ES2230108T3 - Utilizacion de un anticuerpo para detectar basofilos y/o mastocitos. - Google Patents
Utilizacion de un anticuerpo para detectar basofilos y/o mastocitos.Info
- Publication number
- ES2230108T3 ES2230108T3 ES00929537T ES00929537T ES2230108T3 ES 2230108 T3 ES2230108 T3 ES 2230108T3 ES 00929537 T ES00929537 T ES 00929537T ES 00929537 T ES00929537 T ES 00929537T ES 2230108 T3 ES2230108 T3 ES 2230108T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- antibody
- cells
- basophils
- use according
- blood
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56972—White blood cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Empleo de un anticuerpo para la detección y/o cuantificación y/o aislamiento de basófilos y/o mastocitos y/o células precursoras de basófilos y/o mastocitos y/o de la estructura de superficie de estas células, caracterizado por- que tiene lugar la unión del anticuerpo con la estructura de superficie, PDNP3 (fosfodiesterasa/nucleótido-pirofosfatasa- ectoenzima) de las células, a la cual el anticuerpo al que se da el nombre de 97A6 puede unirse, el cual es producido y liberado por células de hibridoma, las cuales han sido
Description
Utilización de un anticuerpo para detectar
basófilos y/o mastocitos.
La invención se refiere a la utilización de un
anticuerpo para la detección y/o cuantificación y/o aislamiento de
basófilos y/o mastocitos y/o las células precursoras de los
basófilos y/o mastocitos y/o la estructura de la superficie de estas
células.
La invención se refiere además a,
- un procedimiento para la investigación de
alergias, así como,
- un procedimiento para la preparación de células
precursoras hematopoyéticas, las cuales pueden diferenciarse en
mastocitos o basofilos.
Ya son conocidos anticuerpos, con los cuales se
pueden detectar basófilos y mastocitos en estado maduro y
aisladamente entre sí.
En la hematopoyesis o formación de la sangre se
originan a partir de células madre pluripotentes de la médula ósea,
las células precursoras linfoides y mieloides. A partir de las
células precursoras linfoides se originan los linfocitos T y B,
mientras que a partir de las células precursoras mieloides se
originan o bien los eritrocitos, megacariocitos, basófilos,
eosinófilos, neutrófilos, monocitos o incluso células precursoras
desconocidas hasta ahora, a partir de las cuales se forman
mastocitos. Los basófilos, eosinófilos y neutrófilos son llamados
en conjunto granulocitos. Después de la hematopoyesis los basófilos
se encuentran en la sangre, mientras que los mastocitos se
encuentran en los tejidos. En los adultos la hematopoyesis tiene
lugar en la médula ósea.
Los basófilos y mastocitos son células efectoras
multifuncionales que participan en las reacciones alérgicas y las
reacciones inflamatorias. A pesar de sus similares propiedades
bioquímicas y funcionales, los basófilos y los mastocitos son tipos
de células diferenciadas, los cuales al igual que los eosinófilos
derivan de las células precursoras
CD34-positivas.
La diferenciación de los diferentes tipos de
células en la médula ósea y la sangre así como su asignación a
diferentes estadios de diferenciación, juega un papel esencialmente
importante en el día a día clínico. Así, es necesario por ejemplo,
para el diagnóstico de trastornos de la formación de la sangre,
determinar el número de células de cada tipo celular específico y a
ser posible el correspondiente estadio de diferenciación.
Además, es importante la investigación de las
células de la sangre y las células precursoras de la sangre en la
médula ósea en el diagnóstico de las leucemias. Se utiliza el
número, la clase y el estadio de las células para la clasificación o
asignación del tipo de leucemia así como la decisión sobre una
terapia adecuada. Además, la asignación de las leucemias se ajusta
por un lado según el transcurso clínico de la enfermedad y por otro
lado según el grado de madurez y el origen de los leucocitos
patológicamente modificados. Para ello es necesario determinar el
tipo de células y el estatus de las células, tanto de las células
sanas como también de las degeneradas, contenidas en una muestra de
los pacientes.
Hasta ahora se efectuaban estos análisis en el
microscopio observando la morfología de las células después de la
tintura con métodos clásicos de tinción, por ejemplo, la tinción de
Pappenheim o la tinción de
May-Grünwald-Giemsa, y mediante un
contaje manual. Modernos procedimientos para la evaluación de
biopsias de médula ósea o muestras de sangre utilizan anticuerpos
que reconocen los antígenos específicos como marcadores para
determinados tipos de células y estadios. Los anticuerpos o
respectivamente los antígenos reconocidos pueden comprobarse a
continuación en procedimientos estándar automatizados como p. ej.,
el análisis ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) ("ensayo
inmnunoenzimático") o mediante la citometría de flujo (FACS =
fluorescence activated cell sorting) ("clasificación de células
activadas por fluorescencia").
Sin embargo, se conocen hasta ahora, pocos
anticuerpos que reconozcan específicamente los basófilos intactos.
Uno de estos anticuerpos es el anticuerpo Bsp-1, el
cual reacciona con los basófilos pero no con los mastocitos de los
tejidos (Bodger, M.P. et al., Blood ("Sangre")
69 (1987), 1414). El anticuerpo YB5B8 reactivo con CD117,
reconoce los mastocitos y las células precursoras hematopoyéticas
(Ashman et al., Blood ("Sangre"), 78 (1991),
30).
En la patente DE 197 08 877 C1 se describe que el
anticuerpo 97A6 específico de los megacariocitos, no se une sin
embargo a los trombocitos.
Hasta hora no se conocía ningún anticuerpo que al
mismo tiempo reconociera los basófilos, los mastocitos y sus
células precursoras.
Con estos antecedentes, es tarea de la presente
invención preparar un anticuerpo para la utilización citada al
principio.
Este problema se resuelve según la invención
mediante el empleo de un anticuerpo según el cual tiene lugar la
unión de dicho anticuerpo con la estructura de la superficie de las
células, a la cual el anticuerpo con la denominación 97A6 puede
unirse, el cual anticuerpo se obtiene y libera a partir de células
de hibridoma, las cuales han sido depositadas en fecha 12.02.1997
con el número de registro DSM ACC 2297 en la Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, ("Colección alemana
de microorganismos y cultivos celulares GmbH"), según el Convenio
de Budapest.
El tiempo de conservación de estas células de
hibridoma se prolongó correspondientemente.
Con el nombre de anticuerpo en el sentido de la
invención están también comprendidos los fragmentos de anticuerpos,
como por ejemplo F(ab), los conjugados con anticuerpos y/o
fragmentos de anticuerpo, así como todas las composiciones que
contienen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y conjugados con
anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpos.
La estructura de superficie a la cual se une un
anticuerpo, puede ser, en el sentido de la invención, una única
molécula por ejemplo una proteína de membrana o también una
asociación de dos o tres diferentes moléculas, por ejemplo un canal
iónico o un receptor compuesto de varias subunidades.
El problema que toma por base la invención se
soluciona de la siguiente manera.
Los inventores de la presente solicitud han
reconocido efectivamente que la estructura de la superficie a la
cual los anticuerpos 97A6 pueden unirse, además de sobre unas pocas
líneas celulares megacariocíticas solamente se expresa sobre los
basófilos y mastocitos así como sobre sus células precursoras y
sobre la línea de mastocitos HMC-1 así como sobre
los basófilos de la línea celular de leucemia
KU-812. Tomando como base la patente DE 197 08 877
C1 esto no era de esperar, puesto que en la misma se describe que el
anticuerpo 97A6 es específico para los megacariocitos. Los
resultados más recientes de la investigación del inventor muestran
sin embargo que el anticuerpo 97A6 reconoce verdaderamente unas
pocas líneas celulares megacariocíticas, pero ningún megacariocito
nativo.
Puesto que el anticuerpo utilizado según la
invención es muy apropiado para la purificación de células, se
refiere también la invención a una población esencialmente pura de
basófilos y/o mastocitos y/o células precursoras de basófilos y/o
mastocitos, en la cual las células pueden unirse a un reactivo, el
cual se une específicamente a dichas estructuras de superficie de
estas células, y las cuales son reconocidas por el anticuerpo 97A6.
En consecuencia, la invención se refiere también al correspondiente
reactivo para la unión de estas células.
Con ayuda del anticuerpo 97A6 es posible aislar
fácilmente la estructura de superficie a la cual se une el
anticuerpo, y por otro lado obtener anticuerpos monoclonales como
también policlonales.
Mediante el análisis FACS pudo mostrarse
entretanto que en el caso de la estructura de superficie se trata
de la
fosfodiesterasa/nucleótido-pirofosfatasa-ectoenzima
PDNP3, la cual se conoce también con los nombres de NPP3 ó
PD-Ibeta. La secuencia fue publicada por
Jin-Hua et al., en la revista Genomics 45,
412-415 (1997).
Una gran ventaja de la utilización según la
invención, de un anticuerpo, consiste en que con ello es posible
con seguridad la supervisión del número de basófilos en la sangre
de pacientes con leucemia mieloica crónica, puesto que muchos de los
basófilos existentes en forma impurificada, que hasta ahora no
podían ser identificados morfológicamente como tales, podían ser
reconocidos de esta forma, con seguridad. Con ello puede
determinarse el número exacto de basófilos en estos pacientes y con
ello el estatus de su enfermedad.
Además, la utilización según la invención de un
anticuerpo posibilita ventajosamente el aislamiento de las células
precursoras, a partir de las cuales según las condiciones de
cultivo, pueden ser generados los mastocitos o los basófilos. Con
ello el empleo según la invención facilita la investigación de la
diferenciación de estas células. Es particularmente ventajoso
frente a los otros anticuerpos conocidos hasta ahora, que los
basófilos, ya en estadios de desarrollo muy tempranos, sean
detectables con los anticuerpos empleados, y en el posterior
desarrollo permanezcan igualmente detectables.
Una ventaja esencial para el diagnóstico de
rutina del empleo según la invención, de un anticuerpo, consiste en
la posibilidad de poder detectar con un único anticuerpo, por
ejemplo los mastocitos de diferentes tejidos y los basófilos de la
sangre. Hasta ahora eran necesarios para ello diferentes
anticuerpos y combinaciones de anticuerpos, lo cual iba ligado a
evidentes sobrecostes. Los basófilos pueden en muestras de sangre
colorearase también histoquimicamente, por ejemplo mediante
May-Grünwald-Giemsa. Para la
identificación y contaje de los basófilos es necesario además
personal cualificado, y es posible que se produzcan desviaciones
subjetivas de los resultados. De esta manera, los basófilos
inmaduros no son identificables. En cambio el empleo de anticuerpos
según la invención posibilitan el análisis mediante procedimientos
estándar objetivamente evaluables, como los análisis ELISA ó FACS,
que pueden realizarse también por personal poco experimentado, y
hacen posible una carga de muestras esencialmente mayor, que la
empleada en la evaluación subjetiva de tinciones.
Además, los inventores de la presente invención
han reconocido que la activación de basófilos, por ejemplo, en
conexión con una reacción alérgica, conduce a una presentación
reforzada de la estructura de superficie reconocida por los
anticuerpos empleados según la invención. Por ello es muy apropiada
la comprobación y/o la cuantificación de esta estructura de
superficie sobre los basófilos para la investigación de la
activación de los basófilos.
En una versión preferida, el anticuerpo utilizado
es un anticuerpo monoclonal.
El empleo de un anticuerpo monoclonal tiene la
ventaja de que el anticuerpo es estandarizadamente reproducible y
con ello puede obtenerse potencialmente en cantidades sin
limitación. Además, las propiedades de unión de un anticuerpo
monoclonal son siempre constantes, de forma que cada utilización de
un anticuerpo monoclonal es estandarizable.
En otra versión preferida, el anticuerpo
utilizado según la invención no interacciona esencialmente con las
inmunoglobulinas de la clase IgE.
El empleo de un tal anticuerpo en las
investigaciones en conexión con la activación de los basófilos
presenta efectivamente la inesperada ventaja de que los basófilos
no se autoactivan mediante el reticulado de las inmunoglobulinas IgE
unidas a las células, por lo que no influyen sobre los resultados
de la investigación.
En otra versión de la presente invención, se
emplea el propio anticuerpo 97A6 para la detección y/o
aislamiento.
El empleo de este anticuerpo tiene la ventaja de
que este anticuerpo ya está bien caracterizado y está disponible en
grandes cantidades.
La invención se refiere además al empleo según la
invención, de un anticuerpo en conexión con el análisis de la
hematopoyesis.
Como ya se ha citado antes, el empleo según la
invención abre la posibilidad de aislar las células precursoras de
los basófilos y mastocitos y de esta forma analizar la
hematopoyesis con referencia a estas células. Este análisis es sin
embargo, no solamente de interés científico sino que puede también
ser empleado en la investigación de los trastornos de formación de
la sangre en el diagnóstico clínico.
En una versión preferida tiene lugar el empleo
según la invención de un anticuerpo en conexión con el análisis de
muestras de pacientes, en particular de biopsias de tejidos,
biopsias de médula ósea y/o muestras de sangre. A este respecto el
empleo según la invención sirve en las biopsias de tejidos como
detección de los mastocitos, en las biopsias de médula ósea para la
detección de células precursoras de los mastocitos y/o basófilos y
en las muestras de sangre para la detección de basófilos maduros e
inmaduros.
Como ya se ha citado, con un único anticuerpo
según el material de partida, son posibles diferentes análisis, los
cuales hasta ahora solamente se podían realizar con combinaciones
de anticuerpos o eran absolutamente irrealizables.
El empleo de un anticuerpo según la invención, se
refiere además a la clasificación de tumores por diagnóstico, en
particular de las leucemias.
El diagnóstico y clasificación de las leucemias
tiene lugar a la vista de las biopsias de la médula ósea o de las
muestras de sangre. Así por ejemplo, en una forma destacada de la
leucemia, la CML, a la vista de las investigaciones de la médula
ósea, se analiza el estatus de todas las células mieloides. El
anticuerpo según la invención tiene a este respecto la ventaja de
suministrar información sobre la parte de células precursoras para
los basófilos y mastocitos. En un análisis de sangre, el empleo
según la invención - como ya se ha citado - hace posible la
detección de basófilos, en particular de los basófilos no maduros,
los cuales hasta ahora no podían reconocerse. Puesto que el número
de basófilos es un parámetro crítico en la progresión de la CML, el
empleo según la invención ofrece la ventaja de posibilitar un
dictamen seguro sobre el estadio de la CML lo cual hasta ahora no
era posible de realizar.
En otra versión preferida de la invención, el
anticuerpo empleado está unido a un marcador, en particular a un
marcador fluorescente.
A este respecto es ventajoso que el anticuerpo
pueda ser detectado a continuación con una alta sensibilidad, razón
por la cual pueden emplearse solamente pequeñas cantidades del
anticuerpo para el diagnóstico. Además, el empleo de este
anticuerpo es posible con un análisis ELISA o mediante el empleo de
la citometría de flujo.
En otra versión según la invención, la detección
de los anticuerpos unidos tiene lugar mediante un procedimiento de
detección inmunológico habitual, en particular un análisis ELISA ó
FACS.
Esta utilización tiene la ventaja de que permite
efectuar una determinación altamente específica, sensible, rápida y
en forma automática, de las células en muestras de los
pacientes.
La invención se refiere además al empleo según la
invención de un anticuerpo para la detección y/o cuantificación de
basófilos activados.
Dicho empleo tiene la ventaja de que mediante el
mismo puede ser investigada la causa de una activación de los
basófilos con relativa facilidad, puesto que los basófilos
activados al contrario de los no activados, se unen a un gran número
de anticuerpos empleados según la invención. Así, los basófilos
pueden por ejemplo incubarse con agentes potencialmente activadores
y anticuerpos empleados según la invención. A continuación, los
basófilos activados pueden diferenciarse de los no activados
mediante la elevada expresión del antígeno del 97A6. Esta elevada
expresión puede cuantificarse con el citómetro de flujo.
El empleo según la invención de un anticuerpo se
refiere además a la determinación de la magnitud de la activación
de los basófilos.
Mediante la determinación de la magnitud de la
unión de los anticuerpos a un único basófilo se puede determinar
también la magnitud de la expresión del antígeno y con ello la
activación de estas células. Con ello, este empleo según la
invención abre la ventajosa posibilidad de que los agentes, que
activan los basófilos, investiguen a continuación, en qué magnitud
contribuyen estas células a la activación. Con ello pueden
clasificarse los agentes como por ejemplo los alergenos, según su
capacidad de activar los basófilos. De esta manera puede efectuarse
por ejemplo una valoración del potencial de un agente para provocar
una alergia.
La invención se refiere además a un procedimiento
para la investigación de alergias, con los pasos:
- incubación de una muestra de sangre con un
agente del que se sospecha que provoca una reacción alérgica,
- incubación de esta muestra de sangre con un
anticuerpo empleado en las reivindicaciones 1 hasta 4,
- cuantificación de los anticuerpos unidos a las
células.
Este procedimiento según la invención abre la
posibilidad de efectuar un test de alergia, sin que la persona
investigada deba someterse a un pesado y desagradable ensayo en la
piel. Para el procedimiento según la invención es solamente
necesario efectuar con algunos mililitros de sangre de la persona
investigada in vitro, un ensayo con diferentes alergenos, en
el que 15 minutos después de la incubación pueda incubarse con un
agente del anticuerpo empleado según la invención. Mediante la
cuantificación de los anticuerpos unidos a los basófilos, se puede
hacer no solamente una declaración de si un agente puede provocar
una reacción alérgica, sino también cuan fuerte es esta reacción
alérgica.
La reacción se refiere además a un procedimiento
para la preparación de células precursoras hematopoyéticas, las
cuales pueden diferenciarse en mastocitos o basófilos, con los
pasos:
- aislamiento y preparación de células de médula
ósea, de un organismo,
- incubación de estas células de médula ósea con
un anticuerpo empleado según la invención,
- aislamiento de las células unidas a anticuerpos
con procedimientos habituales, en particular FACS y MACS
(clasificación magnética de células).
La preparación de estas células precursoras
hematopoyéticas hace posible la investigación del desarrollo de los
mastocitos y/o basófilos. Esto puede efectuarse para fines de
investigación y también en el caso de una hematopoyesis alterada,
para fines diagnósticos. Además, pueden cultivarse células a partir
de células precursoras in vitro, las cuales más tarde pueden
introducirse de nuevo en el dador de las células precursoras, sin
ocasionar problemas inmunológicos. Esto puede ser conveniente, por
ejemplo, en pacientes con una hematopoyesis alterada.
En el caso de los basófilos o mastocitos no se
trata de líneas celulares sino de células primarias, las cuales
solamente pueden ser identificadas y purificadas en el conocimiento
de la invención.
La ventaja de una tal población consiste por
ejemplo, en que con ello pueden investigarse muy específicamente
las propiedades de las células, sin que los resultados puedan estar
influenciados por otra células. Esto es por ejemplo importante
cuando deben investigarse cuáles substancias de determinadas células
son producidas y entregadas bajo determinadas condiciones, puesto
que estas substancias por regla general solo son producidas por una
gran población de células en cantidades suficientes para que con
ello sea posible un análisis o respectivamente una identificación de
estas substancias. En caso de que la población contuviera
diferentes tipos de células, la detección de una determinada
substancia podría no decidir cuáles células producen esta
substancia.
Debe entenderse que las características
mencionadas anteriormente y las que se describen todavía a
continuación, son utilizables no solamente en la correspondiente
combinación expuesta sino también en otras combinaciones o en
posición exclusiva, sin abandonar el marco de la presente
invención.
Otras ventajas se desprenden de las siguientes
ejemplos de versiones y en dependencia con los dibujos, en los
cuales,
La figura 1 muestra un diagrama en el cual se
representa la parte en tanto por ciento de células CD34^{+},
positivas al 97A6, de la sangre periférica, las cuales se
cultivaron in vitro durante 0, 3, 5, 7, 10 y 14 días, en
presencia de 100 ng/ml de IL-3;
La figura 2 muestra una precipitación
inmunológica de 10^{7} células KU-812 marcadas
con ^{125}I en la superficie y a continuación lisadas con el
anticuerpo 97A6 (calle 97A6) así como una precipitación de control
sin los anticuerpos 97A6 (calle C), las cuales se separan
electroforéticamente sobre un gel de
SDS-poliacrilamida al 5-15% en
condiciones reductoras (R) y no reductoras (NR), y se hacen visibles
autoradiográficamente; el estándar de peso molecular está mostrado a
la izquierda;
La figura 3a muestra un diagrama, en el cual está
representada la cantidad media unida al basófilo del anticuerpo
97A6 marcado con ficoeritrina (97A6-PE) en unidades
arbitrarias de intensidad de fluorescencia (valor medio
97A6-PE), en donde los basófilos han sido incubados
previamente con las concentraciones del anticuerpo
anti-IgE indicadas en el diagrama, y derivan de la
sangre de un dador, el cual es alérgico a las acarinas (sangre 1) o
derivan de la sangre de un dador que no es alérgico (sangre 2);
y
La figura 3b, muestra un diagrama en el cual está
representada la cantidad media unida a los basófilos de
97A6-PE en unidades arbitrarias de intensidad de
fluorescencia (valor medio de 97A6-PE), en donde los
basófilos han sido incubados previamente con las diluciones
indicadas en el diagrama del antígeno de acáridos, y derivan de la
sangre de un dador, el cual es alérgico a las acarinas (sangre 1) o
derivan de la sangre de un dador que no es alérgico (sangre 2).
Ya es conocido el hecho de que el número de
basófilos en la sangre periférica de pacientes con CLM, aumenta con
el paso de la fase crónica a la fase acelerada.
Para comprobar la especificidad del anticuerpo
97A6 para los basófilos, se separaron los leucocitos mononucleares
mediante una Ficoll-Hypaque, de los otros
componentes de los Buffy Coats de la sangre periférica de personas
normales o pacientes con CML, en la fase de aceleración. Las
células de la interfase fueron incubadas a continuación con el
anticuerpo 97A6 marcado con biotina, se lavaron tres veces y se
incubaron con perlas MACS anti-IgG (Miltenyi,
Bergisch Gladbach, Alemania). Las células 97A6 positivas se
aislaron a continuación mediante MACS y seguidamente fueron marcadas
para el control de la preparación con estreptavidina marcada con
ficoeritrina (PE) y un anticuerpo 97A6 marcado con PE, y se
analizaron en un citómetro de flujo.
La pureza de las células 97A6 positivas fue del
99%.
Para el análisis morfológico se tiñeron estas
células con el colorante
May-Grünwald-Giemsa. Con ello se
mostró en personas normales también morfológicamente una población
pura de basófilos, mientras que solamente del 60 al 80% de las
cálulas 97A6 positivas de pacientes de CML en la fase de aceleración
fueron identificables morfológicamente como basófilos. Las células
97A6-positivas restantes, morfológicamente
inidentificables se evidenciaron como células precursoras inmaduras
de basófilos.
Esto demuestra que mediante el anticuerpo 97A6 se
reconoce una parte de basófilos mayor de la que se reconocía hasta
ahora mediante el procedimiento de tinción empleado.
Se trituraron tejidos de pulmón, prepucio o
útero, se lavaron en una solución tampón con 200 mg/litro de KCl,
50 mg/litro de NaH_{2}PO_{4} x H_{2}O, 8 g/litro de NaCl y 1
g/litro de glucosa, y a continuación se incubaron 90 a 180 minutos a
37ºC con 2 mg/ml de colagenasa tipo II (Sebak, Suben, Austria). A
continuación se separaron por centrifugación las células
dispersadas, se lavaron y se incubaron durante 30 minutos con suero
AB humano. Después de un nuevo lavado se incubaron las células
durante 30 minutos a 4ºC con el anticuerpo 97A6, se lavaron y a
continuación se incubaron durante 30 minutos a 4ºC con un
anticuerpo IgC antirratón de cabra F(ab')_{2}, marcado con
fluoresceína. Las células se fijaron durante 1 minuto en 0,025% de
glutaraldehido, se lavaron y se incubaron 8-12
minutos con 0,0125% de azul de toluidina. Después del lavado se
identificaron los mastocitos teñidos con azul de toluidina mediante
un microscopio de fluorescencia (Olympus, Viena, Austria) en campo
luminoso en base a su morfología, y a continuación se investigaron
con luz fluorescente.
Se observó que exclusivamente los mastocitos de
todos los tejidos pero no las otras células de tejidos, estaban
marcados con el anticuerpo 97A6. Además los mastocitos presentaban
una coloración fluorescente claramente más pequeña que los basófilos
teñidos de igual manera.
Se centrifugaron células de muestras de médula
ósea en una Ficoll-Hypaque, con una densidad de
1,077 g/cm^{3}. Se separaron las células de la interfase, y las
células que fueron positivas para el CD34, un marcador para células
precursoras hematopoyéticas, se aislaron mediante el procedimiento
MACS. Estas células fueron incubadas con un
anti-cuerpo marcado con FITC contra el CD34 y el
anticuerpo 97A6 marcado con PE. Las células doblemente positivas
fueron seleccionadas por el método FACS y sembradas en un medio
semisólido de acabados con 0,9% de metilcelulosa y una mezcla de
factores de crecimiento incluída la IL-3, con un
factor de diferenciación para los basófilos y eosinófilos
(CellSystems, Remagen, Alemania).
Después de 16 días de incubación a 37ºC en una
atmósfera húmeda (5% de CO_{2}), se contaron las colonias
formadas, se aplicaron con una pipeta Pasteur sobre un
portaobjetivos y se tiñeron para la investigación morfológica con
May-Grünwald-Giemsa. Con ello se
observaron junto a las colonias puras preponderantes de basófilos,
también colonias mezcladas de eosinófilos-basófilos,
basófilos-macrófagos y
basófilos-eosinófilos-macrófagos,
y/o neutrófilos, multipotentes.
Esto demuestra que las células precursoras
positivas al 97A6, o bien son bipotentes de desarrollo limitado, o
son células precursoras multipotentes de diferentes células
mieloides incluidos los basófilos.
La IL-3 es un estimulador para el
crecimiento y diferenciación de basófilos y sus células
precursoras. Para la producción de basófilos de las células
precursoras se aislaron células CD34-positivas
mediante el método MACS, de sangre periférica, y se cultivaron en
medio IMDM exento de suero, con 700 \mug/ml de
holo-transferrina, 40 \mug/ml de proteínas
humanas de bajo peso molecular y 10 \mug/ml de insulina (Sigma,
Munich, Alemania), y se estimularon con 100 ng/ml de
IL-3 (Behring-Werke, Marburg,
Alemania) durante 0, 3, 5, 7, 10 y 14 días. Para la investigación de
la expresión del antígeno del 97A6 se marcaron las células a
continuación como se ha descrito en el ejemplo 1 con ayuda del
anticuerpo 97A6. La parte de células positivas al 97A6 se determinó
mediante citometría de flujo.
Con ello se observó un significativo aumento de
la parte de células 97A6-positivas, del 1 \pm
0,5% el día cero de cultivo hasta por encima del 60% en el tercer
día de cultivo. A continuación permaneció esta parte aproximadamente
constante y cayó solamente muy poco hacia el final de 14 días de
cultivo (figura 1).
En el dictamen morfológico de las células
97A6-positivas después de una tintura con
May-Grünwald-Giemsa se observaron
principalmente, basófilos. El rápido aumento de la parte de células
97A6-positivas demuestra que el antígeno del 97A6 ya
se expresa en los estadios tempranos del desarrollo de los
basófilos. Esto se demuestra también mediante el ensayo descrito en
el ejemplo 3, según el cual con ayuda del antígeno del 97A6 se
aislaron células precursoras de basófilos. También se confirmó este
resultado en el ejemplo 1 pudiendo ser identificadas en la sangre
periférica de pacientes con CML en la fase acelerada, células
97A6-positivas como células precursoras inmaduras de
basófilos.
Células de la línea KU-812 de
células precursoras de basófilos, se marcaron en la superficie con
^{125}I mediante el procedimiento de la lactoperoxidasa, y a
continuación se lisaron con NP-40. La
inmunoprecipitación se efectuó con complejos de anticuerpos 97A6
previamente formados. Los anticuerpos 97A6 fueron inmovilizados con
perlas de sefarosa, que fueron conjugadas con anticuerpos
secundarios. Como control se efectuó una inmunoprecipitación con
perlas sin el anticuerpo 97A6. Después de la cocción de las
muestras en SDS en condiciones reductoras en presencia de
2-mercaptoetanol y bajo condiciones no reductoras
se determinaron los pesos moleculares aparentes mediante la
separación gelelectroforética en geles de poliacrilamida al
5-15 por ciento (Laemmli, Reino Unido, Nature
227 (1970), 680), empleando proteínas marcadas
^{14}C-metiladas, mediante autorradiografía.
El resultado de esta inmunoprecipitación se
muestra en la figura 2. Con el anticuerpo 97A6 pueden precipitarse
proteínas con un peso molecular aparente de aproximadamente 270 kD y
aproximadamente 150 kD en condiciones reductoras y de
aproximadamente 270 kD en condiciones no reductoras. En el caso del
complejo de proteína se trata de una estructura desconocida de la
superficie, que se encuentra en los basófilos, mastocitos y células
precursoras.
Para identificar la estructura molecular del
antígeno detectado, se purificó el lisado KU-812
sobre una columna del anticuerpo 97A6. La proteína eluída se separó
mediante SDS-PAGE y las bandas resultantes fueron
sometidas a una secuenciación de aminoácidos comercial. Una
comparación de las secuencias con secuencias del banco de datos dio
como resultado una identidad del 100 por ciento con el PDNP3/NPP3
fosfodiesterasa/nucleotidopirofosfatasa-ectoenzima
clonado recientemente.
Células de médula ósea (BM), células de sangre
periférica (PB), células de la sangre periférica de pacientes de
CML (PB CML) y células CD34-positivas de sangre
periférica, que habían sido estimuladas con 100 ng/ml de
IL-3 y se recogieron después de tres días (d3 PB
(+IL-3)) ó respectivamente después de 14 días (d14
PB (+IL-3)), se tintaron con
97A6-PE, anticuerpos conjugados con FITC de una
especificidad dada y con anticuerpos
anti-CD34-PerCP
(HPCA-2-PerCP) (Becton Dickinson,
Heidelberg, Alemania). Los anticuerpos conjugados con FITC, contra
CD10 (W8E7), CD26 (L272), CD44 (L178), CD71 (LO1.1) y
HLA-DR (L243), (Becton Dickinson), CD13 (SJ1D1),
CD16 (3G8), CD33 (D3HL60.251), CD38 (T16), (Immunotech, Krefeld,
Alemania), CD117 (9B9), (Hölzel Diagnostics, Colonia, Alemania), IgE
(policlonal), (BioSource, Ratingen, Alemania), CD55 (1A10) y CD59
(P282H19), (PharMingen, Hamburgo, Alemania), CD123 (7G3),
(PharMingen), CD164 (103B2/9E10), (Zanettino A.C.B. et al., Blood 92
(1998), 2613), CD81 (JS-64), (Immunotech) y CDw17
(MEM74), (BioSource), se incubaron cada vez juntamente con las
células, el anticuerpo 97A6-PE y el
anti-CD34-PerCP durante 30 minutos,
sobre hielo, se lavaron dos veces y se analizaron mediante un
citómetro de flujo. Los resultados están indicados en la tabla 1.
"+/-" significa subpoblaciones positivas, "n.d."
significa que el correspondiente antígeno no fue detectable.
Este estudio demuestra que los basófilos maduros
(CD34-negativos) de la sangre periférica son
negativos para el CD117, un marcador para los mastocitos, y
negativos para el CD71, un marcador para las células proliferativas,
aunque expresan el CD17 y una alta densidad de la cadena alfa del
receptor IL-3 (CD123), un marcador para basófilos,
eosinófilos y monocitos. Las células de médula ósea
CD34-negativas parecen expresar CD13, CD17, CD71 y
HLA-DR heterogéneo como basófilos de la sangre
periférica. Se ha encontrado una expresión similar en basófilos de
la sangre periférica de pacientes de CML en la fase de aceleración.
Contrariamente a las correspondientes células de médula ósea, todos
los precursores de basófilos CD34^{+}97A6^{+} de la sangre
periférica son negativos para CD13, CD17 y CD26. Esto demuestra que
los precursores de la sangre periférica son algo inmaduros. Ambos
precursores son sin embargo positivos para CD117 y CD71, lo cual no
ocurre con las basófilos maduros. De otra manera a los basófilos
maduros de la sangre periférica, los basofilos 97A6^{+}
cultivados, los cuales han sido obtenidos de células
CD34-positivas de la sangre periférica mediante
estimulación con IL-3, expresan solamente poco o
ninguno CD38, pero si expresan una alta densidad de moléculas de
HLA-DR.
Estos datos indican que el antígeno del 97A6 se
expresa continuamente en todos los estadios de la maduración de
basófilos, mientras que la expresión de los antígenos de CD sobre
los basófilos de diferentes grados de maduración y de diferentes
fuentes, oscila claramente.
En este estudio representado en la figura 3a y
3b, se ha tratado en cada caso una muestra de sangre de un dador el
cual es alérgico a las acarinas (sangre 1), y una muestra de sangre
de un dador el cual no es alérgico (sangre 2), con heparina para la
inhibición de la coagulación. A continuación, se incubaron cada
vez 100 \mul de sangre de cada muestra, o bien con un anticuerpo
anti IgE (clon
E124-2-8/D\varepsilon2, IgG 1 de
ratón, Immunotech) en las concentraciones finales indicadas en la
figura 3a o con antígenos de acarinas (Stallergenes, Anthony,
Francia), en las diluciones indicadas en la figura 3b durante 15
minutos a 37ºC. Después de lavar todas las muestras con PBS/20 mM de
EDTA y subsiguiente separación por centrifugación de las células, se
resuspendieron los sedimentos celulares en 100 \mul de PBS/BSA. A
cada muestra se añadieron 20 \mul del anticuerpo
97A6-PE en una concentración de 25 \mug/ml.
Después de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente en
la obscuridad, se lavaron las células y se lisaron las células de
la sangre roja mediante el reactivo de lisado IOTest (Immunotech nº
486). Después de lavar nuevamente y resuspender las células en
PBS/BSA, se midió la fluorescencia en un citómetro de flujo.
Con ello, la coloración de la fluorescencia en
las mas pequeñas concentraciones de los activadores
anti-IgE y antígeno de acarinas, se correspondió
con la correspondiente coloración de la fluorescencia sin estos
activadores.
El resultado representado en la figura 3a muestra
que el mecanismo de activación conocido para los basófilos en el
caso del IgE, el cual está unido a la superficie de la célula de
los basófilos, se reticula mediante el anticuerpo, conduce en el
marco de la activación a una muy rápida presentación de la
estructura de superficie sobre los basófilos, la cual es reconocida
por el anticuerpo 97A6.
El resultado representado en la figura 3b indica
que solamente aquellos basófilos que proceden del dador alérgico a
los acáridos, reaccionan a la incubación con el antígeno de
acarinas con una presentación reforzada de la estructura de
superficie, la cual es reconocida por el anticuerpo 97A6. En
cambio, los basófilos de la sangre del dador no alérgico no
muestran después de la incubación con el antígeno de acarinas,
ninguna presentación reforzada de esta estructura de superficie.
El mecanismo que rige todo ello consiste con la
máxima probabilidad en que las IgE inmunoglobulinas unidas a los
basófilos del dador alérgico, pueden reconocer el antígeno de
acarinas, y mediante la incubación con este antígeno se reticulan de
forma que tiene lugar una activación de los basófilos y los
basófilos reaccionan a continuación igualmente que en la activación
mediante anticuerpos anti IgE, con una presentación reforzada de la
estructura de superficie, la cual es reconocida por el anticuerpo
97A6. La ausencia de una reacción en los basófilos del dador no
alérgico demuestra además, que el mismo anticuerpo 97A6 conduce a
una activación de los basófilos mediante la unión a IgE.
Es notable que para esta presentación sea
suficiente una incubación de solamente 15 minutos de las células a
37ºC con el antígeno o respectivamente los anticuerpos
anti-IgE.
Este procedimiento de ensayo abre la posibilidad
de efectuar con una muestra de sangre de pocos mililitros un test
de alergia, mediante el cual pueden ensayarse a continuación en
corto tiempo los más diferentes alergenos, respecto a si pueden
activar los basófilos del dador.
Claims (13)
1. Empleo de un anticuerpo para la detección y/o
cuantificación y/o aislamiento de basófilos y/o mastocitos y/o
células precursoras de basófilos y/o mastocitos y/o de la estructura
de superficie de estas células, caracterizado porque tiene
lugar la unión del anticuerpo con la estructura de superficie, PDNP3
(fosfodiesterasa/nucleótido-pirofosfatasa-ectoenzima)
de las células, a la cual el anticuerpo al que se da el nombre de
97A6 puede unirse, el cual es producido y liberado por células de
hibridoma, las cuales han sido depositadas en fecha 12.02.1997 con
el número DSM ACC 2297 en la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH, DSMZ, ("Colección Alemana de
Microorganismos y cultivos celulares"), de acuerdo con el
convenio de Budapest.
2. Empleo según la reivindicación 1,
caracterizado porque el anticuerpo empleado es un anticuerpo
monoclonal.
3. Empleo según la reivindicación 1 ó la
reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo no tiene
esencialmente ninguna acción recíproca con las inmunoglobulinas de
la clase IgE.
4. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a
3, caracterizado porque el propio anticuerpo 97A6 es
empleado para la detección y/o aislamiento.
5. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a
4, en relación con el análisis de la hematopoyesis.
6. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a
5, en relación con el análisis de muestras de pacientes, en
particular de biopsias de tejidos, biopsias de médula ósea y/o
muestras de sangre.
7. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a
6, en relación con el ordenamiento diagnóstico de tumores, en
particular de leucemias.
8. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a
7, caracterizado porque el anticuerpo está unido con un
marcador, especialmente con un marcador de fluorescencia.
9. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a
8, caracterizado porque la detección del anticuerpo unido
tiene lugar mediante un habitual procedimiento inmunológico de
detección, en particular un análisis ELISA o FACS.
10. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a
9, para la detección y/o cuantificación de basófilos activados.
11. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a
10, para la determinación de la magnitud de la activación de los
basófilos.
12. Empleo para la investigación de alergias, con
los pasos:
- Incubación de una muestra de sangre con un
agente del cual se sospecha que genera una reacción alérgica,
- Incubación de esta muestra de sangre con un
anticuerpo empleado en las reivindicaciones 1 a 4,
- Cuantificación del anticuerpo unido a las
células.
13. Procedimiento para la preparación de células
precursoras hematopoyéticas, las cuales pueden diferenciarse en
mastocitos o basófilos, con los pasos:
- Preparación de células de médula ósea aisladas
de un organismo,
- Incubación de estas células de médula ósea con
un anticuerpo empleado en las reivindicaciones 1 a 4,
- Aislamiento de las células unidas al anticuerpo
con procedimientos habituales, en particular FACS ó MACS.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19922863 | 1999-05-19 | ||
| DE19922863 | 1999-05-19 | ||
| DE19926879A DE19926879A1 (de) | 1999-05-19 | 1999-06-12 | Verwendung eines Antikörpers zur Detektion und/oder Quantifizierung und/oder Isolierung von Basophilen und/oder Mastzellen und/oder den Vorläuferzellen dieser Zellen und/oder einer Oberflächenstruktur dieser Zellen |
| DE19926879 | 1999-06-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2230108T3 true ES2230108T3 (es) | 2005-05-01 |
Family
ID=26053412
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00929537T Expired - Lifetime ES2230108T3 (es) | 1999-05-19 | 2000-05-17 | Utilizacion de un anticuerpo para detectar basofilos y/o mastocitos. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6949346B2 (es) |
| EP (1) | EP1179179B1 (es) |
| JP (1) | JP3759412B2 (es) |
| AT (1) | ATE280389T1 (es) |
| AU (1) | AU764745B2 (es) |
| ES (1) | ES2230108T3 (es) |
| WO (1) | WO2000072010A1 (es) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003040340A2 (en) * | 2001-11-07 | 2003-05-15 | Agensys, Inc. | Nucleic acid and corresponding protein entitled 161p2f10b useful in treatment and detection of cancer |
| DE10160921B4 (de) * | 2001-12-06 | 2005-09-22 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum | Verfahren zum Nachweis von Allergien und Verwendung eines Antikörpers zum Nachweis von Allergien |
| EP1863848A4 (en) * | 2005-03-31 | 2009-09-23 | Agensys Inc | CORRESPONDING ANTIBODIES AND MOLECULES THAT ATTACH PROTEINS 161P2F10B |
| WO2011097627A1 (en) * | 2010-02-08 | 2011-08-11 | Agensys, Inc. | Antibody drug conjugates (adc) that bind to 161p2f10b proteins |
| CN114173875A (zh) | 2019-03-01 | 2022-03-11 | Xencor股份有限公司 | 结合enpp3和cd3的异二聚抗体 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9222548D0 (en) | 1992-10-27 | 1992-12-09 | Foseco Int | Metallurgical pouring vessels |
| TW378213B (en) * | 1992-11-04 | 2000-01-01 | Shionogy Seiyaku Kk | Basophil-binding monoclonal antibody, method for separation of basophils, method for chemical mediator released from basophils, and testing method for release of basophil-derived chemical mediators |
| US6306575B1 (en) | 1995-06-16 | 2001-10-23 | Stemcell Technologies, Inc. | Methods for preparing enriched human hematopoietic cell preparations |
| CA2191655C (en) * | 1995-12-01 | 2010-01-12 | Terry E. Thomas | Novel antibody compositions for preparing enriched human hematopoietic and tumor cell preparations |
| US5786161A (en) * | 1996-06-06 | 1998-07-28 | Miltenyi Biotec. Gmbh | Isolation and characterization of allergen-binding cells for diagnosis of hypersensitivity |
| DE19632755C1 (de) * | 1996-08-14 | 1998-01-29 | Univ Eberhard Karls | Antikörper 40B8 |
| WO1998032014A1 (de) * | 1997-01-20 | 1998-07-23 | Orpegen Pharma Gmbh | Basophilen-degranulationstest |
| DE19708877C1 (de) * | 1997-03-05 | 1998-06-25 | Univ Eberhard Karls | Antikörper 97A6 |
| US6323321B1 (en) | 1997-03-05 | 2001-11-27 | Eberhard-Karls-Universitat Tubingen Universitatsklinikum | Antibody 97A6 |
| DE19918446A1 (de) | 1999-04-23 | 2000-11-23 | Univ Eberhard Karls | Verwendung von Coxsackievirus B3 zur Verbesserung der Transfektion von Zellen |
-
2000
- 2000-05-17 JP JP2000620348A patent/JP3759412B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-05-17 AT AT00929537T patent/ATE280389T1/de active
- 2000-05-17 EP EP00929537A patent/EP1179179B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-17 ES ES00929537T patent/ES2230108T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-17 AU AU47578/00A patent/AU764745B2/en not_active Expired
- 2000-05-17 WO PCT/EP2000/004468 patent/WO2000072010A1/de active IP Right Grant
-
2001
- 2001-11-16 US US09/996,030 patent/US6949346B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3759412B2 (ja) | 2006-03-22 |
| AU4757800A (en) | 2000-12-12 |
| EP1179179B1 (de) | 2004-10-20 |
| EP1179179A1 (de) | 2002-02-13 |
| US6949346B2 (en) | 2005-09-27 |
| US20020160429A1 (en) | 2002-10-31 |
| AU764745B2 (en) | 2003-08-28 |
| WO2000072010A1 (de) | 2000-11-30 |
| JP2003500650A (ja) | 2003-01-07 |
| ATE280389T1 (de) | 2004-11-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Simmons et al. | CD34 expression by stromal precursors in normal human adult bone marrow | |
| Förster et al. | Flow cytometric analysis of cell proliferation dynamics in the B cell compartment of the mouse | |
| Yin et al. | AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells | |
| JP3070865B2 (ja) | ヒトプロジェニター細胞のサブセット | |
| Chaubal et al. | CD34 immunoreactivity in nervous system tumors | |
| Lu et al. | Association of cell cycle expression of Ia-like antigenic determinations on normal human multipotential (CFU-GEMM) and erythroid (BFU-E) progenitor cells with regulation in vitro by acidic isoferritins | |
| US7718376B2 (en) | Identification and isolation of somatic stem cells and uses thereof | |
| Van der Meer et al. | and R. van Furth | |
| US20160123980A1 (en) | Multicolor flow cytometry method for identifying a population of cells, in particular mesenchymal stem cells | |
| D'Arena et al. | Human umbilical cord blood: immunophenotypic heterogeneity of CD34+ hematopoietic progenitor cells | |
| Spiteri et al. | Isolation of phenotypically and functionally distinct macrophage subpopulations from human bronchoalveolar lavage | |
| ES2230108T3 (es) | Utilizacion de un anticuerpo para detectar basofilos y/o mastocitos. | |
| Landreth et al. | Regulation of human B lymphopoiesis: effect of a urinary activity associated with cyclic neutropenia. | |
| Fukai et al. | Cytokeratins in normal thymus and thymic epithelial tumors | |
| Williams et al. | Pluripotential hematopoietic stem cells in post-5-fluorouracil murine bone marrow express the Thy-1 antigen. | |
| US20020102244A1 (en) | Method of identifying and/or isolating stem cells and prognosing responsiveness to leukemia treatment | |
| Solinger | Immature T lymphocytes in human neonatal blood | |
| Lanzavecchia et al. | Human T cell lines with antigen specificity and helper activity | |
| Gabriel et al. | Flow cytometry: principles and applications in exercise immunology | |
| EP3182124B1 (en) | Detection of acute myeloid leukaemia | |
| Meunier et al. | Quantification of CD1a, HLA‐DR, and HLA class I expression on viable human Langerhans cells and keratinocytes | |
| Cordier et al. | Flow cytometry sorting of unlabelled epidermal Langerhans cells using forward and orthogonal light scatter properties | |
| Bruserud et al. | Interleukin 4 responses in acute leukaemia patients with severe chemotherapy‐induced leucopenia | |
| Carayon et al. | Simultaneous identification of eight leucocyte subsets of human peripheral blood using three-colour immunofluorescence flow cytometric analysis | |
| Jansson et al. | Classification of acute leukaemia by light and electron microscope cytochemistry |