ES2901133T3 - Anticuerpos biespecíficos anti-CD3 optimizados y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo biespecífico citotóxico para su uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto, en donde el anticuerpo biespecífico comprende un primer brazo de unión a antígeno que presenta unión débil a no detectable a CD3 humano y CD3 de macaco, y un segundo brazo de unión a antígeno que se une a un antígeno asociado a un tumor, en donde cada uno del primer brazo de unión a antígeno y el segundo brazo de unión a antígeno comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena ligera es común tanto al primer brazo de unión a antígeno como al segundo brazo de unión a antígeno, y en donde la cadena pesada del primer brazo de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende las regiones determinantes de la complementariedad HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos, respectivamente, de SEQ ID NO: 36, 38 y 40 o de SEQ ID NO: 140, 142 y 144.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos biespecíficos anti-CD3 optimizados y usos de los mismos

Campo de la invención

La invención se refiere a anticuerpos biespecíficos, que se dirigen a un antígeno asociado a un tumor y a métodos de destrucción del tumor. La divulgación se refiere a métodos para reducir o eliminar la carga tumoral y controlar los efectos secundarios tóxicos que pueden estar asociados con la inmunoterapia tumoral. La presente invención proporciona anticuerpos biespecíficos que comprenden un brazo efector que se une a un antígeno efector con afinidad débil o sin afinidad de unión detectable, por ejemplo, un brazo de unión a antígeno anti-CD3 que se une al CD3 con una K^d superior a aproximadamente 500 nM, en un ensayo de unión por afinidad in vitro.

Antecedentes

La promesa de los anticuerpos biespecíficos (AcB) terapéuticos, particularmente en inmunoterapias contra el cáncer, tiene como objetivo tender un puente entre múltiples dianas de antígenos con el fin de provocar una respuesta inmunitaria innata más robusta a las células u organismos no deseados portadores de la diana.

Ahora está bien establecido que para mediar en la lisis redirigida, un AcB debe agrupar una célula diana directamente con una molécula desencadenante en una célula efectora, tal como un linfocito T. Hay muchos factores a considerar en el diseño de AcB, por ejemplo, el tamaño y la composición afectarán la biodistribución y la estabilidad in vivo (Segal, D. M., Weiner, G. J. y Weiner, L. M. Current Opinion in Immunol 1999, 11: 558-562; Chames, P. y Baty, D. MAbs.

2009, 1(6): 539-547). Los resultados diferenciales son difíciles de predecir dependiendo del subconjunto de linfocitos T que se activa para responder, así como del estado del linfocito T que se está estimulando. Es bien sabido que los AcB no dan resultados consistentes (Manzke O., et al. Cancer Immunol Immunother. 1997, 45:198-202). Por ejemplo, sin una producción adecuada de citocinas, la reticulación de CD3 puede inducir una respuesta apoptótica en el linfocito T (Noel P. J., Boise L. H., Thompson C. B.: Regulation of T cell activation by CD28 and CTLA4. Adv Exp Med Biol 1996, 406:209-217). El subconjunto de linfocitos T y el estado de diferenciación de dichos linfocitos T reticulados, por ejemplo, linfocitos T indiferenciados, son importantes para la eficacia, ya que los linfocitos T indiferenciados no pueden lisar las células diana sin preactivación (tal como la reticulación con TCR en presencia de IL-2).

Determinadas terapias biespecíficas han tenido éxito, no obstante, como ocurre con muchas terapias contra el cáncer, tienen un precio. La toxicidad es la principal causa de fracaso entre las terapias contra el cáncer. Es bien sabido que la toxicidad de los denominados fármacos quimioterapéuticos es la principal causa de efectos secundarios y enfermedades secundarias en el paciente. El acto de "destruir células" en sí mismo genera problemas para el paciente. Se puede inducir una gran cantidad de respuestas citotóxicas mediante la activación de células efectoras, por ejemplo, linfocitos T y una célula diana del cáncer, sin embargo, queda por ver qué tipo de respuesta es más beneficiosa en la inmunoterapia tumoral. Sería ventajoso un método de identificación de anticuerpos anti-CD3 para su uso en una terapia biespecífica que tenga efectos secundarios reducidos mientras se mantiene la eficacia y las propiedades farmacocinéticas (FC) deseables.

Se han descrito técnicas tales como la maduración por afinidad que, basadas en la relación estructura/actividad (SAR, del inglés "structure/activity relationship"), utiliza la mutagénesis para optimizar los anticuerpos para tener una especificidad o afinidad de unión aumentada y mejorada por un antígeno diana en comparación con el anticuerpo de partida (véase, por ejemplo, el documento WO2011056997, publicado el 12 de mayo de 2011). Se han descrito anticuerpos de OKT3 modificados capaces de unirse e interactuar con CD3 con diversos grados de afinidad mientras todavía presentan una activación de linfocitos T de moderada a elevada (Documento US7820166). Sin embargo, no se han descrito métodos para reducir la afinidad de unión de las moléculas de anticuerpo hasta cerca o más allá del nivel detectable de unión, ni se ha demostrado que tengan la eficacia necesaria para la reducción o supresión de tumores.

Por lo tanto, existe una necesidad de moléculas de unión a antígeno biespecíficas alternativas que tengan citotoxicidad controlada y mejores propiedades FC. Dichas terapias contra el cáncer serían bastante útiles en entornos terapéuticos.

Breve sumario de la invención

La invención proporciona un anticuerpo biespecífico citotóxico para su uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto, en donde el anticuerpo biespecífico comprende un primer brazo de unión a antígeno que presenta unión débil a no detectable a CD3 humano y CD3 de macaco, y un segundo brazo de unión a antígeno que se une a un antígeno asociado a un tumor, en donde cada uno del primer brazo de unión a antígeno y el segundo brazo de unión a antígeno comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena ligera es común tanto al primer brazo de unión a antígeno como al segundo brazo de unión a antígeno, y en donde la cadena pesada del primer brazo de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (HCVR, del inglés "heavy chain variable region") que comprende las regiones determinantes de la complementariedad HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos, respectivamente, de SEQ ID NO: 36, 38 y 40 o de SEQ ID NO: 140, 142 y 144.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende (i) el anticuerpo biespecífico de la invención y (ii) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

También se divulgan anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CD3 humano que tienen una afinidad débil o no detectable por CD3 humano y/o de macaco. Los anticuerpos de acuerdo con este aspecto son útiles, entre otras cosas, para dirigirse a los linfocitos T que expresan CD3 y para estimular la activación de los linfocitos T, por ejemplo, en circunstancias en las que la destrucción mediada por linfocitos T es beneficiosa o deseable. Los anticuerpos anti-CD3 o porciones de unión a antígeno de los mismos, pueden incluirse como parte de un anticuerpo biespecífico que dirige la activación de los linfocitos T mediada por c D3 a tipos celulares específicos tales como células tumorales o agentes infecciosos.

Los anticuerpos anti-CD3 ilustrativos se enumeran en las tablas 2 y 3 en el presente documento. La tabla 2 indica los identificadores de secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada (HCVR), así como de las regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3). La tabla 3 indica los identificadores de secuencia de las moléculas de ácido nucleico que codifican las regiones HCVR, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de los anticuerpos anti-CD3 ilustrativos. Las tablas 4 y 5 indican las regiones variables de cadena ligera (LCVR, del inglés "light chain variable regions"), así como las regiones determinantes de la complementariedad (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) de los anticuerpos anti-CD3 ilustrativos.

La presente divulgación también se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una HCVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.

La presente divulgación también se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la tabla 2 emparejadas con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la tabla 4, o una cadena ligera común procedente de la cadena ligera afín de la cadena pesada anti-TAA, o procedente de una región variable de cadena ligera conocida o de dominio público procedente de una cadena ligera que presenta promiscuidad o capacidad para emparejarse con una amplia variedad de cadenas pesadas no afines, es decir, una cadena ligera universal o común. De acuerdo con determinados casos, se divulgan anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos de HCVr /LCVR contenido en cualquiera de los anticuerpos anti-CD3 ilustrativos enumerados en la tabla 2 emparejados con regiones variables de cadena ligera ilustrativas enumeradas en la tabla 4. En determinados casos, el par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10/162 (por ejemplo, CD3-VH-G2); 18/162 (por ejemplo, CD3-VH-G3); 26/162 (por ejemplo, CD3-VH-G4); 34/162 (por ejemplo, CD3-VH-G5); 42/162 (por ejemplo, c D3-VH-G8); 50/162 (por ejemplo, CD3-VH-G9); 58/162 (por ejemplo, CD3-VH-G10); 66/162 (por ejemplo, CD3-VH-G11); 74/162 (por ejemplo, CD3-VH-G12); 82/162 (por ejemplo, CD3-VH-G13); 90/162 (por ejemplo, CD3-VH-G14); 98/162 (por ejemplo, CD3-VH-G15); 106/162 (por ejemplo, CD3-VH-G16); 114/162 (por ejemplo, CD3-VH-G17); 122/162 (por ejemplo, CD3-VH-G18); 130/162 (por ejemplo, CD3-VH-G19); 138/162 (por ejemplo, CD3-VH-G20); y 146/162 (por ejemplo, CD3-VH-G21).

La presente divulgación también se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR1 enumeradas en la tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia. La presente divulgación también se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 178.

La presente divulgación también se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR2 enumeradas en la tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia. La presente divulgación también se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 179.

La presente divulgación también se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia. La presente divulgación también se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 180.

La presente divulgación también se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR1 enumeradas en la tabla 4 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia. La presente divulgación también se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR1 de cadena ligera (LCDR1) procedente de una cadena ligera afín de la cadena pesada anti-TAA o procedente de una cadena ligera que presenta promiscuidad o capacidad para emparejarse con una amplia variedad de cadenas pesadas no afines, es decir, una cadena ligera universal o común.

La presente divulgación también se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR2 enumeradas en la tabla 4 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia. La presente divulgación también se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR2 de cadena ligera (LCDR2) procedente de una cadena ligera afín de la cadena pesada anti-TAA o procedente de una cadena ligera que presenta promiscuidad o capacidad para emparejarse con una amplia variedad de cadenas pesadas no afines, es decir, una cadena ligera universal o común.

La presente divulgación también se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la tabla 4 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia. La presente divulgación también se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) procedente de una cadena ligera afín de la cadena pesada anti-TAA o procedente de una cadena ligera que presenta promiscuidad o capacidad para emparejarse con una amplia variedad de cadenas pesadas no afines, es decir, una cadena ligera universal o común.

La presente divulgación también se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos HCDR3 y LCDR3 (HCDR3/LCDR3) que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la tabla 2 emparejadas con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la tabla 4. De acuerdo con determinados casos, se divulgan anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos HCDR3/LCDR3 contenidas dentro de cualquiera de los anticuerpos anti-CD3 ilustrativos enumerados en la tabla 2. En determinados casos, el par de secuencias de aminoácidos HCDR3/LCDR3 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16/168 (por ejemplo, CD3-VH-G2); 24/168 (por ejemplo, CD3-VH-G3); 32/168 (por ejemplo, CD3-VH-G4); 40/168 (por ejemplo, CD3-VH-G5); 48/168 (por ejemplo, CD3-VH-G8); 56/168 (por ejemplo, CD3-VH-G9); 64/168 (por ejemplo, CD3-VH-G10); 72/168 (por ejemplo, CD3-VH-G11); 80/168 (por ejemplo, CD3-VH-G12); 88/168 (por ejemplo, CD3-VH-G13); 96/168 (por ejemplo, CD3-VH-G14); 104/168 (por ejemplo, CD3-VH-G15); 112/168 (por ejemplo, CD3-VH-G16); 120/168 (por ejemplo, CD3-VH-G17); 128/168 (por ejemplo, CD3-VH-G18); 136/168 (por ejemplo, CD3-VH-G19); 144/168 (por ejemplo, CD3-VH-G20); y 152/168 (por ejemplo, CD3-VH-G21).

La presente divulgación también se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un conjunto de seis CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contenidas en cualquiera de los anticuerpos anti-CD3 ilustrativos enumerados en las tablas 2 y 4. En determinados casos, el conjunto de secuencias de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12-14-16-164-166-168 (por ejemplo, CD3-VH-G2); 20-22-24-164-166-168 (por ejemplo, CD3-VH-G3); 28-30-32-164-166-168 (por ejemplo, CD3-VH-G4); 36-38-40-164-166-168 (por ejemplo, CD3-VH-G5); 44-46-48­ 164-166-168 (por ejemplo, CD3-VH-G8); 52-54-56-164-166-168 (por ejemplo, CD3-VH-G9); 60-62-64-164-166-168 (por ejemplo, CD3-VH-G10); 68-70-72-164-166-168 (por ejemplo, CD3-VH-G11); 76-78-80-164-166-168 (por ejemplo, CD3-VH-G12); 84-86-88-164-166-168 (por ejemplo, CD3-VH-G13); 92-94-96-164-166-168 (por ejemplo, CD3-VH-G14); 100-102-104-164-166-168 (por ejemplo, CD3-VH-G15); 108-110-112-164-166-168 (por ejemplo, CD3-VH-G16); 116-118-120-164-166-168 (por ejemplo, CD3-VH-G17); 124-126-128-164-166-168 (por ejemplo, CD3-VH-G18); 132­ 134-136-164-166-168 (por ejemplo, CD3-VH-G19); 140-142-144-164-166-168 (por ejemplo, CD3-VH-G20); y 148-150­ 152-164-166-168 (por ejemplo, CD3-VH-G21).

En un caso relacionado, la presente divulgación también se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un conjunto de seis CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contenidas en un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR como se define mediante cualquiera de los anticuerpos anti-CD3 ilustrativos enumerados en las tablas 2 y 4. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden el conjunto de secuencias de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 contenidas en un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10/162 (por ejemplo, CD3-VH-G2); 18/162 (por ejemplo, CD3-VH-G3); 26/162 (por ejemplo, CD3-VH-G4); 34/162 (por ejemplo, CD3-VH-G5); 42/162 (por ejemplo, CD3-VH-G8); 50/162 (por ejemplo, CD3-VH-G9); 58/162 (por ejemplo, CD3-VH-G10); 66/162 (por ejemplo, CD3-VH-G11); 74/162 (por ejemplo, CD3-VH-G12); 82/162 (por ejemplo, CD3-VH-G13); 90/162 (por ejemplo, CD3-VH-G14); 98/162 (por ejemplo, CD3-VH-G15); 106/162 (por ejemplo, CD3-VH-G16); 114/162 (por ejemplo, CD3-VH-G17); 122/162 (por ejemplo, CD3-VH-G18); 130/162 (por ejemplo, CD3-VH-G19); 138/162 (por ejemplo, CD3-VH-G20); y 146/162 (por ejemplo, CD3-VH-G21).

Los métodos y técnicas para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR son bien conocidos en la materia y pueden utilizarse para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR específicas que se divulgan en el presente documento. Las convenciones ilustrativas que pueden utilizarse para identificar los límites de las CDR incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales y la definición de AbM es un término medio entre los enfoques de Kabat y Chothia. Véanse, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); y Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). También hay disponibles bases de datos públicas para identificar secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.

La presente divulgación también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-CD3 o partes de los mismos. Por ejemplo, la presente divulgación se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la tabla 3; en determinados casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de HCVR enumeradas en la tabla 3, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.

La presente divulgación también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la tabla 4; o una LCVR procedente de una cadena ligera afín de la cadena pesada anti-TAA o procedente de una cadena ligera que presenta promiscuidad o capacidad para emparejarse con una amplia variedad de cadenas pesadas no afines, es decir, una cadena ligera universal o común. En determinados aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de LCVR enumeradas en la tabla 5 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.

La presente divulgación también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR1 enumeradas en la tabla 2; en determinados casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCDR1 enumeradas en la tabla 3 o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.

La presente divulgación también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR2 enumeradas en la tabla 2; en ciertos casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de HCDR2 enumeradas en la tabla 3 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.

La presente divulgación también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la tabla 2; en determinados aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCDR3 enumeradas en la tabla 3 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.

La presente divulgación también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR1 enumeradas en la tabla 4; o una LCDR1 procedente de una cadena ligera afín de la cadena pesada anti-TAA o procedente de una cadena ligera que presenta promiscuidad o capacidad para emparejarse con una amplia variedad de cadenas pesadas no afines, es decir, una cadena ligera universal o común. En determinados casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de LCDR1 enumeradas en la tabla 5 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.

La presente divulgación también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR2 enumeradas en la tabla 4; o una LCDR2 procedente de una cadena ligera afín de la cadena pesada anti-TAA o procedente de una cadena ligera que presenta promiscuidad o capacidad para emparejarse con una amplia variedad de cadenas pesadas no afines, es decir, una cadena ligera universal o común. En determinados casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de LCDR2 enumeradas en la tabla 5 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.

La presente divulgación también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la tabla 4; o una LCDR3 procedente de una cadena ligera afín de la cadena pesada anti-TAA o procedente de una cadena ligera que presenta promiscuidad o capacidad para emparejarse con una amplia variedad de cadenas pesadas no afines, es decir, una cadena ligera universal o común. En determinados casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de LCDR3 enumeradas en la tabla 5 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.

La presente divulgación también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican una HCVR, en donde la HCVR comprende un conjunto de tres CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3), en donde el conjunto de secuencias de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3 es como se define por cualquiera de los anticuerpos anti-CD3 ilustrativos enumerados en la tabla 2.

La presente divulgación también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican una LCVR, en donde la LCVR comprende un conjunto de tres CDR (es decir, LCDR1-LCDR2-LCDR3), en donde el conjunto de secuencias de aminoácidos de LCDR1-LCDR2-LCDR3 es como se define por cualquiera de los anticuerpos de cadena ligera universales ilustrativos enumerados en la tabla 4; o el LCDR1-LCDR2-LCDR3 procede de una cadena ligera afín de la cadena pesada anti-TAA o procede de una cadena ligera que presenta promiscuidad o capacidad para emparejarse con una amplia variedad de cadenas pesadas no afines, es decir, una cadena ligera universal o común.

La presente divulgación también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican tanto una HCVR como una LCVR, en donde la HCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la tabla 2 y en donde la LCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la tabla 4; o la LCVR procede de una cadena ligera afín de la cadena pesada anti-TAA o procede de una cadena ligera que presenta promiscuidad o capacidad para emparejarse con una amplia variedad de cadenas pesadas no afines, es decir, una cadena ligera universal o común. En determinados casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de HCVR enumeradas en la tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma, y una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCVR enumeradas en la tabla 5 o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma. En algunos casos, las moléculas de ácido nucleico que codifican tanto una HCVR como una LCVR son secuencias completamente humanas o procedentes de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana.

La presente divulgación también se refiere a vectores de expresión recombinantes capaces de expresar un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD3. Por ejemplo, la presente divulgación incluye vectores de expresión recombinantes que comprenden cualquiera de las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente, es decir, moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de HCVR, LCVR y/o CDR como se exponen en la tabla 2 o 4. También se divulgan células hospedadoras en las que se han introducido dichos vectores, así como métodos para producir los anticuerpos o porciones de los mismos mediante el cultivo de las células hospedadoras en condiciones que permiten la producción de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, y la recuperación de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo así producidos.

La presente divulgación incluye anticuerpos anti-CD3 y/o anticuerpos anti-TAA, así como anticuerpos biespecíficos anti-CD3/anti-TAA que tienen un patrón de glucosilación modificado. En algunos casos, puede ser útil la modificación para eliminar sitios de glucosilación indeseables, o un anticuerpo que carezca de una fracción de fucosa presente en la cadena de oligosacárido, por ejemplo, para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, del inglés "antibody dependent cellular cytotoxicity") (véase, Shield et al., (2002) JBC 277:26733). En otras solicitudes, puede hacerse una modificación de la galactosilación para modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, del inglés "complement dependent cytotoxicity").

En un aspecto, la divulgación también se refiere a una composición citotóxica que comprende una molécula de unión a antígeno biespecífica que i) no es capaz de unirse de manera específica a una célula efectora y ii) se une de manera específica a una célula tumoral diana, en donde la unión específica se mide en un ensayo de unión de FACS in vitro o en un ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial in vitro. En determinados casos, la divulgación se refiere a una composición citotóxica que comprende una molécula de unión a antígeno biespecífica que no presenta unión detectable a una célula efectora y que se une de manera específica a una célula tumoral diana con una afinidad de unión medible, en donde el valor de la afinidad de unión se mide en un ensayo de unión de FACS in vitro o en un ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial in vitro.

En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición citotóxica que comprende un anticuerpo biespecífico de la invención. El anticuerpo biespecífico puede comprender i) un primer fragmento de unión a antígeno (Fab1) que no presenta unión detectable a CD3 y ii) un segundo fragmento de unión a antígeno (Fab2) que se une de manera específica a una célula tumoral diana con una afinidad de unión medible, en donde el valor de la afinidad de unión se mide en un ensayo de unión de FACS in vitro o en un ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial in vitro. En algunos casos, la afinidad de unión es la afinidad de unión monovalente (por ejemplo, en una construcción de anticuerpo biespecífico).

En otro caso, la divulgación se refiere a una composición citotóxica que comprende una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une de manera específica a una célula efectora con una afinidad de unión débil, por ejemplo, que presenta un valor de CE⁵⁰ de aproximadamente 100 nM o superior, y que se une de manera específica a una célula tumoral diana con un valor de CE⁵⁰ apreciable o un valor de CE⁵⁰ de elevada afinidad tal como inferior a 50 nM, en donde el valor de afinidad de unión CE⁵⁰ se mide en un ensayo de unión de FACS in vitro. En determinados casos, la divulgación se refiere a una composición citotóxica que comprende una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une de manera específica a una célula efectora con un valor de CE⁵⁰ superior a aproximadamente 500 nM y que se une de manera específica a una célula tumoral diana con un valor de CE⁵⁰ apreciable, o un valor de CE⁵⁰ de elevada afinidad tal como inferior a 50 nM, en donde el valor de afinidad de unión CE⁵⁰ se mide en un ensayo de unión de FACS in vitro.

En algunos ejemplos, la molécula de unión a antígeno biespecífica incluye un Fab1 que se une de manera específica al CD3 humano con un valor de CE⁵⁰ superior a aproximadamente 40 nM o superior a aproximadamente 100 nM, superior a aproximadamente 200 nM, superior a aproximadamente 300 nM, superior a aproximadamente 400 nM, superior a aproximadamente 500 nM o superior a aproximadamente 1 pM (por ejemplo, en un contexto de unión monovalente). En algunos casos, la molécula de unión a antígeno biespecífica incluye un Fab2 procedente de un segundo anticuerpo que se une de manera específica a la célula tumoral diana con afinidad elevada, por ejemplo, un valor de CE⁵⁰ inferior a aproximadamente 50 nM, inferior a aproximadamente 40 nM, inferior a aproximadamente 20 nM, inferior a aproximadamente 10 nM o inferior a aproximadamente 6 nM (por ejemplo, en un contexto de unión monovalente). En algunos casos, el Fab1 se une de manera específica a cada CD3 humano y CD3 de macaco con un valor de CE⁵⁰ superior a aproximadamente 40 nM o superior a aproximadamente 100 nM, superior a aproximadamente 200 nM o superior a aproximadamente 1 pM. En algunos casos, el Fab1 se une de manera específica a cada CD3 humano y CD3 de macaco con una afinidad débil o no medible.

En algunos casos, la célula tumoral diana es una célula tumoral humana. En algunos casos, el Fab1 (o la molécula de unión a antígeno biespecífica) induce la destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T con un valor de CE⁵⁰ inferior a aproximadamente 1,3 nM, medido en un ensayo de destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T in vitro.

En algunas aplicaciones, el Fab1 o la molécula de unión a antígeno biespecífica se une de manera específica al CD3 humano con un valor de K^d superior a aproximadamente 11 nM, medido en un ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial in vitro. En otros ejemplos, el Fab1 o la molécula de unión a antígeno biespecífica se une de manera específica a cada CD3 humano y CD3 de macaco con un valor de K^d superior a aproximadamente 15 nM o superior a aproximadamente 30 nM, superior a aproximadamente 60 nM, superior a aproximadamente 120 nM o superior a aproximadamente 300 nM, medido en un ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial in vitro. Todavía en algunas aplicaciones, el Fab1 o la molécula de unión a antígeno biespecífica i) no presenta unión detectable a CD3 humano medido en cada uno de un ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial in vitro y un ensayo de unión de FACS y ii) induce la destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T, medido en un ensayo de destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T in vitro.

En algunas aplicaciones, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende una primera cadena pesada que comprende una región HCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 12 o 20. En algunos casos, la primera cadena pesada comprende una región HCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14 o 54. En otros casos, la primera cadena pesada comprende una región HCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16, SEQ ID n O: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 144 o SEQ ID NO: 152. En otras solicitudes, la primera cadena pesada comprende un HCVR que comprende HCDR1-HCDR2-HCDR3 que tiene las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 178-179-180. En otros casos, una primera cadena pesada comprende una CDR1 que comprende los restos de aminoácidos 1 a 7 de la SEQ ID NO: 178, una CDR2 que comprende los restos de aminoácidos 1 a 7 de la SEQ ID NO: 179, una CDR3 que comprende los restos de aminoácidos 4 a 11 de la SEQ ID NO: 180.

En más casos, la primera cadena pesada comprende regiones marco de dominio variable que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de FR1 (SEQ ID NO: 174), FR2 (SEQ ID NO: 175), FR3 (SEQ ID NO: 176) y FR4 (SEQ ID NO: 177).

La presente divulgación también se refiere a moléculas de unión a antígenos biespecíficas que comprenden un par de secuencias de aminoácidos Fab1 HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 10/162; 18/162; 26/162; 34/162; 42/162; 50/162; 58/162; 66/162; 74/162; 82/162; 90/162; 98/162; 106/162; 114/162; 122/162; 130/162; 138/162; 146/162.

Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno y los anticuerpos biespecíficos de los mismos se prepararon mediante el reemplazo de los restos de aminoácidos de un precursor de una manera escalonada basándose en las diferencias entre la secuencia de la línea germinal y la secuencia del anticuerpo precursor. La presente divulgación también se refiere a un método para preparar una composición citotóxica que comprende (a) identificar la secuencia de aminoácidos de la primera cadena pesada procedente de un primer anticuerpo que se une de manera específica a CD3 con afinidad elevada, por ejemplo, presenta un valor de afinidad de unión CE⁵⁰ inferior a aproximadamente 40 nM, (b) modificar restos de aminoácidos seleccionados en la región variable de cadena pesada del primer anticuerpo para producir un anticuerpo modificado, (c) emparejar el anticuerpo modificado con una segunda cadena pesada procedente de un segundo anticuerpo que se une de manera específica a un antígeno tumoral diana para producir un anticuerpo biespecífico, (d) probar el anticuerpo biespecífico en un ensayo de afinidad de unión y, si la afinidad de unión a CD3 tiene una un valor CE⁵⁰ superior a aproximadamente 40 nM o superior a 100 nM o superior a 300 nM o superior a 500 nM o unión no detectable, entonces (e) preparar una composición que comprende el anticuerpo biespecífico y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Además de modificar la región variable de cadena pesada de anticuerpos seleccionados para diseñar brazos de unión a antígeno que tengan una afinidad débil o nula, pero que se dirijan de manera específica a una célula efectora, la divulgación también se refiere a métodos en el presente documento para modificar la región constante de cadena pesada (por ejemplo, el dominio C^h3) de cada brazo de unión para preparar y aislar anticuerpos biespecíficos.

Un método ilustrativo proporciona un método para producir un anticuerpo biespecífico citotóxico, que comprende: (a) identificar un primer anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que interactúa con un antígeno de célula efectora de múltiples especies; (b) identificar los restos de aminoácidos de la línea germinal de la región variable de cadena pesada (HCVR) del anticuerpo humano; (c) comparar la secuencia de aminoácidos de la HCVR del primer anticuerpo humano con la secuencia de aminoácidos de la HCVR de la línea germinal correspondiente; (d) identificar aminoácidos dentro de una región modificada de la HCVR del primer anticuerpo, por lo que una región modificada en el primer anticuerpo muestra al menos una modificación de aminoácido por sustitución, eliminación o adición de un único resto de aminoácido en comparación con la misma región en la HCVR de línea germinal; (e) producir una pluralidad de anticuerpos modificados, comprendiendo cada uno al menos una región modificada de la HCVR; (f) cribar cada uno de la pluralidad de anticuerpos modificados en busca de afinidad monovalente por el antígeno de la célula efectora; (g) seleccionar aquellos anticuerpos modificados que presentan una afinidad de unión más débil o ninguna afinidad de unión detectable por el antígeno de la célula efectora en comparación con el primer anticuerpo; y (h) emparejar el primer anticuerpo seleccionado con un segundo anticuerpo que interactúa con un antígeno asociado a un tumor para producir un anticuerpo biespecífico citotóxico.

La divulgación también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico humano recombinante o un fragmento del mismo que se une de manera específica a CD3 y a un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un caso relacionado, la divulgación presenta una composición que es una combinación de un anticuerpo anti-CD3 y un segundo agente terapéutico. En un caso, el segundo agente terapéutico es cualquier agente que se combine de forma ventajosa con un anticuerpo anti-CD3. Los agentes ilustrativos que pueden combinarse de forma ventajosa con un anticuerpo anti-CD3 incluyen, sin limitación, otros agentes que se unen y/o activan la señalización de c D3 (incluyendo otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, etc.) y/o agentes que no se unen de manera directa a CD3 pero que, sin embargo, activan o estimulan la activación de las células inmunitarias. En cualquier parte del presente documento se divulgan terapias de combinación y coformulaciones adicionales que implican los anticuerpos anti-CD3.

En otro aspecto más, la divulgación se refiere a métodos terapéuticos para estimular la activación de linfocitos T utilizando un anticuerpo anti-CD3 o una porción de unión a antígeno de un anticuerpo de la divulgación, en donde los métodos terapéuticos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico de la divulgación, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, a un sujeto que lo necesita. El trastorno tratado es cualquier enfermedad o afección, que se mejora, alivia, inhibe o previene mediante una terapia citotóxica dirigida a un antígeno asociado a un tumor, tal como un cáncer.

De acuerdo con otro aspecto, la presente divulgación se refiere a moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a CD3 y a un antígeno diana, especialmente un antígeno asociado a tumor (TAA, del inglés "tumor-associated antigen").

La presente divulgación incluye el uso de una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-TAA de la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado o provocado por la expresión de TAA. La presente divulgación también se refiere al uso de una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-TAA, que presenta una afinidad débil por las células efectoras que expresan CD3 y una eliminación reducida, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado o provocado por la expresión de TAA, en comparación con una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-TAA que presenta una afinidad elevada por las células efectoras que expresan CD3.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la alineación de aminoácidos de las siguientes secuencias de región variable de cadena pesada (HCVR) del anticuerpo: hlgHV de línea germinal (SEQ ID NO: 181); CD3-VH-P (SEQ ID NO: 154); CD3-VH-G (SEQ ID NO: 2); CD3-VH-G2 (SEQ ID NO: 10); CD3-VH-G3 (SEQ ID NO: 18); CD3-VH-G4 (SEQ ID NO: 26); CD3-VH-G5 (SEQ ID NO: 34); CD3-VH-G8 (SEQ ID NO: 42); CD3-VH-G9 (SEQ ID NO: 50); CD3-VH-G10 (SEQ ID NO: 58); CD3-VH-G11 (SEQ ID NO: 66); CD3-VH-G12 (SEQ ID NO: 74); CD3-VH-G13 (SEQ ID NO: 82); CD3-VH-G14 (SEQ ID NO: 90); CD3-VH-G15 (SEQ ID NO: 98); CD3-VH-G16 (SEQ ID NO: 106); CD3-VH-G17 (SEQ ID NO: 114); CD3-VH-G18 (SEQ ID NO: 122); CD3-VH-G19 (SEQ ID NO: 130); CD3-VH-G20 (SEQ ID NO: 138); y CD3-VH-G21 (SEQ ID NO: 146). Cada HCVR derivada se compara con el anticuerpo precursor y los restos de aminoácidos de la línea germinal, con recuadros rectangulares que indican mutaciones en las CDR.

Las figuras 2A, 2B y 2C ilustrar las concentraciones medias de IgG total en suero tras una única inyección intraperitoneal de 0,4 mg/kg de anticuerpos BSMUC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-005 y control con isotipo en ratones de tipo silvestre (Figura 2A), ratones CD3 humanizados (Figura 2B) y ratones MUC16 * CD3 humanizados (Figura 2C).

Descripción detallada

Antes de describir la presente invención, debe entenderse que la presente invención no se limita a métodos ni condiciones experimentales particulares descritas, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, puesto que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la cual pertenece la presente invención. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor indicado en no más de un 1 %. Por ejemplo, tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).

Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos.

Definiciones

La expresión "CD3" se refiere a un antígeno que se expresa en los linfocitos T como parte del receptor de linfocitos T (TCR, del inglés "T cell receptor") multimolecular y que consiste en un homodímero o un heterodímero formado a partir de la asociación de dos de las cuatro cadenas receptoras: CD3£, CD38, CD3Z y CD3y. El CD3£ humano (hCD3£) comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 169 (UniProtKB/Swiss-Prot: P07766.2). El CD38 humano (hCD38) comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 170 (UniProtKB/Swiss-Prot: P04234.1). Todas las referencias a proteínas, polipéptidos y fragmentos de proteína en el presente documento pretenden referirse a la versión humana de la proteína, polipéptido o fragmento de proteína respectiva a menos que se especifique explícitamente como de una especie no humana. Por lo tanto, la expresión "CD3" significa CD3 humana a menos que se especifique que proviene de una especie no humana, por ejemplo, "CD3 de ratón", "CD3 de mono", etc.

La expresión "un anticuerpo que se une a CD3" o un "anticuerpo anti-CD3" incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen de manera específica y se asocian con una sola subunidad de CD3 (por ejemplo, £, 8, y o Z), así como anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen de manera específica y se asocian con un complejo dimérico de dos subunidades de CD3 (por ejemplo, dímeros de CD3 £/8, £/y y Z/Z). Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno pueden unirse a CD3 soluble, CD3 unido y/o CD3 expresado en la superficie celular. CD3 soluble incluye proteínas CD3 naturales, así como variantes de proteínas CD3 recombinantes como, por ejemplo, construcciones CD3 monoméricas y diméricas, que carecen de un dominio transmembrana o que no están asociadas con una membrana celular. La presente invención proporciona anticuerpos que se unen y activan CD3 humano y de macaco con una afinidad de unión débil o no detectable. "Unión a CD3 sin afinidad de unión detectable" significa que el anticuerpo o la interacción del fragmento de unión a antígeno con la diana de CD3 puede no ser medible o detectable con un ensayo de detección conocido, tal como un ensayo de unión de FACS (basado en células) como se describe en el presente documento o un ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial como se describe en el presente documento y es bien conocido en la materia. Otros ensayos de unión son bien conocidos en la materia. El anticuerpo y o el fragmento de unión a antígeno pueden reconocer la diana CD3 mediante una interacción bioquímica de proteína y proteína muy débil, sin embargo, no se puede medir una determinación de un valor específico de K^d o CE50 ya que la interacción está más allá del límite de detección del ensayo, por ejemplo, no se puede determinar ninguna medición. En otro caso, se determina "afinidad de unión no detectable" si la afinidad de un anticuerpo correspondiente a un valor de K^d es igual o menos de diez veces inferior a un antígeno no específico tal como, BSA, caseína o similares. La "unión a CD3 con afinidad de unión débil" incluye interacciones en las que la medición de la afinidad de unión está en el límite de detección del ensayo o ligeramente por encima de él, o es equivalente a la afinidad de unión a un antígeno no específico.

La expresión "CD3 expresada en la superficie celular" significa una o más proteínas CD3 que se expresan en la superficie de una célula in vitro o in vivo, de modo que al menos una parte de una proteína CD3 está expuesta al lado extracelular de la membrana celular y es accesible a una parte de unión a antígeno de un anticuerpo. "CD3 expresada en la superficie celular" incluye proteínas CD3 contenidas dentro del contexto de un receptor de linfocitos T funcional en la membrana de una célula. La expresión "CD3 expresada en la superficie celular" incluye la proteína CD3 expresada como parte de un homodímero o un heterodímero en la superficie de una célula (por ejemplo, dímeros de c D3 8/e, y/£ y Z/Z). La expresión, "CD3 expresada en la superficie celular" también incluye una cadena CD3 (por ejemplo, CD38, CD3e o CD3y) que se expresa por sí misma, sin otros tipos de cadenas CD3, en la superficie de una célula. Una "CD3 expresada en la superficie celular" puede comprender o consistir en una proteína CD3 expresada en la superficie de una célula que normalmente expresa la proteína CD3. De manera alternativa, "CD3 expresada en la superficie celular" puede comprender o consistir en una proteína CD3 expresada en la superficie de una célula que normalmente no expresa CD3 humana en su superficie pero que se ha manipulado de manera artificial para expresar CD3 en su superficie.

Las células efectoras incluyen células T efectoras (linfocitos T), por ejemplo, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, Th1, Th2 y linfocitos T reguladores (Tregs). Las células efectoras también pueden incluir linfocitos citolíticos naturales (NK, del inglés " natural killer"), macrófagos, granulocitos, células plasmáticas o células B (linfocitos). Se entiende que las terapias pueden mediar una gran cantidad de respuestas inmunitarias mediadas por células o funciones efectoras, a través de la interacción de Ig con los receptores de la superficie de las células efectoras, tales como CD3 (receptor de superficie de linfocitos T), CD28 (linfocitos T), receptores Fcy (FcyR) (células NK, macrófagos activados y similares). Las funciones efectoras tales como la destrucción celular, la activación del complemento, la fagocitosis y la opsonización se activan posteriormente a través de estas interacciones. La unión a una célula efectora y una célula diana tumoral permite un diseño de inmunoterapia valioso y eficaz que propaga la destrucción de las células tumorales e induce funciones inmunitarias endógenas para combatir el tumor o el cáncer.

La expresión "anticuerpo anti-CD3" incluye tanto anticuerpos monovalentes con una sola especificidad, como anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer brazo que se une a CD3 y un segundo brazo que se une a un segundo antígeno (diana), en donde el brazo anti-CD3 comprende cualquiera de las secuencias de HCVR/LCVR o CDR como se exponen en las tablas 2, 3, 4 y/o 5 en el presente documento. Ejemplos de anticuerpos biespecíficos anti-CD3 se describen en otras partes del presente documento. La expresión "molécula de unión a antígeno" incluye anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno, que incluyen, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos.

El término "anticuerpo" incluye cualquier molécula o complejo molecular de unión a antígeno que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR, del inglés "complementarity determining region") que se une de manera específica o interacciona con un antígeno particular (por ejemplo, CD3). El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o V^h) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, C^h1, C^h2 y C^h3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o V^l) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (C^l1). Las regiones V^h y V^l pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR, del inglés "framework regions"). Cada V^h y V^l está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, Cd R3, FR4. En diferentes realizaciones de la invención, las FR del anticuerpo anti-CD3 (o parte de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana o pueden estar modificadas de forma natural o artificial. Una secuencia consenso de aminoácidos puede definirse basándose en un análisis paralelo de dos o más CDR.

El término "anticuerpo" también incluye fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, tal como se utilizan en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible de manera enzimática, sintético o modificado por ingeniería genética que se une de manera específica a un antígeno para formar un complejo. Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo, por ejemplo, a partir de moléculas de anticuerpo completas, usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables, y opcionalmente constantes, de anticuerpo. Dicho ADN se conoce y/o se puede adquirir fácilmente de, por ejemplo, fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, por ejemplo, fagotecas de anticuerpos) o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o usando técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o eliminar aminoácidos, etc.

Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos de dominio suprimido, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP, del inglés "small modular immunopharmaceuticals") y dominios IgNAR variables de tiburón, también se incluyen dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", tal como se utiliza en el presente documento.

Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que está adyacente a o en fase con una o más secuencias marco. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio V^h asociado a un dominio V^l, los dominios V^h y V^l pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros V^h-V^h, V^h-V^l o V^l-V^l. De manera alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio V^h o V^l monomérico.

En determinadas realizaciones, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente con al menos un dominio constante. Las configuraciones ilustrativas, no limitantes, de dominios variables y constantes que se pueden encontrar dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención incluyen: (i) V^h-C^h 1; (ii) V^h-C^h2; (iii) V^h-C^h3; (iv) V^h-C^h1-C^h2; (v) V^h-C^h1-C^h2-C^h3; (vi) V^h-C^h2-C^h3; (vii) V^h-C^l; (viii) V^l-C^h1; (ix) V^l-C^h2; (x) V^l-C^h3; (xi) V^l-C^h1-C^h2; (xii) V^l-C^h1-C^h2-C^h3; (xiii) V^l-C^h2-C^h3; y (xiv) V^l-C^l. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones ilustrativas enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que dan como resultado una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Asimismo, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un homodímero o un heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios V^h o V^l monoméricos (por ejemplo, mediante enlaces disulfuro).

Como con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable es capaz de unirse de manera específica a un antígeno distinto o a un epítopo diferente en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico ilustrativos que se divulgan en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención usando técnicas rutinarias disponibles en la materia.

Los anticuerpos de la presente invención pueden actuar mediante citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). "Citotoxicidad dependiente del complemento" (CDC) se refiere a lisis de células que expresan antígeno por un anticuerpo de la invención en presencia del complemento. "Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" (ADCC) se refiere a una reacción mediada por células en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y de ese modo da lugar a la lisis de la célula diana. La CDC y la ADCC pueden medirse mediante ensayos que se conocen bien y están disponibles en la materia. (Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.500.362 y 5.821.337, y Clynes et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656). La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo de fijar el complemento y mediar la citotoxicidad dependiente de células. Por lo tanto, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse basándose en si se desea que el anticuerpo medie la citotoxicidad.

En determinados casos de la divulgación, los anticuerpos anti-CD3 (monoespecíficos o biespecíficos) son anticuerpos humanos. La expresión "anticuerpo humano", tal como se utiliza en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria y específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", tal como se utiliza en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias de CDR procedentes de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.

Se entiende que la expresión "anticuerpo humano recombinante" incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante introducido por transfección en una célula hospedadora (que se describe en más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos humanos recombinantes (que se describe en más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res.

20:6287-6295) o anticuerpos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana en otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones V^h y V^l de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden de, y están relacionadas con, secuencias de V^h y V^l de la línea germinal humana, no existen necesariamente de forma natural en el repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que se asocian a la heterogeneidad de bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción de cuatro cadenas estable de aproximadamente 150 a 160 kDa en la que los dímeros se mantienen juntos mediante un enlace disulfuro intercatenario de la cadena pesada. En una segunda forma, los dímeros no están unidos por enlaces disulfuro intercatenarios y se forma una molécula de aproximadamente 75 a 80 kDa compuesta por una cadena ligera y una pesada acopladas de manera covalente (semianticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de la purificación por afinidad.

La frecuencia de aparición de la segunda forma en diversos isotipos de IgG inalterada se debe, pero sin limitación, a diferencias estructurales asociadas al isotipo de la región bisagra del anticuerpo. Una sustitución de un único aminoácido en la región bisagra de la bisagra de IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) hasta los niveles normalmente observados usando una bisagra de IgG1 humana. La presente invención abarca anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región bisagra, C^h2 o C^h3, que puede ser deseable, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.

Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos aislados. Un "anticuerpo aislado", tal como se utiliza en el presente documento, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o eliminado de al menos un componente de un organismo, o de un tejido o célula en donde el anticuerpo existe de forma natural o se produce de forma natural, es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente invención. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpo in situ dentro de una célula recombinante. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que se han sometido a al menos una etapa de purificación o aislamiento. De acuerdo con determinadas realizaciones, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o agentes químicos.

La presente divulgación también se refiere a anticuerpos de un brazo que se unen a CD3. La expresión "anticuerpo de un brazo" significa una molécula de unión a antígeno que comprende una única cadena pesada de anticuerpo y una única cadena ligera de anticuerpo. Los anticuerpos de un brazo de la presente divulgación pueden comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR o CDR como se expone en la tabla 2 en el presente documento.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas en un antígeno y pueden tener diferentes efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce mediante aminoácidos yuxtapuestos de manera espacial de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En una determinada circunstancia, un epítopo puede incluir fracciones de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.

La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean de forma óptima con inserciones o eliminaciones de nucleótidos adecuadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente un 95 % y, más preferentemente, en al menos aproximadamente un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de las bases nucleotídicas, según se mide mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o Gap, como se analiza a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en determinados casos, codificar un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos o una sustancialmente similar que el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.

Aplicada a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos un 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras. Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una en donde un resto de aminoácido está sustituido por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobia). En general, una sustitución de aminoácidos conservadora no cambiará de manera sustancial las propiedades funcionales de una proteína. En los casos donde dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservadora de aminoácidos preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. De manera alternativa, un remplazo conservador es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Un remplazo "moderadamente conservador" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide normalmente con un programa informático de análisis de secuencias. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservadoras. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA usando parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) citado anteriormente). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véanse, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.

Mutaciones de la línea germinal

Los anticuerpos anti-CD3 que se divulgan en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes de las que proceden los anticuerpos.

La presente divulgación también se refiere a anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que proceden de cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos en una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que procede el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservadora del resto o restos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en el presente documento colectivamente "mutaciones de la línea germinal") y tienen una unión débil o no detectable a un antígeno CD3. En la tabla 2 en el presente documento se describen varios de dichos anticuerpos ilustrativos que reconocen CD3.

Además, los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, por ejemplo, en donde determinados restos individuales están mutados al correspondiente resto de una secuencia de la línea germinal particular mientras que otros restos determinados que difieren de la secuencia de la línea germinal original se mantienen o están mutados al correspondiente resto de una secuencia de la línea germinal diferente. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden probarse con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, afinidad de unión débil o reducida, propiedades farmacocinéticas mejoradas o potenciadas, inmunogenia reducida, etc. Pueden obtenerse anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de esta manera general dada la orientación de la presente divulgación.

La presente divulgación también se refiere a anticuerpos anti-CD3 que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservadoras. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-CD3 que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservadoras de aminoácidos respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR expuestas en la tabla 2 en el presente documento. Los anticuerpos y moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación comprenden una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácido en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes de las que proceden los dominios de unión a antígeno individuales, mientras se mantiene o mejora la unión deseada débil a no detectable al antígeno CD3. Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una en donde un resto de aminoácido está sustituido por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobia). En general, una sustitución de aminoácido conservadora no cambiará de manera sustancial las propiedades funcionales de una proteína, es decir, la sustitución de aminoácidos mantiene o mejora la afinidad de unión débil a no detectable deseada en el caso de moléculas de unión anti-CD3. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservadora de aminoácidos preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparaginaglutamina. De manera alternativa, un remplazo conservador es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Un remplazo "moderadamente conservador" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

La presente divulgación también se refiere a moléculas de unión a antígeno que comprenden un dominio de unión a antígeno con una secuencia de aminoácidos de HCVR y/o CDR que es sustancialmente idéntica a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento, mientras se mantiene o mejora la afinidad débil deseada por el antígeno CD3. La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando se hace referencia a una secuencia de aminoácidos significa que dos secuencias de aminoácidos, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos un 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras. En los casos donde dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para los expertos en la materia. Véanse, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331.

La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide normalmente con un programa informático de análisis de secuencias. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservadoras. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véanse, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA usando parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) citado anteriormente). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véanse, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.

Una vez obtenidos, los dominios de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal se probaron para determinar la afinidad de unión disminuida utilizando una o más ensayos in vitro. Aunque los anticuerpos que reconocen un antígeno en particular generalmente se seleccionan para su propósito mediante la prueba de elevada (es decir, fuerte) afinidad de unión al antígeno, los anticuerpos de la presente invención presentan una unión débil o ninguna unión detectable. Se encontró que las moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden uno o más dominios de unión a antígenos obtenidas de esta manera general resultan ventajosas como terapias tumorales impulsadas por la avidez.

Pueden obtenerse beneficios inesperados, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas y baja toxicidad para el paciente a partir de los métodos descritos en el presente documento.

Propiedades de unión de los anticuerpos

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "unión" en el contexto de la unión de un anticuerpo, inmunoglobulina, fragmento de unión a anticuerpo, o proteína que contiene Fc a cualquiera, por ejemplo, un antígeno predeterminado, tal como una proteína de la superficie celular o un fragmento de la misma, se refiere normalmente a una interacción o asociación entre un mínimo de dos entidades o estructuras moleculares, tal como una interacción de anticuerpo y antígeno.

Por ejemplo, la afinidad de unión corresponde normalmente a un valor K^d de aproximadamente 10^-7 M o inferior, tal como aproximadamente 10^-8 M o inferior, tal como aproximadamente 10^-9 M o inferior cuando se determina mediante, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR, del inglés "surface plasmon resonance") en un instrumento BIAcore 3000 que utiliza el antígeno como ligando y el anticuerpo, Ig, fragmento de unión a anticuerpo o proteína que contiene Fc como analito (o antiligando). Las estrategias de unión basadas en células, tales como los ensayos de unión de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, del inglés "fluorescent-activated cell sorting"), también se utilizan de forma rutinaria, y los datos de FACS se correlacionan bien con otros métodos, tales como la unión por competición de radioligandos y la SPR (Benedict, CA, J Immunol Methods. 1997, 201(2):223-31; Geuijen, CA, et al. J Immunol Methods. 2005, 302(1-2):68-77).

Por consiguiente, el anticuerpo o proteína de unión a antígeno de la divulgación puede unirse al antígeno predeterminado o molécula de la superficie celular (receptor tal como CD3) que tiene una afinidad correspondiente a un valor de K^d que es al menos diez veces inferior a su afinidad por unirse a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína). De acuerdo con la presente divulgación, si la afinidad de un anticuerpo correspondiente a un valor de K^d es igual o menos de diez veces inferior a un antígeno no específico, esto puede considerarse unión no detectable, sin embargo, dicho anticuerpo puede emparejarse con un segundo brazo de unión a antígeno para la producción de un anticuerpo biespecífico de la divulgación.

El término "K^d"(M) se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción de anticuerpo y antígeno particular, o la constante de equilibrio de disociación de un anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo que se une a un antígeno. Existe una relación inversa entre la K^d y la afinidad de unión, por lo que cuanto menor es el valor K^d, más alto, es decir, más fuerte, será la afinidad. Por lo tanto, las expresiones "afinidad mayor" o "afinidad más fuerte" se refiere a una mayor capacidad para formar una interacción y, por lo tanto, un valor K^d menor y, por el contrario, las expresiones "afinidad menor" o "afinidad más débil" se refieren a una menor capacidad para formar una interacción y, por lo tanto, un valor K^d mayor. En algunas circunstancias, una mayor afinidad de unión (o K^d) de una molécula particular (por ejemplo, anticuerpo) a su molécula asociada interactiva (por ejemplo, antígeno X) en comparación con la afinidad de unión de la molécula (por ejemplo, anticuerpo) a otra molécula asociada interactiva (por ejemplo, antígeno Y) puede expresarse como una relación de unión determinada mediante la división del valor de K^d más elevado (afinidad menor, o más débil) entre el valor de K^d más bajo (afinidad mayor, o más fuerte), por ejemplo, expresada como afinidad de unión 5 veces o 10 veces superior, según sea el caso. Por ejemplo, "baja afinidad" se refiere a una interacción de unión menos fuerte. En algunas realizaciones, la baja afinidad de unión corresponde a una K^d superior a aproximadamente 1 nM, superior a aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 o K^d superior a aproximadamente 40 nM, en donde dicho valor de afinidad de unión K^d se mide en un ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial in vitro, o en un ensayo de detección de interacción biomolecular equivalente. En algunas realizaciones, la baja afinidad de unión corresponde a una CE50 superior a aproximadamente 10 nM, CE50 superior a aproximadamente 15 nM, CE50 de 20 nM, CE50 superior a aproximadamente 25 nM, CE⁵⁰ de 30 nM, CE⁵⁰ superior a aproximadamente 35 nM o CE⁵⁰ superior a aproximadamente 40 nM, en donde dicho valor de afinidad de unión CE⁵⁰ se mide en un ensayo de unión de FACS in vitro o en un ensayo de unión equivalente basado en células. "Afinidad débil" se refiere a una interacción de unión débil. En algunas realizaciones, la afinidad de unión débil corresponde a una K^d o CE50 superior a aproximadamente 100 nM, K^d o CE50 superior a aproximadamente 200, 300 o superior a aproximadamente 500 nM, en donde dicho valor de afinidad de unión KD se mide en un ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial in vitro, o en un ensayo de detección de interacción biomolecular equivalente, y dicho valor de afinidad de unión CE50 se mide en un ensayo de unión de FACS in vitro, o en un ensayo equivalente de detección de interacciones basadas en células para detectar la unión monovalente. Unión no detectable significa que la afinidad entre las dos biomoléculas, por ejemplo, especialmente entre el brazo de unión del anticuerpo monovalente y su antígeno diana, está más allá del límite de detección del ensayo que se está utilizando.

El término "kd"(s^-1 o 1/s) se refiere a la constante de velocidad de disociación de una interacción de anticuerpo y antígeno particular, o la constante de velocidad de disociación de un anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo. Dicho valor también se conoce como valor koff.

El término "ka" (M^-1 * s^-1 o 1/M) se refiere a la constante de velocidad de asociación de una interacción de anticuerpo y antígeno particular, o la constante de velocidad de asociación de un anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo.

El término "K^a"(M^-1 o 1/M) se refiere a la constante de equilibrio de asociación de una interacción de anticuerpo y antígeno particular, o la constante de equilibrio de asociación de un anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo. La constante de equilibrio de asociación se obtiene dividiendo la ka entre la kd.

El término "CE50" o "CE50" se refiere a la concentración eficaz semimáxima, que incluye la concentración de un anticuerpo que induce una respuesta a medio camino entre el valor inicial y el máximo después de un tiempo de exposición específico. La CE50 representa esencialmente la concentración de un anticuerpo donde se observa el 50 % de su efecto máximo. En determinadas realizaciones, el valor de CE⁵⁰ es igual a la concentración de un anticuerpo de la invención que proporciona una unión semimáxima a las células que expresan CD3 o antígeno asociado a tumores, según se determina mediante, por ejemplo, un ensayo de unión de FACS. Por lo tanto, se observa unión reducida o más débil con un valor de CE⁵⁰ aumentado, o el valor de concentración eficaz semimáxima tal que CE⁵⁰ de 500 nM es indicativo de una afinidad de unión más débil que CE⁵⁰ de 50 nM.

En una realización, la unión disminuida puede definirse como un aumento de la concentración de anticuerpos CE⁵⁰ que permite la unión a la cantidad semimáxima de células diana.

En otras medidas experimentales, el valor de CE⁵⁰ representa la concentración de un anticuerpo de la invención que provoca el agotamiento semimáximo de las células diana mediante la actividad citotóxica de los linfocitos T. Por lo tanto, se observa un aumento de la actividad citotóxica (por ejemplo, destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T) con una disminución de la CE⁵⁰, o el valor de concentración eficaz semimáxima.

Moléculas de unión a antígeno biespecíficas

Los anticuerpos de la presente invención son biespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para una molécula efectora, tal como CD3, en combinación con diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véanse, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Los anticuerpos anti-CD3 de la presente divulgación pueden unirse o coexpresarse con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse de forma funcional (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión.

El uso de la expresión "anticuerpo anti-CD3" en el presente documento pretende incluir tanto anticuerpos anti-CD3 monoespecíficos como anticuerpos biespecíficos que comprenden un brazo de unión a CD3 y un segundo brazo que se une a un antígeno diana. Por lo tanto, la presente divulgación incluye anticuerpos biespecíficos en donde un brazo de una inmunoglobulina se une al CD3 humano y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para un antígeno diana. El antígeno diana al que se une el otro grupo del anticuerpo biespecífico CD3 puede ser cualquier antígeno expresado en o cerca de una célula, tejido, órgano, microorganismo o virus, contra el cual se desea una respuesta inmunitaria dirigida. El brazo de unión a CD3 puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR o CDR como se expone en la tabla 2 en el presente documento. En determinadas realizaciones, el brazo de unión a CD3 se une de forma débil a la CD3 humana e induce la activación de los linfocitos T humanos. En otras realizaciones, el brazo de unión a CD3 se une de forma débil a CD3 humana e induce la destrucción de células que expresan antígenos asociados a tumores en el contexto de un anticuerpo biespecífico o multiespecífico. En otras realizaciones, el brazo de unión a CD3 se une o se asocia de forma débil con CD3 humana y de macaco (mono), sin embargo, la interacción de unión no es detectable mediante ensayos in vitro conocidos en la materia. En algunas realizaciones de la invención, el brazo de unión a CD3 no se une ni se asocia con CD3 humana y de macaco (mono), sin embargo, la molécula biespecífica aún provoca la destrucción celular asociada al tumor.

En el contexto de anticuerpos biespecíficos de la presente invención en donde un brazo del anticuerpo se une a CD3 y el otro brazo se une a un antígeno diana, el antígeno diana puede ser un antígeno asociado a tumor (TAA). Los ejemplos no limitantes de antígenos específicos asociados a tumores incluyen, por ejemplo, AFP, ALK, proteínas BAGE, BIRC5 (survivina), BIRC7, p-catenina, brcabl, BRCA1, BORIS, CA9, anhidrasa carbónica IX, caspasa-8, CALR, CCR5, CD19, CD20 (MS4A1), CD22, CD30, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, ciclina-BI, CYP1B1, EGFR, EGFRvlll, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EpCAM, EphA2, Fra-1, FOLR1, proteínas GAGE (por ejemplo, GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, glipicano-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, LMP2, proteínas MAGE (por ejemplo, MAGE-1, -2, -3, -4, -6 y -12), MART-1, mesotelina, ML-IAP, Muc1, Muc2, Muc3, Muc4, Muc5, Muc16 (CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ESO1, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAME, PSMA (FOLH1), proteínas RAGE, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, STEAP1, STEAP2, TAG-72, TGF-p, TMPRSS2, antígeno Thompson-nouvelle (Tn), TRP-1, TRP-2, tirosinasa y uroplaquina-3.

Los inventores prevén que la presente invención incluye numerosos ejemplos de anticuerpos biespecíficos que tienen un brazo de unión anti-CD3 débil elaborado de acuerdo con la invención.

De acuerdo con determinadas realizaciones ilustrativas, la presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen de manera específica a CD3 y PSMA. En el presente documento dichas moléculas pueden denominarse, por ejemplo, moléculas biespecíficas "anti-CD3/anti-PSMA" o "anti-CD3 * PSMA" o "CD3 * PSMA", etc. El término "PSMA", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la proteína PSMA humana a menos que se especifique que proviene de una especie no humana (por ejemplo, "PSMA de ratón", "PSMA de mono", etc.).

El término "PSMA" se refiere al antígeno de membrana específico de la próstata, también conocido como folato hidrolasa 1 (FOLH1) (UniProtKB/Swiss-Prot. n.° Q04609; SEQ ID NO: 171). PSMA es una glucoproteína integral de membrana no desprendida que se expresa en gran medida en las células epiteliales de la próstata y es un marcador de la superficie celular para el cáncer de próstata.

De acuerdo con otras realizaciones ilustrativas, la presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen de manera específica a CD3 y EGFRvIII. En el presente documento dichas moléculas pueden denominarse, por ejemplo, moléculas biespecíficas "anti-CD3/anti-EGFRvlll" o "anti-CD3 * EGFRvlll" o "CD3 * EGFRvlll", etc. El término "EGFRvIII" se refiere a la proteína EGFRvIII humana a menos que se especifique que proviene de una especie no humana (porejemplo, "EGFRvlll de ratón", "EGFRvlll de mono", etc.).

El término "EGFRvlll" se refiere a la variante de clase III del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFRvlll; SEQ ID NO: 172), que es la variante de EGFR que se encuentra con mayor frecuencia en el glioblastoma (Bigner et al., 1990, Cancer Res 50:8017-8022; Humphrey et al., 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87:4207-4211; Yamazaki et al., 1990, Jap J Cancer Res 81:773-779; Ekstrand et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4309-4313; Wikstrand et al., 1995, Cancer Res 55:3140-3148; y Frederick et al., 2000, Cancer Res 60:1383-1387). EGFRvIII se caracteriza por una eliminación de los exones 2 a 7 del gen EGFR, lo que da como resultado una eliminación en el marco de 801 pares de bases de la región codificante, es decir, una eliminación de los restos de aminoácidos 6 a 273 (basado en el número de restos de EGFR maduro; véase UniProtKB/Swiss-Prot. N.° P00533), así como la generación de una nueva glicina en la unión de fusión (Humphrey et al., 1988, Cancer Res 48:2231-2238; Yamazaki et al., 1990, citado anteriormente). Se ha demostrado que EGFRvIII tiene una actividad cinasa independiente del ligando débil pero constitutivamente activa, así como tumorigenia mejorada (Nishikawa et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:7727-7731; y Batra et al., 1995, Cell Growth and Differentiation 6:1251-1259). Además de en los gliomas, se ha detectado EGFRvIII en carcinoma de mama ductal e intraductal (Wikstrand et al., 1995, Cancer Res 55:3140-3148), carcinomas de pulmón no microcítico (García de Palazzo et al., 1993, Cancer Res 53:3217-3220), carcinomas de ovario (Moscatello et al., 1995, Cancer Res 55:5536-5539), cáncer de próstata (Olapade-Olaopa et al., 2000, British J Cancer 82:186-194) y carcinoma epidermoide de cabeza y cuello (Tinhofer et al., 2011, Clin Cancer Res 17(15):5197-5204).

En aún otras realizaciones ilustrativas, la presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen de manera específica a CD3 y MUC16. En el presente documento dichas moléculas pueden denominarse, por ejemplo, moléculas biespecíficas "anti-CD3/anti-MuC16" o "anti-CD3 * MUC16" o "CD3 * MUC16", etc. El término "MUC16" se refiere a la proteína MUC16 humana a menos que se especifique que proviene de una especie no humana (por ejemplo, "MUC16 de ratón", "MUC16 de mono", etc.).

Mucina 16 (MUC16; secuencia de referencia del NCBI: NP_078966.2, SEQ ID NO: 173), también conocida como antígeno de cáncer 125 (CA-125), es una mucina codificada por el gen MUC16 en seres humanos. Se sabe que la familia de proteínas de mucina protege al cuerpo de la infección por la unión de patógenos a oligosacáridos en el dominio extracelular, evitando que la forma patógena llegue a la superficie celular. Durante muchos años, la sobreexpresión de MUC16/CA125 se ha utilizado como marcador de pronóstico y diagnóstico para el cáncer de ovario (Yin y Lloyd, 2001, J. Biol. Chem. 276 (29), 27371-27375; O'Brien, T. J., et al., 2001, Tumour Biol. 22 (6), 348-366; Leggieri, C. et al., 2014, Eur. J. Gynaecol. Oncol. 35 (4), 438-441). Se ha demostrado que MUC16 protege las células tumorales del sistema inmunitario con su dominio de repetición en tándem fuertemente glucosilado que puede unirse a galectina-1 (una proteína inmunosupresora) (Seelenmeyer, C., et al., 2003, J. Cell. Sci. 116 (Pt 7): 1305-18; O'Brien, T. J., et al., 2002, Tumour Biol. 23 (3), 154-169). Los linfocitos citolíticos naturales y los monocitos no pueden atacar las células tumorales que expresan niveles elevados de MUC16. En su papel fisiológico normal, la interacción de MUC16 y galactina sirve como barrera para la infección bacteriana y vírica, sin embargo, se cree que MUC16 es inmunoprotector en el contexto de las células tumorales, evitando así la citólisis de células cancerosas (Felder, M. et al., 2014, Molecular Cancer, 13:129). Por tanto, MUC16 es una diana deseable para las moléculas de anticuerpos biespecíficos inmunoterapéuticas administradas para tratar el cáncer de ovario mediante la activación de las células efectoras inmunitarias.

En aún otras realizaciones ilustrativas, la presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen de manera específica a CD3 y STEAP2. En el presente documento dichas moléculas pueden denominarse, por ejemplo, moléculas biespecíficas "anti-CD3/anti-STEAP2" o "anti-CD3 * STEAP2" o "CD3 * STEAP2", etc. El término "STEAP2" se refiere a la proteína STEAP2 humana a menos que se especifique que proviene de una especie no humana (por ejemplo, "STEAP2 de ratón", "STEAP2 de mono", etc.). Seis antígenos epiteliales transmembrana de la próstata 2 (STEAP2; UniProtKB/Swiss-Prot: Q8NFT2.3) es una proteína de 490 aminoácidos codificada por el gen STEAP2 ubicado en la región cromosómica 7q21 en seres humanos.

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas antes mencionadas que se unen de manera específica al antígeno asociado a tumores comprenden una molécula de unión a antígeno anti-CD3 que se une a CD3 con una afinidad de unión débil o no detectable, tal como que presenta una K^d superior a aproximadamente 100 nM, 300 nM o 500 nM, medida mediante un ensayo de unión por afinidad in vitro.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "molécula de unión a antígeno" significa una proteína, polipéptido o complejo molecular que comprende o consiste en al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) que sola, o en combinación con una o más CDR y/o regiones marco (FR) adicionales, se une de manera específica a un antígeno particular. En determinados casos, una molécula de unión a antígeno es un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo, como se definen esos términos en otras partes en el presente documento.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "molécula de unión a antígeno biespecífica" significa una proteína, polipéptido o complejo molecular que comprende al menos un primer dominio de unión a antígeno y un segundo dominio de unión a antígeno. Cada dominio de unión a antígeno dentro de la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende al menos una CDR que sola, o en combinación con una o más CDR y/o FR adicionales, se une de manera específica a un antígeno particular. En el contexto de la presente divulgación, el primer dominio de unión a antígeno se une de manera específica a un primer antígeno (porejemplo, CD3), y el segundo dominio de unión a antígeno se une de manera específica a un segundo antígeno distinto (por ejemplo, PSMA, MUC16, EGFRvIII o STEAP2).

La molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención es un anticuerpo biespecífico. Cada dominio de unión a antígeno de un anticuerpo biespecífico comprende un dominio variable de cadena pesada (HCVR) y un dominio variable de cadena ligera (LCVR). En el contexto de una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un primer y un segundo dominios de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico), las CDR del primer dominio de unión a antígeno pueden designarse con el prefijo "A1" y las CDR del segundo dominio de unión a antígeno pueden designarse con el prefijo "A2". Por lo tanto, en el presente documento las CDR del primer dominio de unión a antígeno pueden denominarse A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3; y las CDR del segundo dominio de unión a antígeno en el presente documento pueden denominarse A2-HCDR1, A2-HCDR2 y A2-HCDR3.

El primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno pueden estar conectados directa o indirectamente entre sí para formar una molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente invención. De manera alternativa, el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno pueden estar unidos a un dominio de multimerización separado. La asociación de un dominio de multimerización con otro dominio de multimerización facilita la asociación entre los dos dominios de unión a antígeno, formando así una molécula de unión a antígeno biespecífica. Tal como se utiliza en el presente documento, un "dominio de multimerización" es cualquier macromolécula, proteína, polipéptido, péptido o aminoácido que tiene la capacidad de asociarse con un segundo dominio de multimerización de la misma estructura o constitución o similar. Por ejemplo, un dominio de multimerización puede ser un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina C^h3. Un ejemplo no limitante de un componente de multimerización es una porción Fc de una inmunoglobulina (que comprende un dominio C^h2-C^h3), por ejemplo, un dominio Fc de una IgG seleccionada de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, así como cualquier alotipo dentro de cada grupo de isotipo.

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención comprenderán normalmente dos dominios de multimerización, por ejemplo, dos dominios Fc que son cada uno de manera individual parte de una cadena pesada de anticuerpo separada. El primer y segundo dominio de multimerización pueden ser del mismo isotipo de IgG tal como, por ejemplo, IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4. De manera alternativa, el primer y segundo dominio de multimerización pueden ser de diferentes isotipos de IgG tales como, por ejemplo, IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4, etc.

En determinadas realizaciones, el dominio de multimerización es un fragmento Fc o una secuencia de aminoácidos de 1 a aproximadamente 200 aminoácidos de longitud que contiene al menos un resto de cisteína. En otras realizaciones, el dominio de multimerización es un resto de cisteína o un péptido corto que contiene cisteína. Otros dominios de multimerización incluyen péptidos o polipéptidos que comprenden o consisten en una cremallera de leucina, un motivo de bucle de hélice o un motivo de hélice superenrrollada.

Puede utilizarse cualquier formato o tecnología de anticuerpo biespecífico para preparar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene una primera especificidad de unión a antígeno puede unirse de manera funcional (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tal como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene una segunda especificidad de unión a antígeno para producir una molécula de unión a antígeno biespecífica. Otros formatos biespecíficos ilustrativos específicos que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención incluyen, sin limitación, por ejemplo, formatos biespecíficos basados en scFv o de diacuerpo, fusiones IgG-scFv, dominio variable doble (DVD)-Ig, cuadroma, "botón en ojal", cadena ligera común (por ejemplo, cadena ligera común con protuberancias en los orificios, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)cuerpo, cremallera de leucina, Duocuerpo, IgG1/IgG2, Fab de acción doble (DAF)-IgG y formatos biespecíficos de Mab2 (véase, por ejemplo, Klein et al., 2012, mAbs 4:6, 1-11, y las referencias citadas en el mismo, para una revisión de los formatos anteriores).

En el contexto de moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención, los dominios de multimerización, por ejemplo, dominios Fc, pueden comprender uno o más cambios de aminoácidos (por ejemplo, inserciones, eliminaciones o sustituciones) en comparación con la versión de origen natural de tipo silvestre del dominio Fc. Por ejemplo, la invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden una o más modificaciones en el dominio Fc que dan como resultado un dominio Fc modificado que tiene una interacción de unión modificada (por ejemplo, mejorada o disminuida) entre Fc y FcRn. En una realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende una modificación en una región C^h2 o C^h3, en donde la modificación aumenta la afinidad del dominio Fc por FcRn en un ambiente ácido (por ejemplo, en un endosoma donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones de Fc incluyen, por ejemplo, una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, L/R/S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o Y); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F) y 434. En una realización, la modificación comprende una modificación 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación 428L, 259I (por ejemplo, V259I) y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación 433K (por ejemplo, H433K) y en 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación en 252, 254 y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T y 256e ); una modificación 250Q y 428L (porejemplo, T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P).

La presente invención también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio C^h3 y un segundo dominio C^h3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio C^h3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio C^h3 de Ig está unido a la proteína A y el segundo dominio C^h3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a la proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo C^h3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo C^h3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG4.

En determinadas realizaciones, el dominio Fc puede ser quimérico, que combina secuencias de Fc procedentes de más de un isotipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, un dominio Fc quimérico puede comprender parte o la totalidad de una secuencia C^h2 procedente de una región C^h2 de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, y parte o la totalidad de una secuencia C^h3 procedente de una IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. Un dominio Fc quimérico también puede contener una región bisagra quimérica. Por ejemplo, una bisagra quimérica puede comprender una secuencia de "bisagra superior", procedente de una región bisagra de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, combinada con una secuencia de "bisagra inferior", procedente de una región bisagra de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. Un ejemplo particular de un dominio Fc quimérico que se puede incluir en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno establecidas en el presente documento comprende, desde el extremo N al extremo C: [C^h1 de IgG4] -[Bisagra superior de IgG4] -[Bisagra inferior de IgG2] -[C^h2 de IgG4] -[C^h3 de IgG4]. Otro ejemplo de un dominio Fc quimérico que se puede incluir en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno establecidas en el presente documento comprende, desde el extremo N al extremo C: [C^h1 de IgG1] -[Bisagra superior de IgG1] -[Bisagra inferior de IgG2] -[C^h2 de IgG4] -[C^h3 de IgG1]. Estos y otros ejemplos de dominios Fc quiméricos que se pueden incluir en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno de la presente invención se describen en la Publicación Internacional PCT N.° WO2014/121087 A1, publicada el 7 de agosto de 2014. Los dominios Fc quiméricos que tienen estas disposiciones estructurales generales y variantes de los mismos, pueden tener alterada la unión al receptor de Fc, que a su vez afecta la función efectora de Fc.

En determinados casos, la divulgación se refiere a una cadena pesada de anticuerpo en donde la región de la región constante de cadena pesada (CH) comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % idéntica a una cualquiera de la SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190 o SEQ ID NO: 191. En algunos casos, la región de la región constante de cadena pesada (CH) comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190 y SEQ ID NO: 191.

En otros casos, la divulgación se refiere a una cadena pesada de anticuerpo en donde el dominio Fc comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % idéntica a una cualquiera de la SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200 o SEQ ID NO: 201. En algunos casos, el dominio Fc comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200 y SEQ ID NO: 201.

Otras variantes de Fc

De acuerdo con determinados casos de la presente divulgación, se proporcionan anticuerpos anti-CD3 y moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-TAA que comprenden un dominio Fc que comprende una o más mutaciones que potencian o reducen la unión del anticuerpo al receptor FcRn, por ejemplo, a pH ácido en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos que comprenden una mutación en la región C^h2 o C^h3 del dominio Fc, en donde la mutación o mutaciones aumentan la afinidad del dominio Fc por FcRn en un entorno ácido (por ejemplo, en un endosoma en el que el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0).

Dichas mutaciones pueden dar como resultado un aumento de la semivida en suero del anticuerpo cuando se administra a un animal. Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones de Fc incluyen, por ejemplo, una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, H/L/R/S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o Y); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en 307 o 308 (por ejemplo, 308f , V308F) y 434. En un caso, la modificación comprende una modificación 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación 428L, 259I (por ejemplo, V259I) y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación 433K (por ejemplo, H433K) y en 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación en 252, 254 y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T y 256E); una modificación 250Q y 428L (por ejemplo, T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P).

Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-CD3 y moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-TAA, que comprenden un dominio Fc que comprende uno o más pares o grupos de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: 250Q y 248L (por ejemplo, T250Q y M248L); 252Y, 254T y 256E (por ejemplo, M252Y, S254T y T256E); 428L y 434S (por ejemplo, M428L y N434S); y 433K y 434F (por ejemplo, H433K y N434F). Todas las posibles combinaciones de las mutaciones del dominio Fc anteriores y otras mutaciones dentro de los dominios variables de los anticuerpos divulgados en el presente documento, se contemplan dentro del alcance de la presente divulgación.

Características biológicas de los anticuerpos y las moléculas de unión a antígeno biespecíficas

La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) que pueden unirse de forma simultánea a CD3 humano y TAA humano. De acuerdo con determinadas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención interactúan de manera específica con las células que expresan CD3 y/o TAA, tales como PSMA, EGFRvIII o MUC16. El brazo de unión que interactúa con las células que expresan CD3 puede tener una unión débil a no detectable según se mide en un ensayo de unión in vitro. El grado en que una molécula de unión a antígeno biespecífica se une a células que expresan CD3 y/o TAA se puede evaluar mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), como se ilustra en el ejemplo 4 en el presente documento.

Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos de los mismos que se unen de manera específica a líneas de linfocitos T humanos que expresan CD3 pero no TAA (por ejemplo, Jurkat), linfocitos T de primates (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica [PBMC] de macaco) y/o células que expresan t Aa . La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a cualquiera de los linfocitos T y líneas de linfocitos T mencionadas anteriormente con un valor de CE⁵⁰ de aproximadamente 1,8 * 10^-8 (18 nM) a aproximadamente 2,1 * 10^-7 (210 nM) o más (es decir, afinidad más débil), e incluye anticuerpos biespecíficos para los cuales CE⁵⁰ es indetectable, como se determina usando un ensayo de unión de FACS como se expone en el ejemplo 4 o un ensayo sustancialmente similar. En determinados casos, los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y los anticuerpos biespecíficos de la presente divulgación se unen a CD3 con una CE⁵⁰ superior a aproximadamente 30 nM, superior a aproximadamente 40 nM, superior a aproximadamente 45 nM, superior a aproximadamente 50 nM, superior a aproximadamente 55 nM, superior a aproximadamente 60 nM, superior a aproximadamente 65 nM, superior a aproximadamente 70 nM, superior a aproximadamente 75 nM, al menos 80 nM, superior a aproximadamente 90 nM, superior a aproximadamente 100 nM, superior a aproximadamente 110 nM, al menos 120 nM, superior a aproximadamente 130 nM, superior a aproximadamente 140 nM, superior a aproximadamente 150 nM, al menos 160 nM, superior a aproximadamente 170 nM, superior a aproximadamente 180 nM, superior a aproximadamente 190 nM, superior a aproximadamente 200 nM, superior a aproximadamente 250 nM, superior a aproximadamente 300 nM, superior a aproximadamente 500 nM, superior a aproximadamente 1 |jM, superior a aproximadamente 2 j M o superior a aproximadamente 3 j M, o sin afinidad de unión detectable, medida por la unión de FACS, por ejemplo, usando un formato de ensayo como se define en el ejemplo 4 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.

La presente divulgación también incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos de los mismos que se unen a células y estirpes celulares que expresan TAA, tales como estirpes celulares que expresan PSMA, EGFRvIII, STEAP2 y MUC16, con un valor de CE⁵⁰ inferior a aproximadamente 100 nM o incluso una concentración inferior necesaria para la unión (es decir, una afinidad más fuerte) tal como inferior a 5,6 nM (5,6 * 10^{­ 9}), según se determina usando un ensayo de unión de FACS como se establece en el ejemplo 4 o un ensayo basado en células sustancialmente similar. La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a cualquiera de las líneas de células tumorales mencionadas anteriormente con una valor de CE⁵⁰ inferior a aproximadamente 50 nM, inferior a aproximadamente 45 nM, inferior a 40 nM, inferior a aproximadamente 35 nM, inferior a aproximadamente 30 nM, inferior a aproximadamente 25 nM, inferior a aproximadamente 20 nM, inferior a aproximadamente 15 nM, inferior a aproximadamente 10 nM, inferior a aproximadamente 6 nM, inferior a aproximadamente 5 nM o inferior a aproximadamente 1 nM, por ejemplo, utilizando el ensayo mencionado anteriormente.

La presente divulgación incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos de los mismos que se unen a CD3 humano con afinidad baja, débil o incluso no detectable. De acuerdo con determinados casos, la presente divulgación se refiere a anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos que se unen a CD3 humano (por ejemplo., a 37° C) con una K^d superior a aproximadamente 11 nM, incluyendo anticuerpos que se unen a CD3 con una K^d superior a aproximadamente 100 nM o 500 nM e incluyendo también anticuerpos que no tienen afinidad de unión detectable, según se mide mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando un formato de ensayo como se define en el ejemplo 5 en el presente documento. En determinados casos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación se unen a CD3 con una K^d superior a aproximadamente 15 nM, superior a aproximadamente 20 nM, superior a aproximadamente 25 nM, superior a aproximadamente 30 nM, superior a aproximadamente 35 nM, superior a aproximadamente 40 nM, superior a aproximadamente 45 nM, superior a aproximadamente 50 nM, superior a aproximadamente 55 nM, superior a aproximadamente 60 nM, superior a aproximadamente 65 nM, superior a aproximadamente 70 nM, superior a aproximadamente 75 nM, al menos 80 nM, superior a aproximadamente 90 nM, superior a aproximadamente 100 nM, superior a aproximadamente 110 nM, al menos 120 nM, superior a aproximadamente 130 nM, superior a aproximadamente 140 nM, superior a aproximadamente 150 nM, al menos 160 nM, superior a aproximadamente 170 nM, superior a aproximadamente 180 nM, superior a aproximadamente 190 nM, superior a aproximadamente 200 nM, superior a aproximadamente 250 nM, superior a aproximadamente 300 nM, superior a aproximadamente 1 |jM, superior a aproximadamente 2 j M o superior a aproximadamente 3 j M o sin afinidad detectable, según se mide mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando un formato de ensayo como se define en el ejemplo 5 en el presente documento (por ejemplo, formato de captura de AcM o captura de antígeno) o un ensayo sustancialmente similar.

La presente divulgación incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos de los mismos que se unen a CD3 de mono (es decir, de macaco) con afinidad baja, débil o incluso no detectable. De acuerdo con determinados casos, la presente divulgación incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos de los mismos que se unen a CD3 humano (por ejemplo., a 37° C) con una K^d superior a aproximadamente 10 nM, incluyendo anticuerpos que se unen a c D3 con una K^d superior a aproximadamente 100 nM o 500 nM e incluyendo también anticuerpos que no tienen afinidad de unión detectable, según se mide mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando un formato de ensayo como se define en el ejemplo 5 en el presente documento. En determinados casos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación se unen a CD3 con una K^d superior a aproximadamente 15 nM, superior a aproximadamente 20 nM, superior a aproximadamente 25 nM, superior a aproximadamente 30 nM, superior a aproximadamente 35 nM, superior a aproximadamente 40 nM, superior a aproximadamente 45 nM, superior a aproximadamente 50 nM, superior a aproximadamente 55 nM, superior a aproximadamente 60 nM, superior a aproximadamente 65 nM, superior a aproximadamente 70 nM, superior a aproximadamente 75 nM, al menos 80 nM, superior a aproximadamente 90 nM, superior a aproximadamente 100 nM, superior a aproximadamente 110 nM, al menos 120 nM, superior a aproximadamente 130 nM, superior a aproximadamente 140 nM, superior a aproximadamente 150 nM, al menos 160 nM, superior a aproximadamente 170 nM, superior a aproximadamente 180 nM, superior a aproximadamente 190 nM, superior a aproximadamente 200 nM, superior a aproximadamente 250 nM, superior a aproximadamente 300 nM, superior a aproximadamente 1 j M, superior a aproximadamente 2 j M o superior a aproximadamente 3 j M o sin afinidad detectable, según se mide mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando un formato de ensayo como se define en el ejemplo 5 en el presente documento (por ejemplo, formato de captura de AcM o captura de antígeno) o un ensayo sustancialmente similar.

La presente divulgación incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos de los mismos que se unen a CD3 humano e inducen la activación de linfocitos T. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-CD3 que inducen la activación de linfocitos T humanos con un valor de CE⁵⁰ inferior a aproximadamente 113 pM, medido por un ensayo de activación de linfocitos T in vitro, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el ejemplo 6 en el presente documento [por ejemplo, evaluando el porcentaje de células activadas (CD69+) del total de linfocitos T (CD2+) en presencia de anticuerpos anti-CD3] o un ensayo sustancialmente similar que evalúe los linfocitos T en su estado activado. En determinados casos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación inducen la activación de linfocitos T humanos [por ejemplo, el porcentaje de linfocitos T activados (CD69+)] con un valor CE⁵⁰ inferior a aproximadamente 100 pM, inferior a aproximadamente 50 pM, inferior a aproximadamente 20 pM, inferior a aproximadamente 19 pM, inferior a aproximadamente 18 pM, inferior a aproximadamente 17 pM, inferior a aproximadamente 16 pM, inferior a aproximadamente 15 pM, inferior a aproximadamente 14 pM, inferior a aproximadamente 13 pM, inferior a aproximadamente 12 pM, inferior a aproximadamente 11 pM, inferior a aproximadamente 10 pM, inferior a aproximadamente 9 pM, inferior a aproximadamente 8 pM, inferior a aproximadamente 7 pM, inferior a aproximadamente 6 pM, inferior a aproximadamente 5 pM, inferior a aproximadamente 4 pM, inferior a aproximadamente 3 pM, inferior a aproximadamente 2 pM o inferior a aproximadamente 1 pM, medido por un ensayo de activación de linfocitos T in vitro, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el ejemplo 6 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar. Los anticuerpos anti-CD3 que tienen una unión débil o no detectable a CD3 tienen la capacidad de inducir la activación de linfocitos T con potencia elevada (es decir, intervalo pM), a pesar de tener una afinidad de unión débil o no detectable a CD3, como se ejemplifica en el ejemplo 6 en el presente documento.

La presente divulgación también incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígenos y anticuerpos biespecíficos que se unen a CD3 humano e inducen la destrucción mediada por linfocitos T de células que expresan antígenos tumorales. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-CD3 que inducen la destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T con una CE⁵⁰ inferior a aproximadamente 1,3 nM, medido en un ensayo de destrucción de células tumorales in vitro mediado por linfocitos T, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el ejemplo 6 en el presente documento(por ejemplo, evaluando la extensión de las células que expresan antígenos tumorales, tales como la destrucción de células que expresan PSMA, EGFRvIII o MUC16 mediante PBMC humanas en presencia de anticuerpos anti-CD3) o un ensayo sustancialmente similar. En determinados casos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación inducen la destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T (por ejemplo., destrucción de células OVCAR3 mediada por PBMC) con un valor de CE⁵⁰ inferior a aproximadamente 1 nM, inferior a aproximadamente 400 pM, inferior a aproximadamente 250 pM, inferior a aproximadamente 100 pM, inferior a aproximadamente 50 pM, inferior a aproximadamente 40 pM, inferior a aproximadamente 30 pM, inferior a aproximadamente 20 pM, inferior a aproximadamente 10 pM, inferior a aproximadamente 9 pM, inferior a aproximadamente 8 pM, inferior a aproximadamente 7 pM, inferior a aproximadamente 6 pM, inferior a aproximadamente 5 pM, inferior a aproximadamente 4 pM, inferior a aproximadamente 3 pM, inferior a aproximadamente 2 pM o inferior a aproximadamente 1 pM, medida por un ensayo de destrucción de células tumorales in vitro mediado por linfocitos T, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el ejemplo 6 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.

La presente divulgación también incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos que se unen a CD3 con una semivida (t1^ ) disociativa inferior a aproximadamente 10 minutos, medida por resonancia de plasmón de superficie a 25 °C o 37 °C, por ejemplo, usando un formato de ensayo como se define en el ejemplo 5 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar. En determinados casos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación se unen a CD3 con una t1^ inf , inferior a aproximadamente 8 minutos, inferior a aproximadamente 7 minutos, inf , inferior a aproximadamente 5 minutos, inferior a aproximadamente 4 minutos, inf , inferior a aproximadamente 2 minutos, inferior a aproximadamente 1,9 minutos o s o presentan una unión muy débil o no detectable medida por resonancia de plas

ejemplo, usando un formato de ensayo como se define en el ejemplo 5 en el presente documento (porejemplo, formato de captura de AcM o captura de antígeno) o un ensayo sustancialmente similar.

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-TAA de la presente invención pueden presentar de manera adicional una o más características seleccionadas del grupo que consiste en: (a) inducir la proliferación in vitro de PBMC; (b) activar los linfocitos T mediante la inducción de la liberación de IFN-y y la regulación positiva de CD25 en sangre completa humana; y (c) inducir citotoxicidad mediada por linfocitos T en estirpes celulares resistentes a anti-TAA.

La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-TAA que son capaces de agotar las células que expresan antígenos tumorales en un sujeto (véase, por ejemplo, el ejemplo 7). Por ejemplo, de acuerdo con determinadas realizaciones, se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA, anti-CD3/anti-MUC16 o anti-CD3/anti-STEAP2, en donde una sola administración de 1 |jg o 10 |jg o 100 |jg de la molécula de unión al antígeno biespecífica a un sujeto (por ejemplo., a una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,08 mg/kg, aproximadamente 0,06 mg/kg, aproximadamente 0,04 mg/kg, aproximadamente 0,04 mg/kg, aproximadamente 0,02 mg/kg, aproximadamente 0,01 mg/kg o menos) provoca una reducción en el número de células que expresan antígenos tumorales en el sujeto (por ejemplo, se suprime o inhibe el crecimiento tumoral en el sujeto) por debajo de los niveles detectables. En determinadas realizaciones, una administración única de la molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-PSMA a una dosis de aproximadamente 0,4 mg/kg provoca una reducción en el crecimiento tumoral en el sujeto por debajo de los niveles detectables hacia aproximadamente el día 7, aproximadamente el día 6, aproximadamente el día 5, aproximadamente el día 4, aproximadamente el día 3, aproximadamente el día 2 o aproximadamente el día 1 después de la administración de la molécula de unión a antígeno biespecífica al sujeto. De acuerdo con determinadas realizaciones, una administración única de una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-PSMA de la invención, a una dosis de al menos aproximadamente 0,01 mg/kg, hace que el número de células tumorales que expresan PSMA permanezca por debajo de niveles detectables hasta al menos aproximadamente 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días o más, después de la administración. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "por debajo de los niveles detectables" significa que no se pueden detectar directa o indirectamente células tumorales que crezcan subcutáneamente en un sujeto usando métodos de medición de calibre estándar, por ejemplo, como se establece en el ejemplo 7, en el presente documento. En determinadas realizaciones, una administración única de la molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-MUC16 a una dosis de aproximadamente 10 jg provoca una supresión del crecimiento tumoral en el sujeto aproximadamente el día 6, y mantiene la supresión tumoral hasta al menos el día 26 después de la administración de la molécula de unión a antígeno biespecífica al sujeto. En sujetos que reciben una administración única de la molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-MUC16 a una dosis de aproximadamente 10 jg al menos 7 días después de la implantación del tumor, la molécula de unión a antígeno biespecífica presente eficacia en la supresión de tumores establecidos desde el crecimiento adicional en el sujeto hasta aproximadamente el día 26 después de la implantación del tumor en el sujeto. De acuerdo con determinadas realizaciones, una administración única de una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-MUC16 de la invención, a una dosis de al menos aproximadamente 0,1 mg/kg, inhibe el crecimiento de las células tumorales que expresan MUC16 durante al menos aproximadamente 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días o más, tras la administración de la molécula biespecífica. Véase, por ejemplo, el ejemplo 8.

En determinadas realizaciones, una administración única de la molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-STEAP2 a una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg o 0,01 mg/kg mantiene una supresión del crecimiento tumoral hasta al menos el día 46 después de la administración de la molécula de unión a antígeno biespecífica y el tumor al sujeto. De acuerdo con determinadas realizaciones, una administración única de una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-STEAP2 de la invención, a una dosis de al menos aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,08 mg/kg, aproximadamente 0,06 mg/kg, aproximadamente 0,05 mg/kg, aproximadamente 0,04 mg/kg, aproximadamente 0,03 mg/kg, aproximadamente 0,02 mg/kg, aproximadamente 0,01 mg/kg o menos inhibe el crecimiento de células tumorales que expresan STEAP2 durante al menos aproximadamente 20 días, 30 días, 35 días, 40 días, 45 días o más, tras la administración de la molécula biespecífica. Véase, por ejemplo, el ejemplo 10.

En otras realizaciones, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-TAA que tienen un brazo de unión dirigido a CD3 que tiene una afinidad de unión débil a las células efectoras presentan tasas de eliminación del fármaco reducidas en comparación con los anticuerpos biespecíficos que comprenden el mismo brazo de unión anti-TAA y un brazo de unión fuerte de CD3 administrado en un estudio farmacocinético in vivo. Los resultados sugieren que las moléculas biespecíficas que comprenden una unión más débil del brazo que se dirige a CD3 pueden presentar niveles de exposición al fármaco (ABC^último) y perfiles de eliminación de fármacos (aclaramiento de anticuerpos) beneficiosos. Véase, por ejemplo, el ejemplo 9.

La presente invención proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA, anti-CD3/anti-MUC16 y anti-CD3/anti-STEAP2 (es decir, moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-TAA) que presentan una o más características seleccionadas del grupo que consiste en: (a) inhibir el crecimiento tumoral en ratones inmunodeprimidos que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano; (b) inhibir el crecimiento tumoral en ratones inmunocompetentes que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano; (c) suprimir el crecimiento tumoral de tumores establecidos en ratones inmunodeprimidos que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano; y (d) reducir el crecimiento tumoral de tumores establecidos en ratones inmunocompetentes que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano (véanse, por ejemplo, los ejemplos 7, 8 y 10). La presente invención también proporciona anticuerpos biespecíficos anti-CD3/anti-PSMA, anti-CD3/anti-MUC16 y anti-CD3/anti-STEAP2 (es decir, anticuerpos biespecíficos anti-CD3/anti-TAA) que comprenden una primera cadena pesada dirigida a un linfocito T efector (es decir, CD3), y ii) una segunda cadena pesada dirigida a una célula tumoral diana, en donde los anticuerpos biespecíficos presentan unión débil o unión no detectable a las células efectoras, y presentan supresión del crecimiento tumoral y aclaramiento reducido de anticuerpos (es decir, eliminación) del cuerpo en comparación con los anticuerpos biespecíficos que presentan unión fuerte a células efectoras.

Mapeo de epítopos y tecnologías relacionadas

El epítopo en CD3 o al que se unen las moléculas de unión a antígeno de la presente invención puede consistir en una única secuencia contigua de 3 o más (por ejemplo., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos de una proteína CD3. De manera alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos no contiguos (o secuencias de aminoácidos) de CD3. Los anticuerpos de la invención pueden interactuar con los aminoácidos contenidos dentro de una sola cadena CD3 (por ejemplo., CD3e, CD38 o CD3y), o pueden interactuar con aminoácidos en dos o más cadenas CD3 diferentes. El término "epítopo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas en un antígeno y pueden tener diferentes efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce mediante aminoácidos yuxtapuestos de manera espacial de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En determinadas circunstancias, un epítopo puede incluir fracciones de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.

Para determinar si un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo "interactúa con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o proteína se pueden utilizar diversas técnicas conocidas por los expertos en la materia. Las técnicas ilustrativas incluyen, por ejemplo, ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como el descrito en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), análisis mutacional de rastreo con alanina, análisis de transferencias de péptidos (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463) y análisis de escisión de péptidos. Además, se pueden emplear métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Otro método que puede usarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interactúa un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio hidrógeno/deuterio implica el marcado con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo de proteína/anticuerpo se transfiere a agua para permitir que tenga lugar el intercambio de hidrógeno-deuterio en todos los restos, excepto en los restos protegidos por el anticuerpo (que permanecen marcados con deuterio). Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana se somete a escisión por proteasas y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa el anticuerpo. Véase, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2): 252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A. Para fines de mapeo de epítopos también puede usarse cristalografía de rayos X del complejo antígeno/anticuerpo.

La presente divulgación incluye además anticuerpos anti-PSMA que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se establece en la tabla 6 en el presente documento). De manera análoga, la presente divulgación también incluye anticuerpos anti-PSMA que compiten por unirse a PSMA con cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se establece en la tabla 6 en el presente documento). Anticuerpos anti-PSMA divulgados en la publicación de EE. UU. n.° US 2017-0051074 A1.

La presente divulgación también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une de manera específica a CD3 humano y/o CD3 de macaco con afinidad de unión baja o detectable, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une de manera específica al antígeno asociado a tumores (TAA) humanos, en donde el primer dominio de unión a antígeno se une al mismo epítopo en CD3 que cualquiera de los dominios de unión a antígeno específicos de CD3 ilustrativos específicos descritos en el presente documento.

De manera análoga, la presente divulgación también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une de manera específica a CD3 humano y/o CD3 de macaco con afinidad de unión baja o detectable, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une de manera específica al antígeno asociado a tumores (TAA) humanos, en donde el primer dominio de unión a antígeno compite por la unión a CD3 con cualquiera de los dominios de unión a antígeno específicos de CD3 ilustrativos específicos descritos en el presente documento.

Se puede determinar fácilmente si una molécula de unión a antígeno particular (por ejemplo, un anticuerpo) o un dominio de unión a antígeno de la misma se une al mismo epítopo que, o si compite por unirse a, una molécula de unión a antígeno de referencia de la presente invención mediante métodos de rutina conocidos en la materia. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de prueba se une al mismo epítopo en CD3 (o TAA) como una molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia de la presente invención, primero se permite la unión de la molécula biespecífica de referencia a una proteína CD3 (o proteína TAA). A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de prueba de unirse a la molécula de CD3. Si el anticuerpo de prueba puede unirse a CD3 (o TAA) después de unión de saturación con la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de prueba se une a un epítopo diferente de CD3 (o TAA) que la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia. Por otra parte, si el anticuerpo de prueba no puede unirse a la molécula de CD3 (o TAA) después de unión de saturación con la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia, entonces el anticuerpo de prueba puede unirse al mismo epítopo de CD3 (o TAA) que el epítopo unido por la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia de la divulgación. A continuación, se puede realizar una experimentación de rutina adicional (por ejemplo, análisis de mutación y unión peptídica) para confirmar si la falta de unión observada del anticuerpo de prueba se debe realmente a la unión al mismo epítopo que la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la falta de unión observada. Si el anticuerpo de referencia es uno que no tiene unión medible como se ejemplifica en el presente documento, entonces, el anticuerpo de referencia puede mutarse de nuevo a la secuencia de la línea germinal para determinar la unión al CD3 con el fin de comparar la interacción del epítopo, o comparar sus propiedades de unión con el anticuerpo de prueba como se describe en el presente documento. Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, RIA, Biacore, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la materia. De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, dos proteínas de unión a antígeno se unen al mismo epítopo (o al que se solapan) si, por ejemplo, un exceso de 1, 5, 10, 20 o 100 veces de una proteína de unión a antígeno inhibe la unión de la otra en al menos un 50 %, pero preferentemente un 75 %, un 90 % o incluso un 99 %, según se mide en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). De manera alternativa, se considera que dos proteínas de unión a antígeno se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de una proteína de unión a antígeno reducen o eliminan la unión de la otra. Se considera que dos proteínas de unión a antígeno tienen "epítopos superpuestos" si solo un subconjunto de las mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de una proteína de unión a antígeno reduce o elimina la unión de la otra.

Para determinar si un anticuerpo o dominio de unión a antígeno del mismo compite por unirse con una molécula de unión a antígeno de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que la molécula de unión a antígeno de referencia se una a una proteína CD3 (o proteína TAA) en condiciones de saturación seguido de evaluación de la unión del anticuerpo de prueba a la molécula CD3 (o TAA). En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de prueba se una a una molécula CD3 (o TAA) en condiciones de saturación seguido de una evaluación de la unión de la molécula de unión a antígeno de referencia a la molécula CD3 (o TAA). Si, en ambas orientaciones, solo la primera molécula de unión al antígeno (saturante) es capaz de unirse a la molécula CD3 (o TAA), entonces se concluye que el anticuerpo de prueba y la molécula de unión a antígeno de referencia compiten por unirse al CD3 (o TAA). Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo que compite por unirse con una molécula de unión a antígeno de referencia no necesariamente se une al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente. Si el anticuerpo de referencia es uno que no tiene unión medible como se ejemplifica en el presente documento, entonces, el anticuerpo de referencia puede mutarse de nuevo a la secuencia de la línea germinal para determinar la unión al CD3 con el fin de comparar la interacción del epítopo, o comparar sus propiedades de unión o bloquear la interacción con el anticuerpo de prueba como se describe en el presente documento.

Preparación de dominios de unión a antígeno y construcción de moléculas biespecíficas

Los dominios de unión a antígeno específicos para antígenos particulares pueden prepararse mediante cualquier tecnología generadora de anticuerpos conocida en la materia. Una vez obtenidos, dos dominios de unión a antígeno diferentes, específicos para dos antígenos diferentes (por ejemplo, CD3 y TAA), se pueden disponer de manera adecuada entre sí para producir una molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente invención utilizando métodos de rutina. (Una exposición de formatos de anticuerpos biespecíficos ilustrativos que se pueden utilizar para construir las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención se proporciona en otras partes en el presente documento). En determinadas realizaciones, uno o más de los componentes individuales (por ejemplo, cadenas pesadas y ligeras) de las moléculas de unión a antígeno multiespecíficas de la invención proceden de anticuerpos quiméricos, humanizados o completamente humanos. Los métodos para fabricar dichos anticuerpos se conocen bien en la materia. Por ejemplo, una o más de las cadenas pesadas y/o ligeras de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención se pueden preparar utilizando la tecnología VELOCIMMUNE™. Usando la tecnología VELOCIMMUNE™ (o cualquier otra tecnología de generación de anticuerpos humanos), se aíslan inicialmente los anticuerpos quiméricos de afinidad elevada contra un antígeno particular (por ejemplo, CD3 o TAA) que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Los anticuerpos se caracterizan y seleccionan por características deseables, que incluyen afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se reemplazan con una región constante humana deseada para generar cadenas pesadas y/o ligeras completamente humanas que pueden incorporarse en las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención.

Los animales genéticamente modificados pueden usarse para hacer moléculas de unión a antígeno biespecíficas humanas. Por ejemplo, puede usarse un ratón genéticamente modificado que es incapaz de reorganizar y expresar una secuencia variable de cadena ligera de inmunoglobulina endógena de ratón, en donde el ratón expresa solo uno o dos dominios variables de cadena ligera humana codificados por secuencias de inmunoglobulina humana unidas de manera operativa al gen constante k de ratón en el locus k de ratón endógeno. Tales ratones genéticamente modificados pueden usarse para producir moléculas de unión a antígeno biespecíficas completamente humanas que comprenden dos cadenas pesadas diferentes que se asocian con una cadena ligera idéntica que comprende un dominio variable procedente de uno de dos segmentos génicos de región variable de cadena ligera humana diferentes. (Véase, por ejemplo, el documento US 2011/0195454 para una exposición detallada de dichos ratones genomanipulados y su uso para producir moléculas de unión a antígeno biespecíficas). Los anticuerpos de la invención comprenden cadenas pesadas de inmunoglobulina asociadas con una cadena ligera común. La cadena ligera común puede proceder de una cadena ligera afín de la cadena pesada anti-TAA, o proceder de una región variable de cadena ligera conocida o de dominio público procedente de una cadena ligera que presenta promiscuidad o capacidad para emparejarse con una amplia variedad de cadenas pesadas no afines, es decir, una cadena ligera universal o común. Los anticuerpos de la invención pueden comprender cadenas pesadas de inmunoglobulina asociadas con una única cadena ligera reordenada. En algunas realizaciones, la cadena ligera es un dominio variable procedente de un segmento del gen Vk1-39 humano o un segmento del gen Vk3-20. En otras realizaciones, la cadena ligera comprende un dominio variable procedente de un segmento del gen Vk1-39 humano reordenado con un segmento del gen Jk5 humano o Jk1 humano, o un segmento del gen Vk3-20 reordenado con un segmento del gen Jk1 humano, o un segmento del gen Vk1-39 reordenado con un segmento del gen Jk1 humano.

Bioequivalentes

La presente invención abarca moléculas de unión a antígeno que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de las moléculas ilustrativas divulgadas en el presente documento pero que retienen la capacidad de unirse o interactuar con CD3 y/o TAA. Tales moléculas variantes pueden comprender una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia precursora, pero presentan actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas descritas.

La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno que son bioequivalentes a cualquiera de las moléculas de unión a antígeno ilustrativas expuestas en el presente documento. Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya velocidad y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, ya sea en una sola dosis o en múltiples dosis. Algunas proteínas de unión a antígeno se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción pero no en su velocidad de absorción y, sin embargo, pueden considerarse bioequivalentes porque tales diferencias en la velocidad de absorción son intencionales y se reflejan en el marcado, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo en, por ejemplo, el uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el producto farmacológico particular estudiado.

En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente importantes en su seguridad, pureza y potencia.

En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenia o eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.

En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan mediante un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la condición o condiciones de uso, en la medida en que dichos mecanismos sean conocidos.

La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en el que se mide la concentración del anticuerpo o sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico como una función del tiempo; (b) un ensayo in vitro que se ha correlacionado con y es razonablemente predictivo de datos de biodisponibilidad in vivo en seres humanos; (c) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos en el que se mide el efecto farmacológico agudo adecuado del anticuerpo (o su diana) como una función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia, biodisponibilidad o bioequivalencia de una proteína de unión a antígeno.

Las variantes bioequivalentes de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas ilustrativas expuestas en el presente documento pueden construirse mediante, por ejemplo, la generación de diversas sustituciones de restos o secuencias o la eliminación de secuencias o restos terminales o internos no necesarios para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden eliminarse restos de cisteína no esenciales para la actividad biológica, o remplazarse con otros aminoácidos, para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, las proteínas de unión a antígeno bioequivalentes pueden incluir variantes de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas ilustrativas expuestas en el presente documento que comprenden cambios de aminoácidos que modifican las características de glucosilación de las moléculas, por ejemplo, mutaciones que eliminan o suprimen la glucosilación.

Selectividad de especies y reactividad cruzada de especies

De acuerdo con determinadas realizaciones de la invención, se proporcionan moléculas de unión a antígeno que muestran una interacción débil o nula con el CD3 humano y una interacción débil o nula con el CD3 de otras especies, tal como CD3 de macaco. También se proporcionan moléculas de unión a antígeno que se unen a TAA humano pero no a TAA de otras especies. La presente invención también incluye moléculas de unión a antígeno que se unen a CD3 humano y a CD3 de una o más especies no humanas; y/o moléculas de unión a antígeno que se unen a TAA humano y a TAA de una o más especies no humanas.

De acuerdo con determinadas realizaciones ilustrativas de la invención, se proporcionan moléculas de unión a antígeno que se unen de manera débil a CD3 humano y/o TAA humano y pueden unirse o no unirse, según sea el caso, a uno o más de TAA y/o CD3 de ratón, rata, cobaya, hámster, jerbo, cerdo, gato, perro, conejo, cabra, oveja, vaca, caballo, camello, macaco cangrejero, tití, macaco de la India o chimpancé. Por ejemplo, en determinadas realizaciones ilustrativas de la presente invención, se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une de manera débil a CD3 humano y CD3 de macaco y un segundo dominio de unión a antígeno que se une de manera específica a PSMA, MUC16, EGFRvIII o STEAP2 humano.

Inmunoconjugados

La presente invención abarca moléculas de unión a antígeno conjugadas con una fracción terapéutica ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunodepresor o un radioisótopo. Los agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. En la materia se conocen ejemplos de agentes citotóxicos y agentes quimioterápicos adecuados para formar inmunoconjugados, (véase, por ejemplo, el documento WO 05/103081).

Formulación terapéutica y administración

La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de unión a antígeno (es decir, anticuerpos biespecíficos) de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención se formulan con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que proporcionan una mejor transferencia, administración, tolerancia y similares. Puede encontrarse una multitud de formulaciones adecuadas en el formulario conocido para todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Véase también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

La dosis de la molécula de unión a antígeno administrada a un paciente puede variar según la edad y la talla del paciente, la enfermedad diana, afecciones, vía de administración y similares. La dosis preferida se calcula normalmente de acuerdo con el peso corporal o el área superficial del cuerpo. Cuando una molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente invención se usa con fines terapéuticos en un paciente adulto, puede ser ventajoso administrar por vía intravenosa la molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente invención normalmente a una dosis única de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la intensidad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. Las dosis eficaces y los programas para administrar una molécula de unión a antígeno biespecífica pueden determinarse empíricamente; por ejemplo, puede controlarse el progreso del paciente mediante evaluación periódica, y ajustarse la dosis en consecuencia. Asimismo, pueden realizarse aumentos de escala de las dosificaciones entre especies usando métodos bien conocidos en la materia (por ejemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).

Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem.

262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero sin limitación, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y vías orales. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y una jeringa convencionales. Además, con respecto a la administración subcutánea, un dispositivo inyector de pluma tiene fácilmente aplicaciones en la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. Dicho dispositivo inyector de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo inyector de pluma reutilizable utiliza generalmente un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica dentro del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y remplazarse por un nuevo cartucho que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo inyector de pluma puede entonces reutilizarse. En un dispositivo inyector de pluma desechable, no hay cartucho reemplazable. Más bien, el dispositivo inyector de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, se desecha el dispositivo completo.

Numerosos dispositivos inyectores de pluma y autoinyectores reutilizables tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN ™1 I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OpT iPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OpTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Ejemplos de dispositivos inyectores de pluma desechables que tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (sanofiaventis), la FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y la KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), la PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), la EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar solo algunos.

En determinadas situaciones, la composición farmacéutica se puede administrar en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase Langer, citado anteriormente; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos; véase, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. En otra realización más, se puede colocar un sistema de liberación controlada próximo a la diana de la composición, siendo necesaria, por lo tanto, solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, 1984, en Medical Applications of Controlled Release, mencionado anteriormente, vol. 2, págs. 115-138). Se analizan otros sistemas de liberación controlada en la revisión de Langer, 1990, Science 249:1.527-1.533.

Las preparaciones inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para inyecciones intravenosas, subcutánea, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse por métodos conocidos públicamente. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o un medio oleoso usado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección preparada de este modo se carga preferentemente en una ampolla adecuada.

Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para su uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas farmacéuticas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente contenida generalmente es de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma farmacéutica en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo anteriormente mencionado esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas farmacéuticas.

Usos terapéuticos de las moléculas de unión a antígeno

La presente divulgación también se refiere a métodos que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una composición terapéutica que comprende un anticuerpo antitumoral o fragmento de unión a antígeno del mismo o una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une de manera específica débilmente o no tiene unión detectable a CD3 y se une a un antígeno asociado a un tumor. La composición terapéutica puede comprender cualquiera de los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas como se divulga en el presente documento y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "un sujeto que lo necesita" se refiere a un ser humano o animal no humano que presenta uno o más síntomas o indicios de cáncer (por ejemplo, un sujeto que expresa un tumor o padece cualquiera de los cánceres mencionados a continuación) o que de otra manera se beneficiaría de una inhibición o reducción en la actividad tumoral o de un agotamiento de las células tumorales (por ejemplo, células de cáncer de próstata PSMA++).

Los anticuerpos y las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención (y composiciones terapéuticas que comprenden las mismas) son útiles, entre otras cosas, para tratar cualquier enfermedad o trastorno en donde la estimulación, activación y/u orientación de una respuesta inmunitaria sería beneficiosa. En particular, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención pueden utilizarse para el tratamiento, la prevención y/o la mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado o mediado por una célula que expresa un TAA, por ejemplo, expresión o actividad de PSMA o la proliferación de células PSMA+. El mecanismo de acción mediante el cual se logran los métodos terapéuticos de la divulgación incluye la destrucción de las células que expresan antígenos asociados a tumores, en presencia de células efectoras, por ejemplo, por CDC, apoptosis, ADCC, fagocitosis, o por una combinación de dos o más de estos mecanismos. Las células que expresan antígenos asociados a tumores, tales como PSMA, MUC16, STEAP2 o EGFRvIII, que se pueden inhibir o destruir utilizando las moléculas de unión a antígenos biespecíficas de la invención incluyen, por ejemplo, células de tumor de próstata.

Las moléculas de unión a antígeno de la presente invención pueden usarse para tratar, por ejemplo, tumores primarios y/o metastásicos que surgen en el cerebro y las meninges, de cabeza y cuello, orofaringe, árbol pulmonar y bronquial, tracto gastrointestinal, sistema reproductor masculino y femenino, músculo, hueso, piel y anejos cutáneos, tejido conectivo, bazo, sistema inmunitario, células que forman la sangre y la médula ósea, hígado y tracto urinario, riñón, vejiga y/u órganos sensoriales especiales tales como el ojo. En determinadas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención se utilizan para tratar uno o más de, pero sin limitación, los siguientes cánceres: carcinoma pancreático, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata, gliomas malignos, osteosarcoma, cáncer colorrectal, cáncer gástrico (por ejemplo, cáncer gástrico con amplificación MET), mesotelioma maligno, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, sarcoma sinovial, cáncer de tiroides, cáncer de mama, melanoma, glioma, cáncer de mama (por ejemplo, carcinoma de mama ductal o intraductal, carcinoma epidermoide, cáncer de esófago, carcinoma renal de células claras, carcinoma renal cromófobo, oncocitoma (renal), carcinoma de células de transición (renal), carcinoma urotelial, adenocarcinoma (de vejiga) o carcinoma microcítico (de vejiga). De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, los anticuerpos biespecíficos son útiles para tratar a un paciente que padece un cáncer refractario o resistente al tratamiento, por ejemplo, cáncer de próstata resistente a la castración. De acuerdo con un caso ilustrativo de la divulgación, se proporcionan métodos que comprenden administrar una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-PSMA como se divulga en el presente documento a un paciente que padece un cáncer de próstata resistente a la castración. Pueden usarse métodos analíticos/diagnósticos conocidos en la materia, como exploración tumoral, etc., para determinar si un paciente alberga un tumor que es resistente a la castración.

La presente divulgación también se refiere a métodos para tratar el cáncer residual en un sujeto. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "cáncer residual" significa la existencia o persistencia de una o más células cancerosas en un sujeto después de tratamiento con una terapia anticáncer, tal como una terapia convencional o de primera línea.

De acuerdo con determinados aspectos, la presente divulgación se refiere a métodos para tratar un cáncer asociado con la expresión de TAA (por ejemplo, cáncer de próstata asociado con la expresión de PSMA o expresión de STEAP2, glioblastoma asociado con la expresión de EGFRvIII o cáncer de ovario asociado con la expresión de MUC16) que comprenden administrar una o más de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas descritas en otra parte en el presente documento a un sujeto después de que se haya determinado que el sujeto tiene cáncer. Por ejemplo, la presente divulgación incluye métodos para tratar el cáncer de próstata que comprende administrar una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-TAA a un paciente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas, 2 meses, 4 meses, 6 meses, 8 meses, 1 año o más después de que el sujeto haya recibido una terapia previa.

Terapias y formulaciones de combinación

La presente divulgación también se refiere a métodos que comprenden administrar una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos y moléculas de unión a antígeno biespecíficas ilustrativas descritas en el presente documento en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los agentes terapéuticos adicionales ilustrativos que pueden combinarse o administrarse en combinación con una molécula de unión a antígeno de la presente invención incluyen, por ejemplo, un anticuerpo antimuerte celular programada 1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD1 como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US2015/0203579A1), un anti-ligando de muerte celular programada 1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L1 como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US2015/0203580A1), un antagonista de EGFR (por ejemplo, un anticuerpo anti-EGFR [por ejemplo, cetuximab o panitumumab] o inhibidor de molécula pequeña de EGFR [por ejemplo, gefitinib o erlotinib]), un antagonista de otro miembro de la familia EGFR tal como Her2/ErbB2, ErbB3 o ErbB4 (por ejemplo, anticuerpo anti-ErbB2, anti-ErbB3 o anti-ErbB4 o inhibidor de molécula pequeña de la actividad de ErbB2, ErbB3 o ErbB4), un antagonista de EGFRvIII (por ejemplo, un anticuerpo que se une de manera específica a EGFRvIII), un antagonista de cMET (por ejemplo, un anticuerpo anti-cMET), un antagonista de IGF1R (por ejemplo, un anticuerpo anti-IGF1R), un inhibidor de B-raf (por ejemplo, vemurafenib, sorafenib, GDC-0879, PLX-4720), un inhibidor de PDGFR-a (por ejemplo, un anticuerpo anti-PDGFR-a), un inhibidor de PDGFR-p (por ejemplo, un anticuerpo anti-PDGFR-p), un antagonista de VEGF (por ejemplo, una trampa de VEGF, véase, por ejemplo, el documento US 7.087.411 (también denominado en el presente documento "proteína de fusión inhibidora de VEGF"), anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, bevacizumab), un inhibidor de cinasa de molécula pequeña del receptor de VEGF (por ejemplo, sunitinib, sorafenib o pazopanib)), un antagonista de DLL4por ejemplo., un anticuerpo anti-DLL4 divulgado en el documento US 2009/0142354 tal como REGN421), un antagonista de Ang2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-Ang2 divulgado en el documento US 2011/0027286 tal como H1H685P), un antagonista de FOLH1 (PSMA), un antagonista de PRLR (por ejemplo, un anticuerpo anti-PRLR), un antagonista de STEAP1 o STEAP2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-STEAP1 o un anticuerpo anti-STEAP2), un antagonista de TMPRSS2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-TMPRSS2), un antagonista de MSLN (por ejemplo, un anticuerpo anti-MSLN), un antagonista de CA9 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CA9), un antagonista de uroplaquina (por ejemplo, un anticuerpo antiuroplaquina), etc. Otros agentes que pueden administrarse de manera beneficiosa en combinación con las moléculas de unión a antígeno de la invención incluyen inhibidores de citocinas, incluyendo inhibidores de citocina de molécula pequeña y anticuerpos que se unen a citocinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18 o a sus receptores respectivos. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención (por ejemplo, las composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de unión al antígeno biespecífica anti-CD3/anti-PSMA como se divulga en el presente documento) también se pueden administrar como parte de un régimen terapéutico que comprende una o más combinaciones terapéuticas seleccionadas de "ICE": ifosfamida (por ejemplo, Ifex®), carboplatino (por ejemplo, Paraplatin®), etopósido (por ejemplo, Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16); "DHAP": dexametasona (por ejemplo, Decadron®), citarabina (por ejemplo, Cytosar-U®, arabinósido de citosina, ara-C), cisplatino (por ejemplo, Platinol®-AQ); y "ESHAP": etopósido (por ejemplo, Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16), metilprednisolona (por ejemplo, Medrol®), dosis altas de citarabina, cisplatino (por ejemplo, Platinol®-AQ).

La presente divulgación también se refiere a combinaciones terapéuticas que comprenden cualquiera de las moléculas de unión a antígeno mencionadas en el presente documento y un inhibidor de uno o más de VEGF, Ang2, DLL4, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvIII, cMet, IGF1R, B-raf, PDGFR-a, PDGFR-p, FOLH1 (PSMA), PRLR, STEAP1, STEAP2, TMPRSS2, MSLN, CA9, uroplaquina o cualquiera de las citocinas mencionadas anteriormente, en donde el inhibidor es un aptámero, una molécula antisentido, una ribozima, un ARNip, un pepticuerpo, un nanocuerpo o un fragmento de anticuerpo (porejemplo, fragmento Fab; fragmento F(ab')² ; fragmento Fd; fragmento Fv; scFv; fragmento dAb; u otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos y unidades de reconocimiento mínimas). Las moléculas de unión a antígeno de la invención también pueden administrarse y/o formularse de manera conjunta en combinación con antivíricos, antibióticos, analgésicos, corticosteroides y/o AINE. Las moléculas de unión a antígeno de la invención también pueden administrarse como parte de un régimen de tratamiento que también incluye tratamiento con radiación y/o quimioterapia convencional.

El componente o componentes terapéuticamente activos adicionales pueden administrarse justo antes, de manera simultánea o poco después de la administración de una molécula de unión a antígeno de la presente invención; (para los fines de la presente divulgación, dichos regímenes de administración se consideran la administración de una molécula de unión a antígeno "en combinación con" un componente terapéuticamente activo adicional).

La presente invención incluye composiciones farmacéuticas en donde una molécula de unión a antígeno de la presente divulgación se formula de manera conjunta con uno o más de los componentes terapéuticamente activos adicionales como se describe en otra parte del presente documento.

Regímenes de administración

De acuerdo con determinados casos de la presente divulgación, múltiples dosis de la molécula de unión al antígeno biespecífica (por ejemplo, una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-TAA) se puede administrar a un sujeto durante un transcurso de tiempo definido. Los métodos de acuerdo con este aspecto de la divulgación comprenden administrar de manera secuencial a un sujeto múltiples dosis de una molécula de unión a antígeno de la invención. Tal como se utiliza en el presente documento, "administrar de manera secuencial" significa que cada dosis de una molécula de unión a antígeno se administra al sujeto en un momento diferente, por ejemplo, en días diferentes separados por un intervalo predeterminado (por ejemplo, horas, días, semanas o meses). La presente divulgación incluye métodos que comprenden administrar de manera secuencial al paciente una dosis inicial única de una molécula de unión a antígeno, seguido de una o más dosis secundarias de la molécula de unión a antígeno, y opcionalmente seguido de una o más dosis terciarias de la molécula de unión a antígeno.

Las expresiones "dosis inicial", "dosis secundarias", y "dosis terciarias", se refieren a la secuencia temporal de administración de la molécula de unión a antígeno de la invención. Por lo tanto, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al inicio del régimen de tratamiento (también denominada "dosis basal"); las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial; y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. Las dosis inicial, secundaria y terciaria pueden contener la misma cantidad de la molécula de unión a antígeno, pero generalmente pueden diferir entre sí en términos de frecuencia de administración. En determinados casos, sin embargo, la cantidad de una molécula de unión a antígeno contenida en las dosis inicial, secundarias y/o terciarias varían entre sí (por ejemplo, ajustado hacia arriba o hacia abajo según corresponda) durante el transcurso del tratamiento. En determinados casos, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) dosis al inicio del régimen de tratamiento como "dosis de carga" seguidas por dosis posteriores que se administran con menos frecuencia (por ejemplo, "dosis de mantenimiento").

En un caso ilustrativo de la presente divulgación, cada dosis secundaria y/o terciaria se administra de 1 a 26 (por ejemplo, 1, 1 / , 2, 2 / , 3, 3 / , 4, 41/ 2, 5, 51/ 2, 6, 61/ 2, 7, 71/ 2, 8, 81/ 2, 9, 91/ 2, 10, 101/ 2, 11, 11 /, 12, 121/ 2, 13, 131/ 2, 14, 141/ 2, 15, 15 /, 16, 16 /, 17, 17 /, 18, 18 /, 19, 19 /, 20, 20 /, 21 ,21 /, 22, 22 /, 23, 23 /, 24, 24 /, 25, 25 /, 26, 26 / o más) semanas después de la dosis inmediatamente anterior. La expresión "la dosis inmediatamente anterior", tal como se utiliza en el presente documento, significa, en una secuencia de administraciones múltiples, la dosis de la molécula de unión a antígeno que se administra a un paciente antes de la administración de la siguiente dosis en la secuencia sin dosis intermedias.

Los métodos de acuerdo con este aspecto de la divulgación pueden comprender administrar a un paciente cualquier número de dosis secundarias y/o terciarias de una molécula de unión a antígeno (por ejemplo, una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-TAA). Por ejemplo, en determinados casos, solo se administra una dosis secundaria única al paciente. En otros casos, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis secundarias al paciente. De manera análoga, en determinados casos, solo se administra una dosis terciaria única al paciente. En otros casos, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis terciarias al paciente.

En casos que implican múltiples dosis secundarias, cada dosis secundaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis secundarias. Por ejemplo, cada dosis secundaria puede administrarse al paciente de 1 a 2 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. De manera similar, en casos que implican múltiples dosis terciarias, cada dosis terciaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis terciarias. Por ejemplo, cada dosis terciaria puede administrarse al paciente de 2 a 4 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. De manera alternativa, la frecuencia a la que se administran las dosis secundarias y/o terciarias a un paciente puede variar en el transcurso del régimen de tratamiento. La frecuencia de administración también puede ajustarla un médico durante el transcurso del tratamiento, dependiendo de las necesidades del paciente individual después del examen clínico.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completas de cómo preparar y usar las composiciones de la invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los presentes inventores consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos anti-CD3

Los siguientes procedimientos tenían como objetivo identificar anticuerpos que reconocían de manera específica CD3 (correceptor de linfocitos T) como un antígeno.

Se obtuvo un conjunto de anticuerpos anti-CD3 mediante la inmunización de ratones modificados genéticamente. En resumen, ratones modificados de manera genética para expresar cadenas pesadas de inmunoglobulina y quiméricas inversas (variable humana, constante de ratón) asociadas con una única cadena ligera reordenada (por ejemplo, un Vk1-39/J o un Vk3-20/J), se inmunizaron con un antígeno CD3 y generaron linfocitos B que comprendían una diversidad de reordenamientos de VH humana para expresar un repertorio diverso de anticuerpos específicos de antígeno de afinidad elevada. Determinados anticuerpos ilustrativos descritos en la presente solicitud se han elaborado de manera recombinante y expresan la misma secuencia de cadena ligera de Vk1-39JK5 (LCVR expuesta en la SEQ ID NO: 162), mientras que otros anticuerpos elaborados expresan de manera recombinante una cadena ligera afín de uno de los brazos de cadena pesada (por ejemplo, el brazo diana tumoral).

Los anticuerpos generados se probaron para determinar su afinidad con el antígeno CD3 humano y de macaco en un ensayo de unión in vitro y, por ejemplo, se identificó un anticuerpo CD3, denominado CD3-VH-P (HCVR expuesto en la SEQ ID NO: 154), entre algunos otros, que se encontró que se unía a CD3 humano y de macaco que tiene una CE⁵⁰ entre 1 y 40 nM de afinidad (+++), según se determina en una valoración de FACS de células Jurkat y linfocitos T de macaco, respectivamente. Véase, por ejemplo, los experimentos de unión de FACS descritos en el ejemplo 4 a continuación.

Los restos de aminoácidos de la línea germinal de CD3-VH-P se identificaron posteriormente y se genomanipuló un anticuerpo denominado "CD3-VH-G" para que solo contuviera marcos de la línea germinal. Se genomanipularon otros derivados de anticuerpos mediante técnicas de clonación molecular bien conocidas para reemplazar restos de aminoácidos de manera escalonada basándose en las diferencias entre la secuencia de la línea germinal y la secuencia de CD3-VH-P. A cada derivado de anticuerpo se le asigna un número de denominación "CD3-VH-G". Véanse la tabla 1 y la figura 1.

Los anticuerpos biespecíficos, que comprenden un primer brazo de unión procedente de los anticuerpos anti-CD3 genomanipulados con las denominaciones y descripciones que se muestran en la tabla 1, y un segundo brazo de unión procedente de anticuerpos anti-TAA, se prepararon y se probaron para determinar la afinidad monovalente por las células portadoras de CD3 en un ensayo de FACS (como se describe en el ejemplo 4). Los resultados de la afinidad de unión monovalente de estos anticuerpos biespecíficos se muestran en las dos columnas de la derecha de la tabla 1. En ejemplos específicos, los anticuerpos biespecíficos que tienen un brazo de unión a TAA y un brazo de unión a CD3 con denominaciones "CD3-VH-G", "CD3-VH-G5", y "CD3-VH-G20", respectivamente, se unieron a células Jurkat con una CE⁵⁰ de 2,7 * 10^{' 8} , sin unión detectable, y 5,5 * 10^{' 7} , respectivamente.

Tabla 1: Mutaciones en CDR basadas en la secuencia de la línea germinal y la afinidad de unión de FACS rr n i n r n i r n m ni l

continuación

Mientras que CD3-VH-G y algunos otros anticuerpos genomanipulados retuvieron su afinidad de unión como se observa en los ensayos de FACS, varios anticuerpos anti-CD3 se unieron a CD3 humano o de macaco in vitro con afinidad débil (+/-) a no medible (-). Posteriormente se investigaron las afinidades de unión, la cinética de unión y otras propiedades biológicas para dilucidar la toxicidad y los perfiles farmacocinéticos (FC) en busca de anticuerpos biespecíficos que comprenden los anticuerpos anti-CD3 ilustrativos generados de acuerdo con los métodos de este ejemplo, y se describen en detalle en los ejemplos expuestos a continuación.

Ejemplo 2: Regiones variables de cadena pesada y ligera (Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de las CDR)

Se determinaron las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos para cada secuencia de cadena pesada de anticuerpo. A cada cadena pesada de anticuerpo, como un derivado de la secuencia de la línea germinal IGHV3-9*01/D5-12*01/J6*02 (SEQ ID NO: 181) se le asignó una denominación de número "G" para una nomenclatura coherente. La tabla 2 muestra los identificadores de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y las CDR de los anticuerpos anti-CD3 genomanipulados de la divulgación. Los identificadores de las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes se exponen en la tabla 3. Los identificadores de las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de la región variable de cadena ligera y las CDR para construir cada anticuerpo recombinante también se identifican a continuación en las tablas 4 y 5, respectivamente.

Tabl 2: I n ifi r l n i min i n ada

Tabla 3: Identificadores de las secuencias de ácidos nucleicos de cadena pesada

^{SEQ ID NO:} Denominación del anticuerpo CD3-VH _{HCVR CDR1 CDR2 CDR3}

T abla 4: Identificadores de las secuencias de aminoácidos de cadena ligera

Tabla 5: Identificadores de las secuencias de ácidos nucleicos de cadena ligera

El anticuerpo de control 1 denominado "CD3-L2K" se construyó basándose en un anticuerpo anti-CD3 conocido (es decir, el anticuerpo anti-CD3 "L2K" como se expone en el documento WO2004/106380).

El anticuerpo de control de isotipo, a los que se hace referencia en los ejemplos siguientes, es un anticuerpo de isotipo coincidente (IgG4 modificado) que interactúa con un antígeno irrelevante, es decir, antígeno FelD1.

Ejemplo 3: Generación de anticuerpos biespecíficos ULC que se unen a CD3 y a antígenos asociados a tumores (TAA)

Los anticuerpos biespecíficos que comprenden un dominio de unión específico anti-CD3 y un dominio de unión específico anti-TAA, tales como PSMA, EGFRvIII, MUC16 o STEAP2, se construyeron utilizando metodologías de biología molecular convencionales que utilizan una cadena pesada de un anticuerpo anti-CD3 descrito en el presente documento, una cadena pesada de un anticuerpo anti-TAA y una cadena ligera común o una cadena ligera universal (ULC, del inglés "universal light chain"). Los anticuerpos anti-TAA utilizados para construir los anticuerpos biespecíficos de este ejemplo se obtuvieron mediante la inmunización de ratones modificados de manera genética.

Un sumario de las partes componentes de los dominios de unión a antígeno de los diversos anticuerpos biespecíficos preparados de acuerdo con este ejemplo se expone a continuación en las tablas 6, 7 y 8. Todos los anticuerpos biespecíficos se fabricaron con un dominio Fc de IgG4 modificado (quimérico) como se expone en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US20140243504A1, publicada el 28 de agosto de 2014. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos EGFRvlll * CD3 ilustrativos utilizando cualquiera de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera (o CDR) de cualquiera de los anticuerpos EGFRvIII indicados en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US20150259423, en combinación con las regiones variables o CDR de cualquiera de los anticuerpos anti-CD3 indicados en el presente documento.

T l : n r i n ni r i ífi P MA x D

Tabla 7: Construcción de anticuer os bies ecíficos EGFRvIlI x CD3

T l : n r i n ni r i ífi M 1 x D

Tabla 9 : Construcción de anticuer os bies ecíficos STEAP2 x CD3

Cada uno de los anticuerpos biespecíficos ilustrativos se probó en varios bioensayos como se describe a continuación en el presente documento.

Ejemplo 4: Afinidades de unión de anticuerpos biespecíficos ejemplificados medidos mediante análisis de FACS

En este ejemplo, se determinó la capacidad de los anticuerpos biespecíficos CD3 * TAA para unirse a estirpes celulares que expresan CD3 humanas y de macaco a través de FACS. Además, también se confirmó la capacidad de estos anticuerpos biespecíficos para unirse a estirpes celulares específicas de diana (específicas de TAA). Como se ha descrito anteriormente, los diversos anticuerpos biespecíficos de este ejemplo utilizaron un solo brazo de unión específico de TAA (PSMA, EGFRvIII, MUC16 o STEAP2; véanse el ejemplo 3 y las tablas 6, 7 y 8) emparejado con uno de un grupo de brazos de unión anti-CD3 (véanse los ejemplos 1 y 2 anteriores) y una cadena ligera común. Tal como también se muestra en el ejemplo 5, los anticuerpos biespecíficos CD3 * TAA mostraron una gama de afinidades por la proteína hCD3£/8.mFc heterodimérica soluble humana mediante resonancia de plasmón de superficie.

En resumen, se incubaron 2 * 105 células/pocillo de células Jurkat que expresa CD3 humano, linfocitos T de macaco o células que expresan TAA específicos con una dilución en serie de anticuerpos biespecíficos durante 30 min a 4 °C. Después de la incubación, se lavaron las células y se añadió un F(ab')2 de cabra secundario anti-FeY humano marcado con PE (Jackson Immunolabs) a las células durante 30 min más. Después, las células se lavaron, se resuspendieron en PBS frío BSA al 1 % y se analizaron por citometría de flujo en un BD FACS Canto II.

Para el análisis FACS, las células se clasificaron según la altura de dispersión frontal frente al área de dispersión frontal para la selección de eventos individuales, seguido de dispersiones laterales y frontales. La CE50 para la valoración de la unión celular se determinó utilizando el programa informático PRISM™ (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Los valores se calcularon utilizando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros.

Tabla 10A: Unión de FACS en estir es celulares es ecíficas de CD3 PSMA

Tabla 10B: Unión de FACS en estir es celulares es ecíficas de CD3 EGFRvIII

Tabla 10C: Unión de FACS en estir es celulares es ecíficas de CD3 MUC16

Tal como se muestra en la tabla 10A, los brazos de unión a CD3 de cada anticuerpo biespecífico CD3 * PSMA mostraron una variedad de afinidad de unión celular a células Jurkat que expresan CD3 humano (intervalo de CE50 de 15 a 300 nM). Es importante destacar que, los brazos de CD3 que mostraron unión débil a nula a la proteína heterodimérica CD3 humana a través de resonancia de plasmón de superficie (véase la tabla 11 a continuación) también se correlacionaron con una unión débil a no observable en células Jurkat (es decir, CD3-VH-G2, CD3-VH-G3, CD3-VH-G5). Unión no detectable, o sin unión detectable, en el ensayo de FACS o ensayo equivalente significa que la afinidad entre el anticuerpo y su antígeno diana está más allá del límite de detección del ensayo (por ejemplo, >1 |jM). Varios brazos de unión a CD3 también mostraron reactividad cruzada con los linfocitos T de macaco. Todos los anticuerpos biespecíficos probados mostraron una unión celular similar en las respectivas estirpes celulares que expresan PSMA, EGFRvIlI y MUC16, lo que confirma que el emparejamiento biespecífico con brazos de CD3 individuales no afectó o disminuyó la unión específica de TAA (la unión específica de t Aa fue menor o igual a 5,6 nM (afinidad elevada) en todos los ejemplos probados).

Los anticuerpos que presentan una unión débil a no detectable a CD3 humano, y que también presentan una unión débil a nula a CD3 de macaco, se consideran ventajosos para el emparejamiento biespecífico impulsado por la avidez de acuerdo con la presente invención, y se analizaron adicionalmente para determinar la citotoxicidad en ensayos in vitro e in vivo.

Ejemplo 5: Afinidades de unión de los anticuerpos ejemplificados medidas mediante un ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial

Las afinidades de unión y las constantes cinéticas de los anticuerpos biespecíficos anti-TAA * anti-CD3 a la proteína heterodimérica soluble hCD3£/8.mFc (hCD3£ = UniProtKB/Swiss-Prot: P07766.2; SEQ_ID NO: 169; hCD38 = UniProtKB/Swiss-Prot: P04234.1, SEQ ID NO: 170) se determinaron mediante resonancia de plasmón de superficie a 37 °C utilizando un formato de captura de antígeno (Tabla 11) o un formato de captura de anticuerpo (datos no mostrados). En este ejemplo, se utilizaron anticuerpos biespecíficos BSPSMA/CD3 ya que estos emparejamientos representaban el uso de un grupo más amplio de anticuerpos para el brazo de unión a CD3. Las mediciones se realizaron en un instrumento Sierra Sensors MASS-1.

En el formato de captura de antígeno, la superficie del sensor de amina de densidad elevada MASS-1 se derivatizó con un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG2a de ratón (Southern Biotech). Se capturó la proteína CD3 heterodimérica soluble y se inyectaron los anticuerpos respectivos sobre el antígeno capturado.

Las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) cinéticas se determinaron mediante el procesamiento y el ajuste de los datos a un modelo de unión 1:1 usando el programa informático de ajuste de curvas MASS-1 AnalyserR2. Las constantes en equilibrio de disociación de unión (Kd) y las semividas disociativas (t1/2) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinéticas como: Kd (M) = kd/ka; y t1/2 (min) = (In2/(60*kd).

Tabla 11: Afinidades de los anticuer os bies ecíficos anti-CD3 con el CD3 humano soluble

Como se muestra en la tabla 11, todos los anticuerpos biespecíficos anti-CD3 * anti-PSMA derivados mantuvieron una unión muy débil a CD3 soluble en el ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, teniendo un valor de Kd superior a 11 nM hasta 334 nM que es más débil que el del brazo anti-CD3 biespecífico procedente de marcos de la línea germinal, CD3-VH-G.

Varios anticuerpos biespecíficos presentaron valores de Kd superiores a 50 nM, y algunos eran valores de Kd eran superiores a 100 nM (>1 * 10-7) (es decir, BSPSMA/CD3-900, BSPSMA/CD3-1000, BSPSMA/CD3-1900), valores de Kd superiores a 300 nM (>3 * 10-7) (es decir, BSPSMA/CD3-005) e incluso más allá del límite de detección del ensayo (>500 nM; >5 * 10-7), es decir, no mostraron unión detectable a CD3 humano soluble (es decir, BSPSMA/CD3-200, BSPSMA/CD3-300, BSPSMA/CD3-400, BSPS-MA/CD3-004 y BSPSMA/CD3-1800).

E je m p lo 6: A c tiv a c ió n d e lin fo c ito s T y c ito to x ic id a d e s p e c ífic a d e tu m o re s p re s e n ta d a p o r an tic u e rp o s ^{b ie s p e c ífic o s d e l e je m p lo m e d id o s} in vitro

En este ejemplo, la destrucción específica de células diana TAA que expresan PSMA, EGFRvIlI o MUC16 en presencia de anticuerpos biespecíficos basados en CD3 se controlan mediante citometría de flujo. Como se informó anteriormente, los anticuerpos biespecíficos mostraron un intervalo de afinidad por la proteína CD3 y las estirpes celulares que expresan CD3 (es decir, unión débil, moderada y fuerte). Este mismo grupo de anticuerpos biespecíficos se probó para determinar la capacidad de inducir linfocitos T humanos indiferenciados para redirigir la destrucción hacia células que expresan la diana.

En resumen, las estirpes celulares que expresan PSMA (C4-2, 22Rv1 y TRAMPC2_PSMA), que expresan EGFRvIlI (U87/EGFRvIII) o que expresan MUC16 (OVCAR3) se marcaron con 1 pM del colorante de seguimiento fluorescente Violet Cell T racker. Después del marcaje, las células se sembraron en placas durante la noche a 37 °C. Por separado, las PBMC humanas se sembraron en placas en medio RPMI complementado a 1 * 106 células/ml y se incubaron durante la noche a 37 °C para enriquecer los linfocitos mediante el agotamiento de macrófagos adherentes, células dendríticas y algunos monocitos. Al día siguiente, las células diana se incubaron conjuntamente con PBMC sin tratamiento agotadas en células adherentes (relación efector/célula diana 4:1) y una dilución en serie de anticuerpos biespecíficos en cuestión o control con isotipo (intervalo de concentraciones: 66,7 nM a 0,25 pM) durante 48 horas a 37 °C. Las células se eliminaron de las placas de cultivo celular utilizando un tampón de disociación celular sin enzimas y se analizaron mediante FACS.

Para el análisis FACS, las células se tiñeron con un rastreador de glóbulos rojos muertos/vivos (Invitrogen). Se añadieron 5 * 105 perlas de recuento a cada pocillo inmediatamente antes del análisis FACS. Se recogieron 1 * 104 perlas para cada muestra. Para la evaluación de la especificidad de destrucción, las células se seleccionaron en poblaciones vivas marcadas con violeta. Se registró el porcentaje de población viva y se utilizó para el cálculo de la supervivencia normalizada.

La activación de los linfocitos T se evaluó mediante la incubación de células con anticuerpos conjugados directamente contra CD2 y CD69, y mediante la notificación del porcentaje de linfocitos T activados (CD69+) del total de linfocitos T (CD2+).

Como muestran los resultados de las tablas 12A a 12C, se observó el agotamiento de las células que expresan TAA con anticuerpos biespecíficos anti-PSMA, EGFRvIlI o MUC16 * CD3. La mayoría de los anticuerpos biespecíficos probados activaron y dirigieron los linfocitos T para agotar las células diana con unas CE50 de intervalo picomolar. Además, la lisis (agotamiento) de las células diana observada se asoció con una regulación positiva de las células CD69 en los linfocitos T CD2+, con unas CE50 picomolar (pM).

Es importante destacar que, los resultados de este ejemplo demuestran que varios biespecíficos que utilizaron un brazo de unión a CD3 que mostró una unión débil a no observable a la proteína CD3 o células que expresan CD3 (es decir, CD3-VH-G5) aún conservaban la capacidad de activar los linfocitos T y presentaron una potente citotoxicidad de células que expresan antígenos tumorales.

T a b la 12A: P ro p ie d a d e s d e c ito to x ic id a d y ac tiv ac ió n d e lin fo c ito s T d e an tic u e rp o s b ie s p e c ífic o s P S M A x C D 3 s e le c c io n a d o s

continuación

T a b la 12B: P ro p ie d a d e s d e c ito to x ic id a d y ac tiv ac ió n d e lin fo c ito s T d e an tic u e rp o s b ie s p e c ífic o s E G F R v Ill x C D 3 s e le c c io n a d o s

T a b la 12C: P ro p ie d a d e s d e c ito to x ic id a d y ac tiv ac ió n d e lin fo c ito s T d e an tic u e rp o s b ie s p e c ífic o s M U C 16 x C D 3 s e le c c io n a d o s

^{E je m p lo 7: Los an tic u e rp o s b ie s p e c ífic o s a n ti-P S M A /a n ti-C D 3 m u es tra n u na p o te n te e fic a c ia a n titu m o ra l} in vivo

Para determinar la eficacia in vivo de los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 ilustrativos identificados por tener una afinidad de unión débil o no detectable a CD3 humano y de macaco, se realizaron estudios en ratones inmunodeprimidos que portaban xenoinjertos de cáncer de próstata humana. También se llevaron a cabo estudios adicionales en ratones inmunocompetentes que portaban xenoinjertos de cáncer de próstata de ratón genomanipulados para expresar PSMA humano. Eficacia de los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 en modelos de xenoinjerto de tumores humanos

Para evaluar la eficacia in vivo de los biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 en estudios de xenoinjertos de tumores humanos, se implantaron de manera conjunta ratones NOD scidY (NSG) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) con células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas junto con células tumorales de próstata humana 22Rv1 o C4-2 que expresan PSMA de forma endógena.

En resumen, se implantaron s.c. de manera conjunta 4 x 106 células 22Rv1 o 5 x 106 células C4-2 (MD Anderson, TX) con 1 x 106 PBMC humanas (ReachBio, LLC., Seattle, WA) en una mezcla 50:50 de matriz matrigel (BD Biosciences) en el flanco derecho de ratones NSG macho. En el estudio de C4-2, los ratones se trataron i.p. los días 0, 4 y 7 después de la implantación del tumor con 0,1 mg/kg de BSPS-MA/CD3-003 o BSPSMA/CD3-005.

En un modelo xenogénico adicional, se probaron biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 en ratones injertados con células madre CD34+ hematopoyéticas humanas. En resumen, se injertaron crías recién nacidas de SIRPa BALB/c-Rag2-IL2rY-(BRG) con células de hígado fetal hCD34+. 3 a 6 meses más tarde, a ratones SIRPa BRG injertados con hCD34 se les implantaron células C4-2 (5 x 106 s.c. en matrigel). 8 días después, los ratones se trataron con 10 |jg de BSPSMA/CD3-004 o un anticuerpo de control con isotipo, seguido de dosis 2x/semana durante todo el estudio.

En todos los estudios, el tamaño tumoral se midió 2x/semana usando calibradores, y el volumen tumoral se calculó como Volumen = (longitud x anchura2)/2.

Como demuestran los resultados en la tabla 13, los anticuerpos biespecíficos probados en los modelos xenogénicos descritos anteriormente fueron todos eficaces para suprimir el crecimiento tumoral en comparación con el tratamiento con el control con isotipo.

Tabla 13: Supresión del crecimiento tumoral mediante la administración de anticuerpos biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 a modelos de ratones xeno énicos

Además, se evaluó la actividad antitumoral de los biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 en un modelo inmunocompetente. Los ratones humanizados para las tres cadenas (8y£) de CD3 también se humanizaron para PSMA y se implantaron con una estirpe celular variante de cáncer de próstata murino TRAMP-C2 transfectada con PSMA humano.

Antes del inicio del estudio, se generó la variante de la estirpe celular tumorigénica TRAMP-C2_hPSMAv#1. En resumen, se implantaron s.c. 7,5 * 106 células TRAMP-C2_hPSMA en el flanco derecho de ratones macho humanizados para CD3 y PSMA. Se extirpó un tumor y se cortó en fragmentos de 3 mm y posteriormente se implantaron en el flanco derecho de nuevos ratones macho humanizados. A continuación, se recogió un tumor que surgía de los fragmentos de tumor implantados y se disgregó en una única suspensión celular. A continuación, estas células (TRAMP-C2_hPSMAv#1) se cultivaron in vitro bajo la selección G418. Después, se implantaron 4 * 106 células de esta estirpe celular variante en el flanco derecho de ratones humanizados PSMA/CD3 macho para los estudios de eficacia de anticuerpos biespecíficos.

Los ratones PSMA/CD3 humanizados implantados con TRAMPC2_hPSMAv#1 se trataron con 100 |jg o 10 |jg de anticuerpo biespecífico anti-PSMA/anti-CD3 BSPSMA/CD3-004 o un control con isotipo 2*/semana a partir del día de la implantación del tumor. También se examinaron los niveles séricos de citocinas 4 h después de la inyección, así como los niveles de linfocitos T en el bazo. El estudio se terminó el día 27.

Como demuestran los resultados en la tabla 14, la molécula biespecífica anti-PSMA/anti-CD3 probada, BSPSMA/CD3-004, mostró eficacia para retrasar de manera significativa el crecimiento tumoral en todos los grupos de tratamiento. Se observó una liberación mínima de citocinas después de la administración de BSPSMA/CD3-004, posiblemente debido a la unión débil del anti-CD3. Ambos anticuerpos probados mostraron eficacia antitumoral sin agotar los linfocitos T en el bazo.

Resumiendo, los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 de este ejemplo muestran una potente eficacia antitumoral en modelos de tumores inmunocomprometidos e inmunocompetentes, a pesar de tener una unión baja a nula al antígeno CD3.

Ejemplo 8: Los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16/anti-CD3 muestran una potente eficacia antitumoral in vivo

Para determinar la eficacia in vivo de los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16/anti-CD3 ilustrativos identificados por tener una afinidad de unión débil o no detectable a CD3 humano y de macaco, se realizaron estudios en ratones inmunodeprimidos que portaban xenoinjertos de cáncer de próstata humana. La eficacia de los anticuerpos biespecíficos seleccionados se probó tanto en modelos de dosificación de tratamiento inmediato como de tratamiento terapéutico.

Eficacia de los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16/anti-CD3 en modelos de xenoinjerto de tumores humanos

Para evaluar la eficacia in vivo de los biespecíficos anti-MUC16/anti-CD3 en estudios de xenoinjerto de tumores humanos, se preimplantaron ratones NODscidY (NSG) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) con células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMC; ReachBio LLC., Seattle, WA) y después se les administraron células de ascitis de la estirpe celular de cáncer de ovario humano OVCAR-3 (American Type Tissue Culture, Manassas, VA) transducidas con luciferasa (OVCAR-3/Luc). Las células OVCAR-3 expresan de forma endógena MUC-16.

En resumen, se inyectaron ratones NSG por vía intraperitoneal (i.p.) con 5,0 * 106 PBMC humanas. 8 días más tarde, 1,5 * 106 células de ascitis de la estirpe celular OVCAR-3/Luc, previamente pasadas in vivo, se administraron i.p. a los ratones NSG injertados con PBMC. En el grupo de tratamiento inmediato, los ratones se trataron i.p. el día de la implantación de las células OVCAR-3/Luc con anticuerpos biespecíficos MUC16/CD3 BSMUC16/CD3-001 o BSMUC16/CD3-005, o un control con isotipo, a una dosis de 10 pg/ratón (N = 5 ratones/grupo de tratamiento). En el modelo de dosis terapéutica, los ratones se trataron i.p. 7 días después de la implantación del tumor con los anticuerpos de control o biespecíficos MUC16/CD3 descritos anteriormente, a una dosis de 10 pg/ratón (N = 5/grupo de tratamiento).

En todos los estudios, el crecimiento tumoral se controló mediante imágenes bioluminiscentes (BLI, del inglés "bioluminescent imaging"). A los ratones se les inyectó i.p. el sustrato de luciferasa D-luciferina suspendido en PBS (150 mg/kg) y se obtuvieron imágenes bajo anestesia con isoflurano después de 10 min. Se realizó BLI utilizando el sistema Xenogen IVIS (Perkin Elmer, Hopkinton, MA) y las señales BLI se extrajeron utilizando el programa informático Living Image (Xenogen/Perkin Elmer). Las regiones de interés se dibujaron alrededor de cada masa celular y las intensidades de los fotones se registraron como fotones (p)/segundo (s)/cm2/estereorradián (sr). Para el grupo de tratamiento inmediato, los datos se muestran como niveles de BLI 26 días después de la implantación del tumor (Tabla 15). Para el grupo de tratamiento terapéutico, los datos se muestran como cambio de veces en BLI entre el día 6 (1 día antes del tratamiento) y en el momento final del estudio (26 días después de la implantación del tumor; tabla 16).

Como muestran los resultados, tanto BSMUC16/CD3-001 como BSMUC16/CD3-005 mostraron una eficacia similar en la supresión del crecimiento tumoral en comparación con el control con isotipo cuando se midió BLI el día 26 en el modelo de dosificación inmediata. Ambos anticuerpos biespecíficos anti-MUC16/anti-CD3 también suprimieron el crecimiento de tumores establecidos cuando se administraron 7 días después de la implantación del tumor, en comparación con el control. Resumiendo, los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16/anti-CD3 de este ejemplo muestran una potente eficacia antitumoral en varios modelos.

Tabla 15: Eficacia de los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16/anti-CD3 en el modelo de xenoinjerto inmunocom rometido: Dosificación inmediata

Tabla 16: Eficacia de los anticuerpos biespecíficos anti-Muc16/anti-CD3 en el modelo de xenoinjerto inmunocom rometido: Tratamiento tera éutico

Ejemplo 9: Evaluación farmacocinética de los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16 x CD3

La evaluación de la farmacocinética de los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16 x CD3 BSMUC16/CD3-001 y BSMUC16/CD3-005 y un control con isotipo se llevaron a cabo en ratones MUC16 x CD3 humanizados (ratones homocigotos para la expresión de MUC16 y CD3 humana, MUC16hu/hu x CD3hu/hu), ratones humanizados CD3 (ratones homocigotos para la expresión de CD3 humana, CD3hu/hu) y ratones de tipo silvestre (TS) emparejados por cepas (75 % C57BL, 25 % 129Sv). Las cohortes contenían de 4 a 5 ratones por anticuerpo probado y por cepa de ratón. Todos los ratones recibieron una única dosis intraperitoneal (i.p.) de 0,4 mg/kg. Se recogieron muestras de sangre a las 3 y 6 horas, 1, 3, 7, 14 y 28 días después de la dosis. La sangre se procesó en suero y se congeló a -80 °C hasta que se analizó.

Las concentraciones de anticuerpos circulantes se determinaron mediante el análisis de anticuerpos IgG humanos totales utilizando el GyroLab xPlore™ (Gyros, Uppsala, Suecia). En resumen, un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG humana biotinilado (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) se capturó en perlas recubiertas de estreptavidina en un Gyrolab Bioaffy 200 CD (Gyros) para capturar la IgG humana presente en los sueros. Después de la captura en la columna de afinidad, el anticuerpo IgG humano unido en las muestras se detectó con anti-IgG humana de cabra marcado con Alexa-647 (Jackson ImmunoResearch). La señal fluorescente en la columna permitió la detección de la IgG unida y el instrumento leyó las unidades de respuesta (UR). Las concentraciones de las muestras se determinaron mediante la interpolación a partir de una curva convencional que se ajustó utilizando un ajuste de curva logística de 5 parámetros utilizando el programa informático Gyrolab Evaluator.

Los parámetros FC se determinaron mediante análisis no compartimental (NCA, del inglés "non-compartmental analysis") utilizando el programa informático Phoenix®WinNonlin® versión 6.3 (Certara, L.P., Princeton, NJ) y un modelo de dosificación extravascular. Con los respectivos valores de concentración media para cada anticuerpo, todos los parámetros FC, incluida la concentración máxima observada en suero (Cmáx), la semivida estimada observada (ti/2) y el área bajo la curva de concentración frente al tiempo hasta la última concentración medible (ABCúltima) se determinaron mediante una regla trapezoidal lineal con interpolación lineal y ponderación uniforme

Después de la administración i.p. de los anticuerpos en ratones TS, los perfiles de concentración de IgG-tiempo totales de BSMUC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-005 y del control con isotipo fueron todos similares, caracterizados primero por una breve distribución del fármaco seguida de una única fase de eliminación del fármaco durante el resto del estudio. Las concentraciones séricas máximas (Cmáx) y la exposición calculada al fármaco (ABCúltima) de los tres anticuerpos fueron comparables (con una diferencia de 1,3 veces entre sí). Después de la administración i.p. de los anticuerpos en ratones CD3hu/hu, BSMUC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-005 y el control con isotipo tenían concentraciones Cmáx comparables (4,6, 3,6 y 4,1 pg/ml, respectivamente). BSMUC16/CD3-005 y el control con isotipo presentaron curvas de eliminación del fármaco similares, mientras que BSMUC16/CD3-001 presento una eliminación del fármaco más pronunciada que ambos, lo que sugiere que la unión a la diana de CD3 humana impulsa la eliminación. La concentración terminal de anticuerpos para BSMUC16/CD3-001 fue de 0,03 pg/ml, que es aproximadamente 28 veces inferior a las concentraciones de anticuerpos terminales determinadas para el control con isotipo (0,85 pg/ml) y 22 veces inferior a las concentraciones séricas de BSMUC16/CD3-005 (0,66 pg/ml).

En ratones doble humanizados MUC16hu/hu x CD3hu/hu, los anticuerpos de control con isotipo y biespecíficos Muc16 x CD3 tenían concentraciones Cmáx comparables (Intervalo de Cmáx: 4,5 a 6,9 pg/ml). Ambos anticuerpos biespecíficos presentaron una eliminación del fármaco más pronunciada que el control con isotipo, lo que sugiere un efecto mediado por la diana. Las concentraciones terminales de anticuerpos para BSMUC16/CD3-001 y BSMUC16/CD3-005 fueron aproximadamente 29 veces y 2,9 veces inferiores, respectivamente, a las concentraciones terminales de anticuerpos determinadas para el control con isotipo (0,86 pg/ml).

En la tabla 17 se resumen los datos de los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16 x CD3 totales y las concentraciones de anticuerpos de control con isotipo. Los parámetros Fc medios se describen en las tablas 18A y 18B. Las concentraciones medias de los anticuerpos totales frente al tiempo se muestran en las figuras 2A, 2B y 2C. En conclusión, los anticuerpos biespecíficos MUC16 x CD3 presentaron Cmáx y curvas de eliminación de fármacos en ratones TS similares, pero BSMUC16/CD3-001 mostró velocidades de eliminación más pronunciadas que BSMUC16/CD3-005 y el control con isotipo en ratones CD3 humanizados simples y ratones humanizados dobles MUC16/CD3. Dado que los anticuerpos biespecíficos administrados en este estudio FC están compuestos por el mismo brazo de unión anti-MUC16, los resultados sugieren que la fuerza de unión del brazo de dirección CD3 puede desempeñar un papel en los niveles de exposición al fármaco (ABCúltima) y en las velocidades de eliminación de fármacos. Ni BSMUC16/CD3-001 ni BSMUC16/CD3-005 se unen a MUC16 de ratón o CD3 de ratón.

Tabla 17: Concentraciones medias de IgG total en suero tras una única inyección intraperitoneal de 0,4 mg/kg de anticuerpos BSMUC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-005 y de control con isotipo en ratones TS, ratones CD3 humanizados ratones MUC16 x CD3 humanizados

T l 1 A: m ri l r m r f rm in i : R n h m niz D hh

T l 1 B: m ri l r m r f rm in i : r n l h m niz M 1 hh x D hh

Ejemplo 10: Los anticuerpos biespecíficos anti-STEAP2/anti-CD3 muestran una potente eficacia antitumoral in vivo

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo biespecífico citotóxico para su uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto, en donde el anticuerpo biespecífico comprende un primer brazo de unión a antígeno que presenta unión débil a no detectable a CD3 humano y c D3 de macaco, y un segundo brazo de unión a antígeno que se une a un antígeno asociado a un tumor, en donde cada uno del primer brazo de unión a antígeno y el segundo brazo de unión a antígeno comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena ligera es común tanto al primer brazo de unión a antígeno como al segundo brazo de unión a antígeno, y en donde la cadena pesada del primer brazo de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende las regiones determinantes de la complementariedad HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos, respectivamente, de s Eq ID NO: 36, 38 y 40 o de SEQ ID NO: 140, 142 y 144.

2. El anticuerpo biespecífico citotóxico para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo biespecífico presenta activación de linfocitos T in vitro.

3. El anticuerpo biespecífico citotóxico para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el antígeno asociado al tumor se expresa en una célula tumoral humana.

4. El anticuerpo biespecífico citotóxico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo biespecífico induce la destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T con un valor de CE50 inferior a aproximadamente 1,3 nM, medida en un ensayo in vitro de destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T.

5. El anticuerpo biespecífico citotóxico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la célula tumoral diana expresa un antígeno asociado a un tumor seleccionado del grupo que consiste en AFP, ALK, proteínas BAGE, BIRC5 (survivina), BIRC7, p-catenina, brc-abl, BRCA1, BORIS, CA9, anhidrasa carbónica IX, caspasa-8, CALR, CCR5, CD19, CD20 (MS4A1), CD22, CD30, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, ciclina-B1, CYP1B1, EGFR, EGFRvIII, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EpCAM, EphA2, Fra-1, FOLR1, proteínas GAGE (por ejemplo, GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, glipicano-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, LMP2, proteínas MAGE (por ejemplo, MAGE-1, -2, -3, -4, -6 y -12), MART-1, mesotelina, ML-IAP, Muc1, Muc2, Muc3, Muc4, Muc5, Muc16 (CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ESO1, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAME, PSMA (FOLH1), proteínas RAGE, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, STEAP1, STEAP2, TAG-72, TGF-p, TMPRSS2, antígeno Thompson-nouvelle (Tn), TRP-1, TRP-2, tirosinasa y uroplaquina-3.

6. El anticuerpo biespecífico citotóxico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende regiones determinantes de la complementariedad LCDR1, LCDR2 y LCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos, respectivamente, de Se Q ID NO: 164, 166 y 168.

7. El anticuerpo biespecífico citotóxico para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 162.

8. El anticuerpo biespecífico citotóxico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la cadena ligera es una cadena ligera afín de la cadena pesada del segundo brazo de unión a antígeno que se une a un antígeno asociado a un tumor.

9. El anticuerpo biespecífico citotóxico para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el primer brazo de unión a antígeno comprende regiones determinantes de la complementariedad HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos, respectivamente, de SEQ ID NO: 36, 38, 40, 164, 166 y 168.

10. El anticuerpo biespecífico citotóxico para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el primer brazo de unión a antígeno comprende regiones determinantes de la complementariedad HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos, respectivamente, de SEQ ID NO: 140, 142, 144, 164, 166 y 168.

11. El anticuerpo biespecífico citotóxico para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el anticuerpo biespecífico comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 34/162.

12. El anticuerpo biespecífico citotóxico para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el anticuerpo biespecífico comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 138/162.

13. Una composición farmacéutica que comprende (i) el anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y (ii) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 13 para su uso en un método para tratar el cáncer en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto la composición farmacéutica.

15. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: cáncer pancreático, melanoma, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata, gliomas malignos, osteosarcoma, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, sarcoma sinovial, cáncer de tiroides, cáncer de mama, melanoma, glioma, cáncer de mama, carcinoma epidermoide, cáncer de esófago, carcinoma renal de células claras, carcinoma renal cromófobo, oncocitoma renal, carcinoma de células de transición renal, carcinoma urotelial, adenocarcinoma o carcinoma microcítico, opcionalmente, en donde el sujeto padece un tumor que es resistente o que responde de forma incompleta a la terapia monoespecífica sola.