DE19918446A1

DE19918446A1 - Verwendung von Coxsackievirus B3 zur Verbesserung der Transfektion von Zellen

Info

Publication number: DE19918446A1
Application number: DE19918446A
Authority: DE
Inventors: Jan-Heiner Kuepper; Reinhard Kandolf; Hans-Christoph Selinka
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Current assignee: HEART BIOSYSTEMS GMBH, 69120 HEIDELBERG, DE
Priority date: 1999-04-23
Filing date: 1999-04-23
Publication date: 2000-11-23
Also published as: EP1173595A1; AU4297300A; WO2000065075A1

Abstract

Es werden von dem Coxsackievirus B3 abgeleitete, nicht infektiöse Partikel oder Peptide beschrieben, die dazu geeignet sind, im Rahmen einer Transfektion von Zellen endosomolytisch zu wirken und/oder die Endocytose zu verstärken.

Description

Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich allgemein mit der Verwendung von Coxsackievirus B3 (im folgenden: CVB3) zur Ver besserung der Transfektion von Zellen.

Unter Transfektion wird im Rahmen der vorliegenden Anmeldung nicht nur das Einbringen von DNA oder RNA in Zellen, sondern auch das Einbringen von Peptiden in Zellen verstanden. Die Transfektion kann somit zu therapeutischen, diagnostischen oder prophylaktischen Zwecken, insbesondere einer Gentherapie einge setzt werden.

Besonderes Augenmerk richtet die vorliegende Erfindung auf die Diagnose, Behandlung und Prävention von kardialen Erkrankungen, die insbesondere in den Industrienationen eine immer größere Bedeutung erlangen. Nachdem bereits verschiedene Gene für kar diale Erkrankungen identifiziert wurden und es allgemein er wartet wird, daß eine Vielzahl von pathologischen Genen, die Herzerkrankungen auslösen können, in den nächsten Jahren noch identifiziert werden, ist die Entwicklung von Herzmuskel-spezi fischen Gentransfersystemen zur selektiven Modulation der endo genen Genaktivität kardialer Myozyten für die zukünftige Be handlung einer Vielzahl von angeborenen und erworbenen Herz muskelerkrankungen von großer klinischer Bedeutung. Ideale Vektorsysteme für die kontrollierte Modulation der endogenen Genaktivitäten kardialer Myozyten stehen jedoch bisher nicht zur Verfügung.

Für die Transfektion von Zielzellen des kardiovaskulären Systems wurden zwar bereits verschiedene Techniken beschrieben, diese weisen jedoch alle spezifische Nachteile auf. In präklinischen Studien zur somatischen Gentherapie kardio vaskulärer Erkrankungen wurden bislang insbesondere replika tionsdefekte rekombinante Adenoviren angesetzt, mit denen eine hinreichende Transfektion effizient erreicht wird (Barr et al., Gene Therapy 1, 1994, 51). Im Gegensatz zu rekombinanten Adenoviren ist die Applikation von retroviralen Konstrukten (Nabel EG et al., Science 249, 1990, 1285) sowie von Lipid/ DNA/Komplexen (Nabel EG et al., Science 244, 1989, 1342) durch die niedrige Transfektionseffizienz des Gentransfers limitiert. Trotz der Vorteile des Adenovirus-vermittelten Gentransfers bezüglich der hohen Genexpression liegen die Nachteile dieses Verfahrens in der aus der Literatur bekannten Komplementierung replikationsinaktiver Konstrukte, der Multiorgantropie von Adenoviren sowie der möglichen Induktion einer T-Zell- vermittelten Immunantwort.

Felgner et al., PNAS, Band 84, Seiten 7413-7417, 1987 be schreiben eine Lipofektion genannte Transfektion von DNA in Zellkulturzellen, bei der eine Liposomenformulierung aus dem kationischen Lipid N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-n,n,n-Trime thylammoniumchlorid (DOTMA) und Dioleoyl-Phosphotidylethano lamin (PtdEtn) verwendet wird. Die zu transferierende DNA interagiert spontan mit der Liposomenformulierung, und es bilden sich Lipid-DNA-Komplexe. Die Fusion des Komplexes mit Zellkulturzellen führt zu einer effizienten Aufnahme und Expression der DNA.

Diese Liposomenformulierung wird von GIBCO/BRL unter dem Handelsnamen LIPOFECTIN® vertrieben. Die mitgelieferten Her stellinformationen, in denen PtdEtn mit DOPE bezeichnet wird, geben detaillierte Anweisungen für die Durchführung der Lipofektion an.

Mittlerweile ist Lipofektion eine anerkannte Methode, um rekom binante DNA in Zellen einzuschleusen und dort zu exprimieren. Da die Lipofektion in bezug auf Sicherheit viralen Vektor systemen überlegen ist, wird zunehmend versucht, diese Technik auch für die Gentherapie von Stoffwechsel- oder Tumor erkrankungen einzusetzen. Die Effizienz ist jedoch bei den meisten Anwendungen gering, insbesondere bei Primärkulturen oder in vivo-Applikationen sind die bekannten Liposomen-Systeme bisher nicht gut geeignet.

Ein weiterer Ansatz geht von der Erkenntnis aus, daß viele Viren über zelluläre Rezeptoren aufgenommen werden, auf natür lichem Weg in zytoplasmatische Endosomen gelangen und von dort ihren Replikationszyklus antreten, nachdem die Endosomen aufge brochen wurden. Diese endosomolytische Wirkung nutzen Cotten et al., PNAS Band 89, Seiten 6094-6098, 1992 aus und verwenden replikationsinkompetente Adenoviren als endosomolytisches Agens zusammen mit Transferrin als Ligand für die Zielzellrezeptoren.

Wagner et al., PNAS Band 89, Seiten 7934-7938, 1992 zeigen, daß Peptidfragmente eines Influenzavirus endosomolytisch wirken. Als synthetisches, virusartiges Gentransfervehikel verwenden sie DNA-Komplexe aus Poly-Lysin zum Verpacken der DNA, Poly- Lysin-modifiziertem Transferrin als Ligand für die Zellober flächenrezeptoren sowie Poly-Lysin-gebundene Influenzapeptid fragmente als endosomolytisches Agens.

Die beschriebenen Verfahren sind zum einen sehr aufwendig und damit für Standardanwendungen nicht geeignet. Bei den beiden zuletzt beschriebenen Verfahren werden darüber hinaus sehr große Peptidmengen benötigt, was aufgrund der starken Immuno genität bei in vivo-Applikationen ungünstig und aufgrund der teuren Herstellung darüber hinaus auch für in vitro-Anwendungen ungeeignet ist.

Einen weiteren Ansatz beschreiben Kern et al. in "Coxsackievirus-verstärkter endosomolytischer Gentransfer in kontraktile Kardiomyozyten", Verh. Dtsch. Ges. Path. Band 81, Seite 611, 1997. Ausgehend von der Erkenntnis, daß das Cox sackievirus einen bisher unverstandenen Tropismus in das Herz aufweist, setzen sie bei der Lipofektion durch UV-Strahlung replikationsinkompetente CVB3-Partikel für den Gentransfer in Kardiomyozyten ein. Bei CVB3 handelt es sich um ein Picorna virus mit einem einzelsträngigen RNA-Genom positiver Polarität und einer Genomgröße von nur 7,4 kb. Zum Vergleich, Adenoviren haben eine Genomgröße von 48 kb.

Kandolf und Hofschneider, PNAS, Band 82, Seiten 4818/4822, 1985, beschreiben eine CVB3-Variante mit ausgeprägtem Tropismus für das Herz. Die vollständige Nukleotidsequenz der cDNA dieser infektiösen CVB3-Variante ist beschrieben bei Klump et al., Journal of Virology, 1990, Seiten 1573-1783. Es wird berichtet, daß das cDNA-abgeleitete Virus denselben Tropismus und dieselbe Plaque-Morphologie aufweist wie der Wildtyp.

Kern et al. (a.a.0.) beschreiben, daß durch das inaktivierte CVB3 eine Verstärkung der durch die Liposomenformulierung DOTAP (Böhringer) vermittelten Transfektion erfolgt. Die maximale Transfektionseffizienz wird für die Verwendung von 10 pfu (Plaque-bildende Einheiten) an inaktiviertem CVB3 pro Zelle be richtet, sie lag für das Reportergen der β-Galactosidase bis zu 6-fach höher als bei einer Transfektion der Reportergen konstruktion ausschließlich mit DOTAP.

Obwohl aus der Veröffentlichung von Kern et al. bekannt ist, daß die CVB3-verstärkte DOTAP-vermittelte Lipofektion dazu führt, daß die transfizierte DNA schneller aus den Endosomen in das Zytosol gelangt, ist die beschriebene Effizienz sowie der hohe Einsatz von CVB3 aus immunologischen Gründen noch nicht zufriedenstellend.

Hiervon ausgehend ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, für eine Steigerung der Effizienz der Transfektion von Zellen zu sorgen, wobei das Verfahren gleichzeitig preiswert und immu nologisch unbedenklich sein soll.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch von dem CVB3 abgeleitete, nicht infektiöse Partikel oder Peptide, die dazu geeignet sind, im Rahmen einer Transfektion von Zellen endo somolytisch zu wirken oder die Endocytose zu verstärken.

Die Partikel sind dabei ausgewählt aus der Gruppe

a) leere CVB3-Kapsidpartikel,
b) durch Abspaltung von Virusprotein 4 entstandene CVB3-A- Partikel,
c) CVB3-Proviruspartikel, bei denen die Virusproteine 2 und 4 noch fusioniert sind, und
d) modifizierte Formen der Partikel aus a), b) oder c).

Das Peptid, das vorzugsweise weniger als 30 Aminosäuren umfaßt, ist dabei vorteilhafterweise ausgewählt aus der Gruppe:

a) Peptide mit den Aminosäureseguenzen SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 10 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll,
b) Peptide, bei denen gegenüber den Peptiden aus a) eine oder mehrere der Aminosäuren fehlen oder gegen eine andere aus getauscht sind, und
c) Peptide oder Polypeptide, die die Aminosäuresequenz eines der Peptide aus a) oder b) umfassen.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst.

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben nämlich erkannt, daß von dem CVB3 abgeleitete Partikel oder Peptide für den Gen transfer eingesetzt werden können, da sie endosomolytisch wir ken und/oder die Endocytose verstärken. Das Verfahren der Transfektion wird durch die Verwendung dieser Partikel und/oder Peptide zum einen sehr preiswert, da sich äußerst hohe Aus beuten bei der Herstellung ergeben, eine sehr einfache Reini gung möglich ist, sowie sehr kleine Peptide/Partikel eingesetzt werden, die eine wesentlich geringere Anzahl immunogener Epitope als Adeno- oder Influenzaviren haben. Die Erfinder konnten zeigen, daß sich bei sehr viel geringeren Peptidmengen als bei Adenoviren optimale biologische Effekte ergeben, die größere biologische Wirksamkeit geht ferner einher mit einer Herabsetzung der Immunogenität.

Ein weiterer Vorteil bei der Verwendung der Partikel und Pep tide besteht darin, daß diese in jedem Fall nicht infektiös sind, wobei in vielen Fällen auch auf die UV-Bestrahlung zur Inaktivierung der RNA verzichtet werden kann.

Gegenüber dem von Kern et al. (a.a.0.) beschriebenen Einsatz von inaktivierten CVB3 Partikeln bei der Lipofektion war zu nächst unerwartet, daß auch die abgeleiteten Peptide und Parti kel zu einer Verstärkung der Transfektion führten. Es zeigte sich sogar, daß die Effizienz größer ist als bei inaktivierten CVB3.

Erfindungsgemäß weist ein Verfahren zur Erzeugung eines der artigen Partikels die Schritte auf:

- Isolieren von nativen CVB3-Partikeln,
- Erhitzen der isolierten CVB3-Partikel für 5-20 min, vor zugsweise ca. 10 min, auf über 45°C, vorzugsweise ca. 51°C.

Versuche im Labor der Erfinder haben gezeigt, daß durch dieses Verfahren auf einfache Weise CVB3-A-Partikel erzeugt werden, bei denen das Virusprotein 4 abgespalten wurde.

Alternativ können CVB3-A-Partikel auch mit dem folgenden Ver fahren hergestellt werden:

- Bereitstellen einer Matrix mit gekoppeltem CVB3-Rezeptor,
- Beschicken der Matrix mit nativen CVB3-Partikeln, und
- Eluieren der Matrix.

Hier wird von der Tatsache Gebrauch gemacht, daß das Virus protein 4 nach der Interaktion des CVB3 mit dem zellulären Re zeptor abgespalten wird, so daß nur noch das verbleibende CVB3- A-Partikel internalisiert wird, das nicht infektiös ist und nach Erkenntnis der Anmelder endosomolytisch wirkt.

Vor diesem Hintergrund betrifft die vorliegende Erfindung fer ner ein Verfahren zur Transfektion von Zellen, vorzugsweise von kardialen Myozyten mit einem Polyanion, vorzugsweise einer therapeutischen Gensequenz, bei dem zur Verstärkung der Trans fektion zumindest ein Partikel oder Peptid der oben genannten Art eingesetzt wird, wobei vorzugsweise vor der Transfektion ein Komplex aus dem Polyanion, dem Peptid sowie einem kationi schen Lipid, vorzugsweise DOTMA gebildet wird.

Während die erwähnten Partikel und Peptide allgemein endo somolytisch wirken, also für eine hohe Effizienz des neuen Ver fahrens sorgen, besteht ein besonderer Vorteil bei der Lipo fektion von kardialen Myozyten. Die Erfinder haben nämlich er kannt, daß die Endosomolyse organspezifische Aspekte haben kann, so daß die Verwendung von Partikeln und Peptiden, die von dem CVB3 abgeleitet sind, für den Gentransfer am Herzmuskel die Methode der Wahl ist. Es hat sich gezeigt, daß andere Viren bei weitem nicht so effizient sind, insbesondere haben Adenoviren keine Möglichkeit, dieses Organ so effizient zu besiedeln wie der kardiotrophe CVB3.

Das transfizierte Polyanion kann dabei eine DNA, eine RNA oder ein entsprechend geladenes Protein mit therapeutischer Wirkung sein.

Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ferner ein Ver fahren zur Formulierung von Komplexen für den Transfer von Polyanionen, vorzugsweise einer therapeutischen Gensequenz in Zellen, vorzugsweise kardiale Myozyten, bei dem das Polyanion mit zumindest einem Peptid oder Partikel der oben genannten Art inkubiert wird.

Dabei ist es bevorzugt, wenn das Peptid vor der Inkubation mit dem Polyanion mit einem kationischen Lipid, vorzugsweise mit DOTMA, vorinkubiert wird.

Dieses Verfahren ist besonders effizient, preiswert und einfach durchzuführen, die einzelnen Agenzien sind lediglich der Reihe nach miteinander zu vermischen und für kurze Zeit zu inkubie ren, wobei sich spontan der gewünschte Komplex bildet.

Derartige Komplexe sind somit einfach und damit preiswert her zustellende sowie immunologisch unbedenkliche Vehikel für den Transfer von diagnostisch, therapeutisch oder prophylaktisch wirkenden Agenzien in Zellen insbesondere des Herz-Kreislauf- Systems.

Vor diesem Hintergrund betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Peptides oder Partikels der vorstehend ge nannten Art für die Therapie, Diagnostik oder Prophylaxe von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, insbesondere von Kardiomyopathien.

Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung eines Pep tides oder Partikels der vorstehend genannten Art als Agens zur Verbesserung der Transfektion von Zellen, vorzugsweise kardia len Myozyten, insbesondere zur Verbesserung der Lipofektion bei der Gentherapie.

Die gefundenen Peptide und Partikel lassen sich nicht nur im wissenschaftlichen Bereich oder bei der Einzelzubereitung ein setzen, sie sind vielmehr auch geeignet für den allgemeinen Einsatz auch in weniger spezialisierten Krankenhäusern oder Arztpraxen.

Vor diesem Hintergrund betrifft die vorliegende Erfindung auch eine therapeutische Zusammensetzung mit einem Peptid oder Par tikel der vorstehend genannten Art, sowie einen Kit für die Formulierung von transfizierbaren Komplexen, insbesondere für die Gentherapie, der ein Peptid oder Partikel der vorstehend genannten Art enthält.

Derartige therapeutische Zusammensetzungen und Kits können die Partikel und/oder Peptide in Stammlösungen oder bereits in End konzentrationen enthalten, wobei im Kit ferner die weiter be nötigten Reagenzien, z. B. die Liposomenformulierung vorhanden sein können.

Die Peptide und Partikel lassen sich zum einen enzymatisch durch Verdau von Viruspartikeln erzeugen, zum anderen aber auch auf gentechnische Weise.

Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ferner einen re plizierbaren Expressionsvektor, der eine Gensequenz enthält, die auf exprimierbare Weise für ein Peptid oder Partikel der vorstehend genannten Art kodiert.

Ferner betrifft die Erfindung ein DNA-Isolat mit einer DNA- Sequenz, die für das Peptid oder Protein der vorstehend genann ten Art kodiert.

Auf diese Weise ist es möglich, die Peptide und Partikel im großtechnischen Maßstab durch mikrobiologische Verfahren oder in vitro-Translation zu erzeugen.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungs beispiele.

Beispiel 1: Reinigung von CVB3-Partikeln

Zellkulturen mit konfluent gewachsenen Kardiomyozyten werden mit 1-5 infektiösen Einheiten (PFU) CVB3 infiziert. Nach einigen Stunden ist der zytopathische Effekt erkennbar.

Nach 6-12 Stunden werden die Zellkulturüberstände sowie die Zellen geerntet.

Die Viren werden durch übliche Gefrier/Tau-Lyse aus den Zellen freigesetzt. Diese Virussuspension wird zunächst durch Zentri fugation bei 1.500 Upm von Zelltrümmern gereinigt.

Der virushaltige Überstand wird auf 10 ml eines 5-30% Saccharosegradienten geschichtet und ultrazentrifugiert. Da durch ergibt sich eine Trennung von nativen Virionen (Sedimentationskoeffizient 160 S), CVB3-A-Partikeln (135 S) und Proviren (125 S). Proviren sind unvollständig maturierte Viren, die bei jeder Präparation in großer Menge vorliegen und sich durch noch nicht erfolgte Spaltung des VP0-Proteins in VP2 und VP4 auszeichnen.

A-Partikel entstehen aus nativen Virionen durch Abspaltung des Virusproteins 4, einem bei der Infektion natürlicherweise ab laufenden Vorgang. Sie sind dann nicht mehr infektiös, jedoch in einer Zelle noch vermehrbar.

Die erfahrungsgemäß in den ersten fünf Fraktionen zu findenden infektiösen Partikel werden durch Western-Blot-Analyse auf die Anwesenheit der viralen Partikel untersucht.

Zur Elimination der Saccharose aus den Viruspräparationen wer den die relevanten Einzelfraktionen gegen PBS/20 mM MgCl₂ für 24 Stunden bei 4°C dialysiert.

Die gereinigten Virusstocks werden bei -20°C gelagert. Ver dünnungen dieser Virusstocks werden auf Wirtszellen ausgesät, um den Virustiter in einem üblichen Plaque-Test zu überprüfen.

Zur Inaktivierung der CVB3-Viren wird der Virusstock in eine Petrischale gefüllt und 30-60 min mit UV-C bestrahlt. Dabei werden die Nukleinsäuren der Viren geschädigt, nicht aber die biologisch aktiven Proteine.

Beispiel 2: Erzeugung von CVB3-A-Partikeln

In den gemäß Beispiel 1 hergestellten Fraktionen finden sich nur geringe Mengen an CVB3-A-Partikeln, so daß diese auf die beiden folgenden Weisen aus infektiösen CVB3-Partikeln herge stellt werden können:

A) native Virionen werden für 10 min bei 51°C erhitzt und gehen dabei quantitativ in CVB3-A-Partikel über.
Auf diese Weise steht ein Verfahren zur Verfügung, mit dem beliebig große Mengen dieser sonst nur in limitierenden Mengen von infizierten Zellen freigesetzten Partikel erzeugt werden können.
B) Die Alternative beruht auf einer Säulenaufreinigung, bei der rekombinante CVB3-Rezeptoren an eine Matrix gekoppelt werden. Die Säule wird dann mit aktiven CVB3-Partikeln ge laden, die mit dem Rezeptor interagieren und dabei das Virusprotein 4 verlieren. Durch die Elution der Säule lassen sich die CVB3-A-Partikel gewinnen.

Beispiel 3: Endosomolytische Aktivität

Es konnte gezeigt werden, daß die CVB3-verstärkte Lipofektion unabhängig vom Rezeptor ist, so daß bei der Lipofektion keine A-Partikel erzeugt werden. Die besseren Ergebnisse, die mit der durch A-Partikel verstärkten Lipofektion erzielt werden, lassen sich folglich darauf zurückführen, daß im ersten Fall das Virusprotein 4 mit in die Endosomen gelangt, während dieses Virusprotein 4 den A-Partikeln fehlt.

Die eindeutige endosomolytische Aktivität von CVB3 konnte da durch nachgewiesen werden, daß die CVB3-vermittelte Verstärkung der Lipofektion durch Bafilomycin, einem spezifischen Inhibitor der endosomalen Protonen-Pumpe (Bowman et al., PNAS, Band 85, Seiten 7972-7962, 1988; Drose et al., Biochemistry, Band 32, Seiten 3902-3906, 1993) wieder aufgehoben wird. Die Infektion von Zellen mit CVB3 läßt sich durch Bafilomycin jedoch nicht hemmen.

Peptide aus der Kapsidregion von CVB3, die endosomolytisch aktiv sind, sind in der folgenden Tabelle abgedruckt:

Tabelle 1

CVB3-Peptide mit endosomolytischer Aktivität. Hydrophile saure bzw. basische Aminosäuren sind fett gedruckt

Bei den Peptiden kann das Problem bestehen, daß sie sich auf grund ihrer amphipathischen Eigenschaften nur schwer mit Lipo somen kombinieren lassen, denn diese werden dadurch zerstört. Dieses Problem kann dadurch gelöst werden, daß einige saure Aminosäuren zusätzlich N-terminal oder C-terminal synthetisiert werden, und das synthetische Peptid dann über eine positiv ge ladene Poly-Lysin-Brücke an die zu transferierende DNA gebunden wird. Dies hat den weiteren Vorteil, daß Transferrin-gekoppel tes Poly-Lysin verwendet werden kann, so daß eine effiziente Bindung an den Transferrin-Rezeptor möglich ist (Wagner, a.a.O.).

Beispiel 4: CVB3-verstärkte Lipofektion

Als Zielzellen wurden Chinese-Hamster-Ovarian-Zellen (CHO), Rattenmyoblasten-Zellen (H9C2), humane Zervix-Karzinom-Zellen (HeLa), primäre humane Fibroblasten sowie primäre adulte Herz muskelzellen des Schweins eingesetzt.

Am ersten Tag wurden 5 × 10⁴ Zellen auf 24-Loch-Platten ausge sät. An zweiten Tag wurden die folgenden Lösungen angesetzt:

Lösung A:

150 µl Serum-freies Medium
5 µl Lipofektin (GIBCO/BRL)
1 Partikel pro Zelle bzw. 100 ng-10 µg-Peptidlösung.

Lösung A wird 30 min bei Raumtemperatur inkubiert.

Lösung B:

1,5 µg Plasmid-DNA (z. B. pCMVLacZ)
ad 150 µl Serum-freies Medium.

Die Lösungen A und B werden gemischt und 15 min bei Raum temperatur inkubiert.

Vor Zugabe der fertigen Lipofektionslösung werden die Zellen einmal mit Serumfreiem Medium gewaschen.

Das Medium wird vollständig entfernt und die 300 µl Lipo fektionslösung auf die 24-Loch-Platte gegeben. Danach werden die Zellen für 5 Stunden bei 5% CO₂ und 37°C inkubiert. Nach dieser Zeit wird die Lipofektionslösung entnommen und durch Zellkulturmedium ersetzt.

Die Auswertung der Transfektion erfolgt am nächsten Tag durch einen In-situ-Lac-Z-Assay:
Das transfizierte Plasmid pCMVLacZ kodiert für die β-Galactosi dase, die aus der zunächst farblosen Lösung ein blaues, unlös liches Reaktionsprodukt in den Zellen erzeugt. Die Zellen wer den dabei zunächst fixiert und dann mit der Färbelösung inku biert. Die Transfektionseffizienz ergibt sich aus der Anzahl der gefärbten Zellen/Gesamtzellzahl und wird im Mikroskop be stimmt.

Erste Ergebnisse aus dem Labor der Erfinder zeigen, daß durch die Partikel gemäß Beispiel 1 und 2 sowie die Peptide gemäß Beispiel 3 eine Transfektion vermittelt werden kann, deren Effizienz oberhalb der Effizienz von Adenovirus-vermittelter Lipofektion liegt.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Vom Coxsackievirus B3 abgeleitete, nicht infektiöse Parti kel oder Peptide, die dazu geeignet sind, im Rahmen einer Transfektion von Zellen endosomolytisch zu wirken.

2. Vom Coxsackievirus B3 abgeleitete, nicht infektiöse Parti kel oder Peptide, die dazu geeignet sind, im Rahmen einer Transfektion von Zellen die Endocytose zu verstärken.

3. Partikel nach Anspruch 1 oder 2, ausgewählt aus der Gruppe:

a) leere CVB3-Kapsidpartikel,
b) durch Abspaltung von Virusprotein 4 (VP4) entstandene CVB3-A-Partikel,
c) CVB3-Proviruspartikel, bei denen die Virusproteine 2 (VP2) und 4 (VP4) noch fusioniert sind, und
d) modifizierte Formen der Partikel aus a), b) oder c).

4. Peptid nach Anspruch 1 oder 2, das vorzugsweise weniger als 30 Aminosäuren umfaßt und ausgewählt ist aus der Gruppe:

a) Peptide mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 10 aus dem Sequenzprotokoll,
b) Peptide, bei denen gegenüber den Peptiden aus a) eine oder mehrere der Aminosäuren fehlen oder gegen eine andere ausgetauscht sind, und
c) Peptide oder Polypeptide, die die Aminosäuresequenz eines der Peptide aus a) oder b) umfassen.

5. Verfahren zur Erzeugung eines Partikels nach Anspruch 3, mit den Schritten:

1. Isolieren von nativen Coxsackievirus B3-Partikeln,
2. Erhitzen der isolierten Coxsackievirus B3-Partikel für 5-20 min, vorzugsweise ca. 10 min auf über 45°C, vorzugsweise ca. 51°C.

6. Verfahren zur Erzeugung eines Partikels nach Anspruch 3, mit den Schritten:

1. Bereitstellen einer Matrix von gekoppeltem Cox sackievirus B3-Rezeptor,
2. Beschicken der Matrix mit nativen Coxsackievirus B3-Partikeln, und
3. Eluieren der Matrix.

7. Verfahren zur Transfektion von Zellen, vorzugsweise von kardialen Myozyten mit einem Polyanion, vorzugsweise einer therapeutischen Gensequenz, bei dem zur Verstärkung der Transfektion zumindest ein Partikel oder Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 eingesetzt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Transfektion ein Komplex aus dem Polyanion, dem Peptid sowie einem kationischen Lipid, vorzugsweise DOTMA ge bildet wird.

9. Verfahren zur Formulierung von Komplexen für den Transfer eines Polyanions, vorzugsweise einer therapeutischen Gen sequenz in Zellen, vorzugsweise kardiale Myozyten, bei dem das Polyanion mit zumindest einem Partikel oder Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 inkubiert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid vor der Inkubation mit dem Polyanion mit einem kationischen Lipid, vorzugsweise mit DOTMA, vorinkubiert wird.

11. Verwendung eines Partikels oder Peptides nach einem der Ansprüche 1 bis 4, für die Therapie, Diagnostik oder Pro phylaxe von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, insbesondere von Kardiomyopathien.

12. Verwendung eines Partikels oder Peptides nach einem der Ansprüche 1 bis 4 als Agens zur Verbesserung der Trans fektion von Zellen, vorzugsweise kardialen Myozyten, ins besondere zur Verbesserung der Lipofektion bei der Gen therapie.

13. Replizierbarer Expressionsvektor, der eine Gensequenz ent hält, die auf exprimierbare Weise für ein Peptid oder Par tikel nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert.

14. DNA-Isolat mit einer DNA-Sequenz, die für ein Partikel oder Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert.

15. Kit für die Formulierung von transfizierbaren Komplexen, insbesondere für die Gentherapie, der zumindest ein Par tikel oder Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 ent hält.

16. Therapeutische Zusammensetzung mit zumindest einem Par tikel oder Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4.