CN110041429B - 抗cd-3抗体，与cd3及cd20结合的双特异性抗原结合分子，及其用途 - Google Patents

抗cd-3抗体，与cd3及cd20结合的双特异性抗原结合分子，及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供与CD3结合的抗体及其使用方法。根据某些实施方式，本发明抗体以高亲和力与人类CD3结合并诱导人类T细胞增殖。本发明包括与CD3结合并诱导T细胞介导的肿瘤细胞杀伤的抗体。根据某些实施方式，本发明提供双特异性抗原结合分子，其包括特异性与人类CD3结合的第一抗原结合结构域及特异性与人类CD20结合的第二抗原结合分子。在某些实施方式中，本发明的双特异性抗原结合分子能抑制表达CD20的B‑细胞肿瘤的生长。本发明的抗体及双特异性抗原结合分子可用于治疗其中上调的或诱导的靶向的免疫反应为希望的及/或治疗上有利的疾病和病症。例如，本发明的抗体可用于治疗多种癌症以及其他CD20相关的疾病和病症。

Description

抗CD-3抗体，与CD3及CD20结合的双特异性抗原结合分子，及 其用途
本申请为2013年9月19日提交的，发明名称为“抗CD-3抗体，与CD3及CD20结合的双特异性抗原结合分子，及其用途”的PCT申请PCT/US2013/060511的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2015年3月20日，申请号为201380048967.0。
发明领域
本发明关于对CD3具特异性的抗体及其抗原结合片段，及其使用方法。本发明亦关于与CD3及目标分子例如CD20结合的双特异性抗原结合分子，及其使用方法。
背景
CD3为与T细胞受体复合物(TCR)关联表达在T细胞上的同源二聚性或异源二聚性抗体，且为T细胞活化所需。功能性CD3由四条不同链中的二条链二聚结合所形成：ε、ζ、δ和γ。CD3二聚体排列包括γ/ε、δ/ε和ζ/ζ。抗CD3抗体已显现将CD3丛聚在T细胞上，藉此以类似TCR被肽-承载的MHC分子所吸引的方式，使T细胞活化。因此，抗-CD3抗体己被提出作为涉及T细胞活化作用的治疗目的。此外，能与CD3和靶抗原结合的双特异性抗体己被提出作为涉及将T细胞免疫反应靶向表达靶抗原细胞的组织和细胞的治疗用途。
CD20为表达在成熟B细胞的细胞膜上的非糖基化磷蛋白。CD20被视为B-细胞肿瘤相关抗原，因为有超过95％的B-细胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)和其他B-细胞恶性肿瘤表达CD20，但其在前体B-细胞、树突细胞和浆细胞中则无。靶向CD20的治疗癌症的方法已为本领域所知。例如，嵌合抗-CD20单克隆抗体利妥昔单抗(rituximab)已用于或建议用于治疗癌症，例如NHL、慢性淋巴性白血病(CLL)和小淋巴性淋巴瘤(SLL)。认为CD20通过补体依赖的细胞毒性(CDC)、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)/或引发细胞凋亡和对化学治疗的敏感性，杀死CD20-表达的肿瘤细胞。虽然抗-CD20肿瘤靶向策略在临床情况已显现很大的潜力，但并非所有的患者皆对抗-CD20治疗有反应，且某些患者显示对抗-CD20治疗发生抗性或出现不完全反应(例如，对利妥昔单抗具有抗性)。
与CD3和靶抗原(例如CD20)结合的双特异性抗原结合分子应可用于其中期望特异性靶向和T细胞介导的杀死表达靶抗原的细胞的治疗情况。
发明简述
在第一方面本发明提供与人类CD3结合的抗体及其抗原-结合片段。根据本发明此方面的抗体可用于，特别地，靶向表达CD3的T细胞，及用于刺激T细胞活化，例如在其中T细胞介导的致死为有利或所欲的情况下。可包括本发明的抗-CD3抗体或其抗原-结合部分作为双特异性抗体的部分，所述双特异性抗体针对具体细胞类型诸如肿瘤细胞或感染剂的CD3介导的T细胞活化。
本发明的示例性抗-CD3抗体列于文中的表1和表2。表1列出示例的抗-CD3抗体的重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，以及重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列标示符。表2列出编码示例的抗-CD3抗体的HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸分子的序列标示符。
本发明提供包括HCVR的抗体或其抗原结合片段，该HCVR包括选自由表1所列的任何HCVR氨基酸序列的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明也提供包括LCVR的抗体或其抗原结合片段，该LCVR包括选自由表1所列的任何LCVR氨基酸序列的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明亦提供包括HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)的抗体或其抗原结合片段，该HCVR和LCVR氨基酸序列对包括表1所列的任何HCVR氨基酸序列与表1所列的任何LCVR氨基酸序列配对。根据某些实施方式，本发明提供包括包含在任何表1所列的示例性抗-CD3抗体中的HCVR/LCVR氨基酸序列对的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，HCVR/LCVR氨基酸序列对由下列组成的组中选出：SEQ ID NO：2/10(例如H1H2712N)；114/122(例如H2M2609N)；514/522(例如H2M3563N)；770/778(例如H1H5778P)；1050/1234(例如H1H7195B)；及1090/1234(例如H1H7208B)。
本发明亦提供包括重链CDR1(HCDR1)的抗体或其抗原结合片段，该重链CDR1包括由表1所列的任何HCDR1氨基酸序列中选出的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明亦提供包括重链CDR2(HCDR2)的抗体或其抗原结合片段，该重链CDR2包括由表1所列的任何HCDR2氨基酸序列中选出的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明亦提供包括重链CDR3(HCDR3)的抗体或其抗原结合片段，该重链CDR3包括由表1所列的任何HCDR3氨基酸序列中选出的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明亦提供包括轻链CDR1(LCDR1)的抗体或其抗原结合片段，该轻链CDR1包括由表1所列的任何LCDR1氨基酸序列中选出的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明亦提供包括轻链CDR2(LCDR2)的抗体或其抗原结合片段，该轻链CDR2包括由表1所列的任何LCDR2氨基酸序列中选出的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明亦提供包括轻链CDR3(LCDR3)的抗体或其抗原结合片段，该轻链CDR3包括由表1所列的任何LCDR3氨基酸序列中选出的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明亦提供包括HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)的抗体或其抗原结合片段，该HCDR3和LCDR3氨基酸序列对包括表1所列的任何HCDR3氨基酸序列与表1所列的任何LCDR3氨基酸序列配对。根据某些实施方式，本发明提供包括包含在任何表1所列的示例性抗-CD3抗体中的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，HCDR3/LCDR3氨基酸序列对由下列组成的组中选出：SEQ ID NO：8/16(例如H1H2712N)；120/128(例如H2M2609N)；520/528(例如H2M3563N)；776/784(例如H1H5778P)；1056/1240(例如H1H7195B)；及1096/1240(例如H1H7208B)。
本发明亦提供包括包含在任何表1所列的示例性抗-CD3抗体中的一组六个CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，此HCDRl-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组由下列组成的组中选出：SEQID NO：4-6-8-12-14-16(例如H1H2712N)；116-118-120-124-126-128(例如H2M2609N)；516-518-520-524-526-528(例如H2M3563N)；772-774-776-780-782-784(例如H1H5778P)；1052-1054-1056-1236-1238-1240(例如H1H7195B)；及1092-1094-1096-1236-1238-1240(例如H1H7208B)。
在相关的实施方案中，本发明提供包括包含在如任何表1所列的示例性抗-CD3抗体所定义的HCVR/LCVR氨基酸序列对中的一组六个CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)的抗体或其抗原结合片段。例如，本发明包括抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段含有包含在由下列组成的组中选出的HCVR/LCVR氨基酸序列对中的HCDRl-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组：SEQ ID NO：2/10(例如H1H2712N)；114/122(例如H2M2609N)；514/522(例如H2M3563N)；770/778(例如H1H5778P)；1050/1234(例如H1H7195B)；和1090/1234(例如H1H7208B)。用于鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列中的CDR的方法和技术已为本领域所熟知并可用于鉴定文中所揭示的指定HCVR及/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可用于鉴定CDR界限的示例性习用法包括，例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般而言，Kabat定义以序列变异性为基准，Chothia定义以结构环区域的位置为基准，而AbM定义为介于Kabat和Chothia法的折衷。参见，例如Kabat，″Sequences ofProteins of Immunological Interest，″National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)；Al-Lazikani等人，(1997)，J.Mol.Biol.273：927-948；及Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9268-9272(1989)。亦可取得公开的数据库用以鉴定抗体内的CDR序列。
本发明亦提供编码抗-CD3抗体或其部分的核酸分子。例如，本发明提供编码表1中所列的任何HCVR氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，此核酸分子包括由表2所列的任何HCVR核酸序列中选出的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明亦提供编码表1中所列的任何LCVR氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，此核酸分子包括由表2所列的任何LCVR核酸序列中选出的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明亦提供编码表1中所列的任何HCDRl氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，此核酸分子包括由表2所列的任何HCDR1核酸序列中选出的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明亦提供编码表1中所列的任何HCDR2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，此核酸分子包括由表2所列的任何HCDR2核酸序列中选出的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明亦提供编码表1中所列的任何HCDR3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，此核酸分子包括由表2所列的任何HCDR3核酸序列中选出的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明亦提供编码表1中所列的任何LCDR1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，此核酸分子包括由表2所列的任何LCDR1核酸序列中选出的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明亦提供编码表1中所列的任何LCDR2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，此核酸分子包括由表2所列的任何LCDR2核酸序列中选出的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明亦提供编码表1中所列的任何LCDR3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，此核酸分子包括由表2所列的任何LCDR3核酸序列中选出的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明亦提供编码HCVR的核酸分子，其中该HCVR包括一组三个的CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中该HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列组如表1所列的任何示例性抗-CD3抗体所定义。
本发明亦提供编码LCVR的核酸分子，其中该LCVR包括一组三个的CDR(亦即LCDRl-LCDR2-LCDR3)，其中该LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组如表1所列的任何示例性抗-CD3抗体所定义。
本发明亦提供编码HCVR和LCVR二者的核酸分子，其中此HCVR包括表1中所列的任何HCVR氨基酸序列的氨基酸序列，及其中此LCVR包括表1中所列的任何HCVR氨基酸序列的氨基酸序列。在某些实施方式中，此核酸分子包括由表2所列的任何HCVR核酸序列中选出的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列，及由表2所列的任何LCVR核酸序列中选出的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。在根据本发明此方面的某些实施方式中，此核酸分子编码HCVR和LCVR，其中该HCVR和LCVR二者皆衍生自表1中所列的相同抗-CD3抗体。
本发明亦提供能表达包括抗-CD3抗体的重链或轻链可变区的多肽的重组表达载体。例如，本发明包括重组表达载体，该载体包括任何上文所提的核酸分子，亦即编码表1中所列的任何HCVR、LCVR及/或CDR序列的核酸分子。本发明的范围亦包括其中已导入此等载体的宿主细胞，以及通过在允许产生抗体和抗体片段的条件下培养宿主细胞，并回收所产生的抗体和抗体片段来生产抗体或其部分的方法。
本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗-CD3抗体。在某些实施方案中，修饰以移除不想要的糖基化位点可能为有用的，或缺乏在寡糖链上存在的岩藻糖部分的抗体，例如以增加抗体依赖的细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等人(2002)JBC 277：26733)。在其他的应用上，可进行半乳糖基化的修饰作用以修改补体依赖的细胞毒性(CDC)。
在另一方面，本发明提供包括特异性地结合CD3的重组的人类抗体或其片段以及可药用的载剂的药物组合物。在一相关的方面，本发明的特征为是抗-CD3抗体和第二治疗剂的组合的组合物。在一实施方式中，此第二治疗剂为任何有利地与抗-CD3抗体组合的活性剂。可有利地与抗-CD3抗体组合的示例性活性剂包括(不限于)结合及/或活化CD3讯号传递的其他活性剂(包括其他抗体或其抗原结合片段等)，及/或不直接与CD3结合然而却活化或刺激免疫细胞活化的活性剂。涉及本发明抗-CD3抗体的另外的组合治疗及共同制剂揭示于文中的他处。
又在另一方面，本发明提供使用本发明的抗-CD3抗体或抗体的抗原结合部分来刺激T细胞活化的治疗方法，其中该治疗方法包括将治疗上有效量的包括本发明抗体或抗体的抗原结合片段的药物组合物施用于需要其的对象。所治疗的病症为任何通过刺激CD3活性或讯号传递加以改善、减轻、抑制或预防的疾病或症状。
根据另一方面，本发明提供与CD3和靶抗原结合的双特异性抗原结合分子。根据某些示例性实施方式，此双特异性抗原结合分子与CD3和CD20结合；此等双特异性抗原结合分子在文中亦称为“抗-CD3/抗-CD20双特异性分子”。抗-CD3/抗-CD20双特异性分子的抗-CD20部分可用于靶向表达CD20的肿瘤细胞(例如B-细胞肿瘤)，而双特异性分子的抗-CD3部分可用于活化T细胞。与肿瘤细胞上的CD20和T细胞上的CD3的同时结合促进了由活化的T细胞定向杀死(细胞裂解)被靶向的肿瘤细胞。本发明的抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，特别地，用于治疗与CD20-表达肿瘤相关或由其引起的疾病和病症(例如淋巴瘤)。
根据本发明此方面的双特异性抗原结合分子，包括特异性与人类CD3结合的第一抗原结合结构域及特异性与CD20结合的第二抗原结合结构域。本发明包括抗-CD3/抗-CD20双特异性分子(例如双特异性抗体)，其中各抗原结合结构域包括重链可变区(HCVR)与轻链可变区(LCVR)配对。在本发明特定的示例性实施方式中，抗-CD3抗原结合结构域和抗-CD20抗原结合结构域各包括不同、有区别、与共同LCVR配对的HCVR。例如，如文中实例7所示，构建双特异性抗体包括特异性与CD3结合的第一抗原结合结构域，其中该第一抗原结合结构域包括衍生自抗-CD3抗体的HCVR/LCVR对；及特异性与CD20结合的第二抗原结合结构域，其中该第二抗原结合结构域包括衍生自抗-CD20抗体的HCVR与衍生自抗-CD3抗体的LCVR配对(例如，包括在抗-CD3抗原结合结构域内的相同LCVR)。换言的，在文中所揭示的示例性分子中，来自抗-CD20抗体的HCVR与来自抗-CD3抗体的LCVR的配对，产生特异性与CD20结合(但不与CD3结合)的抗原结合结构域。在此等实施方式中，第一和第二抗原结合结构域包括不同的抗-CD3和抗-CD20 HCVR，但享有共同的抗-CD3LCVR。
本发明提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中特异性与CD3结合的第一抗原结合结构域包括表1或表18中所列的任何HCVR氨基酸序列。特异性与CD3结合的第一抗原结合结构域亦包括表1或表19中所列的任何LCVR氨基酸序列。根据某些实施方式，特异性与CD3结合的第一抗原结合结构域包括表1或表17中所列的任何HCVR/LCVR氨基酸序列对。本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中特异性与CD3结合的第一抗原结合结构域包括如表1或表18中所列的任何重链CDR1-CDR2-CDR3氨基酸序列，和/或如表1或表19中所列的任何轻链CDR1-CDR2-CDR3氨基酸序列。
根据某些实施方式，本发明提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中特异性与CD3结合的第一抗原结合结构域包括重链可变区(HCVR)，所述重链可变区具有由SEQ ID NO：1250、1266、1282、1298、1314和1329组成的组中选出的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中特异性与CD3结合的第一抗原结合结构域包括轻链可变区(LCVR)，所述轻链可变区具有由SEQ ID NO：1258、1274、1290、1306、1322和1333组成的组中选出的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中特异性与CD3结合的第一抗原结合结构域包括由SEQ ID NO：1250/1258、1266/1274、1282/1290、1298/1306、1314/1322和1329/1333组成的组中选出的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)氨基酸序列对。
本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中特异性与CD3结合的第一抗原结合结构域包括重链CDR3(HCDR3)结构域，其具有由SEQ ID NO：1256、1272、1288、1304、1320和1332组成的组中选出的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列；及轻链CDR3(LCDR3)结构域，其具有由SEQ ID NO：1264、1280、1296、1312、1328和1336组成的组中选出的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
在某些实施方式中，特异性与CD3结合的第一抗原结合结构域包括由SEQ ID NO：1256/1264、1272/1280、1288/1296、1304/1312、1320/1328和1332/1336组成的组中选出的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。
本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，其中特异性与CD3结合的第一抗原结合结构域包括重链CDRl(HCDR1)结构域，其具有由SEQ ID NO：1252、1268、1284、1300、1316和1330组成的组中选出的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列；及重链CDR2(HCDR2)结构域，其具有由SEQ IDNO：1254、1270、1286、1302、1318和1331组成的组中选出的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列；轻链CDRl(LCDR1)结构域，其具有由SEQ ID NO：1260、1276、1292、1308、1324和1334组成的组中选出的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列；及轻链CDR2(LCDR2)结构域，其具有由SEQ ID NO：1262、1278、1294、1310、1326和1335组成的组中选出的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明的某些非限定、示例性抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子包括特异性与CD3结合的含有HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域的第一抗原结合结构域，所述HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域分别具有由下列组成的组中选出的氨基酸序列：SEQ ID NO：1252-1254-1256-1260-1262-1264(例如BS3/20-001)；1268-1270-1272-1276-1278-1280(例如BS3/20-002)；1284-1286-1288-1292-1294-1296(例如BS3/20-003)；1300-1302-1304-1308-1310-1312(例如BS3/20-004)；1316-1318-1320-1324-1326-1328(例如BS3-20-005)；及1330-1331-1332-1334-1335-1336(例如BS3/20-007)。
本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中特异性与CD20结合的第二抗原结合结构域包括重链可变区(HCVR)，其具有SEQ ID NO：1242的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中特异性与CD20结合的第二抗原结合结构域包括轻链可变区(LCVR)，其具有由SEQ IDNO：1258、1274、1290、1306、1322和1333组成的组中选出的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中特异性与CD20结合的第二抗原结合结构域包括由SEQ ID NO：1242/1258、1242/1274、1242/1290、1242/1306、1242/1322和1242/1333组成的组中选出的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)氨基酸序列对。
本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中特异性与CD20结合的第二抗原结合结构域包括重链CDR3(HCDR3)结构域，其具有SEQ ID NO：1248的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列；及轻链CDR3(LCDR3)结构域，其具有由SEQ ID NO：1264、1280、1296、1312、1328和1336组成的组中选出的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
在某些实施方式中，特异性与CD20结合的第二抗原结合结构域包括由SEQ ID NO：1248/1264、1248/1280、1248/1296、1248/1312、1248/1328和1248/1336组成的组中选出的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。
本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，其中特异性与CD20结合的第二抗原结合结构域包括重链CDR1(HCDR1)结构域，其具有SEQ ID NO：1244的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列；重链CDR2(HCDR2)结构域，其具有SEQ ID NO：1246的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列；轻链CDR1(LCDR1)结构域，其具有由SEQ ID NO：1260、1276、1292、1308、1324和1334组成的组中选出的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列；及轻链CDR2(LCDR2)结构域，其具有由SEQ ID NO：1262、1278、1294、1310、1326和1335组成的组中选出的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其实质上类似的序列。
本发明的某些非限定、示例性抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子包括特异性与CD20结合的分别含有HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域的第二抗原结合结构域，所述HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域具有由下列组成的组中选出的氨基酸序列：SEQ ID NO：1244-1246-1248-1260-1262-1264(例如BS3/20-001)；1244-1246-1248-1276-1278-1280(例如BS3/20-002)；1244-1246-1248-1292-1294-1296(例如BS3/20-003)；1244-1246-1248-1308-1310-1312(例如BS3/20-004)；1244-1246-1248-1324-1326-1328(例如BS3-20-005)；及1244-1246-1248-1334-1335-1336(例如BS3/20-007)。
在相关的实施方式中，本发明包括抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，其中特异性与CD20结合的第二抗原结合结构域包括重链和轻链CDR结构域，其包含在由SEQ IDNO：1242/1258、1242/1274、1242/1290、1242/1306、1242/1322和1242/1333组成的组中选出的重链和轻链可变区(HCVR/LCVR)序列内。
在另外方面，本发明提供编码文中所揭示的抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子的任何HCVR、LCVR或CDR序列的核酸分子，其包括：包含文中表20和21中所列的多核苷酸序列的核酸分子，以及包括以其任何功能性组合或排列的二或多个如表20和21中所列的多核苷酸序列的核酸分子。携带本发明核酸的重组的表达载体，和已导入此等载体的宿主细胞亦涵盖在本发明中，以及通过在允许产生抗体的条件下培养此等宿主细胞，并回收所产生的抗体来制造抗体的方法，亦涵盖在本发明中。
本发明包括抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，其中任何特异性与CD3结合的前述的抗原结合结构域与任何特异性与CD20结合的前述的抗原结合结构域组合、相连或缔合，形成与CD3和CD20结合的双特异性抗原结合分子。
本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子。在某些应用中，移除不想要的糖基化位置的修饰作用可能为有用的，或寡糖链上缺乏岩藻糖部分存在的抗体，例如用以增加抗体依赖的细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等人(2002)JBC 277：26733)。在其他的应用上，可进行半乳糖基化的修饰作用以修改补体依赖的细胞毒性(CDC)。
在另外方面，本发明提供包括如文中所揭示的抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子及可药用的载剂的药物组合物。在相关的方面，本发明的特征为组合物，所述组合物是抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子和第二治疗剂的组合。在一实施方式中，此第二治疗剂为有利地与抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子组合的任何活性剂。可有利地与抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子组合的示例性活性剂详细讨论于文中的他处。
又在另一方面，本发明提供使用本发明的抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子靶向/杀死表达CD20的肿瘤细胞的治疗方法，其中该治疗方法包括将治疗上有效量的包含本发明的抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子的药物组合物施用于需要其的对象。
本发明亦包括本发明的抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子在制造用于治疗与CD20表达有关或由CD20所引起的疾病或病症的药物中的用途。
从确认详细说明的论述中，其他的实施方式将变得显而易见。
附图简述
图1显示在经皮下植入Raji肿瘤细胞和PBMC的混合物的NOD/SCID小鼠中，于肿瘤移植后及在肿瘤移植当天开始以人类Fc(hFc，实线)或CD3xCD20双特异性抗体(BS3/20-007，虚线)治疗后，随时间变化的肿瘤体积(以mm3表示)。
图2显示在经皮下植入Raji肿瘤细胞和PBMC的混合物的NOD/SCID小鼠中，于肿瘤移植后及在肿瘤移植后第7天开始以人类Fc(hFc，实线)或CD3xCD20双特异性抗体(BS3/20-007，虚线)治疗后，随时间变化的肿瘤体积(以mm3表示)。
图3显示以双特异性抗体BS3/20-001的三种不同剂量(0.01、0.1或1.0mg/kg)；低剂量抗-CD20对照抗体(对照V，0.01mg/kg)；或高剂量抗-CD20对照抗体(对照III(1.0mg/kg)治疗的食蟹猴血液样本中，随时间变化的B细胞数(x1000/μL)的作图。
图4显示以双特异性抗体BS3/20-001的三种不同剂量(0.01、0.1或1.0mg/kg)；低剂量抗-CD20对照抗体(对照V，0.01mg/kg)；或高剂量抗-CD20对照抗体(对照III(1.0mg/kg)治疗的食蟹猴血液样本中，随时间变化的T细胞数(x1000/μL)的作图。
图5A、5B、5C和5D分别显示以单次剂量的BS3/20-001(0.01、0.1或1.0mg/kg)、低剂量的抗-CD20对照抗体(0.01mg/kg对照V)或高剂量抗-CD20对照抗体(1.0mg/kg对照III)治疗的食蟹猴的IFN-γ、IL-2、IL-6和TNF-α的给药前和给药后的水平(pg/mL)。
图6显示在多个时间点从经0.01mg/kg对照V(抗-CD20抗体)；1.0mg/kg对照III(抗-CD20抗体)；及0.01mg/kg，0.1mg/kg和1.0mg/kg BS3/20-001(抗-CD3xCD20双特异性抗体)治疗的食蟹猴所采集的血液样本中测定的CD20表达谱(以表达的Log2倍性变化的方式来表示)。
图7显示经1.0mg/kg(空心三角形)，0.1mg/kg(空心正方形)或0.01mg/kg(空心菱形)的CD3xCD20双特异性抗体治疗的食蟹猴的血液样本中，随时间变化的CD3xCD20双特异性抗体(BS3/20-001)的总血清浓度(μg/mL)。
详细说明
在描述本发明之前，应了解，本发明不限于所述的特定方法和实验条件，因为此等方法和条件可改变。亦应了解，文中所用的术语仅作为描述特定实施方式的目的，且不希望受限，因为本发明的范围将仅受限于所附的权利要求。
除非另有说明，否则所有文中所用的技术和科学术语具有如本发明所属技术的一般技术者所正常理解的相同意义。如文中所用，术语「大约”当用于有关特定引述的数值时，指该值可从该引述值做不大于1％的变化。例如，如文中所用，表达法“约100”包括99和101及所有介于之间的值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在施行或试验本发明时可使用任何与文中所述的类似或相当的方法和物质，但优选的方法和物质为目前所描述。
定义
表达法“CD3”，如文中所用，指这样的抗原，其表达在与T细胞上作为多分子T细胞受体(TCR)的部分，且其由下列四条受体链中的二条的缔合所形成的同源二聚体或异源二聚体所组成：CD3-ε、CD3-δ、CD3-ζ及CD3-γ。人类CD3-ε包括如SEQ ID NO：1370所述的氨基酸序列；人类CD3-δ包括如SEQ ID NO：1371所述的氨基酸序列。除非明确地指出来自非人类物种，否则所有关于文中的蛋白、多肽和蛋白片段旨在指各蛋白、多肽和蛋白片段的人类形式。因此，除非明确地指出来自非人类物种，例如“小鼠CD3”、“猴子CD3”等，否则表达法“CD3”指人类CD3。
如文中所用，“与CD3结合的抗体”或“抗-CD3抗体”包括特异性识别单个CD3亚单元(例如B、δ、γ或ζ)的抗体及其抗原结合片段，以及特异性识别二个CD3亚单元的二聚体复合物(例如，γ/ε、δ/ε及ζ/ζCD3二聚体)的抗体及其抗原结合片段。本发明的抗体及抗原结合片段可与可溶性CD3及/或细胞表面表达的CD3结合。可溶性CD3包括天然的CD3蛋白以及重组的CD3蛋白变体，例如，缺乏跨膜结构域或不与细胞膜缔合的单体和二聚体CD3构建体。
如文中所用，表达法“细胞表面表达的CD3”，指一或多个CD3蛋白，其在体外或体内表达在细胞表面，使得至少一部分的CD3蛋白暴露于细胞膜的胞外侧且易接近抗体的抗原结合部分。“细胞表面表达的CD3”包括包含在细胞膜中的功能性T细胞受体环境内的CD3蛋白。表达法“细胞表面表达的CD3”包括表达为细胞表面上的同源二聚体或异源二聚体(例如，γ/ε、δ/ε及ζ/ζCD3二聚体)的部分的CD3蛋白。表达法“细胞表面表达的CD3”亦包括在细胞表面上自我表达的，无其他CD3链类型的CD3链(例如，CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ)。“细胞表面表达的CD3”可包括或由正常表达CD3蛋白的细胞的表面上表达的CD3蛋白所组成。备选地，“细胞表面表达的CD3”可包括或由在细胞表面上表达的CD3蛋白组成，所述细胞正常不会在其表面上表达人CD3但经人工工程化在其表面上表达CD3。
如文中所用，表达法“抗-CD3抗体”，包括带有单种特异性的单价抗体，以及包括结合CD3的第一臂及结合第二(目标)抗原的第二臂的双特异性抗体，其中抗-CD3臂包括如文中表1或表18/19中所列的任何HCVR/LCVR或CDR序列。抗-CD3双特异性抗体的实例描述于文中的他处。术语“抗原-结合分子”包括抗体和抗体的抗原结合片段，其包括，例如双特异性抗体。
术语“抗体”如文中所用，指包括至少一个与特定抗原(例如CD3)特异性结合或相互作用的互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括：包含四条多肽链，通过双硫键相连接的二条重(H)链和二条轻(L)链的免疫球蛋白分子以及其多聚体(例如IgM)。每条重链包括重链可变区(文中缩写为HCVR或VH)及重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包括轻链可变区(文中缩写为LCVR或VL)及轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域(CL1)。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更为保守性的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR所组成，以下列顺序由氨基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明不同的实施方式中，抗-CD3抗体(或其抗原结合部分)的FR可与人类种系序列相同，或经自然或人工修饰。氨基酸共有序列可以二或多个CDR的并排(side-by-side)分析为基准来定义。
术语“抗体”，如文中所用，亦包括全抗体分子的抗原结合片段。术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等等，如文中所用，包括任何与抗原特异性结合形成复合物的天然存在、可酶促获得、合成或基因工程化的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术，例如蛋白质水解消化作用或涉及编码抗体可变结构域和任选地恒定结构域的DNA的操作和表达的重组基因工程技术，衍生自例如全抗体分子。此DNA为已知的及/或可容易地从例如商业来源、DNA文库(包括，例如噬菌体-抗体文库)取得，或可合成。此DNA可用化学或通过使用分子生物技术来测序和操作，例如，以将一或多个可变及/或恒定结构域排列成适合的构型，或导入密码子，产生半胱氨酸残基、修饰、增添或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限定实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab′)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基所组成的最小识别单位(例如分离的互补决定区(CDR)，例如CDR3肽)或限制性FR3-CDR3-FR4肽。其他工程化的分子，例如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域删除的抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、双价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIP)及鲨可变IgNAR结构域，亦涵盖在文中所用的表达法“抗原结合片段”内。
抗体的抗原结合片段通常包括至少一个可变结构域。可变结构域可为任何大小或氨基酸组成且一般应包括至少一个CDR，所述CDR与一或多个框架序列相邻或符合其读框。在具有与VL结构域缔合的VH结构域的抗原结合片段中，VH和VL结构域可以任何适合的排列位于彼此相对处。例如可变区可为二聚化的并含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。备选地，抗体的抗原结合片段可含有单体VH或VL结构域。
在某些实施方式中，抗体的抗原结合片段可含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。在本发明的抗体的抗原结合片段内可发现的可变和恒定结构域的非限定、示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；及(xiv)VL-CL。在可变和恒定结构域的任何构型中，包括上列任何的示例性构型，可变和恒定结构域可直接彼此相连接或可通过完整或部分的绞链区或接头区相连。绞链区可由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸所组成，所述氨基酸导致在单个多肽分子中相邻的可变及/或恒定结构域间产生柔性和半柔性连结。再者，本发明的抗体的抗原结合片段可包括彼此及/或与一或多个单体VH或VL结构域非共价缔合(例如通过(一个或多个)双硫键)的任何上列的可变和恒定结构域构型的同源二聚体或异源二聚体(或其他多聚体)。
如同全抗体分子，抗原结合片段可为单特异性或多特异性(例如双特异性)。抗体的多特异性抗原结合片段通常应包括至少二个不同的可变结构域，其中各可变结构域能特异性地与单独的抗原或与相同抗原上不同的表位结合。任何多特异性抗体模式，包括文中所揭示的示例性双特异性抗体模示，可使用本领域中可取得的常规技术来改造，使其适用于本发明抗体的抗原结合片段的环境。
本发明的抗体可经由补体-依赖的细胞毒性(CDC)或抗体-依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)来作用。“补体-依赖的细胞毒性(cDC)”指在补体的存在下通过本发明的抗体裂解抗原表达细胞。“抗体-依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)”指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性细胞和巨噬细胞)识别目标细胞上的结合的抗体并据此导致目标细胞的裂解。CDC和ADCC可使用本领域所熟知和可取得的测定法来测量。(参见，例如美国专利第5,500,362号和第5,821,337号，及Clynes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：652-656)。抗体的恒定区对于抗体固定补体和介导细胞依赖的细胞毒性的能力很重要。因此，抗体的同种型可基于其是否对于抗体介导细胞毒性是理想的加以选择。
在本发明某些实施方式中，本发明的抗-CD3抗体(单特异性或双特异性)为人类抗体。术语“人类抗体”，如文中所用，旨在包括具有衍生自人类种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人类抗体可包括非由人类种系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基(例如通过随机或体外位置特异性诱变或通过体内体细胞突变所导入的突变)，例如在CDR中及特别是CDR3。然而，术语“人类抗体”，如文中所用，不旨在包括其中衍生自另外哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已移植在人类框架序列上的抗体。
本发明的抗体，在某些实施方式中可为重组的人类抗体。术语“重组的人类抗体”，如文中所用，旨在包括由重组方法所制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，例如使用转染至宿主细胞中的重组的表达载体(进一步详述于下)表达的抗体，从重组的、组合人类抗体文库(进一步详述于下)分离出的抗体，从人类免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离出的抗体(参见，例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或通过任何其他涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的方法所制备、表达、产生或分离的抗体。此等重组的人类抗体具有衍生自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方式中，此等重组的人类抗体经受体外诱变(或当使用人类Ig序列基因转基因的动物时，为体内体细胞诱变)，且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，当其衍生自人类种系VH和VL序列或与其有关时，可能非在体内天然存在于人类抗体种系库中。
人类抗体可以二种与绞链异质性有关的形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包括约150-160kDa的稳定的四链构建体，其中此二聚体通过链间重链双硫键聚集一起。在第二种形式中，二聚体并非经由链间双硫键相连接且形成约75-80kDa的分子，其由共价偶联的轻链和重链(半抗体)所组成。这些形式极难分离，即使在亲和纯化后。
在多种完整的IgG同种型中，第二种形式出现的频率因(但不限于)与抗体的绞链区同种型有关的结构差异所致。在人类IgG4绞链的绞链区中的单个氨基酸取代可显著地降低第二种形式出现(Angal等人(1993)Molecular Immunology 30：105)至通常使用人类IgG1绞链所观察到的程度。本发明涵盖在绞链、CH2或CH3区中具有一或多个突变的抗体，该突变例如在生产中可能为所希望的，用以提高期望的抗体形式的产率。
本发明的抗体可为分离的抗体。“分离的抗体”，如文中所用，指经鉴定及从其天然环境的至少一种组份分离及/或回收的抗体。例如，从生物体的至少一种组份，或从其中抗体天然存在或天然生产的组织或细胞分离或移出的抗体，就本发明的目的为“分离的抗体”。分离的抗体亦包括重组细胞内的原位抗体。分离的抗体为历经至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方式，分离的抗体可能实质上没有其他细胞物质及/或化学物。
本发明亦包括与CD3结合的单屑抗体。如文中所用，“单-臂抗体”指包括单个抗体重链和单个抗体轻链的抗原结合分子。本发明的单屑抗体可包括如文中表1或表18/19中所述的任何HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列。
相较于从其衍生抗体的对应的种系序列，文中所揭示的抗-CD3抗体可在重链和轻链可变结构域的框架及/或CDR区中包括一或多个氨基酸取代、插入及/或删除。此等突变可通过将文中所揭示的氨基酸序列与得自，例如公开的抗体序列数据库的种系序列相比较容易地确定。本发明包括由任何文中所揭示的氨基酸序列所衍生的抗体及其抗原结合片段，其中在一或多个框架及/或CDR区中的一或多个氨基酸突变成衍生出抗体的种系序列的对应残基，或另一种人类种系序列的对应残基，或对应种系残基的保守氨基酸取代(此等序列改变在文中共同称为“种系突变”)。本领域的一般技术者，由文中所揭示的重链和轻链可变区序列开始，可容易地制造许多包括一或多个个别的种系突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施方式中，VH及/或VL结构域内的所有框架及/或CDR残基突变回到衍生出此抗体的原始种系序列中所发现的残基。在其他实施方式中，仅某些残基突变回到原始的种系序列，例如仅在FR1的前8个氨基酸中或FR4的后8个氨基酸中发现的突变的残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变的残基。在其他的实施方式中，一或多个框架及/或CDR残基突变成不同种系序列的对应残基(亦即与原始衍生出抗体的种系序列不同的种系序列)。再者，本发明的抗体在框架及/或CDR区内可含有二或多个种系突变的任何组合，例如，其中某些个别残基突变成特定种系序列的对应残基，而与原始种系序列不同的某些其他残基维持原样或突变成不同种系序列的对应残基。一旦得到后，可容易地测试含有一或多个种系突变的抗体和抗原结合片段的一或多种所希望的性质，例如提高的结合特异性、增加的结合亲和力、提高的或增强的拮抗或激动生物性质(视情况而定)、降低的免疫原性等。以此通用方法所得的抗体和抗原结合片段涵盖在本发明中。
本发明亦包括抗-CD3抗体，其包含任何具有一或多个保守取代的文中所揭示的HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列的变体。例如，本发明包括抗-CD3抗体，其相对于文中表1所述的任何HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列，具有含例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少的保守性氨基酸取代的HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列。
术语“表位”指与抗体分子可变区中称为补位(paratope)的特异性抗原结合位置相互作用的抗原决定簇。单个抗原可具有一个以上的表位。因此，不同的抗体可与抗原的不同区域结合并可具有不同的生物效应。表位可为构象或线性的。构象表位由来自线性多肽链的不同区段的空间上并列的氨基酸所产生。线性表位由多肽链中相邻的氨基酸残基所产生。在某些情况下，表位可包括抗原上的糖、磷酰基或磺酰基部分。
术语“实质同一”或“实质上相同”当指核酸或其片段时，表示当以适当的核苷酸插入或删除与另一核酸(或其互补链)优化地比对时，以任何熟知的序列同一性算法，例如下文所论述的FASTA、BLAST或Gap来测量，有至少约95％，及更佳地至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基具有核苷酸序列同一性。与参照核酸分子具有实质同一性的核酸分子，在某些情况下，可编码与参照核酸分子所编码的多肽具有相同或实质上类似的氨基酸序列的多肽。
如应用于多肽，术语“实质类似”或“实质上类似”指二个肽序列，当例如以GAP或BESTFIT程序使用缺省空位权重优化比对时，享有至少95％序列同一性，甚佳地至少98％或99％序列同一性。优选地，不同的残基位置相差在保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”为其中氨基酸残基被带有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基)的另一氨基酸残基所取代。一般而言，保守性氨基酸取代实质上不会改变蛋白质的功能特性。在二或多个氨基酸序列因保守性取代而彼此不同的案例中，可调高百分比序列同一性或类似程度以修正此取代的保守性质。调整的方法已为熟习本领域者所熟知。参见，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331。具有类似化学性质的侧链的氨基酸的组的实例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸及苏氨酸；(3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香侧链：苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸及组氨酸；(6)酸性侧链：天门冬胺酸和谷氨酸，及(7)含硫侧链有半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代基群有：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天门冬胺酸及天冬酰胺-谷氨酰胺。另外，保守性置换为在Gonnet等人(1992)Science 256：1443-1445中所揭示的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“中度保守性”置换为在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
多肽的序列类似性，其亦指序列同一性，通常使用序列分析软件来测量。蛋白分析软件使用分配至多种取代、删除和其他修饰作用(包括保守性氨基酸取代)的类似度量值匹配类似的序列。例如，GCG软件含有例如Gap和Bestfit程序，其可以缺省参数使用以测定密切相关的多肽间，例如来自生物的不同物种的同源多肽，或野生型蛋白和其突变蛋白间的序列同源性或序列同一性。参见，例如GCG Version 6.1。多肽序列亦可使用FASTA比较，利用缺省或建议参数，一种GCG Version 6.1内的程序。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列和搜寻序列间最佳重迭区的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)见上文)。当本发明序列与含有较大量的来自不同生物体的序列的数据库作比较时，另一优选的算法为使用缺省参数的计算机程序BLAST，特别是BLASTP或TBLASTN。参见，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402。
双特异性抗原结合分子
本发明的抗体可为单特异性、双特异性或多特异性。多特异性抗体可对一目标多肽的不同的表位具有特异性或可含有对一个以上的目标多肽具有特异性的抗原结合结构域。参见，例如Tutt等人，1991，J.Immunol.147：60-69；Kufer等人，2004，TrendsBiotechnol.22：238-244。本发明的抗-CD3抗体可与另一个功能分子，例如另一肽或蛋白相连结或共表达。例如，抗体或其片段可与一或多个其他的分子部分，例如另一抗体或抗体片段功能性连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他)以产生带有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
文中使用表达法“抗-CD3抗体”旨在包括单特异性抗-CD3抗体以及包括CD3-结合臂及与目标抗原结合的第二臂的双特异性抗体。因此，本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一臂与人类CD3结合，而免疫球蛋白的另一臂对靶抗原具特异性。与CD3双特异性抗体的另一臂结合的靶抗原可为任何表达在细胞、组织、器官、微生物或病毒上或在其邻近地区的抗原，而针对抗此抗原的靶向免疫反应为希望的。CD3-结合臂可包括如表1或表18/19中所述的任何HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列。在某些实施方式中，CD3-结合臂与人类CD3结合并诱导人类T细胞增殖。
在其中抗体的一臂与CD3结合而另一臂与靶抗原结合的本发明的双特异性抗体的情况下，此靶抗原可为肿瘤相关的抗原。特异性肿瘤-相关抗原的非限定实例包括，例如AFP、ALK、BAGE蛋白、β-连环蛋白(β-catenin)、brc-abl、BRCA1、BORIS、cA9、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8(caspase-8)、CCR5、CD19、CD20、CD30、CD40、CDK4、CEA、CTLA4、细胞周期素-B1(cyclin-B1)、cYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白(例如GAGE-1、-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3)、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、LMP2、MAGE蛋白(例如MAGE-1、-2、-3、-4、-6及-12)、MART-1、间皮素(mesothelin)、ML-IAP、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NY-BRl、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、Steap-1、Steap-2、生存素(survivin)、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Tn、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶和uroplakin-3。
在其中抗体的一臂与CD3结合而另一臂与靶抗原结合的本发明的双特异性抗体的情况下，此靶抗原可为感染性疾病-相关的抗原。感染性疾病-相关的抗原的非限定实例包括，例如表达在病毒颗粒表面上，或优先表达在经病毒感染的细胞上的抗原，其中该病毒由下列组成的组中选出：HIV、肝炎(A、B或c)、疱疹病毒(例如HSV-1、HSV-2、cMV、HAV-6、VZV、埃-巴病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黄病毒、伊科病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞体病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、微小病毒、牛痘病毒、HTLV、登革热病毒、乳突病毒、软疣病毒、小儿麻痹病毒、狂犬病病毒、Jc病毒及虫媒病毒性脑炎病毒。备选地，靶抗原可为表达在细菌表面，或优先表达在经细菌感染的细胞上的抗原，其中该细菌由下列组成的组中选出：衣原体、立克次体、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、脑膜炎球菌、淋病球菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团菌、白喉菌、沙门氏菌、杆菌、霍乱菌、破伤风菌、肉毒杆菌、炭疽病菌、瘟疫菌、钩端螺旋体及莱姆病菌。在某些实施方式中，靶抗原可为表达在真菌表面，或优先表达在经真菌感染的细胞上的抗原，其中该真菌由下列组成的组中选出：念珠菌(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Crytococcus neoformans)、曲霉属真菌(Aspergillus)(烟曲霉菌(fumigatus)、黑曲霉菌(niger)等)、毛霉目(毛霉属(mucor)、犁头霉属(absidia)、根霉属(rhizopus)等)、申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、巴西副孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。在某些实施方式中，靶抗原可为表达在寄生虫表面，或优先表达在经寄生虫感染的细胞上的抗原，其中该寄生虫由下列组成的组中选出：痢疾阿米巴原虫(Entamoeba histolytica)、结肠小袋绦虫(Balantidium coli)、福氏耐格里变形虫(Naegleriafowleri)、棘阿米巴属物种(Acanthamoeba sp.)、梨型鞭毛虫(Giardia lambia)、隐孢子虫(Cryptosporidium sp.)、阴道毛滴虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、果氏巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、枯西氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、弓浆虫(Toxoplasma gondii)、巴西鼠钩虫(Nippostrongylus brasiliensis)、狐绦虫(Taenia crassiceps)及马来血丝虫(Brugiamalayi)。特异性病原-相关抗原的非限定实例包括，例如HIV gp120、HIV CD4、肝炎B糖蛋白L、肝炎B糖蛋白M、肝炎B糖蛋白S、肝炎c E1、肝炎c E2、肝细胞特异性蛋白、单纯疱疹病毒gB、巨细胞病毒gB及HTLV胞膜蛋白。
根据某些示例性实施方式，本发明包括特异性与CD3和CD20结合的双特异性抗原结合分子。此等分子在文中可称为，例如“抗-CD3/抗-CD20”或“抗-CD3xCD20”或“CD3xCD20”双特异性分子，或其他类似术语。
除非有指出来自非人类物种(例如“小鼠CD20”、“猴子CD20”等)，否则术语“CD20”如文中所用，指人类CD20蛋白。人类CD20蛋白具有如SEQ ID NO：1369中所示的氨基酸序列。
如文中所用表达法“抗原结合分子”指与特定抗原特异性结合的包括或由至少一个互补决定区(cDR)单独或与一或多个另外的CDR及/或框架区(FR)组合组成的蛋白、多肽或分子复合物。在某些实施方式中，抗原结合分子为抗体或抗体的片段，如该等术语于文中他处所定义。
如文中所用，表达法“双特异性抗原结合分子”指包括至少第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的蛋白、多肽或分子复合物。双特异性抗原结合分子内的各抗原结合结构域包括至少一个CDR，其单独或与一或多个另外的CDR及/或FR组合，与特定抗原特异性结合。在本发明的上下文中，第一抗原结合结构域与第一抗原(例如CD3)特异性结合，而第二抗原结合结构域与第二，不同的抗原(例如CD20)特异性结合。
在本发明某些示例性实施方式中，双特异性抗原结合分子为双特异性抗体。双特异性抗体的各抗原结合结构域包括重链可变结构域(HCVR)和轻链可变结构域(LCVR)。在包括第一和第二抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子(例如双特异性抗体)的背景中，第一抗原结合结构域的CDR可以前缀“A1”来定名，而第二抗原结合结构域的CDR可以前缀“A2”来定名。因此，第一抗原结合结构域的CDR在文中可称为A1-HCDR1、A1-HCDR2及A1-HCDR3；而第二抗原结合结构域的CDR在文中可称为A2-HCDR1、A2-HCDR2及A2-HCDR3。
第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可直接或间接彼此相连形成本发明的双特异性抗原结合分子。备选地，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可各自与单独的多聚体化结构域连接。一多聚体化结构域与另一多聚体化结构域的缔合帮助二个抗原结合结构域间的缔合，藉此形成双特异性抗原结合分子。如文中所用，“多聚体化结构域”为具有与相同或类似结构或组成的第二多聚体化结构域缔合的能力的任何大分子、蛋白、多肽、肽或氨基酸。例如，多聚体化结构域可为包括免疫球蛋白CH3结构域的多肽。多聚体化组份的非限定实例为免疫球蛋白的Fc部分(包括CH2-CH3结构域)，例如选自同种型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的IgG的F结构域区，以及各同种型群组内的任何同种异型。
本发明的双特异性抗原结合分子通常将包括二个多聚体化结构域，例如二个Fc结构域，其为单独的抗体重链的每个个别的部分。第一和第二多聚体化结构域可为相同的IgG同种型，例如IgG1/IgG1、IgG2/IgG2、IgG4/IgG4。备选地，第一和第二多聚体化结构域可为不同的IgG同种型，例如IgG1/IgG2、IgG1/IgG4、IgG2/IgG4等。
在某些实施方式中，此多聚体化结构域为Fc片段或含有至少一个半胱氨酸残基的1至约200个氨基酸长的氨基酸序列。在其他实施方式中，多聚体化结构域为半胱氨酸残基或含半胱氨酸残基的短肽。其他的多聚体化结构域包括含有或由亮氨酸拉链、螺旋-环基序或卷曲螺旋基序所组成的肽或多肽。
任何双特异性抗体模式或技术皆可用于制造本发明的双特异性抗原结合分子。例如，具有第一抗原结合特异性的抗体或其片段可功能性连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他)至一或多个其他分子实体，例如具有第二抗原结合特异性的另一抗体或其片段，以产生双特异性抗原结合分子。可用于本发明背景中的具体示例性双特异性模式包括(不限于)，例如基于scFv的或双抗体双特异性模式、IgG-scFv融合物、双可变结构域(DVD)-Ig、细胞杂交瘤(Quadroma)、结入孔(knobs-into-holes)、共同轻链(例如具有结入孔的共同轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性模式(参见，例如Klein等人2012，mAbs 4：6，1-11及文中所引述的参考文献，作为前述模式的综述)。
在本发明的双特异性抗原结合分子的背景下，相较于Fc结构域的野生型、天然存在的形式，多聚体化结构域，例如Fc结构域，可包括一或多个氨基酸变化(例如插入、删除或取代)。例如，本发明包括在Fc结构域中包含一或多个修饰的双特异性抗原结合分子，所述修饰造成在Fc和FcRn之间具有修饰的结合相互作用(例如促进或减少)的经修饰的Fc结构域。在一实施方式中，此双特异性抗原结合分子在CH2或CH3区中包括修饰，其中该修饰增加了酸性环境中(例如在其中pH范围从约5.5至约6.0的核内体中)Fc结构域对FcRn的亲和力。此等Fc修饰的非限定实例包括，例如在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或在位置428及/或433(例如L/R/S/P/Q或K)及/或434(例如H/F或Y)的修饰；或在位置250及/或428的修饰；或在位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一实施方式中，修饰包括428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；及307及/或308修饰(例如308F或308P)。
本发明亦包括包含第一Ig CH3结构域及第二Ig CH3结构域的双特异性抗原结合分子，其中第一和第二Ig CH3结构域至少有一个氨基酸互不相同，且相较于缺少此氨基酸差异的双特异性抗体，其中至少一个氨基酸差异降低了双特异性抗体与蛋白A的结合。在一实施方式中，第一Ig CH3结构域结合蛋白A而第二Ig CH3结构域含有降低或消除蛋白A结合的突变，例如H95R修饰(IMGT外显子编号；EU编号为H435R)。第二CH3可进一步包括Y96F修饰(IMGT；EU为Y436F)。在第二CH3中可发现的另外修饰包括：就IgG1抗体的情况为D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V821(IMGT；EU为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；就IgG2抗体的情况为N44S、K52N和V82I(IMGT；EU为N384S、K392N和V422I)；及就IgG4抗体的情况为Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT；EU为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在某些实施方式中，Fc结构域可为嵌合的，组合衍生自一个以上的免疫球蛋白同种型的Fc序列。例如，嵌合的Fc结构域可包括衍生自人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4CH2区的CH2序列的部分或全部，及衍生自人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4的CH3序列的部分或全部。嵌合的Fc结构域亦可含有嵌合的绞链区。例如，嵌合绞链可包括衍生自人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4绞链区的“上绞链”序列，与衍生自人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4绞链区的“下绞链”序列组合。可包括在文中所述的任何抗原-结合分子中的嵌合Fc结构域的特定实例，从N-至C-端包括：[IgG4CH1]-[IgG4上绞链]-[IgG2下绞链]-[IgG4CH2]-[IgG4CH3]。可包括在文中所述的任何抗原-结合分子中的嵌合Fc结构域的另一实例，从N-至C-端包括：[IgG1 CH1]-[IgG1上绞链]-[IgG2下绞链]-[IgG4CH2]-[IgG1CH3]。可包括在本发明的任何抗原-结合分子中的嵌合Fc结构域的此等及其他实例，描述于2013年2月1日申请的美国临时申请案第61/759,578号。具有这些通用结构排列的嵌合Fc结构域及其变体，可具有改变的Fc受体结合，其转而影响Fc效应子功能。
序列变体
相较于从其衍生个别的抗原结合结构域的对应的种系序列，本发明的抗体和双特异性抗原结合分子可在重链和轻链可变结构域的框架及/或CDR区中包括一或多个氨基酸取代、插入及/或删除。此等突变可通过将文中所揭示的氨基酸序列与得自，例如公开的抗体序列数据库的种系序列相比较容易地确定。本发明的抗原结合分子可包括由文中所揭示的任何示例氨基酸序列所衍生的抗原结合结构域，其中在一或多个框架及/或CDR区中的一或多个氨基酸突变成从其衍生抗体的种系序列的对应残基，或另一种人类种系序列的对应残基，或对应种系残基的保守氨基酸取代(此等序列改变在文中共同称为“种系突变”)。本领域的一般技术者，由文中所揭示的重链和轻链可变区序列开始，可容易地制造许多包括一或多个个别的种系突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施方式中，VH及/或VL结构域内的所有框架及/或CDR残基突变回到原始衍生出此抗体的原始种系序列中所发现的残基。在其他实施方式中，仅某些残基突变回到原始的种系序列，例如仅在FR1的前8个氨基酸中或FR4的后8个氨基酸中发现的突变的残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变的残基。在其他的实施方式中，一或多个框架及/或CDR残基突变成不同种系序列的对应残基(亦即与原始衍生出抗体的种系序列不同的种系序列)。再者，抗原结合结构域在框架及/或CDR区内可含有二或多个种系突变的任何组合，例如，其中某些个别残基突变成特定种系序列的对应残基，而与原始种系序列不同的某些其他残基维持原样或突变成不同种系序列的对应残基。一旦得到后，可容易地测试含有一或多个种系突变的抗原结合结构域的一或多种所希望的性质，例如提高的结合特异性、增加的结合亲和力、提高的或增强的拮抗或激动生物性质(视情况而定)、降低的免疫原性等。包含以此通用方法所得的一或多个抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子涵盖在本发明中。
本发明亦包括抗原结合分子，其中一或两个抗原结合结构域均包含具有一或多个保守取代的文中所揭示的任何HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列的变体。例如，本发明包括包含抗原结合结构域的抗原结合分子，所述抗原结合结构域具有相对于文中所揭示的任何HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列，带有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少的保守性氨基酸取代的HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列。“保守性氨基酸取代”为其中氨基酸残基被带有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基)的另一氨基酸残基所取代。一般而言，保守性氨基酸取代实质上并不会改变蛋白质的功能特性。具有类似化学性质的侧链的氨基酸基团实例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸及苏氨酸；(3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香侧链：苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸及组氨酸；(6)酸性侧链：天门冬胺酸和谷氨酸，及(7)含硫侧链有半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代基群有：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天门冬胺酸及天冬酰胺-谷氨酰胺。备选地，保守性置换为在Gonnet等人(1992)Science256：1443-1445所揭示的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“中度保守性”置换为在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
本发明亦包括包含抗原结合结构域的抗原结合分子，其中该抗原结合结构域带有与文中所揭示的任何HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列实质上相同的HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列。术语“实质同一”或“实质上相同”当指氨基酸序列时，表示当，例如以GAP或BESTFIT程序使用缺省空位权重优化比对时，二个氨基酸序列享有至少95％序列同一性，及甚佳地至少98％或99％序列同一性。优选地，不同的残基位置相差在保守性氨基酸取代。在二或多个氨基酸序列因保守性取代而彼此不同的案例中，可调高百分比序列同一性或类似程度以修正取代的保守性质。调整的方法已为熟习本领域者所熟知。参见，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331)。
多肽的序列类似性，其亦指序列同一性，通常使用序列分析软件来测量。蛋白分析软件使用分配至多种取代、删除和其他修饰作用(包括保守性氨基酸取代)的类似度量值匹配类似的序列。例如，GCG软件含有例如Gap和Bestfit程序，其可以缺省参数使用以测定密切相关的多肽间，例如来自生物的不同物种的同源多肽，或野生型蛋白和其突变蛋白间的序列同源性或序列同一性。参见，例如GCG Version 6.1。多肽序列亦可使用FASTA比较，利用缺省或建议参数，一种GCG Version 6.1内的程序。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列和搜寻序列间最佳重迭区的比对和序列同一性百分比(Pcarson(2000)见上文)。当本发明序列与含有较大量的来自不同生物体的序列的数据库作比较时，另一优选的算法为使用缺省参数的计算机程序BLAST，特别是BLASTP或TBLASTN。参见，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402。
pH-依赖结合
本发明包括具有pH-依赖结合特征的抗-CD3抗体和抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子。例如，本发明的抗-CD3抗体在酸性pH时，相较于中性pH，可能出现与CD3结合降低。另外，本发明的抗-CD3抗体在酸性pH时，相较于中性pH，可能出现与CD3结合增加。表达法“酸性pH”包括低于约6.2的pH值，例如约6.0、5.95、5，9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更低。如文中所用，表达法“中性pH”指约7.0至约7.4的pH。表达法“中性pH”包括约7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35及7.4的pH值。
在某些情况下，“相较于中性pH，在酸性pH时.....结合降低”表达为在酸性pH时抗体与其抗原结合的KD值和在中性pH时抗体与其抗原结合的KD值的比率(或反之亦然)。例如，就本发明的目的，若抗体或其抗原结合片段出现约3或更大的酸性/中性KD比率，抗体或其抗原结合片段可能被视为出现“相较于中性pH，在酸性pH时与CD3结合降低”。在某些示例性实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段的酸性/中性KD比率可为约3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0.25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更大。
具有pH-依赖结合特征的抗体可例如，通过相较于中性pH，在酸性pH时就与特定抗原的结合降低(或提高)，筛选抗体群体来取得。另外，氨基酸水平的抗原结合结构域的修饰可能产生具有pH-依赖结合特征的抗体。例如，通过将抗原结合结构域的一或多个氨基酸(例如在CDR内)以组氨酸残基取代，可得到相对于中性pH，在酸性pH时具有降低的抗原结合的抗体。
包括Fc变体的抗体
根据本发明某些实施方式，提供包括Fc结构域的抗-CD3抗体及抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，其中该Fc结构域包括一或多个增进或减少抗体与FcRn受体结合的突变，例如在酸性pH时，相较于中性pH。例如，本发明包括在Fc结构域的CH2或CH3区中包含突变的抗体，其中该突变增加Fc结构域在酸性环境(例如在其中pH范围从约5.5至约6.0的核内体中)与FcRn的亲和力。当施用于动物时，此等突变可使抗体的血清半寿期增加。此等Fc修饰的非限定实例包括，例如在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或位置428及/或433(例如，H/L/R/S/P/Q或K)及/或434(例如H/F或Y)的修饰；或位置250及/或428的修饰；或位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一实施方式中，此修饰包括428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；和307及/或308修饰(例如308F或308P)。
例如，本发明包括包含Fc结构域的抗-CD3抗体及抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，所述Fc结构域包含由下列组成的组中选出的一或多对或组突变：250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；以及433K和434F(例如H433K和N434F)。在文中所述的抗体可变结构域内所有可能的前述Fc结构域突变的组合，和其他突变涵盖在本发明的范围内。
抗体和双特异性抗原结合分子的生物特征
本发明包括与人类CD3结合及诱导T细胞增殖的抗体及其抗原结合片段。例如，本发明包括抗-CD3抗体，其当通过活体外T细胞增殖测定法，例如使用文中实例4所定义的分析模式(例如在抗-CD3抗体的存在下评估Jurkat细胞或人类PBMC的增殖)或实质上类似的分析测量时，以低于约0.33pM的EC50值诱导人类T细胞增殖。在某些实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段，当通过活体外T细胞增殖测定法，例如使用文中实例4所定义的分析模式或实质上类似的测定法测量时，以低于约0.32pM，低于约0.31pM，低于约0.30pM，低于约0.28pM，低于约0.26pM，低于约0.24pM，低于约0.22pM，或低于约0.20pM的EC50值诱导人类T细胞增殖(例如Jurkat细胞增殖及/或PBMC增殖)。
本发明亦包括与人类CD3结合及诱导T-细胞介导的肿瘤细胞杀伤的抗体及其抗原结合片段。例如，本发明包括抗-CD3抗体，其当以活体外T-细胞介导的肿瘤细胞杀伤分析，例如使用文中实例6所定义的分析模式(例如在抗-CD3抗体的存在下评估U937肿瘤细胞被人类PBMC杀伤的程度)或实质上类似的分析测量时，以低于约2.3pM的EC50值诱导T-细胞介导的肿瘤细胞杀伤。在某些实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段，当以活体外T-细胞介导的肿瘤细胞杀伤分析，例如使用文中实例6所定义的分析模式或实质上类似的分析测量时，以低于约2.3pM，低于约2.2pM，低于约2.1pM，低于约2.0pM，低于约1.8pM，低于约1.6pM，低于约1.4pM，低于约1.2pM，低于约1.0pM，低于约0.8pM，低于约0.6pM，或低于约0.5pM的EC50值诱导T-细胞介导的肿瘤细胞杀伤(例如PBMC-介导的U937细胞杀伤)。
本发明包括以高亲和力与人类CD3结合的抗体及其抗原结合片段。本发明亦包括以中或低亲和力与人类CD3结合的抗体及其抗原结合片段，依照治疗情况及所希望的特定靶向性质。例如，在其中一臂与CD3结合而另一臂与靶抗原(例如CD20)结合的双特异性抗原结合分子的情况中，可能希望靶抗原结合臂以高亲和力与靶抗原结合，同时抗-CD3臂仅以中度或低亲和力与CD3结合。以此方式，可达到抗原结合分子优先靶向表达靶抗原的细胞，同时避免一般/非靶向的CD3结合及后续与其有关的不良副作用。
根据某些实施方式，本发明包括，当以表面等离子共振，例如使用文中实例3所定义的分析模式所测定，以(例如于25℃)低于约15nM的KD与人类CD3结合的抗体及抗体的抗原结合片段。在某些实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段，如以表面等离子共振，例如使用文中实例3所定义的分析模式(例如mAb-捕捉或抗原-捕捉模式)或实质上类似的分析所测定，以低于约5nM，低于约2nM，低于约1nM，低于约800pM，低于约600pM，低于约500pM，低于约400pM，低于约300pM，低于约200pM，低于约180pM，低于约160pM，低于约140pM，低于约120pM，低于约100pM，低于约80pM，低于约60pM，低于约40pM，低于约20pM或低于约10pM的KD与CD3结合。
本发明亦包括，如以表面等离子共振于25℃或37℃，例如使用文中实例3所定义的分析模式或实质上类似的分析所测定，以大于约10分钟的解离半寿期(t1/2)与CD3结合的抗体及其抗原结合片段。在某些实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段，如以表面等离子共振于25℃或37℃，例如使用文中实例3所定义的分析模式(例如mAb-捕捉或抗原-捕捉模式)或实质上类似的分析所测定，以大于约20分钟，大于约30分钟，大于约40分钟，大于约50分钟，大于约60分钟，大于约70分钟，大于约80分钟，大于约90分钟，大于约100分钟，大于约200分钟，大于约300分钟，大于约400分钟，大于约500分钟，大于约600分钟，大于约700分钟，大于约800分钟，大于约900分钟，大于约1000分钟，或大于约1200分钟的t1/2与CD3结合。
本发明包括能同时与人类CD3和人类CD20结合的双特异性抗原结合分子(例如双特异性抗体)。根据某些实施方式，本发明的双特异性抗原结合分子与表达CD3及/或CD20的细胞特异性相互作用。双特异性抗原结合分子与表达CD3及/或CD20的细胞结合的程度可通过如文中实例8所说明的荧光活化的细胞分选(FACS)来评估。例如，本发明包括与表达CD3但不表达CD20的人类T细胞系(例如Jurkat)，表达CD20但不表达CD3的人类B细胞系(例如Raji)及/或灵长类T-细胞(例如食蟹猴外周血液单核细胞[PBMC])特异性结合的双特异性抗原结合分子。本发明包括，如使用实例8中所述的FACS分析或实质上类似分析所测定，以从约9.0x10-6至约2.0x10-9或更低的EC50值与任何前述细胞和细胞系结合的双特异性抗原结合分子。
本发明也包括以1.0pM和1000nM之间的EC50值结合表达CD3的人T细胞(例如Jurkat)的抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子以1nM和60nM之间的EC50值结合表达CD3的人T细胞。例如，本发明包括以约1pM、约10pM、约100pM、约500pM、约1nM、约2nM、约5nM、约10nM、约20nM、约30nM、约40nM、约50nM、约60nM、约70nM、约80nM、约90nM、约100nM、约200nM、约300nM、约500nM、约800nM、约1000nM或更高的EC50值结合表达CD3的人T细胞(例如Jurkat)的抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子。
本发明亦包括表现出一或多项由下列组成的组中选出的特征的抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子：(a)于体外诱导PBMC增殖(参见，例如文中实例9)；(b)在人类全血中活化T-细胞，诱导IFNγ释放及CD25上调(参见，例如文中实例10)；(c)在抗-CD20-抗性的细胞系上诱导T-细胞介导的细胞毒性(参见，例如文中实例11)；(d)诱导对人类B-细胞的细胞毒性(例如Raji；参见，例如实例13)；(e)在用人类免疫细胞重建的小鼠中去除B-细胞(例如CD19+B-细胞)(参见，例如文中实例14)；及(f)于小鼠异种移植物中减少B-细胞肿瘤体积(例如Raji肿瘤体积)(参见，例如实例15)。
本发明包括能去除对象中的B细胞的抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子(参见，例如实例16)。例如，根据某些实施方式，提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，其中将双特异性抗原结合分子单次施用于对象(例如以约0.1mg/kg、约0.08mg/kg、约0.06mg/kg、约0.04mg/kg、约0.04mg/kg、约0.02mg/kg、约0.01mg/kg或更低的剂量)，使此对象的B细胞数目下降(例如从此对象所采集的血液样本中)至可检测水平以下。在某些实施方式中，单次施用约0.1mg/kg剂量的抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，在将双特异性抗原结合分子施用于此对象后约第7天、约第6天、约第5天、约第4天、约第3天、约第2天、约第1天，使此对象的B胞数目下降至可检测水平以下。根据某些实施方式，单次施用约0.01mg/kg剂量的本发明抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，直到施用后至少约7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天或更多天，使B胞数目保持在可检测水平以下。如文中所用，表达法“可检测水平以下”指在从对象抽取的血液样本中，使用标准的B细胞检测分析，例如如文中实例16中所述的B细胞标志物的FACS分析，无法直接或间接检测到B细胞。
在相关的实施方式，提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，其中在施用约0.01mg/kg的单次剂量的抗原结合分子至对象后约第1天至约第28天，从对象抽出的每微升血液的B细胞数，比施用前由此对象抽出的每微升血液的B细胞数目低25％。在某些其他的实施方式中，提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，其中在施用约0.01mg/kg的单次剂量的抗原结合分子至对象后约第1天至约第56天，从对象抽出的每微升血液的B细胞数，比施用前由此对象抽出的每微升血液的B细胞数目低50％。
本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，当施用于对象时，其造成不超过一次短暂的T细胞降低。例如，提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，当以约0.01mg/kg的剂量施用于对象时，在施用后第1天造成T细胞数目下降，但其中每微升血液的T细胞数在之后的时间点回升(例如在施用后约第2天、第7天、第14天、第28天、第42天、第56或之后)。例如，本发明提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，其中在施用约0.01mg/kg剂量的抗原结合分子至对象后约第14天至约第56天，从该对象抽出的每微升血液的T细胞数目，等于或大于施用双特异性抗原结合分子之前由该对象抽出的每微升血液的T细胞数目。
表位作图及相关技术
在CD3上与本发明的抗原结合分子结合的表位可由CD3蛋白的3或多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多)氨基酸的单条连续序列所组成。备选地，表位可由CD3的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)所组成。本发明的抗体可与包含在单条CD3链(例如CD3-ε，CD3-δ或CD3-γ)内的氨基酸相互作用，或可与二或多条不同CD3链上的氨基酸相互作用。术语“表位”，如文中所用，指与抗体分子可变区中称为补位(paratope)的特异性抗原结合位置相互作用的抗原决定簇。单个抗原可具有一个以上的表位。因此，不同的抗体可与抗原上的不同区域结合并可具有不同的生物效应。表位可为构象或线性的。构象表位由来自线性多肽链的不同区段的空间上并列的氨基酸所产生。线性表位由多肽链中相邻的氨基酸残基所产生。在某些情况下，表位可包括抗原上的糖部分、磷酰基或磺酰基。
本领域的一般技术者已知的多种技术皆可用于测定抗体的抗原结合结构域是否与多肽或蛋白内的“一或多个氨基酸相互作用”。示例的技术包括，例如习用的交叉阻断分析，例如描述于Antibodies，Harlow and Lane(cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarb.，NY)中，丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke(2004)，Methods Mol Biol 248：443-463)及肽切割分析。此外，可使用例如表位切除、表位提取及抗原的化学修饰等方法(Tomer(2000)Protein Science9：487-496)。可用于鉴定多肽内与抗体的抗原结合结构域相互作用的氨基酸的另一种方法为通过质谱检测的氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法包括以氘标定目标蛋白，接着让抗体与氘标定的蛋白结合。接着，将蛋白/抗体复合物转置于水中，让除了受抗体保护的残基(其仍为氘标定)以外的所有残基发生氢-氘交换。解离抗体后，将目标蛋白以蛋白酶裂解并以质谱分析，藉此找出氘标定的残基，其对应于与抗体相互作用的具体氨基酸。参见，例如Ehring(1999)AnalyticalBiochemistry 267(2)：252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73：256A-265A。抗原/抗体复合物的X-光晶体学亦可用于表位作图的目的。
本发明进一步包括与文中所述的任何具体示例性抗体(例如，包括如文中表1所述的任何氨基酸序列的抗体)结合相同的表位的抗-CD3抗体。同样的，本发明亦包括与任何文中所述的具体示例性抗体(例如，包括如文中表1所述的任何氨基酸序列的抗体)竞争结合CD3的抗-CD3抗体。
本发明亦包括双特异性抗原结合分子，其包含特异性与人类CD3结合的第一抗原结合结构域，及特异性与人类CD20结合的第二抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域与任何文中所述的具体示例性CD3-特异性抗原结合结构域结合CD3上的相同表位，及/或其中第二抗原结合结构域与任何文中所述的具体示例性CD20-特异性抗原结合结构域结合CD20上的相同表位。
同样的，本发明亦包括双特异性抗原结合分子，其包含特异性与人类CD3结合的第一抗原结合结构域，及特异性与人类CD20结合的第二抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域与任何文中所述的具体示例性CD3-特异性抗原结合结构域竞争结合CD3，及/或其中第二抗原结合结构域与任何文中所述的具体示例性CD20-特异性抗原结合结构域竞争结合CD20。
通过使用本领域中已知的习用方法，可容易地测定特定的抗原结合分子(例如抗体)或其抗原结合结构域是否与本发明的参照抗原结合分子结合相同的表位，或竞争结合相同的表位。例如，为了测定测试抗体是否与本发明参照双特异性抗原结合分子结合CD3(或CD20)上相同的表位，首先允许参照双特异性分子与CD3蛋白(或CD20蛋白)结合。接着，评估测试抗体与CD3(或CD20)分子结合的能力。若测试抗体在与参照双特异性抗原结合分子饱和结合后，能与CD3(或CD20)结合，则可以得出结论，该测试抗体与参照双特异性抗原结合分子结合CD3(或CD20)的不同表位。另一方面，若测试抗体在与参照的双特异性抗原结合分子饱和结合后，不能与CD3(或CD20)分子结合，则测试抗体可能与和本发明的参照双特异性抗原结合分子结合的表位相同的CD3(或CD20)表位结合。然后可进行另外的常规实验(例如肽突变和结合分析)，以确定所观察到的缺乏测试抗体结合事实上是否由于与参照双特异性抗原结合分子结合相同的表位所致，或是否是立体阻断(或另外的现象)造成缺乏观察到的结合。此类实验可使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞仪或本领域中可取得的另外其他定量或定性抗体-结合测定法来进行。依照本发明某些实施方式，如在竞争性结合测定法中所测，若例如1-、5-、10-、20-或100-倍过量的一种抗原结合蛋白抑制另一抗原结合蛋白的结合至少50％，但优选地75％、90％或甚至99％，则二种抗原结合蛋白结合相同(或重迭)的表位(参见，例如Junghans等人，Cancer Res.199050：1495-1502)。备选地，若基本上降低或消除一种抗原结合蛋白的结合的抗原中所有的氨基酸突变，降低或消除另一种抗原结合蛋白的结合，则二种抗原结合蛋白被认为与相同的表位结合。若降低或消除一种抗原结合蛋白的结合的仅一亚群的氨基酸突变降低或消除另一种抗原结合蛋白的结合，则二种抗原结合蛋白被认为具有“重迭的表位”。
为了测定抗体或其抗原结合结构域是否与参照抗原结合分子竞争结合，以二个取向进行上述结合方法：在第一取向中，允许参照抗原结合分子在饱和的条件下与CD3蛋白(或CD20蛋白)结合，接着评估测试抗体与CD3(或CD20)分子的结合。在第二取向中，允许测试抗体在饱和的条件下与CD3(或CD20)分子结合，接着评估参照抗原结合分子与CD3(或CD20)分子的结合。若在二个取向中，仅有第一(饱和)抗原结合分子能与CD3(或CD20)分子结合，则得出结论测试抗体和参照抗原结合分子竞争结合CD3(或CD20)。本领域的一般技术者应了解，与参照抗原结合分子竞争结合的抗体可能不一定与参照抗体结合相同的表位，但可能通过与重迭或相邻的表位结合，在立体上阻断参照抗体的结合。
制备抗原结合结构域及构建双特异性分子
对特定抗原特异性的抗原结合结构域可通过任何本领域中已知的抗体生产技术来制备。一旦获得后，使用习用方法，对二种不同抗原(例如CD3和CD20)特异性的二种不同的抗原结合结构域可以相对彼此适合地排列，以产生本发明的双特异性抗原结合分子。(可用于构建本发明双特异性抗原结合分子的示例的双特异性抗体模式的论述提供于文中他处)。在某些实施方式中，本发明的多特异性抗原结合分子的一或多个个别组份(例如重链和轻链)衍生自嵌合、人源化或全人类抗体。制造此等抗体的方法已为本领域所熟知。例如，可使用VELOCIMMUNETM技术制备本发明的双特异性抗原结合分子的一或多条重链及/或轻链。使用VELOCIMMUNETM技术(或任何其他人类抗体产生技术)，起初先分离具有人类可变区和小鼠恒定区的对特定抗原(例如CD3或CD20)高亲和力的嵌合抗体。表征并就所希望的性质，包括亲和力、选择性、表位等选择抗体。以所希望的人类恒定区置换小鼠恒定区以产生全人类重链及/或轻链，所述重链及/或轻链可并入本发明的双特异性抗原结合分子中。
基因改造的动物可用于制造人类双特异性抗原结合分子。例如，可使用不能重排和表达内生性小鼠免疫球蛋白轻链可变序列的基因改造的小鼠，其中小鼠仅表达一或二个人类轻链可变结构域，所述人类轻链可变结构域由与在内生性小鼠κ基因座处的小鼠κ恒定基因有效连接的人类免疫球蛋白序列编码。此类基因改造的小鼠可用于生产包括二条不同重链的全人类双特异性抗原结合分子，所述二条不同重链与相同的轻链缔合，所述轻链包括衍生自二个不同人类轻链可变区基因片段之一的可变结构域。(参见，例如US 2011/0195454就此类改造的小鼠的详细论述及其生产双特异性抗原结合分子的用途)。
生物等价物
本发明涵盖具有与文中所揭示的示例分子不同的氨基酸序列但保留与CD3及/或CD20结合能力的氨基酸序列的抗原结合分子。此等变体分子，当与亲代序列相比较时，可包括一或多个氨基酸添加、删除或取代，但表现出与所述的双特异性抗原结合分子实质上等价的生物活性。
本发明包括与文中所述的任何示例性抗原结合分子生物等价的抗原结合分子。二种抗原结合蛋白或抗体被视为生物等价的，若例如其为以单次剂量或多次剂量，于类似的实验条件下以相同的摩尔剂量施用时，其吸收速率和程度并不显示显著差异的药物等价物或药物替代品。某些抗原结合分子将可视为等价物或药物替代品若其吸收程度相当但是吸收速率不相当，且仍可视为生物等价的，因为此等吸收速率上的差异为故意的并反映在标示上，对于达到例如长期使用的有效体药浓度并非必要的，且就研究的特定药物产品被视为医疗上不显著的。
在一实施方式中，二种抗原结合蛋白若在其安全性、纯度及效力上不具有临床上有意义的差异，则为生物等价的。
在一实施方式中，若相较于无此变更的持续治疗，患者可在参照产品和生物产品间作一或多次变更而无预期的不利效应风险增加(包括临床上显著的免疫原性改变或效用减低)，则二种抗原结合蛋白为生物等价的。
在一实施方式中，若二种抗原结合蛋白通过共同的机制或作用机制作用于症状或所用症状，而达到此等机制已知的程度，则二者为生物等价的。
生物等价性可通过体内和体外方法来验证。生物等价性测量包括，例如(a)人类或其他哺乳动物的体内测试，其中测量血液、血浆、血清或其他生物体液中抗体或其代谢物浓度作为时间的函数；(b)与人类体内生物可利用性数据相关联及可合理预测此数据的体外测试；(c)人类或其他哺乳动物的体内测试，其中测量抗体(或其目标)的适当急性药理效用作为时间的函数；及(d)建立抗原结合蛋白的安全性、效力或生物可利用性或生物等价性的良好对照的临床试验。
文中所述的示例性双特异性抗原结合分子的生物等价变体可通过，例如制造多种残基或序列的取代，或删除生物活性不需要的末端或内部残基或序列来构建。例如，生物活性不必要的半胱氨酸残基可删除或以其他的氨基酸置换，以防止复性时形成不必要或不正确的分子内双硫桥。在其他上下文中，生物等价的抗原结合蛋白可包括文中所述的示例性双特异性抗原结合分子的变体，其包含修饰分子的糖基化特征的氨基酸改变，例如消除或移除糖基化的突变。
物种选择性和物种交叉反应性
根据本发明某些实施方式，提供与人类CD3结合但不与其他物种CD3结合的抗原结合分子。亦提供与人类CD20结合但不与其他物种CD20结合的抗原结合分子。本发明亦包括与人类CD3及来自一或多种非人类物种的CD3结合的抗原结合分子；及/或与人类CD20及来自一或多种非人类物种的CD20结合的抗原结合分子。
根据本发明的某些示例性实施方式，提供与人类CD3及/或人类CD20结合，以及可或不可与(视情况而定)小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、食蟹猴、绒猴、恒河猴或黑猩猩CD3及/或CD20中的一或多种结合的抗原结合分子。例如，在本发明特定的示例性实施方式中，提供包括与人类CD3和食蟹猴CD3结合的第一抗原结合结构域，及特异性与人类CD20结合的第二抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子。
免疫缀合物
本发明涵盖与治疗部分，例如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素缀合的抗原结合分子(免疫缀合物)。细胞毒性剂包括任何对细胞有害的活性剂。用于形成免疫缀合物的适合的细胞毒性剂及化疗剂的实例已为本领域所知(参见，例如WO 05/103081)。
治疗制剂及给药
本发明提供包括本发明的抗原结合分子的药物组合物。本发明的药物组合物与适合的载剂、赋形剂和提供改善的转移、递送、耐受性等的其他活性剂配制。许多适合的制剂可参见所有医药化学家已知的处方集：Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Easton，PA。这些制剂包括，例如粉剂、糊膏、软膏、软冻、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(例如LIPOFECTINTM，Life Technologies，Carlsbad，CA)、DNA缀合物、无水吸收糊膏、水包油和油包水乳剂、乳剂聚乙二醇(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶及含聚乙二醇的半固体混合物。亦参见Powell等人″Compendium ofexcipients for parenteral formulations″PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。
施用于患者的抗原结合分子的剂量可取决于患者的年龄和体型大小、目标疾病、症状、给药路径及等。优选的剂量通常根据体重或体表面积来计算。当本发明的双特异性抗原结合分子用于成人患者的治疗目的时，有利地一般可以静脉施用约0.01至约20毫克/kg体重，更佳地约0.02至约7，约0.03至约5，或约0.05至约3毫克/kg体重的单次剂量的本发明的双特异性抗原结合分子。依照症状的严重度，治疗的频率和持续时间可调整。施用双特异性抗原结合分子的有效剂量和时间表可依经验来决定；例如可以通过周期评估来监看患者进步，并据此调整剂量。再者，剂量的物种间缩放可使用本领域熟知的方法来进行(例如Mordenti等人，1991，Pharmaceut.Res.8：1351、)。
多种递送系统已为所知并可用于施用本发明的药物组合物，例如封装于脂质体、微粒、微胶囊、能表达突变体病毒的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见，例如Wu等人(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432)。导入方法包括(但不限于)皮肤内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服路径。组合物可以任何方便的路径，例如通过输注或团注、通过经由上皮或黏膜层(例如口腔黏膜、直肠和肠黏膜等)吸收来给药，并可与其他生物活性剂共同施用。施用可为全身性或局部的。
本发明的药物组合物可以标准针或注射器由皮下或静脉内来递送。此外，就皮下递送而言，笔型递送装置可容易地用于递送本发明的药物组合物。此笔型递送装置可为重复使用型或一次性。可重复使用的笔型递送装置一般利用含有药物组合物的可更换筒。一旦筒内的所有药物组合物施用后而筒变空，此空筒可容易丢弃并更换新的含药物组合物的筒。然后此笔型递送装置便可再使用。在一次性笔型递送装置中无可置换的筒。取而代之的，一次性笔型递送装置预先填充收藏在装置内的储槽中的药物组合物。一旦药物组合物的储槽变空，整个装置便可丢弃。
许多可重复使用的笔型和自动注射递送装置可应用于皮下递送本发明的药物组合物。实例包括(但不限于)AUTOPENTM(Owen Mumford，Inc.，Woodstock，UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems，Bergdorf，Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.，Indianapolis，IN)、NOVOPENTM I、II及III(Novo Nordisk，Copenhagen，Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk，Copenhagen，Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)，OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM及OPTICLIKTM(sanofi-aventis，Frankfurt，Germany)，仅提出一些。用于皮下递送本发明药物组合物的一次性笔型递送装置的实例包括(但不限于)SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)及KWIKPENTM(Eli Lilly)、SUREcLICKTM自动注射器(Amgen，Thousand Oaks，CA)、PENLETTM(Haselmeier，Stuttgart，Germany)、EPIPEN(Dey，L.P.)及HUMIRATM笔(Abbott Labs，Abbott Park IL)，仅提出一些。
在某些情况下，药物组合物可以受控的释放系统来递送。在一实施方式中，可使用泵(参见Langer，见上文；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另一实施方式中，可使用聚合物质；参见MedicalApplications of Controlled Release，Langer和Wise(编辑)，1974，CRC Pres.，Boca Raton，Florida。又在另外的实施方式中，受控的释放系统可放置在组合物的靶附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见，例如Goodson，1984，于Medical Applications of Controlled Release，见上文，第2卷，第115-138页)。其他的受控释放系统论述于Langer，1990，Science 249：1527-1533的综述中。
可注射的制备物可包括用于静脉内、皮下、皮肤内及肌肉内注射、点滴输注等的剂型。这些可注射制备物可以公开已知的方法来制备。例如，可注射制备物可，例如通过将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于注射习用的无菌水性介质或油性介质中来制备。注射用的水性介质有，例如生理食盐水、含葡萄糖的等张溶液和其他佐剂等，其可与适合的增溶剂例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚乙二醇(50摩尔)加合物)]等组合使用。对于油性介质，可使用例如芝麻油、大豆油等，其可与增溶剂例如苯甲酸苯甲基酯、苯甲醇等组合使用。因此所制备的注射液优选地填充于适当的安瓿中。
有利地，将上述的口服或非经肠用途的药物组合物制备成适合活性成份剂量的单位剂型。此等单位剂量的剂型包括，例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。所含的前述抗体的量一般每单位剂量的剂型为约5至约500毫克；特别是注射形式，优选前述抗体含在约5至约100毫克中，而其他剂型为约10至约250毫克。
抗原结合分子的治疗用途
本发明包括这样的方法，所述方法包括对有需要的对象施用包含抗-CD3抗体或特异性与CD3和靶抗原(例如CD20)结合的双特异性抗原结合分子的治疗组合物。此治疗组合物可包括任何文中所揭示的抗体或双特异性抗原结合分子以及可药用的的载剂或稀释剂。如文中所用，表达法“有需要的对象”指表现出癌症的一或多种症状或症候的人类或非人类动物(例如表达肿瘤或患有任何下文所指的癌症的对象)，或另外可从抑制或降低CD20活性或去除CD20+B细胞而得利的对象。
本发明的抗体及双特异性抗原结合分子(及包括彼等的治疗组合物)可用于，除了其他外，治疗疾病或病症，其中刺激、活化及/或靶向免疫反应应为有利。特言之，本发明的抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子可用于治疗、预防及/或改善任何与CD20表达或活性或CD20+B细胞增殖有关或由其所介导的疾病或病症。达成本发明治疗方法的作用机制包括在效应子细胞的存在下杀死表达CD20的细胞，例如，通过CDC、细胞凋亡、ADCC、吞噬作用或通过这些机制中的二或多种的组合。可使用本发明的双特异性抗原结合分子抑制或杀死的表达CD20的细胞包括，例如致肿瘤细胞。
本发明的抗原结合分子可用于治疗，例如发生于脑及脑膜、口咽、肺及支气管树、胃肠道、男性和女性生殖道、肌肉、骨骼、皮肤和附器、结缔组织、脾、免疫系统、造血细胞和骨髓、肝及泌尿道和特定的感官器官例如眼睛的原生及/或转移肿瘤。在某些实施方式中，本发明的双特异性抗原结合分子可用于治疗下列癌症中的一或多种：肾细胞癌、胰脏癌、乳癌、头和颈癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、结肠直肠癌、胃癌(例如带有MET增幅的胃癌)、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、滑液肉瘤、甲状腺癌和黑色素瘤。根据某些示例性实施方式，本发明的双特异性抗原结合分子可用于治疗B细胞癌(例如霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤[NHL]、前体B细胞淋巴母细胞白血病/淋巴瘤、成熟B细胞肿瘤、B细胞慢性淋巴性白血病/小淋巴性淋巴瘤、B细胞前淋巴性白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区域B细胞淋巴瘤、毛状细胞白血病、弥漫性大型B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、移植后淋巴增生病症、华氏(Waldenstrom’s)巨球蛋白血症及间变性大细胞淋巴瘤)。
根据本发明某些实施方式，抗原结合分子可用于治疗患有B细胞淋巴瘤(例如NHL)的患者，所述B细胞淋巴瘤对单独的抗-CD20治疗具有抗性或反应不完全(例如对利妥昔单抗具有抗性)。根据本发明其他相关的实施方式，提供这样的方法，所述方法包括对患有抗-CD20疗法难治性B细胞淋巴瘤(例如NHL)的患者(例如，患有利妥昔单抗难治性肿瘤或患有复发或难治性B细胞淋巴瘤的患者)施用如本文公开的抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子。可以使用本领域已知的分析/诊断方法，诸如肿瘤扫描等，以确定患者是否具有对单独的抗-CD20疗法具有抗性，反应不完全，或难治的肿瘤。
本发明亦包括治疗对象中的残余癌的方法。如文中所用，术语“残余癌”指以抗癌疗法治疗后，在对象中存在或持续留有一或多个癌细胞。
根据某些方面，本发明提供治疗与CD20表达有关的疾病或病症(例如B细胞淋巴瘤)的方法，所述方法包括在对象已接受抗-CD20单一疗法后(例如在施用包括抗-CD20抗体，如利妥昔单抗的药物组合物后)，将一或多种文中他处所述的双特异性抗原结合分子施用于该对象。例如，本发明包括治疗B细胞淋巴瘤的方法，所述方法包括在对象已接受抗-CD20单一疗法(例如，利妥昔单抗治疗或其等价物治疗)后1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周、2个月、4个月、6个月、8个月、1年或更久，将抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子施用于该患者。在其他方面，最初在一个或多个时间点将包含IgG4Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子(抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子)施用于对象(例如，以提供B细胞的稳健的初始消除)，然后在随后的时间点施用包含不同IgG结构域，诸如IgG1Fc结构域的等价双特异性抗原结合分子。
组合治疗及制剂
本发明提供这样的方法，所述方法包括将包含文中所述的任何示例性抗体和双特异性抗原结合分子的药物组合物与一或多种另外的治疗剂组合施用。可与本发明的抗原结合分子组合或组合施用的示例性的另外的治疗剂包括，例如EGFR拮抗剂(例如抗-EGFR抗体[例如，西妥昔单抗(cetuximab)或帕尼单抗(panitumumab)]或EGFR的小分子抑制剂[例如，吉非替尼(gefitinib)或厄洛替尼(erlotinib)])，另一个EGFR家族成员例如Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4的拮抗剂(例如抗-ErbB2、抗-ErbB3或抗-ErbB4抗体或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性的小分子抑制剂)，EGFRvIII的拮抗剂(例如特异性与EGFRvIII结合的抗体)，cMET拮抗剂(例如抗-cMET抗体)，IGFIR拮抗剂(例如抗-IGF1R抗体)，B-raf抑制剂(例如威罗菲尼(vemurafenib)、索拉非尼(sorafenib)、GDC-0879、PLX-4720)，PDGFR-α抑制剂(例如抗-PDGFR-α抗体)，PDGFR-β抑制剂(例如抗-PDGFR-β抗体)，VEGF拮抗剂(例如VEGF-Trap，参见例如US 7,087,411(文中亦称为″VEGF-抑制融合蛋白″)、抗-VEGF抗体(例如贝伐单抗(bevacizumab))、VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)或帕唑帕尼(pazopanib))、DLL4拮抗剂(例如揭示于US 2009/0142354中的抗-DLL4抗体，如REGN421)、Ang2拮抗剂(例如揭示于US 2011/0027286中的抗-Ang2抗体，例如H1H685P)、FOLH1拮抗剂(例如抗-FOLH1抗体)、PRLR拮抗剂(例如抗-PRLR抗体)、STEAP1或STEAP2拮抗剂(例如抗-STEAP1抗体或抗-STEAP2抗体)、TMPRSS2拮抗剂(例如抗-TMPRSS2抗体)、MSLN拮抗剂(例如抗-MSLN抗体)、CA9拮抗剂(例如抗-CA9抗体)、uroplakin拮抗剂(例如抗-uroplakin抗体)、单价CD20拮抗剂(例如单价抗-CD20抗体如利妥昔单抗)等。可有利地与本发明的抗原结合分子组合施用的其他活性剂包括细胞因子抑制剂，其包括小分子细胞因子抑制剂和与细胞因子，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18或其各个受体结合的抗体。本发明的药物组合物(例如，包含如本文公开的抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子的药物组合物)也可以作为治疗方案的一部分施用，所述治疗方案包括一个或多个选自“ICE”的治疗组合：异环磷酰胺(ifosfamide)(例如，
Figure BDA0001892622750000511
)、卡铂(carboplatin)(例如，
Figure BDA0001892622750000512
)，依托泊苷(etoposide)(例如，
Figure BDA0001892622750000513
Figure BDA0001892622750000514
VP-16)；″DHAP″：地塞米松(dexamethasone)(例如，
Figure BDA0001892622750000515
)、阿糖孢苷(cytarabine)(例如，Cytosar-
Figure BDA0001892622750000516
胞嘧啶、阿拉伯糖苷、ara-C)，顺铂(例如，
Figure BDA0001892622750000517
-AQ)；和"ESHAP″：依托泊苷(例如，
Figure BDA0001892622750000518
VP-16)、甲基强的松龙(methylprednisolone)(例如，
Figure BDA0001892622750000519
)，高剂量阿糖孢苷、顺铂(例如，
Figure BDA00018926227500005110
-AQ)。
本发明亦包括包含文中所提及的任何抗原结合分子与VEGF、Ang2、DLL4、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFRvIII、cMet、IGF1R、B-raf、PDGFR-α、PDGFR-β、FOLH1、PRLR、STEAP1、STEAP2、TMPRSS2、MSLN、CA9、uroplakin或任何前述的细胞因子中的一或多种的抑制剂的治疗组合，其中抑制剂为适配体、反义分子、核糖酶、siRNA、肽体、纳米抗体或抗体片段(例如Fab片段；F(ab′)2片段；Fd片段；Fv片段；scFv；dAb片段；或其他改造的分子，例如二抗体、三抗体、四抗体、微小抗体和最效识别单元)。本发明的抗原结合分子亦可与抗病毒、抗生素、镇痛剂、皮质类固醇及/或NSAID组合施用及/或共同配制。本发明的抗原结合分子亦可作为治疗方案的一部分来施用，所述治疗方案也包括放射治疗及/或习用的化疗。
另外的治疗活性组分可在施用本发明的抗原结合分子之前、同时或之后不久施用(就本文公开内容的目的，此等施药方案被视为是抗原结合分子与另外的治疗活性组分的“组合”施用)。
本发明包括药物组合物，其中本发明的抗原结合分子与一或多种如文中他处所述的另外的治疗活性组分共同配制。
给药方案
根据本发明某些实施方式，可于定义的时程将多剂量的抗原结合分子(例如抗-CD3抗体或特异性与CD20和CD3结合的双特异性抗原结合分子)施用于对象。根据本发明此方面的方法包括顺序地将多次剂量的本发明抗原结合分子施用于对象。如文中所用，“顺序地施用”指各剂量的抗原结合分子于不同的时间点施用于该对象，例如以预计的间隔(例如小时、日、周或月)隔开的不同日。本发明包括这样的方法，所述方法包括对患者顺序地施用单次起始剂量的抗原结合分子，接着一或多次第二剂量的抗原结合分子，及任选地接着一或多个第三剂量的抗原结合分子。
术语“起始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”指施用本发明抗原结合分子的暂时顺序。因此，“起始剂量”为治疗方案开始时所施用的剂量(亦称为“基线”剂量)；“第二剂量”为在起始剂量之后所施用的剂量；而“第三剂量”为在第二剂量之后所施用的剂量。起始、第二和第三剂量皆可含有相同量的抗原结合分子，但就给药的频率而言，一般可彼此不同。在某些实施方式中，然而，包含在起始、第二及/或第三剂量中的抗原结合分子的量，在治疗期间互不相同(例如，若适当经上调或下调)。在某些实施方式中，在治疗方案开始时作为“承载剂量”施用二或多次(例如2、3、4或5次)剂量，接着以较低频率为基础，施用后续剂量(例如“维持剂量”)。
在本发明的一个示例性的实施方式中，各第二及/或第三剂量紧接前面剂量之后的1至26周(例如1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更久、)施用。术语“紧接前面剂量”，如文中所用，指在多重给药的顺序中，抗原结合分子的剂量，在下一次剂量给药之前以无插入剂量的顺序对患者施用。
根据本发明此方面的方法可包括将任何数目的第二及/或第三剂量的抗原结合分子(例如抗-CD3抗体或特异性与CD20和CD3结合的双特异性抗原结合分子)，施用于患者。例如，在某些实施方式中，仅将单次第二剂量施用于患者。在其他实施方式中，将二或多次(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第二剂量施用于患者。同样的，在某些实施方式中，仅将单次第三剂量施用于患者。在其他实施方式中，将二或多次(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第三剂量施用于患者。
在涉及多重第二剂量的实施方式中，各第二剂量可以与其他第二剂量相同的频率来施用。例如，各第二剂量可在紧接前面剂量后1至2周，施用于患者。相似的，在涉及多重第三剂量的实施方式中，各第三剂量可以与其他第三剂量相同的频率来给药。例如，各第三剂量可在紧接前面剂量后2至4周，施用于患者。备选地，施用于患者的第二及/或第三剂量的频率，在治疗方案期间可不同。在治疗期间，给药频率亦可依照个别患者的需求在临床检查后由医师做调整。
抗体的诊断用途
本发明的抗-CD3抗体亦可用于检测或测量样本中的CD3或CD3-表达细胞，例如供作诊断目的。例如抗-CD3抗体或其片段可用于诊断特征为CD3异常表达(例如过度表达，表达不足，无表达等)的症状或疾病。CD3的示例性诊断测定法可包括，例如将得自患者的样本与本发明的抗-CD3抗体接触，其中该抗-CD3抗体以可检测的标记或报告分子标定。备选地，未标定的抗-CD3抗体可与本身为可检测标定的第二抗体组合用于诊断用途。可检测标记或报告分子可为放射性同位素，例如3H、14C、32p、35S或125I；荧光或化学发光部分，例如荧光素异硫氰酸酯或罗丹明(rhodamine)；或酶例如碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶、辣根过氧化酶或荧光素酶(luciferase)。可用于检测或测量样本中CD3的具体示例性测定法包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射性免疫测定法(RIA)及荧光活化细胞分类(FACS)。根据本发明可用于CD3诊断测定法的样本包括含有可检测的CD3蛋白或其片段的由患者所得来的任何组织或液体样本，其在正常或病理条件下。一般而言，将测量得自健康患者(例如未患有与异常CD3水平或活性有关的疾病或症状的患者)的特定样本中CD3的水平以最初建立基线或标准的CD3水平。然后可将此CD3的基线水平与得自疑似患有CD3相关疾病或症状的个体的样本中所测量的CD3的水平作比较。
实施例
提出下列实例以提供本领域的一般技术者如何制造及使用本发明方法和组合物的完整揭示和说明，但不希望限制发明者所认为的发明范围。虽已尽力确保所用的相关数字(例如量、温度等)的正确性，但仍应考虑某些实验误差和偏差。除非另有指出，否则份数为重量的份数，分子量为平均分子量，温度以摄氏度数表示，而压力为或接近大气压。
实施例1.产生抗-CD3抗体
通过用表达CD3的细胞或用编码CD3的DNA免疫
Figure BDA0001892622750000541
小鼠(亦即，包括编码人类免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的DNA的改造的小鼠)得到抗-CD3抗体。通过CD3-特异性免疫测定法监测抗体免疫反应。当达到所希望的免疫反应时，收取脾脏细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合以保留其生存力及形成杂交瘤细胞系。筛选及选择杂交瘤细胞系用以鉴定产生CD3-特异性抗体的细胞系。使用此技术得到数种抗-CD3嵌合抗体(亦即，具有人类可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体)。此外，如US 2007/0280945A1中所述，直接从没有与骨髓瘤细胞融合的抗原阳性B细胞分离数种全人类抗-CD3抗体。
依照此实施例的方法所产生的示例性抗-CD3抗体的某些生物性质详述于下列所述的实施例中。
实施例2.重链和轻链可变区氨基酸和核酸序列
表1列出所选的本发明抗-CD3抗体的重链和轻链可变区及CDR的氨基酸序列标示符。对应的核酸序列标示符列于表2中。
表1：氨基酸序列标示符
Figure BDA0001892622750000551
Figure BDA0001892622750000561
Figure BDA0001892622750000571
表2：核酸序列标示符
Figure BDA0001892622750000572
Figure BDA0001892622750000581
Figure BDA0001892622750000591
在文中抗体通常根据下列命名法来指称：Fc前缀(例如“H1H”、“H1M”、“H2M”等)，接着为数字标识符(例如，如表1中所示的“2712”、“2692”等)，接着为“P”、“N”或“B“字尾。因此，根据此命名法，抗体在文中可称为，例如“H1H2712N”、“H1M2692N”、“H2M2689N”等。在用于文中的抗体命名上的H1H、H1M和H2M前缀指抗体特定的Fc区同种型。例如，“H1H”抗体具有人类IgG1 Fc，“H1M”抗体具有小鼠IgG1 Fc，“H2M”抗体具有小鼠IgG2Fc(所有的可变区为全人类的，如由抗体名称中的第一个“H”指出)。本领域的一般技术者应了解，具有特定Fc同种型的抗体可转变为具有不同Fc同种型的抗体(例如带有小鼠IgG1 Fc的抗体可转变为带有人类IgG4的抗体等)，但在任何情况下，可变结构域(包括CDR)-其以表1中所示的数字标示符所表示-仍保持不变，且预期结合性质为相同的或实质上类似的，无论Fc结构域的性质如何。
用于下列实施例中的对照构建体
多种对照构建体(抗-CD3抗体)包括在下列实验中，用于比较的目的：“OKT-3”，抗人T细胞表面抗原的小鼠单克隆抗体，可得自美国典型培养物收藏中心(ATCC)货号CRL-8001；及“SP34”，市售的小鼠单克隆抗体，得自加州圣地亚哥Biolegend公司(货号302914)，针对人类T淋巴细胞上的T3复合物的ε链有反应性。
实施例3.人类单克隆抗-CD3抗体的表面等离子共振衍生的结合亲和力和动力学常数
人类单克隆抗-CD3抗体的结合亲和力和动力学常数通过表面等离子共振于25℃使用抗体捕捉模式(表3、5和7)或抗原捕捉模式(表4、6和8)来测定。测量于T200Biacore仪器上进行。
在抗体捕捉模式中，将Biacore传感器表面以兔抗-小鼠Fc衍生用于杂交瘤捕捉(抗体前缀H1M或H2M)或以小鼠抗-人类Fc表面衍生用于人类IgG模式化的抗体(抗体前缀H1H)衍生化。将带有人类Fc标签(hFcΔAdp/hFc；SEQ ID NO：1372/1373)或小鼠Fc标签(mFcΔAdp/mFc；SEQ ID NO：1374/1375)的可溶性异源二聚体CD3蛋白(hCD3-ε/hCD3-δ；SEQ IDNO：1370/1371)注射于捕捉有抗体的表面上并记录结合反应。异源二聚体CD3蛋白使用Davis等人(US2010/0331527)中所述的方法来纯化。
在抗原捕捉模式中，异源二聚体CD3使用兔抗-小鼠Fc或小鼠抗-人类Fc来捕捉，并将各个抗体注射于捕捉的抗原上。
抗体以其习用的二价模式(表3至6)或以单价1-臂构型(表7和8)来分析，其中将来自抗体的第二Fab移除并仅表达Fc部分(cH2-CH3)。
动力学缔合(ka)和解离(kd)速率常数通过处理并使用Scrubber 2.0曲线拟合软件将数据拟合至1∶1结合模型来测定。结合解离平衡常数(KD)和解离半寿期(t1/2)由动力学速率常数如下所计算：KD(M)＝ka/ka；及t1/2(min)＝(ln2/(60＊kd)。NT＝未测试；NB＝未观察到结合。
表3：杂交瘤mAb(H1M和H2M)的Biacore结合亲和力
Figure BDA0001892622750000611
Figure BDA0001892622750000621
表4：杂交瘤mAb(H1M和H2M)的Biacore结合亲和力
Figure BDA0001892622750000622
Figure BDA0001892622750000631
表5：人类Fc mAb(H1H)的Biacore结合亲和力
Figure BDA0001892622750000632
Figure BDA0001892622750000641
表6：人类Fc mAb(H1H)的Biacore结合亲和力
Figure BDA0001892622750000642
Figure BDA0001892622750000651
表7：单价1-臂mAb的Biacore结合亲和力
Figure BDA0001892622750000661
表8：单价1-臂mAb的Biacore结合亲和力
Figure BDA0001892622750000662
Figure BDA0001892622750000671
如表3-8所示，数种本发明的抗-CD3抗体，在抗体捕捉或抗原捕捉模式中，以高亲力与CD3结合。
实施例4.抗-CD3抗体结合及增殖人类T-细胞
测试本发明的抗-CD3抗体的与人类T细胞结合并诱导其增殖的能力。使用Jurkat细胞(CD3+人类T-细胞系)评估结合，而外周血液单核细胞(PBMC)的增殖使用ATP催化的定量(cellTiter
Figure BDA0001892622750000672
)来评估。抗-CD3抗体OKT3作为阳性对照而不相关的同种型匹配的抗体作为阴性对照。
使用下列方法得到FACS数据：将每孔2x105个的细胞与系列稀释的抗体于冰上孵育30分钟。孵育后，清洗细胞并加入二级抗体及再孵育30分钟。孵育后，清洗细胞、重悬于含1％BSA的冷的PBS中并通过流式细胞术，以通过侧向和前向散射受门控的活Jurkat细胞来分析。细胞结合效价的EC50使用Prism软件以使用4-参数非线性回归分析所计算的值来测定。
使用下列方法得到增殖数据：将人类PBMC(5x104/孔)与3倍系列稀释的抗-CD3抗体及固定浓度的市售抗-CD28抗体(200ng/ml)于96孔盘中以37℃孵育72h。孵育后，加入CellTiter
Figure BDA0001892622750000681
并使用VICTOR X5多标签平板阅读仪(PerkinElmer)测量发光。使用GraphPad Prism中的4-参数非线性回归分析计算细胞活力的EC50(ATP催化的定量)。
结合及增殖实验的结果汇总于表9-11中。
表9：杂交瘤抗-CD3 mAb结合&增殖人类T细胞
Figure BDA0001892622750000682
Figure BDA0001892622750000691
NB：无结合；NT：未测试
表10：人类Fc抗-CD3 mAb结合&增殖人类T细胞
Figure BDA0001892622750000692
Figure BDA0001892622750000701
NB：无结合；NT：未测试
表11：单价1-臂抗-CD3 mAb结合&增殖人类T细胞
Figure BDA0001892622750000702
Figure BDA0001892622750000711
NB：无结合；NT：未测试
如表7-9所示，大量主要的本发明抗-CD3抗体与人类细胞结合并诱导T细胞增殖。
实施例5.抗-CD3抗体结合&增殖猴T细胞
测试本发明的抗-CD3抗体的亚群的结合及诱导猴T细胞增殖的能力。
使用下列方法得到FACS数据：将每孔2x105个的细胞与系列稀释的抗体于冰上孵育30分钟。孵育后，清洗细胞并加入二级抗体及再孵育30分钟。孵育后，清洗细胞、重悬于含1％BSA的冷的PBS中并通过流式细胞术分析。通过侧向和前向散射门控CD4+猴T细胞，及对CD2+CD4+CD20-群体进行门控。细胞结合效价的EC50使用GraphPad Prism中的4-参数非线性回归分析计算。
使用下列方法得到增殖数据：将新鲜分离出的食蟹猴来源的PBMC(5x104/孔)与3倍系列稀释的抗-CD3抗体及固定浓度的市售抗-CD28抗体(500ng/ml)于96孔盘中以37℃孵育72h。孵育后，加入CellTiter
Figure BDA0001892622750000713
并使用VICTOR X5多标签平板阅读仪(PerkinElmer)测量发光。使用GraphPad Prism中的4-参数非线性回归分析计算细胞活力的EC50(ATP催化的定量)。
结合及增殖实验的结果汇总于表12和13中。
表12：抗-CD3 mAb结合&增殖猴PBMc
Figure BDA0001892622750000712
Figure BDA0001892622750000721
NB：无结合；NT：未测试
表13：单价1-臂抗-CD3 mAb结合&增殖猴PBMc
Figure BDA0001892622750000722
Figure BDA0001892622750000731
NB：无结合；NT：未测试
如表12和13所示，数种本发明的抗-CD3抗体与CD2+CD4+猴T细胞结合并诱导其增殖。OKT3不会驱使猴PBMC增殖，而SP34针对猴PBMC有活性。
实施例6.抗-CD3 mAb支持T-细胞介导的肿瘤细胞杀伤
使用基于钙黄绿素(calcein)的U937杀伤测定法来研究抗-CD3抗体的经由Fc/FcR相互作用重新引导(redirect)T细胞介导的杀伤的能力。简言之，在Ficoll-Paque上分离人类PBMC并于数天的期间以含人类IL-2(30U/ml)和T细胞活化珠(抗-CD3/CD28)的培养基活化。以钙黄绿素标定U937细胞，及然后与活化的T细胞以10：1效应子：标靶比率使用3倍系列稀释的抗体于3小时的期间在37℃孵育。孵育后，将板离心并将上清液转置于半透明黑色清洁底板中，进行荧光分析。使.用GraphPad Prism中的4-参数非线性回归分析计算定义为诱导50％细胞毒性的CD3抗体的摩尔浓度的EC50。使用杂交瘤抗体、人类Fc抗体和单价一臂抗体的结果分别如表14、15和16所示。
表14：杂交瘤抗-CD3 mAb重新引导T-细胞杀伤U937细胞
Figure BDA0001892622750000732
Figure BDA0001892622750000741
NT：未测试
表15：人类Fc模式化的抗-CD3 mAb重新引导T-细胞杀伤U937细胞
Figure BDA0001892622750000742
Figure BDA0001892622750000751
NT：未测试
表16：单价1-臂抗-CD3 mAb重新引导T-细胞杀伤U937细胞
Figure BDA0001892622750000752
Figure BDA0001892622750000761
NT：未测试
如表14-16中所示，在此测定法系统中，大多数抗-CD3抗体，以及OKT3，支持重新引导的T细胞介导的杀伤。所观察到的杀伤(认为是依赖于抗体的Fc与U937细胞上的Fc受体接合，导致CD3在邻近的T细胞上聚簇)通过加入非特异性人类IgG消除(数据未显示)。
实施例7.产生与CD3和CD20结合的双特异性抗体
使用标准方法构建包括抗-CD3-特异性结合结构域和抗-CD20-特异性结合结构域的双特异性抗体，其中将来自抗-CD3抗体的重链和轻链与来自抗-CD20抗体的重链组合。用于构建此实施例的双特异性抗体的抗-CD3抗体通过用表达CD3的细胞或用编码CD3的DNA免疫
Figure BDA0001892622750000762
小鼠得到，或在BS3/20-007和-009的情况中，来自已知的抗-CD3抗体(亦即，如WO2004/106380中所述的抗-CD3抗体"L2K")。用于构建此实施例的双特异性抗体的抗-CD20抗体如US 7,879,984中所述。
依照本实施例所制造的双特异性抗体包括二个单独的抗原结合结构域(亦即结合臂)。第一抗原结合结构域包括与衍生自抗-CD3抗体的轻链可变区(″CD3-VL″)配对的衍生自抗-CD20抗体的重链可变区(″CD20-VH")。CD20-VH/CD3-VL配对产生特异性识别CD20的抗原结合结构域。第二抗原结合结构域包括与衍生自抗-CD3抗体的轻链可变区(″CD3-VL″)配对的衍生自抗-CD3抗体的重链可变区(″CD3-VH″)。CD3-VH/CD3-VL配对产生特异性识别CD3的抗原结合结构域。在本实施例中所制造的所有双特异性抗体使用相同的CD20-VH并称为″CD20-VH-A"(BS3/20-009除外，其使用称为″CD20-VH-B″的不同的CD20-VH)。然而，在下列实施例的不同的双特异性抗体中，使用数种不同的CD3-VH和CD3-VL组份(称为″CD3-VH-A、CD3-VH-B等，及CD3-VL-A、CD3-VL-B等，衍生自不同的抗-CD3抗体)。
依照此实施例所制造的多种双特异性抗体的抗原结合结构域的组分部分的总结列于表17中。
表17
Figure BDA0001892622750000771
#CD3-VH-F和CD3-VL-F的重链和轻链可变区衍生自称为″L2K"的抗-CD3抗体，如WO2004/106380中所述。
＊包括CD20-VH-B/CD3-VL-F配对的BS3/20-009的抗-CD20臂为非功能性的；亦即其不与CD20结合。然而，抗-CD3臂(包括CD3-VH-F/CD3-VL-F配对)特异性与CD3结合。因此，BS3/20-009保留此实施例中所产生的其他双特异性分子的相同的一般“双特异性”结构，但其仅与CD3结合。
表18和19列出此实施的例双特异性抗体的多种重链可变区(表18)和轻链可变区(表19)及其对应的CDR的氨基酸序列标识符。
表18(重链可变区氨基酸序列)
Figure BDA0001892622750000781
表19(轻链可变区氨基酸序列)
Figure BDA0001892622750000782
此外，表20和21列出编码此实施例的双特异性抗体的重链可变区(表20)和轻链可变区(表21)及其对应的CDR的核苷酸序列的序列标识符。
表20(编码重链可变区序列的核苷酸序列)
Figure BDA0001892622750000783
表21(编码轻链可变区序列的核苷酸序列)
Figure BDA0001892622750000791
除了上述的双特异性抗体外，下列对照抗体亦用于下列实施例中所示出的某些实验中：
对照I：针对人类T-细胞表面抗原的单克隆抗体"OKT-3″，如US 4,361,549中所示出并可得自杂交瘤CRL-8001(American Type culture Collection，Manassas，VA)。
对照II：针对人T淋巴细胞上的T3复合物的ε链有反应性的抗体″SP34″，可得自BDPharmagen公司，货号#55052。
对照III：抗-CD20治疗性抗体，带有Rituxan(利妥昔单抗)的重链和轻链序列，如US 5,736,137中所公开。
对照IV：单克隆抗-CD20抗体，称为″3B9-10″，如US 7,879,984中所揭示，并且文中所示为包括SEQ ID NO：1242/1346的HCVR/LCVR氨基酸序列对和SEQ ID NO：1244-1246-1248-1348-1350-1352的HCDR1-HcDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列的抗体。
对照V：单克隆抗-CD20抗体，称为″10F2-13″，如US 7,879,984中所揭示，并且文中所示为包括SEQ ID NO：1354/1362的HCVR/LCVR氨基酸序列对及SEQ ID NO：1356-1358-1360-1364-1366-1368的HcDR1-HcDR2-HcDR3-LCDR1-LcDR2-LcDR3氨基酸序列的抗体。
实施例8.CD20xCD3双特异性抗体选择性与Jurkat、Raji和猴T-细胞结合
CD20x CD3双特异性抗体及对照构建体，如实施例1所述，经由FACS测试其与Jurkat(CD3+、CD20-人类T-细胞系)、Raji(CD3-、CD20+人类B细胞系)或食蟹猴PBMC(″mkT细胞″)结合的能力。
使用下列方法得到FACS数据：将每孔2x105个细胞与系列稀释的抗体于冰上孵育30分钟。孵育后，清洗细胞并加入适当的二级抗体(Jurkat，RAJI细胞)或二级抗体混合液(用于食蟹猴PBMC)并再孵育30分钟。孵育后，清洗细胞、重悬浮于含1％BSA的冷的PBS中并通过流式细胞术于BD FACS Canto II上分析。Jurkat和Raji细胞通过侧向和前向散射门控，而食蟹猴T细胞亦在CD2+CD4+群体中门控。使用Prism软件以使用4-参数非线性回归分析所计算的值来测定细胞结合效价的EC50。结果如表22所示。
表22.CD3xCD20双特异性抗体的EC50结合值(摩尔)
抗体 FAGS-Jurkat FAGS-RAJI FAGS-mkT细胞
对照I(抗-CD3) 1.96E-10 NB NB
对照II(抗-CD3) (+) NB 7.03E-11
对照IV(抗-CD20) 无结合 (+) NB
BS3/20-001 3.85E-08 5.99E-08 8.74E-06
BS3/20-002 5.62E-08 1.15E-08 NT
BS3/20-003 5.67E-08 9.24E-08 2.48E-08
BS3/20-004 4.89E-08 1.02E-08 NT
BS3/20-005 1.95E-09 8.17E-08 NT
(+)EC50未测定，但观察到结合；NB无结合；NT未测试
如表22所示，取决于其特异性，测试的抗体组显示对多种细胞系的结合亲和力的范围。双特异性抗体(BS3/20-001、-002、-003、-004和-005)显示与二种人类靶谱系结合的能力。抗体的亚群亦显示与食蟹猴细胞结合的能力(对照II、BS3/20-001和BS3/20-003)。抗-CD3对照I(OKT3)、抗-CD3对照II(SP34)及抗-CD20对照IV分别与Jurkat、食蟹猴T细胞及RAJI结合。
实施例9.体外CD20x CD3双特异性抗体诱导PBMC增殖
选择的CD20x CD3双特异性抗体及对照构建体刺激外周血液单核细胞(PBMC)及诱导增殖的能力使用ATP催化的定量(CellTiter
Figure BDA0001892622750000811
)来评估。PBMC的活化造成细胞因子释放，其驱动细胞增殖。
使用下列方法得到增殖数据：将人类或食蟹猴来源的PBMC(5x105/孔)与3-倍系列稀释的抗-CD3xCD20或对照抗体于96孔板中以37℃孵育72h。孵育后，加入CellTiter
Figure BDA0001892622750000812
并使用VICTOR X5多标签平板阅读仪(PerkinElmer)测量发光。使用Prism软件测定细胞活力的EC50(ATP催化的定量)。数值使用4-参数非线性回归分析所计算并如表23所示。
表23.由抗-CD20x CD3双特异性抗体诱导的人类和食蟹猴PBMC增殖的EC50
抗体 人PBMC增殖EC<sub>50</sub>[M] 食蟹猴PBMC增殖EC<sub>50</sub>[M]
对照I 3.30E-13 NA
对照II 8.93E-12 1.71E-12
BS3/20-001 1.08E-11<sup>＊</sup> 4.02E-11<sup>＊</sup>
BS3/20-002 8.59E-12<sup>＊</sup> 2.60E-11<sup>＊</sup>
BS3/20-003 9.55E-12<sup>＊</sup> 2.78E-11<sup>＊</sup>
BS3/20-004 1.45E-12<sup>＊</sup> NT
BS3/20-005 1.05E-12<sup>＊</sup> NT
(＊)数据为3或更多次的独立测定的中位值。无(＊)数据为1或2次独立测定的代表/平均值。NA＝无活性；NT＝未测试。
如表23所示，本发明的全部CD20x CD3双特异性抗体皆为人类或食蟹猴PBMC的活化剂。一般而言，抗-CD3单特异性二价亲代抗体(对照I和II)比双特异性对应物效力大2-10倍。对照I(OKT3)无法驱动猴PBMC增殖，而对照II(SP34)针对人类和猴PBMC均具有活性。
实施例10.在人类全血中，CD20x CD3双特异性抗体活化T-细胞并诱导IFNγ释放及CD25上调
测试所选择的CD20x CD3双特异性抗体在人类全血中活化T细胞的能力。T细胞活化的程度通过测量干扰素-γ(IFNγ)分泌以及CD8+T细胞上的CD25的上调来测定。
干扰素-γ(IFNγ)分泌通过将肝素化的全血与5-倍系列稀释的双特异性抗体混合，于96-孔板中来定量。20小时后，将板离心5分钟并移除血浆用于ELISA分析，以测定IFNγ水平。将推断的IFNγ浓度对抗体浓度作图，并使用Prism软件使用4-参数非线性回归分析计算EC50值。
对于CD8+T-细胞上的CD25表达分析，在与抗体孵育和移除血浆后，将150μl的血转置于深孔板并以1.5mL RBC裂解缓冲液裂解15分钟。清洗细胞二次，于室温用hFcR阻断试剂阻断10分钟，并然后于4℃与直接与CD2、CD19、CD4、CD8和CD25缀合的抗体孵育30min。接着，清洗细胞二次，之后以FACSCanto细胞仪及FlowJo软件分析。
将表达活化标记物CD25的CD2+CD8+T细胞的百分比对抗体浓度作图，并使用Prism软件使用4-参数非线性回归分析计算EC50值。结果如表24所示。
表24：全血中双特异性抗体介导的CD25上调及IFNγ产生的EC50
双特异性抗体 CD25上调的EC<sub>50</sub>[M] IFNY生产的EC<sub>50</sub>[M] 最大IFNY(pg/mL)
BS3/20-001 1.3E-10 3.9E-10 1815
BS3/20-003 1.7E-10 5.7E-10 1693
BS3/20-004 2.9E-10 2.3E-09 5810
至少3次独立实验的中位数值(BS3/20-003的IFN-γ表达除外，其为n＝2)
如表24所示，全血中CD20x CD3双特异性抗体介导CD8+T细胞上的CD25上调的EC50值范围从130-290pM，而IFNγ的对应的EC50值稍高，范围从390pM至2nM。如EC50所测定的，在介导CD25上调和IFN γ产生上，BS3/20-004比BS3/20-001和BS3/20-003效力稍低，然而，在全血培养物中BS3/20-004可诱导较高水平的IFNγ。
实施例11.CD20x CD3双特异性抗体对利妥昔单抗抗性细胞系诱导T细胞介导的细胞毒性
所选的CD20x CD3双特异性抗体及对照构建体介导补体依赖的细胞毒性(CDC)及T细胞介导的细胞毒性的能力使用亲代Raji细胞及Raji SCID系来评估。后者(Raji SCID系)衍生自单个的抗-CD20抗性肿瘤，其由皮下注射Raji细胞的免疫缺陷小鼠在以抗-CD20mAb利妥昔单抗治疗后所分离。在此实施例中使用四种细胞株(Raji SCID 1-4)。
Raji细胞系上CD20和补体抑制分子CD55及CD59的表达通过FACS来测定。简言之，将1x106细胞于单个试管中与直接与CD20、CD55和CD59缀合的抗体孵育30分钟。清洗细胞二次，之后通过FACSCanto细胞仪得到FACS并以FlowJo软件分析，。
为了测定抗-CD20及抗-CD3xCD20抗体介导T细胞定向的Raji细胞系杀伤的能力，将钙黄绿素标定的Raji细胞于37℃与预活化的T细胞(用rhIL-2(30U/mL)和抗-CD3/CD28活化珠活化的ficoll-分离的人类PBMC)及由2nM开始的抗体的3-倍系列稀释液孵育2小时。孵育后，将板离心并将上清液转置于半透明黑色清洁底板，以485nm发射进行530nm荧光检测。以自发性(仅靶细胞)及最大释放(用清洁剂裂解的靶细胞)值为基础，测定细胞毒性百分比。使用Prism软件使用4-参数非线性回归分析计算EC50值。
为了测定抗体介导CDC的活性，将Raji细胞系用5％正常人类血清补体和由100nM开始的抗体的3-倍系列稀释液孵育。于37℃培养4.5小时后，使用CellTiter
Figure BDA0001892622750000831
测定细胞死亡。以自发性(仅靶细胞)及最大释放(用清洁剂裂解的靶细胞)值为基础，测定细胞毒性百分比。使用Prism软件使用4-参数非线性回归分析计算EC50值。
结果如表25所示。
表25.抗体介导的CDC和T细胞介导的细胞毒性的EC50值
Figure BDA0001892622750000832
Figure BDA0001892622750000841
相较于亲代Raji细胞，四种Raji SCID系中有2种显示降低的CD20表达(表25；细胞系Raji SCID1和3)，具有显著较高的表达补体抑制性分子CD55和CD59的细胞的百分比。Raji SCID细胞对由抗CD20或抗CD20x CD3抗体所介导的CDC的敏感性取决于CD55/CD59表达细胞的百分比，而非CD20的水平，如此使得靶细胞上增加的CD55/CD59表达抑制CDC。
抗CD20抗体(对照IV&对照III[利妥昔单抗])在介导CDC上比抗-CD20x CD3(BS3/20-007)更有效力，因为此双特异性对于CD20为单价的。然而，与CDC相反，T细胞介导的细胞毒性并非取决于CD20或CD55/CD59水平，因为所有细胞系对在抗-CD20x CD3双特异性抗体的存在下由活化的T细胞所导致的细胞死亡同样易感。另外，在CDC测定法中，双特异性抗体在介导T细胞依赖的Raji细胞杀伤上比抗-CD20抗体效力强100-1000倍。
实施例12.在CD20x CD3双特异性抗体的存在下，CD8+T细胞上的CD25上调依赖于CD20浓度
为了评估是否较高浓度的靶细胞(CD20+淋巴瘤)能使CD20x CD3双特异性抗体的效力增加，将人类外周血液单核细胞在伯基特氏淋巴瘤衍生的细胞系，亦即Raji的存在下共培养。
CD8+T细胞上的CD25上调使用下列方法来测定：将经由富含单核细胞白的源自血球细胞分离术的血液以Ficoll离心所分离的人类PBMC(5x105/mL)，在有(1x105/mL)或无Raji细胞的存在下，于37℃在96-孔平底板中与双特异性抗体的5倍系列稀释液孵育。48小时后，清洗细胞2x，于室温以hFcR阻断试剂阻断10分钟，并然后于4℃与直接与CD2、CD19、CD4、CD8和CD25缀合的抗体孵育30分钟。染色后，将细胞清洗二次，之后通过FACSCanto细胞仪得到FACS，并用FlowJo软件分析。将活化的表达CD25的CD2+CD8+T细胞百分比对抗体浓度作图，并使用Prism软件使用4-参数非线性回归分析计算EC50值。结果如表26所示。
表26.在孵育人类PBMC与CD20x CD3双特异性抗体加或减Raji细胞后，CD8+T细胞上的CD25上调
Figure BDA0001892622750000851
如表26所示，活化的T细胞，当在Raji(靶)细胞的存在下培养时，显现CD25上调，及随后其EC50值下降100倍。
实施例13.CD20x CD3双特异性抗体在活化的T细胞存在下诱导对Raji细胞的细胞毒性
CD20x CD3双特异性抗体重新引导对表达CD-20的Raji细胞的T-细胞介导的杀伤的能力在体外细胞毒性测定法中测试。此外，亦研究双特异性和亲代抗-CD3抗体二者经由Fc/FcR相互作用杀伤U937细胞的能力。.
钙黄绿素杀伤测定法使用下列方法来进行：人类和食蟹猴PBMC分别经由ficoll-Plaque或经由淋巴细胞(Lympholyte)哺乳动物细胞分离基质所分离。分离的PBMC用含重组的人IL-2(30U/ml)和T-细胞活化珠(用于人类PBMC为抗-CD3/CD28，用于食蟹猴PBMC为抗-CD2/CD3/CD28)的培养基经过数天的过程活化。
将靶细胞(Raji用于CD20介导的杀伤，及U937用于FcR介导的杀伤)以钙黄绿素标定，并与活化的T细胞以10∶1效应子：标靶比率使用3倍系列稀释的抗体于3小时的期间在37℃孵育。孵育后，将板离心并将上清液转置于半透明黑色清洁底板中，进行荧光分析。使用Prism测定定义为诱导50％细胞毒性的双特异性抗体的摩尔浓度的EC50。使用4-参数非线性回归分析计算数值。结果汇总于表27中。
表27.CD20x CD3-诱导的对Raji和U937细胞的细胞毒性的EC50值
Figure BDA0001892622750000861
(＊)数据为3或多次独立测定的中位数值。无(＊)数据为1或2次独立测定法的代表/平均值。NA＝无活性；NT＝未测试。
如表27所示，含有人类-特异性或人类/食蟹猴交叉反应性抗-CD3臂的双特异性CD20x CD3抗体，在人类活化的T细胞的存在下能特异性重新引导对Raji细胞的细胞毒性。在食蟹猴活化的T细胞的存在下，当与BS3/20-001或BS3/20-003(具有活化猴T细胞的抗-CD3臂的双特异性抗体)孵育时，Raji被杀伤。所有的双特异性抗体以及对照I、抗-CD3 mAb，在U937Fc/FcR依赖的杀伤测定法中显现活性。此活性能通过于反应中添加阻断性非特异性人类IgG来阻断(数据未显示)。
实施例14.CD3x CD20双特异性抗体可去除用人类免疫细胞重建的小鼠中的CD19+B细胞
为了测定体内CD3xCD20双特异性抗体给药的效力，在将10μg或0.1μg的抗-CD3xCD20双特异性抗体施用于用人类免疫细胞重建的小鼠后，经由FACS检测CD19+B细胞及CD2+T-细胞水平的变化。
简言之，将新生的BALB/Rag2null/γcnll小鼠以2x 150Rad辐射并用4x105个人类CD34+造血祖细胞经由肝内注射重建。12周后，通过流式细胞术测定外周血液中重建的人类免疫系统的组成。通常，在重建后3个月，介于10％-60％百分比的外周白血液细胞为人类CD45+，其中40％-70％为B细胞，15％-40％为T细胞并且剩余的为小群体的天然杀伤和树突细胞。
重建后5个月，将小鼠以腹膜内注射10μg或0.1μg的抗-CD3xCD20双特异性抗体BS3/20-007、10μg的单价1-臂CD3抗体(BS3/20-009，参见表1)或10μg的不相关hIgG同种型对照。在注射后1、8和20天，将小鼠以眶后采血并通过流式细胞术(FACS)测定外周血液中的免疫细胞群体。
对于FACS分析，将100μl的血液与1.5ml RBC裂解缓冲液于Eppendorf管中孵育三分钟。将细胞以0.4xg离心五分钟，以FACS清洗液(PBS+3％FBS)清洗2x，并于室温下以小鼠Fc阻断试剂阻断10分钟。然后于4℃与直接与CD2、CD19、CD4、CD8、hCD45、hHLA-DR和mCD45缀合的抗体孵育30分钟。染色后，将细胞清洗二次，之后通过FACSCanto细胞仪得到FACS并用FlowJo软件分析。结果如表28所示。表28：用人类免疫细胞重建的小鼠中循环的CD45、CD19和CD2阳性细胞的百分比
Figure BDA0001892622750000871
如表28所示，单次10μg剂量的抗-CD3xCD20双特异性抗体BS3/20-007使2只经治疗的小鼠的2只中循环hCD45+细胞消失，其在实验期间并未恢复。单次0.1μg剂量的BS3/20-007，在3只经治疗的小鼠的2只中于注射后24小时降低循环的hCD45+细胞，包括CD19+B细胞及CD2+T-细胞。一旦去除后，在经0.1μg BS3/20-007治疗的响应小鼠中，hCD45+细胞的百分比并无显著的恢复。然而，仍留在这些小鼠中的细胞主要为hCD2+T细胞，而CD19+B细胞并未出现在响应小鼠中，即使在治疗后的第25天。在2只经治疗的小鼠的2只中，单次10μg剂量的单价1-臂CD3抗体(BS3/20-009)亦导致CD45+细胞，值得注意地为CD2+T细胞的持续但中度降低。单次10μg剂量的不相关hIgG1对照对于循环的hCD45+、hCD19+，或hCD2+细胞的百分比无显著效应。
实施例15.以CD20x CD3双特异性抗体治疗减小NOD/SCID小鼠中的Raji肿瘤体积
为了评估所选的抗-CD3xCD20双特异性抗体降低Raji肿瘤生长的功效，将NOD/SCID小鼠(Taconic)皮下植入2x106Raji肿瘤细胞和8x106人类PBMC的混合物。由肿瘤植入当天开始，以每只小鼠1μg剂量的人类Fc(hFc)或CD3xCD20双特异性抗体(BS3/20-007)每周治疗小鼠三次(每组治疗组N＝20只小鼠)。试剂通过腹膜内(i.p.)注射来递送。肿瘤大小使用卡尺每周测量三次，并以体积＝(长度x宽2)/2来计算肿瘤体积。结果如图1所示。
在第二个实验中，将NOD/SCID小鼠皮下植入2x106Raji肿瘤细胞和4x106人类PBMC的混合物。在肿瘤植入后7天开始以CD3xCD20双特异性抗体(BS3/20-007)或对照试剂(hFc)治疗以允许肿瘤变得明显。小鼠以每只小鼠1μg剂量，每周治疗2次(每组治疗组N＝6只小鼠)。试剂以皮下注射，远离肿瘤植入位置。肿瘤大小使用卡尺每周测量二次，并以体积＝(长度x宽2)/2来计算肿瘤体积。结果如图2所示。
此实施例证明，使用CD3xCD20双特异性抗体BS3/20-007的治疗在肿瘤植入及肿瘤已建立时对于抑制肿瘤生长皆为有效的。在2个研究中，相对于对照，植入后25天小鼠的肿瘤体积均下降。
实施例16.CD20x CD3双特异性抗体消除食蟹猴中的B-细胞群并具有典型的单克隆抗体的药物动力学谱
于食蟹猴(Macaca fascicularis)中进行初探性非-GLP毒性学和药理学研究，以测定CD3xCD20双特异性抗体消除这些动物中B-细胞群的能力。将雄性的动物组成三组。第1 组接受双特异性抗体BS3/20-001并包括三组不同用药组(0.01、0.10和1.00mg/kg)，每组用药组具有3-4只动物。第2组为二只动物组，其接受低剂量的抗-CD20对照抗体(对照V；0.01mg/kg)。第3组为四只动物组，接受高剂量的抗-CD20对照抗体(对照III；1.0mg/kg)。在第7天及用药之前抽取血液，以便建立这些动物的B和T细胞的基线水平。通过i.v.输注施用0.01、0.10或1.00mg/kg剂量的药物并于用药后5分钟、5小时及1、4、7和14天抽血。在用药后第14天之后，每二周抽血直到研究结束。通过FACS分析血液样本的B和T细胞标记物并测定这些细胞类型的绝对数。亦使用标准的分析方法分析血清样本的细胞因子水平(IFNγ、IL-2，、IL-6和TNFα)。结果如图3(B-细胞)、图4(T-细胞)和图5A-5D(细胞因子)所示。
如本实施例所示，施用CD3xCD20双特异性抗体使循环的B-细胞消除至第一个时间点所测量的基线水平(第1天)。在对照动物组中并未看到此消除。在双特异性组中仍维持B细胞消除，直到用药后二周，且在0.01和0.10mg/kg剂量组中后接B细胞水平的逐渐恢复直到实验在用药后约11周时结束。然而在1.0mg/kg组中，在此实验持续期间(11周)并未见到B细胞水平恢复。在此实验中亦监测T细胞水平。于双特异性组中，在用药后第1天观察到循环T细胞短暂消失。在这些组中，于第四天时间点T细胞水平回到基线水平并维持在此基线水平直到实验结束。此外，在5小时时BS3/20-001的血清细胞因子水平显现剂量和时间依赖的反应，这与T细胞活化相一致(参见图5A-5D)。
在此实验期间亦分析外周血液中基因表达水平。血液样本于用药前的2个时间点(用药前第7天和紧接用药前)及于用药后5、24、72、96和168小时从动物取得。从这些样本中分离RNA并通过微阵列分析。当与用药前水平及对照组的基因表达水平作比较时，观察到经双特异性抗体治疗的动物中B-细胞标记物的基因表达明显降低；此效应类似于从经1.0mg/kg对照III(对应于利妥昔单抗的抗-CD20抗体)治疗的动物得来的样本中所观察到的效应。所观察到的B细胞标记物表达的变化对应于经治疗的动物的血液中所检测到的B细胞消失。来自经CD3xCD20双特异性抗体治疗的动物的样本中T细胞标记物基因的表达显示最初下降，接着在24小时时间点回到正常水平。此外，在双特异性组的动物中，与炎性反应有关的基因显现最初上调，但24小时后回到正常或正常水平以下。最后，CD20基因表达信号的原始强度的检测显示，经CD3xCD20双特异性抗体治疗的动物的B细胞消除多于经对照抗-CD20抗体治疗的动物(参见图6及表29)。
表29.在第7天的CD20基因表达水平
Figure BDA0001892622750000901
如表29所示，在用药后七天，除了一个以外的所有CD3xCD20动物的CD20信号的原始强度仍保持在背景水平，而经1mg/kg的对照III治疗的4只动物中有3只显现边缘或可检测的CD20信号水平。
在相同的实验中，通过在用药前及于0.083、5、24、48、72、168、336、504和840小时取得血液样本来评估双特异性抗体的药物动力学谱(图7)。获得的血清样本通过直接酶联免疫吸附测定(ELISA)分析，以测定总双特异性抗体的浓度。血清总双特异性(BS3/20-001)浓度数据通过非区室分析(Phoenix WinNonLin)来分析以测定药物动力学参数。结果如表30中所示(AUC＝曲线下面积对时间；Cmax＝在目标基质中所观察到的化合物的最大浓度)。
表30：食蟹猴中BS3/20-001的药物动力学参数
Figure BDA0001892622750000911
在食蟹猴中0.01、0.10或1.0mg/kg的BS3/20-001的单次静脉剂量后，在第一取样时间点(0.083hr)观察到平均峰浓度(Cmax)分别为0.261、2.32和33.4μg/mL。在0.01、0.1和1.0mg/kg剂量时观察到4.42、289和4940μg＊hr/mL的平均AUCall值。442、2890和4940μg＊hr/mL每mg/kg的剂量归一化的AUC值(AUCall/剂量)显示血浆暴露(AUCall)随着增加的剂量以非线性方式增加。随着增加的抗体剂量，观察到血浆药物暴露的大于比例的增加，提示BS3/20-001可能经历一些靶介导的清除。BS3/20-001的整个药物动力学谱为典型的单克隆抗体在食蟹猴中的用药。
本发明并不希望被限制于文中所述的特定实施方式的范围中。实际上，除了该等文中所述之外，由前述说明及伴随的图示，多种本发明的修改对熟习本领域者为显而易见。此等修改希望落在所附的权利要求内。
Figure BDA0001892622750000931
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Claims (19)

1.双特异性抗原结合分子，其包括特异性与人类CD3结合的第一抗原结合结构域，及特异性与人类CD20结合的第二抗原结合结构域，其中
第一抗原结合结构域包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，重链可变区包含分别由SEQ ID NO：1284、1286和1288的氨基酸序列组成的互补决定区A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3，轻链可变区包含分别由SEQ ID NO:1292、1294和1296的氨基酸序列组成的互补决定区A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3，其中特异性结合人CD20的第二抗原结合结构域包含HCVR和LCVR，HCVR包含分别由SEQ ID NO：1244、1246和1248的氨基酸序列组成的互补决定区A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3，以及LCVR包含分别由SEQ ID NO：1292、1294和1296的氨基酸序列组成的互补决定区A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3。
2.权利要求1的双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合结构域包含由SEQ ID NO:1250的氨基酸序列组成的重链可变区(HCVR)和由SEQ ID NO:1258的氨基酸序列组成的轻链可变区(LCVR)；并且其中所述第二抗原结合结构域包含由SEQ ID NO:1242的氨基酸序列组成的HCVR和由SEQ ID NO:1258的氨基酸序列组成的LCVR。
3.权利要求1的双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合结构域包含由SEQ ID NO:1282的氨基酸序列组成的重链可变区(HCVR)和由SEQ ID NO:1290的氨基酸序列组成的轻链可变区(LCVR)；并且其中第二抗原结合结构域包含由SEQ ID NO:1242的氨基酸序列组成的HCVR和由SEQ ID NO:1290的氨基酸序列组成的LCVR。
4.权利要求1的双特异性抗原结合分子，其是全人类双特异性抗体。
5.权利要求2的双特异性抗原结合分子，其是全人类双特异性抗体。
6.权利要求3的双特异性抗原结合分子，其是全人类双特异性抗体。
7.权利要求1至6中任一项的双特异性抗原结合分子，其中双特异性抗原结合分子于体外诱导人类和食蟹猴外周血液单核细胞(PBMC)的增殖。
8.药物组合物，其包括权利要求1至7中任一项的双特异性抗原结合分子及可药用的载剂或稀释剂。
9.权利要求1至7中任一项的双特异性抗原结合分子在制备用于治疗对象中的B细胞癌症的药物中的用途。
10.权利要求9的用途，其中该B细胞癌症由下列组成的组中选出：滤泡性淋巴瘤、B细胞慢性淋巴性白血病、B细胞淋巴浆细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、弥漫性大型B细胞淋巴瘤、边缘区域淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、毛状细胞淋巴瘤及伯基特氏淋巴瘤。
11.权利要求10的用途，其中B细胞癌是滤泡性淋巴瘤。
12.权利要求10的用途，其中所述B细胞癌是弥漫性大型B细胞淋巴瘤。
13.权利要求10的用途，其中所述B细胞癌是边缘区域淋巴瘤。
14.权利要求10的用途，其中所述B细胞癌是套细胞淋巴瘤。
15.权利要求9的用途，其中对象患有对于单独的抗-CD20单特异性治疗具有抗性或不完全反应的肿瘤。
16.权利要求15的用途，其中对象患有对利妥昔单抗单一治疗具有抗性或不完全反应的肿瘤。
17.权利要求9的用途，其中在施用药物组合物前对象已经接受抗-CD20单特异性抗体治疗至少1天至1年。
18.权利要求17的用途，其中抗-CD20单特异性治疗包括或由抗-CD20单特异性抗体所组成。
19.权利要求18的用途，其中抗-CD20单特异性抗体为利妥昔单抗。
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