ES2935120T3 - Anticuerpos anti-PSMA, moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a PSMA y a CD3, y sus usos - Google Patents

Abstract

La presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), anticuerpos biespecíficos que se unen a PSMA y CD3, y métodos para usar los mismos. De acuerdo con ciertas realizaciones, los anticuerpos de la divulgación se unen a PSMA humano con alta afinidad y se unen a CD3 para inducir la proliferación de células T humanas. La divulgación incluye anticuerpos que se unen a PSMA y CD3 e inducen la destrucción mediada por células T de células tumorales que expresan PSMA. De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano y una segunda molécula de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA humano. En ciertas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación son capaces de inhibir el crecimiento de tumores de próstata que expresan PSMA. Los anticuerpos y las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la divulgación son útiles para el tratamiento de enfermedades y trastornos en los que se desea y/o es terapéuticamente beneficiosa una respuesta inmunitaria dirigida inducida o regulada al alza. Por ejemplo, los anticuerpos de la divulgación son útiles para el tratamiento de varios tipos de cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-PSMA, moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a PSMA y a CD3, y sus usos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos y a fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que son específicos para el antígeno de membrana específico prostético (PSMA, por sus siglas en inglés), y a sus métodos de uso. La presente invención también se refiere a moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a PSMA y a CD3, y a sus métodos de uso.

Antecedentes

El antígeno de membrana específico prostético (PSMA), también conocido como folato hidrolasa 1 (FOLH1), es una glucoproteína integral de membrana no desprendida que se expresa en gran medida en las células epiteliales de la próstata y es un marcador de la superficie celular para el cáncer de próstata. Su expresión se mantiene en el cáncer de próstata resistente a la castración, una afección con pronóstico desfavorable y opciones de tratamiento limitadas. Se han investigado métodos para el tratamiento del cáncer de próstata dirigidos contra PSMA. Por ejemplo, itrio-90 capromab es un radioterapéutico que comprende un anticuerpo monoclonal contra un epítopo intracelular de PSMA. En otro ejemplo, J591, un anticuerpo monoclonal contra un epítopo extracelular de PSMA, forma parte del lutecio-177 J591 radioterapéutico y de MLN2704, en el que el maitansinoide 1 (DM1, un agente antimicrotúbulos) se conjuga con J591. Estas terapias se han asociado con toxicidad. El PSMA también se expresa en la neovasculatura de otros tumores, tales como carcinomas vesical, renal, gástrico y colorrectal.

CD3 es un antígeno homodimérico o heterodimérico expresado en los linfocitos T en asociación con el complejo receptor de linfocitos T (TCR, por sus siglas en inglés) y es necesario para la activación de los linfocitos T. El CD3 funcional se forma a partir de la asociación dimérica de dos de cuatro cadenas diferentes:

épsilon, zeta, delta y gamma. Las disposiciones diméricas de CD3 incluyen

gamma/épsilon, delta/épsilon y zeta/zeta. Los anticuerpos contra CD3 han mostrado agrupar CD3 sobre los linfocitos T, produciendo, por tanto, la activación de los linfocitos T de una manera similar a la participación de los TCR por las moléculas MHC cargadas de péptidos. Por tanto, se han propuesto anticuerpos anti-CD3 con fines terapéuticos que implican la activación de linfocitos T. De manera adicional, se han propuesto anticuerpos biespecíficos con capacidad de unión a CD3 y un antígeno diana para usos terapéuticos que implican el direccionamiento de las respuestas inmunitarias de los linfocitos T a tejidos y células que expresan el antígeno diana.

Las moléculas de unión a antígeno que se dirigen a PSMA, así como las moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen tanto a PSMA como a CD3, serían útiles en entornos terapéuticos en los que se desee un direccionamiento específico y la destrucción mediada por linfocitos T de células que expresan PSMA.

Lutterbuese et al. Cancer Research 71(8): Suplemento (Resumen 4561), 2011 se refieren a la caracterización preclínica de MT112/BAY 2010112, un anticuerpo biespecífico contra PSMA y CD3 para el tratamiento del cáncer de próstata. Los documentos WO 2011/121110 y Wo 2010/037836 se refieren a moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico PSMAxCD3 específicas para especies cruzadas. El documento WO 2013/158856 se refiere a anticuerpos anti-CD3 biespecíficos que se unen a antígenos asociados a tumores, tales como PSMA. Baum et al. Immunotherapy 5(1): 27-38, 2012 se refieren a las actividades antitumorales de los diacuerpos PSMAxCD3 mediante la lisis de los linfocitos T redirigidos de las células de cáncer de próstata. Friedrich et al. Cancer Research 72(8) Suplemento (Resumen 3526), 2012 se refieren a la administración subcutánea del anticuerpo BiTE biespecífico PSMA/CD3 MT112/BAY 2010112 en ratones con xenoinjertos de cáncer de próstata humano. Fortmuller et al. The Prostate 71(6): 588-596, 2011 se refieren al direccionamiento del cáncer de próstata por linfocitos redirigidos por un diacuerpo monocatenario biespecífico PSMAxCD3. Buhler et al. Cancer Immunology, Immunotherapy 57(1): 43-52, 2008 se refieren a un diacuerpo biespecífico dirigido contra el antígeno de membrana específico de próstata y CD3 para inducir la lisis mediada por linfocitos T de células de cáncer de próstata.

Breve sumario de la invención

En el presente documento se describen anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a PSMA humano. Los anticuerpos pueden ser útiles, entre otras cosas, para dirigirse a células que expresan PSMA. La presente invención proporciona anticuerpos biespecíficos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a PSMA humano y a CD3 humano. Los anticuerpos biespecíficos de la invención comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA humano, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende una región variable de cadena pesada (HCVR, por sus siglas en inglés) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1514, o de la SEQ ID NO: 1618, y una región variable de cadena ligera (LCVR, por sus siglas en inglés) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1386, y en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA humano comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 66, y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1386. Estos anticuerpos son útiles, entre otras cosas, para dirigirse a los linfocitos T que expresan CD3 y para estimular la activación de los linfocitos T, p. ej., en circunstancias en las que es beneficiosa o deseable la destrucción mediada por linfocitos T de las células que expresan PSMA. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden dirigir la activación de linfocitos T mediada por CD3 a células específicas que expresen PSMA, tales como las células tumorales de próstata.

Los anticuerpos anti-PSMA ilustrativos se enumeran en las Tablas 1 y 2 en el presente documento. La Tabla 1 expone los identificadores de secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada (HCVR) y las regiones variables de cadena ligera (LCVR), así como regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3), y regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, lCd R2 y LCDR3) de los anticuerpos anti-PSMA ilustrativos. La Tabla 2 expone los identificadores de secuencia de las moléculas de ácido nucleico que codifican las HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de los anticuerpos anti-PSMA ilustrativos.

En el presente documento se describen anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una HCVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.

En el presente documento también se describen anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una LCVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.

En el presente documento también se describen anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1 junto con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1. En el presente documento se describen anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR contenido dentro de cualquiera de los anticuerpos anti-PSMA ilustrativos enumerados en la Tabla 1. El par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR puede seleccionarse del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 66/1642 (por ejemplo, H1H11810P2); y 122/130 (por ejemplo, H1H3465P).

En el presente documento también se describen anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR1 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.

La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR2 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.

La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.

La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR1 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.

La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR2 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.

La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.

La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3 y LCDR3 (HCDR3/LCDR3) que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la Tabla 1 junto con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la Tabla 1. En el presente documento se describen anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 contenido dentro de cualquiera de los anticuerpos anti-PSMA ilustrativos enumerados en la Tabla 1. El par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 puede seleccionarse del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 72/1648 (por ejemplo, H1H11810P2), y 128/136 (por ejemplo, H1H3465P).

En el presente documento también se describen anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un conjunto de seis CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contenido dentro de cualquiera de los anticuerpos anti-PSMA ilustrativos enumerados en la Tabla 1. El conjunto de secuencias de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 puede seleccionarse del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 68-70-72-1644-1646-1648 (por ejemplo, H1H11810P2); y 124-126-128-132-134-136 (por ejemplo, H1H3465P).

De forma relacionada, la presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un conjunto de seis CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contenido dentro de un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR como se define mediante cualquiera de los anticuerpos anti-PSMA ilustrativos enumerados en la Tabla 1. Por ejemplo, en el presente documento se describen anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden el conjunto de secuencias de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 contenido dentro de un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 66/146 (por ejemplo, H1H11810P2); y 122/130 (por ejemplo, H1H3465P). Los métodos y técnicas para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR son bien conocidos en la materia y pueden utilizarse para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR especificadas que se divulgan en el presente documento. Las convenciones ilustrativas que pueden utilizarse para identificar los límites de las CDR incluyen, p. ej., la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales y la definición de AbM es un término medio entre los enfoques de Kabat y Chothia. Véase, p. ej., Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); y Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). También hay disponibles bases de datos públicas para identificar secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.

La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-PSMA o partes de los mismos. Por ejemplo, se describen en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1; en ciertos casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de HCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.

La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1; la molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.

La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR1 enumeradas en la Tabla 1; la molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCDR1 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.

La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR2 enumeradas en la Tabla 1; la molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCDR2 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.

La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la Tabla 1; la molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCDR3 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.

La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR1 enumeradas en la Tabla 1; la molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCDR1 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.

La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR2 enumeradas en la Tabla 1; la molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCDR2 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.

La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la Tabla 1; la molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCDR3 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.

La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican una HCVR, en donde la HCVR comprende un conjunto de tres CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3), en donde el conjunto de secuencias de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3 es como se define por cualquiera de los anticuerpos anti-PSMA ilustrativos enumerados en la Tabla 1.

La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican una LCVR, en donde la LCVR comprende un conjunto de tres CDR (es decir, LCDR1-LCDR2-LCDR3), en donde el conjunto de secuencias de aminoácidos de LCDR1-LCDR2-LCDR3 es como se define por cualquiera de los anticuerpos anti-PSMA ilustrativos enumerados en la Tabla 1.

La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican tanto una HCVR como una LCVR, en donde la HCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1, y en donde la LCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1. La molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma, y una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCVR enumeradas en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma. La molécula de ácido nucleico puede codificar una HCVR y una LCVR, en donde la HCVR y la LCVR proceden las dos del mismo anticuerpo anti-PSMA enumerado en la Tabla 1.

La presente divulgación también proporciona vectores de expresión recombinantes capaces de expresar un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-PSMA. Por ejemplo, en el presente documento se describen vectores de expresión recombinantes que comprenden cualquiera de las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente, es decir, moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de HCVR, LCVR y/o CDR como se establecen en la Tabla 1. También se incluyen células hospedadoras en las que se han introducido dichos vectores, así como métodos para producir los anticuerpos o partes de los mismos mediante el cultivo de las células hospedadoras en condiciones que permiten la producción de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, y la recuperación de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo así producidos.

La presente divulgación incluye anticuerpos anti-PSMA que tienen un patrón de glucosilación modificado. Puede ser útil la modificación para eliminar sitios de glucosilación no deseables, o un anticuerpo que carezca de una fracción de fucosa presente en la cadena de oligosacárido, por ejemplo, para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) (véase, Shield et al., (2002) JBC 277:26733). En otras solicitudes, se puede modificar la galactosilación para modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés).

En otro aspecto, en el presente documento se describe una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano recombinante o fragmento del mismo que se une específicamente a PSMA y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto relacionado, la divulgación presenta una composición que es una combinación de un anticuerpo anti-PSMA y un segundo agente terapéutico. El segundo agente terapéutico es cualquier agente que se combine de forma ventajosa con un anticuerpo anti-PSMA. En cualquier parte del presente documento se divulgan terapias de combinación y coformulaciones adicionales que implican los anticuerpos anti-PSMA.

En otro aspecto, la divulgación proporciona métodos terapéuticos para atacar/destruir células tumorales que expresan PSMA mediante un anticuerpo anti-PSMA, en donde los métodos terapéuticos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-PSMA a un sujeto que lo necesita. En algunos casos, los anticuerpos anti-PSMA (o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos) se pueden utilizar para tratar el cáncer de próstata o pueden modificarse para que sean más citotóxicos mediante métodos, incluyendo, por ejemplo, dominios Fc modificados para aumentar la ADCC (véase, por ejemplo, Shield et al. (2002) JBC 277:26733), radioinmunoterapia (Akhtar, et al., 2012, Prostate-Specific Membrane Antigen-Based Therapeutics; Adv Urol. 2012: 973820), conjugados anticuerpo-fármaco (Olson, W^c e Israel, RJ, 2014, Front Biosci (Landmark Ed). 19:12-33; DiPippo, et al. Feb 15, 2015, The Prostate, 75(3):303-313, publicado por vez primera en línea el 18 de octubre de 2014), u otros métodos para aumentar la eficacia de la ablación tumoral. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico)

En el presente documento también se describe el uso de un anticuerpo anti-PSMA en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno relacionado o provocado por células que expresan PSMA.

En otro aspecto más, la divulgación proporciona anticuerpos anti-PSMA monoespecíficos para aplicaciones de diagnóstico, tales como, p. ej., reactivos de formación de imágenes.

En otro aspecto más, la divulgación proporciona métodos terapéuticos para estimular la activación de linfocitos T mediante un anticuerpo anti-CD3 o una parte de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención, en donde los métodos terapéuticos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al antígeno de membrana específico prostático (PSMA) humano con una constante de equilibrio de disociación de unión (K^d) inferior a aproximadamente 80 nM que se mide en un análisis de resonancia de plasmón superficial a 37 °C. En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a PSMA humano con una semivida disociativa (t1^ ) superior a aproximadamente 10 minutos, que se mide en un análisis de resonancia de plasmón superficial a 37 °C.

La divulgación proporciona además un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que compite por unirse a PSMA humano con un anticuerpo de referencia que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR como se establece en la Tabla 1. En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que compite por unirse a PSMA humano con un anticuerpo de referencia que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/1642; 10/1642; 18/1642; 26/1642; 34/1642; 42/1642; 50/1642; 58/1642; 66/1642; 74/1642; 82/1642; 90/1642; 98/1642; 106/1642; 114/1642; 122/130; y 138/146.

En el presente documento también se describe un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une al mismo epítopo en PSMA humano que un anticuerpo de referencia que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR como se establece en la Tabla 1. En otro aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une al mismo epítopo de PSMA humano que un anticuerpo de referencia que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/1642; 10/1642; 18/1642; 26/1642; 34/1642; 42/1642; 50/1642; 58/1642; 66/1642; 74/1642; 82/1642; 90/1642; 98/1642; 106/1642; 114/1642; 122/130; y 138/146.

En el presente documento también se describe un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a PSMA humano, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la Tabla 1; y las CDR de una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la Tabla 1. En otro aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno comprende las CDR de cadena pesada y ligera de un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en: ^s E^q ID NO: 2/1642; 10/1642; 18/1642; 26/1642; 34/1642; 42/1642; 50/1642; 58/1642; 66/1642; 74/1642; 82/1642; 90/1642; 98/1642; 106/1642; 114/1642; 122/130; y 138/146. En otro aspecto más, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno comprende los dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, seleccionados del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 4-6-8-1644-1646-1648; 12-14-16-1644-1646-1648; 20-22-24-1644-1646-1648; 28-30-32-1644­ 1646-1648; 36-38-40-1644-1646-1648; 44-46-48-1644-1646-1648; 52-54-56-1644-1646-1648; 60-62-64-1644-1646­ 1648; 68-70-72-1644-1646-1648; 76-78-80-1644-1646-1648; 84-86-88-1644-1646-1648; 92-94-96-1644-1646-1648; 100-102-104-1644-1646-1648; 108-110-112-1644-1646-1648; 116-118-120-1644-1646-1648; 124-126-128-132-134136; y 140-142-144-148-150-152.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a PSMA humano, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: (a) una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106, 114, 122 y 138; y (b) una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 130 y 146. En un aspecto adicional, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2/1642; 10/1642; 18/1642; 26/1642; 34/1642; 42/1642; 50/1642; 58/1642; 66/1642; 74/1642; 82/1642; 90/1642; 98/1642; 106/1642; 114/1642; 122/130; y 138/146.

La presente invención proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas (por ejemplo, anticuerpos) que se unen a PSMA y a CD3, como se define en las reivindicaciones. En el presente documento, dichas moléculas de unión a antígeno biespecíficas también se denominan "moléculas biespecíficas anti-PSMA/anti-CD3", "moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA", o "Ac biespecíficos PSMAxCD3". La parte anti-PSMA de la molécula biespecífica anti-PSMA/anti-CD3 es útil para dirigirse a células (por ejemplo, células tumorales) que expresen PSMA (por ejemplo, tumores de próstata), y la parte anti-CD3 de la molécula biespecífica es útil para activar linfocitos T. La unión simultánea de PSMA en una célula tumoral y CD3 en un linfocito T facilita la destrucción dirigida (lisis celular) de la célula tumoral diana por parte del linfocito T activado. Por tanto, las moléculas biespecíficas anti-PSMA/anti-CD3 de la invención son útiles, entre otras cosas, para el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados o provocados por tumores que expresan PSMA (por ejemplo, cánceres de próstata).

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas según este aspecto de la presente invención comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA. La presente invención incluye moléculas biespecíficas anti-PSMA/anti-CD3 (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), en donde cada dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) emparejada con una región variable de cadena ligera (LCVR). El dominio de unión a antígeno anti-CD3 y el dominio de unión a antígeno anti-PSMA comprenden cada uno diferente, HCVR distintas emparejadas con una LCVR común. Por ejemplo, como se ilustra en el Ejemplo 4 del presente documento, se construyeron anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3, en donde el primer dominio de unión a antígeno comprende un par de HCVR/LCV^r derivado de un anticuerpo anti-CD3; y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA, en donde el segundo dominio de unión a antígeno comprende una HCVR derivada de un anticuerpo anti-PSMA emparejada con una LCVR derivada de un anticuerpo anti-CD3 (por ejemplo, la misma LCVR que está incluida en el dominio de unión a antígeno CD3). En otras palabras, en las moléculas ilustrativas divulgadas en el presente documento, el emparejamiento de una HCVR de un anticuerpo anti-PSMA con una LCVR de un anticuerpo anti-CD3 crea un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA (pero no se une a CD3). En tales realizaciones, el primer y segundo dominios de unión a antígeno comprenden HCVR anti-CD3 y anti-PSMA distintas pero comparten una LCVR anti-CD3 común. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas pueden comprender distintas HCVR anti-CD3 y anti-PSMA, pero comparten una LCVR común. La secuencia de aminoácidos de esta LCVR se muestra, p. ej., en la SEQ ID NO: 1642, y las secuencias de aminoácidos de las CDR correspondientes (es decir, LCDR1-LCDR2-LCDR3) se muestran en las SEQ ID NO: 1644, 1646 y 1648, respectivamente. Dichos ratones modificados genéticamente pueden utilizarse para producir moléculas de unión a antígeno biespecíficas completamente humanas que comprendan dos cadenas pesadas diferentes que se asocian con una cadena ligera idéntica que comprende un dominio variable procedente de uno de dos segmentos génicos de región variable de cadena ligera humana diferentes. De manera alternativa, las cadenas pesadas variables pueden emparejarse con una cadena ligera común y expresarse de forma recombinante en células hospedadoras. Como tal, los anticuerpos de la invención pueden comprender cadenas pesadas de inmunoglobulina asociadas con una única cadena ligera reordenada. La cadena ligera puede comprender un dominio variable procedente de un segmento del gen V^k1-39 o un segmento del gen V^k3-20 humano. La cadena ligera puede comprender un dominio variable procedente de un segmento del gen V^k1-39 humano reordenado con un segmento del gen J^k5 humano o J^k1 humano.

En el presente documento se divulgan moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCV^r , cualquiera de los pares de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR, cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CDR1-CDR2-CDR3 de cadena pesada, o cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CDR1-CDR2-CDR3 de cadena ligera como se establece en la publicación de EE. UU. 2014/0088295.

De manera adicional, en el presente documento se divulgan moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR como se establece en las Tablas 12, 14 y 18 del presente documento. El primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 también puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR como se establece en las Tablas 12, 15 y 20 del presente documento. El primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende cualquiera de los pares de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR como se establece en las Tablas 12, 14, 15, 18 y 20 del presente documento. En el presente documento también se divulgan moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CDR1-CDR2-CDR3 de cadena pesada como se establece en las Tablas 12, 14 y 18 del presente documento, y/o cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CDR1-CDR2-CDR3 de cadena ligera como se establece en las Tablas 12, 15 y 20 del presente documento.

En el presente documento también se divulgan moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en las Tablas 12, 14 y 18 del presente documento o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.

En el presente documento también se divulgan moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en las Tablas 12, 15 y 20 del presente documento, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.

La presente divulgación también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) como se establece en las Tablas 12, 14, 15, 18 y 20 del presente documento.

La presente divulgación también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende un dominio CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en las Tablas 12, 14 y 18 del presente documento, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; y un dominio CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en las Tablas 12, 15 y 20 del presente documento, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.

En ciertos casos, el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 como se establece en las Tablas 12, 14, 15, 18 y 20 del presente documento.

La presente divulgación también proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende un dominio CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que tiene un aminoácido como se establece en las Tablas 12, 14 y 18 del presente documento, o una secuencia sustancialmente similar del mismo que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que tiene un aminoácido como se establece en las Tablas 12, 14 y 18, o una secuencia sustancialmente similar del mismo que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que tiene un aminoácido como se establece en las Tablas 12, 14 y 18, o una secuencia sustancialmente similar del mismo que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en las Tablas 12, 15 y 20 del presente documento, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en las Tablas 12, 15 y 20 del presente documento, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia, y un dominio CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en las Tablas 12, 15 y 20 del presente documento, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.

Determinadas moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA ilustrativas, no limitantes incluyen un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 que comprende dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, que tiene las secuencias de aminoácidos que se establecen en las Tablas 12, 14, 15, 18 y 20 del presente documento.

La presente divulgación proporciona además una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) de una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la Tabla 12, Tabla 14 o Tabla 18, y regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) de una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la Tabla 12, Tabla 15 o Tabla 20.

También se describe en el presente documento una molécula de unión a antígeno biespecífica en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) de una región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionada del grupo que consiste en las Se Q ID NO: 922, 154, 1482, 1490, 1498, 1506, 1514, 1522, 1530, 1538, 1546, 1554, 1562, 1570, 1578, 1586, 1594, 1602, 1610, 1618, y 1626, y regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) de una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 162, 930 y 1642.

La divulgación proporciona además una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (A1-LCDR1, A1-LCDR2 y A1-LCDR3), en donde A1-HCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 924, 156; 1484, 1492, 1500, 1508, 1516, 1524, 1532, 1540, 1548, 1556, 1564, 1572, 1580, 1588, 1596, 1604, 1612, 1620, y 1628; A1-HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 926, 158, 1486, 1494, 1502, 1510, 1518, 1526, 1534, 1542, 1550, 1558, 1566, 1574, 1582, 1590, 1598, 1606, 1614, 1622 y 1630; A1-HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 928, 160, 1488, 1496, 1504, 1512, 1520, 1528, 1536, 1544, 1552, 1560, 1568, 1576, 1584, 1592, 1600, 1608, 1616, 1624 y 1632; A1-LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 932, 164, y 1644; A1-LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 166, 934 y 1646; y A1-LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 168, 936 y 1648.

En un aspecto adicional, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende las CDR de cadena pesada y ligera de un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 922/930, 154/162, 1482/1642, 1490/1642, 1498/1642, 1506/1642, 1514/1642, 1522/1642, 1530/1642, 1538/1642, 1546/1642, 1554/1642, 1562/1642, 1570/1642, 1578/1642, 1586/1642, 1594/1642, 1602/1642, 1610/1642, 1618/1642, y 1626/1642.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (A1-LCDR1, A1-LCDR2 y A1-LCDR3), y en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA humano comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (A2-HCDR1, A2-HCDR2 y A2-HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (A2-LCDR1, A2-LCDR2 y A2-LCDR3); en donde A1-HCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 924, 156, 1484, 1492, 1500, 1508, 1516, 1524, 1532, 1540, 1548, 1556, 1564, 1572, 1580, 1588, 1596, 1604, 1612, 1620 y 1628; A1-HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 926, 158, 1486, 1494, 1502, 1510, 1518, 1526, 1534, 1542, 1550, 1558, 1566, 1574, 1582, 1590, 1598, 1606, 1614, 1622 y 1630; A1-HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID: 928, 160, 1488, 1496, 1504, 1512, 1520, 1528, 1536, 1544, 1552, 1560, 1568, 1576, 1584, 1592, 1600, 1608, 1616, 1624, y 1632; A1-LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 164, 932, y 1644; A1-LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 166, 934, y 1646; y A1-LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 168, 936, y 1648; y en donde A2-HCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 124 y 68; A2-HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 126 y 70; A2-HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 128 y 72; A2-LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 932, 164, y 1644; A2-LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 934, 166, y 1646; y A2-LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 936, 168 y 1648.

Determinadas moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA no limitantes incluyen un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 que comprende una cadena pesada que comprende regiones marco de dominio variable que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de FR1 (SEQ Id NO: 1654), FR2 (SEQ ID NO: 1656), FR3 (SEQ ID NO: 1657) y FR4 (SEQ ID NO: 1658).

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA ilustrativas incluyen una molécula de unión a antígeno biespecífica en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende una HCVR que comprende HCDR1-HCDR2-HCDR3 que tiene las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1659-1660-1661.

La presente divulgación también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA, en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106, 114, 122, y 138, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.

La presente divulgación también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA, en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 930, 162 y 1642 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.

La presente divulgación también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA, en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 122/930, 122/162, y 66/1642.

La presente divulgación también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA, en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA comprende una CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112, 120, 128, y 144, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; y un dominio CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 936, 168, y 1648, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.

En ciertos casos, el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 128/936, 128/168, y 72/1648.

La presente divulgación también proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA, en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA comprende una CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108, 116, 124, y 140, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110, 118, 126 y 142, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112, 120, 128 y 144, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 932, 164, y 1644, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; y un dominio CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 934, 166, y 1646, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; y un dominio CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 936, 168, y 1648, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.

Determinadas moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA ilustrativas, no limitantes incluyen un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA que comprende dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, que tienen las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 124-126-128-932-934-936, 124-126-128-164-166-168, y 68-70-72-1644-1646-1648.

De forma relacionada, la divulgación incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA comprende los dominios CDR de cadena pesada y ligera contenidos en secuencias de región variable de cadena pesada y ligera (HCVR/LCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 122/930, 122/162, y 66/1642.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3 humano y un segundo dominio de unión a antígeno que se une a PSMA humano, en donde el segundo dominio de unión a antígeno se deriva del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de uno cualquiera de los anticuerpos anti-PSMA divulgados en el presente documento. En un aspecto adicional, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA humano.

La molécula de unión a antígeno biespecífica puede unirse a células humanas que expresan CD3 humano y células de macaco cangrejero que expresan CD3 de macaco cangrejero. La molécula de unión a antígeno biespecífica se une a células humanas que expresan PSMA humano y a células de macaco cangrejero que expresan PSMA de macaco cangrejero.

La molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención inhibe el crecimiento tumoral en ratones inmunodeprimidos que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano. La invención proporciona además una molécula de unión a antígeno biespecífica que inhibe el crecimiento tumoral en ratones inmunocompetentes que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano. La invención proporciona además una molécula de unión a antígeno biespecífica que suprime el crecimiento tumoral de tumores establecidos en ratones inmunodeprimidos que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano. La invención proporciona además una molécula de unión a antígeno biespecífica que reduce el crecimiento tumoral de tumores establecidos en ratones inmunocompetentes que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano.

Una molécula de unión a antígeno biespecífica puede comprender i) un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a una célula efectora con un valor de CE⁵⁰ superior a aproximadamente 40 nM y ii) un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a una célula de tumor de próstata humano diana con un valor de CE⁵⁰ inferior a 40 nM, en donde dicho valor de afinidad de unión CE⁵⁰ se mide en un ensayo de unión de FACS in vitro.

Por ejemplo, la molécula de unión a antígeno biespecífica puede incluir un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano con un valor de CE⁵⁰ superior a aproximadamente 40 nM o superior a aproximadamente 100 nM, superior a aproximadamente 200 nM o superior a aproximadamente 1 pM. La molécula de unión a antígeno biespecífica puede incluir un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a la célula de tumor de próstata diana con un valor de CE⁵⁰ inferior a aproximadamente 6 nM. En algunos casos, el primer dominio de unión a antígeno se une específicamente a cada CD3 humano y CD3 de macaco cangrejero con valor de CE⁵⁰ superior a aproximadamente 40 nM, superior a aproximadamente 100 nM, superior a aproximadamente 200 nM o superior a aproximadamente 1 pM. En algunos casos, el primer dominio de unión a antígeno se une específicamente a cada CD3 humano y CD3 de macaco cangrejero con afinidad débil o no medible.

En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno induce la destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T con un valor de CE⁵⁰ inferior a aproximadamente 1,3 nM, según se mide en un ensayo de destrucción de células tumorales in vitro mediada por linfocitos T, por ejemplo, donde las células tumorales son células C4-2, 22Rv1 y TRAMPC2_PSMA.

En algunas aplicaciones, el primer dominio de unión a antígeno se une a CD3 humano con un valor de K^d superior a aproximadamente 11 nM, según se mide en un ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial in vitro. En determinados casos, el primer dominio de unión a antígeno se une a cada CD3 humano y CD3 de macaco cangrejero con un valor de K^d superior a aproximadamente 15 nM, superior a aproximadamente 30 nM, superior a aproximadamente 60 nM, superior a aproximadamente 120 nM o superior a aproximadamente 300 nM, según se mide en un ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial in vitro.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD3 de la invención, los fragmentos de unión a antígeno y los anticuerpos biespecíficos de los mismos se prepararon mediante el reemplazo de los restos de aminoácidos de un precursor de una manera escalonada basándose en las diferencias entre la secuencia de la línea germinal y la secuencia del anticuerpo precursor.

En el presente documento se divulga una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde el segundo dominio de unión a antígeno compite por unirse a PSMA humano con una proteína de unión a antígeno de referencia que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (A2-HCDR1, A2-HCDR2 y A2-HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (A2-LCDR1, A2-LCDR2 y A2-LCDR3), en donde A2-HCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 124 y 68; A2-HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 126 y 70; A2-HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 128 y 72; A2-LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 164, 932 y 1644; A2-LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 166, 934 y 1646; y A2-LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 168, 936 y 1648. La divulgación también proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde el segundo dominio de unión a antígeno compite por unirse a PSMA humano con una proteína de unión a antígeno de referencia que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 122 y 66, y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 162, 930 y 1642.

La divulgación también proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde el primer dominio de unión a antígeno compite por unirse a CD3 humano con una proteína de unión a antígeno de referencia que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (A1-LCDR1, A1-LCDR2 y A1-LCDR3), en donde A1-HCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 924, 156, 1484, 1492, 1500, 1508, 1516, 1524, 1532, 1540, 1548, 1556, 1564, 1572, 1580, 1588, 1596, 1604, 1612, 1620 y 1628; A1-HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 926, 158, 1486, 1494, 1502, 1510, 1518, 1526, 1534, 1542, 1550, 1558, 1566, 1574, 1582, 1590, 1598, 1606, 1614, 1622 y 1630; A1-HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 928, 160, 1488, 1496, 1504, 1512, 1520, 1528, 1536, 1544, 1552, 1560, 1568, 1576, 1584, 1592, 1600, 1608, 1616, 1624 y 1632; A1-LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 164, 932, y 1644; A1-LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 166, 934, y 1646; y A1-LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 168, 936, y 1648. La divulgación también proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde el primer dominio de unión a antígeno compite por unirse a CD3 humano con una proteína de unión a antígeno de referencia que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 922, 154, 1482, 1490, 1498, 1506, 1514, 1522, 1530, 1538, 1546, 1554, 1562, 1570, 1578, 1586, 1594, 1602, 1610, 1618, y 1626, y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 930, 162 y 1642.

La divulgación también proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde el primer dominio de unión a antígeno compite por unirse a CD3 humano con una proteína de unión a antígeno de referencia que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 922, 154, 1482, 1490, 1498, 1506, 1514, 1522, 1530, 1538, 1546, 1554, 1562, 1570, 1578, 1586, 1594, 1602, 1610, 1618, y 1626, y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 930, 162 y 1642; y en donde el segundo dominio de unión a antígeno compite por unirse a PSMA humano con una proteína de unión a antígeno de referencia que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID: 122 y 66, y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 930, 162, y 1642.

En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión a antígeno biespecífica anti-PSMA/anti-CD3 de la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La invención proporciona además la composición farmacéutica para su uso en un método para tratar el cáncer en un sujeto. El método puede comprender administrar al sujeto la composición farmacéutica que comprende una molécula de unión a antígeno anti-PSMA o una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-PSMA/anti-CD3 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal y cáncer gástrico. En algunos casos, el cáncer es cáncer de próstata. En algunos casos, el cáncer de próstata es cáncer de próstata resistente a la castración.

La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de HCVR, LCVR o CDR de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA divulgadas en el presente documento, incluyendo moléculas de ácido nucleico que comprenden las secuencias de polinucleótidos expuestas en las Tablas 2, 13, 15, 17, 19 y 21 del presente documento, así como moléculas de ácido nucleico que comprenden dos o más de las secuencias de polinucleótidos expuestas en las Tablas 2, 13, 15, 17, 19 y 21 en cualquier combinación o disposición funcional de las mismas. Los vectores de expresión recombinantes que portan los ácidos nucleicos de la invención, y células hospedadoras en donde se han introducido dichos vectores, también se describen, así como los métodos de producción de los anticuerpos mediante el cultivo de las células hospedadoras en condiciones que permitan la producción de los anticuerpos y la recuperación de los anticuerpos producidos.

La presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA, en donde cualquiera de los dominios de unión a antígeno mencionados anteriormente que se unen específicamente a CD3 se combinan, conectan o asocian con cualquiera de los dominios de unión a antígeno mencionados anteriormente que se unen específicamente a PSMA para formar una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une a CD3 y a PSMA.

En el presente documento también se describen moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA que tienen un patrón de glucosilación modificado. En algunas aplicaciones, puede ser útil la modificación para eliminar sitios de glucosilación no deseables, o un anticuerpo que carezca de una fracción de fucosa presente en la cadena de oligosacárido, por ejemplo, para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) (véase, Shield et al., (2002) JBC 277:26733). En otras solicitudes, se puede modificar la galactosilación para modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés).

La divulgación también proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-PSMA y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La divulgación presenta una composición que es una combinación de una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-PSMA y un segundo agente terapéutico. El segundo agente terapéutico puede ser cualquier agente que se combine ventajosamente con una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-PSMA. Los agentes ilustrativos que pueden combinarse ventajosamente con una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-PSMA se analizan en detalle en otras partes del presente documento.

La divulgación también proporciona métodos terapéuticos para dirigirse a/destruir células tumorales que expresan PSMA utilizando una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-PSMA, en donde los métodos terapéuticos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-PSMA de la invención a un sujeto que lo necesite.

En el presente documento también se describe el uso de una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-PSMA en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno relacionado o provocado por células que expresan PSMA.

Otras realizaciones resultarán evidentes tras la revisión de la descripción detallada adjunta. La invención se define en las reivindicaciones 1 y 7. Los aspectos y realizaciones preferentes adicionales se definen en las reivindicaciones dependientes. Cualquier aspecto, realización y ejemplo de la presente divulgación que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención y se proporciona meramente con fines ilustrativos.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 ilustra que el anticuerpo biespecífico PSMAxCD3 inhibe el crecimiento de una línea celular de próstata humana in vivo. A los ratones NSG se les coimplantó células 22Rv1 y PBMC humanas por vía subcutánea. A los animales se les administró una dosis tres veces en total en los días 0, 3 y 7 con 1 ug de anticuerpo biespecífico PSMAxCD3 i.p. Los datos se expresan como media (SEM, por sus siglas en inglés) y se analizaron mediante análisis de varianza (ANOVA).

Las Fig. 2A-2D muestran que el tratamiento con un anticuerpo biespecífico PSMAxCD3 induce un aumento transitorio dependiente de la dosis de las citocinas circulantes, donde se analizan los niveles de citocinas (interferón-gamma, IFN-g; factor de necrosis tumoral, TNF; interleucina-2, IL-2; e interleucina-6, IL-6) a las 4 horas después del tratamiento.

Las Fig. 3A-3B ilustran que el tratamiento con un anticuerpo biespecífico PSMAxCD3 en un ratón humanizado con linfocitos T (100 pg/ratón) induce un aumento agudo de las citocinas (por ejemplo, IFNg) (Fig. 3A), así como una disminución transitoria de los linfocitos T circulantes (Fig. 3B). Las Fig. 4A-4C ilustran el efecto de los anticuerpos biespecíficos PSMAxCD3 sobre los linfocitos T efectores en el bazo de los ratones inmunocompetentes.

Descripción detallada

Antes de describir la presente invención, debe entenderse que esta invención no se limita a métodos ni a condiciones experimentales particulares descritos, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la cual pertenece la presente invención. Como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se utiliza en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor indicado en no más de un 1 %. Por ejemplo, como se utiliza en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).

Aunque puede utilizarse cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos.

Definiciones

La expresión "CD3", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un antígeno que se expresa en linfocitos T como parte del receptor multimolecular de linfocitos T (TCR, por sus siglas en inglés) y que consiste en un homodímero o heterodímero formado a partir de la asociación de dos de las cuatro cadenas receptoras: CD3-épsilon, CD3-delta, CD3-zeta y CD3-gamma. CD3-épsilon humano comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SEQ ID NO: 1649; CD3-delta humano comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SEQ ID NO: 1650. Todas las referencias a proteínas, polipéptidos y fragmentos de proteína en el presente documento pretenden referirse a la versión humana de la proteína, polipéptido o fragmento de proteína respectivo a menos que se especifique explícitamente como de una especie no humana. Por tanto, la expresión "CD3" significa CD3 humano a menos que se especifique que proviene de una especie no humana, p. ej., "CD3 de ratón", "CD3 de mono", etc.

Como se utiliza en el presente documento, "un anticuerpo que se une a CD3" o un "anticuerpo anti-CD3" incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen específicamente una subunidad c D3 única (por ejemplo, épsilon, delta, gamma o zeta), así como anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen específicamente un complejo dimérico de dos subunidades CD3 (por ejemplo, dímeros CD3 gamma/épsilon, delta/épsilon, y zeta/zeta). Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente invención pueden unirse a CD3 soluble y/o CD3 expresado en la superficie celular. CD3 soluble incluye proteínas CD3 naturales, así como variantes de proteínas CD3 recombinantes como, p. ej., construcciones CD3 monoméricas y diméricas, que carecen de un dominio transmembrana o que no están asociadas con una membrana celular.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "CD3 expresado en la superficie celular" significa una o más proteínas CD3 que se expresan en la superficie de una célula in vitro o in vivo, de modo que al menos una parte de una proteína c D3 está expuesta al lado extracelular de la membrana celular y es accesible a una parte de unión a antígeno de un anticuerpo. "CD3 expresado en la superficie celular" incluye proteínas CD3 contenidas dentro del contexto de un receptor de linfocitos T funcional en la membrana de una célula. La expresión "CD3 expresado en la superficie celular" incluye la proteína CD3 expresada como parte de un homodímero o heterodímero en la superficie de una célula (por ejemplo, dímeros CD3 gamma/épsilon, delta/épsilon, y zeta/zeta). La expresión, "CD3 expresado en la superficie celular" también incluye una cadena de CD3 (por ejemplo, CD3-épsilon, CD3-delta o CD3-gamma) que se expresa por sí misma, sin otros tipos de cadenas de CD3, en la superficie de una célula. Un "CD3 expresado en la superficie celular" puede comprender o consistir en una proteína CD3 expresada en la superficie de una célula que normalmente expresa la proteína CD3. De manera alternativa, "CD3 expresado en la superficie celular" puede comprender o consistir en una proteína CD3 expresada en la superficie de una célula que normalmente no expresa CD3 humano en su superficie, pero que se ha manipulado de manera artificial para expresar CD3 en su superficie.

La expresión "PSMA", como se utiliza en el presente documento, se refiere a antígeno de membrana específico prostático, también conocido como folato hidrolasa 1 (FOLH1). PSMA es una glucoproteína integral de membrana no desprendida que se expresa en gran medida en las células epiteliales de la próstata y es un marcador de la superficie celular para el cáncer de próstata. La secuencia de aminoácidos de PSMA humano se establece en la SEQ ID NO: 1651.

Como se utiliza en el presente documento, "un anticuerpo que se une a PSMA" o un "anticuerpo anti-PSMA" incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen específicamente PSMA.

La expresión "molécula de unión a antígeno" incluye anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno, incluyendo, p. ej., anticuerpos biespecíficos.

El término "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, significa cualquier molécula o complejo molecular de unión a antígeno que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (^c D^r ) que se une específicamente a o interacciona con un antígeno particular (por ejemplo, PSMA o CD3). El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o V^h) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, C^h1, C^h2 y C^h3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o V^l) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (C^l1). Las regiones V^h y V^l pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada V^h y V^l está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En distintas realizaciones de la invención, las FR del anticuerpo anti-PSMA o anticuerpo anti-CD3 (o parte de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana o pueden estar modificadas de forma natural o artificial. Una secuencia de aminoácidos consenso puede definirse basándose en un análisis en paralelo de dos o más CDR.

El término "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, también incluye fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo y "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo, como se utiliza en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo, p. ej., de moléculas de anticuerpo completas, mediante cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas recombinantes de ingeniería genética que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables y, opcionalmente, constantes, de un anticuerpo. Dicho ADN se conoce y/o se puede adquirir fácilmente de, p. ej., fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, p. ej., fagotecas de anticuerpos) o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o mediante técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o eliminar aminoácidos, etc.

Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos de dominio eliminado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP, por sus siglas en inglés) y dominios IgNAR variables de tiburón, también se incluyen dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", tal como se utiliza en el presente documento.

Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que esté adyacente a o en fase con una o más secuencias marco. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio V^h asociado con un dominio V^l, los dominios V^h y V^l pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros V^h-V^h, V^h-V^l o V^l-V^l. De manera alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio V^h o V^l monomérico.

En ciertas realizaciones, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Configuraciones no limitantes, ilustrativas, de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención incluyen: (i) V^h-C^h1; (ii) V^h-C^h2; (iii) V^h-C^h3; (iv) V^h-C^h1-C^h2; (v) V^h-C^h1-C^h2-C^h3; (vi) V^h-C^h2-C^h3; (vii) V^h-C^l; (viii) V^l-C^h1; (ix) V^l-C^h2; (x) V^l-C^h3; (xi) V^l-C^h1-C^h2; (xii) V^l-C^h1-C^h2-C^h3; (xiii) V^l-C^h2-C^h3; y (xiv) V^l-C^l. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluida cualquiera de las configuraciones ilustrativas enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que producen un enlace flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Por otra parte, un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la presente invención puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios V^h o V^l monoméricos (por ejemplo, mediante enlace o enlaces disulfuro).

Como ocurre con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno diferente o a un epítopo distinto en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico ilustrativos que se divulgan en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención utilizando técnicas rutinarias disponibles en la materia.

Los anticuerpos de la presente invención pueden actuar mediante citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). "Citotoxicidad dependiente del complemento" (CDC) se refiere a lisis de células que expresan antígeno por un anticuerpo de la invención en presencia del complemento. "Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" (CCDA) se refiere a una reacción mediada por células en donde las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, células citolíticas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y de ese modo da lugar a la lisis de la célula diana. La CDC y la ADCC pueden medirse mediante ensayos que se conocen bien y están disponibles en la materia. (Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.500.362 y 5.821.337, y Clynes et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (EE. u U.) 95:652-656). La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo de fijar el complemento y mediar la citotoxicidad dependiente de células. Por tanto, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse basándose en si se desea que el anticuerpo medie la citotoxicidad.

Los anticuerpos monoespecíficos anti-PSMA o los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 pueden ser anticuerpos humanos. La expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria y específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias de CDR procedentes de la línea germinal de otras especies de mamífero, tales como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.

Los anticuerpos de la invención pueden, en algunas realizaciones, ser anticuerpos humanos recombinantes. La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se utiliza en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados o aislados por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante introducido por transfección en una célula hospedadora (que se describe en más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos humanos, recombinante (que se describe en más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos que son preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones V^h y V^l de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden de, y están relacionadas con, secuencias de V^h y V^l de la línea germinal humana, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que se asocian con la heterogeneidad de bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción de cuatro cadenas estable de aproximadamente 150 a 160 kDa en la que los dímeros se mantienen juntos mediante un enlace disulfuro intercate nario de la cadena pesada. En una segunda forma, los dímeros no están unidos mediante enlaces disulfuro intercatenarios y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa que comprende una cadena ligera y pesada acopladas covalentemente (semianticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de la purificación por afinidad.

La frecuencia de aparición de la segunda forma en diferentes isotipos de IgG inalterada se debe, p. ej., a diferencias estructurales asociadas con el isotipo de la región bisagra del anticuerpo. Una sustitución de un único aminoácido en la región bisagra de la bisagra de IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) hasta los niveles normalmente observados utilizando una bisagra de IgG1 humana. La presente invención abarca anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región bisagra, la región C^h2 o C^h3, que puede ser deseable, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.

Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos aislados. Un "anticuerpo aislado", como se utiliza en el presente documento, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o eliminado de al menos un componente de un organismo, o de un tejido o célula en donde el anticuerpo existe de forma natural o se produce de forma natural, es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente invención. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpo in situ dentro de una célula recombinante. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que se han sometido a al menos una etapa de purificación o aislamiento. De acuerdo con determinadas realizaciones, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o agentes químicos.

En el presente documento también se describen anticuerpos de un brazo que se unen a PSMA. Como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo de un brazo" significa una molécula de unión a antígeno que comprende una única cadena pesada de anticuerpo y una única cadena ligera de anticuerpo. Los anticuerpos de un brazo pueden comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR o CDR como se establece en la Tabla 1.

Los anticuerpos anti-PSMA o anti-PSMA/anti-CD3 divulgados en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes de las que proceden los anticuerpos. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento con secuencias de la línea germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que proceden de cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que se obtiene el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservativa del resto o restos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en el presente documento colectivamente "mutaciones de la línea germinal"). Un experto habitual en la materia, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera divulgadas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprendan una o más mutaciones individuales de la línea germinal o combinaciones de las mismas. En ciertos casos, todos los restos de la región marco y/o CDR dentro de los dominios V^h y/o V^l se retromutan a los restos encontrados en la secuencia de la línea germinal original de la que se obtuvo el anticuerpo. En otros casos, únicamente determinados restos se retromutan a la secuencia de línea germinal original, p. ej., únicamente los restos mutados encontrados dentro de los 8 primeros aminoácidos de FR1 o dentro de los 8 últimos aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otros casos, uno o más de entre el resto o los restos de la región marco conservada y/o de la CDR están mutados al resto o los restos correspondientes de una secuencia de la línea germinal diferente (es decir, una secuencia de la línea germinal diferente que es diferente de la secuencia de la línea germinal de la que derivó originariamente el anticuerpo). Es más, los anticuerpos pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, p. ej., en donde determinados restos individuales se mutan al resto correspondiente de una secuencia de línea germinal particular mientras que otros restos determinados que difieren de la secuencia de línea germinal original se mantienen o se mutan al resto correspondiente de una secuencia de línea germinal distinta. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden probarse fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, mayor afinidad de unión, propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), inmunogenicidad reducida, etc.

La presente divulgación también incluye anticuerpos anti-PSMA o anti-PSMA/anti-CD3 que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-PSMA o anti-PSMA/anti-CD3 que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR con, p. ej., 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservativas de aminoácidos respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR expuestas en la Tabla 1 del presente documento o como se describe en las Tablas 12, 14, 15, 18 y 20 del presente documento.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por tanto, distintos anticuerpos pueden unirse a distintas áreas de un antígeno y pueden tener distintos efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce mediante aminoácidos yuxtapuestos espacialmente de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En una determinada circunstancia, un epítopo puede incluir fracciones de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.

La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean de forma óptima con inserciones o eliminaciones de nucleótidos adecuadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente el 95 % y, más preferentemente, en al menos aproximadamente el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de las bases nucleotídicas, según se mide mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o Gap, como se analiza a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en algunas ocasiones, codificar un polipéptido que tenga la misma secuencia de aminoácidos o una sustancialmente similar que el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.

Aplicada a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT utilizando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos el 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es aquella en la que un resto de aminoácido está sustituido con otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para los expertos en la materia. Véase, p. ej., Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparaginaglutamina. De manera alternativa, un reemplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et a/. (1992) Science 256: 1443-1445. Un remplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide normalmente con un programa informático de análisis de secuencias. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares utilizando medidas de similitud asignadas a diferentes sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones conservativas de aminoácidos. Por poner un ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit que pueden utilizarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, p. ej., GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse utilizando FASTA utilizando parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) supra). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, utilizando parámetros por defecto. Véase, p. ej., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.

25:3389-402.

Mutaciones de la línea germinal

Los anticuerpos anti-CD3 que se divulgan en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes de las que proceden los anticuerpos.

En este documento se describen anticuerpos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que proceden de cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que procede el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservativa del resto o restos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en el presente documento colectivamente "mutaciones de la línea germinal") y tienen una unión débil o no detectable a un antígeno CD3. Varios de estos anticuerpos ilustrativos que reconocen CD3 se describen en las Tablas 12 y 18 del presente documento.

Es más, los anticuerpos pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, p. ej., en donde determinados restos individuales se mutan al resto correspondiente de una secuencia de línea germinal particular mientras que otros restos determinados que difieren de la secuencia de línea germinal original se mantienen o se mutan al resto correspondiente de una secuencia de línea germinal distinta. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden probarse con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, afinidad de unión débil o reducida, propiedades farmacocinéticas mejoradas o potenciadas, inmunogenicidad reducida, etc.

Se describe en el presente documento anticuerpos anti-CD3 que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-CD3 que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR con, p. ej., 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservativas de aminoácidos respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR expuestas en las Tablas 12, 14, 15, 18 y 20 del presente documento. Los anticuerpos y moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación comprenden una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes de las que se derivaron los dominios de unión a antígeno individuales, mientras se mantiene o mejora la unión deseada débil a no detectable al antígeno CD3. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es aquella en la que un resto de aminoácido está sustituido con otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína, es decir, la sustitución de aminoácidos mantiene o mejora la afinidad de unión débil a no detectable deseada en el caso de moléculas de unión anti-CD3. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos: valina-leucinaisoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. De manera alternativa, un remplazo conservador es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Un remplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

La presente divulgación también incluye moléculas de unión a antígeno que comprenden un dominio de unión a antígeno con una secuencia de aminoácidos de HCVR y/o CDR que es sustancialmente idéntica a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento, mientras se mantiene o mejora la afinidad débil deseada por el antígeno CD3. La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando se hace referencia a una secuencia de aminoácidos significa que dos secuencias de aminoácidos, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT utilizando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos el 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para los expertos en la materia. Véase, p. ej., Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331.

La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide normalmente con un programa informático de análisis de secuencias. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares utilizando medidas de similitud asignadas a diferentes sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones conservativas de aminoácidos. Por poner un ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit que pueden utilizarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, p. ej., GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse utilizando FASTA utilizando parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) supra). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, utilizando parámetros por defecto. Véase, p. ej., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.

25:3389-402.

Una vez obtenidos, los dominios de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal se probaron para determinar la afinidad de unión disminuida utilizando uno o más ensayos in vitro. Aunque los anticuerpos que reconocen un antígeno en particular generalmente se seleccionan para su propósito mediante la prueba de elevada (es decir, fuerte) afinidad de unión al antígeno, los anticuerpos de la presente invención presentan una unión débil o ninguna unión detectable. Se descubrió que las moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden uno o más dominios de unión a antígeno obtenidas de esta manera general resultan ventajosas como terapias tumorales impulsadas por la avidez.

Los métodos descritos en el presente documento pueden aportar beneficios inesperados, por ejemplo, mejores propiedades farmacocinéticas y una baja toxicidad para el paciente.

Propiedades de unión de los anticuerpos

Como se utiliza en el presente documento, el término "unión" en el contexto de la unión de un anticuerpo, inmunoglobulina, fragmento de unión a anticuerpo, o proteína que contiene Fc a cualquiera, p. ej., un antígeno predeterminado, tal como una proteína de la superficie celular o un fragmento de la misma, se refiere normalmente a una interacción o asociación entre un mínimo de dos entidades o estructuras moleculares, tal como una interacción de anticuerpo y antígeno.

Por poner un ejemplo, la afinidad de unión corresponde normalmente a un valor de K^d de aproximadamente 10'7 M o inferior, tal como aproximadamente 10'8 M o inferior, tal como aproximadamente 10'9 M o inferior cuando se determina mediante, por poner un ejemplo, tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés) en un instrumento BIAcore 3000 que utiliza el antígeno como ligando y el anticuerpo, Ig, fragmento de unión a anticuerpo o proteína que contiene Fc como analito (o antiligando). Las estrategias de unión basadas en células, tales como los análisis de unión de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés), también se utilizan de forma rutinaria, y los datos de FACS se correlacionan bien con otros métodos, tales como la unión por competición de radioligandos y la SPR (Benedict, CA, J Immunol Methods. 1997, 201(2):223-31; Geuijen, CA, et al. J Immunol Methods. 2005, 302(1-2):68-77).

En consecuencia, el anticuerpo o la proteína de unión a antígeno de la invención se une al antígeno predeterminado o molécula de la superficie celular (receptor) que tiene una afinidad correspondiente a un valor de K^d que es al menos diez veces inferior a su afinidad por unirse a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína). De acuerdo con la presente invención, la afinidad de un anticuerpo correspondiente a un valor de K^d que es igual o inferior a diez veces menor que un antígeno no específico puede considerarse unión no detectable, sin embargo, dicho anticuerpo puede emparejarse con un segundo brazo de unión a antígeno para la producción de un anticuerpo biespecífico de la invención.

El término "K^d"(M) se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción de anticuerpo y antígeno particular, o la constante de equilibrio de disociación de un anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo que se une a un antígeno. Existe una relación inversa entre la K^d y la afinidad de unión, por lo que cuanto menor es el valor de K^d, más alto, es decir, más fuerte, será la afinidad. Por tanto, las expresiones "afinidad mayor" o "afinidad más fuerte" se refieren a una mayor capacidad para formar una interacción y, por lo tanto, un valor de K^d menor y, por el contrario, las expresiones "afinidad menor" o "afinidad más débil" se refieren a una menor capacidad para formar una interacción y, por lo tanto, un valor de K^d mayor. En algunas circunstancias, una mayor afinidad de unión (o K^d) de una molécula particular (por ejemplo, anticuerpo) a su molécula asociada interactiva (por ejemplo, antígeno X) en comparación con la afinidad de unión de la molécula (por ejemplo, anticuerpo) a otra molécula asociada interactiva (por ejemplo, antígeno Y) puede expresarse como una relación de unión determinada mediante la división del valor de K^d más elevado (afinidad menor, o más débil) entre el valor de K^d más bajo (afinidad mayor, o más fuerte), por ejemplo, expresada como afinidad de unión 5 veces o 10 veces superior, según sea el caso.

El término "k^d"(s^-1 o 1/s) se refiere a la constante de velocidad de disociación de una interacción de anticuerpo y antígeno particular, o la constante de velocidad de disociación de un anticuerpo o fragmento de unión a anticuerpo. Dicho valor también se conoce como valor de k^off.

El término "k^a" (M^-1 * s^-1 o 1/M) se refiere a la constante de velocidad de asociación de una interacción de anticuerpo y antígeno particular, o la constante de velocidad de asociación de un anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo.

El término "K^a"(M-1 o 1/M) se refiere a la constante de equilibrio de asociación de una interacción de anticuerpo y antígeno particular, o la constante de equilibrio de asociación de un anticuerpo o fragmento de unión a anticuerpo. La constante de equilibrio de asociación se obtiene dividiendo la k^a entre la k^d .

El término "CE50" o "CE⁵⁰" se refiere a la concentración eficaz semimáxima, que incluye la concentración de un anticuerpo que induce una respuesta a medio camino entre el valor inicial y el máximo después de un tiempo de exposición específico. La CE⁵⁰ representa esencialmente la concentración de un anticuerpo donde se observa el 50 % de su efecto máximo. En ciertas realizaciones, el valor de CE⁵⁰ es igual a la concentración de un anticuerpo de la invención que proporciona una unión semimáxima a las células que expresan CD3 o antígeno asociado a tumores, según se determina mediante, por ejemplo, un análisis de unión de FACS. Por tanto, se observa una unión reducida o más débil con un aumento de la CE⁵⁰, o valor de concentración eficaz semimáxima.

En una realización, la unión disminuida puede definirse como un aumento de la concentración de anticuerpos CE⁵⁰ que permite la unión a la cantidad semimáxima de células diana.

En otra realización, el valor de CE⁵⁰ representa la concentración de un anticuerpo de la invención que provoca el agotamiento semimáximo de las células diana mediante la actividad citotóxica de los linfocitos T. Por tanto, se observa un aumento de la actividad citotóxica (por ejemplo, destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T) con una disminución de la CE⁵⁰, o el valor de concentración eficaz semimáxima.

Moléculas de unión a antígeno biespecíficas

Los anticuerpos pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véanse, p. ej., Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Los anticuerpos monoespecíficos anti-PSMA o los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 pueden unirse o expresarse junto con otra molécula funcional, p. ej., otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse de forma funcional (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión o especificidad de unión adicional.

El uso de la expresión "anticuerpo anti-CD3" o "anticuerpo anti-PSMA" en el presente documento pretende incluir tanto anticuerpos monoespecíficos anti-CD3 o anti-PSMA como anticuerpos biespecíficos que comprenden un brazo de unión a CD3 y un brazo de unión a PSMA. Por tanto, la presente invención incluye anticuerpos biespecíficos en donde un brazo de una inmunoglobulina se une a CD3 humano, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico del PSMA humano. El brazo de unión a CD3 puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR o CDR como se establece en las Tablas 12, 14, 15, 18 y 20 del presente documento.

En ciertas realizaciones, el brazo de unión a CD3 se une a CD3 humano e induce la activación de linfocitos T humanos. En ciertas realizaciones, el brazo de unión a CD3 se une de forma débil al CD3 humano e induce la activación de los linfocitos T humanos. En otras realizaciones, el brazo de unión a CD3 se une de forma débil a CD3 humano e induce la destrucción de células que expresan antígenos asociados a tumores en el contexto de un anticuerpo biespecífico o multiespecífico. En otras realizaciones, el brazo de unión a CD3 se une o se asocia de forma débil con CD3 humano y de macaco (mono) cangrejero, sin embargo, la interacción de unión no es detectable mediante ensayos in vitro conocidos en la materia. El brazo de unión a PSMA puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR o CDR como se establece en la Tabla 1 en el presente documento.

De acuerdo con determinadas realizaciones ilustrativas, la presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen de manera específica a CD3 y PSMA. En el presente documento dichas moléculas pueden denominarse, p. ej., moléculas biespecíficas "anti-CD3/anti-PSMA", o "anti-CD3xPSMA" o "CD3xPSMA", u otra terminología similar (por ejemplo, anti-PSMA/anti-CD3).

El término "PSMA", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la proteína PSMA humana a menos que se especifique que proviene de una especie no humana (por ejemplo, "PSMA de ratón", "PSMA de mono", etc.). La proteína PSMA humana tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1651.

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas mencionadas anteriormente que se unen específicamente a CD3 y a PSMA pueden comprender una molécula de unión a antígeno anti-CD3 que se une a CD3 con una afinidad de unión débil, tal como la que presenta una K^d superior a aproximadamente 40 nM, según se mide mediante un ensayo de unión por afinidad in vitro.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "molécula de unión a antígeno" significa una proteína, polipéptido o complejo molecular que comprende o consiste en al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) que sola, o junto con una o más CDR y/o regiones marco (FR) adicionales, se une específicamente a un determinado antígeno. En ciertas realizaciones, una molécula de unión a antígeno es un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo, como se definen esos términos en otras partes en el presente documento.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "molécula de unión a antígeno biespecífica" significa una proteína, polipéptido o complejo molecular que comprende al menos un primer dominio de unión a antígeno y un segundo dominio de unión a antígeno. Cada dominio de unión a antígeno dentro de la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende al menos una CDR que sola, o junto con una o más CDR y/o FR adicionales, se une específicamente a un determinado antígeno. En el contexto de la presente invención, el primer dominio de unión a antígeno se une específicamente a un primer antígeno (por ejemplo, CD3), y el segundo dominio de unión a antígeno se une específicamente a un segundo, antígeno distinto (por ejemplo, PSMA).

En determinadas realizaciones ilustrativas de la presente invención, la molécula de unión a antígeno biespecífica es un anticuerpo biespecífico. Cada dominio de unión a antígeno de un anticuerpo biespecífico comprende un dominio variable de cadena pesada (HCVR) y un dominio variable de cadena ligera (LCVR). En el contexto de una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un primer y un segundo dominios de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico), las ^c D^r del primer dominio de unión a antígeno pueden designarse con el prefijo "A1" y las CDR del segundo dominio de unión a antígeno pueden designarse con el prefijo "A2". Por tanto, en el presente documento las CDR del primer dominio de unión a antígeno pueden denominarse A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3; y las CDR del segundo dominio de unión a antígeno en el presente documento pueden denominarse A2-HCDR1, A2-HCDR2 y A2-HCDR3.

El primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno pueden estar conectados directa o indirectamente entre sí para formar una molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente invención. De manera alternativa, el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno pueden estar unidos a un dominio de multimerización separado. La asociación de un dominio de multimerización con otro dominio de multimerización facilita la asociación entre los dos dominios de unión a antígeno, formando así una molécula de unión a antígeno biespecífica. Como se utiliza en el presente documento, un "dominio de multimerización" es cualquier macromolécula, proteína, polipéptido, péptido o aminoácido que tiene la capacidad de asociarse con un segundo dominio de multimerización de la misma estructura o constitución o similar. Por ejemplo, un dominio de multimerización puede ser un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina C^h3. Un ejemplo no limitante de un componente de multimerización es una porción Fc de una inmunoglobulina (que comprende un dominio C^h2-C^h3), por ejemplo, un dominio Fc de una IgG seleccionada de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4, así como cualquier alotipo dentro de cada grupo de isotipo.

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención comprenderán normalmente dos dominios de multimerización, p. ej., dos dominios Fc que son cada uno de manera individual parte de una cadena pesada de anticuerpo separada. El primer y segundo dominios de multimerización pueden ser del mismo isotipo de IgG tal como, p. ej., IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4. De manera alternativa, el primer y segundo dominios de multimerización pueden ser de diferentes isotipos de IgG tales como, p. ej., IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4, etc.

En ciertas realizaciones, el dominio de multimerización es un fragmento Fc o una secuencia de aminoácidos de 1 a aproximadamente 200 aminoácidos de longitud que contiene al menos un resto de cisteína. En otras realizaciones, el dominio de multimerización es un resto de cisteína o un péptido corto que contiene cisteína. Otros dominios de multimerización incluyen péptidos o polipéptidos que comprenden o consisten en una cremallera de leucina, un motivo de bucle de hélice o un motivo de hélice superenrrollada.

Puede utilizarse cualquier formato o tecnología de anticuerpo biespecífico para preparar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene una primera especificidad de unión a antígeno puede unirse funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tal como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene una segunda especificidad de unión a antígeno para producir una molécula de unión a antígeno biespecífica. Otros formatos biespecíficos ilustrativos específicos que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención incluyen, p. ej., formatos biespecíficos basados en scFv o de diacuerpo, fusiones IgG-scFv, dominio variable doble (DVD)-Ig, cuadroma, botón en ojal, cadena ligera común (por ejemplo, cadena ligera común con "botón en ojal", etc.), Cross-Mab, CrossFab, (SEED)cuerpo, cremallera de leucina, Duocuerpo, IgG1/IgG2, Fab de acción doble (DAF)-IgG y formatos biespecíficos de Mab2 (véase, p. ej., Klein et al., 2012, "mAbs" 4:6, 1-11, y las referencias citadas en el mismo, para una revisión de los formatos anteriores).

En el contexto de moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención, los dominios de multimerización, p. ej., dominios Fc, pueden comprender uno o más cambios de aminoácidos (por ejemplo, inserciones, eliminaciones o sustituciones) en comparación con la versión de origen natural de tipo silvestre del dominio Fc. Por ejemplo, la invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden una o más modificaciones en el dominio Fc produciendo un dominio Fc modificado que tiene una interacción de unión modificada (porejemplo, mejorada o disminuida) entre Fc y FcRn. En una realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende una modificación en una región C^h2 o C^h3, en donde la modificación aumenta la afinidad del dominio Fc a FcRn en un entorno ácido (por ejemplo, en un endosoma donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones de Fc incluyen, p. ej., una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/^y /^f/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, ^l/^r /S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o Y); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F) y 434. En una realización, la modificación comprende una modificación en 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación en 428L, 259I (por ejemplo, V259I), y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación en 433K (por ejemplo, H433K) y una en 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación en 252, 254 y 256 (por ejemplo, 252Y, 254t y 256E); una modificación en 250Q y 428L (por ejemplo,T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P).

La presente invención también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio C^h3 y un segundo dominio C^h3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio C^h3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio C^h3 de Ig está unido a la proteína A y el segundo dominio C^h3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a la proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo C^h3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 8.586.713. Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo C^h3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356e , L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG4.

En ciertas realizaciones, el dominio Fc puede ser quimérico, que combina secuencias de Fc procedentes de más de un isotipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, un dominio Fc quimérico puede comprender parte o la totalidad de una secuencia C^h2 derivada de una región C^h2 de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, y parte o la totalidad de una secuencia C^h3 derivada de una IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. Un dominio Fc quimérico también puede contener una región bisagra quimérica. Por ejemplo, una bisagra quimérica puede comprender una secuencia de "bisagra superior", derivada de una región bisagra de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, junto con una secuencia de "bisagra inferior", derivada de una región bisagra de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. Un ejemplo particular de un dominio Fc quimérico que se puede incluir en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno establecidas en el presente documento comprende, desde el extremo N al extremo C: [C^h1 de IgG4] -[Bisagra superior de IgG4] -[Bisagra inferior de IgG2] -[C^h2 de IgG4] -[C^h3 de IgG4]. Otro ejemplo de un dominio Fc quimérico que se puede incluir en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno establecidas en el presente documento comprende, desde el extremo N al extremo C: [C^h1 de IgG1] - [Bisagra superior de IgG1] - [Bisagra inferior de IgG2] - [C^h2 de IgG4] -[C^h3 de IgG1]. Estos y otros ejemplos de dominios Fc quiméricos que pueden incluirse en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno de la presente invención se describen en la publicación de EE. UU. 2014/0243504, publicada el 28 de agosto de 2014. Los dominios Fc quiméricos que tienen estas disposiciones estructurales generales y variantes de los mismos, pueden tener alterada la unión al receptor de Fc, que a su vez afecta la función efectora de Fc.

En ciertas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno comprenden una cadena pesada de anticuerpo en donde la región de la región constante de cadena pesada (CH) comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % idéntica a una cualquiera de la SEQ ID NO: 1663, SEQ ID NO: 1664, SEQ ID NO: 1665, SEQ ID NO: 1666, SEQ ID NO: 1667, SEQ ID NO: 1668, SEQ ID NO: 1669, SEQ ID NO: 1670 SEQ ID NO: 1671 o SEQ ID NO: 1672. En algunas realizaciones, la región de la región constante de cadena pesada (CH) comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1663, SEQ ID NO: 1664, SEQ ID NO: 1665, SEQ ID NO: 1666, SEQ ID NO: 1667, SEQ ID NO: 1668, SEQ ID NO: 1669, SEQ ID NO: 1670, SEQ ID NO: 1671 y SEQ ID NO: 1672.

En otras realizaciones, las moléculas de unión a antígeno comprenden una cadena pesada de anticuerpo en donde el dominio Fc comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % idéntica a una cualquiera de la SEQ ID NO: 1673, SEQ ID NO: 1674, SEQ ID NO: 1675, SEQ ID NO: 1676, SEQ ID NO: 1677, SEQ ID NO: 1678, SEQ ID NO: 1679, SEQ ID NO: 1680, SEQ ID NO: 1681 o SEQ ID NO: 1682. En algunas realizaciones, el dominio Fc comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1673, SEQ ID NO: 1674, SEQ ID NO: 1675, SEQ ID NO: 1676, SEQ ID NO: 1677, SEQ ID NO: 1678, SEQ ID NO: 1679, SEQ ID NO: 1680, SEQ ID NO: 1681 y SEQ ID NO: 1682.

Variantes de secuencia

Los anticuerpos y las moléculas de unión a antígeno biespecíficas pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes de las que se derivaron los dominios de unión a antígeno individuales. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento con secuencias de la línea germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. Las moléculas de unión a antígeno pueden comprender dominios de unión a antígeno que se derivan de cualquiera de las secuencias de aminoácidos ilustrativas divulgadas en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que se obtiene el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservativa del resto o restos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en el presente documento colectivamente "mutaciones de la línea germinal"). Un experto habitual en la materia, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera divulgadas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprendan una o más mutaciones individuales de la línea germinal o combinaciones de las mismas. En ciertos casos, todos los restos de marco y/o CDR dentro de los dominios V^h y/o V^l se retromutan a los restos encontrados en la secuencia original de la línea germinal de la cual se originó originalmente el dominio de unión al antígeno. En otros casos, únicamente determinados restos se retromutan a la secuencia de línea germinal original, p. ej., únicamente los restos mutados encontrados dentro de los 8 primeros aminoácidos de FR1 o dentro de los 8 últimos aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otros casos, uno o más de entre el resto o restos del marco y/o CDR están mutados al resto o restos correspondientes de una secuencia de línea germinal diferente (es decir, una secuencia de la línea germinal que es diferente de la secuencia de la línea germinal de la cual se derivaba originalmente el dominio de unión a antígeno). Es más, los dominios de unión a antígeno pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, p. ej., en donde determinados restos individuales se mutan al resto correspondiente de una secuencia de línea germinal particular mientras que otros restos determinados que difieren de la secuencia de línea germinal original se mantienen o se mutan al resto correspondiente de una secuencia de línea germinal distinta. Una vez obtenidos, los dominios de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de línea germinal pueden analizarse fácilmente para una o más propiedades deseadas como, especificidad de unión mejorada, mayor afinidad de unión, propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), inmunogenicidad reducida, etc.

En el presente documento también se describen moléculas de unión a antígeno en donde uno o ambos dominios de unión a antígeno comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, las moléculas de unión a antígeno que comprenden un dominio de unión a antígeno que tiene secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR con, p. ej., 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservativas de aminoácidos respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR divulgadas en el presente documento. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es aquella en la que un resto de aminoácido está sustituido con otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparaginaglutamina. De manera alternativa, un remplazo conservador es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Un remplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

La presente divulgación también incluye moléculas de unión a antígeno que comprenden un dominio de unión a antígeno que tiene una secuencia de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR que sea sustancialmente idéntica a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o c Dr divulgadas en el presente documento. La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando se hace referencia a una secuencia de aminoácidos significa que dos secuencias de aminoácidos, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT utilizando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos el 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para los expertos en la materia. Véase, p. ej., Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331.

La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide normalmente con un programa informático de análisis de secuencias. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares utilizando medidas de similitud asignadas a diferentes sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones conservativas de aminoácidos. Por poner un ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit que pueden utilizarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, p. ej., GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse utilizando FASTA utilizando parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) supra). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, utilizando parámetros por defecto. Véanse, p. ej., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.

25:3389-402.

Unión dependiente del pH

En el presente documento se describen anticuerpos anti-PSMA, y moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA, con características de unión dependientes del pH. Por ejemplo, un anticuerpo anti-PSMA puede presentar una unión reducida a PSMA a pH ácido en comparación con el pH neutro. De manera alternativa, los anticuerpos anti-PSMA pueden presentar una unión mejorada a PSMA a pH ácido en comparación con el pH neutro. La expresión "pH ácido" incluye valores de pH inferiores a aproximadamente 6,2, p. ej., aproximadamente 6,0, 5,95, 5,9, 5,85, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,4, 5,35, 5,3, 5,25, 5,2, 5,15, 5,1, 5,05, 5,0 o inferior. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "pH neutro" significa un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7.4. La expresión "pH neutro" incluye valores de pH de aproximadamente 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35 y 7.4.

En algunas ocasiones, "unión reducida... a pH ácido en comparación con un pH neutro" se expresa en términos de una relación del valor de K^d del anticuerpo que se une a su antígeno a pH ácido respecto al valor de K^d del anticuerpo que se une a su antígeno a pH neutro (o viceversa). Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede considerarse que presenta "unión reducida a PSMA a pH ácido en comparación con pH neutro" si el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo presenta una relación de K^d ácida/neutra de aproximadamente 3,0 o superior. En determinadas realizaciones ilustrativas, la relación de K^d ácido/neutro para un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención puede ser aproximadamente 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6.5. 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 20,0. 25,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 100,0 o superior.

Se pueden obtener anticuerpos con características de unión dependientes del pH, p. ej., rastreando una población de anticuerpos para la unión reducida (o potenciada) a un antígeno particular a pH ácido en comparación con pH neutro. De forma adicional, las modificaciones del dominio de unión a antígeno a nivel de aminoácidos pueden producir anticuerpos con características dependientes del pH. Por ejemplo, mediante la sustitución de uno o más aminoácidos de un dominio de unión a antígeno (por ejemplo, dentro de una CDR) con un resto de histidina, puede obtenerse un anticuerpo con unión a antígeno reducida a pH ácido en relación con el pH neutro.

Anticuerpos que comprenden variantes Fc

De acuerdo con determinados aspectos de la presente divulgación, se proporcionan anticuerpos anti-PSMA y moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA que comprenden un dominio Fc que comprende una o más mutaciones que potencian o disminuyen la unión del anticuerpo al receptor FcRn, p. ej., a pH ácido en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos que comprenden una mutación en la región C^h2 o C^h3 del dominio Fc, en donde la mutación o mutaciones aumentan la afinidad del dominio Fc por FcRn en un entorno ácido (por ejemplo, en un endosoma en donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Dichas mutaciones pueden dar como resultado un aumento de la semivida en suero del anticuerpo cuando se administra a un animal. Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones de Fc incluyen, p. ej., una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, H/L/R/S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o Y); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F) y 434. En un aspecto, la modificación comprende una modificación en 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación en 428L, 259I (por ejemplo, V259I), y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación en 433K (por ejemplo, H433K) y una en 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación en 252, 254 y 256 (por ejemplo, 252Y, 254t y 256E); una modificación en 250Q y 428L (por ejemplo,T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P).

Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-PSMA y moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA, que comprenden un dominio Fc que comprende uno o más pares o grupos de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: 250Q y 248L (por ejemplo, T250Q y M248L); 252Y, 254T y 256E (por ejemplo, M252Y, S254T y T256E); 428L y 434S (por ejemplo, M428L y N434S); y 433K y 434F (por ejemplo, H433K y N434F).

Características biológicas de los anticuerpos y las moléculas de unión a antígeno biespecíficas

La presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a PSMA humano con alta afinidad (por ejemplo, valores de K^d subnanomolares).

De acuerdo con determinadas realizaciones, la presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos que se unen a PSMA humano (por ejemplo, a 37 °C) con una K^d inferior a aproximadamente 80 nM según se mide por resonancia de plasmón superficial, p. ej., mediante un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 en el presente documento. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se unen a PSMA con una K^d inferior a aproximadamente 5 nM, inferior a aproximadamente 2 nM, inferior a aproximadamente 1 nM, inferior a aproximadamente 800 pM, inferior a aproximadamente 600 pM, inferior a aproximadamente 500 pM, inferior a aproximadamente 400 pM, inferior a aproximadamente 300 pM, inferior a aproximadamente 200 pM, inferior a aproximadamente 180 pM, inferior a aproximadamente 160 pM, inferior a aproximadamente 140 pM, inferior a aproximadamente 120 pM, inferior a aproximadamente 100 pM, inferior a aproximadamente 80 pM, inferior a aproximadamente 60 pM, inferior a aproximadamente 40 pM, inferior a aproximadamente 20 pM o inferior a aproximadamente 10 pM, según se mide por resonancia de plasmón superficial, p. ej., utilizando un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 en el presente documento (por ejemplo, formato de captura de mAb o captura de antígeno), o un ensayo sustancialmente similar.

Se describe también en el presente documento anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a PSMA con una semivida disociativa (t1^ ) superior a aproximadamente 1 minuto o superior a aproximadamente 10 minutos, según se mide por resonancia de plasmón superficial a 37 °C, p. ej., mediante un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se unen a PSMA con una t1^ superior a aproximadamente 20 minutos, superior a aproximadamente 30 minutos, superior a aproximadamente 40 minutos, superior a aproximadamente 50 minutos, superior a aproximadamente 60 minutos, superior a aproximadamente 70 minutos, superior a aproximadamente 80 minutos, superior a aproximadamente 90 minutos, superior a aproximadamente 100 minutos, superior a aproximadamente 200 minutos, superior a aproximadamente 300 minutos, superior a aproximadamente 400 minutos, superior a aproximadamente 500 minutos, superior a aproximadamente 600 minutos, superior a aproximadamente 700 minutos, superior a aproximadamente 800 minutos, superior a aproximadamente 900 minutos, superior a aproximadamente 1000 minutos o superior a aproximadamente 1100 minutos, según se mide por resonancia de plasmón superficial a 25 °C o 37 °C, p. ej., utilizando un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 en el presente documento (por ejemplo, formato de captura de mAb o captura de antígeno), o un ensayo sustancialmente similar. La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) que pueden unirse simultáneamente a CD3 humano y a PSMA humano. De acuerdo con determinadas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención interactúan específicamente con las células que expresan CD3 y/o PSMA. El grado en que una molécula de unión a antígeno biespecífica se une a células que expresan CD3 y/o PSM^a se puede evaluar mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés), como se ilustra en el Ejemplo 5 en el presente documento. Por ejemplo, la presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen específicamente a líneas de linfocitos T humanos que expresan CD3 (por ejemplo, dichas líneas celulares no expresan PSMA, por ejemplo, Jurkat) y/o líneas humanas que expresan PSMA (dichas líneas celulares no expresan CD3, p. ej., B16F10.9/hPSMA o 22RV1). La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a cualquiera de las células y las líneas celulares mencionadas anteriormente con un valor de CE⁵⁰ de aproximadamente 80 nM, o menos, como se determina utilizando un ensayo FACS como se establece en el Ejemplo 5 o un ensayo sustancialmente similar.

La presente divulgación también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA que se unen a linfocitos T humanos que expresan CD3 (por ejemplo, Jurkat) y/o células que expresan PSMA con un valor de CE⁵⁰ de entre 1,0 pM y 1000 nM. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA pueden unirse a linfocitos T humanos que expresan CD3 con un valor de CE50 de entre 1 nM y 60 nM. Por ejemplo, en el presente documento se describen moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA que se unen a linfocitos T humanos que expresan CD3 (por ejemplo, Jurkat) y/o células que expresan PSMA con un valor de CE⁵⁰ de entre 1 pM y 10 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 2 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 20 nM, aproximadamente 30 nM, aproximadamente 40 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 60 nM, aproximadamente 70 nM, aproximadamente 80 nM, aproximadamente 90 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 300 nM, aproximadamente 500 nM, aproximadamente 800 nM, aproximadamente 1000 nM o mayor.

La presente invención también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA que presentan una o más características seleccionadas del grupo que consiste en: (a) inhibir el crecimiento tumoral en ratones inmunodeprimidos que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano; (b) inhibir el crecimiento tumoral en ratones inmunocompetentes que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano; (c) suprimir el crecimiento tumoral de tumores establecidos en ratones inmunodeprimidos que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano; y (d) reducir el crecimiento tumoral de tumores establecidos en ratones inmunocompetentes que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano (véase, p. ej., Ejemplo 8).

En el presente documento se divulgan anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CD3 humano con alta afinidad. La presente invención también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CD3 humano con afinidad media o baja, dependiendo del contexto terapéutico y las propiedades de direccionamiento particulares que se deseen. Por ejemplo, en el contexto de una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde un brazo se une a CD3 y otro brazo se une a un antígeno diana (por ejemplo, PSMA), puede ser deseable que el brazo de unión a antígeno diana se una al antígeno diana con alta afinidad mientras que el brazo anti-CD3 se une a CD3 solo con afinidad moderada o baja. De este modo, puede conseguirse la orientación preferente de la molécula de unión a antígeno a células que expresan el antígeno diana mientras se evita la unión de CD3 general/no dirigida y los consiguientes efectos secundarios adversos asociados con ella.

La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) que pueden unirse simultáneamente a CD3 humano y a un PSMA humano. El brazo de unión que interactúa con las células que expresan CD3 puede tener una unión débil a no detectable según se mide en un ensayo de unión in vitro. El grado en que una molécula de unión a antígeno biespecífica se une a células que expresan CD3 y/o PSMA se puede evaluar mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), como se ilustra en el Ejemplo 5.

Por ejemplo, en el presente documento se describen anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, y anticuerpos biespecíficos de los mismos que se unen específicamente a líneas de linfocitos T humanos que expresan CD3 pero no expresan PSMA (por ejemplo, Jurkat), linfocitos T de primates (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica [PBMC, por sus siglas en inglés] de macaco cangrejero) y/o células que expresan PSMA. La presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a cualquiera de los linfocitos T y líneas de linfocitos T mencionados anteriormente con un valor de CE⁵⁰ de aproximadamente 1,8 * 10^-8 (18 nM) a aproximadamente 2,1 * 10^-7 (210 nM) o más (es decir, afinidad más débil), o CE⁵⁰ es indetectable, como se determina utilizando un ensayo de unión de FACS como se establece en el Ejemplo 5 o un ensayo sustancialmente similar. Los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y los anticuerpos biespecíficos de la presente divulgación se unen a CD3 con una CE⁵⁰ superior a aproximadamente 30 nM, superior a aproximadamente 40 nM, superior a aproximadamente 45 nM, superior a aproximadamente 50 nM, superior a aproximadamente 55 nM, superior a aproximadamente 60 nM, superior a aproximadamente 65 nM, superior a aproximadamente 70 nM, superior a aproximadamente 75 nM, al menos 80 nM, superior a aproximadamente 90 nM, superior a aproximadamente 100 nM, superior a aproximadamente 110 nM, al menos 120 nM, superior a aproximadamente 130 nM, superior a aproximadamente 140 nM, superior a aproximadamente 150 nM, al menos 160 nM, superior a aproximadamente 170 nM, superior a aproximadamente 180 nM, superior a aproximadamente 190 nM, superior a aproximadamente 200 nM, superior a aproximadamente 250 nM, superior a aproximadamente 300 nM, superior a aproximadamente 1 pM, superior a aproximadamente 2 pM o superior a aproximadamente 3 pM o sin afinidad detectable, según se mide por la unión de FACS, p. ej., mediante un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 5 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.

La presente divulgación también incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos de los mismos que se unen a células y líneas celulares que expresan PSMA, con un valor de CE⁵⁰ inferior o igual a 5,6 nM (5,6 * 10^-9), según se determina utilizando un ensayo de unión de FACS como se establece en el Ejemplo 5 o un ensayo sustancialmente similar.

La presente invención incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos de los mismos que se unen a CD3 humano con una afinidad débil (es decir, baja) o incluso no detectable. De acuerdo con determinados aspectos, la presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos que se unen a CD3 humano (por ejemplo, a 37 °C) con una K^d inferior a aproximadamente 11 nM según se mide por resonancia de plasmón superficial, p. ej., mediante un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 6 en el presente documento. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se unen a CD3 con una K^d superior a aproximadamente 15 nM, superior a aproximadamente 20 nM, superior a aproximadamente 25 nM, superior a aproximadamente 30 nM, superior a aproximadamente 35 nM, superior a aproximadamente 40 nM, superior a aproximadamente 45 nM, superior a aproximadamente 50 nM, superior a aproximadamente 55 nM, superior a aproximadamente 60 nM, superior a aproximadamente 65 nM, superior a aproximadamente 70 nM, superior a aproximadamente 75 nM, al menos 80 nM, superior a aproximadamente 90 nM, superior a aproximadamente 100 nM, superior a aproximadamente 110 nM, al menos 120 nM, superior a aproximadamente 130 nM, superior a aproximadamente 140 nM, superior a aproximadamente 150 nM, al menos 160 nM, superior a aproximadamente 170 nM, superior a aproximadamente 180 nM, superior a aproximadamente 190 nM, superior a aproximadamente 200 nM, superior a aproximadamente 250 nM, superior a aproximadamente 300 nM, superior a aproximadamente 1 j M, superior a aproximadamente 2 j M o superior a aproximadamente 3 j M o sin afinidad detectable, según se mide por resonancia de plasmón superficial, p. ej., utilizando un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 6 en el presente documento (por ejemplo, formato de captura de mAb o captura de antígeno), o un ensayo sustancialmente similar.

La presente divulgación incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos de los mismos que se unen a CD3 de mono (es decir, macaco cangrejero) con una afinidad débil (es decir, baja) o incluso no detectable. De acuerdo con determinados aspectos, la presente divulgación incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos que se unen a CD3 humano (por ejemplo, a 37 °C) con una K^d superior a aproximadamente 10 nM, según se mide por resonancia de plasmón superficial, p. ej., mediante un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 6 en el presente documento. En ciertos aspectos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se unen a CD3 con una Kd superior a aproximadamente 15 nM, superior a aproximadamente 20 nM, superior a aproximadamente 25 nM, superior a aproximadamente 30 nM, superior a aproximadamente 35 nM, superior a aproximadamente 40 nM, superior a aproximadamente 45 nM, superior a aproximadamente 50 nM, superior a aproximadamente 55 nM, superior a aproximadamente 60 nM, superior a aproximadamente 65 nM, superior a aproximadamente 70 nM, superior a aproximadamente 75 nM, al menos 80 nM, superior a aproximadamente 90 nM, superior a aproximadamente 100 nM, superior a aproximadamente 110 nM, al menos 120 nM, superior a aproximadamente 130 nM, superior a aproximadamente 140 nM, superior a aproximadamente 150 nM, al menos 160 nM, superior a aproximadamente 170 nM, superior a aproximadamente 180 nM, superior a aproximadamente 190 nM, superior a aproximadamente 200 nM, superior a aproximadamente 250 nM, superior a aproximadamente 300 nM, superior a aproximadamente 1 j M, superior a aproximadamente 2 j M o superior a aproximadamente 3 j M o sin afinidad detectable, según se mide por resonancia de plasmón superficial, p. ej., utilizando un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 6 en el presente documento (por ejemplo, formato de captura de mAb o captura de antígeno), o un ensayo sustancialmente similar.

La presente divulgación incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos de los mismos que se unen a CD3 humano e inducen la activación de linfocitos T. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-CD3 que inducen la activación de linfocitos T humanos con un valor de CE⁵⁰ inferior a aproximadamente 113 pM, según se mide por un ensayo de activación de linfocitos T in vitro, p. ej., utilizando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 7 del presente documento [por ejemplo, evaluando el porcentaje de células activadas (CD69+) del total de linfocitos T (CD2+) en presencia de anticuerpos anti-CD3] o un ensayo sustancialmente similar que evalúe los linfocitos T en su estado activado. En ciertos aspectos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno inducen la activación de linfocitos T humanos [por ejemplo, el porcentaje de linfocitos T activados (CD69+)] con un valor de CE⁵⁰ inferior a aproximadamente 100 pM, inferior a aproximadamente 50 pM, inferior a aproximadamente 20 pM, inferior a aproximadamente 19 pM, inferior a aproximadamente 18 pM, inferior a aproximadamente 17 pM, inferior a aproximadamente 16 pM, inferior a aproximadamente 15 pM, inferior a aproximadamente 14 pM, inferior a aproximadamente 13 pM, inferior a aproximadamente 12 pM, inferior a aproximadamente 11 pM, inferior a aproximadamente 10 pM, inferior a aproximadamente 9 pM, inferior a aproximadamente 8 pM, inferior a aproximadamente 7 pM, inferior a aproximadamente 6 pM, inferior a aproximadamente 5 pM, inferior a aproximadamente 4 pM, inferior a aproximadamente 3 pM, inferior a aproximadamente 2 pM o inferior a aproximadamente 1 pM, según se mide por un ensayo de activación de linfocitos T in vitro, p. ej., utilizando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 7 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar. Los anticuerpos anti-CD3 que tienen una unión débil o no detectable a CD3 tienen la capacidad de inducir la activación de linfocitos T con potencia elevada (es decir, intervalo pM), a pesar de tener una afinidad de unión débil o no detectable a CD3, como se ejemplifica en el Ejemplo 7 en el presente documento.

La presente invención también incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígenos y anticuerpos biespecíficos que se unen a CD3 humano e inducen la destrucción mediada por linfocitos T de células que expresan antígenos tumorales. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-CD3 que inducen la destrucción mediada por linfocitos T de células tumorales con una CE⁵⁰ inferior a aproximadamente 1,3 nM, según se mide en un ensayo de destrucción de células tumorales in vitro mediada por linfocitos T, p. ej., utilizando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 7 en el presente documento (por ejemplo, evaluando el alcance de la destrucción de células que expresan PSMA por PBMC humanas en presencia de anticuerpos anti-CD3), o un ensayo sustancialmente similar. En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención inducen la destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T (por ejemplo, destrucción de células de C4-2, 22Rv1 y TRAMPC2_PSMA mediada por PBMC) con un valor de CE⁵⁰ inferior a aproximadamente 1 pM, inferior a aproximadamente 400 pM, inferior a aproximadamente 250 pM, inferior a aproximadamente 100 pM, inferior a aproximadamente 50 pM, inferior a aproximadamente 40 pM, inferior a aproximadamente 30 pM, inferior a aproximadamente 20 pM, inferior a aproximadamente 10 pM, inferior a aproximadamente 9 pM, inferior a aproximadamente 8 pM, inferior a aproximadamente 7 pM, inferior a aproximadamente 6 pM, inferior a aproximadamente 5 pM, inferior a aproximadamente 4 pM, inferior a aproximadamente 3 pM, inferior a aproximadamente 2 pM o inferior a aproximadamente 1 pM, según se mide por un ensayo de destrucción de células tumorales in vitro mediada por linfocitos T, p. ej., utilizando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 7 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar. La presente divulgación también incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, y anticuerpos biespecíficos que se unen a CD3 humano y/o de mono (es decir, macaco cangrejero) con afinidad débil (es decir, baja) o incluso no detectable (es decir, no se unen o no presentan afinidad detectable) e inducen la destrucción de células que expresan antígenos tumorales mediada por linfocitos T.

La presente divulgación también incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos que se unen a CD3 con una semivida disociativa (t1^ ) inferior a aproximadamente 10 minutos, según se mide por resonancia de plasmón superficial a 25 °C o 37 °C, p. ej., mediante un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 6 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar. En ciertos aspectos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se unen a CD3 con una t1^ inferior a aproximadamente 9 minutos, inferior a aproximadamente 8 minutos, inferior a aproximadamente 7 minutos, inferior a aproximadamente 6 minutos, inferior a aproximadamente 5 minutos, inferior a aproximadamente 4 minutos, inferior a aproximadamente 3 minutos, inferior a aproximadamente 2 minutos, inferior a aproximadamente 1,9 minutos o inferior a aproximadamente 1,8 minutos o presentan una unión muy débil o no detectable según se mide por resonancia de plasmón superficial a 25 °C o 37 °C, p. ej., utilizando un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 6 en el presente documento (por ejemplo, formato de captura de mAb o captura de antígeno), o un ensayo sustancialmente similar.

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA pueden presentar de manera adicional una o más características seleccionadas del grupo que consiste en: (a) inducir la proliferación in vitro de PBMC; (b) activar los linfocitos T mediante la inducción de la liberación de IFN-gamma y la regulación positiva de CD25 en sangre completa humana; y (c) inducir citotoxicidad mediada por linfocitos T en líneas celulares resistentes a anti-PSMA.

La presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA que son capaces de agotar las células que expresan antígenos tumorales en un sujeto (véase, por ejemplo, Ejemplo 8). Por ejemplo, de acuerdo con determinados aspectos, se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA, en donde una administración única de la molécula de unión a antígeno biespecífica de 1 |jg, o 10 |jg, o 100 |jg de la molécula de unión a antígeno biespecífica a un sujeto (por ejemplo, a una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,08 mg/kg, aproximadamente 0,06 mg/kg, aproximadamente 0,04 mg/kg, aproximadamente 0,04 mg/kg, aproximadamente 0,02 mg/kg, aproximadamente 0,01 mg/kg o menos) provoca una reducción en el número de células que expresan PSMA en el sujeto (por ejemplo, se suprime o inhibe el crecimiento tumoral en el sujeto) por debajo de los niveles detectables. En ciertos aspectos, una administración única de la molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-PSMA a una dosis de aproximadamente 0,4 mg/kg provoca una reducción en el crecimiento tumoral en el sujeto por debajo de los niveles detectables hacia aproximadamente el día 7, aproximadamente el día 6, aproximadamente el día 5, aproximadamente el día 4, aproximadamente el día 3, aproximadamente el día 2 o aproximadamente el día 1 después de la administración de la molécula de unión a antígeno biespecífica al sujeto. De acuerdo con determinados aspectos, una administración única de una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-PSMA de la invención, a una dosis de al menos aproximadamente 0,01 mg/kg, hace que el número de células tumorales que expresan PSMA permanezca por debajo de niveles detectables hasta al menos aproximadamente 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días o más, después de la administración. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "por debajo de los niveles detectables" significa que no se pueden detectar directa o indirectamente células tumorales que crezcan subcutáneamente en un sujeto utilizando métodos de medición de calibre estándar, p. ej., como se establece en el Ejemplo 8, en el presente documento.

La presente invención también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA que presentan una o más características seleccionadas del grupo que consiste en: (a) inhibir el crecimiento tumoral en ratones inmunodeprimidos que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano; (b) inhibir el crecimiento tumoral en ratones inmunocompetentes que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano; (c) suprimir el crecimiento tumoral de tumores establecidos en ratones inmunodeprimidos que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano; y (d) reducir el crecimiento tumoral de tumores establecidos en ratones inmunocompetentes que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano (véase, p. ej., Ejemplo 8). También se describen en el presente documento moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA que presentan una o más características seleccionadas del grupo que consiste en: (a) inducir aumentos transitorios dependientes de la dosis en citocinas circulantes, (b) inducir aumentos transitorios en los linfocitos T circulantes, y (c) no agotar los linfocitos T efectores (por ejemplo, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ y linfocitos T reguladores, es decir, Tregs).

Cartografía epitópica y tecnologías relacionadas

El epítopo en CD3 y/o PSMA al que se unen las moléculas de unión a antígeno de la presente invención puede consistir en una única secuencia contigua de 3 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos de una proteína CD3 o PSMA. De manera alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos no contiguos (o secuencias de aminoácidos) de CD3 o PSMA. Los anticuerpos de la invención pueden interactuar con aminoácidos contenidos dentro de una sola cadena CD3 (por ejemplo, CD3-épsilon, CD3-delta o CD3-gamma), o pueden interactuar con aminoácidos en dos o más cadenas de CD3 diferentes. El término "epítopo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por tanto, distintos anticuerpos pueden unirse a distintas áreas de un antígeno y pueden tener distintos efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce mediante aminoácidos yuxtapuestos espacialmente de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En determinadas circunstancias, un epítopo puede incluir fracciones de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.

Para determinar si un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo "interactúa con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o proteína se pueden utilizar diversas técnicas conocidas por los expertos en la materia. Las técnicas ilustrativas incluyen, p. ej., ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como el descrito en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), análisis mutacional de rastreo con alanina, análisis de transferencias de péptidos (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463) y análisis de escisión de péptidos. De manera adicional, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Otro método que puede utilizarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interactúa un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio hidrógeno/deuterio implica el marcaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo de proteína/anticuerpo se transfiere a agua para permitir que tenga lugar el intercambio de hidrógeno-deuterio en todos los restos, excepto en los restos protegidos por el anticuerpo (que permanecen marcados con deuterio). Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana es sometida a escisión por proteasas y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa el anticuerpo. Véanse, p. ej., Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem. 73:256a -265A. Para fines de cartografía epitópica también puede utilizarse cristalografía de rayos X del complejo antígeno/anticuerpo.

La presente divulgación incluye además anticuerpos anti-PSMA que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se establece en la Tabla 1 en el presente documento). Asimismo, la presente divulgación también incluye anticuerpos anti-PSMA que compiten por unirse a PSMA con cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se establece en la Tabla 1 en el presente documento).

La presente invención también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano y/o a CD3 de macaco cangrejero con afinidad de unión baja o detectable, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA humano, en donde el primer dominio de unión a antígeno se une al mismo epítopo en CD3 que cualquiera de los dominios de unión a antígeno específicos de CD3 ilustrativos descritos en el presente documento, y/o en donde el segundo dominio de unión a antígeno se une al mismo epítopo en PSMA que cualquiera de los dominios de unión a antígeno específicos de PSMA ilustrativos descritos en el presente documento.

Asimismo, la presente divulgación también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA humano, en donde el primer dominio de unión a antígeno compite por unirse a CD3 con cualquiera de los dominios de unión a antígeno específicos de CD3 ilustrativos descritos en el presente documento, y/o en donde el segundo dominio de unión a antígeno compite por unirse a PSMA con cualquiera de los dominios de unión a antígeno específicos de PSMA ilustrativos descritos en el presente documento.

Se puede determinar fácilmente si una molécula de unión a antígeno particular (por ejemplo, un anticuerpo) o un dominio de unión a antígeno de la misma se une al mismo epítopo que, o si compite por unirse a, una molécula de unión a antígeno de referencia utilizando métodos habituales conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo en PSMA (o CD3) como una molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia, primero se permite la unión de una molécula biespecífica de referencia a una proteína PSMA (o proteína CD3). A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo para unirse a la molécula PSMA (o CD3). Si el anticuerpo de ensayo puede unirse a PSMA (o CD3) después de unión de saturación con la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente de PSMA (o CD3) que la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no puede unirse a la molécula PSMA (o CD3) después de unión de saturación con la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo de PSMA (o CD3) que el epítopo unido por la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia. Después puede realizarse una experimentación de rutina adicional (por ejemplo, análisis de mutación de péptidos y unión peptídica) para confirmar si la falta observada de unión del anticuerpo de ensayo se debe realmente a la unión al mismo epítopo que la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la falta de unión observada. Los experimentos de este tipo pueden realizarse utilizando ELISA, RIA, Biacore, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la materia. Dos proteínas de unión a antígeno se unen al mismo epítopo (o superpuesto) si, p. ej., un exceso en un factor de 1, 5, 10, 20 o 100 veces de una proteína de unión a antígeno inhibe la unión de la otra en al menos el 50 %, pero preferentemente el 75 %, el 90 % o incluso el 99 %, según se mide en un ensayo de unión competitiva (véase, p. ej., Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). De manera alternativa, se considera que dos proteínas de unión a antígeno se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de una proteína de unión a antígeno reducen o eliminan la unión de la otra. Se considera que dos proteínas de unión a antígeno tienen "epítopos superpuestos" si solo un subconjunto de las mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de una proteína de unión a antígeno reduce o elimina la unión de la otra.

Para determinar si un anticuerpo o dominio de unión a antígeno del mismo compite por unirse con una molécula de unión a antígeno de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que la molécula de unión a antígeno de referencia se una a una proteína PSMA (o proteína CD3) en condiciones de saturación, seguido de evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula PSMA (o CD3). En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a una molécula PSMA (o CD3) en condiciones de saturación seguido de una evaluación de la unión de la molécula de unión a antígeno de referencia a la molécula PSMA (o CD3). Si, en ambas orientaciones, solo la primera molécula de unión a antígeno (saturante) es capaz de unirse a la molécula PSMA (o CD3), entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y la molécula de unión a antígeno de referencia compiten por unirse a PSMA (o CD3). Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo que compite por unirse con una molécula de unión a antígeno de referencia no necesariamente se une al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo superpuesto o adyacente.

Preparación de dominios de unión a antígeno y construcción de moléculas biespecíficas

Los dominios de unión a antígeno específicos para antígenos particulares pueden prepararse mediante cualquier tecnología generadora de anticuerpos conocida en la técnica. Una vez obtenidos, dos dominios de unión a antígeno diferentes, específicos para dos antígenos diferentes (por ejemplo, CD3 y PSMA), se pueden disponer de manera adecuada entre sí para producir una molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente invención utilizando métodos de rutina. (Una exposición de formatos de anticuerpos biespecíficos ilustrativos que se pueden utilizar para construir las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención se proporciona en otras partes en el presente documento). En ciertas realizaciones, uno o más de los componentes individuales (por ejemplo, cadenas pesadas y ligeras) de las moléculas de unión a antígeno multiespecíficas de la invención se derivan de anticuerpos quiméricos, humanizados o completamente humanos. Los métodos para fabricar tales anticuerpos se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, una o más de las cadenas pesadas y/o ligeras de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención se pueden preparar utilizando la tecnología VELOCIMMUNE™. Utilizando la tecnología VELOCIMMUNE™ (o cualquier otra tecnología de generación de anticuerpos humanos), se aíslan inicialmente los anticuerpos quiméricos de afinidad elevada contra un antígeno particular (por ejemplo, CD3 o PSMA) que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Los anticuerpos se caracterizan y seleccionan por características deseables, que incluyen afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se reemplazan con una región constante humana deseada para generar cadenas pesadas y/o ligeras completamente humanas que pueden incorporarse en las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención.

Los animales genéticamente modificados pueden utilizarse para hacer moléculas de unión a antígeno biespecíficas humanas. Por ejemplo, puede utilizarse un ratón genéticamente modificado que es incapaz de reorganizar y expresar una secuencia variable de cadena ligera de inmunoglobulina endógena de ratón, en donde el ratón expresa solo uno o dos dominios variables de cadena ligera humana codificados por secuencias de inmunoglobulina humana unidas operativamente al gen constante kappa de ratón en el locus kappa de ratón endógeno. Dichos ratones genéticamente modificados pueden utilizarse para producir moléculas de unión a antígeno biespecíficas completamente humanas que comprendan dos cadenas pesadas diferentes que se asocien con una cadena ligera idéntica que comprenda un dominio variable procedente de uno de dos segmentos génicos de región variable de cadena ligera humana diferentes. (Véase, por ejemplo, el documento US 2011/0195454 para una exposición detallada de dichos ratones genomanipulados y su uso para producir moléculas de unión a antígeno biespecíficas).

Bioequivalentes

En el presente documento se divulgan moléculas de unión a antígeno que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de las moléculas ilustrativas divulgadas en el presente documento pero que retienen la capacidad de unirse a CD3 y/o PSMA. Dichas moléculas variantes pueden comprender una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia precursora, pero presentan actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas descritas.

La presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno que son bioequivalentes a cualquiera de las moléculas de unión a antígeno ilustrativas expuestas en el presente documento. Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya velocidad y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, ya sea en una única dosis o en múltiples dosis. Algunas proteínas de unión a antígeno se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción, pero no en su velocidad de absorción y, sin embargo, pueden considerarse bioequivalentes porque tales diferencias en la velocidad de absorción son intencionales y se reflejan en el mareaje, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo en, p. ej., el uso crónico, y se consideran médicamente irrelevantes para el fármaco estudiado en concreto.

Dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente significativas en su seguridad, pureza y potencia.

Dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad o eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.

Dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan mediante un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la afección o afecciones de uso, en la medida en que se conozcan dichos mecanismos.

La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, p. ej., (a) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en el que se mide la concentración del anticuerpo o sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico como una función del tiempo; (b) una prueba in vitro que se ha correlacionado con y es razonablemente predictiva de datos de biodisponibilidad in vivo en seres humanos; (c) una prueba in vivo en seres humanos u otros mamíferos en donde se mide el efecto farmacológico agudo adecuado del anticuerpo (o su diana) en función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia, o biodisponibilidad o bioequivalencia de una proteína de unión a antígeno.

Las variantes bioequivalentes de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas ilustrativas expuestas en el presente documento pueden construirse mediante, por ejemplo, la generación de diferentes sustituciones de restos o secuencias o la eliminación de secuencias o restos terminales o internos no necesarios para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden eliminarse restos de cisteína no esenciales para la actividad biológica, o remplazarse por otros aminoácidos, para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, las proteínas de unión a antígeno bioequivalentes pueden incluir variantes de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas ilustrativas expuestas en el presente documento que comprenden cambios de aminoácidos que modifican las características de glucosilación de las moléculas, p. ej., mutaciones que eliminan o retiran la glucosilación.

Selectividad de especie y reactividad cruzada de especie

De acuerdo con determinados aspectos de la divulgación, se proporcionan moléculas de unión a antígeno que se unen a CD3 humano, pero no a CD3 de otras especies. También se proporcionan moléculas de unión a antígeno que se unen a PSMA humano pero no a PSMA de otras especies. La presente invención también incluye moléculas de unión a antígeno que se unen a CD3 humano y a CD3 de una o más especies no humanas; y/o moléculas de unión a antígeno que se unen a PSMA humano y a PSMA de una o más especies no humanas.

De acuerdo con determinados aspectos ilustrativos de la divulgación, se proporcionan moléculas de unión a antígeno que se unen a CD3 humano y/o a PSMA humano y que pueden unirse o no unirse, según sea el caso, a uno o más de CD3 y/o PSMA de ratón, rata, cobaya, hámster, jerbo, cerdo, gato, perro, conejo, cabra, oveja, vaca, caballo, camello, mono cangrejero, tití, rhesus o chimpancé. Por ejemplo, se describen moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3 humano y a CD3 de mono cangrejero, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA humano.

Inmunoconjugados

La presente invención abarca moléculas de unión a antígeno conjugadas con una fracción terapéutica ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunodepresor o un radioisótopo. Los agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. En la materia se conocen ejemplos de agentes citotóxicos y agentes quimioterápicos adecuados para formar inmunoconjugados, (véase, por ejemplo, el documento WO 05/103081).

Formulación terapéutica y administración

La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de unión a antígeno de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención se formulan con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que proporcionan una mejor transferencia, administración y tolerancia. En el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos se puede encontrar multitud de formulaciones adecuadas: "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LlPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Véase también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

La dosis de la molécula de unión a antígeno administrada a un paciente puede variar, por ejemplo, según la edad y la talla del paciente, la enfermedad diana, las afecciones y la vía de administración. La dosis preferida normalmente se calcula de acuerdo con el peso corporal o la superficie corporal. Cuando una molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente invención se utiliza con fines terapéuticos en un paciente adulto, puede ser ventajoso administrar por vía intravenosa la molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente invención normalmente a una dosis única de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. Las dosis eficaces y los programas para administrar una molécula de unión a antígeno biespecífica pueden determinarse empíricamente; por ejemplo, puede controlarse el progreso del paciente mediante evaluación periódica, y ajustarse la dosis en consecuencia. Por otra parte, pueden realizarse aumentos graduales de las dosis entre especies utilizando métodos bien conocidos en la materia (por ejemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).

Se conocen diversos sistemas de administración y pueden utilizarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, p. ej., encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, p. ej., Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, p. ej., vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y una jeringa convencionales. De manera adicional, con respecto a la administración subcutánea, un dispositivo inyector de pluma tiene fácilmente aplicaciones en la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. Dicho dispositivo inyector de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo inyector de pluma reutilizable utiliza generalmente un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y sustituirse por un nuevo cartucho que contenga la composición farmacéutica. El dispositivo inyector de pluma puede entonces reutilizarse. En un dispositivo inyector de pluma desechable, no hay cartucho sustituible. Más bien, el dispositivo inyector de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, se desecha todo el dispositivo.

Numerosos dispositivos inyectores de pluma y autoinyectores reutilizables tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, p. ej., AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DlSETRONlC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Ejemplos de dispositivos inyectores de pluma desechables que tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, p. ej., la pluma SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), la FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y la KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), la PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), la EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar solo algunos.

En determinadas situaciones, la composición farmacéutica se puede administrar en un sistema de liberación controlada. Puede utilizarse una bomba (véase Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). Pueden utilizarse materiales poliméricos; véase, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Ratón, Florida. Puede colocarse en las proximidades de la diana de la composición un sistema de liberación controlada, siendo necesaria, por tanto, solo una fracción de la dosis sistémica (véase, p. ej., Goodson, 1984, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, págs. 115-138). Se analizan otros sistemas de liberación controlada en la revisión de Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

Las preparaciones inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse mediante métodos conocidos por el público en general. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, p. ej., mediante disolución, suspensión o emulsión del anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o un medio oleoso utilizado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que pueden utilizarse junto con un agente de solubilización apropiado, tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleaginoso, se emplean, p. ej., aceite de sésamo, aceite de soja, etc., los cuales pueden utilizarse junto con un agente de solubilización tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se carga preferentemente en una ampolla apropiada.

De manera ventajosa, las composiciones farmacéuticas para su uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas farmacéuticas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, pastillas, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente contenida es generalmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma farmacéutica en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo anteriormente mencionado esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas farmacéuticas.

Usos terapéuticos de las moléculas de unión a antígeno

La presente divulgación incluye métodos que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una composición terapéutica que comprende un anticuerpo anti-PSMA o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une específicamente a CD3 y a PSMA. La composición terapéutica puede comprender cualquiera de los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas divulgadas en el presente documento y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "un sujeto que lo necesita" se refiere a un ser humano o animal no humano que presenta uno o más síntomas o indicios de cáncer (por ejemplo, un sujeto que expresa un tumor o padece cualquiera de los cánceres mencionados a continuación en el presente documento) o que, de otro modo, se beneficiarían de una inhibición o reducción de la actividad de PSMA o de un agotamiento de las células PSMA+ (por ejemplo, células de cáncer de próstata).

Los anticuerpos y las moléculas de unión a antígeno biespecíficas se describen en el presente documento (y composiciones terapéuticas que los comprenden) son útiles, entre otras cosas, para tratar cualquier enfermedad o trastorno en donde la estimulación, activación y/u orientación de una respuesta inmunitaria sería beneficiosa. En particular, los anticuerpos anti-PSMA o las moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-PSMA pueden utilizarse para el tratamiento, la prevención y/o la mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado o mediado por expresión o actividad de PSMA o proliferación de células PSMA+. El mecanismo de acción mediante el cual se logran los métodos terapéuticos incluye destrucción de células que expresan PSMA en presencia de células efectoras, por ejemplo, mediante CDC, apoptosis, ADCC, fagocitosis, o por una combinación de dos o más de estos mecanismos. Las células que expresan PSMA que pueden inhibirse o destruirse utilizando las moléculas de unión a antígeno biespecíficas incluyen, por ejemplo, células de tumor de próstata.

Las moléculas de unión a antígeno de la presente invención pueden utilizarse para tratar, p. ej., tumores primarios y/o metastásicos que surgen en el tracto gastrointestinal, próstata, riñón y/o vejiga. En ciertas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención se utilizan para tratar uno o más de los siguientes cánceres: carcinoma renal de células claras, carcinoma de células renales cromófobo, oncocitoma (renal), carcinoma de células de transición (renal), cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, carcinoma urotelial, adenocarcinoma (de vejiga) o carcinoma microcítico (de vejiga). Los anticuerpos anti-PSMA o los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA/anti-^c D3 son útiles para tratar a un paciente afectado por cáncer de próstata resistente a la castración. De acuerdo con otros aspectos relacionados de la divulgación, se proporcionan métodos que comprenden administrar una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-PSMA como se divulga en el presente documento a un paciente que padece un cáncer de próstata resistente a la castración. Pueden utilizarse métodos analíticos/diagnósticos conocidos en la materia, como exploración tumoral, etc., para determinar si un paciente alberga un tumor que es resistente a la castración.

La presente divulgación también incluye métodos para tratar el cáncer residual en un sujeto. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "cáncer residual" significa la existencia o persistencia de una o más células cancerosas en un sujeto después de tratamiento con una terapia anticáncer.

De acuerdo con determinados aspectos, la presente divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad o un trastorno asociado con la expresión de PSMA (por ejemplo, cáncer de próstata) que comprende administrar una o más de las moléculas de unión a antígeno o biespecíficas anti-PSMA descritas en otra parte del presente documento a un sujeto después de que se haya determinado que el sujeto tiene cáncer de próstata (por ejemplo, cáncer de próstata resistente a la castración). Por ejemplo, se describen los métodos para tratar el cáncer de próstata que comprenden la administración de un anticuerpo anti-PSMA o una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-PSMA a un paciente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas, 2 meses, 4 meses, 6 meses, 8 meses, 1 año o más después de que el sujeto haya recibido terapia hormonal (por ejemplo, terapia antiandrogénica) en el presente documento.

Terapias y formulaciones de combinación

En el presente documento se divulgan métodos que comprenden administrar una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los ejemplos de anticuerpos y moléculas de unión a antígeno biespecíficas descritas en el presente documento junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los agentes terapéuticos adicionales ilustrativos que pueden combinarse o administrarse junto con una molécula de unión a antígeno incluyen, p. ej., un antagonista de EGFR (por ejemplo, un anticuerpo anti-EGFR [por ejemplo, cetuximab o panitumumab] o inhibidor de molécula pequeña de EGFR [por ejemplo, gefitinib o erlotinib]), un antagonista de otro miembro de la familia EGFR tal como Her2/ErbB2, ErbB3 o ErbB4 (por ejemplo, anticuerpo anti-ErbB2, anti-ErbB3 o anti-ErbB4 o inhibidor de molécula pequeña de la actividad de ErbB2, ErbB3 o ErbB4), un antagonista de EGFRvIII (por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a EGFRvlll), un antagonista de cMET (por ejemplo, un anticuerpo anti-cMET), un antagonista de IGF1R (por ejemplo, un anticuerpo anti-IGF1R), un inhibidor de B-raf (por ejemplo, vemurafenib, sorafenib, GDC-0879, PLX-4720), un inhibidor de PDGFR-a (por ejemplo, un anticuerpo anti-pDGFR-a), un inhibidor de PDGFR-p (por ejemplo, un anticuerpo anti-PDGFR-p), un antagonista de VEGF (por ejemplo, una trampa de VEGF, véase, p. ej., el documento US 7087411 (también denominado en el presente documento "proteína de fusión inhibidora de Ve Gf"), anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, bevacizumab), un inhibidor de cinasa de molécula pequeña del receptor de VEGF (por ejemplo, sunitinib, sorafenib o pazopanib)), un antagonista DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo anti-DLL4 divulgado en el documento US 2009/0142354 tal como REGN421), un antagonista de Ang2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-Ang2 divulgado en el documento US 2011/0027286 tal como H1H685P), un antagonista de FOLH1 (Ps Ma ), un antagonista de PRLR (por ejemplo, un anticuerpo anti-PRLR), un antagonista de STEAP1 o STEAP2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-STEAP1 o un anticuerpo anti-STEAP2), un antagonista de TMPRSS2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-TMPRSS2), un antagonista de MSLN (por ejemplo, un anticuerpo anti-MSLN), un antagonista de CA9 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CA9), un antagonista de uroplaquina (por ejemplo, un anticuerpo antiuroplaquina), etc. Otros agentes que pueden administrarse de manera beneficiosa en combinación con las moléculas de unión a antígeno de la invención incluyen inhibidores de citocinas, incluyendo inhibidores de citocina de molécula pequeña y anticuerpos que se unen a citocinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18 o a sus receptores respectivos. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención (por ejemplo, composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-PSMA como se divulga en el presente documento) también pueden administrarse como parte de un régimen terapéutico que comprende una o más combinaciones terapéuticas seleccionadas entre "ICE": ifosfamida (por ejemplo, Ifex®), carboplatino (por ejemplo, Paraplatin®), etopósido (p.ej., Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16); "DHAP": dexametasona (por ejemplo, Decadron®), citarabina (por ejemplo, Cytosar-U®, arabinósido de citosina, ara-C), cisplatino (por ejemplo, Platinol®-AQ); y "ESHAP": etopósido (p.ej., Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16), metilprednisolona (por ejemplo, Medrol®), dosis altas de citarabina, cisplatino (por ejemplo, Platinol®-AQ).

También se describen en el presente documento combinaciones terapéuticas que comprenden cualquiera de las moléculas de unión a antígeno mencionadas en el presente documento y un inhibidor de uno o más de VEGF, Ang2, DLL4, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvlll, cMet, IGF1R, B-raf, PDGFR-a, PDGFR-p, FOLH1 (PSMA), PRLR, STEAP1, STEAP2, TMPRSS2, MSLN, CA9, uroplaquina o cualquiera de las citocinas mencionadas anteriormente, en donde el inhibidor es un aptámero, una molécula antisentido, una ribozima, un ARNip, un pepticuerpo, un nanocuerpo o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, fragmento Fab; fragmento F(ab')2; fragmento Fd; fragmento Fv; scFv; fragmento dAb; u otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos y unidades de reconocimiento mínimas). Las moléculas de unión a antígeno también pueden administrarse y/o formularse de manera conjunta en combinación con antivíricos, antibióticos, analgésicos, corticosteroides y/o AlNE. Las moléculas de unión a antígeno también pueden administrarse como parte de un régimen de tratamiento que también incluye tratamiento con radiación y/o quimioterapia convencional.

El componente o componentes terapéuticamente activos adicionales pueden administrarse justo antes, de manera simultánea o poco después de la administración de una molécula de unión a antígeno; (para los fines de la presente divulgación, dichos regímenes de administración se consideran la administración de una molécula de unión a antígeno "en combinación con" un componente terapéuticamente activo adicional).

La presente divulgación incluye composiciones farmacéuticas en donde una molécula de unión a antígeno de la presente invención se formula junto con uno o más de los componentes terapéuticamente activos adicionales como se describe en otra parte del presente documento.

Regímenes de administración

Pueden administrarse dosis múltiples de una molécula de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo anti-PSMA o una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une específicamente a Ps Ma y a CD3) a un sujeto durante un periodo de tiempo definido. Los métodos de acuerdo con este aspecto comprenden administrar de manera secuencial a un sujeto múltiples dosis de una molécula de unión a antígeno. Como se utiliza en el presente documento, "administrar de manera secuencial" significa que cada dosis de una molécula de unión a antígeno se administra al sujeto en un momento diferente, p. ej., en días diferentes separados por un intervalo predeterminado (por ejemplo, horas, días, semanas o meses). La presente divulgación incluye métodos que comprenden administrar de manera secuencial al paciente una dosis inicial única de una molécula de unión a antígeno, seguido de una o más dosis secundarias de la molécula de unión a antígeno, y opcionalmente seguido de una o más dosis terciarias de la molécula de unión a antígeno.

Las expresiones "dosis inicial", "dosis secundarias", y "dosis terciarias", se refieren a la secuencia temporal de administración de la molécula de unión a antígeno. Por tanto, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al inicio del régimen de tratamiento (también denominada "dosis de referencia"); las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial; y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. Las dosis inicial, secundaria y terciaria pueden contener la misma cantidad de la molécula de unión a antígeno, pero generalmente pueden diferir entre sí en términos de frecuencia de administración. En ciertas realizaciones, sin embargo, la cantidad de una molécula de unión a antígeno contenida en las dosis inicial, secundaria y/o terciaria varían entre sí (por ejemplo, ajustadas hacia arriba o hacia abajo según corresponda) durante el transcurso del tratamiento. En ciertos casos, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) dosis al comienzo del régimen de tratamiento como "dosis de carga" seguidas de dosis posteriores que se administran con menos frecuencia (por ejemplo, "dosis de mantenimiento").

En un aspecto ilustrativo de la presente divulgación, cada dosis secundaria y/o terciaria se administra de 1 a 26 (por ejemplo, 1, 1 / , 2, 2 / , 3, 3 / , 4, 41/ 2, 5, 51/ 2, 6, 61/ 2, 7, 71/ 2, 8, 81/ 2, 9, 91/ 2, 10, 101/ 2, 11, 11 /, 12, 121/ 2, 13, 131/ 2, 14, 141/ 2, 15, 15 /, 16, 16 /, 17, 17 /, 18, 18 /, 19, 19 /, 20, 20 /, 21,21 /, 22, 22 /, 23, 23 /, 24, 24 /, 25, 25 /, 26, 26 / o más) semanas después de la dosis inmediatamente anterior. La expresión "la dosis inmediatamente anterior", como se utiliza en el presente documento, significa, en una secuencia de administraciones múltiples, la dosis de la molécula de unión a antígeno que se administra a un paciente antes de la administración de la siguiente dosis en la secuencia sin dosis intermedias.

Los métodos de acuerdo con este aspecto de la divulgación pueden comprender la administración a un paciente de cualquier número de dosis secundarias y/o terciarias de una molécula de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo anti-PSMA o una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une específicamente a PSMA y a CD3). Por ejemplo, en ciertos casos, solo se administra una dosis secundaria única al paciente. En otros casos, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis secundarias al paciente. Asimismo, en ciertos casos, solo se administra una dosis terciaria única al paciente. En otras realizaciones, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis terciarias al paciente.

En casos que implican múltiples dosis secundarias, cada dosis secundaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis secundarias. Por ejemplo, cada dosis secundaria puede administrarse al paciente de 1 a 2 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. De manera similar, en casos que implican múltiples dosis terciarias, cada dosis terciaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis terciarias. Por ejemplo, cada dosis terciaria puede administrarse al paciente de 2 a 4 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. De manera alternativa, la frecuencia a la que se administran las dosis secundarias y/o terciarias a un paciente puede variar en el transcurso del régimen de tratamiento. La frecuencia de administración también puede ajustarla un médico en el transcurso del tratamiento, dependiendo de las necesidades del paciente individual después del examen clínico.

Usos de diagnóstico de los anticuerpos

Los anticuerpos anti-PSMA también pueden utilizarse para detectar y/o medir PSMA, o células que expresan PSMA, en una muestra, p. ej., con fines diagnósticos. Por ejemplo, un anticuerpo anti-PSMA, o un fragmento del mismo, puede utilizarse para diagnosticar una afección o enfermedad caracterizada por la expresión anómala (por ejemplo, la sobreexpresión, subexpresión, ausencia de expresión, etc.) del PSMA. Los ensayos diagnósticos ilustrativos para el PSMA pueden comprender, p. ej., poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-PSMA, en donde el anticuerpo anti-PSMA está marcado con una etiqueta detectable o molécula indicadora. De manera alternativa, un anticuerpo anti-PSMA sin marcar puede utilizarse en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que está marcado de manera detectable. El marcador detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I; una fracción fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa. Otro uso de diagnóstico ilustrativo de los anticuerpos anti-PSMA incluye el anticuerpo marcado con 89Zr, tal como el anticuerpo marcado con 89Zr-desferrioxamina, con el fin de la identificación no invasiva y rastreo de células tumorales en un sujeto (por ejemplo, formación de imágenes de tomografía por emisión de positrones (PET, por sus siglas en inglés)). (Véanse, por ejemplo, Tavare, R. et al. Cancer Res. 1 de enero de 2016;76(1):73-82; y Azad, BB. et al. Oncotarget. 15 de marzo de 2016;7(11):12344-58.) Los ensayos específicos ilustrativos que pueden utilizarse para detectar o medir al PSMA en una muestra incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés), radioinmunoanálisis (RIA, por sus siglas en inglés) y clasificación de células activada por fluorescencia (FACS).

Las muestras que pueden utilizarse en ensayos de diagnóstico de PSMA incluyen cualquier tejido o muestra de fluido que se puede obtener de un paciente que contiene cantidades detectables de proteína PSMA o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. Por lo general, se medirán los niveles de PSMA en una muestra particular obtenida de un paciente sano (por ejemplo, un paciente no afectado por una enfermedad o afección asociada a niveles o actividad de PSMA anómalos) para establecer inicialmente un nivel basal, o patrón, de PSMA. Este nivel inicial de PSMA se puede comparar entonces con los niveles de PSMA medidos en muestras obtenidas de individuos de los que se sospecha que tienen una enfermedad o afección relacionada con PSMA (por ejemplo, un tumor que contiene células que expresan PSMA).

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completas de cómo hacer y utilizar los métodos y composiciones de la invención, Se ha intentado garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos anti-PSMA

Los anticuerpos anti-PSMA se obtuvieron mediante la inmunización de un ratón genéticamente modificado con un antígeno PSMA humano o mediante la inmunización de un ratón genéticamente modificado que comprende ADN que codifica las regiones variables de cadena ligera y pesada kappa de inmunoglobulina humana con un antígeno PSM^a humano.

Se inmunizó a ratones con células de cáncer de próstata humano (LNCaP, ATTC®, Manassas, Virginia, EE. UU.) que expresaban PSMA humano (SEQ ID NO: 1651; UniProtKB/Swiss-Prot. N.° Q04609). Después de la inmunización, se extrajeron esplenocitos de cada ratón y (1) se fusionaron con células de mieloma de ratón para preservar su viabilidad y formar células de hibridoma, y se analizaron para determinar la especificidad de PSMA, o (2) se clasificaron los linfocitos B (como se describe en el documento US 2007/0280945A1) mediante un PSMA humano con una etiqueta N-terminal 6-His (R&D, N.° de Cat. 4234-ZN) como reactivo de clasificación que se une e identifica anticuerpos reactivos (linfocitos B positivos a antígeno).

Inicialmente se aislaron anticuerpos quiméricos contra PSMA que tenían una región variable humana y una región constante de ratón. Los anticuerpos se caracterizaron y seleccionaron en cuanto a características deseables, que incluyen afinidad, selectividad, etc. Cuando fue necesario, las regiones constantes de ratón se reemplazaron por una región constante humana deseada, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificadas, para generar un anticuerpo anti-PSMA completamente humano. Si bien la región constante seleccionada puede variar según el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable. Las designaciones de los nombres de los anticuerpos, tales como H1H11453N2 y H1M11900N, indican anticuerpos completamente humanos "H1H" o anticuerpos quiméricos de región variable humana/constante de ratón "H1M". Los anticuerpos identificados mediante el método de hibridoma se indican con números de identificación de anticuerpos que terminan en "N" o "N2"; Los anticuerpos identificados mediante el método de clasificación de linfocitos B se indican con números de identificación de anticuerpos que terminan en "P" o "P2".

Determinadas propiedades biológicas de los anticuerpos anti-PSMA de ejemplo generados de acuerdo con los métodos de este Ejemplo se describen en detalle en los Ejemplos que se exponen a continuación.

Ejemplo 2: Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de región variable de cadena pesada y ligera de anticuerpos anti-PSMA

La Tabla 1 muestra los identificadores de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera y las CDR de los anticuerpos anti-PSMA seleccionados. Los identificadores de secuencia de ácido nucleico correspondientes se exponen en la Tabla 2.

Tabla 1: Identificadores de secuencias de aminoácidos

continuación

Tabla 2: Identificadores de secuencias de ácido nucleico

Ejemplo 3: Afinidades de unión y constantes cinéticas obtenidas por resonancia de plasmón superficial de los anticuerpos monoclonales anti-PSMA humanos

En este ejemplo, los anticuerpos anti-PSMA se evaluaron en cuanto a su capacidad para unirse a PSMA humano. Se determinaron las afinidades de unión y las constantes cinéticas de los anticuerpos anti-PSMA respecto a la proteína PSMA humana soluble mediante resonancia de plasmón superficial a 37 °C utilizando un formato de captura de anticuerpos. Los resultados se muestran en las Tablas 3 y 4. Las mediciones se realizaron en un instrumento Biacore T-200 (GE Healthcare).

Brevemente, una superficie del sensor CM5 Biacore se derivatizó mediante acoplamiento de aminas con un anticuerpo monoclonal de Fc anti-ratón humano (GE, n° BR-1008-39) o un anticuerpo monoclonal de Fc anti-cabra de ratón (GE, n.° BR-1008-38) para capturar anticuerpos anti-PSMA purificados. Los estudios de unión se realizaron en el tampón HBSP++ compuesto por HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, Ca2+ 2 mM, Mg2+ 2 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, pH 7,4. Se inyectaron concentraciones variables de PSMA humano expresado con una etiqueta N-terminal de hexahistidina (6h.hPSMA, R&D) preparadas en tampón de corrida HBSP++ (diluciones cuádruples de 50 a 0,78 nM) sobre la superficie capturada de anticuerpos anti-PSMA a un caudal de 30 pl/minuto. Se monitorizó la asociación anticuerporeactivo durante 2 minutos mientras que se monitorizó la disociación en tampón de corrida HBSP++ durante 8 minutos.

Las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) cinéticas se determinaron ajustando los sensogramas en tiempo real a un modelo de unión 1:1 utilizando el programa informático de ajuste de curvas Scrubber 2.0c. Las constantes de disociación en equilibrio (K^d) de unión y las semividas disociativas (t1^ ) se calcularon a partir de las constantes cinéticas como: Kd (M) = kd/ka; y t1/2 (min) = (In2/(60*kd).

Como se muestra en las Tablas 3 y 4, los anticuerpos anti-PSMA se unieron al PSMA humano en el formato de captura de anticuerpos con afinidades variables y valores de K^d que variaron de 19,9 pM a 75,6 nM. Varios anticuerpos anti-PSMA ilustrativos, tales como el H1H3465P y el H1H11810P2, mostraron una fuerte afinidad por la proteína PSMA humana, con valores de Kd subnanomolares.

Tab - 7 °C

continuación

Tabl - 37 °C

Ejemplo 4: Generación de anticuerpos biespecíficos que se unen al antígeno de membrana específico prostático (PSMA) y a CD3

La presente invención proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a CD3 y a un antígeno de membrana específico prostático (PSMA); dichas moléculas de unión a antígeno biespecíficas también se denominan en el presente documento "moléculas biespecíficas anti-PSMA/anti-CD3". La parte anti-PSMA de la molécula biespecífica anti-PSMA/anti-CD3 es útil para dirigirse a las células tumorales que expresan PSMA, y la parte anti-CD3 de la molécula biespecífica es útil para activar linfocitos T. La unión simultánea de PSMA en una célula tumoral y CD3 en un linfocito T facilita la destrucción dirigida (lisis celular) de la célula tumoral diana por parte del linfocito T activado.

Se construyeron anticuerpos biespecíficos que comprenden un dominio de unión específico anti-PSMA y un dominio de unión específico anti-CD3 mediante metodologías convencionales, el dominio de unión a antígeno anti-PSMA y el dominio de unión a antígeno anti-CD3 comprenden cada uno diferente, HCVR distintas emparejadas con una LCVR común. En algunos casos, los anticuerpos biespecíficos se construyeron mediante una cadena pesada de un anticuerpo anti-CD3, una cadena pesada de un anticuerpo anti-PSMA y una cadena ligera común. En otros casos, los anticuerpos biespecíficos se construyeron mediante una cadena pesada de un anticuerpo anti-CD3, una cadena pesada de un anticuerpo anti-PSMA y una cadena ligera de un anticuerpo anti-CD3.

Los anticuerpos biespecíficos descritos en los siguientes ejemplos consisten en brazos de unión conocidos por unirse a la proteína hCD3£/8 heterodimérica soluble humana (como se describe en los Ejemplos 9-13 del presente documento); y a PSMA humano (véanse los Ejemplos 1-3 anteriores). Los anticuerpos biespecíficos ejemplificados se fabricaron con un dominio Fc de IgG4 modificado (quimérico) como se establece en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US20140243504A1, publicada el 28 de agosto de 2014.

En la Tabla 5, se muestra un sumario de las partes constituyentes de los dominios de unión a antígeno de los diferentes anticuerpos biespecíficos anti-PSMAxCD3 construidos.

T l : m ri l r n i n n i r i ífi P MAx D

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La región variable de cadena pesada anti-PSMA PSMA-VH-3465 es la HCVR de H1H3465P (SEQ ID NO: 122) de la Tabla 1. La región variable de cadena pesada anti-PSMA PSMA-VH-11810 es la HCVR de H1H11810P2 (SEQ ID NO: 66) de la Tabla 1.

La región variable de cadena pesada anti-CD3 CD3-VH-A es la HCVR de H1H5778P (SEQ ID NO: 922) de la Tabla 12. La región variable de cadena pesada anti-CD3 CD3-VH-B es la HCVR de H1H2712N (SEQ ID ⁿ O: 154) de la Tabla 12. Las regiones variables de cadena pesada anti-CD3 CD3-VH-G, CD3-VH-G2, c D3-VH-G3, CD3-VH-G4, CD3-VH-G5, CD3-VH-G8, CD3-VH-G9, CD3-VH-G10, CD3-VH-G11, CD3-VH-G12, CD3-VH-G13, CD3-VH-G14, CD3-VH-G15, CD3-VH-G16, CD3-VH-G17, CD3-VH-G18, CD3-VH-G19, CD3-VH-G20 y CD3-VH-G21 se describen en la Tabla 18.

Las cadenas ligeras en la Tabla 5 eran comunes a los brazos dirigidos a CD3 y PSMA de los anticuerpos biespecíficos. La región variable de cadena ligera anti-CD3 CD3-VL-A es la LCVR de H1H5778P (SEQ ID NO: 930) de la Tabla 12. La región variable de cadena ligera anti-CD3 CD3-VL-B es la LCVR de H1H2712N (SEQ ID NO: 162) de la Tabla 12. La región variable de cadena ligera VK 1-39 JK 5 es la SEQ ID NO: 1386 de la Tabla 20. La Tabla 1 presenta los identificadores de secuencias de aminoácidos para las diversas regiones variables de cadena pesada, y sus correspondientes CDR, de los brazos anti-PSMA de los anticuerpos biespecíficos de este Ejemplo. La Tabla 2 presenta los identificadores de secuencia para las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables de cadena pesada y sus correspondientes CDR, de los dominios de unión a antígeno anti-PSMA de los anticuerpos biespecíficos de este Ejemplo.

Las Tablas 12, 14, 15, 18 y 20 describen las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y sus correspondientes ^c D^r , para los brazos anti-CD3 de los anticuerpos biespecíficos, así como las secuencias de aminoácidos para las regiones variables de cadena ligera, y sus correspondientes CDR, comunes a ambos brazos de los anticuerpos biespecíficos de este Ejemplo. Las Tablas 13, 16, 17, 19 y 21 describen las secuencias de nucleótidos correspondientes para estas características de los anticuerpos biespecíficos de este Ejemplo.

Ejemplo 5: Afinidades de unión de anticuerpos biespecíficos ejemplificados según se mide mediante análisis de FACS

En este ejemplo, se determinó la capacidad de los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 descritos en el Ejemplo 4 para unirse a líneas celulares humanas que expresan PSMA y a líneas celulares que expresan CD3 humano y de macaco cangrejero mediante FACS. Como se ha descrito anteriormente, los anticuerpos biespecíficos de esta invención utilizaron un brazo de unión de cadena pesada (HC) específico de PSMA emparejado con un panel de brazos de unión de HC anti-CD3 y una cadena ligera común. Los brazos de unión de HC de PSMA en los anticuerpos biespecíficos, más adelante, demostraron una unión potente a la proteína PSMA humana mediante resonancia de plasmón superficial (Ejemplo 3). Como se describe en los Ejemplos 6 y 13 del presente documento, los brazos de unión de HC de CD3 mostraron una gama de afinidades por la proteína hCD3£/8.mFc heterodimérica soluble humana mediante resonancia de plasmón de superficie.

Brevemente, se incubaron 2 * 105 células/pocillo de células Jurkat que expresa CD3 humano, linfocitos T de macaco cangrejero o células que expresan PSMA específicos con una dilución en serie de anticuerpos biespecíficos durante 30 min a 4 °C. Después de la incubación, se lavaron las células y se añadió un F(ab')2 de cabra secundario anti-FcY humano marcado con PE (Jackson Immunolabs) a las células durante 30 min más. Después, las células se lavaron, se resuspendieron en PBS frío BSA al 1 % y se analizaron por citometría de flujo en un BD FACS Canto II.

Para el análisis FACS, las células se clasificaron según la altura de dispersión frontal frente al área de dispersión frontal para la selección de eventos individuales, seguido de dispersiones laterales y frontales. La CE50 para la valoración de la unión celular se determinó utilizando el programa informático Prism. Los valores se calcularon utilizando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros.

Tabla 6: Unión de FACS en líneas celulares es ecíficas de CD3 PSMA

Como se muestra en la Tabla 6, los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 analizados demostraron especificidad de unión a las líneas celulares humanas Bl6F10.9/hPSMA y 22RV1 que expresan PSMA mediante FACS. El límite de detección para la unión de FACS es de 1 pM de CE50.

Como se muestra en la Tabla 6, los brazos de unión a CD3 de cada anticuerpo biespecífico CD3xPSMA mostraron una variedad de afinidad de unión celular a células Jurkat que expresan CD3 humano (intervalo de CE50 de 15 a 300 nM). Es importante destacar que, los brazos de CD3 que mostraron unión débil a nula a la proteína heterodimérica CD3 humana a través de resonancia de plasmón superficial (véase la Tabla 7 a continuación) también se correlacionaron con una unión débil a no observable en células Jurkat (es decir, CD3-VH-G2, CD3-VH-G3, CD3-VH-G5). Varios brazos de unión a CD3 también mostraron reactividad cruzada con los linfocitos T de macaco cangrejero. Todos los anticuerpos biespecíficos probados mostraron una unión celular similar en las respectivas líneas celulares que expresan PSMA, lo que confirma que el emparejamiento biespecífico con brazos de CD3 individuales no afectó o disminuyó la unión específica de PSMA (la unión específica de PSMA fue menor o igual a 5,6 nM (afinidad elevada) en todos los ejemplos probados).

Los anticuerpos que presentan una unión débil a no detectable a CD3 humano, y que también presentan una unión débil a nula a CD3 de macaco cangrejero, se consideran ventajosos para el emparejamiento biespecífico impulsado por la avidez de acuerdo con la presente invención, y se analizaron adicionalmente para determinar la citotoxicidad en ensayos in vitro e in vivo.

Ejemplo 6: Afinidades de unión de los anticuerpos ejemplificados según lo medido mediante un ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial

Las afinidades de unión y las constantes cinéticas de los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA x anti-CD3 a la proteína heterodimérica soluble hCD3£/8.mFc (hCD3£ = UniProtKB/Swiss-Prot: P07766.2; SEQ_ID NO: 1652; hCD38 = UniProtKB/Swiss-Prot: P04234.1, SEQ ID NO: 1653) se determinaron mediante resonancia de plasmón superficial a 37 °C utilizando un formato de captura de antígeno (Tabla 7). Las mediciones se realizaron en un instrumento Sierra Sensors MASS-1.

En el formato de captura de antígeno, la superficie del sensor de amina de densidad elevada MASS-1 se derivatizó con un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG2a de ratón (Southern Biotech). Se capturó la proteína CD3 heterodimérica soluble y se inyectaron los anticuerpos respectivos sobre el antígeno capturado.

Las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) cinéticas se determinaron mediante el procesamiento y el ajuste de los datos a un modelo de unión 1:1 utilizando el programa informático de ajuste de curvas MASS-1 AnalyserR2. Las constantes en equilibrio de disociación de unión (Kd) y las semividas disociativas (t1/2) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinéticas como: K^d (M) = kd/ka; y t1/2 (min) = (In2/(60*kd).

^ -

Como se muestra en la Tabla 7, los anticuerpos biespecíficos anti-CD3xanti-PSMA mantuvieron una unión muy débil a CD3 soluble en el ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, teniendo un valor de Kd superior a 11 nM hasta 334 nM que es más débil que el del brazo anti-CD3 biespecífico procedente de marcos de la línea germinal, CD3-VH-G, o no mostraron ninguna unión detectable.

Como tal, varios anticuerpos biespecíficos presentaron valores de KD superiores a 50 nM, y algunos eran superiores a 100 nM (es decir, BSPSMA/CD3-900, BSPSMA/CD3-1000, BSPSMA/CD3-1900, BSPSMA/CD3-005) e incluso más allá del límite de detección del ensayo, es decir, no mostraron unión detectable a CD3 humano soluble (es decir, BSPSMA/CD3-200, BSPS-MA/CD3-300, BSPSMA/CD3-400, BSPSMA/CD3-004 y BSPSMA/CD3-1800).

Ejemplo 7: Activación de linfocitos T y citotoxicidad específica de tumores presentada por anticuerpos biespecíficos según lo medido in vitro

En este ejemplo, la destrucción específica de células diana que expresan PSMA en presencia de anticuerpos biespecíficos anti-PSMA x anti-CD3 se controló mediante citometría de flujo. Como se ha informado anteriormente, los anticuerpos biespecíficos mostraron un intervalo de afinidad por la proteína CD3 y las líneas celulares que expresan CD3 (es decir, unión débil, moderada y fuerte). Este mismo grupo de anticuerpos biespecíficos se probó para determinar la capacidad de inducir linfocitos T humanos indiferenciados para redirigir la destrucción hacia células que expresan la diana.

Brevemente, las líneas celulares que expresan PSMA (C4-2, 22Rv1 y TRAMPC2_PSMA) se marcaron con 1 pM del colorante de seguimiento fluorescente Violet Cell Tracker. Después del marcaje, las células se sembraron en placas durante la noche a 37 °C. Por separado, las PBMC humanas se sembraron en placas en medio RPMI complementado a 1 x 106 células/ml y se incubaron durante la noche a 37 °C para enriquecer los linfocitos mediante el agotamiento de macrófagos adherentes, células dendríticas y algunos monocitos. Al día siguiente, las células diana se incubaron conjuntamente con PBMC sin tratamiento agotadas en células adherentes (relación efector/célula diana 4:1) y una dilución en serie de anticuerpos biespecíficos en cuestión o control con isotipo (intervalo de concentraciones: 66,7 nM a 0,25 pM) durante 48 horas a 37 °C. Las células se eliminaron de las placas de cultivo celular utilizando un tampón de disociación celular sin enzimas y se analizaron mediante FACS.

Para el análisis FACS, las células se tiñeron con un rastreador de glóbulos rojos muertos/vivos (Invitrogen). Se añadieron 5 x 105 perlas de recuento a cada pocillo inmediatamente antes del análisis FACS. Se recogieron 1 x 104 perlas para cada muestra. Para la evaluación de la especificidad de destrucción, las células se seleccionaron en poblaciones vivas marcadas con violeta. Se registró el porcentaje de población viva y se utilizó para el cálculo de la supervivencia normalizada.

La activación de los linfocitos T se evaluó mediante la incubación de células con anticuerpos conjugados directamente contra CD2 y CD69, y mediante la notificación del porcentaje de linfocitos T activados (CD69+) del total de linfocitos T (CD2+).

Como muestran los resultados en la Tabla 8, se observó el agotamiento de las células que expresan PSMA con anticuerpos biespecíficos anti-PSMA x anti-CD3. La mayoría de los anticuerpos biespecíficos probados activaron y dirigieron los linfocitos T para agotar las células diana con unas CE50 de intervalo picomolar. De forma adicional, la lisis de las células diana observada se asoció con una regulación positiva de las células CD69 en los linfocitos T CD2+, con unas CE50 de pM.

Es importante destacar que, los resultados de este ejemplo demuestran que varios biespecíficos que utilizaron un brazo de unión a CD3 que mostró una unión débil a no observable a la proteína CD3 o células que expresan CD3 (es decir, CD3-VH-G5) aún conservaban la capacidad de activar los linfocitos T y presentaron una potente citotoxicidad de células que expresan antígenos tumorales.

Tabla 8: Propiedades de citotoxicidad y activación de linfocitos T de anticuerpos biespecíficos PSMAxCD3 seleccionados

continuación

Ejemplo 8: Los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 muestran una potente eficacia antitumoral in vivo

Para determinar la eficacia in vivo de anticuerpos biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 ilustrativos, se realizaron estudios en ratones inmunodeprimidos que portaban xenoinjertos de cáncer de próstata humana. También se llevaron a cabo estudios adicionales en ratones inmunocompetentes que portaban xenoinjertos de cáncer de próstata de ratón genomanipulados para expresar PSMA humano.

Eficacia de los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 en modelos de xenoinjerto de tumores humanos

Para evaluar la eficacia in vivo de los biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 en estudios de xenoinjertos de tumores humanos, se implantaron de manera conjunta ratones NOD scid (NSG) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) con células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas junto con células tumorales de próstata humana 22Rv1 o C4-2 que expresan PSMA de forma endógena.

Brevemente, se implantaron s.c. de manera conjunta 4 x 106 células 22Rv1 o 5 x 106 células C4-2 (MD Anderson, TX) con 1 x 106 PBMC humanas (ReachBio, LLC., Seattle, WA) en una mezcla 50:50 de matriz matrigel (BD Biosciences) en el flanco derecho de ratones NSG macho. En el estudio de 22Rv1, los ratones se trataron i.p. los días 0, 3 y 7 con 1 ug de BSPSMA/CD3-001 o un control con isotipo (Fig. 1). En el estudio de C4-2, los ratones se trataron i.p. los días 0, 4 y 7 después de la implantación del tumor con 0,1 mg/kg de BSPSMA/CD3-001, BSPSMA/CD3-003 o BSPSMA/CD3-005.

En un modelo xenogénico adicional, se probaron biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 en ratones injertados con células madre CD34+ hematopoyéticas humanas. Brevemente, se injertaron crías recién nacidas de SIRPa BALB/c-Rag2-IL2rY-(BRG) con células de hígado fetal hCD34+. 3-6 meses más tarde, a ratones SIRPa BRG injertados con hCD34 se les implantaron células C4-2 (5x106 s.c. en matrigel). 8 días después, los ratones se trataron con 10 ug de BSPSMA/CD3-004 o un anticuerpo de control con isotipo, seguido de dosis 2x/semana durante todo el estudio.

En todos los estudios, el tamaño tumoral se midió 2x/semana utilizando calibradores y el volumen tumoral se calculó como Volumen = (longitud * anchura2)/2.

Como muestran los resultados en la Tabla 9, los anticuerpos biespecíficos probados en los modelos xenogénicos descritos anteriormente fueron todos eficaces para inhibir el crecimiento tumoral en comparación con el tratamiento con el control con isotipo.

Eficacia de los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 en un modelo de xenoinjerto de tumores humanos establecidos

A continuación, se evaluó la eficacia de los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 para suprimir el crecimiento de tumores establecidos. En primer lugar, se inyectó a ratones NSG 2,5x106 PBMC humanas i.p. para permitir el injerto de linfocitos T humanos. Catorce días después, a los ratones se les coimplantó células C4-2 y PBMC como se ha indicado anteriormente. Se administraron 20 ug de BSPSMA/CD3-002 o un control con isotipo i.p. 18 días después de la implantación del tumor y se continuó 2x/por semana durante todo el estudio. Se administraron PBMC adicionales 1. p. los días 20 y 40 después de la implantación del tumor.

Como muestran los resultados en la Tabla 9, BSPSMA/CD3-002 mostró eficacia en la supresión del crecimiento de tumores establecidos, disminuyendo el crecimiento tumoral en un 95 %.

Eficacia de los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 en un modelo de tumor inmunocompetente

De forma adicional, se evaluó la actividad antitumoral de los biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 en un modelo inmunocompetente. Los ratones humanizados para las tres cadenas (6y£) de CD3 así como PSMA se implantaron con una línea celular variante de cáncer de próstata murino TRAMP-C2 transfectada con PSMA humano.

Antes del inicio del estudio, se generó la variante de la línea celular tumorigénica TRAMP-C2_hPSMAv#1.

Brevemente, se implantaron s.c. 7,5 x 106 células TRAMP-C2_hPSMA en el flanco derecho de ratones macho humanizados para CD3 y PSMA. Se extirpó un tumor y se cortó en fragmentos de 3 mm y posteriormente se implantaron en el flanco derecho de nuevos ratones macho humanizados. A continuación, se recogió un tumor que surgía de los fragmentos de tumor implantados y se disgregó en una única suspensión celular. A continuación, estas células (TRAMP-C2_hPSMAv#1) se cultivaron in vitro bajo la selección G418. Después, se implantaron 4,106 células de esta línea celular variante en el flanco derecho de ratones humanizados PSMA/CD3 macho para los estudios de eficacia de anticuerpos biespecíficos.

Los ratones PSMA/CD3 humanizados implantados con TRAMPC2_hPSMAv#1 se trataron con 100 ug o 10 ug de anticuerpo biespecífico anti-PSMA/anti-CD3 BSPSMA/CD3-001 o BSPSMA/CD3-004 o un control con isotipo 2x/semana a partir del día de la implantación del tumor. También se examinaron los niveles séricos de citocinas 4 h después de la inyección, así como los niveles de linfocitos T en el bazo. El estudio se terminó el día 27.

Como muestran los resultados en la Tabla 10, ambas moléculas biespecíficas anti-PSMA/anti-CD3 mostraron eficacia para retrasar significativamente el crecimiento tumoral en todos los grupos de tratamiento. Se observó una liberación de citocinas dependiente de la dosis después del tratamiento con BSPSMA/CD3-001. Se observó una liberación mínima de citocinas después de la administración de BSPSMA/CD3-004, posiblemente debido a la unión débil del anti-CD3. BSPSMA/CD3-001 mostró eficacia antitumoral sin agotar los linfocitos T en el bazo.

Eficacia de los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 en tumores establecidos en un modelo inmunocompetente

Por último, se evaluó la eficacia de moléculas biespecíficas anti-PSMA/anti-CD3 seleccionadas en la reducción del crecimiento de tumores establecidos en ratones PSMA/CD3 humanizados. Se trasplantaron células TRAMP-C2_hPSMAv#1 en ratones humanizados como se ha descrito anteriormente, y se administraron 100 ug de BSPSMA/CD3-001 o de control con isotipo i.p. 2x/semana 14 días después de la implantación del tumor, cuando el tamaño de los tumores variaba entre 50 mm3-100 mm3. Como muestran los resultados en la Tabla 11, BSPSMA/CD3-001 fue eficaz en este modelo tumoral establecido, mostrando una disminución del 84 % en el crecimiento tumoral en comparación con el grupo de control.

Resumiendo, los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 muestran una potente eficacia antitumoral en modelos de tumores inmunodeprimidos e inmunocompetentes. De forma adicional, varios de los anticuerpos biespecíficos sometidos a ensayo (BSPS-MA/CD3-001 y 002) mostraron una potente capacidad para reducir el volumen de tumores establecidos.

Cabe destacar que, en ausencia de células tumorales que expresen PSMA, no se observó activación de linfocitos T.

De forma adicional, en ratones que no portan tumores, se recogieron muestras de sangre 4 horas después del tratamiento con anticuerpos biespecíficos PSMAxCD3 y se determinaron los niveles séricos de citocinas. Se determinaron aumentos transitorios de los niveles de citocinas, a saber, interferón-gamma (IFN-g), factor de necrosis tumoral (TNF), interleucina-2 (IL-2) e interleucina-6 (IL-6) y los aumentos transitorios fueron dependientes de la dosis (Figs. 2A-2D).

Con el fin de validar la especificidad de los anticuerpos biespecíficos, a ratones humanizados tanto para PSMA como para CD3 o ratones humanizados solo para CD3 se les administró una dosis con 100 |jg de PSMAxCD3 y se les examinó para determinar las citocinas séricas (4 h posteriores a la dosis) y la pérdida transitoria de linfocitos T de la sangre (24 h posteriores a la dosis). El tratamiento con un anticuerpo biespecífico PSMAxCD3 en un ratón humanizado con linfocitos T (100 jg/ratón) induce un aumento agudo de las citocinas (por ejemplo, IFNg) así como una disminución transitoria de los linfocitos T circulantes (Figs. 3A-3B). Este hallazgo reproduce los cambios de citocinas y linfocitos T que se han observado en pacientes humanos tratados con anticuerpos biespecíficos a antígeno tumoral x CD3.

Los anticuerpos biespecíficos PSMAxCD3 son eficaces sin agotar los linfocitos T efectores en el bazo de los ratones inmunocompetentes, como se muestra en las Fig. 4A-4C. Brevemente, a los ratones Velocigene® PSMA y CD3 humanizados se les implantó tumores que expresaban hPSMA y se trataron con PSMAxCD3 dos veces por semana. Los linfocitos T estaban presentes en números normales en la recogida final. Se examinaron los bazos en busca de linfocitos T CD4+, linfocitos CD8+ y Tregs al final del experimento tras el tratamiento con el anticuerpo biespecífico PSMAxCD3 dos veces por semana durante todo el estudio. A los ratones humanizados para PSMA y CD3 se les implantó tumores TRAMP-C2_hPSMA y se les administró una dosis desde el día 0 con 100 jg o 10 jg de PSMAxCD3. Las poblaciones celulares en el bazo se analizaron mediante citometría de flujo. Los datos se analizaron mediante análisis de varianza (ANOVA) para detectar cualquier efecto significativo en comparación con el grupo de control con isotipo, pero no se encontraron diferencias significativas (Figs. 4A-4C).

Tabla 9: Eficacia de los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 en modelos de xenoinjerto inmunodeprimidos

_{_______ _______}

 Tabla 11: Eficacia de los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA/anti-CD3 en la supresión del crecim iento

Ejemplo 9: Generación de anticuerpos anti-CD3

Los anticuerpos anti-CD3 se obtuvieron mediante la inmunización de un ratón genéticamente modificado que comprendía ADN codificante de regiones variables de cadena ligera y pesada kappa de inmunoglobulina humana con células que expresaban CD3 o con ADN codificante de CD3. La respuesta inmunitaria de los anticuerpos se controló mediante un inmunoanálisis específico de CD3. Cuando se consiguió una respuesta inmunitaria deseada, se recogieron los esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar líneas celulares de hibridoma. Las líneas celulares de hibridoma se cribaron y seleccionaron para identificar líneas celulares que producían anticuerpos específicos de CD3. Mediante esta técnica, se obtuvieron varios anticuerpos quiméricos anti-CD3 (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón). De manera adicional, se aislaron varios anticuerpos anti-CD3 totalmente humanos directamente de linfocitos B positivos a antígeno sin fusión con células de mieloma, como se describe en el documento US 2007/0280945A1.

Determinadas propiedades biológicas de los anticuerpos anti-CD3 ilustrativos generados de acuerdo con los métodos de este Ejemplo se describen en detalle en los Ejemplos del presente documento.

Ejemplo 10: Secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de la región variable de las cadenas pesada y ligera

La Tabla 12 muestra los identificadores de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y ligera y las CDR de los anticuerpos anti-CD3 seleccionados. Los identificadores de secuencia de ácido nucleico correspondientes se establecen en la Tabla 13. Los métodos para producir los anticuerpos anti-CD3 divulgados en el presente documento también se pueden encontrar en la publicación de EE. UU. 2014/0088295.

Tabla 12: Identificadores de secuencias de aminoácidos

continuación

continuación

Tabla 13: Identificadores de secuencias de ácido nucleico

continuación

Los anticuerpos se denominan normalmente en el presente documento de acuerdo con la siguiente nomenclatura: Prefijo Fc (por ejemplo, "H1H", "HIM", "H2M", etc.), seguido de un identificador numérico (por ejemplo, "2712", "2692", etc., como se muestra en la Tabla 1), seguido de un sufijo "P", "N", o "B". Por tanto, de acuerdo con esta nomenclatura, un anticuerpo puede denominarse en el presente documento, p. ej., "H1H2712N", "H1M2692N", "H2M2689N", etc. El H1H, H1M y H2M en las denominaciones de anticuerpo utilizadas en el presente documento indican el isotipo de la región Fc particular del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H1H" tiene una Fc de IgG1 humana, un anticuerpo "H1M" tiene una Fc de IgG1 de ratón, y un anticuerpo "H2M" tiene una Fc de IgG2 de ratón, (todas las regiones variables son completamente humanas, como se indica con la primera "H" en la denominación del anticuerpo). Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo que tiene un isotipo de Fc particular se puede convertir en un anticuerpo con un isotipo de Fc diferente (por ejemplo, un anticuerpo con una Fc de IgG1 de ratón se puede convertir en un anticuerpo con una IgG4 humana, etc.), pero en cualquier caso, los dominios variables (incluyendo las CDR), que se indican mediante los identificadores numéricos que se muestran en la Tabla 1, seguirán siendo los mismos, y se espera que las propiedades de unión sean idénticas o sustancialmente similares independientemente de la naturaleza del dominio Fc.

Las Tablas 14 y 15 establecen los identificadores de secuencias de aminoácidos para regiones variables de cadena pesada (Tabla 14) y regiones variables de cadena ligera (Tabla 15) y sus correspondientes CDR, de HCVR y LCVR anti-CD3 adicionales útiles en los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA x anti-CD3.

T l 14 n i min i l r i n v ri l n )

T l 1 n i min i l r i n v ri l n li ra)

Las regiones variables de cadena ligera y pesada de CD3-VH-F y CD3-VL-F se derivaron del anticuerpo anti-CD3 denominado "L2K" como se expone en el documento WO2004/106380.

De manera adicional, las Tablas 16 y 17 establecen los identificadores de secuencia para las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables de cadena pesada (Tabla 16) y las regiones variables de cadena ligera (Tabla 17) y sus correspondientes CDR, de HCVR y LCVR anti-CD3 adicionales útiles en los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA x anti-CD3.

T abte sada)

Tabla 17 n i n l i ifi n n i l r i n v ri l n ligera)

Construcciones de control utilizadas en los siguientes ejemplos

Se incluyeron diferentes construcciones de control (anticuerpos anti-CD3) en los siguientes experimentos con fines comparativos: "OKT-3", un anticuerpo monoclonal de ratón contra antígenos de superficie de linfocitos T humanos disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) con el n.° de catálogo CRL-8001; y "SP34", un anticuerpo monoclonal de ratón disponible en el mercado, obtenido, p. ej., de Biolegend, San Diego, CA (Cat. n.° 302914) o BD Pharmagen, Cat.55052, reactivo contra la cadena épsilon del complejo T3 en linfocitos T humanos. Ejemplo 11: Generación de anticuerpos anti-CD3 adicionales

Los siguientes procedimientos tenían como objetivo identificar anticuerpos que reconocían de manera específica CD3 (correceptor de linfocitos T) como un antígeno.

Una combinación de anticuerpos anti-CD3 se derivó de un ratón modificado genéticamente. Brevemente, se inmunizaron ratones con un antígeno CD3 y generaron linfocitos B que comprendían una diversidad de reordenamientos de VH humana para expresar un repertorio diverso de anticuerpos específicos de antígeno de afinidad elevada. Los anticuerpos descritos en las Tablas 18-21 tienen la misma secuencia de cadena ligera de VK1-39JK5 (LCVR expuesta en SEQ ID NO: 1386).

Los anticuerpos generados se probaron para determinar su afinidad con el antígeno CD3 humano y de macaco cangrejero en un ensayo de unión in vitro y, por ejemplo, se identificó un anticuerpo CD3: denominado CD3-VH-P como se expone en la SEQ ID NO: 1634), entre algunos otros, que se encontró que se unía a CD3 humano y de macaco cangrejero que tiene una CE50 entre 1 y 40 nM de afinidad, según se determina en una valoración de FACS de células Jurkat y linfocitos T de macaco cangrejero, respectivamente. Véanse, por ejemplo, los experimentos de unión de FACS descritos en el Ejemplo 5.

Los restos de aminoácidos de la línea germinal de CD3-VH-P se identificaron posteriormente y se genomanipuló un anticuerpo denominado "CD3-VH-G" para que solo contuviera marcos de la línea germinal. Se genomanipularon otros derivados de anticuerpos mediante técnicas de clonación molecular bien conocidas para reemplazar restos de aminoácidos de manera escalonada basándose en las diferencias entre la secuencia de la línea germinal y la secuencia de CD3-VH-P. A cada derivado de anticuerpo se le asigna un número de denominación "CD3-VH-G". Véase la Tabla 18.

Mientras que CD3-VH-G y algunos otros anticuerpos genomanipulados retuvieron su afinidad de unión como se observa en los ensayos de FACS, varios anticuerpos anti-CD3 se unieron a CD3 humano o de macaco cangrejero in vitro con afinidad débil a no medible, como 40 nM de CE50. Posteriormente se investigaron las afinidades de unión, la cinética de unión y otras propiedades biológicas para dilucidar la toxicidad y los perfiles farmacocinéticos (pK) en busca de anticuerpos biespecíficos que comprenden los anticuerpos anti-CD3 ilustrativos generados de acuerdo con los métodos de este Ejemplo, descritos en detalle en los Ejemplos del presente documento.

Ejemplo 12: Regiones variables de cadena pesada y ligera (Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de las CDR)

La Tabla 18 muestra los identificadores de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y las CDR de los anticuerpos anti-CD3 seleccionados. Los identificadores de secuencia de ácido nucleico correspondientes se establecen en la Tabla 19.

Se determinaron las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos para cada secuencia de cadena pesada de anticuerpo. A cada cadena pesada de anticuerpo derivada de la secuencia de la línea germinal (SEQ ID NO: 1662), se le asignó una designación de número "G" para una nomenclatura coherente. La Tabla 2 muestra los identificadores de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y las CDR de los anticuerpos anti-CD3 genomanipulados. Los identificadores de secuencia de ácido nucleico correspondientes se establecen en la Tabla 19. Los identificadores de secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de la región variable de cadena ligera y las CDR también se identifican a continuación en las Tablas 20 y 21, respectivamente.

T da

Tabl 1 : I n ifi r l n i i n l i n ada

Tabla 20: Identificadores de las secuencias de aminoácidos de cadena ligera

Tabla 21: Identificadores de las secuencias de ácidos nucleicos de cadena ligera

El anticuerpo de control 1 denominado "CD3-L2K" se construyó basándose en un anticuerpo anti-CD3 conocido (es decir, el anticuerpo anti-CD3 "L2K" como se expone en el documento WO2004/106380).

El anticuerpo de control con isotipo, mencionado en los Ejemplos del presente documento, es un anticuerpo de isotipo coincidente (IgG4 modificado) que interactúa con un antígeno irrelevante, es decir, antígeno FelD1.

Ejemplo 13: Afinidades de unión y constantes cinéticas obtenidas por resonancia de plasmón superficial de anticuerpos anti-CD3 monoclonales humanos

Las afinidades de unión y las constantes cinéticas de los anticuerpos anti-CD3 monoclonales humanos se determinaron mediante resonancia de plasmón superficial a 25 °C utilizando un formato de captura de anticuerpo (Tablas 22, 24 y 26) o un formato de captura de antígeno (Tablas 23, 25 y 27). Las mediciones se realizaron en un instrumento T200 Biacore.

En el formato de captura de anticuerpo, la superficie del sensor Biacore se derivatizó con un Fc anti-conejo de ratón para la captura de hibridoma (prefijo de anticuerpo H1M o H2M) o una superficie de Fc anti-ratón humano para anticuerpos humanos en formato IgG (prefijo de anticuerpo H1H). La proteína CD3 heterodimérica soluble (hCD3-épsilon/hcD3-delta; SEQ ID NO: 1652/1653) con un marcador Fc humano (hFcAAdp/hFc; SEQ ID NO: 1683/1684) o un marcador Fc de ratón (mFcAAdp/mFc; SEQ ID NO: 1685/1686) se inyectó sobre la superficie capturada del anticuerpo y se registró la respuesta de unión. La proteína CD3 heterodimérica se purificó mediante el método descrito en Davis et al. (documento US2010/0331527).

En el formato de captura de antígeno, se capturó la proteína CD3 heterodimérica utilizando un Fc anti-conejo de ratón o un Fc anti-ratón humano y se inyectaron los anticuerpos respectivos sobre el antígeno capturado.

Los anticuerpos se analizaron en su formato divalente convencional (Tablas 22-25) o en una configuración monovalente de 1 brazo (Tablas 26-27) en la que se eliminó el segundo Fab del anticuerpo y solo se expresó la parte Fc (CH2-CH3).

Las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) cinéticas se determinaron mediante el procesamiento y el ajuste de los datos a un modelo de unión 1:1 utilizando el programa informático de ajuste de curvas Scrubber 2.0. Las constantes en equilibrio de disociación de unión (K^d) y las semividas disociativas (ti/2) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinéticas como: Kd (M) = kd/ka; y t1/2 (min) = (In2/(60*kd). NT = No sometido a ensayo; NB = sin unión observada.

Tabla 22: Afinidades de unión or Biacore de mAb de hibridoma H1M H2M)

Ta l 2 : Afini ni n r Bi r mA hi ri m H1M H2M)

continuación

Ta l 24: Afini ni n r Bi r mA F h m n H1H)

Tabla 25: Afinidades de unión por Biacore de mAb de Fc humanos (H1H)

l 2 : Afini ni n r Bi r mA m n v l n 1 razo

continuación

T a l 27: Afini ni n r Bi r mA m n v l n 1 razo

Como se muestra en las Tablas 22-27, varios anticuerpos anti-CD3 se unen a CD3, en formatos de captura de anticuerpos o de captura de antígenos, con alta afinidad.

Ejemplo 14: Los anticuerpos anti-CD3 se unen a los linfocitos T humanos e inducen su proliferación

Se comprobó la capacidad de los anticuerpos anti-CD3 para unirse a linfocitos T humanos e inducir su proliferación. La unión se evaluó utilizando células Jurkat (una línea de linfocitos T humanos CD3+), mientras que la proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se evaluó mediante cuantificación catalizada por a Tp (CellTiter Glo®). El anticuerpo anti-CD3 OKT3 actuó como control positivo y los anticuerpos emparejados irrelevantes de isotipo sirvieron como controles negativos.

Los datos de FACS se obtuvieron utilizando el siguiente protocolo: Las células a 2x105 por pocillo se incubaron con anticuerpos diluidos en serie durante 30 min en hielo. Después de la incubación, se lavaron las células, se añadió el anticuerpo secundario y se incubaron durante 30 minutos más. Después de incubar, las células se lavaron, se volvieron a suspender en PBS frío con un 1 % de BSA y se analizaron por citometría de flujo con células Jurkat viables separadas por dispersión lateral y frontal. Las CE50 para titulación de unión celular se determinaron utilizando el software Prism con valores calculados utilizando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros.

Se adquirieron los datos de proliferación utilizando el siguiente protocolo: se incubaron PBMC humanas (5x104/pocillo) con una dilución en serie triple de anti-CD3 y una concentración fija de un anticuerpo comercial anti-CD28 (200 ng/ml) en placas de 96 pocillos durante 72 h a 37 °C. T ras la incubación, se añadió CellTiter Glo® y se midió la luminiscencia utilizando un lector de placas multietiqueta VICTOR X5 (PerkinElmer). La CE50 de la viabilidad celular (cuantificación catalizada por ATP) se calculó mediante un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros en GraphPad Prism.

Los resultados de los experimentos de unión y proliferación se resumen en las Tablas 28-30.

Tabla 28: Lo proliferación

continuación

Tabla 29: Lo roliferación

continuación

Tabla 30: Los mAb anti-CD3 monovalentes de 1 brazo se unen a los lin focitos T humanos e inducen su roliferación

Como se muestra en las Tablas 7-9, la gran mayoría de los anticuerpos anti-CD3 se unían a los linfocitos T humanos e inducían la proliferación de los linfocitos T.

Ejemplo 15: Los anticuerpos anti-CD3 se unen a los linfocitos T de mono e inducen su proliferación

Se comprobó la capacidad de un subconjunto de anticuerpos anti-CD3 para unirse a los linfocitos T de mono e inducir su proliferación.

Los datos de FACS se obtuvieron utilizando el siguiente protocolo: Las células a 2x105 por pocillo se incubaron con anticuerpos diluidos en serie durante 30 min en hielo. Después de la incubación, se lavaron las células, se añadieron anticuerpos secundarios y se incubaron durante 30 minutos más. Después de incubar, las células se lavaron, se resuspendieron en PBS frío que contenía BSA al 1 % y se analizaron por citometría de flujo. Los linfocitos T de mono CD4+ se separaron por dispersión lateral y frontal, y en la población CD2+CD4+CD20. Las CE50 de la titulación de unión celular se calcularon mediante un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros en GraphPad Prism.

Se adquirieron los datos de proliferación utilizando el siguiente protocolo: Se incubaron PBMC de mono cangrejero recién aisladas (5x104/pocillo) con una dilución en serie triple de anticuerpo anti-CD3 y una concentración fija de un anticuerpo comercial anti-CD28 (500 ng/ml) en placas de 96 pocillos durante 72 h a 37 °C. Tras la incubación, se añadió CellTiter Glo® y se midió la luminiscencia utilizando un lector de placas multietiqueta VICTOR X5 (PerkinElmer). La CE50 de la viabilidad celular (cuantificación catalizada por ATP) se calculó mediante un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros en GraphPad Prism.

Los resultados de los experimentos de unión y proliferación se resumen en las Tablas 31 y 32.

Tabla 31: Los mAb anti-CD3 se unen a PBMC de mono e inducen su proliferación

Tabla 32: - o liferación

Como se muestra en las Tablas 31 y 32, varios anticuerpos anti-CD3 se unieron a los linfocitos T de mono CD2+CD4+ e indujeron su proliferación. OKT3 no impulsó la proliferación de PBMC de mono, mientras que SP34 fue activo frente a las PBMC de mono.

Ejemplo 16: Los mAb anti-CD3 favorecen la destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T

Se estudió la capacidad de los anticuerpos anti-CD3 para redirigir la destrucción mediada por linfocitos T mediante interacciones Fc/FcR utilizando un ensayo de destrucción de U937 basado en calceína. Brevemente, las PBMC humanas se aislaron con Ficoll-Paque y se activaron durante un periodo de varios días con medios que contenían IL-2 humana (30 U/ml) y perlas de activación de linfocitos T (anti-CD3/CD28). Las células U937 se marcaron con calceína y luego se incubaron con linfocitos T activados en una relación de 10:1 efector: diana utilizando diluciones triples en serie de anticuerpos durante un periodo de 3 horas a 37 °C. Tras la incubación, las placas se centrifugaron y los sobrenadantes se transfirieron a una placa de fondo transparente negro translúcido para análisis de fluorescencia. Los valores de CE50, definidos como la concentración molar de anticuerpo CD3 que induce un 50% de citotoxicidad, se calcularon utilizando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros en GraphPad Prism. Los resultados obtenidos utilizando anticuerpos de hibridoma, anticuerpos Fc humanos y anticuerpos monovalentes de un brazo se muestran en las Tablas 33, 34 y 35, respectivamente.

Tabla 33: Los mAb anti-CD3 de hibridoma redirigen la destrucción de linfocitos T a las células U937

Tabla 34: Los mAb anti-CD3 con formato Fc humano redirigen la destrucción de linfocitos T a las células

U937

continuación

Tabla 35: Los mAb anti-CD3 monovalentes de 1 brazo redirigen la destrucción de linfocitos T a las células

U937

Como se muestra en las Tablas 33-35, la mayoría de los anticuerpos anti-CD3, así como OKT3, apoyó la destrucción mediada por linfocitos T redirigidos en este sistema de ensayo. La destrucción observada, que se cree que depende de la unión de Fc del anticuerpo con el receptor Fc en las células U937, lo que conduce a la agrupación de CD3 en los linfocitos T adyacentes, se suprimió mediante la adición de IgG humana no específica (datos no mostrados).

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA humano,

en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1514, o la SEQ ID NO: 1618, y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1386, y

en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA humano comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 66, y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1386.

2. La molécula de unión a antígeno biespecífica de la reivindicación 1, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1514.

3. La molécula de unión a antígeno biespecífica de la reivindicación 1, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1618.

4. La molécula de unión a antígeno biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde:

(i) el segundo dominio de unión a antígeno se une a células humanas que expresan PSMA humano y células de macaco cangrejero que expresan PSMA de macaco cangrejero;

(ii) la molécula de unión a antígeno inhibe el crecimiento tumoral en ratones inmunodeprimidos que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano;

(iii) la molécula de unión a antígeno inhibe el crecimiento tumoral en ratones inmunocompetentes que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano;

(iv) la molécula de unión a antígeno suprime el crecimiento tumoral de tumores establecidos en ratones inmunodeprimidos que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano; o

(v) la molécula de unión a antígeno reduce el crecimiento tumoral de tumores establecidos en ratones inmunocompetentes que portan xenoinjertos de cáncer de próstata humano.

5. La molécula de unión a antígeno biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde:

(i) la molécula de unión a antígeno induce la destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T con un valor de CE50 inferior a aproximadamente 1,3 nM, según se mide en un ensayo de destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T in vitro; y/o

(ii) el segundo dominio de unión a antígeno se une específicamente a PSMA humano con un valor de Kd inferior a aproximadamente 80 nM, según se mide en un ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial in vitro; y/o (iii) el segundo dominio de unión a antígeno se une específicamente a cada uno de los PSMA humanos con un valor de Kd inferior a aproximadamente 5 nM, inferior a aproximadamente 2 nM, inferior a aproximadamente 1 nM, inferior a aproximadamente 800 pM o inferior a aproximadamente 600 pM, según se mide en un ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial in vitro.

6. La molécula de unión a antígeno biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno biespecífico del mismo.

7. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión a antígeno biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 para su uso en un método para tratar un cáncer en un sujeto.

9. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 8, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal y cáncer gástrico.

10. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 8, en donde el cáncer es cáncer de próstata, opcionalmente cáncer de próstata resistente a la castración.