DE69825978T2

DE69825978T2 - Genabgabe-Vehikel die das Apoptosis VP2 induzierendes Protein, und/oder Apoptin Exprimiert

Info

Publication number: DE69825978T2
Application number: DE69825978T
Authority: DE
Inventors: Hubertus Matheus NOTEBORN; Maria Alexandra PIETERSEN
Original assignee: Leadd BV
Current assignee: Leadd BV
Priority date: 1997-04-15
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2018-04-16
Also published as: PL196607B1; BR9808542A; CA2286165C; KR100528755B1; AU750162B2; AU6856398A; NO994967L; EP0975764B1; JP2001521387A; SK142899A3; DE69825978D1; CZ349399A3; PT975764E; SK285724B6; ES2227822T3; EP0975764A1; NZ500012A; KR20010006460A; ATE275200T1; PL336312A1

Description

Die Erfindung betrifft Gentransportvehikel, welche Nukleinsäure-Moleküle umfassen, die für Apoptose-induzierende Proteine VP2 und/oder eine Apoptin-(VP3)-artige Aktivität codieren.
Außerdem betrifft die Erfindung Antitumor-Therapien und die Diagnose von Krebs. Die Infektion verschiedener humaner Tumorzellen mit den Gentransportvehikeln der Erfindung wird zur Herbeiführung einer Apoptose in Tumorzellen und einer viel reduzierteren Apoptose, sofern überhaupt, in normalen diploiden, nicht-transformierten/nicht-malignen Zellen führen.
In vitro induzierte die Expression des vom Hühneranämie-Virus (CAV) stammenden Proteins Apoptin (VP3) in transformierten Hühnerzellen eine Apoptose (Noteborn et al. 1994, Noteborn und Koch, 1995). Die Apoptose ist durch ein Schrumpfen der Zellen, eine Segmentierung des Kerns, die Kondensation und Spaltung der DNA in Fragmente von der Größe einer Domäne, in den meisten Zellen gefolgt von internukleosomaler Degradation, gekennzeichnet. Schließlich fragmentieren die apoptotischen Zellen zu membranumschlossenen apoptotischen Körpern, die durch benachbarte Zellen schnell phagozytiert werden. Daher bewirkt eine Apoptose viel weniger Gewebezerstörung als eine Nekrose, die nicht-physiologische Art von Zelltod (Wyllie et al., 1980, Arends und Wyllie, 1991, und White, 1996).
Apoptin ist ein kleines Protein von lediglich 121 Aminosäuren Länge, das ziemlich basisch und Prolin-, Serin- und Threonin-reich ist (Noteborn et al. 1991). In den analysierten transformierten Hühnerzellen, und all jenen, die eine Apoptin-induzierte Apoptose vollziehen, ist Apoptin ausschließlich innerhalb des Zellkerns lokalisiert. Eine Verkürzung der C-terminalen Basenabfolge des Apoptins führt zu einer verminderten nuklea ren Lokalisation und einer signifikant reduzierten apoptotischen Aktivität (Noteborn et al., 1994).
Apoptin, und andere Proteine mit einer Apoptin-artigen Aktivität, können ebenfalls eine Apoptose in humanen malignen und transformierten Zelllinien hervorrufen, doch nicht in untransformierten humanen Zelllinien. Wir haben festgestellt, dass die Apoptin-induzierte Apoptose in Abwesenheit von funktionellem p53 auftritt (Zhuang et al., 1995a) und nicht durch Bcl-2 BCR-ABL (Zhuang et al., 1995), das Bcl-2-assoziierte Protein BAG-1 und das Kuhpocken-Protein CrmA (Noteborn, 1996) blockiert werden kann. In vitro versagt das Apoptin beim Induzieren des programmierten Zelltods in normalen lymphoiden, dermalen, epidermalen, endothelialen und glatten Muskelzellen. Werden normale Zellen allerdings transformiert, so werden sie empfänglich für eine Apoptose durch Apoptin oder andere Proteine mit Apoptin-artiger Aktivität. Eine Langzeit-Expression von Apoptin in normalen humanen Fibroblasten zeigte, dass Apoptin keine toxische oder transformierende Aktivität in diesen Zellen aufweist. In normalen Zellen wurde Apoptin hauptsächlich im Zytoplasma gefunden, wohingegen es in transformierten oder malignen Zellen, z.B. durch Hyperplasie, Metaplasie oder Dysplasie charakterisierten Zellen, im Kern lokalisiert war, was nahelegt, dass die Lokalisiation des Apoptin mit seiner Aktivität in Verbindung steht (Danen-Van Oorschot et al., 1997, Noteborn 1996).
Die Apoptose ist ein aktiver und programmierter physiologischer Prozess zur Eliminierung überflüssiger, veränderter oder maligner Zellen (Earnshaw, 1995). Der apoptotische Prozess kann durch eine Vielzahl regulatorischer Reize ausgelöst werden (Wyllie, 1995, und White, 1996). Veränderungen bei der Zellüberlebensrate spielen eine wichtige Rolle in der Humanpathogenese, z.B. der Krebsentwicklung, welche durch eine vermehrte Zellwucherung, aber auch durch verminderten Zelltod bewirkt wird (Kern, et al., 1994). Von einer Vielfalt chemotherapeutischer Verbindungen und der Bestrahlung wurde gezeigt, dass sie eine Apoptose in Tumorzellen induzieren, in vielen Fällen über Wildtyp-p53 (Thompson 1995, Bellamy et al., 1995, Steller, 1995).
Viele Tumoren nehmen jedoch während ihrer Entwicklung eine Mutation in p53 an, was oftmals mit einer schlechten Reaktion auf die Krebstherapie korreliert (Hooper, 1994).
Bei verschiedenen (leukämischen) Tumoren ist ein hoher Expressionsgrad des protoonkogenen Bcl-2 mit einer starken Resistenz gegenüber verschiedenen Apoptoseinduzierenden chemotherapeutischen Mitteln verbunden (Hockenberry, 1994, Kerr et al., 1994, und Sachs und Lotem, 1993).
Daher kann Apoptin ein potenzieller Kandidat für die Zerstörung von Tumorzellen, oder anderen durch Hyperplasie, Metaplasie oder Dysplasie gekennzeichneten Zelten, werden, die resistent gegenüber der (chemo)therapeutischen Induktion der Apoptose aufgrund des Fehlens des funktionellen p53 und einer (Über)-Expression von Bcl-2 und anderen Apoptose-inhibierenden Agentien geworden sind. Die Tatsache, dass Apoptin in normalen nicht-transformierten Humanzellen keine Apoptose induziert, zumindest nicht in vitro, legt nahe, dass eine toxische Wirkung der Apoptinbehandlung in vivo sehr gering sein könnte.
Bisher wird die Expression des Apoptin in Tumorzellen jedoch unter Anwendung einer transienten Transfektion von Gewebekulturzellen vorgenommen. Der Nachteil dieser Expressionsmethode besteht in dem sehr geringen Prozentsatz an Zellen, der Apoptin unter in vitro-Umständen exprimieren kann. In vivo werden die angewendeten Transfektionsmethoden mühsam und nicht effizient sein, sofern überhaupt möglich, und werden in keinster Weise zu einer wirksamen Behandlung von Krebs beitragen.
Adenovirus kann von humanen Adenoviren (Ads) hergeleitet werden, bei denen es sich um hüllenlose icosaedrische DNA-Viren handelt. Das Genom besteht aus einem linearen, doppelsträngigen DNA-Molekül von etwa 36 kb, das invertierte terminate Repititionen trägt (Horvitz, 1990). Die Serotypen, die zur Vektor-Entwicklung verwendet worden sind (Ad2 und Ad5), sind nicht mit einer schweren Pathologie beim Menschen verbunden (Horvitz, 1990). Das Virus ist extrem effizient beim Einführen seiner DNA in die Wirtszelle. Ads kann eine breite Vielzahl sich teilender und nicht-teilender Zellen eines breiten Bereichs von Spezies infizieren, und das Virus kann in großen Mengen relativ einfach hergestellt werden. Im Gegensatz zu Retroviren integriert sich Ads nicht in das Wirtszellgenom. Alle derzeit verwendeten rAdVs weisen eine Deletion in der EI-Region auf, wo neue DNA eingeführt werden kann. Die EL-Deletion macht das rekombinante Virus replikationsdefekt (Stratford-Perricaudet und Perricaudet, 1991). Einerseits bietet dies ein wesentliches Sicherheitsmerkmal: das rAdV kann nicht an Humanzellen in Abwesenheit von EIA-Proteinen replizieren. So kann das rAdV seine genetische Information in eine menschliche Zelle transportieren, doch wird dies nicht zu einer lytischen oder produktiven Infektion führen. Andererseits stellt dies ein Problem für die Herstellung dieser Vektoren dar. Allerdings brauchen die EI-Funktionen nicht notwendigerweise durch den Vektor selbst codiert zu werden. Sie können auch in trans, in speziellen Helferzellen, die die EI-Gene exprimieren, bereitgestellt werden. Auf die Infektion oder Transfektion dieser Helferzellen mit einem EI-deletierten Ad-Vektor hin werden die zellulären EI-Proteine die Replikation des rAdV komplementieren, was zur Produktion von rAdV-Nachkommen führt. Ad-Helferzellen müssen von humanem Ursprung sein und müssen die AdE1-Region enthalten und exprimieren, d.h. Ad-transformierte Humanzellen wie die Zelllinie 293 (Graham und Prevec, 1991), die 911-Zelllinie (Fallaux, et al., 1996) und die PER.C6-Zelllinie (Fallaux, 1996).
Die Erfindung stellt nun ein Gentransportvehikel (oder Vektor) bereit, welches die Nutzung der Merkmale des Antitumoragens Apoptin, oder anderer Proteine mit Apoptinartiger Aktivität, für die Krebstherapie über die Anwendung der Gentherapie, oder für die Behandlung von durch Hyperplasie, Metaplasie oder Dysplasie gekennzeichneten Malignitäten ermöglicht. Solch ein Gentransportvehikel, welches ein unabhängig infektiöser Vektor ist, kann zum Beispiel ein Virus oder ein Liposom oder ein Polymer oder ähnliches sein, welches aus sich selbst heraus infizieren oder in irgendeiner anderen Weise genetische Information zu beispielsweise Tumorzellen, die behandelbar sind, transportieren kann. Die genetische Information umfasst ein Nukleinsäure-Molekül, das für die Apoptin-artige Aktivität codiert. Die Erfindung stellt auch ein Gentransportvehikel bereit, das hinsichtlich seiner Expressionskapazität der Apoptin-artigen Aktivität stark vergrößert worden ist. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass das Verändern von flussaufwärts gelegenen nicht-codierenden Nukleinsäuresequenzen, die innerhalb der Translationsinitiationsstelle liegen und den Codierungssequenzen für das Apoptinartige Protein vorangehen, die Expression des Proteins in Tumorzellen stark erhöht. Die Erfindung stellt auch ein Gentransportvehikel bereit, das eine Nukleinsäure umfasst, die für die VP2-artige Aktivität codiert. Von der VP2-artigen Aktivität wurde überraschenderweise gezeigt, dass sie mit der Apoptin-artigen Aktivität bezüglich der Induktion der Apoptose in Tumorzellen synergistisch wirkt, dass VP2-artiges Protein aus sich selbst heraus ebenso synergistisch oder additiv zum Beispiel zur (chemo)therapeutischen Induktion von Apoptose wirken kann. Die Erfindung stellt außerdem ein Gentransportvehikel bereit, welches eine Nukleinsäure umfasst, die für eine VP2-artige Aktivität codiert und außerdem ein Nukleinsäure-Molekül umfasst, das für die Apoptinartige Aktivität codiert. Durch die Erfindung wird zum Beispiel ein Gentransportvehikel gemäß der Erfindung bereitgestellt, das ein Virus ist. Außerdem wird mit der Erfindung ein Gentransportvehikel bereitgestellt, das in sich selbst ein replikationsdefektes Virus ist, das aber in Helfer- oder Verpackungszellen replizieren und Gentransportvehikel-Nachkommen erzeugen kann. Das so durch die Erfindung bereitgestellte Gentransportvehikel kann zum Beispiel ein Adenovirus oder ein Retrovirus, oder andere DNA- oder RNA-rekombinante Viren sein, die als ein Transportvehikel oder ein Plasmavirus verwendet werden können. Außerdem stellt die Erfindung ein Gentransportvehikel bereit, das zusätzlich mit einem spezifischen Liganden oder Zielmolekül oder Zielmolekülen ergänzt worden ist, durch die das Gentransportvehikel spezifisch gesteuert werden kann, um seine genetische Information an eine Zielzelle der Wahl zu transportieren. Solch ein Zielmolekül kann zum Beispiel ein virales Spike-Protein oder Rezeptormolekül oder Antikörper sein, das mit einem Tumorzell-Oberflächenrezeptor oder Protein reaktionsfähig ist.
Außerdem wird mit der Erfindung ein Gentransportvehikel bereitgestellt, das in der Diagnose z.B. von Krebs verwendet werden kann. Solch ein Gentransportvehikel kann z.B. für die in vitro-Diagnose verwendet werden, bei der Gewebe- oder Zellproben oder Biopsien von einem Menschen oder Tier genommen werden. Solche Proben können dann ausgewertet oder getestet werden, indem sie in Kultur oder direkt mit dem Gentransportvehikel infiziert werden, das zum Exprimieren z.B. der Apoptin-artigen Aktivität fähig ist. Lediglich transformierte Zellen, oder Zellen, die verschiedene Stadien von Hyperplasie, Dysplasie oder Metaplasie, oder Tumor- oder Krebszellen zeigen, exprimieren ein Protein mit einer Apoptin-artigen Aktivität innerhalb des Kerns. Das Vorhandensein des Proteins kann z.B. mit klassischen (immuno)histochemischen Techniken, d.h. mikroskopisch oder mit automatisierten Zellsortiertechniken, nachgewiesen werden. Alternativ sind die obigen infizierten Zellen durch Apoptose gekennzeichnet und können daher auf die bekannten Charakteristika der Apoptose hin diagnostiziert werden.
Die Erfindung stellt weiterhin alle Schritte bereit oder beschreibt diese, die zur Konstruktion eines rekombinanten, replikationsdefekten Adenovirus erforderlich sind, der das Apoptose-induzierende Agens Apoptin exprimiert. Hohe Titer des rekombinanten Apoptin-Adenovirus können mittels Adenovirus-Verpackungszelllinien wie 293, 911 und PER.C6 erzeugt werden. Apoptin zeigt keine nachweislich negative Wirkung auf alle erforderlichen Adenovirus-Replikationsschritte und andere Lebenszyklus-Ereignisse des Adenovirus unter Zellkulturbedingungen.
Außerdem beschreibt die Erfindung die Konstruktion eines rekombinanten Kontroll-Adenovirus, welches alle Sequenzen des rekombinanten Apoptin-Adenovirus enthält, das aber aufgrund der 3'-5'-Orientierung der Apoptin-codierenden Sequenz unter Kontrolle der regulierenden Promotorelemente nicht zum Exprimieren von Apoptin fähig ist. Mittels dieses Kontroll-Adenovirus-Vektors können die spezifischen Wirkungen der Apoptin-Expression durch ein rekombinantes Adenovirus untersucht werden.
Rekombinanter replikationsdefekten Adenovirus exprimiert Apoptin in hohen Mengen in verschiedenen Tumor- und/oder transformierten Zellen, was zur Induktion der Apoptose führt. Im Gegensatz dazu führt die Expression von Apoptin in normalen nichttransformierten Humanzellen mittels rekombinanter Adenoviren nicht zur Induktion von Apoptin-induzierter Apoptose.
Insbesondere betrifft die Erfindung Antitumor-Therapien. Die Behandlung von Tumorzellen) wird durch die Expression von Apoptin mittels der Infektion von (Tumor)zellen mit Gentransportvehikeln wie Adenovirus-Vektoren stattfinden, die eine Codierungssequenz für ein Protein mit Apoptin-artiger Aktivität enthalten. Daher stellt die Erfindung Gentransportvehikel wie ein Apoptin exprimierendes Adenovirus bereit, bei dem es sich um ein sehr potentes Antitumoragens handelt. Die Adenovirus-Regulation von Apoptin induziert nicht oder zumindest nicht nachweislich eine Apoptose in normalen Zellen, was zeigt, dass die Toxizität der in vivo-Behandlung mit rekombinantem Apoptin-Adenovirus gering sein wird. Durch die Infektion mit rekombinantem Apoptin-Adenovirus kann eine viel höhere Menge an Apoptin-exprimierenden (Tumor)zellen erreicht werden. Dieser Befund stellt eine wichtige Verbesserung der Apoptin-Expression im Vergleich zu DNA-Transfektionen dar.
Die Erfindung betrifft außerdem die Konstruktion einer VP2-Expressionseinheit ohne Synthese von Apoptin und/oder einem Teil von Apoptin. Weiterhin haben wir den Nachweis erbracht, dass die Expression des Hühneranämie-Virus-(CAV)-Proteins VP2 die Apoptin-induzierte Apoptose in menschlichen Tumorzellen verstärkt. Um genauer zu sein wirken VP2 und Apoptin synergistisch bezüglich der Induktion einer Apoptose in Tumorzellen. Dieser Befund zeigt, dass die Koexpression von VP2 und Apoptin zu einer Verbesserung der Therapien auf Apoptinbasis führen wird.
Die Erfindung beschreibt eine signifikante Verbesserung der Apoptin-Expression, indem seine direkt flussaufwärts des ATG-Initiationscodons gelegenen Sequenzen verändert werden. Die Verbesserung des Expression erfordert keinen Aminosäure-Austausch im Apoptin-Protein, wie durch die KOZAK-Regel vorhergesagt wurde. Eine Verbesserung der flussaufwärts gelegenen Sequenzen des ATG-Initiationscodons der anderen CAV-Proteine wird ebenfalls zu einer Verbesserung ihrer Synthese führen.
Die Erfindung betrifft auch die Konstruktion retroviraler Vektoren, welche Apoptin in humanen Tumorzellen exprimieren, was zur Induktion der Apoptose führt. Dieses Ergebnis mit rekombinanten Apoptin-Retroviren in Kombination mit den Daten für das rekombinante Apoptin-Adenovirus zeigt, dass die Apoptin-Expression für die Replikation eines DNA- und RNA-Virus nicht toxisch ist.
Die Expression von Apoptin in (Tumor)zellen kann auch durch Infizieren von Zellen mit anderen DNA- und/oder RNA-viralen Vektoren, neben Adenovirus- oder Retrovirus-Vektoren, erfolgen, die eine Codierungssequenz für Apoptin enthalten. Außerdem können von Viren, wie etwa Plasmaviren, abgeleitete Vektorsysteme für die Induktion einer Apoptin-induzierten Apoptose in Tumorzellen eingesetzt werden.
Die Erfindung wird auf der Grundlage des folgenden experimentellen Teils ausführlicher erläutert werden. Dies dient lediglich dem Zwecke der Veranschaulichung und sollte nicht als eine Beschränkung des Schutzumfangs interpretiert werden.
EXPERIMENTELLER TEIL
Zellen und Zellkultur-Bedingungen.
Ad5 E1-transformierte humane embryonale Nieren-(HEK; 293) und humane embryonale Netzhaut-(HER; 911 und PER.C6)-Zelllinien wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) in einer 5% CO₂-Atmosphäre bei 37°C gezüchtet. Zelllinie 293 wurde von der American Type Culture Collection (ATCC CRL 1573) erhalten. Zelllinien 911 und PER.C6 wurden von Fallaux et al. (1996) erhalten. Zellkultur-Medien, Reagenzien und Seren wurden von GIBCO Laboratories (Grand Island, NY) erworben. Die Kulturkunststoffe wurden bezogen von Greiner (Nürtingen, Deutschland).
Humane epidermale Keratinozyten wurden aus Vorhaut isoliert und in Gegenwart einer Schicht von Mäuse-3T3-Fibroblasten gezüchtet, die mit 137-Ca letal bestrahlt wurden. Primärkulturen der Keratinozyten (FSK-1) wurden in komplettem Medium wie beschrieben (Rheinwald und Green, 1995) bei geringfügigen Modifikationen initiiert.
Tumorigene Keratinozyten, SCC-15-Zellen (Rheinwald und Beckett, 1981), die von Plattenepithelzellkarzinom stammten, wurden in DMEM/F12 (3:1)-Medium gezüchtet, das 5% fötales Kälberserum, 0,4 μg Hydrocortison und 1 μM Isoproterenol enthielt. Die humanen, von Hepatom stammenden HepG2-Zellen (Aden et al., 1979) und die humanen, von Osteosarkom stammenden U2OS und Saos-2-Zellen (Diller et al., 1990) wurden in DMEM (GIBCO/BRL), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, gezüchtet. Der spontan transformierte Keratinozyten-Stamm HaCaT (Boukamp et al., 1988) war ein Geschenk von Prof. Dr. R. Fusenig, DKFZ, Heidelberg, Deutschland. Die HaCaT-Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, gezüchtet.
Murine Zelllinien wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium mit hohem Glucosegehalt (4,5 Gramm pro Liter) und 10% fötalem Kälberserum in einer 5% CO₂-Atmosphäre bei 37°C kultiviert. Die ecotrope Verpackungszelllinie Psi-2 (Mann et al., 1983) und die amphotrope Verpackungszelllinie PA317 sind früher beschrieben worden (Miller, 1990a,b).
Virus-Techniken.
Plaque-Assays wurden durchgeführt, wie zuvor beschrieben (Fallaux et al., 1996). Kurz gesagt wurden Adenovirus-Stocks reihenweise in zwei 2 ml DMEM verdünnt, das 2 Pferdeserum enthielt, und nahezu zusammenfließenden 911-Zellen in 6-Well-Platten zugegeben. Nach 2-stündiger Inkubation bei 37°C wurde das Medium durch F-15-Minimum Essential Medium (MEM) ersetzt, das 0,85% Agarose (Sigma, USA), 20 mM HEPES (pH 7,4), 12,3 mM MgCl₂; 0,0025% L-Glutamin und 2% Pferdeserum (hitzeinaktiviert bei 56°C für 30 Minuten) enthielt.
Eine kleinmaßstäbliche Produktion von Adenovirus-Lots wurde wie zuvor beschrieben vorgenommen (Fallaux, et al., 1996). Kurz gesagt wurden nahezu zusammenfließende 911- oder PER.C6-Monoschichten mit etwa 5-Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro Zelle in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 1% Pferdeserum enthielt, infiziert. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde das Inokulum durch frisches Medium (DMEM/2% Pferdeserum) ersetzt. Nach 48 Stunden wurden die nahezu vollständig abgetrennten Zellen abgeerntet und in 1 ml PBS/1% Pferdeserum gesammelt. Das Virus wurde aus den Erzeugerzellen durch 3 Zyklen von Blitzgefrieren/Auftauen isoliert. Das Lysat wurde durch Zentrifugation bei 300 UpM für 10 Minuten geklärt und bei –20°C gelagert.
Die mit 911- und PER.C6 erzeugten rAdV-Stocks wurden auf das Vorhandensein von Rekombinanten-kompetentem Adenovirus gescreent, indem eine PCR-Analyse mit Primern unter Verwendung eines Perkin Elmer PCR-Geräts vorgenommen wurde, die aus der Ad5 ITR-Region (5_-GGGTGGAGTTTGTGACGIG-3_) und der EIA-codierenden Region (5_-TCGTGAAGGGTAGGTGGTTC-3_) stammten, wie von Noteborn und De Boer (1995) beschrieben. Das Vorhandensein eines amplifizierten 600-bp-Fragments zeigt, dass replikationskompetenter (die E1-Region enthaltender) Adenovirus im analysierten Virus-Stock (Hoeben, unveröffentlichte Ergebnisse) oder durch Infizieren von HepG2-Zellen mit rAdV-Chargen vorlag. Während eines Zeitraums von mindestens 10 Tagen wurden die Zellen auf potenzielle zytopathogene Wirkungen und durch indirekte Immunofluoreszenz unter Verwendung eines spezifischen monoklonalen Antiserums, das gegen EIA-Protein gerichtet war, überwacht.
Plasmide und DNA-Transfektionen.
Das Adaptor-Plasmid pMad5 wurde aus pMLP10 konstruiert (Levrerno et al. 1991), wie unten beschrieben. Plasmid-pMLP10-lin wurde von pMLP10 durch Insertion eines synthetischen DNA-Fragments mit einzelnen Stellen für die Restriktionsendonukleasen MluI, SplI, SanBI, Spl, AsuII und MunI in die HindIII-Stelle von pMLP10 abgeleitet. Das Adenovirus-BglII-Fragment, das nt 3328 bis 8914 des Ad5-Genoms umspannte, wurde in die MunIStelle von pMLP-lin inseriert. Aus dem resultierenden Plasmid wurde das SalI-BamHI-Fragment deletiert, um das Tetracyclin-Resistenzgen zu inaktivieren. Das resultierende Plasmid wurde durch Restriktionsenzym-Analyse kontrolliert und als pMad5 bezeichnet. Die Expression der in die multiplen Klonierstellen inserierten Gene wird durch den Adenovirus-Major-Late-Promotor gesteuert, welcher in dieser Konfiguration an den Adenovirus-Immediate-Early-Gen 1-(EI)-Enhancer geknüpft ist.
Alle CAV-DNA-Sequenzen sind ursprünglich vom Plasmid plc-20H/CAV-EcoRi abgeleitet (Noteborn und De Boer, 1996). Das Expressionsplasmid pCMV-fs, zuvor bezeichnet als pCMV-VP3, enthält CAV-DNA-Sequenzen, die ausschließlich Apoptin codieren (nt 427-868).
Das Plasmid pCMV-VP2mu enthält CAV-DNA-Sequenzen von Positionen 380 bis 1512. Dieses CAV-DNA-Fragment enthält die Codierungsregion für VP2, flankiert durch 25 bp 5'-nicht-codierende und 484 bp 3'-nicht-codierende CAV-DNA-Sequenzen. 106 bp flussabwärts des Startcodons für VP2 ist das Startcodon für Apoptin in einem anderen Leseraster situiert. Um die Synthese von Apoptin ohne Beeinträchtigung der VP2-Synthese zu verhindern, wurde eine Mutation im Apoptin-Initiationscodon (ATG wurde zu ACG ausgetauscht) eingeführt und außerdem eine Punktmutation an Position 549 (T wurde gegen ein A ausgetauscht), was ein zusätzliches Stoppcodon innerhalb des für Apoptin codierenden Gens ergab. Daher werden die inserierten CAV-Sequenzen lediglich VP2-Protein der vollen Länge exprimieren. Durch indirekte Immunofluoreszenz wurde gezeigt, dass VP2 erzeugt werden kann, doch kein Apoptin synthetisiert wurde.
Für das Klonieren von PCR-amplifzierten DNA-Fragmenten haben wir Plasmid-PCR-3.1 verwendet, welches kommerziell von InVitrogen (Carlsbad, CA) bezogen wurde. Für die Konstruktion eines replikationsdefekten rekombinanten Apoptin-Retrovirus wurde der Retrovirus-Vektor pLXSN verwendet (Miller, 1990a,b).
Alle Klonierschritte mit Plasmid-DNAs wurden im Prinzip gemäß den Methoden von Maniatis et al. (1992) durchgeführt.
Alle verwendeten Enzyme wurden kommerziell bezogen von Boehringer Mannheim, Deutschand und/oder BioLabs, USA.
Plasmid-DNA wurde durch Zentrifugation in einem CsCI-Gradienten und Säulenchromatographie in Sephacryl S500 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) gereinigt. Die humanen Zelllinien HaCAT, HepG2, SCC-15, 293, 911 und PER.C6 wurden mit Plasmid-DNA durch Calciumphosphat-Ausfällung transfiziert, wie beschrieben bei Graham und Van der Eb (1973). Normale humane diploide Keratinozyten (FSK-1; zweite Passage) U2OS- und Saos-2-Zellen wurden mit DOTAP transfiziert (Fischer et al., 1996).
Indirekter Immunofluoreszenz-Assay.
Die Zellen wurden mit 80% Aceton fixiert und für Immunofluoreszenz-Assays mit CAV-spezifischen oder Adenovirus-EIA-spezifischen monoklonalen Antikörpern und Ziege-Anti-Maus- und/oder Ziege-Anti-Kaninchen-IgC, konjugiert mit Fluoreszein (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove, PA) verwendet, wie beschrieben bei Noteborn et al. (1990). Nukleare DNA wurde mit 2,4-Diamino-2-phenylindol (DAPI) oder Propidiumiodid (PI) angefärbt.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Konstruktion des Adaptor-Vektors pMab
Zur Einführung einer BamHI-Restriktionsenzymstelle in das Adaptor-Plasmid pMAd5 wurde dieses mit dem Restriktionsenzym ClaI verdaut und mit alkalischer Kälberdarm-Phosphatase behandelt. Ein ClaI-BamHI-Linker wurde mit T4-Kinase behandelt und an sich selbst unter Verwendung einer T4-DNA-Ligase und durch anschließenden ClaI-Verdau ligiert. Der ClaI/BamHI/ClaI-Linker wurde isoliert und an den linearisierten pMadS-Vektor ligiert. Der Bakterienstamm JM109 wurde mit den Ligationsprodukten transformiert.
Durch Resktriktionsenzym-Verdaus wurde der fertiggestellte Vektor pMab charakterisiert. Mittels des pMab-Vektors können Fremdgene in die einzige BamHI-Stelle unter der Regulierung des Adenovirus-Major-Late-Promotors ligiert werden. Eine schematische Darstellung von pMad5 und pMab ist in 1 gezeigt.
Konstruktion eines rekombinanten Apoptin- und Kontroll-Adaptor-Vektors Zur Konstruktion eines Adaptor-Vektors zur Einführung des Apoptin-Gens in ein Adenovirus wurde pMab mit BamHI und anschließend mit Kälberdarm-Phosphatase behandelt. Anschließend wurde pCMV-fs mit BamHI behandelt, und ein 0,45 kb DNA-Fragment, das die Apoptin-codierenden Sequenzen enthielt, wurde isoliert. Das Apoptin-DNA-Fragment wurde in die BamHI-Stelle des linearisierten pMab-Adaptor-Vektors ligiert. Die Ligationsprodukte wurden in den Bakterienstamm JM109 kloniert. Die Orientierung des Apoptin in pMab wurde durch Restriktionsenzym-Analyse bestimmt.
Das pMab-Konstrukt, das das Apoptin-Gen in der 5'-3'-Orientierung unter det Regulierung des Adenovirus-Major-Late-Promotors enthält, wird das Apoptin-Gen exprimieren. Dieser Adaptor-Vektor wird als pMab-VP3 bezeichnet und wird zur Erzeugung eines Apoptin-exprimierenden Adenovirus-Vektors verwendet. Das pMab-DNA-Plasmid, das die Apoptin-codierenden Sequenzen in der 3'-5'-Orientierung flussabwärts des Adenovirus-Major Late-Promotors enthält, kann Apoptin nicht exprimieren und wird zur Herstellung eines rekombinanten Kontroll-Adenovirus-Vektors verwendet. Eine schematische Darstellung beider rekombinanter Adaptor-Vektoren ist in 2 gezeigt.
Induktion der Apoptose durch ein CMV-Plasmid gegenüber einem Apoptinexprimierenden rekombinanten Apoptin-Adaptor-Vektor.
Zunächst haben wir untersucht, ob der pMab-VP3-DNA-Vektor tatsächlich zum Exprimieren von Apoptin in transfizierten Zellen fähig ist, wohingegen dies bei pMab-con nicht möglich sein sollte. Zu diesem Zweck wurden humane Adenovirus-transformierte 293- und 911-Zellen mit pMab-VP3, pMab-con und als positiver Kontrolle mit pCMV-VP3 transfiziert. Etwa zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen fixiert und auf die Expression von Apoptin mittels eines indirekten Immunofluoreszenz-Assays untersucht. Die mit pCMV-VP3 und pMab-VP3 transfizierten Zellkulturen enthielten etwa 1 der Zellen, die mit einem Apoptin-spezifischen monoklonalen Antikörper reagierten, während dies bei mit pMab-con-DNA transfizierten Zellkulturen nicht der Fall war. Diese Ergebnisse legen nahe, dass pMab-VP3 Apoptin exprimiert, pMab-con dagegen nicht, wie zu erwarten war.
Bei einem anderen Transfektions-Experiment haben wir die Induktion der Apoptose in 911-Zellen nach Transfektion mit pMab-VP3 gegen pCMV-VP3 analysiert. Drei Tage nach der Transfektion wurden die 911-Zellen abgeerntet und mittels indirekter Immunofluoreszenz auf die Expression von Apoptin hin untersucht. Außerdem wurden die Zellen mit DAPI oder PI angefärbt, welche intakte DNA stark anfärben, apoptotische DNA dagegen schwach und/oder unregelmäßig (Telford, 1992).
Etwa 60% der Apoptin-positiven 911-Zellen, die mit pMab-VP3 transfiziert waren, waren apoptotisch, wohingegen etwa 40% der Apoptin-positiven Zellen, die mit pCMV-VP3 transfiziert waren, eine Apoptose vollzogen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die pMab-VP3-regulierte Expression von Apoptin zu einem ähnlichen oder etwas höheren Grad der Apoptose-Induktion führt als das durch pCMV-VP3 exprimierte Apoptin. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
Darüber hinaus ist Apoptin zum Induzieren einer Apoptose in humanen Adenovirustransformierten Zellen fähig und hemmt EIB eine durch Apoptin induzierte Apoptose nicht. Im Gegensatz dazu ist EIB zum Blockieren der Apoptose fähig, die durch eine große Vielzahl chemotherapeutischer Mittel induziert wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass Apoptin ein sehr wirksames Antitumormittel ist.
Konstruktion von rekombinantem Apoptin-Adenovirus
Rekombinante Apoptin-Adenovirus-Vektoren wurden durch Kotransfektion in die Helfer-Zelllinie 911 der Adaptor-Plasmide pMab-VP3, die die Codierungssequenzen für Apoptin plus einiger Adenovirus-Sequenzen tragen, und des Plasmids DNA-JM17, das die gesamte Adenovirus-DNA abzüglich der E1- und E3-Region enthielten, erzeugt (McGrory et al., 1988). Die Kotransfektionen wurden mit Calciumphosphat-ausgefällter DNA transformiert, wie beschrieben bei Graham und Van der Eb (1973). Die rekombinante Adenovirus-DNA wird durch homologe Rekombination zwischen den homologen Virussequenzen, die im Plasmid pMab-VP3 vorhanden sind, und der Adenovirus-DNA von JM17-DNA erzeugt.
In ähnlicher Weise wurden Kotransfektionen von 911-Zellen mit pMab-con und pJM17-DNA vorgenommen, um das rekombinante Kontroll-Adenovirus zu erzeugen, das Apoptin nicht exprimieren kann und das als Adenovirus-Kontrolle für die Apoptin-induzierten apoptotischen Wirkungen verwendet wird.
Mehrere Stunden nach der Transfektion wurden die 911-Zell-Monoschichten mit einem Agarose-Überzug bedeckt und bei 37°C inkubiert, bis rekombinante Adenovirusinduzierte Plaques eindeutig sichtbar wurden. Das Virus wurde aus den Plaques als PBS-Pferdeserum-Stocks abgeerntet, wie beschrieben bei Fallaux et al. (1996). Anschließend wurde ein Teil des rekombinanten Virus-Stock in eine 24-Well-Platte eingebracht, die frische 911-Zellen enthielt. Mehrere Tage später wurden diese infizierten 911-Zellen lysiert und die rekombinanten Viren abgeerntet.
Als nächstes wurde die Expression von Apoptin durch die potenziellen rekombinanten Apoptin- Adenoviren (rAd-VP3) oder die Abwesenheit der Expression durch rekombinante Kontroll-Adenoviren (rAd-con) untersucht. Ein Teil der rekombinanten Virus-Stocks, die von den infizierten 24-Well-Platten stammten, wurde zum Infizieren von frischen 911-Zellen verwendet, die als Monoschichten auf Deckglasstreifen gezüchtet wurden. Einen Tag später wurden die infizierten 911-Zellen mit Aceton fixiert und durch Immunofluoreszenz unter Verwendung des Apoptin-spezifischen monoklonalen Antikörpers 85.1 analysiert. Fünf von 5 analysierten 911-Zellkulturen, die mit mutmaßlichen rAd-VP3 infiziert waren, enthielten die das Apoptin exprimierenden Zellen. Keine der 911-Zellen, die mit Ad-con infiziert waren, und der nicht-infizierten 911-Zellen waren für Apoptin positiv.
Diese Ergebnisse besagen, dass auf die Kotransfektion von Adenovirus-Verpackungszelllinien, wie z.B. 911-Zellen, mit der erwünschten Adaptor- und Adenovirus-DNA lebensfähiges, Apoptin exprimierendes rAd-VP3 erzeugt werden kann.
Zwei von rAd-VP3- oder rAd-con-Plaques hergeleitete Stocks wurden zum Reinigen der rAds verwendet, indem drei anschließende Plaque-Reinigungen mit 911-Zellen, oder parallel dazu ein Limited-Dilution-Assay an PER.C6-Zellen, vorgenommen wurde, wie von Fallaux (1996) beschrieben.
Basierend auf den oben beschriebenen Methoden, die zur Erzeugung von Apoptin exprimierenden rAd-VP3 unter der Regulierung des Adenovirus-Major-Late-Promotors führen, waren wir auch mit einen Apoptin exprimierenden Adenovirus-Vektor unter der Kontrolle eines Cytomegalovirus-(CMV)-Promotors erfolgreich. Diese Ergebnisse zeigen, dass verschiedene Typen von rekombinanten Adenoviren erzeugt werden können, reguliert durch eines seiner eigenen oder heterologe Promotor-Elemente.
Produktion von rAd-VP3 und rAd-con unter Verwendung von PER.C6-Zellen
Eine kleinmaßstäbliche Produktion von rAd-VP3- und rAd-con-Lots unter Verwendung von PER.C6-Zellen wurde wie beschrieben vorgenommen (Fallaux, 1996). Dieses Verfahren ist im experimentellen Abschnitt kurz beschrieben.
Mittels Plaque-Assay wurden die Titer als etwa 10^11-12 pro ml geklärtes Lysat sowohl für rAd-VP3 als auch rAd-con bestimmt. Die erhaltenen Titer sind nicht geringer, als in unserem Labor für andere rAd's beobachtet.
Mittels der PCR-Analyse und der Infektion von HepG2 mit rAd-VP3 und rAd-con wurde untersucht, ob die erzeugten Viruschargen replikationskompetenten Adenovirus enthielten (siehe auch Experimenteller Abschnitt). Sowohl die rAd-VP3- als auch rAd-con-Chargen waren frei von RCA, wie mittels beider Methoden nachgewiesen.
Wir folgern, dass die Expression von Apoptin alle erforderlichen Schritte des Adenovirus-Lebenszyklus unter Zellkultur-Bedingungen nicht negativ beeinflusst. Daher ist eine Gentherapie auf der Grundlage eines Apoptin exprimierenden Adenovirus-Vektors möglich.
Aufgrund der Expression der anti-apoptotischen Ad5-E1-Proteine (White, 1996) induziert Apoptin die Apoptose optimal, nachdem der rekombinante Apoptin-Adenovirus in hohem Mengen erzeugt worden ist. Die Tatsache, dass ein Apoptin-exprimierender Adenovirus-Vektor in menschlichen Zellen erzeugt werden kann, die mit Adenovirus Typ 5-(Ad 5)-EI-Proteinen transformiert worden sind, wie etwa 293-, 911- und PERC6-Zellen, zeigt, dass das E1-Protein diesen DNA-Virus zum Replizieren zu hohen Titern in Gegenwart des Apoptose-induzierenden Proteins Apoptin befähigt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Erzeugung anderer rekombinanter DNA-Virus-Vektoren, die Apoptin in Zelllinien exprimieren, die durch das Adenovirus 5 E1-Protein transformiert wurden, ebenfalls möglich ist. Zum Beispiel können die rekombinanten Parvovirus-Vektoren auf der Basis von H-1- oder MVM-Parvoviren in 293T-Zellen vermehrt werden, die durch Ad5-E1-Protein transformiert sind (Dinsart, et al., 1996).
Die H-1- und MVM-Parvoviren induzieren in transformierten Zellen spezifisch den Zelltod, jedoch nicht in allen (Lopez-Guerrero, 1997). Apoptin exprimierende Parvovirus-Vektoren werden beim Induzieren einer Tumor-spezifischen Apoptose wirksamer sein als ein Parvovirus als solches, was an der zusätzlichen Tumor-spezifischen Induktion einer Apoptose durch Apoptin liegt (Dinsart et al., 1996; Danen-Van Oorschot, 1997).
Ein Protokoll der Produktion von rekombinanten Apoptin-Virus-Vektoren auf der Grundlage von Ad5-E1-Protein-transformierten Zellen trifft auch für RNA-Virus-Spezies, z.B. Retroviren, zu.
Induktion von Apoptose in humanen transformierten und/oder malignen Zelllinien
Wir haben untersucht, ob eine Infektion von humanen Tumorzellen mit rAd-VP3 zu einer Apoptin-induzierten Apoptose führt. Zu diesem Zweck wurden humane Hepatom-HepG2, Osteosarkom-U2OS-Zellen, SCC-15-Zellen, die von einem Plattenepithelzellkarzinom stammten, und Zellen von der spontan transformierten Keratinozyten-Zelllinie HaCaT mit rAd-VP3 infiziert. Einen Tag nach der Transfektion wurden die Zellen fixiert, und die Zellen wurden mittels Immunofluoreszenz und DAPI-Anfärbung auf die Apoptin-Synthese und auf das Erfolgen der Apoptose hin untersucht. Bereits einen Tag nach der Infektion waren fast alle analysierten Apoptin-positiven humanen Tumorzellen apoptotisch. Bei nicht-infizierten Kulturen waren lediglich wenige Prozent der humanen Tumorzellen apoptotisch. Die Ergebnisse für HepG2- und U2OS-Zellen sind in 4 gezeigt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass rAd-VP3-exprimiertes Apoptin eine Apoptose in verschiedenen tumorigenen und/oder transformierten Säuger-Zelllinien induzieren kann.
Expression von Apoptin in normalen, mit rAd-VP3 infizierten Zellen
Um die Wirkung von Apoptin, das durch rAd-VP3 in infizierten normalen nichttransformierten Zellen exprimiert wurde, zu analysieren, wurden FSK-1-Zellen mit rAd-VP3 infiziert. Vier Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mittels indirekter Immunofluoreszenz unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 85.1 und durch DAPI-Anfärbung analysiert. Maximal 8% der Apoptin-positiven Zellen zeigten eine DAPI-abnormale Färbung, was darauf hinwies, dass sie möglicherweise eine (Apoptin)-induzierte Apoptose vollzogen. Allerdings wiesen 7% der Zellen, die nicht infiziert waren, außerdem ein abweichendes DAPI-gefärbtes DNA-Muster auf. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
Aufgrund der hepatotropen Natur von humanem Ad5 nach der systemischen Verabreichung ist es auch von Wichtigkeit, die Wirkung von Apoptin in normalen diploiden Hepatozyten zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden isolierte Ratten-Hepatozyten in Williams E-Medium gezüchtet (Gibco/Life Technologies, Grand Island, NY, USA), ergänzt mit Insulin (2 mE/ml) und Dexamethason (1 nM). Die Zellen wurden auf Collagenbeschichteten Kulturträgern gezüchtet (Micronic).
Die primären Ratten-Hepatozyten wurden durch den Apoptin exprimierenden Adenovirus-Vektor Ad5-VP3, einen LacZ exprimierenden Kontroll-Adenovirus oder Scheininfiziert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen fixiert und mittels Immunofluoreszenz und DAPI-Anfärbung der Prozentsatz an apoptotischen Zellen untersucht. Kein Unterschied wurde hinsichtlich des Anteils an toten Zellen der entweder Apoptin-exprimierenden, der lacZ- oder Schein-infizierten Zellen beobachtet. Diese Beobachtungen zeigen, dass (Ratten)-Hepatozyten keine Apoptin-induzierte Apoptose vollzogen, auch dann nicht, wenn Apoptin mittels eines Adenovirus-Vektors synthetisiert wird.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die rAd-VP3-gesteuerte Expression von Apoptin zu keiner Apoptin-induzierten Apoptose in normalen nicht-transformierten Humanzellen, im Gegensatz zu transformierten/tumorigenen Humanzellen, führt.
Erhöhung der Synthese von Apoptin
Um die Wirkung der direkten Sequenzen vor dem Apoptin-ATG-Initiationscodon zu untersuchen, haben wir zwei pCR-3,1-Apoptin-Konstrukte hergestellt. pCR-VP3ori enthält die ursprüngliche direkt flussaufwärts gelegenen Sequenzen (5_-TTTCAA-3_) des ATG-Codons, wohingegen das andere, pCR-Vp3mu, die direkt flussaufwärts gelegene Sequenz 5_-GCCAAC-3_ enthält. Mittels eines In-vitro-Transkriptions/Translations-Weizenkeim-Assays wurde bestimmt, dass die Apoptin-Expression von pCR-VP3mu mindestens fünfmal höher war als für pCR-VP3ori beobachtet. Diese Daten zeigen, dass die Natur der direkt flussaufwärts gelegenen Sequenzen des Apoptin-ATG die Synthese von Apoptin beeinflusst. Die Konstruktion von (viralen) Vektoren mit der direkt flussaufwärts gelegenen Sequenz 5_-GCCAAC-3_ vor dem ATG-Codon von Apoptin wird zu einer höheren Apoptin-Produktion und indirekt zu einer erhöhten Apoptininduzierten Apoptose führen.
Wichtig zu erwähnen ist auch, dass die Aminosäuresequenz von Apoptin nicht verändert ist, wie als für erhöhte Translationsleistungen gemäß der "Kozak-Regel" erforderlich vorhergesagt (Caventer und Stuart, 1991). Gemäß dieser Regel hätten wir das Nukleotid an Position +4 von einem A zu einem G austauschen sollen, was zu einer unterschiedlichen zweiten Aminosäure von Apoptin führt, was seine Aktivität verändert hätte.
Identifikation eines wesentlichen Apoptin-Fragments, das eine apoptotische Aktivität aufweist
Um zu untersuchen, ob ein Teil des Apoptin-Proteins für seine apoptotische Aktivität wesentlich ist, wurde ein Plasmid konstruiert, das für chimäre Proteine codiert, welches aus dem Grün-Fluoreszenz-Protein (GFP; Rizzuto, 1995) und den N-terminalen 71 Aminosäuren von Apoptin (N-Apoptin) oder seinen C-terminalen 50 Aminosäuren (C-Apoptin) besteht. Humane transformierte Zellen, wie etwa Saos-2-Zellen (Zhuang, 1995) wurden mit den Plasmiden transient transfiziert, die chimäres GFP/N-Apoptin oder GFP/C-Apoptin exprimieren. Lediglich die Saos-2-Zellen, die das GFP/C-Apoptin exprimieren, vollzogen eine Apoptin-spezifische Apoptose. Dies stimmt mit der Tatsache überein, dass C-Apoptin (geknüpft an GFP) in den Kern eindringen kann.
Diese Ergebnisse zeigen, dass auch ein Teil des Apoptins ausreichen kann, um eine Apoptose in (humanen) tumorigenen/transformierten Zellen zu induzieren. Daher kann auch eine wirksame (Gen)therapie auf der Grundlage von (Virus)-Vektoren entwickelt werden, die lediglich jenen Teil des Apoptins exprimieren. Außerdem zeigen diese Daten, dass ein Teil des Apoptins seine apoptotitsche Aktivität enthält, wenn an ein Fremdprotein kovalent geknüpft.
Koexpression von VP2 und Apoptin in humanen Tumorzellen erhöht die Induktion der Apoptosis synergistisch
Um die Wirkung einer Koexpression von VP2 und Apoptin auf die Induktion der Apoptose zu untersuchen, wurden Saos-2-Zellen mit pCMV-fs, das Apoptin exprimiert, und/oder pCMV-VP2mu, das VP2 exprimiert, (ko)transfiziert. Die Zellen wurden mit Aceton in verschiedenen Zeitabständen nach der Transfektion fixiert. Durch indirekte Immunofluoreszenz wurden die VP2-positiven Zellen mit monoklonalem Antikörper CVI-CAV-111.1 (Noteborn und Koch, 1996) und die Apoptin-positiven Zellen mit monoklonalem Antikörper CVI-CAV-85.1 bestimmt. Am Tag 3 nach der Transfektion vollzogen lediglich 3% der VP2-exprimierenden Zellen, und lediglich etwa 10% der Apoptinexprimierenden Zellen, die Apoptose. Im Gegensatz dazu waren bereits etwa 40% der Saos-2-Zellen, die sowohl VP2 als auch Apoptin exprimierten, bereits apoptotisch. Außerdem war 4 Tage nach Transfektion der Prozentsatz an VP2/Apoptin-positiven Zellen, die eine Apoptose vollzogen, signifikant höher als bei Zellen, die Apoptin oder VP2 alleine exprimierten.
Diese Ergebnisse zeigen, dass VP2 die Apoptin-induzierte Apoptose erhöht, was in 5 gezeigt ist.
Konstruktion und Produktion von rAD-VP2
Um einen rekombinanten Adenovirus zu konstruieren, der das virale Protein 2 (VP2) des Hühneranämie-Virus exprimierte, wurde das Adaptor-Plasmid pMAb-VP2 herge stellt. Ein 1.1-kb-BamHI-Fragment wurde aus dem Plasmid pCMV-VP2mu isoliert, das alle VP2-codierenden Sequenzen enthielt, doch 2 Punktmutationen innerhalb der Apoptin-codierenden Region aufwies (siehe Experimenteller Abschnitt), und in den BamHilinearisierten und alkalische Kälberdarm-Phosphatase-behandelten Adaptor-Vektor pMAb ligiert. Das fertiggestellte Konstrukt pMAb-VP2 wurde durch Restriktionsenzym- und Sequenz-Analyse charakterisiert und ist in 6 gezeigt.
Durch Kotransfektion von 911-Zellen mit pMab-VP2-DNA und pJM17-DNA wurde rAD-VP2 hergestellt. Die Kotransfektion und alle anderen erforderlichen Schritte für die Charakterisierung, Reinigung und Herstellung von rAd-VP2 wurden durchgeführt, wie beschrieben für rAd-VP3 und rAd-con. Durch indirekte Immunofluoreszenz unter Verwendung von monoklonalem Antikörper CVI-CAV-111.1 wurde gezeigt, das 911- und PER.C6-Zellen, die mit rAd-VP2 infiziert waren, tatsächlich das VP2-Protein exprimieren konnten.
Konstruktion eines Apoptin-exgrimierenden Retrovirus-Vektor
Zur Erzeugung des Plasmids pL-VP3-SN (siehe 7) wurde ein BamHI-Fragment, das die Apoptin-codierenden Sequenzen trug, in die einzige BamHI-Stelle von pLXSN inseriert. Mit Restriktionsenzym-Analyse wurde die korrekte Orientierung des Inserts bestätigt. Um die Unversehrtheit des Inserts zu testen, wurde das Plasmid pL-VP3-SN mit der Calciumphosphat-Kopräzipitationstechnik in COS-7- und HepG2-Zellen transfiziert. Vier Tage nach der Transfektion wurden die Zellen fixiert und mit monoklonalem Antikörper 85.1 auf die Expression des Apoptin-Proteins analysiert. Bei etwa 1 – 2 der Zellen konnte die Apoptin-Expression nachgewiesen werden. Die Mehrzahl der Zellen vollzog die Apoptose, wie durch DAPI-Anfärbung bestätigt. Diese Daten zeigen, dass der provirale LTR-Promotor zum Steuern der Expression des Apoptin-Proteins fähig ist, dass sein Gen im DNA-Konstrukt intakt ist und dass in transfizierten HepG2- und COS-7-Zellen die Expression des Apoptins die Apoptose induziert.
Um Viren zu erzeugen, wurde das Plasmid pL-VP3-SN in Psi-2-Zellen und in PA 317-Zellen mit der Calciumphosphat-Kopräzipitationstechnik transfiziert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurde der Überstand der Zellen abgeerntet und Verdünnungen zum Infizieren der HepG2-Zellen (dem PA317-Überstand) und NIH3T3- Zellen (der Psi-2-Überstand) in Gegenwart von 4 μg/ml Polybren verwendet. Vier Tage nach der Infektion wurden die Zellen fixiert und auf die Apoptin-Expression durch Anfärben mit dem monoklonalen Antikörper 85.1 analysiert. Etwa 1% der Zellen zeigte die Expression von Apoptin. Die Mehrzahl der Apoptin-positiven HepG2-Zellen war apoptotisch. Diese Daten zeigen, dass die Zellen mit den L-Apoptin-SN-Retroviren transduziert worden waren. Außerdem zeigen sie, dass eine einzelne Kopie des Provirus ausreicht, um ausreichende Mengen des durch Immunofluoreszenz nachzuweisenden Apoptin-Proteins zu exprimieren, und dass diese Menge ausreicht, um die Apoptose in einer humanen Tumorzelllinie, nämlich der Hepatom-Zelllinie HepG2, zu induzieren.
Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass Retrovirus-Vektoren, die das Apoptin-Gen tragen, erzeugt werden können und zum Induzieren der Apoptose in humanen Tumorzellen verwendet werden können. Sie beweisen formal, dass weder das Apoptin-Gen noch seine Expression die wesentlichen Schritte im Retrovirus-Lebenszyklus beeinflussen. Sie zeigen auch, dass Apoptin-enthaltende Retroviren chargenweise in ausreichenden Mengen hergestellt werden können, um zum Transduzieren von humanen Tumorzellen in Gewebekultur verwendet werden zu können.
Diese Ergebnisse legen ferner nahe, dass die Apoptin-Expression, und folglich die Apoptin-induzierte Apoptose in (humanen) Tumorzellen auch mittels von (Retro)-Viren abgeleiteten Vektorsystemen, wie etwa den Plasmaviren, möglich ist (Noguiez-Hellin, 1996). Der entscheidende Punkt für ein rekombinantes Apoptin-Plasmavirussystem ist, dass die Retrovirus-Replikation nicht durch die Expression von Apoptin blockiert ist. Wir haben den Nachweis erbracht, dass dies für den oben beschriebenen rekombinanten Apoptin- Retrovirus tatsächlich nicht der Fall ist, was die erfolgreiche Produktion von rekombinantem Apoptin-Plasmavirus impliziert.
Diagnostischer Assay für Krebszellen auf der Basis von rAD-VP3
Die zelluläre Lokalisation von Apoptin ist in tumorigenen/transformierten Humanzellen verschieden von der in normalen nicht-transformierten Zellen. Außerdem stellt ein weiterer Marker die spezifische Fähigkeit von Apoptin zum Induzieren der Apoptose in tumorigenen/transformierten Zellen und nicht in normalen Zellen dar.
Durch Infizieren von Zellen mit rAd-VP3 und Analysieren der Apoptin-Lokalisation und/oder Induktion der Apoptose innerhalb dieser Zellen ist der Nachweis möglich, ob eine Zelle bösartig ist oder nicht. Primärzellen werden aus (verdächtigtem) Gewebe isoliert und im erforderlichen Medium kultiviert. Die Zellen werden mit rAd-VP3 und parallel dazu mit rAd-con infiziert und anschließend analysiert, beispielsweise unter Verwendung eines Immunofluoreszenz-Assays auf der Grundlage eines für Apoptin spezifischen monoklonalen Antikörpers, 85.1. Die Zellen werden darauf geprüft, ob sie Apoptin im Zytoplasma (normale Zellen) oder im Kern (transformierte Zellen) aufweisen. Zusätzlich oder statt dessen wird der Prozentsatz an apoptotischen Zellen bestimmt. Ist der Prozentsatz an apoptotischen Zellen signifikant höher für rAd-VP3- als für rAd-coninfizierte Zellen, so sind diese Zellen bösartig geworden.
Toxizitäts-Experimente mit rekombinantem Apoptin- Adenovirus in gesunden Ratten.
Unter Gewebekultur-Bedingungen induziert Apoptin, das durch den rekombinanten Adenovirus rAd-VP3 in normalen Zellen exprimiert wird, die z.B. von menschlichem oder murinem Ursprung sind, die Apoptose nicht. Im unten beschriebenen Experiment haben wir untersucht, ob die Expression von Apoptin mittels des rekombinanten Adenovirus-Vektors rAd-VP3 in gesunden Ratten nicht zu einer akuten Toxizität führt.
Der verwendete rAd-VP3-Vektor und ein Kontroll-rAd-Vektor wurden beide auf PER.C6-Zellen gezüchtet und durch PCR-Analyse der Nachweis geführt, dass sie für replikationskompetenten Adenovirus negativ sind (RCA-frei). Die rAd's wurden mittels CsCI-Gradienten-Zentrifugation gereinigt.
Männliche Wag/Rij-Ratten (Harlan, Niederlande) mit einem Körpergewicht von 200 Gramm wurde Apoptin-exprimierender rekombinanter Adenovirus (rAd-VP3; 2,5 × 10⁹ Plaque-bildende Einheiten, PFU), rekombinanter Kontroll-Adenovirus, das das Genprodukt Luciferase exprimierte (raD-luc; 2,5 × 10⁹), injiziert. Beide Adenovirus-Vektoren wurden in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, und 10% Glycerol (PBS+) resuspendiert. Diese Lösung ohne Adenovirus-Vektor wurde ebenfalls in Ratten injiziert und dient als zusätzlicher negativer Kontrolle. Zwei Ratten wurde intravenös, intraperitoneal oder subkutan entweder rAd-VP3, rAd-luc oder PBS+-Suspension injiziert.
Makroskopische pathologische Analyse von Ad-VP3-behandelten Ratten.
Die erste Methode zur Untersuchung einer möglichen toxischen Wirkung von Ad-VP3-exprimiertem Apoptin bestand in der Bestimmung des allgemeinen Gesundheitszustands und insbesondere des Körpergewichts der behandelten Ratten, was an jedem Tag im Anschluss an die Injektionen erfolgte. Alle Ratten waren in guter gesundheitlicher Verfassung während des Experiments. Das Körpergewicht war nicht signifikant verschieden in den verschiedenen Gruppen. Nach einer Woche hatten alle untersuchten Ratten, einschließlich jener, denen rAd-VP3 injiziert worden waren, an Körpergewicht zugenommen, was zeigt, dass keines der Tiere an akuter Toxizität aufgrund einer der Behandlungen mit rAd-VP3 litt. Um weiter die Abwesenheit einer akuten Toxizität festzustellen, wurden die folgenden Bestimmungen vorgenommen. Zwei Stunden vor der Opferung wurde allen Ratten BrdU injiziert. Nach der Opferung wurden verschiedene Gewebe (Leber, Niere, Darm, Herz, Lunge, Milz, Keimdrüsen und Penis) pathologisch direkt untersucht und/oder zur weiteren histopathologischen Analyse aufbewahrt (siehe unten). Die makroskopische Analyse zeigte, dass keine der Ad-VP3-behandelten Ratten Organe mit signifikanten pathologischen Wirkungen besaß.
Bestimmung der Ad-VP3-DNA in der Leber.
Das Hauptziel des intravenös injizierten (rekombinanten) Adenovirus-(Vektors) ist die Leber und in gewissem Umfang die Milz. Daher werden jegliche toxische Wirkungen von Apoptin in der Leber beobachtet.
Ein Panel von Experimenten wurde durchgeführt, um das Vorhandensein von Ad-VP3-DNA, die Apoptin-Expression durch Ad-VP3 und eine mögliche zytopathologische Wirkung in der Leber zu untersuchen.
Zunächst haben wir mittels Southern-Blot-Analyse untersucht, ob isolierte DNA aus Lebern von Ad-VP3-behandelten Ratten die Apoptin-DNA am Tag nach der Opferung enthielt, was also 8 Tage nach der Injektion bedeutet. Als negativer Kontrollen wurde die DNA aus den Lebern von Ad-luc-behandelten Ratten parallel untersucht. Vor Auf bringen der isolierten DNA auf ein Agarosegel wurde die DNA mit BamHI verdaut, was ein Apoptin-DNA-Fragment von etwa 0,5 kbp ergibt. Der Southern-Blot wurde mit einer ³²P-markierten Apoptin-DNA-Sonde hybridisiert.
Das Apoptin-BamHI-DNA-Fragment war auf den Southern-Blot im Falle einer von den Ad-VP3-behandelten Tieren stammenden DNA eindeutig sichtbar, und war wie erwartet in den Bahnen abwesend, die aus Lebern von Ratten isolierte DNA enthielten, die mit dem Kontroll-rAd-luc behandelt worden waren. Um die Menge an Ad-VP3-Kopien in der Leber zu untersuchen, wurden verschiedene Mengen an Apoptin-DNA parallel auf den Southern-Blot aufgebracht und mit der markierten Apoptin-DNA-Sonde hybridisiert. Selbst acht Tage nach intravenöser Infektion konnten 0,25 Ad-VP3-Kopien pro Zelle bestimmt werden, was eine sehr signifikante Transduktion von Ad-VP3 in der Leber zeigt.
Expression von Apoptin und seine toxische Wirkung in Leberzellen.
Durch Immunanfärbung von Paraffin-Sektionen von Lebern, die mit Ad-VP3 behandelt waren, oder Kontroll-Lebern unter Verwendung der Apoptin-spezifischen monoklonalen Antikörper CVI-CAB-85.1 oder CVI-CAV-111.3 haben wir gezeigt, dass etwa 20–30% der Leberzellen der Ad-VP3-behandelten Tiere Apoptin exprimiert hatten. Die Lebersektionen der Kontrollratten waren für Apoptin negativ.
Um die möglichen zytotoxischen Wirkungen von Ad-VP3-exprimiertem Apoptin auf Leberzellen zu untersuchen, wurden zwei verschiedene Methoden angewendet. Zunächst wurden die Lebersektionen aller Ad-VP3-behandelten Ratten und solche beider Arten von Kontrolltieren mit Hämatoxylin-Eosin (HE) angefärbt. Bei allen untersuchten Lebersektionen konnten keine morphologischen pathologischen Veränderungen beobachtet werden, was zeigt, dass die Apoptin-Expression für Rattenleberzellen nicht toxisch ist.
Schädigende Wirkungen können mittels BrdU-Markierung erkannt werden, die neu geteilte Leberzellen nachweist. Im Fall von Ad-VP3-enthaltender Leber war die Menge der BrdU-markierten Leberzellen eine ähnliche (etwa 2%) wie bei Kontroll-Ad-luc-behandelten Rattenlebern. Daher hat die Apoptin-Expression als solche keine signifikante toxische Wirkung in vivo.
Apoptin zeigt keine akute toxische Wirkung in einem in vivo-Modell.
Sowohl die makroskopische als auch die histologische Analyse in Kombination mit biochemischen und immunologischen Daten ergaben, dass die Expression von Apoptin keine (akute) toxische Wirkung in einem in vivo-Modell zeigt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Therapie auf der Grundlage der Expression von Apoptin unter Verwendung eines Gentransportvehikels oder durch andere Methoden begrenzte negative Nebenwirkungen ergeben wird.
Antitumor-Studien in einem humanen Hepatom-Modell.
Die Ad-VP3-regulierte Expression von Apoptin führt zur Induktion von Apoptose in humanen transformierten Zellen unter Gewebekultur-Bedingungen. Zum Beispiel führt die Ad-VP3-gesteuerte Apoptin-Expression zur Induktion der Apoptose in humanen, von Hepatom stammenden Zellen HepG2. Bis dahin wurde keine Antitumor-Aktivität von Apoptin (z.B. exprimiert durch Ad-VP3) in vivo untersucht.
Daher haben wir bestimmt, ob eine Ad-VP3-regulierte Apoptin-Expression zu einer Antitumor-Aktivität in einem in vivo-Modell führen wird. Zu diesem Zweck wurde männlichen Balb/C/nu/nu-Nacktmäuse subkutan 1 × 10⁶ humane HepG2-Zellen pro Seite injiziert. Zumindest an zwei oder drei Lokalisationen pro Maus wurden humane Hepatomzellen injiziert. Drei Wochen nach der Injektion hatten sich klare Hepatomtumoren entwickelt, waren subkutan sichtbar und wiesen eine mittlere Größe von mindestens 5 × 5 mm auf.
Die rAd-VP3- und Kontroll-rAd-con1-Vektoren wurden, suspendiert in Phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 5% Sucrose und 0,1% Rinderserumalbumin, intratumoral injiziert.
Der verwendete rAd-VP3-Vektor, der Apoptin exprimiert, und der Kontroll-rAd-con1-Vektor, der das Apoptin-Gen in der 3'-5'-(revers oder Antisense)-Orientierung entgegengesetzt zum Ad MLP-Promotor enthielt, wurden beide auf PER.C6-Zellen gezüchtet. Beide Chargen der rekombinanten Adenoviren erwiesen sich mittels einer PCR- Analyse als RCA-frei. Die rAd's wurden unter Anwendung der CsCI-Gradienten-Zentrifugation gereinigt.
Pro Tumor wurden 7 × 10⁹ PFU rAd-Partikel in 40 Mikroliter Suspension injiziert. Pro Typ des rAd-Vektors wurden 6 Mäuse mit 2 bis 3 HepG2-Tumoren behandelt. Als zusätzlicher Kontrolle wurde einer Gruppe von 4 Nacktmäusen, die HepG2-Tumoren aufwiesen, intratumoral Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, die 5% Sucrose und 0,1 Rinderserumalbumin (PBS+-Gruppe) enthielt, injiziert.
Apoptin weist eine Antitumorwirkung in einem in vivo-Modell auf.
Um die mögliche Antitumorwirkung von Ad-VP3-exprimiertem Apoptin in humanen HepG2-Tumoren zu untersuchen, wurde die Größe der subkutanen Tumoren während des Experiments gemessen, das bis 7 Tage nach Injektion des rAd-VP3 und der Kontrollsuspensionen fortgeführt wurde.
Sowohl die PBS+-Gruppe als auch die mit Kontroll-rAdcon1 behandelte Gruppe zeigte einen mittleren progressiven Anstieg der HepG2-Tumorgröße, was im Kontrast zu der Gruppe stand, die intratumoral mit rAdVP3 behandelt worden war, welche eine verminderte Tumorgröße zeigte. Sieben Tage nach der Injektion wurden die Nacktmäuse geopfert. Die Tumoren wurden isoliert und makroskopisch untersucht. Es ist klar, dass die mit dem Kontroll-rAd-con1-Vektor oder PBS+ behandelten Hepatomtumoren sich als stark vaskularisiertes HepG2-Tumorgewebe erwiesen und nach der Behandlung größer geworden waren. Ein völlig verschiedenes Muster wurde mit den rAd-VP3-behandelten HepG2-Tumoren beobachtet. Die restliche Tumormasse hatte ein blasses Aussehen aufgrund einer verminderten Tumorvaskularisation. Die Tumoren waren nach Behandlung mit rAd-VP3 in ihrer Größe vermindert. Die Tumoren enthielten außerdem weiße blasenartige Strukturen, was auf tote Zellen hinweist.
Neben der Apoptin-inudzierten Tumorregression konnte keine negative Wirkung der Apoptin-Expression auf die Organe (insbesondere wurden Leber und Milz untersucht) beobachtet werden.
Apoptin weist eine Antitumor-Aktivität in einem in vivo-System auf.
Folglich zeigten mit rAd-VP3 behandelte Tumoren eine reduzierte Tumorgröße, die Kontrollen dagegen nicht. Dies impliziert, dass die Expression von Apoptin eine Antitumor-Aktivität in einem in vivo-Modell erbringt.
Die Tatsache, dass Ad-VP3-exprimiertes Apoptin eine Tumorregression in einem schnell wachsenden Tumor wie HepG2 induzieren kann, beweist das starke Antitumor-Potenzial von Apoptin. Die Tatsache, dass Apoptin das Tumorwachstum in Nacktmäusen vermindert, zeigt, dass alleine die Expression von Apoptin die Tumorzellen ohne eine zusätzliche Immunreaktion "abtötet".
Die beschriebenen Toxizitäts- und Antitumor-Studien zeigen, dass eine Antitumor-Therapie auf der Grundlage der Expression von Apoptin sicher und wirksam ist.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt eine diagrammatische Darstellung der wesentlichen Teile der Adenovirus-Adaptor-Vektoren pMAd5 und pMab.
2 zeigt die diagrammatische Darstellung der wesentlichen Teile der rekombinanten Adenovirus-Adaptor-Vektoren pMab-VP3 und pMab-con.
3 zeigt die Apoptin-induzierte Apoptose-Aktivität in mit pMAb-VP3 oder pCMV-VP3 transfizierten 911-Zellen. Zwei unabhängig klonierte und gereinigte pMab-VP3-DNA-Chargen (pMab-VP3/ml und pMab-VP3-m2) wurden für die Transfizierung von 911-Zellen verwendet. Die Zellen wurden 3 Tage nach der Transfektion fixiert und mittels indirekter Immunofluoreszenz unter Verwendung des Apoptin-spezifischen monoklonalen Antikörpers CVI-CAV-85.1 analysiert (85.1; Noteborn et al., 1991). Der Prozentsatz an Zellen, der sich mit DAPI abnormal anfärbte, ist als ein relatives Maß für die Apoptose angegeben.
4 zeigt die Apoptin-(bezeichnet als VP3)-induzierte Aktivität von humanen tumorigenen Hepatom-HepG2-Zellen, Osteosarkom-U2OS-Zellen und normalen nichttransformierten diploiden FSK-1-Keratinozyten, die mit dem replikationsdefekten rekombinantem Apoptin-Adenovirus Ad-VP3 infiziert worden waren. Die Zellen wurden mittels indirekter Immunofluoreszenz unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 85.1 analysiert und mit DAPI angefärbt. Die HepG2- und U2OS-Zellen wurden 1 Tag nach der Transfektion fixiert und die FSK-1-Zellen abgeerntet und 4 Tage nach der Transfektion fixiert. Der Prozentsatz an Apoptin-positiven Zellen, die sich mit DAPI abnormal färbten, ist als ein Maß für die Apoptin-induzierte Apoptose angegeben (schwarze Kästchen). Als Kontrolle ist der Prozentsatz an nicht-infizierten Zellen, die durch DAPI abnormal angefärbt wurden, angegeben (gestrichelte Kästchen).
5 zeigt die Apoptin- und/oder VP-2-induzierte Apoptose-Aktivität in Saos-2-Zellen, die mit 2,5 μg pCMV-fs-DNA, die Apoptin exprimiert (früher bezeichnet als pCMV-VP3; Apoptin ist als VP3 bezeichnet) und 2,5 μg pCMV-neoBam-DNA (Danen-Van Oorschot, 1997) oder mit 2,5 μg pCMV-VP2-DNA, die das CAV-Protein 2 (VP2) exprimiert, und 2,5 μg pCMV-neoBam-DNA; oder mit 2,5 μg pCMV-fs und 2,5 μg pCMV-VP2 transfiziert worden waren, was zur Expression sowohl von Apoptin (VP3) als auch VP2 führte. Die Zellen wurden 3, 4 und 5 Tage nach Transfektion fixiert und mittels indirekter Immunofluoreszenz unter Verwendung des Apoptin-spezifischen monoklonalen Antikörpers CVI-CAV-85.1 (85.1; Noteborn et al., 1991) oder mit monoklonalem Antikörper CVI-CAV-111.1 (Noteborn und Koch, 1996) analysiert. Der Prozentsatz an Zellen, die sich mit DAPI abnormal färbten, ist als das relative Maß für die Apoptose angegeben.
6 zeigt die diagrammatische Darstellung der wesentlichen Teile der rekombinanten Adenovirus-Adaptor-Vektoren pMab-VP2.
7 zeigt die diagrammatische Darstellung der wesentlichen Teile des rekombinanten Retrovirus-Transfervektors pLS-VP3-N.
LITERATURNACHWEISE

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Claims

Verwendung eines adenoviralen Gentransportvehikels, welches zum Induzieren von Apoptose in einer Zelle fähig ist und ein Nukleinsäure-Molekül umfasst, das für eine Apoptin-artige Aktivität codiert, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von transformierten Zellen, wobei die Apoptose in den transformierten Zellen induziert wird und eine reduzierte Apoptose, sofern überhaupt, in normalen diploiden, nicht-transformierten/nicht-malignen Zellen eintritt und wobei die transformierten Zellen durch Hyperplasie, Metaplasie oder Dysplasie gekennzeichnet sind.
Verwendung eines adenoviralen Gentransportvehikels, welches zum Induzieren von Apoptose in einer Zelle fähig ist und ein Nukleinsäure-Molekül umfasst, das für die Apoptin-artige Aktivität codiert, für die Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose von transformierten Zellen, wobei die Apoptose in den transformierten Zellen induziert wird und eine reduzierte Apoptose, sofern überhaupt, in normalen diploiden, nicht-transformierten/nicht-malignen Zellen eintritt und wobei die transformierten Zellen durch Hyperplasie, Metaplasie oder Dysplasie gekennzeichnet sind.
Verwendung nach Anspruch 2, bei der In-vitro-Detektion der transformierten Zellen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das adenovirale Gentransportvehikel außerdem eine modifizierte Translationsinitiationsstelle direkt flussaufwärts des ATG-Initiationscodons des Nukleinsäure-Moleküls umfasst.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Translationsinitiationsstelle die Nukleinsäuresequenz GCCAAC umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der adenovirale Gentransport replikationsdefekt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das adenovirale Gentransportvehikel außerdem mindestens ein Zielmolekül umfasst.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Zielmolekül mit einem Tumorzell-Oberflächenrezeptor reaktionsfähig ist.