CN103261228A - 针对人tnf样配体1a(tl1a)的人抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了特异性结合和抑制人TNF样配体1A(hTL1A)的全人抗体或人抗体的抗原结合片段。人抗hTL1A抗体可用于治疗与TL1A相关的疾病或病症，例如炎性疾病或病症，例如包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病在内的炎性肠病、类风湿性关节炎等；自身免疫疾病或病症，例如多发性硬化、糖尿病等；和变应性反应，例如哮喘和变应性肺炎。

Description

针对人TNF样配体1A(TL1A)的人抗体
技术领域
本发明涉及与人TNF样配体1A(hTL1A)特异性结合的人抗体和人抗体的抗原结合片段，还涉及使用这些抗体的治疗性方法。
背景技术
TL1A是肿瘤害坏死因子超家族(TNFSF)的II型细胞膜蛋白，也称作TNFSF15。其在内皮细胞和造血品系的活化细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、固有层单核细胞(lamina propria mononuclear cell)、树突细胞和浆细胞)的表面表达(Tan，K.B.等，1997，Gene204：35-46；Prehn，J.L.等，2007，JImmunol178：4033-4038)。其也在肾脏、肺、前列腺和胸腺内表达(Tan等，1997，同上)。在内皮细胞中，TL1A的表达被IL-1α和TNFα上调(Migone，T.S.等，2002，Immunity16：479-492)。在人新鲜血液单核细胞和单核细胞衍生的树突细胞中，TL1A的表达被FcγR介导(FcγR-mediated)或Toll样受体(TLR)信号转导上调(Prehn等，2007，同上；Meylan，F.等，2008，Immunity29：79-89)。TL1A可以通过相似于TNFα的机制从细胞膜上被切割并且已经报道了TL1A的可溶性胞外结构域形式(Migone等，2002，同上；Kim，S.等，2005，J ImmunolMethods298：1-8；Yang，C.R.等，2004，Cancer Res64：1122-1129)。蛋白质测序已经证实在残基Ala-71和Leu-72之间切割膜锚定前体之后释放这种形式的TL1A(Migone等，2002，同上)。已经鉴定了可能编码TL1A的N末端截短形式的两种变体cDNA：VEGI-174(或TL1)(Zhai，Y.等，1999，FASEB J13：181-189)和VEGI-192(Chew，L.J.等，2002，FASEB J16：742-744)。已发表的数据表明TL1A基因的生物学活性产物是全长II型跨膜蛋白(残基1-251)及其蛋白水解切割的胞外结构域(残基72-251)(Migone等，2002，同上；Jin等，2007，Biochem Biophys Res Commun364：1-6)。US6,521,422公开了hTL1A的被称为“Fhm”的变体，其包含用Arg替换Gln-167的单个氨基酸替换。
TL1A通过其同源受体死亡受体3(DR3，也称作TNFRSF25，核酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO：251和252)介导信号，导致细胞存活的促进和促炎性细胞因子的分泌，或凋亡的促进(以环境依赖的方式)。TL1A是与内源可溶性诱骗受体(endogenous soluble decoy receptor)DcR3(也称作TR6、NTR3或TNFRSF21，核酸和氨基酸序列分别为SEQID NO：253和254)结合的三种已知配体(另外的是FasL和LIGHT)之一(Migone等，2002，同上；Yang C.R.等，2004，Cancer Res64：1122-1129)。
DR3是大多数活化的T淋巴细胞和NK细胞上表达的TNF受体相关的死亡结构域受体(Migone等，2002，同上；Screaton G.R.等，1997，ProcNatl Acad Sci(USA)94：4615-4619)。TL1A接触T细胞上的DR3，增强其对IL-2的响应性(Migone等，2002，同上)，增强T细胞的增殖以及释放IFNγ和GM-CSF(在次优共刺激的条件下)(Migone等，2002，supra；Meylan等，2008，同上)。还证实TL1A协同次优水平的IL-12/IL-18以诱导CD4+T细胞产生IFNγ(Papadakis，K.A.等，2004，J Immunol172：7002-7007；Prehn，J.L.等，2004，Clin Immunol112：66-77；Papadakis，K.A.等，2005，J Immunol174：4985-4990；Cassatella，M.A.等，2007，JImmunol178：7325-7333)。
TL1A参与多种炎性疾病和/或自身免疫疾病，包括炎性肠病[例如，溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病(CD)]、类风湿性关节炎、多发性硬化(MS)、动脉粥样硬化等(见Bayry，J.，2010，Nature Reviews/Rheumatology6：67-68；Takedatsu，H.等，2008，Gastroenterology135：552-567；Prehn等，2004，同上；Bamias，G.等，2008，Clin Immunol129：249-255；Bull，M.J.等，2008，J Exp Med205：2457-2464；Pappu，B.P.等，2008，J Exp Med205：1049-1062；Bamias，G.等，2003，J Immunol171：4868-4874；Kang，Y.等，2005，Cytokine29：229-235)。尽管大多数已发表的数据与TL1A在驱动TH1和TH17效应子功能分化中的关键作用一致，但是最近的研究提出了TL1A/DR3相互作用在哮喘模型中发展TH2T细胞应答的作用(Fang，L.等，2008，J Exp Med205：1037-1048)。因此，单独使用TL1A抑制剂(例如以高亲和力和中和活性针对TL1A的全人抗体)或将其与当前可得的抗炎剂、免疫抑制剂(例如，TNF-α拮抗剂、可的松或类固醇等)和/或抗过敏剂(anti-allergy agent)组合提供了对这些疾病和病症的有效治疗。
人TL1A的核酸和氨基酸序列分别在SEQ ID NO：243和244示出，Fhm的核酸和氨基酸序列分别在SEQ ID NO：245和246示出。在例如US7,597,886、US7,820,798和US2009/0280116中公开了针对TL1A的抗体。
发明概述
在第一个方面，本发明提供了特异性结合和中和人TL1A(hTL1A)活性的全人单克隆抗体(mAb)及其抗原结合片段。
抗体可以是全长的(例如，IgG1或IgG4抗体)或可仅包含抗原结合部分(例如，Fab、F(ab’)2或scFv片段)，并且可被修饰以影响功能，例如去除剩余的效应子功能(Reddy等，2000，J.Immunol.164：1925-1933)。
在一个实施方案中，本发明提供这样的抗体或抗体的抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、118、134、138、154、158、174、178、194、198、214、218和234或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性之基本相似序列的重链可变区(HCVR)。在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含具有选自SEQ ID NO：2、18、34、50、66、134、174和234之氨基酸序列的HCVR。在另一实施方案中，所述抗体或其片段包含含有SEQ ID NO：2、18、174或234的HCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其片段还包含选自SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226和236或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性之基本相似序列的轻链可变区(LCVR)。在另一个实施方案中，所述抗体或抗体的抗原结合部分包含具有选自SEQ IDNO：10、26、42、58、74、136、176和236之氨基酸序列的LCVR。在又一实施方案，所述抗体或其片段包含含有SEQ ID NO：10、26、176或236的LCVR。
在另一些实施方案中，所述抗体或其片段包含选自SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/116、118/126、134/136、138/146、154/156、158/166、174/176、178/186、194/196、198/206、214/216、218/226和234/236的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列对。在一个实施方案中，所述抗体或其片段包含选自SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、134/136、174/176和234/236氨基酸序列对的HCVR和LCVR。在另一实施方案中，所述抗体或其片段包含含有SEQ IDNO：2/10、18/26、174/176或234/236的HCVR/LCVR对。
在第二个方面，本发明提供这样的抗体或抗体的抗原结合片段，其包含：选自SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、124、144、164、184、204和224或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性之基本相似序列的重链互补决定区3(HCDR3)氨基酸序列；以及选自SEQ ID NO：16、32、48、64、80、96、112、132、152、172、192、212和232或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性之基本相似序列的轻链CDR3(LCDR3)氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体或其片段包含含有SEQ ID NO：8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/112、124/132、144/152、164/172、184/192、204/212或224/232的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。在另一实施方案中，所述抗体或其片段包含含有SEQ ID NO：8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、124/132、164/172或224/232的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。在又一实施方案中，所述抗体或其片段包含含有SEQ ID NO：8/16、24/32、164/172或224/232的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。
在另一实施方案中，本发明提供这样的抗体或其片段，其还包含：选自SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、120、140、160、180、200和220或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性之基本相似序列的重链CDR1(HCDR1)氨基酸序列；选自SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、122、142、162、182、202和222或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性之基本相似序列的重链CDR2(HCDR2)氨基酸序列；和/或选自SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、128、148、168、188、208和228或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性之基本相似序列的轻链CDR1(LCDR1)氨基酸序列；和/或选自SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、130、150、170、190、210和230或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性之基本相似序列的轻链CDR2(LCDR2)氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体或其片段包含选自SEQ ID NO：4/6/8、20/22/24、36/38/40、52/54/56、68/70/72、84/86/88、100/102/104、120/122/124、140/142/144、160/162/164、180/182/184、200/202/204和220/222/224的HCDR1/HCDR2/HCDR3组合；和/或选自SEQ ID NO：12/14/16、28/30/32、44/46/48、60/62/64、76/78/80、92/94/96、108/110/112、128/130/132、148/150/152、168/170/172、188/190/192、208/210/212和228/230/232的LCDR1/LCDR2/LCDR3组合。在另一实施方案中，所述重链和轻链CDR氨基酸序列包含选自SEQ IDNO：4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、36/38/40/44/46/48、52/54/56/60/62/64、68/70/72/76/78/80、84/86/88/92/94/96、100/102/104/108/110/112、120/122/124/128/130/132、140/142/144/148/150/152、160/162/164/168/170/172、180/182/184/188/190/192、200/202/204/208/210/212和220/222/224/228/230/232的CDR序列组合。在另一实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、36/38/40/44/46/48、52/54/56/60/62/64、68/70/72/76/78/80、120/122/124/128/130/132、160/162/164/168/170/172或220/222/224/228/230/232的重链和轻链CDR序列。在又一实施方案中，所述重链和轻链CDR氨基酸序列包含SEQ ID NO：4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、160/162/164/168/170/172或220/222/224/228/230/232的CDR序列组合。
在一个相关实施方案中，本发明包括与hTL1A特异性结合的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含这样的重链和轻链CDR结构域，所述重链和轻链CDR结构域包含在选自SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/116、118/126、134/136、138/146、154/156、158/166、174/176、178/186、194/196、198/206、214/216、218/226和234/236的重链和轻链序列对中。鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列中的CDR的方法和技术是本领域已知的，并且可用于鉴定本文公开的具体HCVR和/或LCVR氨基酸序列中的CDR。可用于鉴定CDR边界的常规定义包括Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般而言，Kabat定义基于序列变异性，Chothia定义基于结构环区的位置，AbM定义是Kabat和Chothia方法的折中。参见，例如Kabat，″Sequences of Proteinsof Immunological Interest，″National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)；Al-Lazikani等，J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；和Martin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：9268-9272(1989)。公共数据库也可用于鉴定抗体内的CDR序列。在一个实施方案中，所述抗体或其片段包含这样的CDR序列，所述CDR序列包含在选自氨基酸序列对SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、134/136、174/176和234/236的HCVR和LCVR对中。在另一实施方案中，所述抗体或其片段包含这样的CDR序列，所述CDR序列包含在SEQ ID NO：2/10、18/26、174/176或234/236的HCVR和LCVR序列对中。
在另一相关实施方案中，本发明提供了这样的抗体或其抗原结合片段，其与包含SEQ ID NO：4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、36/38/40/44/46/48、52/54/56/60/62/64、68/70/72/76/78/80、120/122/124/128/130/132、160/162/164/168/170/172或220/222/224/228/230/232之重链和轻链CDR序列的抗体或抗原结合片段竞争与hTL1A的特异性结合。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与包含SEQ ID NO：4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、160/162/164/168/170/172或220/222/224/228/230/232之重链和轻链CDR序列的抗体或抗原结合片段竞争与hTL1A的特异性结合。在另一实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段与包含SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、134/136、174/176或234/236之HCVR/LCVR序列对的抗体或抗原结合片段竞争与hTL1A的特异性结合。在又一实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与包含SEQ ID NO：2/10、18/26、174/176或234/236之HCVR/LCVR序列对的抗体或抗原结合片段竞争与hTL1A的特异性结合。
在另一相关实施方案中，本发明提供了这样的抗体或其抗原结合片段，其结合的hTL1A上的表位与包含SEQ ID NO：4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、36/38/40/44/46/48、52/54/56/60/62/64、68/70/72/76/78/80、120/122/124/128/130/132、160/162/164/168/170/172或220/222/224/228/230/232之重链和轻链CDR序列的抗体或其片段所识别的相同。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合的hTL1A上的表位与包含SEQ ID NO：4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、160/162/164/168/170/172或220/222/224/228/230/232之重链和轻链CDR序列的抗体或其抗原结合片段所识别的相同。在另一实施方案中，本发明抗体或抗原结合片段识别的hTL1A上的表位与包含SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、134/136、174/176或234/236之HCVR/LCVR序列对的抗体或其抗原结合片段所识别的相同。在又一实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段识别的hTL1A上的表位与包含SEQ ID NO：2/10、18/26、174/176或234/236之HCVR/LCVR序列对的抗体或其抗原结合片段所识别的相同。
在第三个方面，本发明提供了编码上述抗TL1A抗体或其片段的核酸分子。本发明还涵盖携带本发明核酸的重组表达载体，和其中引入了这样的载体的分离的宿主细胞，例如细菌细胞如大肠杆菌细胞或哺乳动物细胞如CHO细胞，还涵盖了通过在允许产生抗体的条件下培养宿主细胞和回收所产生的抗体来产生抗体的方法。
在一个实施方案，本发明提供了包含这样的HCVR的抗体或其片段：所述HCVR由选自SEQ ID NO：1、17、33、49、65、81、97、113、117、133、137、153、157、173、177、193、197、213、217和233的核酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同序列所编码。在另一实施方案中，所述抗体或其片段包含这样的HCVR，其由选自SEQ ID NO：1、17、33、49、65、133、173和233的核酸序列所编码。在又一实施方案中，所述抗体或其片段包含这样的HCVR，其由SEQ ID NO：1、17、173或233的核酸序列所编码。
在一个实施方案中，所述抗体或其片段还包含这样的LCVR，其由选自SEQ ID NO：9、25、41、57、73、89、105、115、125、135、145、155、165、175、185、195、205、215、225和235的核酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同序列所编码。在另一实施方案中，所述抗体或其片段包含这样的LCVR，其由选自SEQ IDNO：9、25、41、57、73、135、175和235的核酸序列所编码。在又一实施方案中，所述抗体或其片段包含这样的LCVR，其由NO：9、25、175或235的核酸序列所编码。
在另一些实施方案中，所述抗体或其片段包含这样的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列对，其由选自SEQ ID NO：1/9、17/25、33/41、49/57、65/73、81/89、97/105、113/115、117/125、133/135、137/145、153/155、157/165、173/175、177/185、193/195、197/205、213/215、217/225和233/235的核酸序列对所编码。在一个实施方案中，所述抗体或其片段包含这样的HCVR/LCVR序列对，其由选自SEQ ID NO：1/9、17/25、33/41、49/57、65/73、133/135、173/175和233/235的核酸序列对编码。在又一实施方案中，所述抗体或其片段包含这样的HCVR/LCVR对，其由SEQ ID NO：1/9、17/25、173/175或233/235的核酸序列对编码。
在一个实施方案中，本发明提供了包含这样的HCDR3结构域和LCDR3结构域的抗体或抗体的抗原结合片段，所述HCDR3结构域由选自SEQ ID NO：7、23、39、55、71、87、103、123、143、163、183、203和223的核苷酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同序列所编码；所述LCDR3结构域由选自SEQ IDNO：15、31、47、63、79、95、111、131、151、171、191、211和231的核苷酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同序列所编码。在另一实施方案中，所述抗体或其片段包含这样的HCDR3和LCDR3序列对，其由SEQ ID NO：7/15、23/31、39/47、55/63、71/79、87/95、103/111、123/131、143/151、163/171、183/191、203/211或223/231的核酸序列对所编码。在另一实施方案中，所述抗体或其片段包含这样的HCDR3和LCDR3序列对，其由SEQ ID NO：7/15、23/31、39/47、55/63、71/79、123/131、163/171或223/231的核酸序列对所编码。在又一实施方案中，所述HCDR3/LCDR3序列对由SEQ ID NO：7/15、23/31、163/171或223/231的核酸序列对所编码。
在另一实施方案中，所述抗体或其片段包含这样的HCDR1结构域、HCDR2结构域、LCDR1结构域和LCDR2结构域，所述HCDR1结构域由选自SEQ ID NO：3、19、35、51、67、83、99、119、139、159、179、199和219的核苷酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同序列所编码；所述HCDR2结构域由选自SEQID NO：5、21、37、53、69、85、101、121、141、161、181、201和221的核苷酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同序列所编码；所述LCDR1结构域由选自SEQ ID NO：11、27、43、59、75、91、107、127、147、167、187、207和227的核苷酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同序列所编码；所述LCDR2结构域由选自SEQ ID NO：13、29、45、61、77、93、109、129、149、169、189、209和229的核苷酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同序列所编码。在一个实施方案中，所述抗体或其片段包含这样的HCDR1/HCDR2/HCDR3组合和LCDR1/LCDR2/LCDR3组合，所述HCDR1/HCDR2/HCDR3组合由SEQ ID NO：3/5/7、19/21/23、35/37/39、51/53/55、67/69/71、83/85/87、99/101/103、119/121/123、139/141/143、159/161/163、179/181/183、199/201/203或219/221/223所编码；所述LCDR1/LCDR2/LCDR3组合由SEQ ID NO：11/13/15、27/29/31、43/45/47、59/61/63、75/77/79、91/93/95、107/109/111、127/129/131、147/149/151、167/169/171、187/189/191、207/209/211或227/229/231所编码。在一个实施方案中，所述抗体或其片段包含这样的重链和轻链CDR序列，其由选自SEQ ID NO：3/5/7/11/13/15、19/21/23/27/29/31、35/37/39/43/45/47、51/53/55/59/61/63、67/69/71/75/77/79、83/85/87/91/93/95、99/101/103/107/109/111、119/121/123/127/129/131、139/141/143/147/149/151、159/161/163/167/169/171、179/181/183/187/189/191、199/201/203/207/209/211和219/221/223/227/229/231的核酸序列组合所编码。在另一实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分包含这样的重链和轻链CDR序列，其由SEQ IDNO：3/5/7/11/13/15、19/21/23/27/29/31、35/37/39/43/45/47、51/53/55/59/61/63、67/69/71/75/77/79、119/121/123/127/129/131、159/161/163/167/169/171或219/221/223/227/229/231的核酸序列组合所编码。在又一实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分包含这样的重链和轻链CDR序列，其由SEQ ID NO：3/5/7/11/13/15、19/21/23/27/29/31、159/161/163/167/169/171或219/221/223/227/229/231的核酸序列组合所编码。
在第四个方面，本发明提供了与hTL1A特异性结合的分离的抗体或抗体的抗原结合片段，其包含HCDR3和LCDR3，其中所述HCDR3包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16(SEQ ID NO：239)的氨基酸序列，其中X1是Thr或Ala，X2是Lys、Arg或不存在，X3是Glu、Gly或不存在，X4是Asp、Pro或不存在，X5是Leu或不存在，X6是Arg、Tyr、Glu或不存在，X7是Gly、Asp、Ala或不存在，X8是Asp、Ser或Tyr，X9是Tyr或Trp，X10是Tyr或Asp，X11是Tyr、Lys或Ile，X12是Gly、Tyr、Asn或Ser，X13是Val、Gly或Ser，X14是Phe或Met，X15是Asp，以及X16是Tyr或Val；以及所述LCDR3包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO：242)的氨基酸序列，其中X1是Gln，X2是Gln，X3是Tyr、Leu或Phe，X4是His、Tyr或Asn，X5是Arg或Ser，X6是Ser、Thr或Tyr，X7是Trp或Pro，X8是Phe、Leu或不存在，以及X9是Thr。
在另一实施方案中，所述抗体或其片段还包含：HCDR1序列，其包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO：237)的氨基酸序列，其中X1是Gly，X2是Phe，X3是Thr，X4是Phe，X5是Ser，X6是Thr、Ser或Asn，X7是Tyr，以及X8是Gly、Trp、Val或Ala；HCDR2序列，其包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO：238)的氨基酸序列，其中X1是Ile或Val，X2是Ser或Lys，X3是Gly或Glu，X4是Thr、Asp、Ser或Arg，X5是Gly，X6是Arg、Ser或Gly，X7是Thr、Glu或Ser，以及X8是Thr或Lys；LCDR1序列，其包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12(SEQ ID NO：240)的氨基酸序列，其中X1是Gln，X2是Thr、Ser、Ala或Gly，X3是Ile，X4是Ser或Leu，X5是Tyr或不存在，X6是Ser或不存在，X7是Ser或不存在，X8是Asn或不存在，X9是Asn或不存在，X10是Lys或不存在，X11是Ser、Asn或Thr，以及X12是Trp或Tyr；和LCDR2序列，其包含式X1-X2-X3(SEQ IDNO：241)的氨基酸序列，其中X1是Ala、Trp或Ser，X2是Ala或Thr，以及X3是Ser。
在第五个方面，本发明提供了这样的人抗TL1A抗体或其抗原结合片段，其包含由源自VH、DH和JH种系序列的核苷酸序列区段所编码的重链可变区(HCVR)，以及由源自VK和JK种系序列的核苷酸序列区段所编码的轻链可变区(LCVR)。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含这样的HCVR和LCVR，其由源自选自以下的种系基因组合的核苷酸序列区段所编码：(i)VH3-23、DH2-21、JH4、VK1-5和JK1；(ii)VH3-7；DH1-7、JH6、VK4-1和JK3；(iii)VH3-23、DH2-2、JH6、VK1-9和JK2；(iv)VH3-23、DH6-6、JH4、VK1-9和JK4；(v)VH1-2、DH2-15、JH3、VK1-12和JK4；(vi)VH4-34、DH3-9、JH4、VK3-20和JK4；(vii)VH4-34、DH1-1、JH4、VK3-20和JK4；以及(viii)VH4-34、DH3-3、JH4、VK2-24和JK4。
在第六个方面，本发明提供了这样的抗体或其抗原结合片段，如通过表面等离子共振测定(例如，BIACORETM)所测量的，其以约1nM或更小的平衡解离常数(KD)与hTL1A或Fhm特异性结合。在某些实施方案中，本发明抗体的KD为约800pM或更低、约700pM或更低、约600pM或更低、约500pM或更低、约400pM或更低、约300pM或更低、约200pM或更低、约150pM或更低、约100pM或更低、约90pM或更低、约80pM或更低、约50pM或更低、或者30pM或更低。
在第七个方面，本发明提供了这样的抗hTL1A抗体或其抗原结合片段，如通过例如本文所述的ELISA、表面等离子共振测定或
Figure BDA00003325577700101
Figure BDA00003325577700102
Technology所确定的，其与SEQ ID NO：244的hTL1A蛋白结合，但是不与其变体如SEQ ID NO：246的Fhm交叉反应。Fhm包含在167位的单氨基酸替换，对应于hTL1A中的Gln被Arg替换(见美国专利No.6,521,422)。在一些相关实施方案中，本发明还提供了与hTL1A蛋白结合并且与Fhm交叉反应的抗hTL1A抗体或其抗原结合片段。在另一相关实施方案中，本发明提供了不与小鼠TL1A(mTL1A：SEQ ID NO：250，由核苷酸序列SEQ ID NO：249编码)交叉反应，但是与食蟹猴的TL1A(Macaca fascicularis，或MfTL1A：SEQ ID NO：248，由核苷酸序列SEQID NO：247编码)或猕猴的TL1A(Macaca mulatta：与MfTL1A相同的氨基酸序列)交叉反应的抗hTL1A抗体或其抗原结合片段。在另一些相关实施方案中，本发明提供了与mTL1A和MfTL1A两者交叉反应的抗hTL1A抗体或其抗原结合片段。
本发明涵盖具有修饰的糖基化模式的抗hTL1A抗体。在一些应用中，可以有用的是进行修饰以除去不期望的糖基化位点或例如除去岩藻糖部分以增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(见，Shield等(2002)JBC277：26733)。在另一些应用中，除去N糖基化位点可降低针对治疗性抗体的不期望的免疫反应或增加抗体的亲和力。在又一些应用中，可进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在第八个方面，本发明提供了药物组合物，其包含与hTL1A特异性结合的重组人抗体或其片段，以及可药用载体。在一个实施方案中，本发明提供了作为本发明的抗体或其抗原结合片段与第二治疗剂之组合的组合物。所述第二治疗剂可以是一种或更多种任意药剂，例如免疫抑制剂、抗炎剂、止痛剂、抗过敏剂等，它们许多彼此可具有重叠的治疗效果。可与本发明的抗hTL1A抗体组合的合适的免疫抑制剂包括但不限于：糖皮质激素、环孢霉素、氨甲蝶呤、干扰素β(IFN-β)、他克莫司、西罗莫司、咪唑硫嘌呤、巯嘌呤、阿片类物质、霉酚酸酯(mycophenolate)；TNF结合蛋白，例如英夫利昔、依坦西普、阿达木单抗等；细胞毒性抗体，例如更生霉素、蒽环类(anthracyclines)、丝裂霉素C、博来霉素、光辉霉素等；靶向免疫细胞的抗体，例如抗CD20抗体、抗CD3抗体等。用于与抗hTL1A抗体进行联合治疗的合适抗炎药和/或止痛剂包括：皮质类固醇；非甾体抗炎药(NSAID)，例如阿司匹林、布洛芬、萘普生、Cox-2抑制剂等；TNF-α拮抗剂、IL-1拮抗剂、IL-6拮抗剂、对乙酰氨基酚、类吗啡(morphinomimetics)等。合适的抗过敏药包括抗组胺、糖皮质激素、肾上腺素(adrenaline)、茶碱、色甘酸钠和抗白三烯，以及抗胆碱药物(anti-cholinergics)、解充血剂、肥大细胞稳定剂等。
在第九个方面，本发明提供了使用本发明的抗hTL1A抗体或抗体的抗原结合部分抑制hTL1A活性的方法，其中所述治疗方法包括：施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗体或抗体的抗原结合片段，以及任选的一种或更多种另外的上述治疗剂。被治疗的疾病或病症是通过消除、抑制或降低TL1A活性而改善、减轻、抑制或预防，或其发生率降低(与未用抗hTL1A抗体治疗相比)的任意疾病或病症。可通过本发明的方法可治疗的疾病或病症的实例包括但不限于：炎性疾病和/或自身免疫疾病，例如包括UC和CD的炎性肠病(IBD)、RA、MS、1型和2型糖尿病、银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、特应性皮炎等；变应性反应或病症，包括哮喘、变应性肺炎等；癌症动脉粥样硬化、传染病、神经退行性疾病、移植排斥、移植物抗宿主疾病(GVHD)、心血管病症/疾病等。
通过接下来的发明详述的描述，其他实施方案将变得明显。
发明详述
在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为这样的方法和实验条件可改变。还应理解本文所使用术语仅旨在描述具体实施方案，而不是意在限制，因为本发明的范围仅由所附权利要求限制。
除非另外定义，否则本文使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域一般技术人员的通常理解相同的意思。尽管在本发明的实施或测试中可使用与本文所描述的方法和材料相似或等效的那些，但是现在描述优选的方法和材料。本文提到的全部发表作品通过引用整体并入本文。
定义
除非另外特别指出，本文使用的术语“人TNF样配体1A”或“hTL1A”是指具有SEQ ID NO：243中所示核酸序列和SEQ ID NO：244的氨基酸序列的hTL1A或其生物活性片段，以及hTL1A变体，其包括具有SEQ IDNO：245中所示核酸序列和SEQ ID NO：246的氨基酸序列的Fhm或其生物活性片段。
本文使用的术语“抗体”旨在指示包含通过二硫键相互连接之四条多肽链(两条重链(H)和两条轻链(L))的免疫球蛋白分子。每一重链包含重链可变区(HCVR)和重链恒定区(CH，包含结构域CH1、CH2和CH3)。每一轻链包含轻链可变区(LCVR)和轻链恒定区(CL)。HCVR和LCVR可进一步细分成称为互补决定区(CDR)的超变区，其与称为框架区(FR)的更保守区域交替。每一HCVR和LCVR由3个CDR和4个FR构成，从氨基端到羧基端按照以下顺序排布：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
也可替换一个或更多个CDR残基或省去一个或更多个CDR。科学文献中已经描述了其中一个或两个CDR可被省去以进行结合的抗体。Padlan等(1995FASEB J.9：133-139)基于公开的晶体结构分析了抗体与其抗原之间的接触区，推断仅有约五分之一至三分之一的CDR残基与抗原实际接触。Padlan还发现了许多这样的抗体，所述抗体中的一个或两个CDR不具有与抗原接触的氨基酸(还参见，Vajdos等2002J Mol Biol320：415-428)。
可基于之前的研究(例如，CDRH2中的残基H60-H65通常是不需要的)通过分子建模和/或经验从Chothia CDR外的Kabat CDR区域鉴定未与抗原接触的CDR。如果省去了CDR或其残基，通常用占据另一人抗体序列或这样序列的共有序列中对应位点的氨基酸进行替换。还可凭经验选择CDR内用于替换的位置或替换氨基酸。经验替换可以是保守或非保守替换。
本文使用的术语“人抗体”旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人mAb可在例如CDR并且尤其是CDR3中包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过随机或体外定点突变或通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，本文使用的术语“人抗体”不旨在包括这样的mAb，其中源自其他哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列被移植到人FR序列上。
与对应的种系序列相比，本文公开的全人抗TL1A抗体可包含重链和轻链可变结构域的框架区和/或CDR区内的一个或更多个氨基酸替换、插入和/或缺失。这样的突变可通过将本文公开的氨基酸序列与可得自例如公共抗体序列数据库的种系序列进行比较容易地确定。本发明包括源自本文公开的任何氨基酸序列的抗体和其抗原结合片段，其中一个或更多个框架区和/或CDR区内的一个或更多个氨基酸被突变成抗体来源的种系序列的对应残基，或另一人种系序列的对应残基，或对应种系残基的保守氨基酸替换(本文将这样的序列改变统称为“种系突变”)。本领域普通技术人员从本文公开的重链和轻链可变区序列出发，可容易地产生包含一个或更多个单独种系回复突变(back-mutation)或其组合的多种抗体和抗原结合片段。在某些实施方案中，VH和/或VL结构域中全部框架和/或CDR残基突变回抗体来源的原始种系序列中发现的残基。在另一些实施方案中，仅某些残基突变回原始种系序列，例如，仅在FR1的前8个氨基酸或FR4的后8个氨基酸内存在突变残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3内发现突变残基。在另一些实施方案中，一个或更多个框架和/或CDR残基突变成不同种系序列(即，与抗体原始来源的种系序列不同的种系序列)的对应残基。另外，本发明的抗体可在框架和/或CDR区内包含两个或更多个种系突变的任意组合，例如，其中某些单独残基突变成特定种系序列的对应残基，而与原始种系序列不同的另一些残基被保留或突变成不同种系序列的对应残基。一旦得到，可容易地测试包含一个或更多个种系突变的抗体或抗原结合片段的一个或更多个期望性质，例如结合特异性提高、结合亲和力增加、拮抗或激动生物学特性(根据具体情况)提高或增强、免疫原性降低等。以这种常用方式得到的抗体和抗原结合片段涵盖在本发明内。
本发明还包括这样的抗TL1A抗体，其包含具有一个或更多个保守替换的本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的变体。例如，本发明包括这样的抗TL1A抗体，相对于本文公开的任意HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，其具有例如有10个或更低、8个或更低、6个或更低、4个或更低、2或1个保守氨基酸替换的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列。
除非另外特别指出，否则应将本文使用的术语“抗体”(Ab)理解为涵盖包含两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的抗体分子(即，“全抗体分子”)及其抗原结合片段。本文使用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括与抗原特异性结合以形成复合物的任何天然的、酶促得到的、合成的或基因改造的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可使用任何合适的标准技术(如蛋白水解消化或重组基因工程技术(涉及操作和表达编码抗体可变结构域和(任选的)恒定结构域的DNA))源自例如全抗体分子。这样的DNA是已知的和/或容易从例如商业来源、DNA文库(包括，例如噬菌体展示抗体文库)得到或可被合成。可化学地或使用分子生物学技术对DNA进行测序和操作，例如以将一个或更多个可变和/或恒定结构域排列成合适的构型，或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰(modify)、添加或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab′)2片段；(iii)Fd片段；(iV)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体超变区的氨基酸残基(例如，分离的互补决定区(CDR)如CDR3肽)或限制(constrained)的FR3-CDR3-FR4肽组成的最小识别单位。另一些工程分子也涵盖本发明所使用的表达“抗原结合片段”内，例如：结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)、微小抗体(minibodies)、纳米抗体(例如，单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小型免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域。
抗体的抗原结合片段通常包含至少一个可变结构域。可变结构域可以是任意大小和氨基酸组成的，并且一般包含至少一个CDR，其与一个或更多个框架序列相邻或在框内(in frame)。在具有与VL结构域相关联的VH结构域的抗原结合片段中，VH和VL结构域可以以任何合适的排布彼此相对定位。例如，可变区可以是二聚的并且包含VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可包含单体VH或VL结构域。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可包含与至少一个恒定结构域共价链接的至少一个可变结构域。可在本发明抗体的抗原结合片段中存在的可变结构域和恒定结构域的非限制示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构型中(包括以上所列的任意示例性构型)，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或可通过完整或部分铰链或接头区连接。铰链区可由至少2个(例如，5、10、15、20、40、60个或更多个)氨基酸组成，其导致单个多肽分子中相邻可变结构域和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。另外，本发明抗体的抗原结合片段可包括与一个或更多个单体VH或VL结构域(例如通过二硫键)和/或彼此之间非共价连接的以上所列任何可变结构域和恒定结构域构型的同型二聚体或异型二聚体(或其他多聚体)。
对于全抗体分子，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性(例如双特异性)。抗体的多特异性抗原结合片段通常包含至少两个不同的可变结构域，其中每一可变结构域都能够与独立的抗原或同一抗原上的不同表位特异性结合。可使用本领域可利用的常规技术将任何多特异性抗体形式(包括本文公开的示例性双特异性抗体形式)适用于在本发明抗体的抗原结合片段的背景中。
在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段可与治疗部分(“免疫缀合物”)如细胞毒素、化学治疗药、免疫抑制剂或放射性同位素缀合。
术语“特异性结合”等是指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合可通过以下平衡解离常数(KD)表征：约3000nM或更低(即，更小的KD表明更紧密的结合)、约2000nM或更低、约1000nM或更低、约500nM或更低、约300nM或更低、约200nM或更低、约100nM或更低、约50nM或更低、约1nM或更低、或者约0.5nM或更低。确定两种分子是否特异性结合的方法是本领域周知的，包括例如平衡透析、表面等离子共振等。但是，与hTL1A特异性结合的分离的抗体可表现出与其他抗原(如源自其他物种的TL1A分子，如食蟹猴TL1A(SEQ ID NO：248)和/或小鼠TL1A(SEQ ID NO：250)和/或TL1A变体如Fhm(SEQ ID NO：246))的交叉反应性。另外，与hTL1A以及一种或更多种额外抗原结合的多特异性抗体(例如双特异性)也被认为是本文所使用与hTL1A“特异性结合”的抗体。
术语“高亲和力”抗体是指如通过表面等离子共振如BIACORETM或溶液亲和ELISA测量的，与hTL1A的结合亲和力(表示为KD)为约1x10-9M或更低、约0.5x10-9M或更低、约0.25x10-9M或更低、约1x10-10M或更低、约0.5x10-10M或更低的那些抗体。
本文使用的术语“KD”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
术语“缓慢解离速率(slow off rate)”、“Koff”或“kd”是指如通过表面等离子共振(例如BIACORETM)所确定的，以1x10-3s-1或更低，优选1x10-4s-1或更低的速率常数从hTL1A解离的抗体。
术语“固有亲和常数(intrinsic affinity constant)”或“ka”是指如通过表面等离子共振(例如BIACORETM)所确定的，以约1x103M-1s-1或以上的速率常数与hTL1A结合的抗体。
本文使用的术语“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他mAb的抗体(例如，特异性结合hTL1A的分离的抗体基本不含特异性结合hTL1A之外的抗原的Ab)。但是，特异性结合hTL1A的分离的抗体可与其他抗原如源自其他物种(例如，食蟹猴和小鼠)的TL1A分子和/或hTL1A变体如Fhm有交叉反应性。
本文使用的“中和抗体”(或“中和TL1A活性的抗体”)旨在指示与TL1A结合导致抑制TL1A的至少一种生物活性的抗体。TL1A生物活性的这种抑制可使用本领域已知的多种标准体外或体内测定中的一种或更多种通过测量TL1A生物活性的一种或更多种指示物来评估(也见以下实施例)。
本文使用的术语“表面等离子共振”是指一种光学现象，其允许例如使用BIAcoreTM系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden andPiscataway，N.J.)通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度变化来分析实时的生物特异性相互作用。
术语“表位”是指与抗体结合的抗原区域。表位可以被定义为结构或功能的。功能表位一般是结构表位的子集(subset)，具有那些直接有助于相互作用的亲和力的残基。表位也可以是构象型的，即由非线性氨基酸构成的。在某些实施方案中，表位可包含作为分子的化学活性表面基团的决定簇，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，在某些实施方案中，表位可具有特定的三维结构特性和/或特定的电荷特性。
当提及核酸或其片段时，术语“基本一致”表示当与另一核酸(或其互补链)以合适的核苷酸插入或缺失最佳比对时，如使用任何周知的序列同一性算法(例如下文讨论的FASTA、BLAST或GAP)测量的，至少约90％，更优选至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基具有核苷酸序列同一性。
当应用于多肽时，术语“基本相似”是指当最佳比对时(例如通过使用默认缺口重量的GAP或BESTFIT程序)，两条多肽序列具有至少90％的序列同一性，甚至更优选至少95％、98％或99％的序列同一性。优选地，不一致的残基位置相差的是保守氨基酸替换。“保守氨基酸替换”是氨基酸被有具有化学特性(例如，电荷或疏水性)相似之侧链(R基)的另一氨基酸残基替换。通常，保守氨基酸替换基本上不改变蛋白质的功能特性。当两个或更多个氨基酸序列因保守替换而彼此不同时，可上调相似性百分比或程度以符合替换的保守性。用于这种调节的方法是本领域技术人员周知的。例如，见Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331，其通过引用并入本文。具有化学特性相似之侧链的氨基酸的组的实例包括：1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸：5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。一些优选的保守氨基酸替换的组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守替换是在Gonnet等(1992)Science256：1443-1445(通过引用并入本文)中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何改变。“适度保守”替换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何改变。
多肽的序列相似性通常使用序列分析软件测量。蛋白质分析软件使用分配给多种替换、缺失和其他修改(包括保守性氨基酸替换)的相似性测量来匹配相似序列。例如，GCG软件包含程序如GAP和BESTFIT，其可用缺省参数使用来确定密切相关的多肽(例如源自不同生物物种的同源多肽之间或野生型蛋白质和其突变体之间)的序列同源性或序列一致性。参见，例如GCG6.1版。也可用使用缺省或推荐参数的FASTA(GCG6.1版中的一个程序)比较多肽序列。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供了查询序列与检索序列之间最佳重叠区的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)同上)。当将本发明的序列与包含源自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，另一优选算法是使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见，例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402，均通过引用并入本文。
短语“治疗有效量”是指产生施用其的期望效果的量。确切量取决于治疗目的、治疗对象的年龄和体型、施用途径等，并且可由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如，Lloyd(1999)The Art，Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding)。
人抗体的制备
在转基因小鼠体内产生人抗体的方法是本领域已知的。可将任意这样的已知方法用在本发明的背景中以产生特异性结合TL1A的人抗体。
使用VELOCIMMUNETM技术或任何其他产生单克隆抗体的已知方法，首先分离具有人可变区和小鼠恒定区的针对TL1A的高亲和力嵌合抗体。如下文的实验部分，表征抗体并针对期望特性进行选择，包括亲和力、选择性、表位等。
一般而言，本发明的抗体具有非常高的亲和力，当通过与固定在固相上或溶液相内的抗原结合来测量时，通常具有约10-12M至约10-9M的KD。将小鼠恒定区替换成期望的人恒定区(例如野生型IgG1(SEQ IDNO：255)或IgG4(SEQ ID NO：256)或者经修饰IgG1或IgG4(例如，如SEQ ID NO：257所示用Pro替换Ser-108的IgG4))以产生本发明的全人抗体。尽管所选择的恒定区可根据具体用途而不同，但是抗体的高亲和性抗原结合和靶标特异性特性在于可变区。
表位作图和相关技术
为了筛选与特定表位结合的抗体，可实施常规交叉阻断测定，例如Antibodies，Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarb.，NY)中描述的。其他方法包括丙氨酸扫描突变、肽印迹(Reineke，2004，Methods Mol Biol248：443-463)(其通过整体引用特别并入本文)或肽切割分析。另外，可使用方法如表位切除、表位提取和抗原的化学修饰(Tomer，2000，Protein Science9：487-496)(其通过整体引用特别并入本文)。
术语“表位”是指抗原上B和/或T细胞应答的部位。B细胞表位可由相邻氨基酸或通过蛋白质三级折叠而邻近的非相邻氨基酸二者形成。由相邻氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常保持，而由三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常失去。表位通常包含独特空间构型中的至少3个，更通常地至少5或8至10个氨基酸。
修饰辅助谱(Modification-Assisted Profiling，MAP)(也称作基于抗原结构的抗体谱(ASAP))是根据每一抗体与化学修饰或酶修饰抗原表面的结合谱的相似性来对针对相同抗原的大量mAb进行分类的方法(US2004/0101920，其通过引用整体特别并入本文)。每一类可反映独特表位，其与另一类表示的表位完全不同或部分重叠。这种技术允许快速过滤遗传上相同的mAb，这样可集中表征遗传上不同的mAb。当应用于杂交瘤筛选时，MAP可便于鉴定产生具有期望特性之mAb的稀有杂交瘤克隆。MAP可用于将本发明的抗TL1A mAb分选成与结合不同表位的mAb组。
本发明包括与本文所述任意具体示例抗体结合相同表位的hTL1A抗体。同样，本发明还包括与本文所述任意具体示例抗体竞争与hTL1A或hTL1A片段的结合的抗hTL1A抗体。
使用本领域已知的常规方法可容易地确定抗体是否与参照抗hTL1A抗体结合相同的表位或与其竞争结合。例如，为了确定测试抗体是否与本发明的参照抗hTL1A抗体结合相同的表位，在饱和条件下使参照抗体与hTL1A蛋白质或肽结合。接下来，评价测试抗体与hTL1A分子结合的能力。如果测试抗体在hTL1A与参照抗hTL1A抗体饱和结合后能够与hTL1A结合，那么可推断测试抗体与参照抗hTL1A抗体结合于不同表位。另一方面，如果测试抗体在hTL1A分子与参照抗hTL1A抗体饱和结合后不能与hTL1A分子结合，那么测试抗体可结合于与本发明参照抗hTL1A抗体所结合表位相同的表位。
为了确定抗体是否与参照抗hTL1A抗体竞争结合，按两个方向实施上述结合方法：第一方向，使参照抗体在饱和条件下与hTL1A分子结合，之后评估测试抗体与hTL1A分子的结合。在第二方向，使测试抗体在饱和条件下与hTL1A分子结合，之后评估参照抗体与hTL1A分子的结合。如果在两个方向下，仅第一(饱和)抗体能够与hTL1A分子结合，那么可以推断测试抗体与参照抗体竞争结合hTL1A。如本领域一般技术人员将理解的，与参照抗体竞争结合的抗体未必与参照抗体结合于相同表位，而可以通过结合重叠或相邻表位来立体阻断参照抗体的结合。
如果两种抗体均竞争性抑制(阻断)另一抗体与抗原的结合，那么它们结合于相同或重叠的表位。也就是说，一种1、5、10、20或100倍过量的抗体抑制另一种抗体至少50％，但优选75％、90％或甚至99％的结合(如在竞争性结合测定中测量的)(参见，例如Junghans等，Cancer Res.1990：50：1495-1502)。或者，如果抗原中降低或消除与一种抗体结合的基本所有氨基酸突变均降低或消除了另一抗体的结合，那么这两种抗体具有相同表位。如果一些降低或消除与一种抗体的结合的氨基酸突变降低或消除了另一抗体的结合，那么这两种抗体具有重叠的表位。
然后可实施其他常规实验(例如，肽突变和结合分析)来确定所观察到的测试抗体无法结合确实是由于与参照抗体结合于相同表位，或者立体阻断(或另一现象)是未观察到结合的原因。这类实验可使用ELISA、RIA、表面等离子共振、流式细胞术或本领域可利用的任意其他定量或定性抗体结合测定来实施。
免疫缀合物
本发明涵盖与治疗部分(“免疫缀合物”)如细胞毒素、化学治疗剂、免疫抑制剂或放射性同位素缀合的人抗TL1A单克隆抗体。细胞毒素剂包括对细胞有害的任何药剂。用于形成免疫缀合物的合适细胞毒素剂和化学治疗剂的实例是本领域已知的，参见，例如WO05/103081，其通过引用特别并入本文。
双特异性
本发明的抗体可以是单特异性、双特异性或多特异性的。多特异性mAb可特异性针对一种靶多肽的不同表位，或可包含特异性针对多于一种靶多肽的抗原结合结构域。参见，例如Tutt等，1991，J.Immunol.147：60-69。人抗hTL1A mAb可与另一功能分子(如另一肽或蛋白质)连接或共表达。例如，抗体或其片段可与一种或更多种其他分子实体(例如另一抗体或抗体片段)功能性连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价连接等)，以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
可在本发明上下文使用的示例性双特异性抗体形式包括使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中第一和第二Ig CH3结构域彼此具有至少一个氨基酸的差异，并且其中与没有氨基酸差异的双特异性抗体相比，至少一个氨基酸的差异降低了双特异性抗体与蛋白质A的结合。在一个实施方案中，第一Ig CH3结构域与蛋白质A结合，第二Ig CH3结构域包含降低或消除与蛋白质A的结合的突变，例如H95R修改(通过IMGT外显子编号；通过EU编号为H435R)。第二CH3还可包含Y96F修改(通过IMGT，通过EU的Y436F)。可在第二CH3中存在的另一些修改包括：IgG1抗体的情况下的D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(通过IMGT；通过EU的D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；IgG2抗体的情况下的N44S、K52N和V82I(IMGT；通过EU的N384S、K392N和V422I)；和IgG4抗体的情况下的Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(通过IMGT；通过EU的Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。考虑了上述双特异性抗体形式的变化也在本发明的范围内。
生物等效性
本发明的抗hTL1A抗体和抗体片段涵盖这样的蛋白质，其具有与所描述mAb不同的氨基酸序列，但是保持与人TL1A结合的能力。当与亲本序列比较时，这样的变体mAb和抗体片段包含一个或更多个氨基酸的添加、缺失或替换，但是具有与所描述mAb基本等效的的生物活性。同样地，本发明的hTL1A mAb编码DNA序列涵盖这样的序列，当与所公开的序列比较时，其包括一个或更多个核苷酸的添加、缺失或替换，但是其编码与本发明的抗hTL1A抗体或抗体片段基本生物等效的抗hTL1A抗体或抗体片段。上面讨论了这样的变体氨基酸和DNA序列的实例。
例如，如果两种抗原结合蛋白或抗体是药学等效或药学可替代的(在相似实验条件下以相同的摩尔剂量(单剂量或多剂量)施用时，其吸收速率和程度不具有显著差异)，那么认为他们是生物等效的。如果一些抗体在吸收程度上等效但是在吸收速率上不同，则将认为它们是等效的或药物可替代的，也可认为是生物等效的，因为吸收速率这样的差异是有意的并且反应在标记上，在例如长期使用时对达到有效机体药物浓度不是必要的，并且认为对于所研究的特定药品是医学上不显著的。在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在其安全性、纯度和效力上没有临床上有意义的差异，那么它们是生物等效的。
在一个实施方案中，如果患者可以在参照产品与生物产品之间切换一次或更多次而没有预期的不利作用(包括与继续治疗而不切换相比，免疫原性的临床显著变化或效力降低)风险的增加，那么两种抗原结合蛋白质是生物等效的。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白均对于使用条件通过共同的作用机制来起作用(在这样的机理已知的情况下)，那么它们是生物等效的。
可通过体内和体外方法证明生物等效性。生物等效性的测量包括：例如(a)人或其他哺乳动物的体内测试，其中测量作为时间的函数的血液、血浆、血清或其他生物流体中的抗体或其代谢物的浓度；(b)已经与人体内生物利用度数据对应并且对其有合理预测性的体外试验；(c)人或其他哺乳动物的体内测试，其中测量作为时间的函数的抗体(或其靶标)的适当急性药理作用(acute pharmacological effect)；和(d)良好控制的临床试验，其建立抗体的安全性、效力或生物利用度或生物等效性。
可通过例如进行残基或序列的多种替换或使对于生物活性不必须的末端或内部残基或序列缺失来构建本发明的抗hTL1A抗体的生物等效性变体。例如，使对于生物活性不必须的半胱氨酸残基缺失或替换成其他氨基酸，以防止通过复性形成不需要或不正确的分子内二硫键。
治疗性施用和制剂
本发明提供了包含本发明的抗hTL1A抗体或其抗原结合片段的治疗组合物和使用它们的治疗方法。与被并入制剂中以提供改善的转移、递送、耐受性等的合适载体、赋形剂和其他试剂一起施用来进行根据本发明的治疗组合物的施用。可在全部药剂师已知的处方集中发现大量的合适制剂：Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA。这些制剂包括例如：粉剂、糊剂、药膏、凝胶剂(jellies)、蜡状物、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(例如LIPOFECTINTM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(emulsionscarbowax)(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶、包含碳蜡的半固体混合物。还参见Powell等″Compendium of excipients for parenteralformulations″PDA(1998)J Pharm Sci Technol52：238-311。
剂量可取决于以下而不同：待施用对象的年龄和体型、目标疾病、治疗目的、症状、施用途径等。当使用本发明的抗体治疗成年患者中与TL1A活性直接或间接相关的多种病症和疾病(包括炎性疾病/病症、自身免疫疾病/病症、变应性反应等)时，有利的是以约0.01至约20mg/kg体重，更优选约0.02至约7、约0.03至约5或约0.05至约3mg/kg体重的单剂量静脉内或皮下施用本发明的抗体。根据病症的严重程度，可调节治疗的频率和持续时间。在某些实施方案中，可以至少约0.1mg至约800mg，约1至约500mg，约5至约300mg，或约10至约200mg、至约100mg、或至约50mg的初始剂量施用本发明的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，可在初始剂量之后以大约等于或小于初始剂量的量施用第二次或多次随后剂量的抗体或其抗原结合片段，其中所述随后剂量相隔至少1天至3天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少12周或至少14周。
多种递送系统是已知的并且可用于施用本发明的药物组合物，例如封装在脂质体中、微粒、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞(参见，例如Wu等，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)。引入的方法包括但不限于：皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可通过任何方便的途径施用组合物，例如，通过输注或团注(bolus injection)，通过表皮或粘膜层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收来施用，并且可与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。
还可以在囊泡中尤其是脂质体中递送药物组合物(见Langer，1990，Science249：1527-1533；Treat等，1989，in Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer，Lopez Berestein and Fidler(eds.)，Liss，New York，第353-365页；Lopez-Berestein，ibid.，第317-327页；一般参见同处)。
在某些情况下，可在受控的释放系统中递送药物组合物。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer，同上；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另一些实施方案中，可使用聚合物材料；参见Medical Applications of Controlled Release，Langer and Wise(eds.)，1974，CRC Pres.，Boca Raton，Florida。在又一个实施方案中，可将受控的释放系统放置在组合物的目标附近，从而仅需要一部分系统剂量(参见，例如Goodson，1984，in Medical Applications of Controlled Release，supra，第2卷，第115-138页，1984)。
可注射制剂可包含用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、滴注等的剂型。这些可注射制剂可通过公知的方法制备。例如，可通过将上述抗体或其盐在通常用于注射的无菌水介质或油介质中溶解、悬浮或乳化来制备可注射制剂。对于用于注射的水介质，有例如生理盐水，其为包含葡萄糖和其他助剂等的等渗溶液，其可与适当的增溶剂如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧化乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。对于油介质，使用例如芝麻油、大豆油等，其可与增溶剂如苯甲酸苄酯、苄醇等组合使用。优选将如此制备的注射剂装填在合适的安瓿瓶中。可通过标准针和注射器皮下或静脉内递送本发明的药物组合物。另外，对于皮下递送，笔型递送装置已现成地应用于递送本发明的药物组合物。这样的笔型递送装置可以是可再用的或一次性的。可再用的笔型递送装置通常使用含有药物组合物可替换药筒。一旦药筒中全部的药物组合物被施用且药筒成为空的，可容易地丢弃空药筒并且替换成含有药物组合物的新药筒。然后可再度利用笔型递送装置。在一次性笔型递送装置中，没有可替换药筒。当然，一次性笔型递送装置预装填有容纳在装置内的容器中的药物组合物。一旦容器内没有药物组合物，就丢弃整个装置。
多种可再用笔型和自动注射递送装置已用于皮下递送本发明的药物组合物。实例包括但当然不限于AUTOPENTM(Owen Mumford，Inc.，Woodstock，UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems，Bergdorf，Switzerland)、HUMALOG MIX75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN70/30TM笔(Eli Lilly and Co.，Indianapolis，IN)、NOVOPENTMI，II和III(Novo Nordisk，Copenhagen，Denmark)、NOVOPENJUNIORTM(Novo Nordisk，Copenhagen，Denmark)、BDTM笔(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(sanofi-aventis，Frankfurt，Germany)等。应用于皮下递送本发明的药物组合物的一次性笔型递送装置的实例包括但当然不限于：SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)。
有利地，将用于上述口服或胃肠外使用的药物组合物制备成适于适应活性成分剂量的单位剂型中。这样的单位剂量剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓶)、栓剂等。所包含的前述抗体的量一般为每单位剂量剂型约0.1至约800mg；尤其在注射的形式下，对于其他剂型，包含前述抗体约1至约500mg、约5至300mg、约8至200mg和约10至约100mg。
联合治疗
本发明还提供了通过与一种或更多种额外治疗剂组合施用本发明的hTL1A mAb或其片段来治疗与hTL1A直接或间接相关的疾病或病症的治疗方法。所述额外治疗剂可以是与本发明的抗体或其片段有利地组合的一种或更多种任意药剂，包括免疫抑制剂、抗炎剂、止痛剂、抗过敏剂等。合适的免疫抑制剂包括但不限于：糖皮质激素、环孢霉素、氨甲蝶呤、干扰素β(IFN-β)、他克莫司、西罗莫司、咪唑硫嘌呤、巯基嘌呤、阿片类物质、霉酚酸酯；TNF结合蛋白，例如英夫利昔、依坦西普、阿达木单抗等；细胞毒性抗体，例如更生霉素、蒽环类、丝裂霉素C、博来霉素、光辉霉素等；靶向免疫细胞的抗体，例如抗CD20抗体、抗CD3抗体等。用于与抗hTL1A抗体联合治疗的合适抗炎药和/或止痛剂包括：皮质类固醇；非甾体抗炎药(NSAID)，例如阿司匹林、布洛芬、萘普生、Cox-2抑制剂等；TNF-α拮抗剂(例如，Centocor Inc.的英夫利昔或
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Centocor Inc.的戈利木单抗；Amgen/Wyeth的依那西普或
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Abbott Laboratories的阿达木单抗或
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等)、IL-1拮抗剂(例如，与IL-1结合的融合蛋白，例如，Regeneron Pharmaceuticals，Inc.的
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见美国专利No.6,927,044；Amgen的
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等)、IL-6拮抗剂(例如，美国专利No.7,582,298中公开的抗IL-6受体抗体，以及Roche的
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)、对乙酰氨基酚、类吗啡等。可阻断过敏性介质的活性或防止细胞活化和脱粒过程的合适的抗过敏药包括抗组胺、糖皮质激素、肾上腺素(epinephrine，adrenaline)、茶碱、色甘酸钠和抗白三烯药物(例如孟鲁司特(Merck的
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)或扎鲁司特(AstraZeneca的
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))和抗胆碱药物、减充血剂、肥大细胞稳定剂，以及可削弱嗜酸性细胞趋化性的其他化合物。
本发明的hTL1A mAb或其片段可与所述额外治疗剂一起施用或分开施用。在使用分开的药物制剂时，本发明的抗体或其片段与所述额外药剂可同时施用或以合适的顺序交错时间(即相继)分开施用。
实施例
提出以下实施例以向本领域一般技术人员提供如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开内容和描述，并且不是旨在限制发明人所认为的其发明的范围。已经尽力确保关于所使用数值的精确度，但是应预计有一些实验误差和偏差。除非另外明确指出，否则分子量是平均分子量，温度是摄氏度，以及压力是大气压或大气压左右。
实施例1：针对人TL1A的人抗体的产生
使用人TL1A免疫VELOCIMMUNETM小鼠，并且使用获自这些小鼠的血清通过抗原特异性免疫测定来监控抗体免疫应答。从表现出升高抗TL1A抗体滴度的免疫小鼠的脾脏中收集表达抗TL1A抗体的B细胞，并且与小鼠骨肿瘤细胞融合以形成杂交瘤。使用下文所述测定筛选和选择杂交瘤以鉴别表达hTL1A特异性抗体的细胞系。测定鉴别出产生被称为H2M1681N、H2M1704N、H2M1804N、H2M1805N、H2M1817N和H2M1818N的嵌合抗hTL1A抗体的几种细胞系。随后通过用在铰链区包含S108P突变的hIgG4氨基酸序列SEQ ID NO：257替换各小鼠恒定区将这些抗体转化成hIgG4同种型，分别被称为H4H1681N、H4H1704N、H4H1804N、H4H1805N、H4H1817N和H4H1818N。
也从抗原免疫的B细胞中直接分离人TL1A特异性抗体而未与骨髓瘤细胞融合，如美国专利No.7,582,298中描述的，其通过引用整体并入本文。克隆重链和轻链可变区以产生被称为H4H1719P、H4H1725P、H4H1738P、H4H1742P、H4H1745P、H4H1750P和H4H1752P的全人抗hTL1A抗体。建立表达稳定的重组抗体的CHO细胞系。
实施例2可变基因使用分析
为了分析所产生的抗体的结构，对编码抗体可变区的核酸进行克隆和测序。从抗体的核酸序列和预测的氨基酸序列中，鉴别各重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)的基因使用(gene usage)。表1示出了本发明所选择抗体的基因使用。
表1
Figure BDA00003325577700271
表2示出了所选择的抗hTL1A抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列对及其对应的抗体标识。N和P名称是指具有这样的重链和轻链的抗体，其具有相同的CDR序列但是在CDR序列之外的区域(即，在框架区内)中具有序列变异。因此，特定抗体的N和P变体在其重链和轻链可变区内具有相同的CDR序列，但在其框架区内包含变化。
表2
Figure BDA00003325577700281
实施例3TL1A结合亲和力的确定
如表3至5所示通过25℃和37℃下的表面等离子共振确定人单克隆抗TL1A抗体与以下TL1A物种变体结合的结合亲和力和动力学常数：人(h)(CHO表达，SEQ ID NO：244的残基72-251，具有N端His6标签)，食蟹猴(Mf)(大肠杆菌(E.coli)表达，SEQ ID NO：248的残基72-251，具有或不具有N端Met)，食蟹猴(CHO表达，SEQ ID NO：248的残基72-251，具有N端His6标签)，小鼠(m)(大肠杆菌表达，SEQ ID NO：250的残基76-252，具有或不具有N端Met)，小鼠(CHO表达，SEQ ID NO：250的残基76-252，具有N端His6标签)，和大鼠(CHO细胞表达，SEQ IDNO：258的残基76-252具有N端His6标签)。还确定了hTL1A变体Fhm(大肠杆菌表达，包含Q167R替换的SEQ ID NO：246的残基72-251，具有或不具有N端Met)的结合常数。在T100BIACORETM仪上测量。将与小鼠Fc(用前缀“H2M”指示)或人IgG4(S108P)Fc(用前缀“H4H”指示)一起表达的抗体捕捉在抗Fc传感器表面，并且在传感器表面上注入1.25nM至100nM的至少三种不同浓度的可溶性TL1A蛋白。通过使用BIAevaluation4.1曲线拟合软件(BIAcore Life Sciences)将数据拟合于1∶1结合模型来确定动态结合(ka)和解离(kd)速率常数。数据拟合中使用的TL1A/Fhm的摩尔浓度假设TL1A在溶液中的单体状态。由动态速率常数计算结合解离平衡常数(KD)和解离半寿命(dissociativehalf-lives)(t1/2)：KD(M)＝kd/ka；和t1/2(分钟)＝[ln2/(60＊kd)]。NB：在测试条件下未结合；NT：在该试验中未测试；＊：低于1x10-6(1/s)的拟合kd值小于在这些试验条件下的检测限；因此，为了近似KD和t1/2，kd值设定为1x10-6(1/s)；＊＊：在稳定状态下确定的抗体的平衡解离常数。
如表3和4中所示，抗体在25℃(分别有13和12种抗体KD＜1nM)和37℃(分别有13和12种抗体KD＜1nM)下以高亲和力与CHO表达形式的人和猴TL1A蛋白结合。H4H1750P与猴TL1A蛋白的结合显著弱于与人TL1A蛋白的结合。H4H1704N在25℃和37℃下均以KD＜2nM与CHO表达的mTL1A结合。H4H1818N在25℃下与CHO表达的mTL1A结合(KD～7nM)，但是在37℃下不结合。H4H1681N、H4H1738P、H4H1750P、H4H1752P和H4H1805N这五种抗体在25℃或37℃下不与CHO表达的大鼠TL1A结合；其他八种抗体在两种温度下以～0.6pM至～16nM的KD与大鼠TL1A结合。
如表5所示，三种抗体(H2M1681N、H4H1752P和H2M1805N)在测试条件下不与大肠杆菌表达的Fhm变体[hTL1A(Q167R)]结合。三种抗体(H2M1704N、H4H1725P和H2M1818N)如在稳态条件下分析的与大肠杆菌表达的小鼠TL1A有弱结合(KD为～60nM至～170nM)，而其他全部测试抗体在测试条件下不与小鼠TL1A蛋白结合。
表3
Figure BDA00003325577700291
表4
Figure BDA00003325577700301
表5
Figure BDA00003325577700311
实施例4：抗hTL1A抗体对TL1A的抑制
产生HEK293细胞系(CRK01573，ATCC)以稳定表达与萤光素酶报告子[NFkB效应元件(5x)-荧光素酶-IRES-GFP]一起的人DR3(全长，SEQ ID NO：252)或小鼠DR3(全长，SEQ ID NO：259)。之前已经表明NFkB被TL1A活化(Migone等，2002，Immunity16：479-492)。为了测试膜结合形式的TL1A和TL1A变体，产生稳定表达全长人TL1A(SEQ IDNO：244)、以Arg替换Gln-167的全长人TL1A[Fhm；TL1A(Q167R)；SEQID NO：246]、源自食蟹猴(Macaca fascicularis)的全长TL1A(MfTL1A；SEQ ID NO：248)、全长小鼠TL1A(SEQ ID NO：250)和全长大鼠TL1A(SEQ ID NO：258)的HEK293细胞系。分离稳定细胞系并且维持在10％胎牛血清(FBS；IrVine Scientific)、Dulbecco′s改良Eagle培养基(DMEM；IrVine Scientific)、非必需氨基酸(NEAA；IrVine Scientific)、青霉素/链霉素(Invitrogen)和G418(Invitrogen)中。
对于生物测定，将人或小鼠DR3报告细胞在低血清培养基(即，0.1％FBS和
Figure BDA00003325577700321
(Invitrogen))中以1x104细胞/孔接种在96孔测定板上，并且在37℃、5％CO2下孵育过夜。次日，将可溶性TL1A或Fhm(sTL1A或sFhm)以1∶3系列稀释并且以浓度0.002nM至100nM添加到细胞中(加上不含TL1A的缓冲液对照)。对于抑制，将抗体以1∶3系列稀释并且在恒定浓度的TL1A或Fhm的存在下以浓度0.002nM至100nM添加到细胞中(加上不含抗体的缓冲液对照)：800pM hTL1A(CHO细胞表达；SEQ ID NO：244的残基72-251，具有N端His6标签)、100pMhTL1A(大肠杆菌表达；SEQ ID NO：244的残基72-251，具有或不具有N端Met)、500pM Fhm(CHO细胞表达；SEQ ID NO：246的残基72-251)、400pM MfTL1A(CHO细胞表达；SEQ ID NO：248的残基72-251，具有N端His6标签)、400pM MfTL1A(大肠杆菌表达；SEQ ID NO：248的残基72-251，具有或不具有N端Met)、50pM小鼠TL1A(CHO细胞表达；SEQID NO：250的残基76-252，具有N端His6标签)、20pM小鼠TL1A(大肠杆菌表达；SEQ ID NO：250的残基76-252，具有或不具有N端Met)和50pM大鼠TL1A(CHO细胞表达；SEQ ID NO：258的残基76-252，具有N端His6标签)。在37℃、5％CO2下孵育5.5小时后检测萤光素酶活性。结果在表6示出。对照mAb1：阳性对照(具有对应于US2009/0280116的SEQ ID NOS：21和27的氨基酸序列的重链和轻链可变结构域的抗hTL1A抗体)；对照mAb2：阴性对照(不相关抗体)；NB：在测试条件下未结合；NT：在该测定中未测试；＊：在100nM的最高抗体浓度下抑制未到基线。
表6
如表6所示，如使用针对NFκB活化的萤光素酶报告子所确定的，十三种抗TL1A抗体表现出抑制可溶性人TL1A(CHO和大肠杆菌表达)对表达在HEK293细胞上的人DR3受体的刺激。阳性对照抗体(对照mAb1)抑制大肠杆菌表达的hTL1A，但是不抑制CHO表达的hTL1A。10种抗体还抑制Fhm(具有Q167R的hTL1A)对hDR3表达细胞的刺激。H4H1681N、H4H1805N和H4H1752P在100nM的最高抗体浓度不完全抑制Fhm。全部十三种抗体还阻断MfTL1A(表6)。小鼠TL1A(由CHO和大肠杆菌两者产生)刺激hDR3报告细胞中的NFκB活化；但是，在该测定中，13种抗人TL1A抗体都没有抑制大肠杆菌表达的小鼠TL1A(表6)。在该测定中进一步测试了9种所选择抗体，并且未表明阻断CHO表达的小鼠TL1A(表6)。
为了测试细胞上表达的TL1A刺激hDR3报告系统中信号转导的能力，进行上述可溶性TL1A的生物测定，并进行了以下改变：使用无酶解离溶液(Chemicon)解离粘附的HEK293/TL1A细胞，并且在以1∶2从2x105TL1A细胞开始连续稀释至195细胞之后添加到粘附的hDR3报告细胞中(加上无细胞对照)。对于抗体抑制，将1x104细胞与从100nM至0.002nM的系列稀释抗体一起添加(加上无抗体对照)。结果在表7示出。对照：mAb1和mAb2：与上述测定相同。NB：在测试条件下未结合；NT：在该测定中未测试；＊：在100nM的最高抗体浓度下抑制未到基线。
表7
Figure BDA00003325577700341
如表7所示，全部13种抗体阻断细胞上表达的hTL1A对hDR3表达细胞的刺激。对于细胞结合Fhm，除了H4H1681N、H4H1805N、H4H1750P和H4H1752P(在100nM的最高测试抗体浓度下不完全抑制)之外的所有抗体都显著抑制。对于细胞结合MfTL1A，除了在100nM的最高测试抗体浓度下不完全抑制的H4H1750之外的所有抗体都抑制。检测了H4H1704N、H4H1804N、H4H1805N、H4H1817N、H4H1725P和H4H1742P这六种抗体对于mDR3细胞的细胞表面mTL1A刺激的阻断，均没有表现出抑制。表达小鼠DR3的报告细胞也可被表达rTL1A的293细胞刺激，观察到9773细胞的EC50(表7)。在rTL1A/mDR3测定中测试了四种抗体：H4H1804N、H4H1817N、H4H1725P这三种抗体阻断，而H4H1805N不阻断细胞表面rTL1A对mDR3细胞的刺激(表7)。对照mAb1阻断大肠杆菌表达的可溶性hTL1A和MfTL1A对hDR3细胞的刺激，但是在所有测试条件下不能阻断CHO表达形式的hTL1A和MfTL1A(表6)。在所有测试条件下对照mAb1也不抑制任何细胞表面表达的TL1A和Fhm对hDR3表达细胞的刺激(表7)。
实验5：抗TL1A抗体对于TL1A与hDR3和DcR3的阻断
使用竞争性夹心ELISA测量了抗体阻断人TL1A与其同源受体DR3和DcR3受体之结合的能力。另外，以相同方式测量了对于人TL1A变体Fhm(人TL1AQ167R)和食蟹猴(Macaca fascicularis)TL1A(MfTL1A)蛋白与人DR3或DcR3受体之结合的阻断。用不同量的抗体分别滴定恒定量的生物素化人TL1A或Fhm(两者都在CHO细胞中表达有6His标签)或生物素化MfTL1A(在CHO细胞中表达)。在溶液中孵育抗体-蛋白复合物(1小时，25℃)，然后转移到微量滴定板上，所述微量滴定板包被有表达为人IgG1Fc融合蛋白的人DR3(hDR3)或人DcR3(hDcR3)。在25℃1小时后，将孔洗涤，利用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的链霉亲和素检测结合的人或猴TL1A。使用TMB使孔显色以产生比色反应并且用硫酸水溶液淬灭，之后在Perkin-Elmer Victor X5读板器上在450nm处读取吸光度。使用PrismTM数据分析包将S形剂量反应曲线拟合于数据。使用所计算的IC50值(定义为阻断50％TL1A与hDR3或hDcR3的结合所需的抗体浓度)作为阻断效力的指标。本研究包括全人抗hTL1AmAb和对比抗体，即对照mAb1(具有分别对应于US2009/0280116的SEQ ID NOS：21和27的氨基酸序列的重链和轻链可变结构域的抗hTL1A抗体)和对照mAb3(具有分别对应于US2009/0280116的SEQ ID NOS：57和48的氨基酸序列的重链和轻链可变结构域的抗hTL1A抗体。结果在表8示出。NB：在测试条件下未结合；NT：未检测；生物素化可溶配体的浓度：(1)150pM；(2)500pM；(3)10pM；和(4)50pM。
如表8所示，大部分全人mAb表现出有效阻断TL1A/hDR3和TL1A/hDcR3的结合相互反应，几种表现出低于50pM的IC50值。H4H1752P和H4H1805N这两种抗体强烈阻断人和猴TL1A两者与hDR3和hDcR3两者的结合，但是不能够阻断Fhm与hDR3或hDcR3的结合，表明这两种抗体的结合表位可涉及Fhm突变位点(具有Q167R的hTL1A)附近的区域。hTL1A晶体结构表明残基Q167出现在表面暴露的环内(Zhan等，2009，Biochemistry48：7636-7645)。
表8
Figure BDA00003325577700371
实施例6可溶性hTL1A对于TL1A抗体的细胞表面结合的竞争
将稳定转染以过表达细胞表面hTL1A的人胚肾293细胞首先在流式细胞实验中用4种浓度(1、0.1、0.01和0.003μg/ml)的8种抗hTL1A抗体染色。使用特异性针对人Fcγ的别藻蓝蛋白标记的山羊F(ab′)2[或抗hFcγ-APC F(ab’)2，Jackson ImmunoResearch，#109-136-170]检测结合的人抗体。在竞争性结合试验中使用提供显著染色水平的最低抗体浓度。以1μg/ml使用阴性同种型对照抗体(人IgG4)定义背景信号。对于竞争性试验，将上文定义的最小浓度的8个抗体样品首先用由CHO细胞表达的浓度0.03μg/ml至10μg/ml的可溶性hTL1A处理。在冰上预孵育30分钟，之后将抗体/hTL1A混合物加入到已经通过离心分离在96孔锥形板中的293/HEK-hTL1A细胞中。在冰上再孵育10分钟后，洗涤细胞。向所有孔中以200倍稀释加入第二试剂抗hFcγ-APC F(ab’)2以检测结合抗体。将样品背光在冰上孵育15分钟，然后洗涤。在BDTM LSR II流式细胞仪(BD Biosciences)上检测细胞中结合在细胞表面的抗hTL1A抗体，并且使用FlowJo软件(版本8.8.6；Tree Star Inc.)分析数据。结果在表9示出。最大信号：在不存在可溶性hTL1A时抗hTL1A抗体的结合；最小信号：在加入1μg/ml同种型对照抗体代替抗hTL1A抗体时记录的信号。NT：未检测。
表9
如表9所示，通过添加过量的可溶性hTL1A，8个测试抗体的信号可被竞争性降低至基线水平，表明抗体与细胞表面hTL1A特异性结合。
实施例7：抗TL1A抗体阻断hTL1A依赖性CD4+T细胞刺激
为了确定抗TL1A抗体阻断人CD4+T细胞的hTL1A依赖性刺激的能力，进行体外实验，其中在存在或不存在抗体时测量IFN-gamma(IFN-γ)的hTL1A/抗CD3/抗CD28刺激释放。从由获自纽约血液中心的人血液样品制备的新鲜血块黄层(buffy coat)分离人CD4+T细胞。对于各测定，保持源自单一供体的细胞与其他供体细胞分开。将CD4+T细胞加入以每孔3.5x105细胞加入到96孔平板的孔中。然后向每一孔中加入可溶性hTL1A(具有N端六组氨酸标签的NP_005109.2的72-251残基，由CHO细胞表达)至在RPMI+10％FBS，L谷氨酰胺和青霉素/链霉素中终浓度1μg/ml(16nM，假设hTL1A在溶液中形成三聚体)。还向每一孔中加入抗hTL1A抗体或同种型对照抗体至终浓度1.0μg/ml或3.0μg/ml(分别为6.7nM或20nM)。将样品在黑暗中于4℃孵育15分钟，之后向每一孔中加入抗hCD3(BD Pharmingen、cat#555336)和抗hCD28(BDPharmingen，cat#555725)至终浓度1.0μg/ml。将样品在37℃孵育24小时，获取上清液，通过ELISA确定IFN-γ水平。将每一人CD4+T细胞供体样品中每一抗体的阻断效果(每一条件的两个单独孔的平均值)表示为最大信号除以最大响应窗口的降低，即阻断％＝[(Max-Inhib)/(Max-Min)]x100，其中“MaX”、“Inhib”、“Min”为测量的按如下处理的CD4+人T细胞的IFN-γ浓度：“Max”用[hTL1A+抗hCD3+抗hCD28+同种型对照mAb]处理；“Min：”：用[抗hCD3+抗hCD28+同种型对照mAb]处理；“Inhib”：用[hTL1A+抗hCD3+抗hCD28+抗hTL1A测试mAb]处理。超过“Min”基线水平的IFN-γ阻断对的抗体表示为100％阻断。比率(Max/Min)是以上定义的Max和Min条件下由人CD4+T细胞产生的IFN-γ浓度的比率。
如表10所示，抗体H4H1725P、H4H1805N、H4H1817N和H4H1804N在1μg/ml和3μg/ml浓度显著阻断hTL1A刺激的IFN-γ释放，观察到在较高抗体浓度对于大部分供体几乎完全阻断(＞80％)。针对源自10个不同人供体的CD4+T细胞的13种不同抗hTL1A抗体的IFN-γ分泌的阻断结果进一步总结在表11中。SD：标准偏差。
表10
Figure BDA00003325577700401
表11
Figure BDA00003325577700402
还向来自十二个人供体的CD4+T添加六种不同抗体，在六种不同抗体浓度(0.03μg/ml至10μg/ml)的每一种抗体下测量IFN-γ水平。拟合于数据的曲线允许评估实现每一供体细胞样品的每一抗体的半数最大抑制的抗体浓度。表12提供了实现半数最大抑制的平均(±SD)浓度。
表12
Figure BDA00003325577700411
H4H1725P、H4H1804N、H4H1805N、H4H1817N这四种抗体表现为平均半数最大抑制浓度小于10nM(约为4-9nM)。
Figure IDA00003325578100011
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Claims (20)

1.特异性结合并中和人TNF样配体1A(hTL1A)活性的分离的人抗体或其抗原结合片段。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以约700pM或更低、约300pM或更低、约80pM或更低、或者50pM或更低的平衡解离常数(KD)与具有SEQ ID NO：244之氨基酸序列的hTL1A结合。
3.与人TNF样配体1A(hTL1A)特异性结合的分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、118、134、138、154、158、174、178、194、198、214、218和234的氨基酸序列。
4.与人TNF样配体1A(hTL1A)特异性结合的分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(LCVR)，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226和236的氨基酸序列。
5.根据权利要求3或4所述的抗体或抗原结合片段，其包含选自SEQID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/116、118/126、134/136、138/146、154/156、158/166、174/176、178/186、194/196、198/206、214/216、218/226和234/236的HCVR/LCVR序列对。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其包含SEQ ID NO：2/10、18/26、174/176或234/236的HCVR/LCVR序列对。
7.与hTL1A特异性结合的分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含权利要求5或6所述抗体或抗原结合片段的HCVR/LCVR序列对中所含的重链和轻链互补决定区(CDR)序列。
8.抗体或其抗原结合片段，其与权利要求6所述的抗体或抗原结合片段竞争结合hTL1A。
9.抗体或其抗原结合片段，其结合与权利要求6所述抗体或抗原结合片段所识别的hTL1A上的相同表位。
10.根据权利要求3至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与食蟹猴TL1A(MfTL1A)交叉反应。
11.根据权利要求3至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段与具有SEQ ID NO：246之氨基酸序列的Fhm交叉反应。
12.根据权利要求3至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段不与具有SEQ ID NO：246之氨基酸序列的Fhm交叉反应。
13.分离的核酸分子，其编码权利要求1至12中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
14.表达载体，其包含权利要求13所述的核酸分子。
15.产生抗hTL1A抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：在允许产生所述抗体或其片段的条件下培养包含权利要求14所述表达载体的宿主细胞，以及回收这样产生的所述抗体或其片段。
16.药物组合物，其包含权利要求1至12中任一项所述的抗体或抗原结合片段，以及可药用载体。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其还包含一种或更多种另外的治疗剂，所述治疗剂选自免疫抑制剂、抗炎剂、止痛剂和抗过敏剂。
18.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途，所述疾病或病症通过消除、抑制或降低TL1A活性被预防、减轻、改善或抑制。
19.用于治疗通过消除、抑制或降低TL1A活性来预防、减轻、改善或抑制的疾病或病症的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的权利要求16所述的药物组合物。
20.根据权利要求18所述的用途和根据权利要求19所述的方法，其中所述疾病或病症选自：溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、哮喘和变应性肺炎。
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