，其显示TL1A中的不连续表位将需要来自重链和轻链两者的相互作用。肽区域1(呈洋红色)和肽区域2(呈蓝色)形成暴露于溶剂的不连续表位。

优选实施方案的详述

本发明公开了分离的抗体，特别是单克隆抗体，例如，人单克隆抗体，其特异性结合人TL1A并阻断与DR3的结合，由此抑制否则将在TL1A表达细胞中发生的免疫刺激信号。本文提供了分离的抗体、制备此类抗体的方法和配制成含有所述抗体或片段的药物组合物。本文还提供了单独或与其他免疫抑制剂组合使用抗体用于免疫抑制的方法。因此，本文所述的抗huTL1A抗体可用于治疗各自各样的治疗应用，包括例如治疗免疫系统疾病。

定义

如本文所用的术语“抗体”可包括完整抗体和其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。在一个实施方案中，“抗体”指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合片段。每一重链由重链可变区(本文缩写为V_H)和重链恒定区构成。在某些天然存在的IgG、IgD和IgA抗体中，重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。在某些天然存在的抗体中，每一轻链由轻链可变区(本文缩写为V_L)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。V_H和V_L区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变的区域，其散布有称为框架区(FR)的更保守的区域。每一V_H和V_L由三个CDR和四个框架区(FR)构成，从氨基端向羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子、包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)的结合。

抗体通常以高亲和力特异性结合其同源抗原，通过10⁷-10^-11 M或更低的解离常数(K_D)来反映。任何大于约10^-6 M的K_D通常被认为表明非特异性结合。如本文所用，“特异性结合”抗原的抗体指以高亲和力结合抗原和实质上相同的抗原但不以高亲和力结合不相关抗原的抗体，所述高亲和力意指具有10^-7 M或更低、优选10^-8 M或更低、甚至更优选5 x 10^-9 M或更低、且最优选10^-8 M至10^-10 M或更低的K_D。如果抗原展示出与给定抗原高度的序列同一性，例如，如果其展示出与给定抗原序列至少80％、至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、或甚至更优选至少99%的序列同一性，则所述抗原与给定抗原是“实质上相同的”。例如，特异性结合人TL1A的抗体还可以与来自某些非人灵长类物种(例如食蟹猴)的TL1A交叉反应，但可以不与来自其他物种的TL1A或除TL1A之外的抗原交叉反应。

免疫球蛋白可以来自任何通常已知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG同种型在某些物种中分为亚类：在人中为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，和在小鼠中为IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。免疫球蛋白例如人IgG1以几种同种异型存在，其彼此之间在至多几个氨基酸上有所不同。“抗体”可以包括例如单克隆和多克隆抗体；嵌合和人源化抗体；人和非人抗体；全合成抗体；和单链抗体。

如本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”指保留特异性结合抗原(例如，人TL1A)的能力的抗体的一种或多种片段。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分/片段”中的结合片段的实例包括(i)Fab片段 - 由V_L、V_H、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii) a F(ab')₂片段 - 包含通过铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii) 由V_H和CH1结构域组成的Fd片段；(iv) 由抗体的单臂的V_L和V_H 结构域组成的Fv片段和(v) 由V_H结构域组成的dAb片段(Ward 等人, (1989) Nature 341:544-546)。分离的互补决定区(CDR)或通过合成接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合，可以包含抗体的抗原结合结构域(如果其能够结合抗原的话)。

除非另有说明，当关于抗体使用时，诸如在权利要求中，词语“片段”指抗体的抗原结合片段，使得“抗体或片段”具有如“其抗体或其抗原结合片段”的相同含义。

如本文所用，术语“单克隆抗体”指展示单一结合特异性和对于特定表位的亲和力的抗体或者抗体的组合物，在所述组合物中所有抗体均展示单一结合特异性和对于特定表位的亲和力。通常此类单克隆抗体将衍生自单一细胞或编码抗体的核酸，并且将在无有意引入任何序列改变的情况下增殖。因此，术语“人单克隆抗体”指具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和任选恒定区的单克隆抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体通过杂交瘤，例如通过将获自转基因或转染色体的非人动物(例如，具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因小鼠)的B细胞融合至无限增殖化细胞获得的杂交瘤，来产生。

如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如(a)从对于人免疫球蛋白基因为转基因的或转染色体的动物(例如小鼠)或从该动物制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞(例如从转染瘤)分离的抗体，(c)从重组组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式来制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体包含可变和恒定区，所述可变和恒定区利用由种系基因编码的特定人种系免疫球蛋白序列，但包括例如在抗体成熟过程中发生的随后的重排和突变。如现有技术(参见例如，Lonberg (2005) Nature Biotech.23(9):1117-1125)中已知，可变区包含抗原结合结构域，其由重排以形成对外源抗原特异性的抗体的各种基因编码。除了重排，可变区还可以进一步通过多个单一氨基酸改变(称为体细胞突变或超突变)来修饰以增加抗体对外源抗原的亲和力。恒定区将在进一步响应抗原中改变(即，同种型转换)。因此，编码响应于抗原的轻链和重链免疫球蛋白多肽的重排的和体细胞突变的核酸序列可以不与原始种系序列相同，而是会实质上相同或相似(即，具有至少80%同一性)。

“人”抗体(HuMAb)指具有其中框架区和CDR区域均衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自人种系免疫球蛋白序列。本文所述的抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”并不旨在包括这样的抗体，其中衍生自另一哺乳动物物种诸如小鼠的种系的CDR序列已经移植至人框架序列上。术语“人”抗体和“完全人”抗体同义使用。

短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异性的抗体”在本文中可与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。

如本文所用，“分离的抗体”意指实质上没有具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合TL1A的分离的抗体实质上没有特异性结合TL1A之外的抗原的抗体)。然而，特异性结合TL1A的表位的分离的抗体可以具有与来自不同物种的其他TL1A蛋白的交叉反应性。

如本文所用，“抑制TL1A与DR3的结合”的抗体指在本领域公认的方法中(例如基于FACS的细胞结合测定中)以以下EC50 抑制人TL1A与人DR3的结合的抗体：约1 µg/mL或更小、诸如约0.9 µg/mL或更小、约0.85 µg/mL或更小、约0.8 µg/mL或更小、约0.75 µg/mL或更小、约0.7 µg/mL或更小、约0.65 µg/mL或更小、约0.6 µg/mL或更小、约0.55 µg/mL或更小、约0.5 µg/mL或更小、约0.45 µg/mL或更小、约0.4 µg/mL或更小、约0.35 µg/mL或更小、约0.3 µg/mL或更小、约0.25 µg/mL或更小、约0.2 µg/mL或更小、约0.15 µg/mL或更小或约0.1 µg/mL。

术语“表位”或“抗原决定簇”指抗原(例如TL1A)上免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。蛋白抗原内的表位可以由连续的氨基酸(通常为线性表位)或通过蛋白的三级折叠而并列的不连续氨基酸(通常为构象表位)形成。由连续的氨基酸形成的表位通常(但并非总是如此)对变性溶剂保持暴露，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。表位通常包括独特空间构象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。

术语“表位作图”指鉴定参与抗体-抗原识别的抗原上的分子决定簇的方法。用于确定哪种表位被给定抗体所结合的方法是本领域中众所周知的并且包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定，其中测试来自(例如来自TL1A)的重叠或连续肽与给定抗体(例如抗TL1A抗体)的反应性；x射线晶体学；二维核磁共振；酵母展示；和HDX-MS(参见本文的实施例8)(参见例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E. Morris, 编辑(1996))。

关于两种或多种抗体的术语“结合相同表位”意指抗体结合氨基酸残基的相同区段，如通过给定方法所测定的。用于确定抗体是否与本文所述抗体结合“TL1A上相同的表位”的技术包括例如表位作图方法，诸如，抗原：抗体复合物的晶体的x射线分析，其提供表位的原子分辨率，和氢/氘交换质谱法(HDX-MS)(参见本文的实施例8)。其他方法监测抗体与抗原片段(例如蛋白水解片段)或抗原突变的变化形式(其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰导致的结合丧失通常认为是表位组分的指示)的结合，诸如丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells (1985) Science 244:1081)或突变体靶序列变体的酵母展示。此外，还可以使用用于表位作图的计算组合方法。这些方法依赖于目标抗体亲和力分离来自组合噬菌体展示肽文库的特异性短肽的能力。预期具有相同或密切相关的VH和VL或相同的CDR1、2和3序列的抗体结合相同的表位。

“与另一抗体竞争结合靶标”的抗体指(部分或完全)抑制其他抗体与靶标结合的抗体。两种抗体是否彼此竞争结合靶标，即一种抗体是否抑制另一抗体结合靶标且至何种程度，可以使用已知的竞争实验来确定。在某些实施方案中，抗体与另一抗体竞争结合靶标并使另一抗体与靶标的结合抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。抑制或竞争的水平可以取决于何种抗体是“阻断抗体”(即，首先与靶标孵育的冷抗体(coldantibody))而不同。竞争测定可以如例如以下中所述进行：Ed Harlow和David Lane, ColdSpring Harb.Protoc.；2006；doi:10.1101/pdb.prot4277或“Using Antibodies”，EdHarlow和David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY, USA 1999的第11章。竞争抗体结合相同表位、重叠表位或邻近表位(例如，如通过位阻所证明)。

其他竞争性结合测定包括：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见Stahli 等人(1983) Methods in Enzymology 9:242)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (参见Kirkland 等人(1986) J. Immunol.137:3614)；固相直接标记测定，固相直接标记夹心测定(参见Harlow和Lane (1988)Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel 等人(1988) Mol.Immunol.25(1):7)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (Cheung 等人(1990) Virology 176:546)；和直接标记的RIA (Moldenhauer 等人(1990) Scand.J. Immunol.32:77)。

如本文所用，术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”指抗体结合预定抗原上的表位但不结合其他抗原。通常，抗体(i)以约小于10^-7 M、诸如约小于10 ^-8 M、10^-9 M或10^-10 M或甚至更低的平衡解离常数(K_D)结合预定抗原，当通过例如表面等离子共振(SPR)技术在BIACORE^® 2000表面等离子共振仪器中使用预定抗原(例如重组人TL1A)作为分析物和抗体作为配体、或抗体结合抗原阳性细胞的Scatchard分析所测定时，和(ii)以是其对预定抗原或密切相关抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的亲和力的至少两倍的亲和力结合预定抗原。因此，“特异性结合人TL1A”的抗体指以10^-7 M或更低，诸如约小于10 ^-8 M、10^-9 M或10^-10 M或甚至更低的K_D 结合可溶性或细胞结合的人TL1A的抗体。“与食蟹猴TL1A交叉反应”的抗体指以10^-7 M或更低，诸如约小于10 ^-8 M、10^-9M或10^-10 M或甚至更低的K_D结合食蟹猴TL1A的抗体。

如本文所用，术语“k_assoc”或“k_a”指特定抗体-抗原相互作用的结合速率常数，而如本文所用的术语“k_dis”或“k_d,”指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。如本文所用，术语“K_D”指平衡解离常数，其获自k_d比k_a (即，k_d/k_a)的比率并且表示为摩尔浓度(M)。抗体的K_D值可以使用本领域充分建立的方法来测定。用于测定抗体的K_D 的优选方法是通过使用表面等离子共振，优选使用生物传感器系统诸如BIACORE^®表面等离子共振系统、或流式细胞术和Scatchard分析。

在使用抗体或其抗原结合片段的体外或体内测定的上下文中的术语“EC50”指诱导为50%最大响应的响应(即，最大响应和基线之间的一半)的抗体或其抗原结合片段的浓度。

术语“结合固定的TL1A”指本文所述的抗体结合TL1A，例如表达于细胞表面或连接于固体支持物的TL1A的能力。

如本文所用，术语“交叉反应”指本文所述的抗体结合来自不同物种的TL1A的能力。例如，结合人TL1A的本文所述的抗体也可结合来自另一物种的TL1A(例如食蟹猴TL1A)。如本文所用，交叉反应性可以通过在结合测定(例如SPR、ELISA)中用纯化的抗原检测特异性反应性或结合或以其他方式功能性地与生理表达TL1A的细胞相互作用来测量。用于测定交叉反应性的方法包括如本文所述的标准结合测定，例如通过BIACORE® 表面等离子共振(SPR)分析使用BIACORE® 2000 SPR仪器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)或流式细胞术技术。

如本文所用应用于对象的术语“天然存在的”指对象在自然界中可发现的事实。例如，存在于可以从自然界的来源中分离的生物(包括病毒)中且尚未在实验室中由人有目的地改变的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。

“多肽”指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，其对于链长度没有上限。蛋白中的一个或多个氨基酸残基可以含有修饰，诸如但不限于糖基化、磷酸化或二硫键。“蛋白”可以包含一种或多种多肽。

如本文所用的术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，并且可以是cDNA。

还提供的是对本文提供的抗体序列的“保守序列修饰”，即不消除由核苷酸序列编码的或含有氨基酸序列的抗体对抗原的结合的核苷酸和氨基酸序列修饰。例如，可以通过本领域已知的标准技术诸如定点诱变和PCR介导的诱变来引入修饰。保守序列修饰包括保守氨基酸取代，其中将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，抗TL1A抗体中预测的非必需氨基酸残基优选用来自相同侧链家族的另一氨基酸残基替代。鉴定不会消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域中众所周知的。参见例如，Brummell 等人, Biochem.32:1180-1187 (1993)；Kobayashi 等人Protein Eng. 12(10):879-884(1999)；和Burks 等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417 (1997))。

或者，在另一个实施方案中，可以将突变连同抗TL1A编码序列的全部或部分随机地引入，诸如通过饱和诱变，并且可以针对改进的结合活性来筛选所得的修饰的抗TL1A抗体。

对于核苷酸，术语“实质上同源性”表示当最优比对和比较时，两个核酸或其指定序列在至少约80%的核苷酸，通常至少约90%至95%、且最优选至少约98%至99.5%的核苷酸上是相同的，且具有合适的核苷酸插入或缺失。或者，当区段在选择性杂交条件下将与链的互补体杂交时，存在实质上同源性。

对于多肽，术语“实质上同源性”表示当最优比对和比较时，两个多肽或其指定序列在至少约80%的氨基酸，通常至少约90%至95%、且最优选至少约98%至99.5%的氨基酸上是相同的，且具有合适的氨基酸插入或缺失。

两个序列之间的百分比同一性是当序列最优比对时序列共有的相同位置的数目的函数(即，% 同一性 = 相同位置的#/位置的总# x 100)，且确定的最优比对考虑缺口的数目和每一缺口的长度，其需要被引入用于两个序列的最优比对。序列比较和两个序列之间的百分比同一性的确定可以使用数学算法完成，如在下文的非限制性实例中所述。

两个核苷酸序列之间的百分比同一性可以使用GCG软件包(在http://www.gcg.com处可得)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性还可以使用E. Meyers和W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))的算法来确定，所述算法已并入ALIGN程序(2.0版)中，其使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12且缺口罚分为4。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用Needleman和Wunsch (J. Mol.Biol.(48):444-453 (1970))算法测定，所述算法已并入GCG软件包(在http://www.gcg.com处可得)中的GAP程序，其使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，和16、14、12、10、8、6或4的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。

本文所述的核酸和蛋白序列可以进一步用作“询问序列”以进行针对公共数据库的检索以例如鉴定相关序列。此类序列可以使用以下的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)来进行：Altschul等人(1990) J. Mol.Biol.215:403-10。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序、评分=100、字长=12来进行以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白检索可以用XNBLAST程序、评分=50、字长=3来进行以获得与本文所述的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有缺口的比对，可以利用Gapped BLAST，如Altschul等人(1997) Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。

核酸可以存在于完整细胞中、细胞裂解物中、或部分纯化或实质上纯化形式中。当通过标准技术包括碱性/SDS处理、CsCl条带、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和本领域中众所周知的其他技术将核酸从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸(例如，染色体的其他部分)或蛋白中纯化时，所述核酸“被分离”或使所述核酸“实质上纯的”。参见F. Ausubel等人, 编辑 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing andWiley Interscience, New York (1987)。

可根据标准技术使核酸(例如cDNA)突变以提供基因序列。对于编码序列而言，此类突变可如期望的那样影响氨基酸序列。具体而言，涵盖与本文所述的天然V、D、J序列、恒定序列、转换序列及其他此类序列实质上同源或自它们衍生的DNA序列。

如本文所用，术语“载体”旨在指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指额外的DNA区段可以连入其中的环状双链的DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接入病毒基因组中。某些载体能够在它们导入其中的宿主细胞(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)中自主复制。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中后可以整合入宿主细胞的基因组中，并由此随宿主基因组进行复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简单称为“表达载体”)。通常，重组DNA技术中采用的表达载体经常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，还包括其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，其起同样的功能。

如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简单地“宿主细胞”)旨在指包含天然不存在于细胞中的核酸的细胞，并且可以是重组表达载体已引入其中的细胞。应理解此类术语旨在不仅指具体的受试者细胞还指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可以在后代中发生，此类后代实际上可能与亲代细胞不相同，但仍包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。

如本文所用，术语“抗原”指任何天然或合成免疫原性物质，诸如蛋白质、肽或半抗原。抗原可为TL1A或其片段，其作为可溶性蛋白构建体或在细胞表面上表达。

“免疫调节剂(immunomodulator)”或“免疫调控剂(immunoregulator)”指这样的试剂，例如可以参与调节、调控或修饰免疫应答的信号传导途径的组分。“调节”、“调控”或“修饰”免疫应答指免疫系统的细胞中的任何改变或此类细胞(例如效应T细胞)的活性中的任何改变。此类调节包括刺激或抑制免疫系统，其可以显示为各种细胞类型的数目中的增加或降低、这些细胞活性中的增加或降低、或可以在免疫系统内发生的任何其他改变。“免疫调节靶标”或“免疫调控靶标”是这样的免疫调节剂，其靶向被物质、试剂、部分、化合物或分子所结合并且其活性受所述物质、试剂、部分、化合物或分子的结合而改变。免疫调节靶标包括例如细胞表面上的受体(“免疫调节受体”)和受体配体(“免疫调节配体”)。

如本文所用，“施用”指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统的任一种向受试者身体引入包含治疗剂的组合物。用于本文所述的抗体的优选施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊椎或其他肠胃外施用途径，例如，通过注射或输注。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。或者，本文所述的抗体可以经由非肠胃外途径使用，诸如施用的局部、表皮或粘膜途径，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部地。施用还可以例如一次、多次、和/或经一个或多个延长的时段来进行。

如本文所用，术语“抑制”或“阻断”(例如，指TL1A与DR3的结合的抑制/阻断)可互换使用，并且包括部分和完全抑制/阻断。在一些实施方案中，抗TL1A抗体使DR3与TL1A的结合抑制至少约50%，例如，至少约60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指对受试者进行的任何类型的干预或处理，或对受试者施用活性剂，目标在于逆转、减轻、改善、抑制、或减缓或防止与疾病相关的症状、并发症、病况或生物化学指标的进展、发展、加重或复发。预防指向不患有疾病的受试者施用，以防止疾病发生或如果发病将其影响降至最低。

术语“有效剂量(dose)”或“有效剂量(dosage)”定义为足以实现或至少部分实现期望效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是这样的药物的任何量，当单独或与另一治疗剂组合使用时，所述量促进由疾病症状严重度降低、无疾病症状的时期的频率和持续时间的增加、或防止由于疾病折磨导致的损伤或失能所证明的疾病消退。药物的“预防有效量”或“预防有效剂量”是药物这样的量，当单独或与另一治疗剂组合施用于处于发生疾病或患有疾病复发的风险中的受试者时，所述量抑制疾病的发展或复发。治疗剂或预防剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力可以使用从业医师已知的多种方法来评价，诸如在临床试验过程中在人受试者中，在预测在人中的效力的动物模型系统中，或通过测定体外测定中药剂的活性。

术语“患者”和“受试者”指任何接受预防性或治疗性治疗的人或非人动物。例如，本文所述的方法和组合物可以用于治疗免疫系统疾病。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物及非哺乳动物，诸如非人类灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行类等。

如本文所用，“免疫系统疾病”包括但不限于银屑病、狼疮(例如红斑狼疮、狼疮性肾炎)、桥本氏甲状腺炎、原发性粘液性水肿、格雷夫斯氏病、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、艾迪生氏病、糖尿病(例如胰岛素依赖型糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病)、古德帕斯彻氏综合征、重症肌无力、天疱疮、克罗恩氏病、炎性肠病、交感性眼炎、自身免疫性葡萄膜炎、多发性硬化症、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少症、原发性胆汁肝硬化、慢性活动性肝炎、溃疡性结肠炎、舍格伦氏综合征、风湿性疾病、多肌炎、硬皮病和混合性结缔组织病。

如本文所用，“风湿性疾病”意指影响关节、骨、软组织或脊髓的任何疾病(Mathies, H. 1983 Rheuma)，并且包括炎性风湿病、退行性风湿病、关节外风湿病和胶原病。另外，风湿性疾病包括但不限于慢性多关节炎、关节病型银屑病、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、结节性动脉炎、系统性红斑狼疮、进行性系统性硬皮病、肩关节周围炎、尿酸性关节炎(arthritis uratica)、软骨钙质沉着症、皮肌炎、肌肉风湿病、肌炎和肌硬化。已知一些风湿性疾病是由受试者的免疫应答改变引起的自身免疫疾病。

本文所述的各个方面在以下子部分中进一步详述。

I. 抗TL1A抗体

本申请公开了具有期望特性的完全人抗huTL1A抗体，其用作治疗免疫系统疾病中的治疗剂。这些特性包括以高亲和力结合人TL1A的能力、结合食蟹猴TL1A的能力以及阻断DR3结合(且因此阻断信号传导)的能力。

本文通过序列公开的抗TL1A抗体结合人TL1A上的特异性表位，其如实施例8和9中所述进行测定。因此，结合相同或密切相关表位的其他抗体可能共有这些期望的特性。

另外，抗体10A4.F7.2E8结合食蟹猴TL1A，当有必要进行毒性研究以支持使用抗体作为人治疗剂的监管批准时，这是方便的。与10A4.F7.2E8结合相同或相似表位的其他抗TL1A抗体可能共有这种结合食蟹猴TL1A的有利特性。可以通过进行竞争实验或通过直接测定其表位来发现结合相似表位的抗体。

与本文公开的抗huTL1A抗体竞争的抗TL1A抗体

与本发明的抗体竞争结合huTL1A的抗huTL1A抗体(诸如10A4.F7.2E8)可以使用与本文所述的免疫方案(实施例1)类似的那些来产生。与本文描述的抗huTL1A抗体竞争结合的抗体也可以通过用人TL1A或包含其胞外结构域(SEQ ID NO:19的残基72-251)的构建体免疫小鼠、或通过用含有本文公开的抗TL1A抗体(例如10A4.F7.2E8)所结合的表位的人TL1A的片段免疫来产生。所得的抗体可以通过本领域众所周知的方法例如在ELISA中的阻断结合TL1A的胞外结构域和免疫球蛋白Fc结构域的融合蛋白、或例如通过FACS的阻断结合在其表面上表达huTL1A的细胞的能力来筛选阻断10A4.F7.2E8结合人TL1A的能力。在各个实施方案中，在添加10A4.F7.2E8之前、同时或之后将测试抗体与TL1A-Fc融合蛋白(或与在其表面上表达huTL1A的细胞)接触。降低10A4.F7.2E8结合TL1A(作为Fc融合体或在细胞上)(特别是以粗略地化学计量浓度)的抗体可能结合在相同、重叠或邻近表位上，并因此可能共有10A4.F7.2E8的期望的功能特性。

还可以使用本领域已知的其他方法来鉴定竞争抗体。例如，可使用标准ELISA测定或竞争性ELISA测定，其中将重组人TL1A蛋白构建体固定于板上，添加不同浓度的未标记的第一抗体，洗涤板，添加经标记的第二抗体，洗涤，且测量结合的标记的量。如果增加浓度的未经标记(第一)抗体(也称作“阻断抗体”)抑制经标记的(第二)抗体的结合，则称第一抗体抑制第二抗体与板上的靶标的结合，或称与第二抗体竞争结合。另外或可替代地，可使用BIACORE^® SPR分析以评价抗体竞争的能力。测试抗体抑制本文所述的抗huTL1A抗体与TL1A的结合的能力表明测试抗体可与抗体竞争结合TL1A。

因此，本文提供了抗TL1A抗体，其使本文所述的抗huTL1A抗体与细胞上TL1A的结合抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%和/或其与细胞上TL1A的结合被抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100％，例如，如通过ELISA或FACS所测量。

通常，然后颠倒(in the reverse)进行相同实验，即，第一抗体为第二抗体且第二抗体为第一抗体。在某些实施方案中，抗体至少部分地(例如，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%)或完全(100%)阻断其他抗体与靶标(例如人TL1A或其片段)的结合，而与当一种或另一种抗体为第一抗体时是否发生抑制无关。当抗体以两种方式彼此竞争时(即，在其中首先加入第一抗体的竞争实验中和在其中首先加入第二抗体的竞争实验中)，第一抗体和第二抗体“交叉阻断”彼此与靶标的结合。

如果当以粗略相等浓度存在时，抗huTL1A抗体使10A4.F7.2E8与人TL1A的结合抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%，则认为它们与本文公开的抗huTL1A抗体竞争。

结合相同表位的抗TL1A抗体

与本文公开的抗体结合相同或相似表位的抗huTL1A抗体可以使用与本文所述的免疫方案(实施例1)类似的那些来产生。可以针对结合人TL1A的高亲和力筛选所得抗体(实施例4)。然后可以在氢/氘交换质谱(HDX-MS)方法(实施例8)中研究选择的抗体，以确定所述抗体结合的精确表位。与抗体10A4.F7.2E8结合人TL1A上的相同或相似表位的抗体可能共有10A4.F7.2E8的所需功能特性。

表位确定可以通过本领域已知的任何方法来进行。本文公开的表位通过HDX-MS和计算确定，如实施例8和9所述，且在图10-12呈现。在各个实施方案中，如果抗huTL1A抗体与在由10A4.F7.2E8接触的huTL1A的至少一个区域内的相同残基中的一个或多个接触；如果抗huTL1A抗体与在由10A4.F7.2E8接触的huTL1A的至少一个区域内的大部分残基接触；如果抗huTL1A抗体与在由10A4.F7.2E8接触的huTL1A的每一区域内的大部分残基接触；如果抗huTL1A抗体与沿由10A4.F7.2E8接触的huTL1A的整个长度的大部分接触；如果抗huTL1A抗体与在由10A4.F7.2E8接触的人TL1A的所有不同区域内接触；如果抗huTL1A抗体与在由10A4.F7.2E8接触的人TL1A上的任一区域处的所有残基接触；或如果抗huTL1A抗体与在由10A4.F7.2E8接触的所有区域处的所有残基接触，则认为抗huTL1A抗体与本文公开的抗huTL1A mAb(例如10A4.F7.2E8)结合相同的表位。表位“区域”是由抗体10A4.F7.2E8接触的沿一级序列的残基簇，例如如在SEQ ID NO:16和17处所提供。

TL1A中10A4的HDX-MS测量表明，10A4具有由TL1A中的两个肽区域构成的不连续表位，其中区域1具有氘摄取中最显著的变化(图10和11)：

肽区域1 (166-180)：EIRQAGRPNKPDSIT (SEQ ID NO:17)

肽区域2 (102-116)：TVVRQTPTQHFKNQF (SEQ ID NO:16 )

通过对TL1A中10A4 Fab的HDX-MS测量来交叉验证潜在的表位区域。MS中氘代肽片段化的效用进一步将表位的空间分辨率精确至以下：表位1 ¹⁶⁹QAGR¹⁷²和表位2 ¹¹³KNQF¹¹⁶

用于确定与本文所述抗体结合“TL1A上的相同表位”的技术包括抗原：抗体复合物的晶体的x射线分析，其提供表位的原子分辨率。其他方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变化形式的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基修饰导致的结合丧失通常被认为是表示表位组分。此外，还可以使用用于表位作图的计算组合方法。方法还可以依赖于目标抗体从组合噬菌体展示肽文库亲和力分离特异性短肽(以天然三维形式或以变性形式)的能力。随后将肽认为是对应于用于筛选肽文库的抗体的表位定义的引导。对于表位作图，还已经开发了计算算法，其已显示对构象不连续表位进行定位(参见实施例9)。

表位或包含表位的区域也可以通过筛选结合跨越TL1A的一系列重叠肽来鉴定。或者，Jespers等人(1994) Biotechnology 12:899的方法可以用于引导选择具有相同表位且因此具有与本文所述的抗TL1A抗体的相似特性的抗体。使用噬菌体展示，首先将抗TL1A抗体的重链与全部的(repertoire)(优选人)轻链配对以选择TL1A结合抗体，并随后将新的轻链与全部(优选人)重链配对以选择具有如本文所述的抗huTL1A抗体的相同表位或表位区域的(优选人)TL1A结合抗体。或者，本文所述的抗体的变体可以通过诱变编码抗体的重链和轻链的cDNA来获得。

丙氨酸扫描诱变，如Cunningham和Wells (1989) Science 244:1081中所述，或一些其他形式的TL1A中氨基酸残基的点诱变也可用于确定抗TL1A抗体的功能表位。

由特异性抗体结合的表位或表位区域(“表位区域”是包含表位的区域或与表位重叠的区域)也可以通过评价抗体与包含TL1A片段的肽的结合来测定。含有TL1A(例如人TL1A)序列的一系列重叠肽可以合成并针对结合筛选，例如在直接ELISA、竞争ELISA(其中评价肽阻止抗体与结合至微量滴定板的孔的TL1A的结合的能力)中或在芯片上。此类肽筛选方法可能无法检测一些不连续功能表位，即，涉及沿TL1A多肽链的一级序列不连续的氨基酸残基的功能表位。

表位还可以通过基于MS的蛋白足迹法诸如蛋白快速光化学氧化法(FastPhotochemical Oxidation of Proteins, FPOP)来鉴定。FPOP可以如例如描述于Hambley和Gross (2005) J. American Soc.Mass Spectrometry 16:2057中所述进行，所述方法具体地通过引用并入本文。

由抗TL1A抗体结合的表位也可以通过结构方法来测定，诸如X射线晶体结构测定(例如WO2005/044853)、分子建模和核磁共振(NMR)光谱学，包括当游离时和当结合在目标抗体的复合物中时TL1A中不稳定的酰胺氢的H-D交换速率的NMR测定(Zinn-Justin等人(1992) Biochemistry 31:11335；Zinn-Justin 等人(1993) Biochemistry 32:6884)。

关于X射线晶体学，结晶可以使用本领域任何已知方法来完成(例如Giege等人(1994) Acta Crystallogr.D50:339；McPherson (1990) Eur.J. Biochem.189:1)，包括微配液结晶法(microbatch)(例如Chayen (1997) Structure 5:1269)、悬滴蒸汽扩散(例如McPherson (1976) J. Biol.Chem.251:6300)、接种(seeding)和透析。期望使用具有至少约1 mg/mL且优选约10 mg/mL至约20 mg/mL的浓度的蛋白制剂。结晶可以在含有聚乙二醇1000-20,000 (PEG；平均分子量范围为约1000至约20,000 Da)、优选约5000至约7000 Da、更优选约6000 Da，且浓度范围为约10%至约30% (w/v)的沉淀剂溶液中最佳实现。还可以期望包含蛋白稳定剂，例如，浓度范围为约0.5%至约20%的甘油。合适的盐诸如氯化钠、氯化锂或柠檬酸钠在沉淀剂溶液中也是期望的，优选浓度范围为约1 mM至约1000 mM。沉淀剂优选缓冲至约3.0至约5.0、优选约4.0的pH。可用于沉淀剂溶液中的具体缓冲液可以改变并且是本领域众所周知的(Scopes, Protein Purification:Principles and Practice, 第三版, (1994) Springer-Verlag, New York)。可用的缓冲液的实例包括但不限于HEPES、Tris、MES和乙酸盐。晶体可以在宽范围温度下生长，包括2℃、4℃、8℃和26℃。

抗体：抗原晶体可以使用众所周知的X射线衍射技术研究并可以使用计算机软件诸如X-PLOR细化(Yale University, 1992, 由Molecular Simulations, Inc.发布；参见例如Blundell和Johnson (1985) Meth.Enzymol.114 & 115, H. W. Wyckoff 等人, 编辑, Academic Press；美国专利申请公开号2004/0014194)和BUSTER (Bricogne (1993)Acta Cryst.D49:37-60；Bricogne (1997) Meth.Enzymol.276A:361-423, Carter和Sweet, 编辑；Roversi 等人(2000) Acta Cryst.D56:1313-1323)，其公开内容以其整体通过引用并入本文。

以高亲和力结合的抗TL1A抗体

在一些实施方案中，本发明的抗huTL1A抗体以高亲和力结合huTL1A，如本文公开的抗huTL1A抗体，增加其成为有效治疗剂的可能性。在各个实施方案中，本发明的抗huTL1A抗体结合huTL1A，且K_D为小于10nM、5nM、2nM、1nM、300pM或100pM。在其他实施方案中，本发明的抗huTL1A抗体结合huTL1A，且K_D为2nM-100pM。用于评价抗体对huTL1A的结合能力的标准测定包括ELISA、蛋白质印迹、BIACORE^® SPR分析和RIA。

抗TL1A抗体序列变体

本文公开的抗体序列中的一些改变可以被耐受且仍维持抗体的期望特性。CDR区使用Kabat系统描绘(Kabat, E. A., 等人(1991) Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH公开号91-3242)。因此，本发明进一步提供了抗huTL1A抗体，其包含与本文公开的抗体(例如10A4.F7.2E8)的CDR序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的CDR序列。本发明还提供了抗huTL1A抗体，其包含与本文公开的抗体(例如10A4.F7.2E8)的重链和/或轻链可变结构域序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的重链和/或轻链可变结构域序列。

衍生自相同种系的抗TL1A抗体

考虑到抗原结合特异性主要由CDR决定，因此与本文公开的抗体(例如10A4.F7.2E8)共有CDR序列的抗体可能共有其期望的特性。

在某些实施方案中，本发明的抗huTL1A抗体包含衍生自特定人种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定人种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。抗体10A4具有衍生自人种系V4-39、D4-17和JH3的重链，以及衍生自种系VK1和JK4的轻链。结合人TL1A且衍生自这些种系序列中的一些或全部的其他抗体可能在序列上非常密切相关，尤其是衍生自相同V区基因的那些，并因此将预期共有相同的期望特性。

如本文所用，如果人抗体的可变区获自使用人种系免疫球蛋白基因的系统并且该抗体序列与种系足够相关使得其更可能衍生自给定的种系而非任何其他种系，则该抗体包含“衍生自”特定种系序列的重链或轻链可变区。此类系统包括用目标抗原免疫携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠疫或用目标抗原筛选展示于噬菌体上的人类免疫球蛋白基因文库。抗体序列所“衍生”的人种系免疫球蛋白序列可以通过将人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列比较并选择在序列上与人抗体序列最接近的(即最大的%同一性)人种系免疫球蛋白序列来鉴定。“衍生自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体当相比于种系序列时可以包含氨基酸差异，其由于例如天然存在的体细胞突变或定点突变的有意引入。然而，所选的人抗体通常在氨基酸序列上与由人种系免疫球蛋白基因(例如V区)编码的氨基酸序列具有至少90%同一性，且含有当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠种系序列)相比时将人抗体鉴定为人的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体可以在氨基酸序列上与由种系免疫球蛋白基因(例如V区)编码的氨基酸序列具有至少95%、或甚至至少96%、97%、98%或99%的同一性。通常，衍生自特定人种系序列的人抗体将展示出与由人种系免疫球蛋白基因(例如V区)编码的氨基酸序列的不超过10个氨基酸差异。在某些情况下，人抗体可以展现与由种系免疫球蛋白基因(例如V区)编码的氨基酸序列的不超过5个、或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。

II. 工程改造且修饰的抗体

VH和VL区

还提供工程改造且修饰的抗体，其可以使用具有本文公开的V_H和/或V_L序列中的一种或多种的抗体作为起始材料以工程改造修饰的抗体来制备，所述修饰的抗体可以具有自起始抗体的改变的特性。可以通过在一个或两个可变区(即V_H和/或V_L)内，例如在一个或多个CDR区和/或在一个或多个框架区内改变一个或多个残基来将抗体工程改造。另外或可替代地，可以通过在恒定区内修饰残基例如以改变抗体的效应物功能来将抗体工程改造。

可以进行的一种类型的可变区工程改造是CDR移植。此类移植在人源化非人抗TL1A抗体中特别有用，所述非人抗TL1A抗体与本文公开的抗huTL1A抗体竞争结合和/或结合如本文公开的抗huTL1A抗体的相同表位。抗体经位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基主要地与靶抗原相互作用。为此原因，CDR内的氨基酸序列在不同抗体之间比CDR之外的序列更加多变。由于CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，因此可以通过构建表达载体来表达模拟特定参考抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包括移植至来自具有特性的不同抗体的框架序列的特定参考抗体的CDR序列(参见例如，Riechmann, L.等人(1998) Nature 332:323-327；Jones, P. 等人(1986) Nature 321:522-525；Queen, C.等人(1989) Proc.Natl.Acad.Sci。参见U.S.A 86:10029-10033；Winter的美国专利号5,225,539和Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

此类框架序列可以获自公共DNA数据库或包括种系抗体基因序列的公开的参考文献。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以发现于"VBase"人种系序列数据库(可得自www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase的因特网)以及Kabat, E. A., 等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department ofHealth and Human Services, NIH公开号91-3242；Tomlinson, I. M., 等人(1992) "TheRepertoire of Human Germline V_H Sequences Reveals about Fifty Groups of V_HSegments with Different Hypervariable Loops" J. Mol.Biol.227:776-798；和Cox,J. P. L. 等人(1994) "A Directory of Human Germ-line V_H Segments Reveals aStrong Bias in their Usage" Eur.J. Immunol.24:827-836；其各自内容通过引用明确地并入本文。

用于本文所述的抗体中的优选的框架序列是结构上类似于由本文所述的抗体使用的框架序列的那些。V_H CDR1、2和3序列以及V_L CDR1、2和3序列可以移植至具有与发现于框架序列所来源的种系免疫球蛋白基因中的相同序列的框架区上，或者CDR序列可以移植至相比于种系序列含有最多20个(优选保守的)氨基酸取代的框架区上。例如，已发现在某些情况下，在框架区内突变残基对于维持或增强抗体的抗原结合能力是有利的(参见例如Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

本文所述的工程改造的抗体包括其中已对V_H和/或V_L内的框架残基进行修饰例如以改进抗体特性的那些。通常进行此类框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是“回复突变(backmutate)”一个或多个框架残基至相应的种系序列。更具体地，已经历体细胞突变的抗体可以含有与抗体所来源的种系序列不同的框架残基。此类残基可以通过将抗体框架序列与抗体所来源的种系序列进行比较来鉴定。为了使框架区序列返回至其种系构象，可以将体细胞突变“回复突变”至种系序列，例如通过定点诱变或PCR介导的诱变。此类“回复突变的”抗体也旨在被涵盖。

另一类型的框架修饰涉及在框架区内或甚至在一个或多个CDR区内突变一个或多个残基，以去除T细胞表位，由此降低抗体的潜在免疫原性。这种方法也称为“去免疫化(deimmunization)”，且进一步详细描述于Carr等人的美国专利公开号20030153043中。

另一类型的可变区修饰是在CDR区内突变氨基酸残基以改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入突变和对抗体结合的作用或其他目标功能特性。优选地，引入保守修饰。突变可以是氨基酸添加、缺失或优选取代。此外，通常改变CDR区内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。

抗体的CDR中的甲硫氨酸残基可以被氧化，导致潜在的化学降解和随之抗体效能的降低。因此，还提供抗TL1A抗体，其在重链和/或轻链CDR中用不经受氧化降解的氨基酸残基替换一个或多个甲硫氨酸残基。

类似地，脱酰胺位点可以从抗TL1A抗体尤其是CDR中去除。

优选消除抗原结合结构域内的潜在糖基化位点以防止可能干扰抗原结合的糖基化。参见例如美国专利号5,714,350。

Fc和修饰的Fc

除了从抗原结合结构域与抗原的结合产生的治疗抗体的活性(例如在拮抗剂抗体的情况下阻断同源配体或受体蛋白，或在激动剂抗体的情况下诱导的信号传导)外，抗体的Fc部分与免疫系统通常以复杂方式相互作用以引发任何数量的生物效应。效应物功能(诸如免疫球蛋白的Fc区)负责许多重要抗体功能，诸如抗原依赖性细胞细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)，导致杀死靶细胞，但通过不同机制。存在重链恒定区的五种主要类别或同种型(IgA、IgG、IgD、IgE、IgM)，各自具有特征性效应物功能。这些同种型可进一步细分成亚类，例如，IgG分成四个亚类，称作IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgG分子与三类对抗体的IgG类别特异性的Fcγ受体(FcγR)(即FcγRI、FcγRII和FcγRIII)相互作用。已报导对于IgG与FcγR受体的结合重要的序列位于CH2和CH3结构域中。抗体的血清半衰期受该抗体结合新生Fc受体(FcRn)的能力影响。

本发明的抗体可以包含本发明的可变结构域与包含不同Fc区的恒定结构域的组合，其基于抗体对于预期用途的生物活性(如有的话)来选择。Salfeld (2007) Nat. Biotechnol.25:1369。人IgG例如可以分为四个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，并且这些中的每一种包含这样的Fc区，所述Fc区具有结合Fcγ受体(活化性受体FcγRI (CD64)、FcγRIIA、FcγRIIC (CD32)；FcγRIIIA和FcγRIIIB (CD16)和抑制性受体FcγRIIB)中的一种或多种和第一补体组分(C1q)的独特概况。人IgG1和IgG3结合所有Fcγ受体；IgG2结合FcγRIIA_H131，和以较低亲和力结合FcγRIIA_R131 FcγRIIIA_V158；IgG4结合FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC和FcγRIIIA_V158；且抑制性受体FcγRIIB比所有其他Fcγ受体具有对于IgG1、IgG2和IgG3的较低的亲和力。Bruhns 等人(2009) Blood 113:3716。研究已显示FcγRI不结合IgG2，且FcγRIIIB不结合IgG2或IgG4。同上。通常，关于ADCC活性，人IgG1 ≧IgG3 ≫ IgG4 ≧ IgG2。因此，例如，IgG1恒定结构域而非IgG2或IgG4，可以被选择用于其中期望ADCC的药物中；如果活化表达FcγRIIIA的NK细胞、单核细胞或巨噬细胞，可以选择IgG3；且如果将抗体用于将过敏患者脱敏，则可以选择IgG4。如果期望抗体缺乏所有效应物功能，也可以选择IgG4。

因此，本文描述的抗TL1A可变区可以连接(例如共价连接或融合)至Fc，例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc，其可以是例如任何同种异型或异同种异型(isoallotype)，例如，对于IgG1：G1m、G1m1(a)、G1m2(x)、G1m3(f)、G1m17(z)；对于IgG2: G2m、G2m23(n)；对于IgG3: G3m、G3m21(g1)、G3m28(g5)、G3m11(b0)、G3m5(b1)、G3m13(b3)、G3m14(b4)、G3m10(b5)、G3m15(s)、G3m16(t)、G3m6(c3)、G3m24(c5)、G3m26(u)、G3m27(v)。参见例如，Jefferis等人(2009) mAbs 1:1)。同种异型的选择可能受潜在的免疫原性考量的影响，例如，以将抗药物抗体的形成降至最低。

本文所述的可变区可连接至包含一个或多个修饰以通常改变抗体的一种或多种功能特性(诸如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞细胞毒性)的Fc。此外，本文所述的抗体可经化学修饰(例如可将一个或多个化学部分附接至该抗体)或其可经修饰以改变其糖基化，以改变抗体的一种或多种功能特性。这些实施方案中的每一者进一步详细描述于下文中。Fc区中残基的编号是Kabat的EU索引的编号。参考残基编号和随后取代代替天然存在的氨基酸的氨基酸、任选地之前有该位置处的天然存在的残基来提供本文公开的序列变体。在给定位置处存在多个氨基酸的情况下，例如如果序列在天然存在的同种型之间不同或如果可以在该位置处取代多个突变，则其由斜杠分开(例如“X/Y/Z”)。

例如，可在Fc区中进行修饰以生成相对于亲代Fc具有如下的Fc变体：(a)增加或降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，(b)增加或降低的补体介导的细胞毒性(CDC)，(c)增加或降低的对C1q的亲和力和/或(d)增加或降低的对Fc受体的亲和力。此类Fc区变体通常将包含Fc区中的至少一个氨基酸修饰。认为组合氨基酸修饰尤其期望的。例如，变体Fc区可包括其中、(例如本文鉴定的特定Fc区位置)的两个、三个、四个、五个等取代。示例性Fc序列变体公开于本文中，且还提供于美国专利号5,624,821；6,277,375；6,737,056；6,194,551；7,317,091；8,101,720；PCT专利公开号WO 00/42072；WO 01/58957；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752；WO 04/074455；WO 04/099249；WO 04/063351；WO05/070963；WO 05/040217；WO 05/092925和WO 06/020114。

降低效应物功能

ADCC活性可通过修饰Fc区而降低。在某些实施方案中，可去除影响与Fc受体的结合的位点，优选除了补救受体结合位点以外的位点。在其他实施方案中，Fc区可经修饰以去除ADCC位点。ADCC位点是本领域中已知的；关于IgG1中的ADCC位点，参见例如Sarmay等人(1992) Molec. Immunol. 29 (5): 633-9。在一个实施方案中，人类IgG1的G236R和L328R变体有效地消除FcγR结合。Horton等人 (2011) J. Immunol. 186:4223和Chu等人(2008) Mol. Immunol. 45:3926。在其他实施方案中，具有降低的与FcγR的结合的Fc包含氨基酸取代L234A、L235E和G237A。Gross等人 (2001) Immunity 15:289。

CDC活性也可通过修饰Fc区而降低。IgG1位置D270、K322、P329和P331处的突变、尤其丙氨酸突变D270A、K322A、P329A及P331A显著降低相应抗体结合C1q和活化补体的能力。Idusogie等人 (2000) J. Immunol. 164:4178; WO 99/51642。已显示IgG1的位置331的修饰(例如P331S)降低补体结合。Tao等人 (1993) J. Exp. Med. 178:661和Canfield &Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483。在另一个实例中，改变氨基酸位置231至239内的一个或多个氨基酸残基以藉由此降低抗体结合补体的能力。WO 94/29351。

在一些实施方案中，补体结合降低的Fc具有氨基酸取代A330S和P331S。Gross等人(2001) Immunity 15:289。

对于待完全避免效应物功能的用途，例如在仅抗原结合以足以生成期望治疗益处且效应物功能仅导致不期望副作用(或增加其风险)时，可使用IgG4抗体，或可设计缺乏Fc区或其大部分的抗体或片段，或可使Fc突变以完全消除糖基化(例如N297A)。或者，已生成人类IgG2(CH1结构域和铰链区)和人类IgG4(CH2和CH3结构域)的杂合构建体，其无效应物功能，缺乏结合FcγR的能力(如IgG2)且不能活化补体(如IgG4)。Rother等人 (2007) Nat. Biotechnol. 25:1256。还参见Mueller等人 (1997) Mol. Immunol. 34:441; Labrijn等人(2008) Curr. Op. Immunol. 20:479(通常讨论Fc修饰以降低效应物功能)。

在其他实施方案中，通过用不同氨基酸残基替代至少一个氨基酸残基来改变Fc区以改变抗体的效应物功能。例如，一个或多个选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的氨基酸可用不同氨基酸残基替代，使得抗体具有降低的对效应物配体的亲和力，但保留亲代抗体的抗原结合能力。改变亲和力的效应物配体可以是例如Fc受体(残基234、235、236、237、297)或补体的C1组分(残基297、318、320、322)。均为Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260。

一个早期专利申请提出IgG Fc区的修饰以减少与FcγRI的结合以减少ADCC(234A；235E；236A；G237A)或阻断与补体组分C1q的结合以消除CDC(E318A或V/K320A和K322A/Q)。WO 88/007089。还参见Duncan & Winter (1988) Nature 332:563; Chappel等人 (1991) Proc. Nat’l Acad. Sci.(USA) 88:9036;和Sondermann等人 (2000) Nature406:267(讨论这些突变对FcγRIII结合的影响)。

降低效应物功能的Fc修饰还包括在位置234、235、236、237、267、269、325和328处的取代、插入和缺失，诸如234G、235G、236R、237K、267R、269R、325L和328R。Fc变体可包含236R/328R。用于降低FcγR和补体相互作用的其他修饰包括取代297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P和234V。这些和其他修饰综述于Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691。可通过使位置233-236和327-331中的一个或多个处的IgG残基突变来降低效应物功能(ADCC和补体活化两者)，同时维持新生FcR结合(维持半衰期)，诸如IgG1中的E233P、L234V、L235A、任选地G236Δ、A327G、A330S和P331S；IgG4中的E233P、F234V、L235A、任选地G236Δ；和IgG2中的A330S和P331S。参见Armour等人 (1999) Eur. J. Immunol. 29:2613; WO 99/58572。降低效应物功能的其他突变包括IgG1中的L234A和L235A (Alegre等人 (1994)Transplantation 57:1537)；IgG2中的V234A和G237A(Cole等人 (1997) J. Immunol.159:3613；还参见美国专利号5,834,597)；和IgG4的S228P和L235E(Reddy等人 (2000) J. Immunol. 164:1925)。人IgG1中用于降低效应物功能的突变的另一组合包括L234F、L235E和P331S。Oganesyan等人 (2008) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 64:700。通常参见Labrijn et gal. (2008) Curr. Op. Immunol. 20:479。其他被发现在Fc(IgG1)融合蛋白(阿巴西普(abatacept))的背景下降低效应物功能的突变是C226S、C229S和P238S(EU残基编号)。Davis等人(2007) J. Immunol. 34:2204。

具有降低的ADCC和/或CDC的其他Fc变体公开于Glaesner等人 (2010) Diabetes Metab. Res. Rev. 26:287 (IgG4中的F234A和L235A以降低ADCC和ADCP)；Hutchins等人(1995) Proc. Nat’l Acad. Sci. (USA) 92:11980 (IgG4中的F234A、G237A和E318A)；An等人 (2009) MAbs 1:572和美国专利申请公开2007/0148167(IgG2中的H268Q、V309L、A330S和P331S)；McEarchern等人 (2007) Blood 109:1185 (IgG1中的C226S、C229S、E233P、L234V、L235A)；Vafa等人 (2014) Methods 65:114 (IgG2中的V234V、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、P331S)。

在某些实施方案中，选择基本上无效应物功能的Fc，即，其具有降低的与FcγR的结合和降低的补体结合。无效应物功能的示例性Fc(例如IgG1 Fc)包含以下五个突变：L234A、L235E、G237A、A330S和P331S。Gross等人 (2001) Immunity 15:289。这五个取代也可与N297A组合以消除糖基化。

III.抗体物理特性

本文描述的抗体可以在轻链或重链可变区中包含一个或多个糖基化位点。此类糖基化位点可以导致抗体的免疫原性增加或改变抗体的pK，这是由于抗原结合改变(Marshall等人(1972) Annu.Rev. Biochem.41:673-702；Gala和Morrison (2004) J. Immunol.172:5489-94；Wallick 等人(1988) J. Exp.Med.168:1099-109；Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R；Parekh 等人(1985) Nature 316:452-7；Mimura 等人(2000) Mol Immunol 37:697-706)。已经知晓糖基化在含有N-X-S/T序列的基序处发生。在一些情况下，优选抗TL1A抗体不包含可变区糖基化。这可以通过选择在可变区中不包含糖基化基序的抗体或者通过在糖基化区域内突变残基来实现。

在某些实施方案中，本文所述的抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可以在N-G或D-G序列上发生并且导致产生引入扭结(kink)至多肽链并降低其稳定性(异天冬氨酸作用)的异天冬氨酸残基。

每一抗体将具有独特的等电点(pI)，其一般落入6-9.5的pH范围。IgG4抗体的pI通常落入6-8的pH范围。推测具有正常范围之外的pI的抗体可能在体内条件下具有一些解折叠和不稳定性。因此，优选抗TL1A抗体包含落入正常范围内的pI值。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过突变带电荷的表面残基来实现。

每一抗体具有特征性解链温度，且更高的解链温度表明更高的体内总体稳定性(Krishnamurthy R和Manning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。通常，优选T_M1 (初始解折叠的温度)高于60℃，优选高于65℃，甚至更优选高于70℃。抗体的解链点可以使用差示扫描量热法(Chen 等人(2003) Pharm Res 20:1952-60；Ghirlando 等人(1999) Immunol Lett.68:47-52)或圆二色性(Murray 等人(2002) J. Chromatogr.Sci.40:343-9)来测量(参见实施例5)。

在一个优选的实施方案中，选择不快速降解的抗体。抗体的降解可以使用毛细管电泳(CE)和MALDI-MS来测量(Alexander A J和Hughes D E (1995) Anal Chem. 67:3626-32)。

在另一优选的实施方案中，选择具有最小聚集作用的抗体，所述聚集作用可以导致引起不想要的免疫应答和/或改变的或不利的药代动力学特性。通常，具有25%或更低、优选20%或更低、甚至更优选15%或更低、甚至更优选10%或更低和甚至更优选5%或更低的聚集的抗体是可接受的。聚集可以通过几种技术来测量，包括尺寸排阻柱(SEC)、高效液相色谱(HPLC)和光散射。

格式化为人IgG4同种型的抗TL1A mAb 10A4 (10A4-IgG4)通过几种标准生物物理技术表征，并显示具有纯的单体和稳定的单克隆抗体典型的生物物理特性。例如，与多角度激光散射检测器(MALS)偶联的尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)显示抗体样品的纯度超过90％，其中主要种类具有~140 kDa的MALS测定的质量。动态光散射测定5.3nm的流体动力学半径，也与对于溶液中单体抗体预期的流体动力学半径一致。差示扫描量热法数据还显示10A4-IgG4具有高热稳定性，具有3个不同的热转变，其具有70.75℃、84.698℃和88.50℃的转变中点(Tm)值。

IV. 核酸分子

本文所述的另一方面涉及编码本文所述的抗体的核酸分子。核酸可以存在于完整细胞中、细胞裂解物中、或部分纯化或实质上纯化形式中。当通过标准技术包括碱性/SDS处理、CsCl条带、柱色谱、限制酶、琼脂糖凝胶电泳和本领域中众所周知的其他技术将核酸从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸(例如，其他染色体DNA，例如天然连接到分离的DNA上的染色体DNA)或蛋白中纯化出时，所述核酸“被分离”或使所述核酸“实质上纯的”。参见F. Ausubel, 等人, 编辑(1987) Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing and Wiley Interscience, New York。本文所述的核酸例如可以是DNA或RNA且可以包含或可以不包含内含子序列。在某些实施方案中，核酸是cDNA分子。

本文所述的核酸可以使用标准分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如从携带有如下文进一步所述的人免疫球蛋白基因的转基因小鼠中制备的杂交瘤)表达的抗体，编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于获自免疫球蛋白基因文库(例如使用噬菌体展示技术)的抗体，可以从文库中回收编码抗体的核酸。

一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如，以将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至编码另一蛋白(诸如抗体恒定区或柔性接头)的另一DNA片段。如本上下文中所用的术语“可操作地连接”旨在意指将两个DNA片段连接，使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持框内(in-frame)。

编码VH区的分离的DNA可以转化为全长重链基因，其通过将编码VH的DNA可操作地连接至编码重链恒定区(铰链、CH1、CH2和/或CH3)的另一DNA分子。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat, E. A. 等人(1991) Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No. 91-3242)并且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，例如，IgG1区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以可操作地连接至仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。

编码VL区的分离的DNA可以转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)，其通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat, E. A. 等人(1991) Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No. 91-3242)并且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。

为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段可操作地连接至编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly₄ -Ser)₃的另一片段，使得VH和VL序列可以表达为连续单链蛋白，且VL和VH区由柔性接头连接(参见例如，Bird 等人(1988) Science 242:423-426；Huston 等人(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty 等人(1990) Nature 348:552-554)。

V.抗体产生

本发明的各种抗体例如与本文公开的抗人TL1A抗体竞争或与本文公开的抗人TL1A抗体结合相同表位的那些抗体可以使用各种已知技术、诸如由Kohler和Milstein, Nature256:495 (1975)所述的标准体细胞杂交技术产生。尽管优选体细胞杂交程序，但原则上，也可以采用其他用于产生单克隆抗体的技术，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌性转化、使用人抗体基因文库的噬菌体展示技术。

用于制备杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。在小鼠中的杂交瘤产生是非常完善的程序。用于分离用于融合的经免疫的脾细胞的免疫方案和技术是本领域中已知的。融合伴侣(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。

本文所述的嵌合或人源化抗体可以基于如上所述制备的鼠单克隆抗体的序列来制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以使用标准分子生物学技术获自目标鼠杂交瘤并且经工程改造以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域中已知的方法将鼠可变区连接至人恒定区(参见例如Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人框架中(参见例如Winter的美国专利号5,225,539 和Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

在一个实施方案中，本文所述的抗体是人单克隆抗体。此类针对TL1A的人单克隆抗体可以使用携带部分人免疫系统而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来产生。这些转基因和转染色体小鼠包括本文分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在本文中统称为“人Ig小鼠”。

HuMAb小鼠® (Medarex, Inc.)含有编码未重排的人重链(µ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因迷你基因座(miniloci)，连同失活内源µ 和κ 链基因座的靶向突变(参见例如，Lonberg, 等人(1994) Nature 368(6474):856-859)。因此，小鼠展示出小鼠IgM或κ的表达降低，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力的人IgGκ单克隆(Lonberg, N. 等人(1994),上文；综述于Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg,N.和Huszar, D. (1995) Intern.Rev. Immunol.13:65-93, 和Harding, F.和Lonberg,N. (1995) Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。制备和使用HuMab小鼠和通过此类小鼠携带的基因组修饰进一步描述于Taylor, L.等人(1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen, J. 等人(1993) International Immunology 5:647-656；Tuaillon 等人(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720-3724；Choi 等人(1993) Nature Genetics 4:117-123；Chen, J. 等人(1993) EMBO J. 12:821-830；Tuaillon 等人(1994) J. Immunol.152:2912-2920；Taylor, L. 等人(1994) International Immunology 6:579-591；和Fishwild, D. 等人(1996) Nature Biotechnology 14:845-851，所有参考文献的内容以其整体通过引用在此具体地并入本文。进一步参见美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；均属于Lonberg和Kay；Surani等人的美国专利号5,545,807；PCT 公开号 WO92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884和WO 99/45962, 均属于Lonberg和Kay；和Korman等人的PCT公开号WO 01/14424。

在某些实施方案中，本文所述的抗体使用携带转基因和转染色体上的人免疫球蛋白基因的小鼠诸如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠来产生。此类小鼠在本文称为“KM小鼠”，详细描述于Ishida等人的PCT公开WO 02/43478中。

仍进一步，表达人免疫球蛋白基因的替代转基因动物系统是本领域可获得的并且可用于产生本文所述的抗TL1A抗体。例如，可以使用称为Xenomouse (Abgenix, Inc.)的替代转基因系统；此类小鼠描述于例如Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963。

此外，表达人免疫球蛋白基因的替代转染色体动物系统是本领域可获得的并且可用于产生本文所述的抗TL1A抗体。例如，可以使用称为“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠；此类小鼠描述于Tomizuka等人(2000) Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727。此外，本领域中已经描述了携带人重链和轻链转染色体的牛(Kuroiwa等人(2002) Nature Biotechnology 20:889-894)并且其可用于产生本文所述的抗TL1A抗体。

本领域中所述的用于产生人抗体(例如人抗TL1A抗体)的另外的小鼠系统包括：(i)VelocImmune^® 小鼠(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)，其中已经经同源重组用可操作地连接至内源小鼠恒定区的人重链和轻链可变区替代内源小鼠重链和轻链可变区，使得在小鼠中产生嵌合抗体(人V/小鼠C)，并随后使用标准重组DNA技术转换为完全人抗体；和(ii) MeMo^®小鼠(Merus Biopharmaceuticals, Inc.)，其中小鼠包含未重排的人重链可变区但单一重排的人共同轻链可变区。此类小鼠及其产生抗体的用途描述于例如WO 2009/15777、US 2010/0069614、WO 2011/072204、WO 2011/097603、WO 2011/163311、WO 2011/163314、WO 2012/148873、US 2012/0070861和US 2012/0073004。

本文所述的人单克隆抗体还可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备。用于分离人抗体的此类噬菌体展示方法在本领域中已建立。参见例如：Ladner等人的美国专利号5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美国专利号5,969,108和6,172,197；和Griffiths等人的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。

本文所述的人单克隆抗体也可以使用SCID小鼠来制备，已经将人免疫细胞重构入所述SCID小鼠，使得免疫后可以产生人抗体应答。此类小鼠描述于例如Wilson等人的美国专利号5,476,996和5,698,767中。

免疫

为了产生针对TL1A的完全人抗体，含有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或转染色体小鼠(例如HCo12、HCo7或KM小鼠)可以用纯化的或富集的TL1A抗原制备物和/或表达TL1A的细胞免疫，如例如通过以下对于其他抗原所述的：Lonberg等人(1994) Nature 368(6474):856-859；Fishwild 等人(1996) Nature Biotechnology 14:845-851和WO 98/24884。或者，可以用编码人TL1A的DNA免疫小鼠。优选地，小鼠将在第一次输注时为6-16周龄。例如，重组TL1A抗原的纯化的或富集的制备物(5-50 µg)可用于腹膜内免疫HuMab小鼠。在使用纯化的或富集的TL1A抗原制备物免疫不产生抗体的情况中，还可以用表达TL1A的细胞例如细胞系免疫小鼠以促进免疫应答。示例性细胞系包括过表达TL1A的稳定CHO和Raji细胞系。

用各种抗原的经验累积已显示用在Ribi氏佐剂中的抗原腹膜内(IP)或皮下(SC)初始免疫随后每隔一周用Ribi氏佐剂中的抗原IP/SC免疫(最高至总共10次)时，HuMAb转基因小鼠应答最好。免疫应答可以随免疫方案过程用通过框后出血获得的血浆样品来监测。血浆可以通过ELISA和FACS(如下文所述)来筛选并且具有抗TL1A人免疫球蛋白的足够滴度的小鼠可用于融合。可以在处死并移除脾和淋巴结前3天用抗原静脉内对小鼠加强。预期对于每一免疫可能需要进行2-3次融合。对于每一抗原通常免疫6-24只小鼠。通常，使用HCo7、HCo12和KM品系。此外，HCo7和HCo12转基因可以一同繁殖为具有两种不同人重链转基因(HCo7/HCo12)的单一小鼠。

生产针对TL1A的单克隆抗体的杂交瘤的产生

为了产生生产本文所述的人单克隆抗体的杂交瘤，可以从经免疫的小鼠分离脾细胞和/或淋巴结细胞并融合至合适的无限增殖化细胞系，诸如小鼠骨髓瘤细胞系。所得的杂交瘤可以针对抗原特异性抗体的产生进行筛选。例如，来自经免疫的小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液可以用50% PEG融合至Sp2/0非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC, CRL 1581)。将细胞以大约2 x 10⁵铺板于平底微量滴定板，随后在选择性培养基中孵育两周，所述选择性培养基包含10%胎儿克隆血清、18% "653"条件培养基、5% origen (IGEN)、4 mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055 mM 2-巯基乙醇、50 单位/ml青霉素、50 mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1X HAT (Sigma)。大约两周后，在其中用HT替换HAT的培养基中培养细胞。各个孔可以随后通过ELISA针对人单克隆IgM和IgG抗体来筛选。一旦出现大量杂交瘤生长，通常在10-14天后可以观察培养基。将分泌抗体的杂交瘤再铺板，再次筛选，并且如果仍对于人IgG为阳性，则可以通过有限稀释将单克隆抗体亚克隆至少两次。稳定的亚克隆可以随后体外培养以在组织培养基中产生少量的抗体用于表征。

为了纯化人单克隆抗体，所选的杂交瘤可以在两升旋转瓶(spinner-flask)中生长。可以将上清液过滤并浓缩，随后用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia, Piscataway, N.J.)亲和色谱。洗脱的IgG可以通过凝胶电泳和高效液相色谱检查以确保纯度。可以将缓冲液交换至PBS并可以使用1.43消光系数通过OD₂₈₀测定浓度。可以将单克隆抗体进行等分并存储于-80℃。

VI. 抗体制备

生产针对TL1A的单克隆抗体的转染瘤的产生

本发明的抗体包括提供其序列的特异性抗体和其他相关的抗TL1A抗体可以使用例如本领域中众所周知的重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生(Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。

例如，为了表达抗体或其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如，使用表达目标抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可以将DNA插入表达载体中，使得将基因可操作地连接至转录和翻译控制序列。在本上下文中，术语“可操作地连接”旨在意指将抗体基因连接入载体内使得载体内的转录和翻译控制序列行使其调节转录和翻译抗体基因的预期功能。选择表达载体和表达控制序列以与所用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入单独的载体或者将两个基因插入同一表达载体。通过标准方法(例如，抗体基因片段和载体上的互补性限制位点连接或平端连接(如果不存在限制性位点的话))将抗体基因插入表达载体中。本文所述的抗体的轻链和重链可变区可用于产生任何抗体同种型的全长抗体基因，其通过将它们插入已经编码期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体内，使得V_H区段可操作地连接至载体内的C_H区段并且V_L区段可操作地连接至载体内的C_L区段。另外或可替代地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆入载体中，使得信号肽框内连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白的信号肽)。

除了抗体链基因外，重组表达载体可以携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”旨在包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。此类调节序列例如描述于Goeddel (GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,CA (1990))。本领域技术人员将理解设计表达载体包括选择调节序列可以依赖于作为待转化的宿主细胞的选择、期望蛋白的表达水平等的此类因素。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调节序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件，诸如衍生自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒)的启动子和/或增强子。或者，可以使用非病毒调节序列，诸如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。还进一步，调节元件由来自不同来源的序列构成，诸如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复(Takebe, Y. 等人(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。

除了抗体链基因和调节序列外，重组表达载体可以携带额外序列，诸如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和可选标记基因。可选标记基因促进选择其中已引入载体的宿主细胞(参见例如美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017，均属于Axel 等人)。例如，通常可选标记基因赋予其中已引入载体的宿主细胞对药物诸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的可选标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于用甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。

为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染入宿主细胞。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的各种各样的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。尽管理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本文所述的抗体，但在真核细胞且最优选在哺乳动物宿主细胞中表达抗体是最优选的，因为此类真核细胞特别是哺乳动物细胞比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠且免疫学有活性的抗体。已报道抗体基因的原核表达无法有效产生高产量的活性抗体(Boss, M. A.和Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13)。本发明的抗体也可以在酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的糖工程改造菌株中产生。Li等人(2006)Nat. Biotechnol.24:210。

用于表达本文所述的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞) (包括dhfr- CHO细胞，其描述于Urlaub 和Chasin (1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220，用DHRF可选标记使用，例如如描述于R. J.Kaufman和P. A. Sharp (1982) Mol.Biol.159:601-621)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。具体地，对于与NSO骨髓瘤细胞使用，另一优选的表达系统是公开于WO 87/04462、WO89/01036和EP 338,841中的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达或更优选地分泌抗体至宿主细胞生长的培养基中的时期来产生抗体。抗体可以使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收。

本发明的抗体多肽链的N末端和C末端可以由于通常观察到的翻译后修饰而与预期序列不同。例如，C末端赖氨酸残基通常从抗体重链中缺失。Dick 等人(2008)Biotechnol.Bioeng.100:1132。N末端谷氨酰胺残基且在更小程度上谷氨酸残基经常在治疗性抗体的轻链和重链上转化为焦谷氨酸残基。Dick等人 (2007) Biotechnol. Bioeng.97:544; Liu等人 (2011) JBC 28611211; Liu等人 (2011) J. Biol. Chem. 286:11211.

VII. 测定

本文所述的抗体可以例如通过标准ELISA测试与TL1A的结合。简言之，将微量滴定板用PBS中1-2 µg/ml的经纯化的TL1A包被，并随后用PBS中的5%牛血清白蛋白封闭。将抗体稀释液(例如，来自TL1A免疫小鼠的血浆稀释液)添加至每一孔并在37^oC下孵育1-2小时。将板用PBS/Tween洗涤并随后与缀合至辣根过氧化物酶(HRP)的二级试剂(例如，对于人抗体而言，山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)在37^oC下孵育1小时。洗涤后，将板用ABTS底物(MossInc, 产品:ABTS-1000)显色并通过分光光度计在OD 415-495分析。来自经免疫小鼠的血清随后进一步通过流式细胞术筛选与表达人TL1A的细胞系但不与不表达TL1A的对照细胞系的结合。简言之，抗TL1A抗体的结合通过将表达TL1A的CHO细胞与以1：20稀释的抗TL1A抗体孵育来评估。将细胞洗涤并用PE标记的抗人IgG Ab检测结合。使用FACScan流式细胞术进行流式细胞术分析(Becton Dickinson, San Jose, CA)。优选地，将发生最高滴度的小鼠用于融合。

上文所述的ELISA测定可用于筛选抗体并且因此筛选产生显示与TL1A免疫原的阳性反应性的抗体的杂交瘤。产生(优选以高亲和力)结合TL1A的抗体的杂交瘤可随后进行亚克隆并进一步表征。然后来自每一杂交瘤的一个克隆(其保留亲代细胞的反应性(通过ELISA))可以选择用于产生细胞库和抗体纯化。

为了纯化抗TL1A抗体，所选的杂交瘤可以在两升旋转瓶(spinner-flask)中生长用于单克隆抗体纯化。可以将上清液过滤并浓缩，随后用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia,Piscataway, NJ)亲和色谱。洗脱的IgG可以通过凝胶电泳和高效液相色谱检查以确保纯度。可以将缓冲液交换至PBS并可以使用1.43消光系数通过OD₂₈₀测定浓度。可以将单克隆抗体进行等分并存储于-80℃。

为了确定所选的抗TL1A单克隆抗体是否结合独特表位，可以将每一抗体使用可商购试剂(Pierce, Rockford, IL)进行生物素化。生物素化的MAb结合可以用链霉抗生物素蛋白标记的探针检测。使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争研究可以使用如上所述的TL1A包被的ELISA板进行。

为了确定纯化抗体的同种型，可以使用对于特定同种型的抗体特异性的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定人单克隆抗体的同种型，可以将微量滴定板的孔用1 µg/ml的抗人免疫球蛋白在4℃包被过夜。用1% BSA封闭后，将板与1 µg /ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度下反应1至2小时。孔随后可以与人IgG1或人IgM特异性的碱性磷酸酶缀合的探针反应。将板显色并如上所述分析。

为了测试单克隆抗体与表达TL1A的活细胞的结合，可以使用流式细胞术，如实施例17中所述。简言之，将表达膜结合的TL1A的细胞系(在标准生长条件下生长)与各种浓度的在含0.1% BSA的PBS中的单克隆抗体在4℃下混合1小时。洗涤后，将细胞与藻红蛋白(PE)标记的抗IgG抗体在与一级抗体染色相同的条件下反应。样品可以通过FACScan仪器使用光和侧散射特性分析以对单细胞门控，并且测定经标记抗体的结合。(除了流式细胞术测定之外，或代替流式细胞术)可以使用使用荧光显微术的替代测定。细胞可如上所述准确染色并通过荧光显微术来检查。该方法允许个别细胞的显现，但取决于抗原密度，可以具有减少的灵敏度。

抗TL1A抗体可以进一步通过蛋白质印迹测试与TL1A抗原的反应性。简言之，可以制备来自表达TL1A的细胞的细胞提取物并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移至硝酸纤维素膜，用20%小鼠血清封闭，并用待测试的单克隆抗体探测。IgG结合可以使用抗IgG碱性磷酸酶检测并且用BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem.Co.,St. Louis, MO)来显色。

用于分析各种抗TL1A抗体的结合亲和力、交叉反应性和结合动力学的方法包括本领域已知的标准测定，例如，BIACORE^®表面等离子共振(SPR)分析(其使用BIACORE^® 2000SPR仪器(Biacore AB, Uppsala, Sweden))。

在一个实施方案中，抗体特异性结合人TL1A的胞外区。抗体可以特异性结合TL1A的胞外结构域内的特定结构域(例如，功能结构域)。在一个具体实施方案中，所述抗体特异性结合TL1A上DR3结合的位点。在某些实施方案中，抗体特异性结合人TL1A的胞外区和食蟹猴TL1A的胞外区。优选地，抗体以高亲和力结合人TL1A。

VIII. 组合物

进一步提供组合物，例如药物组合物，其包含连同药学上可接受的载体一起配制的一种如本文所述的抗TL1A抗体或其抗原结合片段或其组合。

在某些实施方案中，组合物包含抗TL1A抗体，浓度为至少1 mg/ml、5 mg/ml、10mg/ml、50 mg/ml、100 mg/ml、150 mg/ml、200 mg/ml、1-300 mg/ml或100-300 mg/ml。

本文所述的药物组合物还可以以组合疗法(即与其他药剂组合)施用。例如，组合疗法可以包括组合有至少一种其他免疫抑制剂的本文所述的抗TL1A抗体。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，其是生理学上可接受的。优选地，载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊椎或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于施用途径，活性化合物即抗体、免疫缀合物或双特异性分子可以包衣在材料中以保护所述化合物免于酸和其他可能失活化合物的天然条件的作用。

本文所述的药物化合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”指保留母体化合物的期望的生物活性且不赋予任何不想要的毒性作用的盐(参见例如Berge, S.M., 等人(1977) J. Pharm.Sci.66:1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等的酸加成盐以及衍生自无毒有机酸诸如脂族一元和二元羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族磺酸和芳族磺酸等的酸加成盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属诸如钠、钾、镁、钙等的碱加成盐以及衍生自无毒有机胺诸如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的碱加成盐。

本文所述的药物组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

可用于本文所述的药物组合物中的合适的含水和非含水载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油诸如橄榄油和可注射有机酯诸如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料诸如卵磷脂，通过在分散剂的情况下维持期望的颗粒大小和通过使用表面活性剂，维持适当的流动性。

这些组合物还可以包含辅助剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。防止存在微生物可以通过灭菌程序(上文)和通过包括多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保。还可以期望包括等渗剂诸如糖、氯化钠等在组合物中。此外，可注射的药物形式延长的吸收可以通过包含延迟吸收的试剂诸如单硬脂酸铝和明胶来实现。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。使用此类介质和试剂用于药学上有活性的物质是本领域已知的。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或试剂范围之外，其在本文所述的药物组合物中的使用均被考虑。还可以将补充的活性化合物掺入组合物中。

治疗组合物通常必须是无菌的且在制造和储存的条件下是稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳液、脂质体或其他适合于高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣剂诸如卵磷脂，通过在分散的情况下维持期望的颗粒大小和通过使用表面活性剂，维持适当的流动性。在许多情况下，优选可将等渗剂(例如糖、多元醇(诸如，甘露醇、山梨醇)或氯化钠)包括于组合物中。可通过向组合物中包括延迟吸收剂(例如，单硬脂酸盐和明胶)实现可注射组合物的长期吸收。

无菌的可注射溶液可以通过将活性化合物以需要的量掺入具有一种上文列举的成分或其组合的合适的溶剂中(如需要，随后为灭菌微滤)来制备。通常，分散剂通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备，所述无菌的媒介物含有基础分散介质和来自上文列出的那些的需要的其他成分。在用于制备无菌的可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从其之前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何另外的期望的成分的粉末。

可与载体物质组合以产生单一剂型的活性组分的量将取决于所治疗受试者和具体施用模式而不同。可与载体物质组合以产生单一剂型的活性组分的量将通常为产生治疗效果的组合物的那种量。通常，以百分之百计，该量范围将为活性组分的约0.01%至约99%，优选约0.1%至约70%，最优选活性组分与药学上可接受的载体的组合的约1%至约30%。

给药方案进行调整以提供最佳的期望应答(例如，治疗性应答)。例如，单次大剂量(bolus)可以施用，几次分开的剂量可以随时间施用，或者剂量可以随治疗情形的紧急情况所示而按比例降低或增加。为了容易施用和剂量的一致性，尤其有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物。如本文所用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上分离的单位(physically discrete units)；每一单位含有经计算产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物和必需的药物载体。对本文所述的剂量单位形式的规格由(a)活性化合物的独特特征和待实现的具体治疗效果以及(b)在调配此类用于治疗个体中敏感性的活性化合物的领域中固有的限制所指明且直接取决于它们。

对于施用抗体，剂量范围为约1-100 mg/kg，且更通常1-50 mg/ml的宿主体重。例如，剂量可以为40 mg/kg体重、30 mg/kg体重、20 mg/kg体重、15 mg/kg体重、10 mg/kg体重或5 mg/kg体重或在1-20 mg/kg的范围内。示例性治疗方案包括每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次、每月一次、每3个月一次或每3-6个月一次。

抗体可以作为缓释制剂施用，在这种情况下需要较低频率施用。剂量和频率取决于抗体在患者中的半衰期而不同。通常，人抗体显示最长的半衰期，随后为人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可以取决于治疗为维持还是治疗性的而不同。在维持应用中，在长时期以相对较少的间隔施用相对低剂量。一些患者持续接受治疗，持续其一生。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔的相对高剂量，直至疾病进展减轻或终止，并且优选直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。随后，可以向患者施用维持方案。

本文所述的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以改变，从而获得这样的活性成分的量，其有效地实现对特定患者、组合物和施用模式而言的期望的治疗应答。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用的本文所述的具体组合物的活性、其酯、盐或酰胺、施用途径、施用时间、所用的具体化合物的排泄速率、治疗持续时间、其他药物、与所用的具体化合物组合使用的化合物和/或材料，被治疗的患者的年龄、性别、体重、病况和总体健康和早期医疗史，和医疗领域众所周知的其他因素。

本文所述的抗TL1A抗体的“治疗有效剂量”优选可降低疾病症状的严重程度，增加无疾病症状时段的频率和持续时间或预防因患病所致所致的损害或失能。

本文所述的组合物可以使用本领域已知的多种方法的一种或多种经一种或多种施用途径来施用。如技术人员将理解的，施用途径和/或模式将根据期望的结果而不同。用于本文所述的抗体的优选施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊椎或其他肠胃外施用途径，例如，通过注射或输注。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、和胸骨内注射和输注。

或者，本文所述的抗体可以经非肠胃外途径施用，诸如施用的局部、表皮或粘膜途径，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部地。

活性化合物可以用载体来制备，所述载体将保护化合物免于快速释放，诸如受控释放制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化的递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、和聚乳酸。许多用于此类制剂制备的方法是获专利的或本领域技术人员通常已知的。参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.Robinson, 编辑, Marcel Dekker,Inc., New York, 1978。

治疗组合物可以用本领域已知的医疗装置施用。例如，在优选的实施方案中，本文所述的治疗组合物可以用无针皮下注射装置施用，诸如公开于以下中的装置：美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556。与本文所述的抗TL1A抗体使用的众所周知的植入物和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开以控制速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利号4,486,194，其公开用于经皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开用于持续药物递送的变速流可植入输注设备；美国专利号4,439,196，其公开具有多室隔室的渗透药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其公开渗透药物递送系统。这些专利通过引用并入本文。许多其他此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。

IX. 用途和方法

本文所述的抗体、抗体组合物和方法具有大量涉及例如通过阻断TL1A信号传递或检测TL1A来抑制免疫应答的体外和体内应用。在优选的实施方案中，本文所述的抗体是人抗体。例如，本文所述的抗TL1A抗体可以体外或离体施用于培养中的细胞，或者施用于人受试者(例如体内)以抑制多种疾病中的免疫。因此，本文提供改变受试者中的免疫应答的方法，其包括向受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段，使得受试者中的免疫应答被修饰。优选地，所述应答被抑制、遏制或下调。

还涵盖的是用于检测样品中存在人TL1A抗原或测量人TL1A抗原的量的方法，其包括在允许特异性结合人TL1A的人单克隆抗体或其抗原结合片段与人TL1A之间形成复合物的条件下，将样品和对照样品与所述抗体或其片段接触。随后检测复合物的形成，其中样品相比于对照样品之间复合物形成的差异表明样品中存在人TL1A抗原。此外，本文所述的抗TL1A抗体可以用于经免疫亲和纯化来纯化人TL1A。

实施例

实施例1

TL1A免疫和融合

KM免疫：

为了生成针对TL1A的完全人单克隆抗体，用纯化的重组TL1A抗原(R&D Systems 1319-TL/CF)免疫KM小鼠^TM (表1)。

表1 TL1A融合物2596

将Ribi佐剂中的15μg可溶性TL1A加5μg TNP标记的TL1A在第0天、第5天、第8天、第11天、第15天和第18天SC加肘关节注射，随后在第22天进行融合。

将15μg天然抗原和5μg TNP修饰的抗原于Ribi佐剂中的混合物在第0天、第5天、第8天、第11天、第15天和第18天在肘关节加多个部位皮下(SC)注射，然后在第22天融合脾细胞和淋巴结B细胞。TNP修饰的TL1A通过如下制备：将5μl苦基磺酸(Sigma 92822)与1 mgTL1A在4℃下混合4小时，随后用PBS过夜透析。

产生针对BTLA的人单克隆抗体的杂交瘤的生成：

将从KM小鼠^TM分离的淋巴细胞通过电融合与小鼠骨髓瘤细胞系融合。电融合通过如下完成：使用电流在Cytopluse^TM融合皿中的电极之间对齐淋巴细胞和骨髓瘤细胞，且然后短暂地增加穿过细胞膜的电势。短暂的电流脉冲使膜去稳定，打开相邻细胞之间的孔。在该过程期间，相邻细胞的膜融合，导致产生杂交的骨髓瘤：淋巴细胞(杂交瘤)细胞。

将来自免疫小鼠的淋巴细胞的单细胞悬浮液通过电融合与相等数量的P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)融合。将细胞以约2.5 x 10⁴铺板于平底微量滴定板中，随后在含有10％ FBS、3-5% Origen (IGEN)、OPI补充剂(Sigma O 5003:1.1 x 10^-3 M草酰乙酸、4.5 x10^-4 M丙酮酸钠、4 mM L-谷氨酰胺、0.055 mM 2-巯基乙醇和1X HAT (Sigma H0262)的选择性培养基中孵育。约一周后，将细胞在其中HAT用HT替代的培养基(Sigma H0137)中培养。然后通过自动化均相测定来筛选各别孔，以选择产生人IgG κ抗体的孔。随后，通过ELISA在TL1A抗原包被的板上筛选这些人IgG阳性孔，以选择分泌TL1A特异性人IgG κ抗体的杂交瘤。将分泌抗体的杂交瘤重新铺板至24孔板，再次筛选，并且如果它们仍产生对TL1A特异性的抗体，则将细胞在-80℃冷冻保存或保存在液氮(LN2)中。将抗TL1A单克隆抗体通过有限稀释来亚克隆至少两次。然后在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中生成少量抗体用于进一步表征。通过在LN2中冷冻来保存冷冻的亚克隆的等分试样。

用于该杂交瘤：TL1A 2596.10A4.F7.2E8的命名方案如下。该抗体对TL1A特异性，并衍生自融合物2596。亲代克隆分离自平板10孔A4。10A4.F7是亲代克隆10A4的亚克隆，而10A4.F7.2E8是10A4.F7的亚克隆。

抗体与抗原结合的表征

本公开的抗体可以例如通过标准ELISA测试与TL1A的结合。简言之，将微量滴定板用PBS中1.0 µg/ml的经纯化的TL1A包被，并随后用PBS/tween中的1%牛血清白蛋白封闭。将抗体稀释液(例如，来自TL1A免疫小鼠的血浆稀释液或细胞培养上清液)添加至每一孔并在环境温度下孵育1-2小时。将板用PBS/Tween洗涤并随后与缀合至辣根过氧化物酶的二级试剂(例如，对于人抗体而言，山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)在环境温度下孵育1小时。洗涤后，将板用ABTS (2,2'-连氮基- 双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)底物(MossSubstrates, 1.46 mmol/L)显色并在405的OD分析。

如上文所述的ELISA测定也可用于筛选显示与TL1A免疫原的阳性反应性的杂交瘤。以高亲合力结合TL1A的杂交瘤可进行亚克隆并进一步表征。来自每一杂交瘤的一个克隆(其保留亲代细胞的反应性(通过ELISA))可以选择用于制备5-10小瓶细胞库(储存在-140℃)且用于抗体纯化。

为了纯化抗TL1A抗体，所选的杂交瘤可以在组织培养烧瓶中生长至1-2L的体积用于单克隆抗体纯化。可以将上清液过滤并浓缩，随后用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia,Piscataway, NJ)进行亲和色谱。洗脱的IgG可以通过凝胶电泳和高效液相色谱检查以确保纯度。可以将缓冲液交换至PBS并可以使用1.43消光系数通过OD₂₈₀测定浓度。可以将单克隆抗体进行等分并存储于-80 ℃。

为了确定所选的抗TL1A单克隆抗体是否结合独特表位，可以将每一抗体使用可商购试剂(Pierce, Rockford, IL)进行生物素化。使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争研究可以使用如上所述的TL1A包被的ELISA板进行。可以用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶探针检测生物素化的mAb结合。另外，可以通过FACS对TL1A-CHO细胞进行类似的竞争研究。可以用抗人Ig-藻红蛋白探针检测TL1A抗体与细胞的结合。

为了确定纯化抗体的同种型，可以使用对于特定同种型的抗体特异性的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定人单克隆抗体的同种型，可以将微量滴定板的孔用1 µg/ml的抗人免疫球蛋白在4℃包被过夜。用1% BSA封闭后，将板与1 µg /ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度下反应1至2小时。孔随后可以与人IgG1或人IgM特异性的辣根过氧化物酶缀合的探针反应。将板显色并如上所述分析。

FACS测定用于验证本公开的抗体结合细胞上表达的天然TL1A。简而言之，将抗体于PBS 1% BSA加0.5％叠氮化钠(FACS缓冲液)中的稀释液与表达TL1A的转染的CHO细胞(10⁵个细胞)在4℃下孵育30-60分钟。将细胞通过离心、抽吸上清液和添加新鲜的FACS缓冲液来洗涤两次。抗体与细胞上的TL1A的结合通过如下检测：将细胞在PE(藻红蛋白)标记的山羊抗人IgG (Fc特异性)抗体中在4℃下孵育30分钟，如上所述洗涤细胞2次，并通过FACS分析(图1)。

阻断TL1A与DR3结合的抗TL1A抗体的鉴定也通过FACS通过使用结合CHO细胞(DR3CHO)上表达的hDR3的可溶性TL1A-SH6蛋白(his标记的)来进行。将抗TL1A或对照抗体与TL1A SH6抗原以0.1-0.5 ug/ml在FACS缓冲液中孵育30分钟，且然后将hDR3 CHO细胞添加至抗体TL1A混合物中并孵育30分钟。洗涤细胞并用PE抗His抗体、随后FACS检测TL1A与hDR3CHO细胞的结合。阻断性抗体阻止TL1A SH6与hDR3 CHO细胞结合(图2)。

实施例2

抗TL1A抗体纯化

来自杂交瘤的原始抗TL1A抗体1490-2596-10A4.F7.2E8在CHO细胞中表达为重组蛋白，并被称为TL1A.2。该蛋白表达为G4P Fc版本以及G1.1f Fc版本。在MabSelectSure蛋白A柱上纯化从CHO细胞获得的上清液。简而言之，将CHO上清液上样至蛋白A柱上，所述蛋白A柱用PBS(磷酸盐缓冲盐水)，pH7.4预平衡。在样品上样后，用PBS充分洗涤柱，随后使用0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0)洗脱结合的蛋白。立即通过添加适量的1M Tris缓冲液来使洗脱的蛋白达到中性pH。然后通过充分透析来将样品缓冲液交换至PBS中。

通过测量蛋白在280 nm处的吸光度来测定纯化抗体的浓度。在280nm处1.4的吸光度被认为等于1mg/mL的抗体。通过Bioanalyzer以及CE-SDS方法证实抗体的纯度。通过LAL动力学方法测量纯化样品中的内毒素水平。

通过SEC-HPLC以及SEC-MALLS方法测定聚集水平。通过Edman测序通过确定抗体的轻链和重链的N-末端氨基酸序列来证实抗体的身份。通过LC-MS方法测定抗体的轻链和重链的质量。使用TSK Ether 5PW柱通过疏水相互作用色谱法评估抗体的异质性。通过使用PNGAse F酶从抗体去除聚糖结构、荧光标记寡核苷酸和通过毛细管电泳方法进一步分析来确定抗体的寡糖概况。

实施例3

载体构建和表达

通过利用V_K克隆MP.1_06132012-A06作为模板的PCR来扩增10A4 VK，并克隆至含有骨粘连蛋白信号序列和人κ恒定区的载体pICOFSCneoK中，生成质粒pICOFSCneoK(TL1A.10A4)。

通过利用V_H克隆MP.1_06132012-E02作为模板的PCR来扩增10A4 VH，并克隆至含有骨粘连蛋白信号序列和人IgG4-S228P恒定区的载体pICOFSCpurG4P中，生成质粒pICOFSCpurG4P(TL1A.10A4)。将质粒pICOFSCpurG4P(TL1A.10A4)和pICOFSCneoK(TL1A.10A4)共转染至CHO-S细胞中，并选择稳定的合并物并按比例放大用于表达TL1A.2-g4P用于研究用途。

实施例4

亲和力测量的方案

蛋白G芯片(CM5)通过使用乙酸盐缓冲液(pH2.9)将其包被~400Rus来制备。在蛋白G表面上以10uL/min流速捕获10A4.F7 mab (7.5ug/mL, 12uL)。将多种浓度(250、200、150、100和50n)的Hu-TL1A-His抗原(批号50182AS151)以25ul/min流过捕获的mab 5分钟，并使其解离7.5分钟。用10uL 50mM NaOH和5uL 25mM HCL以100uL/min流速再生蛋白G表面。通过使用Biaevaluation 3.1分析数据。(图3)

实施例5

表位结合的方案

将10A4.A7 (4.6KRUs)、17H11.C2 (6.3KRUs)和10A6.B6 (9.6KRUs)包被在CM5芯片上。将Mabs以30ug/mL开始往下滴定(1:3)并与25n Hu-TL1A-His抗原一起孵育~2小时。将抗体-抗原复合物注射在mab包被的表面上2.5分钟。用25mM NaOH再生表面。使用log [Ab] vs.响应来生成图，其中抗体-抗原复合物信号的减少显示相同的表位箱。(图4)

实施例6

通过DSC的10A4.7的物理稳定性

通过DSC完成10A4.7的物理稳定性 图5。

实施例7

可变区测序

从杂交瘤克隆1490.2596.10A4.F7.2E8制备总RNA，并一式两份制备V_H和V_K cDNA。通过cDNA末端的快速扩增(RACE)程序，使用与5’ RACE通用引物混合物配对的3’人特异性恒定区引物，扩增抗体的可变区。将所得的含有可变区的PCR产物克隆至pCR4-TOPO载体中。从TOPO克隆制备Templiphi样品并进行DNA测序。针对框内重排和其他抗体特征分析所得DNA序列。选择来自克隆MP.1_06132012-E02的V_H序列(图7和8)和来自克隆MP.1_06132012-A06的V_K序列(图6和9)作为代表性序列。

实施例8

通过HDX-MS的TL1A/10A4表位作图

氢/氘交换质谱(HDX-MS)方法通过监测骨架酰胺氢原子的氘交换速率和程度来探测溶液中的蛋白构象和构象动力学。HDX的水平取决于骨架酰胺氢原子和蛋白氢键的溶剂可及性。HDX时蛋白的质量增加可以通过MS精确测量。当该技术与酶促消化配对时，可以解析肽水平的结构特征，从而能够区分表面暴露的肽和折叠在内部的那些。通常，进行氘标记和随后的淬灭实验，然后是在线胃蛋白酶消化、肽分离和MS分析。

对具有抗TL1A mAb (10A4)的TL1A三聚体和具有10A4 Fab的TL1A三聚体进行表位作图。表位作图实验之前，进行非氘化实验以产生一系列重组全长人TL1A三聚体的普通肽(peptic peptide)(4 µM)和TL1A三聚体与10A4或TL1A三聚体与10A4 Fab(1：3摩尔比)的蛋白复合物，对于TL1A实现80%序列覆盖率。在HDX-MS实验中，将5 µL的各样品(TL1A或具有mAb/Fab的TL1A)稀释至55 µL的D₂O缓冲液(10 mM磷酸盐缓冲液，D₂O, pD7.0)以开始标记反应。将反应进行不同时期：30秒、5分钟、20分钟、60分钟和240分钟。各标记反应期结束时，通过添加淬灭缓冲液(100 mM磷酸盐缓冲液，含有4M GdnCl, pH 2.5, 1:1, v/v)将反应淬灭，并将50 µL的淬灭样品注射入Waters HDX-MS系统用于分析。在不存在/存在10A4或10A4Fab的情况下监测普通消化的肽的氘摄取水平(图10)。

实施例9

通过计算建模的TL1A/10A4表位作图

使用TL1A三聚体的结构，进行计算分析。TNF样配体1A (TL1A)结合其同源受体DR3和诱饵受体DcR3。TL1A属于常规TNF配体家族，其目前包括八个其他成员：FasL、LIGHT、TNFα、LTα、LTβ、TRAIL、RANKL和CD40L。

人TL1A由251个氨基酸组成：胞质结构域中35个，跨膜区中24个，和细胞外结构域中192个。在TL1A氨基酸序列中存在两个潜在的N-连接的糖基化位点，在位置133和229的Asn残基。TL1A结构显示TNF超家族典型的果冻卷折叠。TNF超家族的成员是II型跨膜蛋白，其形成非共价同三聚体，其采用TNF家族典型的果冻卷折叠，其中内部和外部β片层分别由A′ AHCF和B′ BGDE链构成。紧密堆积的三聚体是TNF超家族典型的。埋入三聚组装物中的每种单体的溶剂可及表面积是1977 Å 2，与在其他稳定的三聚TNF配体中观察到的溶剂可及表面积(TNFα，2412 Å2；TRAIL，2261 Å2；CD40L，2091 Å2)相当。与其他常规TNF配体类似，TL1A的亚基界面由一个单体(E和F链)中β-三明治的边缘和相邻单体(A、H、C和F链)的内片层之间的相互作用形成。该界面的中心区域主要由疏水残基构成，其中来自每个单体的F81、Y146、F182和L184定位成有助于三聚体的疏水核心。在其他常规TNF配体中这四个位置的相应残基通常是保守的，并形成最普遍的结构域间疏水接触。

通过HDX鉴定的TL1A的两个区域被作图至TL1A结构上，图12。个别单体骨架带颜色为灰色、绿色和黄色。肽区域1(呈洋红色)和肽区域2(呈蓝色)形成暴露于溶剂的不连续表位。图13显示对于10A4 mAb具有FAB模型(红色= H链，粉红色= L链)的TL1A三聚体，其显示TL1A中的不连续表位将需要来自重链和轻链的相互作用。蛋白复合物的计算评价显示，位于蛋白界面的选定残基可以显著促进蛋白-蛋白相互作用能量。已显示促进蛋白相互作用的残基包括芳族氨基酸(Tyr、Phe、Trp)、碱性氨基酸(Arg、Lys)、酸性氨基酸(Asp、Glu)和极性氨基酸(Gln、Asn、Ser、Thr)。

表2和3含有对应于肽区域1和2的暴露氨基酸的计算评价。该表显示侧链暴露和侧链暴露百分比，其可用于评价这些肽区域中功能性残基的可及性。对于肽区域1，表2，有趣的是注意到，E¹⁶⁶、R¹⁶⁸、Q¹⁶⁹、R¹⁷²和K¹⁷⁵具有极端暴露(50-97％)的功能性氨基酸侧链。有趣的是，与区域1 ¹⁶⁹QAGR¹⁷²的肽片段化MS空间表位的数据具有良好的相关性，其中最暴露的残基Q¹⁶⁹为97％。R¹⁶⁸和R¹⁷²两者均在TL1A结构中邻近于Q¹⁶⁹，表明建模、三维结构和HDX实验的相关性。

表2 对应于肽区域1的暴露氨基酸的计算评价

对于肽区域2，最暴露的功能性残基是H¹¹¹、F¹¹²、K¹¹³和N¹¹⁴。这些功能性氨基酸也是非常暴露的，62-93％，并形成不连续表位的第二大部分。通过建模鉴定的功能性残基与通过片段化MS ¹¹³KNQF¹¹⁶鉴定的区域2的MS空间表位相关。

表3 对应于肽区域2的暴露氨基酸的计算评价

总之，结构建模和HDX数据定义了TL1A表面上与10A4 mAb互补位接触的不连续表位。

实施例10

T细胞增殖测定

将1µg/ml-0.219µg/ml的TL1A抗体10A4.F7.2E8 huIgG4的剂量响应曲线与抗人CD3(Biolegend 300314)在37℃、5% CO2下孵育30分钟，然后添加StemCell试剂盒(19052)富集的CD4+人T细胞。在37℃、5% CO2下孵育4天后，添加3H-胸苷(0.5μCi/孔)，持续最后18-20小时。使用Packard Filtermate收集器将板收获至Unifilter GF/C板(Packard 5007185)上并使其干燥。添加50μl/孔PerkinElmer Microscint-20闪烁剂，并将板在PackardTopCount闪烁计数器上计数。通过使用GraphPad Prism软件绘制最大值百分比减去背景来计算EC50值。

表4 抗CD3驱动的T细胞增殖测定(Hu CD4 + T细胞)(2.45mg/ml)

实施例11

人PBMC IFNg抑制测定(可溶性TL1A刺激)

将3ug/ml-0.3ng/ml的TL1A抗体10A4.F7.2E8 huIgG4的剂量响应曲线与50ng/ml人TL1A(内部)加0.25ng/ml hIL-12 (Peprotech)和1ng/ml hIL-18 (R&D Systems)在具有分离自全人血液的PBMC的96孔圆底板中一起孵育。在37℃、5% CO2下孵育过夜后，收获上清液并用匹配的成对夹心ELISA抗体(Thermo Scientific)测试IFNg水平。通过使用GraphPadPrism软件绘制最大值百分比减去背景来计算EC50值。

表5 TL1A+IL-12+IL-18驱动的IFNg (Hu PBMCs) (2.45mg/ml)

表6 TL1A+IL-12+IL-18驱动的IFNg (Hu PBMCs) (5.9mg/ml)

实施例12

人PBMC IFNg抑制测定(表达TL1A的CHO细胞刺激)

将3ug/ml-0.3ng/ml的TL1A抗体10A4.F7.2E8 huIgG4的剂量响应曲线与经辐照的表达TL1A的CHO细胞加0.25ng/ml hIL-12 (Peprotech)和1ng/ml hIL-18 (R&D Systems)在具有分离自全人血液的PBMC的96孔圆底板中一起孵育。在37℃、5% CO2下孵育过夜后，收获上清液并用匹配的成对夹心ELISA抗体(Thermo Scientific)测试IFNg水平。通过使用GraphPad Prism软件绘制最大值百分比减去背景来计算EC50值。

表7 表达TL1A的CHO细胞+IL-12+IL-18驱动IFNg (Hu PBMCs) (2.45mg/ml)

实施例13

人T细胞IFNg抑制测定

将3ug/ml-0.3ng/ml的TL1A抗体10A4.F7.2E8 huIgG4的剂量响应曲线与50ng/ml人TL1A(内部)加0.5ng/ml hIL-12 (Peprotech)和5ng/ml hIL-18 (R&D Systems)在具有Stem Cell (19051)富集的人T细胞的96孔圆底板中一起孵育。在37℃、5% CO2下孵育过夜后，收获上清液并用匹配的成对夹心ELISA抗体(Thermo Scientific)测试IFNg水平。通过使用GraphPad Prism软件绘制最大值百分比减去背景来计算EC50值。

表8 TL1A+IL-12+IL-18驱动的IFNg (Hu T细胞) (2.45mg/ml)

表9 TL1A+IL-12+IL-18驱动的IFNg (Hu T细胞) (5.9mg/ml)

表10 TL1A+IL-12+IL-18驱动的IFNg (Hu T细胞) (4.8mg/ml)

实施例14

人NK细胞IFNg抑制测定

将3ug/ml-0.3ng/ml的TL1A抗体10A4.F7.2E8 huIgG4的剂量响应曲线与50ng/ml人TL1A(内部)加0.5ng/ml hIL-12 (Peprotech)和1ng/ml hIL-18 (R&D Systems)在具有Stem Cell (19055)富集的人NK细胞的96孔圆底板中一起孵育。在37℃、5% CO2下孵育过夜后，收获上清液并用匹配的成对夹心ELISA抗体(Thermo Scientific)测试IFNg水平。通过使用GraphPad Prism软件绘制最大值百分比减去背景来计算EC50值。

表11 TL1A+IL-12+IL-18驱动的IFNg (Hu NK细胞) (2.45mg/ml)

实施例15

人全血IFNg抑制测定

将3ug/ml-0.3ng/ml的TL1A抗体10A4.F7.2E8 huIgG4的剂量响应曲线与50ng/ml人TL1A(内部)加0.5ng/ml hIL-12 (Peprotech)和5ng/ml hIL-18 (R&D Systems)在具有肝素处理的全人血液的96孔圆底板中一起孵育。在37℃、5% CO2下孵育过夜后，将板以1900rpm离心10分钟，收获血浆并用匹配的成对夹心ELISA抗体(Thermo Scientific)测试IFNg水平。通过使用GraphPad Prism软件绘制最大值百分比减去背景来计算EC50值。

表12 TL1A+IL-12+IL-18驱动的IFNg (Hu WB)(2.45mg/ml)

实施例16

食蟹猴PBMC IFNg抑制测定

将3ug/ml-0.3ng/ml的TL1A抗体10A4.F7.2E8 huIgG4的剂量响应曲线与50ng/ml食蟹猴TL1A(内部)加2ng/ml hIL-12 (Peprotech)和5ng/ml hIL-18 (R&D Systems)在具有分离自全食蟹猴血液的PBMC的96孔圆底板中一起孵育。在37℃、5% CO2下孵育过夜后，收获上清液并用灵长类动物ELISA试剂盒(R&D Systems)测试IFNg水平。通过使用GraphPad Prism软件绘制最大值百分比减去背景来计算EC50值。

表13 TL1A+IL-12+IL-18驱动的IFNg (Cyno PBMCs)(2.45mg.ml)

实施例17

人pNFkB抑制测定

将TL1A抗体10A4.F7.2E8 huIgG4的剂量响应曲线与0.5 μg/ml人TL1A(内部)在37℃、5% CO2下与肝素处理的全人血液在96孔深孔板中孵育15分钟。在刺激后，将细胞裂解/固定，透化，并用适当的抗体组染色。在流式细胞仪上进行测量，并在TreeStar的FlowJo分析软件上进行分析。使用GraphPad Prism软件计算EC50值。

表14 Hu全血中TL1A驱动的磷酸化NFkB (2.45mg/ml)

Claims (16)

1.分离的抗体或其抗原结合片段，其与抗体10A4竞争结合人TL1A(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)。

2.分离的抗体或其抗原结合片段，其在表位处结合TL1A，所述表位包含残基102-116(SEQ ID NO:16)或166-180 (SEQ ID NO:17)中的一个或多个。

3.权利要求2的分离的抗体或抗原结合片段，其在表位处结合TL1A，所述表位包含残基¹⁶⁹QAGR¹⁷²中的一个或多个和残基¹¹³KNQF¹¹⁶中的一个或多个。

4.权利要求2的分离的抗体或抗原结合片段，其在表位处结合TL1A，所述表位包含序列¹⁶⁹QAGR¹⁷²和/或¹¹³KNQF¹¹⁶。

5.前述权利要求中任一项的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段实质上抑制人TL1A与DR3的结合。

6.权利要求1-4中任一项的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体结合人和食蟹猴TL1A两者。

7.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体10A4进一步包含：

a) 重链可变结构域，其包含：

i) 包含SEQ ID NO:7的序列的CDRH1，

i) 包含SEQ ID NO:8的序列的CDRH2；和

i) 包含SEQ ID NO:9的序列的CDRH3；

和

b) 轻链可变结构域，其包含：

i) 包含SEQ ID NO:12的序列的CDRL1；

i) 包含SEQ ID NO:13的序列的CDRL2；和

i) 包含SEQ ID NO:14的序列的CDRL3。

8.权利要求7的分离的抗体或抗原结合片段，其包含一条或多条重链和一条或多条轻链，其中：

a) 所述重链包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少80％序列同一性的重链可变区；且

a) 所述轻链包含与SEQ ID NO:11的序列具有至少80％序列同一性的轻链可变区。

9.分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是10A4，其包含：

a) 重链可变结构域，其包含：

i) 包含SEQ ID NO:7的序列的CDRH1，

i) 包含SEQ ID NO:8的序列的CDRH2；和

i) 包含SEQ ID NO:9的序列的CDRH3；

和

b) 轻链可变结构域，其包含：

i) 包含SEQ ID NO:12的序列的CDRL1；

i) 包含SEQ ID NO:13的序列的CDRL2；和

i) 包含SEQ ID NO:14的序列的CDRL3，

其中所述抗体或片段实质上抑制人TL1A与DR3的结合。

10.权利要求9的分离的抗体或抗原结合片段，其包含一条或多条重链和一条或多条轻链，其中：

a) 所述重链包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少80％序列同一性的重链可变区；且

a) 所述轻链包含与SEQ ID NO:11的序列具有至少80％序列同一性的轻链可变区，

其中所述抗体或片段实质上抑制人TL1A与DR3的结合。

11.前述权利要求中任一项的分离的抗体，其中所述抗体是具有降低或消除的效应物功能的人IgG1 Fc变体。

12.核酸，其编码前述权利要求中任一项的抗体或抗原结合片段的重链和/或轻链可变区。

13.表达载体，其包含权利要求12的核酸分子。

14.用权利要求13的表达载体转化的宿主细胞。

15.产生抗TL1A抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在允许产生所述抗体或片段的条件下培养权利要求14的宿主细胞，并从所述细胞纯化所述抗体。

16.检测样品中TL1A的存在的方法，其包括在允许权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合片段和TL1A之间形成复合物的条件下使所述样品与所述抗体或其抗原结合片段接触，并检测所述复合物的形成。