TW202241514A - 最優化抗cd3雙特異性抗體及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係提供以微弱或未檢出的結合親和力與CD3結合之抗體及彼等之使用方法。根據特定的實施例,本發明之抗體係以低親和力與人類CD3結合並引發人類T細胞增生及因而以高效力引發T細胞-媒介的腫瘤細胞毒殺。根據特定的實施例,本發明係提供雙特異性抗原結合分子,其係包括在活體外分析中以微弱或未檢出的結合親和力與人類CD3特異性結合之第一抗原結合區,及與人類腫瘤-相關抗原特異性結合之第二抗原結合分子。在特定的實施例中,本發明之雙特異性抗原結合分子能抑制表現目標抗原,例如PSMA之腫瘤生長。本發明之抗體和雙特異性抗原結合分子可用於治療其中上調或引發靶向免疫反應為所欲的及/或治療上有利之疾病和病症。例如,本發明之抗體可用於治療各種癌症或其他,其中免疫治療,亦即效應細胞免疫調節證明為正當之疾病。
Description
本申請案係以電腦可讀取形式之參照序列表提出,存檔為10151WO01_ST25.txt,其係於2016年9月22日所建立並含有264,418位元。
本發明係關於以效應子抗原,例如CD3抗原和腫瘤相關抗原為目標之雙特異性抗體,以及殺死腫瘤的方法。本發明係關於降低或消除腫瘤負荷並控制可能與腫瘤免疫治療有關的毒性副作用。本發明係提供雙特異性抗體,其係包括以微弱親和力或以未檢出的結合親和力與效應子抗原結合之效應子臂,例如抗-CD3抗原結合臂,其在一活體外親和力分析中,係以大於約500nM之KD與CD3結合。
治療性雙特異性抗體(bsAb)之前景,特別是在腫瘤免疫治療中,係瞄準橋接多重抗原目標,以便對帶有不欲目標之細胞或生物體引出更健全先天免疫反應。
為了媒介重新定向的溶離,bsAb必須直接聚集一目標細胞與一效應細胞,例如T細胞上的觸發分子,目前已完全建立。在bsAb設計上有許多因素須考慮,例如大小和組成將影響活體內的生物分布和穩定性(Segal,DM,Weiner,GJ,and Weiner,LM.Current Opinion in Immunol 1999,
11:558-562;Chames,P.and Baty,D.MAbs.2009,1(6):539-547)。依照所欲觸發反應之T細胞亞群,以及所欲刺激的T細胞狀態,分化結果難以預測。眾所皆知的,bsAb不會得到一致的結果(Manzke O,et al.Cancer Immunol Immunother.1997,45:198-202)。例如,在無充分的細胞激素產生下,CD3交叉連接可能在T細胞中引發細胞凋亡反應(Noel PJ,Boise LH,Thompson CB:Regulation of T cell activation by CD28 and CTLA4.Adv Exp Med Biol 1996,406:209-217)。T細胞亞群和此等招募的T細胞,例如初始T細胞之分化狀態,對於效力為重要的,因為初始T細胞在無活化下無法溶離目標細胞(例如在IL-2存在下與TCR交叉連接)。
特定的雙特異性治療為成功的,然而,如同許多癌症治療,需付出代價。毒性為癌症治療中主要的失敗原因。眾所皆知的,所謂的化療藥物毒性為病患副作用之主要原因及次要弊病。「殺死細胞」之行為本身為病患製造了麻煩。過剩的細胞毒性反應可能係由效應細胞,例如T細胞活化所引發,且癌症目標細胞,在腫瘤免疫治療中哪一類型的反應為最有利的仍尚待分曉。用於雙特異性治療之鑑定抗-CD3抗體的方法具有降低副作用同時維持效力和所欲的藥物動力學性質,應為有利的。
以結構/活性關係(SAR)為基礎之技術,例如親和力成熟,已有描述,其係利用致突變來優化抗體,使其相較於開始的抗體,對目標抗原具有增加和提升的結合特異性或親和力(參見,例如2011年5月12日公開的WO2011056997)。能以各種程度的親和力與CD3結合和交互作用,同時仍具有中度至高度T細胞活化作用之修飾的OKT3抗體已有描述(US7820166)。然而,降低抗體分子之結合親和力至接近或超出可偵測結合量之外,並未描述,亦無顯示對腫瘤減少或抑制具有必須的功效。
因此,對於具有控制的細胞毒性和較佳PK性質之替代的雙特異性抗原結合分子存有需求。此等癌症治療在治療設置中應為相當有用
的。
在第一方面,本發明係提供與人類CD3結合,對人類及/或獼猴CD3具有微弱或未檢出親和力之抗體及其抗原結合片段。根據本發明此方面,此等抗體可用於,其中包括,以表現CD3之T細胞為標靶,及用於刺激T細胞活化,例如在其中T細胞媒介的毒殺為有利或所欲的情況。本發明之抗-CD3抗體或其抗原結合部份可包括將CD3-媒介的T細胞活化導向特定細胞類型,例如腫瘤細胞或感染原,作為雙特異性抗體的部份。
本發明之示例性抗-CD3抗體係列於文中的表2和3中。表2係列出重鏈可變區(HCVR)以及重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2和HCDR3)之胺基酸序列辨識碼。表3係列出編碼示例抗-CD3抗體之HCVR、HCDR1、HCDR2和HCDR3區的核酸分子之序列辨識碼。表4和5係列出示例的抗-CD3抗體之輕鏈可變區(LCVR)以及輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
本發明係提供包括一HCVR之抗體或其抗原結合片段,該HCVR係包括一由表2所列的任何HCVR胺基酸序列中選出之胺基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其序列相同度之實質上其類似序列。
本發明亦提供包括一HCVR和一LCVR胺基酸序列對(HCVR/LCVR)之抗體或其抗原結合片段,而該HCVR和LCVR胺基酸序列對係包括表2所列的任何HCVR胺基酸序列與表4所列的任何LCVR胺基酸序配對,或衍生自抗-TAA重鏈之同源輕鏈的共同輕鏈,或衍生自一已知或公共區輕鏈可變區,其係衍生自具有雜交或與各種非同源重鏈配對能力之輕鏈,亦即通用或共同輕鏈。根據特定的實施例,本發明係提供包括一HCVR/LCVR胺基酸序列對之抗體或其抗原結合片段,該HCVR/LCVR胺
基酸序列對係包含在與表4所列的示例輕鏈可變區配對之表2所列的任何示例抗-CD3抗體內。在特定的實施例中,此HCVR/LCVR胺基酸序列對係由下列組成之群中選出:SEQ ID NO:10/162(例如CD3-VH-G2);18/162(例如CD3-VH-G3);26/162(例如CD3-VH-G4);34/162(例如CD3-VH-G5);42/162(例如CD3-VH-G8);50/162(例如CD3-VH-G9);58/162(例如CD3-VH-G10);66/162(例如CD3-VH-G11);74/162(例如CD3-VH-G12);82/162(例如CD3-VH-G13);90/162(例如CD3-VH-G14);98/162(例如CD3-VH-G15);106/162(例如CD3-VH-G16);114/162(例如CD3-VH-G17);122/162(例如CD3-VH-G18);130/162(例如CD3-VH-G19);138/162(例如CD3-VH-G20);及146/162(例如CD3-VH-G21)。
本發明亦提供包括一重鏈CDR1(HCDR1)之抗體或其抗原結合片段,該重鏈CDR1係包括一由表2所列的任何HCDR1胺基酸序列中選出之胺基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。本發明亦提供包括一重鏈CDR1(HCDR1)之抗體或其抗原結合片段,而該重鏈CDR1係包括一SEQ ID NO:178中所示的胺基酸序列。
本發明亦提供包括一重鏈CDR2(HCDR2)之抗體或其抗原結合片段,該重鏈CDR2係包括一由表2所列的任何HCDR2胺基酸序列中選出之胺基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似序列。本發明亦提供包括一重鏈CDR2(HCDR2)之抗體或其抗原結合片段,而該重鏈CDR2係包括一SEQ ID NO:179中所示的胺基酸序列。
本發明亦提供包括一重鏈CDR3(HCDR3)之抗體或其抗原結合片段,該重鏈CDR3係包括一由表2所列的任何HCDR3胺基酸序列中選出之胺基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序
列相同度之實質上其類似的序列。本發明亦提供包括一重鏈CDR3(HCDR3)之抗體或其抗原結合片段,而該重鏈CDR3係包括一SEQ ID NO:180中所示的胺基酸序列。
本發明亦提供包括一輕鏈CDR1(LCDR1)之抗體或其抗原結合片段,該輕鏈CDR1係包括一由表4所列的任何LCDR1胺基酸序列中選出之胺基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。本發明亦提供包括一輕鏈CDR1(LCDR1)之抗體或其抗原結合片段,而該輕鏈CDR1係包括衍生自抗-TAA重鏈之同源輕鏈,或衍生自一具有雜交或與各種非同源重鏈配對能力之輕鏈,亦即通用或共同輕鏈。
本發明亦提供包括一輕鏈CDR2(LCDR2)之抗體或其抗原結合片段,該輕鏈CDR2係包括一由表4所列的任何LCDR2胺基酸序列中選出之胺基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。本發明亦提供包括一輕鏈CDR2(LCDR2)之抗體或其抗原結合片段,而該輕鏈CDR2係包括衍生自抗-TAA重鏈之同源輕鏈,或衍生自一具有雜交或與各種非同源重鏈配對能力之輕鏈,亦即通用或共同輕鏈。
本發明亦提供包括一輕鏈CDR3(LCDR3)之抗體或其抗原結合片段,該輕鏈CDR3係包括一由表4所列的任何LCDR3胺基酸序列中選出之胺基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。本發明亦提供包括一輕鏈CDR3(LCDR3)之抗體或其抗原結合片段,而該輕鏈CDR3係包括衍生自抗-TAA重鏈之同源輕鏈,或衍生自一具有雜交或與各種非同源重鏈配對能力之輕鏈,亦即通用或共同輕鏈。
本發明亦提供包括一HCDR3和一LCDR3胺基酸序列對
(HCDR3/LCDR3)之抗體或其抗原結合片段,而該胺基酸序列對係包括表2所列的任何HCDR3胺基酸序列與表4所列的任何LCDR3胺基酸序配對。根據特定的實施例,本發明係提供包括一HCDR3/LCDR3胺基酸序列對之抗體或其抗原結合片段,而該胺基酸序列對係包含在表2所列的任何示例抗-CD3抗體內。在特定的實施例中,此HCDR3/LCDR3胺基酸序列對係由下列組成之群中選出:SEQ ID NO:16/168(例如CD3-VH-G2);24/168(例如CD3-VH-G3);32/168(例如CD3-VH-G4);40/168(例如CD3-VH-G5);48/168(例如CD3-VH-G8);56/168(例如CD3-VH-G9);64/168(例如CD3-VH-G10);72/168(例如CD3-VH-G11);80/168(例如CD3-VH-G12);88/168(例如CD3-VH-G13);96/168(例如CD3-VH-G14);104/168(例如CD3-VH-G15);112/168(例如CD3-VH-G16);120/168(例如CD3-VH-G17);128/168(例如CD3-VH-G18);136/168(例如CD3-VH-G19);144/168(例如CD3-VH-G20);及152/168(例如CD3-VH-G21)。
本發明亦提供包括一組6個CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)之抗體或其抗原結合片段,而該CDR組係包含在表2和4所列的任何示例抗-CD3抗體內。在特定的實施例中,此HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列係由下列組成之群中選出:SEQ ID NO:12-14-16-164-166-168(例如CD3-VH-G2);20-22-24-164-166-168(例如CD3-VH-G3);28-30-32-164-166-168(例如CD3-VH-G4);36-38-40-164-166-168(例如CD3-VH-G5);44-46-48-164-166-168(例如CD3-VH-G8);52-54-56-164-166-168(例如CD3-VH-G9);60-62-64-164-166-168(例如CD3-VH-G10);68-70-72-164-166-168(例如CD3-VH-G11);76-78-80-164-166-168(例如CD3-VH-G12);84-86-88-164-166-168(例如CD3-VH-G13);92-94-96-164-166-168(例如CD3-VH-G14);
100-102-104-164-166-168(例如CD3-VH-G15);108-110-112-164-166-168(例如CD3-VH-G16);116-118-120-164-166-168(例如CD3-VH-G17);124-126-128-164-166-168(例如CD3-VH-G18);132-134-136-164-166-168(例如CD3-VH-G19);140-142-144-164-166-168(例如CD3-VH-G20);及148-150-152-164-166-168(例如CD3-VH-G21)。
在一相關的實施例中,本發明係提供包括一組6個CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)之抗體或其抗原結合片段,而該CDR組係包含在如表2和4所列的任何示例抗-CD3抗體所定義的HCVR/LCVR胺基酸序列對內。例如,本發明係包括包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列組之抗體或其抗原結合片段,而該胺基酸序列組係包括在由下列組成之群中選出的HCVR/LCVR胺基酸序列對內:SEQ ID NO:10/162(例如CD3-VH-G2);18/162(例如CD3-VH-G3);26/162(例如CD3-VH-G4);34/162(例如CD3-VH-G5);42/162(例如CD3-VH-G8);50/162(例如CD3-VH-G9);58/162(例如CD3-VH-G10);66/162(例如CD3-VH-G11);74/162(例如CD3-VH-G12);82/162(例如CD3-VH-G13);90/162(例如CD3-VH-G14);98/162(例如CD3-VH-G15);106/162(例如CD3-VH-G16);114/162(例如CD3-VH-G17);122/162(例如CD3-VH-G18);130/162(例如CD3-VH-G19);138/162(例如CD3-VH-G20);及146/162(例如CD3-VH-G21)。
用於鑑定HCVR和LCVR胺基酸序列中之CDR的方法和技術已為本項技術所熟知並可用於鑑別文中所揭示的特定HCVR及/或LCVR胺基酸序列內的CDR。可用於鑑別CDR界限之示例性習用法包括,例如Kabat定義、Chothia定義和AbM定義。一般而言,Kabat定義係以序列變異性為基準,Chothia定義係以結構環區域之位置為基準,而AbM定義為介於Kabat和Chothia法之折衷。參見,例如Kabat,"Sequences of Proteins of
Immunological Interest," National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991);Al-Lazikani et al.,J.Mol.Biol.273:927-948(1997);及Martin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。亦可取得公開的資料庫用來鑑別抗體內的CDR序列。
本發明亦提供編碼抗-CD3抗體或其部分之核酸分子。例如,本發明係提供編碼表3中所列的任何HCVR胺基酸序列之核酸分子;在特定的實施例中,此核酸分子係包括由表3所列的任何HCVR核酸序列中選出之多核苷酸序列,或具有與其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似序列。
本發明亦提供編碼表4中所列的任何LCVR胺基酸序列之核酸分子;或衍生自抗-TAA重鏈之同源輕鏈,或衍生自一具有雜交或與各種非同源重鏈配對能力之輕鏈,亦即通用或共同輕鏈的LCVR。在特定的實施例中,此核酸分子係包括由表5所列的任何LCVR核酸序列中選出之多核苷酸序列,或具有與其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。
本發明亦提供編碼表2中所列的任何HCDR1胺基酸序列之核酸分子;在特定的實施例中,此核酸分子係包括由表3所列的任何HCDR1核酸序列中選出之多核苷酸序列,或具有與其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似序列。
本發明亦提供編碼表2中所列的任何HCDR2胺基酸序列之核酸分子;在特定的實施例中,此核酸分子係包括由表3所列的任何HCDR2核酸序列中選出之多核苷酸序列,或具有與其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似序列。
本發明亦提供編碼表2中所列的任何HCDR3胺基酸序列之核酸分子;在特定的實施例中,此核酸分子係包括由表3所列的任何HCDR3
核酸序列中選出之多核苷酸序列,或具有與其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似序列。
本發明亦提供編碼表4中所列的任何LCDR1胺基酸序列之核酸分子;或衍生自抗-TAA重鏈之同源輕鏈,或衍生自一具有雜交或與各種非同源重鏈配對能力之輕鏈,亦即通用或共同輕鏈的LCDR1。在特定的實施例中,此核酸分子係包括由表5所列的任何LCDR1核酸序列中選出之多核苷酸序列,或具有與其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。
本發明亦提供編碼表4中所列的任何LCDR2胺基酸序列之核酸分子;或衍生自抗-TAA重鏈之同源輕鏈,或衍生自一具有雜交或與各種非同源重鏈配對能力之輕鏈,亦即通用或共同輕鏈的LCDR2。在特定的實施例中,此核酸分子係包括由表5所列的任何LCDR2核酸序列中選出之多核苷酸序列,或具有與其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。
本發明亦提供編碼表4中所列的任何LCDR3胺基酸序列之核酸分子;或衍生自抗-TAA重鏈之同源輕鏈,或衍生自一具有雜交或與各種非同源重鏈配對能力之輕鏈,亦即通用或共同輕鏈的LCDR3。在特定的實施例中,此核酸分子係包括由表5所列的任何LCDR3核酸序列中選出之多核苷酸序列,或具有與其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。
本發明亦提供編碼HCVR之核酸分子,其中該HCVR係包括一組三個CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3),其中該HCDR1-HCDR2-HCDR3胺基酸序列組係如表2所列的任何示例性抗-CD3抗體所定義。
本發明亦提供編碼LCVR之核酸分子,其中該LCVR係包
括一組三個CDR(亦即LCDR1-LCDR2-LCDR3),其中該LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列組係如表4所列的任何示例性通用輕鏈抗體所定義;或該LCDR1-LCDR2-LCDR3係衍生自抗-TAA重鏈之同源輕鏈,或衍生自一具有雜交或與各種非同源重鏈配對能力之輕鏈,亦即通用或共同輕鏈。
本發明亦提供編碼HCVR和LCVR二者之核酸分子,其中此HCVR係包括一表2中所列的任何HCVR胺基酸序列之胺基酸序列,及其中此LCVR係包括一表4中所列的任何LCVR胺基酸序列之胺基酸序列;或該LCVR係衍生自抗-TAA重鏈之同源輕鏈,或衍生自一具有雜交或與各種非同源重鏈配對能力之輕鏈,亦即通用或共同輕鏈。在特定的實施例中,此核酸分子係包括由表2所列的任何HCVR核酸序列中選出之多核苷酸序列,或具有與其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列,及由表5所列的LCVR核酸序列中選出之多核苷酸序列,或具有與其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。在某些實施例中,此編碼HCVR和LCVR的核酸分子為全長的人類序列或衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列。
本發明亦提供能表現包括抗-CD3抗體之重鏈或輕鏈可變區之多肽的重組表現載體。例如,本發明係包括重組的表現載體,該載體係包括任何上文所提之核酸分子,亦即編碼表2或表4中所列的任何HCVR、LCVR及/或CDR序列之核酸分子。本發明之範圍亦包括已導入此等載體之宿主細胞,以及藉由在得以產生抗體和抗體片段之條件下培養宿主細胞,並回收所產生的抗體和抗體片段來製造抗體或其部分之方法。
本發明係包括具有一修飾糖基化模式之抗-CD3抗體及/或抗-TAA抗體,以及雙特異性抗-CD3/抗-TAA抗體。在某些實施例中,移除不欲的糖基化位置之修飾作用或在寡糖鏈上缺乏岩藻糖基團存在之抗體,
例如,用以增加抗體依賴的細胞毒殺(ADCC)功能,可能為有用的(參見Shield et al.(2002)JBC 277:26733)。在其他的應用上,可進行半乳糖基化之修飾作用以修改補體依賴的細胞毒殺作用(CDC)。
在一方面,本發明係提供一細胞毒性組成物,其包括i)不能與效應細胞特異性結合,及ii)與一目標腫瘤細胞特異性結合之雙特異性抗原結合分子,其中該特異性結合係以一活體外FACS結合分析或一活體外表面電漿子共振結合分析所測量。在特定的實施例中,本發明係提供一包括雙特異性抗原結合分子的細胞毒性組成物,而該雙特異性抗原結合分子對效應細胞展現未檢出的結合且係以一可測量的結合親和力與目標腫瘤細胞特異性結合,其中該結合親和力值係以一活體外FACS結合分析或一活體外表面電漿子共振結合分析所測量。
在其他的實施例中,本發明係提供一包括雙特異性抗原結合分子的細胞毒性組成物,而該雙特異性抗原係包括i)對CD3展現未檢出的結合之第一抗原結合片段(Fab1),及ii)以可測量的結合親和力與腫瘤細胞特異性結合之第二抗原結合片段(Fab2),其中該結合親和力值係以一活體外FACS結合分析或一活體外表面電漿子共振結合分析所測量。在某些案例中,此結合親和力為單價結合親和力(例如以雙特異性抗體結構)。
在另一方面本發明係提供一包括雙特異性抗原結合分子的細胞毒性組成物,該雙特異性抗原結合分子係以微弱結合親和力與效應細胞特異性結合,例如具有約或大於100nM之EC50值,及以一可觀的EC50值,或例如低於50nM之高親和力EC50值與目標腫瘤細胞結合,其中該EC50結合親和力值係以一活體外FACS結合分析所測量。在特定的實施例中,本發明係提供一包括雙特異性抗原結合分子的細胞毒性組成物,而該雙特異性抗原結合分子係以大於約500nM之EC50值與一效應細胞特異性結合,及以一可觀的EC50值,或例如低於50nM之高親和力EC50值與目標腫瘤細
胞結合,其中該EC50結合親和力值係以一活體外FACS結合分析所測量。
在某些實例中,此雙特異性抗原結合分子係包括以大於約40nM,或大於約100nM,大於約200nM,大於約300nM,大於約400nM,大於約500nM,或大於約1μM(例如,在單價結合情況下)之EC50值與人類CD3結合的Fab1。在某些實施例中,此雙特異性抗原結合分子係包括一Fab2,其係衍生自以高親和力,例如低於約50nM,低於約40nM,低於約20nM,低於約10nM或低於約6nM(例如,在單價結合情況下)之EC50值與目標腫瘤細胞特異性結合的第二抗體。在某些案例中,Fab1係各自以大於約40nM,或大於約100nM,大於約200nM,或大於約1μM之EC50值與人類CD3和獼猴CD3特異性結合。在某些案例中,Fab1係以微弱或未檢出的親和力與各人類CD3和獼猴CD3特異性結合。
在某些實施例中,此目標腫瘤細胞為一人類腫瘤細胞。在某些實施例中,此Fab1(或雙特異性抗原結合分子),如活體外T細胞-媒介的腫瘤細胞毒殺分析中所測,係包括具有低於約1.3nM之EC50值之T細胞-媒介的腫瘤細胞毒殺。
在某些應用中,此Fab1或雙特異性抗原結合分子,如活體外表面電漿子共振結合分析所測,係以大於約11nM之KD值與人類CD3特異性結合。在其他的情況下,此Fab1或雙特異性抗原結合分子,如活體外表面電漿子共振結合分析所測,係以大於約15nM,或大於約30nM,大於約60nM,大於約120nM,或大於約300nM之KD值與各人類CD3和獼猴CD3特異性結合。又在某些應用中,此Fab1或雙特異性抗原結合分子i)如在各活體外表面電漿子共振結合分析和FACS結合分析所測,對人類CD3不具有可偵測的結合,及ii)如活體外T細胞-媒介的腫瘤細胞毒殺分析中所測,引發T細胞-媒介的腫瘤細胞毒殺。
在某些應用中,此雙特異性抗原結合分子係包括一包含
HCDR1區之第一重鏈,而該HCDR1區係包括一SEQ ID NO:12或20中所述之胺基酸序列。在某些實施例中,此第一重鏈係包括一HCDR2區,其係包含SEQ ID NO:14或54中所述之胺基酸序列。在其他的實施例中,此第一重鏈係包括一HCDR3區,其係包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:144或SEQ ID NO:152中所述之胺基酸序列。在其他的應用中,此第一重鏈係包括一HCVR,其係包含具有SEQ ID NO:178-179-180胺基酸序列之HCDR1-HCDR2-HCDR3。在其他的實施例中,第一重鏈係包括一包含SEQ ID NO:178之胺基酸殘基1-7的CDR1,一包含SEQ ID NO:179之胺基酸殘基1-7的CDR2,一包含SEQ ID NO:180之胺基酸殘基4-11的CDR3。
在更多的實施例中,此第一重鏈係包括可變區框架區,其係具有由FR1(SEQ ID NO:174)、FR2(SEQ ID NO:175)、FR3(SEQ ID NO:176)和FR4(SEQ ID NO:177)選出之胺基酸序列。
本發明係提供包括由下列組成中選出的Fab1 HCVR和LCVR胺基酸序列對(HCVR/LCVR)之雙特異性抗原結合分子:SEQ ID NO:10/162;18/162;26/162;34/162;42/162;50/162;58/162;66/162;74/162;82/162;90/162;98/162;106/162;114/162;122/162;130/162;138/162;146/162。
抗體、其抗原結合片段及雙特異性體係以生殖系序列和親代抗體序列間的差異為基礎,用一逐步方式藉由置換親代胺基酸殘基所製造。本發明係提供一製造細胞毒性組成物的方法,其包括(a)鑑定一第一重鏈的胺基酸序列,其係衍生自以高親和力,例如具有低於約40nM之結合親和
力EC50值,與CD3特異性結合的抗體,(b)修飾第一抗體之重鏈可變區中所選的胺基酸殘基,產生一修飾的抗體,(c)將修飾的抗體與衍生自與目標腫瘤細胞抗原特異性結合之第二抗體的第二重鏈配對,產生雙特異性抗體,(d)以一結合親和力分析檢測此雙特異性抗體,且若與CD3之結合親和力具有大於約40nM,或大於100nM,或大於300nM,或大於500nM之EC50值,活未檢出的結合,則(e)製備一包括此雙特異性抗體和一醫藥上接受載劑或稀釋劑之組成物。除了修飾選出抗體之重鏈可變區,用以工程化對特異性靶向效應細胞具有微弱或無親和力之抗原結合臂之外,本發明在文中係提供用於修飾各結合臂之重鏈恆定區(例如CH3區)以製備和純化雙特異性抗體之方法。
一示例方法係提供一製造細胞毒性雙特異性抗體之方法,其包括:(a)鑑定與一來自多物種之效應細胞抗原相互作用之第一人類抗體或其抗原結合片段;(b)鑑定人類抗體之重鏈可變區(HCVR)的生殖系胺基酸殘基;(c)將第一人類抗體的HCVR之胺基酸序列與對應的生殖系HCVR之胺基酸序列作比較;(d)相較於生殖系HCVR中的相同區,鑑定在第一抗體HCVR之修飾區內的胺基酸,藉以讓第一抗體中的修飾區藉由取代、刪除或添加單一胺基酸殘基展現至少一胺基酸修飾;(e)產生多數個各包括至少一個HCVR修飾區之修飾抗體;(f)針對效應細胞抗原之單價親和力,篩選各多數個修飾抗體;(g)選擇相較於第一抗體對效應細胞抗原展現較弱結合親和力或無可偵測結合親和力的修飾抗體;及(h)將選擇的第一抗體和與腫瘤-相關抗原交互作用的第二抗體配對,產生一細胞毒性雙特異性抗體。
在另一方面,本發明係提供一醫藥組成物,其包括一與CD3特異性結合之重組的人類雙特異性抗體或其片段以及一醫藥上可接受載劑。在一相關的方面,本發明之特徵為一組成物,其為抗-CD3抗體和第二治療劑之組合物。在一實施例中,此第二治療劑為有利地與抗-CD3抗體組合之
任何藥劑。可有利地與抗-CD3抗體組合之示例性藥劑,包括(不限於)與結合及/或活化CD3訊號傳遞之其他藥劑(包括其他抗體或其抗原結合片段等)及/或不會直接與CD3結合但仍會活化或刺激免疫細胞活化之藥劑。涉及本發明抗-CD3之另外的組合治療或共調配物係揭示於文中他處。
又在另一方面,本發明係提供使用本發明之抗-CD3抗體或抗體之抗原結合部份刺激T細胞活化之治療方法,其中該治療方法係包括將一治療上有效量之包括本發明雙特異性抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物投予有此需要之患者。所治療的病症為藉由以腫瘤-相關抗原,例如癌症為目標的細胞毒性治療而加以改進、改善、抑制或防止之任何疾病或症狀。
根據另一方面,本發明係提供與CD3和目標抗原,特別是腫瘤相關抗原(TAA)結合之雙特異性抗原結合分子。
本發明亦包括本發明抗-CD3/抗-TAA雙特異性抗原結合分子於製造醫藥品供治療與TAA表現有關或由其所造成的疾病或病症之用途。本發明亦提供相較於對CD3-表現的效應細胞具高親和力之抗-CD3/抗-TAA雙特異性抗原結合分子,對CD3-表現的效應細胞具弱親和力及降低的清除率之抗-CD3/抗-TAA雙特異性抗原結合分子於製造醫藥品供治療與TAA表現有關或由其所造成的疾病或病症之用途。
從審視接續的實施方式,其他實施例將更顯而易見。
圖1係顯示下列重鏈可變區(HCVR)序列之胺基酸比對:生殖系hIgHV(SEQ ID NO:181);CD3-VH-P(SEQ ID NO:154);CD3-VH-G(SEQ ID NO:2);CD3-VH-G2(SEQ ID NO:10);CD3-VH-G3(SEQ ID NO:18);CD3-VH-G4(SEQ ID NO:26);CD3-VH-G5(SEQ ID NO:34);
CD3-VH-G8(SEQ ID NO:42);CD3-VH-G9(SEQ ID NO:50);CD3-VH-G10(SEQ ID NO:58);CD3-VH-G11(SEQ ID NO:66);CD3-VH-G12(SEQ ID NO:74);CD3-VH-G13(SEQ ID NO:82);CD3-VH-G14(SEQ ID NO:90);CD3-VH-G15(SEQ ID NO:98);CD3-VH-G16(SEQ ID NO:106);CD3-VH-G17(SEQ ID NO:114);CD3-VH-G18(SEQ ID NO:122);CD3-VH-G19(SEQ ID NO:130);CD3-VH-G20(SEQ ID NO:138);及CD3-VH-G21(SEQ ID NO:146)。各衍生的HCVR係與親代抗體和生殖系胺基酸殘基比較,其中長方形框係代表CDR中的突變。
圖2A、2B和2C係說明,在野生型小鼠(圖2A)、人源化CD3小鼠(圖2B)和人源化MUC16 x CD3小鼠(圖2C)中單一0.4mg/kg腹膜內注射BSMUC16/CD3-001、BSMUC16/CD3-005和同型對照抗體後之血清中總IgG的平均濃度。
在描述本發明之前,應了解,本發明不限於所述的特定方法和實驗條件,因為此等方法和條件可改變。亦應了解,文中所用的術語僅作為描述特定實施例之目的,且不希望受限,因為本發明之範圍將僅受限於所附的申請專利範圍。
除非另有說明,否則所有文中所用的技術和科學術語係具有如本發明所屬技術之一般技術者所正常理解之相同意義。如文中所用,術語「大約」當用於有關特定引述的數值時,係指該值可從該引述值做不大於1%的變化。例如,如文中所用,「約100」一詞包括99和101及所有介於之間的值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
雖然在施行或試驗本發明時可使用任何該等與文中所述的
方法和物質類似或相當者,但較佳的方法和物質為目前所述。
定義
「CD3」一詞,係指表現在T細胞上作為多分子T細胞受體(TCR)之部分的抗原,且其係由下列四條受體鏈中的二條鏈所形成的同源二聚體或異源二聚體所組成:CD3-ε、CD3-δ、CD3-ζ及CD3-γ。人類CD3-εn(hCD3ε)係包括SEQ ID NO:169(UniProtKB/Swiss-Prot:P07766.2)中所述的胺基酸序列。人類CD3-δ(hCD3δ係包括SEQ ID NO:170(UniProtKB/Swiss-Prot:P04234.1)中所述的胺基酸序列。除非明確地指出係來自非人類物種,否則所有關於文中之蛋白、多肽和蛋白片段希望係指人類版本的各蛋白、多肽和蛋白片段。因此,除非明確地指出係來非人類物種,例如「小鼠CD3」、「猴子CD3」等,否則「CD3」一詞係指人類CD3。
詞語「與CD3結合之抗體」或「抗-CD3抗體」包括特異辨識單一CD3亞單元(例如ε、δ、γ或ζ)或與其連結之抗體及其抗原結合片段,以及特異辨識二個CD3亞單元之二聚複合物(例如,γ/ε、δ/ε及ζ/ζ CD3二聚體)以及與其連結之的抗體及其抗原結合片段。本發明之抗體及抗原結合片段可與可溶性CD3、結合CD3及/或細胞表面表現的CD3結合。可溶性CD3包括天然的CD3蛋白以及重組的CD3蛋白變體,例如,缺乏跨膜區或另外不與細胞膜結合之單體和二聚體CD3結構。本發明係提供以微弱或未檢出的結合親和力結合和活化人類及獼猴CD3之抗體。「以未檢出的結合親和力與CD3結合」係指與抗體或抗原結合片段與目標CD3之相互作用可能以已知的偵測分析,例如如文中所述之FACS(細胞為基礎)結合分析或如文中所述及本項技術所熟知之表面電漿子共振分析為無法測量的或無法偵測的。其他的結合分析已為本項技術所熟知。抗體或抗原結合片段可藉由非常弱的蛋白-蛋白生化交互作用辨識CD3目標,然而,特定的KD或
EC50值之測定可能無法測量,因為交互作用係超出此分析的偵測極限之外,例如無法測定任何測量值。在其他的情況,「未檢出的結合親和力」,若對應KD值之抗體親和力係等於或比非特異性抗原,例如BSA、酪蛋白及其類似物低10倍,則經測定為「未檢出的結合親和力」。「以微弱的結合親和力與CD3結合」包括其中結合親和力測量係在分析的偵測極限或些微超過,或等同對非特異性抗原之結合親和力的相互作用。
「細胞表面-表現的CD3」一詞,係指一或多個CD3蛋白,其在活體內或活體外係表現在細胞表面,使得至少一部分的CD3蛋白係暴露於細胞膜的胞外側且易接近抗體的抗原結合部分。「細胞表面表現的CD3」包括包含在細胞膜中之功能性T細胞受體環境內的CD3蛋白。「細胞表面表現的CD3」一詞包括表現作為細胞表面上的同源二聚體或異源二聚體(例如,δ/ε、γ/ε及ζ/ζ CD3二聚體)部分的CD3蛋白。「細胞表面表現的CD3」一詞亦包括自我表現,在細胞表面上無其他CD3鏈類型之CD3鏈(例如,CD3-δ、CD3-ε或CD3-γ)。「細胞表面表現的CD3」可包括或由表現於正常表現CD3蛋白之細胞表面的CD3蛋白所組成。另一種選擇,「細胞表面表現的CD3」可包括或由表現於正常不會表現CD3蛋白在其表面上但經人工工程化表現CD3在其表面上之細胞表面的CD3蛋白所組成。
效應細胞包括效應T細胞(T淋巴細胞),例如CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、Th1、Th2和調節T細胞(Tregs)。效應細胞亦可包括天然的殺手細胞、巨噬細胞、粒細胞、漿細胞或B細胞(淋巴細胞)。請了解,治療可能經由Ig與效應細胞表面受體,例如CD3(T細胞表面受體)、CD28(T細胞)、Fcγ受體(FcγRs)(NK細胞,活化的巨噬細胞等)的交互作用,媒介過剩的細胞-媒介免疫反應或效應子功能。效應子功能,例如殺死細胞、補體活化、吞噬作用和調理作用隨後係經由這些交互作用所觸發。與效應細胞和腫瘤目標細胞結合,導致了傳播腫瘤細胞毒殺及引發對抗腫瘤或癌症之內
生性免疫功能的有價值和有效之免疫治療設計。
「抗-CD3抗體」一詞,包括帶有單一特異性之單價抗體,以及包括結合CD3之第一臂及結合第二(目標)抗原之第二臂的雙特異性抗體,其中抗-CD3臂係包括任何如文中表2、3、4及/或5中所列的HCVR/LCVR或CDR序列。抗-CD3雙特異性抗體之實例係描述於文中之他處。術語「抗原-結合分子」包括抗體和抗體之抗原結合片段,其包括,例如雙特異性抗體。
術語「抗體」係包括任何包含至少一個與特定抗原(例如CD3)特異性結合或相互作用之互補決定區(CDR)的抗原結合分子或分子複合物。術語「抗體」係包括:包含藉由雙硫鍵相互連接的四條多肽鏈,二條重(H)鏈和二條輕(L)鏈之免疫球蛋白分子以及其多聚體(例如IgM)。各重鏈係包括一重鏈可變區(文中縮寫為HCVR或VH)及一重鏈恆定區。此重鏈恆定區係包括三個區,CH1、CH2和CH3。各輕鏈係包括一輕鏈可變區(文中縮寫為LCVR或VL)及一輕鏈恆定區。輕鏈恆定區係包括一個區(CL1)。VH和VL區可進一步細分為高變區,稱為互補決定區(CDR),其間散佈著較保守性區域,稱為框架區(FR)。各VH和VL係由三個CDR和四個FR所組成,以下列順序由胺基端排列至羧基端:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明不同的實施例中,抗-CD3抗體(或其抗原結合部分)之FR可與人類生殖系序列相同,或可經自然或人工修飾。胺基酸共有序列可以二或多個CDR之並排(side-by-side)分析為基準來定義。
術語「抗體」亦包括全抗體分子之抗原結合片段。術語抗體之「抗原結合部分」、抗體之「抗原結合片段」等等,如文中所用,係包括任何與抗原特異性結合形成一複合物之天然生成、酵素製得、合成或基因工程化的多肽或糖蛋白。抗體之抗原結合片段可使用任何適合的標準技術,例如蛋白質水解消化作用或涉及編碼抗體可變區和(視需要)恆定區之
DNA操作和表現的重組基因工程技術,衍生自例如全抗體分子。此DNA為已知的及/或可容易地從例如市面來源、DNA資料庫(包括,例如噬菌體-抗體資料庫)取得或可經合成。此DNA可用化學或藉由使用分子生物技術來定序和操作,例如將一或多個可變及/或恆定區排列成適合的組態,或導入密碼子,產生半胱胺酸殘基、修飾、增添或刪除胺基酸等。
抗原結合片段之非限定實例包括:(i)Fab片段;(ii)F(ab')2片段;(iii)Fd片段;(iv)Fv片段;(v)單鏈Fv(scFv)分子;(vi)dAb片段;和(vii)由模擬抗體高變區之胺基酸殘基所組成的最小識別單位(例如分離的互補決定區(CDR),例如CDR3胜肽)或限制性FR3-CDR3-FR4胜肽。其他工程化分子,例如區域特異性抗體、單區抗體、區域刪除抗體、嵌合抗體、CDR-植入抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、雙價奈米抗體等)、小模組免疫醫藥(SMIP)及鯊可變IgNAR區,亦涵蓋在文中所用的「抗原結合片段」之詞語內。
抗體之抗原結合片段典型地將包括至少一可變區。可變區可為任何大小或胺基酸組成之區域且一般將包括與一或多個框架序列相鄰或在其框架內之CDR。在具有VH區與VL區結合之抗原結合片段中,VH和VL區可以任何適合的排列位於彼此相對處。例如可變區可為二聚化並含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。另一種選擇,抗體之抗原結合片段可含有單體VH或VL區。
在特定的實施例中,抗體之抗原結合片段可含有至少一個可變區與至少一個恆定區共價連接。在本發明之抗體的抗原結合片段內可發現的可變區和恆定區之非限定、示例性組態包括:(i)VH-CH1;(ii)VH-CH2;(iii)VH-CH3;(iv)VH-CH1-CH2;(v)VH-CH1-CH2-CH3;(vi)VH-CH2-CH3;(vii)VH-CL;(viii)VL-CH1;(ix)VL-CH2;(x)VL-CH3;(xi)VL-CH1-CH2;(xii)VL-CH1-CH2-CH3;(xiii)VL-CH2-CH3;及(xiv)VL-CL。在任何可變區和恆定
區之組態中,包括上列任何的示例性組態,可變區和恆定區可直接彼此相連接或可藉由完整或部分的絞鏈或連接子區相連接。絞鏈區可由至少2個(例如5、10、15、20、40、60或更多個)胺基酸所組成,使其在單一多肽分子中於相鄰的可變及/或恆定區之間產生柔性和半柔性連結。再者,在本發明之抗體的抗原結合片段可包括以非共價彼此相互連結及/或與一或多個單體VH或VL區相連結(例如以雙硫鍵)之任何上列的可變區和恆定區組態之同源二聚體或異源二聚體(或其他多聚體)。
如同全抗體分子,抗原結合片段可為單特異性或多特異性(例如雙特異性)。抗體之多特異性抗原結合片段典型地將包括至少二個不同的可變區,其中各可變區能特異性與個別的抗原結合或與相同抗原上不同的表位結合。任何多特異性抗體模式,包括文中所揭示的示例性雙特異性抗體模示,可使用本項技術中可取得的習用技術來改造,使其適用於本發明抗體之抗原結合片段狀況。
本發明之抗體可經由補體-依賴的細胞毒殺作用(CDC)或抗體-依賴的細胞媒介之細胞毒殺作用(ADCC)來作用。「補體-依賴的細胞毒殺作用(CDC)」係指在補體的存在下藉由本發明之抗體解離抗原-表現細胞。「抗體-依賴的細胞媒介之細胞毒殺作用(ADCC)」係指細胞媒介的反應,其中表現Fc受體(FcR)之非特異性細胞毒性細胞(例如天然的殺手(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)辨識出目標細胞上的結合抗體並據此導致目標細胞的解離。CDC和ADCC可使用本項技術所熟知和可取得的分析來測量。(參見,例如美國專利第5,500,362號和第5,821,337號,及Clynes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656)。抗體的恆定區對於抗體固定補體和媒介細胞-依賴的細胞毒殺作用之能力很重要。因此,抗體之同型可依其是否為抗體媒介細胞毒殺作用所希望的為基準加以選擇。
在本發明特定的實施例中,本發明之抗-CD3抗體(單特異性
或雙特異性)為人類抗體。術語「人類抗體」,如文中所用,希望係包括具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變和恆定區的抗體。本發明之人類抗體可包括非由人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼之胺基酸殘基(例如藉由隨機或活體外位點特異性誘變所導入之突變或活體內體細胞突變),例如在CDR中及特別是CDR3。然而,術語「人類抗體」,如文中所用,不希望包括其中衍生自另外哺乳動物物種(例如小鼠)之生殖系的CDR序列已稼接在人類框架序列上之抗體。
術語「重組的人類抗體」,希望係包括由重組方法,例如使用重組的表現載體轉染至宿主細胞(進一步詳述於下)所製備、表現、產生或分離之所有人類抗體,由重組的組合人類抗體庫(進一步詳述於下)分離出之抗體,由經轉殖人類免疫球蛋白基因之動物(例如小鼠)分離出的抗體(參見,例如Taylor et al.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295),或由任何其他涉及將人類免疫球蛋白基因序列與DNA序列拼接之方法所製備、表現、產生或分離之抗體。此等重組的人類抗體具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區和恆定區。然而,在特定的實施例中,此等重組的人類抗體係在活體外經誘發突變(或當使用以人類Ig序列基因轉殖之動物時,為活體內體細胞誘發突變),且因此重組抗體之VH和VL區的胺基酸序列,當衍生自人類生殖系VH和VL序列或與其有關時,其可能並非天然存在於活體內人類抗體生殖系庫中之序列。
人類抗體可以二種與絞鏈異質性有關之形式存在。第一種形式,包括約150-160kDa之安定的四鏈結構之免疫球蛋白分子,其中此二聚體係藉由鏈間重鏈雙硫鍵聚集一起。第二種形式,二聚體並非經由雙硫鍵相連接且此約75-80kDa之分子係由共價偶合的輕鏈和重鏈(半抗體)所組成。這些形式極難分離,即使在親和純化後。
在各種完整的IgG同型中,第二種形式出現的頻率係因(但
不限於)與抗體之絞鏈區同型有關之結構差異所致。在人類IgG4絞鏈之絞鏈區中單一胺基酸取代可顯著地降低第二種形式出現(Angal et al.(1993)Molecular Immunology 30:105)至典型地使用人類IgG1絞鏈所觀察到的程度。本發明係涵蓋絞鏈、CH2或CH3區中具有一或多個突變之抗體,該突變例如在製造上可能為所希望的,用以改善所欲的抗體形式之產率。
本發明之抗體可為分離的抗體。「分離的抗體」,如文中所用,係指經鑑定及從至少一種其天然環境之組成份分離及/或回收之抗體。例如,從至少一種生物體,或從組織或細胞之組成份分離或移出之抗體,其中就本發明之目的,該存在自然界或為自然產生的抗體為一「分離的抗體」。分離的抗體亦包括重組細胞內原位抗體。分離的抗體為歷經至少一純化或分離步驟之抗體。根據特定的實施例,分離的抗體可能實質上無其他細胞物質及/或化學物。
本發明亦包括與CD3結合之單-臂抗體。「單-臂抗體」一詞係指包括單一抗體重鏈和單一抗體輕鏈之抗原結合分子。本發明之單-臂抗體可包括如文中表2中所述之任何HCVR/LCVR或CDR胺基酸序列。
術語「表位」係指與抗體分子可變區中稱為補位(paratope)的特定抗原結合位置相互作用之抗原決定位。單一抗原可具有一個以上的表位。因此,不同的抗體可與抗原的不同區域結合並可具有不同的生物效應。表位可為構型或線性。構型表位係由直鏈多肽鏈不同線段之空間上並列的胺基酸所產生。線性表位係由多肽鏈相鄰的胺基酸殘基所產生。在特定的情況下,表位可在抗原上包括醣類基團、磷醯基基團或磺醯基基團。
術語「實質上一致」或「實質上相同」當係指核酸或其片段時,係表示當以適當的核苷酸插入或刪除與另一核酸(或其互補股)最佳化對齊時,以任何熟知的序列相同度演算法,例如下文所論述的FASTA、BLAST或Gap來測量,有至少約95%,及更佳地至少約96%、97%、98%或99%
之核苷酸鹼基具核苷酸序列相同度。與參照核酸分子具有實質上相同性的核酸分子,在特定情況下,可編碼與參照核酸分子所編碼的多肽具有相同或實質上類似胺基酸序列之多肽。
當應用於多肽時,術語「實質上類似」係指二個胜肽序列,當以GAP或BESTFIT程式使用內建缺位權重最佳化對齊時,享有至少95%序列相同度,甚佳地至少98%或99%序列相同度。較佳地,不同的殘基位置係相差在保守性胺基酸取代。「保守性胺基酸取代」為其中一胺基酸殘基係經另一帶有類似化學性質(例如電荷或疏水性)側鏈(R基)之胺基酸殘基所取代。一般而言,保守性胺基酸取代實質上將不會改變蛋白質的功能特性。在其中彼此有二或多個保守性取代之不同胺基酸序列的案例中,可調高序列相同度之百分比或類似程度以修正此保守性取代作用之性質。調整之方法已為熟習本項技術者所熟知。參見,例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331。具有類似化學性質之側鏈的胺基酸基團實例包括(1)脂系側鏈:甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸;(2)脂系-羥基側鏈:絲胺酸及蘇胺酸;(3)含醯胺側鏈:天門冬醯胺酸和麩醯胺酸;(4)芳香側鏈:苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸;(5)鹼性側鏈:離胺酸、精胺酸及組胺酸;(6)酸性側鏈:天門冬胺酸和麩胺酸,及(7)含硫側鏈有半胱胺酸和甲硫胺酸。較佳的保守性胺基酸取代基群有:纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天門冬胺酸及天門冬醯胺酸-麩醯胺酸。另一種選擇,保守性置換為在Gonnet等人(1992)Science 256:1443-1445所揭示的PAM250對數似然矩陣中具有正值之任何變化。「中度保守性」置換為在PAM250對數似然矩陣中具有非負值之任何變化。
多肽之序列類似性,其亦指序列相同度,典型地係使用序列分析軟體來測量。蛋白分析軟體使用分配至各種取代、刪除和其他修飾作用(包括保守性胺基酸取代)之類似度量值配出類似的序列。例如,GCG軟
體含有例如Gap和Bestfit程式,其可用於內定參數,測定密切相關的多肽間,例如來自不同生物物種之同源多肽,或野生型和其突變蛋白間之序列同源性或序列相同度。參見,例如GCG Version 6.1。多肽序列亦可使用FASTA,利用內定或建議參數,一種GCG Version 6.1內的程式,作比較。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)係提供查詢序列和搜尋序列間最佳重疊區之比對和序列相同度百分比(Pearson(2000)前文)。當本發明序列與含有較大量來自不同生物體的序列資料庫作比較時,另一較佳的演算法為使用內定參數之電腦程式BLAST,特別是BLASTP或TBLASTN。參見,例如Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410及Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402。
生殖系突變
相較於從其衍生抗體之對應的生殖系序列,文中所揭示的抗體係在重鏈可變區之框架區及/或CDR區中包括一或多個胺基酸取代、插入及/或刪除。
本發明亦包括由任何文中所揭示的胺基酸序列所衍生之抗體及其抗原結合片段,其中在一或多個框架及/或CDR區中的一或多個胺基酸係突變成從其衍生抗體之生殖系序列的對應殘基,或另外人類生殖系序列之對應殘基,或對應生殖系殘基之保守胺基酸取代(此等序列改變在文中共同稱為「生殖系突變」)且對於CD3抗原具有微弱或未檢出的結合。數種此等辨識CD3之示例性抗體係描述於文中表2中。
再者,本發明之抗體在框架區及/或CDR區內可含有任何二或多個生殖系突變之組合,例如,其中特定的個別殘基係突變成特定生殖系序列之對應殘基,而與原始生殖系序列不同的其他殘基係維持原樣或突變成不同生殖系序列之對應殘基。一旦得到後,含有一或多個生殖系突變之抗體及抗原結合片段可檢測其一或多種所欲的性質,例如增強的結合特
異性、微弱或減低的結合親和力、強化的藥物動力學性質、降低的致免疫性等。以給予本揭示文指引之此通用方法所得到的抗體和抗原結合區係涵蓋在本發明中。
本發明亦包括抗-CD3抗體,其包含任何具有一或多個保守取代之文中所揭示的HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列的變體。例如,本發明包括抗-CD3抗體,其相對於文中表2所述之任何HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列,係具有含例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少等之保守性胺基酸取代的HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列。相較於從其衍生個別的抗原結合區之對應的生殖系序列,本發明之抗體及雙特異性抗原結合分子係在重鏈和輕鏈可變區之框架區及/或CDR區中包括一或多個胺基酸取代、插入及/或刪除,同時對CD3抗原維持或增進所欲的微弱-至-無可偵測結合。「保守性胺基酸取代」為其中一胺基酸殘基係經另一帶有類似化學性質(例如電荷或疏水性)側鏈(R基)之胺基酸殘基所取代。一般而言,保守性胺基酸取代實質上將不會改變蛋白質的功能特性,亦即此胺基酸取代,就抗-CD3結合分子的情況係維持或增進此所欲的微弱至無可偵測的結合親和力。具有類似化學性質之側鏈的胺基酸基團實例包括(1)脂系側鏈:甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸;(2)脂系-羥基側鏈:絲胺酸及蘇胺酸;(3)含醯胺側鏈:天門冬醯胺酸和麩醯胺酸;(4)芳香側鏈:苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸;(5)鹼性側鏈:離胺酸、精胺酸及組胺酸;(6)酸性側鏈:天門冬胺酸和麩胺酸,及(7)含硫側鏈有半胱胺酸和甲硫胺酸。較佳的保守性胺基酸取代基群有:纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天門冬胺酸及天門冬醯胺酸-麩醯胺酸。另一種選擇,保守性置換為在Gonnet等人(1992)Science 256:1443-1445所揭示的PAM250對數似然矩陣中具有正值之任何變化。「中度保守性」置換為在PAM250對數似然矩陣中具有非負值之任何變
化。
本發明亦包括包含抗原結合區之抗原結合分子,其中該抗原結合區係帶有與文中所揭示的任何HCVR及/或CDR胺基酸序列實質上相同的HCVR及/或CDR胺基酸序列,同時對CD3抗原維持或增進所欲的微弱親和力。術語「實質上一致」或「實質上相同」當係指胺基酸序列時,係表示當,例如以GAP或BESTFIT程式使用內建缺位權重最佳化對齊時,二個胺基酸序列享有至少約95%序列相同度,及甚佳地至少98%或99%之序列相同度。較佳地,不同的殘基位置係相差在保守性胺基酸取代。在其中彼此有二或多個保守性取代之不同胺基酸序列的案例中,可調高序列相同度之百分比或類似程度以修正此保守性取代作用之性質。調整之方法已為熟習本項技術者所熟知。參見,例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331。
多肽之序列類似性,其亦稱為序列相同度,典型地係使用序列分析軟體來測量。蛋白分析軟體使用分配至各種取代、刪除和其他修飾作用(包括保守性胺基酸取代)之類似度量值配出類似的序列。例如,GCG軟體含有例如Gap和Bestfit程式,其可以內定參數用於測定密切相關的多肽間,例如來自不同生物物種之同源多肽,或介於野生型和其突變蛋白之序列同源性或序列相同度。參見,例如GCG Version 6.1。多肽序列亦可使用FASTA,利用內定或建議參數,一種GCG Version 6.1內的程式來作比較。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查詢序列和搜尋序列間最佳重疊區之比對和序列相同度百分比(Pearson(2000)前文)。當本發明序列與含有較大量來自不同物種的序列資料庫作比較時,另一較佳的演算法為使用內定參數之電腦程式BLAST,特別是BLASTP或TBLASTN。參見,例如Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410 and Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402。
一旦得到後,含有一或多個生殖系突變之抗體和抗原結合片段係利用一或多個活體外分析檢測減低的結合親和力。雖然辨識一特定抗原之抗體典型地係就其目的藉由檢測對於抗原之高(亦即強的)結合親和力進行篩選,但本發明抗體具有微弱結合或無可偵測的結合。以此通用方法所得到之包括一或多個抗原結合區地雙特異性抗原結合分子亦涵蓋在本發明中並發現為有利的親和力-驅動之腫瘤治療。
從文中所述的方法可了解到意外的利益,例如增進的藥物動力學和對病患低毒性。
抗體之結合親和力
如文中所用,在抗體、免疫球蛋白、抗原結合片段或含Fc蛋白與預定抗原,例如細胞表面蛋白或其片段之結合中,術語「結合」典型地係指最少二種實體或分子結構之間的交互作用或結合,例如抗體-抗原交互作用。
例如,當例如以表面電漿子共振(SPR)技術於BIAcore 3000儀器上使用抗原作為配體及抗體、Ig、抗體結合片段或含Fc蛋白作為分析物(抗配體)測量時,結合親和力典型地係相當於約10-7M或更低之KD值,例如約10-8M或更低,例如約10-9M或更低。以細胞為基礎的結合策略,例如螢光活化的細胞分類(FACS)結合分析亦為習用的,且FACS數據係與其他方法例如放射性配體競爭結合及SPR密切相關(Benedict,CA,J Immunol Methods.1997,201(2):223-31;Geuijen,CA,et al.J Immunol Methods.2005,302(1-2):68-77)。
因此,本發明之抗體或抗原結合蛋白可與預定抗原或細胞表面分子(受體例如CD3)結合,其係具有相當於至少低於其與非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)結合親和力的10倍之KD值。根據本發明,若對應於KD值之抗體親和力係等於或低於非特異性抗原10倍,則可視為未檢出的結
合,然而,就產生本發明之雙特異性抗體,此一抗體可能與第二抗原結合臂配對。
術語「KD」(M)係指特定的抗體-抗原相互作用之解離平衡常數,或抗體或抗體結合片段與抗原結合之解離平衡常數。KD和結合親和力之間具有逆相關性,因此較小的KD值,親和力越高,亦即越強。因此,術語「較高的親和力」或「較強的親和力」係關於形成相互作用的能力較高且因此KD值較小,而反之,術語「較低的親和力」或「較弱的親和力」係關於形成相互作用的能力較低且因此KD值較大。在某些情況下,特定分子(例如抗體)與其相互作用的夥伴分子(例如受體X)之較高的結合親和力(或KD),相較於此分子(例如抗體)與另外的夥伴分子(例如受體Y)之結合親和力,可用較大KD值(較低或較弱親和力)除以較小KD(較高或較強親和力)所測定的結合比率來表示,或例如以大於5-倍或10-倍的結合親和力來表示,視情況而定。例如,「較低的親和力」係指較不強的結合交互作用。在某些實施例中,較低的親和力係相當大於約1nM KD,大於約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35,或大於約40nM KD,其中此KD結合親和力值係以活體外表面電漿子共振結合分析或等同的生物分子交互作用感知分析所測定。在某些實施例中,此低的結合親和力係相當大於約10nM EC50,大於約15nM EC50,20nM EC50,大於約25nM EC50,30nM EC50,大於約35nM EC50,或大於約40nM EC50,其中此EC50結合親和力值係以活體外FACS結合分析,或等同的細胞基礎結合分析所測量。「弱親和力」係指弱的結合交互作用。在某些實施例中,弱親和力係相當大於約100nM KD或EC50,大於約200、300,或大於約500nM KD或EC50,其中此KD結合親和力值係以活體外表面電漿子共振結合分析或等同的生物分子交互作用感知分析所測定,而此EC50結合親和力值係以活體外FACS結合分析所測,或等同的細胞基礎交互作用偵測分析
來真測單價結合。未檢出的結合係指二種生物分子之間,特別是單價抗體結合臂及其目標抗原之間的親和力,係在所用的分析之偵測極限以外。
術語「Kd」(sec -1或1/s),如文中所用,係指特定的抗體-抗原交互作用之解離速率常數,或抗體或抗體結合片段之解離速率常數。該值亦稱為koff值。
術語「Ka」(M-1 x sec -1或1/M),係指特定的抗體-抗原交互作用之結合速率常數,或抗體或抗體結合片段之結合速率常數。
術語「KA」(M-1或1/M),如文中所用,係指特定的抗體-抗原交互作用之結合平衡常數,或抗體或抗體結合片段之結合平衡常數。此結合平衡常數係由ka除以kd所得來。
術語「EC50」或「EC50」,係指半數最大有效濃度,其包括引發基線至一特定暴露時間後最大量間之半數反應的抗體濃度。EC50基本上係代表其中觀察到50%之其最大效用的抗體濃度。在特定的實施例中,此EC50值係等於,如,例如FACS結合分析所測,得到表現CD3的細胞或腫瘤相關抗原之半數最大結合的本發明抗體濃度。因此,隨著增加的EC50值,或半數最大有效濃度值,觀察到降低或較弱的結合使得500nM EC50係表示比50nM EC50更弱的結合親和力。
在一實施例中,降低的結合可定義為:能與半數最大量之目標細胞結合的EC50抗體濃度增加。
在其他的實驗測量中,此EC50值係代表,因T細胞細胞毒性活性引起半數最大目標細胞耗損之本發明抗體濃度。因此,隨著降低的EC50值,或半數最大有效濃度值,觀察到增加的細胞毒性活性(例如T細胞媒介的腫瘤毒殺)。
雙特異性抗原結合分子
本發明之抗體可為雙特異性或多特異性。多特異性抗體可對
一個效應分子,例如CD3,以及一目標多肽之不同的表位具特異性,或可含有對一個以上的目標多肽具特異性之抗原結合區。參見,例如Tutt et al.,1991,J.Immunol.147:60-69;Kufer et al.,2004,Trends Biotechnol.22:238-244。本發明之抗-CD3抗體可與另外的功能分子,例如另外的胜肽或蛋白相連結或共表現。例如,抗體或其片段可與一或多個其他的分子實體,例如另外的抗體或抗體片段功能性連接(例如以化學偶合、基因融合、非共價連結或其他),產生帶有第二結合特異性之雙特異性或多特異性抗體。
文中所使用的詞語「抗-CD3抗體」希望係包括單特異性抗-CD3抗體以及包含一CD3-結合臂和與目標抗原結合之第二結合臂的雙特異性抗體。因此,本發明係包括雙特異性抗體,其中免疫球蛋白之一臂係與人類CD3結合,而免疫球蛋白之另一臂係對一目標抗原具特異性。與CD3雙特異性抗體之另一臂結合的目標抗原可為表現在細胞、組織、器官、微生物或病毒上或其中,而對抗此抗原的標靶免疫反應為所欲的之任何抗原。CD3-結合臂可包括如文中表2所列之任何HCVR或CDR胺基酸序列。在特定的實施例中,此CD3-結合臂係微弱地與人類CD3結合並引發人類T細胞活化。在其他的實施例中,在雙特異性或多特異性抗體的情況下,此CD3-結合臂係微弱地與人類CD3結合並引發腫瘤有關的抗原表現細胞毒殺在其他的實施例中,此CD3-結合臂係微弱地與人類和獼猴(猴子)CD3結合或連結,而此結合交互作用以本項技術中已知的活體外分析並未檢出。在本發明的某些實施例中,此CD3-結合臂不會與人類和獼猴(猴子)CD3結合或連結,而此雙特異性分子仍引起腫瘤有關的細胞毒殺。
在其中抗體的一臂係與CD3結合而另一臂係與目標抗原結合之本發明雙特異性抗體的情況下,此目標抗原可為一腫瘤相關的抗原(TAA)。特異性腫瘤-相關抗原之非限定實例包括,例如AFP、ALK、BAGEproteins、BIRC5(survivin)、BIRC7、β-連環蛋白(β-catenin)、brc-abl、BRCA1、
BORIS、CA9、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8(caspasc-8)、CALR、CCR5、CD19、CD20(MS4A1)、CD22、CD30、CD40、CDK4、CEA、CTLA4、cyclin-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白(例如GAGE-1、-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3)、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、LMP2、MAGE蛋白(例如MAGE-1、-2、-3、-4、-6和-12)、MART-1、間皮素(mesothelin)、ML-IAP、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Thompson-nouvelle抗原(Tn)、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶及uroplakin-3。
發明者們預想,本發明係包括許多具有依照本發明所製造之微弱抗-CD3結合臂的雙特異性抗體之實例。
根據特定的示例實施例,本發明係包括與CD3和PSMA特異性結合之雙特異性抗原結合分子。此等分子在文中可稱為,例如「抗-CD3/抗-PSMA」,或「抗-CD3xPSMA」或「CD3xPSMA」雙特異性分子等。除非有指出係來自非人類物種(例如「小鼠PSMA」、「猴子PSMA」等),否則術語「PSMA」如文中所用係指人類PSMA蛋白。
術語「PSMA」係指前列腺特異性膜抗原,亦稱為葉酸水解酶1(FOLH1)(UniProtKB/Swiss-Prot.No.Q04609;SEQ ID NO:171)。PSMA為一種完整、無脫落的膜糖蛋白,其係高度表現在前列腺上皮細胞且為一種前列腺癌之細胞表面標記。
根據其他示例性實施例,本發明係包括與CD3和FGFRvIII
特異性結合之雙特異性抗原結合分子。此等分子在文中可稱為,例如「抗-CD3/抗-EGFRvIII」或「抗-CD3x EGFRvIII」或「CD3x EGFRvIII」雙特異性分子等。除非有指出係來自非人類物種(例如「小鼠EGFRvIII」、「猴子EGFRvIII」等),否則術語「EGFRvIII」係指人類EGFRvIII蛋白。
術語「EGFRvIII」係指表皮生長因子受體第III類變體(EGFRvIII;SEQ ID NO:172),其為膠質母細胞瘤中所常發現的EGFR變體(Bigner et al.,1990,Cancer Res 50:8017-8022;Humphrey et al.,1990,Proc Natl Acad Sci USA 87:4207-4211;Yamazaki et al.,1990,Jap J Cancer Res 81:773-779;Ekstrand et al.,1992,Proc Natl Acad Sci USA 89:4309-4313;Wikstrand et al.,1995,Cancer Res 55:3140-3148;及Frederick et al.,2000,Cancer Res 60:1383-1387)。EGFRvIII其特徵為EGFR基因的外顯子2-7刪除,產生一編碼區之801鹼基對的框內刪除,亦即刪除6-273胺基酸殘基(以成熟的EGFR之殘基編號為基準;參見UniProtKB/Swiss-Prot.No.P00533),以及在融合連接處產生一新的甘胺酸(Humphrey et al.,1988,Cancer Res 48:2231-2238;Yamazaki et al.,1990,supra)。EGFRvIII已顯示具有配體-依賴、微弱但組成性活化的激酶活性,以及增強的致腫瘤性(Nishikawa et al.,1994,Proc Natl Acad Sci USA 91:7727-7731;及Batra et al.,1995,Cell Growth and Differentiation 6:1251-1259)。除了膠質細胞瘤,已在乳管和乳管內乳癌(Wikstrand et al.,1995,Cancer Res 55:3140-3148)、非小細胞肺癌(Garcia de Palazzo et al.,1993,Cancer Res 53:3217-3220)、卵巢癌(Moscatello et al.,1995,Cancer Res 55:5536-5539)、前列腺癌(Olapade-Olaopa et al.,2000,British J Cancer 82:186-194)以及頭頸之鱗狀細胞癌(Tinhofer et al.,2011,Clin Cancer Res 17(15):5197-5204)中偵測到EGFRvIII。
又在其他的示例性實施例中,本發明係包括與CD3和MUC16特異性結合之雙特異性抗原結合分子。此等分子在文中可稱為,例
如「抗-CD3/抗-MUC16」或「抗-CD3x MUC16」或「CD3xMUC16」雙特異性分子等。除非有指出係來自非人類物種(例如「小鼠MUC16」、「猴子MUC16」等),否則術語「MUC16」係指人類MUC16蛋白。
Mucin 16(MUC16;NCBI參照序列:NP_078966.2,SEQ ID NO:173),另外亦稱為癌抗原125(CA-125),在人類中為一種由MUC16基因所編碼的黏蛋白。黏蛋白家族已知係藉由病原體與寡糖在胞外區結合來保護身體免於感染,防止病原體到達細胞表面。許多年來,MUC16/CA125之過度表現已用作為卵巢癌之預測和診斷標記(Yin and Lloyd,2001,J.Biol.Chem.276(29),27371-27375;O’Brien,TJ,et al,2001,Tumour Biol.22(6),348-366;Leggieri,C.et al.,2014,Eur.J.Gynaecol.Oncol.35(4),438-441)。MUC16已顯示,以其可與galectin-1(一種免疫抑制蛋白)結合之重度糖基化綜排重複區,保護腫瘤細胞避開免疫系統(Seelenmeyer,C.,et al.,2003,J.Cell.Sci.116(Pt 7):1305-18;O’Brien,TJ,et al.,2002,Tumour Biol.23(3),154-169)。天然的殺手細胞和單核細胞無法攻擊表現高量MUC16之腫瘤細胞。在其在正常的生理學角色中,MUC16-galactin交互作用作為細菌和病毒感染之屏障,然而,在腫瘤細胞的情況下,MUC16咸信為免疫保護性,因而防止癌細胞之細胞溶解(Felder,M.et al.,2014,Molecular Cancer,13:129)。MUC16因此為所投予之藉由活化免疫系統治療卵巢癌的免疫治療雙特異性抗體分子之所欲目標。
又在其他的示例性實施例中,本發明係包括與CD3和STEAP2特異性結合之雙特異性抗原結合分子。此等分子在文中可稱為,例如「抗-CD3/抗-STEAP2」或「抗-CD3xSTEAP2」或「CD3xSTEAP2」雙特異性分子等。除非有指出係來自非人類物種(例如「小鼠STEAP2」、「猴子STEAP2」等),否則術語「STEAP2」如文中所用係指人類STEAP2蛋白。前列腺2之六跨膜上皮抗原(STEAP2;UniProtKB/Swiss-Prot:Q8NFT2.3)為
一種490個胺基酸之蛋白,其係由位於人類7q21染色體區的STEAP2基因所編碼。
與腫瘤相關抗原特異性結合的前述雙特異性抗原結合分子,如活體外親和結合分析所測,係包括以微弱或未檢出的結合力,例如具有大於約100nM,300nM或500nM之KD與CD3結合的抗-CD3抗原結合分子。
如文中所用,「抗原結合分子」一詞係指與特定抗原特異性結合之包括或由至少一個互補決定區(CDR)單獨或與一或多個另外的CDR及/或框架區(FR)組合所組成之蛋白、多肽或分子複合物。在特定的實施例中,抗原結合分子為一抗體或抗體之片段,而該等術語係定義於文中他處。
如文中所用,「雙特異性抗原結合分子」一詞係指包括至少一第一抗原結合區和一第二抗原結合區之蛋白、多肽或分子複合物。與特定抗原特異性結合之雙特異性抗原結合分子內的各抗原結合區係包括至少單獨一個CDR或與一或多個另外的CDR及/或FR組合。在本發明內文中,第一抗原結合區係與第一抗原(例如CD3)特異性結合,而第二抗原結合區係與第二,不同的抗原(例如PSMA、MUC16、EGFRvIII或STEAP2)特異性結合。
在本發明特定的示例性實施例中,此雙特異性抗原結合分子為雙特異性抗體。雙特異性抗體之各抗原結合區係包括一重鏈可變區(HCVR)和一輕鏈可變區(LCVR)。就包括第一和第二抗原結合區之雙特異性抗原結合分子(例如雙特異性抗體)之情況,第一抗原結合區的CDR可以字首「A1」來定名,而第二抗原結合區之CDR可以字首「A2」來定名。因此,第一抗原結合區之CDR在文中可稱為A1-HCDR1、A1-HCDR2及A1-HCDR3;而第二抗原結合區之CDR在文中可稱為A2-HCDR1、A2-HCDR2及A2-HCDR3。
第一抗原結合區和第二抗原結合區可直接或間接彼此相連形成本發明之雙特異性抗原結合分子。另一種選擇,第一抗原結合區和第二抗原結合區可各自與個別的多聚化區連接。一多聚化區與另一個多聚化區連結係幫助二個抗原結合區之間的連結,藉此形成雙特異性抗原結合分子。如文中所用,「多聚化區」為具有與相同或類似結構或組成之第二多聚化區結合之能力的任何大分子、蛋白、多肽、胜肽或胺基酸。例如,多聚化區可為包括一免疫球蛋白CH3區之多肽。多聚化組份之非限定實例為免疫球蛋白(包括一CH2-CH3區)之Fc部份,例如選自同型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4,以及各同型群族中的任何異型之IgG的Fc區。
本發明之雙特異性抗原結合分子典型地係包括二個多聚化區,例如二個為個別抗體重鏈之各個別部份的Fc區。第一和第二多聚化區可為相同的IgG同型,例如IgG1/IgG1、IgG2/IgG2、IgG4/IgG4。另一種選擇,第一和第二多聚化區可為不同的IgG同型,例如IgG1/IgG2、IgG1/IgG4、IgG2/IgG4等。
在特定的實施例中,多聚化區為含有至少一個半胱胺酸殘基之長度1至約200個胺基酸的Fc片段或胺基酸序列。在其他的實施例中,此多聚化區為一半胱胺酸殘基或含有半胱胺酸的短胜肽。其他的多聚化區係包括含有或由白胺酸拉鏈、螺旋-環模組或纏繞線圈模組所組成的胜肽或多肽。
任何雙特異性抗體模式或技術可用來製造本發明之雙特異性抗原結合分子。例如具有第一抗原結合特異性之抗體或其片段可與一或多個其他的分子實體,例如具有第二抗原結合特異性之另外的抗體或抗體片段功能性連接(例如以化學偶合、基因融合、非共價連結或其他),產生一特異性抗原結合分子。可用於本發明內文中之特定示例性雙特異性模式包括(不限於),例如scFv-為基礎或雙抗體雙特異性模式、IgG-scFv融合物、
雙可變區(DVD)-Ig、四源雜交瘤(Quadroma)、knobs-into-holes、共同輕鏈(例如帶有knobs-into-holes之共同輕鏈等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、白胺酸拉鏈、Duobody、IgG1/IgG2、雙作用Fab(DAF)-IgG和Mab2雙特異性模式(參見,例如Klein et al.2012,mAbs 4:6,1-11及文中所引述的參考文獻,作為前述模式之審視)。
相較於野生型,天然生成版本的Fc區,在本發明之雙特異性抗原結合分子內容中,多聚化區,例如Fc區可包括一或多個胺基酸變化(例如插入、刪除或取代)。例如,本發明係包括在Fc區中包含一或多個修飾,其造成經修飾的Fc區在Fc和FcRn之間具有修飾的結合交互作用(例如增強或減少)之雙特異性抗原結合分子。在一實施例中,此雙特異性抗原結合分子係包括CH2或CH3區中之修飾,其中該修飾增加了酸性環境中Fc區對FcRn之親和力(例如在其中pH範圍從約5.5至約6.0的核內體中)。此等Fc修飾之非限定實例包括,例如位置250(例如E或Q);250和428(例如L或F);252(例如L/Y/F/W或T),254(例如S或T),和256(例如S/R/Q/E/D或T)之修飾;或位置428及/或433(例如L/R/S/P/Q或K)及/或434(例如H/F或Y)之修飾;或位置250及/或428之修飾;或位置307或308(例如308F,V308F)和434之修飾。在一實施例中,此修飾係包括一428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修飾;428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修飾;一433K(例如H433K)和a 434(例如434Y)修飾;一252、254和256(例如252Y、254T和256E)修飾;一250Q和428L修飾(例如T250Q和M428L);及一307及/或308修飾(例如308F或308P)。
本發明亦包括包含第一CH3區及第二Ig CH3區之雙特異性抗原結合分子,其中該第一和第二Ig CH3區至少有一胺基酸互不相同,且相較於無此胺基差異之雙特異性抗體,其中至少一胺基酸之差異降低了雙特異性抗體與蛋白A之結合。在一實施例中,第一Ig CH3區係與蛋白A結
合而第二Ig CH3區係含有降低或消除蛋白A結合之突變,例如H95R修飾(IMGT外顯子編號;EU編號為H435R)。第二CH3可進一步包括Y96F修飾(IMGT編號;EU為Y436F)。在第二CH3中可發現的另外修飾作用,就IgG1抗體之情況而言係包括:D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(IMGT編號;EU編號為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I);及就IgG2抗體之情況為N44S、K52N和V82I(IMGT編號;EU編號為N384S、K392N和V422I);及就IgG4抗體之情況為Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT編號;EU編號為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在特定的實施例中,此Fc區可為衍生自一或多個免疫球蛋白同型之嵌合的組合Fc序列。例如,嵌合的Fc區可包括衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4 CH2區之部份或全部的CH2序列,或衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4之部份或全部的CH3序列。嵌合的Fc區亦可含有一嵌合的絞鏈區。例如,一嵌合的絞鏈可包括一衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4絞鏈區的「上絞鏈」序列,與一衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4絞鏈區的「下絞鏈」序列組合。可包括在文中所述的任何抗原結合分子中的嵌合Fc區之特定實例,從N-端至C-端係包括:[IgG4 CH1]-[IgG4上絞鏈]-[IgG2下絞鏈]-[IgG4 CH2]-[IgG4 CH3]。可包括在文中所述的任何抗原結合分子中的嵌合Fc區之另外的實例,從N-端至C-端係包括:[IgG1 CH1]-[IgG1上絞鏈]-[IgG2下絞鏈]-[IgG4 CH2]-[IgG1 CH3]。這些和其他可包括在本發明之任何抗原結合分子中的嵌合Fc區之實例,係描述於2014年8月7日公開的PCT國際公開案第WO2014/121087 A1號中,其係以全文引用的方式併入本文中。具有這些通用結構排列的嵌合Fc區及其變體,可能具有改變的Fc受體結合,其轉而影響Fc效應子功能。
在特定的實施例中,本發明係提供一抗體重鏈,其中該重鏈
恆定(CH)區係包括與任一SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:190或SEQ ID NO:191至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,此重鏈恆定(CH)區係包括由下列組成之群中選出的胺基酸序列:SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:191。
在其他的實施例中,本發明係係提供一抗體重鏈,其中該Fc區係包括與任一SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:200或SEQ ID NO:201至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,此Fc區係包括由下列組成之群中選出的胺基酸序列:SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:200和SEQ ID NO:201。
其他Fc變體
根據本發明特定的實施例,係提供包括一Fc區之抗-CD3抗體及抗-CD3/抗-TAA雙特異性抗原結合分子,其中該Fc區係包括一或多個相較於中性pH,例如在酸性pH時,強化或減少抗體與FcRn受體結合之突變。例如,本發明係包括在Fc區域之CH2或a CH3區中包含一突變之抗體,其中該突變係增加Fc區與FcRn在酸性環境之親和力(例如在pH範圍從約5.5至約6.0之核內體中)。當投予動物時,此等突變可使抗體的血清半衰期增加。此等Fc修飾之非限定實例包括,例如位置250(例如E或Q);
250和428(例如L或F);252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)之修飾;或位置428及/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)及/或434(例如H/F或Y)之修飾;或位置250及/或428之修飾;或位置307或308(例如308F、V308F)和434之修飾。在一實施例中,此修飾係包括一428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修飾;一428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修飾;一433K(例如H433K)和一434(例如434Y)修飾;一252、254和256(例如252Y、254T和256E)修飾;一250Q和428L修飾(例如T250Q和M428L);以及一307及/或308修飾(例如308F或308P)。
例如,本發明係包括包含一Fc區之抗-CD3抗體及抗-CD3/抗-TAA雙特異性抗原結合分子,而該Fc區係包括一或多對或一或多組由下列組成之群中選出的突變:250Q和248L(例如T250Q和M248L);252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E);428L和434S(例如M428L和N434S);以及433K和434F(例如H433K和N434F)。文中所揭示的抗體可變區內所有可能的前述Fc區突變之組合,和其他突變係涵蓋在本發明的範圍內。
抗體及雙特異性抗原結合分子之生物特性
本發明係包括能同時與人類CD3和人類TAA結合之雙特異性抗原結合分子(例如雙特異性抗體)。根據特定的實施例,本發明之雙特異性抗原結合分子係與表現CD3及/或TAA,例如PSMA、EGFRvIII或MUC16之細胞特異性交互作用。與表現CD3之細胞交互作用的結合臂,如以適合的活體外結合分所測量,可能具有微弱至未檢出的結合。雙特異性抗原結合分子與表現CD3及/或TAA之細胞結合的程度可藉由如文中實例4中所說明的螢光活化細胞分類(FACS)來評估。
例如,本發明係包括與表現CD3但不會表現TAA(例如Jurkat)之人類T-細胞株、靈長類T-細胞(例如獼猴周邊血液單核細胞[PBMC])
及/或TAA-表現細胞特異性結合之抗體、抗原結合片段及其雙特異性抗體。本發明係包括,如使用實例4中所述的FACS結合分析或實質上類似的分析所測,以約1.8x10-8(18nM)至約2.1x10-7(210nM)或更高(亦即較弱的親和力)之EC50值與前述T細胞及T細胞株結合的雙特異性抗原結合分子,以及包括無法偵測到EC50之雙特異性抗體。在特定的實施例中,本發明之抗體、抗原結合片段及雙特異性抗體,如藉由FACS結合,例如使用文中實例4中所定義的分析模式或實質上類似的分析所測,係以大於約30nM,大於約40nM,大於約45nM,大於約50nM,大於約55nM,大於約60nM,大於約65nM,大於約70nM,大於約75nM,至少80nM,大於約90nM,大於約100nM,大於約110nM,至少120nM,大於約130nM,大於約140nM,大於約150nM,至少160nM,大於約170nM,大於約180nM,大於約190nM,大於約200nM,大於約250nM,大於約300nM,大於約500nM,大於約1μM,大於約2μM,或大於約3μM之EC50或未檢出的結合親和力與CD3結合。
本發明亦包括,如使用實例4中所述的FACS結合分析或實質上類似的細胞分析所測,以低於約100nM之EC50值或甚至低於結合所需濃度(亦即較強的親和力),例如低於5.6nM(5.6x10-9)與TAA-表現細胞和細胞株,例如PSMA-、EGFRvIII-、STEAP2-和MUC16-表現細胞株結合之抗體、抗原結合片段及其雙特異性抗體。本發明係包括,例如使用前述分析,以低於約50nM,低於約45nM,低於約40nM,低於約35nM,低於約30nM,低於約25nM,低於約20nM,低於約15nM,低於約10nM,低於約6nM,低於約5nM,或低於約1nM之EC50值與前述腫瘤細胞株結合的雙特異性抗原結合分子。
本發明係包括以低、微弱或甚至未檢出的親和力與人類CD3結合之抗體、抗原結合片段及其雙特異性抗體。根據特定的實施例,如以
表面電漿子共振,例如使用文中實例5中所定義的分析模式所測,本發明係包括以大於約11nM之KD與人類CD3(例如於37℃)結合之抗體及抗體的抗原結合片段,包括以大於約100nM或500nM之KD與CD3結合的抗體,以及包括不具有可偵測親和力之抗體。在特定的實施例中,如藉由表面電漿子共振,例如使用文中實例5中所定義的分析模式(例如mAb-捕捉或抗原-捕捉模式)或實質上類似的分析所測,本發明之抗體或抗原結合片段係以大於約15nM,大於約20nM,大於約25nM,大於約30nM,大於約35nM,大於約40nM,大於約45nM,大於約50nM,大於約55nM,大於約60nM,大於約65nM,大於約70nM,大於約75nM,至少80nM,大於約90nM,大於約100nM,大於約110nM,至少120nM,大於約130nM,大於約140nM,大於約150nM,至少160nM,大於約170nM,大於約180nM,大於約190nM,大於約200nM,大於約250nM,大於約300nM,大於約1μM,大於約2μM,或大於約3μM之KD或未檢出的親和力與CD3結合。
本發明係包括以低、微弱或甚至未檢出的親和力與猴子(亦即獼猴)CD3結合之抗體、抗原結合片段及其雙特異性抗體。根據特定的實施例,如以表面電漿子共振,例如使用文中實例5中所定義的分析模式所測,本發明係包括以大於約10nM之KD與人類CD3(例如於37℃)結合之抗體、抗原結合片段及其雙特異性抗體,包括以大於約100nM或500nM之KD與CD3結合的抗體,以及包括不具有可偵測親和力之抗體。在特定的實施例中,如藉由表面電漿子共振,例如使用文中實例5中所定義的分析模式(例如mAb-捕捉或抗原-捕捉模式)或實質上類似的分析所測,本發明之抗體或抗原結合片段係以大於約15nM,大於約20nM,大於約25nM,大於約30nM,大於約35nM,大於約40nM,大於約45nM,大於約50nM,大於約55nM,大於約60nM,大於約65nM,大於約70nM,大於約75nM,至少80nM,大於約90nM,大於約100nM,大於約110nM,至少120nM,
大於約130nM,大於約140nM,大於約150nM,至少160nM,大於約170nM,大於約180nM,大於約190nM,大於約200nM,大於約250nM,大於約300nM,大於約1μM,大於約2μM,或大於約3μM之KD或未檢出的親和力與CD3結合。
本發明係包括與人類CD3結合並引發T細胞活化之抗體、抗原結合片段及其雙特異性抗體。例如,如藉由活體外T細胞活化分析,例如使用文中實例6中所定義的分析模式[例如在抗-CD3抗體的存在下評估總T細胞(CD2+)中活化的(CD69+)細胞之百分比]或評估處於活化狀態之T細胞的實質上類似分析所測,本發明係包括以低於約113pM之EC50值引發人類T細胞活化的抗-CD3抗體。在特定的實施例中,本發明之抗體或抗原結合片段,如藉由活體外T細胞活化分析,例如使用文中實例6中所定義的分析模式或實質上類似的分析所測,係以低於約100pM,低於約50pM,低於約20pM,低於約19pM,低於約18pM,低於約17pM,低於約16pM,低於約15pM,低於約14pM,低於約13pM,低於約12pM,低於約11pM,低於約10pM,低於約9pM,低於約8pM,低於約7pM,低於約6pM,低於約5pM,低於約4pM,低於約3pM,低於約2pM或低於約1pM之EC50值引發人類T細胞活化[例如活化的(CD69+)T細胞百分比]。如實例6中所示例,僅管對CD3具有微弱或未檢出的結合親和力,對CD3具有微弱或未檢出結合之抗-CD3抗體係以高效力(亦即pM範圍)引發T細胞活化。
本發明亦包括與人類CD3結合並引發T細胞-媒介的腫瘤抗原表現細胞毒殺之抗體、抗原結合片段及雙特異性抗體。例如,如以活體外T細胞-媒介的腫瘤細胞毒殺分析,例如使用文中實例6中所定義的分析模式[例如在抗-CD3抗體的存在下評估腫瘤抗原表現細胞,例如PSMA-表現、EGFRvIII-表現或MUC16-表現細胞被人類PBMC毒殺之程度]或實質上類似分析所測,本發明係包括以低於約1.3nM之EC50引發T細胞-媒介的
腫瘤細胞毒殺的抗-CD3抗體。在特定的實施例中,本發明之抗體或抗原結合片段,如以活體外T細胞-媒介的腫瘤細胞毒殺分析,例如使用文中實例6中所定義的分析模式或實質上類似分析所測,係以低於約1nM,低於約400pM,低於約250pM,低於約100pM,低於約50pM,低於約40pM,低於約30pM,低於約20pM,低於約10pM,低於約9pM,低於約8pM,低於約7pM,低於約6pM,低於約5pM,低於約4pM,低於約3pM,低於約2pM或低於約1pM之EC50值引發T細胞-媒介的腫瘤細胞毒殺(例如PBMC-媒介OVCAR3細胞毒殺)。
本發明亦包括,如於25℃或37℃藉由表面電漿子共振,例如使用文中實例5中所定義的分析模式或實質上類似的分析所測,以低於約10分鐘之解離半衰期(t½)與CD3結合之抗體、抗原結合片段及其雙特異性抗體。在特定的實施例中,如於25℃或37℃藉由表面電漿子共振,例如使用文中實例5中所定義的分析模式(例如mAb-捕捉或抗原-捕捉模式)或實質上類似的分析所測,係以低於約9分鐘,低於約8分鐘,低於約7分鐘,低於約6分鐘,低於約5分鐘,低於約4分鐘,低於約3分鐘,低於約2分鐘,低於約1.9分鐘或低於約1.8分鐘之t½或具有非常弱或未檢出結合與CD3結合。
本發明之抗-CD3/抗-TAA雙特異性抗原結合分子可另外具有一或多項由下列組成之群中選出的特性:(a)於活體外引發PBMC增生;(b)在人類全血中經由引發IFNγ釋放及CD25上調活化T-細胞;及(c)在抗-TAA-阻抗的細胞株上引發T-細胞媒介的細胞毒性。
本發明係包括能於患者中消除腫瘤抗原表現細胞之抗-CD3/抗-TAA雙特異性抗原結合分子(參見,例如實例7)。例如,根據特定的實施例,係提供抗-CD3/抗-PSMA、抗-CD3/抗-MUC16或抗-CD3/抗-STEAP2雙特異性抗原結合分子,其中單一投予患者1μg或10μg或100μg的雙特
異性抗原結合分子(例如以約0.1mg/kg,約0.08mg/kg,約0.06mg/kg,約0.04mg/kg,約0.04mg/kg,約0.02mg/kg,約0.01mg/kg或更低的劑量)造成該患者中腫瘤抗原表現細胞的數目下降(該患者中腫瘤生長受到壓抑或抑制)至可偵測量以下。在特定的實施例中,單一投予約0.4mg/kg劑量之抗-CD3/抗-PSMA雙特異性抗原結合分子,在投予該患者雙特異性抗原結合分子後約第7天,約第6天,約第5天,約第4天,約第天,約第3天,約第2天,約第1天,造成該患者中腫瘤生長下降至可偵測量以下。根據特定的實施例,單一投予約0.01mg/kg劑量之本發明抗-CD3/抗-PSMA雙特異性抗原結合分子,造成PSMA-表現的腫瘤細胞數目在給藥後直到至少約7天,約8天,約9天,約10天,約11天,約12天,約13天,約14天,約15天,約16天,約17天或更久,仍維持在可偵測量以下。如文中所用,「可偵測量以下」一詞係指在一患者中,使用標準的測徑器測量方法,例如文中實例7中所述,直接或間接皆無偵測到皮下生長的腫瘤細胞。在特定的實施例中,單一投予10μg劑量的抗-CD3/抗-MUC16雙特異性抗原結合分子在約第6天造成患者中腫瘤生長抑制,並維持腫瘤抑制直到投予該患者雙特異性抗原結合分子後的第26天。在腫瘤植人後約至少7天接受單一投予約10μg劑量的抗-CD3/抗-MUC16雙特異性抗原結合分子之患者中,在腫瘤植入患者後約第26天,此雙特異性抗原結合分子在患者中展現抑制建立的腫瘤免於進一步生長。根據特定的實施例,單一投予約0.1mg/kg劑量的本發明抗-CD3/抗-MUC16雙特異性抗原結合分子,在投予此雙特異性分子後,抑制MUC16-表現的腫瘤細胞生長達至少約7天,8天,9天,10天,11天,12天,13天,14天,15天,16天,17天,18天,19天,20天或更久。參見,例如實例8。
在特定的實施例中,單一投予約0.1mg/kg或0.01mg/kg劑量的抗-CD3/抗-STEAP2雙特異性抗原結合分子持續抑制腫瘤生長直到至
少投予該患者雙特異性抗原結合分子和腫瘤後的第46天。根據特定的實施例,單一投予至少約0.1mg/kg,約0.08mg/kg,約0.06mg/kg,約0.05mg/kg,約0.04mg/kg,約0.03mg/kg,約0.02mg/kg,約0.01mg/kg或更少劑量的本發明抗-CD3/抗-STEAP2雙特異性抗原結合分子,在投予雙特異性分子後,抑制STEAP2-表現的腫瘤細胞生長至少約20天,30天,35天,40天,45天或更久。參見,例如實例10。
在其他的實施例中,對效應細胞具有微弱結合親和力之CD3靶向結合臂的抗-CD3/抗-TAA雙特異性抗原結合分子,在一活體外藥物動力學研究中相較於相同抗-TAA結合臂和強CD3結合臂,係展現降低的藥物排除率。此等結果顯示,包括較弱結合力的CD3靶向臂之雙特異性分子可能具有有利的藥物暴露量(AUClast)及藥物排除樣貌(抗體清除)。參見,例如實例9。
本發明係提供抗-CD3/抗-PSMA、抗-CD3/抗-MUC16和抗-CD3/抗-STEAP2雙特異性抗原結合分子(亦即抗-CD3/抗-TAA雙特異性抗原結合分子),其具有一或多項由下列組成之群中選出的特性:(a)在帶有人類前列腺癌異種移植物之免疫妥協小鼠中抑制腫瘤生長;(b)在帶有人類前列腺癌異種移植物之免疫活性小鼠中抑制腫瘤生長;(c)在帶有人類前列腺癌異種移植物之免疫妥協小鼠中抑制已建立之腫瘤的腫瘤生長;及(d)在帶有人類前列腺癌異種移植物之免疫活性小鼠中降低已建立之腫瘤的腫瘤生長(參見,例如實例7、8和10)。本發明亦提供包括導向效應T細胞(亦即CD3)之第一重鏈以及導向目標腫瘤細胞之第二重鏈的抗-CD3/抗-PSMA、抗-CD3/抗-MUC16和抗-CD3/抗-STEAP2雙特異性抗體(亦即抗-CD3/抗-TAA雙特異性抗體),其中該雙特異性抗體對效應細胞具有微弱結合或未檢出的結合,且相較於對效應細胞具有強結合之雙特異性抗體,係具有腫瘤生長抑制和降低身體的抗體清除(亦即排除)。
表位定位及相關技術
與本發明抗原結合分子結合之CD3上的表位可由3或多個(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個)CD3蛋白之胺基酸的單一連續序列所組成。另一種選擇,表位可由多數個CD3之非連續胺基酸(或胺基酸序列)所組成。本發明之抗體可與包含在單一CD3鏈(例如CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ)內的胺基酸相互作用,或可與二或多條不同CD3鏈上的胺基酸相互作用。術語「表位」,如文中所用,係指與抗體分子可變區中稱為補位(paratope)的特定抗原結合位置相互作用之抗原決定位。單一抗原可具有一個以上的表位。因此,不同的抗體可與抗原的不同區域結合並可能具有不同的生物效應。表位可為構型或線性。構型表位係由直鏈多肽鏈不同線段之空間上並列的胺基酸所產生。線性表位係由多肽鏈相鄰的胺基酸殘基所產生。在特定的情況下,表位可在抗原上包括醣類基團、磷醯基基團或磺醯基基團。
本項技術之一般技術者已知的各種技術皆可用於測定抗體之抗原結合區是否與多肽或蛋白內的「一或多個胺基酸交互作用」。示例的技術包括,例如習用的交叉阻斷分析,例如描述於Antibodies,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中,丙胺酸掃描突變分析、胜肽墨點分析(Reineke,2004,Methods Mol Biol 248:443-463)及胜肽裂解分析。此外,可使用例如表位切除、表位萃取及抗原之化學修飾等方法(Tomer,2000,Protein Science 9:487-496)。可用於鑑定多肽內與抗體之抗原結合區相互作用之胺基酸的另外方法係以質譜偵測氫/氘交換。一般而言,氫/氘交換方法係包括以氘標定感興趣蛋白,接著讓抗體與氘標定的蛋白結合。接著,將蛋白/抗體複合物轉置於水中,讓除了受抗體保護的殘基(其仍為氘標定)以外的所有殘基發生氫-氘交換。解離抗體後,將目標蛋白以蛋白酶裂解並以質譜分析,藉此找出氘標定殘基,其係相當於與抗體交互作用
之特定胺基酸。參見,例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259;Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。抗原/抗體複合物之X-光晶體學亦可用於表位定位之目的。
本發明進一步係包括與任何文中所述之特定示例性抗體相同之表位結合的抗-PSMA抗體(例如,包括如文中表6所述之任何胺基序的抗體)。同樣的,本發明亦包括與任何文中所述之特定示例性抗體(例如,包括如文中表6所述之任何胺基序的抗體)競爭和PSMA結合之抗-PSMA抗體。揭示於美國申請案第15/223,434號之抗-PSMA係以引用的方式併入本申請案中。
本發明亦包括雙特異性抗原結合分子,其係包括與人類CD3及/或獼猴CD3以低或可偵測結合親和力特異性結合之第一抗原結合區,以及與人類腫瘤相關抗原(TAA)特異性結合之第二抗原結合區,其中該第一抗原結合區係與任何文中所述之特定示例性CD3-抗原結合區相同的CD3表位結合。
同樣地,本發明亦包括雙特異性抗原結合分子,其係包括與人類CD3及/或獼猴CD3以低或可偵測結合親和力特異性結合之第一抗原結合區,以及與人類腫瘤相關抗原(TAA)特異性結合之第二抗原結合區,其中該第一抗原結合區係與任何文中所述之特定示例性CD3-抗原結合區競爭和CD3結合。
藉由使用本項技術中已知的習用方法,可容易地測定特定的抗原結合分子(例如抗體)或其抗原結合區是否與本發明之參照抗原結合分子相同的表位結合或是與其競爭結合。例如,測定試驗抗體是否與如同本發明參照的雙特異性抗原結合分子之CD3(或TAA)上的相同表位結合,首先係讓參照的雙特異性分子與CD3蛋白(或TAA蛋白)結合。接著,評估試驗抗體與CD3分子結合之能力。若試驗抗體在與參照的雙特異性抗原結合
分子飽和結合後,能與CD3(或TAA)結合,則其可結論出,該試驗抗體係與不同於參照的雙特異性抗原結合分子的CD3(或TAA)表位結合。另一方面,若試驗抗體在與參照的雙特異性抗原結合分子飽和結合後,不能與CD3(或TAA)分子結合,則試驗抗體可能與和本發明之參照的雙特異性抗原結合分子結合的表位相同之CD3(或TAA)表位結合。然後可進行另外例行的實驗(例如胜肽突變及結合分析),以確定所觀察到無試驗抗體結合事實上是否係由於與和參照的雙特異性抗原結合分子相同的表位結合所致,或是否係因立體阻斷(或另外的現象)造成無觀察到結合。若此參照抗體係如文中所示例不具有可測量的結合,則此參照抗體可突變回生殖系序列,以便就比較表位相互作用,或與如文中所述之試驗抗體比較其結合性質之目的,測定與CD3的結合。此類實驗可使用ELISA、RIA、Biacore、流式細胞儀或本項技術中可取得的任何其他量性或質性抗體-結合分析來進行。依照本發明特定的實施例,如競爭性結合分析中所測,若例如一1-、5-、10-、20-或100-倍過量的抗原結合蛋白抑制另一抗體之結合至少50%,但較佳地75%、90%或甚至99%,則二種抗原結合蛋白係與相同(或重疊)的表位結合(參見,例如Junghans et al.,Cancer Res.1990:50:1495-1502)。另一種選擇,若基本上降低或消除一抗原結合蛋白之結合的抗原中所有的胺基酸突變,係降低或消除另一種抗原結合蛋白之結合,則二種抗原結合蛋白被認為係與相同的表位結合。若僅一亞群的胺基酸突變降低或消除一抗原結合蛋白之結合或消除另一種抗原結合蛋白之結合,則二種抗原結合蛋白被認為具有「重疊的表位」。
為了測定一抗體或其抗原結合區是否與參照的抗原結合分子競爭結合,係以二個方向進行上述結合方法:第一個方向:讓參照的抗原結合分子在飽和的條件下與CD3蛋白(或TAA蛋白)結合,接著評估試驗抗體與CD3(或TAA)分子之結合。第二個方向:讓試驗抗體在飽和的條件
下與CD3(或TAA)分子結合,接著評估參照的抗原結合分子與CD3(或TAA)分子之結合。若在二個方向中,僅有第一(飽和)抗原結合分子能與CD3(或TAA)分子結合,則結論出試驗抗體和參照的抗原結合分子係競爭與CD3(或TAA)結合。本項技術之一般技術者應了解,與參照的抗原結合分子競爭結合之抗體可能不一定係與參照抗體相同之表位結合,但可能藉由與重疊或相鄰的表位結合,在立體上阻斷參照抗體之結合。若此參照抗體係如文中所示例不具有可測量的結合,則此參照抗體可突變回生殖系序列,以便就比較表位相互作用,或與如文中所述之試驗抗體比較其結合性質或阻斷交互作用之目的,測定與CD3的結合。
製備抗原結合區及建構雙特異性分子
對特定抗原具特異性之抗原結合區可藉由任何本項技術中已知的抗體生產技術來製備。一旦獲得後,對二種不同抗原(例如CD3和TAA)具特異性之二種不同的抗原結合區可以相對彼此適合的排列使用習用方法,產生本發明之雙特異性抗原結合分子。(可用於建構本發明雙特異性抗原結合分子之示例的雙特異性抗體模式之論述係提供於文中他處)。在特定的實施例中,本發明之多特異性抗原結合分子的一或多個個別組份(例如重鏈和輕鏈)係衍生自嵌合、人源化或全人類抗體。製造此等抗體之方法已為本項技術所熟知。例如,可使用VELOCIMMUNETM技術製備一或多條本發明雙特異性抗原結合分子之重鏈及/或輕鏈。使用VELOCIMMUNETM技術(或任何其他人類抗體生產技術),起初先分離對特定抗原(例如CD3或TAA)具高親和力之具有人類可變區和小鼠恆定區的嵌合抗體。將抗體定性並就所欲的性質來選擇,包括親和力、選擇性、表位等。以所欲的人類恆定區置換小鼠恆定區產生可併入本發明雙特異性抗原結合分子中之全人類重鏈及/或輕鏈。
基因工程動物可用於製造人類雙特異性抗原結合分子。例如,
可使用不能重排和表現內生性小鼠免疫球蛋白輕鏈可變序列之基因改造小鼠,其中小鼠僅表現一或二個由人類免疫球蛋白序列操作上在內生性小鼠卡帕(κ)基因座連接小鼠卡帕(κ)輕鏈恆定基因所編碼的人類輕鏈可變區。此基因改造小鼠可用於製造包括連結相同輕鏈之二種不同重鏈的全人類雙特異性抗原結合分子,該輕鏈係包括衍生自二種不同人類輕鏈可變區基因片段其中一種之可變區。(就該工程化小鼠詳細論述及其於製造雙特異性抗原結合分子之用途,請參見,例如US 2011/0195454)。本發明之抗體可包括與一共同輕鏈結合的免疫球蛋白重鏈。此共同輕鏈可衍生自抗-TAA重鏈的同源輕鏈,或衍生自一已知或公共區輕鏈可變區,而該輕鏈可變區係衍生自一具有雜交或與各種非同源重鏈配對能力之輕鏈,亦即通用或共同輕鏈。本發明抗體可包括與單一重排輕鏈結合的免疫球蛋白重鏈。在某些實施例中,此輕鏈一可變區係衍生自人類Vκ1-39基因段或Vκ3-20基因段。在其他的實施例中,此輕鏈係包括一可變區,其係衍生自經人類Jκ5或人類Jκ1基因段重排之人類Vκ1-39基因段,或經人類Jκ1基因段重排的Vκ3-20基因段,或經人類Jκ1重排之Vκ1-39基因段。
生物等效性
本發明係涵蓋具有與文中所揭示的示例分子不同但保留與CD3及/或TAA結合能力之胺基酸序列的抗原結合分子。此等變體分子,當與親代序列相比較時,可包括一或多個胺基酸之添加、刪除或取代,但具有與所述的雙特異性抗原結合分子實質上相當之生物活性。
本發明係包括與文中所述的任何示例性抗原結合分子為生物等效之抗原結合分子。二種抗原結合蛋白或抗體,若例如其為醫藥同等物或醫藥替代品,當於類似的實驗條件下以單一劑量或多劑量之相同的莫耳劑量投予時,其吸收速率和程度並無顯示顯著的差異,則係視為生物等效的。某些抗原結合蛋白若其吸收程度相當但是吸收速率不同應可視為等
效物或醫藥替代品,且仍可視為生物等效,因為此等吸收速率上的差異為故意的並反映在標示上,對於達到例如長期使用之有效體藥濃度並非必要的,且就特定藥物產品的研究上被視為無醫療上的顯著性。
在一實施例中,二種抗原結合蛋白若在其安全性、純度及效力上不具有臨床上有意義的差異,則為生物等效的。
在一實施例中,若相較於無此變更之持續治療,病患可在參照產品和生物產品間作一或多次變更而無預期的有害效應之風險增加(包括臨床上致免疫性之明顯改變或效用減低),則二種抗原結合蛋白為生物等效的。
在一實施例中,若二種抗原結合蛋白係藉由共同的機制或作用機制作用於症狀或所用症狀,而達到此等機制已知的程度,則二者係為生物等效的。
生物等效性可藉由活體內和活體外方法來驗證。生物等效性測量包括,例如(a)人類或其他哺乳動物之活體內試驗,其中係測量血液、血漿、血清或其他生物體液中隨時間變化之抗體或其代謝物濃度;(b)與人類活體內生物可利用性數據有相互關係及可合理預測此數據之活體外試驗;(c)人類或其他哺乳動物之活體內試驗,其中係測量隨時間變化之抗體(或其目標)的適當急性藥理效用;及(d)建立抗原結合蛋白之安全性、效力或生物可利用性或生物等效性之良好對照的臨床試驗。
文中所述之示例性雙特異性抗原結合分子的生物等效變體可藉由,例如製造各種殘基或序列之取代,或刪除生物活性不需要的末端或內部殘基或序列來建構。例如,生物活性不需要的半胱胺酸殘基可刪除或以其他的胺基酸置換,以防止因變性而形成不必要或不正確的分子內雙硫橋。在其他內容中,生物等效的抗原結合蛋白可包括文中所述之示例性雙特異性抗原結合分子的變體,其係包含修飾分子之糖基化特性的胺基酸
改變,例如消除或移除糖基化之突變。
物種選擇性和物種交叉反應
根據本發明特定的實施例,係提供對人類CD3展現微弱或無相互作用,以及對來自其他物種的CD3,例如獼猴CD3展現微弱或無相互作用之抗原結合分子。亦提供與人類TAA結合但不與其他物種TAA結合之抗原結合分子。本發明亦包括與人類CD3及來自一或多種非人類物種之CD3結合的抗原結合分子;及/或與人類TAA及來自一或多種非人類物種之TAA結合的抗原結合分子。
根據本發明特定的示例性實施例,係提供與人類CD3及/或人類TAA結合,以及可或不可與(視情況而定)一或多種小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、獼猴、絨猴、恆河猴或黑猩猩CD3及/或TAA結合之抗原結合分子。例如,在本發明特定的示例性實施例中,係提供包括與人類CD3和獼猴CD3微弱結合之第一抗原結合區及與人類人類PSMA、MUC16、EGFRvIII或STEAP2特異性結合之第二抗原結合區的雙特異性抗原結合分子。
免疫接合物
本發明涵蓋與療效成份,例如細胞毒素、化療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素接合之抗原結合分子(免疫接合物)。細胞毒性劑包括任何對細胞有害之試劑。用於形成免疫接合物之適合的細胞毒性劑及化療劑實例已為本項技術所知(參見,例如WO 05/103081)。
治療調配物及給藥
本發明係提供包括本發明之抗原結合分子的醫藥組成物。本發明之醫藥組成物係與適合的載劑、賦形劑和其他提供改善轉移、遞送、耐受性及類似性質之藥劑所調配。許多適合的調配物可參見所有醫藥化學家已知的處方集:賓州伊斯頓馬克出版公司之Remington's Pharmaceutical
Sciences。這些調配物包括,例如散劑、糊膏、軟膏、軟凍、蠟、油、脂質、含脂質(陽離子或陰離子)之囊泡(例如LIPOFECTINTM,Life Technologies,Carlsbad,CA)、DNA接合物、無水吸收糊膏、水包油和油包水乳劑、乳劑碳蠟(各種分子量之聚乙二醇)、半固體凝膠及含碳蠟(carbowax)之半固體混合物。亦參見Powell et al."Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。
投予病患之抗原結合分子劑量可依照病患的年齡和體型大小、標的疾病、症狀、給藥路徑及其類似因素而不同。較佳的劑量典型地係根據體重或體表面積來計算。當本發明之雙特異性抗原結合分子係用於成人病患之治療目的時,有利的一般可以靜脈給予約0.01至約20毫克/kg體重,更佳地約0.02至約7,約0.03至約5,或約0.05至約3毫克/kg體重之單一劑量的本發明雙特異性抗原結合分子。依照症狀之嚴重度,治療之頻率和作用期可調整。給予雙特異性抗原結合分子之有效劑量和時程可依經驗來決定;例如可以定期評估來監看病患進步,並據此調整劑量。再者,物種間劑量之衡量可使用本項技術熟知的方法來進行(例如Mordenti et al.,1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
各種的遞送系統已為所知並可用於投予本發明之醫藥組成物,例如包膠之微脂體、微粒、微膠囊、能表現突變病毒之重組細胞、受體媒介的內吞作用(參見,例如Wu et al.,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。導入方法包括(但不限於)皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外和口服路徑。組成物可以任何方便的路徑,例如以輸注或團注、以經由上皮或黏膜層(例如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收來給藥,並可與其他生物活性劑共同給藥。給藥可為全身性或局部的。
本發明之醫藥組成物可以標準針或注射器由皮下或靜脈內來遞送。此外,就皮下遞送而言,筆型遞送裝置可容易地用於遞送本發明
之醫藥組成物。此筆型遞送裝置可為重複使用型或拋棄型。可重複使用的筆型遞送裝置一般係利用含有醫藥組成物之可更換補充匣。一旦匣內的所有醫藥組成物投予後而補充匣變空,此空匣可容易丟棄並更換新的含醫藥組成物之補充匣。然後此筆型遞送裝置便可再使用。在拋棄型筆型遞送裝置中無可置換的補充匣。取而代之的,拋棄型筆型遞送裝置係預先填充醫藥組成物收藏在裝置內的儲槽中。一旦醫藥組成物的儲槽變空,整個裝置便可丟棄。
許多可重複使用的筆型和自動注射器遞送裝置已應用於皮下遞送本發明之醫藥組成物。實例包括(但不限於)AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM筆(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM筆、HUMALOGTM筆、HUMALIN 70/30TM筆(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I,II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM筆(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany),僅提出一些。用於皮下遞送本發明醫藥組成物之拋棄型筆型遞送裝置之實例包括(但不限於)SOLOSTARTM筆(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自動注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM筆(Abbott Labs,Abbott Park IL),僅提出一些。
在特定的情況下,醫藥組成物可以控制釋放系統來遞送。在一實施例中,可使用幫浦(參見Langer,前文;Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另外的實施例中,可使用聚合物質;參見Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),1974,CRC Pres.,
Boca Raton,Florida。又在另外的實施例中,控制釋放系統可放置在靠近組成物的目標處,因此僅需要全身劑量之一部分(參見,例如Goodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138)。其他的控制釋放系統係論述於Langer,1990,Science 249:1527-1533之評論中。
可注射的製備物可包括用於靜脈內、皮下、皮內及肌肉內注射、點滴輸注等之劑型。這些可注射製備物可由公開已知的方法來製備。例如,可注射製備物可,例如藉由將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化於注射上習用的無菌水性媒劑或油性媒劑中來製備。注射用之水性媒劑有,例如生理食鹽水、含葡萄糖和其他佐劑之等張溶液等,其可與適合的增溶劑例如醇(例如乙醇)、多醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子介面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化蓖麻油之聚環氧乙烷(50莫耳)加合物)]等組合使用。油性媒劑,可使用芝麻油、大豆油等,其可與增溶劑例如苯甲酸苯甲基酯、苯甲醇等組合使用。由此所製備的注射液較佳地係填充於適當的安瓶中。
有利地,上述之口服或非經腸用途之醫藥組成物係製備成適合活性成份劑量之單位劑型。此等單位劑量之劑型包括,例如錠劑、片劑、膠囊、注射劑(安瓶)、栓劑等。所含的前述抗體之量一般每單位劑量之劑型為約5至約500毫克;特別是注射形式,較佳的前述抗體係含有約5至約100毫而其他劑型為約10至約250毫克。
抗原結合分子之治療用途
本發明係包括於一有此需要的患者中投予一包括與CD3微弱結合或與CD3無可偵測結合並與腫瘤相關抗體結合之抗-腫瘤抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗原結合分子的治療組合物之方法。此治療組成物可包括任何文中所揭示之抗體或雙特異性抗原結合分子以及醫藥上可接受之載劑或稀釋劑。如文中所用,「有此需要之患者」一詞係指具有一或
多種癌症之癥候或適應症之人類或非人類動物(例如表現腫瘤或患有任何下文所指的癌症之患者),或另外可從抑制或降低腫瘤活性或去除腫瘤細胞(例如PSMA++前列腺癌細胞)而得利者。
本發明之抗體及雙特異性抗原結合分子(及包括彼等之治療組成物)可用於,其中包括,治療其中刺激、活化及/或以免疫反應為目標應為有利的疾病或病症。特言之,本發明之雙特異性抗原結合分子可用於治療、防止及/或改善任何與表現TAA,例如PSMA表現或活性之細胞或PSMA+細胞增生有關或由其所媒介之疾病或病症。達成本發明治療方法之作用機制係包括在效應細胞的存在下殺死表現腫瘤相關抗原之細胞,例如,藉由CDC、細胞凋亡、ADCC、吞噬作用或藉由二或多種這些機制的組合或類似的細胞毒性機制。可使用本發明之雙特異性抗原結合分子抑制或毒殺之表現腫瘤相關抗原例如PSMA、MUC16、STEAP2或EGFRvIII之細胞,係包括,例如前列腺癌細胞。
本發明之抗原結合分子可用於治療,例如發生於腦及腦膜、頭和頸、口咽、肺及支氣管樹、胃腸道、男性和女性生殖道、肌肉、骨骼、皮膚和附屬件、結締組織、脾、免疫系統、造血細胞和骨髓、肝及泌尿道、腎、膀胱及/或特定的感官器官例如眼睛之原生及/或轉移腫瘤。在特定的實施例中,本發明之雙特異性抗原結合分子可用於治療一或多種(但不限於)下列癌症:胰臟癌、頭頸癌、前列腺癌、惡性膠質瘤、骨肉瘤、大腸直腸癌、胃癌(例如帶有MET增幅之胃癌)、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑液肉瘤、甲狀腺癌、乳癌、膠質母細胞瘤、乳癌(例如乳管和乳管內乳癌)、鱗狀細胞癌、食道癌、透明細胞腎細胞癌、嫌色性腎細胞癌、(腎)嗜酸粒細胞瘤、(腎)移行細胞癌、泌尿上皮癌、(膀胱)腺癌,或(膀胱)小細胞癌。根據本發明特定的實施例,此雙特異性抗體可用於治療患有難處理或難治型癌症之病患,例如去勢療法阻抗之前列
腺癌。根據本發明之示例性實施例,係提供包括將一如文中所揭示之抗-CD3/抗-PSMA雙特異性抗原結合分子投予患有去勢療法阻抗之前列腺癌病患的方法。本項技術中已知的分析/診斷方法,例如腫瘤掃描可用於確認一患者是否具有去勢療法阻抗之腫瘤。
本發明亦包括於一患者中治療殘餘癌之方法。如文中所用,術語「殘餘癌」係指以抗癌療法,例如第一線或標準療法治療後,在一患者中存在或持續留有一或多個癌細胞。
根據特定方面,本發明係提供治療與TAA表現有關的癌症(例如與PSMA表現或STEAP2表現有關的前列腺癌、與EGFRvIII表現有關的膠質母細胞瘤,或與MUC16表現有關的卵巢癌)之方法,其包括在一患者經測定患有癌症後,將一或多種文中他處所述的雙特異性抗原結合分子投予該患者。例如,本發明係包括治療前列腺癌之方法,其包括在一病患已接受先前的治療後1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週或4週、2個月、4個月、6個月、8個月、1年或更久,將抗-CD3/抗-TAA雙特異性抗原結合分子投予該病患。
組合治療及調配物
本發明係提供包括將包含文中所述之任何示例性抗體和雙特異性抗原結合分子之醫藥組成物與一或多種另外的治療劑組合給藥之方法。可與本發明之抗原結合分子組合或組合給藥之示例性另外的治療劑包括,例如抗-計畫性死亡1抗體(例如美國專利申請案公開案號第US2015/0203579A1號中所述之抗-PD1抗體)、抗-計畫性死亡1配體(例如美國專利申請案公開案號第US2015/0203580A1號中所述之抗-PD1抗體)抗、EGFR拮抗劑(例如抗-EGFR抗體[例如,西妥昔單抗(cetuximab)或帕尼單抗(panitumumab)]或EGFR之小分子抑制劑[例如,吉非替尼(gefitinib)或厄洛替尼(erlotinib)]),另外的EGFR家族成員之拮抗劑,例如Her2/ErbB2、ErbB3
或ErbB4(例如抗-ErbB2、抗-ErbB3或抗-ErbB4抗體或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性之小分子抑制劑),EGFRvIII之拮抗劑(例如與EGFRvIII特異性結合之抗體),cMET拮抗劑(例如抗-cMET抗體),IGF1R拮抗劑(例如抗-IGF1R抗體),B-raf抑制劑(例如威羅菲尼(vemurafenib)、索拉非尼(sorafenib)、GDC-0879、PLX-4720),PDGFR-α抑制劑(例如抗-PDGFR-α抗體),PDGFR-β抑制劑(例如抗-PDGFR-β抗體),VEGF拮抗劑(例如VEGF-Trap,參見例如US 7,087,411(文中亦稱為「VEGF-抑制融合蛋白」)、抗-VEGF抗體(例如貝伐單抗(bevacizumab))、VEGF受體之小分子激酶抑制劑(例如舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)或帕唑帕尼(pazopanib))、DLL4拮抗劑(例如揭示於US 2009/0142354中之抗-DLL4抗體)、Ang2拮抗劑(例如揭示於US 2011/0027286中之抗-Ang2抗體,例如H1H685P)、FOLH1拮抗劑(例如抗-FOLH1抗體)、PRLR拮抗劑(例如抗-PRLR抗體)、STEAP1或STEAP2拮抗劑(例如抗-STEAP1抗體或抗-STEAP2抗體)、TMPRSS2拮抗劑(例如抗-TMPRSS2抗體)、MSLN拮抗劑(例如抗-MSLN抗體)、CA9拮抗劑(例如抗-CA9抗體)、uroplakin拮抗劑(例如抗-uroplakin抗體)等。可有利地與本發明之抗原結合分子組合之其他試劑包括細胞激素抑制劑,其包括小分子細胞激素抑制劑以及予細胞激素,例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18或其個別受體結合之抗體。本發明之醫藥組成物(例如包括如文中所揭示的抗-CD3/抗-PSMA雙特異性抗原結合分子之醫藥組成物)亦可作為包括一或多個治療組合之療法的部份來給藥,而該治療組合係選自「ICE」:異磷醯胺(ifosfamide)(例如Ifex®)、卡鉑(carboplatin)(例如Paraplatin®)、依托泊苷(etoposide)(例如Etopophos®、Toposar®、VePesid®、VP-16);「DHAP」:地塞米松(dexamethasone)(例如Decadron®)、阿糖胞苷(cytarabine)(例如Cytosar-U®、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、ara-C)、順鉑(cisplatin)(例如Platinol®-AQ);及「ESHAP」:
依託泊苷(例如Etopophos®、Toposar®、VePesid®、VP-16)、甲潑尼龍(methylprednisolone)(例如Medrol®)、高劑量阿糖胞苷、順鉑(例如Platinol®-AQ)。
本發明亦包括包含文中所提及之任何抗原結合分子與一或多種下列抑制劑之治療組合:VEGF、Ang2、DLL4、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFRvIII、cMet、IGFIR、B-raf、PDGFR-α、PDGFR-β、FOLH1(PSMA)、PRLR、STEAP1、STEAP2、TMPRSS2、MSLN、CA9、uroplakin或任何前述的細胞激素,其中該抑制劑為一適體(aptamer)、反義分子、核糖酵素、siRNA、肽體、奈米抗體或抗體片段(例如Fab片段;F(ab')2片段;Fd片段;Fv片段;scFv;dAb片段;或其他工程化分子,例如二抗體、三抗體、四抗體、微抗體和最小識別單元)。本發明之抗原結合分子亦可與抗病毒劑、抗生素、鎮痛劑、皮質類固醇及/或NSAID組合給藥及/或共調配。本發明之抗原結合分子亦可作為同時包括放射線治療及/或習用化療之治療療法的部分來給藥。
另外的治療活性組份可在投予本發明抗原結合分子之前、同時或之後不久給藥(就本揭示文之目的,此等給藥療法係被視為本發明之抗原結合分子與另外的治療活性組份「組合」給藥)。
本發明係包括其中本發明之抗原結合分子係與一或多種如文中他處所述之另外的治療活性組份共調配之醫藥組成物。
給藥療法
根據本發明特定的實施例,可於一定義的時程將多劑量的抗原結合分子(例如抗-TAA雙特異性抗原結合分子)投予一患者。根據本發明此方面之方法係包括先後將多劑量之本發明抗原結合分子投予一患者。如文中所用,「先後給藥」係指各劑量之抗原結合分子係於不同的時間點投予該患者,例如以預計的間隔隔開之不同日(例如小時、日、週或月)。本發
明係包括,包含將一單一起始劑量之抗原結合分子先後投予病患,接著一或多個第二劑量之抗原結合分子及視需要接著一或多個第三劑量之抗原結合分子之方法。
術語「起始劑量」、「第二劑量」和「第三劑量」係指投予本發明抗原結合分子之暫時順序。因此,「起始劑量」為治療療法開始時所投予之劑量(亦稱為「基線」劑量);「第二劑量」為在起始劑量之後所投予之劑量;而「第三劑量」為在第二劑量之後所投予之劑量。起始、第二和第三劑量皆可含有相同量之抗原結合分子,但就給藥的頻率而言,一般可彼此不同。在特定的實施例中,然而,包含在起始、第二及/或第三劑量中之抗原結合分子之量,在治療期間可互不相同(例如,若適當,經上調或下調)。在特定的實施例中,係在治療療法開始時投予二或多個(例如2、3、4或5個)劑量作為「承載劑量」,接著以較低頻率為基礎,投予後續劑量(例如「維持劑量」)。
在本發明一示例性的實施例中,各第二及/或第三劑量係在緊接前面劑量之後的1至26週(例如1、1½、2、2½、3、3½、4、4½、5、5½、6、6½、7、7½、8、8½、9、9½、10、10½、11、11½、12、12½、13、13½、14、14½、15、15½、16、16½、17、17½、18、18½、19、19½、20、20½、21、21½、22、22½、23、23½、24、24½、25、25½、26、26½週或更久)給藥。「緊接前面劑量」一詞,如文中所用,係指在一多重給藥之順序中,抗原結合分子之劑量,在每個相鄰接的劑量給藥之前係以無插入劑量之順序給藥。
根據本發明此方面之方法可包括將任何數目之第二及/或第三劑量之抗原結合分子(例如抗-TAA雙特異性抗原結合分子),投予一病患。例如,在特定的實施例中,僅將一單一的第二劑量投予該病患。在其他實施例中,係將二或多個(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第二劑量投予該
病患。同樣地,在特定的實施例中,僅將一單一的第三劑量投予該病患。在其他實施例中,係將二或多個(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第三劑量投予該病患。
在涉及多重第二劑量之實施例中,各第二劑量可與其他第二劑量相同的頻率來給藥。例如,各第二劑量可在緊接前面劑量後1至2週,投予該病患。同樣地,在涉及多重第三劑量之實施例中,各第三劑量可與其他第三劑量相同的頻率來給藥。例如,各第三劑量可在緊接前面劑量後2至4週,投予該病患。另一種選擇,投予病患之第二及/或第三劑量的頻率,在治療療法期間可不同。在治療期間,給藥頻率亦可依照個別病患之需求在臨床檢查後由醫師做調整。
實例
提出下列實例以提供本項技術之一般技術者如何製造及使用本發明方法和組合物之完整揭示和說明,但不希望限制發明者所認為之發明範圍。雖已盡力確保所用的相關數字(例如量、溫度等)之正確性,但仍應考量某些實驗誤差和偏差。除非另有指出,否則份數係為重量之份數,分子量為平均分子量,溫度係以攝氏度數表示,而壓力係為或接近大氣壓。
實例1:產生抗-CD3抗體
下列製程係以鑑定特異性辨識CD3(T細胞共受體)作為抗原之抗體為目標。
藉由讓基因改造小鼠產生免疫力衍生一抗-CD3抗體池。簡言之,將經基因改造而表現逆向嵌合(人類可變區,小鼠恆定區)和免疫球蛋白重鏈結合單一重排輕鏈(例如Vκ1-39/J或Vκ3-20/J)之小鼠以CD3抗原產生免疫力,並產生包括多樣人類VH重排用以表現多樣指令之高親和力抗原-特異性抗體的B細胞。在主體申請書中所述的特定示例性抗體係經重組製造並表現相同的Vκ1-39JK5輕鏈序列(SEQ ID NO:162所述之LCVR),
而其他重組製造的抗體係表現重鏈臂之一(例如腫瘤目標臂)的同源輕鏈。
將產生的抗體以一活體外結合分析就對人類和獼猴CD3抗原之親和力進行檢測,及例如一CD3抗體:鑑定出命名CD3-VH-P(SEQ ID NO:154中所示之HCVR),其中發現,如分別Jurkat細胞和獼猴T細胞之FACS滴定所測,係以介於1至40nM親和力(+++)之EC50與人類和獼猴CD3二者結合。參見,例如下文實例4中所概述的FACS結合實驗。
隨後鑑定出CD3-VH-P之生殖系胺酸殘基及將命名為「CD3-VH-G」之抗體進行工程化而僅含有生殖區之框架。以生殖系序列和CD3-VH-P序列間的差異為基礎,以逐步的方式藉由熟知的分子生物選殖技術置換胺基酸殘基,將其他的抗體衍生物進行工程化。各抗體衍生物係給予一「CD3-VH-G」編號命名。參見表1和圖1。
製備雙特異性抗體,其包括衍生自具有如表1所示之命名和說明之工程化抗-CD3抗體的第一結合臂,以及衍生自抗-TAA抗體的第二結合臂,並對帶有CD3的細胞之單價親和力以一FACS分析進行檢測(如實例4中所述)。這些雙特異性抗體之單價結合親和力結果係如表1中右邊二欄所示。在特定的實施例中,具有TAA-結合臂和CD3-結合臂的雙特異性抗體分別命名為「CD3-VH-G」、「CD3-VH-G5」和「CD3-VH-G20」,結合的Jurkat細胞EC50分別為2.7E-08、未檢出的結合及5.5E-07。
如FACS分析中所見,當CD3-VH-G和某些其他工程化抗體保留其結合親和力時,數種抗-CD3抗體在活體外係以微弱(+/-)至未檢出(-)的親和力與人類或獼CD3結合。隨後對包括依照本實例方法所產生的示例抗-CD3之雙特異性抗體調查用以闡明細胞毒性和藥物動力學(pK)性質之結合親和力、結合動力學和其他生物性質,並詳述於下文所列之實例中。
實例2:重鏈和輕鏈可變區(CDR之胺基酸和核酸序列)
測定各抗體重鏈序列的胺基酸和核酸序列。各抗體,為生殖系序列IGHV3-9*01/D5-12*01/J6*02(SEQ ID NO:181)之衍生物,係指定「G」編號名稱作為一致的命名。表2係列出本發明工程化的抗-CD3抗體之重鏈可變區和CDR的胺基酸序列辨識碼。對應的核酸序列辨識碼係列於表3中。建構各重組抗體的輕鏈可變區和CDR之胺基酸和核酸序列辨識碼亦分別確認於下表4和5中。
對照1抗體定名為「CD3-L2K」係以已知的抗-CD3抗體(亦即如WO2004/106380中所述之抗-CD3抗體「L2K」)所建構。
同型對照抗體,就下文之實例而言,為符合與不相關抗原,亦即FelD1抗原相互作用之抗體的同型(修飾的IgG4)。
實例3:產生與CD3和腫瘤相關抗原(TAA)結合之ULC雙特異性抗體
使用標準分子生物法,利用一來自文中所述的抗-CD3抗體之重鏈、一來自抗-TAA抗體之重鏈及一共同輕鏈或通用輕鏈(ULC),建構包括抗-CD3-特異性結合區和抗-TAA-特異性結合區,例如PSMA、EGFRvIII、MUC16或STEAP2之雙特異性抗體。用於建構本發明雙特異性抗體之抗-TAA抗體係藉由讓基因改造小鼠產生免疫所得來。
依照此實例所製造的各種雙特異性抗體之抗原結合區組份部分的彙整係列於下表6、7和8中。所有的雙特異性抗體係經製造而具有一2014年8月28日公開的美國專利申請公開案第US20140243504A1號中所述之修飾(嵌合的)IgG4 Fc區。示例的EGFRvIIIxCD3雙特異性抗體可使用美國專利申請公開案第US20150259423號中(其係以全文引用的方式併入)所論述之任何EGFRvIII抗體的任何重鏈和輕鏈可變區(或CDR),與文中所論述的任何抗-CD3抗體之可變區或CDR組合來製備。
將各示例的雙特異性抗體以各種下文所述的生物分析進行檢測。
實例4:如FACS分析所測之示例的雙特異性抗體之結合親和力
在此實例中,係經由FACS測定CD3xTAA雙特異性抗體與人類和獼猴CD3-表現細胞株結合之能力。另外,亦確認這些雙特異性抗體與目標特異性(TAA-特異性)細胞株結合的能力。如上所述,本發明各種雙特異性抗體係利用單一TAA-特異性結合臂(PSMA、EGFRvIII、MUC16或STEAP2;參見實例3表6、7和8)與一組抗-CD3結合臂(參見上文實例1和2)和共同輕鏈配對。如實例5中所示,經由表面電漿子共振,CD3xTAA
雙特異性抗體係對人類可溶性異源二聚體hCD3ε/δ.mFc蛋白展現一定範圍的親和力。
簡言之,將2x105個細胞/孔之人類CD3-表現Jurkat、獼猴T或TAA-特異性表現細胞以連續稀釋的雙特異性抗體於4℃培養30min。培養後,清洗細胞並將一山羊F(ab')2抗-人類FcγPE標定的二級抗體(Jackson Immunolabs)加到細胞中再歷經30min。之後,清洗細胞,再懸浮於冷的PBS+1% BSA中並經由流式細胞儀於BD FACS Canto II上分析。
就FACS分析,係藉由前散射高度對前散射面積針對單一事件選擇把關細胞,接著側散射和前散射。使用PRISMTM軟體(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)測定細胞結合滴定之EC50。使用4-參數非線性迴歸分析計算數值。
如表10A中所示,各CD3xPSMA雙特異性抗體之CD3結合臂對人類CD3表現Jurkat細胞展現一定範圍的細胞結合親和力(15至300nM EC50範圍)。重要地,經由表面電漿子共振,對人類CD3異源二聚體蛋
白顯現微弱-至-無結合的CD3臂(參見下文表11)亦與Jurkat細胞上(亦即CD3-VH-G2、CD3-VH-G3、CD3-VH-G5)微弱至未檢出的結合相關聯。未檢出的結合,在FACS分析或等同的分析中係指抗體與其目標抗原間的親和力係超出分析之偵測極限以外(例如>1μM)。數種CD3-結合臂亦對獼猴T細胞顯現交叉反應性。所有檢測的雙特異性抗體在個別的PSMA、EGFRvIII和MUC16-表現細胞株上展現類似的細胞結合,其確認了與個別CD3臂的雙特異性配對不會影響或減少TAA-特異性結合(在所有檢測的實例中,TAA-特異性結合係低於或等於5.6nM(高親和力))。
對人類CD3展現微弱-至-無結合以及對獼猴CD3展現微弱-至-無結合的抗體,依照本發明,就親和力驅動的雙特異性配對被視為有利的,並進一步以活體外和活體內分析檢測細胞毒性。
實例5:以表面電漿子共振結合分析所測之示例抗體的結合親和力
藉由表面電漿子共振於37℃使用抗原-捕捉模式(表11)或抗體捕捉模式(數據未顯示)測定抗-TAA x抗-CD3雙特異性抗體對可溶性二聚體hCD3ε/δ.mFc蛋白(hCD3ε=UniProtKB/Swiss-Prot:P07766.2;SEQ_ID NO:169;hCD3δUniProtKB/Swiss-Prot:P04234.1,SEQ ID NO:170)之結合親和力和動力學常數。在此實例中,係利用BSPSMA/CD3雙特異性抗體作為這些配對,其係代表更廣泛用於CD3結合臂之抗體組的用途。測量係於Sierra Sensors MASS-1儀器上進行。
在抗原捕捉模式中,係以山羊抗-小鼠IgG2a多株抗體(Southern Biotech)將MASS-1高密度胺感測器表面衍生化。捕捉可溶性二聚體CD3蛋白並將個別抗體注射至捕捉的抗原上。
藉由使用MASS-1 AnalyserR2曲線擬合軟體處理並將數據與1:1結合模型擬合,測定動力學結合(ka)和解離(kd)速率常數。從動力學速率常數計算結合解離平衡常數(KD)和解離半衰期(t1/2)為:KD(M)=kd/ka;
及t1/2(min)=(ln2/(60*kd)。
如表11中所示,在表面電漿子共振結合分析中,所有衍生的抗-CD3x抗-PSMA雙特異性抗體對可溶性CD3維持非常微弱的結合,具有大於11nM至高334nM之KD值,其係比衍生自生殖系框架CD3-VH-G之雙特異性抗-CD3臂更弱的值。
數種雙特異性抗體展現大於50nM KD值,且某些係大於100nM(>1x10-7)KD值(亦即BSPSMA/CD3-900、BSPSMA/CD3-1000、BSPSMA/CD3-1900),大於300nM(>3x10-7)KD值(亦即BSPSMA/CD3-005)及甚至超出分析的偵測極限(>500nM;>5x10-7),亦即對可溶性人類CD3顯示未檢出的結合(亦即BSPSMA/CD3-200、BSPSMA/CD3-300、BSPSMA/CD3-400、BSPSMA/CD3-004和BSPSMA/CD3-1800)。
實例6:如活體所測量,本發明之雙特異性抗體展現T細胞活化和腫瘤-特異性細胞毒性
在此實例中,係在CD3-為基礎的雙特異性抗體存在下經由流式細胞儀監測PSMA、EGFRvIII或MUC16-表現的TAA目標細胞之特異性毒殺。如先前的報告,此等雙特異性抗體係對CD3蛋白和CD3-表現細胞株展現一定範圍的親和力(亦即微弱、中度和強力結合)。以相同的雙特異性抗體組就引發初始T人類細胞將毒殺再導向目標表現細胞的能力進行檢測。
簡言之,將PSMA-表現(C4-2、22Rv1和TRAMPC2_PSMA)、EGFRvIII-表現(U87/EGFRvIII)或MUC16-表現(OVCAR3)的細胞株以1μM的螢光追蹤染劑Violet Cell Tracker標定。標定後,於37℃植入細胞至隔夜。分開地,將人類PBMC以1x106個細胞/mL植入補充的RPMI培養基並於37℃培養至隔夜以便藉由排除黏附的巨噬細胞、樹突細胞和一些單核細胞
來增豐淋巴細胞。隔天,將目標細胞與黏附細胞排除的初始PBMC(效應子/目標細胞4:1比率)和連續稀釋的相關雙特異性抗體或同型對照(濃度範圍:66.7nM至0.25pM)於37℃共培養48小時。使用無酵素的細胞解離緩液從細胞培養盤移出細胞並以FACS分析。
就FACS分析,係將細胞以死/活far red細胞追蹤劑(Invitrogen)染色。就在FACS分析前將5x105計數微珠加到各孔槽。各樣本係收集1x104微珠。就毒殺特異性之評估,細胞係以活的Violet標定群族為門控。記錄活群族之百分比並用於計算正常化存活。
T細胞活化係藉由將細胞以直接接合CD2和CD69的抗體培養,並藉由提出總T細胞(CD2+)中活化的(CD69+)T細胞百分比來評估。
如表12A-12C之結果所示,觀察到抗-PSMA、EGFRvIII或MUC16xCD3雙特異性抗體消除了TAA-表現細胞。大部分檢測的雙特異性抗體以皮莫耳範圍的EC50活化人類T細胞並導向消除目標細胞。另外,所觀察到的目標細胞解離(消除)係與CD2+ T細胞上的CD69細胞上調有關,具有皮莫耳(pM)EC50。
重要地,此實例的結果驗證了數種利用CD3結合臂之雙特異性抗體其對CD3蛋白或CD3-表現細胞(亦即CD3-VH-G5)展現微弱-至-未檢出的結合,但仍保留活化T細胞的能力及展現強力的腫瘤抗原表現細胞之細胞毒性。
NT=無檢測
實例7:抗-PSMA/抗-CD3雙特異性抗體展現強力的活體內抗-腫瘤功效
為了測定經鑑定對人類和獼猴CD3具有微弱或未檢出結合親和力之示例抗-PSMA/抗-CD3雙特異性抗體的功效,係於帶有人類前列腺癌異種移植物之免疫妥協小鼠中進行研究。亦於經基因改造表現人類PSMA之帶有小鼠前列腺癌異種移植物的免疫活性小鼠中進行另外的研究。
抗-PSMA/抗-CD3雙特異性抗體在人類腫異種移植模型中之功效
為了評估抗-PSMA/抗-CD3雙特異性抗體在活體內人類腫瘤異種移植研究中的功效,係將NOD scid γ(NSG)小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)與人類周邊血液單核細胞(PBMC)以及內生性表現PSMA之22Rv1或C4-2人類前列腫瘤細胞共移植。
簡言之,將4x106個22Rv1或5x106 C4-2細胞(MD Anderson,TX)以皮下(s.c.)與1x106個人類PBMC(ReachBio,LLC.,Seattle,WA)以50:50之基質膠基質膜(matrigel matrix)(BD Biosciences)混合物共植入至雄性NSG小鼠的右腹。在C4-2研究中,係於腫瘤移植後第0、4和7天以腹腔注射(i.p.)0.1mg/kg BSPSMA/CD3-003或BSPSMA/CD3-005治療。
在另外的異種基因模型中,抗-PSMA/抗-CD3雙特異性抗體
係於植入人類造血CD34+幹細胞之小鼠中進行檢測。簡言之,將新生的SIRPαBALB/c-Rag2-IL2rγ-(BRG)幼鼠植入上hCD34+胎肝細胞。3-6個月後,將hCD34-植入的SIRPα BRG小鼠以C4-2細胞(基底膠中5x106皮下)移植。8天後以10μg的BSPSMA/CD3-004或同型對照抗體治療,接著在整個研究係以2x/週給劑。
在所有的研究中,係使用游標尺2x/週測量腫瘤大小並計算腫瘤體積為體積=(長x寬2)/2。
如表13之結果所示,以上述異種基因模型所檢測的雙特異性抗體在抑制腫生長上,相較於以同形對照治療者,全部皆為有效的。
抗-PSMA/抗-CD3雙特異性抗體在免疫活性腫瘤模型中的功效
另外,係於免疫活性模型中評估抗-PSMA/抗-CD3雙特異性抗體之抗-腫瘤活性(2014年11月24日申請的美國臨時申請案第62/083,653號)。將三條CD3鏈(δγε)人源化之小鼠亦對PSMA人源化並植入以人類PSMA轉染之變體鼠科前列腺癌細胞株TRAMP-C2。
在研究開始前,先產生致腫瘤細胞株變體TRAMP-C2_hPSMAv#1。簡言之,將7.5x106個TRAMP-C2_hPSMA細胞以皮下植入CD3和PSMA人源化之雄性小鼠右腹。割下腫瘤並切成3mm片段及隨後植入新的雄性人源化小鼠右腹。然後收取由植入的腫瘤片段所引發的腫瘤並研碎成單一細胞懸浮液。然後在G418選擇下於活體外培養這些細胞(TRAMP-C2_hPSMAv#1)。然後將4x106個此變體細胞株植入雄性PSMA/CD3人源化小鼠的右腹進行雙特異性抗體功效研究。
從腫瘤移植當日開始,以100μg或10μg的抗-PSMA/抗-CD3雙特異性抗體BSPSMA/CD3-004或同型對照,2x/週治療植入TRAMPC2_hPSMAv#1之人源化PSMA/CD3小鼠。亦檢驗注射4h後之血清細胞激素量,以及脾T細胞量。研究在第27天終止。
如表14中的結果所示,所檢測的抗-PSMA/抗-CD3雙特異性抗體分子BSPSMA/CD3-004,就整個治療組在明顯延遲腫瘤生長上顯示功效。在投予BSPSMA/CD3-004後觀察到最小的細胞激素釋放,可能係由於抗-CD3之微弱的結合。在無排除脾中T細胞下,二種檢測抗體顯示抗腫瘤功效。
總言之,本發明之抗-PSMA/抗-CD3雙特異性抗體,僅管對CD3抗原具有低至未檢出的結合,其在二個免疫妥協腫瘤模型中展現強力的抗-腫瘤功效。
實例8:抗-MUC16/抗-CD3雙特異性抗體展現活體內強力的抗-腫瘤功效
為了測定經鑑定對人類和獼猴CD3具有微弱或未檢出結合親和力之示例抗-MUC16/抗-CD3雙特異性抗體的功效,係於帶有人類前列腺癌異種移植物之免疫妥協小鼠中進行研究。亦於立即治療和治療性給劑治療二種模型中檢測選出的雙特異性抗體之功效。
抗-MUC16/抗-CD3雙特異性抗體在人類腫異種移植模型中之功效
為了評估抗-MUC16/抗-CD3雙特異性抗體在人類腫瘤異種移植研究中的功效,係將NOD scid γ(NSG)小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)先以人類周邊血液單核細胞(PBMC;ReachBio LLC.,Seattle,WA)移植,及然後將來自人類卵巢癌細胞株OVCAR-3(American Type Tissue Culture,Manassas,VA)之特定腹水細胞以螢光素酶(OVCAR-3/Luc)轉導。OVCAR-3細胞係內生性表現MUC-16。
簡言之,將NSG小鼠以腹膜內注射(i.p.)5.0 x 106個人類PBMC。8天後,將1.5 x 106個先前於活體內傳代的OVCAR-3/Luc細胞株之腹水細胞以i.p.投予至植入PBMC之SG小鼠。在立即治療組中,小鼠係在OVCAR-3/Luc細胞移植當天以10ug/小鼠劑量之MUC16/CD3雙特異性抗體BSMUC16/CD3-001或BSMUC16/CD3-005或同型對照由i.p治療(N=5隻小鼠/治療組)。在治療性給劑模型中,小鼠係在腫瘤移植後7天以10ug/小鼠劑量之MUC16/CD3雙特異性抗體或對照抗體由i.p治療(N=5隻小鼠/治療組)。
在所有的研究中,係經由生物冷光造影(BLI)來監測腫瘤生長。將小鼠以i.p.注射懸浮於PBS(150mg/kg)中的螢光素酶基質D-螢光素並
在10min.後於異氟烷(isoflurane)麻醉下進行造影。BLI係使用Xenogen IVIS系統(Perkin Elmer,Hopkinton,MA)來進行,及使用Living Image軟體(Xenogen/Perkin Elmer)來提取BLI訊號。在各細胞群周圍劃出感興趣區域並記錄光子強度為光子(p)/秒(s)/cm2/球面度(sr)。就立即治療組,數據係顯示腫瘤移植後26天的BLI量(表15)。就治療性治療組,數據係顯示介於第6天(治療1天後)和研究終了(腫瘤移植後26天;表16)之間的BLI倍數變化。
如結果所示,在立即給劑模型中,當於第26天測量BLI時,BSMUC16/CD3-001和BSMUC16/CD3-005二者在抑制腫瘤生長上,相較於同型對照,係顯示類似的功效。二種抗-MUC16/抗-CD3雙特異性抗體當於腫瘤移植後7天給藥時,相較於對照組,亦抑制了已建立腫瘤的生長。總言之,本發明之雙特異抗-MUC16/抗-CD3抗體在數種模型中展現強力的抗-腫瘤功效。
實例9:抗-MUC16 x CD3雙特異性抗體之藥物動力學評估
抗-MUC16 x CD3雙特異性抗體BSMUC16/CD3-001和BSMUC16/CD3-005以及同型對照之藥物動力學評估係在人源化MUC16 x CD3小鼠(人類MUC16和CD3表現同型接合之小鼠MUC16hu/hu x CD3hu/hu)、CD3人源化小鼠(人類CD3表現之同型接合小鼠CD3hu/hu)及品系相配(75% C57BL,25%129Sv)野生型(WT)小鼠中進行。各組隊每種試驗抗體和每種小鼠品系係含有4-5隻小鼠。所有的小鼠係接受單一腹膜內(i.p.)0.4mg/kg劑量。於給劑後3和6小時,1、3、7、14和28天收集血液樣本。將血液處理成血清並冷凍於-80℃直到分析。
循環的抗體濃度係藉由總人類IgG抗體分析使用GyroLab xPloreTM(Gyros,Uppsala,Sweden)來測定。簡言之,將一生物素化的山羊抗-人類IgG多株抗體(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)捕捉至Gyrolab Bioaffy 200 CD(Gyros)上塗覆鏈黴親和素(streptavidin)的微珠,用以捕捉存在血清中的人類IgG。在親和管柱捕捉後,以Alexa-647標定的山羊抗-人類IgG(Jackson ImmunoResearch)偵測樣本中結合的人類IgG抗體。得以偵測結合的IgG之管柱上的螢光訊號及反應單位(RU),係藉由此儀器讀取。以內插法從使用Gyrolab Evaluator軟體使用5-參數邏輯曲線擬合之標
準曲線,測定樣本濃度。
PK參數係藉由非模室分析(NCA)使用Phoenix®WinNonlin®軟體Version 6.3(Certara,L.P.,Princeton,NJ)和血管外給劑模型來測定。使用各抗體之個別的平均濃度值,所有的PK參數,包括觀察到的血清中最大濃度(Cmax)、觀察到的預估半衰期(t1/2)和濃度對時間曲線下的面積至最後一次可測量濃度(AUClast)係使用線性梯型法則以線性內插和均勻加權所測定。
在WT小鼠中i.p.投予抗體後,BSMUC16/CD3-001、BSMUC16/CD3-005和同型對照之總IgG濃度-時間樣貌皆為類似的,其特徵首先為簡短藥物分布,接著貫穿剩餘研究的單一藥物消除。將最大血清濃度(Cmax)和三種抗體之理論的藥物暴露(AUClast)作比較(相互在1.3倍內)。在CD3hu/hu小鼠中i.p.投予抗體後,BSMUC16/CD3-001、BSMUC16/CD3-005和同型對照具有相當的Cmax濃度(分別為4.6、3.6和4.1μg/mL)。BSMUC16/CD3-005和同型對照展現類似的藥物清除曲線,而BSMUC16/CD3-001係展現比二者更陡峭的藥物清除,其顯示人類CD3目標結合驅動了清除。BSMUC16/CD3-001的最終抗體濃度為0.03μg/mL,其比同型對照所測定的最終抗體濃度(0.85μg/mL)低約28-倍及比BSMUC16/CD3-005(0.66μg/mL)血清濃度低22-倍。
在MUC16hu/hu x CD3hu/hu雙-人源化小鼠中,Muc16xCD3雙特異性和同型對照抗體具有相當的Cmax濃度(Cmax範圍:4.5-6.9μg/mL)。二種雙特異性抗體展現比同型對照更陡峭的藥物清除,其顯示了目標-媒介的效應。BSMUC16/CD3-001和BSMUC16/CD3-005的最終抗體濃度比同型對照所測定的最終抗體濃度(0.86μg/mL)分別低約29-倍和2.9-倍。
總抗-MUC16 x CD3雙特異性抗體和同型對照抗體濃度之數據的概要係彙整於表17中。平均PK參數係描述於表18A和18B中。平均總抗體濃度與時間係如圖2A、2B和2C所示。總之,MUC16xCD3雙特
異性抗體在WT小鼠中展現類似的Cmax和藥物清除曲線,但BSMUC16/CD3-001在CD3單人源化小鼠和MUC16/CD3雙人源化小鼠中展現比BSMUC16/CD3-005和同型對照更陡峭的清除率。因為在此PK研究中所投予的雙特異性抗體係包括相同的抗-MUC16結合臂,所以結果顯示CD3靶向臂之結合強度可能在藥物暴露量(AUClast)和藥物清除率上佔有一席之地。BSMUC16/CD3-001或BSMUC16/CD3-005皆不會與小鼠MUC16或小鼠CD3結合。
實例10:抗-STEAP2/抗-CD3雙特異性抗體展現活體內強力抗-腫瘤功效
為了測定經鑑定對人類和獼猴CD3具有微弱或未檢出結合親和力之示例抗-STEAP2/抗-CD3雙特異性抗體的功效,係於帶有人類前列腺癌異種移植物之免疫妥協小鼠中進行研究。
為了評估抗-STEAP2/抗-CD3雙特異性抗體在活體內人類腫瘤異種移植研究中的功效,係將NOD scid γ(NSG)小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)以人類周邊血液單核細胞(PBMC;ReachBio LLC.,Seattle,WA)以及內生性表現STEAP2之人類前列癌C4-2細胞(MD Anderson Cancer Center,Houston TX)共移植。
簡言之,將5x106 C4-2細胞以皮下(s.c.)與1.25x106個人類PBMC以50:50之基質膠基質膜(matrigel matrix)(BD Biosciences,San Jose,CA)混合物共植入至雄性NSG小鼠的右腹。在植入當天(立即治療模型),以
腹膜內注射(i.p.)0.1或0.01mg/kg劑量的抗-STEAP2/抗-CD3雙特異性BSSTEAP2/CD3-001、BSSTEAP2/CD3-002或BSSTEAP2/CD3-003,或同型對照治療(N=5隻小鼠/組)。
使用游標尺2x/週測量腫瘤大小並計算腫瘤體積為體積=(長x寬2)/2。在研究終了,移植腫瘤後46天時,數據係以腫瘤大小(mm3)表示(表19)。
如表19中之結果所示,相較於同型對照,當於研究終了測量腫瘤大小時,BSSTEAP2/CD3-001、BSSTEAP2/CD3-002和BSSTEAP2/CD3-003顯著地抑制腫瘤生長。重要地,抗-STEAP2/抗-CD3雙特異性抗體在抑制C4-2腫瘤生長上為有效的,即使在最低劑量0.1mg/kg時。
本發明並不受限於文中所述的特定實施例之範圍。實際上,
除了該等文中所述之外,由前述說明及伴隨的圖示,各種本發明之修改對熟習本項技術者將變得顯而易見。此等修改係希望落在所附的申請專利範圍內。
<110> 美商再生元醫藥公司(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)
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<220>
<223> 合成的
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<220>
<223> 合成的
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<210> 175
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<220>
<223> 合成的
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 176
<210> 177
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 177
<210> 178
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 變體
<222> (8)..(8)
<223> Xaa=Ala或Ser
<400> 178
<210> 179
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 變體
<222> (8)..(8)
<223> Xaa=Lys或Ile
<400> 179
<210> 180
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 變體
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Tyr或Asp
<220>
<221> 變體
<222> (12)..(12)
<223> Xaa=Tyr或His
<220>
<221> 變體
<222> (15)..(15)
<223> Xaa=Met或Leu
<220>
<221> 變體
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Claims (16)
- 一種細胞毒性雙特異性抗體用於製造治療個體中癌症的醫藥品之用途,其中該雙特異性抗體包含顯示對人類CD3和獼猴CD3具有微弱至未檢出結合之第一抗原結合臂,及與腫瘤相關抗原結合之第二抗原結合臂,其中該第一抗原結合臂及該第二抗原結合臂各自包含一重鏈及一輕鏈,其中該輕鏈係為該第一抗原結合臂及該第二抗原結合臂二者所共同者,且其中該第一抗原結合臂之重鏈包含重鏈可變區(HCVR),該HCVR包含分別含有SEQ ID NO:36、38及40或SEQ ID NO:140、142及144的胺基酸序列之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3,且其中該輕鏈係為與腫瘤相關抗原結合之該第二抗原結合臂的重鏈之同源輕鏈。
- 如請求項1之用途,其中該雙特異性抗體顯現活體外T細胞活化。
- 如請求項1之用途,其中該腫瘤相關抗原係表現於人類腫瘤細胞上。
- 如請求項1之用途,其中該雙特異性抗體,當以活體外T細胞媒介的腫瘤細胞毒殺分析所測量,係以低於約1.3nM之EC50值引發T細胞媒介的腫瘤細胞毒殺。
- 如請求項1之用途,其中該目標腫瘤細胞係表現選自下列組成之群之腫瘤相關抗原:AFP、ALK、BAGE蛋白、BIRC5(survivin)、BIRC7、β-連環蛋白(β-catenin)、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8、CALR、CCR5、CD19、CD20(MS4A1)、CD22、CD30、CD40、CDK4、CEA、CTLA4、cyclin-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白(例如GAGE-1、-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3)、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、LMP2、MAGE蛋白(例如MAGE-1、-2、-3、 -4、-6和-12)、MART-1、間皮素(mesothelin)、ML-IAP、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Thompson-nouvelle抗原(Tn)、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶及uroplakin-3。
- 如請求項1至5中任一項之用途,其中該第一抗原結合臂包含分別含有SEQ ID NO:36、38及40的胺基酸序列之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3。
- 如請求項1至5中任一項之用途,其中該第一抗原結合臂包含分別含有SEQ ID NO:140、142及144的胺基酸序列之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3。
- 如請求項6之用途,其中該雙特異性抗體包含含有SEQ ID NO:34的胺基酸序列之HCVR。
- 如請求項7之用途,其中該雙特異性抗體包含含有SEQ ID NO:138的胺基酸序列之HCVR。
- 如請求項1之用途,其中該癌症係由下列組成之群中選出:胰臟癌、黑色素瘤、膠質母細胞瘤、頭頸癌、前列腺癌、惡性膠質瘤、骨肉瘤、大腸直腸癌、胃癌、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑液肉瘤、甲狀腺癌、乳癌、黑色素膠質母細胞瘤、鱗狀細胞癌、食道癌、透明細胞腎細胞癌、嫌色性腎細胞癌、腎嗜酸性粒細胞瘤、腎移行細胞癌、泌尿上皮癌、腺癌或小細胞癌,視情況其中該個體係患有對單獨的單一治療具阻抗性或反應不完全之腫瘤。
- 一種細胞毒性雙特異性抗體,其包含顯示對人類CD3和獼猴CD3具有微弱至未檢出結合之第一抗原結合臂,及與腫瘤相關抗原結合之第二抗 原結合臂,其中該第一抗原結合臂及該第二抗原結合臂各自包含一重鏈及一輕鏈,其中該輕鏈係為該第一抗原結合臂及該第二抗原結合臂二者所共同者,且其中該第一抗原結合臂之重鏈包含重鏈可變區(HCVR),該HCVR包含分別含有SEQ ID NO:36、38及40或SEQ ID NO:140、142及144的胺基酸序列之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3,且其中該輕鏈係為與腫瘤相關抗原結合之該第二抗原結合臂的重鏈之同源輕鏈。
- 如請求項11之用途,其中該第一抗原結合臂包含分別含有SEQ ID NO:36、38及40的胺基酸序列之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3。
- 如請求項11之用途,其中該第一抗原結合臂包含分別含有SEQ ID NO:140、142及144的胺基酸序列之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3。
- 如請求項12之用途,其中該雙特異性抗體包含含有SEQ ID NO:34的胺基酸序列之HCVR。
- 如請求項13之用途,其中該雙特異性抗體包含含有SEQ ID NO:138的胺基酸序列之HCVR。
- 一種醫藥組成物,其包含如請求項11至15中任一項之細胞毒性雙特異性抗體,及醫藥上可接受載劑。
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