CN108290951B - 优化抗cd3双特异性抗体和其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供以微弱或不可检测的结合亲和力与CD3结合的抗体和其使用方法。根据某些实施例,本发明的抗体是以低亲和力与人类CD3结合并且诱导人类T细胞增殖,并且因此以高效力诱导T细胞介导的肿瘤细胞杀死。根据某些实施例,本发明提供双特异性抗原结合分子,其包含在活体外分析中以微弱或不可检测的结合亲和力与人类CD3特异性结合的第一抗原结合区,和与人类肿瘤相关抗原特异性结合的第二抗原结合分子。在某些实施例中,本发明的双特异性抗原结合分子能够抑制表达目标抗原,如PSMA的肿瘤生长。本发明的抗体和双特异性抗原结合分子适用于治疗其中上调或诱导靶向免疫反应是所需的和/或治疗上有利的疾病和病症。举例来说,本发明的抗体适用于治疗各种癌症或其中批准免疫治疗,即效应细胞免疫调节的其它疾病。
Description
对序列表的参考
本申请案以引用的方式合并有呈电脑可读形式的序列表文档10151WO01_ST25.txt,其是于2016年9月22日建立并且含有264,418个字节。
技术领域
本发明涉及以效应子抗原,如CD3抗原和肿瘤相关抗原为目标的双特异性抗体,以及杀死肿瘤的方法。本发明涉及降低或消除肿瘤负荷并且控制可能与肿瘤免疫治疗相关的毒性副作用的方法。本发明提供双特异性抗体,其包含以微弱亲和力或以不可检测的结合亲和力与效应子抗原结合的效应子臂,例如抗CD3抗原结合臂,其在活体外亲和力结合分析中以大于约500nM的KD结合于CD3。
背景技术
治疗性双特异性抗体(bsAb)的前景,特别是在肿瘤免疫治疗中,旨在桥接多个抗原目标,以便引发对携带非所需目标的细胞或生物体更稳定的先天免疫反应。
目前已充分确认,为了介导重新定向的溶离,bsAb必须使目标细胞与效应细胞,例如T细胞上的触发分子直接聚集。在bsAb设计中需要考虑许多因素,例如大小和组成将影响活体内生物分布和稳定性(Segal,DM,Weiner,GJ和Weiner,LM.《免疫学新观点(CurrentOpinion in Immunol)》1999,11:558-562;Chames,P.和Baty,D.MAbs.2009,1(6):539-547)。难以视被触发反应的T细胞亚群以及被刺激的T细胞的状态来预测分化结果。众所周知,bsAb不会产生一致的结果(Manzke O等人,《癌症免疫学免疫疗法(Cancer ImmunolImmunother.)》1997,45:198-202)。例如,在细胞激素生产不充分的情况下,CD3交联可能在T细胞中诱导细胞凋亡反应(Noel PJ,Boise LH,Thompson CB:通过CD28和CTLA4调节T细胞活化(Regulation of T cell activation by CD28 and CTLA4).《实验医学与生物学进展(Adv Exp Med Biol)》1996,406:209-217)。T细胞亚群和这些招募的T细胞,例如初始T细胞的分化状态,对于效力是重要的,因为初始T细胞在无活化下无法溶离目标细胞(例如在IL-2存在下与TCR交联)。
某些双特异性治疗是成功的,然而,如同许多癌症治疗,需付出代价。毒性是癌症治疗中主要的失败原因。众所周知,所谓的化疗药物毒性是病患副作用的主要原因和次要弊病。“杀死细胞”的行为本身为病患制造了麻烦。过剩的细胞毒性反应可能是由效应细胞,例如T细胞活化所诱导,且癌症目标细胞,在肿瘤免疫治疗中哪一类型的反应是最有利的仍尚待分晓。用于双特异性治疗的鉴定抗CD3抗体的方法具有降低副作用同时维持效力和所需的药物动力学性质,应所述是有利的。
已描述以结构/活性关系(SAR)为基础的技术,例如亲和力成熟,其利用突变诱发来优化抗体,使其相较于起始抗体,对目标抗原具有增加和提升的结合特异性或亲和力(参见,例如2011年5月12日公开的WO2011056997)。已描述能以各种程度的亲和力与CD3结合和相互作用,同时仍具有中度至高度T细胞活化作用的修饰的OKT3抗体(US7820166)。然而,并未描述使抗体分子的结合亲和力降低到接近或超出可检测的结合量之外,亦未证实具有用于肿瘤减少或抑制所需的功效。
因此,对于具有控制的细胞毒性和优选PK性质的替代性双特异性抗原结合分子存有需求。这些癌症治疗在治疗设置中应该是相当有用的。
发明内容
在第一方面,本发明提供与人类CD3结合,对人类和/或猕猴CD3具有微弱或不可检测的亲和力的抗体和其抗原结合片段。根据本发明的这一方面,这些抗体可用于,其中包含,以表达CD3的T细胞为标靶,和用于刺激T细胞活化,例如在其中T细胞介导的杀死是有利或所需的情况。本发明的抗CD3抗体或其抗原结合部分可包含将CD3介导的T细胞活化导向特定细胞类型,例如肿瘤细胞或感染原,作为双特异性抗体的部分。
本发明的示例性抗CD3抗体列于文中的表2和3中。表2列出重链可变区(HCVR)以及重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)的氨基酸序列识别码。表3列出编码示例抗CD3抗体的HCVR、HCDR1、HCDR2和HCDR3区的核酸分子的序列识别码。表4和5列出示例的抗CD3抗体的轻链可变区(LCVR)以及轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
本发明提供包含HCVR的抗体或其抗原结合片段,所述HCVR包含由表2所列的任何HCVR氨基酸序列中选出的氨基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其序列一致性的基本上其类似序列。
本发明还提供包含HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)的抗体或其抗原结合片段,而所述HCVR和LCVR氨基酸序列对包含表2所列的任何HCVR氨基酸序列与表4所列的任何LCVR氨基酸序配对,或来源于抗TAA重链的同源轻链的共同轻链,或来源于已知或公共区轻链可变区,其来源于具有杂交或与各种非同源重链配对能力的轻链,即通用或共同轻链。根据某些实施例,本发明提供包含HCVR/LCVR氨基酸序列对的抗体或其抗原结合片段,所述HCVR/LCVR氨基酸序列对包括在与表4所列的示例轻链可变区配对的表2所列的任何示例抗CD3抗体内。在某些实施例中,这一HCVR/LCVR氨基酸序列对由下列组成的群中选出:SEQ IDNO:10/162(例如CD3-VH-G2);18/162(例如CD3-VH-G3);26/162(例如CD3-VH-G4);34/162(例如CD3-VH-G5);42/162(例如CD3-VH-G8);50/162(例如CD3-VH-G9);58/162(例如CD3-VH-G10);66/162(例如CD3-VH-G11);74/162(例如CD3-VH-G12);82/162(例如CD3-VH-G13);90/162(例如CD3-VH-G14);98/162(例如CD3-VH-G15);106/162(例如CD3-VH-G16);114/162(例如CD3-VH-G17);122/162(例如CD3-VH-G18);130/162(例如CD3-VH-G19);138/162(例如CD3-VH-G20);和146/162(例如CD3-VH-G21)。
本发明还提供包含重链CDR1(HCDR1)的抗体或其抗原结合片段,所述重链CDR1包含由表2所列的任何HCDR1氨基酸序列中选出的氨基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本上其类似的序列。本发明还提供包含重链CDR1(HCDR1)的抗体或其抗原结合片段,而所述重链CDR1包含SEQ ID NO:178中所示的氨基酸序列。
本发明还提供包含重链CDR2(HCDR2)的抗体或其抗原结合片段,所述重链CDR2包含由表2所列的任何HCDR2氨基酸序列中选出的氨基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本上其类似序列。本发明还提供包含重链CDR2(HCDR2)的抗体或其抗原结合片段,而所述重链CDR2包含SEQ ID NO:179中所示的氨基酸序列。
本发明还提供包含重链CDR3(HCDR3)的抗体或其抗原结合片段,所述重链CDR3包含由表2所列的任何HCDR3氨基酸序列中选出的氨基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本上其类似的序列。本发明还提供包含重链CDR3(HCDR3)的抗体或其抗原结合片段,而所述重链CDR3包含SEQ ID NO:180中所示的氨基酸序列。
本发明还提供包含轻链CDR1(LCDR1)的抗体或其抗原结合片段,所述轻链CDR1包含由表4所列的任何LCDR1氨基酸序列中选出的氨基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本上其类似的序列。本发明还提供包含轻链CDR1(LCDR1)的抗体或其抗原结合片段,而所述轻链CDR1包含来源于抗TAA重链的同源轻链,或来源于具有杂交或与各种非同源重链配对能力的轻链,即通用或共同轻链。
本发明还提供包含轻链CDR2(LCDR2)的抗体或其抗原结合片段,所述轻链CDR2包含由表4所列的任何LCDR2氨基酸序列中选出的氨基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本上其类似的序列。本发明还提供包含轻链CDR2(LCDR2)的抗体或其抗原结合片段,而所述轻链CDR2包含来源于抗TAA重链的同源轻链,或来源于具有杂交或与各种非同源重链配对能力的轻链,即通用或共同轻链。
本发明还提供包含轻链CDR3(LCDR3)的抗体或其抗原结合片段,所述轻链CDR3包含由表4所列的任何LCDR3氨基酸序列中选出的氨基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本上其类似的序列。本发明还提供包含轻链CDR3(LCDR3)的抗体或其抗原结合片段,而所述轻链CDR3包含来源于抗TAA重链的同源轻链,或来源于具有杂交或与各种非同源重链配对能力的轻链,即通用或共同轻链。
本发明还提供包含HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)的抗体或其抗原结合片段,而所述氨基酸序列对包含表2所列的任何HCDR3氨基酸序列与表4所列的任何LCDR3氨基酸序配对。根据某些实施例,本发明提供包含HCDR3/LCDR3氨基酸序列对的抗体或其抗原结合片段,而所述氨基酸序列对包括在表2所列的任何示例抗CD3抗体内。在某些实施例中,这一HCDR3/LCDR3氨基酸序列对是由下列组成的群中选出:SEQ ID NO:16/168(例如CD3-VH-G2);24/168(例如CD3-VH-G3);32/168(例如CD3-VH-G4);40/168(例如CD3-VH-G5);48/168(例如CD3-VH-G8);56/168(例如CD3-VH-G9);64/168(例如CD3-VH-G10);72/168(例如CD3-VH-G11);80/168(例如CD3-VH-G12);88/168(例如CD3-VH-G13);96/168(例如CD3-VH-G14);104/168(例如CD3-VH-G15);112/168(例如CD3-VH-G16);120/168(例如CD3-VH-G17);128/168(例如CD3-VH-G18);136/168(例如CD3-VH-G19);144/168(例如CD3-VH-G20);和152/168(例如CD3-VH-G21)。
本发明还提供包含一组6个CDR(即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)的抗体或其抗原结合片段,而所述CDR组包括在表2和4所列的任何示例抗CD3抗体内。在某些实施例中,这一HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列是由下列组成的群中选出:SEQ ID NO:12-14-16-164-166-168(例如CD3-VH-G2);20-22-24-164-166-168(例如CD3-VH-G3);28-30-32-164-166-168(例如CD3-VH-G4);36-38-40-164-166-168(例如CD3-VH-G5);44-46-48-164-166-168(例如CD3-VH-G8);52-54-56-164-166-168(例如CD3-VH-G9);60-62-64-164-166-168(例如CD3-VH-G10);68-70-72-164-166-168(例如CD3-VH-G11);76-78-80-164-166-168(例如CD3-VH-G12);84-86-88-164-166-168(例如CD3-VH-G13);92-94-96-164-166-168(例如CD3-VH-G14);100-102-104-164-166-168(例如CD3-VH-G15);108-110-112-164-166-168(例如CD3-VH-G16);116-118-120-164-166-168(例如CD3-VH-G17);124-126-128-164-166-168(例如CD3-VH-G18);132-134-136-164-166-168(例如CD3-VH-G19);140-142-144-164-166-168(例如CD3-VH-G20);和148-150-152-164-166-168(例如CD3-VH-G21)。
在相关实施例中,本发明提供包含一组6个CDR(即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)的抗体或其抗原结合片段,而所述CDR组包括在如表2和4所列的任何示例抗CD3抗体所定义的HCVR/LCVR氨基酸序列对内。例如,本发明包含包括HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组的抗体或其抗原结合片段,而所述氨基酸序列组包含在由下列组成的群中选出的HCVR/LCVR氨基酸序列对内:SEQ ID NO:10/162(例如CD3-VH-G2);18/162(例如CD3-VH-G3);26/162(例如CD3-VH-G4);34/162(例如CD3-VH-G5);42/162(例如CD3-VH-G8);50/162(例如CD3-VH-G9);58/162(例如CD3-VH-G10);66/162(例如CD3-VH-G11);74/162(例如CD3-VH-G12);82/162(例如CD3-VH-G13);90/162(例如CD3-VH-G14);98/162(例如CD3-VH-G15);106/162(例如CD3-VH-G16);114/162(例如CD3-VH-G17);122/162(例如CD3-VH-G18);130/162(例如CD3-VH-G19);138/162(例如CD3-VH-G20);和146/162(例如CD3-VH-G21)。
用于鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列中的CDR的方法和技术已在所属领域中众所周知并且可用于鉴别文中所公开的特定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可用于鉴别CDR界限的示例性常规方法法包含,例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。通常,Kabat定义是以序列变异性为基准,Chothia定义是以结构环区域的位置为基准,而AbM定义是Kabat与Chothia方法之间的折衷。参见,例如Kabat,″免疫学相关蛋白质序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest)″,美国国立卫生研究院(National Institutesof Health),Bethesda,Md.(1991);Al-Lazikani等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》273:927-948(1997);和Martin等人,《美国科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》86:9268-9272(1989)。也可以获得公开的资料库用来鉴别抗体内的CDR序列。
本发明还提供编码抗CD3抗体或其部分的核酸分子。例如,本发明提供编码表3中所列的任何HCVR氨基酸序列的核酸分子;在某些实施例中,这一核酸分子包含由表3所列的任何HCVR核酸序列中选出的多核苷酸序列,或具有与其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本上其类似序列。
本发明还提供编码表4中所列的任何LCVR氨基酸序列的核酸分子;或来源于抗TAA重链的同源轻链,或来源于具有杂交或与各种非同源重链配对能力的轻链,即通用或共同轻链的LCVR。在某些实施例中,这一核酸分子包含由表5所列的任何LCVR核酸序列中选出的多核苷酸序列,或具有与其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本上其类似的序列。
本发明还提供编码表2中所列的任何HCDR1氨基酸序列的核酸分子;在某些实施例中,这一核酸分子包含由表3所列的任何HCDR1核酸序列中选出的多核苷酸序列,或具有与其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本上其类似序列。
本发明还提供编码表2中所列的任何HCDR2氨基酸序列的核酸分子;在某些实施例中,这一核酸分子包含由表3所列的任何HCDR2核酸序列中选出的多核苷酸序列,或具有与其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本上其类似序列。
本发明还提供编码表2中所列的任何HCDR3氨基酸序列的核酸分子;在某些实施例中,这一核酸分子包含由表3所列的任何HCDR3核酸序列中选出的多核苷酸序列,或具有与其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本上其类似序列。
本发明还提供编码表4中所列的任何LCDR1氨基酸序列的核酸分子;或来源于抗TAA重链的同源轻链,或来源于具有杂交或与各种非同源重链配对能力的轻链,即通用或共同轻链的LCDR1。在某些实施例中,这一核酸分子包含由表5所列的任何LCDR1核酸序列中选出的多核苷酸序列,或具有与其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本上其类似的序列。
本发明还提供编码表4中所列的任何LCDR2氨基酸序列的核酸分子;或来源于抗TAA重链的同源轻链,或来源于具有杂交或与各种非同源重链配对能力的轻链,即通用或共同轻链的LCDR2。在某些实施例中,这一核酸分子包含由表5所列的任何LCDR2核酸序列中选出的多核苷酸序列,或具有与其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本上其类似的序列。
本发明还提供编码表4中所列的任何LCDR3氨基酸序列的核酸分子;或来源于抗TAA重链的同源轻链,或来源于具有杂交或与各种非同源重链配对能力的轻链,即通用或共同轻链的LCDR3。在某些实施例中,这一核酸分子包含由表5所列的任何LCDR3核酸序列中选出的多核苷酸序列,或具有与其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本上其类似的序列。
本发明还提供编码HCVR的核酸分子,其中所述HCVR包含一组三个CDR(即HCDR1-HCDR2-HCDR3),其中所述HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列组如表2所列的任何示例性抗CD3抗体所定义。
本发明还提供编码LCVR的核酸分子,其中所述LCVR包含一组三个CDR(即LCDR1-LCDR2-LCDR3),其中所述LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组如表4所列的任何示例性通用轻链抗体所定义;或所述LCDR1-LCDR2-LCDR3来源于抗TAA重链的同源轻链,或来源于具有杂交或与各种非同源重链配对能力的轻链,即通用或共同轻链。
本发明还提供编码HCVR和LCVR的核酸分子,其中这一HCVR包含表2中所列的任何HCVR氨基酸序列的氨基酸序列,和其中这一LCVR包含表4中所列的任何LCVR氨基酸序列的氨基酸序列;或所述LCVR来源于抗TAA重链的同源轻链,或来源于具有杂交或与各种非同源重链配对能力的轻链,即通用或共同轻链。在某些实施例中,这一核酸分子包含由表2所列的任何HCVR核酸序列中选出的多核苷酸序列,或具有与其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本上其类似的序列,和由表5所列的LCVR核酸序列中选出的多核苷酸序列,或具有与其至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本上其类似的序列。在某些实施例中,这一编码HCVR和LCVR的核酸分子为全长的人类序列或来源于人类生殖系免疫球蛋白序列。
本发明还提供能表达包含抗CD3抗体的重链或轻链可变区的多肽的重组表达载体。例如,本发明包含重组的表达载体,所述载体包含任何上文所提及的核酸分子,即编码表2或表4中所列的任何HCVR、LCVR和/或CDR序列的核酸分子。本发明的范围还包含已导入这些载体的宿主细胞,以及通过在得以产生抗体和抗体片段的条件下培养宿主细胞,并回收所产生的抗体和抗体片段来制造抗体或其部分的方法。
本发明包含具有修饰糖基化模式的抗CD3抗体和/或抗TAA抗体,以及双特异性抗CD3/抗TAA抗体。在某些实施例中,移除非所需的糖基化位置的修饰作用或在寡糖链上缺乏岩藻糖基团存在的抗体,例如,用以增加抗体依赖的细胞杀死(ADCC)功能,可能是有用的(参见Shield等人(2002)《生物化学杂志(JBC)》277:26733)。在其它的应用上,可进行半乳糖基化的修饰作用以修改补体依赖的细胞杀死作用(CDC)。
在一方面,本发明提供细胞毒性组合物,其包含i)不能与效应细胞特异性结合,和ii)与目标肿瘤细胞特异性结合的双特异性抗原结合分子,其中所述特异性结合是以活体外FACS结合分析或活体外表面等离子共振结合分析所测量。在某些实施例中,本发明提供包含双特异性抗原结合分子的细胞毒性组合物,而所述双特异性抗原结合分子对效应细胞呈现不可检测的结合且是以可测量的结合亲和力与目标肿瘤细胞特异性结合,其中所述结合亲和力值是以活体外FACS结合分析或活体外表面等离子共振结合分析所测量。
在其它实施例中,本发明提供包含双特异性抗原结合分子的细胞毒性组合物,而所述双特异性抗原系包含i)对CD3呈现不可检测的结合的第一抗原结合片段(Fab1),和ii)以可测量的结合亲和力与肿瘤细胞特异性结合的第二抗原结合片段(Fab2),其中所述结合亲和力值是以活体外FACS结合分析或活体外表面等离子共振结合分析所测量。在某些案例中,这一结合亲和力是单价结合亲和力(例如以双特异性抗体结构)。
在另一方面,本发明提供包含双特异性抗原结合分子的细胞毒性组合物,所述双特异性抗原结合分子以微弱结合亲和力与效应细胞特异性结合,例如具有约或大于100nM的EC50值,和以可观的EC50值,或例如低于50nM的高亲和力EC50值与目标肿瘤细胞结合,其中所述EC50结合亲和力值是以活体外FACS结合分析所测量。在某些实施例中,本发明提供包含双特异性抗原结合分子的细胞毒性组合物,而所述双特异性抗原结合分子以大于约500nM的EC50值与效应细胞特异性结合,和以可观的EC50值,或例如低于50nM的高亲和力EC50值与目标肿瘤细胞结合,其中所述EC50结合亲和力值是以活体外FACS结合分析所测量。
在某些实例中,这一双特异性抗原结合分子包含以大于约40nM,或大于约100nM,大于约200nM,大于约300nM,大于约400nM,大于约500nM,或大于约1μM(例如,在单价结合情况下)的EC50值与人类CD3结合的Fab1。在某些实施例中,这一双特异性抗原结合分子包含Fab2,其来源于以高亲和力,例如低于约50nM,低于约40nM,低于约20nM,低于约10nM或低于约6nM(例如,在单价结合情况下)的EC50值与目标肿瘤细胞特异性结合的第二抗体。在某些案例中,Fab1各自以大于约40nM,或大于约100nM,大于约200nM,或大于约1μM的EC50值与人类CD3和猕猴CD3特异性结合。在某些案例中,Fab1以微弱或不可检测的亲和力与各人类CD3和猕猴CD3特异性结合。
在某些实施例中,这一目标肿瘤细胞是人类肿瘤细胞。在某些实施例中,这一Fab1(或双特异性抗原结合分子),如活体外T细胞介导的肿瘤细胞杀死分析中所测,包含具有低于约1.3nM的EC50值的T细胞介导的肿瘤细胞杀死。
在某些应用中,这一Fab1或双特异性抗原结合分子,如活体外表面等离子共振结合分析所测,以大于约11nM的KD值与人类CD3特异性结合。在其它情况下,这一Fab1或双特异性抗原结合分子,如活体外表面等离子共振结合分析所测,以大于约15nM,或大于约30nM,大于约60nM,大于约120nM,或大于约300nM的KD值与各人类CD3和猕猴CD3特异性结合。在某些应用中,这一Fab1或双特异性抗原结合分子i)如在各活体外表面等离子共振结合分析和FACS结合分析所测,对人类CD3不具有可检测的结合,和ii)如活体外T细胞介导的肿瘤细胞杀死分析中所测,诱导T细胞介导的肿瘤细胞杀死。
在某些应用中,这一双特异性抗原结合分子包含包括HCDR1区的第一重链,而所述HCDR1区包含SEQ ID NO:12或20中所述的氨基酸序列。在某些实施例中,这一第一重链包含HCDR2区,其包括SEQ ID NO:14或54中所述的氨基酸序列。在其它的实施例中,这一第一重链包含HCDR3区,其包括SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:40、SEQID NO:48、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:88、SEQID NO:96、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:144或SEQ ID NO:152中所述的氨基酸序列。在其它应用中,这一第一重链包含HCVR,其包括具有SEQ ID NO:178-179-180氨基酸序列的HCDR1-HCDR2-HCDR3。在其它实施例中,第一重链包含包括SEQ ID NO:178的氨基酸残基1-7的CDR1,包括SEQ ID NO:179的氨基酸残基1-7的CDR2,包括SEQ ID NO:180的氨基酸残基4-11的CDR3。
在更多的实施例中,这一第一重链包含可变区框架区,其具有由FR1(SEQ ID NO:174)、FR2(SEQ ID NO:175)、FR3(SEQ ID NO:176)和FR4(SEQ ID NO:177)选出的氨基酸序列。
本发明提供包含由下列组成中选出的Fab1 HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)的双特异性抗原结合分子:SEQ ID NO:10/162;18/162;26/162;34/162;42/162;50/162;58/162;66/162;74/162;82/162;90/162;98/162;106/162;114/162;122/162;130/162;138/162;146/162。
抗体、其抗原结合片段和双特异性体是以生殖系序列和亲代抗体序列间的差异为基础,用逐步方式通过置换亲代氨基酸残基所制造。本发明提供制造细胞毒性组合物的方法,其包含(a)鉴定第一重链的氨基酸序列,其来源于以高亲和力,例如具有低于约40nM的结合亲和力EC50值,与CD3特异性结合的抗体,(b)修饰第一抗体的重链可变区中所选的氨基酸残基,产生修饰的抗体,(c)将修饰的抗体与来源于与目标肿瘤细胞抗原特异性结合的第二抗体的第二重链配对,产生双特异性抗体,(d)以结合亲和力分析检测这一双特异性抗体,且如果与CD3的结合亲和力具有大于约40nM,或大于100nM,或大于300nM,或大于500nM的EC50值,或不可检测的结合,那么(e)制备一包含这一双特异性抗体和医药上接受载剂或稀释剂的组合物。除了修饰选出抗体的重链可变区,用以工程改造对特异性靶向效应细胞具有微弱或无亲和力的抗原结合臂以外,本发明在文中提供用于修饰各结合臂的重链恒定区(例如CH3区)以制备和纯化双特异性抗体的方法。
示例方法提供制造细胞毒性双特异性抗体的方法,其包含:(a)鉴定与来自多物种的效应细胞抗原相互作用的第一人类抗体或其抗原结合片段;(b)鉴定人类抗体的重链可变区(HCVR)的生殖系氨基酸残基;(c)将第一人类抗体的HCVR的氨基酸序列与对应的生殖系HCVR的氨基酸序列作比较;(d)相较于生殖系HCVR中的相同区,鉴定在第一抗体HCVR的修饰区内的氨基酸,从而让第一抗体中的修饰区通过取代、删除或添加单一氨基酸残基呈现至少一种氨基酸修饰;(e)产生多个各自包含至少一个HCVR修饰区的修饰抗体;(f)针对效应细胞抗原的单价亲和力,筛选多个修饰抗体中的每一个;(g)选择相较于第一抗体对效应细胞抗原呈现较弱结合亲和力或无可检测结合亲和力的修饰抗体;和(h)将选择的第一抗体和与肿瘤-相关抗原相互作用的第二抗体配对,产生细胞毒性双特异性抗体。
在另一方面,本发明提供医药组合物,其包含与CD3特异性结合的重组的人类双特异性抗体或其片段以及医药学上可接受载剂。在相关的方面,本发明的特征是组合物,其是抗CD3抗体和第二治疗剂的组合物。在实施例中,这一第二治疗剂是有利地与抗CD3抗体组合的任何药剂。可有利地与抗CD3抗体组合的示例性药剂,包含(但不限于)与结合和/或活化CD3信号传递的其它药剂(包含其它抗体或其抗原结合片段等)和/或不会直接与CD3结合但仍会活化或刺激免疫细胞活化的药剂。涉及本发明抗CD3的另外的组合治疗或共配制物公开于文中其它地方。
在另一方面,本发明提供使用本发明的抗CD3抗体或抗体的抗原结合部分刺激T细胞活化的治疗方法,其中所述治疗方法包含将治疗上有效量的包含本发明双特异性抗体或其抗原结合片段的医药组合物给予有这一需要的患者。所治疗的病症是通过以肿瘤相关抗原,例如癌症为目标的细胞毒性治疗而加以改进、改善、抑制或防止的任何疾病或症状。
根据另一方面,本发明提供与CD3和目标抗原,特别是肿瘤相关抗原(TAA)结合的双特异性抗原结合分子。
本发明还包含本发明抗CD3/抗TAA双特异性抗原结合分子于制造医药品供治疗与TAA表达有关或由其所造成的疾病或病症的用途。本发明还提供相较于对CD3表达的效应细胞具高亲和力的抗CD3/抗TAA双特异性抗原结合分子,对CD3表达的效应细胞具弱亲和力和降低的清除率的抗CD3/抗TAA双特异性抗原结合分子于制造医药品供治疗与TAA表达有关或由其所造成的疾病或病症的用途。
由阅读随后的详细说明,其它实施例将更显而易见。
附图说明
图1显示下列重链可变区(HCVR)序列的氨基酸比对:生殖系hIgHV(SEQ ID NO:181);CD3-VH-P(SEQ ID NO:154);CD3-VH-G(SEQ ID NO:2);CD3-VH-G2(SEQ ID NO:10);CD3-VH-G3(SEQ ID NO:18);CD3-VH-G4(SEQ ID NO:26);CD3-VH-G5(SEQ ID NO:34);CD3-VH-G8(SEQ ID NO:42);CD3-VH-G9(SEQ ID NO:50);CD3-VH-G10(SEQ ID NO:58);CD3-VH-G11(SEQ ID NO:66);CD3-VH-G12(SEQ ID NO:74);CD3-VH-G13(SEQ ID NO:82);CD3-VH-G14(SEQ ID NO:90);CD3-VH-G15(SEQ ID NO:98);CD3-VH-G16(SEQ ID NO:106);CD3-VH-G17(SEQ ID NO:114);CD3-VH-G18(SEQ ID NO:122);CD3-VH-G19(SEQ ID NO:130);CD3-VH-G20(SEQ ID NO:138);和CD3-VH-G21(SEQ ID NO:146)。每个衍生的HCVR与亲代抗体和生殖系氨基酸残基比较,其中长方形框代表CDR中的突变。
图2A、2B和2C说明,在野生型小鼠(图2A)、人类化CD3小鼠(图2B)和人类化MUC16xCD3小鼠(图2C)中单一0.4mg/kg腹膜内注射BSMUC16/CD3-001、BSMUC16/CD3-005和同型对照抗体后的血清中总IgG的平均浓度。
具体实施方式
在描述本发明之前,应了解,本发明不限于所述的具体方法和实验条件,因为这些方法和条件可改变。还应了解,文中所用的术语仅作为描述具体实施例的目的,且不希望受限,因为本发明的范围将仅受限于所附的权利要求书。
除非另有说明,否则所有文中所用的技术和科学术语具有如本发明所属领域的一般技术人员所正常理解的相同意义。如文中所用,术语“大约”当关于具体陈述数值使用时,指所述值可与陈述值相差不超过1%。例如,如文中所用,“约100”一词包含99和101和所有介于其间的值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在施行或试验本发明时可使用任何所述与文中所述的方法和物质类似或等效的方法和物质,但优选的方法和物质为目前所述。
定义
“CD3”一词,指表达在T细胞上作为多分子T细胞受体(TCR)的部分的抗原,且其是由下列四条受体链中的二条链所形成的同源二聚体或异源二聚体所组成:CD3-ε、CD3-δ、CD3-ζ和CD3-γ。人类CD3-εn(hCD3ε)包含SEQ ID NO:169(UniProtKB/Swiss-Prot:P07766.2)中所述的氨基酸序列。人类CD3-δ(hCD3δ包含SEQ ID NO:170(UniProtKB/Swiss-Prot:P04234.1)中所述的氨基酸序列。除非明确地指出来自非人类物种,否则所有关于文中的蛋白、多肽和蛋白片段希望是指人类版本的各别蛋白、多肽和蛋白片段。因此,除非明确地指出是来自非人类物种,例如“小鼠CD3”、“猴CD3”等,否则“CD3”一词指人类CD3。
词语“与CD3结合的抗体”或“抗CD3抗体”包含特异性识别单一CD3亚单元(例如ε、δ、γ或ζ)或与其连结的抗体和其抗原结合片段,以及特异性识别两个CD3亚单元的二聚复合物(例如,γ/ε、δ/ε和ζ/ζCD3二聚体)以及与其连结的抗体和其抗原结合片段。本发明的抗体和抗原结合片段可与可溶性CD3、结合CD3和/或细胞表面表达的CD3结合。可溶性CD3包含天然的CD3蛋白以及重组的CD3蛋白变异体,例如,缺乏跨膜区或另外不与细胞膜结合的单体和二聚体CD3结构。本发明提供以微弱或不可检测的结合亲和力结合和活化人类和猕猴CD3的抗体。“以不可检测的结合亲和力与CD3结合”指与抗体或抗原结合片段与目标CD3的相互作用可能以已知的检测分析,例如如文中所述的FACS(细胞为基础)结合分析或如文中所述和所属领域中众所周知的表面等离子共振分析为无法测量的或无法检测的。其它结合分析是所属领域中众所周知的。抗体或抗原结合片段可通过非常弱的蛋白-蛋白生化相互作用识别CD3目标,然而,具体的KD或EC50值的测定可能无法测量,因为相互作用超出这一分析的检测极限之外,例如无法测定任何测量值。在其它的情况下,“不可检测的结合亲和力”,如果对应KD值的抗体亲和力等于或比非特异性抗原,例如BSA、酪蛋白和其类似物低10倍,那么经测定为“不可检测的结合亲和力”。“以微弱的结合亲和力与CD3结合”包含其中结合亲和力测量在分析的检测极限或些微超过,或等同对非特异性抗原的结合亲和力的相互作用。
“细胞表面表达的CD3”一词,指一个或多个CD3蛋白,其在活体内或活体外表达在细胞表面,使得至少一部分的CD3蛋白暴露于细胞膜的胞外侧且易接近抗体的抗原结合部分。“细胞表面表达的CD3”包含包括在细胞膜中的功能性T细胞受体环境内的CD3蛋白。“细胞表面表达的CD3”一词包含表达作为细胞表面上的同源二聚体或异源二聚体(例如,δ/ε、γ/ε和ζ/ζCD3二聚体)部分的CD3蛋白。“细胞表面表达的CD3”一词还包含自我表达,在细胞表面上无其它CD3链类型的CD3链(例如,CD3-δ、CD3-ε或CD3-γ)。“细胞表面表达的CD3”可包含或由表达于正常表达CD3蛋白的细胞表面的CD3蛋白所组成。另一种选择,“细胞表面表达的CD3”可包含或由表达于正常不会表达CD3蛋白在其表面上但经人工工程改造表达CD3在其表面上的细胞表面的CD3蛋白所组成。
效应细胞包含效应T细胞(T淋巴细胞),例如CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、Th1、Th2和调节T细胞(Tregs)。效应细胞还可以包含天然的杀手细胞、巨噬细胞、粒细胞、浆细胞或B细胞(淋巴细胞)。应了解,治疗可能经由Ig与效应细胞表面受体,例如CD3(T细胞表面受体)、CD28(T细胞)、Fcγ受体(FcγRs)(NK细胞,活化的巨噬细胞等)的相互作用,介导过剩的细胞-介导免疫反应或效应子功能。效应子功能,例如杀死细胞、补体活化、吞噬作用和调理作用随后经由这些相互作用所触发。与效应细胞和肿瘤目标细胞结合,导致传播肿瘤细胞杀死和诱导对抗肿瘤或癌症的内生性免疫功能的有价值和有效的免疫疗法设计。
“抗CD3抗体”一词,包含带有单一特异性的单价抗体,以及包含结合CD3的第一臂和结合第二(目标)抗原的第二臂的双特异性抗体,其中抗CD3臂包含任何如文中表2、3、4和/或5中所列的HCVR/LCVR或CDR序列。抗CD3双特异性抗体的实例描述于文中的其它地方。术语“抗原-结合分子”包含抗体和抗体的抗原结合片段,其包含,例如双特异性抗体。
术语“抗体”包含任何包括至少一个与具体抗原(例如CD3)特异性结合或相互作用的互补决定区(CDR)的抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包含:包括通过双硫键相互连接的四条多肽链,二条重(H)链和二条轻(L)链的免疫球蛋白分子以及其多聚体(例如IgM)。各重链包含重链可变区(文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。这一重链恒定区包含三个区,CH1、CH2和CH3。各轻链包含轻链可变区(文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个区(CL1)。VH和VL区可进一步细分为高变区,称为互补决定区(CDR),其间散布着较保守性区域,称为框架区(FR)。各VH和VL是由三个CDR和四个FR所组成,以下列顺序由氨基端排列到羧基端:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施例中,抗CD3抗体(或其抗原结合部分)的FR可与人类生殖系序列相同,或可经自然或人工修饰。氨基酸共有序列可以两个或更多个CDR的并排(side-by-side)分析为基准来定义。
术语“抗体”还包含全抗体分子的抗原结合片段。术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等,如文中所用,包含任何与抗原特异性结合形成复合物的天然生成、酶制得、合成或基因工程改造的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术,例如蛋白质水解消化作用或涉及编码抗体可变区和(视需要)恒定区的DNA操作和表达的重组基因工程技术,来源于例如全抗体分子。这一DNA是已知的和/或可容易地从例如市售来源、DNA资料库(包含,例如噬菌体-抗体资料库)取得或可经合成。这一DNA可用化学或通过使用分子生物技术来定序和操作,例如将一个或多个可变和/或恒定区排列成适合的配置,或导入密码子,产生半胱氨酸残基、修饰、增添或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限定实例包含:(i)Fab片段;(ii)F(ab′)2片段;(iii)Fd片段;(iv)Fv片段;(v)单链Fv(scFv)分子;(vi)dAb片段;和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基所组成的最小识别单位(例如分离的互补决定区(CDR),例如CDR3胜肽)或限制性FR3-CDR3-FR4胜肽。其它工程改造分子,例如区域特异性抗体、单区抗体、区域删除抗体、嵌合抗体、CDR-植入抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、双价纳米抗体等)、小模块免疫医药(SMIP)和鲨可变IgNAR区,也涵盖在文中所用的“抗原结合片段”的词语内。
抗体的抗原结合片段典型地将包含至少一个可变区。可变区可以是任何大小或氨基酸组成的区域且一般将包含与一个或多个框架序列相邻或在其框架内的CDR。在具有VH区与VL区结合的抗原结合片段中,VH和VL区可以任何适合的排列位于彼此相对处。例如可变区可为二聚化并含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。另一种选择,抗体的抗原结合片段可含有单体VH或VL区。
在某些实施例中,抗体的抗原结合片段可以含有至少一个可变区与至少一个恒定区共价连接。在本发明的抗体的抗原结合片段内可发现的可变区和恒定区的非限定、示例性配置包含:(i)VH-CH1;(ii)VH-CH2;(iii)VH-CH3;(iv)VH-CH1-CH2;(v)VH-CH1-CH2-CH3;(vi)VH-CH2-CH3;(vii)VH-CL;(viii)VL-CH1;(ix)VL-CH2;(x)VL-CH3;(xi)VL-CH1-CH2;(xii)VL-CH1-CH2-CH3;(xiii)VL-CH2-CH3;和(xiv)VL-CL。在任何可变区和恒定区的配置中,包含上列任何的示例性配置,可变区和恒定区可直接彼此相连接或可通过完整或部分的绞链或连接子区相连接。绞链区可由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸所组成,使其在单一多肽分子中于相邻的可变和/或恒定区之间产生柔性和半柔性连结。再者,在本发明的抗体的抗原结合片段可包含以非共价彼此相互连结和/或与一个或多个单体VH或VL区相连结(例如以双硫键)的任何上列的可变区和恒定区配置的同源二聚体或异源二聚体(或其它多聚体)。
如同全抗体分子,抗原结合片段可以是单特异性或多特异性(例如双特异性)。抗体的多特异性抗原结合片段典型地将包含至少两个不同的可变区,其中各可变区能特异性与个别的抗原结合或与相同抗原上不同的表位结合。任何多特异性抗体模式,包含文中所公开的示例性双特异性抗体模式,可使用所属领域中可取得的常规技术来改造,使其适用于本发明抗体的抗原结合片段状况。
本发明的抗体可经由补体依赖的细胞杀死作用(CDC)或抗体依赖的细胞介导的细胞杀死作用(ADCC)来作用。“补体依赖的细胞杀死作用(CDC)”指在补体的存在下通过本发明的抗体解离抗原表达细胞。“抗体依赖的细胞介导的细胞杀死作用(ADCC)”指细胞介导的反应,其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然的杀手(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别出目标细胞上的结合抗体并据此导致目标细胞的解离。CDC和ADCC可使用所属领域中众所周知和可取得的分析来测量。(参见,例如美国专利第5,500,362号和第5,821,337号,和Clynes等人(1998)《美国国家科学院院刊》(USA)95:652-656)。抗体的恒定区对于抗体固定补体和介导细胞依赖的细胞杀死作用的能力很重要。因此,抗体的同型可依其是否为抗体介导细胞杀死作用所希望的为基准加以选择。
在本发明的具体实施例中,本发明的抗CD3抗体(单特异性或双特异性)是人类抗体。术语“人类抗体”,如文中所用,希望包含具有来源于人类生殖系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人类抗体可包含不由人类生殖系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基(例如通过随机或活体外定点诱发所导入的突变或活体内体细胞突变),例如在CDR中且特别是CDR3。然而,术语“人类抗体”,如文中所用,不希望包含其中来源于另外哺乳动物物种(例如小鼠)的生殖系的CDR序列已稼接在人类框架序列上的抗体。
术语“重组的人类抗体”,希望包含由重组方法,例如使用重组的表达载体转染至宿主细胞(进一步详述于下文中)所制备、表达、产生或分离的所有人类抗体,由重组的组合人类抗体库(进一步详述于下文中)分离出的抗体,由经转殖人类免疫球蛋白基因的动物(例如小鼠)分离出的抗体(参见,例如Taylor等人(1992)《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》20:6287-6295),或由任何其它涉及将人类免疫球蛋白基因序列与DNA序列拼接的方法所制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组的人类抗体具有来源于人类生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而,在某些实施例中,这些重组的人类抗体在活体外经诱发突变(或当使用以人类Ig序列基因转殖的动物时,为活体内体细胞诱发突变),且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列,当来源于人类生殖系VH和VL序列或与其有关时,其可能并非天然存在于活体内人类抗体生殖系库中的序列。
人类抗体可以两种与绞链异质性有关的形式存在。第一种形式,包含约150-160kDa的稳定的四链结构的免疫球蛋白分子,其中这种二聚体是通过链间重链双硫键聚集一起。第两种形式,二聚体并非经由双硫键相连接且这一约75-80kDa的分子是由共价偶合的轻链和重链(半抗体)所组成。这些形式极难分离,即使在亲和纯化后。
在各种完整的IgG同型中,第两种形式出现的频率是因(但不限于)与抗体的绞链区同型有关的结构差异所致。在人类IgG4绞链的绞链区中单一氨基酸取代可显著地降低第两种形式出现(Angal等人(1993)Molecular《分子免疫学(Immunology)》30:105)至典型地使用人类IgG1绞链所观察到的程度。本发明涵盖绞链、CH2或CH3区中具有一个或多个突变的抗体,所述突变例如在制造上可能是所希望的,用以改善所需的抗体形式的产率。
本发明的抗体可以是分离的抗体。“分离的抗体”,如文中所用,指经鉴定和从至少一种其天然环境的组成分分离和/或回收的抗体。例如,从至少一种生物体,或从组织或细胞的组成分分离或移出的抗体,其中就本发明的目的,所述存在自然界或为自然产生的抗体是“分离的抗体”。分离的抗体还包含重组细胞内原位抗体。分离的抗体是历经至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施例,分离的抗体可能基本上无其它细胞物质和/或化学物。
本发明还包含与CD3结合的单臂抗体。“单臂抗体”一词指包含单一抗体重链和单一抗体轻链的抗原结合分子。本发明的单臂抗体可包含如文中表2中所述的任何HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列。
术语“表位”指与抗体分子可变区中称为补位(paratope)的具体抗原结合位置相互作用的抗原决定位。单一抗原可具有超过一个表位。因此,不同的抗体可与抗原的不同区域结合并可具有不同的生物作用。表位可以是构型或线性。构型表位是由直链多肽链不同线段的空间上并列的氨基酸所产生。线性表位是由多肽链相邻的氨基酸残基所产生。在具体情况下,表位可在抗原上包含糖类基团、磷酰基或磺酰基。
术语“基本上一致”或“基本上相同”当指核酸或其片段时,表示当以适当的核苷酸插入或删除与另一核酸(或其互补股)最佳化对齐时,以任何常规的序列一致性算法,例如下文所讨论的FASTA、BLAST或Gap来测量,有至少约95%,和更优选的至少约96%、97%、98%或99%的核苷酸碱基具核苷酸序列一致性。与参照核酸分子具有基本上相同性的核酸分子,在具体情况下,可编码与参照核酸分子所编码的多肽具有相同或基本上类似氨基酸序列的多肽。
当应用于多肽时,术语“基本上类似”指两个胜肽序列,当以GAP或BESTFIT程式使用内建缺位权重最佳化对齐时,享有至少95%序列一致性,极佳地至少98%或99%序列一致性。优选地,不同的残基位置是相差在保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基经另一个带有类似化学性质(例如电荷或疏水性)侧链(R基)的氨基酸残基所取代。一般说来,保守性氨基酸取代基本上将不会改变蛋白质的功能特性。在其中彼此有两个或更多个保守性取代的不同氨基酸序列的案例中,可调高序列一致性的百分比或类似程度以修正这一保守性取代作用的性质。调整的方法已为所属领域的技术人员众所周知。参见,例如Pearson(1994)《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》24:307-331。具有类似化学性质的侧链的氨基酸基团实例包含(1)脂系侧链:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、白氨酸和异白氨酸;(2)脂系-羟基侧链:丝氨酸和苏氨酸;(3)含酰胺侧链:天门冬酰胺酸和谷氨酰胺;(4)芳香侧链:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;(5)碱性侧链:离氨酸、精氨酸和组氨酸;(6)酸性侧链:天门冬氨酸和谷氨酸,和(7)含硫侧链有半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代基群有:缬氨酸-白氨酸-异白氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、离氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天门冬氨酸和天门冬酰胺酸-谷氨酰胺。另一种选择,保守性置换是在Gonnet等人(1992)《科学(Science)》256:1443-1445所公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“中度保守性”置换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
多肽的序列类似性,其也指序列一致性,典型地是使用序列分析软件来测量。蛋白分析软件使用分配至各种取代、删除和其它修饰作用(包含保守性氨基酸取代)的类似度量值配出类似的序列。例如,GCG软件含有例如Gap和Bestfit程式,其可用于内定参数,测定密切相关的多肽间,例如来自不同生物物种的同源多肽,或野生型和其突变蛋白间的序列同源性或序列一致性。参见,例如GCG Version 6.1。多肽序列也可以使用FASTA,利用内定或建议参数,一种GCG Version 6.1内的程式,作比较。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列和搜寻序列间最佳重叠区的比对和序列一致性百分比(Pearson(2000)前文)。当本发明序列与含有较大量来自不同生物体的序列资料库作比较时,另一优选的算法是使用内定参数的电脑程式BLAST,特别是BLASTP或TBLASTN。参见,例如Altschul等人(1990)《分子生物学杂志》215:403-410和Altschul等人(1997)《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25:3389-402。
生殖系突变
相较于从其衍生抗体的对应的生殖系序列,文中所公开的抗体在重链可变区的框架区和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或删除。
本发明还包含由任何文中所公开的氨基酸序列所衍生的抗体和其抗原结合片段,其中在一个或多个框架和/或CDR区中的一个或多个氨基酸突变成从其衍生抗体的生殖系序列的对应残基,或另外人类生殖系序列的对应残基,或对应生殖系残基的保守氨基酸取代(这些序列改变在文中统称为“生殖系突变”)且对于CD3抗原具有微弱或不可检测的结合。数种这些识别CD3的示例性抗体描述于文中表2中。
再者,本发明的抗体在框架区和/或CDR区内可含有任何两个或更多个生殖系突变的组合,例如,其中具体的个别残基突变成具体生殖系序列的对应残基,而与原始生殖系序列不同的其它残基维持原样或突变成不同生殖系序列的对应残基。一旦得到后,含有一个或多个生殖系突变的抗体和抗原结合片段可检测其一种或多种所需的性质,例如增强的结合特异性、微弱或减低的结合亲和力、强化的药物动力学性质、降低的致免疫性等。以给予本公开文指引的这一通用方法所得到的抗体和抗原结合区涵盖在本发明中。
本发明还包含抗CD3抗体,其包括任何具有一个或多个保守取代的文中所公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的变异体。例如,本发明包含抗CD3抗体,其相对于文中表2所述的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列,具有含例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守性氨基酸取代的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列。相较于从其衍生个别的抗原结合区的对应的生殖系序列,本发明的抗体和双特异性抗原结合分子在重链和轻链可变区的框架区和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或删除,同时对CD3抗原维持或增进所需的微弱-至-无可检测结合。“保守性氨基酸取代”为其中一个氨基酸残基经另一个带有类似化学性质(例如电荷或疏水性)侧链(R基)的氨基酸残基所取代。一般说来,保守性氨基酸取代基本上将不会改变蛋白质的功能特性,即这一氨基酸取代,就抗CD3结合分子的情况,维持或增进这一所需的微弱至无可检测的结合亲和力。具有类似化学性质的侧链的氨基酸基团实例包含(1)脂系侧链:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、白氨酸和异白氨酸;(2)脂系-羟基侧链:丝氨酸和苏氨酸;(3)含酰胺侧链:天门冬酰胺酸和谷氨酰胺;(4)芳香侧链:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;(5)碱性侧链:离氨酸、精氨酸和组氨酸;(6)酸性侧链:天门冬氨酸和谷氨酸,和(7)含硫侧链有半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代基群有:缬氨酸-白氨酸-异白氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、离氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天门冬氨酸和天门冬酰胺酸-谷氨酰胺。另一种选择,保守性置换是在Gonnet等人(1992)《科学》256:1443-1445所公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“中度保守性”置换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
本发明还包含包括抗原结合区的抗原结合分子,其中所述抗原结合区带有与文中所公开的任何HCVR和/或CDR氨基酸序列基本上相同的HCVR和/或CDR氨基酸序列,同时对CD3抗原维持或增进所需的微弱亲和力。术语“基本上一致”或“基本上相同”当指氨基酸序列时,表示当,例如以GAP或BESTFIT程式使用内建缺位权重最佳化对齐时,两个氨基酸序列具有至少约95%序列一致性,和极佳地至少98%或99%的序列一致性。优选地,不同的残基位置相差在保守性氨基酸取代。在其中彼此有两个或更多个保守性取代的不同氨基酸序列的案例中,可调高序列一致性的百分比或类似程度以修正这一保守性取代作用的性质。调整的方法已为所属领域的技术人员众所周知。参见,例如Pearson(1994)《分子生物学方法》24:307-331。
多肽的序列类似性,其也称为序列一致性,典型地使用序列分析软件来测量。蛋白分析软件使用分配至各种取代、删除和其它修饰作用(包含保守性氨基酸取代)的类似度量值配出类似的序列。例如,GCG软件含有例如Gap和Bestfit程式,其可以内定参数用于测定密切相关的多肽间,例如来自不同生物物种的同源多肽,或介于野生型和其突变蛋白的序列同源性或序列一致性。参见,例如GCG Version 6.1。多肽序列也可以使用FASTA,利用内定或建议参数,一种GCG Version 6.1内的程式来作比较。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列和搜寻序列间最佳重叠区的比对和序列一致性百分比(Pearson(2000)前文)。当本发明序列与含有较大量来自不同物种的序列资料库作比较时,另一优选的算法是使用内定参数的电脑程式BLAST,特别是BLASTP或TBLASTN。参见,例如Altschul等人(1990)《分子生物学杂志》215:403-410和Altschul等人(1997)《核酸研究》25:3389-402。
一旦得到后,含有一个或多个生殖系突变的抗体和抗原结合片段利用一个或多个活体外分析检测减低的结合亲和力。虽然识别具体抗原的抗体典型地就其目的通过检测对于抗原的高(即强的)结合亲和力进行筛选,但本发明抗体具有微弱结合或无可检测的结合。以这一通用方法所得到的包含一个或多个抗原结合区地双特异性抗原结合分子也涵盖在本发明中并发现为有利的亲和力-驱动的肿瘤治疗。
从文中所述的方法可了解到意外的利益,例如增进的药物动力学和对病患低毒性。
抗体的结合亲和力
如文中所用,在抗体、免疫球蛋白、抗原结合片段或含Fc蛋白与预定抗原,例如细胞表面蛋白或其片段的结合中,术语“结合”典型地指最少两种实体或分子结构之间的相互作用或结合,例如抗体-抗原相互作用。
例如,当例如以表面等离子共振(SPR)技术于BIAcore 3000仪器上使用抗原作为配体和抗体、Ig、抗体结合片段或含Fc蛋白作为分析物(抗配体)测量时,结合亲和力典型地相当于约10-7M或更低的KD值,例如约10-8M或更低,例如约10-9M或更低。以细胞为基础的结合策略,例如荧光活化的细胞分类(FACS)结合分析也是常用的,且FACS数据与其它方法例如放射性配体竞争结合和SPR密切相关(Benedict,CA,《免疫学方法杂志(J ImmunolMethods.)》1997,201(2):223-31;Geuijen,CA等人,《免疫学方法杂志》2005,302(1-2):68-77)。
因此,本发明的抗体或抗原结合蛋白可与预定抗原或细胞表面分子(受体例如CD3)结合,其具有相当于至少低于其与非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合亲和力的10倍的KD值。根据本发明,如果对应于KD值的抗体亲和力等于或低于非特异性抗原10倍,那么可视为不可检测的结合,然而,就产生本发明的双特异性抗体,这一一抗体可能与第二抗原结合臂配对。
术语“KD”(M)系指具体的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数,或抗体或抗体结合片段与抗原结合的解离平衡常数。KD和结合亲和力之间具有逆相关性,因此较小的KD值,亲和力越高,即越强。因此,术语“较高的亲和力”或“较强的亲和力”涉及形成相互作用的能力较高且因此KD值较小,而相反,术语“较低的亲和力”或“较弱的亲和力”涉及形成相互作用的能力较低且因此KD值较大。在某些情况下,具体分子(例如抗体)与其相互作用的伙伴分子(例如受体X)的较高的结合亲和力(或KD),相较于这一分子(例如抗体)与另外的伙伴分子(例如受体Y)的结合亲和力,可用较大KD值(较低或较弱亲和力)除以较小KD(较高或较强亲和力)所测定的结合比率来表示,或例如以大于5倍或10倍的结合亲和力来表示,视情况而定。例如,“较低的亲和力”指不太强的结合相互作用。在某些实施例中,较低的亲和力相当大于约1nM KD,大于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35,或大于约40nM KD,其中这一KD结合亲和力值是以活体外表面等离子共振结合分析或等同的生物分子相互作用感知分析所测定。在某些实施例中,这一低的结合亲和力相当大于约10nM EC50、大于约15nM EC50、20nM EC50、大于约25nM EC50、30nM EC50、大于约35nM EC50、或大于约40nM EC50,其中这一EC50结合亲和力值是以活体外FACS结合分析,或等同的细胞基础结合分析所测量。“弱亲和力”指弱的结合相互作用。在某些实施例中,弱亲和力相当大于约100nM KD或EC50、大于约200、300,或大于约500nM KD或EC50,其中这一KD结合亲和力值是以活体外表面等离子共振结合分析或等同的生物分子相互作用感知分析所测定,而这一EC50结合亲和力值是以活体外FACS结合分析所测,或等同的细胞基础相互作用检测分析来检测单价结合。不可检测的结合是指两种生物分子之间,特别是单价抗体结合臂和其目标抗原之间的亲和力,是在所用的分析的检测极限以外。
术语“Kd”(sec-1或1/s),如文中所用,指具体的抗体-抗原相互作用的解离速率常数,或抗体或抗体结合片段的解离速率常数。所述值也称为koff值。
术语“Ka”(M-1×sec-1或1/M),指具体的抗体-抗原相互作用的结合速率常数,或抗体或抗体结合片段的结合速率常数。
术语“KA”(M-1或1/M),如文中所用,指具体的抗体-抗原相互作用的结合平衡常数,或抗体或抗体结合片段的结合平衡常数。这一结合平衡常数是由ka除以kd所得来。
术语“EC50”或“EC50”,指半数最大有效浓度,其包含诱导基线至具体暴露时间后最大量间的半数反应的抗体浓度。EC50基本上代表其中观察到50%的其最大效用的抗体浓度。在某些实施例中,这一EC50值等于,如,例如FACS结合分析所测,得到表达CD3的细胞或肿瘤相关抗原的半数最大结合的本发明抗体浓度。因此,随着增加的EC50值,或半数最大有效浓度值,观察到降低或较弱的结合使得500nM EC50是表示比50nM EC50更弱的结合亲和力。
在一个实施例中,降低的结合可定义为:能与半数最大量的目标细胞结合的EC50抗体浓度增加。
在其它的实验测量中,这一EC50值代表,因T细胞细胞毒性活性引起半数最大目标细胞耗损的本发明抗体浓度。因此,随着降低的EC50值,或半数最大有效浓度值,观察到增加的细胞毒性活性(例如T细胞介导的肿瘤杀死)。
双特异性抗原结合分子
本发明的抗体可为双特异性或多特异性。多特异性抗体可对一个效应分子,例如CD3,以及目标多肽的不同的表位具特异性,或可含有对超过一个目标多肽具特异性的抗原结合区。参见,例如Tutt等人,1991,《免疫学杂志(J.Immunol.)》147:60-69;Kufer等人,2004,《生物技术趋势(Trends Biotechnol.)》22:238-244。本发明的抗CD3抗体可与另外的功能分子,例如另外的胜肽或蛋白相连结或共表达。例如,抗体或其片段可与一个或多个其它的分子实体,例如另外的抗体或抗体片段功能性连接(例如以化学偶合、基因融合、非共价连结或其它),产生带有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
文中所使用的词语“抗CD3抗体”希望包含单特异性抗CD3抗体以及包括CD3-结合臂和与目标抗原结合的第二结合臂的双特异性抗体。因此,本发明包含双特异性抗体,其中免疫球蛋白的一个臂与人类CD3结合,而免疫球蛋白的另一个臂对目标抗原具有特异性。与CD3双特异性抗体的另一个臂结合的目标抗原可以是表达在细胞、组织、器官、微生物或病毒上或其中,而对抗这一抗原的标靶免疫反应为所需的的任何抗原。CD3-结合臂可包含如文中表2所列的任何HCVR或CDR氨基酸序列。在某些实施例中,这一CD3-结合臂微弱地与人类CD3结合并诱导人类T细胞活化。在其它实施例中,在双特异性或多特异性抗体的情况下,这一CD3-结合臂微弱地与人类CD3结合并诱导肿瘤有关的抗原表达细胞杀死。在其它实施例中,这一CD3-结合臂微弱地与人类和猕猴(猴)CD3结合或连结,而这一结合相互作用以所属领域中已知的活体外分析并不可检测的。在本发明的某些实施例中,这一CD3-结合臂不会与人类和猕猴(猴)CD3结合或连结,而这一双特异性分子仍引起肿瘤有关的细胞杀死。
在其中抗体的一个臂与CD3结合而另一个臂与目标抗原结合的本发明双特异性抗体的情况下,这一目标抗原可以是肿瘤相关的抗原(TAA)。特异性肿瘤相关抗原的非限定实例包含,例如AFP、ALK、BAGE蛋白质、BIRC5(存活素)、BIRC7、β-连环蛋白(β-catenin)、brc-ab1、BRCA1、BORIS、CA9、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8(caspase-8)、CALR、CCR5、CD19、CD20(MS4A1)、CD22、CD30、CD40、CDK4、CEA、CTLA4、周期素-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白(例如GAGE-1、-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3)、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、LMP2、MAGE蛋白(例如MAGE-1、-2、-3、-4、-6和-12)、MART-1、间皮素(mesothelin)、ML-IAP、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白质、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、汤-诺氏抗原(Thompson-nouvelle antigen;Tn)、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶和尿溶蛋白-3。
发明人们预想,本发明包含许多具有依照本发明所制造的微弱抗CD3结合臂的双特异性抗体的实例。
根据具体的示例实施例,本发明包含与CD3和PSMA特异性结合的双特异性抗原结合分子。这些分子在文中可称为,例如“抗CD3/抗PSMA”,或“抗CD3xPSMA”或“CD3xPSMA”双特异性分子等。除非有指出来自非人类物种(例如“小鼠PSMA”、“猴子PSMA”等),否则术语“PSMA”如文中所用指人类PSMA蛋白。
术语“PSMA”指前列腺特异性膜抗原,也称为叶酸水解酶1(FOLH1)(UniProtKB/Swiss-Prot.编号Q04609;SEQ ID NO:171)。PSMA是一种完整、无脱落的膜糖蛋白,其高度表达在前列腺上皮细胞且是一种前列腺癌的细胞表面标记。
根据其它示例性实施例,本发明包含与CD3和EGFRvIII特异性结合的双特异性抗原结合分子。这些分子在文中可称为,例如“抗CD3/抗EGFRvIII”或“抗CD3x EGFRvIII”或“CD3x EGFRvIII”双特异性分子等。除非有指出来自非人类物种(例如“小鼠EGFRvIII”、“猴EGFRvIII”等),否则术语“EGFRvIII”指人类EGFRvIII蛋白。
术语“EGFRvIII”指表皮生长因子受体第III类变异体(EGFRvIII;SEQ ID NO:172),其是胶质母细胞瘤中所常发现的EGFR变异体(Bigner等人,1990,《癌症研究(CancerRes)》50:8017-8022;Humphrey等人,1990,《美国国家科学院院刊》87:4207-4211;Yamazaki等人,1990,《日本癌症研究杂志(Jap J Cancer Res)》81:773-779;Ekstrand等人,1992,《美国国家科学院院刊》89:4309-4313;Wikstrand等人,1995,《癌症研究》55:3140-3148;和Frederick等人,2000,《癌症研究》60:1383-1387)。EGFRvIII其特征是EGFR基因的外显子2-7删除,产生编码区的801碱基对的框内删除,即删除6-273氨基酸残基(以成熟的EGFR的残基编号为基准;参见UniProtKB/Swiss-Prot.编号P00533),以及在融合连接处产生新的甘氨酸(Humphrey等人,1988,《癌症研究》48:2231-2238;Yamazaki等人,1990,见上文)。EGFRvIII已显示具有配体-依赖、微弱但组成性活化的激酶活性,以及增强的致肿瘤性(Nishikawa等人,1994,《美国国家科学院院刊》91:7727-7731;和Batra等人,1995,《细胞生长和分化(Cell Growth and Differentiation)》6:1251-1259)。除了胶质细胞瘤,已在乳管和乳管内乳癌(Wikstrand等人,1995,《癌症研究》55:3140-3148)、非小细胞肺癌(Garciade Palazzo等人,1993,《癌症研究》53:3217-3220)、卵巢癌(Moscatello等人,1995,《癌症研究》55:5536-5539)、前列腺癌(Olapade-Olaopa等人,2000,《英国癌症杂志(British JCancer)》82:186-194)以及头颈的鳞状细胞癌(Tinhofer等人,2011,《临床癌症研究(ClinCancer Res)》17(15):5197-5204)中检测到EGFRvIII。
在其它的示例性实施例中,本发明包含与CD3和MUC16特异性结合的双特异性抗原结合分子。这些分子在文中可称为,例如“抗CD3/抗MUC16”或“抗CD3x MUC16”或“CD3xMUC16”双特异性分子等。除非有指出来自非人类物种(例如“小鼠MUC16”、“猴MUC16”等),否则术语“MUC16”指人类MUC16蛋白。
Mucin 16(MUC16;NCBI参照序列:NP_078966.2,SEQ ID NO:173),另外也称为癌抗原125(CA-125),在人类中是一种由MUC16基因所编码的粘蛋白。粘蛋白家族已知是通过病原体与寡糖在胞外区结合来保护身体免于感染,防止病原体到达细胞表面。许多年来,MUC16/CA125的过度表达已用作为卵巢癌的预测和诊断标记(Yin和Lloyd,2001,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》276(29),27371-27375;O’Brien,TJ等人,2001,《肿瘤生物学(TumourBiol.)》22(6),348-366;Leggieri,C.等人,2014,《欧洲妇科肿瘤学杂志(Eur.J.Gynaecol.Oncol.)》35(4),438-441)。MUC16已显示,以其可与半乳糖凝集素-1(一种免疫抑制蛋白)结合的重度糖基化综排重复区,保护肿瘤细胞避开免疫系统(Seelenmeyer,C.,等人,2003,《细胞科学杂志(J.Cell.Sci.)》116(Pt 7):1305-18;O’Brien,TJ,等人,2002,《肿瘤生物学》23(3),154-169)。天然的杀手细胞和单核细胞无法攻击表达大量MUC16的肿瘤细胞。在其在正常的生理学角色中,MUC16-泌乳素相互作用作为细菌和病毒感染的屏障,然而,在肿瘤细胞的情况下,MUC16相信具有免疫保护性,因而防止癌细胞的细胞溶解(Felder,M.等人,2014,《分子癌症(Molecular Cancer)》,13:129)。MUC16因此为所给予的通过活化免疫系统治疗卵巢癌的免疫疗法双特异性抗体分子的所需目标。
在其它的示例性实施例中,本发明包含与CD3和STEAP2特异性结合的双特异性抗原结合分子。这些分子在文中可称为,例如“抗CD3/抗STEAP2”或“抗CD3xSTEAP2”或“CD3xSTEAP2”双特异性分子等。除非有指出来自非人类物种(例如“小鼠STEAP2”、“猴STEAP2”等),否则术语“STEAP2”如文中所用是指人类STEAP2蛋白。前列腺2的六跨膜上皮抗原(STEAP2;UniProtKB/Swiss-Prot:Q8NFT2.3)是一种490个氨基酸的蛋白,其由位于人类7q21染色体区的STEAP2基因所编码。
与肿瘤相关抗原特异性结合的前述双特异性抗原结合分子,如活体外亲和结合分析所测,包含以微弱或不可检测的结合力,例如具有大于约100nM,300nM或500nM的KD与CD3结合的抗CD3抗原结合分子。
如文中所用,“抗原结合分子”一词指与具体抗原特异性结合的包含或由至少一个互补决定区(CDR)单独或与一个或多个另外的CDR和/或框架区(FR)组合所组成的蛋白、多肽或分子复合物。在某些实施例中,抗原结合分子是抗体或抗体的片段,而所述术语定义于文中其它地方。
如文中所用,“双特异性抗原结合分子”一词指包含至少一个第一抗原结合区和一个第二抗原结合区的蛋白、多肽或分子复合物。与具体抗原特异性结合的双特异性抗原结合分子内的各抗原结合区包含至少单独一个CDR或与一个或多个另外的CDR和/或FR组合。在本发明内文中,第一抗原结合区与第一抗原(例如CD3)特异性结合,而第二抗原结合区与第二、不同的抗原(例如PSMA、MUC16、EGFRvIII或STEAP2)特异性结合。
在本发明具体的示例性实施例中,这一双特异性抗原结合分子是双特异性抗体。双特异性抗体的各抗原结合区包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)。就包含第一和第二抗原结合区的双特异性抗原结合分子(例如双特异性抗体)的情况,第一抗原结合区的CDR可以字首“A1”来定名,而第二抗原结合区的CDR可以字首“A2”来定名。因此,第一抗原结合区的CDR在文中可称为A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3;而第二抗原结合区的CDR在文中可称为A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3。
第一抗原结合区和第二抗原结合区可直接或间接彼此相连形成本发明的双特异性抗原结合分子。另一种选择,第一抗原结合区和第二抗原结合区可各自与个别的多聚化区连接。一个多聚化区与另一个多聚化区连结帮助两个抗原结合区之间的连结,从而形成双特异性抗原结合分子。如文中所用,“多聚化区”为具有与相同或类似结构或组成的第二多聚化区结合的能力的任何大分子、蛋白、多肽、胜肽或氨基酸。例如,多聚化区可以是包含免疫球蛋白CH3区的多肽。多聚化组分的非限定实例是免疫球蛋白(包含CH2-CH3区)的Fc部分,例如选自同型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4,以及各同型群族中的任何异型的IgG的Fc区。
本发明的双特异性抗原结合分子典型地包含两个多聚化区,例如两个作为个别抗体重链的各个别部分的Fc区。第一和第二多聚化区可以是相同的IgG同型,例如IgG1/IgG1、IgG2/IgG2、IgG4/IgG4。另一种选择,第一和第二多聚化区可以是不同的IgG同型,例如IgG1/IgG2、IgG1/IgG4、IgG2/IgG4等。
在某些实施例中,多聚化区是含有至少一个半胱氨酸残基的长度1到约200个氨基酸的Fc片段或氨基酸序列。在其它的实施例中,这一多聚化区是半胱氨酸残基或含有半胱氨酸的短胜肽。其它的多聚化区系包含含有或由白氨酸拉链、螺旋-环模块或缠绕线圈模块所组成的胜肽或多肽。
任何双特异性抗体模式或技术可用来制造本发明的双特异性抗原结合分子。例如具有第一抗原结合特异性的抗体或其片段可与一个或多个其它的分子实体,例如具有第二抗原结合特异性的另外的抗体或抗体片段功能性连接(例如以化学偶合、基因融合、非共价连结或其它),产生特异性抗原结合分子。可用于本发明内文中的具体示例性双特异性模式包含(但不限于),例如scFv-是基础或双抗体双特异性模式、IgG-scFv融合物、双可变区(DVD)-Ig、四源杂交瘤(Quadroma)、杵臼结构(knobs-into-holes)、共同轻链(例如带有杵臼结构的共同轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、白氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性模式(参见,例如Klein等人2012,mAbs 4:6,1-11和文中所引述的参考文献,作为前述模式的审视)。
相较于野生型,天然生成版本的Fc区,在本发明的双特异性抗原结合分子内容中,多聚化区,例如Fc区可包含一个或多个氨基酸变化(例如插入、删除或取代)。例如,本发明包含在Fc区中包括一个或多个修饰,其造成经修饰的Fc区在Fc和FcRn之间具有修饰的结合相互作用(例如增强或减少)的双特异性抗原结合分子。在一个实施例中,这一双特异性抗原结合分子包含CH2或CH3区中的修饰,其中所述修饰增加了酸性环境中Fc区对FcRn的亲和力(例如在其中pH值范围从约5.5到约6.0的核内体中)。这些Fc修饰的非限定实例包含,例如位置250(例如E或Q);250和428(例如L或F);252(例如L/Y/F/W或T),254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰;或位置428和/或433(例如L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰;或位置250和/或428的修饰;或位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施例中,这一修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰;428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰;433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰;252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰;250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L);和307和/或308修饰(例如308F或308P)。
本发明还包含包括第一CH3区和第二Ig CH3区的双特异性抗原结合分子,其中所述第一和第二Ig CH3区至少有一个氨基酸互不相同,且相较于无这一氨基差异的双特异性抗体,其中至少一氨基酸的差异降低了双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施例中,第一Ig CH3区与蛋白A结合而第二Ig CH3区含有降低或消除蛋白A结合的突变,例如H95R修饰(IMGT外显子编号;EU编号是H435R)。第二CH3可进一步包含Y96F修饰(IMGT编号;EU是Y436F)。在第二CH3中可发现的另外修饰作用,就IgG1抗体的情况来说包含:D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(IMGT编号;EU编号是D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I);和就IgG2抗体的情况是N44S、K52N和V82I(IMGT编号;EU编号是N384S、K392N和V422I);和就IgG4抗体的情况是Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT编号;EU编号是Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在某些实施例中,这一Fc区可以是来源于一个或多个免疫球蛋白同型的嵌合的组合Fc序列。例如,嵌合的Fc区可以包含来源于人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4CH2区的部分或全部的CH2序列,或来源于人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4的部分或全部的CH3序列。嵌合的Fc区也可以含有嵌合的绞链区。例如,嵌合的绞链可包含来源于人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4绞链区的“上绞链”序列,与来源于人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4绞链区的“下绞链”序列组合。可包含在文中所述的任何抗原结合分子中的嵌合Fc区的具体实例,从N-端到C-端包含:[IgG4 CH1]-[IgG4上绞链]-[IgG2下绞链]-[IgG4 CH2]-[IgG4 CH3]。可包含在文中所述的任何抗原结合分子中的嵌合Fc区的另外的实例,从N-端到C-端包含:[IgG1CH1]-[IgG1上绞链]-[IgG2下绞链]-[IgG4 CH2]-[IgG1 CH3]。这些和其它可包含在本发明的任何抗原结合分子中的嵌合Fc区的实例,描述于2014年8月7日公开的PCT国际公开案第WO2014/121087 A1号中,其以全文引用的方式并入本文中。具有这些通用结构排列的嵌合Fc区和其变异体,可能具有改变的Fc受体结合,其转而影响Fc效应子功能。
在某些实施例中,本发明提供抗体重链,其中所述重链恒定(CH)区包含与任一SEQID NO:182、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:190或SEQ ID NO:191至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%相同的氨基酸序列。在某些实施例中,这一重链恒定(CH)区包含由下列组成的群中选出的氨基酸序列:SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183、SEQ IDNO:184、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:191。
在其它的实施例中,本发明提供抗体重链,其中所述Fc区包含与任一SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:200或SEQ ID NO:201至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%相同的氨基酸序列。在某些实施例中,这一Fc区包含由下列组成的群中选出的氨基酸序列:SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:200和SEQ ID NO:201。
其它Fc变异体
根据本发明的具体实施例,提供包含Fc区的抗CD3抗体和抗CD3/抗TAA双特异性抗原结合分子,其中所述Fc区包含或多个相较于中性pH值,例如在酸性pH值时,强化或减少抗体与FcRn受体结合的突变。例如,本发明包含在Fc区域的CH2或a CH3区中包括突变的抗体,其中所述突变系增加Fc区与FcRn在酸性环境的亲和力(例如在pH值范围从约5.5到约6.0的核内体中)。当给予动物时,这些突变可使抗体的血清半衰期增加。这些Fc修饰的非限定实例包含,例如位置250(例如E或Q);250和428(例如L或F);252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰;或位置428和/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰;或位置250和/或428的修饰;或位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施例中,这一修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰;428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰;433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰;252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰;250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L);以及307和/或308修饰(例如308F或308P)。
例如,本发明包含包括Fc区的抗CD3抗体和抗CD3/抗TAA双特异性抗原结合分子,而所述Fc区包含一对或多对或一组或多组由下列组成的群中选出的突变:250Q和248L(例如T250Q和M248L);252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E);428L和434S(例如M428L和N434S);以及433K和434F(例如H433K和N434F)。文中所公开的抗体可变区内所有可能的前述Fc区突变的组合,和其它突变涵盖在本发明的范围内。
抗体和双特异性抗原结合分子的生物特性
本发明包含能同时与人类CD3和人类TAA结合的双特异性抗原结合分子(例如双特异性抗体)。根据某些实施例,本发明的双特异性抗原结合分子与表达CD3和/或TAA,例如PSMA、EGFRvIII或MUC16的细胞特异性相互作用。与表达CD3的细胞相互作用的结合臂,如以适合的活体外结合分所测量,可能具有微弱-到-不可检测的结合。双特异性抗原结合分子与表达CD3和/或TAA的细胞结合的程度可通过如文中实例4中所说明的荧光活化细胞分类(FACS)来评估。
例如,本发明包含与表达CD3但不会表达TAA(例如Jurkat)的人类T细胞株、灵长类T细胞(例如猕猴周边血液单核细胞[PBMC])和/或TAA-表达细胞特异性结合的抗体、抗原结合片段和其双特异性抗体。本发明包含,如使用实例4中所述的FACS结合分析或基本上类似的分析所测,以约1.8×10-8(18nM)到约2.1×10-7(210nM)或更高(即较弱的亲和力)的EC50值与前述T细胞和T细胞株结合的双特异性抗原结合分子,以及包含无法检测到EC50的双特异性抗体。在某些实施例中,本发明的抗体、抗原结合片段和双特异性抗体,如通过FACS结合,例如使用文中实例4中所定义的分析模式或基本上类似的分析所测,以大于约30nM,大于约40nM、大于约45nM、大于约50nM、大于约55nM、大于约60nM、大于约65nM、大于约70nM、大于约75nM、至少80nM、大于约90nM、大于约100nM、大于约110nM、至少120nM、大于约130nM、大于约140nM、大于约150nM、至少160nM、大于约170nM、大于约180nM、大于约190nM、大于约200nM、大于约250nM、大于约300nM、大于约500nM、大于约1μM、大于约2μM或大于约3μM的EC50或不可检测的结合亲和力与CD3结合。
本发明还包含,如使用实例4中所述的FACS结合分析或基本上类似的细胞分析所测,以低于约100nM的EC50值或甚至低于结合所需浓度(即较强的亲和力),例如低于5.6nM(5.6×10-9)与TAA-表达细胞和细胞株,例如PSMA-、EGFRvIII-、STEAP2-和MUC16-表达细胞株结合的抗体、抗原结合片段和其双特异性抗体。本发明包含,例如使用前述分析,以低于约50nM、低于约45nM、低于约40nM、低于约35nM、低于约30nM、低于约25nM、低于约20nM、低于约15nM、低于约10nM、低于约6nM、低于约5nM或低于约1nM的EC50值与前述肿瘤细胞株结合的双特异性抗原结合分子。
本发明包含以低、微弱或甚至不可检测的亲和力与人类CD3结合的抗体、抗原结合片段和其双特异性抗体。根据某些实施例,如以表面等离子共振,例如使用文中实例5中所定义的分析模式所测,本发明包含以大于约11nM的KD与人类CD3(例如于37℃)结合的抗体和抗体的抗原结合片段,包含以大于约100nM或500nM的KD与CD3结合的抗体,以及包含不具有可检测亲和力的抗体。在某些实施例中,如通过表面等离子共振,例如使用文中实例5中所定义的分析模式(例如mAb-捕捉或抗原-捕捉模式)或基本上类似的分析所测,本发明的抗体或抗原结合片段以大于约15nM、大于约20nM、大于约25nM、大于约30nM、大于约35nM、大于约40nM、大于约45nM、大于约50nM、大于约55nM、大于约60nM、大于约65nM、大于约70nM、大于约75nM、至少80nM、大于约90nM、大于约100nM、大于约110nM、至少120nM、大于约130nM、大于约140nM、大于约150nM、至少160nM、大于约170nM、大于约180nM、大于约190nM、大于约200nM、大于约250nM、大于约300nM、大于约1μM、大于约2μM或大于约3μM的KD或不可检测的亲和力与CD3结合。
本发明包含以低、微弱或甚至不可检测的亲和力与猴(即猕猴)CD3结合的抗体、抗原结合片段和其双特异性抗体。根据某些实施例,如以表面等离子共振,例如使用文中实例5中所定义的分析模式所测,本发明包含以大于约10nM的KD与人类CD3(例如于37℃)结合的抗体、抗原结合片段和其双特异性抗体,包含以大于约100nM或500nM的KD与CD3结合的抗体,以及包含不具有可检测亲和力的抗体。在某些实施例中,如通过表面等离子共振,例如使用文中实例5中所定义的分析模式(例如mAb-捕捉或抗原-捕捉模式)或基本上类似的分析所测,本发明的抗体或抗原结合片段以大于约15nM、大于约20nM、大于约25nM、大于约30nM、大于约35nM、大于约40nM、大于约45nM、大于约50nM、大于约55nM、大于约60nM、大于约65nM、大于约70nM、大于约75nM、至少80nM、大于约90nM、大于约100nM、大于约110nM、至少120nM、大于约130nM、大于约140nM、大于约150nM、至少160nM、大于约170nM、大于约180nM、大于约190nM、大于约200nM、大于约250nM、大于约300nM、大于约1μM、大于约2μM或大于约3μM的KD或不可检测的亲和力与CD3结合。
本发明包含与人类CD3结合并诱导T细胞活化的抗体、抗原结合片段和其双特异性抗体。例如,如通过活体外T细胞活化分析,例如使用文中实例6中所定义的分析模式[例如在抗CD3抗体的存在下评估总T细胞(CD2+)中活化的(CD69+)细胞的百分比]或评估处于活化状态的T细胞的基本上类似分析所测,本发明包含以低于约113pM的EC50值诱导人类T细胞活化的抗CD3抗体。在某些实施例中,本发明的抗体或抗原结合片段,如通过活体外T细胞活化分析,例如使用文中实例6中所定义的分析模式或基本上类似的分析所测,以低于约100pM、低于约50pM,低于约20pM、低于约19pM、低于约18pM、低于约17pM、低于约16pM、低于约15pM、低于约14pM、低于约13pM、低于约12pM、低于约11pM、低于约10pM、低于约9pM、低于约8pM、低于约7pM、低于约6pM、低于约5pM、低于约4pM、低于约3pM、低于约2pM或低于约1pM的EC50值诱导人类T细胞活化[例如活化的(CD69+)T细胞百分比]。如实例6中所示例,尽管对CD3具有微弱或不可检测的结合亲和力,对CD3具有微弱或不可检测的结合的抗CD3抗体以高效力(即pM范围)诱导T细胞活化。
本发明还包含与人类CD3结合并诱导T细胞介导的肿瘤抗原表达细胞杀死的抗体、抗原结合片段和双特异性抗体。例如,如以活体外T细胞介导的肿瘤细胞杀死分析,例如使用文中实例6中所定义的分析模式[例如在抗CD3抗体的存在下评估肿瘤抗原表达细胞,例如PSMA-表达、EGFRvIII-表达或MUC16-表达细胞被人类PBMC杀死的程度]或基本上类似分析所测,本发明包含以低于约1.3nM的EC50诱导T细胞介导的肿瘤细胞杀死的抗CD3抗体。在某些实施例中,本发明的抗体或抗原结合片段,如以活体外T细胞介导的肿瘤细胞杀死分析,例如使用文中实例6中所定义的分析模式或基本上类似分析所测,以低于约1nM、低于约400pM、低于约250pM、低于约100pM、低于约50pM、低于约40pM、低于约30pM、低于约20pM、低于约10pM、低于约9pM、低于约8pM、低于约7pM、低于约6pM、低于约5pM、低于约4pM、低于约3pM、低于约2pM或低于约1pM的EC50值诱导T细胞介导的肿瘤细胞杀死(例如PBMC-介导OVCAR3细胞杀死)。
本发明还包含,如于25℃或37℃通过表面等离子共振,例如使用文中实例5中所定义的分析模式或基本上类似的分析所测,以低于约10分钟的解离半衰期(t1/2)与CD3结合的抗体、抗原结合片段和其双特异性抗体。在某些实施例中,如于25℃或37℃通过表面等离子共振,例如使用文中实例5中所定义的分析模式(例如mAb-捕捉或抗原-捕捉模式)或基本上类似的分析所测,以低于约9分钟、低于约8分钟、低于约7分钟、低于约6分钟、低于约5分钟、低于约4分钟、低于约3分钟、低于约2分钟、低于约1.9分钟或低于约1.8分钟的t1/2或具有非常弱或不可检测的结合与CD3结合。
本发明的抗CD3/抗TAA双特异性抗原结合分子可另外具有一项或多项由下列组成的群中选出的特性:(a)于活体外诱导PBMC增生;(b)在人类全血中经由诱导IFNγ释放和CD25上调活化T细胞;和(c)在抗TAA-阻抗的细胞株上诱导T细胞介导的细胞毒性。
本发明包含能于患者中消除肿瘤抗原表达细胞的抗CD3/抗TAA双特异性抗原结合分子(参见,例如实例7)。例如,根据某些实施例,提供抗CD3/抗PSMA、抗CD3/抗MUC16或抗CD3/抗STEAP2双特异性抗原结合分子,其中单一给予患者1μg或10μg或100μg的双特异性抗原结合分子(例如以约0.1mg/kg、约0.08mg/kg、约0.06mg/kg、约0.04mg/kg、约0.04mg/kg、约0.02mg/kg、约0.01mg/kg或更低的剂量)造成所述患者中肿瘤抗原表达细胞的数目下降(所述患者中肿瘤生长受到压抑或抑制)到可检测量以下。在某些实施例中,单一给予约0.4mg/kg剂量的抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子,在给予所述患者双特异性抗原结合分子后约第7天、约第6天、约第5天、约第4天、约第天、约第3天、约第2天、约第1天,造成所述患者中肿瘤生长下降到可检测量以下。根据某些实施例,单一给予约0.01mg/kg剂量的本发明抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子,造成PSMA-表达的肿瘤细胞数目在给药后直到至少约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天或更久,仍维持在可检测量以下。如文中所用,“可检测量以下”一词指在患者中,使用标准的测径器测量方法,例如文中实例7中所述,直接或间接皆无检测到皮下生长的肿瘤细胞。在某些实施例中,单一给予10μg剂量的抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子在约第6天造成患者中肿瘤生长抑制,并维持肿瘤抑制直到给予所述患者双特异性抗原结合分子后的第26天。在肿瘤植入后约至少7天接受单一给予约10μg剂量的抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子的患者中,在肿瘤植入患者后约第26天,这一双特异性抗原结合分子在患者中呈现抑制建立的肿瘤免于进一步生长。根据某些实施例,单一给予约0.1mg/kg剂量的本发明抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子,在给予这一双特异性分子后,抑制MUC16-表达的肿瘤细胞生长达至少约7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或更久。参见,例如实例8。
在某些实施例中,单一给予约0.1mg/kg或0.01mg/kg剂量的抗CD3/抗STEAP2双特异性抗原结合分子持续抑制肿瘤生长直到至少给予所述患者双特异性抗原结合分子和肿瘤后的第46天。根据某些实施例,单一给予至少约0.1mg/kg、约0.08mg/kg、约0.06mg/kg、约0.05mg/kg、约0.04mg/kg、约0.03mg/kg、约0.02mg/kg、约0.01mg/kg或更少剂量的本发明抗CD3/抗STEAP2双特异性抗原结合分子,在给予双特异性分子后,抑制STEAP2-表达的肿瘤细胞生长至少约20天、30天、35天、40天、45天或更久。参见,例如实例10。
在其它的实施例中,对效应细胞具有微弱结合亲和力的CD3靶向结合臂的抗CD3/抗TAA双特异性抗原结合分子,在活体外药物动力学研究中相较于相同抗TAA结合臂和强CD3结合臂,呈现降低的药物排除率。这些结果显示,包含较弱结合力的CD3靶向臂的双特异性分子可能具有有利的药物暴露量(AUClast)和药物排除样貌(抗体清除)。参见,例如实例9。
本发明提供抗CD3/抗PSMA、抗CD3/抗MUC16和抗CD3/抗STEAP2双特异性抗原结合分子(即抗CD3/抗TAA双特异性抗原结合分子),其具有一项或多项由下列组成的群中选出的特性:(a)在带有人类前列腺癌异种移植物的免疫胜任型小鼠中抑制肿瘤生长;(b)在带有人类前列腺癌异种移植物的免疫活性小鼠中抑制肿瘤生长;(c)在带有人类前列腺癌异种移植物的免疫胜任型小鼠中抑制已建立的肿瘤的肿瘤生长;和(d)在带有人类前列腺癌异种移植物的免疫活性小鼠中降低已建立的肿瘤的肿瘤生长(参见,例如实例7、8和10)。本发明还提供包含导向效应T细胞(即CD3)的第一重链以及导向目标肿瘤细胞的第二重链的抗CD3/抗PSMA、抗CD3/抗MUC16和抗CD3/抗STEAP2双特异性抗体(即抗CD3/抗TAA双特异性抗体),其中所述双特异性抗体对效应细胞具有微弱结合或不可检测的结合,且相较于对效应细胞具有强结合的双特异性抗体,具有肿瘤生长抑制和降低身体的抗体清除(即排除)。
表位定位和相关技术
与本发明抗原结合分子结合的CD3上的表位可由3个或多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)CD3蛋白的氨基酸的单一连续序列所组成。另一种选择,表位可由多个CD3的非连续氨基酸(或氨基酸序列)所组成。本发明的抗体可与包括在单一CD3链(例如CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ)内的氨基酸相互作用,或可与两条或多条不同CD3链上的氨基酸相互作用。术语“表位”,如文中所用,指与抗体分子可变区中称为补位(paratope)的具体抗原结合位置相互作用的抗原决定位。单一抗原可具有超过一个表位。因此,不同的抗体可与抗原的不同区域结合并可能具有不同的生物作用。表位可为构型或线性。构型表位系由直链多肽链不同线段的空间上并列的氨基酸所产生。线性表位由多肽链相邻的氨基酸残基所产生。在具体的情况下,表位可在抗原上包含糖类基团、磷酰基基团或磺酰基基团。
所属领域的一般技术人员已知的各种技术皆可用于测定抗体的抗原结合区是否与多肽或蛋白内的“一个或多个氨基酸相互作用”。示例的技术包含,例如常规的交叉阻断分析,例如描述于《抗体(Antibodies)》,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中,丙氨酸扫描突变分析、胜肽墨点分析(Reineke,2004,《分子生物学方法》248:443-463)和胜肽裂解分析。此外,可使用例如表位切除、表位萃取和抗原的化学修饰等方法(Tomer,2000,《蛋白质科学(Protein Science)》9:487-496)。可用于鉴定多肽内与抗体的抗原结合区相互作用的氨基酸的另外方法以质谱检测氢/氘交换。一般说来,氢/氘交换方法包含以氘标定感兴趣蛋白,接着让抗体与氘标定的蛋白结合。接着,将蛋白/抗体复合物转置于水中,让除了受抗体保护的残基(其仍为氘标定)以外的所有残基发生氢-氘交换。解离抗体后,将目标蛋白以蛋白酶裂解并以质谱分析,从而找出氘标定残基,其相当于与抗体相互作用的具体氨基酸。参见,例如Ehring(1999)《当代生物化学(Analytical Biochemistry)》267(2):252-259;Engen和Smith(2001)《分析化学(Anal.Chem.)》73:256A-265A。抗原/抗体复合物的X-光晶体学也可以用于表位定位的目的。
本发明还包含与任何文中所述的具体示例性抗体相同的表位结合的抗PSMA抗体(例如,包含如文中表6所述的任何氨基序的抗体)。同样的,本发明还包含与任何文中所述的具体示例性抗体(例如,包含如文中表6所述的任何氨基序的抗体)竞争和PSMA结合的抗PSMA抗体。公开于美国申请案第15/223,434号的抗PSMA以引用的方式并入本申请案中。
本发明还包含双特异性抗原结合分子,其包含与人类CD3和/或猕猴CD3以低或可检测结合亲和力特异性结合的第一抗原结合区,以及与人类肿瘤相关抗原(TAA)特异性结合的第二抗原结合区,其中所述第一抗原结合区与任何文中所述的具体示例性CD3-抗原结合区相同的CD3表位结合。
同样地,本发明还包含双特异性抗原结合分子,其包含与人类CD3和/或猕猴CD3以低或可检测结合亲和力特异性结合的第一抗原结合区,以及与人类肿瘤相关抗原(TAA)特异性结合的第二抗原结合区,其中所述第一抗原结合区与任何文中所述的具体示例性CD3-抗原结合区竞争和CD3结合。
通过使用所属领域中已知的常规方法,可容易地测定具体的抗原结合分子(例如抗体)或其抗原结合区是否与本发明的参照抗原结合分子相同的表位结合或是与其竞争结合。例如,测定试验抗体是否与如同本发明参照的双特异性抗原结合分子的CD3(或TAA)上的相同表位结合,首先让参照的双特异性分子与CD3蛋白(或TAA蛋白)结合。接着,评估试验抗体与CD3分子结合的能力。如果试验抗体在与参照的双特异性抗原结合分子饱和结合后,能与CD3(或TAA)结合,那么其可结论出,所述试验抗体与不同于参照的双特异性抗原结合分子的CD3(或TAA)表位结合。另一方面,如果试验抗体在与参照的双特异性抗原结合分子饱和结合后,不能与CD3(或TAA)分子结合,那么试验抗体可能与和本发明的参照的双特异性抗原结合分子结合的表位相同的CD3(或TAA)表位结合。然后可进行另外例行的实验(例如胜肽突变和结合分析),以确定所观察到无试验抗体结合事实上是否是由于与和参照的双特异性抗原结合分子相同的表位结合所致,或是否是因立体阻断(或另外的现象)造成无观察到结合。如果这一参照抗体是如文中所示例不具有可测量的结合,那么这一参照抗体可突变回生殖系序列,以便就比较表位相互作用,或与如文中所述的试验抗体比较其结合性质的目的,测定与CD3的结合。这一类实验可使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞仪或所属领域中可取得的任何其它量性或质性抗体-结合分析来进行。依照本发明的具体实施例,如竞争性结合分析中所测,如果例如1-、5-、10-、20-或100-倍过量的抗原结合蛋白抑制另一抗体的结合至少50%,但优选地75%、90%或甚至99%,那么两种抗原结合蛋白与相同(或重叠)的表位结合(参见,例如Junghans等人,《癌症研究》.1990:50:1495-1502)。另一种选择,如果基本上降低或消除抗原结合蛋白的结合的抗原中所有的氨基酸突变,降低或消除另一种抗原结合蛋白的结合,那么两种抗原结合蛋白被认为与相同的表位结合。如果仅一亚群的氨基酸突变降低或消除抗原结合蛋白的结合或消除另一种抗原结合蛋白的结合,那么两种抗原结合蛋白被认为具有“重叠的表位”。
为了测定抗体或其抗原结合区是否与参照的抗原结合分子竞争结合,以两个方向进行上述结合方法:第一个方向:让参照的抗原结合分子在饱和的条件下与CD3蛋白(或TAA蛋白)结合,接着评估试验抗体与CD3(或TAA)分子的结合。第二个方向:让试验抗体在饱和的条件下与CD3(或TAA)分子结合,接着评估参照的抗原结合分子与CD3(或TAA)分子的结合。如果在两个方向中,仅有第一(饱和)抗原结合分子能与CD3(或TAA)分子结合,那么结论出试验抗体和参照的抗原结合分子竞争与CD3(或TAA)结合。所属领域的一般技术人员应了解,与参照的抗原结合分子竞争结合的抗体可能不一定与参照抗体相同的表位结合,但可能通过与重叠或相邻的表位结合,在立体上阻断参照抗体的结合。如果这一参照抗体是如文中所示例不具有可测量的结合,那么这一参照抗体可突变回生殖系序列,以便就比较表位相互作用,或与如文中所述的试验抗体比较其结合性质或阻断相互作用的目的,测定与CD3的结合。.
制备抗原结合区和建构双特异性分子
对具体抗原具特异性的抗原结合区可通过任何所属领域中已知的抗体生产技术来制备。一旦获得后,对两种不同抗原(例如CD3和TAA)具特异性的两种不同的抗原结合区可以相对彼此适合的排列使用常规方法,产生本发明的双特异性抗原结合分子。(可用于建构本发明双特异性抗原结合分子的示例的双特异性抗体模式的讨论提供于文中其它地方)。在某些实施例中,本发明的多特异性抗原结合分子的一个或多个个别组分(例如重链和轻链)来源于嵌合、人类化或全人类抗体。制造这些抗体的方法已是所属领域中众所周知。例如,可使用VELOCIMMUNETM技术制备一条或多条本发明双特异性抗原结合分子的重链和/或轻链。使用VELOCIMMUNETM技术(或任何其它人类抗体生产技术),起初先分离对具体抗原(例如CD3或TAA)具高亲和力的具有人类可变区和小鼠恒定区的嵌合抗体。将抗体定性并就所需的性质来选择,包含亲和力、选择性、表位等。以所需的人类恒定区置换小鼠恒定区产生可并入本发明双特异性抗原结合分子中的全人类重链和/或轻链。
基因工程动物可用于制造人类双特异性抗原结合分子。例如,可使用不能重排和表达内生性小鼠免疫球蛋白轻链可变序列的基因改造小鼠,其中小鼠仅表达一个或两个由人类免疫球蛋白序列操作上在内生性小鼠卡帕(κ)基因座连接小鼠卡帕(κ)轻链恒定基因所编码的人类轻链可变区。这一基因改造小鼠可用于制造包含连结相同轻链的两种不同重链的全人类双特异性抗原结合分子,所述轻链包含来源于两种不同人类轻链可变区基因片段其中一种的可变区。(就所述工程改造小鼠详细讨论和其于制造双特异性抗原结合分子的用途,请参见,例如US 2011/0195454)。本发明的抗体可包含与共同轻链结合的免疫球蛋白重链。这一共同轻链可来源于抗TAA重链的同源轻链,或来源于已知或公共区轻链可变区,而所述轻链可变区是来源于具有杂交或与各种非同源重链配对能力的轻链,即通用或共同轻链。本发明抗体可包含与单一重排轻链结合的免疫球蛋白重链。在某些实施例中,这一轻链可变区是来源于人类Vκ1-39基因段或Vκ3-20基因段。在其它的实施例中,这一轻链包含可变区,其是来源于经人类Jκ5或人类Jκ1基因段重排的人类Vκ1-39基因段,或经人类Jκ1基因段重排的Vκ3-20基因段,或经人类Jκ1重排的Vκ1-39基因段。
生物等效性
本发明涵盖具有与文中所公开的示例分子不同但保留与CD3和/或TAA结合能力的氨基酸序列的抗原结合分子。这些变异体分子,当与亲代序列相比较时,可以包含一个或多个氨基酸的添加、删除或取代,但具有与所述的双特异性抗原结合分子基本上相当的生物活性。
本发明包含与文中所述的任何示例性抗原结合分子为生物等效的抗原结合分子。两种抗原结合蛋白或抗体,如果例如其是医药同等物或医药替代品,当在类似的实验条件下以单一剂量或多剂量的相同的摩尔剂量给予时,其吸收速率和程度并无显示显著的差异,那么视为生物等效的。某些抗原结合蛋白如果其吸收程度相当但是吸收速率不同应可视为等效物或医药替代品,且仍可视为生物等效,因为这些吸收速率上的差异为故意的并反映在标示上,对于达到例如长期使用的有效体药浓度并非必要的,且就具体药物产品的研究上被视为无医疗上的显著性。
在一个实施例中,两种抗原结合蛋白如果在其安全性、纯度和效力上不具有临床上有意义的差异,那么是生物等效的。
在一个实施例中,如果相较于无这一变更的持续治疗,病患可在参照产品和生物产品间做一次或多次变更而无预期的有害作用的风险增加(包含临床上致免疫性的明显改变或效用减低),那么两种抗原结合蛋白是生物等效的。
在一个实施例中,如果两种抗原结合蛋白是通过共同的机制或作用机制作用于症状或所用症状,而达到这些机制已知的程度,那么这两种抗原结合蛋白是生物等效的。
生物等效性可通过活体内和活体外方法来验证。生物等效性测量包含,例如(a)人类或其它哺乳动物的活体内试验,其中测量血液、血浆、血清或其它生物体液中随时间变化的抗体或其代谢物浓度;(b)与人类活体内生物可利用性数据有相互关系和可合理预测这一数据的活体外试验;(c)人类或其它哺乳动物的活体内试验,其中测量随时间变化的抗体(或其目标)的适当急性药理效用;和(d)建立抗原结合蛋白的安全性、效力或生物可利用性或生物等效性的良好对照的临床试验。
文中所述的示例性双特异性抗原结合分子的生物等效变异体可通过,例如制造各种残基或序列的取代,或删除生物活性不需要的末端或内部残基或序列来建构。例如,生物活性不需要的半胱氨酸残基可删除或以其它的氨基酸置换,以防止因变性而形成不必要或不正确的分子内双硫桥。在其它内容中,生物等效的抗原结合蛋白可包含文中所述的示例性双特异性抗原结合分子的变异体,其包括修饰分子的糖基化特性的氨基酸改变,例如消除或移除糖基化的突变。
物种选择性和物种交叉反应
根据本发明的具体实施例,提供对人类CD3呈现微弱或无相互作用,以及对来自其它物种的CD3,例如猕猴CD3呈现微弱或无相互作用的抗原结合分子。还提供与人类TAA结合但不与其它物种TAA结合的抗原结合分子。本发明还包含与人类CD3和来自一种或多种非人类物种的CD3结合的抗原结合分子;和/或与人类TAA和来自一种或多种非人类物种的TAA结合的抗原结合分子。
根据本发明具体的示例性实施例,提供与人类CD3和/或人类TAA结合,以及可或不可与(视情况而定)一种或多种小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、猕猴、绒猴、恒河猴或黑猩猩CD3和/或TAA结合的抗原结合分子。例如,在本发明具体的示例性实施例中,提供包含与人类CD3和猕猴CD3微弱结合的第一抗原结合区和与人类人类PSMA、MUC16、EGFRvIII或STEAP2特异性结合的第二抗原结合区的双特异性抗原结合分子。
免疫接合物
本发明涵盖与疗效成分,例如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素接合的抗原结合分子(免疫接合物)。细胞毒性剂包含任何对细胞有害的试剂。用于形成免疫接合物的适合的细胞毒性剂和化疗剂实例已是所属领域中已知的(参见,例如WO 05/103081)。
治疗配制物和给药
本发明提供包含本发明的抗原结合分子的医药组合物。本发明的医药组合物是与适合的载剂、赋形剂和其它提供改善转移、递送、耐受性和类似性质的药剂所配制。许多适合的配制物可参见所有医药化学家已知的处方集:Remington′s PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。这些配制物包含,例如粉末、糊膏、软膏、软冻、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(例如LIPOFECTINTM,LifeTechnologies,Carlsbad,CA)、DNA接合物、无水吸收糊膏、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含碳蜡(carbowax)的半固体混合物。亦参见Powell等人″Compendium of excipients for parenteral formulations″PDA(1998)《医药科学技术杂志(J Pharm Sci Technol)》52:238-311。
给予病患的抗原结合分子剂量可依照病患的年龄和体型大小、目标疾病、症状、给药路径等而不同。优选的剂量典型地是根据体重或体表面积来计算。当本发明的双特异性抗原结合分子用于成人病患的治疗目的时,有利的一般可以静脉给予约0.01至约20mg/kg体重,更优选的约0.02至约7、约0.03至约5或约0.05至约3mg/kg体重的单一剂量的本发明双特异性抗原结合分子。依照症状的严重度,治疗的频率和作用期可调整。给予双特异性抗原结合分子的有效剂量和时程可依经验来决定;例如可以定期评估来监看病患进步,并据这一调整剂量。再者,物种间剂量的衡量可使用所属领域中常规的方法来进行(例如Mordenti等人,1991,《药物学研究(Pharmaceut.Res.)》8:1351)。
各种的递送系统已为所知并可用于给予本发明的医药组合物,例如包胶的微脂体、微粒、微胶囊、能表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见,例如Wu等人,1987,《生物化学杂志》262:4429-4432)。导入方法包含(但不限于)皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服路径。组合物可以任何方便的路径,例如以输注或团注、以经由上皮或粘膜层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收来给药,并可与其它生物活性剂共同给药。给药可为全身性或局部的。
本发明的医药组合物可以标准针或注射器由皮下或静脉内来递送。此外,就皮下递送来说,笔型递送装置可容易地用于递送本发明的医药组合物。这一笔型递送装置可以是重复使用型或抛弃型。可重复使用的笔型递送装置一般是利用含有医药组合物的可更换补充匣。一旦匣内的所有医药组合物给予后而补充匣变空,这一空匣可容易丢弃并更换新的含医药组合物的补充匣。然后这一笔型递送装置便可再使用。在抛弃型笔型递送装置中无可置换的补充匣。取而代之的,抛弃型笔型递送装置是预先填充医药组合物收藏在装置内的储槽中。一旦医药组合物的储槽变空,整个装置便可丢弃。
许多可重复使用的笔型和自动注射器递送装置已应用于皮下递送本发明的医药组合物。实例包含(但不限于)AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I、II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(NovoNordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany),仅提出一些。用于皮下递送本发明医药组合物的抛弃型笔型递送装置的实例包含(但不限于)SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(EliLilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM笔(Abbott Labs,Abbott Park IL),仅提出一些。
在具体的情况下,医药组合物可以控制释放系统来递送。在一个实施例中,可使用泵(参见Langer,前文;Sefton,1987,《生物医药工程评论(CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.)》14:201)。在另外的实施例中,可使用聚合物质;参见《控制释放的医药应用(MedicalApplications of Controlled Release)》,Langer和Wise(编),1974,CRC Pres.,BocaRaton,Florida。在另外的实施例中,控制释放系统可放置在靠近组合物的目标处,因此仅需要全身剂量的一部分(参见,例如Goodson,1984,《控制释放的医药应用》,见上文,第2卷,第115-138页)。其它的控制释放系统讨论于Langer,1990,《科学》249:1527-1533的评论中。
可注射的制备物可包含用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、点滴输注等的剂型。这些可注射制备物可由公开已知的方法来制备。例如,可注射制备物可,例如通过将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于注射上常规的无菌水性媒剂或油性媒剂中来制备。注射用的水性媒剂有,例如生理食盐水、含葡萄糖和其它佐剂的等张溶液等,其可与适合的增溶剂例如醇(例如乙醇)、多醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子介面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚环氧乙烷(50摩尔)加合物)]等组合使用。油性媒剂,可使用芝麻油、大豆油等,其可与增溶剂例如苯甲酸苯甲基酯、苯甲醇等组合使用。由此制备的注射液优选地填充于适当的安瓶中。
有利地,上述的口服或非经肠用途的医药组合物是制备成适合活性成分剂量的单位剂型。这些单位剂量的剂型包含,例如锭剂、片剂、胶囊、注射剂(安瓶)、栓剂等。所含的前述抗体的量一般每单位剂量的剂型是约5到约500毫克;特别是注射形式,优选的前述抗体含有约5到约100毫而其它剂型是约10到约250毫克。
抗原结合分子的治疗用途
本发明包含于有这一需要的患者中给予包含与CD3微弱结合或与CD3无可检测结合并与肿瘤相关抗体结合的抗肿瘤抗体或其抗原结合片段或双特异性抗原结合分子的治疗组合物的方法。这一治疗组合物可包含任何文中所公开的抗体或双特异性抗原结合分子以及医药学上可接受的载剂或稀释剂。如文中所用,“有这一需要的患者”一词指具有一种或多种癌症的症候或适应症的人类或非人类动物(例如表达肿瘤或患有任何下文所指的癌症的患者),或另外可从抑制或降低肿瘤活性或去除肿瘤细胞(例如PSMA++前列腺癌细胞)而得利的患者。
本发明的抗体和双特异性抗原结合分子(和包含这些物质的治疗组合物)可用于,其中包含,治疗其中刺激、活化和/或以免疫反应为目标应为有利的疾病或病症。具体地说,本发明的双特异性抗原结合分子可用于治疗、防止和/或改善任何与表达TAA,例如PSMA表达或活性的细胞或PSMA+细胞增殖有关或由其所介导的疾病或病症。实现本发明治疗方法的作用机制包含在效应细胞的存在下杀死表达肿瘤相关抗原的细胞,例如,通过CDC、细胞凋亡、ADCC、吞噬作用或通过两种或多种这些机制的组合或类似的细胞毒性机制。可使用本发明的双特异性抗原结合分子抑制或杀死的表达肿瘤相关抗原例如PSMA、MUC16、STEAP2或EGFRvIII的细胞,包含,例如前列腺癌细胞。
本发明的抗原结合分子可用于治疗,例如发生于脑和脑膜、头和颈、口咽、肺和支气管树、胃肠道、男性和女性生殖道、肌肉、骨骼、皮肤和附属件、结缔组织、脾、免疫系统、造血细胞和骨髓、肝和泌尿道、肾、膀胱和/或具体的感官器官例如眼睛的原生和/或转移肿瘤。在某些实施例中,本发明的双特异性抗原结合分子可用于治疗一种或多种(但不限于)下列癌症:胰脏癌、头颈癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、大肠直肠癌、胃癌(例如带有MET增幅的胃癌)、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、滑液肉瘤、甲状腺癌、乳癌、胶质母细胞瘤、乳癌(例如乳管和乳管内乳癌)、鳞状细胞癌、食道癌、透明细胞肾细胞癌、嫌色性肾细胞癌、(肾)嗜酸粒细胞瘤、(肾)移行细胞癌、泌尿上皮癌、(膀胱)腺癌,或(膀胱)小细胞癌。根据本发明的具体实施例,这一双特异性抗体可用于治疗患有难处理或难治型癌症的病患,例如去势疗法阻抗的前列腺癌。根据本发明的示例性实施例,提供包含将如文中所公开的抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子给予患有去势疗法阻抗的前列腺癌病患的方法。所属领域中已知的分析/诊断方法,例如肿瘤扫描可用于确认患者是否具有去势疗法阻抗的肿瘤。
本发明还包含于患者中治疗残余癌的方法。如文中所用,术语“残余癌”指以抗癌疗法,例如第一线或标准疗法治疗后,在患者中存在或持续留有一个或多个癌细胞。
根据具体方面,本发明提供治疗与TAA表达有关的癌症(例如与PSMA表达或STEAP2表达有关的前列腺癌、与EGFRvIII表达有关的胶质母细胞瘤,或与MUC16表达有关的卵巢癌)的方法,其包含在患者经测定患有癌症后,将一种或多种文中其它地方所述的双特异性抗原结合分子给予所述患者。例如,本发明包含治疗前列腺癌的方法,其包含在病患已接受先前的治疗后1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周、2个月、4个月、6个月、8个月、1年或更久,将抗CD3/抗TAA双特异性抗原结合分子给予所述病患。
组合治疗和配制物
本发明提供包含将包括文中所述的任何示例性抗体和双特异性抗原结合分子的医药组合物与一种或多种另外的治疗剂组合给药的方法。可与本发明的抗原结合分子组合或组合给药的示例性另外的治疗剂包含,例如抗计划性死亡1抗体(例如美国专利申请案公开案第US2015/0203579A1号中所述的抗PD1抗体)、抗计划性死亡1配体(例如美国专利申请案公开案号第US2015/0203580A1号中所述的抗PD1抗体)抗、EGFR拮抗剂(例如抗EGFR抗体[例如,西妥昔单抗(cetuximab)或帕尼单抗(panitumumab)]或EGFR的小分子抑制剂[例如,吉非替尼(gefitinib)或厄洛替尼(erlotinib)]),另外的EGFR家族成员的拮抗剂,例如Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4(例如抗ErbB2、抗ErbB3或抗ErbB4抗体或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性的小分子抑制剂),EGFRvIII的拮抗剂(例如与EGFRvIII特异性结合的抗体),cMET拮抗剂(例如抗cMET抗体),IGF1R拮抗剂(例如抗IGF1R抗体),B-raf抑制剂(例如威罗菲尼(vemurafenib)、索拉非尼(sorafenib)、GDC-0879、PLX-4720),PDGFR-α抑制剂(例如抗PDGFR-α抗体),PDGFR-β抑制剂(例如抗PDGFR-β抗体),VEGF拮抗剂(例如VEGF-Trap,参见例如US 7,087,411(文中也称为“VEGF-抑制融合蛋白”)、抗VEGF抗体(例如贝伐单抗(bevacizumab))、VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)或帕唑帕尼(pazopanib))、DLL4拮抗剂(例如公开于US 2009/0142354中的抗DLL4抗体)、Ang2拮抗剂(例如公开于US 2011/0027286中的抗Ang2抗体,例如H1H685P)、FOLH1拮抗剂(例如抗FOLH1抗体)、PRLR拮抗剂(例如抗PRLR抗体)、STEAP1或STEAP2拮抗剂(例如抗STEAP1抗体或抗STEAP2抗体)、TMPRSS2拮抗剂(例如抗TMPRSS2抗体)、MSLN拮抗剂(例如抗MSLN抗体)、CA9拮抗剂(例如抗CA9抗体)、尿溶蛋白拮抗剂(例如抗尿溶蛋白抗体)等。可有利地与本发明的抗原结合分子组合的其它试剂包含细胞激素抑制剂,其包含小分子细胞激素抑制剂以及与细胞激素,例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18或其个别受体结合的抗体。本发明的医药组合物(例如包含如文中所公开的抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子的医药组合物)也可以作为包含一个或多个治疗组合的疗法的部分来给药,而所述治疗组合是选自“ICE”:异磷酰胺(ifosfamide)(例如)、卡铂(carboplatin)(例如)、依托泊苷(etoposide)(例如VP-16);“DHAP”:地塞米松(dexamethasone)(例如)、阿糖胞苷(cytarabine)(例如阿糖胞苷(cytosinearabinoside)、ara-C)、顺铂(cisplatin)(例如-AQ);和“ESHAP”:依托泊苷(例如VP-16)、甲泼尼龙(methylprednisolone)(例如)、高剂量阿糖胞苷、顺铂(例如-AQ)。
本发明还包含包括文中所提及的任何抗原结合分子与一种或多种下列抑制剂的治疗组合:VEGF、Ang2、DLL4、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFRvIII、cMet、IGF1R、B-raf、PDGFR-α、PDGFR-β、FOLH1(PSMA)、PRLR、STEAP1、STEAP2、TMPRSS2、MSLN、CA9、尿溶蛋白或任何前述的细胞激素,其中所述抑制剂是适体、反义分子、核糖酶、siRNA、肽体、纳米抗体或抗体片段(例如Fab片段;F(ab′)2片段;Fd片段;Fv片段;scFv;dAb片段;或其它工程改造分子,例如二抗体、三抗体、四抗体、微抗体和最小识别单元)。本发明的抗原结合分子也可以与抗病毒剂、抗生素、镇痛剂、皮质类固醇和/或NSAID组合给药和/或共配制。本发明的抗原结合分子也可以作为同时包含放射线治疗和/或常规化疗的治疗疗法的部分来给药。
另外的治疗活性组分可在给予本发明抗原结合分子之前、同时或之后不久给药(就本公开文的目的,这些给药疗法被视为本发明的抗原结合分子与另外的治疗活性组分“组合”给药)。
本发明包含其中本发明的抗原结合分子与一种或多种如文中其它地方所述的另外的治疗活性组分共配制的医药组合物。
给药疗法
根据本发明的具体实施例,可于定义的时程将多剂量的抗原结合分子(例如抗TAA双特异性抗原结合分子)给予患者。根据本发明这一方面的方法包含先后将多剂量的本发明抗原结合分子给予患者。如文中所用,“先后给药”指各剂量的抗原结合分子是在不同的时间点给予所述患者,例如以预计的间隔隔开的不同天(例如小时、天、周或月)。本发明包含,包括将单一起始剂量的抗原结合分子先后给予病患,接着一个或多个第二剂量的抗原结合分子和视需要接着一个或多个第三剂量的抗原结合分子的方法。
术语“起始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”指给予本发明抗原结合分子的暂时顺序。因此,“起始剂量”是治疗疗法开始时所给予的剂量(也称为“基线”剂量);“第二剂量”是在起始剂量的后所给予的剂量;而“第三剂量”是在第二剂量的后所给予的剂量。起始、第二和第三剂量皆可含有相同量的抗原结合分子,但就给药的频率来说,一般可彼此不同。在某些实施例中,然而,包括在起始、第二和/或第三剂量中的抗原结合分子的量,在治疗期间可互不相同(例如,如果适当,经上调或下调)。在某些实施例中,是在治疗疗法开始时给予两个或更多个(例如2、3、4或5个)剂量作为“承载剂量”,接着以较低频率为基础,给予后续剂量(例如“维持剂量”)。
在本发明示例性的实施例中,各第二和/或第三剂量是在紧接前面剂量之后的1到26周(例如1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2周或更久)给药。“紧接前面剂量”一词,如文中所用,是指在多重给药的顺序中,抗原结合分子的剂量,在每个相邻接的剂量给药之前是以无插入剂量的顺序给药。
根据本发明这一方面的方法可包含将任何数目的第二和/或第三剂量的抗原结合分子(例如抗TAA双特异性抗原结合分子),给予病患。例如,在某些实施例中,仅将单一的第二剂量给予所述病患。在其它实施例中,将两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第二剂量给予所述病患。同样地,在某些实施例中,仅将单一的第三剂量给予所述病患。在其它实施例中,将两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第三剂量给予所述病患。
在涉及多重第二剂量的实施例中,各第二剂量可与其它第二剂量相同的频率来给药。例如,各第二剂量可在紧接前面剂量后1到2周,给予所述病患。同样地,在涉及多重第三剂量的实施例中,各第三剂量可与其它第三剂量相同的频率来给药。例如,各第三剂量可在紧接前面剂量后2到4周,给予所述病患。另一种选择,给予病患的第二和/或第三剂量的频率,在治疗疗法期间可不同。在治疗期间,给药频率也可以依照个别病患的需求在临床检查后由医师做调整。
实例
提出下列实例以提供所属领域的一般技术人员如何制造和使用本发明方法和组合物的完整公开和说明,但不希望限制发明人所认为的发明范围。虽已尽力确保所用的相关数字(例如量、温度等)的正确性,但仍应考量某些实验误差和偏差。除非另有指出,否则份数是重量份,分子量是平均分子量,温度是以摄氏度表示,而压力是或接近大气压。
实例1:产生抗CD3抗体
下列制程是以鉴定特异性识别CD3(T细胞共受体)作为抗原的抗体为目标。
通过让基因改造小鼠产生免疫力衍生抗CD3抗体池。简单地说,将经基因改造而表达逆向嵌合(人类可变区,小鼠恒定区)和免疫球蛋白重链结合单一重排轻链(例如Vκ1-39/J或Vκ3-20/J)的小鼠以CD3抗原产生免疫力,并产生包含多样人类VH重排用以表达多样指令的高亲和力抗原-特异性抗体的B细胞。在主体申请书中所述的具体示例性抗体是经重组制造并表达相同的Vκ1-39JK5轻链序列(SEQ ID NO:162所述的LCVR),而其它重组制造的抗体是表达重链臂之一(例如肿瘤目标臂)的同源轻链。
将产生的抗体以活体外结合分析就对人类和猕猴CD3抗原的亲和力进行检测,和例如CD3抗体:鉴定出命名CD3-VH-P(SEQ ID NO:154中所示的HCVR),其中发现,如分别Jurkat细胞和猕猴T细胞的FACS滴定所测,是以介于1到40nM亲和力(+++)的EC50与人类和猕猴CD3结合。参见,例如下文实例4中所概述的FACS结合实验。
随后鉴定出CD3-VH-P的生殖系氨酸残基和将命名为“CD3-VH-G”的抗体进行工程改造而仅含有生殖区的框架。以生殖系序列和CD3-VH-P序列间的差异为基础,以逐步的方式通过常规的分子生物选殖技术置换氨基酸残基,将其它的抗体衍生物进行工程改造。各抗体衍生物给予“CD3-VH-G”编号命名。参见表1和图1。
制备双特异性抗体,其包含来源于具有如表1所示的命名和说明的工程改造抗CD3抗体的第一结合臂,以及来源于抗TAA抗体的第二结合臂,并对带有CD3的细胞的单价亲和力以FACS分析进行检测(例如实例4中所述)。这些双特异性抗体的单价结合亲和力结果如表1中右边两栏所示。在某些实施例中,具有TAA-结合臂和CD3-结合臂的双特异性抗体分别命名为“CD3-VH-G”、“CD3-VH-G5”和“CD3-VH-G20”,结合的Jurkat细胞EC50分别是2.7E-08、不可检测的结合和5.5E-07。
表1:以生殖系序列和各工程改造抗体的对应FACS结合亲和力为基准的CDR突变
*以7221G(CD3-VH-G)成熟蛋白为基础的序列编号
如FACS分析中所见,当CD3-VH-G和某些其它工程改造抗体保留其结合亲和力时,数种抗CD3抗体在活体外以微弱(+/-)到不可检测的(-)的亲和力与人类或猕CD3结合。随后对包含依照本实例方法所产生的示例抗CD3的双特异性抗体调查用以阐明细胞毒性和药物动力学(pK)性质的结合亲和力、结合动力学和其它生物性质,并详述于下文所列的实例中。
实例2:重链和轻链可变区(CDR的氨基酸和核酸序列)
测定各抗体重链序列的氨基酸和核酸序列。各抗体,是生殖系序列IGHV3-9*01/D5-12*01/J6*02(SEQ ID NO:181)的衍生物,指定“G”编号名称作为一致的命名。表2列出本发明工程改造的抗CD3抗体的重链可变区和CDR的氨基酸序列识别码。对应的核酸序列识别码列于表3中。建构各重组抗体的轻链可变区和CDR的氨基酸和核酸序列识别码也分别确认于下表4和5中。
表2:重链氨基酸序列识别码
表3:重链核酸序列识别码
表4:轻链氨基酸序列识别码
表5:轻链核酸序列识别码
对照1抗体定名为“CD3-L2K”是以已知的抗CD3抗体(即如WO2004/106380中所述的抗CD3抗体“L2K”)所建构。
同型对照抗体,就下文的实例来说,是符合与不相关抗原,即FelD1抗原相互作用的抗体的同型(修饰的IgG4)。
实例3:产生与CD3和肿瘤相关抗原(TAA)结合的ULC双特异性抗体
使用标准分子生物法,利用来自文中所述的抗CD3抗体的重链、来自抗TAA抗体的重链和共同轻链或通用轻链(ULC),建构包含抗CD3-特异性结合区和抗TAA-特异性结合区,例如PSMA、EGFRvIII、MUC16或STEAP2的双特异性抗体。用于建构本发明双特异性抗体的抗TAA抗体是通过让基因改造小鼠产生免疫所得来。
依照这一实例所制造的各种双特异性抗体的抗原结合区组分部分的汇整系列于下表6、7和8中。所有的双特异性抗体是经制造而具有2014年8月28日公开的美国专利申请公开案第US20140243504A1号中所述的修饰(嵌合的)IgG4 Fc区。示例的EGFRvIIIxCD3双特异性抗体可使用美国专利申请公开案第US20150259423号中(其以全文引用的方式并入)所讨论的任何EGFRvIII抗体的任何重链和轻链可变区(或CDR),与文中所讨论的任何抗CD3抗体的可变区或CDR组合来制备。
表6:建构PSMAxCD3双特异性抗体
表7:建构EGFRvIII xCD3双特异性抗体
表8:建构MUC16xCD3双特异性抗体
表9:建构STEAP2xCD3双特异性抗体
将各示例的双特异性抗体以各种下文所述的生物分析进行检测。
实例4:如FACS分析所测的示例的双特异性抗体的结合亲和力
在这一实例中,经由FACS测定CD3xTAA双特异性抗体与人类和猕猴CD3-表达细胞株结合的能力。另外,还确认这些双特异性抗体与目标特异性(TAA-特异性)细胞株结合的能力。如上所述,本发明各种双特异性抗体利用单一TAA-特异性结合臂(PSMA、EGFRvIII、MUC16或STEAP2;参见实例3表6、7和8)与一组抗CD3结合臂(参见上文实例1和2)和共同轻链配对。如实例5中所示,经由表面等离子共振,CD3xTAA双特异性抗体对人类可溶性异源二聚体hCD3ε/δ.mFc蛋白呈现一定范围的亲和力。
简单地说,将2×105个细胞/孔的人类CD3-表达Jurkat、猕猴T或TAA-特异性表达细胞以连续稀释的双特异性抗体于4℃培养30min。培养后,清洗细胞并将山羊F(ab′)2抗人类FcγPE标定的二级抗体(Jackson Immunolabs)加到细胞中再历经30min。随后,清洗细胞,再悬浮于冷的PBS+1%BSA中并经由流式细胞仪于BD FACS Canto II上分析。
就FACS分析,通过前散射高度对前散射面积针对单一事件选择把关细胞,接着侧散射和前散射。使用PRISMTM软件(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)测定细胞结合滴定的EC50。使用4-参数非线性回归分析计算数值。
表10A:CD3和PSMA-特异性细胞株上的FACS结合
表10B:CD3和EGFRvIII-特异性细胞株上的FACS结合
表10C:CD3和MUC16-特异性细胞株上的FACS结合
如表10A中所示,各CD3xPSMA双特异性抗体的CD3结合臂对人类CD3表达Jurkat细胞呈现一定范围的细胞结合亲和力(15到300nM EC50范围)。重要的是,经由表面等离子共振,对人类CD3异源二聚体蛋白显现微弱到无结合的CD3臂(参见下文表11)也与Jurkat细胞上(即CD3-VH-G2、CD3-VH-G3、CD3-VH-G5)微弱-到-不可检测的结合相关联。不可检测的结合,在FACS分析或等同的分析中指抗体与其目标抗原间的亲和力超出分析的检测极限以外(例如>1μM)。数种CD3-结合臂也对猕猴T细胞显现交叉反应性。所有检测的双特异性抗体在个别的PSMA、EGFRvIII和MUC16-表达细胞株上呈现类似的细胞结合,其确认了与个别CD3臂的双特异性配对不会影响或减少TAA-特异性结合(在所有检测的实例中,TAA特异性结合低于或等于5.6nM(高亲和力))。
对人类CD3呈现微弱到无结合以及对猕猴CD3呈现微弱到无结合的抗体,依照本发明,就亲和力驱动的双特异性配对被视为有利的,并进一步以活体外和活体内分析检测细胞毒性。
实例5:以表面等离子共振结合分析所测的示例抗体的结合亲和力
通过表面等离子共振于37℃使用抗原-捕捉模式(表11)或抗体捕捉模式(数据未显示)测定抗TAA x抗CD3双特异性抗体对可溶性二聚体hCD3ε/δ.mFc蛋白(hCD3ε=UniProtKB/Swiss-Prot:P07766.2;SEQ_ID NO:169;hCD3δUniProtKB/Swiss-Prot:P04234.1,SEQ ID NO:170)的结合亲和力和动力学常数。在这一实例中,利用BSPSMA/CD3双特异性抗体作为这些配对,其代表更广泛用于CD3结合臂的抗体组的用途。测量是在SierraSensors MASS-1仪器上进行。
在抗原捕捉模式中,以山羊抗小鼠IgG2a多株抗体(Southern Biotech)将MASS-1高密度胺感测器表面衍生化。捕捉可溶性二聚体CD3蛋白并将个别抗体注射至捕捉的抗原上。
通过使用MASS-1 AnalyserR2曲线拟合软件处理并将数据与1∶1结合模型拟合,测定动力学结合(ka)和解离(kd)速率常数。从动力学速率常数计算结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)为:KD(M)=kd/ka;和t1/2(min)=(1n2/(60×kd)。
表11:抗CD3双特异性抗体对可溶性人类CD3的亲和力
NB:未检测到结合
如表11中所示,在表面等离子共振结合分析中,所有衍生的抗CD3x抗PSMA双特异性抗体对可溶性CD3维持非常微弱的结合,具有大于11nM到334nM的KD值,其比来源于生殖系框架CD3-VH-G的双特异性抗CD3臂更弱的值。
数种双特异性抗体呈现大于50nM KD值,且某些大于100nM(>1×10-7)KD值(即BSPSMA/CD3-900、BSPSMA/CD3-1000、BSPSMA/CD3-1900),大于300nM(>3x10-7)KD值(即BSPSMA/CD3-005)和甚至超出分析的检测极限(>500nM;>5×10-7),即对可溶性人类CD3显示不可检测的结合(即BSPSMA/CD3-200、BSPSMA/CD3-300、BSPSMA/CD3-400、BSPSMA/CD3-004和BSPSMA/CD3-1800)。
实例6:如活体所测量,本发明的双特异性抗体呈现T细胞活化和肿瘤特异性细胞毒性
在这一实例中,在CD3为基础的双特异性抗体存在下经由流式细胞仪监测PSMA、EGFRvIII或MUC16-表达的TAA目标细胞的特异性杀死。如先前报道,这些双特异性抗体对CD3蛋白和CD3-表达细胞株呈现一定范围的亲和力(即微弱、中度和强力结合)。以相同的双特异性抗体组就诱导初始T人类细胞将杀死再导向目标表达细胞的能力进行检测。
简单地说,将PSMA-表达(C4-2、22Rv1和TRAMPC2_PSMA)、EGFRvIII-表达(U87/EGFRvIII)或MUC16-表达(OVCAR3)的细胞株以1μM的荧光追踪染剂Violet Cell Tracker标定。标定后,于37℃植入细胞过夜。分开地,将人类PBMC以1×106个细胞/mL植入补充的RPMI培养基并于37℃培养过夜以便通过排除粘附的巨噬细胞、树突细胞和一些单核细胞来增丰淋巴细胞。隔天,将目标细胞与粘附细胞排除的初始PBMC(效应子/目标细胞4∶1比率)和连续稀释的相关双特异性抗体或同型对照(浓度范围:66.7nM到0.25pM)于37℃共培养48小时。使用无酶的细胞解离缓液从细胞培养盘移出细胞并以FACS分析。
就FACS分析,将细胞以死/活远红细胞追踪剂(far red cell tracker)(Invitrogen)染色。就在FACS分析前将5×105计数微珠加到各孔槽中。各样品收集1×104个微珠。就杀死特异性的评估,细胞以活的Violet标定群族为门控。记录活群族的百分比并用于计算正常化存活。
T细胞活化是通过将细胞以直接接合CD2和CD69的抗体培养,并通过提出总T细胞(CD2+)中活化的(CD69+)T细胞百分比来评估。
如表12A-12C的结果所示,观察到抗PSMA、EGFRvIII或MUC16xCD3双特异性抗体消除了TAA-表达细胞。大部分检测的双特异性抗体以皮摩尔范围的EC50活化人类T细胞并导向消除目标细胞。另外,所观察到的目标细胞解离(消除)与CD2+ T细胞上的CD69细胞上调有关,具有皮摩尔(pM)EC50。
重要的是,这一实例的结果验证了数种利用CD3结合臂的双特异性抗体其对CD3蛋白或CD3-表达细胞(即CD3-VH-G5)呈现微弱-到-不可检测的结合,但仍保留活化T细胞的能力和呈现强力的肿瘤抗原表达细胞的细胞毒性。
表12A:选出的PSMAxCD3双特异性抗体的细胞毒性和T细胞活化特性
NT=未检测
表12B:选出的EGFRvIIIxCD3双特异性抗体的细胞毒性和T细胞活化特性
表12C:选出的MUC16xCD3双特异性抗体的细胞毒性和T细胞活化特性
实例7:抗PSMA/抗CD3双特异性抗体呈现强力的活体内抗肿瘤功效
为了测定经鉴定对人类和猕猴CD3具有微弱或不可检测的结合亲和力的示例抗PSMA/抗CD3双特异性抗体的功效,于带有人类前列腺癌异种移植物的免疫胜任型小鼠中进行研究。也于经基因改造表达人类PSMA的带有小鼠前列腺癌异种移植物的免疫活性小鼠中进行另外的研究。
抗PSMA/抗CD3双特异性抗体在人类肿异种移植模型中的功效
为了评估抗PSMA/抗CD3双特异性抗体在活体内人类肿瘤异种移植研究中的功效,将NOD scidγ(NSG)小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)与人类周边血液单核细胞(PBMC)以及内生性表达PSMA的22Rv1或C4-2人类前列肿瘤细胞共移植。
简单地说,将4×106个22Rv1或5×106C4-2细胞(MD Anderson,TX)以皮下(s.c.)与1×106个人类PBMC(ReachBio,LLC.,Seattle,WA)以50∶50的基质胶基质膜(matrigelmatrix)(BD Biosciences)混合物共植入雄性NSG小鼠的右腹。在C4-2研究中,于肿瘤移植后第0、4和7天以腹腔注射(i.p.)0.1mg/kg BSPSMA/CD3-003或BSPSMA/CD3-005治疗。
在另外的异种基因模型中,抗PSMA/抗CD3双特异性抗体是于植入人类造血CD34+干细胞的小鼠中进行检测。简单地说,将新生的SIRPαBALB/c-Rag2-IL2rγ-(BRG)幼鼠植入上hCD34+胎肝细胞。3-6个月后,将hCD34-植入的SIRPαBRG小鼠以C4-2细胞(基底胶中5×106皮下)移植。8天后以10μg的BSPSMA/CD3-004或同型对照抗体治疗,接着在整个研究以2次/周给药。
在所有的研究中,使用游标尺每周2次测量肿瘤大小且肿瘤体积计算为体积=(长×宽2)/2。
如表13的结果所示,以上述异种基因模型所检测的双特异性抗体在抑制肿生长上,相较于以同形对照治疗者,全部皆是有效的。
表13:通过给予抗PSMA/抗CD3双特异性抗体于异种基因小鼠模型,抑制肿瘤生长
抗PSMA/抗CD3双特异性抗体在免疫活性肿瘤模型中的功效
另外,于免疫活性模型中评估抗PSMA/抗CD3双特异性抗体的抗肿瘤活性(2014年11月24日申请的美国临时申请案第62/083,653号)。将三条CD3链(δγε)人类化的小鼠也对PSMA人类化并植入以人类PSMA转染的变异体鼠科前列腺癌细胞株TRAMP-C2。
在研究开始前,先产生致肿瘤细胞株变异体TRAMP-C2_hPSMAv#1。简单地说,将7.5×106个TRAMP-C2_hPSMA细胞以皮下植入CD3和PSMA人类化的雄性小鼠右腹。割下肿瘤并切成3mm片段和随后植入新的雄性人类化小鼠右腹。然后收取由植入的肿瘤片段所诱导的肿瘤并研碎成单一细胞悬浮液。然后在G418选择下于活体外培养这些细胞(TRAMP-C2_hPSMAv#1)。然后将4×106个这一变异体细胞株植入雄性PSMA/CD3人类化小鼠的右腹进行双特异性抗体功效研究。
从肿瘤移植当日开始,以100μg或10μg的抗PSMA/抗CD3双特异性抗体BSPSMA/CD3-004或同型对照,每周2次治疗植入TRAMPC2_hPSMAv#1的人类化PSMA/CD3小鼠。还检验注射4h后的血清细胞激素量,以及脾T细胞量。研究在第27天终止。
如表14中的结果所示,所检测的抗PSMA/抗CD3双特异性抗体分子BSPSMA/CD3-004,就整个治疗组在明显延迟肿瘤生长上显示功效。在给予BSPSMA/CD3-004后观察到最小的细胞激素释放,可能是由于抗CD3的微弱的结合。在未排除脾中T细胞下,两种检测抗体显示抗肿瘤功效。
表14:抗PSMA/抗CD3双特异性抗体在免疫活性同基因模型中的功效
*小鼠是由肿瘤植入当天开始以抗体或同型对照2次/周给药
#测量活的mCD45+细胞中脾的CD4+或CD8+细胞的百分比
总体说来,本发明的抗PSMA/抗CD3双特异性抗体,尽管对CD3抗原具有低到不可检测的结合,其在两个免疫胜任型肿瘤模型中呈现强力的抗肿瘤功效。
实例8:抗MUC16/抗CD3双特异性抗体呈现活体内强力的抗肿瘤功效
为了测定经鉴定对人类和猕猴CD3具有微弱或不可检测的结合亲和力的示例抗MUC16/抗CD3双特异性抗体的功效,于带有人类前列腺癌异种移植物的免疫胜任型小鼠中进行研究。也在立即治疗和治疗性给药治疗两种模型中检测选出的双特异性抗体的功效。
抗MUC16/抗CD3双特异性抗体在人类肿异种移植模型中的功效
为了评估抗MUC16/抗CD3双特异性抗体在人类肿瘤异种移植研究中的功效,系将NOD scidγ(NSG)小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)先以人类周边血液单核细胞(PBMC;ReachBio LLC.,Seattle,WA)移植,和然后将来自人类卵巢癌细胞株OVCAR-3(American Type Tissue Culture,Manassas,VA)的具体腹水细胞以荧光素酶(OVCAR-3/Luc)转导。OVCAR-3细胞系内生性表达MUC-16。
简单地说,将NSG小鼠以腹膜内注射(i.p.)5.0×106个人类PBMC。8天后,将1.5×106个先前于活体内传代的OVCAR-3/Luc细胞株的腹水细胞以腹膜内注射给予至植入PBMC的SG小鼠。在立即治疗组中,小鼠在OVCAR-3/Luc细胞移植当天以10微克/小鼠剂量的MUC16/CD3双特异性抗体BSMUC16/CD3-001或BSMUC16/CD3-005或同型对照由腹膜内注射治疗(N=5只小鼠/治疗组)。在治疗性给药模型中,小鼠在肿瘤移植后7天以10微克/小鼠剂量的MUC16/CD3双特异性抗体或对照抗体由腹膜内注射治疗(N=5只小鼠/治疗组)。
在所有的研究中,经由生物冷光造影(BLI)来监测肿瘤生长。将小鼠以腹膜内注射注射悬浮于PBS(150mg/kg)中的荧光素酶基质D-荧光素并在10min.后于异氟烷(isoflurane)麻醉下进行造影。BLI是使用Xenogen IVIS系统(Perkin Elmer,Hopkinton,MA)来进行,和使用Living Image软件(Xenogen/Perkin Elmer)来提取BLI信号。在各细胞群周围划出感兴趣区域并记录光子强度为光子(p)/秒(s)/平方厘米/球面度(sr)。就立即治疗组,数据显示肿瘤移植后26天的BLI量(表15)。就治疗性治疗组,数据显示介于第6天(治疗1天后)和研究结束(肿瘤移植后26天;表16)之间的BLI倍数变化。
如结果所示,在立即给药模型中,当于第26天测量BLI时,BSMUC16/CD3-001和BSMUC16/CD3-005在抑制肿瘤生长上,相较于同型对照,显示类似的功效。两种抗MUC16/抗CD3双特异性抗体当于肿瘤移植后7天给药时,相较于对照组,也抑制已建立肿瘤的生长。总体说来,本发明的双特异抗MUC16/抗CD3抗体在数种模型中呈现强力的抗肿瘤功效。
表15:在免疫胜任型异种移植模型中抗MUC16/抗CD3双特异性抗体的功效:立即给药
表16:在免疫胜任型异种移植模型中抗MUC16/抗CD3双特异性抗体的功效:治疗性治疗
实例9:抗MUC16x CD3双特异性抗体的药物动力学评估
抗MUC16x CD3双特异性抗体BSMUC16/CD3-001和BSMUC16/CD3-005以及同型对照的药物动力学评估是在人类化MUC16x CD3小鼠(人类MUC16和CD3表达同型接合的小鼠MUC16hu/hux CD3hu/hu)、CD3人类化小鼠(人类CD3表达的同型接合小鼠CD3hu/hu)和品系相配(75%C57BL,25%129Sv)野生型(WT)小鼠中进行。各组每种试验抗体和每种小鼠品系含有4-5只小鼠。所有的小鼠系接受单一腹膜内(i.p.)0.4mg/kg剂量。于给药后3和6小时,1、3、7、14和28天收集血液样品。将血液处理成血清并冷冻于-80℃直到分析。
循环的抗体浓度是通过总人类IgG抗体分析使用GyroLab xPloreTM(Gyros,Uppsala,Sweden)来测定。简单地说,将生物素化的山羊抗人类IgG多株抗体(JacksonImmunoResearch,West Grove,PA)捕捉至Gyrolab Bioaffy 200CD(Gyros)上涂覆链霉亲和素(streptavidin)的微珠,用以捕捉存在血清中的人类IgG。在亲和管柱捕捉后,以Alexa-647标定的山羊抗人类IgG(Jackson ImmunoResearch)检测样品中结合的人类IgG抗体。实现检测结合的IgG的管柱上的荧光信号和反应单位(RU)是通过这一仪器读取。以内插法从使用Gyrolab Evaluator软件使用5-参数逻辑曲线拟合的标准曲线,测定样品浓度。
PK参数是通过非模室分析(NCA)使用软件Version 6.3(Certara,L.P.,Princeton,NJ)和血管外给药模型来测定。使用各抗体的个别的平均浓度值,所有的PK参数,包含观察到的血清中最大浓度(Cmax)、观察到的预估半衰期(t1/2)和浓度对时间曲线下的面积到最后一次可测量浓度(AUClast)是使用线性梯型法则以线性内插和均匀加权所测定。
在WT小鼠中腹膜内给予抗体后,BSMUC16/CD3-001、BSMUC16/CD3-005和同型对照的总IgG浓度-时间概况皆是类似的,其特征首先是简短药物分布,接着贯穿剩余研究的单一药物消除。将最大血清浓度(Cmax)和三种抗体的理论的药物暴露(AUClast)作比较(相互在1.3倍内)。在CD3hu/hu小鼠中腹膜内给予抗体后,BSMUC16/CD3-001、BSMUC16/CD3-005和同型对照具有相当的Cmax浓度(分别是4.6、3.6和4.1μg/mL)。BSMUC16/CD3-005和同型对照呈现类似的药物清除曲线,而BSMUC16/CD3-001呈现比前二者更陡峭的药物清除,其显示人类CD3目标结合驱动了清除。BSMUC16/CD3-001的最终抗体浓度是0.03μg/mL,其比同型对照所测定的最终抗体浓度(0.85μg/mL)低约28倍并且比BSMUC16/CD3-005(0.66μg/mL)血清浓度低22倍。
在MUC16hu/hux CD3hu/hu双-人类化小鼠中,Muc16xCD3双特异性和同型对照抗体具有相当的Cmax浓度(Cmax范围:4.5-6.9μg/mL)。两种双特异性抗体呈现比同型对照更陡峭的药物清除,其显示了目标介导的效应。BSMUC16/CD3-001和BSMUC16/CD3-005的最终抗体浓度比同型对照所测定的最终抗体浓度(0.86μg/mL)分别低约29倍和2.9倍。
总抗MUC16x CD3双特异性抗体和同型对照抗体浓度的数据的概要汇整于表17中。平均PK参数描述于表18A和18B中。平均总抗体浓度与时间如图2A、2B和2C所示。总之,MUC16xCD3双特异性抗体在WT小鼠中呈现类似的Cmax和药物清除曲线,但BSMUC16/CD3-001在CD3单人类化小鼠和MUC16/CD3双人类化小鼠中呈现比BSMUC16/CD3-005和同型对照更陡峭的清除率。因为在这一PK研究中所给予的双特异性抗体包含相同的抗MUC16结合臂,所以结果显示CD3靶向臂的结合强度可能在药物暴露量(AUClast)和药物清除率上占有一席之地。BSMUC16/CD3-001或BSMUC16/CD3-005皆不会与小鼠MUC16或小鼠CD3结合。
表17:于WT小鼠、人类化CD3小鼠和人类化MUC16x CD3小鼠中单一0.4mg/kg腹膜内注射BSMUC16/CD3-001、BSMUC16/CD3-005和同型对照抗体后,血清中总IgG的平均浓度
时间:(h,当指出时)=单一剂量注射后以小时表示的时间;D=研究天数;SD=标准偏差;ND=未测定,由于药物清除抗药物滴定排除的小鼠
表18A:药物动力学参数的概要:CD3hu/hu人类化小鼠
Cmax=高峰浓度;AUC=浓度-时间曲线下的面积;AUClast=从时间0到最后正浓度时间所计算的AUC;T1/2=观察到的预估半衰期;d=天
表18B:药物动力学参数的概要:MUC16hu/hu x CD3hu/hu双人类化小鼠
Cmax=高峰浓度;AUC=浓度-时间曲线下的面积;AUClast=从时间0到最后正浓度时间所计算的AUC;T1/2=观察到的预估半衰期;d=天
实例10:抗STEAP2/抗CD3双特异性抗体呈现活体内强力抗肿瘤功效
为了测定经鉴定对人类和猕猴CD3具有微弱或不可检测的结合亲和力的示例抗STEAP2/抗CD3双特异性抗体的功效,于带有人类前列腺癌异种移植物的免疫胜任型小鼠中进行研究。
为了评估抗STEAP2/抗CD3双特异性抗体在活体内人类肿瘤异种移植研究中的功效,将NOD scidγ(NSG)小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)以人类周边血液单核细胞(PBMC;ReachBio LLC.,Seattle,WA)以及内生性表达STEAP2的人类前列癌C4-2细胞(MD Anderson Cancer Center,Houston TX)共移植。
简单地说,将5×106个C4-2细胞以皮下(s.c.)与1.25×106个人类PBMC以50∶50的基质胶基质膜(matrigel matrix)(BD Biosciences,San Jose,CA)混合物共植入雄性NSG小鼠的右腹。在植入当天(立即治疗模型),以腹膜内注射(i.p.)0.1或0.01mg/kg剂量的抗STEAP2/抗CD3双特异性BSSTEAP2/CD3-001、BSSTEAP2/CD3-002或BSSTEAP2/CD3-003,或同型对照治疗(N=5只小鼠/组)。
使用游标尺每周2次测量肿瘤大小并计算肿瘤体积为体积=(长×宽2)/2。在研究终了,移植肿瘤后46天时,数据系以肿瘤大小(mm3)表示(表19)。
如表19中的结果所示,相较于同型对照,当于研究终了测量肿瘤大小时,BSSTEAP2/CD3-001、BSSTEAP2/CD3-002和BSSTEAP2/CD3-003显著地抑制肿瘤生长。重要的是,抗STEAP2/抗CD3双特异性抗体在抑制C4-2肿瘤生长上是有效的,即使在最低剂量0.1mg/kg时。
表19:在免疫胜任型异种移植模型中抗STEAP2/抗CD3双特异性抗体的功效:立即给药
本发明并不受限于文中所述的具体实施例的范围。实际上,除了所述文中所述以外,由前述说明和伴随的图示,各种本发明的修改对所属领域的技术人员将变得显而易见。这些修改希望落在所附的权利要求书内。
Claims (21)
1.一种细胞毒性双特异性抗体的用途,用于制造医药品供治疗患者中的癌症,其中所述双特异性抗体包含显示出与人CD3和猕猴CD3的微弱至不可检测的结合的第一抗原结合臂,以及与肿瘤相关抗原结合的第二抗原结合臂,其中第一抗原结合臂和第二抗原结合臂各自包含重链和轻链,其中轻链对于第一抗原结合臂和第二抗原结合臂两者是共同的,以及其中第一抗原结合臂的重链包含重链可变区,所述重链可变区包含分别由SEQ ID NO:36、38和40的氨基酸序列组成,或分别由SEQ ID NO:140、142和144的氨基酸序列组成的互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且轻链包含轻链可变区,所述轻链可变区包含分别由SEQID NO:164、166和168的氨基酸序列组成的互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3,或轻链是结合肿瘤相关抗原的第二抗原结合臂的同源轻链。
2.根据权利要求1所述的用途,其中所述双特异性抗体在体外表现出T细胞活化。
3.根据权利要求1所述的用途,其中所述的肿瘤相关抗原在人肿瘤细胞上表达。
4.根据权利要求1所述的用途,其中所述双特异性抗体以低于1.3nM的EC50值诱导T细胞介导的肿瘤细胞杀死,如在活体外T细胞介导的肿瘤细胞杀死分析中所测量。
5.根据权利要求1所述的用途,其中所述癌症的细胞表达选自以下组成的组的肿瘤相关抗原:AFP、ALK、BAGE蛋白质、BIRC5、BIRC7、β-连环蛋白、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8、CALR、CCR5、CD19、CD20、CD22、CD30、CD40、CDK4、CEA、CTLA4、细胞周期蛋白-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白质、GD2、GD3、GloboH、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、LMP2、MAGE蛋白质、MART-1、间皮素、ML-IAP、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16、MUM1、NA17、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA、RAGE蛋白质、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、汤-诺氏抗原、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶和尿溶蛋白-3。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的用途,其中轻链包含轻链可变区,所述轻链可变区包含分别由SEQ ID NO:164、166和168组成的氨基酸序列的互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3。
7.根据权利要求6所述的用途,其中轻链可变区由SEQ ID NO:162的氨基酸序列组成。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的用途,其中轻链是结合肿瘤相关抗原的第二抗原结合臂的重链的同源轻链。
9.根据权利要求6所述的用途,其中第一抗原结合臂包含分别由SEQ ID NO:36、38、40、164、166和168的氨基酸序列组成的互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
10.根据权利要求6所述的用途,其中第一抗原结合臂包含分别由SEQ ID NO:140、142、144、164、166和168的氨基酸序列组成的互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
11.根据权利要求1-5中任一项所述的用途,其中重链可变区由与SEQ ID NO:34或SEQID NO:138的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列组成。
12.根据权利要求1-5中任一项所述的用途,其中重链可变区由与SEQ ID NO:34或SEQID NO:138的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列组成。
13.根据权利要求1-5中任一项所述的用途,其中重链可变区由与SEQ ID NO:34或SEQID NO:138的氨基酸序列至少98%相同的氨基酸序列组成。
14.根据权利要求1-5中任一项所述的用途,其中重链可变区由与SEQ ID NO:34或SEQID NO:138的氨基酸序列至少99%相同的氨基酸序列组成。
15.根据权利要求7所述的用途,其中该双特异性抗体包含由SEQ ID NO:34的氨基酸序列组成的重链可变区,以及由SEQ ID NO:162的氨基酸序列组成的轻链可变区。
16.根据权利要求7所述的用途,其中该双特异性抗体包含由SEQ ID NO:138的氨基酸序列组成的重链可变区,以及由SEQ ID NO:162的氨基酸序列组成的轻链可变区。
17.根据权利要求1所述的用途,其中所述癌症选自以下组成的组:胰脏癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、头颈癌、前列腺癌、骨肉瘤、大肠直肠癌、胃癌、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌、滑液肉瘤、甲状腺癌、乳癌、鳞状细胞癌、食道癌、透明细胞肾细胞癌、嫌色性肾细胞癌、肾嗜酸性粒细胞瘤、肾移行细胞癌、泌尿上皮癌、腺癌或小细胞癌。
18.根据权利要求1所述的用途,其中所述癌症是恶性胶质瘤。
19.根据权利要求1所述的用途,其中所述癌症是黑色素胶质母细胞瘤。
20.根据权利要求1所述的用途,其中所述癌症是免疫系统的原发性或转移性肿瘤。
21.根据权利要求1所述的用途,其中所述患者患有对单独的单特异性治疗具有抗性或反应不完全的肿瘤。
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