CN108137700B - 抗psma抗体、结合psma及cd3的双特异性抗原结合分子及其用途 - Google Patents

抗psma抗体、结合psma及cd3的双特异性抗原结合分子及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供结合于前列腺特异性膜抗原(PSMA)的抗体、结合于PSMA及CD3的双特异性抗体及其使用方法。根据某些实施方案，本发明的抗体以高亲和力结合人PSMA且结合CD3以诱导人T细胞增殖。本发明包括结合PSMA及CD3且诱导T细胞介导的表达PSMA的肿瘤细胞的杀伤的抗体。根据某些实施例，本发明提供双特异性抗原结合分子，其包含特异性结合人CD3的第一抗原结合结构域及特异性结合人PSMA的第二抗原结合分子。在某些实施方案中，本发明的双特异性抗原结合分子能够抑制表达PSMA的前列腺肿瘤的生长。本发明的抗体及双特异性抗原结合分子可用于治疗其中上调或诱导标靶免疫反应为所需/或为治疗上有益的疾病及病症。举例而言，本发明的抗体可用于治疗各种癌症。

Description

抗PSMA抗体、结合PSMA及CD3的双特异性抗原结合分子及其 用途
序列表的参考
本申请通过引用的方式并入序列表，该序列表以计算机可读形式作为文件10173WO01_seqlisting.txt递交，其创建于2016年7月22日且含有630,026字节。
技术领域
本发明是关于对前列腺特异性膜抗原(PSMA)具有特异性的抗体及其抗原结合片段，及其使用方法。本发明也关于结合PSMA及CD3的双特异性抗原结合分子及其使用方法。
背景技术
前列腺特异性膜抗原，也称为叶酸水解酶1(FOLH1)，为一种完整的非脱落性膜糖蛋白，它可在前列腺上皮细胞中高度表达，且为前列腺癌的细胞表面标记物。其表达在去势抵抗性前列腺癌中维持，去势抵抗性前列腺癌为一种结果差且治疗方案有限的病状。已对靶向PSMA来治疗前列腺癌的方法进行研究。例如，钇-90卡罗单抗为一种包含PSMA胞内表位的单株抗体的放射治疗剂。在另一个实施例中，J591(一种PSMA胞外表位的单株抗体)为放射治疗剂镏-177J591的一部分，且在MLN2704中，美登木素1(DM1，一种抗微管药)结合于J591。这些疗法已引起毒性。PSMA也可在诸如膀胱癌、肾癌、胃癌、结肠直肠癌的其他肿瘤中的新血管系统内表达。
CD3为一种与T细胞受体复合物(TCR)结合的表达于T细胞上的同种型二聚体或异型二聚体抗原且为T细胞活化所需。功能性CD3由四条不同链：ε、ζ、δ及γ中的两者进行二聚体结合来形成。CD3二聚体排列包括γ/ε、δ/ε及ζ/ζ。针对CD3的抗体已展示将CD3丛集在T细胞上，从而活化T细胞，方式类似于具有肽的MHC分子使TCR接合。因此，已提议抗CD3抗体用于达成治疗目的，包括活化T细胞。此外，已提议能够结合CD3及标靶抗原的双特异性抗体用于治疗用途，包括靶向对表达标靶抗原的组织及细胞的T细胞免疫反应。
靶向PSMA的抗原结合分子以及同时结合PSMA及CD3的双特异性抗原结合分子将适用于其中需要特异性靶向表达PSMA的细胞及T细胞介导的其杀伤的治疗背景下。
发明内容
在第一方面中，本发明提供结合于人PSMA的抗体及其抗原结合片段。根据本发明的此方面的抗体尤其适用于靶向表达PSMA的细胞。本发明也提供结合人PSMA及人CD3的双特异性抗体及其抗原结合片段。根据本发明的此方面的双特异性抗体尤其适用于靶向表达CD3的T细胞，且刺激T细胞活化，例如在表达PSMA的细胞的T细胞介导的杀伤为有益或需要的情形下。举例而言，双特异性抗体可引导CD3介导的T细胞活化至特定的表达PSMA的细胞，诸如前列腺肿瘤细胞。
本发明的示例性抗PSMA抗体在本文中的表1及2中列出。图1阐述示例性抗PSMA抗体的重链可变区(HCVR)及轻链可变区(LCVR)的氨基酸序列识别符(identifier)，以及重链互补决定区(HCDR1、HCDR2及HCDR3)及轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2及LCDR3)的氨基酸序列识别符。表2阐述编码示例性抗PSMA抗体的HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3的核酸分子的序列识别符。
本发明提供抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含含有选自表1中列出的任何HCVR氨基酸序列的氨基酸序列的HCVR，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的HCVR。
本发明也提供抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含含有选自表1中列出的任何LCVR氨基酸序列的氨基酸序列的LCVR，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的LCVR。
本发明也提供抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含含有表1中列出的任何HCVR氨基酸序列与表1中列出的任何LCVR氨基酸序列配对的HCVR及LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)。根据某些实施例，本发明提供抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含表1中列出的任何示例性抗PSMA抗体内所含的HCVR/LCVR氨基酸序列对。在某些实施例中，HCVR/LCVR氨基酸序列对选自：SEQ ID NO:66/1642(例如H1H11810P2)及122/130(例如H1H3465P)。
本发明也提供抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含含有选自表1中列出的任何重链CDR1(HCDR1)氨基酸序列的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的HCDR1。
本发明也提供抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含含有选自表1中列出的任何重链CDR2(HCDR2)氨基酸序列的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的HCDR2。
本发明也提供抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含含有选自表1中列出的任何重链CDR3(HCDR3)氨基酸序列的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的HCDR3。
本发明也提供抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含含有选自表1中列出的任何轻链CDR1(LCDR1)氨基酸序列的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的LCDR1。
本发明也提供抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含含有选自表1中列出的任何轻链CDR2(LCDR2)氨基酸序列的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的LCDR2。
本发明也提供抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含含有选自表1中列出的任何轻链CDR3(LCDR3)氨基酸序列的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的LCDR3。
本发明也提供抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含含有表1中列出的任何HCDR3氨基酸序列与表1中列出的任何LCDR3氨基酸序列配对的HCDR3及LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)。根据某些实施例，本发明提供抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含表1中列出的任何示例性抗PSMA抗体内所含的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。在某些实施例中，HCDR3/LCDR3氨基酸序列对选自：SEQ ID NO:72/1648(例如H1H11810P2)及128/136(例如H1H3465P)。
本发明也提供抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含表1中列出的任何示例性抗PSMA抗体内所含的一组六个CDR(也即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。在某些实施例中，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组选自：SEQID NO:68-70-72-1644-1646-1648(例如H1H11810P2)及124-126-128-132-134-136(例如H1H3465P)。
在一相关实施方案中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含如表1中列出的任何示例性抗PSMA抗体所定义的HCVR/LCVR氨基酸序列对内所含的一组六个CDR(也即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。举例而言，本发明包括抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:66/146(例如H1H11810P2)及122/130(例如H1H3465P)的HCVR/LCVR氨基酸序列对内所含的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组。用于鉴别HCVR及LCVR氨基酸序列内CDR的方法及技术为本领域中所熟知且可用于鉴别本文公开的指定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可用于鉴别CDR边界的示例性协议包括例如Kabat定义、Chothia定义及AbM定义。一般而言，Kabat定义是基于序列变化性，Chothia定义是基于结构环区域的位置，且AbM定义为Kabat与Chothia方法之间的折衷。参见例如Kabat,“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.273:927-948(1997)及Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。也可获得用于鉴别抗体内CDR序列的公共数据库。
本发明也提供编码抗PSMA抗体或其部分的核酸分子。举例而言，本发明提供编码表1中列出的任何HCVR氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，该核酸分子包含选自表2中列出的任何HCVR核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列。
本发明也提供编码表1中列出的任何LCVR氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，该核酸分子包含选自表2中列出的任何LCVR核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列。
本发明也提供编码表1中列出的任何HCDR1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，该核酸分子包含选自表2中列出的任何HCDR1核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列。
本发明也提供编码表1中列出的任何HCDR2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，该核酸分子包含选自表2中列出的任何HCDR2核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列。
本发明也提供编码表1中列出的任何HCDR3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，该核酸分子包含选自表2中列出的任何HCDR3核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列。
本发明也提供编码表1中列出的任何LCDR1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，该核酸分子包含选自表2中列出的任何LCDR1核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列。
本发明也提供编码表1中列出的任何LCDR2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，该核酸分子包含选自表2中列出的任何LCDR2核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列。
本发明也提供编码表1中列出的任何LCDR3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，该核酸分子包含选自表2中列出的任何LCDR3核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列。
本发明也提供编码HCVR的核酸分子，其中该HCVR包含一组三个CDR(也即HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中该HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列组如表1中列出的任何示例性抗PSMA抗体所定义。
本发明也提供编码LCVR的核酸分子，其中该LCVR包含一组三个CDR(也即LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中该LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组如表1中列出的任何示例性抗PSMA抗体所定义。
本发明也提供编码HCVR及LCVR两者的核酸分子，其中该HCVR包含表1中列出的任何HCVR氨基酸序列的氨基酸序列，且其中该LCVR包含表1中列出的任何LCVR氨基酸序列的氨基酸序列。在某些实施方案中，该核酸分子包含选自表2中列出的任何HCVR核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列及选自表2中列出的任何LCVR核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列。在根据本发明的此方面的某些实施方案中，该核酸分子编码HCVR及LCVR，其中该HCVR及LCVR均来源于表1中列出的同一抗PSMA抗体。
本发明也提供能够表达包含抗PSMA抗体的重链或轻链可变区的多肽的重组表达载体。举例而言，本发明包括包含任何上文提及的核酸分子，也即编码如表1中阐述的任何HCVR、LCVR和/或CDR序列的核酸分子的重组表达载体。也包括在本发明的范畴内的为其中已引入这种载体的宿主细胞，以及产生该抗体或其部分的方法，该方法是通过在允许产生抗体或抗体片段的条件下培养宿主细胞且回收因此产生的抗体及抗体片段。
本发明包括具有经修饰的糖基化模式的抗PSMA抗体。在一些实施方案中，为移除不需的糖基化位点而进行的修饰可为有益的，或缺乏在寡糖链上存在的岩藻糖部分的抗体，例如以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等人(2002)JBC 277:26733)。在其他申请案中，可进行半乳糖基化的修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在另一个方面中，本发明提供一种药物组合物，其包含特异性结合PSMA的重组人抗体或其片段及可药用载体。在一相关方面中，本发明特征在于一种组合物，其为抗PSMA抗体与第二治疗剂的组合。在一个实施方案中，第二治疗剂为宜与抗PSMA抗体组合的任何药物。在本文中其他地方公开涉及本发明的抗PSMA抗体的其他组合疗法及共制剂。
在另一个方面中，本发明提供使用本发明的抗PSMA抗体靶向/杀伤表达PSMA的肿瘤细胞的治疗方法，其中该治疗方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的包含本发明的抗PSMA抗体的药物组合物。在一些情况下，抗PSMA抗体(或其抗原结合片段)可用于治疗前列腺癌，或可通过包括(但不限于)以下的方法进行修饰以具有更大细胞毒性：经修饰的Fc结构域以增加ADCC(参见例如Shield等人(2002)JBC 277:26733)、放射免疫疗法(Akhtar等人,2012,Prostate-Specific Membrane Antigen-Based Therapeutics；Adv Urol.2012:973820)、抗体-药物结合物(Olson,WC及Israel,RJ,2014,Front Biosci(Landmark Ed).19:12-33；DiPippo,等人2015年2月15日,The Prostate,75(3):303-313,于2014年10月18日首次在线公开)或用于增加肿瘤消融术效率的其他方法。
本发明也包括本发明的抗PSMA抗体的用途，其用于制备供治疗与表达PSMA的细胞相关或由表达PSMA的细胞引起的疾病或病症的药物。
在又一个方面中，本发明提供用于诊断应用的单特异性抗PSMA抗体，诸如例如显像剂。
在又一个方面中，本发明提供使用抗CD3抗体或本发明抗体的抗原结合部分刺激T细胞活化的治疗方法，其中该治疗方法包括施用治疗有效量的包含抗体的药物组合物。
在另一个方面中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，37℃下如表面等离振子共振分析法测定，其以小于约80nM的结合解离平衡常数(KD)结合人前列腺特异性膜抗原(PSMA)。在又一个方面中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，37℃下如表面等离振子共振分析法测定，其以超过约10分钟的解离半衰期(t1/2)结合人PSMA。
本发明进一步提供一种抗体或抗原结合片段，其与包含如表1中阐述的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体竞争结合于人PSMA。在另一个方面中，本发明提供一种抗体或抗原结合片段，其与包含选自下述的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体竞争结合于人PSMA：SEQ ID NO:2/1642；10/1642；18/1642；26/1642；34/1642；42/1642；50/1642；58/1642；66/1642；74/1642；82/1642；90/1642；98/1642；106/1642；114/1642；122/130及138/146。
此外，本发明提供一种抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段与包含如表1中阐述的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体结合于人PSMA上相同的表位。在另一个方面中，抗体或抗原结合片段与包含选自下述的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体结合于人PSMA上相同的表位：SEQ ID NO:2/1642；10/1642；18/1642；26/1642；34/1642；42/1642；50/1642；58/1642；66/1642；74/1642；82/1642；90/1642；98/1642；106/1642；114/1642；122/130及138/146。
本发明进一步提供一种结合人PSMA的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含：具有如表1中阐述的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)及具有如表1中阐述的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的CDR。在另一个方面中，分离的抗体或抗原结合片段包含选自下述的HCVR/LCVR氨基酸序列对的重链及轻链CDR：SEQ IDNO:2/1642；10/1642；18/1642；26/1642；34/1642；42/1642；50/1642；58/1642；66/1642；74/1642；82/1642；90/1642；98/1642；106/1642；114/1642；122/130及138/146。在又一个方面中，分离的抗体或抗原结合片段包含分别选自下述的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域：SEQ ID NO:4-6-8-1644-1646-1648；12-14-16-1644-1646-1648；20-22-24-1644-1646-1648；28-30-32-1644-1646-1648；36-38-40-1644-1646-1648；44-46-48-1644-1646-1648；52-54-56-1644-1646-1648；60-62-64-1644-1646-1648；68-70-72-1644-1646-1648；76-78-80-1644-1646-1648；84-86-88-1644-1646-1648；92-94-96-1644-1646-1648；100-102-104-1644-1646-1648；108-110-112-1644-1646-1648；116-118-120-1644-1646-1648；124-126-128-132-134-136及140-142-144-148-150-152。
在另一个方面中，本发明提供一种结合人PSMA的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含：(a)具有选自SEQ ID NO:2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、98、106、114、122及138的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)及(b)具有选自SEQ IDNO:130及146的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)。在另一个方面中，如权利要求第10项的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含选自下述的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:2/1642；10/1642；18/1642；26/1642；34/1642；42/1642；50/1642；58/1642；66/1642；74/1642；82/1642；90/1642；98/1642；106/1642；114/1642；122/130及138/146。
根据另一方面，本发明提供结合PSMA及CD3的双特异性抗原结合分子(例如抗体)。这种双特异性抗原结合分子在本文中也称为“抗PSMA/抗CD3双特异性分子”、“抗CD3/抗PSMA双特异性分子”或“PSMA×CD3bsAb”。抗PSMA/抗CD3双特异性分子的抗PSMA部分可用于靶向表达PSMA的细胞(例如肿瘤细胞)(例如前列腺肿瘤)，且双特异性分子的抗CD3部分可用于活化T细胞。肿瘤细胞上PSMA及T细胞上CD3的同时结合促进活化T细胞直接杀伤(细胞溶解作用)所靶向的肿瘤细胞。因此，本发明的抗PSMA/抗CD3双特异性分子尤其可用于治疗与表达PSMA的肿瘤(例如前列腺癌)相关或由其引起的疾病及病症。
根据本发明的此方面的双特异性抗原结合分子包含特异性结合人CD3的第一抗原结合结构域及特异性结合PSMA的第二抗原结合结构域。本发明包括抗PSMA/抗CD3双特异性分子(例如双特异性抗体)，其中各抗原结合结构域包含与轻链可变区(LCVR)配对的重链可变区(HCVR)。在本发明的某些示例性实施例中，抗CD3抗原结合结构域及抗PSMA抗原结合结构域各包含与共同LCVR配对的不同的不同HCVR。举例而言，如本文实施例4中展示，构建包含特异性结合CD3的第一抗原结合结构域及特异性结合PSMA的第二抗原结合结构域的双特异性抗体，其中该第一抗原结合结构域包含来源于抗CD3抗体的HCVR/LCVR对；其中该第二抗原结合结构域包含与来源于抗CD3抗体的LCVR(例如包括在抗CD3抗原结合结构域内的相同LCVR)配对的来源于抗PSMA抗体的HCVR。换言的，在本文公开的示例性分子中，来自抗PSMA抗体的HCVR与来自抗CD3抗体的LCVR配对产生特异性结合PSMA(但不结合CD3)的抗原结合结构域。在这种实施例中，第一及第二抗原结合结构域包含不同的抗CD3及抗PSMAHCVR但共享共同的抗CD3LCVR。在其他实施例中，双特异性抗原结合分子包含不同的抗CD3及抗PSMAHCVR但共享共同的LCVR。此LCVR的氨基酸序列展示于例如SEQ ID NO:1642中，且对应CDR(也即LCDR1-LCDR2-LCDR3)的氨基酸序列分别展示于SEQ IDNO:1644、1646及1648中。经基因修饰的小鼠可用于产生包含两条与相同轻链结合的不同重链的完全人双特异性抗原结合分子，该轻链包含来源于两种不同人轻链可变区基因区段之一的可变结构域。或者，可变重链可与一条共同轻链配对且在宿主细胞中重组表达。因而，本发明的抗体可包含与单一重排的轻链结合的免疫球蛋白重链。在一些实施例中，轻链包含来源于人Vκ1-39基因区段或Vκ3-20基因区段的可变结构域。在其他实施例中，轻链包含来源于人Vκ1-39基因区段与人Jκ5或人Jκ1基因区段重排的可变结构域。
本发明提供抗CD3/抗PSMA双特异性分子，其中特异性结合CD3的第一抗原结合结构域包含如美国公开2014/0088295中阐述的任何HCVR氨基酸序列、任何LCVR氨基酸序列、任何HCVR/LCVR氨基酸序列对、任何重链CDR1-CDR2-CDR3氨基酸序列或任何轻链CDR1-CDR2-CDR3氨基酸序列。
另外，本发明提供抗CD3/抗PSMA双特异性分子，其中特异性结合CD3的第一抗原结合结构域包含如本文中表12、14及18中阐述的任何HCVR氨基酸序列。特异性结合CD3的第一抗原结合结构域也可包含如本文中表12、15及20中阐述的任何LCVR氨基酸序列。根据某些实施例，特异性结合CD3的第一抗原结合结构域包含如本文中表12、14、15、18及20中阐述的任何HCVR/LCVR氨基酸序列对。本发明也提供抗CD3/抗PSMA双特异性分子，其中特异性结合CD3的第一抗原结合结构域包含如本文中表12、14及18中阐述的任何重链CDR1-CDR2-CDR3氨基酸序列，和/或如本文中表12、15及20中阐述的任何轻链CDR1-CDR2-CDR3氨基酸序列。
根据某些实施例，本发明提供抗CD3/抗PSMA双特异性分子，其中特异性结合CD3的第一抗原结合结构域包含具有如本文中表12、14及18中阐述的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的重链可变区(HCVR)。
本发明也提供抗CD3/抗PSMA双特异性分子，其中特异性结合CD3的第一抗原结合结构域包含具有如本文中表12、15及20中阐述的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的轻链可变区(LCVR)。
本发明也提供抗CD3/抗PSMA双特异性分子，其中特异性结合CD3的第一抗原结合结构域包含如本文中表12、14、15、18及20中阐述的HCVR及LCVR(HCVR/LCVR)氨基酸序列对。
本发明也提供抗CD3/抗PSMA双特异性分子，其中特异性结合CD3的第一抗原结合结构域包含具有如本文中表12、14及18中阐述的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的重链CDR3(HCDR3)及具有如本文中表12、15及20中阐述的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的轻链CDR3(LCDR3)。
在某些实施例中，特异性结合CD3的第一抗原结合结构域包含如本文中表12、14、15、18及20中阐述的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。
本发明也提供抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子，其中特异性结合CD3的第一抗原结合结构域包含具有如本文中表12、14及18中阐述的氨基酸或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的重链CDR1(HCDR1)结构域；具有如本文中表12、14及18中阐述的氨基酸或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的重链CDR2(HCDR2)结构域；具有如本文中表12、14及18中阐述的氨基酸或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的重链CDR3(HCDR3)结构域；具有如本文中表12、15及20中阐述的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的轻链CDR1(LCDR1)结构域；具有如本文中表12、15及20中阐述的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的轻链CDR2(LCDR2)结构域及具有如本文中表12、15及20中阐述的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的轻链CDR3(LCDR3)结构域。
本发明的某些非限制性、示例性抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子包括特异性结合CD3的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含分别具有如本文中表12、14、15、18及20中阐述的氨基酸序列的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域。
本发明进一步提供一种双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人CD3的第一抗原结合结构域包含来自包含如表12、表14或表18中阐述的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的重链互补决定区(HCDR1、HCDR2及HCDR3)，及来自包含如表12、表15或表20中阐述的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2及LCDR3)。
在另一个方面中，本发明提供一种双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人CD3的第一抗原结合结构域包含来自选自SEQ ID NO:922、154、1482、1490、1498、1506、1514、1522、1530、1538、1546、1554、1562、1570、1578、1586、1594、1602、1610、1618及1626的重链可变区(HCVR)的重链互补决定区(HCDR1、HCDR2及HCDR3)，及来自包含选自SEQ IDNO:162、930及1642的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2及LCDR3)。
本发明进一步提供一种双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人CD3的第一抗原结合结构域包含三个重链互补决定区(A1-HCDR1、A1-HCDR2及A1-HCDR3)及三个轻链互补决定区(A1-LCDR1、A1-LCDR2及A1-LCDR3)，其中A1-HCDR1包含选自SEQ ID NO:924、156；1484、1492、1500、1508、1516、1524、1532、1540、1548、1556、1564、1572、1580、1588、1596、1604、1612、1620及1628的氨基酸序列；A1-HCDR2包含选自SEQ ID NO:926、158、1486、1494、1502、1510、1518、1526、1534、1542、1550、1558、1566、1574、1582、1590、1598、1606、1614、1622及1630的氨基酸序列；A1-HCDR3包含选自SEQ ID NO:928、160、1488、1496、1504、1512、1520、1528、1536、1544、1552、1560、1568、1576、1584、1592、1600、1608、1616、1624及1632的氨基酸序列；A1-LCDR1包含选自SEQ ID NO:932、164及1644的氨基酸序列；A1-LCDR2包含选自SEQ ID NO:166、934及1646的氨基酸序列；且A1-LCDR3包含选自SEQ ID NO:168、936及1648的氨基酸序列。
在另一个方面中，本发明提供一种双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人CD3的第一抗原结合结构域包含选自下述的HCVR/LCVR氨基酸序列对的重链及轻链CDR：SEQ IDNO:922/930、154/162、1482/1642、1490/1642、1498/1642、1506/1642、1514/1642、1522/1642、1530/1642、1538/1642、1546/1642、1554/1642、1562/1642、1570/1642、1578/1642、1586/1642、1594/1642、1602/1642、1610/1642、1618/1642及1626/1642。
在另一个方面中，本发明提供一种双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人CD3的第一抗原结合结构域包含三个重链互补决定区(A1-HCDR1、A1-HCDR2及A1-HCDR3)及三个轻链互补决定区(A1-LCDR1、A1-LCDR2及A1-LCDR3)，且其中特异性结合人PSMA的第二抗原结合结构域包含三个重链互补决定区(A2-HCDR1、A2-HCDR2及A2-HCDR3)及三个轻链互补决定区(A2-LCDR1、A2-LCDR2及A2-LCDR3)；其中A1-HCDR1包含选自SEQ ID NO:924、156、1484、1492、1500、1508、1516、1524、1532、1540、1548、1556、1564、1572、1580、1588、1596、1604、1612、1620及1628的氨基酸序列；A1-HCDR2包含选自SEQ ID NO:926、158、1486、1494、1502、1510、1518、1526、1534、1542、1550、1558、1566、1574、1582、1590、1598、1606、1614、1622及1630的氨基酸序列；A1-HCDR3包含选自SEQ ID NO:928、160、1488、1496、1504、1512、1520、1528、1536、1544、1552、1560、1568、1576、1584、1592、1600、1608、1616、1624及1632的氨基酸序列；A1-LCDR1包含选自SEQ ID NO:164、932及1644的氨基酸序列；A1-LCDR2包含选自SEQ ID NO:166、934及1646的氨基酸序列；且A1-LCDR3包含选自SEQ ID NO:168、936及1648的氨基酸序列；且其中A2-HCDR1包含选自SEQ ID NO:124及68的氨基酸序列；A2-HCDR2包含选自SEQ IDNO:126及70的氨基酸序列；A2-HCDR3包含选自SEQ ID NO:128及72的氨基酸序列；A2-LCDR1包含选自SEQ ID NO:932、164及1644的氨基酸序列；A2-LCDR2包含选自SEQ IDNO:934、166及1646的氨基酸序列；且A2-LCDR3包含选自SEQ ID NO:936、168及1648的氨基酸序列。
本发明的某些非限制性、示例性抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子包括特异性结合CD3的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含含有具有选自FR1(SEQ IDNO:1654)、FR2(SEQ ID NO:1656)、FR3(SEQ ID NO:1657)及FR4(SEQ ID NO:1658)的氨基酸序列的可变结构域构架区的重链。
在更多实施例中，本发明的示例性抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子包括一种双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人CD3的第一抗原结合结构域包含含有具有SEQID NO:1659-1660-1661的氨基酸序列的HCDR1-HCDR2-HCDR3的HCVR。
本发明也提供抗CD3/抗PSMA双特异性分子，其中特异性结合PSMA的第二抗原结合结构域包含具有选自SEQ ID NO:2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、98、106、114、122及138的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的重链可变区(HCVR)。
本发明也提供抗CD3/抗PSMA双特异性分子，其中特异性结合PSMA的第二抗原结合结构域包含具有选自SEQ ID NO:930、162及1642的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的轻链可变区(LCVR)。
本发明也提供抗CD3/抗PSMA双特异性分子，其中特异性结合PSMA的第二抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:122/930、122/162及66/1642的HCVR及LCVR(HCVR/LCVR)氨基酸序列对。
本发明也提供抗CD3/抗PSMA双特异性分子，其中特异性结合PSMA的第二抗原结合结构域包含具有选自SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、112、120、128及144的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的重链CDR3(HCDR3)结构域及具有选自SEQ ID NO:936、168及1648的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的轻链CDR3(LCDR3)域。
在某些实施例中，特异性结合PSMA的第二抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:128/936、128/168及72/1648的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。
本发明也提供抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子，其中特异性结合PSMA的第二抗原结合结构域包含具有选自SEQ ID NO:4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、92、100、108、116、124及140的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的重链CDR1(HCDR1)结构域；具有选自SEQ ID NO:6、14、22、30、38、46、54、62、70、78、86、94、102、110、118、126及142的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的重链CDR2(HCDR2)结构域；具有选自SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、112、120、128及144的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的重链CDR3(HCDR3)结构域；具有选自SEQ ID NO:932、164及1644的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的轻链CDR1(LCDR1)结构域及具有选自SEQ ID NO:934、166及1646的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的轻链CDR2(LCDR2)结构域及具有选自SEQ ID NO:936、168及1648的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似序列的轻链CDR3(LCDR3)结构域。
本发明的某些非限制性、示例性抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子包括特异性结合PSMA的第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含分别具有选自下述的氨基酸序列的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域：SEQ ID NO:124-126-128-932-934-936、124-126-128-164-166-168及68-70-72-1644-1646-1648。
在一相关实施例中，本发明包括抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子，其中特异性结合PSMA的第二抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:122/930、122/162及66/1642的重链及轻链可变区(HCVR/LCVR)序列内所含的重链及轻链CDR域。
在另一个方面中，本发明提供一种双特异性抗原结合分子，其包含结合人CD3的第一抗原结合结构域及结合人PSMA的第二抗原结合结构域，其中第二抗原结合结构域来源于任一本发明的抗PSMA抗体的抗体或抗原结合片段。在另一个方面中，本发明提供一种双特异性抗原结合分子，其包含特异性结合人CD3的第一抗原结合结构域及特异性结合人PSMA的第二抗原结合结构域。
本发明进一步提供一种双特异性抗原结合分子，其结合表达人CD3的人细胞及表达食蟹猴CD3的食蟹猴细胞。在另一个方面中，双特异性抗原结合分子结合表达人PSMA的人细胞及表达食蟹猴PSMA的食蟹猴细胞。
在另一个方面中，本发明提供一种双特异性抗原结合分子，其抑制具有人前列腺癌异种移植物(xenografts)的无免疫应答(immunocompromised)小鼠中的肿瘤生长。本发明进一步提供一种双特异性抗原结合分子，其抑制具有人前列腺癌异种移植物的免疫活性(immunocompetent)小鼠中的肿瘤生长。本发明进一步提供一种双特异性抗原结合分子，其抑制具有人前列腺癌异种移植物的无免疫应答小鼠中建立的肿瘤的肿瘤生长。本发明进一步提供一种双特异性抗原结合分子，其减少具有人前列腺癌异种移植物的免疫活性小鼠中建立的肿瘤的肿瘤生长。
在另一个方面中，本发明提供一种双特异性抗原结合分子，其包含i)以超过约40nM的EC50值特异性结合效应细胞的第一抗原结合结构域及ii)以小于40nM的EC50值特异性结合人靶标前列腺肿瘤细胞的第二抗原结合结构域，其中这种EC50结合亲和力值在体外FACS结合分析法中测定。
举例而言，双特异性抗原结合分子可包括以超过约40nM或超过约100nM、超过约200nM或超过约1μM的EC50值特异性结合人CD3的第一抗原结合结构域。在一个实施例中，双特异性抗原结合分子可包括以小于约6nM的EC50值特异性结合标靶前列腺肿瘤细胞的第二抗原结合结构域。在一些情况下，第一抗原结合结构域以超过约40nM、超过约100nM、超过约200nM或超过约1μM的EC50值特异性结合人CD3及食蟹猴CD3中的每一个。在一些情况下，第一抗原结合结构域以微弱或不可测定的亲和力特异性结合人CD3及食蟹猴CD3中的每一个。
在一些实施例中，如在体外T细胞介导的肿瘤细胞杀伤分析法中测定，例如在肿瘤细胞为C4-2、22Rv1及TRAMPC2_PSMA细胞的情况下，抗原结合分子以小于约1.3nM的EC50值诱发T细胞介导的肿瘤细胞杀伤。
在一些应用中，如在体外表面等离振子共振结合分析法中测定，第一抗原结合结构域以超过约11nM的KD值结合人CD3。在一些情况下，如在体外表面等离振子共振结合分析法中测定，第一抗原结合结构域以超过约15nM、超过约30nM、超过约60nM、超过约120nM或超过约300nM的KD值结合人CD3及食蟹猴CD3中的每一个。
在某些实施例中，本发明的抗CD3抗体、其抗原结合片段及双特异性抗体通过基于种系序列与亲本抗体序列之间的差异，以逐步方式替换亲本的氨基酸残基来制备。
在一些实施例中，本发明提供一种双特异性抗原结合分子，其中第二抗原结合结构域与包含三个重链互补决定区(A2-HCDR1、A2-HCDR2及A2-HCDR3)及三个轻链互补决定区(A2-LCDR1、A2-LCDR2及A2-LCDR3)的参考抗原结合蛋白竞争结合于人PSMA，其中A2-HCDR1包含选自SEQ ID NO:124及68的氨基酸序列；A2-HCDR2包含选自SEQID NO:126及70的氨基酸序列；A2-HCDR3包含选自SEQ ID NO:128及72的氨基酸序列；A2-LCDR1包含选自SEQ IDNO:164、932及1644的氨基酸序列；A2-LCDR2包含选自SEQ ID NO:166、934及1646的氨基酸序列；且A2-LCDR3包含选自SEQ ID NO:168、936及1648的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明提供一种双特异性抗原结合分子，其中第二抗原结合结构域与包含含有选自SEQ IDNO:122及66的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)及含有选自SEQ ID NO:162、930及1642的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的参考抗原结合蛋白竞争结合于人PSMA。
在一些实施例中，本发明提供一种双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合结构域与包含三个重链互补决定区(A1-HCDR1、A1-HCDR2及A1-HCDR3)及三个轻链互补决定区(A1-HCDR1、A1-HCDR2及A1-HCDR3)的参考抗原结合蛋白竞争结合于人CD3，其中A1-HCDR1包含选自SEQ ID NO:924、156、1484、1492、1500、1508、1516、1524、1532、1540、1548、1556、1564、1572、1580、1588、1596、1604、1612、1620及1628的氨基酸序列；A1-HCDR2包含选自SEQID NO:926、158、1486、1494、1502、1510、1518、1526、1534、1542、1550、1558、1566、1574、1582、1590、1598、1606、1614、1622及1630的氨基酸序列；A1-HCDR3包含选自SEQ ID NO:928、160、1488、1496、1504、1512、1520、1528、1536、1544、1552、1560、1568、1576、1584、1592、1600、1608、1616、1624及1632的氨基酸序列；A1-LCDR1包含选自SEQ ID NO:164、932及1644的氨基酸序列；A1-LCDR2包含选自SEQ ID NO:166、934及1646的氨基酸序列；且A1-LCDR3包含选自SEQ ID NO:168、936及1648的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明提供一种双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合结构域与包含含有选自SEQ ID NO:922、154、1482、1490、1498、1506、1514、1522、1530、1538、1546、1554、1562、1570、1578、1586、1594、1602、1610、1618及1626的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)及含有选自SEQ ID NO:930、162及1642的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的参考抗原结合蛋白竞争结合于人CD3。
在一些实施例中，本发明提供一种双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合结构域与包含含有选自SEQ ID NO:922、154、1482、1490、1498、1506、1514、1522、1530、1538、1546、1554、1562、1570、1578、1586、1594、1602、1610、1618及1626的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)及含有选自SEQ ID NO:930、162及1642的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的参考抗原结合蛋白竞争结合于人CD3；且其中第二抗原结合结构域与包含含有选自SEQ ID NO:122及66的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)及含有选自SEQ ID NO:930、162及1642的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的参考抗原结合蛋白竞争结合于人PSMA。
在一个方面中，本发明提供一种药物组合物，其包含抗PSMA抗原结合分子或抗PSMA/抗CD3双特异性抗原结合分子及可药用载体或稀释剂。本发明进一步提供一种用于治疗个体的癌症的方法，该方法包括向该个体施用包含抗PSMA抗原结合分子或抗PSMA/抗CD3双特异性抗原结合分子及可药用载体或稀释剂的药物组合物。在一些实施例中，癌症选自：前列腺癌、肾癌、膀胱癌、结肠直肠癌及胃癌。在一些情况下，癌症为前列腺癌。在一些情况下，前列腺癌为去势抵抗性前列腺癌。
在另一个方面中，本发明提供编码本文公开的抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子的任何HCVR、LCVR或CDR序列的核酸分子，其包括包含如本文中表2、13、15、17、19及21中阐述的多核苷酸序列的核酸分子，以及包含两种或超过两种以任何功能组合或排列的如表2、13、15、17、19及21中阐述的多核苷酸序列的核酸分子。本发明也涵盖携带本发明的核酸的重组表达载体及已引入这种载体的宿主细胞，以及产生抗体的方法，其通过在允许抗体产生的条件下培养宿主细胞且回收所产生的抗体。
本发明包括抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子，其中特异性结合CD3的任何上述抗原结合结构域与特异性结合PSMA的任何上述抗原结合结构域组合、连接或以其他方式结合，以形成结合CD3及PSMA的双特异性抗原结合分子。
本发明包括具有经修饰的糖基化模式的抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子。在一些应用中，为移除不需的糖基化位点而进行的修饰可为有益的，或缺乏在寡糖链上存在的岩藻糖部分的抗体，例如以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等人(2002)JBC 277:26733)。在其他申请案中，可进行半乳糖基化的修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在另一个方面中，本发明提供一种药物组合物，其包含如本文公开的抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子及可药用载体。在一相关方面中，本发明特征在于一种组合物，其为抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子与第二治疗剂的组合。在一个实施例中，第二治疗剂为宜与抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子组合的任何药物。宜与抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子组合的示例性药物详细地论述在本文中其他地方。
在又一个方面中，本发明提供使用本发明的抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子靶向/杀伤表达PSMA的肿瘤细胞的治疗方法，其中该治疗方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的包含本发明的抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子的药物组合物。
本发明也包括本发明的抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子的用途，其用于制备供治疗与表达PSMA的细胞相关或由表达PSMA的细胞引起的疾病或病症的药物。
其他实施例将从随后详细描述的评述，变得显而易见。
附图简述
图1展示PSMA×CD3双特异性抗体抑制体内人前列腺细胞系的生长。NSG小鼠与22Rv1细胞及人PBMC皮下共同植入。在第0天、第3天及第7天，动物总共用1ug PSMA×CD3双特异性抗体腹膜内给药三次。数据表示为平均值(SEM)且使用方差分析(ANOVA)分析。
图2A-2D展示用PSMA×CD3双特异性抗体处理诱导循环细胞因子的瞬时剂量依赖性增加，其中细胞因子水平(干扰素-γ、IFN-g；肿瘤坏死因子、TNF；白介素-2、IL-2及白介素-6、IL-6)在处理后4小时测试。
图3A-3B展示在人源化T细胞小鼠(100μg/小鼠)中用PSMA×CD3双特异性抗体处理诱导细胞因子(例如IFNg)急性增加(图3A)以及循环T细胞瞬时下降(图3B)。
图4A-4C展示在免疫活性小鼠的脾中PSMA×CD3双特异性抗体对效应T细胞的作用。
发明详述
在描述本发明前，应了解本发明不限于所描述的具体方法及实验条件，因而方法及条件可改变。还了解本文中使用的术语仅是出于描述具体实施例的目的，且不意欲限制，因为本发明的范围将仅受随附权利要求的限制。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术及科学术语均具有与本发明所属领域的技术人员通常了解的含义相同的含义。如本文所用，术语“约”在提及具体叙述的数值使用时是指该值可与所叙述的值相差不超过1％。举例而言，如本文所用，表述“约100”包括99及101以及之间的所有值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然与本文中描述的方法及材料类似或同等的任何方法及材料可用于实施或测试本发明，但现描述优选方法及材料。本说明书中所提及的所有专利、申请案及非专利公开案均以全文引用的方式并入本文中。
定义
如本文所用，表述“CD3”是指在T细胞上表达为多分子T细胞受体(TCR)的一部分且由自四个受体链：CD3-ε、CD3-δ、CD3-ξ及CD3-γ中的两个结合形成的同二聚体或杂二聚体组成的抗原。人CD3-ε包含如SEQ IDNO:1649中阐述的氨基酸序列；人CD3-δ包含如SEQ IDNO:1650中阐述的氨基酸序列。除非明确说明来自于非人物种，否则本文中对蛋白质、多肽及蛋白质片段的所有提及均意欲指相应蛋白质、多肽或蛋白质片段的人形式。因此，除非说明来自于非人物种，例如“小鼠CD3”、“猴CD3”等，否则表述“CD3”是指人CD3。
如本文所用，“结合CD3的抗体”或“抗CD3抗体”包括特异性识别单一CD3次单元(例如ε、δ、γ或ξ)的抗体及其抗原结合片段，以及特异性识别两个CD3次单元的二聚复合物(例如γ/ε、δ/ε及ξ/ξCD3二聚体)的抗体及其抗原结合片段。本发明的抗体及抗原结合片段可结合可溶性CD3和/或细胞表面表达的CD3。可溶性CD3包括天然CD3蛋白质以及缺乏跨膜域或以其他方式不与细胞膜结合的重组CD3蛋白质变体，诸如例如单体及二聚CD3构建体。
如本文所用，表述“细胞表面表达的CD3”是指体外或体内在细胞表面上表达的一种或多种CD3蛋白质，使得至少一部分CD3蛋白质暴露于细胞膜的细胞外侧且能够接近抗体的抗原结合部分。“细胞表面表达的CD3”包括在细胞膜中功能T细胞受体的背景下所含的CD3蛋白质。表述“细胞表面表达的CD3”包括在细胞表面上表达为同二聚体或杂二聚体(例如γ/ε、δ/ε及ξ/ξCD3二聚体)的CD3蛋白质。表述“细胞表面表达的CD3”也包括在细胞表面上无其他CD3链类型，单独表达的CD3链(例如CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ)。“细胞表面表达的CD3”可包含在通常表达CD3蛋白质的细胞的表面上表达的CD3蛋白质或由其组成。或者，“细胞表面表达的CD3”可包含在通常不在表面上表达人CD3但经人工工程化而在表面上表达CD3的细胞的表面上表达的CD3蛋白质或由其组成。
如本文所用，表述“PSMA”是指前列腺特异性膜抗原，也称叶酸水解酶1(FOLH1)。PSMA为一种在前列腺上皮细胞中高度表达的完整非脱落性膜糖蛋白，且为前列腺癌的细胞表面标记物。人PSMA的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1651中。
如本文所用，“结合PSMA的抗体”或“抗PSMA抗体”包括特异性识别PSMA的抗体及其抗原结合片段。
术语“抗原结合分子”包括抗体及抗体的抗原结合片段，包括例如双特异性抗体。
如本文所用，术语“抗体”是指包含至少一个特异性结合于特定抗原(例如PSMA或CD3)或与其相互作用的互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括包含四条多肽链，通过二硫键互连的两条重(H)链及两条轻(L)链的免疫球蛋白分子，以及其多聚体(例如IgM)。每一重链均包含重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)及重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2及CH3。每一轻链均包含轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)及轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH及VL区可进一步再分成高变区，称为互补决定区(CDR)，穿插有更保守的区域，称为构架区(FR)。每一VH及VL均包含三个CDR及四个FR，自氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施例中，抗PSMA抗体或抗CD3抗体(或其抗原结合部分)的FR可与人种系序列相同，或是天然的或人工修饰的。氨基酸共同序列可基于两个或超过两个CDR的并排分析定义。
如本文所用，术语“抗体”也包括完全抗体分子的抗原结合片段。如本文所用，术语抗体的”抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”及其类似术语包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在、酶促获得、合成或基因工程改造的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可使用例如任何适合标准技术，诸如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变结构域及任选的恒定区的DNA的操纵及表达的重组基因工程改造技术，衍生自完全抗体分子。这种DNA为已知的和/或容易获自例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)，或可为合成的。DNA可进行测序且化学上或通过使用分子生物学技术操纵，以例如将一个或多个可变结构域和/或恒定区排列成适合的构象，或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实施例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段及(vii)由模仿抗体的高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如分离的互补决定区(CDR)，诸如CDR3肽)或束缚的FR3-CDR3-FR4肽。其他工程改造分子，诸如结构域特异性抗体、单域抗体、域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微型抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIP)及鲨鱼可变IgNAR结构域也包含在如本文所用的表述“抗原结合片段”内。
抗体的抗原结合片段将通常包含至少一个可变结构域。可变结构域可具有任何尺寸或氨基酸组成，且一般将包含至少一个与一个或多个构架序列邻接或同框的CDR。在VH域与VL结构域结合的抗原结合片段中，VH及VL结构域可相对于彼此以任何适合排列定位。举例而言，可变区可为二聚的且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可含有单体VH或VL结构域。
在某些实施例中，抗体的抗原结合片段可含有至少一个共价连接于至少一个恒定区的可变结构域。可在本发明抗体的抗原结合片段内发现的可变结构域及恒定区的非限制性、示例性构象包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3及(xiv)VL-CL。在可变结构域及恒定结构域的任何构象中，包括上列的任何示例性构象，可变结构域及恒定区可直接彼此连接或可通过完全或部分铰链或者接头区连接。铰链区可由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸组成，其在单一多肽分子中相邻可变结构域和/或恒定区之间形成柔性或半柔性连接。此外，本发明抗体的抗原结合片段可包含任何上列可变结构域及恒定区构象以彼此和/或与一个或多个单体VH或VL结构域(例如通过二硫键))非共价结合的同二聚体或异二聚体(或其他多聚体)。
如同完全抗体分子一样，抗原结合片段可为单特异性或多特异性(例如双特异性)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包含至少两个不同可变结构域，其中各可变结构域能够特异性结合于分开抗原或同一抗原上不同表位。使用本领域中可得的常规技术，任何多特异性抗体形式，包括本文公开的示例性双特异性抗体形式，可适用于本发明抗体的抗原结合片段的背景下。
本发明的抗体可通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)起作用。“补体依赖性细胞毒性”(CDC)是指在补体存在下本发明的抗体对表达抗原的细胞的裂解作用。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)是指一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特定细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞及巨噬细胞)识别标靶细胞上结合的抗体且藉此引起标靶细胞裂解。CDC及ADCC可使用熟知且本领域中可得的分析法测定。(参见例如美国专利第5,500,362号及第5,821,337号，以及Clynes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656)。抗体的恒定区在抗体固定补体且介导细胞依赖性细胞毒性的能力上为重要的。因此，抗体的同种型可基于是否需要抗体介导细胞毒性来选择。
在本发明的某些实施例中，本发明的抗PSMA单特异性抗体或抗PSMA/抗CD3双特异性抗体为人抗体。如本文所用，术语“人抗体”意欲包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区及恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括未由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性突变诱发或通过体内体细胞突变所引入的突变)，例如CDR及尤其CDR3中。然而，如本文所用，“人抗体”不意欲包括其中来源于另一哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列已移植至人构架序列上的抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体可为重组人抗体。如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如使用转染至宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(以下进一步描述)、自重组的组合人抗体文库分离的抗体(以下进一步描述)、自针对人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或通过涉及人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。这种重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区及恒定区。在某些实施例中，然而，这种重组人抗体可经受体外突变诱发(或当使用针对人Ig序列转基因的动物时进行体内体细胞突变诱发)，因此重组抗体的VH及VL区的氨基酸序列为虽然来源于人种系VH及VL序列且与其相关，但可不天然存在于体内人抗体种系所有组分的序列。
人抗体可以两种与铰链异质性相关的形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含大约150-160kDa的稳定四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键结合在一起。在第二形式中，二聚体不通过链间二硫键连接，且形成由共价偶联的轻链及重链(半抗体)构成的约75-80kDa分子。这些形式已极难区分，即使在亲和力纯化后。
各种完整IgG同种型中第二形式的出现频率归因于(但不限于)与抗体的铰链区同种型相关的结构差异。人IgG4铰链的铰链区中单个氨基酸取代可显著减少第二形式的出现(Angal等人(1993)Molecular Immunology30:105)至使用人IgG1铰链通常观测到的水平。本发明涵盖在铰链、CH2或CH3区中具有一个或多个突变的抗体，这种突变可为所需，例如在生产中，从而提高所需抗体形式的产率。
本发明的抗体可为分离的抗体。如本文所用，“分离的抗体”是指已经鉴别且与其自然环境的至少一种组分分离和/或从其回收的抗体。举例而言，对于本发明的目的而言，已自生物体的至少一种组分或从其中抗体天然存在或天然产生的组织或细胞分离或移除的抗体为“分离的抗体”。分离的抗体也包括在重组细胞内原位的抗体。分离的抗体为已经受至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施例，分离的抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
本发明也包括结合PSMA的单臂抗体。如本文所用，“单臂抗体”是指包含单个抗体重链及单个抗体轻链的抗原结合分子。本发明的单臂抗体可包含如表1中阐述的任何HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列。
本文公开的抗PSMA或抗PSMA/抗CD3抗体可包含与抗体来源于的对应种系序列相比，重链及轻链可变结构域的构架和/或CDR区中的一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。这种突变可容易通过将本文公开的氨基酸序列与例如自公共抗体序列数据库获得的种系序列比较来确定。本发明包括衍生自本文公开的任何氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段，其中一个或多个构架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变成抗体所来源的种系序列的对应残基，或突变成另一人种系序列的对应残基，或突变成对应种系残基的保守氨基酸取代(这种序列改变在本文中统称为”种系突变”)。本领域技术人员自本文公开的重链及轻链可变区序列开始，可容易地产生包含一个或多个各种系突变或其组合的许多抗体及其抗原结合片段。在某些实施例中，VH和/或VL结构域内的所有构架和/或CDR残基突变回至在抗体所来源的原始种系序列中发现的残基。在其他实施例中，仅仅某些残基突变回至原始种系序列，例如仅仅在FR1的头8个氨基酸内或FR4的最后8个氨基酸内发现的突变残基，或仅仅在CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变残基。在其他实施例中，构架和/或CDR残基中的一个或多个突变成不同种系序列(也即不同于抗体最初所来源的种系序列的种系序列)的对应残基。此外，本发明的抗体可在构架和/或CDR区内含有两个或超过两个种系突变的任何组合，例如其中某些个别残基突变成特定种系序列的对应残基，而不同于原始种系序列的某些其他残基维持或突变成不同种系序列的对应残基。一旦获得，可容易地测试含有一个或多个种系突变的抗体及抗原结合片段的一种或多种所需特性，诸如提高的结合特异性、增加的结合亲和力、提高或增强的拮抗或激动生物特性(视情况而定)、降低的免疫原性等。以此通用方式获得的抗体及抗原结合片段包含在本发明内。
本发明也包括包含本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的具有一个或多个保守性取代的变体的抗PSMA或抗PSMA/抗CD3抗体。举例而言，本发明包括HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列相对于本文中表1中阐述或如本文中表12、14、15、18及20中所描述的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等保守性氨基酸取代的抗PSMA或抗PSMA/抗CD3抗体。
术语“表位”是指与抗体分子的可变区中称为互补位的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可具有超过一个表位。因此，不同抗体可结合于抗原上的不同区域，且可具有不同生物效应。表位可为构形的或线性的。构形表位通过来自线性多肽链的不同区段的空间上并列的氨基酸产生。线性表位为通过多肽链中相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情形下，表位可包括抗原上的糖部分、磷酰基或磺酰基。
当提及核酸或其片段时术语“实质同一性”或“基本上相同”表明当在适当核苷酸插入或缺失下与另一核酸(或其互补链)最佳比对时，如通过任何熟知的序列同一性算法，诸如如以下所讨论的FASTA、BLAST或Gap测定，核苷酸碱基的至少约95％且更佳至少约96％、97％、98％或99％存在核苷酸序列同一性。在某些情况下，与参考核酸分子具有实质同一性的核酸分子可编码具有与参考核酸分子编码的多肽相同或基本上类似的氨基酸序列的多肽。
如应用于多肽，术语“实质相似性”或“基本上类似”是指两个肽序列在诸如通过程序GAP或BESTFIT使用默认空位权重进行最佳比对时，共享至少95％序列同一性、甚至更佳至少98％或99％序列同一性。优选地，不相同的残基位置的不同之处为保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”为其中氨基酸残基经侧链(R基团)具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的另一氨基酸残基取代。一般而言，保守性氨基酸取代不会基本上改变蛋白质的功能性。在两个或超过两个氨基酸序列彼此的不同之处在于保守性取代的情况下，序列同一性百分比或相似性程度可向上调整以校正取代的保守性质。进行此调整的方式为本领域技术人员所熟知。参见例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331，其以引用的方式并入本文中。侧链具有类似化学性质的氨基酸群组的实施例包括：(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸；(2)脂族羟基侧链：丝氨酸及苏氨酸；(3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺及谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸及组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸及谷氨酸及(7)含硫侧链为半胱氨酸及甲硫氨酸。优选保守性氨基酸取代群组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸及天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守性置换为在Gonnet等人(1992)Science 256:1443-1445(以引用的方式并入)中公开的PAM250对数可能性矩阵(log-likelihood matrix)中具有正值的任何改变。”中等保守”置换为在PAM250对数可能性矩阵中具有非负值的任何改变。
也称为序列同一性的多肽序列相似性通常使用序列分析软件测定。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失及其他修饰(包括保守性氨基酸取代)的相似性量度匹配类似序列。举例而言，GCG软件含有诸如Gap及Bestfit的程序，其可与默认参数一起使用以确定密切相关的多肽，诸如来自生物体不同物种的同源多肽之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG6.1版。也可使用FASTA(GCG6.1版中的程序)使用默认或推荐参数比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2及FASTA3)提供查询与搜索序列之间的最佳重叠区的比对及序列同一性百分比(Pearson(2000)上文)。当将本发明的序列与含有来自不同生物体的大量序列的数据库比较时另一优选算法为计算机程序BLAST，尤其BLASTP或TBLASTN，使用预设参数。参见例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410及Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402，各以引用的方式并入本文中。
种系突变
本文公开的抗CD3抗体包含与抗体所来源的对应种系序列相比，重链可变结构域的构架和/或CDR区中的一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。
本发明也包括衍生自本文公开的任何氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段，其中一个或多个构架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变成抗体所来源的种系序列的对应残基，或突变成另一人种系序列的对应残基，或突变成对应种系残基的保守氨基酸取代(这种序列改变在本文中统称为”种系突变”)，且与CD3抗原的结合微弱或不可检测。识别CD3的若干这种示例性抗体描述于本文中表12及18中。
此外，本发明的抗体可在构架和/或CDR区内含有两个或超过两个种系突变的任何组合，例如其中某些个别残基突变成特定种系序列的对应残基，而不同于原始种系序列的某些其他残基维持或突变成不同种系序列的对应残基。一旦获得，可测试含有一个或多个种系突变的抗体及抗原结合片段的一种或多种所需特性，诸如提高的结合特异性、微弱或降低的结合亲和力、提高或增强的药物动力学特性、降低的免疫原性等。在本发明的指导下以此通用方式获得的抗体及抗原结合片段包含在本发明内。
本发明也包括包含本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的具有一个或多个保守性取代的变体的抗CD3抗体。举例而言，本发明包括HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列相对于本文中表12、14、15、18及20中所述的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等保守性氨基酸取代的抗CD3抗体。与个别抗原结合结构域所来源的对应种系序列相比，本发明的抗体及双特异性抗原结合分子在重链及轻链可变结构域的构架区和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失，同时维持或提高与CD3抗原的所需微弱至不可检测的结合。“保守性氨基酸取代”为其中氨基酸残基经侧链(R基团)具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的另一氨基酸残基取代的取代。一般而言，保守性氨基酸取代将基本上不改变蛋白质的功能特性，也即氨基酸取代维持或提高在抗CD3结合分子情况下所需微弱至不可检测的结合亲和力。侧链具有类似化学性质的氨基酸群组的实施例包括：(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸；(2)脂族羟基侧链：丝氨酸及苏氨酸；(3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺及谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸及组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸及谷氨酸及(7)含硫侧链为半胱氨酸及甲硫氨酸。优选保守性氨基酸取代群组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸及天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守性置换为在Gonnet等人(1992)Science 256:1443-1445中公开的PAM250对数概似矩阵中具有正值的任何改变。“中等保守”置换为在PAM250对数概似矩阵中具有非负值的任何改变。
本发明也包括如下抗原结合分子，其包含具有与本文公开的任何HCVR和/或CDR氨基酸序列基本上相同的HCVR和/或CDR氨基酸序列的抗原结合结构域，同时维持或提高对CD3抗原的所需微弱亲和力。当提及氨基酸序列时，术语“实质同一性”或“基本上相同”是指两个氨基酸序列在诸如通过程序GAP或BESTFIT使用默认空位权重进行最佳比对时，共享至少95％序列同一性、甚至更佳至少98％或99％序列同一性。优选地，不相同的残基位置的不同之处为保守性氨基酸取代。在两个或超过两个氨基酸序列彼此的不同之处在于保守性取代的情况下，序列同一性百分比或相似性程度可向上调整以校正取代的保守性质。进行此调整的方式为本领域技术人员所熟知。参见例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331。
也称为序列同一性的多肽序列相似性通常使用序列分析软件测定。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失及其他修饰(包括保守性氨基酸取代)的相似性量度匹配类似序列。举例而言，GCG软件含有诸如Gap及Bestfit的程序，其可与默认参数一起使用以确定密切相关的多肽，诸如来自生物体不同物种的同源多肽之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG 6.1版。也可使用FASTA(GCG6.1版中的程序)使用默认或推荐参数比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2及FASTA3)提供查询与搜索序列之间的最佳重叠区的比对及序列同一性百分比(Pearson(2000)上文)。当将本发明的序列与含有来自不同生物体的大量序列的数据库比较时另一优选算法为计算机程序BLAST，尤其BLASTP或TBLASTN，使用预设参数。参见例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410及Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402。
一旦获得，利用一种或多种体外分析法测试含有一个或多个种系突变的抗原结合结构域的降低的结合亲和力。虽然通常通过测试与抗原的高(也即强烈)结合亲和力，筛选识别特定抗原的抗体以达成其目的，但本发明的抗体展现微弱结合或不可检测的结合。以此通用方式获得的包含一个或多个抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子也包含在本发明内且发现其宜作为亲合力驱动的肿瘤疗法。
自本文中描述的方法可实现意外的益处，例如提高的药物动力学特性及对患者的低毒性。
抗体的结合特性
如本文所用，在抗体、免疫球蛋白、抗体结合片段或含有Fc的蛋白质与例如预定抗原、诸如细胞表面蛋白或其片段结合的背景下术语“结合”通常是指最少两种实体或者分子结构之间的相互作用或结合，诸如抗体-抗原相互作用。
举例而言，当通过例如表面等离振子共振(SPR)技术在BIAcore 3000仪器中使用抗原作为配体及使用抗体、Ig、抗体结合片段或含有Fc的蛋白质作为分析物(或抗配体)测定时，结合亲和力通常对应于约10-7M或更少，诸如约10-8M或更少，诸如10-9M或更少的KD值。通常也使用基于细胞的结合策略，诸如荧光活化的细胞分选(FACS)结合分析，且FACS数据与诸如放射性配体竞争结合及SPR良好相关(Benedict,CA,J ImmunolMethods.1997,201(2):223-31；Geuijen,CA等人,J Immunol Methods.2005,302(1-2):68-77)。
因此，本发明的抗体或抗原结合蛋白结合于预定抗原或细胞表面分子(受体)，对应于KD值的亲和力比其结合于非特定抗原(例如BSA、酪蛋白)的亲和力低至少十倍。根据本发明，对应于KD值的等于或小于非特定抗原10倍的抗体亲和力可视为不可检测的结合，然而，这种抗体可与第二抗原结合臂配对以产生本发明的双特异性抗体。
术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，或抗体或抗体结合片段结合于抗原的解离平衡常数。KD与结合亲和力之间存在反比关系，因此KD值愈小，亲和力愈高，也即愈强。因此，术语“更高亲和力”或“更强亲和力”是指更高的形成相互作用的能力，因此KD值愈小，且相反，术语“更低亲和力”或“更弱亲和力”是指更低的形成相互作用的能力，因此KD值愈大。在一些情况下，特定分子(例如抗体)对其相互作用配偶体分子(例如抗原X)的结合亲和力(或KD)与分子(例如抗体)对另一相互作用配偶体分子(例如抗原Y)的结合亲和力比较更高可表示为通过较大KD值(较低或较弱亲和力)除以较小KD(较高或较强亲和力)所确定的结合比，例如表示为5倍或10倍更大结合亲和力，视情况而定。
术语“kd”(sec-1或1/s)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数或抗体或抗体结合片段的解离速率常数。该数值也称为koff值。
术语“ka”(M-1×sec-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率常数或抗体或抗体结合片段的结合速率常数。
术语“KA”(M-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的结合平衡常数或抗体或抗体结合片段的结合平衡常数。结合平衡常数通过将ka除以kd获得。
术语“EC50”或“EC50”是指半数最大有效浓度，其包括在指定暴露时间后诱发基线与最大值之间的一半反应的抗体浓度。EC50基本上表示观测到其50％最大作用的抗体浓度。在某些实施例中，EC50值等于实现与表达CD3或肿瘤相关抗原的细胞的最大结合一半的本发明抗体的浓度，如通过例如FACS分析法测定。因此，EC50或半最大有效浓度值增加时，观测到结合降低或较弱。
在一个实施例中，结合降低可定义为使得能够结合于标靶细胞的一半最大量的EC50抗体浓度增加。
在另一个实施例中，EC50值表示本发明抗体通过T细胞细胞毒活性引起标靶细胞半数最大耗尽的浓度。因此，在EC50或半数最大有效浓度值降低下观测到细胞毒活性(例如T细胞介导的肿瘤细胞杀伤)增加。
双特异性抗原结合分子
本发明的抗体可为单特异性、双特异性或多特异性。多特异性抗体可对一种标靶多肽的不同表位具有特异性或可含有对超过一种标靶多肽具有特异性的抗原结合结构域。参见例如Tutt等人,1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等人,2004,TrendsBiotechnol.22:238-244。本发明的抗PSMA单特异性抗体或抗PSMA/抗CD3双特异性抗体可连接于另一功能分子，例如另一肽或蛋白质，或与其共同表达。举例而言，抗体或其片段可在功能上连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或以其他方式)于一种或多种其他分子实体，诸如另一抗体或抗体片段，以产生具有第二或其他结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
本文中表述“抗CD3抗体”或“抗PSMA抗体”的使用意欲包括单特异性抗CD3或抗PSMA抗体以及包含CD3结合臂及PSMA结合臂的双特异性抗体。因此，本发明包括其中免疫球蛋白的一臂结合人CD3且该免疫球蛋白的另一臂对人PSMA具有特异性的双特异性抗体。CD3结合臂可包含如本文中表12、14、15、18及20中阐述的任何HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列。
在某些实施例中，CD3结合臂结合于人CD3且诱发人T细胞活化。在某些实施例中，CD3结合臂微弱地结合于人CD3且诱发人T细胞活化。在其他实施例中，CD3结合臂微弱地结合于人CD3且在双特异性或多特异性抗体的背景下诱发表达肿瘤相关抗原的细胞杀伤。在其他实施例中，CD3结合臂与人及食蟹猴(猴)CD3微弱地结合或结合，而结合相互作用通过本领域中已知的体外分析法不可检测。PSMA结合臂可包含如本文中表1中阐述的任何HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列。
根据某些示例性实施例，本发明包括特异性结合CD3及PSMA的双特异性抗原结合分子。这种分子在本文中可称为例如“抗CD3/抗PSMA”或“抗CD3×PSMA”或“D3×PSMA”双特异性分子或其他类似术语(例如抗PSMA/抗CD3)。
除非指定来自于非人物种(例如“小鼠PSMA”、“猴PSMA”等)，如本文所用，术语“PSMA”是指人PSMA蛋白质。人PSMA蛋白质具有SEQ ID NO:1651中所示的氨基酸序列。
特异性结合CD3及PSMA的上述双特异性抗原结合分子可包含如通过体外亲和力结合分析法测定，以诸如展现KD超过约40nM的弱结合亲和力结合于CD3的抗CD3抗原结合分子。
如本文所用，表述“抗原结合分子”是指包含至少单独一个，或与一个或多个其他CDR和/或构架区(FR)组合，特异性结合于特定抗原的互补决定区(CDR)或由其组成的蛋白质、多肽或分子复合物。在某些实施例中，抗原结合分子为抗体或抗体片段，那些术语在本文中的其他地方定义。
如本文所用，表述“双特异性抗原结合分子”是指包含至少第一抗原结合结构域及第二抗原结合结构域的蛋白质、多肽或分子复合物。双特异性抗原结合分子内的各抗原结合结构域包含至少单独一个，或与一个或多个其他CDR和/或FR组合，特异性结合于特定抗原的CDR。在本发明的背景下，第一抗原结合结构域特异性结合第一抗原(例如CD3)，且第二抗原结合结构域特异性结合第二不同抗原(例如PSMA)。
在本发明的某些示例性实施例中，双特异性抗原结合分子为双特异性抗体。双特异性抗体的各抗原结合结构域包含重链可变结构域(HCVR)及轻链可变结构域(LCVR)。在包含第一及第二抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子(例如双特异性抗体)的背景下，第一抗原结合结构域的CDR可用前缀“A1”指定且第二抗原结合结构域的CDR可用前缀“A2”指定。因此，第一抗原结合结构域的CDR在本文中可称为A1-HCDR1、A1-HCDR2及A1-HCDR3；且第二抗原结合结构域的CDR在本文中可称为A2-HCDR1、A2-HCDR2及A2-HCDR3。
第一抗原结合结构域及第二抗原结合结构域可彼此直接或间接连接以形成本发明的双特异性抗原结合分子。或者，第一抗原结合结构域及第二抗原结合结构域可各连接于分开的多聚结构域。一个多聚结构域与另一多聚结构域的结合促进两个抗原结合结构域之间的结合，藉此形成双特异性抗原结合分子。如本文所用，“多聚结构域”为能够与具有相同或类似结构或构造的第二多聚结构域结合的任何大分子、蛋白质、多肽、肽或氨基酸。举例而言，多聚结构域可为包含免疫球蛋白CH3结构域的多肽。多聚组分的一非限制性实施例为免疫球蛋白的Fc部分(包含CH2-CH3结构域)，例如选自同种型IgG1、IgG2、IgG3及IgG4以及各同种型组内的任何异型的IgG的Fc结构域。
本发明的双特异性抗原结合分子通常将包含两个多聚结构域，例如各自个别地为分开抗体重链的一部分的两个Fc结构域。第一及第二多聚结构域可具有相同IgG同种型，诸如例如IgG1/IgG1、IgG2/IgG2、IgG4/IgG4。或者，第一及第二多聚结构域可具有不同的IgG同种型，诸如例如IgG1/IgG2、IgG1/IgG4、IgG2/IgG4等。
在某些实施例中，多聚结构域为Fc片段或长度为1至约200个氨基酸的含有至少一个半胱氨酸残基的氨基酸序列。在其他实施例中，多聚结构域为半胱氨酸残基，或含有半胱氨酸的短肽。其他多聚结构域包括包含亮氨酸拉链、螺旋-环模体或卷曲螺旋模体或由其组成的肽或多肽。
任何双特异性抗体形式或技术均可用于制备本发明的双特异性抗原结合分子。举例而言，具有第一抗原结合特异性的抗体或其片段可在功能上连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或以其他方式)于一种或多种其他分子实体，诸如具有第二抗原结合特异性的另一抗体或抗体片段，以产生双特异性抗原结合分子。可用于本发明的背景下的特定示例性双特异性形式包括不限于例如基于scFv或双功能抗体双特异性形式、IgG-scFv融合物、双重可变结构域(DVD)-Ig、Quadroma、杵臼结构、共同轻链(例如具有杵臼结构的共同轻链等等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)体、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双作用Fab(DAF)-IgG及Mab2双特异性形式(关于上述形式的评述，参见例如Klein等人2012,mAbs 4:6,1-11及其中引用的参考文献)。
在本发明的双特异性抗原结合分子的背景下，多聚结构域，例如Fc结构域，可包含与Fc结构域的野生型天然存在形式相比，一个或多个氨基酸改变(例如插入、缺失或取代)。举例而言，本发明包括在Fc结构域中包含一个或多个修饰的双特异性抗原结合分子，产生在Fc与FcRn之间具有改变的结合相互作用(例如增强或减弱)的经修饰的Fc结构域。在一个实施例中，双特异性抗原结合分子包含CH2或CH3区中的修饰，其中该修饰增加酸性环境下(例如pH值在约5.5至约6.0范围内的核内体中)Fc结构域对FcRn的亲和力。这种Fc修饰的非限制性实施例包括例如位置250(例如E或Q)；250及428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)及256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或位置428和/或433(例如L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰；或位置250和/或428的修饰；或位置307或308(例如308F、V308F)及434的修饰。在一个实施方案中，修饰包含428L(例如M428L)及434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)及308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)及434(例如434Y)修饰；252、254及256(例如252Y、254T及256E)修饰；250Q及428L修饰(例如T250Q及M428L)及307和/或308修饰(例如308F或308P)。
本发明也包括包含第一CH3结构域及第二Ig CH3结构域的双特异性抗原结合分子，其中第一及第二Ig CH3结构域彼此差异的处在于至少一个氨基酸，且其中与缺乏氨基酸差异的双特异性抗体相比，至少一个氨基酸差异降低双特异性抗体对A蛋白的结合。在一个实施方案中，第一Ig CH3结构域结合A蛋白且第二Ig CH3结构域含有降低或消除A蛋白结合的突变，诸如H95R修饰(通过IMGT外显子编号；通过EU编号为H435R)。第二CH3可进一步包含Y96F修饰(通过IMGT；通过EU为Y436F)。参见例如美国专利第8,586,713号。可在第二CH3内发现的其他修饰包括：在IgG1抗体情况下D16E、L18M、N44S、K52N、V57M及V82I(通过IMGT；通过EU为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M及V422I)；在IgG2抗体情况下N44S、K52N及V82I(IMGT；通过EU为N384S、K392N及V422I)及在IgG4抗体情况下Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q及V82I(通过IMGT；通过EU为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q及V422I)。
在某些实施方案中，Fc结构域可为嵌合的，将来源于超过一种免疫球蛋白同种型的Fc序列组合。举例而言，嵌合Fc结构域可包含来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4CH2区的部分或全部CH2序列，及来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4的部分或全部CH3序列。嵌合Fc结构域也可含有嵌合铰链区。举例而言，嵌合铰链可包含来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上铰链”序列与来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下铰链”序列的组合。可包括在本文中阐述的任何抗原结合分子中的嵌合Fc结构域的一特定实施例包含自N端至C端：[IgG4CH1]-[IgG4上铰链]-[IgG2下铰链-[IgG4CH2]-[IgG4CH3]。可包括在本文中阐述的任何抗原结合分子中的嵌合Fc结构域的另一实施例包含自N端至C端：[IgG1CH1]-[IgG1上铰链]-[IgG2下铰链]-[IgG4CH2]-[IgG1CH3]。可包括在任何本发明的抗原结合分子中的嵌合Fc结构域的这些及其他实施例描述于2014年8月28日公开的美国公开2014/0243504(整体并入本文中)中。具有这些通用结构排列的嵌合Fc结构域及其变体可具有改变的Fc受体结合，此又影响Fc效应功能。
在某些实施例中，本发明提供一种抗体重链，其中重链恒定区(CH)包含与以下任一者至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1663、SEQ ID NO:1664、SEQ ID NO:1665、SEQ ID NO:1666、SEQ ID NO:1667、SEQ ID NO:1668、SEQ ID NO:1669、SEQ ID NO:1670SEQ ID NO:1671或SEQ ID NO:1672。在一些实施例中，重链恒定区(CH)包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:1663、SEQ ID NO:1664、SEQID NO:1665、SEQ ID NO:1666、SEQ ID NO:1667、SEQ ID NO:1668、SEQ ID NO:1669、SEQ IDNO:1670、SEQ ID NO:1671及SEQ ID NO:1672。
在其他实施例中，本发明提供一种抗体重链，其中Fc结构域包含与以下任一者至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1673、SEQ ID NO:1674、SEQ ID NO:1675、SEQ ID NO:1676、SEQ ID NO:1677、SEQ ID NO:1678、SEQ ID NO:1679、SEQ ID NO:1680、SEQ ID NO:1681或SEQ ID NO:1682。在一些实施例中，Fc结构域包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:1673、SEQ ID NO:1674、SEQ ID NO:1675、SEQ ID NO:1676、SEQ ID NO:1677、SEQ ID NO:1678、SEQ ID NO:1679、SEQ ID NO:1680、SEQ ID NO:1681及SEQ ID NO:1682。
序列变体
与各抗原结合结构域所来源的对应种系序列相比，本发明的抗体及双特异性抗原结合分子在重链及轻链可变结构域的构架区和/或CDR区中可包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。这种突变可容易通过将本文公开的氨基酸序列与例如自公共抗体序列数据库获得的种系序列比较来确定。本发明的抗原结合分子可包含来源于本文公开的任何示例性氨基酸序列的抗原结合结构域，其中一个或多个构架区和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变成抗体所来源的种系序列的对应残基，或突变成另一人种系序列的对应残基，或突变成对应种系残基的保守性氨基酸取代(这种序列改变在本文中统称为“种系突变”。本领域技术人员自本文公开的重链及轻链可变区序列开始，可容易地产生包含一个或多个各种系突变或其组合的许多抗体及抗原结合片段。在某些实施方案中，VH和/或VL结构域内的所有构架和/或CDR残基突变回至在抗原结合结构域最初所来源的原始种系序列中发现的残基中。在其他实施方案中，仅仅某些残基突变回至原始种系序列，例如仅仅在FR1的头8个氨基酸内或FR4的最后8个氨基酸内发现的突变残基，或仅仅在CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变残基。在其他实施方案中，构架和/或CDR残基中的一个或多个突变成不同种系序列(也即不同于抗原结合结构域最初所来源的种系序列的种系序列)的对应残基。此外，抗原结合结构域可在构架区和/或CDR区内含有两个或超过两个种系突变的任何组合，例如其中某些个别残基突变成特定种系序列的对应残基，而不同于原始种系序列的某些其他残基维持或突变成不同种系序列的对应残基。一旦获得，可容易地测试含有一个或多个种系突变的抗原结合结构域的一种或多种所需特性，诸如提高的结合特异性、增加的结合亲和力、提高或增强的拮抗或激动生物特性(视情况而定)、降低的免疫原性等。以此通用方式获得的包含一个或多个抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子包含在本发明内。
本发明也包括其中一或两个抗原结合结构域包含本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的具有一个或多个保守性取代的变体的抗原结合分子。举例而言，本发明包括包含HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列相对于本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等保守性氨基酸取代的抗原结合结构域的抗原结合分子。“保守性氨基酸取代”为其中氨基酸残基经侧链(R基团)具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的另一氨基酸残基取代的取代。一般而言，保守性氨基酸取代不会基本上改变蛋白质的功能性。侧链具有类似化学性质的氨基酸群组的实施例包括：(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸；(2)脂族羟基侧链：丝氨酸及苏氨酸；(3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺及谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸及组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸及谷氨酸及(7)含硫侧链为半胱氨酸及甲硫氨酸。优选保守性氨基酸取代群组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸及天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守性置换为在Gonnet等人(1992)Science 256:1443-1445(以引用的方式并入本文中)中公开的PAM250对数概似矩阵中具有正值的任何改变。“中等保守”置换为在PAM250对数概似矩阵中具有非负值的任何改变。
本发明也包括包含HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列与本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列基本上相同的抗原结合结构域的抗原结合分子。当提及氨基酸序列时，术语“实质同一性”或“基本上相同”是指两个氨基酸序列在诸如通过程序GAP或BESTFIT使用默认空位权重进行最佳比对时，共享至少95％序列同一性、甚至更佳至少98％或99％序列同一性。优选地，不相同的残基位置的不同之处为保守性氨基酸取代。在两个或超过两个氨基酸序列彼此的不同之处在于保守性取代的情况下，序列同一性百分比或相似性程度可向上调整以校正取代的保守性质。进行此调整的方式为本领域技术人员所熟知。参见例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331，以引用的方式并入本文中。
也称为序列同一性的多肽序列相似性通常使用序列分析软件测定。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失及其他修饰(包括保守性氨基酸取代)的相似性量度匹配类似序列。举例而言，GCG软件含有诸如Gap及Bestfit的程序，其可与默认参数一起使用以确定密切相关的多肽，诸如来自生物体不同物种的同源多肽之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG 6.1版。也可使用FASTA(GCG 6.1版中的程序)使用默认或推荐参数比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2及FASTA3)提供查询与搜索序列之间的最佳重叠区的比对及序列同一性百分比(Pearson(2000)上文)。当将本发明的序列与含有来自不同生物体的大量序列的数据库比较时另一优选算法为计算机程序BLAST，尤其BLASTP或TBLASTN，使用预设参数。参见例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410及Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402，各以引用的方式并入本文中。
pH依赖性结合
本发明包括具有pH依赖性结合特征的抗PSMA抗体及抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子。举例而言，本发明的抗PSMA抗体在酸性pH值下，与中性pH相比可展现降低的与PSMA的结合。或者，本发明的抗PSMA抗体在酸性pH值下，与中性pH相比可展现增强的与PSMA的结合。表述“酸性pH值”包括小于约6.2的pH值，例如约6.0、5.95、5,9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更小。如本文所用，表述“中性pH值”是指约7.0至约7.4的pH值。表述“中性pH值”包括约7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35及7.4的pH值。
在某些情况下，“在酸性pH值下，与中性pH值相比，降低的结合“根据抗体在酸性pH值下与其抗原的结合的KD值与抗体在中性pH值下与其抗原的结合的KD值(或反的也然)的比率表示。举例而言，若抗体或其抗原结合片段展现约3.0或更大的酸性/中性KD比率，则对于本发明的目的而言，抗体或其抗原结合片段可视为展现“在酸性pH值下，与中性pH值相比，降低的结合”。在某些示例性实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段的酸性/中性KD比率可为约3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0.25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更大。
具有pH依赖性结合特征的抗体可例如通过针对在酸性pH值下，与中性pH值相比，与特定抗原的结合降低(或增强)筛选抗体群体来获得。另外，在氨基酸侧面上抗原结合结构域的修饰可产生具有pH依赖性特征的抗体。举例而言，通过用组氨酸残基取代抗原结合结构域(例如CDR内)的一个或多个氨基酸，可获得在酸性pH值下，相对于中性pH值，抗原结合降低的抗体。
包含Fc变体的抗体
根据本发明的某些实施例，提供抗PSMA抗体及抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子，其包含含有一个或多个突变的Fc结构域，该一个或多个突变增强或减弱抗体例如在酸性pH值下与中性pH值相比与FcRn受体的结合。举例而言，本发明包括在Fc结构域的CH2或CH3区中包含突变的抗体，其中该(等)突变增加酸性环境下(例如pH值在约5.5至约6.0范围内的核内体中)Fc结构域对FcRn的亲和力。这种突变可引起抗体在施用动物时血清半衰期增加。这种Fc修饰的非限制性实施例包括例如位置250(例如E或Q)；250及428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)及256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或位置428和/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰；或位置250和/或428的修饰；或位置307或308(例如308F、V308F)及434的修饰。在一个实施例中，修饰包含428L(例如M428L)及434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)及308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)及434(例如434Y)修饰；252、254及256(例如252Y、254T及256E)修饰；250Q及428L修饰(例如T250Q及M428L)及307和/或308修饰(例如308F或308P)。
举例而言，本发明包括抗PSMA抗体及抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子，其包含含有一对或多对，或一组或多组选自下述的突变的Fc结构域：250Q及248L(例如T250Q及M248L)；252Y、254T及256E(例如M252Y、S254T及T256E)；428L及434S(例如M428L及N434S)及433K及434F(例如H433K及N434F)。上述Fc结构域突变的所有可能组合及本文公开的抗体可变结构域内的其他突变涵盖在本发明的范畴内。
抗体及双特异性抗原结合分子的生物学特征
本发明包括以高亲和力(例如低于奈摩尔KD值)结合人PSMA的抗体及其抗原结合片段。
根据某些实施例，本发明包括如通过表面等离振子共振，例如使用如本文中实施例3中定义的分析形式测定，以小于约80nM的KD结合人PSMA(例如在37℃下)的抗体及抗体的抗原结合片段。在某些实施例中，如通过表面等离振子共振，例如使用本文中实施例3中定义的分析形式(例如mAb-捕捉或抗原-捕捉形式)或基本上类似的分析法测定，本发明的抗体或抗原结合片段以小于约5nM、小于约2nM、小于约1nM、小于约800pM、小于约600pM、小于约500pM、小于约400pM、小于约300pM、小于约200pM、小于约180pM、小于约160pM、小于约140pM、小于约120pM、小于约100pM、小于约80pM、小于约60pM、小于约40pM、小于约20pM或小于约10pM的KD结合PSMA。
本发明也包括如通过表面等离振子共振在37℃下，例如使用如本文中实施例3中定义的分析形式或基本上类似的分析法测定，以超过约1分钟或超过约10分钟的解离半衰期(t1/2)结合PSMA的抗体及其抗原结合片段。在某些实施例中，如通过表面等离振子共振，在25℃或37℃下，例如使用如本文中实施例3中定义的分析形式(例如mAb-捕捉或抗原-捕捉形式)或基本上类似的分析法测定，本发明的抗体或抗原结合片段以超过约20分钟、超过约30分钟、超过约40分钟、超过约50分钟、超过约60分钟、超过约70分钟、超过约80分钟、超过约90分钟、超过约100分钟、超过约200分钟、超过约300分钟、超过约400分钟、超过约500分钟、超过约600分钟、超过约700分钟、超过约800分钟、超过约900分钟、超过约1000分钟或超过约1100分钟的t1/2结合PSMA。本发明包括能够同时结合于人CD3及人PSMA的双特异性抗原结合分子(例如双特异性抗体)。根据某些实施例，本发明的双特异性抗原结合分子与表达CD3和/或PSMA的细胞特异性相互作用。双特异性抗原结合分子结合表达CD3和/或PSMA的细胞的程度可通过如本文中实施例5展示的荧光活化细胞分选(FACS)评估。举例而言，本发明包括特异性结合表达CD3的人T细胞系(这种细胞系不表达PSMA，例如Jurkat)和/或表达PSMA的人细胞系(这种细胞系不表达CD3，例如B16F10.9/hPSMA或22RV1)的双特异性抗原结合分子。本发明包括如使用如实施例5中所述的FACS分析法或基本上类似的分析法测定，以约80nM或更少的EC50值结合任何上述细胞及细胞系的双特异性抗原结合分子。
本发明也包括以1.0pM与1000nM之间的EC50值结合于表达CD3的人T细胞(例如Jurkat)和/或表达PSMA的细胞的抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子。在某些实施例中，抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子以1nM与60nM之间的EC50值结合于表达CD3的人T细胞。举例而言，本发明包括以约1pM、约10pM、约100pM、约500pM、约1nM、约2nM、约5nM、约10nM、约20nM、约30nM、约40nM、约50nM约60nM、约70nM、约80nM、约90nM、约100nM、约200nM、约300nM、约500nM、约800nM、约1000nM或更大的EC50值结合于表达CD3的人T细胞(例如Jurkat)和/或表达PSMA的细胞的抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子。
本发明也包括展现一个或多个选自下述的特征的抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子：(a)抑制具有人前列腺癌异种移植物的无免疫应答小鼠中的肿瘤生长；(b)抑制具有人前列腺癌异种移植物的免疫活性小鼠中的肿瘤生长；(c)抑制具有人前列腺癌异种移植物的无免疫应答小鼠中建立的肿瘤的肿瘤生长及(d)减少具有人前列腺癌异种移植物的免疫活性小鼠中建立的肿瘤的肿瘤生长(参见例如实施例8)。
本发明包括以高亲和力结合于人CD3的抗体及其抗原结合片段。本发明也包括以中等或低亲和力结合人CD3的抗体及其抗原结合片段，视治疗背景及所需特定目标特性而定。举例而言，在一臂结合CD3且另一臂结合标靶抗原(例如PSMA)的双特异性抗原结合分子的背景下，可能需要标靶抗原结合臂以高亲和力结合标靶抗原，而抗CD3臂仅仅以中度或低亲和力结合CD3。以此方式，可实现抗原结合分子对表达标靶抗原的细胞的优先靶向，同时避免普遍/非靶向性CD3结合及随后与此相关的不良副作用。
本发明包括能够同时结合于人CD3及人PSMA的双特异性抗原结合分子(例如双特异性抗体)。与表达CD3的细胞相互作用的结合臂可具有如适合的体外结合分析法中测定，微弱至不可检测的结合。双特异性抗原结合分子结合表达CD3和/或PSMA的细胞的程度可通过如本文中实施例5展示的荧光活化细胞分选(FACS)评估。
举例而言，本发明包括特异性结合表达CD3但不表达PSMA的人T细胞系(例如Jurkat)、灵长类动物T细胞(例如食蟹猴外周血单核细胞[PBMC])和/或表达PSMA的细胞的抗体、抗原结合片段及其双特异性抗体。本发明包括如使用如实施例5中阐述的FACS结合分析法或基本上类似的分析法测定，以约1.8×10-8(18nM)至约2.1×10-7(210nM)或更多(也即更弱亲和力)的EC50值结合任何上述T细胞及T细胞系的双特异性抗原结合分子，或EC50不可检测。在某些实施例中，如通过FACS结合，例如使用如本文中实施例5中定义的分析形式或基本上类似的分析法测定，本发明的抗体、抗原结合片段及双特异性抗体以超过约30nM、超过约40nM、超过约45nM、超过约50nM、超过约55nM、超过约60nM、超过约65nM、超过约70nM、超过约75nM、至少80nM、超过约90nM、超过约100nM、超过约110nM、至少120nM、超过约130nM、超过约140nM、超过约150nM、至少160nM、超过约170nM、超过约180nM、超过约190nM、超过约200nM、超过约250nM、超过约300nM、超过约1μM、超过约2μM或超过约3μM的EC50或不可检测的亲和力结合CD3。
本发明也包括如使用如实施例5中阐述的FACS结合分析法或基本上类似的分析法测定，以小于或等于5.6nM(5.6×10-9)的EC50值结合于表达PSMA的细胞及细胞系的抗体、抗原结合片段及其双特异性抗体。
本发明包括以微弱(也即低)亲和力甚至不可检测的亲和力结合人CD3的抗体、抗原结合片段及其双特异性抗体。根据某些实施例，本发明包括如通过表面等离振子共振，例如使用如本文中实施例6中定义的分析形式测定，以超过约11nM的KD结合人CD3(例如在37℃下)的抗体及抗体的抗原结合片段。在某些实施例中，如通过表面等离振子共振，例如使用如本文中实施例6中定义的分析形式(例如mAb-捕捉或抗原-捕捉形式)或基本上类似的分析法测定，本发明的抗体或抗原结合片段以超过约15nM、超过约20nM、超过约25nM、超过约30nM、超过约35nM、超过约40nM、超过约45nM、超过约50nM、超过约55nM、超过约60nM、超过约65nM、超过约70nM、超过约75nM、至少80nM、超过约90nM、超过约100nM、超过约110nM、至少120nM、超过约130nM、超过约140nM、超过约150nM、至少160nM、超过约170nM、超过约180nM、超过约190nM、超过约200nM、超过约250nM、超过约300nM、超过约1μM、超过约2μM或超过约3μM的KD或不可检测的亲和力结合CD3。
本发明包括以微弱(也即低)亲和力甚至不可检测的亲和力结合猴(也即食蟹猴)CD3的抗体、抗原结合片段及其双特异性抗体。根据某些实施例，本发明包括如通过表面等离振子共振，例如使用如本文中实施例6中定义的分析形式测定，以超过约10nM的KD结合人CD3(例如在37℃下)的抗体、其抗原结合片段及双特异性抗体。在某些实施例中，如通过表面等离振子共振，例如使用如本文中实施例6中定义的分析形式(例如mAb-捕捉或抗原-捕捉形式)或基本上类似的分析法测定，本发明的抗体或抗原结合片段以超过约15nM、超过约20nM、超过约25nM、超过约30nM、超过约35nM、超过约40nM、超过约45nM、超过约50nM、超过约55nM、超过约60nM、超过约65nM、超过约70nM、超过约75nM、至少80nM、超过约90nM、超过约100nM、超过约110nM、至少120nM、超过约130nM、超过约140nM、超过约150nM、至少160nM、超过约170nM、超过约180nM、超过约190nM、超过约200nM、超过约250nM、超过约300nM、超过约1μM、超过约2μM或超过约3μM的KD或不可检测的亲和力结合CD3。
本发明包括结合人CD3且诱发T细胞活化的抗体、其抗原结合片段及双特异性抗体。举例而言，本发明包括如通过体外T细胞活化分析法，例如使用如本文中实施例7中定义的分析形式[例如评估在抗CD3抗体存在下全部T细胞(CD2+)中活化(CD69+)细胞百分比]或评估处于活化状态的T细胞的基本上类似的分析法测定，以小于约113pM的EC50值诱发人T细胞活化的抗CD3抗体。在某些实施例中，如通过体外T细胞活化分析法，例如使用如本文中实施例7中定义的分析形式或基本上类似的分析法测定，本发明的抗体或抗原结合片段以小于约100pM、小于约50pM、小于约20pM、小于约19pM、小于约18pM、小于约17pM、小于约16pM、小于约15pM、小于约14pM、小于约13pM、小于约12pM、小于约11pM、小于约10pM、小于约9pM、小于约8pM、小于约7pM、小于约6pM、小于约5pM、小于约4pM、小于约3pM、小于约2pM或小于约1pM的EC50值诱发人T细胞活化[例如活化(CD69+)T细胞百分比]。如本文中实施例7中例示，与CD3的结合微弱或不可检测的抗CD3抗体能够以高效力(也即pM范围)诱发T细胞活化，尽管与CD3结合的亲和力微弱或不可检测。
本发明也包括结合人CD3且诱发T细胞介导的表达肿瘤抗原的细胞杀伤的抗体、其抗原结合片段及双特异性抗体。举例而言，本发明包括如在体外T细胞介导的肿瘤细胞杀伤分析法，例如使用如本文中实施例7中定义的分析形式(例如评估在抗CD3抗体存在下通过人PBMC杀伤表达PSMA的细胞的程度)或基本上类似的分析法中测定，以小于约1.3nM的EC50诱发T细胞介导的肿瘤细胞杀伤的抗CD3抗体。在某些实施例中，如通过体外T细胞介导的肿瘤细胞杀伤分析法，例如使用如本文中实施例7中定义的分析形式或基本上类似的分析法测定，本发明的抗体或抗原结合片段以少于约1nM、少于约400pM、少于约250pM、少于约100pM、少于约50pM、少于约40pM、少于约30pM、少于约20pM、少于约10pM、少于约9pM、少于约8pM、少于约7pM、少于约6pM、少于约5pM、少于约4pM、少于约3pM、少于约2pM或少于约1pM的EC50值诱发T细胞介导的肿瘤细胞杀伤(例如PBMC介导的C4-2、22Rv1及TRAMPC2_PSMA细胞杀伤)。本发明也包括以微弱(也即低)或甚至不可检测亲和力(也即不结合或展现不可检测亲和力)结合人和/或猴(也即食蟹猴)CD3且诱发T细胞介导的表达肿瘤抗原的细胞杀伤的抗体、抗原结合片段及双特异性抗体。
本发明也包括如通过表面等离振子共振，在25℃或37℃下，例如使用如本文中实施例6中定义的分析形式或基本上类似的分析法测定，以小于约10分钟的解离半衰期(t1/2)结合人CD3的抗体、抗原结合片段及双特异性抗体。在某些实施例中，如通过表面等离振子共振，在25℃或37℃下，例如使用如本文中实施例6中定义的分析形式(例如mAb-捕捉或抗原-捕捉形式)或基本上类似的分析法测定，本发明的抗体或抗原结合片段以少于约9分钟、少于约8分钟、少于约7分钟、少于约6分钟、少于约5分钟、少于约4分钟、少于约3分钟、少于约2分钟、少于约1.9分钟或少于约1.8分钟的t1/2结合CD3，或展示非常微弱或不可检测的结合。
本发明的抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子可另外展现一个或多个选自下述的特征：(a)诱发体外PBMC增殖；(b)通过诱发人全血中IFN-γ释放及CD25上调而活化T细胞及(c)诱发抗PSMA抗性细胞系上T细胞介导的细胞毒性。
本发明包括能够耗尽个体中表达肿瘤抗原的细胞的抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子(参见例如实施例8)。举例而言，根据某些实施例，提供抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子，其中向个体单次施用1μg或10μg或100μg双特异性抗原结合分子(例如以约0.1mg/kg、约0.08mg/kg、约0.06mg/kg、约0.04mg/kg、约0.04mg/kg、约0.02mg/kg、约0.01mg/kg的剂量或更少)减少个体中表达PSMA的细胞数目(例如抑制或抑制个体中肿瘤生长)至低于可检测水平。在某些实施例中，以约0.4mg/kg的剂量单次施用抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子截至向个体施用双特异性抗原结合分子后约第7天、约第6天、约第5天、约第4天、约第3天、约第2天或约第1天引起个体中肿瘤生长减少至低于可检测水平。根据某些实施例，以至少约0.01mg/kg的剂量单次施用本发明的抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子直至施用后至少约第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天或更多天引起表达PSMA的肿瘤细胞数目保持低于可检测水平。如本文所用，表述“低于可检测水平”是指使用例如如本文中实施例8中阐述的标准测径规测定法，不可直接或间接检测个体中皮下生长的肿瘤细胞。
本发明也包括展现一个或多个选自下述的特征的抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子：(a)抑制具有人前列腺癌异种移植物的无免疫应答小鼠中的肿瘤生长；(b)抑制具有人前列腺癌异种移植物的免疫活性小鼠中的肿瘤生长；(c)抑制具有人前列腺癌异种移植物的无免疫应答小鼠中建立的肿瘤的肿瘤生长及(d)减少具有人前列腺癌异种移植物的免疫活性小鼠中建立的肿瘤的肿瘤生长(参见例如实施例8)。本发明也包括抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子，其展现一个或多个选自下述的特征：(a)诱发循环细胞因子的瞬时剂量依赖性增加；(b)诱发循环T细胞的瞬时增加及(c)不耗尽效应T细胞(例如CD4+T细胞、CD8+T细胞及调节T细胞，也即Treg)。
表位定位及相关技术
本发明的抗原结合分子结合的CD3和/或PSMA上的表位可由CD3或PSMA蛋白质的3个或更多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)氨基酸的单一连续序列组成。或者，表位可由CD3或PSMA的多个不连续氨基酸(或氨基酸序列)组成。本发明的抗体可与单一CD3链(例如CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ)内含有的氨基酸相互作用，或可与两个或超过两个不同CD3链上氨基酸相互作用。如本文所用，术语“表位”是指与抗体分子的可变区中称为互补位的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可具有超过一个表位。因此，不同抗体可结合于抗原上不同区域，且可具有不同生物效应。表位可为构形的或线性的。构形表位通过来自线性多肽链的不同区段的空间并列的氨基酸产生。线性表位为通过多肽链中相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情形下，表位可包括抗原上的糖部分、磷酰基或磺酰基。
本领域技术人员已知的各种技术可用于确定抗体的抗原结合结构域是否“与多肽或蛋白质内的一个或多个氨基酸相互作用”。示例性技术包括例如常规交叉阻断分析法，诸如Antibodies,Harlow及Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中描述；丙氨酸扫描突变分析；肽墨点分析(Reineke,2004,Methods Mol Biol 248:443-463)及肽裂解分析。另外，可采用诸如表位切除、表位提取及抗原化学修饰的方法(Tomer,2000,Protein Science 9:487-496)。可用于鉴别抗体的抗原结合结构域进行相互作用的多肽内氨基酸的另一方法为通过质谱分析检测的氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法涉及氘标记相关蛋白质，接着抗体与氘标记的蛋白质结合。接着，蛋白质/抗体复合物转移至水中以允许在除抗体所保护的残基(其保持氘标记)外的所有残基上发生氢-氘交换。抗体解离后，标靶蛋白质进行蛋白酶裂解及质谱分析，藉此揭露对应于抗体相互作用的特定氨基酸的氘标记的残基。参见例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；Engen及Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。抗原/抗体复合物的X射线结晶学也可用于达成表位定位的目的。
本发明进一步包括与本文中描述的任何特定示例性抗体结合于相同表位的抗PSMA抗体(例如包含如本文中表1中阐述的任何氨基酸序列的抗体)。同样，本发明也包括与本文中描述的任何特定示例性抗体竞争结合于PSMA的抗PSMA抗体(例如包含如本文中表1中阐述的任何氨基酸序列的抗体)。
本发明也包括包含以低或可检测结合亲和力特异性结合人CD3和/或食蟹猴CD3的第一抗原结合结构域及特异性结合人PSMA的第二抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合结构域与本文中描述的任何特定示例性CD3特异性抗原结合结构域结合于CD3上相同表位，和/或其中第二抗原结合结构域与本文中描述的任何特定示例性PSMA特异性抗原结合结构域结合于PSMA上相同的表位。
同样，本发明也包括包含特异性结合人CD3的第一抗原结合结构域及特异性结合人PSMA的第二抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子，其中该第一抗原结合结构域与本文中描述的任何特定示例性CD3特异性抗原结合结构域竞争结合于CD3，和/或其中该第二抗原结合结构域与本文中描述的任何特定示例性PSMA特异性抗原结合结构域竞争结合于PSMA。
通过使用本领域中已知的常规方法，可容易确定特定抗原结合分子(例如抗体)或其抗原结合结构域是否与本发明的参考抗原结合分子结合于相同表位或竞争结合。举例而言，为确定是否测试抗体与本发明的参考双特异性抗原结合分子结合于PSMA(或CD3)上相同表位，首先使参考双特异性分子结合于PSMA蛋白质(或CD3蛋白质)。接着，评估测试抗体结合于PSMA(或CD3)分子的能力。若测试抗体在参考双特异性抗原结合分子饱和结合后能够结合于PSMA(或CD3)，则可断定测试抗体结合于与参考双特异性抗原结合分子不同的PSMA(或CD3)表位。另一方面，若测试抗体在参考双特异性抗原结合分子饱和结合后不能结合于PSMA(或CD3)分子，则测试抗体可结合于PSMA(或CD3)的表位与本发明的参考双特异性抗原结合分子结合的表位相同。接着可进行其他常规实验(例如肽突变及结合分析)，以证实观测到的测试抗体的结合缺乏实际上是否归因于与参考双特异性抗原结合分子结合于相同表位，或是否空间阻断(或另一现象)引起观测到的结合缺乏。这种实验可使用ELISA、RIA、Biacore、流动式细胞测定术或本领域中可用的任何其他定量或定性抗体结合分析法进行。根据本发明的某些实施例，若例如1、5、10、20或100倍过量的一种抗原结合蛋白抑制另一抗原结合蛋白的结合达至少50％，但优选75％、90％或甚至99％，如竞争性结合分析法中测定，则两种抗原结合蛋白结合于相同(或重叠)表位(参见例如Junghans等人,CancerRes.1990:50:1495-1502)。或者，若抗原中减少或消除一种抗原结合蛋白的结合的基本上所有氨基酸突变减少或消除另一种抗原结合蛋白的结合，则认为两种抗原结合蛋白结合于相同表位。若仅仅减少或消除一种抗原结合蛋白的结合的氨基酸突变子集减少或消除另一种抗原结合蛋白的结合，则认为两种抗原结合蛋白具有“重叠表位”。
为确定抗体或其抗原结合结构域是否与参考抗原结合分子竞争结合，以两个方向进行上述结合方法：在第一方向中，在饱和条件下使参考抗原结合分子结合于PSMA蛋白质(或CD3蛋白质)，接着评估测试抗体与PSMA(或CD3)分子的结合。在第二方向中，在饱和条件下使测试抗体结合于PSMA(或CD3)，接着评估参考抗原结合分子与PSMA(或CD3)分子的结合。若在两个方向中，仅仅第一(饱和)抗原结合分子能够结合于PSMA(或CD3)分子，则断定测试抗体及参考抗原结合分子竞争结合于PSMA(或CD3)。如本领域技术人员所了解，与参考抗原结合分子竞争结合的抗体可不一定与参考抗体结合于相同表位，而可能通过结合重叠或相邻表位在空间上阻断参考抗体的结合。
制备抗原结合结构域及构建双特异性分子
对特定抗原具有特异性的抗原结合结构域可通过本领域中已知的任何抗体产生技术制备。一旦获得，使用常规方法，对两个不同抗原(例如CD3及PSMA)具有特异性的两个不同抗原结合结构域可相对于彼此适当排列，以产生本发明的双特异性抗原结合分子。(可用于构建本发明的双特异性抗原结合分子的示例性双特异性抗体形式的讨论提供在本文中其他地方)。在某些实施例中，本发明的多特异性抗原结合分子的各组分(例如重链及轻链)中的一个或多个来源于嵌合、人源化或完全人抗体。制备这种抗体的方法为本领域中所熟知。举例而言，本发明的双特异性抗原结合分子的重链和/或轻链中的一个或多个可使用VELOCIMMUNETM技术制备。使用VELOCIMMUNETM技术(或任何其他人抗体产生技术)，初始分离具有人可变区及小鼠恒定区的针对特定抗原(例如CD3或PSMA)的高亲和力嵌合抗体。对抗体进行表征且针对包括亲和力、选择性、表位等所需特征进行选择。小鼠恒定区经所需人恒定区置换，以产生可并入本发明的双特异性抗原结合分子中的完全人重链和/或轻链。
基因工程改造的动物可用于制备人双特异性抗原结合分子。举例而言，可使用经基因修饰的小鼠，其不能重排且表达内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变序列，其中该小鼠仅仅表达通过在内源性小鼠κ基因座可操作地连接于小鼠κ恒定基因的人免疫球蛋白序列编码的一或两个人轻链可变结构域。这种经基因修饰的小鼠可用于产生包含两条与相同轻链结合的不同重链的完全人双特异性抗原结合分子，该轻链包含来源于两种不同人轻链可变区基因区段的一的可变结构域。(关于这种工程改造小鼠及其产生双特异性抗原结合分子的用途的详细讨论，参见例如US 2011/0195454)。
生物同等物
本发明涵盖氨基酸序列与本文公开的示例性分子的氨基酸序列不同，但保留结合CD3和/或PSMA的能力的抗原结合分子。当与亲本序列比较时，这种变异分子可包含氨基酸的一个或多个添加、缺失或取代，但展现与所述双特异性抗原结合分子基本上同等的生物活性。
本发明包括与本文中阐述的任何示例性抗原结合分子生物上同等的抗原结合分子。举例而言，若两种抗原结合蛋白或抗体在类似实验条件下以相同摩尔浓度剂量施用(单剂量或多剂量)时，为吸收速率及程度未展示显著差异的医药同等物或医药替代物，则其视为生物同等。若一些抗原结合蛋白在吸收程度而非其吸收速率上同等，而可视为生物同等的，则其将视为同等物或医药学上替代物，因为这种吸收速率差异为有意识的且反映在标记上，对例如长期使用时有效身体药物浓度的实现并非必要，且对于特定研究药品，视为医学上不重要的。
在一个实施例中，若两种抗原结合蛋白的安全性、纯度及效能无临床上有意义的差异，则其为生物同等的。
在一个实施例中，若患者可在参考产品与生物制品之间切换一或多次，但与无这种切换的持续疗法相比，副作用风险未预期增加，包括无免疫原性的临床上显著变化或有效性减弱，则两种抗原结合蛋白为生物同等的。
在一个实施例中，若两种抗原结合蛋白通过使用共同机制或作用机制(在已知这种机制的程度上)对病状起作用，则其为生物同等的。
生物同等性可通过体内及体外方法证明。生物同等性量度包括例如(a)人或其他哺乳动物中的体内测试，其中在血液、血浆、血清或其他生物流体中测定作为时间函数的抗体或其代谢物的浓度；(b)已与人体内生物可用性资料相关且合理地预示人体内生物可用性资料的体外测试；(c)人或哺乳动物中的体内测试，其中抗体(或其标靶)的适当急性药理学作用作为时间函数测定及(d)良好控制的临床试验中，该临床试验确定抗原结合蛋白的安全性、功效或生物可用性或生物同等性。
本文中阐述的示例性双特异性抗原结合分子的生物同等变体可通过例如对生物活性无需的残基或序列进行各种取代或使生物活性无需的末端或内部残基或序列缺失来构建。举例而言，对生物活性而言并非必需的半胱氨酸残基可缺失或经其他氨基酸置换以防止在复原后不必要或不正确的分子内二硫桥键形成。在其他情况下，生物同等抗原结合蛋白可包括本文中阐述的示例性双特异性抗原结合分子的变体，其包含改变分子的糖基化特征的氨基酸改变，例如消除或移除糖基化的突变。
物种选择性及物种交叉反应性
根据本发明的某些实施例，提供结合于人CD3而非来从其他物种的CD3的抗原结合分子。也提供结合于人PSMA而非来从其他物种的PSMA的抗原结合分子。本发明也包括结合于人CD3及来自一种或多种非人物种的CD3的抗原结合分子；和/或结合于人PSMA及来自一种或多种非人物种的PSMA的抗原结合分子。
根据本发明的某些示例性实施例，提供结合于人CD3和/或人PSMA且视情况而定，可结合或不结合于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、犬、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、食蟹猴、狨猴、恒河猴或黑猩猩CD3和/或PSMA中的一个或多个的抗原结合分子。举例而言，在本发明的一个特定示例性实施方案中，提供双特异性抗原结合分子，其包含结合人CD3及食蟹猴CD3的第一抗原结合结构域及特异性结合人PSMA的第二抗原结合结构域。
免疫结合物
本发明涵盖结合于诸如细胞毒素、化学治疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素的治疗部分的抗原结合分子(“免疫结合物”)。细胞毒性剂包括对细胞有害的任何药物。适用于形成免疫结合物的细胞毒性剂及化学治疗剂的实施例为本领域中已知(参见例如WO 05/103081)。
治疗制剂及施用
本发明提供包含本发明的抗原结合分子的药物组合物。本发明的药物组合物用适合载体、赋形剂及提供改善的转移、递送、耐受性及其类似物的其他试剂配制。大量适当制剂可见于所有医药化学家已知的药典中：Remington's Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Company,Easton,PA。这些制剂包括例如散剂、糊剂、软膏、凝胶、蜡、油、脂质、含有小泡的脂质(阳离子或阴离子)(诸如LIPOFECTINTM,Life Technologies,Carlsbad,CA)、DNA结合物、无水吸附糊剂、水包油及油包水乳液、乳液碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶及含有碳蜡的半固体混合物。也参见Powell等人“Compendium of excipientsfor parenteral formulations”PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。
施用患者的抗原结合分子的剂量可视患者的年龄及体型、目标疾病、病状、施用途径及其类似物而改变。优选剂量通常根据体重或体表面积计算。当本发明的双特异性抗原结合分子用于在成年患者中达成治疗目的时，通常宜以约0.01至约20mg/kg体重、更佳约0.02至约7、约0.03至约5或约0.05至约3mg/kg体重的单次剂量静脉内施用本发明的双特异性抗原结合分子。视病状的严重程度而定，可调整治疗的频率及持续时间。施用双特异性抗原结合分子的有效剂量及时程可凭经验确定；举例而言，患者进展可通过周期性评估监测，且因此调整剂量。此外，可使用本领域中熟知的方法进行剂量的种间比例缩放(例如Mordenti等人,1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
已知各种递送系统，且可用于施用本发明的药物组合物，例如囊封在脂质粒中、微粒、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见例如Wu等人,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入方法包括(但不限于)皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外及经口途径。组合物可通过任何便利途径，例如通过输注或快速注射，通过经上皮或黏膜与皮肤内层(例如口腔黏膜、直肠及肠黏膜等等)吸收来施用，且可与其他生物活性剂一起施用。施用可为全身性或局部施用。
本发明的药物组合物可用标准针及注射器皮下或静脉内递送。另外，关于皮下递送，笔式递送装置容易用于递送本发明的药物组合物。这种笔式递送装置可再用或可抛弃。可再用笔式递送装置一般利用含有药物组合物的可替换药筒。一旦已施用药筒内的所有药物组合物且药筒为空的，则可容易抛弃空药筒且用含有药物组合物的新药筒替换。接着可再使用该笔式递送装置。在可抛弃笔式递送装置中，无可替换的药筒。更确切些，可抛弃笔式递送装置预装填药物组合物，该药物组合物固持在装置内的储集器中。一旦储集器倒出药物组合物，则抛弃整个装置。
许多可再用笔式及自动注射器式递送装置用于皮下递送本发明的药物组合物。实施例包括(但不限于)AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,瑞士)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTMI、II及III(NovoNordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPENSTARLETTM及OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,德国)，仅举数例。用于皮下递送本发明的药物组合物的可抛弃笔式递送装置的实施例包括(但不限于)SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)及KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,德国)、EPIPEN(Dey,L.P.)及HUMIRATM笔(Abbott Labs,Abbott Park IL)，仅举数例。
在某些情况下，药物组合物可于控制释放系统中递送。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer,上文；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一个实施例中，可使用聚合物材料；参见Medical Applications of Controlled Release,Langer及Wise(编辑),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在又一个实施例中，控制释放系统可接近组合物的目标置放，因此仅仅需要一小部分全身性剂量(参见例如Goodson,1984,Medical Applications of Controlled Release,上文,第2卷,第115-138页)。其他控制释放系统论述于Langer,1990,Science 249:1527-1533的评述中。
可注射制剂可包括用于静脉内、皮下、皮内及肌肉内注射、滴注(drip infusion)等的剂型。这些可注射制剂可通过公开已知的方法制备。举例而言，可注射制剂可例如通过使上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于通常用于注射的无菌水性介质或油性介质来制备。作为注射用水性介质，存在例如生理食盐水、含有葡萄糖及其他助剂等的等渗溶液，其可与适当增溶剂，诸如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活化剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)等]组合使用。作为油性介质，采用例如芝麻油、豆油等，其可与诸如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等增溶剂组合使用。由此制备的注射液优选填充在适当安瓿中。
上述用于经口或非经肠使用的药物组合物宜制备成适于配合活性成分的剂量的剂型的单位剂量。单位剂量的这种剂型包括例如锭剂、丸剂、胶囊、注射液(安瓿)、栓剂等。所含的上述抗体的量一般为单位剂量中每个剂型约5至约500mg；特别呈注射液形式，优选地，上述抗体含量为约5至约100mg，且对于其他剂型，为约10至约250mg。
抗原结合分子的治疗用途
本发明包括包含向有需要的个体施用包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段或特异性结合CD3及PSMA的双特异性抗原结合分子的治疗组合物的方法。治疗组合物可包含任何如本文公开的抗体或双特异性抗原结合分子及可药用载体或稀释剂。如本文所用，表述“有需要的个体”是指展现癌症的一种或多种症状或指症(例如表达肿瘤或罹患任何下文所提及的癌症的个体)或将以其他方式得益于PSMA活性抑制或降低或PSMA+细胞(例如前列腺癌细胞)耗尽的人或非人动物。
本发明的抗体及双特异性抗原结合分子(及包含其的治疗组合物)尤其适用于治疗其中刺激、活化和/或靶向免疫反应将有益的任何疾病或病症。具体而言，本发明的抗PSMA抗体或抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子可用于治疗、预防和/或改善与PSMA表达或活性或PSMA+细胞增殖相关或由其介导的任何疾病或病症。实现本发明的治疗方法的作用机制包括在效应细胞存在下例如通过CDC、细胞凋亡、ADCC、噬菌作用或通过两种或超过两种这些机制的组合杀死表达PSMA的细胞。可使用本发明的双特异性抗原结合分子抑制或杀死的表达PSMA的细胞包括例如前列腺肿瘤细胞。
本发明的抗原结合分子可用于治疗例如胃肠道、前列腺、肾和/或膀胱中出现的原发性和/或转移性肿瘤。在某些实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子用以治疗一种或多种以下癌症：透明细胞肾细胞癌、难染肾细胞癌、(肾)嗜酸粒细胞腺瘤、(肾)转移细胞癌、前列腺癌、结肠直肠癌、胃癌、尿道上皮癌、(膀胱)腺癌或(膀胱)小细胞癌。根据本发明的某些实施例，抗PSMA抗体或抗PSMA/抗CD3双特异性抗体可用于治疗罹患去势抵抗性前列腺癌的患者。根据本发明的其他相关实施例，提供包含向罹患去势抵抗性前列腺癌的患者施用如本文公开的抗PSMA抗体或抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子的方法。本领域中已知的分析/诊断方法，诸如肿瘤扫描等，可用于确定患者是否患有去势抵抗性肿瘤。
本发明也包括用于治疗个体中残余癌症的方法。如本文所用，术语“残余癌症”是指在用抗癌疗法治疗后个体中存在或持续有一个或多个癌细胞。
根据某些方面，本发明提供用于治疗与PSMA表达相关的疾病或病症(例如前列腺癌)的方法，其包括在已确定个体患有前列腺癌(例如去势抵抗性前列腺癌)后向个体施用一种或多种在本文中其他地方描述的抗PSMA或双特异性抗原结合分子。举例而言，本发明包括用于治疗前列腺癌的方法，其包括在个体接受激素治疗(例如抗雄激素疗法)后1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周、2个月、4个月、6个月、8个月、1年或更长时间向患者施用抗PSMA抗体或抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子。
组合疗法及制剂
本发明提供包含施用药物组合物的方法，该药物组合物包含任何本文中描述的示例性抗体及双特异性抗原结合分子与一种或多种其他治疗剂。可与本发明的抗原结合分子组合或与其组合施用的示例性其他治疗剂包括例如EGFR拮抗剂(例如抗EGFR抗体[例如西妥昔单抗(cetuximab)或帕尼单抗(panitumumab)]或EGFR小分子抑制剂[例如吉非替尼(gefitinib)或厄罗替尼(erlotinib)])、诸如Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4的另一EGFR家族成员的拮抗剂(例如抗ErbB2、抗ErbB3或抗ErbB4抗体或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性的小分子抑制剂)、EGFRvIII的拮抗剂(例如特异性结合EGFRvIII的抗体)、cMET拮抗剂(例如抗cMET抗体)、IGF1R拮抗剂(例如抗IGF1R抗体)、B-raf抑制剂(例如威罗菲尼(vemurafenib)、索拉非尼(sorafenib)、GDC-0879、PLX-4720)、PDGFR-α抑制剂(例如抗PDGFR-α抗体)、PDGFR-β抑制剂(例如抗PDGFR-β抗体)、VEGF拮抗剂(例如VEGF-Trap，参见例如US 7,087,411(本文中也称为“抑制VEGF的融合蛋白”)、抗VEGF抗体(例如贝伐单抗(bevacizumab))、VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)或帕唑帕尼(pazopanib))、DLL4拮抗剂(例如US2009/0142354中公开的抗DLL4抗体，诸如REGN421)、Ang2拮抗剂(例如US2011/0027286中公开的抗Ang2抗体，诸如H1H685P)、FOLH1(PSMA)拮抗剂、PRLR拮抗剂(例如抗PRLR抗体)、STEAP1或STEAP2拮抗剂(例如抗STEAP1抗体或抗STEAP2抗体)、TMPRSS2拮抗剂(例如抗TMPRSS2抗体)、MSLN拮抗剂(例如抗MSLN抗体)、CA9拮抗剂(例如抗CA9抗体)、尿溶蛋白拮抗剂(例如抗尿溶蛋白抗体)等。可有利地与本发明的抗原结合分子组合施用的其他药物包括细胞因子抑制剂，包括小分子细胞因子抑制剂及结合于细胞因子诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18或其相应受体的抗体。本发明的药物组合物(例如包含如本文公开的抗CD3/抗PSMA双特异性抗原结合分子的药物组合物)也可作为包含选自下述的一种或多种治疗组合的治疗方案的一部分施用：“ICE”，异环磷酰胺(ifosfamide)(例如
Figure BDA0001618239300000601
)、卡铂(carboplatin)(例如
Figure BDA0001618239300000602
)、依托泊苷(etoposide)(例如
Figure BDA0001618239300000603
Figure BDA0001618239300000604
VP-16)；“DHAP”，地塞米松(dexamethasone)(例如
Figure BDA0001618239300000605
)、阿糖胞苷(cytarabine)(例如
Figure BDA0001618239300000606
阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、ara-C)、顺铂(cisplatin)(例如
Figure BDA0001618239300000607
-AQ)及“ESHAP”，依托泊苷(例如
Figure BDA0001618239300000608
VP-16)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)(例如
Figure BDA0001618239300000609
)、高剂量阿糖胞苷、顺铂(例如
Figure BDA00016182393000006010
-AQ)。
本发明也包括包含任何本文中提及的抗原结合分子及以下一个或多个抑制剂的治疗组合：VEGF、Ang2、DLL4、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFRvIII、cMet、IGF1R、B-raf、PDGFR-α、PDGFR-β、FOLH1(PSMA)、PRLR、STEAP1、STEAP2、TMPRSS2、MSLN、CA9、尿溶蛋白或任何上述细胞因子，其中抑制剂为适体、反义分子、核糖酶、siRNA、肽体、纳米抗体或抗体片段(例如Fab片段；F(ab')2片段；Fd片段；Fv片段；scFv；dAb片段；或其他工程改造分子，诸如双抗体、三功能抗体、四功能抗体、微型抗体及最小识别单元)。本发明的抗原结合分子也可与抗病毒剂、抗生素、止痛剂、皮质类固醇和/或NSAID组合施用和/或共同配制。本发明的抗原结合分子也可作为治疗方案的一部分施用，该治疗方案也包括放射治疗和/或常规的化学疗法。
其他治疗活性组分可在即将施用本发明的抗原结合分子时、与其同时或在其的后不久施用；(对本发明而言，这种施用方案视为施用抗原结合分子“与其他治疗活性组分组合”)。
本发明包括药物组合物，其中本发明的抗原结合分子与一种或多种如本文中其他地方描述的其他治疗活性组分共同配制。
施用方案
根据本发明的某些实施例，在给定的时间内，多剂量抗原结合分子(例如特异性结合PSMA及CD3的抗PSMA抗体或双特异性抗原结合分子)可施用个体。根据本发明此方面的方法包括向个体连续施用多剂量本发明的抗原结合分子。如本文所用，“连续施用”是指每剂抗原结合分子在不同时间点，例如在相隔预定时间间隔(例如小时、天、周或月)的不同日施用个体。本发明包括包含向患者连续施用单一初始剂量的抗原结合分子，接着一个或多个第二剂量的抗原结合分子，且任选接着一个或多个第三剂量的抗原结合分子的方法。
术语“初始剂量”、“第二剂量”及“第三剂量”是指本发明的抗原结合分子的施用时间序列。因此，“初始剂量”为在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”)；“第二剂量”为初始剂量后施用的剂量；且“第三剂量”为第二剂量后施用的剂量。初始、第二及第三剂量均可含有相同量的抗原结合分子，但一般可根据施用频率而彼此不同。然而，在某些实施例中，初始、第二和/或第三剂量中所含的抗原结合分子的量在治疗过程中彼此不同(例如视情况向上或向下调整)。在某些实施例中，在治疗方案开始时施用两个或超过两个(例如2、3、4或5个)剂量作为“具有体量”，接着以较低频率施用随后剂量(例如“维持剂量”)。
在本发明的一个示例性实施例中，在前一个剂量后各第二和/或第三剂量施用1至26(例如1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更多)周。如本文所用，短语“前一次剂量”是指在多个施用系列中，在系列中施用紧接着的剂量之前施用患者的抗原结合分子的剂量，其中不插入剂量。
根据本发明的此方面的方法可包含向患者施用许多第二和/或第三剂量的抗原结合分子(例如特异性结合PSMA及CD3的抗PSMA抗体或双特异性抗原结合分子)。举例而言，在某些实施例中，仅仅向患者施用单个第二剂量。在其他实施例中，向患者施用两个或超过两个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多个)第二剂量。同样，在某些实施方案中，仅仅向患者施用单个第三剂量。在其他实施方案中，向患者施用两个或超过两个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多个)第三剂量。
在涉及多个第二剂量的实施例中，各第二剂量可以与其他第二剂量相同的频率施用。举例而言，各第二剂量可在前一次剂量后1至2周施用患者。类似地，在涉及多个第三剂量的实施例中，各第三剂量可以与其他第三剂量相同的频率施用。举例而言，各第三剂量可在前一次剂量后2至4周施用患者。或者，在治疗方案过程期间，第二和/或第三剂量施用患者的频率可改变。施用频率也可在治疗过程中由医师视临床检查后各患者的需要而定进行调整。
抗体的诊断用途
本发明的抗PSMA抗体也可用以检测和/或测定样品中PSMA或表达PSMA的细胞，以达成诊断目的。举例而言，抗PSMA抗体或其片段可用于诊断特征为PSMA表达异常(例如过度表达、表达不足、缺乏表达等)的病状或疾病。PSMA的示例性诊断分析可包含例如使自患者获得的样品与本发明的抗PSMA抗体接触，其中抗PSMA抗体经可检测标记或报告分子标记。或者，未标记的抗PSMA抗体可与本身可检测标记的第二抗体组合用于诊断应用。可检测标记或报告分子可为放射性同位素，诸如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光部分，诸如异硫氰酸荧光素或罗丹明；或酶，诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化酶或荧光素酶。本发明的抗PSMA抗体的另一示例性诊断用途包括89Zr标记，诸如89Zr-去铁敏标记的抗体，以非侵入性鉴别及追踪个体中的肿瘤细胞(例如正电子发射断层摄影法(PET)成像)。(参见例如Tavare,R.等人Cancer Res.2016年1月1日；76(1):73-82及Azad,BB.等人Oncotarget.2016年3月15日；7(11):12344-58)。可用于检测或测定样品中PSMA的特定示例性分析包括酶联免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)及荧光启动细胞分选术(FACS)。
根据本发明可用于PSMA诊断分析法的样品包括可从在正常或病理学条件下，含有可检测量的PSMA蛋白质或其片段的患者获得的任何组织或流体样品。一般而言，将测定从健康患者(例如未患与异常PSMA含量或活性相关的疾病或病状的患者)获得的特定样品中PSMA的含量以初始确定PSMA的基线或标准含量。接着PSMA的此基线含量可与在自怀疑患有PSMA相关疾病(例如含有表达PSMA的细胞的肿瘤)或病状的个体获得的样品中测定的PSMA含量比较。
实施例
提出以下实施例以便为本领域技术人员提供关于如何进行和使用本发明的方法及组合物的完整公开内容及描述，且不意欲限制本发明者视为其发明的内容的范畴。努力确保关于所使用的数字(例如量、温度等等)的准确性，但应说明一些实验误差及偏差。除非另外指示，否则份为重量份，分子量为平均分子量，温度以℃计，且压力为大气压或接近大气压。
实施例1：产生抗PSMA抗体
通过用人PSMA抗原对经基因修饰的小鼠进行免疫接种，或通过用人PSMA抗原对包含编码人免疫球蛋白重链及κ轻链可变区的DNA的工程改造的小鼠免疫接种，来获得抗PSMA抗体。
用表达人PSMA(SEQ ID NO:1651；UniProtKB/Swiss-Prot.No.Q04609)的人前列腺癌细胞(LNCaP,
Figure BDA0001618239300000641
Manassas,Virginia,USA)对小鼠进行免疫接种。免疫接种后，自各小鼠收获脾细胞，且(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合以维持其存活力且形成杂交瘤细胞且针对PSMA特异性进行筛选，或者(2)使用具有N端6-His标签的人PSMA(R&D，目录号4234-ZN)作为结合及鉴别反应抗体的分选试剂，进行B细胞分选(如US2007/0280945A1中所描述)(抗原阳性B细胞)。
最初分离具有人可变区及小鼠恒定区的PSMA的嵌合抗体。对抗体进行表征且针对包括亲和力、选择性等所需特征进行选择。必要时，小鼠恒定区经所需人恒定区，例如野生型或修饰IgG1或IgG4置换，以产生完全人抗PSMA抗体。虽然所选择的恒定区可根据特定用途改变，但高亲和力抗原结合及靶向特异性特征存在于可变区中。诸如H1H11453N2及H1M11900N的抗体名称表示完全人抗体“H1H”或嵌合人可变/小鼠恒定区抗体“H1M”。通过杂交瘤方法鉴别的抗体用以“N”或“N2”结束的抗体ID编号表示；通过B细胞分选方法鉴别的抗体用以“P”或“P2”结束的抗体ID编号表示。
根据此实施例的方法产生的示例性抗PSMA抗体的某些生物特性详细描述于以下阐述的实施例中。
实施例2：抗PSMA抗体的重链及轻链可变区氨基酸及核酸序列
图1阐述所选择的本发明的抗PSMA抗体的重链及轻链可变区及CDR的氨基酸序列识别符。对应核酸序列识别符阐述于表2中。
表1：氨基酸序列识别符
Figure BDA0001618239300000651
表2：核酸序列识别符
Figure BDA0001618239300000652
实施例3：表面等离振子共振获得的人单株抗PSMA抗体的结合亲和力及动力学常数
在此实施例中，评估抗PSMA抗体结合于人PSMA的能力。抗PSMA抗体与可溶性人PSMA蛋白质的结合亲和力及动力学常数在37℃下通过表面等离振子共振，使用抗体捕捉形式来测定。结果展示于表3及4中。在Biacore T-200仪器(GE Healthcare)上进行测定。
简言之，通过与单株小鼠抗人Fc抗体(GE，#BR-1008-39)或单株山羊抗小鼠Fc抗体(GE，#BR-1008-38)进行胺偶联以捕捉纯化的抗PSMA抗体，衍生CM5Biacore传感器表面。在由0.01M HEPES、0.15M NaCl、2mM Ca2+、2mM Mg2+、0.05％v/v表面活性剂P20pH7.4构成的HBSP++缓冲液中进行结合研究。将在HBSP++运行缓冲液(在50至0.78nM范围内，稀释4倍)中制备的不同浓度的经表达而具有N端六组氨酸标签的人PSMA(6h.hPSMA，R&D)以30微升/分钟的流速注射在抗PSMA抗体捕捉表面上。监测抗体-试剂结合2分钟，而监测HBSP++运行缓冲液中解离8分钟。
动力学结合(ka)及解离(kd)速率常数通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件将实时传感器图谱与1:1结合模型拟合来确定。结合解离平衡常数(KD)及解离半衰期(t1/2)由动力学速率常数计算为：KD(M)＝kd/ka及t1/2(min)＝(ln2/(60*kd)。
如表3及4中所示，本发明的抗PSMA抗体以抗体捕捉形式结合于人PSMA，具有改变亲和力且KD值在19.9pM至75.6nM范围内。诸如H1H3465P及H1H11810P2的若干示例性抗PSMA抗体显示对人PSMA蛋白质的强亲和力，具有低于亚纳摩尔浓度的KD值。
表3：在37℃下抗PSMA人IgG1抗体对可溶性人PSMA的亲和力
抗体ID ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) t<sub>1/2</sub>(min)
H1H3465P 2.67E+05 6.06E‐05 2.27E‐10 190.6
H1H11792P2 4.73E+05 9.70E‐05 2.05E‐10 119.1
H1H11797P2 1.68E+05 6.30E‐04 3.74E‐09 18.3
H1H11800P2 2.51E+05 4.10E‐05 1.63E‐10 281.8
H1H11803P2 4.57E+05 6.08E‐04 1.33E‐09 19
H1H11804P2 2.03E+04 8.01E‐04 3.94E‐08 14.4
H1H11805P2 1.29E+05 9.74E‐03 7.56E‐08 1.2
H1H11808P2 1.78E+05 ≤1E‐05 ≤5.63E‐11 ≥1155
H1H11810P2 5.03E+05 ≤1E‐05 ≤1.99E‐11 ≥1155
H1H11835P2 1.75E+05 2.46E‐03 1.40E‐08 4.7
H1H11836P2 3.27E+05 2.80E‐04 8.55E‐10 41.3
H1H11837P2 4.41E+05 7.34E‐04 1.66E‐09 15.7
H1H11838P2 2.37E+05 4.71E‐04 1.99E‐09 24.5
H1H11841P2 IC IC IC IC
IC：无结果
表4：在37℃下抗PSMA小鼠恒定抗体对可溶性人PSMA的亲和力
抗体ID ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) t<sub>1/2</sub>(min)
H2M11899N 1.51E+05 2.65E‐04 1.76E‐09 43.6
H1M11453N 1.85E+05 3.56E‐04 1.93E‐09 32.4
H1M11900N 1.57E+05 4.06E‐03 2.58E‐08 2.8
实施例4：结合前列腺特异性膜抗原(PSMA)及CD3的双特异性抗体的产生
本发明提供结合CD3及前列腺特异性膜抗原(PSMA)的双特异性抗原结合分子；这种双特异性抗原结合分子在本文中也称为“抗PSMA/抗CD3双特异性分子”。抗PSMA/抗CD3双特异性分子的抗PSMA部分可用于靶向表达PSMA的肿瘤细胞，且双特异性分子的抗CD3部分可用于活化T细胞。肿瘤细胞上PSMA及T细胞上CD3的同时结合促进活化T细胞直接杀伤(细胞裂解作用)所靶向的肿瘤细胞。
使用标准方法构建包含抗PSMA特异性结合结构域及抗CD3特异性结合结构域的双特异性抗体，其中该抗PSMA抗原结合结构域及该抗CD3抗原结合结构域各包含与共同LCVR配对的不同的不同HCVR。在一些情况下，利用来自抗CD3抗体的重链、来自抗PSMA抗体的重链及共同轻链构建双特异性抗体。在其他情况下，利用来自抗CD3抗体的重链、来自抗PSMA抗体的重链及来自抗CD3抗体的轻链构建双特异性抗体。
以下实施例中描述的双特异性抗体由已知结合于人可溶性异二聚体hCD3ε/δ蛋白质(如本文中实施例9-13中所描述)及人PSMA(参见以上实施例1-3)的结合臂组成。制备具有如2014年8月28日公开的美国专利申请公开第US20140243504A1号中阐述的经修饰(嵌合)IgG4Fc结构域的示例双特异性抗体。
各种抗PSMA×CD3双特异性抗体构建体的抗原结合结构域的组分部分的概述阐述于表5中。
表5：PSMA×CD3双特异性抗体的组成部分的概述
Figure BDA0001618239300000681
抗PSMA重链可变区PSMA-VH-3465为来自表1的H1H3465P的HCVR(SEQ ID NO:122)。抗PSMA重链可变区PSMA-VH-11810为来自表1的H1H11810P2的HCVR(SEQ ID NO:66)。
抗CD3重链可变区CD3-VH-A为来自表12的H1H5778P的HCVR(SEQ ID NO:922)。抗CD3重链可变区CD3-VH-B为来自表12的H1H2712N的HCVR(SEQ ID NO:154)。抗CD3重链可变区CD3-VH-G、CD3-VH-G2、CD3-VH-G3、CD3-VH-G4、CD3-VH-G5、CD3-VH-G8、CD3-VH-G9、CD3-VH-G10、CD3-VH-G11、CD3-VH-G12、CD3-VH-G13、CD3-VH-G14、CD3-VH-G15、CD3-VH-G16、CD3-VH-G17、CD3-VH-G18、CD3-VH-G19、CD3-VH-G20及CD3-VH-G21描述于表18中。
表5中的轻链与双特异性抗体的CD3及PSMA靶向臂为共同的。抗CD3轻链可变区CD3-VL-A为来自表12的H1H5778P的LCVR(SEQ IDNO:930)。抗CD3轻链可变区CD3-VL-B为来自表12的H1H2712N的LCVR(SEQ ID NO:162)。轻链可变区VK 1-39JK 5为来自表20的SEQIDNO:1642。表1阐述此实施例的双特异性抗体的抗PSMA臂的各种重链可变区及其对应CDR的氨基酸序列识别符。表2阐述编码此实施例的双特异性抗体的抗PSMA抗原结合结构域的重链可变区及其对应CDR的核苷酸序列的序列识别符。
图12、14、15、18及20描述双特异性抗体的抗CD3臂的重链可变区及其对应CDR的氨基酸序列，以及为此实施例的双特异性抗体的两个臂所共享的轻链可变区及其对应CDR的氨基酸序列。表13、16、17、19及21描述此实施例的双特异性抗体的这些特征的对应核苷酸序列。
实施例5：通过FACS分析所测定的示例双特异性抗体的结合亲和力
在此实施例中，通过FACS测定实施例4中描述的抗PSMA/抗CD3双特异性抗体结合于表达人PSMA的细胞系的能力，及结合于表达人及食蟹猴CD3的细胞系的能力。如上所述，本发明的双特异性抗体利用与一组抗CD3HC结合臂及共同轻链配对的PSMA特异性重链(HC)结合臂。以下双特异性抗体中PSMA-HC结合臂通过表面等离振子共振(实施例3)证明有效结合于人PSMA蛋白质。如本文中实施例6及13中所描述，通过表面等离振子共振，CD3结合HC臂也显示对人可溶性异二聚体hCD3ε/δ.mFc蛋白质的一系列亲和力。
简言之，将2×105个细胞/孔的表达人CD3的Jurkat细胞、食蟹猴T细胞或特异性表达人PSMA的细胞与双特异性抗体的连续稀释液在4℃下一起培育30分钟。培育后，将细胞洗涤且添加山羊F(ab')2抗人FcγPE标记的第二抗体(Jackson Immunolabs)至细胞，又历时30分钟。接着洗涤细胞，再悬浮在冷PBS+1％BSA中且在BD FACS Canto II上通过流动式细胞测定术分析。
为进行FACS分析，通过单一事件选择的正散射高度对比正散射面积，接着侧散射及正散射来闸控(gate)细胞。使用Prism软件测定细胞结合滴定的EC50。使用4参数非线性回归分析计算数值。
表6：CD3及PSMA特异性细胞系上FACS结合
Figure BDA0001618239300000701
NB＝未结合；NT＝未测试
如表6中所示，测试的抗PSMA/抗CD3双特异性抗体通过FACS证明特异性结合于表达人PSMA的B16F10.9/hPSMA及22RV1细胞系。FACS结合的检测极限为1μM EC50。
如表6中所示，各CD3×PSMA双特异性抗体的CD3结合臂显示对表达人CD3的Jurkat细胞的细胞结合亲和力范围(15至300nM EC50范围)。重要地，通过表面等离振子共振(参见下文表7)展示微弱至不结合于人CD3异二聚体蛋白质的CD3臂也与Jurkat细胞上微弱至不可观察到的结合相关(也即CD3-VH-G2、CD3-VH-G3、CD3-VH-G5)。若干CD3结合臂也显示与食蟹猴T细胞的交叉反应性。所有测试的双特异性抗体显示在相应表达PSMA的细胞系上类似的细胞结合，证实与各个CD3臂的双特异性配对不影响或减弱PSMA特异性结合(在所有测试的实施例中PSMA特异性结合小于或等于5.6nM(高亲和力))。
根据本发明，认为展现与人CD3微弱至不可检测结合以及展现与食蟹猴CD3微弱至不结合的抗体有利于亲合力驱动的双特异性配对，且在体外及体内分析法中进一步测试细胞毒性。
实施例6：通过表面等离振子共振结合分析法所测定的示例抗体的结合亲和力
在37℃下通过表面等离振子共振，使用抗原捕捉形式(表7)，测定抗PSMA×抗CD3双特异性抗体与可溶性异二聚体hCD3ε/δ.mFc蛋白质(hCD3ε＝UniProtKB/Swiss-Prot：P07766.2；SEQ_ID NO:1652；hCD3δ＝UniProtKB/Swiss-Prot：P04234.1，SEQ ID NO:1653)的结合亲和力及动力学常数。在Sierra Sensors MASS-1仪器上进行测定。
在抗原捕捉形式中，MASS-1高密度胺传感器表面用山羊抗小鼠IgG2a多克隆抗体(Southern Biotech)衍生化。捕捉可溶性异二聚体CD3蛋白质且相应抗体注射在捕捉抗原上。
动力学结合(ka)及解离(kd)速率常数通过使用MASS-1AnalyserR2曲线拟合软件加工数据且与1:1结合模型拟合来确定。结合解离平衡常数(KD)及解离半衰期(t1/2)由动力学速率常数计算为：KD(M)＝kd/ka及t1/2(min)＝(ln2/(60*kd)。
表7：抗CD3双特异性抗体与可溶性人CD3的亲和力
Figure BDA0001618239300000721
如表7中所示，在表面等离振子共振结合分析法中，抗CD3×抗PSMA双特异性抗体维持与可溶性CD3的极弱结合，例如KD值超过11nM至多达334nM，比来源于种系构架的双特异性抗CD3臂CD3-VH-G弱，或者未展现任何可检测的结合。
因而，若干双特异性抗体展现超过50nM KD值，且一些超过100nM(也即BSPSMA/CD3-900、BSPSMA/CD3-1000、BSPSMA/CD3-1900、BSPSMA/CD3-005)且甚至超过分析的检测极限，也即展示不可检测的与可溶性人CD3的结合CD3(也即BSPSMA/CD3-200、BSPSMA/CD3-300、BSPSMA/CD3-400、BSPSMA/CD3-004及BSPSMA/CD3-1800)。
实施例7：如体外所测定，本发明的双特异性抗体展现的T细胞活化及肿瘤特异性细胞毒性
在此实施例中，通过流动式细胞测定术监测在抗PSMA×抗CD3双特异性抗体存在下，表达PSMA的标靶细胞的特异性杀伤。如先前所报告，双特异性抗体显示对CD3蛋白质及表达CD3的细胞系的亲和力范围(也即微弱、中度及强烈结合)。测试此相同组的双特异性抗体诱发幼稚人T细胞改向杀伤表达靶标的细胞的能力。
简言之，将表达PSMA(C4-2、22Rv1及TRAMPC2_PSMA)的细胞系用1μM荧光示踪染料Violet Cell Tracker标记。标记后，细胞在37℃下铺板隔夜。分开地，人PBMC以1×106个细胞/mL铺板在补充的RPMI培养基中且在37℃下培育隔夜，以通过耗尽附着巨噬细胞、树突状细胞及一些单核细胞而富集淋巴细胞。第二天，将标靶细胞与附着细胞耗尽的原生PBMC(效应/标靶细胞4:1比率)及相关双特异性抗体或同种型对照的连续稀释液(浓度范围：66.7nM至0.25pM)在37℃下共同培育48小时。使用无酶细胞解离缓冲液自细胞培养板移除细胞，且通过FACS分析。
对于FACS分析，细胞用死/活远红外细胞跟踪器(Invitrogen)染色。在即将FACS分析时将计数为5×105的小珠添加至各孔。每一样品收集1×104个小珠。为评估杀伤特异性，在活Violet标记群体上闸控细胞。记录活群体的百分比且用于计算标准化存活率。
通过将细胞与直接结合于CD2及CD69的抗体一起培育，且通过报告全部T细胞(CD2+)中活化(CD69+)T细胞的百分比来评估T细胞活化。
如表8中的结果展示，在抗PSMA×抗CD3双特异性抗体下观测到表达PSMA的细胞的耗尽。大部分测试的双特异性抗体活化且定向人T细胞以耗尽标靶细胞，EC50在皮摩尔范围内。另外，观测到的标靶细胞溶解与CD2+T细胞上CD69细胞上调有关，具有pM EC50。
重要地，此实施例的结果证明若干利用显示微弱至不可观察到的与CD3蛋白质或表达CD3的细胞的结合的CD3结合臂(也即CD3-VH-G5)的双特异性抗体仍然保留活化T细胞的能力且展现表达肿瘤抗原的细胞的有效细胞毒性。
表8：所选PSMA×CD3双特异性抗体的细胞毒性及T细胞活化特性
Figure BDA0001618239300000731
Figure BDA0001618239300000741
NT＝未测试
实施例8：显示体内有效抗肿瘤功效的抗PSMA/抗CD3双特异性抗体
为确定示例性抗PSMA/抗CD3双特异性抗体的体内功效，在具有人前列腺癌异种移植物的无免疫应答小鼠中进行研究。也在具有经工程改造以表达人PSMA的小鼠前列腺癌异种移植物的免疫活性小鼠中进行其他研究。
人肿瘤异种移植模型中抗PSMA/抗CD3双特异性抗体的功效
为评估人肿瘤异种移植研究中抗PSMA/抗CD3双特异性抗体的体内功效，将NODscidγ(NSG)小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)与人外周血单核细胞(PBMC)以及内源性表达PSMA的22Rv1或C4-2人前列腺肿瘤细胞共同植入。
简言之，将4×106个22Rv1或5×106个C4-2细胞(MD Anderson,TX)与1×106个人PBMC(ReachBio,LLC.,Seattle,WA)于基质胶(matrigel matrix,BD Biosciences)中的50:50混合物皮下共同植入雄性NSG小鼠的右侧腰窝中。在22Rv1研究中，在第0天、第3天及第7天，将小鼠用1ug BSPSMA/CD3-001或同种型对照腹膜内处理(图1)。在C4-2研究中，在肿瘤植入后第0天、第4天及第7天，将小鼠用0.1mg/kg BSPSMA/CD3-001、BSPSMA/CD3-003或BSPSMA/CD3-005腹膜内处理。
在另一异基因模型中，在移植人造血CD34+干细胞的小鼠中测试抗PSMA/抗CD3双特异性抗体。简言之，新生SIRPαBALB/c-Rag2-IL2rγ-(BRG)幼犬移植hCD34+胎儿肝细胞。3-6个月后，接着hCD34移植的SIRPa BRG小鼠植入C4-2细胞(基质胶中5×106个，皮下)。8天后，小鼠用10ug BSPSMA/CD3-004或同种型对照抗体处理，接着在整个研究中每周给药2次。
在所有研究中，使用测径器，每周测定肿瘤尺寸2次且肿瘤体积计算为体积＝(长度×宽度2)2。
如表9中的结果展示，与用同种型对照处理比较，上述异基因模型中测试的双特异性抗体均有效抑制肿瘤生长。
建立的人肿瘤异种移植模型中抗PSMA/抗CD3双特异性抗体的功效
接着，评估抗PSMA/抗CD3双特异性抗体抑制建立的肿瘤生长的功效。首先NSG小鼠腹膜内注射2.5×106个人PBMC，以允许人T细胞移植。十四天后，小鼠如上共同植入C4-2细胞及PBMC。在肿瘤植入后18天，20ug BSPSMA/CD3-002或同种型对照腹膜内施用，且在整个研究时期内继续每周2次。肿瘤植入后20天及40天，腹膜内给药其他PBMC。
如表9中的结果展示，BSPSMA/CD3-002展示抑制建立的肿瘤生长、减少肿瘤生长95％的功效。
免疫活性肿瘤模型中抗PSMA/抗CD3双特异性抗体的功效
另外，在免疫活性模型中评估抗PSMA/抗CD3双特异性抗体的抗肿瘤活性。针对CD3的三条链(δγε)以及针对PSMA人源化的小鼠植入经人PSMA转染的变异鼠类前列腺癌细胞系TRAMP-C2。
在开始研究的前，产生致瘤细胞系变体TRAMP-C2_hPSMAv#1。简言之，7.5×106个TRAMP-C2_hPSMA细胞皮下植入针对CD3及PSMA人源化的雄性小鼠的右侧腰窝中。切除肿瘤且切成3mm片段，且随后植入新雄性人源化小鼠的右侧腰窝中。接着收获源自植入肿瘤片段的肿瘤，且解聚成单细胞悬浮液。接着这些细胞(TRAMP-C2_hPSMAv#1)在G418选择下离体培养。接着此变异细胞系的4.106个细胞植入雄性PSMA/CD3人源化小鼠的右侧腰窝中，用于双特异性抗体功效研究。
将植入TRAMPC2_hPSMAv#1的人源化PSMA/CD3小鼠用100ug或10ug抗PSMA/抗CD3双特异性抗体BSPSMA/CD3-001或BSPSMA/CD3-004或同种型对照处理，每周2次，自肿瘤植入当日开始。也检查注射后4小时的血清细胞因子水平，以及脾T细胞水平。在第27天终止研究。
如表10中的结果展示，处理组中的两种抗PSMA/抗CD3双特异性分子均展示显著延迟肿瘤生长的功效。在用BSPSMA/CD3-001处理后，观测到剂量依赖性细胞因子释放。在施用BSPSMA/CD3-004后观测到最少细胞因子释放，可能因为抗CD3的结合弱。BSPSMA/CD3-001展示在不耗尽脾中T细胞下的抗肿瘤功效。
免疫活性模型中建立的肿瘤上抗PSMA/抗CD3双特异性抗体的功效
最后，评估所选抗PSMA/抗CD3双特异性分子对减少人源化PSMA/CD3小鼠中建立的肿瘤生长的功效。将TRAMP-C2_hPSMAv#1细胞移植于如上所述的人源化小鼠中，且在肿瘤植入后14天，当肿瘤尺寸在50mm3-100mm3范围内时腹膜内施用100ug BSPSMA/CD3-001或同种型对照，每周2次。如表11中的展示，BSPSMA/CD3-001在此建立的肿瘤模型中为有效的，显示与对照组比较，肿瘤生长下降84％。
总之，本发明的抗PSMA/抗CD3双特异性抗体在无免疫应答及免疫活性肿瘤模型中均显示有效抗肿瘤功效。另外，若干测试的双特异性抗体(BSPSMA/CD3-001及002)显示有效减小建立的肿瘤体积的能力。
值得注意地，在缺乏表达PSMA的肿瘤细胞的情况下，未看见T细胞活化。
另外，在未具有肿瘤的小鼠中，在PSMA×CD3双特异性抗体处理后4小时收集血液样品，且测定血清细胞因子含量。测得细胞因子，也即干扰素-γ(IFN-g)、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-2(IL-2)及白介素-6(IL-6)的含量瞬时增加，且该瞬时增加为剂量依赖性的(图2A-2D)。
为验证双特异性抗体的特异性，给针对PSMA与CD3两者人源化的小鼠或者针对单独CD3人源化的小鼠服用100μg PSMA×CD3且检查血清细胞因子(服用后4小时)及血液中瞬时T细胞损失(服用后24小时)。在人源化T细胞小鼠中用PSMA×CD3双特异性抗体处理(100μg/小鼠)诱发细胞因子(例如IFNg)的急性增加，以及循环T细胞的瞬时下降(图3A-3B)。此发现再现在用肿瘤抗原×CD3双特异性抗体处理的人患者中观测到的细胞因子及T细胞改变。
PSMA×CD3双特异性抗体在不耗尽免疫活性小鼠的脾中效应T细胞下为有效的，如图4A-4C中所示。简言之，将人源化PSMA及CD3
Figure BDA0001618239300000772
小鼠植入表达hPSMA的肿瘤且每周用PSMA×CD3处理两次。最终收获时T细胞以正常数目存在。在整个研究期间每周两次用PSMA×CD3双特异性抗体处理后，在实验结束时，检查脾的CD4+T细胞、CD8+T细胞及Treg。将针对PSMA及CD3人源化的小鼠植入TRAMP-C2_hPSMA肿瘤，且自第0天，给药100μg或10μgPSMA×CD3。通过流动式细胞测定术分析脾中细胞群体。使用方差分析(ANOVA)，针对与同种型对照组比较的任何显著影响，分析数据，但未发现显著差异(图4A-4C)。
表9：无免疫应答异种移植模型中抗PSMA/抗CD3双特异性抗体的功效
Figure BDA0001618239300000771
Figure BDA0001618239300000781
表10：免疫活性同基因模型中抗PSMA/抗CD3双特异性抗体的功效
Figure BDA0001618239300000782
*在肿瘤植入当日开始，每周2次，给药小鼠抗体或同种型对照
#测定为脾中CD4+或CD8+细胞外加活mCD45+细胞的百分比
表11：免疫活性同基因模型中抗PSMA/抗CD3双特异性
抗体抑制建立的肿瘤生长的功效
Figure BDA0001618239300000783
实施例9：产生抗CD3抗体
抗CD3抗体通过将包含编码人免疫球蛋白重链及κ轻链可变区的DNA的工程改造的小鼠用表达CD3或具有编码CD3的DNA的细胞免疫接种来获得。抗体免疫反应通过CD3特异性免疫分析法监测。当实现所需免疫反应时，收获脾细胞，且与小鼠骨髓瘤细胞融合，以维持其存活力且形成杂交瘤细胞系。筛选杂交瘤细胞系且进行选择以鉴别产生CD3特异性抗体的细胞系。使用此项技术，获得若干抗CD3嵌合抗体(也即具有人可变结构域及小鼠恒定区的抗体)。另外，若干完全人抗CD3抗体直接自抗原阳性B细胞分离，不与骨髓瘤细胞融合，如US 2007/0280945A1中所描述。
根据此实施例的方法产生的示例性抗CD3抗体的某些生物特性详细描述于本文实施例中。
实施例10：重链及轻链可变区氨基酸及核酸序列
图12阐述所选择的本发明的抗CD3抗体的重链及轻链可变区及CDR的氨基酸序列识别符。对应核酸序列识别符阐述于表13中。制备本文公开的抗CD3抗体的方法也可见于美国公开2014/0088295中。
表12：氨基酸序列识别符
Figure BDA0001618239300000791
Figure BDA0001618239300000801
Figure BDA0001618239300000811
表13：核酸序列识别符
Figure BDA0001618239300000812
Figure BDA0001618239300000821
Figure BDA0001618239300000831
本文中抗体通常根据以下命名法提及：Fc前缀(例如“H1H”、“H1M”“H2M”等等)，接着数字识别符(例如“2712”、“2692”等等，如表1中所示)，接着“P”、“N”或“B”字尾。因此，根据此命名法，抗体在本文中可称为例如“H1H2712N”、“H1M2692N”、“H2M2689N”等等。本文中所用的抗体名称上的H1H、H1M及H2M前缀指示抗体的特定Fc区同种型。举例而言，“H1H”抗体具有人IgG1Fc，“H1M”抗体具有小鼠IgG1Fc，且“H2M”抗体具有小鼠IgG2Fc(所有可变区均为全人，如通过抗体名称中第一个“H”所示)。如本领域技术人员所了解，具有特定Fc同种型的抗体转变成具有不同Fc同种型的抗体(例如具有小鼠IgG1Fc的抗体可转变成具有人IgG4的抗体等等)，但无论如何，由表1中所示的数字识别符指示的可变结构域(包括CDR)将保持不变，且预计无论Fc结构域的性质如何，结合特性相同或基本上类似。
表14及15陈述适用于本发明的抗PSMA×抗CD3双特异性抗体的其他抗CD3HCVR及LCVR的重链可变区(表14)及轻链可变区(图15)及其对应CDR的氨基酸序列识别符。
表14(重链可变区氨基酸序列)
Figure BDA0001618239300000832
表15(轻链可变区氨基酸序列)
Figure BDA0001618239300000833
CD3-VH-F及CD3-VL-F的重链及轻链可变区来源于如WO2004/106380中阐述的名为“L2K”的抗CD3抗体。
另外，表16及17陈述编码适用于本发明的抗PSMA×抗CD3双特异性抗体的其他抗CD3HCVR及LCVR的重链可变区(表16)及轻链可变区(图17)及其对应CDR的核苷酸序列的序列识别符。
表16(编码重链可变区序列的核苷酸序列)
Figure BDA0001618239300000841
表17(编码轻链可变区序列的核苷酸序列)
Figure BDA0001618239300000842
用于以下实施例中的对照构建体
在以下实验中包括各种对照构建体(抗CD3抗体)以用于比较目的：“OKT-3”，可获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)在目录号CRL-8001下获得的针对人T细胞表面抗原的小鼠单株抗体及“SP34”，例如自Biolegend,SanDiego,CA(目录号302914)或BD Pharmagen,目录号55052获得的市售小鼠单株抗体，对人T淋巴细胞上的T3复合物的ε链具有反应性。
实施例11：产生其他抗CD3抗体
以下程序目的在于鉴别特异性识别CD3(T细胞共受体)作为抗原的抗体。
抗CD3抗体汇集物来源于经基因修饰的小鼠。简言之，将小鼠用CD3抗原免疫接种且产生包含多种人VH重排的B细胞，以表达高亲和力抗原特异性抗体的各种组成。图18-21中描述的抗体具有VK1-39JK5(SEQ IDNO:1642中阐述的LCVR)的相同轻链序列。
在体外结合分析法中测试所产生的抗体对人及食蟹猴猴CD3抗原的亲和力，且例如在其中鉴别一种CD3抗体，称为CD3-VH-P(SEQ ID NO:1634中阐述的HCVR)，发现其结合于人与食蟹猴CD3，具有EC50在1与40nM之间的亲和力，如分别在Jurkat细胞及食蟹猴T细胞的FACS滴定中确定。参见例如实施例5中概述的FACS结合实验。
随后鉴别CD3-VH-P的种系氨基酸残基且称为“CD3-VH-G”的抗体经工程改造以仅仅含有种系构架。其他抗体衍生物通过熟知的分子克隆技术进行工程改造，以基于种系序列与CD3-VH-P序列之间的差异，以逐步方式替换氨基酸残基。给药各抗体衍生物“CD3-VH-G”数字名称。参见表18。
虽然如FACS分析法中所见，CD3-VH-G及一些其他工程改造的抗体保留其结合亲和力，但若干抗CD3抗体在体外以微弱至不可测定的结合亲和力结合于人或食蟹猴CD3，诸如40nM EC50。随后研究包含根据此实施例的方法产生的示例性抗CD3抗体的双特异性抗体的结合亲和力、结合动力学及阐明毒性及药物动力学(pK)型态的其他生物特性，详细描述于本文中的实施例中。
实施例12：重链及轻链可变区(CDR的氨基酸及核酸序列)
图18阐述所选择的本发明的抗CD3抗体的重链可变区及CDR的氨基酸序列识别符。对应核酸序列识别符阐述于表19中。
测定各抗体重链序列的氨基酸及核酸序列。来源于种系序列(SEQ ID NO:1662)的各抗体重链分配“G”数字名称，以一致命名。图2阐述本发明的经工程改造的抗CD3抗体的重链可变区及CDR的氨基酸序列识别符。对应核酸序列识别符阐述于表19中。轻链可变区及CDR的氨基酸及核酸序列识别符也分别鉴别于以下图20及图21中。
表18：重链氨基酸序列识别符
Figure BDA0001618239300000861
表19：重链核酸序列识别符
Figure BDA0001618239300000862
表20：轻链氨基酸序列识别符
Figure BDA0001618239300000871
表21：轻链核酸序列识别符
Figure BDA0001618239300000872
称为“CD3-L2K”的对照1抗体是基于已知的抗CD3抗体(也即如WO2004/106380中阐述的抗CD3抗体“L2K”)构建。
本文实施例中提及的同种型对照抗体为与不相关抗原，也即FelD1抗原相互作用的同种型匹配(修饰IgG4)抗体。
实施例13：人单株抗CD3抗体的表面等离振子共振获得的结合亲和力及动力学常数
人单株抗CD3抗体的结合亲和力及动力学常数在25℃下通过表面等离振子共振，使用抗体捕捉形式(表22、24及26)或者抗原捕捉形式(表23、25及27)测定。测定在T200Biacore仪器上进行。
在抗体捕捉形式中，Biacore传感器表面用兔抗小鼠Fc衍生化以进行杂交瘤捕捉(抗体前缀H1M或H2M)或用小鼠抗人Fc表面衍生化用于人IgG形式化抗体(抗体前缀H1H)。将具有人Fc标签(hFcΔAdp/hFc；SEQ ID NO:1683/1684)或小鼠Fc标签(mFcΔAdp/mFc；SEQID NO:1685/1686)的可溶性异二聚体CD3蛋白质(hCD3-ε/hCD3-δ；SEQ ID NO:1652/1653)注射在抗体捕捉表面上且记录结合反应。异二聚体CD3蛋白质使用Davis等人(US2010/0331527)中描述的方法纯化。
在抗原捕捉形式中，异二聚体CD3蛋白质使用兔抗小鼠Fc或小鼠抗人Fc捕捉且将相应抗体注射在捕捉抗原上。
抗体以其常规的二价形式(表22-25)或以其中移除来自抗体的第二Fab且仅仅表达Fc部分(CH2-CH3)的单价一臂构象(表26-27)。
动力学结合(ka)及解离(kd)速率常数通过使用Scrubber 2.0曲线拟合软件加工数据且将数据与1:1结合模型拟合来确定。结合解离平衡常数(KD)及解离半衰期(t1/2)由动力学速率常数计算为：KD(M)＝kd/ka及t1/2(min)＝(ln2/(60*kd)。NT＝未测试；NB＝未观测到结合。
表22：杂交瘤mAb(H1M及H2M)的Biacore结合亲和力
Figure BDA0001618239300000881
表23：杂交瘤mAb(H1M及H2M)的Biacore结合亲和力
Figure BDA0001618239300000882
Figure BDA0001618239300000891
表24：人Fc mAb(H1H)的Biacore结合亲和力
Figure BDA0001618239300000892
Figure BDA0001618239300000901
表25：人Fc mAb(H1H)的Biacore结合亲和力
Figure BDA0001618239300000902
表26：单价一臂mAb的Biacore结合亲和力
Figure BDA0001618239300000911
表27：单价一臂mAb的Biacore结合亲和力
Figure BDA0001618239300000912
如表22-27中所示，若干本发明的抗CD3抗体以高亲和力以抗体捕捉或者抗原捕捉形式结合CD3。
实施例14：抗CD3抗体结合及增殖人T细胞
测试本发明的抗CD3抗体结合于人T细胞及诱发其增殖的能力。使用Jurkat细胞(CD3+人T细胞系)评估结合，而使用ATP催化的定量(CellTiter
Figure BDA0001618239300000921
)评估外周血单核细胞(PBMC)的增殖。抗CD3抗体OKT3充当阳性对照且不相关的同种型匹配抗体用作阴性对照。
使用以下方案获得FACS数据：细胞以每孔2×105个与连续稀释的抗体在冰上一起培育30分钟。培育后，将细胞洗涤且添加二级抗体且再培育30分钟。培育后，将细胞洗涤，再悬浮在含有1％BSA的冷PBS中，且通过流动式细胞测定术，使用通过侧散射及正向散射闸控的活Jurkat细胞分析。使用Prism软件，利用使用4参数非线性回归分析计算的值，测定细胞结合滴定的EC50。
使用以下方案获得增殖数据：将人PBMC(5×104个/孔)与抗CD3的3倍连续稀释液及固定浓度的商业抗CD28抗体(200ng/ml)在96孔板中在37℃下一起培育72小时。在培育后，添加CellTiter
Figure BDA0001618239300000923
且使用VICTORX5多标记板式读数器(PerkinElmer)测定发光。在GraphPad Prism中使用4参数非线性回归分析计算细胞存活力的EC50(ATP催化的定量)。
结合及增殖实验的结果概述于表28-30中。
表28：杂交瘤抗CD3mAb结合及增殖人T细胞
Figure BDA0001618239300000922
Figure BDA0001618239300000931
NB：未结合；NT：未测试
表29：人Fc抗CD3mAb结合及增殖人T细胞
Figure BDA0001618239300000932
Figure BDA0001618239300000941
NB：未结合；NT：未测试
表30：单价一臂抗CD3mAb结合及增殖人T细胞
抗体 EC<sub>50</sub>[M]FACS JURKAT EC<sub>50</sub>[M]hPBMC增殖
H1H7194P 1.50E-09 2.37E-12
H1H7195P 3.42E-10 2.42E-12
H1H7196P 3.44E-08 1.27E-12
H1H7198P 7.26E-10 2.55E-12
H1H7203P 3.24E-09 1.64E-12
H1H7204P 2.29E-09 1.51E-12
H1H7208P 5.19E-08 1.46E-12
H1H7211P 7.01E-10 2.75E-12
H1H7221P 1.40E-09 2.60E-12
H1H7223P 9.37E-10 1.07E-12
H1H7226P 7.95E-10 9.52E-13
H1H7232P 1.50E-09 1.03E-12
H1H7233P 7.15E-10 7.34E-13
H1H7241P 1.01E-09 1.05E-12
H1H7242P 1.83E-09 2.13E-12
H1H7250P 1.37E-09 2.43E-12
H1H7251P 1.45E-09 1.30E-12
H1H7254P 1.09E-09 2.80E-12
H1H7258P 1.07E-09 2.17E-12
H1H7269P 1.95E-09 1.15E-12
H1H7279P NB 0.00E+00
同种型对照 NB 0.00E+00
NB：未结合；NT：未测试
如表7-9中所示，大多数本发明的抗CD3抗体结合人T细胞且诱发T细胞增殖。
实施例15：抗CD3抗体结合及增殖猴T细胞
测试本发明的抗CD3抗体的子集结合及诱发猴T细胞增殖的能力。
使用以下方案获得FACS数据：每孔2×105个细胞与连续稀释的抗体在冰上一起培育30分钟。培育后，将细胞洗涤且添加二级抗体且再培育30分钟。培育后，将细胞洗涤，再悬浮在含有1％BSA的冷PBS中，且通过流动式细胞测定术分析。CD4+猴T细胞通过侧散射及正向散射且在CD2+CD4+CD20群体上闸控。在GraphPad Prism中，使用4参数非线性回归分析计算细胞结合滴定的EC50。
使用以下方案获得增殖数据：新分离的食蟹猴来源的PBMC(5×104个/孔)与抗CD3抗体的3倍连续稀释液及固定浓度的商业抗CD28抗体(500ng/ml)在96孔板中在37℃下一起培育72小时。在培育后，添加CellTiter
Figure BDA0001618239300000951
且使用VICTOR X5多标记板式读数器(PerkinElmer)测定发光。在GraphPad Prism中使用4参数非线性回归分析计算细胞存活力的EC50(ATP催化的定量)。
结合及增殖实验的结果概述于表31及32中。
表31：抗CD3mAb结合及增殖猴PBMC
抗体 EC50[M]FACS PBMC EC50[M]mfPBMC增殖
H1H2690N 5.66E-09 2.71E-12
H1H2712N 2.29E-09 2.72E-12
H2M3547N 1.12E-10 NT
H2M3563N 1.65E-10 NT
H1H5761P NT 2.81E-09
H1H5763P NT 0.00E+00
H1H5764P NT 4.06E-10
H1H5769P NT 8.33E-13
H1H5771P NT 2.74E-12
H1H5772S NT 1.47E-12
H1H5778P NT 5.93E-13
H1H5780P NT 3.13E-13
H1H5781P NT 7.92E-13
H1H5788P NT 2.01E-12
OKT3 NB NT
SP34 7.03E-11 1.71E-12
NB：未结合；NT：未测试
表32：单价一臂抗CD3mAb结合及增殖猴PBMC
抗体 EC50[M]FACS PBMC EC50[M]mfPBMC增殖
H1H7194P NT 4.84E-12
H1H7195P NT 1.36E-12
H1H7196P NT 1.40E-08
H1H7198P NT 2.29E-12
H1H7203P NT 4.97E-13
H1H7204P NT 1.26E-11
H1H7208P NT 7.02E-12
H1H7211P NT 2.81E-13
H1H7221P NT 1.72E-12
H1H7223P NT 6.75E-11
H1H7226P NT 2.26E-11
H1H7232P NT 4.90E-11
H1H7233P NT 4.35E-12
H1H7241P NT 2.05E-11
H1H7242P NT 1.38E-11
H1H7250P NT 7.27E-11
H1H7251P NT 1.83E-11
H1H7254P NT 8.88E-11
H1H7258P NT 1.11E-11
NB：未结合；NT：未测试
如表31及32中所示，若干本发明的抗CD3抗体结合CD2+CD4+猴T细胞且诱发其增殖。OKT3不驱动猴PBMC增殖，而SP34对猴PBMC具有活性。
实施例16：抗CD3mAb支援肿瘤细胞的T细胞介导的杀伤
使用基于钙荧光素的U937杀伤分析研究抗CD3抗体通过Fc/FcR相互作用将T细胞介导的杀伤改向的能力。简言之，人PBMC经Ficoll-Paque分离，且用含有人IL-2(30U/ml)及T细胞活化小珠(抗CD3/CD28)的培养基活化若干天的过程。U937细胞经钙荧光素标记，接着与活化T细胞以10:1效应:标靶比率使用抗体的3倍连续稀释液在37℃下一起培育3小时的过程。培育后，将平板离心且上清液转移至半透明黑色透明底板用于荧光分析。在GraphPadPrism中，使用4参数非线性回归分析计算EC50值，EC50值定义为诱发50％细胞毒性的CD3抗体的摩尔浓度。使用杂交瘤抗体、人Fc抗体及单价一臂抗体的结果分别展示于表33、34及35中。
表33：杂交瘤抗CD3mAb改向T细胞对U937细胞的杀伤
抗体 U937细胞毒性人T细胞[M]
H2M2689N 0.00E+00
H2M2690N 2.79E-11
H2M2691N 2.34E-11
H1M2692N 3.59E-10
H2M2704N 2.49E-12
H2M2705N 1.73E-12
H2M2706N 7.91E-12
H2M2707N 7.21E-12
H2M2708N 3.27E-12
H2M2709N 3.47E-12
H2M2710N 3.97E-12
H2M2711N 3.66E-12
H1M2712N 3.14E-10
H2M2774N 2.46E-12
H2M2775N 3.38E-12
H2M2776N 4.06E-12
H2M2777N 4.86E-12
H2M2778N 0.00E+00
H2M2779N 6.75E-10
H2M2789N NT
H2M2862N 7.66E-12
H2M2885N 3.71E-12
H2M2886N 8.06E-12
H2M3540N 1.25E-11
H2M3541N 5.39E-11
H1M3542N 2.92E-11
H2M3543N 1.31E-11
H1M3544N 1.72E-10
H2M3547N 3.17E-11
H2M3548N 5.50E-12
H1M3549N 1.07E-10
H2M3563N 4.05E-11
H1M3613N 8.66E-10
同种型对照 0.00E+00
NT：未测试
表34：人Fc形式化抗CD3mAb改向T细胞对U937细胞的杀伤
Figure BDA0001618239300000971
Figure BDA0001618239300000981
NT：未测试
表35：单价一臂抗CD3mAb改向T细胞对U937细胞的杀伤
Figure BDA0001618239300000982
Figure BDA0001618239300000991
NT：未测试
如表33-35中所示，在此分析系统中大部分抗CD3抗体以及OKT3支持改向T细胞介导的杀伤。相信观测到的杀伤基于抗体的Fc与U937细胞上Fc受体的结合(engagement)，引起相邻T细胞上CD3簇集而定，其通过添加非特异性人IgG而压制(资料未示)。
本发明的范围不受本文中描述的特定实施例限制。实际上，从上述描述，除本文中所描述之外的本发明的各种改变对于本领域技术人员而言将是显而易见的。预期这种改变在随附权利要求的范围内。
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Claims (12)

1.一种双特异性抗原结合分子，其包含特异性结合人CD3的第一抗原结合结构域及特异性结合人PSMA的第二抗原结合结构域，
其中该特异性结合人CD3的第一抗原结合结构域包含分别由SEQ ID NO:1516、1518和1520的氨基酸序列组成的、或分别由SEQ ID NO:1620、1622和1624的氨基酸序列组成的重链互补决定区A1-HCDR1、A1-HCDR2及A1-HCDR3，以及分别由SEQ ID NO:1388、1390和1392的氨基酸序列组成的轻链互补决定区LCDR1、LCDR2及LCDR3，并且
其中该特异性结合人PSMA的第二抗原结合结构域包含分别由SEQ ID NO:68、70和72的氨基酸序列组成的重链互补决定区A2-HCDR1、A2-HCDR2及A2-HCDR3，以及分别由SEQ IDNO:1388、1390和1392的氨基酸序列组成的轻链互补决定区LCDR1、LCDR2及LCDR3。
2.如权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，其中该特异性结合人CD3的第一抗原结合结构域包含由SEQ ID NO:1514或SEQ ID NO:1618的氨基酸序列组成的重链可变区HCVR，和由SEQ ID NO:1386的氨基酸序列组成的轻链可变区LCVR，并且其中该特异性结合人PSMA的第二抗原结合结构域包含由SEQ ID NO:66的氨基酸序列组成的HCVR，和由SEQ ID NO:1386的氨基酸序列组成的LCVR。
3.如权利要求2所述的双特异性抗原结合分子，其中该特异性结合人CD3的第一抗原结合结构域包含由SEQ ID NO:1514的氨基酸序列组成的HCVR。
4.如权利要求2所述的双特异性抗原结合分子，其中该特异性结合人CD3的第一抗原结合结构域包含由SEQ ID NO:1618的氨基酸序列组成的HCVR。
5.如权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，其中
(i)该第二抗原结合结构域结合表达人PSMA的人细胞及表达食蟹猴PSMA的食蟹猴细胞；
(ii)该抗原结合分子抑制具有人前列腺癌异种移植物的无免疫应答小鼠中的肿瘤生长；
(iii)该抗原结合分子抑制具有人前列腺癌异种移植物的免疫活性小鼠中的肿瘤生长；
(iv)该抗原结合分子抑制具有人前列腺癌异种移植物的无免疫应答小鼠中建立的肿瘤的肿瘤生长；或
(v)该抗原结合分子减少具有人前列腺癌异种移植物的免疫活性小鼠中建立的肿瘤的肿瘤生长。
6.如权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，其中
(i)如在体外T细胞介导的肿瘤细胞杀伤分析法中测定，该抗原结合分子以小于1.3nM的EC50值诱导T细胞介导的肿瘤细胞杀伤；和/或
(ii)如在体外表面等离振子共振结合分析法中测定，该第二抗原结合结构域以小于80nM的KD值特异性结合人PSMA；和/或
(iii)如在体外表面等离振子共振结合分析法中测定，该第二抗原结合结构域以小于5nM、小于2nM、小于1nM、小于800pM或小于600pM的KD值特异性结合人PSMA中的每一个。
7.如权利要求1-6中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其为双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
8.一种药物组合物，其包含如权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗原结合分子及可药用载体或稀释剂。
9.如权利要求8所述的药物组合物在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗个体中表达PSMA的癌症。
10.如权利要求9的用途，其中该癌症选自：前列腺癌、肾癌、膀胱癌、结肠直肠癌及胃癌。
11.如权利要求9的用途，其中该癌症为前列腺癌。
12.如权利要求11的用途，其中该前列腺癌为去势抗性前列腺癌。
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