JP2022523946A - Ｅｎｐｐ３およびｃｄ３に結合するヘテロ二量体抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）に結合する、新規の抗原結合ドメインおよびヘテロ二量体抗体を含む抗体を対象とする。【選択図】図１５Ａ
Description
優先権主張
本出願は、２０１９年３月１日に出願された米国仮出願第６２／８１２，９２２号および２０１９年１１月１日に出願された同第６２／９２９，６８７号の優先権を主張するものであり、これらの仮出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年３月１日に出願された米国仮出願第６２／８１２，９２２号および２０１９年１１月１日に出願された同第６２／９２９，６８７号の優先権を主張するものであり、これらの仮出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
抗体に基づいた治療法は、癌を含む様々な疾患の治療に成功裏に使用されてきた。探求されているますます普及している道は、２つの異なる抗原に同時連結する単一の免疫グロブリン分子のエンジニアリングである。２つの異なる抗原に連結するそのような代替抗体フォーマットは、しばしば二重特異性抗体と称される。抗体可変領域（Ｆｖ）のかなりの多様性により、事実上あらゆる分子を認識するＦｖを生成できるため、二重特異性抗体生成への典型的なアプローチは、抗体に新しい可変領域を導入することである。
二重特異性抗体の特に有用なアプローチは、ＣＤ３に連結する第１の結合ドメインと、癌細胞に関連するか、または癌細胞でアップレギュレートされる抗原に連結する第２の結合ドメインを操作して、それにより、二重特異性抗体がＣＤ３＋Ｔ細胞をリダイレクトして癌細胞を破壊することである。エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）は、腎細胞癌で高度に発現され、正常組織では最小限に発現されることが以前に報告されている。これを考慮して、抗ＥＮＰＰ３抗体は、例えば、抗腫瘍治療薬（例えば、化学療法剤およびＴ細胞）をそのようなＥＮＰＰ３発現腫瘍に局在化させるために有用であると考えられている。ＣＤ３＋エフェクターＴ細胞をＥＮＰＰ３発現腫瘍に局在化させることができるＣＤ３およびＥＮＰＰ３に対する新規の二重特異性抗体が本明細書で提供される。
したがって、ＥＮＰＰ３抗原結合ドメインおよび抗ＥＮＰＰ３抗体が本明細書で提供される（例えば、二重特異性抗体）。
一態様では、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のいずれかの可変重鎖相補性決定領域１～３（ｖｈＣＤＲ１～３）および可変軽鎖相補性決定領域（ｖｌＣＤＲ１～３）を含むエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）結合ドメインを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３は、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに提供されるＥＮＰＰ３結合ドメインのｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３配列から選択される。
別の態様では、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のいずれかの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含むエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）結合ドメインを含む組成物が本明細書で提供される。
別の態様では、本発明は、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）から選択されるエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）結合ドメインを含む組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、ａ）ＥＮＰＰ３結合ドメインの可変重鎖相補性決定領域１～３（ｖｈＣＤＲ１～３）を含む可変重鎖ドメインをコードする第１の核酸と、ｂ）ＥＮＰＰ３結合ドメインの可変軽鎖相補性決定領域１～３（ｖｌＣＤＲ１～３）を含む可変軽鎖ドメインをコードする第２の核酸と、を含む核酸組成物を提供し、ＥＮＰＰ３結合ドメインが、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちの１つである。いくつかの実施形態では、ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３は、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに提供されるｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３配列から選択される。
別の態様では、本発明は、ａ）ＥＮＰＰ３結合ドメインの可変重鎖ドメインを含む可変重鎖ドメインをコードする第１の核酸と、ｂ）ＥＮＰＰ３結合ドメインの可変軽鎖ドメインを含む可変軽鎖ドメインをコードする第２の核酸と、を含む核酸組成物を提供し、ＥＮＰＰ３結合ドメインが、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちのいずれか１つである。
いくつかの実施形態では、本発明は、ａ）第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、ｂ）第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、を含む発現ベクター組成物を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、発現ベクター組成物を含む宿主細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＥＮＰＰ３結合ドメインが発現される条件下で宿主細胞を培養することと、ＥＮＰＰ３結合ドメインを回収することと、を含む、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）結合ドメインを作製する方法を提供する。
一態様では、本発明は、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）結合ドメインを含む抗ＥＮＰＰ３抗体を提供し、ＥＮＰＰ３結合ドメインが、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のいずれかの可変重鎖相補性決定領域１～３（ｖｈＣＤＲ１～３）および可変軽鎖相補性決定領域（ｖｌＣＤＲ１～３）を含む。いくつかの実施形態では、ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３は、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉの以下のＥＮＰＰ３結合ドメインのいずれかのｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３から選択される。
別の態様では、本発明は、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）結合ドメインを含む抗ＥＮＰＰ３抗体を提供し、ＥＮＰＰ３結合ドメインが、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のいずれかの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む。
別の態様では、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちのいずれか１つから選択されるエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）結合ドメインを含む抗ＥＮＰＰ３抗体が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、抗体は、ａ）第１の抗原結合ドメインおよび第１の定常ドメインを含む第１の単量体と、ｂ）第２の抗原結合ドメインおよび第２の定常ドメインを含む第２の単量体と、を含み、第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインのいずれかが、ＥＮＰＰ３結合ドメインである。さらなる実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合する。さらなる実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、ＥＮＰＰ３結合ドメインであり、第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ３結合ドメインである。さらなる実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、以下のＣＤ３結合ドメイン：Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）のいずれかのｖｈＣＤＲ１～３、およびｖｌＣＤＲ１～３を含む。さらなる実施形態では、ＣＤ３結合ドメインのｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３は、図１０Ａ～１０ＦのｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３から選択される。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、以下のＣＤ３結合ドメイン：Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）のいずれかの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、抗ＣＤ３ｓｃＦｖである。
いくつかの実施形態では、第１および第２の定常ドメインはそれぞれ、ＣＨ２－ＣＨ３を含む。
いくつかの実施形態では、第１および第２の定常ドメインはそれぞれ、ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。
いくつかの実施形態では、第１および第２の定常ドメインはそれぞれ、バリアント定常ドメインである。
いくつかの実施形態では、第１および第２の単量体は、ヘテロ二量体化バリアントのセットを含み、これらは、図１Ａ～１Ｅに示されるバリアントのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化バリアントのセットは、以下のバリアントのセット：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ；Ｄ４０１Ｋ：Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ；およびＴ３６６Ｗ：Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖのうちの１つを含む。
いくつかの実施形態では、第１および第２の単量体はそれぞれ、除去バリアントをさらに含む。さらなる実施形態では、除去バリアントは、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋである。
いくつかの実施形態では、第１または第２の単量体のうちの少なくとも１つは、ｐＩバリアントをさらに含む。さらなる実施形態では、ｐＩバリアントは、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄである。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、荷電ｓｃＦｖリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、抗ＥＮＰＰ３をコードする核酸を含む核酸組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、第１および第２の単量体をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、核酸を含む発現ベクターを提供する。さらなる実施形態では、本発明は、発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、請求項Ｂ１～Ｂ２１のいずれか一項に記載の抗ＥＮＰＰ３抗体を作製する方法を提供する。この方法は、抗ＥＮＰＰ３抗体が発現される条件下で請求項Ｂ２５に記載の宿主細胞を培養することと、抗ＥＮＰＰ３抗体を回収することと、を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、それを必要とする患者に抗体を投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、ａ）ｉ）第１の可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよび第１の可変重鎖ドメインを含む抗ＣＤ３ｓｃＦｖと、ｉｉ）第１のＦｃドメインと、を含む第１の単量体であって、ｓｃＦｖが、ドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合している、第１の単量体と、ｂ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体を含む第２の単量体であって、ＶＨが、第２の可変重鎖ドメインであり、ＣＨ２－ＣＨ３が、第２のＦｃドメインである、第２の単量体と、ｃ）第２の可変軽鎖ドメインを含む軽鎖であって、第２の可変重鎖ドメインおよび第２の可変軽鎖ドメインが、ＥＮＰＰ３結合ドメインを形成する、軽鎖と、を含むヘテロ二量体抗体を提供する。
いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３結合ドメインは、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のいずれかのｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３を含む。
いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３結合ドメインのｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３は、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに提供されるＥＮＰＰ３結合ドメインのｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３配列から選択される。
いくつかの実施形態では、第２の重可変ドメインは、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のいずれかの重可変ドメインを含み、第２の軽可変ドメインは、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のいずれかの可変軽ドメインを含む。
さらなる実施形態では、抗ＣＤ３結合ｓｃＦｖは、以下のＣＤ３結合ドメイン：Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）のいずれかのｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３ｓｃＦｖのｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３は、図１０Ａ～１０ＦのｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３から選択される。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３ｓｃＦｖは、以下のＣＤ３結合ドメイン：Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）のいずれかの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、第１の可変軽鎖ドメインは、ドメインリンカーを使用して、第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合している。
いくつかの実施形態では、第１の可変重鎖ドメインは、ドメインリンカーを使用して、第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合している。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、荷電ｓｃＦｖリンカーである。
いくつかの実施形態では、第１および第２のＦｃドメインは、バリアントＦｃドメインである。
いくつかの実施形態では、第１および第２の単量体は、図１Ａ～１Ｅのヘテロ二量体かバリアントのいずれかから選択されるヘテロ二量体化バリアントのセットを含む。いくつかの実施形態では、選択されるヘテロ二量体化バリアントのセットは、以下の：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ；Ｄ４０１Ｋ：Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ；およびＴ３６６Ｗ：Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖに由来し、ここで、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。
いくつかの実施形態では、第１および第２の単量体は、除去バリアントをさらに含む。いくつかの実施形態では、除去バリアントは、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋであり、ここで、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。
いくつかの実施形態では、第１または第２の単量体のうちの１つは、ｐＩバリアントを含む。
いくつかの実施形態では、ｐＩバリアントは、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄであり、ここで、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。
いくつかの実施形態では、第１の単量体は、アミノ酸バリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、第２の単量体は、アミノ酸バリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ／Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、ここで、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、アミノ酸配列（ＧＫＰＧＳ）４を有する荷電ｓｃＦｖリンカーである。
いくつかの実施形態では、第１および第２の単量体はそれぞれ、アミノ酸バリアント４２８／４３４Ｓをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、以下のヘテロ二量体抗体：ＸＥＮＰ２４８０４、ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２８２８７、ＸＥＮＰ２８９２５、ＸＥＮＰ２９５１６、ＸＥＮＰ３０２６２、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２９４３６、ＸＥＮＰ２８３９０、ＸＥＮＰ２９４６３、およびＸＥＮＰ３０２６３を含む。
別の態様では、本発明は、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｓｃＦｖ－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第１の単量体であって、ｓｃＦｖが、抗ＣＤ３ｓｃＦＶであり、ＣＨ２－ＣＨ３が、第１のＦｃドメインである、第１の単量体と、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第２の単量体であって、ＣＨ２－ＣＨ３が、第２のＦｃドメインである、第２の単量体と、ｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖と、を含むヘテロ二量体抗体を提供し、第１のバリアントＦｃドメインが、アミノ酸バリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、第２のバリアントＦｃドメインが、アミノ酸バリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、第１および第２のバリアントＦｃドメインがそれぞれ、アミノ酸バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、第２の単量体のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３が、アミノ酸バリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含み、ＶＨおよびＶＬがそれぞれ、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）から選択されるＥＮＰＰ３結合ドメインの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含むＥＮＰＰ３結合ドメインを形成し、抗ＣＤ３ｓｃＦｖが、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）から選択されるＣＤ３結合ドメインの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含み、ここで、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、アミノ酸配列（ＧＫＰＧＳ）４を有する荷電ｓｃＦｖリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、第１および第２のバリアントＦｃドメインはそれぞれ、アミノ酸バリアント４２８／４３４Ｓをさらに含み、ここで、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。
いくつかの実施形態では、本発明は、第１および第２の単量体ならびに抗体の軽鎖をコードする核酸を含む核酸組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸を含む発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、それを必要とする患者に、本明細書に提供される抗体のうちのいずれか１つを投与することを含む、ＥＮＰＰ３関連癌を治療する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ１－ＣＨ１－リンカー１－ｓｃＦｖ－リンカー２－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第１の単量体であって、ＶＨ１が、第１の可変重鎖ドメインであり、ｓｃＦｖが、抗ＣＤ３ｓｃＦＶであり、リンカー１およびリンカー２が、それぞれ、第１のドメインリンカーおよび第２のドメインリンカーであり、ＣＨ２－ＣＨ３が、第１のＦｃドメインである、第１の単量体と、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第２の単量体であって、ＶＨ２が、第２の可変重鎖ドメインであり、ＣＨ２－ＣＨ３が、第２のＦｃドメインである、第２の単量体と、ｃ）可変軽鎖ドメインを含む共通軽鎖と、を含むヘテロ二量体抗体を提供し、第１の可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインとが、第１のＥＮＰＰ３結合ドメインを形成し、第２の可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインが、第２のＥＮＰＰ３結合ドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、第１および第２のＥＮＰＰ３結合ドメインはそれぞれ、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のいずれかのｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３を含む。
いくつかの実施形態では、第１および第２のＥＮＰＰ３結合ドメインのｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３は、図１４および４５に提供されるｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３から選択される。
いくつかの実施形態では、第１および第２の可変重鎖ドメインはそれぞれ、ＥＮＰＰ３結合ドメインの可変重鎖ドメインを含み、第１および第２の可変軽鎖ドメインはそれぞれ、ＥＮＰＰ３結合ドメインの可変軽鎖ドメインを含み、ＥＮＰＰ３結合ドメインが、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のいずれかである。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、以下のＣＤ３結合ドメイン：Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）のいずれかのｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖのｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３は、図１０Ａ～１０ＦのｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３から選択される。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、以下のＣＤ３結合ドメイン：Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）のいずれかの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ可変重鎖ドメイン、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、およびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインとｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインとを接続するｓｃＦｖリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ可変重鎖ドメインは、第１のドメインリンカーを使用して第１の単量体のＣＨ１のＣ末端に結合され、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインは、第２のＦｃドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合している。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインは、第１のドメインリンカーを使用して第１の単量体のＣＨ１のＣ末端に結合され、ｓｃＦｖ可変重鎖ドメインは、第２のＦｃドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合している。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、荷電ｓｃＦｖリンカーである。
いくつかの実施形態では、第１および第２のＦｃドメインは、バリアントＦｃドメインである。
いくつかの実施形態では、第１および第２の単量体は、図１Ａ～１Ｅに示されるものから選択されるヘテロ二量体化バリアントのセットを含む。
いくつかの実施形態では、選択されるヘテロ二量体化バリアントのセットは、以下の：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ；Ｄ４０１Ｋ：Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ；およびＴ３６６Ｗ：Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖに由来し、ここで、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。
いくつかの実施形態では、第１および第２の単量体は、除去バリアントをさらに含む。
さらなる実施形態では、除去バリアントは、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋであり、ここで、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。
いくつかの実施形態では、第１または第２の単量体のうちの１つは、ｐＩバリアントをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｐＩバリアントは、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄであり、ここで、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。
いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメインは、アミノ酸バリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、第２のバリアントＦｃドメインは、アミノ酸バリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ／Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、ここで、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、アミノ酸配列（ＧＫＰＧＳ）４を有する荷電ｓｃＦｖリンカーである。
いくつかの実施形態では、第１および第２のバリアントＦｃドメインはそれぞれ、アミノ酸バリアント４２８／４３４Ｓをさらに含み、ここで、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、以下のヘテロ二量体抗体：ＸＥＮＰ２９４３７、ＸＥＮＰ２９５２０、ＸＥＮＰ３０２６４、ＸＥＮＰ２６８２２、ＸＥＮＰ２８４３８、ＸＥＮＰ２９４３８、ＸＥＮＰ２９４６７、ＸＥＮＰ３０４６９、ＸＥＮＰ３０４７０、ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、ＸＥＮＰ３１１４８、ＸＥＮＰ３１１４９、ＸＥＮＰ３１１５０、ＸＥＮＰ３１４１９、およびＸＥＮＰ３１４７１を含む。
別の態様では、ヘテロ二量体抗体は、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ１－ＣＨ１－リンカー１－ｓｃＦｖ－リンカー２－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第１の単量体であって、ｓｃＦｖが、抗ＣＤ３ｓｃＦＶであり、ＣＨ２－ＣＨ３が、第１のＦｃドメインである、第１の単量体と、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第２の単量体であって、ＣＨ２－ＣＨ３が、第２のＦｃドメインである、第２の単量体と、ｃ）ＶＬ－ＣＬを含む共通軽鎖と、を含み、第１のバリアントＦｃドメインが、アミノ酸バリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、第２のバリアントＦｃドメインが、アミノ酸バリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、第１および第２のバリアントＦｃドメインがそれぞれ、アミノ酸バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、第２の単量体のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３が、アミノ酸バリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含み、該ＶＨおよびＶＬが、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）から選択されるＥＮＰＰ３結合ドメインの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含み、抗ＣＤ３ｓｃＦｖが、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）から選択されるＣＤ３結合ドメインの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含み、ここで、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、アミノ酸配列（ＧＫＰＧＳ）４を有する荷電ｓｃＦｖリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、第１および第２のバリアントＦｃドメインはそれぞれ、アミノ酸バリアント４２８／４３４Ｓをさらに含む。
いくつかの実施形態では、抗体の第１および第２の単量体ならびに共通軽鎖である。いくつかの実施形態では、本発明は、核酸を含む発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、それを必要とする患者に抗体を投与することを含む、ＥＮＰＰ３関連癌を治療することを提供する。
別の態様では、本発明は、以下のヘテロ二量体抗体：ＸＥＮＰ２４８０４、ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２８２８７、ＸＥＮＰ２８９２５、ＸＥＮＰ２９５１６、ＸＥＮＰ３０２６２、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２９４３６、ＸＥＮＰ２８３９０、ＸＥＮＰ２９４６３、およびＸＥＮＰ３０２６３を含むヘテロ二量体抗体を提供する。
別の態様では、本発明は、以下のヘテロ二量体抗体：ＸＥＮＰ２９４３７、ＸＥＮＰ２９５２０、ＸＥＮＰ３０２６４、ＸＥＮＰ２６８２２、ＸＥＮＰ２８４３８、ＸＥＮＰ２９４３８、ＸＥＮＰ２９４６７、ＸＥＮＰ３０４６９、ＸＥＮＰ３０４７０、ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、ＸＥＮＰ３１１４８、ＸＥＮＰ３１１４９、ＸＥＮＰ３１１５０、ＸＥＮＰ３１４１９、およびＸＥＮＰ３１４７１を含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ヘテロ二量体抗体をコードする核酸を含む核酸組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、核酸を含む発現ベクターを提供する。さらなる実施形態では、本発明は、発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、それを必要とする患者に、本明細書に提供されるヘテロ二量体抗体のうちのいずれか１つを投与することを含む、ＥＮＰＰ３関連癌を治療する方法を提供する。
Ｉ．概要
ＣＤ３と腫瘍抗原標的とを同時連結させる抗二重特異性抗体は、標的腫瘍細胞を攻撃および溶解するようにＴ細胞をリダイレクトするために使用される。例としては、ＣＤ３と腫瘍抗原とを一価的に連結するＢｉｔｅ（登録商標）およびＤＡＲＴフォーマットが挙げられる。ＣＤ３標的化アプローチはかなりの見込みを示しているが、そのような治療法の一般的な副作用は、関連するサイトカインの産生であり、しばしば毒性サイトカイン放出症候群を引き起こす。二重特異性抗体の抗ＣＤ３結合ドメインはすべてのＴ細胞に連結するため、高サイトカイン産生ＣＤ４ Ｔ細胞サブセットが動員される。さらに、ＣＤ４ Ｔ細胞サブセットには制御性Ｔ細胞が含まれており、その動員および増殖は、免疫抑制をもたらし、長期的な腫瘍抑制に悪影響を与える可能性がある。さらに、これらのフォーマットはＦｃドメインを含有せず、患者の血清半減期が非常に短いことを示している。
ＣＤ３と腫瘍抗原標的とを同時連結させる抗二重特異性抗体は、標的腫瘍細胞を攻撃および溶解するようにＴ細胞をリダイレクトするために使用される。例としては、ＣＤ３と腫瘍抗原とを一価的に連結するＢｉｔｅ（登録商標）およびＤＡＲＴフォーマットが挙げられる。ＣＤ３標的化アプローチはかなりの見込みを示しているが、そのような治療法の一般的な副作用は、関連するサイトカインの産生であり、しばしば毒性サイトカイン放出症候群を引き起こす。二重特異性抗体の抗ＣＤ３結合ドメインはすべてのＴ細胞に連結するため、高サイトカイン産生ＣＤ４ Ｔ細胞サブセットが動員される。さらに、ＣＤ４ Ｔ細胞サブセットには制御性Ｔ細胞が含まれており、その動員および増殖は、免疫抑制をもたらし、長期的な腫瘍抑制に悪影響を与える可能性がある。さらに、これらのフォーマットはＦｃドメインを含有せず、患者の血清半減期が非常に短いことを示している。
新規の抗ＣＤ３×抗ＥＮＰＰ３（抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３、αＣＤ３×αＥＮＰＰ３、またはαＥＮＰＰ３×αＣＤ３とも呼ばれる）ヘテロ二量体二重特異性抗体および癌の治療のためのそのような抗体の使用方法が本明細書で提供される。特に、図１５Ａおよび１５Ｂに示されるものなどの様々なフォーマットの抗ＣＤ３、抗ＥＮＰＰ３二重特異性抗体が本明細書で提供される。これらの二重特異性抗体は、癌、特に腎細胞癌などのＥＮＰＰ３発現が増加している癌の治療に有用である。そのような抗体は、ＣＤ３＋エフェクターＴ細胞をＥＮＰＰ３＋腫瘍に向けるために使用され、それによってＣＤ３＋エフェクターＴ細胞がＥＮＰＰ３＋腫瘍を攻撃および溶解することを可能にする。
さらに、いくつかの実施形態では、本開示は、抗ＣＤ３療法の潜在的な副作用を変更または低減することができる、ヒトＣＤ３に対して異なる結合親和性を有する二重特異性抗体を提供する。すなわち、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ＣＤ３に対する「強い」または「高い親和性」の結合剤であり（例えば、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７（任意に、必要に応じて荷電リンカーを含める）として示される重鎖および軽可変ドメインである））、ＥＮＰＰ３にも結合する抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含む抗体構築物を提供する。他の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ＣＤ３に対する「ライト」または「低親和性」結合剤である抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含む抗体構築物を提供する。追加の実施形態は、ＥＮＰＰ３にも結合するＣＤ３に対して中間または「中」の親和性を有する抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含む抗体構築物を提供する。非常に多数の抗ＣＤ３抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を使用できる一方で、特に有用な実施形態では、６つの異なる抗ＣＤ３ ＡＢＤを使用するが、本明細書で説明するように２つのｓｃＦｖ方向で使用することができる。親和性は一般に、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを用いて測定される。
本明細書で提供される「高、中、低」抗ＣＤ３配列は、図１５Ａおよび１５Ｂに示されるように、様々なヘテロ二量体化フォーマットで使用できることを理解されたい。一般に、Ｔ細胞動員の潜在的な副作用のために、例示的な実施形態は、図１５Ａおよび１５Ｂに示されるように、ＣＤ３に一価でのみ結合するフォーマットを利用し、本明細書に示されるフォーマットでは、本明細書により完全に説明されるように、ｓｃＦｖであるのはＣＤ３ ＡＢＤである。対照的に、対象の二重特異性抗体は、一価（例えば図１５Ａ）または二価（例えば図１５Ｂ）のいずれかでＥＮＰＰ３に結合することができる。
そのようなＥＮＰＰ結合ドメインを有する抗体（例えば、ＥＮＰＰ３×ＣＤ３二重特異性抗体）を含む、ＥＮＰＰ３結合ドメインを含む組成物が本明細書で提供される。そのようなＥＮＰＰ３結合ドメインを含む対象抗体は、使用される特定のＥＮＰＰ３結合ドメインに応じて、様々な異なる免疫応答を有利に誘発する。例えば、対象の抗体は、異なるＥＮＰＰ３発現を有する細胞に対する選択性、ＥＮＰＰ３発現細胞に対する効力、サイトカイン放出を誘発する能力、および可溶性ＥＮＰＰ３に対する感受性の違いを示す。そのようなＥＮＰＰ３結合ドメインおよび関連する抗体は、例えば、ＥＮＰＰ３関連癌の治療に使用される。
したがって、一態様では、２つの異なる抗原に結合するヘテロ二量体抗体が本明細書で提供され、例えば、抗体は、本明細書に記載の２つの異なる標的抗原、一般にＥＮＰＰ３およびＣＤ３に結合するという点で「二重特異性」である。これらのヘテロ二量体抗体は、これらの標的抗原に一価（例えば、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインのペアなどの単一の抗原結合ドメインがある）または二価（それぞれが独立して抗原に結合する２つの抗原結合ドメインがある）のいずれかに結合することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるヘテロ二量体抗体は、１つのＣＤ３結合ドメインおよび１つのＥＮＰＰ３結合ドメイン（例えば、本明細書に記載の「１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマットのヘテロ二量体抗体）を含む。他の実施形態では、本明細書で提供されるヘテロ二量体抗体は、１つのＣＤ３結合ドメインおよび２つのＥＮＰＰ３結合ドメイン（例えば、本明細書に記載の「２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマットのヘテロ二量体抗体）を含む。本明細書で提供されるヘテロ二量体抗体は、以下でより完全に概説されるように、ホモ二量体上でヘテロ二量体の形成を「ゆがめる」アミノ酸置換を含む異なる単量体の使用に基づいており、以下に同様に概説されるように、ホモ二量体から離れたヘテロ二量体の単純な精製を可能にする「ｐＩバリアント」と連結される。提供されるヘテロ二量体二重特異性抗体は、一般に、産生細胞で自己集合してヘテロ二量体タンパク質を産生することができる操作されたまたはバリアントのＦｃドメインの使用、およびそのようなヘテロ二量体タンパク質を生成および精製する方法に依存する。
ＩＩ．命名法
本明細書に提供される抗体は、いくつかの異なるフォーマットで列挙されている。場合によっては、特定の抗体の各単量体には、固有の「ＸＥＮＰ」番号が与えられるが、当該技術分野において離解されるように、より長い配列はより短いものを含み得る。例えば、１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体の「ｓｃＦｖ－Ｆｃ」単量体は第１のＸＥＮＰ番号を有し得るが、ｓｃＦｖドメイン自体は異なるＸＥＮＰ番号を有する。いくつかの分子には３つのポリペプチドがあるため、ＸＥＮＰ番号が構成要素とともに名称として使用される。したがって、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットの分子ＸＥＮＰ２９５２０は、３つの配列（図１９Ａを参照されたい）「Ｆａｂ－Ｆｃ重鎖」単量体；２）「Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ重鎖」単量体；および３）「軽鎖」単量体または同等物を含むが、当業者であれば、配列アラインメントを通してこれらを容易に同定することができるであろう。これらのＸＥＮＰ番号は、配列表ならびに識別子にあり、図で使用される。さらに、３つの構成要素を含む１つの分子は、複数の配列識別子を生成する。例えば、Ｆａｂのリストは、完全な重鎖配列、可変重鎖ドメイン配列、および可変重鎖ドメイン配列の３つのＣＤＲ、完全な軽鎖配列、可変の軽鎖ドメイン配列、および可変軽鎖ドメイン配列の３つのＣＤＲを含む。Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ単量体は、全長配列、可変重鎖ドメイン配列、３つの重鎖ＣＤＲ配列、およびｓｃＦｖ配列（ｓｃＦｖ可変重鎖ドメイン配列、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン配列およびｓｃＦｖリンカーを含む）を含む。本明細書ではいくつかのｓｃＦｖドメインを有する分子の中は、単一の荷電ｓｃＦｖリンカー（＋Ｈ）を使用するが、他のものを使用できることに留意されたい。さらに、特定の抗原結合ドメイン（例えば、ＥＮＰＰ３およびＣＤ３結合ドメイン）の命名法は、「Ｈｘ．ｘｘ＿Ｌｙ．ｙｙ」タイプのフォーマットを使用し、数字は特定の可変鎖配列に対する固有の識別子である。したがって、ＣＤ３結合ドメインＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１のＦａｂ側の可変ドメイン（例えば、図１２）は「Ｈ１Ｌ１」であり、これは、可変重鎖ドメインＨ１が軽鎖ドメインＬ１と組み合わされたことを示している。これらの配列がｓｃＦｖとして使用される場合、名称「Ｈ１Ｌ１」は、可変重鎖ドメインＨ１が軽鎖ドメインＬ１と組み合わされ、ＮからＣ末端に向かってＶＨ－リンカー－ＶＬ方向にあることを示す。重可変ドメインおよび軽可変ドメインの同一の配列を有するが逆の順序（ＶＬ－リンカー－ＶＨ方向、Ｎ末端からＣ末端に向かって）であるこの分子は、「Ｌ１＿Ｈ１．１」と命名されるであろう。同様に、異なる構築物は、配列表および図から明らかになるように、重鎖および軽鎖を「混合および適合させる」ことができる。
本明細書に提供される抗体は、いくつかの異なるフォーマットで列挙されている。場合によっては、特定の抗体の各単量体には、固有の「ＸＥＮＰ」番号が与えられるが、当該技術分野において離解されるように、より長い配列はより短いものを含み得る。例えば、１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体の「ｓｃＦｖ－Ｆｃ」単量体は第１のＸＥＮＰ番号を有し得るが、ｓｃＦｖドメイン自体は異なるＸＥＮＰ番号を有する。いくつかの分子には３つのポリペプチドがあるため、ＸＥＮＰ番号が構成要素とともに名称として使用される。したがって、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットの分子ＸＥＮＰ２９５２０は、３つの配列（図１９Ａを参照されたい）「Ｆａｂ－Ｆｃ重鎖」単量体；２）「Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ重鎖」単量体；および３）「軽鎖」単量体または同等物を含むが、当業者であれば、配列アラインメントを通してこれらを容易に同定することができるであろう。これらのＸＥＮＰ番号は、配列表ならびに識別子にあり、図で使用される。さらに、３つの構成要素を含む１つの分子は、複数の配列識別子を生成する。例えば、Ｆａｂのリストは、完全な重鎖配列、可変重鎖ドメイン配列、および可変重鎖ドメイン配列の３つのＣＤＲ、完全な軽鎖配列、可変の軽鎖ドメイン配列、および可変軽鎖ドメイン配列の３つのＣＤＲを含む。Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ単量体は、全長配列、可変重鎖ドメイン配列、３つの重鎖ＣＤＲ配列、およびｓｃＦｖ配列（ｓｃＦｖ可変重鎖ドメイン配列、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン配列およびｓｃＦｖリンカーを含む）を含む。本明細書ではいくつかのｓｃＦｖドメインを有する分子の中は、単一の荷電ｓｃＦｖリンカー（＋Ｈ）を使用するが、他のものを使用できることに留意されたい。さらに、特定の抗原結合ドメイン（例えば、ＥＮＰＰ３およびＣＤ３結合ドメイン）の命名法は、「Ｈｘ．ｘｘ＿Ｌｙ．ｙｙ」タイプのフォーマットを使用し、数字は特定の可変鎖配列に対する固有の識別子である。したがって、ＣＤ３結合ドメインＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１のＦａｂ側の可変ドメイン（例えば、図１２）は「Ｈ１Ｌ１」であり、これは、可変重鎖ドメインＨ１が軽鎖ドメインＬ１と組み合わされたことを示している。これらの配列がｓｃＦｖとして使用される場合、名称「Ｈ１Ｌ１」は、可変重鎖ドメインＨ１が軽鎖ドメインＬ１と組み合わされ、ＮからＣ末端に向かってＶＨ－リンカー－ＶＬ方向にあることを示す。重可変ドメインおよび軽可変ドメインの同一の配列を有するが逆の順序（ＶＬ－リンカー－ＶＨ方向、Ｎ末端からＣ末端に向かって）であるこの分子は、「Ｌ１＿Ｈ１．１」と命名されるであろう。同様に、異なる構築物は、配列表および図から明らかになるように、重鎖および軽鎖を「混合および適合させる」ことができる。
ＩＩＩ．定義
本出願をより完全に理解できるようにするため、いくつかの定義を以下に示す。そのような定義は、文法的同等物を包含することを意図する。
本出願をより完全に理解できるようにするため、いくつかの定義を以下に示す。そのような定義は、文法的同等物を包含することを意図する。
本明細書における「ＥＮＰＰ３」または「エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３」（例えば、Ｇｅｎｅｂａｎｋ寄託番号ＮＰ００５０１２．２）は、細胞外ヌクレオチドの加水分解に連結する一連の外部酵素に属するタンパク質を意味する。ＥＮＰＰ３配列は、例えば、図１１Ａおよび１１Ｂに示されている。ＥＮＰＰ３は、腎細胞癌を含む特定の癌で発現される。
本明細書において「除去」は、活性の低下または排除を意味する。したがって、例えば、「ＦｃγＲ結合を切除する」とは、特定のバリアントを含有しないＦｃ領域と比較して、Ｆｃ領域アミノ酸バリアントが、開始結合の５０％未満を有することを意味し、活性を７０～８０～９０～９５～９８％超えて喪失していることが好ましく、一般に、活性は、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＳＰＲ、またはＢＬＩアッセイにおいて、検出可能な結合レベルを下回る。ＦｃγＲ結合の切除において特に使用されるものは、図５に示すものであり、これらは一般に両方の単量体に付加される。
本明細書で使用される「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」は、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を意味する。ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合と相関し、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加はＡＤＣＣ活性の増加をもたらす。
本明細書で使用される「ＡＤＣＰ」または「抗体依存性細胞媒介性細胞食作用」とは、ＦｃγＲを発現する非特異的食細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介反応を意味する。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語が一般的に使用される。本発明に記載の抗体は、本明細書に記載の従来の抗体ならびに抗体誘導体、断片および模倣物を含む、本明細書に記載されているようにいくつかのフォーマットをとることができる。
従来の免疫グロブリン（Ｉｇ）抗体は、「Ｙ」字型の四量体である。各四量体は、典型的には、２本の同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は、１本の「軽鎖」単量体（典型的には、約２５ｋＤａの分子量を有する）と、１本の「重鎖」単量体（典型的には、約５０～７０ｋＤａの分子量を有する）とを有する。
他の有用な抗体フォーマットには、図４９に示されるように、本明細書に記載の１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットおよび２＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体フォーマット、ならびに「ｍＡｂ－Ｆｖ」、「ｍＡｂ－ｓｃＦｖ」、「セントラル－Ｆｖ」、「ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「ｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「デュアルｓｃＦｖ」、および「トライデント」フォーマットの抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
抗体重鎖は、典型的には、ｖｈＣＤＲ１～３を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメインと、ＣＨ２－ＣＨ３単量体を含むＦｃドメインとを含む。いくつかの実施形態では、抗体重鎖は、ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む。従来の抗体重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって組織化された単量体：ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３である。ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３は、抗体、５つの異なるカテゴリーまたは「アイソタイプ」：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＭがあるものの、重鎖「定常ドメイン」または「定常領域」として総称される。したがって、本明細書で使用されるとき、「アイソタイプ」は、それらの定常領域の化学的および抗原的特徴によって定義される免疫グロブリンの任意のサブクラスを意味する。治療用抗体は、アイソタイプおよび／またはサブクラスのハイブリッドも含み得ることを理解されたい。例えば、参照により組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０１６３６９９号に示されるように、本明細書に記載の抗体は、ヒトＩｇＧ１／Ｇ２ハイブリッドの使用を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むがこれらに限定されないいくつかのサブクラスを有するＩｇＧアイソタイプ定常ドメインを含む。免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスには、重鎖においていくつかの免疫グロブリンドメインがある。本明細書における「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」は、明確に異なる三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。定常重鎖ＣＨ）ドメインおよびヒンジドメインを含む重鎖ドメインが本明細書に記載の抗体における関心対象である。ＩｇＧ抗体の関連において、ＩｇＧアイソタイプは、各々、３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧの関連における「ＣＨ」ドメインは以下の通りである。「ＣＨ１」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従って１１８～２２０位を指す。「ＣＨ２」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従って２３７～３４０位を指し、「ＣＨ３」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従って３４１～４４７位を指す。本明細書において示され、以下に記載されるように、ｐＩバリアントは、ＣＨ領域、および以下に論じられるように、ヒンジ領域のうちの１つ以上に存在し得る。
ＩｇＧ１は、３５６（ＤまたはＥ）および３５８（ＬまたはＭ）で多型を有する異なるアロタイプを有することに留意すべきである。本明細書に図示される配列は３５６Ｄ／３５８Ｍアロタイプを使用するが、他のアロタイプが本明細書に含まれる。すなわち、本明細書に含まれるＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む任意の配列は、３５６Ｄ／３５８Ｍアロタイプの代わりに３５６Ｅ／３５８Ｌを有することができる。治療用抗体は、アイソタイプおよび／またはサブクラスのハイブリッドも含み得ることを理解されたい。例えば、参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２００９／０１６３６９９号に示されるように、本抗体は、いくつかの実施形態ではＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッドを含む。
本明細書で使用される「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは、抗体の定常領域を含む、いくつかの場合では、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ１）のすべてまたはその一部を除外し、いくつかの場合では、任意にヒンジの全部または一部を含む、ポリペプチドを意味する。ＩｇＧの場合、Ｆｃドメインは免疫グロブリンドメインＣＨ２およびＣＨ３（Ｃγ２およびＣγ３）、ならびに任意選択的に、ＣＨ１（Ｃγ１）とＣＨ２（Ｃγ２）との間のヒンジ領域のすべてまたは一部を含む。したがって、いくつかの場合では、Ｆｃドメインは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＣＨ２－ＣＨ３およびヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４からのものであり、ＩｇＧ１ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３およびＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３は、多くの実施形態において特定の用途が見出される。加えて、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインの場合では、頻繁にヒンジはＣ２２０Ｓアミノ酸置換を含む。さらに、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインの場合では、頻繁にヒンジはＳ２２８Ｐアミノ酸置換を含む。Ｆｃ領域の境界は異なり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシ末端に残基Ｅ２１６、Ｃ２２６、またはＡ２３１を含むものと定義され、ここでの番号付けはＫａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態では、以下でより詳細に説明されるように、例えば、１つ以上のＦｃγＲまたはＦｃＲｎへの連結を変化させるために、Ｆｃ領域に対してアミノ酸修飾が行われる。
本明細書における「重鎖定常領域」とは、可変重鎖ドメインを除く、抗体（またはそのフラグメント）のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３部分を意味し、ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号付けでは、これはアミノ酸１１８～４４７である。本明細書における「重鎖定常領域フラグメント」とは、Ｎ末端およびＣ末端のいずれかまたは両方からのアミノ酸がより少ない重鎖定常領域を意味するが、別の重鎖定常領域と二量体を形成する能力を依然として保持する重鎖定常領域を意味する。
重鎖のＩｇドメインの別の種類は、ヒンジ領域である。本明細書において「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」とは、抗体の第１のおよび第２の定常ドメイン間のアミノ酸を含む可動性ポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインはＥＵ位置２１５で終わり、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは残基ＥＵ位置２３１で始まる。したがって、ＩｇＧについては、抗体ヒンジは、本明細書では、位置２１６（ＩｇＧ１中のＥ２１６）～２３０（ＩｇＧ１中のＰ２３０）を含むように定義され、番号付けはＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスによる。場合によっては、「ヒンジフラグメント」が使われ、それは、ヒンジドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは両方でより少ないアミノ酸を含有する。本明細書に記載の通り、ｐＩバリアントはヒンジ領域にも同様に作製することができる。本明細書の抗体の多くは、セリンで置き換えられたＥＵ番号付け（ヒンジ領域）による位置２２０に少なくとも１つのシステインを有する。一般に、この修飾は、本明細書に示される配列のほとんどについて「ｓｃＦｖ単量体」側にあるが、ジスルフィド形成を低減するために「Ｆａｂ単量体」側、またはその両方にあることもできる。本明細書中の配列内に具体的に含まれるのは、これらのシステインの一方または両方が置き換えられたもの（Ｃ２２０Ｓ）である。
当業者には理解されるように、重定常領域ドメインの正確な番号付けおよび配置は、異なる番号付けシステムで異なり得る。ＥＵおよびＫａｂａｔによる重定常領域の番号付けの有用な比較は以下の通りであり、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８－８５、およびＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ（参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい。
抗体軽鎖は、一般に、２つのドメイン：軽鎖ＣＤＲ ｖｌＣＤＲ１～３を含む可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）と、定常軽鎖領域（しばしば、ＣＬまたはＣκとして称される）と、を含む。抗体軽鎖は通常、Ｎ末端からＣ末端に向かって組織化されている：ＶＬ－ＣＬ。
本明細書において「抗原連結ドメイン」または「ＡＢＤ」とは、ポリペプチド配列の一部として存在する場合、本明細書で考察されるような標的抗原（例えば、ＥＮＰＰ３またはＣＤ３）に特異的に連結する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを意味する。当技術分野で知られるように、これらのＣＤＲは、一般に、可変重鎖ＣＤＲの第１のセット（ｖｈＣＤＲまたはＶＨＣＤＲ）および可変軽鎖ＣＤＲの第２のセット（ｖｌＣＤＲまたはＶＬＣＤＲ）として存在し、それぞれが３つのＣＤＲ：ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３可変重鎖ＣＤＲ、およびｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３ ｖｈＣＤＲ３可変軽鎖ＣＤＲを含む。ＣＤＲは、可変重鎖ドメイン（ｖｈＣＤＲ１～３）と可変軽鎖ドメイン（ｖｌＣＤＲ１～３）に存在する。Ｆｖ領域からの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメイン。
本明細書に記載の抗体は、多数の異なるＣＤＲセットを提供する。この場合、「完全ＣＤＲセット」は、３つの可変軽鎖ＣＤＲおよび３つの可変重鎖ＣＤＲ、例えばｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２およびｖｈＣＤＲ３を含む。これらは、それぞれ、より大きな可変軽鎖または可変重鎖ドメインの一部であってもよい。さらに、本明細書により完全に概説されているように、可変重および可変軽鎖ドメインは、重鎖および軽鎖が使用されるとき（例えば、Ｆａｂが使用されるとき）には別個のポリペプチド鎖上に、またはｓｃＦｖ配列の場合には単一ポリペプチド鎖上にあり得る。
当業者には理解されるように、ＣＤＲの正確な番号付けおよび配置は、異なる番号付けシステムで異なり得る。しかしながら、可変重鎖および／または可変軽鎖配列の開示は、関連する（固有の）ＣＤＲの開示を含むことが理解されるべきである。したがって、各可変重領域の開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２およびｖｈＣＤＲ３）の開示であり、各可変軽領域の開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２およびｖｌＣＤＲ３）の開示である。ＣＤＲ番号付けの有用な比較は以下の通りであり、Ｌａｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５－７７（２００３）を参照されたい。
本明細書全体を通して、Ｋａｂａｔ番号付けシステムは概して、可変ドメイン内の残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１～１０７および重鎖可変領域の残基１～１１３）を参照するときに使用され、ＥＵ番号付けシステムは、Ｆｃ領域に対するものである（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，上述（１９９１）を参照）。
ＣＤＲは、抗原結合の形成、またはより具体的には、抗原結合ドメインおよび抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」とは、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域内の特異的抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の群分けであり、通常、特異的構造特性、ならびに特異的電荷特性を有する。単一抗原が、２つ以上のエピトープを有してもよい。
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性構成要素とも称される）および結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的抗原結合ペプチドによって効果的に遮断されるアミノ酸残基、換言すると、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にあるアミノ酸残基を含み得る。
エピトープは、立体配座または直線状のいずれかであってもよい。立体配座エピトープは、直線状のポリペプチド鎖の異なるセグメントからのアミノ酸の空間的な並置によって生成される。直線状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸残基によって生成されるものである。立体配座エピトープおよび非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないという点で区別され得る。
エピトープは、典型的には、固有の空間立体構造内に、少なくとも３個、より通常には、少なくとも５個、または８～１０個のアミノ酸を含む。同一のエピトープを認識する抗体は、ある抗体の別の抗体の標的抗原への結合を遮断する能力、例えば、「ビニング」を示す単純な免疫アッセイにおいて検証され得る。以下に概説するように、本開示は、列挙された抗原結合ドメインおよび本明細書の抗体を含むだけでなく、列挙された抗原結合ドメインによって結合されるエピトープとの結合について競合するものも含む。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインの６つのＣＤＲには、可変重鎖および可変軽鎖ドメインが寄与する。「Ｆａｂ」フォーマットにおいて、６つのＣＤＲのセットには、２つの異なるポリペプチド配列、すなわち可変重鎖ドメイン（ｖｈまたはＶＨ、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２およびｖｈＣＤＲ３を含む）および可変軽鎖ドメイン（ｖｌまたはＶＬ、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２およびｖｌＣＤＲ３を含む）が寄与され、このうちｖｈドメインのＣ末端が重鎖のＣＨ１ドメインのＮ末端と結合し、ｖｌドメインのＣ末端が定常軽鎖ドメインのＮ末端と結合している（したがって、軽鎖を形成する）。ｓｃＦｖフォーマットでは、ｖｈおよびｖｌドメインは、一般に本明細書に概説されているように、リンカー（「ｓｃＦｖリンカー」）の使用によって、単一のポリペプチド配列に共有結合され、それは（Ｎ末端から開始して）ｖｈ－リンカー－ｖｌまたはｖｌ－リンカー－ｖｈのいずれかであってよく、前者が一般的に好ましい（使用されるフォーマット（例えば、図１からのもの）に応じて、両側の任意選択的なドメインリンカーを含む）。一般に、ｓｃＦｖドメインのＣ末端は、第２の単量体のヒンジのＮ末端に結合される。
本明細書で使用される「可変領域」または「可変ドメイン」とは、カッパ、ラムダ、および重鎖免疫グロブリン遺伝子座をそれぞれ構成するＶκ、Ｖλ、および／またはＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１つ以上のＩｇドメインを含み、抗原特異性を付与するＣＤＲを含有する、免疫グロブリンの領域を意味する。したがって、「可変重鎖ドメイン」は「可変軽鎖ドメイン」と対になって抗原結合ドメイン（「ＡＢＤ」）を形成する。さらに、各可変ドメインは、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）（可変重鎖ドメインではＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３、可変軽鎖ドメインではＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３）と４つのフレームワーク（ＦＲ）領域とを含み、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、次の順序で配置される：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。超可変領域は、一般に、軽鎖可変領域において約アミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１、「Ｌ」は軽鎖を表す）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、および８９～９７（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域においておよそ約３１～３５Ｂ（ＨＣＤＲ１、「Ｈ」は重鎖を表す）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、および９５～１０２（ＨＣＤＲ３）からのアミノ酸残基；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）および／または超可変ループを形成するそれらの残基（例えば、軽鎖可変領域中の残基２６－３２（ＬＣＤＲ１）、５０－５２（ＬＣＤＲ２）および９１－９６（ＬＣＤＲ３）ならびに重鎖可変領域中の２６－３２（ＨＣＤＲ１）、５３－５５（ＨＣＤＲ２）および９６－１０１（ＨＣＤＲ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７を包含する。本発明の特定のＣＤＲを表２に記載する。
本明細書で使用される「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」とは、概して２つの異なるポリペプチド鎖の（例えば、一方の鎖のＶＨ－ＣＨ１、他方の鎖のＶＬ－ＣＬ）、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、この領域単独、または本明細書に記載の二重特異性抗体との関係においてこの領域を指し得る。Ｆａｂの関連で、Ｆａｂは、ＣＨ１およびＣＬドメインに加えてＦｖ領域を含む。
本明細書で使用される「Ｆｖ」または「Ｆｖフラグメント」または「Ｆｖ領域」は、ＡＢＤのＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆｖ領域は、Ｆａｂ（上述の通り、概して上記に概説されている定常領域も含む２つの異なるポリペプチド）とｓｃＦｖの両方としてフォーマットすることができ、ＶＬおよびＶＨドメインを（一般に、本明細書で考察されるリンカーで）組み合わせてｓｃＦｖを形成する。
本明細書における「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は概して、本明細書で論じられるｓｃＦｖリンカーを使用してｓｃＦｖまたはｓｃＦｖドメインを形成する、可変軽鎖ドメインに共有結合した可変重鎖ドメインを意味する。ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端（ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨ）まで、いずれの向きであってもよい。配列表および図に示す配列では、ＶＨおよびＶＬドメインの順序が名前に示される。例えば、Ｈ．Ｘ＿Ｌ．Ｙは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＨ－リンカー－ＶＬ、およびＬ．Ｙ＿Ｈ．ＸがＶＬ－リンカー－ＶＨであることを意味する。
本明細書に提供される対象の抗体の実施形態は、少なくとも１つのｓｃＦｖドメインを含み、ｓｃＦｖドメインは、天然に存在しないが、一般に、ｓｃＦｖリンカーによってともに連結された可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む。本明細書に概説されるように、ｓｃＦｖドメインは、一般に、ＶＨ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬとしてＮ末端からＣ末端まで配向されているが、これは、ｓｃＦｖドメイン（または、Ｆａｂ由来のＶＨおよびＶＬ配列を使用して構築されたドメイン）のいずれに関しても、フォーマットに応じて一方または両方の端部に任意のリンカーを用いて、ＶＬ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨへと逆転させることができる。
本明細書における「修飾」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、および／もしくは欠失、またはタンパク質と化学的に連結された部分に対する改変を意味する。例えば、修飾は、タンパク質に結合した改変された炭水化物またはＰＥＧ構造であってもよい。本明細書における「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列中のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を意味する。明確にするために、別段の記載がない限り、アミノ酸修飾は常に、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡ中にコドンを有する２０個のアミノ酸に対するものである。
本明細書における「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することを意味する。特に、いくつかの実施形態では、置換は、特定の位置で天然に存在しない（生物内で天然に存在しないか、またはいずれの生物中にも存在しないかのいずれか）アミノ酸に対するものである。例えば、置換Ｅ２７２Ｙは、２７２位のグルタミン酸がチロシンで置換されているバリアントポリペプチド、この場合はＦｃバリアント体を指す。明確にするために、核酸コード配列を変化させるが、開始アミノ酸を変化させない（例えば、宿主生物発現レベルを増加させるためにＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（アルギニンをなおコードする）に交換する）ように操作されたタンパク質は、「アミノ酸置換」ではない。すなわち、同じタンパク質をコードする新たな遺伝子の創出にもかかわらず、タンパク質は、それが開始される特定の位置に同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。
本明細書で使用される「アミノ酸挿入」または「挿入」は、親ポリペプチド配列の特定の位置にアミノ酸配列を付加することを意味する。例えば、－２３３Ｅまたは２３３Ｅは、２３３位の後、および２３４位の前のグルタミン酸の挿入を示す。さらに、－２３３ＡＤＥまたはＡ２３３ＡＤＥは、２３３位の後、および２３４位の前のＡｌａＡｓｐＧｌｕの挿入を示す。
本明細書で使用される「アミノ酸欠失」または「欠失」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置でアミノ酸配列を除去することを意味する。例えば、Ｅ２３３－またはＥ２３３＃、Ｅ２３３（）またはＥ２３３ｄｅｌは、２３３位のグルタミン酸の欠失を示す。さらに、ＥＤＡ２３３－またはＥＤＡ２３３＃は、２３３位で始まる配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を示す。
本明細書で使用される「バリアントタンパク質」または「タンパク質バリアント」または「バリアント」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親タンパク質のそれとは異なるタンパク質を意味する。タンパク質バリアントは、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を有するが、バリアントタンパク質は、以下に記載されるようなアライメントプログラムを使用して親タンパク質と整列しないほど多くはない。一般に、本明細書で概説するバリアントタンパク質（バリアントＦｃドメインなど）は、ＢＬＡＳＴなど、以下に説明するアラインメントプログラムを使用して親タンパク質に対して、一般に少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である。本明細書で使用される「バリアント」はまた、特定の機能を付与する特定のアミノ酸修飾（例えば、「ヘテロ二量体化バリアント」、「ｐＩバリアント」、「除去バリアント」など）を指す。
以下に記載するように、いくつかの実施形態では、親ポリペプチド、例えばＦｃ親ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４由来の重鎖定常ドメインまたはＦｃ領域などのヒト野生型配列であるが、バリアントを有するヒト配列もまた、「親ポリペプチド」として機能することができ、例えば、米国公開第２００６／０１３４１０５号のＩｇＧ１／２ハイブリッドを含めることができる。本明細書のタンパク質バリアントの配列は、好ましくは、親タンパク質配列と少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９５－９８－９９％の同一性を有する。したがって、本明細書で使用される「抗体バリアント」または「バリアント抗体」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親抗体とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される「ＩｇＧバリアント」または「バリアントＩｇＧ」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親ＩｇＧ（ここでも、多くの場合はヒトＩｇＧに由来）とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される「免疫グロブリンバリアント」または「バリアント免疫グロブリン」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親免疫グロブリン配列のそれとは異なる免疫グロブリン配列を意味する。本明細書で使用される「Ｆｃバリアント」または「バリアントＦｃ」は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４のＦｃドメインと比較してアミノ酸修飾を含むタンパク質を意味する。
本明細書で使用される「Ｆｃバリアント」または「バリアントＦｃ」とは、Ｆｃドメインにアミノ酸修飾を含むタンパク質を意味する。修飾は、付加、欠失、または置換であり得る。Ｆｃバリアントは、それらを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。したがって、例えば、Ｎ４３４Ｓまたは４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して４３４位に置換セリンを有するＦｃバリアントであり、番号付けはＥＵインデックスによるものである。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して置換Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを有するＦｃバリアントを定義する。ＷＴアミノ酸の同一性は特定されていなくてもよく、その場合、前述のバリアントは４２８Ｌ／４３４Ｓと称される。置換が提供される順序は任意であり、すなわち、例えば、４２８Ｌ／４３４Ｓは４３４Ｓ／４２８Ｌと同じＦｃバリアントなどであることが留意される。抗体または誘導体およびそれらの断片（例えば、Ｆｃドメイン）に関連する本発明において議論されるすべての位置について、特に明記しない限り、アミノ酸位置の番号付けはＥＵインデックスによるものである。「ＥＵインデックス」または「ＫａｂａｔのようなＥＵインデックス」もしくは「ＥＵ番号付け」スキームは、ＥＵ抗体の番号付けを指す（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ６３：７８－８５、これにより完全に参照により組み込まれる）。
一般に、バリアントＦｃドメインは、対応する親ヒトＩｇＧＦｃドメインに対して少なくとも約８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９パーセントの同一性を有する（以下に考察する同一性アルゴリズム（一実施形態では当技術分野で既知のＢＬＡＳＴアルゴリズム）をデフォルトパラメータを用いて使用する）。あるいは、バリアントＦｃドメインは、親Ｆｃドメインに対する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸修飾を有し得る。あるいは、バリアントＦｃドメインは、親Ｆｃドメインと比較して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸修飾を有し得る。さらに、本明細書で考察されるように、本明細書に記載のバリアントＦｃドメインは、非変性ゲル電気泳動などの本明細書に記載の既知の技術を使用して測定される別のＦｃドメインとともに二量体を形成する能力を依然として保持する。
本明細書における「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味する。さらに、本明細書に記載の抗体を作成するポリペプチドには、１つ以上の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ＰＥＧ化、円順列、環化、他の分子へのリンカー、タンパク質またはタンパク質ドメインへの融合、およびペプチドタグまたは標識の付加が含まれ得る。
「残基」は、本明細書で使用されるとき、タンパク質における位置およびその関連するアミノ酸素性を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７またはＮ２９７とも称される）は、ヒト抗体ＩｇＧ１中の２９７位の残基である。
本明細書で使用される「ＩｇＧサブクラス修飾」または「アイソタイプ修飾」とは、１つのＩｇＧアイソタイプの１つのアミノ酸を、異なる、整合したＩｇＧアイソタイプの対応するアミノ酸に変換するアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＥＵ位置２９６においてＩｇＧ１はチロシンを含み、ＩｇＧ２はフェニルアラニンを含むので、ＩｇＧ２におけるＦ２９６Ｙ置換は、ＩｇＧサブクラス修飾であると考えられる。
本明細書で使用される「天然に存在しない修飾」は、アイソタイプ性ではないアミノ酸修飾を意味する。例えば、ヒトＩｇＧのうちのいずれも４３４位にセリンを含まないので、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４（またはそれらのハイブリッド）における置換４３４Ｓは、天然に生じない修飾であると見なされる。
本明細書で使用される「アミノ酸」および「アミノ酸同一性」とは、ＤＮＡおよびＲＮＡによってコードされている２０種の天然に存在するアミノ酸のうちの１つを意味する。
本明細書で使用される「エフェクター機能」とは、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用から生じる生化学的事象を意味する。エフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ＩｇＧ Ｆｃリガンド」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域と結合してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌプロテインＡ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌプロテインＧ、およびウイルスＦｃγＲが含まれるが、これらに限定されない。Ｆｃリガンドにはまた、ＦｃγＲと相同なＦｃ受容体のファミリーである、Ｆｃ受容体相同体（ＦｃＲＨ）が含まれる（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９０：１２３－１３６（参照により全体が組み込まれる））。Ｆｃリガンドは、Ｆｃに結合する未発見の分子を含み得る。特定のＩｇＧ Ｆｃリガンドは、ＦｃＲｎおよびＦｃガンマ受容体である。本明細書で使用される「Ｆｃリガンド」とは、抗体のＦｃ領域と結合してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。
本明細書で使用される「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」、または「ＦｃガンマＲ」は、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、かつＦｃγＲ遺伝子によってコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトにおいて、このファミリーには、アイソフォームであるＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームであるＦｃγＲＩＩａ（アロタイプであるＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ－１およびＦｃγＲＩＩｂ－２を含む）、ならびにＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびにアイソフォームであるＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプであるＶ１５８およびＦ１５８を含む）、ならびにＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプであるＦｃγＲＩＩｂ－ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩｂ－ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（参照により全体が組み込まれるＪｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７－６５）、ならびに任意の発見されていないヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、これらに限定されない任意の生物由来であり得る。マウスＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＩＩ－２（ＣＤ１６－２）、ならびに任意の未発見のマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ＦｃＲｎ」または「新生児Ｆｃ受容体」は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、少なくとも部分的にＦｃＲｎ遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。ＦｃＲｎは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、これらに限定されない任意の生物由来であり得る。当該技術分野において既知のように、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、しばしば重鎖および軽鎖と称される２つのポリペプチドを含む。軽鎖はβ－２－ミクログロブリンであり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によってコードされている。本明細書において別段の記載がない限り、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖とβ－２－ミクログロブリンとの複合体を指す。ＦｃＲｎ受容体への結合を増加させるために、そしていくつかの場合には血清半減期を増加させるために使用される様々なＦｃＲｎバリアントが使用できる。「ＦｃＲｎバリアント」とは、ＦｃＲｎへの結合を増加させるものであり、好適なＦｃＲｎバリアントを以下に示す。
本明細書で使用される「親ポリペプチド」は、バリアントを生成するようにその後修飾される出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、または天然に存在するポリペプチドのバリアントもしくは操作されたバージョンであってもよい。したがって、本明細書で使用される「親免疫グロブリン」とは、バリアントを生成するように修飾される非修飾免疫グロブリンポリペプチドを意味し、本明細書で使用される「親抗体」とは、バリアント抗体を生成するように修飾される非修飾抗体を意味する。「親抗体」には、以下に概説するように、既知の市販の組み換えで産生した抗体が含まれることに注意すべきである。このような関係では、「親Ｆｃドメイン」は、列挙されたバリアントに関連するものであり、したがって、「バリアントヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン」はヒトＩｇＧ１の親Ｆｃドメインと比較され、「バリアントヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン」は親ＦｃドメインヒトＩｇＧ４と比較される等である。
本明細書で使用される「位置」とは、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、順次に、または確立された形式、例えば、抗体番号付けのためのＥＵインデックスに従って、番号付けされ得る。
「標的抗原」は、本明細書で使用されるとき、所与の抗体の可変領域を含む抗体結合ドメインによって特異的に結合される分子を意味する。
本明細書中の本明細書に記載のヘテロ二量体抗体の単量体に牽連して「撚り度（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」は、「マッチ」する２本鎖ＤＮＡと同様に、「マッチ」してヘテロ二量体を形成する能力を保持するようにヘテロ二量体化変異を各単量体に組み込むことを意味する。例えば、いくつかのｐＩバリアントが単量体Ａへと操作される（例えば、ｐＩをより高くする）場合、同様に利用され得る「電荷対」である立体変異はｐＩバリアントを妨害せず、例えば、ｐＩを高くした電荷変異が同一の「鎖」または「単量体」に置かれ、両方の機能を保持する。同様に、以下により詳細に概説されるように、対のセットになる「スキュー（ｓｋｅｗ）」バリアントついて、当業者は、対の１つのセットが、どちらの鎖または単量体に入るかを決定する際に、ｐＩを考慮し、そのため、ｐＩ分離もまた、スキューのｐＩを使用して最大化される。
「標的細胞」は、本明細書で使用されるとき、標的抗原を発現する細胞を意味する。
本明細書に記載の抗体による二重特異性抗体を製造する文脈における「宿主細胞」とは、二重特異性抗体の構成要素をコードする外因性核酸を含み、好適な条件下で二重特異性抗体を発現できる細胞を意味する。好適な宿主細胞について以下で説明する。
本明細書における「野生型またはＷＴ」は、対立遺伝子変異を含む、天然に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
本明細書には、ヒト抗体ドメインと配列同一性を有するいくつかの抗原結合ドメインが提供される。２つの類似した配列（抗体可変ドメインなど）間の配列同一性は、Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｏｆ Ｂｉｏｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２［ｌｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ，ＣＤ．（１９７０）“Ａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ Ｔｏ Ｔｈｅ Ｓｅａｒｃｈ Ｆｏｒ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｏｆ Ｔｗｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３［ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ］、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８８）“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ Ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４［ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄ］、またはＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ，（１９９０）”Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ，“Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，ｔｈｅ”ＢＬＡＳＴ”ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ参照されたい）などのアルゴリズムによって測定できる。前述のアルゴリズムのいずれかを使用する場合、デフォルトパラメータ（ウィンドウの長さ、ギャップペナルティなど）が使用される。一実施形態では、配列同一性は、デフォルトパラメータを使用して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して測定される。
本明細書に記載の抗体は一般に、単離されているか、または組換え体である。本明細書に開示される様々なポリペプチドを説明するために使用される場合、「単離された」とは、それが発現された細胞または細胞培養物から特定および分離および／または回収されたポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップによって調製されるであろう。「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。「組み換え体」は、外来性宿主細胞において組み換え核酸技術を用いて抗体が生成されることを意味し、それらも単離され得る。
特定の抗原またはエピトープとの「特異的結合」もしくは「～と特異的に結合する」または特定の抗原またはエピトープ「～に対して特異的である」とは、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を有さない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって、測定することができる。例えば、特異的結合は、標的と類似の対照分子との競合によって決定することができる。
特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対して少なくとも約１０－４Ｍ、少なくとも約１０－５Ｍ、少なくとも約１０－６Ｍ、少なくとも約１０－７Ｍ、少なくとも約１０－８Ｍ、少なくとも約１０－９Ｍ、代替的に少なくとも約１０－１０Ｍ、少なくとも約１０－１１Ｍ、少なくとも約１０－１２Ｍ、またはそれ以上のＫＤを有する抗体によって示され得、ＫＤとは特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープと比べて、対照分子に対して２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きいＫＤを有することになる。
また、特定の抗原またはエピトープへの特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対するＫＡまたはＫａが、対照と比べて、そのエピトープに対して少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きい抗体によって示され得、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指す。結合親和性は一般的に、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＳＰＲまたはＢＬＩアッセイを用いて測定される。
ＩＶ．ＥＮＰＰ３結合ドメイン
一態様では、ＥＮＰＰ３抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および抗ＥＮＰＰ３抗体を含むそのようなＥＮＰＰ３抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物が本明細書で提供される。そのようなＥＮＰＰ３抗原結合ドメインを含む対象抗体（例えば、抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体）は、様々な異なる免疫応答を有利に誘発する（実施例５および６を参照されたい）。そのようなＥＮＰＰ３結合ドメインおよび関連する抗体は、例えば、ＥＮＰＰ３関連癌の治療に使用される。
一態様では、ＥＮＰＰ３抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および抗ＥＮＰＰ３抗体を含むそのようなＥＮＰＰ３抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物が本明細書で提供される。そのようなＥＮＰＰ３抗原結合ドメインを含む対象抗体（例えば、抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体）は、様々な異なる免疫応答を有利に誘発する（実施例５および６を参照されたい）。そのようなＥＮＰＰ３結合ドメインおよび関連する抗体は、例えば、ＥＮＰＰ３関連癌の治療に使用される。
当業者によって理解されるように、好適なＥＮＰＰ３結合ドメインは、下線が引かれているか、または、本明細書に記載され、表２に示されるように異なる番号付けスキームが使用される場合、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉならびに配列表（表２を参照されたい）に図示されるような可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）配列内の他のアラインメントを使用して同定されるＣＤＲとして、配列表および図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに図示されるような６つのＣＤＲのセットを含むことができる。好適なＥＮＰＰ３ ＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂドメインとして使用される、これらの配列および図に示されるようなＶＨおよびＶＬの全体の配列をも含み得る。
一実施形態では、ＥＮＰＰ３抗原結合ドメインは、図および配列リストを含む、本明細書に記載のＥＮＰＰ３ ＡＢＤの６つのＣＤＲ（すなわち、ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３）を含む。例示的な実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちの１つである。
ＥＮＰＰ３に対するＡＢＤを形成する図および配列表に開示される親ＣＤＲセットに加えて本明細書に開示されるＥＮＰＰ３ ＡＢＤ ＣＤＲの少なくとも１つの修飾を含むＣＤＲを有するバリアントＥＮＰＰ３ ＡＢＤＳが、本明細書に提供される。一実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、図および配列表を含む、本明細書に記載のＥＮＰＰ３ ＡＢＤの６つのＣＤＲと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０のアミノ酸修飾を有する６つのＣＤＲのセットを含む。例示的な実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、以下のＥＮＰＰ３ ＡＢＤ：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちの１つの６つのＣＤＲと比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０のアミノ酸修飾を有する６つのＣＤＲのセットを含む。ある特定の実施形態では、バリアントＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えば、オクテットアッセイ）アッセイの少なくとも１つによって測定される場合、ＥＮＰＰ３抗原に結合することができ、後者は多くの実施形態で特定の用途を見出す。特定の実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、ヒトＥＮＰＰ３抗原に結合することができる（実施例５を参照されたい）。
一実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、図および配列表を含む、本明細書に記載されるＥＮＰＰ３ ＡＢＤの６つのＣＤＲと少なくとも９０、９５、９７、９８または９９％同一である６つのＣＤＲを含む。例示的な実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、以下のＥＮＰＰ３ ＡＢＤ：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちの１つの６つのＣＤＲと少なくとも９０、９５、９７、９８または９９％同一である６つのＣＤＲを含む。ある特定の実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えば、オクテットアッセイ）アッセイの少なくとも１つによって測定される場合、ＥＮＰＰ３抗原に対して結合することができ、後者は多くの実施形態で特定の用途を見出す。特定の実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、ヒトＥＮＰＰ３抗原に結合することができる（図２を参照されたい）。
別の例示的な実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、図および配列表を含む、本明細書に記載のＥＮＰＰ３ ＡＢＤのうちのいずれか１つの可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む。例示的な実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちの１つである。
本明細書に開示される親ＥＮＰＰ３可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインに加えて、本明細書に開示されるＥＮＰＰ３ ＡＢＤ ＶＨおよびＶＬドメインのバリアントである可変重鎖ドメインおよび／または可変軽鎖ドメインを含むＥＮＰＰ３ ＡＢＤが本明細書で提供される。一実施形態では、バリアントＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインは、図および配列表を含む、本明細書に記載されるＥＮＰＰ３ ＡＢＤのＶＨおよび／またはＶＬドメインからの１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸変化を有する。例示的な実施形態では、バリアントＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインは、以下のＥＮＰＰ３ ＡＢＤ：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちの１つの６つのＶＨおよび／またはＶＬドメインからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０のアミノ酸変化を有する。ある特定の実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えば、オクテットアッセイ）アッセイの少なくとも１つによって測定される場合、ＥＮＰＰ３に結合することができ、後者は多くの実施形態で特定の用途を見出す。特定の実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、ヒトＥＮＰＰ３抗原に結合することができる（実施例５を参照されたい）。
一実施形態では、バリアントＶＨおよび／またはＶＬドメインは、図および配列表を含む、本明細書に記載されるＥＮＰＰ３ ＡＢＤのＶＨおよび／またはＶＬと少なくとも９０、９５、９７、９８または９９％同一である。例示的な実施形態では、バリアントＶＨおよび／またはＶＬドメインは、以下のＥＮＰＰ３ ＡＢＤ：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちの１つのＶＨおよび／またはＶＬと少なくとも９０、９５、９７、９８または９９％同一である。ある特定の実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えば、オクテットアッセイ）アッセイの少なくとも１つによって測定される場合、ＥＮＰＰ３に結合することができ、後者は多くの実施形態で特定の用途を見出す。特定の実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、ヒトＥＮＰＰ３抗原に結合することができる（実施例５を参照されたい）。
Ｖ．抗体
一態様では、ＥＮＰＰ３に結合する抗体（例えば、抗ＥＮＰＰ３抗体）が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、抗体は、ヒトＥＮＰＰ３に結合する（図１１Ａ）。対象の抗ＥＮＰＰ３抗体には、単一特異性ＥＮＰＰ３抗体、および多重特異性（例えば、二重特異性）抗ＥＮＰＰ３抗体が含まれる。ある特定の実施形態では、抗ＥＮＰＰ３抗体は、図１５Ａ、１５Ｂ、および５２Ａ～５２Ｋに示される抗体フォーマットのうちのいずれか１つによるフォーマットを有する。
一態様では、ＥＮＰＰ３に結合する抗体（例えば、抗ＥＮＰＰ３抗体）が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、抗体は、ヒトＥＮＰＰ３に結合する（図１１Ａ）。対象の抗ＥＮＰＰ３抗体には、単一特異性ＥＮＰＰ３抗体、および多重特異性（例えば、二重特異性）抗ＥＮＰＰ３抗体が含まれる。ある特定の実施形態では、抗ＥＮＰＰ３抗体は、図１５Ａ、１５Ｂ、および５２Ａ～５２Ｋに示される抗体フォーマットのうちのいずれか１つによるフォーマットを有する。
いくつかの実施形態では、対象の組成物は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを有する抗体を含む。本明細書で提供される抗体は、１つ、２つ、３つ、４つ、および５つ以上のＥＮＰＰ３結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＥＮＰＰ３結合ドメインは、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されるものから選択されるＥＮＰＰ３結合ドメインのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２およびｖｌＣＤＲ３配列のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３結合ドメインは、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されるものから選択されるＥＮＰＰ３結合ドメインの下線付きのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２およびｖｌＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３結合ドメインは、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されるものから選択されるＥＮＰＰ３結合ドメインの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む。図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されるＥＮＰＰ３結合ドメインは、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０を含む。
一態様では、以下に概説され、一般に図１５Ａおよび１５Ｂに示されるような様々なフォーマットで、ＥＮＰＰ３およびＣＤ３に結合する二重特異性抗体が本明細書で提供される。これらの二重特異性ヘテロ二量体抗体は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＥＮＰＰ３結合ドメインは、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されるものからなる群から選択されるＥＮＰＰ３結合ドメインのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２およびｖｌＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３結合ドメインは、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されるものから選択されるＥＮＰＰ３結合ドメインの下線付きのＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３配列を含む。
これらの二重特異性ヘテロ二量体抗体は、ＥＮＰＰ３およびＣＤ３に結合する。そのような抗体には、ＣＤ３結合ドメインと、少なくとも１つのＥＮＰＰ３結合ドメインと、を含む。任意の適切なＥＮＰＰ３結合ドメインを抗ＥＮＰＰ３Ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体に含めることができる。いくつかの実施形態では、抗ＥＮＰＰ３Ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体は、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されるものを含むがこれらに限定されない、１つ、２つ、３つ、４つ以上のＥＮＰＰ３結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、抗ＥＮＰＰ３Ｘ抗ＣＤ３抗体は、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されるものからなる群から選択されるＥＮＰＰ３結合ドメインのＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３配列を含むＥＮＰＰ３結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＮＰＰ３Ｘ抗ＣＤ３抗体は、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されるものからなる群から選択されるＥＮＰＰ３結合ドメインの、下線が引かれたＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３配列を含むＥＮＰＰ３結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＮＰＰ３Ｘ抗ＣＤ３抗体は、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されるものからなる群から選択されるＥＮＰＰ３結合ドメインの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含むＥＮＰＰ３結合ドメインを含む。例示的な実施形態では、抗ＥＮＰＰ３Ｘ抗ＣＤ３抗体は、抗ＥＮＰＰ３ ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］＿Ｈ１Ｌ１結合ドメインを含む。
本明細書で提供される抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３抗体は、任意の適切なＣＤ３結合ドメインを含むことができる。ある特定の実施形態では、抗ＥＮＰＰ３Ｘ抗ＣＤ３抗体は、図１０Ａ～Ｆに示されるものからなる群から選択されるＣＤ３結合ドメインのＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３配列を含むＣＤ３結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＮＰＰ３Ｘ抗ＣＤ３抗体は、図１０Ａ～１０Ｆに示されるものからなる群から選択されるＣＤ３結合ドメインの下線付きＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３配列を含むＣＤ３結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＮＰＰ３Ｘ抗ＣＤ３抗体は、図１０Ａ～１０Ｆに示されるものからなる群から選択されるＣＤ３結合ドメインの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含むＣＤ３結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、抗ＣＤ３ Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７；抗ＣＤ３Ｈ１．８９＿Ｌ１．４８；抗ＣＤ３Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７；抗ＣＤ３Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７；および抗ＣＤ３Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７から選択される。本明細書に概説されるように、これらの抗ＣＤ３抗原結合ドメイン（ＣＤ３－ＡＢＤ）は、いずれかの方向でｓｃＦｖフォーマットで（例えば、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬまたはＶＬ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨ）使用され得る。
本明細書で提供される抗体は、異なる抗体ドメインを含む。本明細書中に記載され、当該技術分野において既知であるように、本明細書に記載のヘテロ二量体抗体は、重鎖および軽鎖内に異なるドメインを含み、これもまた重複し得る。これらのドメインは、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＦｃドメインまたはＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、Ｆａｂドメイン、およびｓｃＦｖドメインを含むが、これらに限定されない。
本明細書に示されるように、好適なリンカー（ドメインリンカーまたはｓｃＦｖリンカーのいずれかとして使用）にはいくつかあり、列挙されたドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｃドメインなど）に共有結合（組み換え技術により生成される従来型ペプチド結合を含む）するために使用することができる。対象の抗体のドメインを互いに取り付けるための例示的なリンカーを図６に示す。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、主に、以下のアミノ酸残基Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒを含み得る。リンカーペプチドは、それらが所望の活性を保持するように互いに対して正しい立体配座をとるような方法で２つの分子を結合させるのに十分な長さを有するべきである。一実施形態では、リンカーは、約１～５０アミノ酸長、好ましくは約１～３０アミノ酸長である。一実施形態では、１～２０アミノ酸長のリンカーが使用され得、いくつかの実施形態では、約５～約１０アミノ酸が使用されている。有用なリンカーには、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎ（ｎは少なくとも１（および一般に３～４）の整数である）を含むグリシン－セリンポリマー、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、ならびに他の可動性リンカーが含まれ、それらの一部が、図５および図６に示されている。代替的に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含むがこれらに限定されない様々な非タンパク質性ポリマーが、リンカーとして有用であり得る。
他のリンカー配列は、任意の長さのＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の配列を含むが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインのすべての残基を含まない場合があり、例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５～１２アミノ酸残基である。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖、例えば、ＣκまたはＣλに由来し得る。リンカーは、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、およびＣμを含む任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来し得る。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来配列、および他のタンパク質由来の他の天然配列などの他のタンパク質に由来してもよい。
いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に概説される任意の２つのドメインをともに連結するために使用される「ドメインリンカー」である。例えば、図１５Ｂにおいて、ＦａｂのＣＨ１ドメインのＣ末端をｓｃＦｖのＮ末端に結合するドメインリンカーがあってよく、別の任意のドメインリンカーはｓｃＦｖのＣ末端をＣＨ２ドメインに結合している（ただし、多くの実施形態では、このドメインリンカーとしてヒンジが使用される）。任意の好適なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば、ｎが少なくとも１（一般に３～４～５）の整数である、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎを含むドメインリンカーとしてグリシン－セリンポリマー、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持できるように十分な長さおよび柔軟性を有する２つのドメインの組み換え結合を可能にする任意のペプチド配列を利用する。場合によっては、以下に概説する「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」に注意を払って、ｓｃＦｖリンカーのいくつかの実施形態において使用されるように、荷電ドメインリンカーを使用することができる。例示的な有用なドメインリンカーが、図６に示されている。
ｓｃＦｖドメインを「２＋１」フォーマットでＦｃドメインに接続するために使用されるドメインリンカーを特に参照すると、図６に示されるように、「フルヒンジＣ２２０Ｓバリアント」、「フレックスハーフヒンジ」、「荷電ハーフヒンジ１」、「荷電ハーフヒンジ２」を含む、特定の用途を見出すいくつかのドメインリンカーがある。
いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書で考察されるＶＨおよびＶＬドメインを共有結合するために使用される「ｓｃＦｖリンカー」である。多くの場合では、ｓｃＦｖリンカーは、荷電ｓｃＦｖリンカーであり、そのいくつかは図５に示されている。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体はさらに、第１の単量体と第２の単量体との間のｐＩの分離を促進するための荷電ｓｃＦｖリンカーを提供する。すなわち、正または負のいずれかの荷電ｓｃＦｖリンカー（または異なるモノマー上にｓｃＦｖを使用する足場の場合は両方）を組み込むことによって、これは、Ｆｃドメインをさらに変化させることなく、荷電リンカーを含むモノマーのｐＩを変えることを可能にする。これらの荷電リンカーは、標準的なリンカーを含む任意のｓｃＦｖ中に置換することができる。また、当業者には理解されるように、ｐＩの所望の変化に従って、荷電ｓｃＦｖリンカーが正しい「鎖」またはモノマー上に使用される。例えば、本明細書中で論じられるように、１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットヘテロ二量体抗体を作製するために、所望の抗原連結ドメインのそれぞれについてのＦｖ領域の元のｐＩが計算され、そしてｓｃＦｖを作製するために１つが選択され、ｐＩに応じて、正または負のリンカーのいずれかが選択される。
荷電ドメインリンカーも同様に、本明細書に記載の抗体の単量体のｐＩ分離を増加させるために使用することができ、したがって、図５に含まれるものは、リンカーが利用される、本明細書の任意の実施形態で使用することができる。
特に、図１５Ａおよび１５Ｂに示すフォーマットは、通常「ヘテロ二量体抗体」と呼ばれる抗体であり、タンパク質が、ヘテロ二量体Ｆｃドメインに自己集合した少なくとも２つの関連Ｆｃ配列、およびＦａｂとしてまたはｓｃＦｖとしてであれ少なくとも２つのＦｖ領域を有することを意味する。
提供されるＥＮＰＰ３結合ドメインは、例えば、標準的な免疫グロブリン、ならびに本明細書で提供される１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃおよび２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｖフォーマットを含む任意の有用な抗体フォーマットに含めることができる。他の有用な抗体フォーマットには、図５２Ａ～５２Ｋに示されるように、「ｍＡｂ－Ｆｖ」、「ｍＡｂ－ｓｃＦｖ」、「セントラル－Ｆｖ」、「ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「ｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「デュアルｓｃＦｖ」、および「トライデント」フォーマットの抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、対象抗体は、本明細書で提供されるＥＮＰＰ３ ＡＢＤのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、１つのＥＮＰＰ３ ＡＢＤを含む。他の実施形態では、抗体は２つのＥＮＰＰ３ ＡＢＤを含む。例示的な実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちの１つの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む。例示的な実施形態では、ＥＮＰＯ３ ＡＢＤは、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちの１つである。
例示的な実施形態では、抗体は、本明細書で提供されるＥＮＰＰ３ ＡＢＤのいずれかを含む、１つまたは２つのＥＮＰＰ３ ＡＢＤを含む二重特異性抗体である。そのようなＥＮＰＰ３ ＡＢＤを含む二重特異性抗体には、例えば、１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃおよび２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重特異性フォーマット抗体が挙げられる。例示的な実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、以下のＢ７Ｈ３ ＡＢＤ：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちの１つである。例示的な実施形態では、ＥＮＰＰ３結合ドメインはＦａｂである。いくつかの実施形態では、そのような二重特異性抗体は、本明細書に記載のヘテロ二量体化スキューバリアント、ｐＩバリアントおよび／または除去バリアントのいずれかを含むヘテロ二量体二重特異性抗体である。
Ａ．キメラおよびヒト化抗体
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、特定の生殖細胞系列重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。例えば、そのような抗体は、特定の生殖細胞系列配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含むヒト抗体を含み得るかまたはそれからなり得る。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較することと、ヒト抗体の配列に最も近い配列である（即ち、最も高い同一性％）ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンを選択することとによって（本明細書に概説される方法を使用する）、そのようなものとして同定され得る。特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に生じる体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的導入に起因して、生殖細胞系列配列と比較してアミノ酸の相違を含み得る。しかしながら、ヒト化抗体は、典型的には、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較したときに、抗体をヒト配列に由来するものとして特定するアミノ酸残基を含む。ある特定の場合には、ヒト化抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも９５、９６、９７、９８もしくは９９％、または少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％までも同一であり得る。典型的には、特定のヒト生殖細胞系配列に由来するヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０～２０アミノ酸以下の相違しか示さない（本明細書中の任意のスキュー、ｐＩおよび除去変異の導入前、すなわち、本明細書に記載のバリアントの導入前は、バリアントの数は一般に少ない）。ある特定の場合には、ヒト化抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは５アミノ酸以下、またはさらには４、３、２、もしくは１アミノ酸以下の相違しか示さない場合がある（同様に、本明細書における任意のスキュー、ｐＩ、および除去変異の導入前、すなわち、本明細書に記載のバリアントの導入前は、バリアントの数は一般に少ない）。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、特定の生殖細胞系列重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。例えば、そのような抗体は、特定の生殖細胞系列配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含むヒト抗体を含み得るかまたはそれからなり得る。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較することと、ヒト抗体の配列に最も近い配列である（即ち、最も高い同一性％）ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンを選択することとによって（本明細書に概説される方法を使用する）、そのようなものとして同定され得る。特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に生じる体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的導入に起因して、生殖細胞系列配列と比較してアミノ酸の相違を含み得る。しかしながら、ヒト化抗体は、典型的には、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較したときに、抗体をヒト配列に由来するものとして特定するアミノ酸残基を含む。ある特定の場合には、ヒト化抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも９５、９６、９７、９８もしくは９９％、または少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％までも同一であり得る。典型的には、特定のヒト生殖細胞系配列に由来するヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０～２０アミノ酸以下の相違しか示さない（本明細書中の任意のスキュー、ｐＩおよび除去変異の導入前、すなわち、本明細書に記載のバリアントの導入前は、バリアントの数は一般に少ない）。ある特定の場合には、ヒト化抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは５アミノ酸以下、またはさらには４、３、２、もしくは１アミノ酸以下の相違しか示さない場合がある（同様に、本明細書における任意のスキュー、ｐＩ、および除去変異の導入前、すなわち、本明細書に記載のバリアントの導入前は、バリアントの数は一般に少ない）。
一実施形態では、親抗体は、当技術分野で既知の通り、親和性成熟されたものである。構造に基づく方法が、例えば、ＵＳＳＮ１１／００４，５９０に記載されているように、ヒト化および親和性成熟のために用いられ得る。選択に基づく方法を使用して、抗体可変領域をヒト化および／または親和性成熟してもよく、限定されないが、Ｗｕら、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１－１６２；Ｂａｃａら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８－１０６８４；Ｒｏｓｏｋら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３７）：２２６１１－２２６１８；Ｒａｄｅｒら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：８９１０－８９１５；Ｋｒａｕｓｓら、２００３、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １６（１０）：７５３－７５９に記載される方法を含み、すべて全体が参照により組み込まれる。他のヒト化方法は、ＣＤＲの一部のみを移植することを含んでいてもよく、限定されないが、ＵＳＳＮ０９／８１０，５１０；Ｔａｎら、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９－１１２５；Ｄｅ Ｐａｓｃａｌｉｓら、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６－３０８４に記載される方法を含み、すべて全体が参照により組み込まれる。
Ｂ．ヘテロ二量体抗体
例示的な実施形態では、本明細書で提供される二重特異性抗体は、２つのバリアントＦｃドメイン配列を含むヘテロ二量体二重特異性抗体である。そのようなバリアントＦｃドメインは、ヘテロ二量体抗体の自己組織化および／または精製を容易にするためのアミノ酸修飾を含む。
例示的な実施形態では、本明細書で提供される二重特異性抗体は、２つのバリアントＦｃドメイン配列を含むヘテロ二量体二重特異性抗体である。そのようなバリアントＦｃドメインは、ヘテロ二量体抗体の自己組織化および／または精製を容易にするためのアミノ酸修飾を含む。
抗体技術における継続的な問題は、２つの異なる抗原に同時に結合する「二重特異性」抗体であって、一般に、異なる抗原を近接させ、新しい機能と新しい治療法をもたらすことができる、「二重特異性」抗体に対する要望である。一般に、これらの抗体は、各重鎖および軽鎖の遺伝子を宿主細胞に含めることによって作成される。これにより、一般に、２つのホモ二量体（Ａ－ＡおよびＢ－Ｂ（軽鎖ヘテロ二量体の問題は含まない））だけでなく、所望のヘテロ二量体（Ａ－Ｂ）が形成される。しかしながら、二重特異性抗体形成における主な障壁は、ホモ二量体形成を上回るようにヘテロ二量体形成に偏らせることおよび／またはホモ二量体から離してヘテロ二量体抗体を精製することが困難であるということである。
対象のヘテロ二量体抗体を生成するために使用することができる多くの機構が存在する。さらに、当業者には理解されるように、これらの異なる機構を組み合わせて高いヘテロ二量体化を確実にすることができる。ヘテロ二量体の生成と精製を容易にするアミノ酸修飾は、総称して「ヘテロ二量体化バリアント」と呼ばれる。以下に議論するように、ヘテロ二量体化バリアントには、「スキュー」バリアント（例えば、以下に議論する「ノブアンドホール」および「電荷対」バリアント）、ならびにホモ二量体からのヘテロ二量体の精製を可能にする「ｐＩバリアント」が含まれる。その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第ＵＳ９，６０５，０８４号に一般的に記載されるように、また、具体的には、ヘテロ二量体化バリアントの議論について以下のように、ヘテロ二量体化に有用な機構としては、米国特許第ＵＳ９，６０５，０８４号に記載される「ノブアンドホール」（「ＫＩＨ」）、米国特許第ＵＳ９，６０５，０８４号に記載される「静電ステアリング」または「電荷対」、米国特許第ＵＳ９，６０５，０８４号に記載されるｐＩバリアント、および米国特許第ＵＳ９，６０５，０８４号および以下に概説される一般的なさらなるＦｃバリアントが挙げられる。
対象のヘテロ二量体抗体（例えば、二重特異性抗体）の形成および精製に有用なヘテロ二量体化バリアントについて、以下でさらに詳細に議論する。
１．スキューバリアント
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、第１のＦｃドメイン（Ａ）および／または第２のＦｃドメイン（Ｂ）における１つ以上のアミノ酸修飾であるスキューバリアントを含み、スキューバリアントは、Ｆｃホモ二量体（第１のＦｃドメインの２つまたは第２のＦｃドメインの２つを含むＦｃダイマー；Ａ－ＡまたはＢ－Ｂ）を上回って第１および第２のＦｃドメインを含むＦｃダイマー；Ａ－Ｂ）の形成を促す。好適なスキューバリアントは、米国特許出願公開第２０１６／０３５５６０８号の図２９に含まれ、全体的に、特に、スキューバリアントの開示について、ならびに図１Ａ～１Ｅおよび図４において、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、第１のＦｃドメイン（Ａ）および／または第２のＦｃドメイン（Ｂ）における１つ以上のアミノ酸修飾であるスキューバリアントを含み、スキューバリアントは、Ｆｃホモ二量体（第１のＦｃドメインの２つまたは第２のＦｃドメインの２つを含むＦｃダイマー；Ａ－ＡまたはＢ－Ｂ）を上回って第１および第２のＦｃドメインを含むＦｃダイマー；Ａ－Ｂ）の形成を促す。好適なスキューバリアントは、米国特許出願公開第２０１６／０３５５６０８号の図２９に含まれ、全体的に、特に、スキューバリアントの開示について、ならびに図１Ａ～１Ｅおよび図４において、参照により本明細書に組み込まれる。
１つの機構は、当該技術分野において一般的に「ノブアンドホール」と呼ばれ、ヘテロ二量体形成を有利にし、ホモ二量体形成を不利にする立体効果をもたらすアミノ酸工学を指し、任意で使用することもできる；これはしばしば、「ノブアンドホール」と呼ばれ、ＵＳＳＮ６１／５９６，８４６，Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９（７）：６１７（１９９６）；Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７ ２７０：２６；ＵＳＳＮ８，２１６，８０５に記載されるようなものであり、これらのすべては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの図は、「ノブアンドホール」に依存するいくつかの「単量体Ａ－単量体Ｂ」対を特定する。さらに、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）に記載されているように、これらの「ノブアンドホール（ｋｎｏｂｓ ａｎｄ ｈｏｌｅ）」変異は、ヘテロ二量体化に対するスキュー形成へのジスルフィド結合と組み合わせることができる。
ヘテロ二量体の生成に使用されるさらなる機構は、参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）に記載されているように、時に「静電ステアリング」と呼ばれる。これは、本明細書において、時に「電荷対」と称される。この実施形態では、静電学を使用して、ヘテロ二量体化に向けて形成をスキューさせる。当業者には理解されるように、これらは、ｐＩ、すなわち精製にも影響を及ぼす可能性があり、したがっていくつかの場合ではｐＩバリアントとみなすこともできる。しかしながら、これらはヘテロ二量体化を強制するために生成され、精製手段として使用されなかったので、それらは「立体バリアント」として分類される。これらには、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（例えば、これらは「単量体の対応セットである）、およびＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅが含まれるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、スキューバリアントは、有利かつ同時に、「ノブアンドホール」機構および「静電ステアリング」機構の両方に基づくヘテロ二量体化を促進する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、そのようなヘテロ二量体化スキューバリアントの１つ以上のセットを含む。これらのバリアントは、「セット」の「対」になる。すなわち、一方のセットの対が第１の単量体に組み込まれ、他のセットの対が第２の単量体に組み込まれる。これらのセットは、必ずしも「ノブアンドホール」バリアントとして挙動するわけではなく、一方のモノマーの残基と他方のモノマーの残基との間の一対一の対応を有することを留意すべきである。すなわち、セットのこれらの対は、その代わりに、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を促進しない２つのモノマー間の界面を形成する可能性があり、生物学的条件下で自発的に形成するヘテロ二量体の割合は、予想される５０％（２５％ホモ二量体Ａ／Ａ：５０％ヘテロ二量体Ａ／Ｂ：２５％ホモ二量体Ｂ／Ｂ）ではなく、９０％を超える。例示的なヘテロ二量体化「スキュー」バリアントを図４に示す。例示的な実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ；Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ；またはＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ（任意に、架橋ジスルフィドを含む、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ）「スキュー」バリアントアミノ酸置換セットを含む。例示的な実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、「Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ」アミノ酸置換セットを含む。命名法に関して、「Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ」の対は、モノマーの１つが、アミノ酸置換Ｓ３６４ＫおよびＥ３５７Ｑを含むＦｃドメインを含み、他方のモノマーが、アミノ酸置換Ｌ３６８ＤおよびＫ３７０Ｓを含むＦｃドメインを含むことを意味する。上述のように、これらの対の「撚り度」は、開始時のｐＩに依存する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるスキューバリアントは、ＩＬ－１５－Ｆｃ融合タンパク質の第１および第２のＦｃドメインの片方または両方に、他のスキューバリアント（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号の図３７、特に、スキューバリアントの開示について、参照により本明細書に組み込まれるものを参照されたい）、ｐＩバリアント、アイソタイプバリアント、ＦｃＲｎバリアント、除去バリアントなどを含むがこれらに限定されない、ヘテロ二量体抗体の第１および第２のＦｃドメインの一方または両方への他の修飾とともに独立して組み込まれる。さらに、個々の修飾はまた、独立して、かつ任意に、ヘテロ二量体抗体を対象に含めるか、または対象から除外することができる。
さらなる単量体Ａおよび単量体Ｂのバリアントは、本明細書に概説されるｐＩバリアントまたは参照によりその図、説明文および配列番号それらのすべてが本明細書に明示的に組み込まれるＵＳ２０１２／０１４９８７６の図３７に示される他の立体バリアントなどの他のバリアントと、任意の量で任意選択的にかつ独立して組み合わせることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に概説される立体変異は、任意で独立していずれかのｐＩ変異（またはＦｃ変異、ＦｃＲｎ変異などの他の変異）を一方または両方の単量体に組み込むことができ、独立して任意で本明細書に記載の抗体のタンパク質に含めるかまたは除外することができる。
好適なスキューバリアントのリストが図１Ａ～１Ｅに見られ、図４は多くの実施形態における特に有用性のいくつかの対を示す。多くの実施形態で特に使用されるのは、限定されないが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７ＬおよびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含むセットの対である。命名法に関して、対「Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ」は、一方の単量体が二重バリアントセットＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを有し、他方が二重バリアントセットＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを有することを意味する。
２．ヘテロ二量体のｐＩ（等電点）バリアント
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、ホモ二量体タンパク質からのヘテロ二量体抗体（例えば、抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体）の分離を有利に可能にする精製バリアントを含む。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、ホモ二量体タンパク質からのヘテロ二量体抗体（例えば、抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体）の分離を有利に可能にする精製バリアントを含む。
ヘテロ二量体抗体の精製を容易にし得るいくつかの基本的な機構が存在する。例えば、各単量体が異なるｐＩを有するように抗体重鎖単量体ＡおよびＢの一方または両方への修飾は、単量体Ａ－ＡおよびＢ－Ｂタンパク質からのヘテロ二量体Ａ－Ｂ抗体の等電点精製を可能にする。あるいは、「１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマットや「２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマットなどの一部の足場フォーマットでも、サイズに基づいて分離を可能にする。上記のように、スキューバリアントを使用してホモ二量体上にヘテロ二量体の形成を「スキュー」することもまた可能である。したがって、ヘテロ二量体化スキューバリアントとｐＩバリアントとの組み合わせは、本明細書で提供されるヘテロ二量体抗体において特定の用途を見出す。
さらに、以下でより完全に概説されるように、ヘテロ二量体抗体のフォーマットに応じて、単量体の定常領域および／またはＦｃドメイン内に含まれるｐＩバリアント、および／またはドメインリンカーを使用することができる。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、Ｆｃ、ＦｃＲｎおよびＫＯバリアントなどの、ｐＩ変化を作り出すこともできる代替機能のための追加の修飾を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される対象のヘテロ二量体抗体は、単量体のｐＩを変更する１つ以上の修飾を有する少なくとも１つの単量体（すなわち、「ｐＩバリアント」）を含む。一般に、当業者には理解されるように、ｐＩバリアントには２つの一般的なカテゴリー：タンパク質のｐＩを増加させるもの（塩基性変化）とタンパク質のｐＩを減少させるもの（酸性変化）がある。本明細書中に記載されるように、これらのバリアントのすべての組み合わせがなされ得る：一方のモノマーは野生型、または野生型と顕著に異なるｐＩを示さないバリアントであり得、他方がより塩基性またはより酸性のいずれかであり得る。代替的に、各モノマーは、１つがより塩基性に、１つがより酸性へと変化する。
ヘテロ二量体抗体のフォーマットに応じて、ｐＩ変異は単量体の定常および／またはＦｃドメイン内に含まれるか、または荷電リンカー、ドメインリンカーまたはｓｃＦｖリンカーのいずれかが使用され得る。すなわち、「１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」などのｓｃＦｖを利用する抗体フォーマットには、精製目的のためにさらにｐＩブーストを与える荷電ｓｃＦｖリンカー（正または負のいずれか）を含むことができる。当業者には理解されるように、本明細書に記載の抗体は、単量体の一方または両方にあるｐＩバリアント、および／または荷電ドメインリンカーも提供するが、いくつかの１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットは、荷電ｓｃＦｖリンカーのみで有用であり、追加のｐＩ調整はない。加えて、代替の機能性のためのさらなるアミノ酸操作もまた、Ｆｃ、ＦｃＲｎ、およびＫＯバリアントなどのｐＩ変化を付与し得る。
ヘテロ二量体タンパク質の精製を可能にする分離メカニズムとしてｐＩを利用する対象のヘテロ二量体抗体では、アミノ酸バリアントが単量体ポリペプチドの一方または両方に導入される。すなわち、単量体の１つ（単純化のため本明細書では、簡「単量体Ａ」として称される）のｐＩは、単量体Ｂから離れるように操作させることができ、または単量体ＡのｐＩを増加させ、単量体ＢのｐＩを減少させつつ、単量体ＡとＢの両方の変化を変化させることができる。下記により完全に概説されるように、いずれかまたは両方の単量体のｐＩ変化は、荷電残基を除去または付加することによって（例えば、中性アミノ酸を正または負に荷電したアミノ酸残基で置換する、例えばグリシンからグルタミン酸）、正または負から反対の電荷への荷電残基の変更によって（アスパラギン酸からリジンへ）、または荷電残基の中性残基への変更によって（例えば、電荷の消失、リジンからセリンへ）、実施することができる。いくつかのこれらのバリアントを図３および４に示す。
したがって、いくつかの実施形態では、対象のヘテロ二量体抗体は、二量体タンパク質の単量体の両方ではないにしても少なくとも１つの等電点（ｐＩ）を、アミノ酸置換（「ｐＩバリアント」または「ｐＩ置換」）を単量体の一方または両方に組み込むことによって変更する定常領域におけるアミノ酸修飾を含む。本明細書中に示されるように、２つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、２つの単量体のｐＩが０．１ｐＨ単位とわずかに異なる場合に達成でき、０．２、０．３、０．４、および０．５以上異なるものがすべて本明細書に記載の抗体において使用される。
当業者には理解されるように、良好な分離を得るために各単量体または両方の単量体に含まれるべきｐＩ変異の数は、構成要素の出発ｐＩ、例えば、１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃおよび２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットにおいて、目的のｓｃＦｖおよびＦａｂの出発ｐＩに部分的に依存するであろう。すなわち、どの単量体を操作するか、またはどの「方向」（例えば、より正またはより負）かを決定するために、２つの標的抗原のＦｖ配列が計算され、そしてそこから決定がなされる。当該技術分野において知られているように、異なるＦｖは、本明細書に記載の抗体おいて利用される異なる出発ｐＩを有するであろう。一般に、本明細書に概説されるように、ｐＩは、少なくとも約０．１ｌｏｇの各モノマーの総ｐＩ差をもたらすように操作され、本明細書に概説されるように０．２～０．５が好ましい。
重鎖の定常領域を使用することによって、ヘテロ二量体を達成するためにｐＩバリアントが使用される場合、抗体を含む二重特異性タンパク質を設計および精製するためのよりモジュール方式のアプローチが提供される。したがって、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化変異（スキューおよびｐＩヘテロ二量体化バリアントを含む）は可変領域に含まれず、そのため各個々の抗体を操作しなければならない。加えて、いくつかの実施形態では、ｐＩバリアントから生じる免疫原性の可能性は、顕著な免疫原性を導入することなくｐＩが変化するように、異なるＩｇＧアイソタイプからのｐＩバリアントを移入することによって顕著に低減する。したがって、解決されるべきさらなる問題は、高いヒト配列含有量を有する低いｐＩ定常ドメインの解明、例えば、任意の特定位置における非ヒト残基の最小化または回避である。アイソタイプ置換に代えて、またはこれに加え、ｐＩバリアントから生じる免疫原性の可能性は、等配電子置換（例えば、ＡｓｎからＡｓｐおよびＧｌｎからＧｌｕ）を利用することによって、有意に低減する。
以下に議論するように、このｐＩ工学で起こり得る副次的な利益はまた、血清半減期の延長およびＦｃＲｎ連結の増加である。すなわち、米国特許出願公開第ＵＳ２０１２／００２８３０４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、抗体定常ドメイン（抗体およびＦｃ融合体に見られるものを含む）のｐＩを低下させるとインビボでより長い血清保持をもたらし得る。血清半減期を延長するためのこれらのｐＩバリアントはまた、精製のためのｐＩ変化を促進する。
さらに、ｐＩバリアントは、ホモ二量体が存在するときを排除、最小化、および区別する能力が顕著であるので、二重特異性抗体の分析および品質管理プロセスにさらなる利益を与える。同様に、ヘテロ二量体抗体産生の再現性を確実に試験する能力は重要である。
一般に、特に使用される実施形態は、スキューバリアントを含むバリアントのセットに依存し、これは、２つの単量体間でｐＩ差異を増加させるｐＩバリアントと組み合わせて、ホモ二量体化形成より優先してヘテロ二量体化形成を促し、ホモ二量体を除去してヘテロ二量体の精製を容易にする。
ｐＩバリアントの例示的な組み合わせは、米国特許出願公開第２０１６／０３５５６０８号の図４および５、および図３０に示されており、これらのすべては、全体的に、特に、ｐＩバリアントの開示について、参照により本明細書に組み込まれる。ｐＩバリアントの好ましい組み合わせを、図１および２に示す。本明細書に概説し、図に示すように、これらの変化はＩｇＧ１と比較して示されているが、すべてのアイソタイプをこのように変更することができ、アイソタイプハイブリッドも同様である。重鎖定常ドメインがＩｇＧ２～４に由来する場合、Ｒ１３３ＥおよびＲ１３３Ｑもまた使用され得る。
一実施形態では、ｐＩバリアントの好ましい組み合わせは、２０８Ｄ／２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄバリアント（ヒトＩｇＧ１に対しての場合、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む１つの単量体（負のＦａｂ側）と、（ＧＫＰＧＳ）４（配列番号ＸＸ）を含む正に荷電したｓｃＦｖリンカーを含む第２の単量体（正のｓｃＦｖ側）とを有する。しかしながら、当業者によって理解されるように、第１の単量体は、位置２０８を含むＣＨ１ドメインを含む。したがって、ＣＨ１ドメインを含まない構築物（例えば、ドメインの１つにＣＨ１ドメインを利用しない抗体の場合）において、好ましい負のｐＩ変異Ｆｃセットは、２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄ変異（ヒトＩｇＧ１と比較するときＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む。
したがって、いくつかの実施形態では、一方の単量体は図２からの置換のセットを有し、他方の単量体は荷電リンカー（フォーマットに示されるように、その単量体がｓｃＦｖまたは荷電ドメインリンカーを含むため荷電ｓｃＦｖリンカーのフォーマットのいずれかで、図５に示されているものから選択できる）を有する。
いくつかの実施形態では、修飾は、ＥＵ番号付けに基づき、位置２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９および２３０を含む、Ｆｃドメインのヒンジで生じる。したがって、ｐＩバリアント、特に置換は、位置２１６～２３０の１つ以上で行うことができ、用途を見出す１、２、３、４または５個の変異を有する。同様に、すべての可能な組み合わせが、単独で、または他のドメイン中の他のｐＩバリアントとともに企図されている。
ヒンジドメインのｐＩを低下させるのに使用される具体的な置換は、２２１位の欠失、２２２位の非天然バリンまたはトレオニン、２２３位の欠失、２２４位の非天然グルタミン酸、２２５位の欠失、２３５位の欠失、および２３６位の欠失または非天然アラニンを含むが、これらに限定されない。場合によっては、ヒンジドメインにおいてはｐＩ置換のみが行われ、他の例では、これらの置換は他のドメイン内の他のｐＩバリアントに任意の組み合わせで加えられる。
いくつかの実施形態では、ＥＵ番号付けに基づき、位置２３３、２３４、２３５、２３６、２７４、２９６、３００、３０９、３２０、３２２、３２６、３２７、３３４および３３９を含むＣＨ２領域内に変異を生じさせることができる。２３３～２３６における変化は、ＩｇＧ２骨格における（３２７Ａとともに）エフェクター機能を増加させるためになされ得ることに留意されたい。同様に、これら１４の位置のすべての可能な組み合わせを作ることができ、例えば、＝は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＣＨ２のｐＩ置換を有するバリアントＦｃドメインを含み得る。
ＣＨ２ドメインのｐＩを低下させるのに使用される具体的な置換は、２７４位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、２９６位の非天然フェニルアラニン、３００位の非天然フェニルアラニン、３０９位の非天然バリン、３２０位の非天然グルタミン酸、３２２位の非天然グルタミン酸、３２６位の非天然グルタミン酸、３２７位の非天然グリシン、３３４位の天然グルタミン酸、３３９位の非天然トレオニン、およびＣＨ２内および他のドメインとのすべての可能な組み合わせを含むが、これらに限定されない。
この実施形態では、修飾は、ＣＨ３領域の位置３５５、３５９、３６２、３８４、３８９、３９２、３９７、４１８、４１９、４４４および４４７（ＥＵ番号付け）から独立して、かつ任意選択で選択され得る。ＣＨ３ドメインのｐＩを低下させるのに使用される具体的な置換としては、３５５位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、３８４位の非天然セリン、３９２位の非天然アスパラギンまたはグルタミン酸、３９７位の非天然メチオニン、４１９位の非天然グルタミン酸、３５９位の非天然グルタミン酸、３６２位の非天然グルタミン酸、３８９位の非天然グルタミン酸、４１８位の非天然グルタミン酸、４４４位の非天然グルタミン酸、および４４７位の欠失または非天然アスパラギン酸が含まれるがこれらに限定されない。
一般に、当業者には理解されるように、ｐＩバリアントには２つの一般的なカテゴリー：タンパク質のｐＩを増加させるもの（塩基性変化）とタンパク質のｐＩを減少させるもの（酸性変化）がある。本明細書中に記載されるように、これらのバリアントのすべての組み合わせがなされ得る：一方のモノマーは野生型、または野生型と顕著に異なるｐＩを示さないバリアントであり得、他方がより塩基性またはより酸性のいずれかであり得る。代替的に、各モノマーは、１つがより塩基性に、１つがより酸性へと変化する。
ｐＩバリアントの好ましい組み合わせを図４に示す。本明細書に概説し、図に示すように、これらの変化はＩｇＧ１と比較して示されているが、すべてのアイソタイプをこのように変更することができ、アイソタイプハイブリッドも同様である。重鎖定常ドメインがＩｇＧ２～４に由来する場合、Ｒ１３３ＥおよびＲ１３３Ｑもまた使用され得る。
一実施形態では、例えば図１５Ａおよび１５Ｂのフォーマットにおいて、ｐＩバリアントの好ましい組み合わせは、２０８Ｄ／２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄバリアント（ヒトＩｇＧ１に対しての場合、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む１つの単量体（負のＦａｂ側）と、（ＧＫＰＧＳ）４（配列番号ＸＸＸ）を含む正に荷電したｓｃＦｖリンカーを含む第２の単量体（正のｓｃＦｖ側）とを有する。しかしながら、当業者によって理解されるように、第１の単量体は、位置２０８を含むＣＨ１ドメインを含む。したがって、ＣＨ１ドメインを含まない構築物（例えば、ドメインの１つにＣＨ１ドメインを利用しないヘテロ二量体抗体の場合、例えば、図４２Ｂ、Ｃ、またはＤに示されているようなデュアルｓｃＦｖ形式または「ワンアーム」形式の場合）において、好ましい負のｐＩバリアントＦｃセットは、２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄバリアント（ヒトＩｇＧ１に対しての場合、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む。
したがって、いくつかの実施形態では、一方の単量体は図４からの置換のセットを有し、他方の単量体は荷電リンカー（フォーマットに示されるように、その単量体がｓｃＦｖまたは荷電ドメインリンカーを含むため荷電ｓｃＦｖリンカーのフォーマットのいずれかで、図５に示されているものから選択できる）を有する。
３．アイソタイプバリアント
さらに、本明細書に記載の抗体の多くの実施形態は、あるＩｇＧアイソタイプから別のＩｇＧアイソタイプへの特定の位置でのｐＩアミノ酸の「移入」に依存し、したがって、バリアントに望ましくない免疫原性が導入される可能性を低減または排除する。これらのいくつかは、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図２１に示されている。すなわち、ＩｇＧ１は、高いエフェクター機能を含む様々な理由から治療用抗体の一般的なアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１の重定常領域は、ＩｇＧ２のそれよりも高いｐＩを有する（８．１０対７．３１）。特定の位置でＩｇＧ２残基をＩｇＧ１骨格に導入することによって、得られるモノマーのｐＩは低下（または上昇）し、さらにより長い血清半減期を示す。例えば、ＩｇＧ１は１３７位にグリシン（ｐＩ５．９７）を有し、ＩｇＧ２はグルタミン酸（ｐＩ３．２２）を有し、グルタミン酸を移入すると、得られるタンパク質のｐＩに影響を与える。以下に記載されるように、いくつかのアミノ酸置換は一般に、バリアント抗体のｐＩに顕著な影響を与えるために必要とされる。しかしながら、ＩｇＧ２分子中の変化でさえも血清半減期の増加を可能にすることが以下に論じられるように留意されるべきである。
さらに、本明細書に記載の抗体の多くの実施形態は、あるＩｇＧアイソタイプから別のＩｇＧアイソタイプへの特定の位置でのｐＩアミノ酸の「移入」に依存し、したがって、バリアントに望ましくない免疫原性が導入される可能性を低減または排除する。これらのいくつかは、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図２１に示されている。すなわち、ＩｇＧ１は、高いエフェクター機能を含む様々な理由から治療用抗体の一般的なアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１の重定常領域は、ＩｇＧ２のそれよりも高いｐＩを有する（８．１０対７．３１）。特定の位置でＩｇＧ２残基をＩｇＧ１骨格に導入することによって、得られるモノマーのｐＩは低下（または上昇）し、さらにより長い血清半減期を示す。例えば、ＩｇＧ１は１３７位にグリシン（ｐＩ５．９７）を有し、ＩｇＧ２はグルタミン酸（ｐＩ３．２２）を有し、グルタミン酸を移入すると、得られるタンパク質のｐＩに影響を与える。以下に記載されるように、いくつかのアミノ酸置換は一般に、バリアント抗体のｐＩに顕著な影響を与えるために必要とされる。しかしながら、ＩｇＧ２分子中の変化でさえも血清半減期の増加を可能にすることが以下に論じられるように留意されるべきである。
他の実施形態では、非アイソタイプのアミノ酸変化を行って、（例えば、高ｐＩのアミノ酸から低ｐＩのアミノ酸へと変化させることによって）得られるタンパク質の全体的な荷電状態を低下させるか、または以下でさらに詳細に説明する安定性等のための構造の調整を可能にする。
加えて、重定常ドメインおよび軽定常ドメインの両方をｐＩ操作することによって、ヘテロ二量体の各単量体における顕著な変化を見ることができる。本明細書で論じるように、２つのモノマーのｐＩが少なくとも０．５だけ異なることは、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点に感受性の他の方法による分離を可能にし得る。
４．ｐＩを計算する
各モノマーのｐＩは、バリアント重鎖定常ドメインのｐＩおよび全モノマーのｐＩに依存し、バリアント重鎖定常ドメインおよび融合パートナーを含み得る。したがって、いくつかの実施形態において、ｐＩの変化は、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図１９のチャートを用いて、バリアント重鎖定常ドメインに基づいて計算される。本明細書で論じるように、どの単量体を操作するかは概して、Ｆｖおよび足場の固有のｐＩによって決定される。代替的に、各単量体のｐＩを比較することができる。
各モノマーのｐＩは、バリアント重鎖定常ドメインのｐＩおよび全モノマーのｐＩに依存し、バリアント重鎖定常ドメインおよび融合パートナーを含み得る。したがって、いくつかの実施形態において、ｐＩの変化は、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図１９のチャートを用いて、バリアント重鎖定常ドメインに基づいて計算される。本明細書で論じるように、どの単量体を操作するかは概して、Ｆｖおよび足場の固有のｐＩによって決定される。代替的に、各単量体のｐＩを比較することができる。
５．より良好なインビボ結合のＦｃＲｎも付与するｐＩバリアント
ｐＩバリアントがモノマーのｐＩを減少させる場合、それらはインビボでの血清保持を改善するというさらなる利点を有することができる。
ｐＩバリアントがモノマーのｐＩを減少させる場合、それらはインビボでの血清保持を改善するというさらなる利点を有することができる。
まだ検討中ではあるが、エンドソーム内のｐＨ６でＦｃＲｎに結合するとＦｃが隔離されるため、Ｆｃ領域はインビボでより長い半減期を有すると考えられている（参照により全体的に組み込まれる、Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，１９９７ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ．１８（１２）：５９２－５９８）。次いでエンドソーム区画はＦｃを細胞表面にリサイクルする。区画が細胞外空間に開くと、約７．４のより高いｐＨが、血中へのＦｃの放出を誘導する。マウスにおいて、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａらは、ｐＨ６およびｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合が増加したＦｃバリアントは、実際に低下された血清濃度、および野生型Ｆｃと同一の半減期を有することを示した（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５１７１－５１８０、参照によりその全体が組み込まれる）。ｐＨ７．４でのＦｃＲｎに対するＦｃの親和性の増加は、血中へのＦｃの放出を妨げると考えられる。したがって、インビボでのＦｃの半減期を増加させるＦｃ変異は、理想的には、より高いｐＨでのＦｃの放出をなお可能にしながら、より低いｐＨでのＦｃＲｎ結合を増加させる。アミノ酸ヒスチジンは、６．０～７．４のｐＨ範囲でその荷電状態を変化させる。それ故、Ｆｃ／ＦｃＲｎ複合体中の重要な位置にＨｉｓ残基を見出すことは驚くべきことではない。
最近、より低い等電点を有する可変領域を有する抗体もまたより長い血清半減期を有し得ることが示唆されている（Ｉｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２０１０ ＰＥＤＳ．２３（５）：３８５－３９２、参照によりすべてが本明細書に組み込まれる）。しかし、このメカニズムはまだよくわかっていない。さらに、可変領域は抗体ごとに異なる。本明細書に記載されるように、ｐＩが低下し半減期が延長された定常領域バリアントは、抗体の薬物動態特性を改善するためのよりモジュール化されたアプローチを提供するであろう。
Ｃ．追加の機能性のための追加のＦｃバリアント
上記に概説されているヘテロ二量体化バリアントに加えて、限定されないが、以下に概説されているように、１つ以上のＦｃγＲ受容体との結合を変化させること、ＦｃＲｎへの変化された結合を含む、様々な理由から行われ得るいくつかの有用なＦｃアミノ酸修飾がある。
上記に概説されているヘテロ二量体化バリアントに加えて、限定されないが、以下に概説されているように、１つ以上のＦｃγＲ受容体との結合を変化させること、ＦｃＲｎへの変化された結合を含む、様々な理由から行われ得るいくつかの有用なＦｃアミノ酸修飾がある。
したがって、本明細書で提供される抗体（ヘテロ二量体、ならびにホモ二量体）は、本明細書で概説されるヘテロ二量体化バリアント（例えば、ｐＩバリアントおよび立体バリアント）を伴うか、または伴わないそのようなアミノ酸修飾を含み得る。バリアントの各セットは独立してかつ任意選択で特定のヘテロ二量体タンパク質に含み得るかまたはそれから除外し得る。
１．ＦｃγＲバリアント
ＦｃγＲ受容体のうちの１つ以上への結合を改変するために実施され得るいくつかの有用なＦｃ置換が存在する。ある特定の実施形態では、対象の抗体は、１つ以上のＦｃγＲ受容体（すなわち、「ＦｃγＲバリアント」）への結合を変更する修飾を含む。結合の増加ならびに結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加は、一般に、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性、すなわち、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の連結抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応）の増加をもたらすことが知られている。同様に、いくつかの状況下では、ＦｃγＲＩＩｂ（抑制性受容体）への結合の減少も有益であり得る。本明細書に記載の抗体で使用されるアミノ酸置換には、米国特許第８，１８８，３２１号（特に図４１）および同第８，０８４，５８２号、ならびに米国特許公開出願２００６０２３５２０８号および同第２００７０１４８１７０号に列挙されるものが挙げられ、これらはすべて、参照によりその全体が、特にそこに開示されているバリアントについて明示的に、本明細書に組み込まれている。使用される特定のバリアントには、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｌ、２４３Ａ、２４３Ｌ、２６４Ａ、２６４Ｖおよび２９９Ｔが挙げられるが、これらに限定されない。
ＦｃγＲ受容体のうちの１つ以上への結合を改変するために実施され得るいくつかの有用なＦｃ置換が存在する。ある特定の実施形態では、対象の抗体は、１つ以上のＦｃγＲ受容体（すなわち、「ＦｃγＲバリアント」）への結合を変更する修飾を含む。結合の増加ならびに結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加は、一般に、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性、すなわち、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の連結抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応）の増加をもたらすことが知られている。同様に、いくつかの状況下では、ＦｃγＲＩＩｂ（抑制性受容体）への結合の減少も有益であり得る。本明細書に記載の抗体で使用されるアミノ酸置換には、米国特許第８，１８８，３２１号（特に図４１）および同第８，０８４，５８２号、ならびに米国特許公開出願２００６０２３５２０８号および同第２００７０１４８１７０号に列挙されるものが挙げられ、これらはすべて、参照によりその全体が、特にそこに開示されているバリアントについて明示的に、本明細書に組み込まれている。使用される特定のバリアントには、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｌ、２４３Ａ、２４３Ｌ、２６４Ａ、２６４Ｖおよび２９９Ｔが挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１２／３４１，７６９に具体的に開示されているように、４３４Ｓ、４３４Ａ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６ＩまたはＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ、および２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌを含むがこれらに限定されない、ＦｃＲｎ受容体への結合の増加および血清半減期の増加に使用される追加のＦｃ置換が存在する。そのような修飾は、対象抗体の一方または両方のＦｃドメインに含まれ得る。
２．除去バリアント
同様に、機能的バリアントの別のカテゴリーは「ＦｃγＲ除去バリアント」または「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯまたはＫＯ）」バリアントである。これらの実施形態では、いくつかの治療用途のために、１つ以上またはすべてのＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）へのＦｃドメインの正常な結合を低減または除去して、追加の作用機序を回避することが望ましい。すなわち、例えば、多くの実施形態では、特にＣＤ３に一価的に結合する二重特異性抗体の使用において、ＡＤＣＣ活性を排除または顕著に低下させるためにＦｃγＲＩＩＩａ結合を除去することが概して望ましく、Ｆｃドメインのうちの１つは、１つ以上のＦｃγ受容体除去バリアントを含む。これらの除去バリアントは、図１４に示され、それぞれは、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択される除去バリアントを用いる好ましい態様で、独立して任意選択的に含まれるか除外することができる。本明細書で言及される除去バリアントは、ＦｃγＲ結合を除去するが、ＦｃＲｎ結合を除去しないことに留意されたい。
同様に、機能的バリアントの別のカテゴリーは「ＦｃγＲ除去バリアント」または「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯまたはＫＯ）」バリアントである。これらの実施形態では、いくつかの治療用途のために、１つ以上またはすべてのＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）へのＦｃドメインの正常な結合を低減または除去して、追加の作用機序を回避することが望ましい。すなわち、例えば、多くの実施形態では、特にＣＤ３に一価的に結合する二重特異性抗体の使用において、ＡＤＣＣ活性を排除または顕著に低下させるためにＦｃγＲＩＩＩａ結合を除去することが概して望ましく、Ｆｃドメインのうちの１つは、１つ以上のＦｃγ受容体除去バリアントを含む。これらの除去バリアントは、図１４に示され、それぞれは、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択される除去バリアントを用いる好ましい態様で、独立して任意選択的に含まれるか除外することができる。本明細書で言及される除去バリアントは、ＦｃγＲ結合を除去するが、ＦｃＲｎ結合を除去しないことに留意されたい。
当技術分野で知られているように、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインはＦｃγ受容体への結合が最も高く、したがってヘテロ二量体抗体の骨格の定常ドメイン（またはＦｃドメイン）がＩｇＧ１である場合、除去バリアントを使用できる。代替的に、またはＩｇＧ１バックグラウンドの除去バリアントに加えて、グリコシル化位置２９７（一般にＡまたはＳへの）での変異は、例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を有意に除去することができる。ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、Ｆｃγ受容体への結合が自然に低下しているため、これらの骨格は、除去バリアントの有無にかかわらず使用できる。
Ｄ．ヘテロ二量体とＦｃバリアントとの組み合わせ
当業者には理解されるように、列挙されたヘテロ二量体化バリアント（スキューバリアントおよび／またはｐＩバリアントを含む）はすべて、それらの「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」または「モノマー分割」を保持する限り、任意選択で、かつ独立して組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるヘテロ二量体抗体は、図４に示されるように、ヘテロ二量体化スキューバリアント、等比体積ｐＩ置換およびＦｃＫＯバリアントの組み合わせを含む。さらに、これらのバリアントはすべて、ヘテロ二量体化フォーマットのいずれにも組み合わせることができる。
当業者には理解されるように、列挙されたヘテロ二量体化バリアント（スキューバリアントおよび／またはｐＩバリアントを含む）はすべて、それらの「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」または「モノマー分割」を保持する限り、任意選択で、かつ独立して組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるヘテロ二量体抗体は、図４に示されるように、ヘテロ二量体化スキューバリアント、等比体積ｐＩ置換およびＦｃＫＯバリアントの組み合わせを含む。さらに、これらのバリアントはすべて、ヘテロ二量体化フォーマットのいずれにも組み合わせることができる。
ｐＩバリアントの場合、特に使用される実施形態が図に示されている一方、精製を促進するために２つのモノマー間のｐＩの差異を変えるという基本的な規則に従って、他の組み合わせを生成できる。
さらに、ヘテロ二量体化バリアント、スキュー、およびｐＩのいずれも、本明細書で一般的に概説されるように、Ｆｃ除去バリアント、Ｆｃバリアント、ＦｃＲｎバリアントと、独立してかつ任意選択で組み合わせることができる。
ヘテロ二量体１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃおよび２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体のいくつかの実施形態に含まれるバリアントの例示的な組み合わせが図４に含まれている。ある特定の実施形態では、抗体は、図１５Ａおよび１５Ｂに示されるように、ヘテロ二量体１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃまたは２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体である。
Ｅ．抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体
別の態様では、抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３（本明細書では「αＥＮＰＰ３×αＣＤ３」とも称される）二重特異性抗体が本明細書で提供される。そのような抗体は、少なくとも１つのＥＮＰＰ３結合ドメインと少なくとも１つのＣＤ３結合ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性αＥＮＰＰ３×αＣＤ３は、本明細書において、ＥＮＰＰ３を発現する腫瘍部位において選択的に免疫応答を提供した。
別の態様では、抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３（本明細書では「αＥＮＰＰ３×αＣＤ３」とも称される）二重特異性抗体が本明細書で提供される。そのような抗体は、少なくとも１つのＥＮＰＰ３結合ドメインと少なくとも１つのＣＤ３結合ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性αＥＮＰＰ３×αＣＤ３は、本明細書において、ＥＮＰＰ３を発現する腫瘍部位において選択的に免疫応答を提供した。
本明細書で指示されていない限り、名前の抗原リストの順序は構造を与えないことに注意されたく、すなわち、ＥＮＰＰ３ＸＣＤ３ １＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体は、ｓｃＦｖをＥＮＰＰ３またはＣＤ３に結合させることができるが、場合によっては、指示されている通りの順序で構造が特定される。
本明細書でより詳細に概説されるように、ＡＢＤのこれらの組み合わせは、以下に概説されるように、一般に一方のＡＢＤがＦａｂ形式であり、他方がｓｃＦｖ形式である組み合わせで、様々な形式であり得る。本明細書で提供される二重特異性抗体で使用される例示的なフォーマットには、１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃおよび２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｖフォーマットが挙げられる（例えば、図１５Ａおよび１５Ｂを参照されたい）。他の有用な抗体フォーマットには、図５２Ａ～５２Ｋに示されるように、「ｍＡｂ－Ｆｖ」、「ｍＡｂ－ｓｃＦｖ」、「セントラル－Ｆｖ」、「ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「ｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「デュアルｓｃＦｖ」、および「トライデント」フォーマットの抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、概して、ＡＢＤのうちの１つは、ＶＨ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬまたはＶＬ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨのＮ末端からＣ末端に向かう方向で、本明細書に概説されるようなｓｃＦｖを含む。フォーマットによれば、他のＡＢＤの一方または両方は、概して、一方のタンパク質鎖上にＶＨドメインを（概して重鎖の構成要素として）およびもう別のタンパク質鎖上にＶＬ（概して軽鎖の構成要素として）を含むＦａｂである。
当業者には理解されるように、６個のＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬドメインの任意のセットはｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットにすることができ、次いでこれを重鎖および軽鎖の定常ドメインに付加し、ここで重鎖定常ドメインは変異（ＣＨ１ドメインおよびＦｃドメイン内を含む）を含む。配列表に含まれるｓｃＦｖ配列は特定の荷電リンカーを利用するが、本明細書で概説するように、図５および図６に示されるものを含めて、非荷電または他の荷電リンカーを使用できる。
さらに、上記のように、ＣＤＲの同定のために配列表において使用される番号付けはＫａｂａｔであるが、異なる番号付けを使用することができ、それは表２に示されるようにＣＤＲのアミノ酸配列を変化させるであろう。
本明細書に記載されているすべての可変重鎖および軽鎖ドメインについて、さらなるバリアントを作製することができる。本明細書で概説されるように、いくつかの実施形態では、６つのＣＤＲのセットは、０、１、２、３、４または５のアミノ酸修飾（特に使用されるアミノ酸置換による）を有し、ならびに、可変重鎖および軽鎖ドメインのフレームワーク領域であって、このフレームワーク（ＣＤＲを除く）が、図と説明文が組み込まれている米国特許第７，６５７，３８０号の図１に列挙されているもの（その図および説明文は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）から選択されたヒト生殖系列配列と少なくとも約８０、８５、または９０％の同一性を保持している限りにおいてそのフレームワーク領域の変化を、有することができる。したがって、例えば、フレームワーク領域が米国特許第７，６５７，３８０号の図１に列挙されたものから選択されたヒト生殖系列配列と少なくとも８０、８５または９０％の同一性を保持している限り、本明細書に記載の同一のＣＤＲをヒト生殖系列配列由来の異なるフレームワーク配列と組み合わせることができる。代替的に、ＣＤＲは、アミノ酸改変（例えば、ＣＤＲのセットにおいて１、２、３、４、または５個のアミノ酸改変を有し得（すなわち、ＣＤＲは、６個のＣＤＲのセット中の変化の全数が６アミノ酸改変未満である限り、任意の組み合わせのＣＤＲが変更され、例えば、ｖｌＣＤＲ１において１つの変更、ｖｈＣＤＲ２において２つの変更、ｖｈＣＤＲ３において変更がないなどであり得る））、同様に、フレームワーク領域が、米国特許第７，６５７，３８０号の図１に列挙されるものから選択されるヒト生殖細胞系列の配列に対して少なくとも８０、８５、または９０％同一性を保持する限り、フレームワーク領域の変更を有する。
抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、本明細書に記載されているものを含む、任意の適切なＣＤ３ ＡＢＤを含むことができる（例えば、図１０Ａ～１０Ｆを参照されたい）。いくつかの実施形態では、抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体のＣＤ３ ＡＢＤは、図１０Ａ～１０Ｆおよび配列表に記載されるものを含む、本明細書で提供されるＣＤ３ ＡＢＤの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＡＢＤは、以下のＣＤ３結合ドメイン：Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）のうちの１つの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む。例示的な実施形態では、ＣＤ３ ＡＢＤは、以下のＣＤ３結合ドメイン：Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）またはこれらのバリアントのうちの１つのである。
抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、本明細書に記載されているものを含む、任意の適切なＥＮＰＰ３ ＡＢＤを含むことができる（例えば、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉを参照されたい）。いくつかの実施形態では、抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体のＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉならびに配列表に記載されるものを含む、本明細書で提供されるＥＮＰＰ３ ＡＢＤの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、以下のＥＮＰＰ３ ＡＢＤ：ＥＮＰＰ３ ＡＢＤ：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちの１つの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む。例示的な実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、以下のＥＮＰＰ３ ＡＢＤ：ＥＮＰＰ３ ＡＢＤ：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちの１つである。
抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、本明細書に記載されているものを含む、任意の適切なＥＮＰＰ３ ＡＢＤを含むことができる（例えば、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉを参照されたい）。いくつかの実施形態では、抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体のＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉならびに配列表に記載されるものを含む、本明細書で提供されるＥＮＰＰ３ ＡＢＤの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、以下のＥＮＰＰ３ ＡＢＤ：ＥＮＰＰ３ ＡＢＤ：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちの１つの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む。例示的な実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、以下のＥＮＰＰ３ ＡＢＤ：ＥＮＰＰ３ ＡＢＤ：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちの１つである。
Ｆ．抗ＳＳＴＲ２×抗ＣＤ３二重特異性抗体
別の態様では、抗ＳＳＴＲ２×抗ＣＤ３（本明細書では「αＳＳＴＲ２×αＣＤ３」とも称される）二重特異性抗体が本明細書で提供される。そのような抗体は、少なくとも１つのＳＳｔＲ２結合ドメインと少なくとも１つのＣＤ３結合ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性αＳＳＴＲ２×αＣＤ３は、本明細書において、ＳＳＴＲ２を発現する腫瘍部位において選択的に免疫応答を提供した。
別の態様では、抗ＳＳＴＲ２×抗ＣＤ３（本明細書では「αＳＳＴＲ２×αＣＤ３」とも称される）二重特異性抗体が本明細書で提供される。そのような抗体は、少なくとも１つのＳＳｔＲ２結合ドメインと少なくとも１つのＣＤ３結合ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性αＳＳＴＲ２×αＣＤ３は、本明細書において、ＳＳＴＲ２を発現する腫瘍部位において選択的に免疫応答を提供した。
本明細書で指示されていない限り、名前の抗原リストの順序は構造を与えないことに注意されたく、すなわち、ＳＳＴＲ２ＸＣＤ３ １＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体は、ｓｃＦｖをＳＳＴＲ２またはＣＤ３に結合させることができるが、場合によっては、指示されている通りの順序で構造が特定される。
本明細書でより詳細に概説されるように、ＡＢＤのこれらの組み合わせは、以下に概説されるように、一般に一方のＡＢＤがＦａｂ形式であり、他方がｓｃＦｖ形式である組み合わせで、様々な形式であり得る。本明細書で提供される二重特異性抗体で使用される例示的なフォーマットには、１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃおよび２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｖフォーマットが挙げられる（例えば、図１５Ａおよび１５Ｂを参照されたい）。他の有用な抗体フォーマットには、図５２Ａ～５２Ｋに示されるように、「ｍＡｂ－Ｆｖ」、「ｍＡｂ－ｓｃＦｖ」、「セントラル－Ｆｖ」、「ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「ｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「デュアルｓｃＦｖ」、および「トライデント」フォーマットの抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、概して、ＡＢＤのうちの１つは、ＶＨ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬまたはＶＬ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨのＮ末端からＣ末端に向かう方向で、本明細書に概説されるようなｓｃＦｖを含む。フォーマットによれば、他のＡＢＤの一方または両方は、概して、一方のタンパク質鎖上にＶＨドメインを（概して重鎖の構成要素として）およびもう別のタンパク質鎖上にＶＬ（概して軽鎖の構成要素として）を含むＦａｂである。
当業者には理解されるように、６個のＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬドメインの任意のセットはｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットにすることができ、次いでこれを重鎖および軽鎖の定常ドメインに付加し、ここで重鎖定常ドメインは変異（ＣＨ１ドメインおよびＦｃドメイン内を含む）を含む。配列表に含まれるｓｃＦｖ配列は特定の荷電リンカーを利用するが、本明細書に概説されるように、図５および図６に示されるものを含めて、非荷電または他の荷電リンカーを使用できる。
さらに、上記のように、ＣＤＲの同定のために配列表において使用される番号付けはＫａｂａｔであるが、異なる番号付けを使用することができ、それは表２に示されるようにＣＤＲのアミノ酸配列を変化させるであろう。
本明細書に記載されているすべての可変重鎖および軽鎖ドメインについて、さらなるバリアントを作製することができる。本明細書で概説されるように、いくつかの実施形態では、６つのＣＤＲのセットは、０、１、２、３、４または５のアミノ酸修飾（特に使用されるアミノ酸置換による）を有し、ならびに、可変重鎖および軽鎖ドメインのフレームワーク領域であって、このフレームワーク（ＣＤＲを除く）が、図と説明文が組み込まれている米国特許第７，６５７，３８０号の図１に列挙されているもの（その図および説明文は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）から選択されたヒト生殖系列配列と少なくとも約８０、８５、または９０％の同一性を保持している限りにおいてそのフレームワーク領域の変化を、有することができる。したがって、例えば、フレームワーク領域が米国特許第７，６５７，３８０号の図１に列挙されたものから選択されたヒト生殖系列配列と少なくとも８０、８５または９０％の同一性を保持している限り、本明細書に記載の同一のＣＤＲをヒト生殖系列配列由来の異なるフレームワーク配列と組み合わせることができる。代替的に、ＣＤＲは、アミノ酸改変（例えば、ＣＤＲのセットにおいて１、２、３、４、または５個のアミノ酸改変を有し得（すなわち、ＣＤＲは、６個のＣＤＲのセット中の変化の全数が６アミノ酸改変未満である限り、任意の組み合わせのＣＤＲが変更され、例えば、ｖｌＣＤＲ１において１つの変更、ｖｈＣＤＲ２において２つの変更、ｖｈＣＤＲ３において変更がないなどであり得る））、同様に、フレームワーク領域が、米国特許第７，６５７，３８０号の図１に列挙されるものから選択されるヒト生殖細胞系列の配列に対して少なくとも８０、８５、または９０％同一性を保持する限り、フレームワーク領域の変更を有する。
抗ＳＳＴＲ２×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、本明細書に記載されているものを含む、任意の適切なＣＤ３ ＡＢＤを含むことができる（例えば、図１０Ａ～１０Ｆを参照されたい）。いくつかの実施形態では、抗ＳＳＴＲ２×抗ＣＤ３二重特異性抗体のＣＤ３ ＡＢＤは、図１０Ａ～１０Ｆおよび配列表に記載されるものを含む、本明細書で提供されるＣＤ３ ＡＢＤの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＡＢＤは、以下のＣＤ３結合ドメイン：Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）のうちの１つの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む。例示的な実施形態では、ＣＤ３ ＡＢＤは、以下のＣＤ３結合ドメイン：Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）またはこれらのバリアントのうちの１つのである。
抗ＳＳＴＲ２×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、［αＳＳＴＲ２］Ｈ１．２４＿Ｌ１．３０（図６３）の可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメイン、またはそれらのバリアントを含むことができる。
抗ＳＳＴＲ２×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、［αＳＳＴＲ２］Ｈ１．２４＿Ｌ１．３０（図６３）の可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメイン、またはそれらのバリアントを含むことができる。
Ｇ．本発明の有用なフォーマット
当業者には理解され、以下でより詳細に説明するように、概して図１に示すように、本明細書に提供される二重特異性ヘテロ二量体抗体は、多種多様な立体配置をとることができる。いくつかの図は、「シングルエンド型」立体配置を示し、分子の一方の「アーム」には１つのタイプの特異性があり、他方の「アーム」には異なる特異性がある。他の図は、「デュアルエンド型」立体配置を示し、分子の「上部」に少なくとも１つのタイプの特異性があり、分子の「底部」に１つ以上の異なる特異性がある。したがって、いくつかの実施形態では、異なる第１および第２の抗原と同時連結する新規な免疫グロブリン組成物を対象とする。
当業者には理解され、以下でより詳細に説明するように、概して図１に示すように、本明細書に提供される二重特異性ヘテロ二量体抗体は、多種多様な立体配置をとることができる。いくつかの図は、「シングルエンド型」立体配置を示し、分子の一方の「アーム」には１つのタイプの特異性があり、他方の「アーム」には異なる特異性がある。他の図は、「デュアルエンド型」立体配置を示し、分子の「上部」に少なくとも１つのタイプの特異性があり、分子の「底部」に１つ以上の異なる特異性がある。したがって、いくつかの実施形態では、異なる第１および第２の抗原と同時連結する新規な免疫グロブリン組成物を対象とする。
当業者には理解されるように、本発明のヘテロ二量体フォーマットは、異なる価数を有し得るとともに、二重特異性であり得る。すなわち、本明細書に記載の抗体のヘテロ二量体抗体は、二価および二重特異性であり得、一方の標的腫瘍抗原（例えば、ＣＤ３）は１つの結合ドメインによって結合され、他方の標的腫瘍抗原（例えば、ＥＮＰＰ３）は第２の結合ドメインによって結合される。ヘテロ二量体抗体はまた、三価および二重特異性であり得、第１の抗原は２つの結合ドメインによって結合され、第２の抗原は第２の結合ドメインによって結合される。本明細書に概説されるように、ＣＤ３が標的抗原の１つである場合、潜在的な副作用を低減するために、ＣＤ３は一価的のみに結合することが好ましい。
本明細書に記載の抗体は、抗ＣＤ３抗原結合ドメインを抗ＥＮＰＰ３結合ドメインと組み合わせて利用する。当業者によって理解されるように、図のいずれかに示されるような抗ＣＤ３ ＣＤＲ、抗ＣＤ３可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメイン、ＦａｂおよびｓｃＦｖの任意のコレクションを使用することができる。同様に、抗ＥＮＰＰ３抗原結合ドメインのいずれかを使用することができ、図のいずれか（例えば、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）に示されるように、ＣＤＲ、可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメイン、ＦａｂおよびｓｃＦｖのいずれかを、任意に、かつ独立して任意の組み合わせで組み合わせて使用することができる。
１．１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット
本明細書に記載の抗体で特定の用途が見出される１つのヘテロ二量体足場は、図１５Ａに示されるような「１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」または「ボトルオープナー」フォーマットであり、ＣＤ３結合ドメインおよび腫瘍標的抗原（ＥＮＰＰ３）結合ドメインの例示的な組み合わせを伴う。この実施形態では、抗体の１つの重鎖単量体は、単鎖Ｆｖ（以下に定義される「ｓｃＦｖ」）およびＦｃドメインを含む。ｓｃＦｖは、可変重鎖ドメイン（ＶＨ１）および可変軽鎖ドメイン（ＶＬ１）を含み、ＶＨ１は、家電可能なｓｃＦｖリンカーを使用してＶＬ１に結合されている（例えば、図５を参照されたい）。ｓｃＦｖは、ドメインリンカーを使用して重鎖に結合される（例えば、図６を参照されたい）。他の重鎖単量体は「通常の」重鎖（ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）である。１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃは、ＶＨ－ＣＨ１と相互作用してＦａｂを形成する軽鎖も含む。この構造は、ボトルオープナーと視覚的に大まかに似ているため、本明細書では「ボトルオープナー」（フォーマットと称されることがある。２つの重鎖単量体は、以下により詳細に記載されるように、ヘテロ二量体抗体の形成を促進する定常領域（例えば、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジ領域）におけるアミノ酸バリアント（例えば、上述したヘテロ二量体化バリアント）の使用により一緒にされる。
本明細書に記載の抗体で特定の用途が見出される１つのヘテロ二量体足場は、図１５Ａに示されるような「１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」または「ボトルオープナー」フォーマットであり、ＣＤ３結合ドメインおよび腫瘍標的抗原（ＥＮＰＰ３）結合ドメインの例示的な組み合わせを伴う。この実施形態では、抗体の１つの重鎖単量体は、単鎖Ｆｖ（以下に定義される「ｓｃＦｖ」）およびＦｃドメインを含む。ｓｃＦｖは、可変重鎖ドメイン（ＶＨ１）および可変軽鎖ドメイン（ＶＬ１）を含み、ＶＨ１は、家電可能なｓｃＦｖリンカーを使用してＶＬ１に結合されている（例えば、図５を参照されたい）。ｓｃＦｖは、ドメインリンカーを使用して重鎖に結合される（例えば、図６を参照されたい）。他の重鎖単量体は「通常の」重鎖（ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）である。１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃは、ＶＨ－ＣＨ１と相互作用してＦａｂを形成する軽鎖も含む。この構造は、ボトルオープナーと視覚的に大まかに似ているため、本明細書では「ボトルオープナー」（フォーマットと称されることがある。２つの重鎖単量体は、以下により詳細に記載されるように、ヘテロ二量体抗体の形成を促進する定常領域（例えば、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジ領域）におけるアミノ酸バリアント（例えば、上述したヘテロ二量体化バリアント）の使用により一緒にされる。
現在の「１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマットにはいくつかの明確な利点が存在する。当該技術分野で知られているように、２つのｓｃＦｖ構築物に依存する抗体類似体はしばしば安定性および凝集の問題を有し、それは本明細書に記載の抗体において「通常の」重鎖および軽鎖の対形成の付加により軽減できる。さらに、２つの重鎖と２つの軽鎖に依存する形式とは対照的に、重鎖と軽鎖の誤った対合（例えば、重鎖１と軽鎖２の対合など）の問題はない。
本明細書に概説した実施形態の多くは、一般に、ｓｃＦｖリンカー（多くは荷電されているが、すべての場合ではない）を用いて共有連結した可変重鎖および可変軽鎖のドメインを含む、ｓｃＦｖを含む第１の単量体を含む１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃまたは「ボトルオープナー」フォーマット抗体に依存しており、ｓｃＦｖは、第１のＦｃドメインに通常ドメインリンカーを介して共有結合している。ドメインリンカーは、荷電または非荷電であってもよく、外来性または内在性であってもよい（例えば、天然のヒンジドメインのすべてまたは部分）。任意の好適なリンカーを使用して、ｓｃＦｖを第１のＦｃドメインのＮ末端に取り付けることができる。いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは、図６のドメインリンカーから選択される。１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃまたは「ボトルオープナー」フォーマットの第２の単量体は重鎖であり、組成物は軽鎖をさらに含む。
一般に、多くの好ましい実施形態では、ｓｃＦｖは、ＣＤ３に結合するドメインであり、Ｆａｂは、ＥＮＰＰ３結合ドメインを形成する。１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットの例示的な抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体を図１５Ａに示す。１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットの例示的な抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体を、図１７Ａ～１７Ｃおよび図１８Ａ～１８Ｃに示す。
さらに、本明細書に記載の抗体のＦｃドメインは、一般にスキューバリアント（例えば、図３および９に示すようなアミノ酸置換のセットであって、特に有用なスキューバリアントはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ；Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ；Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意に除去バリアント（図３に示すものを含む）、任意選択的に荷電ｓｃＦｖリンカー（図５に示すものを含む）を含み、および重鎖はｐＩバリアント（図４に示すものを含む）を含む。
特定の実施形態では、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ足場フォーマットは、ｓｃＦｖドメインリンカー－ＣＨ２－ＣＨ３単量体を含む第１の単量体、第１の可変重鎖ドメイン－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第２の単量体、および第１の可変軽鎖ドメインを含む第３の単量体を含む。いくつかの実施形態では、第１の単量体のＣＨ２－ＣＨ３は、第１のバリアントＦｃドメインであり、第２の単量体のＣＨ２－ＣＨ３は、第２のバリアントＦｃドメインである。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ＣＤ３結合部分を形成するｓｃＦｖ可変重鎖ドメインおよびｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖ可変重鎖ドメインおよびｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインは、ｓｃＦｖリンカー（すべてではないが多くの場合、荷電している）を使用して共有結合している。例えば、図５を参照されたい。いくつかの実施形態では、第１の可変重鎖ドメインおよび第１可変軽鎖ドメインは、ＥＮＰＰ３結合ドメインを形成する。１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－ＦｃのＥＮＰＰ３×ＣＤ３二重特異性抗体フォーマットで使用するための特に有用なＥＮＰＰ３とＣＤ３との組み合わせは、図１７Ａ～１７Ｃおよび図１８Ａ～１８Ｃに開示されており、ＥＮＰＰ３ Ｈ１６－１．９３×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ Ｈ１６－７．８×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、およびＥＮＰＰ３ ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３×ＣＤ２ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、およびＥＮＰＰ３ Ｈ１。８ Ｌ１．７７×ＣＤ３ Ｈ．１３０ Ｌ１．４７が含まれる。いくつかの実施形態では、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットは、スキューバリアント、ｐＩバリアント、および除去バリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットであって、ａ）荷電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では図５の＋Ｈ配列が好ましい）、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および本明細書で概説するＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および可変軽鎖ドメインと一緒に、本明細書に概説する第２の抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）と、ｃ）可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）および定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖と、を含む、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットを含み、ここで、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインは、ＥＮＰＰ３結合部分を構成する。これらの実施形態において特定の用途を見出すＣＤ３結合ドメイン配列としては、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１ならびに図１０Ａ～１０Ｆに示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。これらの実施形態において特定の用途があるＥＮＰＰ３結合ドメイン配列としては、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。１＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体と使用するための特に有用なＥＮＰＰ３とＣＤ３配列との組み合わせは、例えば、ＥＮＰＰ３ Ｈ１６－１．９３×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ Ｈ１６－７．８×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、およびＥＮＰＰ３ Ｈ１．８ Ｌ１．７７×ＣＤ３ Ｈ．１３０ Ｌ１．４７が挙げられる。
ＣＤ３に結合するｓｃＦｖの例示的な可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインが、図１０Ａ～１０Ｆに含まれている。ＥＮＰＰ３に結合するＦｖの例示的な可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインが、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに含まれている。例示的な実施形態では、１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－ＦｃのＥＮＰＰ３×ＣＤ３二重特異性抗体のＥＮＰＰ３結合ドメインは、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちの１つのＶＨおよびＶＬを含む。一実施形態では、１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－ＦｃのＥＮＰＰ３×ＣＤ３二重特異性抗体のＣＤ３結合ドメインは、以下のＣＤ３結合ドメイン：Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）のうちの１つのＶＨおよびＶＬを含む。１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－ＦｃのＥＮＰＰ３×ＣＤ３二重特異性抗体フォーマットで使用するための特に有用なＥＮＰＰ３とＣＤ３との組み合わせは、図１７Ａ～１７Ｃおよび図１８Ａ～１８Ｃに開示されており、ＥＮＰＰ３ Ｈ１６－１．９３×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ Ｈ１６－７．８×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、およびＥＮＰＰ３ Ｈ１．８ Ｌ１．７７×ＣＤ３ Ｈ．１３０ Ｌ１．４７が含まれる。
いくつかの実施形態では、１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットは、スキューバリアント、ｐＩバリアント、除去バリアントおよびＦｃＲｎバリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットであって、ａ）荷電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では図６の＋Ｈ配列が好ましい）、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓおよび本明細書で概説するＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および可変重鎖ドメインを含む第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）と、ｃ）可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）および定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖と、を含む、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットを含み、ここで、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインは、ＥＮＰＰ３結合ドメインを構成する。これらの実施形態において特定の用途を見出すＣＤ３結合ドメイン配列としては、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１ならびに図１０Ａ～１０Ｆに示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。これらの実施形態において特定の用途があるＥＮＰＰ３結合ドメイン配列としては、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されるような）が挙げられるが、これらに限定されない。１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットの抗体で使用するために特異に有用なＥＮＰＰ３ およびＣＤ３配列の組み合わせは、例えば、図１７Ａ～１７Ｃおよび図１８Ａ～１８Ｃに開示されており、ＥＮＰＰ３ Ｈ１６－１．９３×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ Ｈ１６－７．８×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、およびＥＮＰＰ３ Ｈ１．８ Ｌ１．７７×ＣＤ３ Ｈ．１３０ Ｌ１．４７が含まれる。
図７Ａ～７Ｄは、１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体で有用ないくつかの例示的なＦｃドメイン配列を示している。図７Ａ～７Ｄに示される「単量体１」配列は、通常、「Ｆａｂ－Ｆｃ重鎖」のＦｃドメインを指し、「単量体２」配列は、「ｓｃＦｖ－Ｆｃ重鎖」のＦｃドメインを指す。さらに、図９は、このフォーマットで使用できる有用なＣＬ配列を示している。
いくつかの実施形態では、本明細書に示されるＶＨおよびＶＬ配列のいずれか（図および配列表に示されるすべてのＶＨおよびＶＬ配列を含み、ＥＮＰＰ３に向けられたものを含む）は、図７Ａ～７Ｄのボトルオープナー骨格フォーマットに、図および配列表に示されている抗ＣＤ３ｓｃＦｖ配列のいずれかを使用して、「Ｆａｂ側」として付加することができる。
図７Ａからのボトルオープナー骨格１（任意に４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを含む）の場合、これらの実施形態で特定の用途を見出すＣＤ結合ドメイン配列としては、ＣＤ３結合ドメイン抗ＣＤ３ Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７および抗ＣＤ３ Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、ならびに図７Ａ～７Ｄに示した骨格のｓｃＦｖ側として取り付けられた、図１０Ａ～１０Ｆに示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
使用するのに特に有用なＥＮＰＰ３およびＣＤ３配列の組み合わせ（任意に４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを含む）は、図１７Ａ～１７Ｃおよび図１８Ａ～１８Ｃに開示されている。
２．ｍＡｂ－Ｆｖ
本明細書に記載の抗体において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、ｍＡｂ－Ｆｖフォーマットである。この実施形態では、フォーマットは、「追加の」可変重鎖ドメインの１つの単量体へのＣ末端結合と、「追加の」可変軽鎖ドメインのもう一方の単量体へのＣ末端結合の使用に依存し、これにより第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は、ＥＮＰＰ３に結合し、「追加の」ｓｃＦｖドメインはＣＤ３に結合する。
本明細書に記載の抗体において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、ｍＡｂ－Ｆｖフォーマットである。この実施形態では、フォーマットは、「追加の」可変重鎖ドメインの１つの単量体へのＣ末端結合と、「追加の」可変軽鎖ドメインのもう一方の単量体へのＣ末端結合の使用に依存し、これにより第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は、ＥＮＰＰ３に結合し、「追加の」ｓｃＦｖドメインはＣＤ３に結合する。
この実施形態では、第１の単量体は、第１の可変重鎖ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖ドメインを含む第１の重鎖を含み、ドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＣ末端に共有結合されている第１の可変軽鎖ドメインを有する（ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－［任意のリンカー］－ＶＬ２）。第２の単量体は、第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖ドメインの第２の可変重鎖ドメインと、ドメインリンカーを使用して第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合されている第３の可変重鎖ドメインを含む（ｖｈ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－［任意選択的なリンカー］－ＶＨ２。２つのＣ末端に結合した可変ドメインは、ＣＤ３に結合するＦｖを構成する（２価のＣＤ３結合を有することはあまり好ましくないため）。この実施形態はさらに、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖を利用し、これらは重鎖と会合してＥＮＰＰ３に連結する２つの同一のＦａｂを形成する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらの構築物には、本明細書で所望され、説明されるように、スキューバリアント、ｐＩバリアント、除去バリアント、追加のＦｃバリアントなどが含まれる。
本明細書に記載の抗体は、ＣＤ３結合ドメイン配列が図１０Ａ～１０Ｆに示されているようなｍＡｂ－Ｆｖフォーマットを提供する。本明細書に記載の抗体は、ＥＮＰＰ３結合ドメイン配列が図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されているようなｍＡｂ－Ｆｖフォーマットを提供する。
さらに、ｍＡｂ－Ｆｖ形式のＦｃドメインは、スキューバリアント（例えば、図３および８に示すようなアミノ酸置換のセットであって、特に有用なスキューバリアントはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択的に除去バリアント（図３に示すものを含む）、任意選択的に荷電ｓｃＦｖリンカー（図５に示すものを含む）を含み、および重鎖はｐＩバリアントを含む（図２に示すものを含む）。
いくつかの実施形態では、ｍＡｂ－Ｆｖ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、および除去バリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、ｍＡｂ－Ｆｖフォーマットであって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインと一緒にＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメインおよび第２の可変重鎖ドメインを含む、第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに第１の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書に概説されるようにＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメインおよび、第２の可変重鎖ドメインと一緒になってＣＤ３に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第２の可変軽鎖を含む、第２の単量体と、ｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖と、を含む、ｍＡｂ－Ｆｖフォーマット、を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＡｂ－Ｆｖ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、除去バリアントおよびＦｃＲｎバリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、ｍＡｂ－Ｆｖフォーマットであって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインと一緒に抗原に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の可変重鎖ドメインを含む、第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに第１の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説するＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメインおよび、第１の単量体の第２の可変重鎖ドメインと一緒になってＣＤ３に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第２の可変軽鎖を含む、第２の単量体と、ｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖と、を含む、ｍＡｂ－Ｆｖフォーマットを含む。
３．ｍＡｂ－ｓｃＦｖ
本明細書に記載の抗体において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマットである。この実施形態では、フォーマットは、単量体のうちの１つへのｓｃＦｖのＣ末端結合の使用に依存し、これにより第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分はＥＮＰＰ３に結合しおよび「追加の」ｓｃＦｖドメインはＣＤ３に結合する。したがって、第１の単量体は、第１の重鎖（可変重鎖ドメインと定常ドメインを含む）を含み、いずれかの向きでｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、およびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含む、Ｃ末端で共有結合されたｓｃＦｖを有する（ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－［任意選択的なリンカー］－ＶＨ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬ２またはＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－［任意のリンカー］－ＶＬ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨ２）。この実施形態はさらに、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖を利用し、これらは重鎖と会合してＥＮＰＰ３に連結する２つの同一のＦａｂを形成する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらの構築物には、本明細書で所望され、説明されるように、スキューバリアント、ｐＩバリアント、除去バリアント、追加のＦｃバリアントなどが含まれる。
本明細書に記載の抗体において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマットである。この実施形態では、フォーマットは、単量体のうちの１つへのｓｃＦｖのＣ末端結合の使用に依存し、これにより第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分はＥＮＰＰ３に結合しおよび「追加の」ｓｃＦｖドメインはＣＤ３に結合する。したがって、第１の単量体は、第１の重鎖（可変重鎖ドメインと定常ドメインを含む）を含み、いずれかの向きでｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、およびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含む、Ｃ末端で共有結合されたｓｃＦｖを有する（ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－［任意選択的なリンカー］－ＶＨ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬ２またはＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－［任意のリンカー］－ＶＬ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨ２）。この実施形態はさらに、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖を利用し、これらは重鎖と会合してＥＮＰＰ３に連結する２つの同一のＦａｂを形成する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらの構築物には、本明細書で所望され、説明されるように、スキューバリアント、ｐＩバリアント、除去バリアント、追加のＦｃバリアントなどが含まれる。
本明細書に記載の抗体は、ＣＤ結合ドメイン配列が図１０Ａ～１０Ｆに示され、ＥＮＰＰ３結合ドメイン配列が図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されるようなｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマットを提供する。
さらに、セントラルｓｃＦｖフォーマットのＦｃドメインは、スキューバリアント（例えば、図１に示すようなアミノ酸置換のセットであって、特に有用なスキューバリアントはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意に除去バリアント（図３に示すものを含む）、任意に荷電ｓｃＦｖリンカー（図５に示すものを含む）を含み、および重鎖はｐＩバリアントを含む（図２に示すものを含む）。
いくつかの実施形態では、ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマットは、スキューバリアント、ｐＩバリアント、および除去バリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマットであって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに共通軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるようにＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインを含む、第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに共通軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるようにＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む、第２の単量体と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖と、を含む、ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマット、を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマットは、スキューバリアント、ｐＩバリアント、除去バリアントおよびＦｃＲｎバリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマットであって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに共通軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるようにＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインを含む、第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに共通軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるようにＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む、第２の単量体と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖と、を含む、ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマット、を含む。
４．２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット
本明細書に記載の抗体で特定の用途が見出される１つのヘテロ二量体足場は、ＣＤ３結合ドメインと２つの腫瘍標的抗原（ＥＮＰＰ３）結合ドメインとの例示的な組み合わせで図１５Ｂに示される「２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマット（以前の関連するファイリングでは「セントラル－ｓｃＦｖフォーマット」とも呼ばれる）である。この実施形態では、フォーマットは、挿入されたｓｃＦｖドメインの使用に依存し、これにより第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分はＥＮＰＰ３に結合し、「追加の」ｓｃＦｖドメインはＣＤ３に結合する。ｓｃＦｖドメインは、単量体のうちの１つのＦｃドメインとＣＨ１－Ｆｖ領域の間に挿入され、これにより第３の抗原結合ドメインを提供する。説明したように、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットを有するＥＮＰＰ３×ＣＤ３二重特異性抗体は、低レベルのＥＮＰＰ３を発現する細胞環境でリダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性を誘導するのに強力である。さらに、例に示されているように、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットを有するＥＮＰＰ３×ＣＤ３二重特異性抗体は、そのような抗体が使用されるＥＮＰＰ３および／またはＣＤ３結合ドメインに応じて、多種多様な異なる特性を示すので、免疫応答の「微調整」を可能にする。例えば、そのような抗体は、異なるＥＮＰＰ３発現を有する細胞に対する選択性、ＥＮＰＰ３発現細胞に対する効力、サイトカイン放出を誘発する能力、および可溶性ＥＮＰＰ３に対する感受性の違いを示す。これらのＥＮＰＰ３抗体は、例えば、ＥＮＰＰ３関連癌の治療に使用される。
本明細書に記載の抗体で特定の用途が見出される１つのヘテロ二量体足場は、ＣＤ３結合ドメインと２つの腫瘍標的抗原（ＥＮＰＰ３）結合ドメインとの例示的な組み合わせで図１５Ｂに示される「２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマット（以前の関連するファイリングでは「セントラル－ｓｃＦｖフォーマット」とも呼ばれる）である。この実施形態では、フォーマットは、挿入されたｓｃＦｖドメインの使用に依存し、これにより第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分はＥＮＰＰ３に結合し、「追加の」ｓｃＦｖドメインはＣＤ３に結合する。ｓｃＦｖドメインは、単量体のうちの１つのＦｃドメインとＣＨ１－Ｆｖ領域の間に挿入され、これにより第３の抗原結合ドメインを提供する。説明したように、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットを有するＥＮＰＰ３×ＣＤ３二重特異性抗体は、低レベルのＥＮＰＰ３を発現する細胞環境でリダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性を誘導するのに強力である。さらに、例に示されているように、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットを有するＥＮＰＰ３×ＣＤ３二重特異性抗体は、そのような抗体が使用されるＥＮＰＰ３および／またはＣＤ３結合ドメインに応じて、多種多様な異なる特性を示すので、免疫応答の「微調整」を可能にする。例えば、そのような抗体は、異なるＥＮＰＰ３発現を有する細胞に対する選択性、ＥＮＰＰ３発現細胞に対する効力、サイトカイン放出を誘発する能力、および可溶性ＥＮＰＰ３に対する感受性の違いを示す。これらのＥＮＰＰ３抗体は、例えば、ＥＮＰＰ３関連癌の治療に使用される。
この実施形態では、１つの単量体は、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン（および任意選択的なヒンジ）およびＦｃドメインを含む第１重鎖を含み、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むｓｃＦｖを有する。ｓｃＦｖは、任意選択的なドメインリンカーを使用して、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端の間に共有結合している（ＶＨ１－ＣＨ１－［任意のリンカー］－ＶＨ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬ２－［ヒンジを含む任意のリンカー］－ＣＨ２－ＣＨ３、またはｓｃＦｖに対して反対方向の、ＶＨ１－ＣＨ１－［任意のリンカー］－ＶＬ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨ２－［ヒンジを含む任意のリンカー］－ＣＨ２－ＣＨ３）。任意のリンカーは、例えば、図６に含まれるドメインリンカーを含む、任意の好適なペプチドリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、任意のリンカーはヒンジまたはその断片である。他の単量体は、標準的なＦａｂ側（例えば、ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）である。この実施形態はさらに、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖を利用し、これらは重鎖と会合してＥＮＰＰ３に結合する２つの同一のＦａｂを形成する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらの構築物には、本明細書で所望され、説明されるように、スキューバリアント、ｐＩバリアント、除去バリアント、追加のＦｃバリアントなどが含まれる。
一実施形態では、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体は、図１０Ａ～１０Ｆまたは配列表に示されるＣＤ３結合ドメイン配列のＶＨおよびＶＬを有するｓｃＦｖを含む。一実施形態では、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体は、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉまたは配列表に示されるＥＮＰＰ３結合ドメインのＶＨおよびＶＬを有する２つのｓｃＦｖを含む。例示的な実施形態では、２＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－ＦｃのＥＮＰＰ３×ＣＤ３二重特異性抗体のＥＮＰＰ３結合ドメインは、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちの１つのＶＨおよびＶＬを含む。一実施形態では、２＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－ＦｃのＥＮＰＰ３×ＣＤ３二重特異性抗体のＣＤ３結合ドメインは、以下のＣＤ３結合ドメイン：Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）のうちの１つのＶＨおよびＶＬを含む。２＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体フォーマットで使用するための特に有用なＥＮＰＰ３とＣＤ３との組み合わせは、図１９Ａ～１９Ｃ、２０Ａ～Ｄ、２１、２２Ａ～２２Ｃ、２３Ａ～Ｅに開示されており、ＥＮＰＰ３ Ｈ１．８ Ｌ１×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ Ｈ１．８ Ｌ１．３３×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ Ｈ１．８ Ｌ１．７７×ＣＤ３ Ｈ１．３０ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ Ｈ１６－７．８×ＣＤ３ Ｈ１．３２ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ ＡＮ［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１×ＣＤ３ Ｈ１．３２ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ Ｈ１．８ Ｌ１×ＣＤ３ Ｈ１．３２ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ Ｈ１．８ Ｌ１．３３×ＣＤ３ Ｈ１．３２ Ｌ１．４７、ＥＮＰＰ３ Ｈ１．８ Ｌ１×ＣＤ３ Ｌ１．４７ Ｈ１．３０、ＥＮＰＰ３ Ｈ１．８ Ｌ１×ＣＤ３ Ｌ１．４７ Ｈ１．３２、ＥＮＰＰ３ Ｈ１．８ Ｌ１．３３×ＣＤ３ Ｌ１．４７ Ｈ１．３２、ＥＮＰＰ３ Ｈ１．８ Ｌ１．７７×ＣＤ３ Ｌ１．４７ Ｈ１．３２、ＥＮＰＰ３ Ｈ１．８ Ｌ１×ＣＤ３ Ｌ１．４７ Ｈ１．８９、ＥＮＰＰ３ Ｈ１．８ Ｌ１．３３×ＣＤ３ Ｌ１．４７ Ｈ１．８９、ＥＮＰＰ３ Ｈ１．８ Ｌ１．７７×ＣＤ３ Ｌ１．４７ Ｈ１．８９、ＥＮＰＰ３ Ｈ１．８ Ｌ１．３３×ＣＤ３ Ｌ１．４７ Ｈ１．８９、およびＥＮＰＰ３ Ｈ１．８ Ｌ１．７７×ＣＤ３ Ｌ１．４７ Ｈ１．８９が挙げられる。
さらに、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－ＦｃフォーマットのＦｃドメインは、スキューバリアント（例えば、図１に示すようなアミノ酸置換のセットであって、特に有用なスキューバリアントはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意に除去バリアント（図３に示すものを含む）、任意に荷電ｓｃＦｖリンカー（図５に示すものを含む）を含み、および重鎖はｐＩバリアントを含む（図２に示すものを含む）。
いくつかの実施形態では、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、および除去バリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットであって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに共通軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるようにＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインを含む、第１の単量体（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ側）と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに共通軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるようにＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む、第２の単量体（Ｆａｂ－Ｆｃ側）と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖と、を含む、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット、を含み、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３結合ドメインのための各単量体上の共通軽鎖および可変の重鎖ドメインである。これらの実施形態において特定の用途を見出すＣＤ３結合ドメイン配列としては、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１ならびに図１０Ａ～１０Ｆに示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。これらの実施形態において特定の用途があるＥＮＰＰ３結合ドメイン配列としては、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されるような）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、１＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、除去バリアントおよびＦｃＲｎバリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットであって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓならびに共通軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるようにＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインを含む、第１の単量体（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ側）と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓならびに共通軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるようにＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む、第２の単量体（Ｆａｂ－Ｆｃ側）と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖と、を含む、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット、を含み、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３結合ドメインのための各単量体上の共通軽鎖および可変の重鎖ドメインである。これらの実施形態において特定の用途を見出すＣＤ３結合ドメイン配列としては、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１ならびに図１０Ａ～１０Ｆに示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。これらの実施形態において特定の用途があるＥＮＰＰ３結合ドメイン配列としては、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されるような）が挙げられるが、これらに限定されない。
図８Ａ～８Ｃは、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで有用ないくつかの例示的なＦｃドメイン配列を示している。図８Ａ～８Ｃに示される「単量体１」配列は、通常、「Ｆａｂ－Ｆｃ重鎖」のＦｃドメインを指し、「単量体２」配列は、「Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ重鎖」のＦｃドメインを指す。さらに、図９は、このフォーマットで使用できる有用なＣＬ配列を示している。
５．セントラル－Ｆｖ
本明細書に記載の抗体において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、セントラル－Ｆｖフォーマットである。この実施形態では、フォーマットは、挿入されたＦｖドメイン（すなわち、セントラルＦｖドメイン）の使用に依存し、これにより「追加の」第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分はＥＮＰＰ３に結合し、「追加の」セントラルＦｖドメインはＣＤ３に結合する。「追加の」セントラルＦｖドメインは、単量体のＦｃドメインとＣＨ１－Ｆｖ領域との間に挿入され、したがって第３の抗原結合ドメイン（すなわち、「追加の」セントラルＦｖドメイン）を提供し、ここで各単量体は「追加の」セントラルＦｖドメインの構成要素を含む（すなわち、一方の単量体は可変重鎖ドメインを含み、他方は「追加の」中央Ｆｖドメインのドメインの可変軽鎖を含む）。
本明細書に記載の抗体において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、セントラル－Ｆｖフォーマットである。この実施形態では、フォーマットは、挿入されたＦｖドメイン（すなわち、セントラルＦｖドメイン）の使用に依存し、これにより「追加の」第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分はＥＮＰＰ３に結合し、「追加の」セントラルＦｖドメインはＣＤ３に結合する。「追加の」セントラルＦｖドメインは、単量体のＦｃドメインとＣＨ１－Ｆｖ領域との間に挿入され、したがって第３の抗原結合ドメイン（すなわち、「追加の」セントラルＦｖドメイン）を提供し、ここで各単量体は「追加の」セントラルＦｖドメインの構成要素を含む（すなわち、一方の単量体は可変重鎖ドメインを含み、他方は「追加の」中央Ｆｖドメインのドメインの可変軽鎖を含む）。
この実施形態では、１つの単量体は、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＦｃドメインを含む第１の重鎖ならびに追加の可変軽鎖ドメインを含む。軽鎖ドメインは、ドメインリンカーを使用して、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端の間に共有結合している（ＶＨ１－ＣＨ１－［任意のリンカー］－ＶＬ２－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）。もう１つの単量体は、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含む第１の重鎖ならびに追加の可変重鎖ドメインを含む（ＶＨ１－ＣＨ１－［任意のリンカー］－ＶＨ２－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）。軽鎖ドメインは、ドメインリンカーを使用して、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端の間に共有結合している。
この実施形態は、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖を利用し、これは重鎖と会合して各々がＥＮＰＰ３に結合する２つの同一のＦａｂを形成する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらの構築物には、本明細書で所望され、説明されるように、スキューバリアント、ｐＩバリアント、除去バリアント、追加のＦｃバリアントなどが含まれる。
本明細書に記載の抗体は、ＣＤ３結合ドメイン配列が図１０Ａ～１０Ｆに示され、ＥＮＰＰ３結合ドメイン配列が図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されるようなセントラル－ｓｃＦｖフォーマットを提供する。
６．１アームの中央－ｓｃＦｖ
本明細書に記載の抗体において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、ワンアームセントラル－ｓｃＦｖフォーマットである。この実施形態では、一方の単量体はＦｃドメインのみを含み、他方の単量体はＦａｂドメイン（第１の抗原連結ドメイン）、ｓｃＦｖドメイン（第２の抗原連結ドメイン）、およびＦｃドメインを含み、ここでｓｃＦｖドメインはＦｃドメインとＦｃドメインの間に挿入されている。このフォーマットでは、Ｆａｂ部分は１つの受容体標的に連結し、ｓｃＦｖは別のものに連結する。このフォーマットでは、Ｆａｂ部分がＥＮＰＰ３に結合し、ｓｃＦｖがＣＤ３に結合するか、またはその逆である。
本明細書に記載の抗体において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、ワンアームセントラル－ｓｃＦｖフォーマットである。この実施形態では、一方の単量体はＦｃドメインのみを含み、他方の単量体はＦａｂドメイン（第１の抗原連結ドメイン）、ｓｃＦｖドメイン（第２の抗原連結ドメイン）、およびＦｃドメインを含み、ここでｓｃＦｖドメインはＦｃドメインとＦｃドメインの間に挿入されている。このフォーマットでは、Ｆａｂ部分は１つの受容体標的に連結し、ｓｃＦｖは別のものに連結する。このフォーマットでは、Ｆａｂ部分がＥＮＰＰ３に結合し、ｓｃＦｖがＣＤ３に結合するか、またはその逆である。
この実施形態では、１つの単量体は、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含む第１の重鎖を含み、ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含む。ｓｃＦｖは、ＶＨ１－ＣＨ１－［任意のドメインリンカー］－ＶＨ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬ２－［任意のドメインリンカー］－ＣＨ２－ＣＨ３、または、ＶＨ１－ＣＨ１－［任意のドメインリンカー］－ＶＬ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨ２－［任意のドメインリンカー］－ＣＨ２－ＣＨ３のいずれかの配向で、ドメインリンカーを使用して、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有結合している。第２の単量体は、Ｆｃドメイン（ＣＨ２－ＣＨ３）を含む。この実施形態はさらに重鎖と会合してＦａｂを形成する可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を利用する。
本明細書の実施形態の多くに関して、これらの構築物には、本明細書で所望され、説明されるように、スキューバリアント、ｐＩバリアント、除去バリアント、追加のＦｃバリアントなどが含まれる。
本明細書に記載の抗体は、ＣＤ３結合ドメイン配列が図１０Ａ～１０Ｆに示され、ＥＮＰＰ３結合ドメイン配列が図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されるようなセントラル－ｓｃＦｖフォーマットを提供する。
さらに、ワンアームセントラルｓｃＦｖ形式のＦｃドメインには、一般にスキューバリアント（例えば、図３１に示すようなアミノ酸置換のセットであって、特に有用なスキューバリアントはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択的に除去バリアント（図３に示すものを含む）、任意選択的に荷電ｓｃＦｖリンカー（図５に示すものを含む）が含まれ、および重鎖はｐＩバリアント（図２に示すものを含む）を含む。
いくつかの実施形態では、ワンアームセントラルｓｃＦｖフォーマットは、スキューバリアント、ｐＩバリアント、および除去バリアントを含む。したがって、ワンアームセントラルｓｃＦｖフォーマットのいくつかの実施形態は、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に、本明細書に概説されるようにＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインを含む、第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含むＦｃドメインを含む、第２の単量体と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖と、を含む。
いくつかの実施形態では、ワンアームセントラルｓｃＦｖフォーマットは、スキューバリアント、ｐＩバリアント、除去バリアントおよびＦｃＲｎバリアントを含む。したがって、ワンアームセントラルｓｃＦｖフォーマットのいくつかの実施形態は、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に、本明細書に概説されるようにＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインを含む、第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、およびＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを有する、Ｆｃドメインを含む、第２の単量体と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖と、を含む。
７．ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂ
本明細書に記載の抗体において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂフォーマットである。この実施形態では、一方の単量体はＦｃドメインのみを含み、他方の単量体は、一般にリンカーの使用を通じて、重鎖のＮ末端に結合したｓｃＦｖドメインを使用する。ＶＨ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬ－［任意のドメインリンカー］－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３または（反対方向）ＶＬ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨ－［任意のドメインリンカー］－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３。このフォーマットでは、Ｆａｂ部分はそれぞれＥＮＰＰ３に結合し、ｓｃＦｖはＣＤ３に結合する。この実施形態はさらに、重鎖と会合してＦａｂを形成する可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらの構築物には、本明細書で所望され、説明されるように、スキューバリアント、ｐＩバリアント、除去バリアント、追加のＦｃバリアントなどが含まれる。
本明細書に記載の抗体において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂフォーマットである。この実施形態では、一方の単量体はＦｃドメインのみを含み、他方の単量体は、一般にリンカーの使用を通じて、重鎖のＮ末端に結合したｓｃＦｖドメインを使用する。ＶＨ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬ－［任意のドメインリンカー］－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３または（反対方向）ＶＬ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨ－［任意のドメインリンカー］－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３。このフォーマットでは、Ｆａｂ部分はそれぞれＥＮＰＰ３に結合し、ｓｃＦｖはＣＤ３に結合する。この実施形態はさらに、重鎖と会合してＦａｂを形成する可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらの構築物には、本明細書で所望され、説明されるように、スキューバリアント、ｐＩバリアント、除去バリアント、追加のＦｃバリアントなどが含まれる。
本明細書に記載の抗体は、ＣＤ３結合ドメイン配列が図１０Ａ～１０Ｆに示され、ＥＮＰＰ３結合ドメイン配列が図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されるようなワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂフォーマットを提供する。
さらに、ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂフォーマットのＦｃドメインには、一般にスキューバリアント（例えば、図３および８に示すようなアミノ酸置換のセットであって、特に有用なスキューバリアントはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択的に除去バリアント（図３に示すものを含む）、任意選択的に荷電ｓｃＦｖリンカー（図５に示すものを含む）が含まれ、および重鎖はｐＩバリアント（図２に示すものを含む）を含む。
いくつかの実施形態では、ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂフォーマットは、スキューバリアント、ｐＩバリアント、および除去バリアントを含む。したがって、ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂフォーマットのいくつかの実施形態は、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に、本明細書に概説されるように標的抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインを含む第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを有する、Ｆｃドメインを含む、第２の単量体と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖と、を含む。
いくつかの実施形態では、ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂフォーマットは、スキューバリアント、ｐＩバリアント、除去バリアントおよびＦｃＲｎバリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態のワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂフォーマットは、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に、本明細書に概説されるようにＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインを含む第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７ＫおよびＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを有する、Ｆｃドメインを含む、第２の単量体と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖と、を含む。
８．ｓｃＦｖ０ｍＡｂ
本明細書に記載の抗体において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマットである。この実施形態では、フォーマットは、単量体のうちの１つへのｓｃＦｖのＮ末端結合の使用に依存し、これにより第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分はＥＮＰＰ３に結合しおよび「追加の」ｓｃＦｖドメインはＣＤ３に結合する。
本明細書に記載の抗体において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマットである。この実施形態では、フォーマットは、単量体のうちの１つへのｓｃＦｖのＮ末端結合の使用に依存し、これにより第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分はＥＮＰＰ３に結合しおよび「追加の」ｓｃＦｖドメインはＣＤ３に結合する。
この実施形態では、第１の単量体は、いずれかの配向で、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むＮ末端共有連結ｓｃＦｖを有する第１の重鎖（可変重鎖ドメインおよび定常ドメインを含む）を含む（（ＶＨ１－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬ１－［任意のドメインリンカー］－ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）または（反対の配向のｓｃＦｖとともに）（（ＶＬ１－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨ１－［任意のドメインリンカー］－ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３））。この実施形態はさらに、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖を利用し、これらは重鎖と会合してＥＮＰＰ３に連結する２つの同一のＦａｂを形成する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらの構築物には、本明細書で所望され、説明されるように、スキューバリアント、ｐＩバリアント、除去バリアント、追加のＦｃバリアントなどが含まれる。
本明細書に記載の抗体は、ＣＤ３結合ドメイン配列が図１０Ａ～１０Ｆに示され、ＥＮＰＰ３結合ドメイン配列が図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されるようなｓｃＦｖ－ｍＡｂフォーマットを提供する。
さらに、ｓｃＦｖ－ｍＡｂ形式のＦｃドメインは、一般にスキューバリアント（例えば、図１に示すようなアミノ酸置換のセットであって、特に有用なスキューバリアントはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択的に除去バリアント（図３に示すものを含む）、任意選択的に荷電ｓｃＦｖリンカー（図５に示すものを含む）を含み、および重鎖はｐＩバリアント（図２に示すものを含む）を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ－ｍＡｂ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、および除去バリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、ｓｃＦｖ－ｍＡｂフォーマットであって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに共通軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるようにＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインを含む、第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに共通軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるようにＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む、第２の単量体と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖と、を含む、ｓｃＦｖ－ｍＡｂフォーマット、を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ－ｍＡｂ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、除去バリアントおよびＦｃＲｎバリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、ｓｃＦｖ－ｍＡｂフォーマットであって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに共通軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるようにＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインを含む、第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに共通軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるようにＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む、第２の単量体と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖と、を含む、ｓｃＦｖ－ｍＡｂフォーマット、を含む。
９．デュアルｓｃＦｖフォーマット
本明細書に記載の抗体はまた、当技術分野で知られているように、デュアルｓｃＦｖフォーマットを提供する。この実施形態では、ＥＮＰＰ３×ＣＤ３ヘテロ二量体二重特異性抗体は、２つのｓｃＦｖ－Ｆｃ単量体（両方とも（ＶＨ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬ－［任意のドメインリンカー］－ＣＨ２－ＣＨ３）形式または（ＶＬ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨ－［任意のドメインリンカー］－ＣＨ２－ＣＨ３）形式のいずれかで、あるいは一方の単量体を一方の方向に、もう一方を他方の方向にして構成される。
本明細書に記載の抗体はまた、当技術分野で知られているように、デュアルｓｃＦｖフォーマットを提供する。この実施形態では、ＥＮＰＰ３×ＣＤ３ヘテロ二量体二重特異性抗体は、２つのｓｃＦｖ－Ｆｃ単量体（両方とも（ＶＨ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬ－［任意のドメインリンカー］－ＣＨ２－ＣＨ３）形式または（ＶＬ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨ－［任意のドメインリンカー］－ＣＨ２－ＣＨ３）形式のいずれかで、あるいは一方の単量体を一方の方向に、もう一方を他方の方向にして構成される。
本明細書に記載の抗体は、ＣＤ３結合ドメイン配列が図１０Ａ～１０Ｆに示され、ＥＮＰＰ３結合ドメイン配列が図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されるようなデュアルｓｃＦｖフォーマットを提供する。いくつかの実施形態では、デュアルｓｃＦｖ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、および除去バリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、デュアルｓｃＦｖフォーマットであって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、およびＣＤ３またはＥＮＰＰ３のいずれかに結合する第１のｓｃＦｖを含む、第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントを含む、第２の単量体と、を含むデュアルｓｃＦｖフォーマットを含む。
Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、およびＣＤ３またはＥＮＰＰ３のいずれかに結合する第２のｓｃＦｖ。いくつか実施形態では、デュアルｓｃＦｖ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、除去バリアントおよびＦｃＲｎバリアントを含む。いくつかの実施形態では、デュアルｓｃＦｖ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、および除去バリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、デュアルｓｃＦｖフォーマットであって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、およびＣＤ３またはＥＮＰＰ３のいずれかに結合する第１のｓｃＦｖを含む、第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、およびＣＤ３またはＥＮＰＰ３のいずれかに結合する第２のｓｃＦｖを含む第２の単量体と、を含むデュアルｓｃＦｖフォーマットを含む。
１０．非ヘテロ二量体二重特異性抗体
当業者によって理解されるように、本明細書に概説されるＥＮＰＰ３およびＣＤ３のＦｖ配列はまた、単一特異性抗体（例えば、「従来のモノクローナル抗体」）または非ヘテロ二重特異性フォーマットの両方で使用することができる。
当業者によって理解されるように、本明細書に概説されるＥＮＰＰ３およびＣＤ３のＦｖ配列はまた、単一特異性抗体（例えば、「従来のモノクローナル抗体」）または非ヘテロ二重特異性フォーマットの両方で使用することができる。
特定の用途を見出すＣＤ３結合ドメイン配列としては、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の用途があるＥＮＰＰ３結合ドメイン配列としては、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。
適切な非ヘテロ二量体二重特異性フォーマットは当該技術分野において既知であり、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（６７）：９５－１０６（２０１５）およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ｍＡｂｓ ４：２，１８２－１９７（２０１２）に概して示されているようないくつかの異なるフォーマットを含み、これらの両方は、参照により、特にその中のフォーマットに対する図、図説および引用について、明示的に組み込まれる。
１１．トライデントフォーマット
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性抗体は、概してＷＯ２０１５／１８４２０３に記載されている「トライデント」フォーマットであり、そのすべての内容、特に、図、図説、定義、ならびに「Ｋ－コイル」および「Ｅ－コイル」配列を含む「ヘテロ二量体促進ドメイン」または「ＨＰＤ」の配列は、参照により本明細書に組み込まれる。トライデントは、構造の構成要素として、会合してヘテロ二量体構造を形成する２つの異なるＨＰＤの使用に依存し、図１Ｋを参照されたい。この実施形態において、トライデントフォーマットは、「従来の」重鎖および軽鎖（例えば、ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３およびＶＬ１－ＣＬ）、第１の「ディアボディ型連結ドメイン」または「ＤＡＲＴ（登録商標）」を含む第３の鎖、ＶＨ２－（リンカー）－ＶＬ３－ＨＰＤ１、ならびに第２のＤＡＲＴ（登録商標）を含む第４の鎖、ＶＨ３－（リンカー）－（リンカー）－ＶＬ２－ＨＰＤ２を含む。ＶＨ１およびＶＬ１は第１のＡＢＤを形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は第２のＡＢＤを形成し、そしてＶＨ３およびＶＬ３は第３のＡＢＤを形成する。図１Ｋに示されているように、いくつかの場合では、第２および第３のＡＢＤは同一の抗原、この例では一般的にＥＮＰＰ３に、例えば二価で連結し、第１のＡＢＤは、ＣＤ３に一価で連結する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性抗体は、概してＷＯ２０１５／１８４２０３に記載されている「トライデント」フォーマットであり、そのすべての内容、特に、図、図説、定義、ならびに「Ｋ－コイル」および「Ｅ－コイル」配列を含む「ヘテロ二量体促進ドメイン」または「ＨＰＤ」の配列は、参照により本明細書に組み込まれる。トライデントは、構造の構成要素として、会合してヘテロ二量体構造を形成する２つの異なるＨＰＤの使用に依存し、図１Ｋを参照されたい。この実施形態において、トライデントフォーマットは、「従来の」重鎖および軽鎖（例えば、ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３およびＶＬ１－ＣＬ）、第１の「ディアボディ型連結ドメイン」または「ＤＡＲＴ（登録商標）」を含む第３の鎖、ＶＨ２－（リンカー）－ＶＬ３－ＨＰＤ１、ならびに第２のＤＡＲＴ（登録商標）を含む第４の鎖、ＶＨ３－（リンカー）－（リンカー）－ＶＬ２－ＨＰＤ２を含む。ＶＨ１およびＶＬ１は第１のＡＢＤを形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は第２のＡＢＤを形成し、そしてＶＨ３およびＶＬ３は第３のＡＢＤを形成する。図１Ｋに示されているように、いくつかの場合では、第２および第３のＡＢＤは同一の抗原、この例では一般的にＥＮＰＰ３に、例えば二価で連結し、第１のＡＢＤは、ＣＤ３に一価で連結する。
１２．単一特異性、モノクローナル抗体
当業者によって理解されるように、本明細書に概説される新規のＦｖ配列はまた、単一特異性抗体（例えば、「従来のモノクローナル抗体」）または非ヘテロ二重特異性フォーマットの両方で使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、一般にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の定常領域、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐのアミノ酸置換を含むＩｇＧ４定常領域を含む）を有する、図からの６つのＣＤＲならびに／またはｖｈおよびｖｌ配列を含むモノクローナル（単一特異性）抗体を提供し、いくつかの実施形態において特に使用される。すなわち、本明細書で「Ｈ＿Ｌ」の名称を有する任意の配列は、ヒトＩｇＧ１抗体の定常領域に連結することができる。
当業者によって理解されるように、本明細書に概説される新規のＦｖ配列はまた、単一特異性抗体（例えば、「従来のモノクローナル抗体」）または非ヘテロ二重特異性フォーマットの両方で使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、一般にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の定常領域、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐのアミノ酸置換を含むＩｇＧ４定常領域を含む）を有する、図からの６つのＣＤＲならびに／またはｖｈおよびｖｌ配列を含むモノクローナル（単一特異性）抗体を提供し、いくつかの実施形態において特に使用される。すなわち、本明細書で「Ｈ＿Ｌ」の名称を有する任意の配列は、ヒトＩｇＧ１抗体の定常領域に連結することができる。
いくつかの実施形態では、単一特異性抗体は、ＥＮＰＰ３単一特異性抗体である。ある特定の実施形態では、単一特異性ＥＮＰＰ３抗体は、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）から選択される抗ＥＮＰＰ３抗体のいずれかの６つのＣＤＲを含む。
Ｈ．抗原結合ドメイン
本明細書で論じられるように、対象のヘテロ二量体抗体は、それぞれがＥＮＰＰ３またはＣＤ３に結合する２つの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む。本明細書で概説するように、これらのヘテロ二量体抗体は、二重特異性および二価（各抗原は、例えば、図１５Ａに示される形式で単一のＡＢＤによって結合される）、または二重特異性および三価（例えば、図１５Ｂに示すように、１つの抗原は単一のＡＢＤによって結合され、他は２つのＡＢＤによって結合される）であり得る。
本明細書で論じられるように、対象のヘテロ二量体抗体は、それぞれがＥＮＰＰ３またはＣＤ３に結合する２つの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む。本明細書で概説するように、これらのヘテロ二量体抗体は、二重特異性および二価（各抗原は、例えば、図１５Ａに示される形式で単一のＡＢＤによって結合される）、または二重特異性および三価（例えば、図１５Ｂに示すように、１つの抗原は単一のＡＢＤによって結合され、他は２つのＡＢＤによって結合される）であり得る。
さらに、概して、ＡＢＤのうちの１つは、ＶＨ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬまたはＶＬ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨのＮ末端からＣ末端に向かう方向で、本明細書に概説されるようなｓｃＦｖを含む。フォーマットによれば、他のＡＢＤの一方または両方は、概して、一方のタンパク質鎖上にＶＨドメインを（概して重鎖の構成要素として）およびもう別のタンパク質鎖上にＶＬ（概して軽鎖の構成要素として）を含むＦａｂである。
本開示は、以下に概説するように、いくつかの異なるチェックポイントタンパク質に連結するいくつかのＡＢＤを提供する。当業者には理解されるように、６個のＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬドメインの任意のセットはｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットにすることができ、次いでこれを重鎖および軽鎖の定常ドメインに付加し、ここで重鎖定常ドメインは変異（ＣＨ１ドメインおよびＦｃドメイン内を含む）を含む。配列リストに含まれるｓｃＦｖ配列は特定の荷電リンカーを利用するが、本明細書に概説するように、図７に示されるものを含めて、非荷電または他の荷電リンカーを使用できる。
さらに、上記のように、ＣＤＲの同定のために配列表において使用される番号付けはＫａｂａｔであるが、異なる番号付けを使用することができ、それは表２に示されるようにＣＤＲのアミノ酸配列を変化させるであろう。
本明細書に記載されているすべての可変重鎖および軽鎖ドメインについて、さらなるバリアントを作製することができる。本明細書で概説されるように、いくつかの実施形態では、６つのＣＤＲのセットは、０、１、２、３、４または５のアミノ酸修飾（特に使用されるアミノ酸置換による）を有し、ならびに、可変重鎖および軽鎖ドメインのフレームワーク領域であって、このフレームワーク（ＣＤＲを除く）が、図と説明文が組み込まれている米国特許第７，６５７，３８０号の図１に列挙されているもの（その図および説明文は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）から選択されたヒト生殖系列配列と少なくとも約８０、８５、または９０％の同一性を保持している限りにおいてそのフレームワーク領域の変化を、有することができる。したがって、例えば、フレームワーク領域が米国特許第７，６５７，３８０号の図１に列挙されたものから選択されたヒト生殖系列配列と少なくとも８０、８５または９０％の同一性を保持している限り、本明細書に記載の同一のＣＤＲをヒト生殖系列配列由来の異なるフレームワーク配列と組み合わせることができる。代替的に、ＣＤＲは、アミノ酸改変（例えば、ＣＤＲのセットにおいて１、２、３、４、または５個のアミノ酸改変を有し得（すなわち、ＣＤＲは、６個のＣＤＲのセット中の変化の全数が６アミノ酸改変未満である限り、任意の組み合わせのＣＤＲが変更され、例えば、ＶＬＣＤＲ１において１つの変更、ＶＨＣＤＲ２において２つの変更、ＶＨＣＤＲ３において変更がないなどであり得る））、同様に、フレームワーク領域が、米国特許第７，６５７，３８０号の図１に列挙されるものから選択されるヒト生殖細胞系列の配列に対して少なくとも８０、８５、または９０％同一性を保持する限り、フレームワーク領域の変更を有する。
１．ＥＮＰＰ３抗原連結ドメイン
いくつかの実施形態において、ＡＢＤのうちの１つはＥＮＰＰ３に連結する。６つのＣＤＲおよび／またはＶＨおよびＶＬドメインの好適なセットが、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されている。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃまたは２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｖフォーマット抗体である（例えば、図１５Ａおよび１５Ｂを参照されたい）。
いくつかの実施形態において、ＡＢＤのうちの１つはＥＮＰＰ３に連結する。６つのＣＤＲおよび／またはＶＨおよびＶＬドメインの好適なセットが、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに示されている。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃまたは２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｖフォーマット抗体である（例えば、図１５Ａおよび１５Ｂを参照されたい）。
一実施形態では、ＥＮＰＰ３抗原結合ドメインは、図および配列リストを含む、本明細書に記載のＥＮＰＰ３ ＡＢＤの６つのＣＤＲ（すなわち、ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３）を含む。例示的な実施形態では、ＥＮＰＰ３ ＡＢＤは、以下のＥＮＰＰ３ ＡＢＤ：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちの１つである。
当業者には理解されるように、好適なＥＮＰＰ３結合ドメインは、下線が付されているものとしてか、または、本明細書において記載され表２に示されるような、異なる番号付けスキームが使用される場合、本明細書で示されるもののＶＨおよびＶＬの配列内の他のアラインメントを使用して同定されるＣＤＲとして、これらの配列および図に描かれているような６個のＣＤＲのセットを含み得る。好適なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるようなＶＨおよびＶＬの全体の配列をも含み得る。ＥＮＰＰ３に対するＦｖを含む本明細書中の実施形態の多くにおいて、ＥＮＰＰ３に連結するのはＦａｂ単量体である。
ＥＮＰＰ３に対するＡＢＤを形成する、図および配列表に開示された親ＣＤＲセットに加えて、本開示はバリアントＣＤＲセットを提供する。一実施形態では、６つのＣＤＲのセットは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＥＮＰＰ３ ＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親ＣＤＲから１、２、３、４または５のアミノ酸の変更を有することができ、後者は多くの実施形態では特に使用される。
ＥＮＰＰ３に対するＡＢＤを形成する、本明細書に開示されている親の可変重鎖および可変軽鎖ドメインに加えて、本開示はバリアントＶＨおよびＶＬドメインを提供する。一実施形態において、変異型のＶＨおよびＶＬドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親のＶＨおよびＶＬドメインから１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０からのアミノ酸の変更をそれぞれが有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。別の実施形態では、バリアントＶＨおよびＶＬは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、それぞれの親のＶＨおよびＶＬドメインに対し、少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であることができ、後者は多くの実施形態では特に使用される。
２．ＣＤ３抗原連結ドメイン
いくつかの実施形態において、ＡＢＤのうちの１つはＣＤ３に連結する。６つのＣＤＲおよび／またはＶＨならびにＶＬドメインの好適なセット、ならびにｓｃＦｖ配列は、図１０Ａ～１０Ｆおよび配列表に示されている。特定の用途のものであるＣＤ３結合ドメイン配列としては、ＣＤ３結合ドメイン配列には、図１０Ａ～１０Ｆに示される、抗ＣＤ３ Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．３２、抗ＣＤ３ Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、抗ＣＤ３ Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、抗ＣＤ３ Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、抗ＣＤ３ Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、抗ＣＤ３ Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、抗ＣＤ３ Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、および抗ＣＤ３ Ｌ１．４７＿Ｈ１．３１が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ＡＢＤのうちの１つはＣＤ３に連結する。６つのＣＤＲおよび／またはＶＨならびにＶＬドメインの好適なセット、ならびにｓｃＦｖ配列は、図１０Ａ～１０Ｆおよび配列表に示されている。特定の用途のものであるＣＤ３結合ドメイン配列としては、ＣＤ３結合ドメイン配列には、図１０Ａ～１０Ｆに示される、抗ＣＤ３ Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．３２、抗ＣＤ３ Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、抗ＣＤ３ Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、抗ＣＤ３ Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、抗ＣＤ３ Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、抗ＣＤ３ Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、抗ＣＤ３ Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、および抗ＣＤ３ Ｌ１．４７＿Ｈ１．３１が挙げられるが、これらに限定されない。
当業者には理解されるように、好適なＣＤ３結合ドメインは、下線が付されているものとしてか、または、本明細書において記載され表２に示されるような、異なる番号付けスキームが使用される場合、図１０Ａ～１０Ｆで示されるもののＶＨおよびＶＬの配列内の他のアラインメントを使用して同定されるＣＤＲとして、図１０Ａ～１０Ｆに示される６つのＣＤＲのセットを含み得る。好適なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるようなＶＨおよびＶＬの全体の配列をも含み得る。ＣＤ３に対するＦｖを含む本明細書中の実施形態の多くにおいて、ＣＤ３に連結するのはｓｃＦｖ単量体である。
ＣＤ３に対するＡＢＤを形成する、図および配列表に開示された親ＣＤＲセットに加えて、本開示はバリアントＣＤＲセットを提供する。一実施形態では、６つのＣＤＲのセットは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＣＤ３ ＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親ＣＤＲから１、２、３、４または５のアミノ酸の変更を有することができ、後者は多くの実施形態では特に使用される。
ＣＤ３に対するＡＢＤを形成する、本明細書に開示されている親の可変重鎖および可変軽鎖ドメインに加えて、本開示はバリアントＶＨおよびＶＬドメインを提供する。一実施形態において、変異型のＶＨおよびＶＬドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親のＶＨおよびＶＬドメインから１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０からのアミノ酸の変更をそれぞれが有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。別の実施形態では、バリアントＶＨおよびＶＬは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、それぞれの親のＶＨおよびＶＬドメインに対し、少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であることができ、後者は多くの実施形態では特に使用される。
ＶＩ．ＳＳＴＲ２結合ドメイン
一態様では、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および抗ＳＳＴＲ２抗体を含むそのようなＳＳＴＲ２抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物が本明細書で提供される。
一態様では、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および抗ＳＳＴＲ２抗体を含むそのようなＳＳＴＲ２抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物が本明細書で提供される。
ソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ）は、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）のスーパーファミリーに属しており、それぞれが細胞外／細胞内ドメインと７つの膜貫通ドメインからなる単一のポリペプチド鎖を含有する。ＤＤＴＲは、ＮＥＴ（肺、ＧＩ、膵臓、下垂体、髄様癌、前立腺、膵臓肺癌、骨肉腫など）ならびに非ＮＥＴ（乳癌、肺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、子宮頸癌など）を含む様々な培養腫瘍細胞および原発腫瘍組織で高度に発現している（Ｒｅｕｂｉ．，２００３，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２４：３８９－４２７；Ｖｏｌａｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２８６：２１９－２２９；およびＳｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．８９：３８５－３９０）。現在までに、５つのＳＳＴＲ受容体サブタイプが同定されている（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８：３９８－４０５）。特にＳＳＴＲ２は、多くの腫瘍細胞に高濃度で発現しており（Ｖｏｌａｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２８６：２１９－２２９；およびＲｅｕｂｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ ３０：７８１－７９３）、したがって、それを二重特異性抗体癌標的治療薬の候補標的抗原にする。様々な腫瘍で発現される高濃度のＳＳＴＲ２を考慮して、抗ＳＳＴＲ２抗体は、例えば、抗腫瘍治療薬（例えば、化学療法剤およびＴ細胞）をそのようなＳＳＴＲ２発現腫瘍に局在化させるために有用であると考えられる。
本明細書で提供されるＳＳＴＲ２抗原結合ドメインを含む対象抗体（例えば、抗ＳＳＴＲ２×抗ＣＤ３二重特異性抗体）は、様々な異なる免疫応答を有利に誘発する。そのようなＳＳＴＲ２２結合ドメインおよび関連する抗体は、例えば、ＳＳＴＲ２関連癌の治療に使用される。
当業者には理解されるように、好適なＳＳＴＲ２結合ドメインは、下線が付されているものとしてか、または、本明細書において記載され表２に示されるような、異なる番号付けスキームが使用される場合、図６３で示されるもののＶＨおよびＶＬの配列内の他のアラインメントを使用して同定されるＣＤＲとして、図６３に示される６つのＣＤＲのセットを含み得る。好適なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるようなＶＨおよびＶＬの全体の配列をも含み得る。ＳＳＴＲ２に対するＦｖを含む本明細書中の実施形態の多くにおいて、ＳＳＴＲ２に連結するのはＦａｂ単量体である。一実施形態では、ＳＳＴＲ２抗原結合ドメインは、［αＳＳＴＲ２］Ｈ１．２４＿Ｌ１．３０の６つのＣＤＲ（すなわち、ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３）を含む（図６３）。
ＳＳＴＲ２に対するＡＢＤを形成する図および配列表に開示される親ＣＤＲセットに加えて、本明細書に開示されるＳＳＴＲ２ ＡＢＤ ＣＤＲの少なくとも１つの修飾を含むＣＤＲを有するバリアントＳＳＴＲ２ ＡＢＤＳが本明細書に提供される。一実施形態では、ＳＳＴＲ２ ＡＢＤは、図および配列表を含む、本明細書に記載のＳＳＴＲ２ ＡＢＤの６つのＣＤＲと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０のアミノ酸修飾を有する６つのＣＤＲのセットを含む。一実施形態では、ＳＳＴＲ２ ＡＢＤは、［αＳＳＴＲ２］Ｈ１．２４＿Ｌ１．３０の６つのＣＤＲと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０のアミノ酸修飾を有する６つのＣＤＲのセットを含む（図６３）。ある特定の実施形態では、バリアントＳＳＴＲ２ ＡＢＤは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えば、オクテットアッセイ）アッセイの少なくとも１つによって測定される場合、ＳＳＴＲ２抗原に結合することができ、後者は多くの実施形態で特定の用途を見出す。特定の実施形態では、ＳＳＴＲ２ ＡＢＤは、ヒトＳＳＴＲ２抗原に結合することができる。
一実施形態では、ＳＳＴＲ２ ＡＢＤは、図および配列表を含む、本明細書に記載されるＳＳＴＲ２ ＡＢＤの６つのＣＤＲと少なくとも９０、９５、９７、９８または９９％同一である６つのＣＤＲを含む。例示的な実施形態では、ＳＳＴＲ２ ＡＢＤは、［αＳＳＴＲ２］Ｈ１．２４＿Ｌ１．３０（図６３）の６つのＣＤＲと比較して、少なくとも９０、９５、９７、９８または９９％同一の６つのＣＤＲのセットを含む。ある特定の実施形態では、ＳＳＴＲ２ ＡＢＤは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えば、オクテットアッセイ）アッセイの少なくとも１つによって測定される場合、ＳＳＴＲ２抗原に対して結合することができ、後者は多くの実施形態で特定の用途を見出す。特定の実施形態では、ＳＳＴＲ２ ＡＢＤは、ヒトＳＳＴＲ２抗原に結合することができる。
別の例示的な実施形態では、ＳＳＴＲ２ ＡＢＤは、図および配列表を含む、本明細書に記載のＳＳＴＲ２ ＡＢＤのうちのいずれか１つの可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む。例示的な実施形態では、ＳＳＴＲ２ ＡＢＤは［αＳＳＴＲ２］Ｈ１．２４＿Ｌ１．３０（図６３）である。
本明細書に開示される親ＳＳＴＲ２可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインに加えて、本明細書に開示されるＳＳＴＲ２ ＡＢＤ ＶＨおよびＶＬドメインのバリアントである可変重鎖ドメインおよび／または可変軽鎖ドメインを含むＳＳＴＲ２ ＡＢＤが本明細書に提供される。一実施形態では、バリアントＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインは、図および配列表を含む、本明細書に記載されるＳＳＴＲ２ ＡＢＤのＶＨおよび／またはＶＬドメインからの１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸変化を有する。例示的な実施形態では、バリアントＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインは、［αＳＳＴＲ２］Ｈ１．２４＿Ｌ１．３０（図６３）のＶＨおよび／またはＶＬドメインからの１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸変化を有する。ある特定の実施形態では、ＳＳＴＲ２ ＡＢＤは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えば、オクテットアッセイ）アッセイの少なくとも１つによって測定される場合、ＳＳＴＲ２に結合することができ、後者は多くの実施形態で特定の用途を見出す。特定の実施形態では、ＳＳＴＲ２ ＡＢＤは、ヒトＳＳＴＲ２抗原に結合することができる。
一実施形態では、バリアントＶＨおよび／またはＶＬドメインは、図および配列表を含む、本明細書に記載されるＳＳＴＲ２ ＡＢＤのＶＨおよび／またはＶＬと少なくとも９０、９５、９７、９８または９９％同一である。例示的な実施形態では、バリアントＶＨおよび／またはＶＬドメインは、［αＳＳＴＲ２］Ｈ１．２４＿Ｌ１．３０（図６３）のＶＨおよび／またはＶＬと少なくとも９０、９５、９７、９８または９９％同一である。ある特定の実施形態では、ＳＳＴＲ２ ＡＢＤは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えば、オクテットアッセイ）アッセイの少なくとも１つによって測定される場合、ＳＳＴＲ２に結合することができ、後者は多くの実施形態で特定の用途を見出す。特定の実施形態では、ＳＳＴＲ２ ＡＢＤは、ヒトＳＳＴＲ２抗原に結合することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の対象抗体は、少なくとも１つのＳＳＴＲ２結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、ヘテロ二量体抗体である。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃまたは２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｖフォーマット抗体である（例えば、図１５Ａおよび１５Ｂを参照されたい）。そのようなヘテロ二量体抗体は、本明細書で提供される、Ｆｃバリアントアミノ酸置換のいずれかを、独立してまたは組み合わせて含み得る（例えば、図１～４に示されるものを含む、スキュー、ｐＩおよび除去バリアント）。特に有用なスキュー変異は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択され、任意で除去変異（図３に示すものを含む）を含み、任意で荷電ｓｃＦｖリンカー（図５に示すものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異（図２に示すものを含む）を含む。
Ａ．有用な実施形態
有用な実施形態は、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットであって、ａ）荷電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では図５の＋Ｈ配列が好ましい）、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および本明細書で概説するＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および可変軽鎖ドメインと一緒に、本明細書に概説する第２の抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）と、ｃ）可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）および定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖と、を含む、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットを含み、ここで、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。いくつかの実施形態では、可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインは、ＥＮＰＰ３結合部分を構成する。
有用な実施形態は、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットであって、ａ）荷電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では図５の＋Ｈ配列が好ましい）、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および本明細書で概説するＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および可変軽鎖ドメインと一緒に、本明細書に概説する第２の抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）と、ｃ）可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）および定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖と、を含む、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットを含み、ここで、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。いくつかの実施形態では、可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインは、ＥＮＰＰ３結合部分を構成する。
他の有用な実施形態は、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットであって、ａ）荷電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では図５の＋Ｈ配列が好ましい）、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および本明細書で概説するＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および可変軽鎖ドメインと一緒に、本明細書に概説する第２の抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）と、ｃ）可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）および定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖と、を含む、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットを含み、ここで、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。いくつかの実施形態では、可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインは、ＳＳＴＲ２結合部分を構成する。
したがって、いくつかの実施形態は、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットであって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓならびに共通軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるようにＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインを含む、第１の単量体（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ側）と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓならびに共通軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるようにＥＮＰＰ３に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む、第２の単量体（Ｆａｂ－Ｆｃ側）と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖と、を含む、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット、を含み、ここで、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３結合ドメインからの各単量体上の共通軽鎖および可変の重鎖ドメインである。
他の有用な実施形態は、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットであって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに共通軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインを含む、第１の単量体（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ側）と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに共通軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む、第２の単量体（Ｆａｂ－Ｆｃ側）と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖と、を含む、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット、を含み、ここで、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。いくつかの実施形態では、ＳＳＴＲ２結合ドメインからの各単量体上の共通軽鎖および可変の重鎖ドメイン（例えば、［αＳＳＴＲ２］Ｈ１．２４＿Ｌ１．３０（図６３））である。
いくつかの有用な実施形態は、ＸＥＮＰ２４８０４、ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２８２８７、ＸＥＮＰ２８９２５、ＸＥＮＰ２９５１６、ＸＥＮＰ３０２６２、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２９４３６、ＸＥＮＰ２８３９０、ＸＥＮＰ２９４６３、およびＸＥＮＰ３０２６３を含む。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体以下のヘテロ二量体抗体：ＸＥＮＰ２９４３７、ＸＥＮＰ２９５２０、ＸＥＮＰ３０２６４、ＸＥＮＰ２６８２２、ＸＥＮＰ２８４３８、ＸＥＮＰ２９４３８、ＸＥＮＰ２９４６７、ＸＥＮＰ３０４６９、ＸＥＮＰ３０４７０、ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、ＸＥＮＰ３１１４８、ＸＥＮＰ３１１４９、ＸＥＮＰ３１１５０、ＸＥＮＰ３１４１９、およびＸＥＮＰ３１４７１を含む。
別の有用な実施形態は、ＸＥＮＰ３０４５８である。
ＶＩＩ．本発明の核酸
本開示はさらに、抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体およびＥＮＰＰ３単一特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない、本明細書で提供される抗ＥＮＰＰ３抗体をコードする核酸組成物を提供する。
本開示はさらに、抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体およびＥＮＰＰ３単一特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない、本明細書で提供される抗ＥＮＰＰ３抗体をコードする核酸組成物を提供する。
当業者には理解されるように、核酸組成物はヘテロ二量体タンパク質の形式および足場に依存する。したがって、例えば、１つまたは２つ以上の１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット（例えば、ＦｃドメインとｓｃＦｖを含む第１のアミノ酸単量体、重鎖と軽鎖を含む第２のアミノ酸単量体）など、３つのアミノ酸配列がフォーマットに必要な場合、発現のために、３つの核酸配列を１つ以上の発現ベクターに組み込むことができる。同様に、いくつかの形式（例えば、図１に開示されているようなデュアルｓｃＦｖフォーマット）は２つの核酸のみを必要とし、同様に、それらを１つまたは２つの発現ベクターに組み込むことができる。
当該技術分野において既知であるように、本明細書に記載の抗体の構成要素をコードする核酸は、当該技術分野において既知であるように、そして本明細書に記載のヘテロ二量体抗体を産生するために使用される宿主細胞に応じた発現ベクターに組み込まれ得る。一般に、核酸は任意の数の制御性エレメント（プロモーター、複製起点、選択可能マーカー、リボソーム結合部位、インデューサーなど）に作動可能に連結されている。発現ベクターは、染色体外ベクターまたは組み込みベクターであり得る。
次いで、本明細書に記載の核酸および／または発現ベクターを、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および／または真菌細胞を含む当該技術分野で周知の任意の数の異なる種類の宿主細胞に形質転換するが、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）が、多くの実施形態では使用される。
いくつかの実施形態では、各単量体をコードする核酸および、形式に応じて適用可能な、軽鎖をコードする任意の核酸は、一般に異なるまたは同じプロモーター制御下で単一の発現ベクター内にそれぞれ含有される。本明細書に記載の抗体において特に使用される実施形態では、これら２つまたは３つの核酸のそれぞれは異なる発現ベクターに含まれる。本明細書および参照により本明細書に組み込まれる６２／０２５，９３１に示されるように、ヘテロ二量体形成を推進するために異なるベクター比を使用することができる。すなわち、驚くべきことに、（ヘテロ二量体抗体を含む３つのポリペプチド有する本明細書の実施形態の多くの場合）タンパク質は、第１単量体：第２単量体：軽鎖を１：１：２の比率で含むが、これらは最高の結果が得られる比率ではない。
本明細書に記載のヘテロ二量体抗体は、当該技術分野において周知のように、発現ベクターを含む宿主細胞を培養することによって作製される。一旦製造されると、イオン交換クロマトグラフィー工程を含む従来の抗体精製工程が実施される。本明細書で論じるように、２つのモノマーのｐＩが少なくとも０．５だけ異なることは、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点に感受性の他の方法による分離を可能にし得る。すなわち、各単量体の等電点（ｐＩ）が異なるｐＩを有し、かつヘテロ二量体も異なるｐＩを有するようになるように各単量体の等電点（ｐＩ）を変化させるｐＩ置換を含むことによって、「１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」および「２＋１」ヘテロ二量体の等電点精製（例えば、アニオン交換カラム、カチオン交換カラム）を促進する。これらの置換はまた、精製後、混入したデュアルｓｃＦｖ－ＦｃおよびｍＡｂホモ二量体の決定およびモニタリングにも役立つ（例えば、ＩＥＦゲル、ｃＩＥＦ、および分析用ＩＥＸカラム）。
ＶＩＩＩ．ヘテロ二量体二重特異性抗体の生物学的および生化学的機能
一般に、本明細書に記載の二重特異性ＥＮＰＰ３×ＣＤ３抗体は、癌を有する患者に投与され、そして有効性は、本明細書中に記載されるようないくつかの方法で評価される。このため、癌量、腫瘍のサイズ、転移の存在または程度の評価などの、有効性の標準的なアッセイを実行し得るが、免疫腫瘍学的治療もまた免疫状態評価に基づいて評価され得る。これは、インビトロアッセイおよびインビボアッセイの両方を含むいくつかの方法で行うことができる。
一般に、本明細書に記載の二重特異性ＥＮＰＰ３×ＣＤ３抗体は、癌を有する患者に投与され、そして有効性は、本明細書中に記載されるようないくつかの方法で評価される。このため、癌量、腫瘍のサイズ、転移の存在または程度の評価などの、有効性の標準的なアッセイを実行し得るが、免疫腫瘍学的治療もまた免疫状態評価に基づいて評価され得る。これは、インビトロアッセイおよびインビボアッセイの両方を含むいくつかの方法で行うことができる。
ＩＸ．治療
一旦作製されると、本明細書に記載の抗体の組成物は、多くの用途での使用が見出される。ＥＮＰＰ３は腎細胞癌で高度に発現しているため、本明細書に記載の抗体のヘテロ二量体組成物は、そのようなＥＮＰＰ３陽性癌の治療における使用を見出す。
一旦作製されると、本明細書に記載の抗体の組成物は、多くの用途での使用が見出される。ＥＮＰＰ３は腎細胞癌で高度に発現しているため、本明細書に記載の抗体のヘテロ二量体組成物は、そのようなＥＮＰＰ３陽性癌の治療における使用を見出す。
Ｘ．インビボ投与のための抗体組成物
本明細書に記載の抗体に従って使用される抗体の製剤は、所望の純度の抗体を任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］）と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量および濃度において、レシピエントに対して非毒性でありリン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
本明細書に記載の抗体に従って使用される抗体の製剤は、所望の純度の抗体を任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］）と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量および濃度において、レシピエントに対して非毒性でありリン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
ＸＩ．投与様式
本明細書に記載の抗体および化学療法剤は、ボーラスとしての静脈内投与またはある期間にわたる持続注入などの既知の方法に従って対象に投与される。
本明細書に記載の抗体および化学療法剤は、ボーラスとしての静脈内投与またはある期間にわたる持続注入などの既知の方法に従って対象に投与される。
ＸＩＩ．治療法
本発明の方法において、治療は、疾患または病状に関して肯定的な治療応答を提供するために使用される。「肯定的な治療応答」は、疾患もしくは病状の改善、および／または疾患または病状に関連する症状の改善を意図する。例えば、肯定的な治療応答は、疾患における以下の改善のうちの１つ以上を指し得る：（１）腫瘍細胞の数の減少、（２）腫瘍細胞死の増加、（３）腫瘍細胞の生存の阻害、（５）腫瘍増殖の阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）、（６）患者生存率の増加、および（７）疾患または病状に関連する１つ以上の症状からのいくらかの解放。
本発明の方法において、治療は、疾患または病状に関して肯定的な治療応答を提供するために使用される。「肯定的な治療応答」は、疾患もしくは病状の改善、および／または疾患または病状に関連する症状の改善を意図する。例えば、肯定的な治療応答は、疾患における以下の改善のうちの１つ以上を指し得る：（１）腫瘍細胞の数の減少、（２）腫瘍細胞死の増加、（３）腫瘍細胞の生存の阻害、（５）腫瘍増殖の阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）、（６）患者生存率の増加、および（７）疾患または病状に関連する１つ以上の症状からのいくらかの解放。
任意の所与の疾患または病状における肯定的な治療応答は、その疾患または病状に特有の標準化された応答基準によって決定され得る。腫瘍応答は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線撮影、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨スキャン撮影、内視鏡検査、ならびに骨髄穿刺（ＢＭＡ）および循環中の腫瘍細胞の計数を含む腫瘍生検サンプリングなどのスクリーニング技法を使用して、腫瘍形態（すなわち、全身腫瘍組織量、腫瘍サイズなど）の変化について評価され得る。
これらの肯定的な治療応答に加えて、治療を受けている対象は、疾患に関連する症状の改善の有益な効果を経験し得る。
本開示に従う治療には、使用される医薬品の「治療有効量」が含まれる。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために、必要な投薬量および期間で有効な量をいう。
治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する薬剤の能力などの因子によって異なり得る。治療有効量はまた、抗体または抗体部分のいずれの毒性または有害な効果よりも治療上有益な効果が勝る量である。
腫瘍療法のための「治療有効量」は、疾患の進行を安定化する能力によっても測定することができる。癌を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価してもよい。
あるいは、組成物のこの特性は、当業者に知られているインビトロアッセイによって、化合物が細胞増殖を阻害するか、またはアポトーシスを誘導する能力を検査することによって評価してもよい。治療有効量の治療用化合物は、腫瘍サイズを減少させるか、さもなければ対象の症状を軽減し得る。当業者であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択される特定の組成物または投与経路などの因子に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調節される。例えば、単回のボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例して減少または増加させてもよい。非経口組成物は、投与の容易性および投薬量の均一性のために、単位剤形で処方され得る。本明細書で使用される単位剤形は、治療される対象のための単一投薬量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。
本開示の単位剤形形態の仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴および達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の治療に対してそのような活性化合物を調合する分野に付いて回る制限に影響され、またそれらに直接的に依存する。
本明細書に記載の二重特異性抗体の効率的な投薬量および投薬レジメンは、治療される疾患または病状に依存し、当業者によって決定され得る。
本明細書に記載の抗体で使用される二重特異性抗体の治療有効量の例示的かつ非限定的な範囲は、約０．１～１００ｍｇ／ｋｇである。
すべての引用文献は、本明細書にそれらの全体が参照により明示的に組み込まれる。
本開示の特定の実施形態を例示の目的で上述のように説明したが、添付の特許請求の範囲に記載の本発明から逸脱することなく詳細の多数の変形をなし得ることが当業者には理解されよう。
本明細書に記載の抗体を説明するために実施例を以下に提供する。これらの実施例は、本明細書に記載の抗体を任意の特定の用途または動作理論に拘束することを意味するものではない。本明細書に記載の抗体において論じられるすべての定常領域位置について、番号付けは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、参照により完全に組み込まれる）と同様のＥＵインデックスに従う。抗体の技術分野の当業者は、この規則が免疫グロブリン配列の特定の領域における非連続的な番号付けからなり、免疫グロブリンファミリーにおける保存された位置への標準的な基準を可能にすることを理解するであろう。したがって、ＥＵインデックスによって定義されるような任意の所与の免疫グロブリンの位置は必ずしもその連続配列に対応しない。
一般的および具体的な科学技術は、米国特許出願公開第２０１５／０３０７６２９号、同第２０１４／０２８８２７５号、およびＷＯ２０１４／１４５８０６に概説されており、それらはすべて、特にその中に概説されている技術に関して、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。
実施例１：結合ドメイン
１Ａ：ＣＤ３結合ドメイン
異なるＣＤ３結合親和性を有するＣＤ３結合ドメインについての配列を図１０に示す。
１Ａ：ＣＤ３結合ドメイン
異なるＣＤ３結合親和性を有するＣＤ３結合ドメインについての配列を図１０に示す。
１Ｂ：ＥＮＰＰ３結合ドメイン
１Ｂ（ａ）：ＥＮＰＰ３結合ドメインＡＮ１
マウスＥＮＰＰ３結合ドメインの可変領域は、ストリングコンテント最適化を使用してヒト化された（例えば、２０１０年２月２日に発行された米国特許第７，６５７，３８０号を参照されたい）。ヒト化ＥＮＰＰ３結合ドメイン（以下、ＡＮ１と呼ぶ）の配列を図１０Ａ～１０Ｆに示す。
１Ｂ（ａ）：ＥＮＰＰ３結合ドメインＡＮ１
マウスＥＮＰＰ３結合ドメインの可変領域は、ストリングコンテント最適化を使用してヒト化された（例えば、２０１０年２月２日に発行された米国特許第７，６５７，３８０号を参照されたい）。ヒト化ＥＮＰＰ３結合ドメイン（以下、ＡＮ１と呼ぶ）の配列を図１０Ａ～１０Ｆに示す。
ＡＮ１バリアントは、精製の改善（αＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体に関して）および調節されたＥＮＰＰ３結合親和性／効力のために設計された。例示的なそのようなバリアントについての配列を、図１３に示す。
１Ｂ（ｂ）：追加のＥＮＰＰ３バインディングドメイン
本明細書に記載のαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体で使用できる可能性のある追加のＥＮＰＰ３結合ドメインの配列を図１４に示す。
本明細書に記載のαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体で使用できる可能性のある追加のＥＮＰＰ３結合ドメインの配列を図１４に示す。
実施例２：αＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体の操作および製造
αＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）のいくつかのフォーマットが考案され、その例示的なフォーマットは、以下および図１５に概説されている。
αＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）のいくつかのフォーマットが考案され、その例示的なフォーマットは、以下および図１５に概説されている。
そのようなフォーマットの１つは、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットであり、これは、第１のヘテロ二量体Ｆｃドメインに共有結合した単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、相補的な第２のヘテロ二量体Ｆｃドメインに共有結合した重鎖可変領域（ＶＨ）、およびＦａｂドメインが可変重鎖ドメインで形成されるように別々にトランスフェクトされた軽鎖（ＬＣ）を含む。
別のフォーマットは、２＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットであり、これは、第１のヘテロ二量体Ｆｃドメインに共有結合したｓｃＦｖに共有結合したＣＨ１に共有結合したＶＨドメイン（ＶＨ－ＣＨ１－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）、相補的な第２のヘテロ二量体Ｆｃドメインに共有結合したＶＨドメイン、およびＦａｂドメインがＶＨドメインで形成されるように別々にトランスフェクトされたＬＣを含む。
αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂのＤＮＡコード鎖は、標準的な遺伝子合成とそれに続く等温クローニング（ギブソンアセンブリ）、または融合パートナー（図６に示すドメインリンカーおよび／または図７～９に示す骨格など）を含有するｐＴＴ５発現ベクターへのサブクローニングによって生成された。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした。１＋Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットおよび２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットにおける例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂ（実施例１に記載の結合ドメインに基づく）の配列を、それぞれ図１７～２３に示す。
実施例３：αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂはＴ細胞をリダイレクトしてＥＮＰＰ３発現細胞を破壊する
１＋Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－ＦｃフォーマットのプロトタイプαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂは、実施例１で説明した結合ドメインを使用して設計された。特に、ＸＥＮＰ２６８２０（ＥＮＰＰ３結合ドメインクローンＨ１６－７．８およびＣＤ３ Ｈｉｇｈ ｓｃＦｖを含む）、ＸＥＮＰ２６８２１（ＥＮＰＰ３結合ドメインクローンＨ１６－７．８およびＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１ ｓｃＦｖを含む）、ＸＥＮＰ２８２８７（ＥＮＰＰ３結合ドメインクローンＡＮ１およびＣＤ３ Ｈｉｇｈ ｓｃＦｖを含む）、およびＸＥＮＰ２８３９０（ＥＮＰＰ３結合ドメインクローンＡＮ１およびＣＤ３ Ｈｉｇｈ Ｉｎｔ＃１ ｓｃＦｖを含む）、これらの配列を図１７および１８に示す。ＸＥＮＰ１３２４５（モタビズマブおよび抗ＣＤ３－Ｈｉｇｈに基づくＲＳＶ結合ドメインを含む；図１６に示す配列）を対照として使用した。
１＋Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－ＦｃフォーマットのプロトタイプαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂは、実施例１で説明した結合ドメインを使用して設計された。特に、ＸＥＮＰ２６８２０（ＥＮＰＰ３結合ドメインクローンＨ１６－７．８およびＣＤ３ Ｈｉｇｈ ｓｃＦｖを含む）、ＸＥＮＰ２６８２１（ＥＮＰＰ３結合ドメインクローンＨ１６－７．８およびＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１ ｓｃＦｖを含む）、ＸＥＮＰ２８２８７（ＥＮＰＰ３結合ドメインクローンＡＮ１およびＣＤ３ Ｈｉｇｈ ｓｃＦｖを含む）、およびＸＥＮＰ２８３９０（ＥＮＰＰ３結合ドメインクローンＡＮ１およびＣＤ３ Ｈｉｇｈ Ｉｎｔ＃１ ｓｃＦｖを含む）、これらの配列を図１７および１８に示す。ＸＥＮＰ１３２４５（モタビズマブおよび抗ＣＤ３－Ｈｉｇｈに基づくＲＳＶ結合ドメインを含む；図１６に示す配列）を対照として使用した。
プロトタイプαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）がＣＤ３＋エフェクターＴ細胞をリダイレクトしてＥＮＰＰ３発現細胞株を破壊する可能性を調査した。最初の実験では、ＫＵ８１２（ＥＮＰＰ３高い好塩基球性白血病細胞株）細胞をヒトＰＢＭＣとともに（１０：１のエフェクター対標的細胞比）、３７℃で２４時間、上記の被験物質の示された濃度でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＡｑｕａ Ｚｏｍｂｉｅ染料で室温で１５分間染色した。次に、細胞を洗浄し、細胞表面マーカーの抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。リダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）の誘導を調査するために、２つの異なるアプローチを使用した：ａ）ＣＳＦＥ＋標的細胞の数の減少（データは図２４Ａに示されている）、およびｂ）ＣＳＦＥ＋標的細胞のＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ染色（そのデータは図２４Ｂに示されている）。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および脱顆粒も、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２５、およびＣＤ６９の発現に基づいて決定した（データは図２５～２６に示されている）。
２番目の実験では、ＲＸＦ３９３（ＥＮＰＰ３を発現する臨床的に関連する腎細胞癌細胞株）細胞をヒトＰＢＭＣとともに（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、３７℃で２４時間、上記のプロトタイプ被験物質の示された濃度でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＡｑｕａ Ｚｏｍｂｉｅ染料で室温で１５分間染色した。次に、細胞を洗浄し、細胞表面マーカーの抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。上記のように、ＲＴＣＣの誘導を調査するために、２つの異なるアプローチを使用した：ａ）ＣＳＦＥ＋標的細胞の数の減少（データは図２７Ａに示されている）、およびｂ）ＣＳＦＥ＋標的細胞のＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ染色（そのデータは図２７Ｂに示されている）。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および脱顆粒も、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２５、およびＣＤ６９の発現に基づいて決定した（データは図２８～２９に示されている）。
まとめると、データは、プロトタイプαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂがＥＮＰＰ３細胞上で用量依存的にＲＴＣＣを誘導したこと、ＣＤ３結合親和性がＲＴＣＣ効力と相関していること（すなわち、ＣＤ３ Ｈｉｇｈを含むｂｓＡｂｓが、ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１を含むｂｓＡｂよりも強力にＲＴＣＣを誘導したこと）、およびＡＮ１ベースの結合ドメインを有するｂｓＡｂがＨ１６－７．８ベースの結合ドメインを有するｂｓＡｂよりも強力にＲＴＣＣを誘導したことを示している。ＲＴＣＣデータと一致して、αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、Ｔ細胞の活性化を用量依存的に誘導し、ＣＤ３結合親和性が活性化効力と相関し（すなわち、ＣＤ３ Ｈｉｇｈを含むｂｓＡｂｓが、ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１を含むｂｓＡｂよりも強力にＴ細胞の活性化を誘導し）、およびＡＮ１結合ドメインを有するｂｓＡｂが、Ｈ１６－７．８結合ドメインを有するｂｓＡｂよりも強力にＴ細胞活性化を誘導した。
実施例４：αＥＮＰＰ３×αＣＤ３産生の改善
一般に、二重特異性抗体を、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞における一過性トランスフェクションによって産生し、プロテインＡクロマトグラフィー（精製パート１）、続いてイオン交換クロマトグラフィー（精製パート２）を含む２段階精製プロセスによって精製した。
一般に、二重特異性抗体を、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞における一過性トランスフェクションによって産生し、プロテインＡクロマトグラフィー（精製パート１）、続いてイオン交換クロマトグラフィー（精製パート２）を含む２段階精製プロセスによって精製した。
４Ａ：産生を改善するためのＡＮ１バリアントの操作
４Ａ（ａ）：ＸＥＮＰ２８２８７の産生により、凝集体と不対単量体を含む均一な集団が得られる。
ＸＥＮＰ２８２８７は、上記のようにＨＥＫ２９３Ｅの上清から精製した。図３０Ａは、ＸＥＮＰ２８２８７の精製パート２（プロテインＡクロマトグラフィーに続くカチオン交換クロマトグラフィー）を示すクロマトグラムを表示する。クロマトグラムは、２つのピーク（ピークＢおよびピークＢＣ）の単離を示し、これは、以下に一般的に記載される同一性、純度、および均一性について多角度光散乱を備えた分析サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ－ＭＡＬＳ）および分析カチオン交換クロマトグラフィー（ａＣＩＥＸ）によってさらに特性評価した。
４Ａ（ａ）：ＸＥＮＰ２８２８７の産生により、凝集体と不対単量体を含む均一な集団が得られる。
ＸＥＮＰ２８２８７は、上記のようにＨＥＫ２９３Ｅの上清から精製した。図３０Ａは、ＸＥＮＰ２８２８７の精製パート２（プロテインＡクロマトグラフィーに続くカチオン交換クロマトグラフィー）を示すクロマトグラムを表示する。クロマトグラムは、２つのピーク（ピークＢおよびピークＢＣ）の単離を示し、これは、以下に一般的に記載される同一性、純度、および均一性について多角度光散乱を備えた分析サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ－ＭＡＬＳ）および分析カチオン交換クロマトグラフィー（ａＣＩＥＸ）によってさらに特性評価した。
ＸＥＮＰ２８２８７の精製パート２（ならびに事前精製された材料）から分離されたピークＢおよびＢＣを、ａＳＥＣ－ＭＡＬＳを使用して分析し、それらの構成タンパク質種を推定した。分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムで実施した。４℃で２５分間、移動相として１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４を１．０ｍＬ／分で用いて、２８０ｎＭのＵＶ検出波長で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に試料を注入した。ＭＡＬＳは、Ｏｐｔｉｌａｂ（登録商標）Ｔ－ｒＥＸ屈折率検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、Ｃａｌｉ．）を備えたｍｉｎｉＤＡＷＮ（登録商標）ＴＲＥＯＳ（登録商標）で実施した。分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＯｐｅｎＬａｂクロマトグラフィーデータシステム（ＣＤＳ）ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ Ｅｄｉｔｉｏｎ ＡＩＣバージョンＣ．０１．０７およびＡＳＴＲＡバージョン６．１．７．１５を使用して実施した。事前精製された材料、ピークＢ、およびピークＢＣのＳＥＣ分離プロファイルを示すクロマトグラムが、ＭＡＬＳによって決定された構成種のおおよそのＭＷとともに図３０Ｂに示されている。プロファイルは、ピークＢがＸＥＮＰ２８２８７ヘテロ二量体の計算された分子量（アミノ酸配列に基づく）と一致する約１２６ ｋＤａの優勢な種を含むが、７５ ｋＤａの汚染種（単量体である可能性が高い）も含むことを示している。ピークＢＣは、３０８ｋＤａ（凝集体である可能性が高い）、１２１ｋＤａ（ＸＥＮＰ２８２８７）、および８２ｋＤａ（汚染単量体）の種のピークで構成される。特に、事前に精製された材料の分離プロファイルは、材料の８５％未満が二重特異性抗体ヘテロ二量体であったことを示している。
分析ＣＩＥＸを使用して、精製パート２のピークも分析し、ピークＢとＢＣの純度と均一性をさらに評価した。分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムで実施した。試料を、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｘ ＳＣＸ－ＮＰ５ ５μＭ非多孔質カラム（Ｓｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗａｒｋ，Ｄｅｌ）に、１．０ｍＬ／分で、２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０バッファー中の０～４０％ＮａＣｌ勾配を使用して、２８０ｎＭのＵＶ検出波長で注入した。分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＯｐｅｎＬＡＢ ＣＤＳ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ Ｅｄｉｔｉｏｎ ＡＩＣバージョンＣ．０１．０７を使用して実施した。ピークＢとＢＣのａＣＩＥＸ分離を示すクロマトグラムを、図３０Ｃに示す。特に、ａＣＩＥＸ分離は、ピークＢＣ材料には、支配的なピークに加えて多くの電荷バリアントがあることを示している。
４Ａ（ｂ）：ＡＮ１ ＶＨバリアントＨ１．８は、改善された分離を可能にした
二重特異性抗体産生を改善することを目的として、多くのＡＮ１可変重鎖（ＶＨ）ドメインを操作した。１つの特定のＶＨバリアント（Ｈ１．８；配列番号ＸＸＸ；図１３にも示されている）は、汚染種からの二重特異性抗体ヘテロ二量体の改善された分離を可能にした。これを説明するために、ＸＥＮＰ２８９２５（ＡＮ１ Ｈ１．８ ＶＨバリアントを有するＥＮＰＰ３結合ドメインを含む；１７に示す配列）を上記のようにＨＥＫ２９３Ｅ上清から生成および精製した。図３１Ａは、ＸＥＮＰ２８９２５の精製パート２（プロテインＡクロマトグラフィーに続くカチオン交換クロマトグラフィー）を示すクロマトグラムを表示する。クロマトグラムは、１つの優勢なピーク（ピークＢ）の分離を示しており、これは、上記のように、同一性、純度、および均一性についてａＳＥＣ－ＭＡＬＳおよびａＣＩＥＸによってさらに特性評価された。
二重特異性抗体産生を改善することを目的として、多くのＡＮ１可変重鎖（ＶＨ）ドメインを操作した。１つの特定のＶＨバリアント（Ｈ１．８；配列番号ＸＸＸ；図１３にも示されている）は、汚染種からの二重特異性抗体ヘテロ二量体の改善された分離を可能にした。これを説明するために、ＸＥＮＰ２８９２５（ＡＮ１ Ｈ１．８ ＶＨバリアントを有するＥＮＰＰ３結合ドメインを含む；１７に示す配列）を上記のようにＨＥＫ２９３Ｅ上清から生成および精製した。図３１Ａは、ＸＥＮＰ２８９２５の精製パート２（プロテインＡクロマトグラフィーに続くカチオン交換クロマトグラフィー）を示すクロマトグラムを表示する。クロマトグラムは、１つの優勢なピーク（ピークＢ）の分離を示しており、これは、上記のように、同一性、純度、および均一性についてａＳＥＣ－ＭＡＬＳおよびａＣＩＥＸによってさらに特性評価された。
事前精製された材料とピークＢのａＳＥＣ分離プロファイル（ＭＡＬＳによって決定された成分種のＭＷを含む）を示すクロマトグラム、およびピークＢのａＣＩＥＸ分離プロファイルを、図３１Ｂ～Ｃに示す。プロファイルは、ピークＢがＸＥＮＰ２８９２５ヘテロ二量体の計算された分子量（アミノ酸配列に基づく）と一致する約１２８ ｋＤａの優勢な種を含む。特に、事前に精製された材料の分離プロファイルは、材料の９７％超が二重特異性抗体ヘテロ二量体であったことを示す。
まとめると、これは、ＡＮ１ Ｈ１．８ ＶＨバリアントが、αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ヘテロ二量体の産生を改善し、汚染種からのヘテロ二量体の分離を改善できることを示している。
４Ｂ：生産性を向上させるための２＋１ＦＡＢ２－ＳＣＦＶ－ＦＣ二重特異性フォーマットの骨格の操作
４Ｂ（ａ）：ＸＥＮＰ３１４１９の産生により、タンパク質集団がＶＨ－Ｆｃホモ二量体にスキューした
ＸＥＮＰ３１１４９（２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－ＦｃフォーマットのαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂ；図２３に示す配列）を上記のようにＨＥＫ２９３Ｅ上清から精製した。図３２Ａは、ＸＥＮＰ３１１４９の精製パート２（プロテインＡクロマトグラフィーに続くカチオン交換クロマトグラフィー）を示すクロマトグラムを示している。クロマトグラムは、２つのピーク（優勢なピークＢおよび微小ピークＢ）の単離を示し、これは、以下に一般的に上述される同一性、純度、および均一性について多角度光散乱を備えた分析サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ－ＭＡＬＳ）によって、同一性についてさらに特性評価した。
４Ｂ（ａ）：ＸＥＮＰ３１４１９の産生により、タンパク質集団がＶＨ－Ｆｃホモ二量体にスキューした
ＸＥＮＰ３１１４９（２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－ＦｃフォーマットのαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂ；図２３に示す配列）を上記のようにＨＥＫ２９３Ｅ上清から精製した。図３２Ａは、ＸＥＮＰ３１１４９の精製パート２（プロテインＡクロマトグラフィーに続くカチオン交換クロマトグラフィー）を示すクロマトグラムを示している。クロマトグラムは、２つのピーク（優勢なピークＢおよび微小ピークＢ）の単離を示し、これは、以下に一般的に上述される同一性、純度、および均一性について多角度光散乱を備えた分析サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ－ＭＡＬＳ）によって、同一性についてさらに特性評価した。
ピークＡおよびＢのＳＥＣ分離プロファイルを示すクロマトグラムが、ＭＡＬＳによって決定された構成種のおおよそのＭＷとともに図３２Ｂに示されている。プロファイルは、優勢なピークＡがＶＨ－Ｆｃホモ二量体の計算された分子量と一致する分子量１４８．４ ｋＤａの種を含み、微小ピークＢがＸＥＮＰ３１１４９ヘテロ二量体の計算された分子量と一致する分子量１７３．９ｋＤａの種を含むことを示している。このように、産生は非常に低い１２．４ｍｇ／Ｌ力価のＸＥＮＰ３１１４９ヘテロ二量体をもたらした。
４Ｂ（ｂ）：Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃチェーンの完全ヒンジの操作が、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃヘテロ二量体の収量を向上させた
Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ鎖のＶＨとｓｃＦｖの間のリンカー、またはｓｃＦｖとＣＨ２の間のリンカーを変えるなど、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃヘテロ二量体の収量を高めるための様々なアプローチを調査した。ＸＥＮＰ３１４１９（図２３に示されている配列）を、ｓｃＦｖとＣＨ２領域との間にフレックスハーフヒンジ（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号ＸＸ）ではなく完全ヒンジ（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号ＸＸ）を有するＸＥＮＰ３１１４９対応物として操作した。ＸＥＮＰ３１４１９は、上記のようにＨＥＫ２９３Ｅの上清から産生および精製された。図３３Ａは、ＸＥＮＰ３１４１９の精製パート２（プロテインＡクロマトグラフィーに続くカチオン交換クロマトグラフィー）を示すクロマトグラムを表示する。クロマトグラムは、２つのピーク（微小ピークＡおよび優勢なピークＢ）の単離を示し、これは、以下に一般的に記載される同一性について多角度光散乱を備えた分析サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ－ＭＡＬＳ）によってさらに特性評価した。
Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ鎖のＶＨとｓｃＦｖの間のリンカー、またはｓｃＦｖとＣＨ２の間のリンカーを変えるなど、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃヘテロ二量体の収量を高めるための様々なアプローチを調査した。ＸＥＮＰ３１４１９（図２３に示されている配列）を、ｓｃＦｖとＣＨ２領域との間にフレックスハーフヒンジ（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号ＸＸ）ではなく完全ヒンジ（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号ＸＸ）を有するＸＥＮＰ３１１４９対応物として操作した。ＸＥＮＰ３１４１９は、上記のようにＨＥＫ２９３Ｅの上清から産生および精製された。図３３Ａは、ＸＥＮＰ３１４１９の精製パート２（プロテインＡクロマトグラフィーに続くカチオン交換クロマトグラフィー）を示すクロマトグラムを表示する。クロマトグラムは、２つのピーク（微小ピークＡおよび優勢なピークＢ）の単離を示し、これは、以下に一般的に記載される同一性について多角度光散乱を備えた分析サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ－ＭＡＬＳ）によってさらに特性評価した。
ピークＡおよびＢのＳＥＣ分離プロファイルを示すクロマトグラムが、ＭＡＬＳによって決定された構成種のおおよそのＭＷとともに図３３Ｂに示されている。プロファイルは、微小なピークＡがＶＨ－Ｆｃホモ二量体の計算された分子量と一致する分子量１５２．２ ｋＤａの種を含み、優勢なピークＢがＸＥＮＰ３１４１９ヘテロ二量体の計算された分子量と一致する分子量１８０ｋＤａの種を含むことを示している。このように、産生は非常に改善された１０７．８ｍｇ／Ｌ力価のＸＥＮＰ３１４１９ヘテロ二量体をもたらした。
実施例５：選択性および治療指数を高めるためのαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂの調整
以下の実験を、一般に、ＫＵ８１２を、ＥＮＰＰ３高標的細胞として（ＥＮＰＰ３＋腫瘍細胞の代用として）使用して、またはＲＣＣ４をＥＮＰＰ３低標的細胞として（腫瘍環境の外側の細胞の代用として）使用して実施した。標的細胞を、３７℃で、示されたエフェクター対標的細胞比で、ヒトＰＢＭＣおよび被験物質とともにインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＡｑｕａ Ｚｏｍｂｉｅ染料で室温で１５分間染色した。次に、細胞を洗浄し、細胞表面マーカーの抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。ＲＴＣＣの誘導を、ＣＳＦＥ＋標的細胞のＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ染色を使用して決定し、Ｔ細胞の活性化と脱顆粒を、リンパ球でのＣＤ１０７ａ、ＣＤ２５、およびＣＤ６９の発現によって決定した。いくつかの工学的アプローチが同時に調査されたため、一部のデータセットは同じ実験からのものであることに注意する必要がある。
以下の実験を、一般に、ＫＵ８１２を、ＥＮＰＰ３高標的細胞として（ＥＮＰＰ３＋腫瘍細胞の代用として）使用して、またはＲＣＣ４をＥＮＰＰ３低標的細胞として（腫瘍環境の外側の細胞の代用として）使用して実施した。標的細胞を、３７℃で、示されたエフェクター対標的細胞比で、ヒトＰＢＭＣおよび被験物質とともにインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＡｑｕａ Ｚｏｍｂｉｅ染料で室温で１５分間染色した。次に、細胞を洗浄し、細胞表面マーカーの抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。ＲＴＣＣの誘導を、ＣＳＦＥ＋標的細胞のＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ染色を使用して決定し、Ｔ細胞の活性化と脱顆粒を、リンパ球でのＣＤ１０７ａ、ＣＤ２５、およびＣＤ６９の発現によって決定した。いくつかの工学的アプローチが同時に調査されたため、一部のデータセットは同じ実験からのものであることに注意する必要がある。
高親和性ＣＤ３結合および高親和性ＥＮＰＰ３結合を有するプロトタイプ１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重特異性抗体によるオンターゲット／オフ腫瘍殺傷の可能性を調査するために、ＫＵ８１２およびＲＣＣ４細胞をヒトＰＢＭＣと（１０：１のエフェクター対標的細胞比）と、ＸＥＮＰ２８９２５の示された濃度で、３７℃で１８時間インキュベートした。図３４に示されているデータは、ＸＥＮＰ２８９２５がＥＮＰＰ３高ＫＵ８１２細胞でＲＴＣＣを誘導したことを示しているが、ＸＥＮＰ２８９２５はＥＮＰＰ３低ＲＣＣ４細胞でもＲＴＣＣを誘導し、αＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体の治療指数を改善する余地があることを示している。したがって、プロトタイプαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂは、選択性および治療指数を高めることを目的としてさらに操作された。
５Ａ：ＥＮＰＰ３結合親和性の調整
最初のアプローチでは、ＥＮＰＰ３結合親和性の調整を検討した。バリアントＥＮＰＰ３結合アームは、ＥＮＰＰ３結合親和性のラダーを作成することを目的として、可変軽鎖ドメインバリアントで操作し、その例示的なシーケンスは、図１３（可変領域の場合）および図１６（１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｂｓＡｂに関して）示されている。
最初のアプローチでは、ＥＮＰＰ３結合親和性の調整を検討した。バリアントＥＮＰＰ３結合アームは、ＥＮＰＰ３結合親和性のラダーを作成することを目的として、可変軽鎖ドメインバリアントで操作し、その例示的なシーケンスは、図１３（可変領域の場合）および図１６（１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｂｓＡｂに関して）示されている。
親和性操作されたαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの細胞表面ＥＮＰＰ３への結合を調べた。ＫＵ８１２細胞は、示された濃度の示された被験物質とともにインキュベートした。次に、細胞をＦｃγフラグメント特異的二次抗体で染色して被験物質を検出し、フローサイトメトリーで分析した。図３５に示すデータは、親和性操作されたαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂが、高（Ｌ１可変軽鎖を有するＸＥＮＰ２８９２５）から中間（Ｌ１．３３可変軽鎖を有するＸＥＮＰ２９５１６）から低（Ｌ１．７７可変軽鎖を有するＸＥＮＰ３０２６２）まで、ＥＮＰＰ３高ＫＵ８１２細胞への様々な結合効力の範囲を示したことを表示している。
次に、二重特異性抗体の選択性に対するＥＮＰＰ３結合親和性の調節の影響を調査するために、ＫＵ８１２（ＥＮＰＰ３高）およびＲＣＣ４（ＥＮＰＰ３低）細胞をヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクター対標的細胞比）と、固定ＣＤ３効力を有する以下の二重特異性抗体（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ）：ＸＥＮＰ２８９２５（ＷＴ高ＥＮＰＰ３結合）、ＸＥＮＰ２９５１６（中間ＥＮＰＰ３結合）、またはＸＥＮＰ３０２６２（低ＥＮＰＰ３結合）と、３７℃で４２時間インキュベートした。図３６に示したデータは、ＸＥＮＰ２９５１６およびＸＥＮＰ３０２６２の両方が、ＸＥＮＰ２８９２５と比較して、ＥＮＰＰ３低細胞でのＲＴＣＣの誘導が実質的に効力が弱く、ＲＴＣＣ効力が上記のように結合効力と相関していることを示している。しかしながら、ＸＥＮＰ２９５１６およびＸＥＮＰ３０２６２は、ＥＮＰＰ３高細胞でのＲＴＣＣの誘導がそれほど強力ではないことも示した。
５Ｂ：ＣＤ３結合力の調整
ＣＤ３に対する親和性を低下させることも、薬物動態の改善およびサイトカイン放出の減弱に向けて検討した。ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１ ｓｃＦｖを有するαＥＮＰＰ３×αＣＤ３１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｂｓＡｂを操作し、その例示的な配列を図１８に示す。
ＣＤ３に対する親和性を低下させることも、薬物動態の改善およびサイトカイン放出の減弱に向けて検討した。ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１ ｓｃＦｖを有するαＥＮＰＰ３×αＣＤ３１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｂｓＡｂを操作し、その例示的な配列を図１８に示す。
サイトカイン放出の誘導を調査するために、ＫＵ８１２およびＲＣＣ４細胞をヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクター対標的細胞比）と、示された濃度のＸＥＮＰ２８９２５（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ）またはＸＥＮＰ２９４３６（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１）と、３７℃で１８時間インキュベートした。ＩＦＮγ、ＩＬ－６、およびＴＮＦαの放出は、Ｖ－ＰＬＥＸ前炎症性パネル１ヒトキット（製造元のプロトコル；Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）を使用して決定され、これらのデータは図３７および３８に示されている。
ＣＤ３結合力を調製することが選択制に影響を及ぼすかどうかを調査するために、別の実験を実施し、ここでは、ＫＵ８１２（ＥＮＰＰ３高）およびＲＣＣ４（ＥＮＰＰ３低）細胞を、ヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクター対標的細胞比）と、示された濃度のＸＥＮＰ２８９２５（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ）またはＸＥＮＰ２９４３６（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１）と、３７℃で４２時間インキュベートした。図３９に示されたデータは、ＸＥＮＰ２９４３６がＸＥＮＰ２８９２５と比較して、ＥＮＰＰ３低細胞でのＲＴＣＣの誘導の効力が実質的に弱いことを実証しているが、ＸＥＮＰ２９４３６はまた、ＥＮＰＰ３高細胞でのＲＴＣＣの誘導における効力の低下も実証したことを示している。
５Ｃ：ＥＮＰＰ３結合親和性およびＣＤ３結合効力の両方の調整
次に、ＥＮＰＰ３およびＣＤ３の両方の結合力を低下させる効果を調べた。効力が低下したＥＮＰＰ３結合ドメインおよびＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１ｓｃＦｖを有するαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ １＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｂｓＡｂを操作し、その配列を図１８に示す。
次に、ＥＮＰＰ３およびＣＤ３の両方の結合力を低下させる効果を調べた。効力が低下したＥＮＰＰ３結合ドメインおよびＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１ｓｃＦｖを有するαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ １＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｂｓＡｂを操作し、その配列を図１８に示す。
ＫＵ８１２細胞を、ヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）および示された濃度のＸＥＮＰ２８９２５（ＥＮＰＰ３ Ｈｉｇｈ；ＣＤ３ Ｈｉｇｈ）、ＸＥＮＰ２９４３６（ＥＮＰＰ３ Ｈｉｇｈ；ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１）、ＸＥＮＰ２９５１８（ＥＮＰＰ３ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ；ＣＤ３ Ｈｉｇｈ）、ＸＥＮＰ２９４６３（ＥＮＰＰ３ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ；ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１）、ＸＥＮＰ３０２６２（ＥＮＰＰ３ Ｌｏｗ；ＣＤ３ Ｈｉｇｈ）、またはＸＥＮＰ３０２６３（ＥＮＰＰ３ Ｌｏｗ；ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１）と、３７℃で１８時間インキュベートした。ＩＦＮγの放出は、Ｖ－ＰＬＥＸ前炎症性パネル１ヒトキットを使用して決定した。図４０に示されるデータは、ＣＤ３またはＥＮＰＰ３の結合力を低下させると、サイトカイン放出の誘導が低下することを示している。特に、ＣＤ３およびとＥＮＰＰ３の結合力を低下させると、サイトカイン放出の誘導がさらに低下する。
５Ｄ：ＥＮＰＰ３結合価およびＥＮＰＰ３結合力の両方の調整
減少したＥＮＰＰ３結合力が、ＥＮＰＰ３低およびＥＮＰＰ３高細胞の両方への結合を減少させるが、増加した結合価がＥＮＰＰ３高細胞に対する効力を回復することができると仮定した。したがって、ＥＮＰＰ３結合力が低下したαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体は、２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで操作され、その配列を図１９に示す。
減少したＥＮＰＰ３結合力が、ＥＮＰＰ３低およびＥＮＰＰ３高細胞の両方への結合を減少させるが、増加した結合価がＥＮＰＰ３高細胞に対する効力を回復することができると仮定した。したがって、ＥＮＰＰ３結合力が低下したαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体は、２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで操作され、その配列を図１９に示す。
ＫＵ８１２（ＥＮＰＰ３高）およびＲＣＣ４（ＥＮＰＰ３低）細胞をヒトＰＢＭＣ（１０：１エフェクター対標的細胞比）と、示された濃度のＸＥＮＰ２８９２５（一価高ＥＮＰＰ３結合）、ＸＥＮＰ２９５１６（一価中間ＥＮＰＰ３結合）、ＸＥＮＰ２９５２０（二価中間ＥＮＰＰ３結合）、ＸＥＮＰ３０２６２（一価低ＥＮＰＰ３結合）、またはＸＥＮＰ３０２６４（二価低ＥＮＰＰ３結合）と、３７℃で４２時間インキュベートした。
データ（図４１に示した）は、二価結合（中間ＥＮＰＰ３結合を伴う）がＥＮＰＰ３低細胞でのＲＴＣＣ効力の低下を維持したが、ＸＥＮＰ２８９２５によって示されたものに近いＥＮＰＰ３高細胞でのＲＴＣＣ効力を回復したことを示している。データ（図４２に示した）は、二価結合（低いＥＮＰＰ３結合を伴う）がＥＮＰＰ３低細胞でのＲＴＣＣ効力をさらに低下させ、ＥＮＰＰ３高細胞でのいくらかのＲＴＣＣ効力を回復したことを示している。まとめると、データは、減少したＥＮＰＰ３結合親和性と、増加したＥＮＰＰ３結合価とを組み合わせることで、選択制を向上させるという仮説を立証した。
５Ｅ：ＥＮＰＰ３結合価およびＣＤ３結合力の両方の調整
次に、増加したＥＮＰＰ３結合価と減少したＣＤ３結合親和性の組み合わせを調査した。したがって、ＣＤ３結合力が低下したαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体は、２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで操作され、その配列を図２０に示す。
次に、増加したＥＮＰＰ３結合価と減少したＣＤ３結合親和性の組み合わせを調査した。したがって、ＣＤ３結合力が低下したαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体は、２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで操作され、その配列を図２０に示す。
ＫＵ８１２細胞を、ヒトＰＢＭＣ（１０：１エフェクター対標的細胞比）と、示された濃度のＸＥＮＰ２８９２５（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ；一価ＥＮＰＰ３結合）、ＸＥＮＰ２９４３７（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ；二価ＥＮＰＰ３結合）、ＸＥＮＰ２９４３６（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１；一価ＥＮＰＰ３結合）、またはＸＥＮＰ２９４３８（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１；二価ＥＮＰＰ３結合）と、３７℃で４４時間インキュベートした。予期せぬことに、データ（図４３に示す）は、ＸＥＮＰ２９４３８がＫＵ８１２細胞でＲＴＣＣを誘導できなかったことを示している。
５Ｅ（ａ）：減少した効力のＣＤ３結合ドメインの修復活性
２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｂｓＡｂで使用するためにＨｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１ ＣＤ３結合ドメインの活性を修復するために検討された１つのアプローチは、αＣＤ３ｓｃＦｖの可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの方向を交換することであった。新しいｓｃＦｖについての配列を図１０に示す。ここで、αＣＤ３ｓｃＦｖは、ＶＨ／ＶＬまたはＶＬ／ＶＨのいずれかとして指定され、それらの構成要素の可変ドメインの方向を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体ＶＬ／ＶＨ ＣＤ３ｓｃＦｖは、２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで操作され、その配列を図２１～２２に示す。
２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｂｓＡｂで使用するためにＨｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１ ＣＤ３結合ドメインの活性を修復するために検討された１つのアプローチは、αＣＤ３ｓｃＦｖの可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの方向を交換することであった。新しいｓｃＦｖについての配列を図１０に示す。ここで、αＣＤ３ｓｃＦｖは、ＶＨ／ＶＬまたはＶＬ／ＶＨのいずれかとして指定され、それらの構成要素の可変ドメインの方向を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体ＶＬ／ＶＨ ＣＤ３ｓｃＦｖは、２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで操作され、その配列を図２１～２２に示す。
ＫＵ８１２ （ＥＮＰＰ３高）およびＲＣＣ４（ＥＮＰＰ３低）細胞を、ヒトＰＢＭＣ（１０：１エフェクター対標的細胞比）と、示された濃度のＸＥＮＰ２９４３７（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ ＶＨ／ＶＬ；二価ＥＮＰＰ３結合）、ＸＥＮＰ３０４６９（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ ＶＬ／ＶＨ；二価ＥＮＰＰ３結合）、ＸＥＮＰ２９４２８（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１ ＶＨ／ＶＬ；二価ＥＮＰＰ３結合）、またはＸＥＮＰ３０４７０（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃２ ＶＬ／ＶＨ；二価ＥＮＰＰ３結合）と、３７℃で４４時間インキュベートした。図４４に示したデータは、ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１ｓｃＦｖの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインの方向を交換すると、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｂｓＡｂフォーマットとの関連でその活性が復元されることを示した。これは、２＋１のＦａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｂｓＡｂフォーマット（ＸＥＮＰ３０４６９の場合のように）と関連してＣＤ３ Ｈｉｇｈ ｓｃＦｖ中の可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインの方向を交換するとき、効力のはるかに適度な増加を考慮すると、驚くべきことである。さらに、オクテット実験（データは示していない）では、可変ドメインの方向を交換しても、ＣＤ３抗原に対する分子の結合親和性に影響がないことがわかり、ＶＬ／ＶＨ交換によるＲＴＣＣ活性の予期しない回復がさらに強調された。
５Ｆ：：２＋１ＦＡＢ２－ＳＣＦＶ－ＦＣフォーマットにおけるＥＮＰＰ３およびＣＤ３結合力の微調整
上記の統一的な発見（すなわち、選択性と効力との間には相容れない関係（ｔｒａｄｅｏｆｆ）がある）を考慮して、ＥＮＰＰ３とＣＤ３の結合効力の様々な組み合わせを有する、２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ フォーマットの追加のαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体を、異なる選択性／効力プロファイルを有する一連の分子を提供するために生成し、その配列を、図１７～２３全体にわたって示している。
上記の統一的な発見（すなわち、選択性と効力との間には相容れない関係（ｔｒａｄｅｏｆｆ）がある）を考慮して、ＥＮＰＰ３とＣＤ３の結合効力の様々な組み合わせを有する、２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ フォーマットの追加のαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体を、異なる選択性／効力プロファイルを有する一連の分子を提供するために生成し、その配列を、図１７～２３全体にわたって示している。
ＫＵ８１２（ＥＮＰＰ３高）およびＲＣＣ４（ＥＮＰＰ３低）細胞を、ヒトＰＢＭＣ（１０：１エフェクター対標的細胞比）と、示された濃度のＸＥＮＰ２９５２０（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ［ＶＨ／ＶＬ］；二価のＥＮＰＰ３中間結合）、ＸＥＮＰ３０８１９（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１［ＶＬ／ＶＨＬ］；二価のＥＮＰＰ３中間結合）、ＸＥＮＰ３１１４９（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃２［ＶＬ／ＶＨＬ］；二価のＥＮＰＰ３中間結合）、ＸＥＮＰ３０２６４（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ［ＶＨ／ＶＬ］二価のＥＮＰＰ３低結合）、ＸＥＮＰ３０８２１（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１［ＶＬ／ＶＨＬ］；二価のＥＮＰＰ３低結合）、またはＸＥＮＰ３１１５０（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃２［ＶＬ／ＶＨＬ］；二価のＥＮＰＰ３低結合）とインキュベートした。図４５に示したデータは、各分子がＥＮＰＰ３高細胞とＥＮＰＰ３低細胞に対するＲＴＣＣ効力の間で良好な分離を提供したことを示している。
実施例６：αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、インビボでのＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強し、ＰＤ－１遮断薬とうまく結合する
６Ａ：抗ＥＮＰＰ３ Ｘ抗ＣＤ３ ＢＳＡＢは、インビボのＫＵ８１２細胞で活性である
最初の研究では、ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウス（ｎ＝１０）に、１５日目に右脇腹に、５×１０６個のＫＵ８１２細胞を移植した。０日目に、マウスに５×１０６個のヒトＰＢＭＣを腹腔内生着させた。次いで、マウスを０、７、１４、および２１日目に、ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９で、低用量もしくは高用量で、単独で、もしくは３ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて処置した（二価の抗ＰＤ－１ｍＡｂ、移植されたヒトＴ細胞を抑制解除することによって抗腫瘍活性を増強するチェックポイント阻害剤：配列は図４６に示す）。腫瘍体積を週に３回キャリパーで測定し（データは図４７に示されている）、リンパ球の増殖を調べるために採血した（データを図４８に示す）。各処置について個々のマウスプロットを、図５０Ａ～５０Ｎに示す。
６Ａ：抗ＥＮＰＰ３ Ｘ抗ＣＤ３ ＢＳＡＢは、インビボのＫＵ８１２細胞で活性である
最初の研究では、ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウス（ｎ＝１０）に、１５日目に右脇腹に、５×１０６個のＫＵ８１２細胞を移植した。０日目に、マウスに５×１０６個のヒトＰＢＭＣを腹腔内生着させた。次いで、マウスを０、７、１４、および２１日目に、ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９で、低用量もしくは高用量で、単独で、もしくは３ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて処置した（二価の抗ＰＤ－１ｍＡｂ、移植されたヒトＴ細胞を抑制解除することによって抗腫瘍活性を増強するチェックポイント阻害剤：配列は図４６に示す）。腫瘍体積を週に３回キャリパーで測定し（データは図４７に示されている）、リンパ球の増殖を調べるために採血した（データを図４８に示す）。各処置について個々のマウスプロットを、図５０Ａ～５０Ｎに示す。
データは、各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂが、低用量および／または高用量の処置で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができることを示している。特に、３ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ３０８１９単独での処置は、ＰＤ－１遮断（ＸＥＮＰ１６４３２）単独と比較して、５日目までに抗腫瘍活性（腫瘍体積の変化によって示される）を有意に増強した。７日目までに、より低い１ｍｇ／ｋｇの用量のＸＥＮＰ３０８１９単独での処置は、ＰＤ－１遮断単独と比較して抗腫瘍活性を有意に増強した。マンホイットニー検定を使用して、ベースライン補正データに対して統計を実行し、有意性は、ｐ＜０．５を意味する。さらに、７日目までに、６ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ３０８２１（ＸＥＮＰ３０８１９よりもインビトロでの効力が低い）とＰＤ－１遮断薬と組み合わせによる処置は、ＰＤ－１遮断薬単独と比較して抗腫瘍活性を有意に増強し、また１６日目までに、６ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ３１４１９（ＸＥＮＰ３０８１９とＸＥＮＰ３０８２１の両方よりもＣＤ３に対する親和性が低い）とＰＤ－１遮断薬との組み合わせによる処置は、ＰＤ－１遮断薬単独と比較して抗腫瘍活性を有意に増強した。まとめると、これは、αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂがＰＤ－１遮断薬と生産的に組み合わさることを示した。マンホイットニー検定を使用して、ベースライン補正データに対して統計を実行し、有意性は、ｐ＜０．５を意味する。さらに、図４８に示すように、αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂをＰＤ－１遮断薬と組み合わせると、リンパ球の増殖が促進された。
６Ｂ：抗ＥＮＰＰ３ Ｘ抗ＣＤ３ ＢＳＡＢは、インビボのＲＸＦ－３９３細胞で活性である
２番目の研究では、より臨床的に関連性のあるヒト腎細胞癌細胞株であるＲＸＦ－３９３を使用した。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウス（ｎ＝１０）に、８日目に右脇腹に、１×１０６個のＲＸＦ－３９３細胞を移植した。０日目に、マウスに５×１０６個のヒトＰＢＭＣを腹腔内生着させた。次いで、マウスを０、７、１４、２１、および２８日目に、ＸＥＮＰ３０８１９またはＸＥＮＰ３１４１９で、低用量、中容量、もしくは高用量で、単独で、もしくは３ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ１６４３２（ＰＤ－１遮断薬）と組み合わせて処置した。腫瘍体積を、キャリパーで週に３回測定した（これについてのデータを図４９に示す）。各処置について個々のマウスプロットを、図５１Ａ～５１Ｌに示す。データは、各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂが、低用量、中間および／または高用量の処置で、ＲＸＦ－３９３細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができることを示している。ＸＥＮＰ３１４１９（ＣＤ３結合の効力が低い）単独では、ＸＥＮＰ３０８１９よりも効果が低くなるが、ＰＤ－１遮断薬と組み合わせると、その抗腫瘍効果を増強させる。
２番目の研究では、より臨床的に関連性のあるヒト腎細胞癌細胞株であるＲＸＦ－３９３を使用した。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウス（ｎ＝１０）に、８日目に右脇腹に、１×１０６個のＲＸＦ－３９３細胞を移植した。０日目に、マウスに５×１０６個のヒトＰＢＭＣを腹腔内生着させた。次いで、マウスを０、７、１４、２１、および２８日目に、ＸＥＮＰ３０８１９またはＸＥＮＰ３１４１９で、低用量、中容量、もしくは高用量で、単独で、もしくは３ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ１６４３２（ＰＤ－１遮断薬）と組み合わせて処置した。腫瘍体積を、キャリパーで週に３回測定した（これについてのデータを図４９に示す）。各処置について個々のマウスプロットを、図５１Ａ～５１Ｌに示す。データは、各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂが、低用量、中間および／または高用量の処置で、ＲＸＦ－３９３細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができることを示している。ＸＥＮＰ３１４１９（ＣＤ３結合の効力が低い）単独では、ＸＥＮＰ３０８１９よりも効果が低くなるが、ＰＤ－１遮断薬と組み合わせると、その抗腫瘍効果を増強させる。
実施例７：２：１の混合原子価フォーマットを利用したＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性抗体による腫瘍選択的細胞傷害性
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）×ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｔ細胞を動員して、腫瘍細胞に対する細胞傷害性を媒介することが示されている。ＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の薬力学および耐容性は、腫瘍負荷、細胞表面抗原密度、および正常組織発現などのＴＡＡ生物学の複数の態様の影響を受ける。二価／一価（２：１）混合原子価フォーマットを使用して、ＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性の複数の例が設計されているため、そのような二重特異性は、それぞれ腫瘍対正常細胞を模倣する高抗原密度細胞株対低抗原密度細胞株の選択的リダイレクトＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）を示す。２：１フォーマットによって示される選択性は、ＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性抗体に、腫瘍抗原生物学の拡張されたセットに対処する力を与える可能性がある。
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）×ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｔ細胞を動員して、腫瘍細胞に対する細胞傷害性を媒介することが示されている。ＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の薬力学および耐容性は、腫瘍負荷、細胞表面抗原密度、および正常組織発現などのＴＡＡ生物学の複数の態様の影響を受ける。二価／一価（２：１）混合原子価フォーマットを使用して、ＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性の複数の例が設計されているため、そのような二重特異性は、それぞれ腫瘍対正常細胞を模倣する高抗原密度細胞株対低抗原密度細胞株の選択的リダイレクトＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）を示す。２：１フォーマットによって示される選択性は、ＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性抗体に、腫瘍抗原生物学の拡張されたセットに対処する力を与える可能性がある。
ヘテロ二量体Ｆｃは、原子価が変更された次世代の二重特異性フォーマットを強化した。そのようなヘテロ二量体Ｆｃタンパク質（例えば、図５３を参照）としては、２：１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重特異性タンパク質（例えば、結合力または選択性が必要な場合のＣＤ３二重特異性）、１：１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重特異性タンパク質（例えば、デュアルチェックポイント標的またはチェックポイント標的ｘ共刺激標的）、Ｙ／Ｚ－Ｆｃタンパク質（例えば、ヘテロサイトカイン）、抗Ｘ×Ｙ／Ｚ－Ｆｃタンパク質（例えば、標的化サイトカイン）、およびワンアームＦｃタンパク質（例えば、一価サイトカイン）が挙げられるが、これらに限定されない。
安定した正常に動作するヘテロ二量体Ｆｃ領域により、２：１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重特異性フォーマットが可能になった。Ｆｃ置換の新規セットは、熱安定性をほとんど変化させることなく、９５％を超えるヘテロ二量体収率を達成することができた（図５４）。さらに、Ｆｃ領域での等電点の違いにより、ヘテロ二量体の直接的な精製が可能になった。三次構造への影響を最小限に抑えるために、等比体積置換が使用された。図５５は、ｐＩで操作されたＦｃダイマーとｐＩで操作されたＦｃヘテロ二量体の分析ＩＥＸによって決定された標準プロテインＡ精製後の分布を示している。ｐＩで操作されたＦｃ二量体とｐＩで操作されたＦｃヘテロ二量体の熱安定性には、ほとんど違いがなかった。ヒンジとＣＨ２の置換により、ＦｃγＲの結合が失われた（図５６）。Ｆｃサイレンシングされた構築物は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ）、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）、およびＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）の結合を実質的に示さなかった。
２：１のＦａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットがまた、正常細胞上の低密度を有する固形腫瘍抗原の標的化を可能にするＴＡＡの原子価およびＴＡＡ／ＣＤ３の親和性を調整することで、癌組織および正常組織を模倣した細胞株の選択的な細胞傷害性が可能になった（高／低抗原密度）。ＦＡＰ、ＳＳＴＲ２、ＥＮＰＰ３などのＴＡＡを対象とした二重特異性フォーマットを試験した。調整された１：１フォーマットは幅広い反応性を示し、調整された２：１フォーマットは高い選択性を示した（図５７Ａ～５７Ｃ）。調整された２：１二重特異性抗体は、可溶性抗原からの干渉を減らし、サイトカイン放出も減らした。
本明細書に記載の２：１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ＣＤ３二重特異性抗体は、安定しており、良好に動作し、簡単に精製できる。また、研究規模の生産も含めた生産は簡単であった。２：１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ＣＤ３二重特異性抗体は、ＤＳＣで測定した抗体のような熱安定性と、ＳＥＣで測定した好ましい溶液特性を示した（図５８）。二重特異性抗体はまた、ＩＥＸによって決定されたように高純度であった。
本明細書に記載の二重特異性を発現する安定な細胞株は、高い力価および高いヘテロ二量体を保因する割合を有していた。例えば、上位のクローンは、１～２ｇ／Ｌの振盪フラスコの収量を有し、ヘテロ二量体含有量は約９０％であった（図５９）。
本明細書に記載のＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の２：１混合原子価フォーマットは安定しており、容易に精製できる。それらはまた、腫瘍選択的細胞傷害性を示す。
実施例８：αＳＳＴＲ２×αＣＤ３二重特異性抗体の調整により、選択性の向上とサイトカイン放出の減弱を可能にした
調整されていないＸＥＮＰ１８０８７（１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｂｓＡｂ）および調整されたＸＥＮＰ３０４５８（２＋１（Ｆａｂ）２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｂｓＡｂ）を、ＲＴＣＣ実験で調査した。
調整されていないＸＥＮＰ１８０８７（１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｂｓＡｂ）および調整されたＸＥＮＰ３０４５８（２＋１（Ｆａｂ）２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｂｓＡｂ）を、ＲＴＣＣ実験で調査した。
最初の実験では、αＳＳＴＲ２×αＣＤ３二重特異性抗体を調整することによる選択性の改善が検討された。異なる密度（高、中、低）のＳＳＴＲ２でトランスフェクトされたＡ５４９細胞を使用した。ＣＦＳＥ標識Ａ５４９細胞を、ＸＥＮＰ１８０８７またはＸＥＮＰ３０４５８の存在下でヒトＰＢＭＣ（エフェクター：標的比２０：１）と４８時間インキュベートした。ＲＴＣＣ活性を示すデータ（Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ染色で示される）を図６０に示す。データは、ＸＥＮＰ３０４５８が高密度および中密度の細胞株でＸＥＮＰ１８０８７よりも強力にＲＴＣＣを誘導しなかったにもかかわらず、高濃度のＸＥＮＰ３０４５８でも効果的な標的細胞の死滅が達成可能であることを示している。ただし、特に、ＸＥＮＰ３０４５８は、高濃度で効果的な標的細胞の死滅を誘導したＸＥＮＰ１８０８７と比較して、非常に高濃度でも低密度細胞株でＲＴＣＣをほとんど誘導しなかった。
２番目の実験では、αＳＳＴＲ２×αＣＤ３二重特異性抗体を調整することによるサイトカイン放出の減弱を調べた。この実験では、ＳＳＴＲ２陽性であることが知られているより臨床的に関連性のあるヒト肺小細胞癌細胞株であるＣＯＲ－Ｌ２７９を使用した。ＣＦＳＥ標識ＣＯＲ－Ｌ２７９を、ＸＥＮＰ１８０８７またはＸＥＮＰ３０４５８の存在下で、ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター：標的比）と４８時間インキュベートした。標的細胞の死滅を示すデータを図６１Ａに示し、エフェクター細胞によるサイトカインの放出を示すデータを図６１Ｂ～Ｅに示す。図６１Ａに示すように、ＸＥＮＰ３０４５８はＸＥＮＰ１８０８７よりも強力にＲＴＣＣを誘導しなかったが、高濃度のＸＥＮＰ３０４５８でも完全な標的細胞の死滅を達成できなかった。しかしながら、図６１Ｂ～Ｅに示すように、ＸＥＮＰ３０４５８は、高用量でもＸＥＮＰ１８０８７と比較してサイトカイン放出を大幅に減少させた。
本発明の例示的な実施形態を本明細書に示し説明してきたが、そのような実施形態が例示としてのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。当業者には、本発明から逸脱することなく、数多くの変形、変更、および置換が想起されるであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替物が、本発明の実施において採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの均等物がそれによって網羅されることが意図される。
Claims (100)
- エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）結合ドメインを含む組成物であって、前記ＥＮＰＰ３結合ドメインが、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のいずれかの可変重鎖相補性決定領域１～３（ｖｈＣＤＲ１～３）および可変軽鎖相補性決定領域（ｖｌＣＤＲ１～３）を含む、組成物。
- 前記ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３が、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに提供されるＥＮＰＰ３結合ドメインの前記ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３配列から選択される、請求項１に記載の組成物。
- エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）結合ドメインを含む組成物であって、前記ＥＮＰＰ３結合ドメインが、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のいずれかの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む、組成物。
- エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）結合ドメインを含む組成物であって、前記ＥＮＰＰ３結合ドメインが、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）から選択される、組成物。
- 核酸組成物であって、
ａ）ＥＮＰＰ３結合ドメインの可変重鎖相補性決定領域１～３（ｖｈＣＤＲ１～３）を含む可変重鎖ドメインをコードする第１の核酸と、
ｂ）前記ＥＮＰＰ３結合ドメインの可変軽鎖相補性決定領域１～３（ｖｌＣＤＲ１～３）を含む可変軽鎖ドメインをコードする第２の核酸と、を含み、前記ＥＮＰＰ３結合ドメインが、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちの１つである、核酸組成物。 - 前記ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３が、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに提供されるｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３配列から選択される、請求項５に記載の核酸組成物。
- 核酸組成物であって、
ａ）ＥＮＰＰ３結合ドメインの可変重鎖ドメインを含む前記可変重鎖ドメインをコードする第１の核酸と、
ｂ）前記ＥＮＰＰ３結合ドメインの可変軽鎖ドメインを含む前記可変軽鎖ドメインをコードする第２の核酸と、を含み、
前記ＥＮＰＰ３結合ドメインが、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：
ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のいずれか１つである、核酸組成物。 - 発現ベクター組成物であって、
ａ）請求項５～７のいずれか一項に記載の第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項５～７のいずれか一項に記載の第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。 - 請求項８に記載の発現ベクター組成物を含む宿主細胞。
- 請求項１～９のいずれか一項に記載のエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）結合ドメインを作製する方法であって、前記ＥＮＰＰ３結合ドメインが発現される条件下で、請求項９に記載の宿主細胞を培養することと、前記ＥＮＰＰ３結合ドメインを回収することと、を含む、方法。
- エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）結合ドメインを含む抗ＥＮＰＰ３抗体であって、前記ＥＮＰＰ３結合ドメインが、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のいずれかの可変重鎖相補性決定領域１～３（ｖｈＣＤＲ１～３）および可変軽鎖相補性決定領域（ｖｌＣＤＲ１～３）を含む、抗ＥＮＰＰ３抗体。
- 前記ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３が、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉの以下のＥＮＰＰ３結合ドメインのいずれかの前記ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３から選択される、請求項１１に記載の抗ＥＮＰＰ３抗体。
- エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）結合ドメインを含む抗ＥＮＰＰ３抗体であって、前記ＥＮＰＰ３結合ドメインが、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のいずれかの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む、抗ＥＮＰＰ３抗体。
- エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）結合ドメインを含む抗ＥＮＰＰ３抗体であって、前記ＥＮＰＰ３結合ドメインが、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のうちのいずれか１つから選択される、抗ＥＮＰＰ３抗体。
- 前記抗体が、
ａ）第１の抗原結合ドメインおよび第１の定常ドメインを含む第１の単量体と、
ｂ）第２の抗原結合ドメインおよび第２の定常ドメインを含む第２の単量体と、を含み、
前記第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインのいずれかが、前記ＥＮＰＰ３結合ドメインである、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の抗体。 - 前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、請求項１５に記載の抗体。
- 前記第１の抗原結合ドメインが、前記ＥＮＰＰ３結合ドメインであり、前記第２の抗原結合ドメインが、ＣＤ３結合ドメインである、請求項１６に記載の抗体。
- 前記ＣＤ３結合ドメインが、以下のＣＤ３結合ドメイン：Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）のいずれかの前記ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３を含む、請求項１７に記載の抗体。
- 前記ＣＤ３結合ドメインの前記ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３が、図１０Ａ～１０Ｆの前記ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３から選択される、請求項１７に記載の抗体。
- 前記ＣＤ３結合ドメインが、以下のＣＤ３結合ドメイン：Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）のいずれかの前記可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む、請求項１７に記載の抗体。
- 前記ＣＤ３結合ドメインが、抗ＣＤ３ｓｃＦｖである、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記第１および第２の定常ドメインがそれぞれ、ＣＨ２－ＣＨ３を含む、請求項１５～２１のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記第１および第２の定常ドメインがそれぞれ、ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む、請求項１５～２１のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記第１および第２の定常ドメインがそれぞれ、バリアント定常ドメインである、請求項１６～２３のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記第１および第２の単量体が、図１Ａ～１Ｅに示されるものからなる群から選択されるヘテロ二量体化バリアントのセットを含む、請求項１６～２４のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記選択されるヘテロ二量体化バリアントのセットが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ；Ｄ４０１Ｋ：Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ；およびＴ３６６Ｗ：Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖからなる群に由来する、請求項２５に記載の抗体。
- 前記第１および第２の単量体がそれぞれ、除去バリアントをさらに含む、請求項２または２６に記載の抗体。
- 前記除去バリアントが、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋである、請求項２７に記載の抗体。
- 前記第１または第２の単量体のうちの少なくとも１つが、ｐＩバリアントをさらに含む、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記除去バリアントが、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄである、請求項２９に記載の抗体。
- 前記ｓｃＦｖが、荷電ｓｃＦｖリンカーを含む、請求項２１に記載の抗体。
- 請求項１１～３１のいずれか一項に記載の抗ＥＮＰＰ３抗体をコードする核酸を含む、核酸組成物。
- 請求項１５～３１のいずれか一項に記載の第１および第２の単量体をコードする核酸を含む、核酸組成物。
- 請求項３２または３３に記載の核酸を含む、発現ベクター。
- 請求項３４に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
- 抗ＥＮＰＰ３抗体を作製する方法であって、請求項３５に記載の宿主細胞を、前記抗ＥＮＰＰ３抗体が発現される条件下で培養することと、前記抗ＥＮＰＰ３抗体を回収することと、を含む、方法。
- 癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に、請求項１１～３１のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
- ヘテロ二量体抗体であって、
ａ）第１の単量体であって、
ｉ）第１の可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、および第１の可変重鎖ドメインを含む抗ＣＤ３ｓｃＦｖと、
ｉｉ）第１のＦｃドメインと、を含み、前記ｓｃＦｖが、ドメインリンカーを使用して前記第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合している、第１の単量体と、
ｂ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体を含む第２の単量体であって、ＶＨが第２の可変重鎖ドメインであり、ＣＨ２－ＣＨ３が第２のＦｃドメインである、第２の単量体と、
ｃ）第２の可変軽鎖ドメインを含む軽鎖と、を含み、
前記第２の可変重鎖ドメインおよび前記第２の可変軽鎖ドメインが、ＥＮＰＰ３結合ドメインを形成する、ヘテロ二量体抗体。 - 前記ＥＮＰＰ３結合ドメインが、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のいずれかのｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３を含む、請求項３８に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記ＥＮＰＰ３結合ドメインの前記ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３が、図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉに提供される前記ＥＮＰＰ３結合ドメインの前記ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３配列から選択される、請求項３９に記載のヘテロ二量体抗体。
- 第２の重可変ドメインが、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のいずれかの重可変ドメインを含み、第２の軽可変ドメインが、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のいずれかの可変軽ドメインを含む、請求項３８に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記抗ＣＤ３ｓｃＦｖが、以下のＣＤ３結合ドメイン：Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）のいずれかの前記ｖｈＣＤＲ１～３および前記ｖｌＣＤＲ１～３を含む、請求項３８～４１のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記抗ＣＤ３ｓｃＦｖの前記ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３が、図１０Ａ～１０Ｆの前記ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３から選択される、請求項４２に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記抗ＣＤ３ｓｃＦｖが、以下のＣＤ３結合ドメイン：Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）のいずれかの前記可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む、請求項４３に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第１の可変軽鎖ドメインが、ドメインリンカーを使用して、前記第１のＦｃドメインの前記Ｎ末端に共有結合している、請求項３８～４４のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第１の可変重鎖ドメインが、ドメインリンカーを使用して、前記第１のＦｃドメインの前記Ｎ末端に共有結合している、請求項３８～４５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記ｓｃＦｖリンカーが、荷電ｓｃＦｖリンカーである、請求項３８～４６のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第１および第２のＦｃドメインが、バリアントＦＣドメインである、請求項３８～４７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第１および第２の単量体が、図１Ａ～１Ｅに示されるものからなる群から選択されるヘテロ二量体化バリアントのセットを含む、請求項３８～４８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記選択されるヘテロ二量体化バリアントのセットが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ；Ｄ４０１Ｋ：Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ；およびＴ３６６Ｗ：Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖからなる群に由来し、番号付けが、ＥＵ番号付けに従う、請求項４９に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第１および第２の単量体が、除去バリアントをさらに含む、請求項４９または５０に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記除去バリアントが、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋであり、番号付けが、ＥＵ番号付けに従う、請求項５１に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第１または第２の単量体のうちの１つが、ｐＩバリアントを含む、請求項３８～５２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記ｐＩバリアントが、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄであり、番号付けが、ＥＵ番号付けに従う、請求項５３に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第１の単量体が、アミノ酸バリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、
前記第２の単量体が、アミノ酸バリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ／Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、
番号付けが、ＥＵの番号付けに従う、請求項３８～４７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。 - 前記ｓｃＦｖリンカーが、アミノ酸配列（ＧＫＰＧＳ）４を有する荷電ｓｃＦｖリンカーである、請求項５５に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第１および第２の単量体がそれぞれ、アミノ酸バリアント４２８／４３４Ｓをさらに含む、請求項５５に記載のヘテロ二量体抗体。
- 以下のヘテロ二量体抗体：ＸＥＮＰ２４８０４、ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２８２８７、ＸＥＮＰ２８９２５、ＸＥＮＰ２９５１６、ＸＥＮＰ３０２６２、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２９４３６、ＸＥＮＰ２８３９０、ＸＥＮＰ２９４６３、およびＸＥＮＰ３０２６３から選択される、請求項３８に記載のヘテロ二量体抗体。
- ヘテロ二量体抗体であって、
ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｓｃＦｖ－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第１の単量体であって、
ｓｃＦｖが、抗ＣＤ３ｓｃＦＶであり、ＣＨ２－ＣＨ３が、第１のＦｃドメインである、第１の単量体と、
ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第２の単量体であって、ＣＨ２－ＣＨ３が、第２のＦｃドメインである、第２の単量体と、
ｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖とを含み、
第１のバリアントＦｃドメインが、アミノ酸バリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、
第２のバリアントＦｃドメインが、アミノ酸バリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、
前記第１および第２のバリアントＦｃドメインがそれぞれ、アミノ酸バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、
前記第２の単量体の前記ヒンジＣＨ２－ＣＨ３が、アミノ酸バリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含み、
前記ＶＨおよびＶＬが、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）から選択されるＥＮＰＰ３結合ドメインの、それぞれ、可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含むＥＮＰＰ３結合ドメインを形成し、
前記抗ＣＤ３ｓｃＦｖが、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）から選択されるＣＤ３結合ドメインの前記可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインを含み、
番号付けが、ＥＵの番号付けに従う、ヘテロ二量体抗体。 - 前記ｓｃＦｖが、アミノ酸配列（ＧＫＰＧＳ）４を有する荷電ｓｃＦｖリンカーである、請求項５９に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第１および第２のバリアントＦｃドメインがそれぞれ、アミノ酸バリアント４２８／４３４Ｓをさらに含み、番号付けが、ＥＵ番号付けに従う、請求項５９に記載のヘテロ二量体抗体。
- 請求項３８～６１のいずれか一項に記載の抗体の第１および第２の単量体ならびに軽鎖をコードする核酸を含む、核酸組成物。
- 請求項６２に記載の核酸を含む、発現ベクター。
- 請求項６３に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
- ＥＮＰＰ３関連癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に、請求項３８～６１のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
- ヘテロ二量体抗体であって、
ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ１－ＣＨ１－リンカー１－ｓｃＦｖ－リンカー２－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第１の単量体であって、
ＶＨ１が、第１の可変重鎖ドメインであり、ｓｃＦｖが、抗ＣＤ３ｓｃＦＶであり、リンカー１およびリンカー２が、それぞれ第１のドメインリンカーおよび第２のドメインリンカーであり、ＣＨ２－ＣＨ３が、第１のＦｃドメインである、第１の単量体と、
ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第２の単量体であって、ＶＨ２が、第２の可変重鎖ドメインであり、ＣＨ２－ＣＨ３が、第２のＦｃドメインである、第２の単量体と、
ｃ）可変軽鎖ドメインを含む共通軽鎖と、を含み、
前記第１の可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインが、第１のＥＮＰＰ３結合ドメインを形成し、前記第２の可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインが、第２のＥＮＰＰ３結合ドメインを形成する、ヘテロ二量体抗体。 - 前記第１および第２のＥＮＰＰ３結合ドメインがそれぞれ、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のいずれかの前記ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３を含む、請求項６６に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第１および第２のＥＮＰＰ３結合ドメインの前記ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３が、図１４および４５に提供される前記ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３から選択される、請求項６６に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第１および第２の可変重鎖ドメインがそれぞれ、ＥＮＰＰ３結合ドメインの可変重鎖ドメインを含み、前記第１および第２の可変軽鎖ドメインがそれぞれ、前記ＥＮＰＰ３結合ドメインの可変軽鎖ドメインを含み、前記ＥＮＰＰ３結合ドメインが、以下のＥＮＰＰ３結合ドメイン：ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）のいずれかである、請求項６６に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記ｓｃＦｖが、以下のＣＤ３結合ドメイン：Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）のいずれかの前記ｖｈＣＤＲ１～３および前記ｖｌＣＤＲ１～３を含む、請求項６６に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記ｓｃＦｖの前記ｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３が、図１０Ａ～１０ＦのｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３から選択される、請求項７０記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記ｓｃＦｖが、以下のＣＤ３結合ドメイン：Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）のいずれかの前記可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む、請求項７１に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記ｓｃＦｖが、ｓｃＦｖ可変重鎖ドメイン、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、および前記ｓｃＦｖ可変重鎖ドメインと前記ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインとを接続するｓｃＦｖリンカーを含む、６６～７２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記ｓｃＦｖ可変重鎖ドメインが、前記第１のドメインリンカーを使用して前記第１の単量体の前記ＣＨ１の前記Ｃ末端に結合され、前記ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインが、前記第２のドメインリンカーを使用して前記第１のＦｃドメインの前記Ｎ末端に共有結合している、請求項６６～７３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインが、前記第１のドメインリンカーを使用して前記第１の単量体の前記ＣＨ１の前記Ｃ末端に結合され、前記ｓｃＦｖ可変重鎖ドメインが、前記第２のドメインリンカーを使用して前記第１のＦｃドメインの前記Ｎ末端に共有結合している、請求項６６～７３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記ｓｃＦｖリンカーが、荷電ｓｃＦｖリンカーである、請求項６６～７５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第１および第２のＦｃドメインが、バリアントＦＣドメインである、請求項６６～７６のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第１および第２の単量体が、図１Ａ～１Ｅに示されるものからなる群から選択されるヘテロ二量体化バリアントのセットを含む、請求項６６～７７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記選択されるヘテロ二量体化バリアントのセットが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ；Ｄ４０１Ｋ：Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ；およびＴ３６６Ｗ：Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖからなる群に由来し、番号付けが、ＥＵ番号付けに従う、請求項７８に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第１および第２の単量体が、除去バリアントをさらに含む、請求項７８または７９に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記除去バリアントが、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋであり、番号付けが、ＥＵ番号付けに従う、請求項８０に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第１または第２の単量体のうちの１つが、ｐＩバリアントをさらに含む、請求項７８～８１のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記ｐＩバリアントが、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄであり、番号付けが、ＥＵ番号付けに従う、請求項８２に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記単量体が、アミノ酸バリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、
前記第２の単量体が、アミノ酸バリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ／Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、番号付けが、ＥＵ番号付けに従う、請求項６６～７６のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。 - 前記ｓｃＦｖリンカーが、アミノ酸配列（ＧＫＰＧＳ）４を有する荷電ｓｃＦｖリンカーである、請求項８４に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第１および第２のバリアントＦｃドメインがそれぞれ、アミノ酸バリアント４２８／４３４Ｓをさらに含み、番号付けが、ＥＵ番号付けに従う、請求項８４に記載のヘテロ二量体抗体。
- 以下のヘテロ二量体抗体：ＸＥＮＰ２９４３７、ＸＥＮＰ２９５２０、ＸＥＮＰ３０２６４、ＸＥＮＰ２６８２２、ＸＥＮＰ２８４３８、ＸＥＮＰ２９４３８、ＸＥＮＰ２９４６７、ＸＥＮＰ３０４６９、ＸＥＮＰ３０４７０、ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、ＸＥＮＰ３１１４８、ＸＥＮＰ３１１４９、ＸＥＮＰ３１１５０、ＸＥＮＰ３１４１９、およびＸＥＮＰ３１４７１から選択される、請求項６６に記載のヘテロ二量体抗体。
- ヘテロ二量体抗体であって、
ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ１－ＣＨ１－リンカー１－ｓｃＦｖ－リンカー２－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第１の単量体であって、
ｓｃＦｖが、抗ＣＤ３ｓｃＦＶであり、ＣＨ２－ＣＨ３が、第１のＦｃドメインである、第１の単量体と、
ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第２の単量体であって、ＣＨ２－ＣＨ３が、第２のＦｃドメインである、第２の単量体と、
ｃ）ＶＬ－ＣＬを含む共通軽鎖とを含み、
第１のバリアントＦｃドメインが、アミノ酸バリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、
第２のバリアントＦｃドメインが、アミノ酸バリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、
前記第１および第２のバリアントＦｃドメインがそれぞれ、アミノ酸バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、
前記第２の単量体の前記ヒンジＣＨ２－ＣＨ３が、アミノ酸バリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含み、
前記ＶＨおよびＶＬが、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１．８ Ｌ１．３３、ＡＮ１［ＥＮＰＰ３］Ｈ１ Ｌ１．７７、Ｈ１６－７．２１３、Ｈ１６－９．６９、Ｈ１６－１．５２、Ｈａ１６－１（１）２３、Ｈ１６－９．４４、Ｈ１６－１．６７、Ｈａ１ ６－１（３，５）３６、Ｈ１６－１．８６、Ｈ１６－９．１０、Ｈ１６－９．３３、Ｈ１６－１．６８、Ｈａ１６－１（１）１、Ｈａ１ ６－１（３，５）１８、Ｈａ１６－１（２，４）４、Ｈａ１６－１（３，５）５６、Ｈ１６－７．８、Ｈ１６－１．９３、Ｈａ１ ６－１（３，５）２７．１、Ｈ１６－１．６１、Ｈ１６－１（３，５）５、Ｈ１６－７．２００、Ｈ１６－１（３，５）４２、Ｈ１ ６－９．６５、Ｈａ１－１（３，５）１９、およびＨａ１６－１．８０（図１２、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｉ）から選択されるＥＮＰＰ３結合ドメインの、可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含み、
前記抗ＣＤ３ｓｃＦｖが、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９、Ｌ１．４７＿Ｈ１．９０、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３３、およびＬ１．４７＿Ｈ１．３１（図１０Ａ～１０Ｆ）から選択されるＣＤ３結合ドメインの前記可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインを含み、
番号付けが、ＥＵの番号付けに従う、ヘテロ二量体抗体。 - 前記ｓｃＦｖが、アミノ酸配列（ＧＫＰＧＳ）４を有する荷電ｓｃＦｖリンカーである、請求項８８に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第１および第２のバリアントＦｃドメインがそれぞれ、アミノ酸バリアント４２８／４３４Ｓをさらに含む、請求項８８に記載のヘテロ二量体抗体。
- 請求項６６～９０のいずれか一項に記載の抗体の前記第１および第２の単量体ならびに前記共通軽鎖をコードする核酸を含む、核酸組成物。
- 請求項９１に記載の核酸を含む、発現ベクター。
- 請求項９２に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
- ＥＮＰＰ３関連癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に、請求項６６～９０のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
- 以下のヘテロ二量体抗体：ＸＥＮＰ２４８０４、ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２８２８７、ＸＥＮＰ２８９２５、ＸＥＮＰ２９５１６、ＸＥＮＰ３０２６２、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２９４３６、ＸＥＮＰ２８３９０、ＸＥＮＰ２９４６３、およびＸＥＮＰ３０２６３から選択される、ヘテロ二量体抗体。
- 以下のヘテロ二量体抗体：ＸＥＮＰ２９４３７、ＸＥＮＰ２９５２０、ＸＥＮＰ３０２６４、ＸＥＮＰ２６８２２、ＸＥＮＰ２８４３８、ＸＥＮＰ２９４３８、ＸＥＮＰ２９４６７、ＸＥＮＰ３０４６９、ＸＥＮＰ３０４７０、ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、ＸＥＮＰ３１１４８、ＸＥＮＰ３１１４９、ＸＥＮＰ３１１５０、ＸＥＮＰ３１４１９、およびＸＥＮＰ３１４７１から選択される、ヘテロ二量体抗体。
- 請求項９５または９６に記載のヘテロ二量体抗体をコードする核酸を含む、核酸組成物。
- 請求項９７に記載の核酸を含む、発現ベクター。
- 請求項９８に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
- ＥＮＰＰ３関連癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に、請求項８５または８６に記載のヘテロ二量体抗体を投与することを含む、方法。
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