BR112013011245A2 - anticorpos humanos ao ligante 1a do tipo tnf (tl1a) humano - Google Patents

anticorpos humanos ao ligante 1a do tipo tnf (tl1a) humano Download PDF

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Brendan J. CLASSON
Dimitris SKOKOS
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Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
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Abstract

ANTICORPOS HUMANOS AO LIGANTE 1A DO TIPO TNF (TL1A) HUMANO. A presente invenção refere-se a um anticorpo totalmente humano ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo humano que se liga especificamente e inibe o ligante 1A de TNF humano (hTL1A) é fornecido. Os anticorpos anti-hTL1A humana são úteis no tratamento de doenças ou distúrbios associados à TL1A, tais como doenças e distúrbios inflamatórios, tais como as doenças inflamatórias do intestino, incluindo colite ulcerativa e doença de Crohn, artrite reumatoide e similares, doenças ou distúrbios auto-imunes, tais como esclerose múltipla, diabetes e similares e reações alérgicas, tais como asma e inflamação pulmonar alérgica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS HUMANOS AO LIGANTE 1A DO TIPO TNF (TL1A) HUMANO".
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a anticorpos humanos e fragmen- 5 tos de ligação a antígeno de anticorpos humanos que se ligam especifica- mente ao ligante do tipo TNF 1A humano (hTL1A) e métodos terapêuticos de uso destes anticorpos.
DECLARAÇÃO DE TÉCNICAS RELACIONADAS TL1A é uma proteína de membrana celular do tipo II da super- família do factor de necrose de tumor (Tumor Necrosis Factor Superfamily - TNFSF) e também designada como TNFSF15. Ela é expressa sobre a su- perfície de células endoteliais e células ativadas da linhagem hematopoiéti- ca, incluindo monócitos, macrófagos, linfócitos, células mononucleares da lamina propria, células dendríticas e células plasmáticas (Tan, K.B. et al., 1997, Gene 204: 35-46; Prehn, J.L. et al., 2007, J Immunol 178: 4033-4038). Ela é também expressa no rim, pulmão, próstata e timo (Tan et al., 1997, supra). Em células endoteliais, expressão de TL1A é regulada positivamente por IL-1α e TNFγ (Migone, T.S. et al., 2002, Immunity 16: 479-492). Em mo- nócitos de sangue humano fresco e células dendríticas derivadas de monóci- tos, expressão de TL1A é super-regulada por sinalização mediada pelo re- ceptor Fc(R ou do tipo Toll (TLR) (Prehn et al., 2007, supra; Meylan, F. et al., 2008, Immunity 29: 79-89). TL1A pode ser clivada a partir da membrana ce- lular por meio de um mecanismo análogo ao TNF( e uma forma de TL1A com ectodomínio solúvel foi reportada (Migone et al., 2002, supra; Kim, S. et al., 2005, J Immunol Methods 298: 1-8; Yang, C.R. et al., 2004, Cancer Res 64: 1122-1129). Sequenciamento de proteína confirmou que esta forma de TL1A é liberada após clivagem do precursor ancorado à membrana entre os resíduos Ala-71 e Leu-72 (Migone et al., 2002, supra). Dois cDNAs variantes que codificam potencialmente versões N-terminalmente truncadas de TL1A foram identificados: VEGI-174 (ou TL1) (Zhai, Y. et al., 1999, FASEB J. 13: 181-189) e VEGI-192 (Chew, L.J. et al., 2002, FASEB J. 16: 742-744). Os dados publicados na literatura sugerem que os produtos biologicamente ati-
vos do gene de TL1A são do a proteína transmembrana do tipo II de com- primento total (resíduos 1-251) e seu ectodomínio proteoliticamente clivado (resíduos 72-251) (Migone et al., 2002, supra; Jin et al., 2007, Biochem Bio- phys Res Commun 364: 1-6). Uma variante de hTL1A, designada como 5 "Fhm", que contém uma única substituição de aminoácido de Gln-167 por Arg, é descrita no documento US 6.521.422. TL1A media sinais via seu receptor cognato Receptor de Morte 3 (Death Receptor 3 - DR3; também conhecido como TNFRSF25; as sequên- cias de ácido nucleico e aminoácido de SEQ ID NOs: 251 e 252, respecti- vamente), resultando em promoção de sobrevivência celular e secreção de citocinas pró-inflamatórias ou que promovem a apoptose de maneira depen- dente do contexto.
TL1A é um de três ligantes conhecidos (além de FasL e LIGHT) que são ligados pelo receptor decoy solúvel endógeno DcR3 (tam- bém conhecido como TR6, NTR3 ou TNFRSF2; as sequências de ácido nu- cleico e aminoácido de SEQ ID NOs: 253 e 254, respectivamente) (Migone et al., 2002, supra; Yang, C.R. et al., 2004, Cancer Res. 64: 1122-1129). DR3 é um receptor relacionado com domínio de morte relacio- nado ao receptor de TNF expresso na maioria dos linfócitos T ativados e células NK (Migone et al., 2002, supra; Screaton, G.R. et al., 1997, Proc Natl Acad Sci (USA) 94: 4615-4619). TL1A se encaixa ao DR3 sobre células T, aumentando sua capacidade de resposta à IL-2 (Migone et al., 2002, supra), potencializando a proliferação de células T e liberação de IFN-γ e GM-CSF sob condições de co-estimulação sub-ótima (Migone et al., 2002, supra; Me- ylan et al., 2008, supra). Também foi mostrado que a TL1A sinergiza com níveis sub-ótimos de IL-12/IL-18 para induzir à produção de IFN( por células T CD4+ (Papadakis, K.A. et al., 2004, J.
Immunol 172: 7002-7007; Prehn, J.L. et al., 2004, Clin Immunol 112: 66-77; Papadakis, K.A. et al., 2005, J Immunol 174: 4985-4990;. Cassatella, M.A. et al., 2007, J Immunol 178: 7325-7333). Foi mostrado que TL1A está envolvida em várias doenças infla- matórias e/ou doenças autoimunes, incluindo doenças inflamatórias do intes- tino [por exemplo, colite ulcerativa (Ulcerative Colitis - UC) e doença de
Crohn (Crohn's Disease - DC)], artrite reumatoide, esclerose múltipla (Multi- ple Sclerosis - MS), aterosclerose e similares (vide Bayry, J., 2010, Nature Reviews/Rheumatology 6: 67-68; Takedatsu, H. et al., 2008, Gastroentero- logy 135: 552-567; Prehn et al., 2004, supra; Bamias, G. et al., 2008, Clin 5 Immunol 129: 249-255; Bull, M.J. et al., 2008, J Exp Med 205: 2457-2464; Pappu, B.P. et al., 2008, J Exp Med 205: 1049-1062; Bamias, G. et al., 2003, J Immunol 171: 4868-4874; Kang, Y. et al., 2005, Cytokine 29: 229-235). Embora a maioria dos dados publicados sejam consistentes com um papel central para TL1A ao ativar a diferenciação de células efetuadoras TH1 e TH17, um estudo recente propôs um papel para a interação TL1A/DR3 no desenvolvimento de respostas de células T TH2 em modelos de asma (Fang , L. et al., 2008, J Exp. Med. 205: 1037-1048). Assim, o uso de inibidores de TL1A, tais como anticorpos totalmente humanos contra TL1A com altas afi- nidades e atividade de neutralização, isoladamente ou em combinação com agentes anti-inflamatórios atualmente disponíveis, imunossupressores (por exemplo, antagonistas de TNF-(, cortisona ou esteroides e similares) e/ou agentes antialérgicos, constitui um tratamento eficaz para estas doenças e distúrbios. As sequências de ácido nucleico e aminoácido de TL1A humana são mostradas em SEQ ID NOS: 243 e 244, respectivamente e aquelas de Fhm são mostradas em SEQ ID NOS: 245 e 246, respectivamente. Anticor- pos à TL1A são descritos, por exemplo, nos documentos US 7.597.886, US
7.820.798 e US 2009/0280116.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO Em um primeiro aspecto, a invenção proporciona anticorpos mo- noclonais totalmente humanos (mAbs) e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam especificamente e neutralizam a atividade de TL1A humana (hTL1A). Os anticorpos podem ser de comprimento total (por exemplo, um anticorpo IgG1 ou IgG4) ou podem compreender apenas uma porção de li- gação a antígeno (por exemplo, um fragmento Fab, F(ab')2 ou scFv) e po- dem ser modificados para afetar a funcionalidade, por exemplo, para elimi-
nar funções efetuadoras residuais (Reddy et al., 2000, J.
Immunol. 164: 1925-1933). Em uma modalidade, a invenção se caracteriza por um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo compreendendo uma 5 região variável da cadeia pesada (Heavy Chain Variable Region - HCVR) selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 118, 134, 138, 154, 158, 174, 178, 194, 198, 214, 218 e 234 ou uma sequência substancialmente similar às mesmas que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
Em outra modalidade, o anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR tendo uma sequência de ami- noácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 134, 174 e 234. Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma HCVR compreendendo SEQ ID NOs: 2, 18, 174 ou 234. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo com- preende ainda uma região variável de cadeia leve (Light Chain Variable Re- gion - LCVR) selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 176, 186, 196, 206, 216, 226 e 236 ou uma sequência substancialmente similar às mesmas que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
Em outra modalidade, o anticorpo ou porção de ligação a antígeno de um anticorpo compreende uma LCVR tendo uma se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 136, 176 e 236. Em ainda outra modalidade, o anti- corpo ou fragmento do mesmo compreende uma LCVR compreendendo SEQ ID NOs: 10, 26, 176 ou 236. Em outras modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende um par de sequências de HCVR e LCVR (HCVR/LCVR) sele- cionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/116, 118/126, 134/136, 138/146, 154/156, 158/166, 174/176, 178/186, 194/196, 198/206, 214/216, 218/226 e 234/236.
Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma HCVR e LCVR selecionadas dos pares de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 134/136, 174/176 e 234/236. Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende um 5 par de HCVR/LCVR compreendendo SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 174/176 ou 234/236. Em um segundo aspecto, a invenção se caracteriza por um anti- corpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região de determinação de complementa- ridade de cadeia pesada 3 (Heavy Chain Complementarity Determining Re- gion - HCDR3) selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8, 24, 40 , 56, 72, 88, 104, 124, 144, 164, 184, 204 e 224 ou uma sequência subs- tancialmente similar às mesmas que têm pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e uma sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve (Light Chain Comple- mentarity Determining Region - LCDR3) selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 132, 152, 172, 192, 212 e 232 ou sequências substancialmente similares às mesmas que têm pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende um par de sequências de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 compreendendo SEQ ID NOs: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112 124/132, 144/152, 164/172, 184/192, 204/212 ou 224/232. Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende um par de sequências de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 compreendendo SEQ ID NOs: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 124/132, 164/172 ou 224/232. Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende um par de sequências de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 compreendendo SEQ ID NOs: 8/16, 24/32, 164/172 ou 224/232. Em outra modalidade, a invenção se caracteriza por um anticor- po ou fragmento do mesmo compreendendo ainda uma sequência de ami- noácidos de CDR1 de cadeia pesada (HCDR1) selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 120, 140, 160, 180, 200 e 220 ou uma sequência substancialmente similar às mesmas que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de i- dentidade de sequência, uma sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia 5 pesada (HCDR2) selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 122, 142, 162, 182, 202 e 222 ou uma sequência subs- tancialmente similar às mesmas que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência e/ou uma sequência de aminoácidos de cadeia leve de CDR1 (LCDR1) selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 12, 28, 44, 60, 76 , 92, 108, 128, 148, 168, 188, 208 e 228 ou uma sequência substancialmente similar às mesmas que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência e/ou uma sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia leve (LCDR2) selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 130, 150, 170, 190, 210 e 230 ou uma sequência substancialmente similar às mesmas que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo com- preende uma combinação de HCDR1/HCDR2/HCDR3 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4/6/8, 20/22/24, 36/38/40, 52/54/56, 68/70/72, 84/86/88, 100/102/104, 120/122/124, 140/142/144, 160/162/164, 180/182/184, 200/202/204 e 220/222/224 e/ou uma combinação de LCDR1/LCDR2/ LC- DR3 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 12/14/16, 28/30/32, 44/46/48, 60/62/64, 76/78/80, 92/94/96, 108/110/112, 128/130/132, 148/150/152, 168/170/172, 188/190/192, 208/210/212 e 228/230/232. Em outra modalida- de, as sequências de aminoácidos de CDR de cadeias pesada e leve com- preendem uma combinação de sequências de CDR selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/ 44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/ 104/108/110/112, 120/122/124/128/130/132, 140/142/144/148/150/152, 160/ 162/164/168/170/172, 180/182/184/188/190/192, 200/202/204/208/210/212 e 220/222/224/228/230/232. Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende as sequências de CDR de cadeias pesada e leve de SEQ ID NOs: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 120/122/124/128/ 130/132, 160/162/164/168/170/172 ou 220/222/224/228/230/232. Em ainda 5 modalidade, as sequências de aminoácidos de CDR de cadeias pesada e leve compreendem uma combinação de sequências de CDR selecionada de SEQ ID NO: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 160/162/164/168/170/172 ou 220/222/224/228/230/232. Em uma modalidade relacionada, a invenção compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo que se liga especificamente à hTL1A, em que o anticorpo ou fragmento do mesmo com- preende os domínios de CDR contidos dentro de pares de sequências de cadeias pesada e leve selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/116, 118/126, 134/136, 138/146 , 154/156, 158/166, 174/176, 178/186, 194/196, 198/206, 214/216, 218/226 e 234/236. Métodos e técnicas para identificação de CDRs dentro de sequências de aminoácidos de HCVR e LCVR são conhecidos na técnica e podem ser aplicados para identificar CDRs dentro das sequências de ami- noácidos de HCVR e/ou LCVR especificadas descritas aqui.
Definições con- vencionais que podem ser aplicadas para identificar os limites de CDRs in- cluem a definição de Kabat, a definição de Chothia e a definição AbM.
Em termos gerais, a definição de Kabat se baseia na variabilidade de sequência, a definição de Chothia se baseia na localização das regiões estruturais da alça e a definição AbM é um compromisso entre as abordagens de Kabat e Chothia.
Vide, por exemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), Al-Lazikani et al., J.
Mol.
Biol. 273: 927-948 (1997) e Martin et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 86: 9268-9272 (1989). Bancos de dados públicos também estão dispo- níveis para a identificação de sequências de CDR dentro de um anticorpo.
Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende se- quências de CDR contidas dentro de um par de HCVR e LCVR selecionado do grupo que consiste nos pares de sequências de aminoácidos de SEQ ID
NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58 , 66/74, 134/136, 174/176 e 234/236. Em ou- tra modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende sequên- cias de CDR contidas dentro do par de sequências de HCVR e LCVR de SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 174/176 ou 234/236. 5 Em outra modalidade relacionada, a invenção proporciona um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compete pela ligação específica à hTL1A com um anticorpo ou fragmento de ligação a an- tígeno compreendendo sequências de CDR de cadeias pesada e leve de SEQ ID NOs: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/ 56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 120/122/124/128/130/132, 160/162/164/168/ 170/172 ou 220/222/224/228/230/232. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compete pela ligação específica à hTL1A com um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreen- dendo sequências de CDR de cadeias pesada e leve de SEQ ID NOs: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 160/162/164/168/170/172 ou 220/222/ 224/228/230/232. Em outra modalidade, o anticorpo da invenção ou frag- mento de ligação a antígeno compete pela ligação específica à hTL1A com um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendendo um par de sequências de HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 134/136, 174/176 ou 234/236. Em ainda outra modalidade, o anticor- po ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compete pela ligação es- pecífica à hTL1A com um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendendo um par de sequências de HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 174/176 ou 234/236. Em outra modalidade relacionada, a invenção proporciona um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga ao mesmo epítopo sobre hTL1A que é reconhecido por um anticorpo ou frag- mento do mesmo que compreende as sequências de CDR de cadeias leve e pesada de SEQ ID NOs: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/ 46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 120/122/124/128/130/132, 160/ 162/164/168/170/172 ou 220/222/224/228/230/232. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga ao mesmo epítopo sobre hTL1A que é reconhecido por um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que compreende as sequências de CDR de cadeias pe- sada e leve de SEQ ID NOs: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 160/162/ 164/168/170/172 ou 220/222/224/228/230/232. Em outra modalidade, o anti- 5 corpo da invenção ou fragmento de ligação a antígeno reconhece o mesmo epítopo sobre hTL1A que é reconhecido por um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que compreende um par de sequências de HCVR/LCVR de SEQ ID NO: SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 134/136, 174/176 ou 234/236. Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo reconhece o mesmo epítopo sobre hTL1A que é reconhecido por um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que compreende um par de sequências de HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 2/10, 18/26 , 174/176 ou 234/236. Em um terceiro aspecto, a invenção proporciona moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos anti-TL1A ou fragmentos dos mes- mos descritos acima.
Vetores de expressão recombinantes que trazem os ácidos nucleicos da invenção e células hospedeiras isoladas, por exemplo, células bacterianas, tais como células de E. coli ou células de mamíferos, tais como células CHO, nas quais tais vetores foram introduzidos, também são abrangidos pela invenção, bem como métodos de produção dos anticor- pos por meio de cultura das células hospedeiras sob condições que permi- tem a produção dos anticorpos e recuperação dos anticorpos produzidos.
Em uma modalidade, a invenção proporciona um anticorpo ou fragmento do mesmo que compreende uma HCVR codificada por uma se- quência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 117, 133, 137, 153, 157, 173, 177, 193, 197, 213, 217 e 233 ou uma sequência substancialmente idêntica que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia com as mesmas.
Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma HCVR codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 49, 65, 133, 173 e 233. Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma HCVR codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 1, 17, 173 ou 233. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo com- preende ainda uma LCVR codificada por uma sequência de ácido nucleico 5 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 115, 125, 135, 145, 155, 165, 175, 185, 195, 205, 215, 225 e 235 ou uma sequência substancialmente idêntica que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia com as mesmas.
Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo com- preende uma LCVR codificada por uma sequência de ácido nucleico sele- cionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 9, 25, 41, 57, 73, 135, 175 e 235. Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma LCVR codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 9, 25, 175 ou 235. Em outras modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende um par de sequências de HCVR e LCVR (HCVR/LCVR) codifi- cado por um par de sequências de ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1/9, 17/25, 33/41, 49/57, 65/73, 81/89, 97/105, 113/115, 117/125, 133/135, 137/145, 153/155, 157/165, 173/175, 177/185 , 193/195, 197/205, 213/215, 217/225 e 233/235. Em uma modalidade, o anti- corpo ou fragmento do mesmo compreende um par de sequências de HC- VR/LCVR codificado por um par de sequências de ácido nucleico seleciona- do do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1/9, 17/25, 33/41, 49/57, 65/73, 133/135, 173/175 e 233/235. Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende um par de sequências de HCVR/LCVR codificado por um par de sequências de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 1/9, 17/25, 173/175 ou 233/235. Em uma modalidade, a invenção se caracteriza por um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo que compreende um domínio de HCDR3 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecio- nada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 123, 143, 163, 183, 203 e 223 ou uma sequência substancialmente idêntica que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia com as mesmas e um domínio de LCDR3 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 131, 151, 171, 191, 211 e 231 ou uma 5 sequência substancialmente idêntica que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia com as mesmas.
Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende um par de sequências de LCDR3 e HCDR3 codificado pelo par de sequências de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 7/15, 23/31, 39/47, 55/63, 71/79, 87/95, 103/111, 123/131, 143/151, 163/171, 183/191, 203/211 ou 223/231. Em ou- tra modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende um par de sequências de LCDR3 e HCDR3 codificado pelo par de sequências de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 7/15, 23/31, 39/47, 55/63, 71/79, 123/131, 163/171 ou 223/231. Em ainda outra modalidade, o par de sequências de HC- DR3/LCDR3 é codificado pelo par de sequências de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 7/15, 23/31, 163/171 ou 223/231. Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo com- preende, além disso, um domínio de HCDR1 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 119, 139, 159, 179, 199 e 219 ou uma sequência subs- tancialmente idêntica que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo me- nos 98% ou pelo menos 99% de homologia com as mesmas; um domínio de HCDR2 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 121, 141, 161, 181, 201 e 221 ou uma sequência substancialmente idêntica que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia com as mesmas; um domínio de LCDR1 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 127, 147, 167, 187, 207 e 227 ou uma sequência subs- tancialmente idêntica que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo me- nos 98% ou pelo menos 99% de homologia com as mesmas; e um domínio de LCDR2 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 129, 149, 169, 189, 209 e 229 ou uma sequência substancialmente idêntica que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia com as mesmas.
Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento 5 do mesmo compreende uma combinação de HCDR1/HCDR2/HCDR3 codifi- cada por SEQ ID NOs: 3/5/7, 19/21/23, 35/37/39, 51/53/55, 67/69/71, 83/85/87, 99/101/103, 119/121/123, 139/141/143, 159/161/163, 179/181/183, 199/201/203 ou 219/221/223, e uma combinação de LCDR1/LCDR2/LCDR3 codificada por SEQ ID NOs: 11/13/15, 27/29/31, 43/45/47, 59/61/63, 75/77/79, 91/93/95, 107/109/111, 127/129/131, 147/149/151, 167/169/171, 187/189/191, 207/209/211 ou 227/229/231. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende sequências de CDR de cadeias pesa- da e leve codificadas por uma combinação de sequências de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3/5/7/11/13/15, 19/21/ 23/27/29/31, 35/37/39/43/45/47, 51/53/55/59/61/63, 67/69/71/75/77/79, 83/ 85/ 87/91/93/95 99/101/103/107/109/111, 119/121/123/127/129/131, 139/141/ 143/147/149/151, 159/161/163/167/169/171, 179/181/183/187/189/191, 199/ 201/203/207/209/211 e 219/221/223/227/229/231. Em outra modalidade, o anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo compreende sequên- cias de CDR de cadeias pesada e leve codificadas por uma combinação de sequências de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 3/5/7/11/13/15, 19/21/23/ 27/29/31, 35/37/39/43/45/47, 51/53/55/59/61/63, 67/69/71/75/77/79, 119/121/ 123/127/129/131 ou 159/161/163/167/169/171 219/221/223/227/229/231. Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo compreende sequências de CDR de cadeias pesada e leve codifica- das por uma combinação de sequências de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 3/5/7/11/13/15, 19/21/23/27/29/31, 159/161/163/167/169/171 ou 219/221/ 223/227/229/231. Em um quarto aspecto, a invenção se caracteriza por um anti- corpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo que se liga especificamente à hTL1A compreendendo uma HCDR3 e LCDR3, em que a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos da fórmula X1 -
X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 - X9 - X10 - X11 - X12 - X13 - X14 - X15 - X16 (SEQ ID NO:239), em que X1 é Thr ou Ala, X2 é Lys, Arg ou está ausente, X3 é Glu, Gly ou está ausente, X4 é Asp, Pro ou está ausente, X5 é Leu ou está ausente, X6 é Arg, Tyr, Glu ou está ausente, X7 é Gly, Asp, Ala ou está au- 5 sente, X8 é Asp, Ser ou Tyr, X9 é Tyr ou Trp, X10 é Tyr ou Asp, X11 é Tyr, Lys ou Ile, X12 é Gly, Tyr, Asn, ou Ser, X13 é Val, Gly ou Ser, X14 é Phe ou Met, X15 é Asp e X16 é Tyr ou Val; e a LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos da fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 - X9 (SEQ ID NO:242), em que X1 é Gln, X2 é Gln, X3 é Tyr, Leu ou Phe, X4 é His, Tyr ou Asn, X5 é Arg ou Ser, X6 é Ser, Thr ou Tyr, X7 é Trp ou Pro, X8 é Phe, Leu ou está ausente e X9 é Thr.
Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo com- preende ainda uma sequência de HCDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 (SEQ ID NO:237), em que X1 é Gly, X2 é Phe, X3 é Thr, X4 é Phe, X5 é Ser, X6 é Thr, Ser ou Asn, X7 é Tyr, and X8 é Gly, Trp, Val ou Ala; uma sequência de HC- DR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 (SEQ ID NO:238), em que X1 é Ile ou Val, X2 é Ser ou Lys, X3 é Gly ou Glu, X4 é Thr, Asp, Ser ou Arg, X5 é Gly, X6 é Arg, Ser ou Gly, X7 é Thr, Glu ou Ser, and X8 é Thr ou Lys; uma sequência de LCDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos da fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 - X9 - X10 - X11 - X12 (SEQ ID NO:240), em que X1 é Gln, X2 é Thr, Ser, Ala ou Gly, X3 é Ile, X4 é Ser ou Leu, X5 é Tyr ou está ausente, X6 é Ser ou está ausente, X7 é Ser ou está ausente, X8 é Asn ou está ausente, X9 é Asn ou está ausente, X10 é Lys ou está ausente, X11 é Ser, Asn ou Thr, and X12 é Trp ou Tyr; e uma sequência de LDR2 compreendendo uma se- quência de aminoácidos da fórmula X1 - X2 - X3 (SEQ ID NO:241) em que X1 é Ala, Trp ou Ser, X2 é Ala ou Thr, and X3 é Ser.
Em um quinto aspecto, a invenção se caracteriza por um anti- corpo anti-TL1A humana ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) codificada por segmentos de sequências de nucleotídeos derivados de sequências de li-
nhagem germinativa de VH, DH e JH e uma região variável de cadeia leve (LCVR) codificada por segmentos de sequências de nucleotídeos derivados de sequências de linhagem germinativa de VK e JK. Em determinadas moda- lidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compre- 5 ende a HCVR e a LCVR codificadas por segmentos de sequências de nu- cleotídeos derivados de uma combinação de genes da linhagem germinativa selecionada do grupo que consiste em: (i) VH3-23, DH2-21, JH4, VK1-5 e JK1; (ii) VH3-7, DH1-7, JH6, VK4-1 e JK3; (iii) VH3-23, DH2-2, JH6, VK1-9 e JK2; (iv) VH3-23, DH6-6, JH4, VK1-9 e JK4; (v) VH1-2, DH2-15, JH3, VK1-12 e JK4; (vi) VH4-34, DH3-9, JH4, VK3-20 e JK4; (vii) VH4-34, DH1-1, JH4, VK3-20 e JK4; e (viii) VH4-34, DH3-3, JH4, VK2-24 e JK4. Em um sexto aspecto, a invenção se caracteriza por um anticor- po ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamen- te à hTL1A ou Fhm com uma constante de dissociação em equilíbrio (KD) de cerca de 1 nM ou menos, conforme medido pelo ensaio de ressonância de plasmon de superfície (por exemplo, BIACORETM). Em determinadas moda- lidades, o anticorpo da invenção exibe uma KD de cerca de 800 pM ou me- nos, cerca de 700 pM ou menos, cerca de 600 pM ou menos, cerca de 500 pM ou menos, cerca de 400 pM ou menos, cerca de 300 pM ou menos, cer- ca 200 pM ou menos, cerca de 150 pM ou menos, cerca de 100 pM ou me- nos, cerca de 90 pM ou menos, cerca de 80 pM ou menos, cerca de 50 pM ou menos ou 30 pM ou menos. Em um sétimo aspecto, a presente invenção proporciona um an- ticorpo anti-hTL1A ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína hTL1A de SEQ ID NO: 244, mas não reage de forma cruzada com uma variante da mesma, tal como Fhm de SEQ ID NO: 246, conforme de- terminado, por exemplo, por meio de ELISA, ensaio de ressonância de plasmon de superfície ou a Tecnologia Luminex® ou xMAP, conforme des- crito aqui. Fhm contém uma única substituição de aminoácido na posição 167, que corresponde à Gln em hTL1A, por Arg (vide Patente U.S. N°
6.521.422). Em modalidades relacionadas, a invenção também proporciona um anticorpo anti-hTL1A ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a uma proteína hTL1A e reage de forma cruzada com uma Fhm.
Em outra modalidade relacionada, a invenção proporciona um anticorpo anti- hTL1A ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que não reage de forma cruzada com TL1A de camundongo (mTL1A: SEQ ID NO: 250, codifi- 5 cada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 249), mas reage de forma cruzada com TL1A de macaco Cynomolgus (Macaca fascicularis ou MfTL1A: SEQ ID NO: 248, codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 247) ou de macaco rhesus (Macaca mulatta: a mesma sequên- cia de aminoácidos conforme MfTL1A). Em outras modalidades relaciona- das, a invenção proporciona um anticorpo anti-hTL1A ou fragmento de liga- ção a antígeno do mesmo que reage de forma cruzada com mTL1A e Mf- TL1A.
A invenção abrange anticorpos anti-hTL1A que têm um padrão de glicosilação alterado.
Em algumas aplicações, modificação para remover sítios de glicosilação indesejáveis ou, por exemplo, remoção de uma porção fucos e para aumentar a função de citotoxicidade celular dependente de an- ticorpo (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity - ADCC) vide Escudo e tal. (2002) JBC 277: 26733). Em outras aplicações, remoção do sítio de N-glicosi laçã o p ode reduz ir reações imunes indesejáveis contra o santicorpos tera- pêuticos ou aumentaras afinidades dos anticorpos.
E m ainda outras aplica- ções, modificação de galactosilaçã o pode ser feita de modo a modificar a citotoxicidade dependente de complemento (Complement Dependent Cyto- toxicity - CDC). Em um oitavo aspecto, a invenção se caracteriza por uma com- posição farmacêutica compreendendo um anticorpo humano recombinante ou fragmento do mesmo que se liga especificamente à hTL1A e um veículo farmaceuticamente aceitável.
Em uma modalidade, a invenção se caracteri- za por uma composição que é uma combinação de um anticorpo ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo da invenção e um segundo agente terapêutico.
O segundo agente terapêutico pode ser um ou mais de qualquer agente, tais como agentes imunossupressores, agentes anti-inflamatórios, agentes analgésicos, agentes antialérgicos e similares, muitos dos quais podem ter efeitos terapêuticos sobrepostos uns aos outros.
Imunossupresso- res adequados para serem usados em combinação com os anticorpos anti- hTL1A da invenção incluem, porém sem limitações, glucocorticodes, ciclos- porina, metotrexato, interferon β (IFN-β), tacrolimus, sirolimus, azatioprina, 5 mercaptopurina, opioides, micofenolato, proteínas de ligação ao TNF, tais como eternacept, infliximab, adalimumab e similares, antibióticos citotóxicos, tais como dactinomicina, antraciclinas, mitomicina C, bleomicina, mitramicina e similares, anticorpos que objetivam células imunes, tais como anticorpos anti-CD20, anticorpos anti-CD3 e similares.
Agentes anti-inflamatórios e/ou analgésicos adequados para terapias combinadas com anticorpos anti- hTL1A incluem corticosteroides, fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (Non Steroidal Anti-Inflammatory Drugs - NSAIDs), tais como aspirina, ibu- profeno, naproxeno, inibidores de COX-2 e similares, antagonistas de TNF- α, antagonistas de IL-1, antagonistas de IL-6, acetaminofeno, morfinomimé- ticos e similares.
Agentes antialérgicos adequados incluem anti-histamínicos, glucocorticoides, epinefrina (adrenalina), teofilina, cromolina sódica e anti- leucotrienos, bem como anticolinérgicos, descongestionantes, estabilizantes de mastócitos e similares.
Em um nono aspecto, a invenção apresenta métodos para inibi- ção de atividade de hTL1A usando o anticorpo anti-hTL1A ou porção de li- gação a antígeno do anticorpo da invenção, em que os métodos terapêuticos compreendem administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo uma anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo da invenção e opcionalmente um ou mais agentes terapêuticos adicionais descritos acima.
A doença ou distúrbio tratado é qualquer doença ou condição a qual é aliviada, melhor inibida ou evitada ou sua taxa de ocorrência é reduzida comparado com aquela sem tratamento com o anticorpo anti-hTL1A mediante eliminação, redução ou inibição da atividade de TL1A.
Exemplos de doenças ou distúrbios tratáveis por meio dos métodos da invenção incluem, porém sem limitações, doenças inflamatórias e/ou doenças autoimunes, tais como as doenças inflamatórias do intestino (Inflammatory Bowel Disease - IBD), incluindo UC e CD, RA,
MS, diabetes tipo 1 e tipo 2, psoríase, artrite psoriática, espondilite anquilo- sante, dermatite atópica e similares; reações e condições alérgicas, incluindo asma, inflamação pulmonar alérgica e similares; aterosclerose em cânceres, infecções, doenças neurodegenerativas, rejeição a enxerto, doenças enxerto 5 versus hospedeiro (GVHD), distúrbios/doenças cardiovasculares e similares. Outras modalidades serão evidentes a partir de uma revisão da descrição detalhada a seguir.
DESCRIÇÃO DETALHADA Antes que a presente invenção seja descrita em detalhes, deve ser entendido que a presente invenção não está limitada aos métodos parti- culares e condições experimentais descritas, uma vez que os métodos e condições podem variar. Deve também ser entendido que a terminologia usada aqui é para fins de descrição de modalidades particulares apenas e não se destina a ser limitativa, uma vez que o âmbito da presente invenção estará limitado apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente en- tendido por aqueles versados na técnica à qual pertence a presente inven- ção. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àque- les descritos aqui possam ser usados na prática ou testagem da presente invenção, métodos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as pu- blicações mencionadas são aqui incorporadas por referência na íntegra. Definições O termo "ligante 1A de TNF humano" ou "hTL1A", conforme u- sado aqui, refere-se à hTL1A que tem a sequência de ácido nucleico mos- trada em SEQ ID NO: 243 e a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 244 ou um fragmento biologicamente ativo da mesma, bem como as varian- tes de hTL1A, incluindo Fhm, que têm a sequência de ácido nucleico mos- trada em SEQ ID NO: 245 e a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 246 ou um fragmento biologicamente ativo da mesma, a menos que especi- ficamente indicado em contrário. O termo "anticorpo", conforme usado aqui, se destina referir-se à moléculas de imunoglobulina compreendidas de quatro cadeias polipeptídi- cas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por pontes de dissulfeto.
Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável da cadeia pesada (Heavy Chain Variable Region - HCVR) e uma 5 região constante de cadeia pesada (CH; compreendida por domínios CH1, CH2 e CH3). Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável de cadeia leve (Light Chain Variable Region - LCVR) e um a região constante de cadeia leve (CL). A HCRV e LCVR podem ainda ser subdivididas em re- giões de hipervariabilidade denominadas regiões de determinação de com- plementaridade (Complementary Determining Regions - CDR) intercaladas com regiões que são mais conservadas denominadas regiões de framework (FR). Cada HCVR e LCVR é composta de três CDRs e quatro FRs dispos- tas, do amino término para o carbóxi término, na seguinte ordem: FR1, C- DR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Substituição de um ou mais resíduos de CDR ou omissão de uma ou mais CDRs também é possível.
Foram descritos anticorpos na litera- tura científica nos quais uma ou duas CDRs podem ser dispensadas para ligação.
Padlan et al. (1995 FASEB J. 9: 133-139) analisaram as regiões de contato entre anticorpos e seus antígenos com base em estruturas de cristal publicadas e concluíram que apenas cerca de um quinto a um terço dos re- síduos de CDR realmente contatam o antígeno.
Padlan também descobriu muitos anticorpos em que uma ou duas CDRs não tinham aminoácidos em contato com um antígeno (vide também, Vajdos et al., 2002 J Mol Biol 320: 415-428). Resíduos de CDR que não contatam o antígeno podem ser iden- tificados com base em estudos anteriores (por exemplo, os resíduos H60- H65 em CDRH2 frequentemente não são necessários) a partir de regiões CDR de Kabat que estão fora das CDRs de Chothia por meio de modela- mento molecular e/ou empiricamente.
Se uma CDR ou resíduo(s) da mesma são omitidos, ele é usualmente substituído por um aminoácido que ocupa a posição correspondente em outra sequência de anticorpo humano ou um consenso de tais sequências.
Posições para substituição dentro de CDRs e aminoácidos a substituir também podem ser selecionados empiricamente.
Substituições empíricas podem ser substituições conservativas ou não con- servativas.
O termo "anticorpo humano", conforme usado aqui, se destina a 5 incluir anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de sequên- cias de imunoglobulina da linhagem germinativa humana.
Os mAbs huma- nos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pe- las sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana (por e- xemplo, mutações introduzidas por meio de mutagênese aleatória ou sítio- específica in vitro ou através de mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e, em particular, na CDR3. No entanto, o termo "anticorpo humano", conforme usado aqui, não se destina a incluir mAbs nos quais sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamífero (por exemplo, camundongo) foram enxertadas sobre sequências de FR huma- nas.
Os anticorpos anti-TL1A totalmente humanos descritos aqui po- dem compreender uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos nas regiões de framework e/ou CDR dos domínios variáveis de cadeias pesada e leve quando comparado com sequências de linhagem germinativa correspondentes.
Tais mutações podem ser facilmente determi- nadas comparando as sequências de aminoácidos descritas aqui com se- quências de linhagem germinativa disponíveis, por exemplo, a partir de ban- cos de dados de sequências de anticorpos públicos.
A presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos os quais são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos descritas aqui, em que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões de framework e/ou de CDR sofreram mutação para o(s) resíduo(s) correspon- dente(s) da sequência de linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi derivado ou para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de outra sequência de linhagem germinativa humana ou uma substituição conservativa de aminoá- cidos do(s) resíduo(s) correspondente(s) da linhagem germinativa (tais alte- rações de sequência são referidas aqui coletivamente como "mutações de linhagem germinativa"). Aqueles versados na técnica, começando a partir das sequências de região variável de cadeias leve e pesada descritas aqui, podem produzir facilmente inúmeros anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno os quais compreendem uma ou mais mutações reversas de linha- 5 gem germinativa individuais ou combinações das mesmas.
Em determinadas modalidades, todos os resíduos de framework e/ou de CDR dentro dos do- mínios VH e/ou VL sofreram mutação reversa para os resíduos encontrados na sequência de linhagem germinativa original a partir da qual o anticorpo foi derivado.
Em outras modalidades, apenas determinados resíduos sofrem mutação reversa para a sequência de linhagem germinativa original, por e- xemplo, somente os resíduos com mutação encontrados dentro dos primei- ros oito aminoácidos de FR1 ou dentro dos últimos 8 aminoácidos de FR4 ou apenas os resíduos com mutação encontrados dentro de CDR1, CDR2 ou CDR3. Em outras modalidades, um ou mais dos resíduos de framework e/ou de CDR sofrem mutação para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de uma se- quência de linhagem germinativa diferente (isto é, uma sequência de linha- gem germinativa que é diferente da sequência de linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi originalmente derivado). Além disso, os anticor- pos da presente invenção podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações de linhagem germinativa nas regiões de framework e/ou de CDR, por exemplo, em que determinados resíduos sofrem mutação individu- al para os resíduos correspondentes de uma sequência de linhagem germi- nativa em particular, enquanto que alguns outros resíduos que diferem da sequência de linhagem germinativa original são mantidos ou sofrem muta- ção para o resíduo correspondente de uma sequência de linhagem germina- tiva diferente.
Uma vez obtidos, os anticorpos e fragmentos de ligação a an- tígeno que contêm uma ou mais mutações de linhagem germinativa podem ser facilmente testados quanto a uma ou mais propriedade desejadas, tais como especificidade de ligação aprimorada, afinidade de ligação aumentada, propriedades biológicas antagonistas ou agonistas aprimoradas ou aumen- tadas (conforme o caso), imunogenicidade reduzida, etc.
Anticorpos e frag- mentos de ligação a antígeno obtidos desta maneira geral são abrangidos pela presente invenção.
A presente invenção também inclui anticorpos anti-TL1A com- preendendo variantes de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR descritas aqui que têm uma ou mais substituições 5 conservativas.
Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-TL1A tendo, sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR com, por e- xemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, 2 ou 1 substi- tuição(ões) conservativa(s) de aminoácidos em relação a qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR descritas aqui.
A menos que especificamente indicado de outra forma, o termo "anticorpo" (Ac), conforme usado aqui, deve ser entendido como abrangendo moléculas de anticorpo que compreendem duas cadeias pesadas de imuno- globulina e duas cadeias leves de imunoglobulina (isto é, moléculas de anti- corpo "completas"), bem como fragmentos de ligação a antígeno das mes- mas.
Os termos "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo, "fragmento de ligação a antígeno" de um anticorpo e similares, conforme usado aqui, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, enzi- maticamente obtenível, sintética ou geneticamente manipulada que liga es- pecificamente a um antígeno para formar um complexo.
Fragmentos de liga- ção a antígeno de um anticorpo podem ser derivado, por exemplo, de molé- culas de anticorpo completas usando quaisquer técnicas convencionais ade- quadas, tais como digestão proteolítica ou técnicas de engenharia genética recombinante envolvendo manipulação e expressão de DNA que codifica domínios variáveis e (opcionalmente) constantes de anticorpo.
Tal DNA é conhecido e/ou está prontamente disponível, por exemplo, de fontes comer- ciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de anticorpos de phage display) ou pode ser sintetizado.
O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou por meio de técnicas de biologia molecular, por exemplo, para dispor um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração adequada ou para introduzir códons, criar resíduos de cisteína, modificar, adicionar ou deletar aminoácidos, etc.
Exemplos não limitativos de fragmentos de ligação a antígeno incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadeia simples (scFv); (vi) fragmentos dAb; e (vii) unidades de reconhecimento mínimas que consistem mos resí- duos de aminoácidos que imitam a região hipervariável de um anticorpo (por 5 exemplo, uma região de determinação de complementaridade (Complemen- tary Determining Region - CDR) isolada, tal como um peptídeo de CDR3) ou um peptídeo restrito à FR3-CDR3-FR4. Outras moléculas manipuladas, tais como anticorpos domínio-específicos, anticorpos com um único domínio, anticorpos com domínio deletado, anticorpos quiméricos, anticorpos enxer- tados com CDR, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, nanocorpos (por exemplo, nanocorpos monovalentes, nanocorpos bivalentes, etc.), pe- quenos produtos imuno-farmacêuticos modulares (Small Modular Immuno- Pharmaceuticals - SMIPs) e os domínios IgNAR variáveis de tubarão, tam- bém são abrangidos dentro da expressão "fragmento de ligação a antígeno", conforme usado aqui.
Um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo compreen- derá, tipicamente, pelo menos um domínio variável.
O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e compreenderá, em geral, pelo menos uma CDR a qual é adjacente a ou in-frame com uma ou mais sequências de framework.
Em fragmentos de ligação a antígeno que têm um domínio VH associado a um domínio VL, os domínios VH e VL podem estar localizados um em relação ao outro em qualquer disposição adequada.
Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter díme- ros de VH-VH, VH-VL ou VL-VL.
Alternativamente, o fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo pode conter um domínio VH ou VL monomérico.
Em determinadas modalidades, um fragmento de ligação a antí- geno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável ligado covalentemente a pelo menos um domínio constante.
Configurações exem- plificativas não limitativas de domínios variáveis e constantes que podem ser encontrados dentro de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH- CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix)
VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; and (xiv) VL-CL.
Em qualquer configuração de domínios constantes e variá- veis, incluindo qualquer uma das configurações exemplificativas listadas a- cima, os domínios variáveis e constantes podem ser diretamente ligados uns 5 aos outros ou podem ser ligados por uma região ligante ou de dobradiça to- tal ou parcial.
Uma região de dobradiça pode consistir em pelo menos 2, por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos os quais resultam em uma ligação flexível ou semiflexível entre domínios variáveis e/ou constantes adjacentes em uma única molécula polipeptídica.
Além disso, um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo da presente invenção pode compre- ender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qualquer uma das configurações de domínios variáveis e constantes listadas acima em associação não covalente uns com os outros e/ou com um ou mais do- mínios VH ou VL monoméricos (por exemplo, por ligação(ões) de dissulfeto). Conforme com moléculas de anticorpos completas, fragmentos de ligação a antígeno podem ser monoespecíficos ou multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos). Um fragmento de ligação a antígeno multiespecífico de um anticorpo compreenderá, tipicamente, pelo menos dois domínios vari- áveis diferentes, em que cada domínio variável é capaz de se ligar especifi- camente a um antígeno distinto ou a um epítopo diferente sobre o mesmo antígeno.
Qualquer formato de anticorpo multiespecífico, incluindo os forma- tos de anticorpos biespecíficos exemplificativos descritos aqui, pode ser a- daptado para uso no contexto de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo da presente invenção usando métodos de rotina disponíveis na técnica.
Em determinadas modalidades, o anticorpo ou fragmentos de anticorpo da invenção podem ser conjugados a uma porção terapêutica ("i- munoconjugado"), tal como uma citotoxina, um fármaco quimioterapêutico, um imunossupressor ou um radioisótopo.
O termo "se ligar especificamente" ou similar significa que um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo forma um complexo com um antígeno que é relativamente estável sob condições fisiológicas.
Ligação específica pode ser caracterizada por uma constante de dissociação em equilíbrio (KD) de cerca de 3000 nM ou menos (isto é, uma KD menor de- nota uma ligação mais firme), cerca de 2000 nM ou menos, cerca de 1000 nM ou menos, cerca de 500 nM ou menos, cerca 300 nm ou menos, cerca 5 de 200 nm ou menos, cerca de 100 nm ou menos, cerca de 50 nm ou me- nos, cerca de 1 nm ou menos ou cerca de 0,5 nm ou menos.
Métodos para determinar se duas moléculas se ligam especificamente são bem conheci- dos na técnica e incluem, por exemplo, diálise em equilíbrio, ressonância de plasmon de superfície e similares.
Um anticorpo isolado que se liga especifi- camente à hTL1A pode, contudo, exibir reatividade cruzada com outros antí- genos, tais como moléculas de TL1A de outras espécies, por exemplo, TL1A de macaco Cynomolgus (SEQ ID NO: 248) e/ou TL1A de camundongo (SEQ ID NO: 250) e/ou uma variante TL1A, tal como Fhm (SEQ ID NO: 246). Além disso, anticorpos multi-específicos (por exemplo, biespecíficos) que se ligam à hTL1A e um ou mais antígenos adicionais são, todavia, considerados anti- corpos que "se ligam especificamente" à hTL1A, conforme usado aqui.
O termo anticorpo de "alta afinidade" refere-se àqueles anticor- pos que têm uma afinidade de ligação pela hTL1A, expressa como KD, de cerca de 1 x 10-9 M ou menos, cerca de 0,5 x 10-9 M ou menos, cerca de 0,25 x 10-9 M ou menos, cerca de 1 x 10-10 M ou menos ou cerca de 0,5 x 10- 10 M ou menos, conforme medido por ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, BIACORE®ou ELISA de solução-afinidade.
O termo "KD", conforme usado aqui, se destina a referir-se à constante de dissociação em equilíbrio de uma interação anticorpo-antígeno em particular.
Pelo termo "taxa de dissociação", "Koff" ou "kd" entenda-se um anticorpo que se dissocia da hTL1A com uma constante de taxa de 1 x 10-3 s-1 ou menos, de preferência 1 x 10-4 s-1 ou menos, conforme determinado por ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, BIACORE®. O termo "constante de afinidade intrínseca" ou "ka" significa um anticorpo que se associa à hTL1A em uma taxa constante de cerca de 1 x 103 M-1 s-1 ou superior, conforme determinado por meio de ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, BIACORE. Um "anticorpo isolado", conforme usado aqui, se destina a refe- rir-se a um anticorpo que é substancialmente livre de outros mAbs que têm diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado 5 que se liga especificamente à hTL1A é substancialmente livre de Abs que se ligam especificamente a outros antígenos que não hTL1A). Um anticorpo isolado que se liga especificamente à hTL1A pode, no entanto, ter uma rea- tividade cruzada por outros antígenos, tais como moléculas TL1A de outras espécies, tais como de macaco Cynomolgus e camundongo e/ou variantes de hTL1A, tal como Fhm.
Um "anticorpo de neutralização", conforme usado aqui (ou um "anticorpo que neutraliza a atividade de TL1A"), se destina a referir-se a um anticorpo cuja ligação à TL1A resulta em inibição de pelo menos uma ativi- dade biológica de TL1A.
Esta inibição de atividade biológica de TL1A pode ser avaliada medindo um ou mais indicadores de atividade biológica de TL1A por meio de um ou mais dos vários ensaios padrões in vitro ou in vivo conhecidos na técnica (vide também exemplos abaixo). O termo "ressonância de plasmon de superfície", conforme usa- do aqui, refere-se a um fenômeno óptico que permite a análise de interações bioespecíficas em tempo real por meio de detecção de alterações em con- centrações de proteína dentro de uma matriz de biossensor, por exemplo, usando o sistema BIACORE (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, NJ). O termo "epítopo" é uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo.
Epítopos podem ser definidos como estruturais ou funcionais.
Epítopos funcionais são, em geral, um subconjunto dos epítopos estruturais e têm aqueles resíduos que contribuem diretamente para a afinidade da inte- ração.
Epítopos também podem ser conformacionais, isto é, compostos de aminoácidos não lineares.
Em determinadas modalidades, epítopos podem incluir determinantes que são agrupamentos com superfície quimicamente ativa de moléculas, tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, gru- pos fosforila ou grupos sulfonila e, em determinadas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específicas.
O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntica", quando de referência a um ácido nucleico ou fragmento do mesmo, indica 5 que, quando perfeitamente alinhado com inserções ou deleções de nucleotí- deos adequadas com um outro ácido nucleico (ou sua fita complementar), há identidade de sequência de nucleotídeos em pelo menos cerca de 90% e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bases de nucleotídeos, conforme medido por meio de qualquer algorit- mo de identidade de sequência conhecido, tais como FASTA , BLAST ou GAP, conforme discutido abaixo.
Quando aplicado a polipeptídeos, o termo "similaridade substan- cial" ou "substancialmente similar" significa que duas sequências de peptí- deos, quando perfeitamente alinhadas, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de default por gap, compartilham pelo menos 90% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência.
De preferência, posições de resí- duos as quais não são idênticas diferem por substituições de aminoácidos conservativas.
Uma "substituição de aminoácidos conservativa" é aquela na qual um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoáci- do com uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de ami- noácidos conservativa não alterará substancialmente as propriedades fun- cionais de uma proteína.
Em casos onde duas ou mais sequências de ami- noácidos diferem umas das outras por substituições conservativas, a percen- tagem ou grau de similaridade pode ser ajustado para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição.
Meios para fazer este ajuste são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.
Vide, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol.
Biol. 24: 307-331, o qual é aqui incorporado por refe- rência.
Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas similares incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glici- na, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais alifáticas-
hidroxila: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadeias laterais á- cidas: aspartato e glutamato; e 7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína 5 e metionina.
Grupos de substituição de aminoácidos conservativa preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina- valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina.
Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer alteração tendo um valor positivo na matriz de log-probabilidade PAM250 descrita em Gonnet et al. (1992) Scien- ce 256: 45-1443, aqui incorporado por referência.
Uma substituição "mode- radamente conservativa" é qualquer alteração tendo um valor não negativo na matriz de log-probabilidade PAM250. Similaridade de sequência para polipeptídeos é, tipicamente, medida usando software de análise de sequência.
Software de análise de proteína combina sequências similares usando medidas de similaridade atri- buídas à vários substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições conservativas de aminoácidos.
Por exemplo, o software GCG contém programas, tais como GAP e BESTFIT, que podem ser usado com os parâmetros de default para determinar a identidade ou homologia de se- quência entre sequências polipeptídicas intimamente relacionadas, tais co- mo polipeptídeos de homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína do tipo silvestre e uma muteína da mesma.
Vide, por e- xemplo, GCG Versão 6.1. Sequências polipeptídicas também podem ser comparadas usando FASTA com parâmetros de default ou recomendados, um programa no GCG Versão 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FAS- TA3) proporciona alinhamentos e identidade de sequência percentual de regiões das melhores sobreposições entre as sequências de consulta e de pesquisa (Pearson, 2000, supra). Um outro algoritmo preferido quando de comparação de uma sequência da invenção com um banco de dados con- tendo um grande número de sequências de diferentes organismos é o pro- grama de computador BLAST, especialmente BLASTP e TBLASTN, usando parâmetros de default.
Vide, por exemplo, Altschul et al., 1990, J.
Mol.
Biol.
215: 403-410, 1997; Nucleic Acids Res. 25: 3389-402, cada um dos os quais é aqui incorporado por referência.
Pela frase "quantidade terapeuticamente eficaz" entenda-se uma quantidade que produz o efeito desejado para o qual ela é administrada.
A 5 quantidade exata dependerá da finalidade do tratamento, da idade e tama- nho de um indivíduo que está sendo tratado, da via de administração e simi- lares e será determinável por aqueles versados na técnica usando métodos conhecidos (vide, por exemplo, Lloyd (1999), The Art, Science and Techno- logy of Pharmaceutical Compounding). Preparo de Anticorpos Humanos Métodos para geração de anticorpos humanos em camundongos transgênicos são conhecidos na técnica.
Qualquer um dos métodos conhe- cidos podem ser usados no contexto da presente invenção para produzir anticorpos humanos que se ligam especificamente à TL1A.
Usando a tecnologia VELOCIMMUNE® ou qualquer outro méto- do conhecido para geração de anticorpos monoclonais, anticorpos quiméri- cos de alta afinidade pela TL1A são inicialmente isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo.
Conforme na se- ção experimental abaixo, os anticorpos são caracterizados e selecionados quanto à características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopo e similares.
Em geral, os anticorpos da presente invenção possuem altas a- finidades, tipicamente tendo uma KD de cerca de 10-12 M a cerca de 10-9 M, quando medido pela ligação a antígeno, quer imobilizado sobre fase sólida ou em fase de solução.
As regiões constantes de camundongo são substitu- ídas por regiões constantes humanas desejadas, por exemplo, IgG1 do tipo silvestre (SEQ ID NO: 255) ou IgG4 (SEQ ID NO: 256) ou IgG1 ou IgG4 mo- dificada (por exemplo, IgG4 com Ser-108 substituída por Pro, conforme mos- trado em SEQ ID NO: 257), para gerar os anticorpos inteiramente humanos da invenção.
Embora a região constante selecionada possa variar de acordo com o uso específico, as características de ligação a antígeno e especifici- dade pelo alvo dos anticorpos residem na região variável.
Mapeamento de Epítopos e Tecnologias Relacionadas Para triagem de anticorpos que se ligam a um epítopo em parti- cular, um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como aquele descrito em Antibodies, Harlow e Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., 5 New York) pode ser realizado.
Outros métodos incluem mutantes de varre- dura de alanina, blots peptídicas (Reineke, 2004, Methodos Mol Biol 248: 443-63) (aqui especificamente incorporado por referência na íntegra) ou aná- lise de clivagem peptídica.
Além disso, métodos tais como excisão de epíto- po, extração de epítopo e modificação química de antígenos, podem ser empregados (Tomer, 2000, Protein Science 9: 487-496) (aqui especifica- mente incorporado por referência na íntegra). O termo "epítopo" refere-se a um sítio sobre um antígeno ao qual células B e/ou células T respondem.
Epítopos de células B podem ser formados a partir de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos por meio de dobramento terciário de uma proteína.
Epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são, tipicamente, retidos quando de exposição a solventes de desnaturação, enquanto que epítopos formados por meio de dobramento terciário são, tipicamente, perdidos quando de tra- tamento com solventes de desnaturação.
Um epítopo inclui, tipicamente, pelo menos 3 e, mais usualmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em uma conformação espacial única.
Caracterização de Perfil Modificação-Assistida (Modification- Assisted Profiling - MAP), também conhecida como Caracterização de Perfil de Anticorpo com base em Estrutura de Antígeno (Antigen Sctructure-based Antibody Profiling - ASAP), é um método que classifica grandes números de mAbs dirigidos contra o mesmo antígeno de acordo as similaridades da ca- racterização de perfil de ligação de cada anticorpo contra à superfícies quí- mica ou enzimaticamente modificadas (documento US 2004/0101920, aqui especificamente incorporado por referência na íntegra). Cada categoria pode refletir um epítopo único, quer distintamente diferente ou parcialmente so- breposto com um epítopo representado por outra categoria.
Esta tecnologia permite filtração rápida de mAbs geneticamente idênticos, de modo que ca-
racterização pode ser focada sobre mAbs geneticamente distintos.
Quando aplicada à triagem de hibridoma, a MAP pode facilitar a identificação de clo- nes de hibridoma raros que produzem mAbs que têm as características de- sejadas.
MAP pode ser usada para classificar os mAbs anti-TL1A da inven- 5 ção em grupos de mAbs que se ligam a diferentes epítopos.
A presente invenção inclui anticorpos à hTL1A que se ligam ao mesmo epítopo que qualquer um dos anticorpos exemplificativos específicos descritos aqui.
Da mesma forma, a presente invenção também inclui anticor- pos anti-hTL1A que competem pela ligação à hTL1A ou um fragmento de hTL1A com qualquer um dos anticorpos exemplificativos específicos descri- tos aqui.
Pode-se determinar facilmente se um anticorpo se liga ao mes- mo epítopo ou compete pela ligação com um anticorpo anti-hTL1A de refe- rência usando métodos de rotina conhecidos na técnica.
Por exemplo, para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo epítopo que um anti- corpo anti-hTL1A de referência da invenção, o anticorpo de referência é dei- xado se ligar a uma proteína ou peptídeo de hTL1A sob condições de satu- ração.
Em seguida, a capacidade de um anticorpo de teste de se ligar à mo- lécula de hTL1A é avaliada.
Se o anticorpo de teste é capaz de se ligar à hTL1A após ligação por saturação com o anticorpo anti-hTL1A de referência, pode ser concluído que o anticorpo de teste se liga a um epítopo diferente do que o anticorpo anti-hTL1A de referência.
Por outro lado, se o anticorpo de teste não é capaz de se ligar à molécula de hTL1A após ligação por satu- ração com o anticorpo anti-hTL1A de referência, então, o anticorpo de teste pode se ligar ao mesmo epítopo que o epítopo ligado pelo anticorpo anti- hTL1A de referência da invenção.
Para determinar se um anticorpo compete pela ligação com um anticorpo anti-hTL1A de referência, a metodologia de ligação descrita acima é realizada em duas orientações: em uma primeira orientação, o anticorpo de referência é deixado se ligar a uma molécula de hTL1A sob condições de saturação, seguido por avaliação de ligação do anticorpo de teste à molécula de hTL1A.
Em uma segunda orientação, o anticorpo de teste é deixado se ligar a uma molécula de hTL1A sob condições de saturação, seguido por avaliação de ligação do anticorpo de referência à molécula de TL1A.
Se, em ambas as orientações, apenas o primeiro anticorpo (saturação) é capaz de se ligar à molécula de TL1A, então, concluiu-se que o anticorpo de teste e o 5 anticorpo de referência competem pela ligação à hTL1A.
Conforme será a- preciado por aqueles versados na técnica, um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo de referência pode não se ligar necessariamente ao epítopo idêntico conforme o anticorpo de referência, mas pode bloquear estericamente a ligação do anticorpo de referência ao se ligar a um epítopo sobreposto ou adjacente.
Dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo ou se sobrepõem ao epítopo se cada um inibe competitivamente (bloqueia) a ligação do outro ao antígeno.
Isto é, um excesso de 1, 5, 10, 20 ou 100 vezes de um anticorpo inibe a ligação do outro em pelo menos 50%, mais preferivelmente 75%, 90% ou mesmo 99%, medido em um ensaio de ligação competitiva (vide, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990, 50: 1495-1502). Alternativa- mente, dois anticorpos têm o mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro.
Dois anticorpos têm epítopos em sobreposição se algumas mutações de aminoácidos que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a li- gação do outro.
Experimentação de rotina adicional (por exemplo, mutação pep- tídica e análise de ligação) pode, então, ser realizada para confirmar se a ausência de ligação observada do anticorpo de teste é de fato em virtude de ligação ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência ou se bloqueio es- térico (ou outro fenômeno) é responsável pela ausência de ligação observa- da.
Experimentos deste tipo podem ser realizados usando ELISA, RIA, res- sonância de plasmon de superfície, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio de ligação de anticorpo qualitativo ou quantitativo disponível na técni- ca.
Imunoconjugados
A invenção abrange um anticorpo monoclonal anti-TL1A humana conjugado a uma porção terapêutica ("imunoconjugado"), tal como uma cito- toxina, um fármaco quimioterapêutico, um imunossupressor ou um radioisó- topo.
Agentes citotoxigênicos incluem qualquer agente que é prejudicial para 5 células.
Exemplos de agentes citotoxigênicos e agentes quimioterapêuticos adequados para formação de imunoconjugados ão conhecidos na técnica; vide, por exemplo, o documento WO 05/103081, aqui especificamente incor- porado por referência). Biespecíficos Os anticorpos da presente invenção podem ser monoespecífi- cos, biespecíficos ou multiespecífico. mAbs multiespecíficos podem ser es- pecíficos para diferentes epítopos de um polipeptídeo alvo ou podem conter domínios de ligação a antígeno específicos para mais de um polipeptídeo alvo.
Vide, por exemplo, Tutt et al., 1991, J.
Immunol. 147: 60-69. Os mAbs anti-hTL1A humanos podem ser ligados a ou co-expressos com outra molé- cula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína.
Por exemplo, um anticorpo ou um fragmento do mesmo pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por meio de acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma) a uma ou mais de outras entidades molecula- res, tais como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo, para produzir um anticorpo biespecífico ou multiespecífico com uma segunda especificidade de ligação.
Um formato de anticorpo biespecífico exemplificativo que pode ser usado no contexto da presente invenção envolve o uso de um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina (Ig) e um segundo domínio CH3 de Ig, em que os primeiro e segundo domínios CH3 de Ig diferem um ao outro por pelo menos um aminoácido e em que pelo menos uma diferença de aminoácidos reduz a ligação do anticorpo biespecífico à Proteína A quando comparado com um anticorpo bi-específico que carece da diferença de aminoácidos.
Em uma modalidade, o primeiro domínio CH3 de Ig se liga à Proteína A e o se- gundo domínio CH3 de Ig contém uma mutação que reduz ou suprime a liga- ção à Proteína A, tal como uma modificação H95R (pela numeração de éxon
IMGT; H435R pela numeração EU). O segundo domínio CH3 pode compre- ender ainda uma modificação Y96F (pela IMGT; Y436F pela EU). Outras modificações que podem ser encontradas dentro do segundo domínio CH3 incluem: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, e V82I (pela IMGT; D356E, 5 L358M, N384S, K392N, V397M e V422I pela EU) no caso de IgG1; N44S, K52N e V82I (IMGT; N384S, K392N e V422I pela EU) no caso de IgG2 e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q e V82I (pela IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q e V422I pela EU) no caso de anticorpos IgG4. Variações no formato de anticorpos biespecíficos descritos acima são consideradas dentro do âmbito da presente invenção.
Bioequivalentes Os anticorpos anti-hTL1A e fragmentos de anticorpo da presente invenção abrangem proteínas com sequências de aminoácidos que variam daquelas dos mAbs descritos, mas que retêm a capacidade de se ligar à TL1A humana.
Tais mAb variantes e fragmentos de anticorpos compreen- dem uma ou mais adições, deleções ou substituições de aminoácidos quan- do comparado com a sequência parental, mas exibem atividade biológica que é essencialmente equivalente àquela dos MAbs.
Da mesma forma, as sequências de DNA que codificam mAb à hTL1A da presente invenção a- brangem sequências que compreendem uma ou mais adições, deleções ou substituições de nucleotídeos quando comparado com a sequência descrita, mas que codificam um anticorpo anti-hTL1A ou fragmento de anticorpo que é essencialmente bioequivalente a um anticorpo ou fragmento de anticorpo anti-hTL1A da invenção.
Exemplos de tais sequências de DNA e aminoáci- dos variantes são discutidos acima.
Duas proteínas de ligação a antígeno ou anticorpos são conside- rados bioequivalentes se, por exemplo, eles são equivalentes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas cuja taxa e extensão de absorção não mos- tram uma diferença significativa quando administrados na mesma dose mo- lar sob condições experimentais similares, quer em uma única ou múltiplas doses.
Alguns anticorpos serão considerados equivalentes ou alternativas farmacêuticas se eles são equivalentes quanto à extensão em sua absorção,
mas não sua taxa de absorção e podem ainda ser considerados bioequiva- lentes porque tais diferenças na taxa de absorção são intencionais e refleti- das na marcação não são essenciais para obtenção de concentrações efica- zes do fármaco no organismo, por exemplo, quando de uso crônico, e são 5 considerados clinicamente insignificantes para o produto de fármaco especí- fico estudado.
Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a antígeno são bioequivalentes se não houver diferenças clinicamente significativas quanto à sua segurança, pureza e potência.
Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a antígeno são bioequivalentes se, em um paciente, pode haver uma troca uma ou mais vezes entre o produto referência e o produto biológico sem um aumento es- perado do risco de efeitos adversos, incluindo uma alteração clinicamente significativa na imunogenicidade ou eficácia reduzida quando comparado com terapia contínua sem que tal troca.
Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a antígeno são bioequivalentes se ambas atuam por meio de um mecanismo ou mecanis- mos de ação em comum sob a condição ou condições de uso, contanto que tais mecanismos sejam conhecidos.
A bioequivalência pode ser demonstrada por meio de métodos in vivo e in vitro.
Medidas de bioequivalência incluem, por exemplo, (a) um tes- te in vivo em seres humanos ou outros mamíferos em que a concentração do anticorpo ou seus metabólitos é medida no sangue, plasma, soro ou outro fluido biológico como uma função do tempo; (b) um teste in vitro que tenha sido correlacionado com e seja razoavelmente prognóstico de dados de bio- disponibilidade humana in vivo; (c) um teste in vivo em seres humanos ou outros mamíferos em que o efeito farmacológico agudo adequado do anti- corpo (ou seu alvo) é medido como uma função do tempo; e (d) um experi- mento clínico bem controlado que estabelece a segurança, eficácia ou bio- disponibilidade ou bioequivalência de um anticorpo.
Variantes bioequivalentes de anticorpos anti-hTL1A da invenção podem ser construídos, por exemplo, fazendo várias substituições de resí- duos ou sequências ou deletando resíduos terminais ou internos ou sequên-
cias não necessários para a atividade biológica.
Por exemplo, resíduos de cisteína não essenciais para a atividade biológica podem ser deletados ou substituídos por outros aminoácidos para evitar a formação de pontes de dissulfeto intramoleculares desnecessárias ou incorretas após renaturação. 5 Formulações e Administração Terapêutica A invenção proporciona composições terapêuticas compreen- dendo os anticorpos anti-hTL1A ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da presente invenção e métodos terapêuticos que usam o mesmo.
A administração de composições terapêuticas de acordo com a invenção será realizada com veículos, excipientes e outros agentes adequados que são incorporados em formulações para conferir transferência aprimorada, distribuição, tolerância e similares.
Múltiplas formulações apropriadas podem ser encontradas no formulário conhecido por todos os químicos farmacêuti- cos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Eas- ton, PA.
Estas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geleias, ceras, óleos, lipídios, veículos contendo lipídios (catiônicos ou aniô- nicos) (tal como LIPOFECTIN®), conjugados de DNA, pastas de absorção anidras, emulsões água-em-óleo e água-em-óleo, emulsões em Carbowax (polietileno glicóis de vários pesos moleculares), géis semisólidos e misturas semisólidas contendo Carbowax.
Vide também Powell et al. "Compendium of Excipients for Parenteral Formulations" PDA, 1998, J Pharm Sci Tecno 52: 238-311. A dose pode variar dependendo da idade e tamanho de um indi- víduo a ser administrado, doença alvo, a finalidade do tratamento, condi- ções, via de administração e similares.
Quando o anticorpo da presente in- venção é usado para o tratamento de várias condições e doenças associa- das direta ou indiretamente à TL1A, incluindo doenças/distúrbios inflamató- rios, doenças/distúrbios autoimunes, reações alérgicas e similares em um paciente adulto, é vantajoso administrar o anticorpo da presente invenção por via intravenosa ou subcutaneamente em uma dose única de cerca de 0,01 a cerca de 20 mg/kg de peso corporal, mais preferivelmente cerca de 0,02 a cerca de 7, cerca de 0,03 a cerca de 5 ou cerca de 0,05 a cerca de 3 mg/kg de peso corporal.
Dependendo da gravidade da condição, a frequên- cia e a duração do tratamento podem ser ajustadas.
Em determinadas mo- dalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente invenção pode ser administrado como uma dose inicial de pelo 5 menos cerca de 0,1 mg a cerca de 800 mg, cerca de 1 a cerca de 500 mg, cerca de 5 a cerca de 300 mg, ou cerca de 10 a cerca de 200 mg, a cerca de 100 mg ou cerca de 50 mg.
Em determinadas modalidades, a dose inicial pode ser seguida pela administração de uma segunda ou múltiplas doses subsequentes do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo em uma quantidade que pode ser aproximadamente a mesma ou menor do que a dose inicial, em que as doses subsequentes são separadas por pelo menos 1 dia a 3 dias, pelo menos uma semana, pelo menos 2 semanas, pe- lo menos 3 semanas, pelo menos 4 semanas, pelo menos 5 semanas, pelo menos 6 semanas, pelo menos 7 semanas, pelo menos 8 semanas, pelo menos 9 semanas, pelo menos 10 semanas, pelo menos 12 semanas ou pelo menos 14 semanas.
Vários sistemas de distribuição são conhecidos e podem ser u- sados para administrar a composição farmacêutica da invenção, por exem- plo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar os vírus mutantes, endocitose media- da por receptor (vide, por exemplo, Wu et al., 1987, J.
Biol.
Chem. 262: 4429-4432). Métodos de introdução incluem, porém sem limitações, vias in- tradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intrana- sal, epidural e oral.
A composição pode ser administrada através de qual- quer via conveniente, por exemplo, por meio de infusão ou injeção de bolo, por meio de absorção através de revestimentos mucocutâneos ou epiteliais (por exemplo, mucosa oral, retal e mucosa intestinal, etc.) e pode ser admi- nistrada conjuntamente com outros agentes biologicamente ativos.
A admi- nistração pode ser sistêmica ou local.
A composição farmacêutica pode também ser distribuída em uma vesícula, em particular um lipossoma (vide Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Treat et al., 1989, em Liposomes in The Therapy of Infectious
Disease and Cancer, Lopez Berestein e Fidler (eds.), Liss, New York, pági- nas 353-365; Lopez-Berestein, ibid., páginas 317-327; vide em geral ibid.). Em determinadas situações, a composição farmacêutica pode ser distribuída em um sistema com liberação controlada.
Em uma modalida- 5 de, uma bomba pode ser usada (vide Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit Ref Biomed Eng. 14: 201). Em outra modalidade, materiais poliméricos po- dem ser usados; vide Medical Applications of Controlled Release, Langer e Wise (eds.), CRC Pres, Boca Raton, Flórida (1974). Em ainda outra modali- dade, um sistema com liberação controlada pode ser colocado na proximi- dade do alvo da composição, assim, requerendo apenas uma fração da dose sistêmica (vide, por exemplo, Goodson, em Medical Applications of Control- led Release, supra, vol. 2, páginas 115-138, 1984). Preparados injetáveis podem incluir formas de dosagem para administração por injeção intravenosa, subcutânea, intradérmica e intramus- cular, infusões por gotejamento, etc.
Estes preparados injetáveis podem ser feitos por meio de métodos conhecidos publicamente.
Por exemplo, os pre- parados injetáveis podem ser feitos, por exemplo, por meio de dissolução, suspensão ou emulsificação do anticorpo ou seu sal descrito anteriormente em um meio aquoso estéril ou um meio oleoso usado convencionalmente para soluções injetáveis.
Como meio aquoso para injeções existem, por e- xemplo, solução salina fisiológica, uma solução isotônica contendo glicose e outros agentes auxiliares, etc. que podem ser usados em combinação com um agente de solubilização apropriado, tal como um álcool (por exemplo, etanol), um poliálcool (por exemplo, propileno glicol, polietileno glicol), um tensoativo não iônico [por exemplo, polissorbato 80, HCO-50 (aduto de poli- oxietileno (50 moles) de óleo de rícino hidrogenado)], etc.
Como o meio ole- oso são empregados, por exemplo, óleo de gergelim, óleo de soja, etc., os quais podem ser usados em combinação com um agente de solubilização, tal como benzoato de benzila, álcool benzílico, etc.
A injeção assim prepara- da é, de preferência, enchida em uma ampola adequada.
Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser distribuída por via subcutânea ou intravenosa com uma agulha e seringa padrões.
Além disso, no que diz respeito à distribuição por via subcutânea, um dispositivo de distribuição por caneta tem prontamente aplicações na distribuição de uma composição far- macêutica da presente invenção.
Tal dispositivo de distribuição por caneta pode ser reutilizável ou descartável.
Um dispositivo de distribuição por cane- 5 ta reutilizável geralmente usa um cartucho substituível que contém uma composição farmacêutica.
Uma vez que toda a composição farmacêutica dentro do cartucho foi administrada e o cartucho está vazio, o cartucho vazio pode ser facilmente descartado e substituído por um novo cartucho que con- tém a composição farmacêutica.
O dispositivo de administração por caneta pode, então, ser reutilizado.
Em um dispositivo de administração por caneta descartável, não há cartucho substituível.
Pelo contrário, o dispositivo de distribuição por caneta descartável vem previamente cheio com a composi- ção farmacêutica contida em um reservatório dentro do dispositivo.
Uma vez que a composição farmacêutica no reservatório é esvaziada, todo o disposi- tivo é descartado.
Numerosos dispositivos de distribuição por autoinjetor e caneta reutilizáveis têm aplicações na distribuição subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção.
Exemplos incluem, porém certamente sem limitações, AUTOPEN® (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Reino Uni- do), caneta DISETRONIC® (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Suíça), caneta HUMALOG MIX 75/25®, caneta HUMALOG®, caneta HUMALIN 70/30® (Eli Lilly and Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN® I, II e III (Novo Nor- disk, Copenhagen, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR® (Novo Nordisk, Cope- nhagen, Dinamarca), caneta BD® (Becton Dickinson , Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN®, OPTIPEN PRO®, OPTIPEN STARLET® e OPTICLIK® (Sanofi- Aventis, Frankfurt, Alemanha), para citar apenas alguns.
Exemplos de dispo- sitivos de distribuição por caneta descartável tendo aplicações em distribui- ção subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção in- cluem, porém certamente sem limitações, a caneta SoloSTAR® (Sanofi- Aventis), FLEXPEN® (Novo Nordisk) e KWIKPEN® ( Eli Lilly). Vantajosamente, as composições farmacêuticas para uso oral ou parenteral descritas acima são preparadas em formas de dosagem em uma dose unitária adequada para se ajustar a dose dos ingredientes ativos.
Tais formas de dosagem em uma dose unidade incluem, por exemplo, com- primidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios, etc.
A quanti- dade do anticorpo antes mencionado contida é, em geral, de cerca de 0,1 a 5 cerca de 800 mg por forma de dosagem em uma dose unitária; especialmen- te na forma de injeção, o anticorpo referido antes está contido em cerca de 1 a cerca de 500 mg, de cerca de 5 a 300 mg, em cerca de 8 a 200 mg e em cerca de 10 a cerca de 100 mg para as outras formas de dosagem.
Terapias Combinadas A invenção proporciona ainda métodos terapêuticos para o tra- tamento de doenças ou distúrbios que estão, direta ou indiretamente, asso- ciados à hTL1A mediante administração do mAb à hTL1A ou fragmento do mesmo da invenção em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais.
O agente terapêutico adicional pode ser um ou mais de qualquer agente que é vantajosamente combinado com o anticorpo ou fragmento da invenção, incluindo imunossupressores, agentes anti-inflamatórios, agentes analgésicos, agentes antialérgicos e similares.
Imunossupressores adequa- dos incluem, porém sem limitações, glucocorticoides, ciclosporina, metotre- xato, interferon β (IFN-β), tacrolimus, sirolimus, azatioprina, mercaptopurina, opioides, micofenolato, proteínas de ligação ao TNF, tais como infliximab, eternacept, adalimumab e similares, antibióticos citotóxicos, tais como dacti- nomicina, antraciclinas, mitomicina C, bleomicina, mitramicina e similares, anticorpos que objetivam células imunes, tais como anticorpos anti-CD20, anticorpos anti-CD3 e similares.
Agentes anti-inflamatórios e/ou analgésicos adequados para as terapias combinadas com os anticorpos anti-hTL1A in- cluem corticosteroides, fármacos anti-inflamatórios não esterodais (NSAIDs), tais como aspirina, ibuprofeno, naproxeno, inibidores de COX-2 e similares, antagonistas de TNF-α (por exemplo, infliximab ou REMICADE® da Cento- cor; Golimumab da Centocor; etanercept ou ENBREL® da Amgen/Wyeth; adalimumab ou HUMIRA® da Abbott Laboratories e similares), antagonistas de IL-1 (por exemplo, proteínas de fusão de ligação à IL-1, por exemplo, ARCALYST® da Regeneron Pharmaceuticals, Inc.; vide Patente US N°
6.927.044; KINERET® da Amgen e similares), antagonistas de IL-6 (por e- xemplo, anticorpos anti-receptor de IL6, conforme descrito na Patente US N°
7.582.298 e ACTEMRA® da Roche), acetaminofeno, morfinomiméticos e similares. Agentes antialérgicos adequados os quais podem bloquear a ação 5 de mediadores alérgicos ou evitar a ativação de células e processos de des- granulação incluem anti-histamínicos, glicocorticoides, epinefrina (adrenali- na), teofilina, cromoglicato de sódio e antileucotrienos, tais como montelu- caste (SINGULAIR® da Merck) ou zafirlucaste (ACCOLATE® da AstraZene- ca), bem como anticolinérgicos, descongestionantes, estabilizantes de mas- tócitos e outros compostos que podem prejudicar a quimiotaxia de eosinófi- los. O mAb à hTL1A ou fragmento do mesmo da invenção e o(s) a- gente(s) terapêutico(s) adicional(is) podem ser coadministrados em conjunto ou separadamente. Quando formulações de dosagem distintas são usadas, o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção e os agentes adicionais podem ser administrados simultaneamente, separadamente ou em momen- tos alternados, isto é, sequencialmente, em ordens apropriadas.
EXEMPLOS Os exemplos a seguir são fornecidos de modo a proporcionar àqueles versados na técnica uma descrição e uma divulgação completa de como fazer e usar os métodos e composições da invenção e não se desti- nam a limitar o âmbito daquilo que os inventores consideram como sua in- venção. Esforços foram feitos para assegurar a precisão no que diz respeito aos números usados, mas alguns erros e desvios experimentais devem ser contabilizados. Salvo indicação em contrário, o peso molecular é o peso mo- lecular médio, a temperatura é em graus centígrados e pressão é a atmosfé- rica ou próximo. Exemplo 1: Geração de anticorpos humanos para TL1A Humano Camundongos VELOCIMMUNE® foram imunizados com TL1A humana e a resposta imune de anticorpo monitorada pelo imunoensaio antí- geno-específico usando soro obtido a partir destes camundongos. Células B que expressam anticorpo anti-hTL1A coletadas dos baços de camundongos imunizados demonstraram ter titulações elevados de anticorpos anti-hTL1A e foram fundidas com células de mieloma de camundongo para formar hibri- domas.
Os hibridomas sofreram triagem e foram selecionados para identifi- car linhagens de células que expressam anticorpos específicos para hTL1A 5 usando ensaios conforme descrito abaixo.
Os ensaios identificaram várias linhagens de células que produziam anticorpos quiméricos anti-hTL1A desig- nados como H2M1681N, H2M1704N, H2M1804N, H2M1805N, H2M1817N e H2M1818N.
Estes anticorpos foram depois convertidos para o isotipo hIgG4 substituindo as respectivas regiões constantes de camundongo pela se- quência de aminoácidos de IgG4 de SEQ ID NO: 257, a qual contém uma mutação S108P na região de dobradiça e designados como H4H1681N, H4H1704N, H4H1804N, H4H1805N, H4H1817N e H4H1818N, respectiva- mente.
Anticorpos específicos para TL1A humana foram isolados dire- tamente a partir de células B imunizadas com antígeno sem fusão à células de mieloma, conforme descrito na Patente US N° 7.58 2.298, a qual é aqui incorporada por referência na íntegra.
Regiões variáveis da cadeia pesada e leve foram clonadas para gerar anticorpos anti-hTL1A inteiramente humanos designados como H4H1719P, H4H1725P, H4H1738P, H4H1742P, H4H1745P, H4H1750P e H4H1752P.
Linhagens de células CHO que ex- pressam anticorpo recombinante estáveis foram estabelecidas.
Exemplo 2. Análise de Utilização de Gene Variável Para analisar a estrutura dos anticorpos produzidos, os ácidos nucleicos que codificam regiões variáveis de anticorpos foram clonados e sequenciados.
A partir da sequência de ácido nucleico e da sequência de aminoácidos previstas dos anticorpos, o uso do gene foi identificado para cada Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) e Região Variável de Ca- deia Leve (LCVR). A Tabela 1 mostra o uso de genes para anticorpos sele- cionados de acordo com a invenção.
Tabela 1
HCVR LCVR Anticorpo
VH DH JH VK JK H2M1704 3-7 1-7 6 4-1 3 H2M1681 3-23 2-21 4 1-5 1 H2M1817 4-34 3-9 4 3-20 4 H2M1804 4-34 1-1 4 3-20 4 H2M1818 3-11 4-17 6 4-1 1 H2M1805 4-34 3-3 4 2-24 4 H4H1719 3-9 3-3 6 2-28 2 H4H1725 1-2 2-15 3 1-12 4 H4H1738 3-15 4-4 6 2-28 2 H4H1742 3-23 2-2 6 1-9 2 H4H1745 3-23 6-6 4 1-9 4 H4H1750 3-30 4-17 6 1-17 1 H4H1752 3-23 1-7 4 1-5 1 A Tabela 2 mostra os pares de sequências de aminoácidos da região variável de cadeias pesada e leve de anticorpos anti-hTL1A selecio- nados e seus identificadores de anticorpo correspondentes. As designações 5 N e P referem-se a anticorpos que têm cadeias leves e pesadas com se- quências de CDR idênticas, mas com variações de sequência nas regiões que ficam fora das sequências de CDR (isto é, nas regiões de framework). Assim, variantes N e P de um anticorpo particular têm sequências de CDR idênticas dentro de suas regiões variáveis de cadeias pesada e leve, mas contêm modificações dentro das regiões de framework. Tabela 2 Nome do mAb HCVR/LCVR Nome do mAb HCVR/LCVR (H2M- or H4H-) SEQ ID NOS (H2M- or H4H-) SEQ ID NOS 1704N 2/10 1738N 138/146 1681N 18/26 1738P 154/156 1804N 34/42 1745N 158/166 1805N 50/58 1745P 174/176 1817N 66/74 1750N 178/186 1818N 82/90 1750P 194/196 1719N 98/106 1752N 198/206 1719P 114/116 1752P 214/216 1725N 118/126 1742N 218/226 1725P 134/136 1742P 234/236 Exemplo 3. Determinação de Afinidade de Ligação de TL1A As afinidades de ligação e constantes cinéticas foram determi-
nadas por meio de ressonância de plasmon de superfície a 25 °C e 37 °C, conforme indicado nas Tabelas 3-5 para anticorpos monoclonais anti-TL1A humana que se ligam às seguintes variantes de espécies de TL1A: humana (h) (expressa em CHO, resíduos 72-251 de SEQ ID NO: 244, com His6-tag 5 N-terminal), macaco Cynomolgus (Mf) (expressa em E. coli, resíduos 72-251 de SEQ ID NO: 248, com ou sem Met N-terminal), macaco Cynomolgus (ex- pressa em CHO, resíduos 72-251 de SEQ ID NO: 248, com His6-tag N- terminal), camundongo (m) (expressa em E. coli, resíduos 76-252 de SEQ ID NO: 250, com ou sem Met N-terminal), camundongo (expressa em CHO, resíduos 76-252 de SEQ ID NO: 250, com His6-tag N-terminal) e rato (ex- pressa em CHO; resíduos 76-252 de SEQ ID NO: 258, com His6-tag N- terminal). As constantes de ligação foram também determinadas para a vari- ante de hTL1A, Fhm (expressa em E. coli, resíduos 72-251 de SEQ ID NO: 246, contendo a substituição Q167R, com ou sem Met N-terminal). As medi- ções foram conduzidas em um instrumento BIACORE® T100. Os anticorpos, expressos com Fc de camundongo (designados com o prefixo "H2M") ou Fc de IgG4 humana (S108P) (designados com o prefixo "H4H"), foram captura- dos sobre uma superfície sensora anti-Fc e pelo menos três concentrações diferentes das proteínas TL1A solúveis, variando de 1,25 nM a 100 nM, fo- ram injetadas sobre a superfície do sensor.
Constantes de associação ciné- tica (ka) e dissociação (kd) foram determinadas ajustando os dados a um modelo de ligação a 1:1 usando o software de adaptação de curva BIAeva- luation 4.1 (BIAcore Life Sciences). Concentrações molares de TL1A/Fhm usadas na adaptação de dados admitem um estado monomérico para TL1A em solução.
As constantes de dissociação de ligação em equilíbrio (KD) e meia-vida de dissociação (t1/2) foram calculadas a partir das constantes de taxa cinética como: KD (M) = kd / ka e t1/2 (min) = [ln2/(60*kd )]. NB: Sem liga- ção sob as condições testadas; NT: Não testado neste experimento; *: valo- res de kd abaixo de 1x10-6 (1/s) são mais lentos do que o limite de detecção sob estas condições experimentais e, portanto, os valores de kd foram fixa- dos em 1x10-6 (1/s) com a finalidade de aproximação da KD e t1/2; **: cons- tantes de dissociação em equilíbrio para os anticorpos foram determinadas sob condições de estado constante.
Conforme mostrado nas Tabelas 3 e 4, os anticorpos se ligaram com alta afinidade à formas expressas em CHO de proteína TL1A humana e de macaco a 25 °C (13 e 12 anticorpos com K D <1 nM, respectivamente) e a 5 37 °C (13 e 12 anticorpos com K D <1 nM, respectivamente). H4H1750P se ligou significativamente mais fraco à proteína TL1A de macaco em relação à proteína TL1A humana.
H4H1704N se ligou à mTL1A expressa em CHO com KD <2nM a 25 °C e 37 °C.
H4H1818N se ligou à mTL1A ex pressa em CHO a 25 °C (K D ~ 7Nm), mas não a 37 °C.
Cinco anticorpos, H4H1681 N, H4H1738P, H4H1750P, H4H1752P e H4H1805N, não se ligaram à TL1A de rato expressa em células CHO a 25 °C ou 37 °C; os o utros oito anticorpos se ligara à TL1A de rato em ambas as temperaturas com KD variando de ~ 0,6 pM a ~ 16 nM . Conforme mostrado na Tabela 5, três anticorpos (H2M1681N, H4H1752P e H2M1805N) não demonstraram ligação à variante de Fhm ex- pressa em E. coli [hTL1A (Q167R)] sob as condições testadas.
Três anticor- pos (H2M1704N, H4H1725P e H2M1818N) demonstraram fraca ligação (KD variando entre ~ 60 nM a ~ 170 nM) à TL1A de camundongo expressa em E. coli, conforme avaliado sob condições em estado constante, enquanto que todos os outros anticorpos testados não se ligam à proteína TL1A de ca- mundongo sob as condições testadas.
Tabela 3 º mAb TL1A expressa em CHO a 25 C hTL1A hTL1A MfTL1A MfTL1A mTL1A mTL1A rTL1A rTL1A KD (pM) t1/2 (min) KD (pM) t1/2 (min) KD (pM) t1/2 (min) KD (pM) t1/2 (min) H4H1681N 263 36 404 25 NB NB NB NB H4H1704N 39,2 453 59,9 276 194 46 404 25 H4H1719P 481 44 417 45 NB NB 364 38 H4H1725P 63,6 185 346 64 NB NB 317 26 H4H1738P 608 64 361 93 NB NB NB NB H4H1742P 60,4 755 115 577 NB NB 78 144 H4H1745P 164 172 115 231 NB NB 2,7 (nM) 4 H4H1750P 15,8* 11550* 8,6 (nM) 21 NB NB NB NB H4H1752P 156 197 213 139 NB NB NB NB H4H1804N 291 51 264 49 NB NB 321 43 H4H1805N 365 73 342 74 NB NB NB NB H4H1817N 321 103 356 92 NB NB 2,5 (nM) 25 H4H1818N 124 120 119 122 7,1 (nM) 12 88 92
Tabela 4 º mAb TL1A expressa em CHO a 37 C hTL1A hTL1A MfTL1A MfTL1A mTL1A mTL1A rTL1A rTL1A KD (pM) t1/2 (min) KD (pM) t1/2 (min) KD (pM) t1/2 (min) KD (pM) t1/2 (min) H4H1681N 254 31 226 32 NB NB NB NB H4H1704N 1,00* 11550* 0,93* 11550* 1,3 (nM) 27 46 133 H4H1719P 7,61 1912 2,01 5784 NB NB 78 86 H4H1725P 23,9 758 17,7 888 NB NB 411 15 H4H1738P 571 51 465 60 NB NB NB NB H4H1742P 4,37* 11550* 4,45* 11550* NB NB 653 27 H4H1745P 177 129 173 124 NB NB 16,5 (nM) 11 H4H1750P 13,8* 11550* 17,1 (nM) 11 NB NB NB NB H4H1752P 225 96 223 91 NB NB NB NB H4H1804N 45,8 286 78 167 NB NB 127 88 H4H1805N 299 80 352 68 NB NB NB NB H4H1817N 27,8 1098 25,6 1150 NB NB 1,6 (nM) 26 H4H1818N 0,925* 11550* 0,804* 11550* NB NB 0,61* 11550*
Tabela 5 Fhm/TL1A expressa em E. coli o o o o o 25 C 37 C 25 C 37 C 25 C mAb Fhm Fhm Fhm Fhm MfTL1A MfTL1A MfTL1A MfTL1A mTL1A KD (pM) t1/2 (min) KD (pM) t1/2 (min) KD (pM) t1/2 (min) KD (pM) t1/2 (min) KD (pM)** H2M1681N NB NB NT NT 546 54 1,5 (nM) 14 NB H2M1704N 282 52 NT NT 285 57 751 16 127 (nM) H4H1719P 109 96 174 42 242 79 289 40 NB H4H1725P 28,9 447 43,6 194 63,7 292 62,2 174 62 (nM) H4H1738P 1020 19 3100 4 1360 18 4,2 (nM) 4 NB H4H1742P 437 129 696 45 593 97 945 35 NB H4H1745P 115 226 207 71 141 221 281 74 NB H4H1750P 204 623 244 335 52,7 (nM) 4 456 (nM) 1 NB H4H1752P NB NB NB NB 274 122 1320 29 NB H2M1804N 192 108 NT NT 176 172 218 118 NB H2M1805N NB NB NT NT 345 67 439 36 NB H2M1817N 451 57 NT NT 1250 37 1,0 (nM) 30 NB H2M1818N 1080 17 NT NT 1840 10 4,1 (nM) 3 171 (nM)
Exemplo 4: Inibição de TL1A por Anticorpos Anti-hTL1A Linhagens de células HEK293 (CRK01573, ATCC) foram geradas 5 para expressar estavelmente DR3 humano (comprimento total; SEQ ID NO: 252) ou DR3 de camundongo (comprimento total; SEQ ID NO: 259), juntamente com um repórter de luciferase [elemento de resposta NFκB (5x)-luciferase- IRES-GFP]. Ativação de NFκB por TL1A foi mostrada anteriormente (Migone et al., 2002, Immunity 16: 479-492). Para testar a forma ligada à membrana de TL1A e variantes de TL1A, foram geradas linhagens de células HEK293 que expressam estavelmente TL1A humana de comprimento total (SEQ ID NO: 244), TL1A humana de comprimento total com Gln-167 substituída por Arg [Fhm; TL1A (Q167R); SEQ ID NO: 246], TL1A de comprimento total de macaco Cynomolgus, Macaca fascicularis (MfTL1A; SEQ ID NO: 248), TL1A de camun- dongo de comprimento total (SEQ ID NO: 250) e TL1A de rato de comprimento total (SEQ ID NO: 258). Linhagens de células estáveis foram isoladas e manti-
das em soro fetal bovino a 10% (FBS; Irvine Scientific), Meio de Eagle Modifi- cado de Dulbecco (DMEM; Irvine Scientific), aminoácidos não essenciais (NE- AA, Irvine Scientific), penicilina/estreptomicina (Invitrogen) e G418 (Invitrogen). Para o bioensaio, células repórter DR3 humanas ou de camundon- 5 go foram cultivadas em placas de ensaio com 96 cavidades a 1 x 104 célu- las/cavidade em meio com baixo teor de soro, isto é, FBS a 0,1% e OPTIMEM® (Invitrogen) e incubadas a 37 °C e 5% de CO 2 durante a noite.
No dia seguinte, TL1A solúvel ou Fhm (sTL1A ou sFhm) foi serialmente diluída a 1:3 e adiciona- da à células em concentrações que variam de 0,002 nM a 100 nM (além de um tampão de controle que não continha TL1A). Para inibição, os anticorpos foram serialmente diluídos a 1:3 e adicionados às células em concentrações que vari- am de 0,002 nM a 100 nM (além de um tampão de controle que não contém o anticorpo) na presença de concentrações constantes de TL1A ou Fhm: 800 pM para hTL1A (expressa em células CHO; resíduos 72-251 de SEQ ID NO: 244, com a Hi6-tag N-terminal), 100 pM para hTL1A (expressa em E. coli; resíduos 72-251 de SEQ ID NO: 244, com ou sem Met N-terminal), 500 pM para Fhm (expressa em células CHO; resíduos 72-251 de SEQ ID NO: 246), 400 pM para MfTL1A (expressa em células CHO; resíduos 72-251 de SEQ ID NO: 248, com Hi6-tag N-terminal), 400 pM para MfTL1A (expressa em E. coli; resíduos 72-251 de SEQ ID NO: 248, com ou sem Met N-terminal), 50 pM para TL1A de camun- dongo (expressa em células CHO; resíduos 76-252 de SEQ ID NO: 250, com Hi6-tag N-terminal), 20 pM para TL1A de camundongo (expressa em E. coli; re- síduos 76-252 de SEQ ID NO: 250, com ou sem Met N-terminal) e 50 pM para TL1A de camundongo (expressa em células CHO; resíduos 76-252 de SEQ ID NO: 258, com Hi6-tag N-terminal). A atividade de luciferase foi detectada após 5,5 horas de incubação a 37°C e 5% de CO 2. Os resultados são mostrados na Tabela 6. mAb1 de controle: controle positivo (um anticorpo anti-hTL1A com os domínios variáveis de cadeia pesada e leve tendo sequências de aminoácidos correspondendo à SEQ ID NOS: 21 e 27 do documento US 2009/0280116); mAb2 de controle: Controle negativo (anticorpo irrelevante); NB: Sem ligação sob as condições testadas; NT: Não testado neste ensaio; *: Inibição não é a linha de base para a concentração mais alta de anticorpo de 100 nM.
Tabela 6 hTL1A hTL1A Fhm MfTL1A MfTL1A mTL1A mTL1A rTL1A sTL1A ou sFhm (CHO) (E.
Coli) (CHO) (CHO) (E.
Coli) (CHO) (E.
Coli) (CHO) EC50 (nM) 0,63 0,12 0,32 0,86 2,02 0,08 0,01 0,06 Constante TL1A ou Fhm (pM) 800 100 500 400 400 50 20 50 H4H1681N 0,17 0,02 NB 0,03 0,02 NB NB NB H4H1704N 0,13 0,06 0,17 0,01 0,03 NB NB 0,40 H4H1804N 0,07 0,03 0,10 0,03 0,02 NB NB 3,64 H4H1805N 0,10 0,04 185,50* 0,03 0,02 NB NB NB H4H1817N 0,11 0,04 0,12 0,04 0,02 NB NB 23,87 H4H1818N 0,37 0,29 0,62 0,13 0,06 NB NB 1,10 H4H1719P 0,06 0,02 0,08 0,01 0,02 NT NB NT H4H1725P 0,05 0,02 0,07 0,01 0,02 NB NB 63,43 IC50 [nM] H4H1738P 0,39 0,16 0,33 0,39 0,07 NT NB NT
47/55 H4H1742P 0,31 0,19 0,53 0,26 0,07 NB NB 6,12 H4H1745P 0,09 0,06 0,15 0,05 0,03 NB NB NB H4H1750P 0,90 2,17 3,10 154,70 32,47* NT NB NT H4H1752P 0,36 0,21 NB 0,12 0,05 NT NB NT mAb1 de controle NB 0,74 NB NB 3,25 NT NB NT mAb2 de controle NB NB NB NB NB NB NT NB
Conforme mostrado na Tabela 6, foi mostrado que treze anticor- pos anti-TL1A inibem a estimulação do receptor humano DR3 expresso so- bre células HEK293 induzida por TL1A solúvel humana (expressa em CHO e E. coli), conforme determinado usando o repórter luciferase para ativação de 5 NFκB.
Um anticorpo de controle positivo (mAb1 de controle) inibiu hTL1A expressa em E. coli, mas não expressa em CHO.
Dez anticorpos também inibiram a estimulação de células que expressam hDR3 pela Fhm (hTL1A com Q167R). H4H1681N, H4H1805N e H4H1752P não inibiram totalmente a Fhm na concentração mais alta de anticorpo de 100 nM.
Todos os treze an- ticorpos também bloquearam MfTL1A (Tabela 6). TL1A de camundongo (produzida a partir de CHO e E. coli) estimulou a ativação de NFκB em célu- las repórter hDR3, no entanto, nenhum dos 13 anticorpos anti-TL1A humana inibiu TL1A de camundongo expressa em E. coli neste ensaio (Tabela 6). Nove anticorpos selecionados foram testados e não demonstraram bloqueio de TL1A de camundongo expressa em CHO neste ensaio (Tabela 6). Para testar a capacidade de TL1A expressa sobre células de es- timular a sinalização no sistema repórter hDR3, bioensaios foram realizados conforme descrito acima para TL1A solúvel com as seguintes modificações: células HEK293/TL1A aderentes foram dissociadas usando Enzyme-Free Dissociation Solution (Chemicon) e adicionadas à células repórter hDR3 a- derentes após diluição serial das células com TL1A a 1:2 começando de 2 x 105 células a 195 células (além de um controle sem células). Para inibição da formação de anticorpos, 1 x 104 células foram adicionadas junto com an- ticorpos serialmente diluídos de 100 nM a 0,002 nM (além de um controle não contendo o anticorpo). Os resultados são mostrados na Tabela 7. mAb1 e mAb2 de controle: Igual ao ensaios acima.
NB: Nenhuma ligação sob as condições testadas; NT: Não testado neste ensaio; *: Inibição não é a linha de base para a concentração mais alta de anticorpo de 100 nM.
Tabela 7 HEK293/ HEK293/ HEK293/ HEK293/ HEK293/ TL1A ou Fhm ligada à célula hTL1A Fhm MfTL1A mTL1A rTL1A EC50 (células) 23474 47921 8465 12366 9773 Constante TL1A/Fhm 10.000 (# de células) H4H1681N 0,66 NB 3,07 NT NT H4H1704N 1,11 1,58 3,76 NB NT H4H1804N 0,56 1,23 2,23 NB 3,99 H4H1805N 0,82 54,10* 1,93 NB NB H4H1817N 1,11 0,62 5,04 NB 94,96* H4H1818N 1,54 1,42 4,29 NT NT H4H1719P 0,82 0,84 3,00 NT NT IC50 [nM] H4H1725P 0,66 0,94 2,82 NB 190,30* H4H1738P 7,47 7,75 20,25 NT NT H4H1742P 6,55 8,39 18,45 NB NT H4H1745P 0,76 2,12 4,28 NT NT H4H1750P 12,82 29,52* 107,40* NT NT H4H1752P 1,99 138,10* 11,67 NT NT mAb1 de controle NB NB NB NB NT mAb2 de controle NB NB NB NB NB
Conforme mostrado na Tabela 7, todos os treze anticorpos blo- quearam a estimulação de células que expressam hDR3 pela hTL1A ex- pressa sobre células.
Com Fhm ligada à célula, todos os anticorpos inibiram 5 significativamente, exceto H4H1681N, H4H1805N, H4H1750P e H4H1752P, os quais não inibiram totalmente na concentração mais alta testada de anti- corpo de 100 nM.
Com MfTL1A ligada à célula, todos os anticorpos inibiram, exceto H4H1750, o qual não inibiu completamente na concentração mais alta testada de anticorpo de 100 nM.
Seis dos anticorpos, H4H1704N, H4H1804N, H4H1805N, H4H1817N, H4H1725P e H4H1742P, foram testa- dos quanto ao bloqueio de estimulação de células mDR3 por mTL1A na su- perfície celular e não mostraram inibição.
Células repórter que expressam DR3 de camundongo também puderam ser estimuladas por células 293 que expressam rTL1A, com uma EC50 observada de 9773 células (Tabela 7). Quatro anticorpos foram testados no ensaio de rTL1A/mDR3: três anticor- pos, H4H1804N, H4H1817N e H4H1725P, bloquearam, enquanto que H4H1805N não bloqueou a estimulação de células mDR3 por rTL1A na su- perfície celular (Tabela 7). mAb1 de controle bloqueou a estimulação de cé- lulas hDR3 por hTL1A solúvel e MfTL1A expressa em E. coli, mas falhou em bloquear formas CHO-expressas de hTL1A e MfTL1A sob todas as condi- ções testadas (Tabela 6). mAb1 de controle também não inibiu a estimula- ção de células que expressam hDR3 por qualquer um de TL1A e Fhm ex-
pressa na superfície celular sob todas as condições testadas (Tabela 7). Exemplo 5: Bloqueio de TL1A ao hDR3 e DcR3 por Anticorpos Anti-TL1A A capacidade de anticorpos de bloquear a ligação de TL1A hu- mana a seus receptores cognatos, os receptores DR3 e DcR3, foi medida 5 usando um ELISA competitivo em sanduíche.
Além disso, bloqueio de liga- ção de uma variante de proteína TL1A humana, Fhm (TL1A humana Q167R) e TL1A de macaco Cynomolgus (Macaca fascicularis) (MfTL1A) aos recepto- res de DR3 ou DcR3 humanos foi medida da mesma maneira.
Quantidades constantes de TL1A biotinilada humana ou Fhm (ambas expressas com um tag 6-His em células CHO) ou MfTL1A biotinilada (expressa em células CHO) foram tituladas separadamente com quantidades variáveis de anticor- pos.
Os complexos anticorpo-proteína foram incubados em solução (1h, 25°C) e, então, transferidos para placas de microti tulação revestidas com DR3 humano (hDR3) ou DcR3 humano (hDcR3) expressas como proteínas de fusão de Fc/IgG1 humana.
Após uma hora a 25 ºC, as cavidades foram lavadas e TL1A de macaco ou humana ligada foi detectada com estreptavi- dina conjugada com peroxidase de rábano (HRP). As cavidades foram lava- das com uma solução de TMB para produzir uma reação colorimétrica e dis- sipada com ácido sulfúrico aquoso, antes de leitura da absorbância a 450 nm em um Plate Reader Victor X5 da Perkin-Elmer.
Uma curva sigmoidal de dose-resposta foi adaptada aos dados usando o pacote de análise de dados Prism®. O valor calculado de IC50, definido como a concentração de anticor- po necessária para bloquear 50% da ligação de TL1A a hDR3 ou hDcR3, foi usado como um indicador de potência de bloqueio.
Ambos os mAbs anti- hTL1A totalmente humanos e anticorpos de comparação, isto é, o mAb1 de controle (um anticorpo anti-hTL1A com os domínios variáveis de cadeia pe- sada e leve tendo sequências de aminoácidos correspondendo à SEQ ID NOS: 21 e 27, respectivamente, documento US 2009/0280116 ) e mAb3 de controle (um anticorpo anti-hTL1A com domínios variáveis da cadeia pesada e leve tendo sequências de aminoácidos correspondendo à SEQ ID NOS: 57 e 48, respectivamente, documento US 2009/0280116), foram incluídos no estudo.
Os resultados são mostrados na Tabela 8. NB: Sem ligação sob as condições testadas; NT: não testado.
Concentrações de ligantes solúveis biotinilados: (1) 150 pM; (2) 500 pM; (3) 10 pM; e (4) 50 pM.
Conforme mostrado na Tabela 8, a maior parte dos mAbs total- mente humanos mostram bloqueio eficaz da interação de ligação 5 TL1A/hDR3 e TL1A/hDcR3, com vários mostrando valores de IC50 abaixo de 50 pM.
Dois dos anticorpos, H4H1752P e H4H1805N, bloquearam fortemen- te a ligação de TL1A humana e de macaco ao hDR3 e hDcR3, mas falharam em bloquear a ligação de Fhm a qualquer um de hDR3 ou hDcR3, sugerindo que o epítopo de ligação para estes dois anticorpos pode envolver a região perto do local de mutação em Fhm (hTL1A com Q167R). A estrutura de cris- tal da hTL1A mostra que o resíduo Q167 ocorre dentro de uma alça exposta na superfície (Zhan et al., 2009, Biochemistry 48: 7636-7645). Tabela 8 hDR3 hDR3 hDR3 DcR3 DcR3 DcR3 1 1 2 3 3 4 ID mAb hTL1A (CHO) Fhm (CHO) MfTL1A(CHO) hTL1A (CHO) Fhm (CHO) MfTL1A (CHO) IC50 (pM) IC50 (pM) IC50 (pM) IC50 (pM) IC50 (pM) IC50 (pM) H4H1681N 60 >10000 141 17 90 93 H2M1681N 37 >10000 61 13 234 149 H4H1704N 30 44 42 77 170 110 H2M1704N NT NT NT NT NT NT H4H1719P 22 23 46 44 45 61 H4H1725P 15 18 16 68 85 145 H4H1738P 69 152 117 122 150 68 H4H1742P 64 214 240 181 231 127 H4H1745P 18 44 50 58 85 118 H4H1750P 341 589 5209 656 626 NB H4H1752P 104 NB 110 31 NB 56 H4H1804N 40 69 71 175 >10000 34 H2M1804N 46 102 81 120 >10000 9 H4H1805N 14 NB 26 33 436 313 H2M1805N 6 NB 13 12 2241 1138 H4H1817N 114 235 101 270 NT 322 H2M1817N 154 249 137 890 666 776 H4H1818N 119 202 123 232 NT 1102 H2M1818N 154 317 239 396 NB 55 mAb1 de >10000 NB 5300 >1000 NT 21000 controle mAb3 de >10000 NB 17000 8600 NT NT controle
Exemplo 6: Competição por Ligação na Superfície Celular de Anticorpos à TL1A com hTL1A Solúvel Células 293 de rim embriônico humano transfectadas de forma es- tável para superexpressar hTL1A na superfície celular foram primeiro marcadas em um experimento de citometria de fluxo com oito anticorpos anti-hTL1A em quatro concentrações (1, 0,1, 0,01 e 0,003 µg/ml). Os anticorpos humanos liga-
dos foram detectados usando um F(ab')2 de cabra marcado com aloficocianina específico para FCγ humano [ou F(ab')2 anti-hFcγ-APC, Jackson ImmunoRese- arch, # 109-136-170]. A menor concentração de anticorpo que proporcionou níveis significativos de coloração foi, então, usada em um ensaio de ligação 5 competitiva. Um anticorpo de controle de isotipo negativo (IgG4 humana) foi usado a 1 µg/ml para definir o sinal de fundo. Para o experimento de competi- ção, oito amostras de anticorpo, nas concentrações mínimas acima identifica- das, foram primeiro tratadas com hTL1A solúvel expressa a partir de células CHO em concentrações variando entre 0,03 µg/ml a 10 µg/ml. Após pré- incubação durante 30 min sobre gelo, a mistura de anticorpo/hTL1A foi adicio- nada à células 293/HEK-hTL1A que tinham sido isoladas por meio de centrifu- gação em uma placa cônica com 96 cavidades. Após incubação durante mais 10 minutos sobre gelo, as células foram lavadas. O reagente secundário, F(ab')2 anti-hFcγ-APC, foi adicionado a todas as cavidades em uma diluição de 200 vezes para detectar anticorpos ligados. As amostras foram incubadas du- rante 15 minutos sobre gelo, protegidas da luz e, então, lavadas. As células foram processadas sobre um Citômetro de Fluxo LSR II BD (BD Biosciences) para detecção de anticorpos anti-hTL1A ligados à superfície celular e os dados foram analisados usando o software FlowJo (Versão 8.8.6; Tree Star Inc.). Os resultados são mostrados na Tabela 9. sinal Máximo: ligação de anticorpo anti- hTL1A na ausência de hTL1A solúvel; Sinal Mínimo: sinal registrado quando 1 µg/ml de anticorpo de controle de isotipo foi adicionado em vez do anticorpo anti-hTL1A. NT: Não testado. Tabela 9 Intensidade média de fluorescência para anticorpos anti-hTL1A (H4H) que se ligam à hTL1A na superfície celular hTL1A 1704N 1725P 1742P 1804N 1805N 1817N 1681N 1745P solúvel 0,1 g/ml 0,1 g/ml 1 g/ml 0,1 g/ml 0,1 g/ml 1 g/ml 1 g/ml 1 g/ml ( g/ml) 10 NT NT NT NT NT NT 16,9 15 3 22,6 34,9 19,9 28,9 23,6 25,2 28,5 19,5 1 26 29,2 32,7 33,7 25,1 29,1 80,9 26,9
0.3 31,5 40,7 44,7 33,5 36,8 23,6 236 115
0.1 132 84,5 79,4 51,1 60,2 97,2 327 93,1
0.03 163 207 126 126 156 85,3 318 80 Sinal 116 211 126 127 158 110 320 87,2 máximo Sinal 27,5 27,5 27,5 27,5 27,5 27,5 17,9 17,9 mínimo
Conforme mostrado na Tabela 9, os sinais dos oito anticorpos testados competiram para diminuir os níveis de linha de base mediante a adição de hTL1A solúvel em excesso, demonstrando a especificidade de ligação dos anticorpos à hTL1A na superfície celular. 5 Exemplo 7: Bloqueio de Estimulação de Células T CD4+ hTL1A-Depen- dentes Por Anticorpos Anti-TL1A Para determinar a capacidade dos anticorpos anti-hTL1A de blo- quear a estimulação de células T CD4+ humanas hTL1A-dependentes, um ensaio in vitro foi desenvolvido no qual liberação de IFN-gama (IFN-γ) esti- mulada por hTL1A/anti-CD3/anti-CD28 foi medida na presença ou ausência de anticorpos.
Células T CD4+ humanas foram isoladas da camada leuco- plaquetária fresca preparada a partir de amostras de sangue humano obtido do New York Blood Center.
Células de um único doador foram separadas de células de outro doador para cada ensaio.
Células T CD4+ foram adiciona- das à cavidades de uma placa com 96 cavidades a 3,5 x 105 células por ca- vidade.
A cada cavidade foi, então, adicionada hTL1A solúvel (resíduos 72- 251 de NP_005109.2 com uma tag de hexa-histidina N-terminal, expressa a partir de células CHO) em uma concentração final de 1 µg/ml (16 nM, assu- mindo trímeros de formação de hTL1A em solução) em RPMI + FBS a 10%, L-glutamina e penicilina/estreptomicina.
A cada cavidade foram adicionados também os anticorpos anti-hTL1A ou um anticorpo de controle de isotipo em concentrações finais de 1,0 µg/ml ou 3,0 µg/ml (6,7 nM ou 20 nM, respecti- vamente). As amostras foram incubadas durante 15 minutos a 4 °C no escu- ro, seguido pela adição de anti-hCD3 (BS Pharmingen, cat # 555336) e anti- hCD28 (BD Pharmingen, cat # 555725) a cada cavidade em concentrações finais de 1,0 µg/ml.
As amostras foram incubadas durante 24 horas a 37 °C, os sobrenadantes coletados e os níveis de IFN-γ (determinados por meio de ELISA.
O efeito de bloqueio (média de duas cavidades para cada condição) de cada anticorpo em cada amostra de doador de células T CD4+ humanas é representada como a redução do sinal máximo dividido pela janela de res- posta máxima; isto é, Bloqueio % = [(Max - Inib) / (Max - Min)] x 100, onde "Max", "Inib" e "Min" são concentrações de IFN-γ medidas para células T
CD4+ humanas tratadas como se segue: "Max" - tratada com [hTL1A + anti - hCD3 + anti-hCD28 + mAb de controle de isotipo], "Min:" - tratadas com [an- ti-hCD3 + anti-hCD28 + mAb de controle de isotipo] e "Inib" - tratadas com [hTL1A + anti-hCD3 + anti-hCD28 + mAb anti-hTL1A de teste]. Anticorpos 5 para os quais bloqueio de IFN-γ ultrapassou o nível da linha de base "Min" são representados como bloqueio de 100%. Proporção (Max/Min) é a pro- porção entre a concentração de IFN-γ produzida a partir de células T CD4+ humanas tratadas sob condições Max e Min, conforme definido acima.
Conforme mostrado na Tabela 10, os anticorpos H4H1725P, H4H1805N, H4H1817N e H4H1804N bloquearam significativamente a libe- ração de IFN-γ estimulada por hTL1A em ambas as concentrações de 1 µg/ml e 3 µg/ml, com bloqueio quase completo (> 80%) observado para a maioria dos doadores na maior concentração de anticorpos.
Os resultados para bloqueio de secreção de IFN-γ por treze diferentes anticorpos anti- hTL1A contra células T de 10 diferentes doadores humanos CD4+ são ainda resumidos na Tabela 11. DP: desvio padrão.
Tabela 10 Bloqueio % de produção de IFN-γγ em células T humanas de 10 doadores Donor # D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 Proporção 5 4 10 10 4 3 4 3 8 2 ID mAb (Max/Min) H4H1725P 90 100 70 85 45 80 60 85 50 95 mAb H4H1805N 100 100 90 100 100 100 100 100 90 100 1 g/ml H4H1817N 100 100 90 90 100 45 55 100 55 80 (6,7 nM) H4H1804N 95 100 80 90 100 50 10 100 50 0 H4H1725P 95 100 95 100 90 80 90 100 90 100 mAb H4H1805N 100 100 95 100 80 100 100 100 70 100 3 g/ml H4H1817N 100 100 100 100 100 100 100 100 95 85 (20 nM) H4H1804N 100 100 95 100 100 100 100 100 100 80
Tabela 11 ID mAb Bloqueio % médio Bloqueio % médio Bloqueio % médio (SD) (SD) 0.1 g/ml mAb (SD) 1 g/ml mAb 3 g/ml mAb H4H1681N 20% (24) 45% (30) 95% (7) H4H1704N 22% (29) 53% (27) 98% (5) H4H1719P 10% (22) 37% (23) 78% (30) H4H1725P 13% (14) 80% (20) 94% (7) H4H1738P 25% (30) 41% (35) 81% (18) H4H1742P 10% (22) 58% (33) 83% (16) H4H1745P 22% (27) 36% (36) 91% (7) H4H1750P 11% (14) 42% (35) 89% (15) H4H1752P 18% (25) 52% (35) 71% (30) H4H1804N 26% (30) 68% (38) 98% (6) H4H1805N 21% (28) 98% (4) 94% (10) H4H1817N 25% (33) 81% (22) 98% (5) H4H1818N 25% (33) 42% (33) 71% (35) Controle de isotipo 16% (21) 26% (33) 28% (27)
Os níveis de IFN-γ foram também medidos em seis diferentes concentrações de anticorpo (variando de 0,03 µg/ml a 10 µg/ml) para cada um de seis diferentes anticorpos adicionados à células T CD4+ de doze doa- dores humanos.
Adaptação da curva aos dados permitiu estimar a concen- 5 tração de anticorpo na qual metade da inibição máxima foi obtida para cada anticorpo para cada amostra de célula dos doadores.
As concentrações mé- dias (± SD) para obtenção de metade da inibição máxima são fornecidas na Tabela 12. Tabela 12 mAb IC50 (nM) Doador # H4H1725P H4H1742P H4H1805N H4H1817N H4H1804N H4H1704N _ D1 3,4 24 2,4 6,6 6,8 _ D2 3,2 4,6 5,5 3,1 8,6 _ D3 5,4 10 3,4 4,7 8,6 _ D4 4,7 13 2,5 2,4 7,7 D5 7,0 12 2,9 8,5 6,7 17 D6 5,4 10 3,4 4,7 8,6 11 D7 13 31 8,0 7,0 12 12 D8 12 27 5,1 7,0 11 19 D9 6,4 56 5,9 9,5 8,1 7,5 D10 4,1 12 2,8 7,3 12 10 D11 6,1 27 3,0 7,3 7,6 11 D12 6,4 14 3,1 9,4 7,5 8,0 média 6,4 20 4,0 6,5 8,8 12 (± SD) (3,1) (14) (1,7) (2,3) (1,9) (4,1)
Quatro dos anticorpos, H4H1725P, H4H1804N, H4H1805N, H4H1817N, exibiram concentrações médias para metade da inibição máxi- ma abaixo de 10 nM (variando aproximadamente de 4-9 nM).

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo humano isolado ou um fragmento de ligação a antí- geno do mesmo que se liga especificamente e neutraliza a atividade do li- gante 1A de TNF humano (hTL1A). 5
2. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à hTL1A que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 244 com uma constante de dissociação em equilíbrio (KD) de cerca de 700 pM ou menos, cerca 300 pM ou menos, cerca de 80 pM ou menos ou 50 pM ou menos.
3. Anticorpo humano isolado ou um fragmento de ligação a antí- geno do mesmo que se liga especificamente ao ligante 1A de TNF humano (hTL1A) compreendendo uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50 , 66, 82, 98, 114, 118, 134, 138, 154, 158, 174, 178, 194, 198, 214, 218 e 234.
4. Anticorpo humano isolado ou um fragmento de ligação a antí- geno do mesmo que se liga especificamente ao ligante 1A de TNF humano (hTL1A) compreendendo uma região variável de cadeia leve (LCVR) com- preendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58 , 74, 90, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 176, 186, 196, 206, 216, 226 e 236.
5. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 3 ou 4, compreendendo uma HCVR/LCVR par de sequência selecionada a partir da SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/116, 118/126, 134/136, 138/146, 154/156, 158/166, 174/176, 178/186, 194/196, 198/206, 214/216, 218/226 e 234/236.
6. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, compreendendo um par de sequên- cias de HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 174/176 ou 234/236.
7. Anticorpo humano isolado ou um fragmento de ligação a antí- geno do mesmo que se liga especificamente à hTL1A, compreendendo se-
quências de região de determinação de complementaridade (CDR) de ca- deias pesada e leve contidas no par de sequências de HCVR/LCVR do anti- corpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 5 ou 6. 5 8. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compete pela ligação à hTL1A com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 6.
9. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga ao mesmo epítopo sobre a hTL1A que é reconhecido pelo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 6.
10. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 9, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno tem reatividade cruzada com TL1A de macaco Cynomol- gus (MfTL1A).
11. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 10, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno tem reatividade cruzada com Fhm que tem a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 246.
12. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 10, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno não reage de forma cruzada com Fhm que tem a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 246.
13. Molécula de ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 12.
14. Vetor de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 13.
15. Método de produção de um anticorpo anti-hTL1A ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo cultura de uma célula hospedeira compreendendo o vetor de expressão como definido na reivindicação 14 sob condições que permitem a produção do anticorpo ou fragmento do mesmo e recuperação do anticorpo ou fragmento do mesmo assim produzido.
16. Composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno como definido em qualquer uma das reivin- dicações 1 a 12 e um veículo farmaceuticamente aceitável. 5
17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 16, compreendendo ainda um ou mais agentes terapêuticos adicionais selecio- nados de um imunossupressor, um agente anti-inflamatório, um analgésico e um agente antialérgico.
18. Uso do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 na fabri- cação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio o qual é prevenido, aliviado, melhorado ou inibido mediante remoção, redução ou inibição de atividade de TL1A.
19. Método para o tratamento de uma doença ou distúrbio o qual é prevenido, aliviado, melhorado ou inibido mediante remoção, redução ou inibição de atividade de TL1A compreendendo administração, a um indivíduo que precisa da mesma, de uma quantidade terapeuticamente eficaz da com- posição farmacêutica como definida na reivindicação 16.
20. Uso de acordo com a reivindicação 18 ou método como defi- nido na reivindicação 19, em que a referida doença ou distúrbio é seleciona- do dentre colite ulcerativa, doença de Crohn, artrite reumatoide, esclerose múltipla, diabetes, asma e inflamação pulmonar alérgica.
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