KR100561985B1 - 종양 특이적 아폽틴 발현 카세트 및 이를 포함하는아데노바이러스 발현 벡터 - Google Patents

종양 특이적 아폽틴 발현 카세트 및 이를 포함하는아데노바이러스 발현 벡터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양만을 선택적으로 살상하는 아폽틴(apoptin)의 발현량 증가를 위해 MMRE, SV40 인핸서를 부과한 종양 특이적 발현 카세트, 이를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터 및 이를 항암 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 MMRE와 SV40 인핸서로 발현이 증가된 암세포 특이 살상능이 있는 apoptin 단백질을 암세포에서만 다량 발현하는 아데노바이러스 벡터와 그의 응용방법에 관한 것으로서, 본 발명의 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-apoptin-enh 는 각종 종양에만 작용하며 정상 세포에는 영향을 미치지 않는 종양 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
아폽틴, MMRE, SV40 인핸서, 아데노바이러스, 종양 유전자 치료

Description

종양 특이적 아폽틴 발현 카세트 및 이를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터 {Cancer-specific apoptin-expression cassette and adenovirus expression vector comprising the same}
도 1a는 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터를 제조하는데 사용된 pGL3-control 벡터(미 프로메가사 제품)의 유전자 지도이다.
도 1b는 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터를 제조하는데 사용된 pShuttle(Q-bio 사 제품 AES1020)의 유전자 지도이다.
도 1c는 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터 pS-MMRE-apoptin-enh의 유전자 지도이다.
도 2는 Myc-Max response elements (MMRE) 구조를 나타낸 도면이다. Myc-Max heterodimers가 결합하는 core sequence (CACGTG)는 볼드체와 밑줄로 표시된다.
도 3는 apoptin 유전자의 염기서열(nt 427-868)을 나타낸다. 추가된 NcoI 및 XbaI 부위가 볼드체와 밑줄로 표시된다.
도 4는 본 발명의 아데노바이러스 클론을 제조하는데 사용된 pAdEasy-1 (Quantum 사 제품, AES1010)의 유전자 지도이다.
도 5는 pS-apoptin, pS-apoptin-enh, pS-MMRE-apoptin-enh의 구조를 개략적 으로 나타내는 도면이다.
도 6는 pGL3-Con, pGL3-Pro, pGL3-MMRE-enh plasmids 를 QBI-293A에 transfection후 루시퍼라제 발현 정도를 측정한 그래프이다. c-Myc에 의한 MMRE활성 증가 효과를 알아보기 위해 c-Myc expression plasmid를 293A세포주에 transfection후 24시간 후 pGL3-MMRE-enh plasmid를 다시 transfection 함 (c-Myc+mm-enh). Control plasmid로 pGL3-Promoter에 의한 발현양을 1로 기준을 삼음, (Con; pGL3-Control, mm-enh; pGL3-MMRE-enh, c-Myc; pCMV-c-myc).
도 7는 NCI-H417 SCLC 세포에 pGL3-Con, pGL3-Pro, pGL3-MMRE-enh plasmids 를 transfection 후 루시퍼라제 발현 정도를 측정한 그래프이다. Control plasmid로 pGL3-Promoter에 의한 발현양을 1로 기준을 삼음, (Con; pGL3-Control, mm-enh; pGL3-MMRE-enh).
도 8은 Wi-38과 NCI-H417 에 Ad-apo, Ad-apo-enh, Ad-MMRE-apo-enh 각 50 moi 처리 후 5일 후 trypan blue exclusion 으로 세포 사멸도를 측정한 그래프이다. (apo; Ad-apoptin, apo-enh; Ad-apo-enh,mm-apo-enh; Ad-MMRE-apoptin-enh)
도 9은 Ad-MMRE-apo-enh에 의한 NCI-H417 세포의 아폽토시스 여부를 ELISA 방법을 이용하여 나타낸 결과 그래프이다. (negative; negative control, positive; positive control, apo; Ad-apoptin, apo-enh; Ad-apo-enh,mm-apo-enh; Ad-MMRE-apoptin-enh)
본 발명은 종양만을 선택적으로 살상하는 아폽틴(apoptin)의 발현량 증가를 위해 MMRE, SV40 인핸서를 부과한 종양 특이적 발현 카세트, 이를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터 및 이를 항암 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다.
아폽틴(Apoptin)은 chicken anemia virus (CAV) 유래 단백질로 121 amino acids 으로 구성된다. 이 단백질은 특이하게 암세포만 살상하는 데 반해, 정상세포나 배수체 (diploid) 세포에는 영향을 미치지 않는 것으로 알려져 종양 유전자 치료에 기대를 모으는 단백질이다. apoptin 유도 apoptosis는 p53 과는 다른 기작에 의하며 apoptin 단백질의 세포내 위치가 apoptosis를 유도하는데 관련이 있는 것으로 알려졌다. 즉, apoptin은 정상세포의 세포질에서 발견되는데 종양세포에서는 핵내에서 발견됨으로써 종양세포의 핵내에서만 apoptosis를 일으키는 것으로 알려졌다 (Noteborn et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 94, 5843-5847). 이러한 특성은 apoptin을 종양세포만 살상하는 표적지향적 종양 유전자 치료의 좋은 타겟으로 생각된다.
소세포 폐암 (small cell lung cancer; SCLC)은 전체 폐암 중 15-30 %를 차지하나 매우 빠르게 자라며 침윤성도 크고 쉽게 전이되는 성질이 갖으며 수술이 어렵다. SCLC의 83% 에서 종양 발암유전자인 myc family가 과발현되며, 이러한 MYC 단백질들은 MAX 단백질들과 결합해 Myc-Max complex를 이루며, CACGTG 서열(Myc-Max response element; MMRE)에 결합해 전사를 촉진시킨다는 것이 밝혀졌다 (Cancer Research 56, 354-358, 1996) . 따라서 이 MMRE 부위를 프로모터 앞 부위 에 삽입한다면 myc family가 과발현되는 각종 암, 특히 SCLC 특이 유전자 치료 시 높은 살상 효과를 얻을 수 있을 것이며, 정상세포에는 그 영향이 없는 새로운 형태의 유전자 치료제 개발이 가능할 것이다.
따라서, 본 발명자는 Myc-Max response element (MMRE), SV40 enhancer, 종양 특이 살상 유전자인 apoptin 로 구성되는 아데노바이러스 벡터는 종양 특이적 살상능을 갖는 apoptin의 특성을 유지하면서 MMRE, SV40 enhancer에 의해 종양 특이적으로 apoptin의 발현 양을 증가 시켜서 myc family가 과발현되는 암의 치료에 효과적인 유전자 치료 벡터가 되리라고 생각에 착안하여 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명은 MMRE와 SV40 인핸서로 발현이 증가된 암세포 특이 살상능이 있는 apoptin 단백질을 c-myc 이 과발현되는 소세포폐암세포에서만 다량 발현하는 아데노바이러스 벡터와 그의 응용방법에 관한 것으로서, 본 발명의 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-apoptin-enh 는 각종 종양에만 작용하며 정상 세포에는 영향을 미치지 아니한다.더 구체적으로는 본 발명의 목표는 증가된 apoptin을 발현하는 아데노바이러스를 이용하여 이를 소세포폐암 유전자 치료에 응용하는데 있다. 80~90 % 소세포폐암세포에서 과발현되는 Myc 단백질을 이용하여 apoptin 발현양을 증가시킨 아데노바이러스를 이용해 apoptin을 종양세포에서만 발현시켜 종양 세포만을 공격함으로써 잔여 폐암 세포들을 제거할 수 있을 것이다.
본 발명의 목적은 이중의 종양 특이적 특성을 갖는 종양 특이적 살상능의 apoptin 의 종양 특이적 발현 카세트를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 종양 특이적 발현 카세트를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 아데노바이러스 발현 벡터를 패키징 세포에서 증식시킨 아데노바이러스 클론을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 아데노바이럿 클론을 유효성분으로 함유하는 항암 유전자요법 치료제를 제공하는 데 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 종양 특이적 살상능을 갖는 apoptin과 소세포폐암에서의 c-Myc 과발현을 이용해서 소세포폐암세포에만 특이적으로 작용하는 아데노바이러스 벡터를 개발하는데 있다. 즉, 종양 특이살상능을 갖는 apotin을 과발현하는 아데노바이러스 벡터를 개발함에 있다. 본 발명에서는 이러한 apoptin 의 종양 특이적 특성은 유지하면서 좀 더 강력한 발현을 유도하기 위해 MMRE와 SV40 virus의 transcription enhancer를 삽입하여 아데노바이러스 발현 벡터에 유전자 치료에 이용하고자 한다.
본 발명에 제공되는 아데노바이러스는 바이러스 증식에 관여하는 E1, E3 유전자 부위를 포함하지 않고 암세포 내에서만 apotin을 생산할 수 있는 아데노바이러스 발현 벡터를 제공한다. 구체적으로 본 발명은 SV40 프로모터, MMRE, apoptin 및 SV40 후 아데닌 다중화 신호 (late polyadenylation signal) 및 SV40 인핸서로 구성되는 발현 카세트를 이용하여 종양 살상 유전자를 발현할 수 있는 아데노바이러스 발현 벡터 pS-MMRE-apoptin-enh 를 제공한다. 또한, 본 발명은 암세포내에서 만 apoptin을 과량 발현하여 종양 특이적 항암 유전자 요법에 사용될 수 있는 아데노바이러스 클론을 제공함에 그 목적이 있다. 또한, 본 발명은 상기 아데노바이러스 클론을 암의 치료에 사용하는 용도를 제공함에 그 목적이 있다. 구체적으로, 본 발명은 상기 아데노바이러스 클론을 인체내에 암이 생긴 부위에 감염시켜 암이 진행되는 것을 억제하거나 암세포만을 사멸시켜 암을 치료하는 항암 유전자 요법을 제공할 수 있다.
상기 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 MMRE(Myc-Max response element), SV40 프로모터, 아폽틴(apoptin) 유전자, SV40후 아데닌다중화신호 및 SV인핸서가 전사방향으로 연결되어 구성된 종양특이적 아폽틴 발현 카세트를 제공한다.
본 발명의 종양 특이적 아폽틴 발현 카세트에 있어서, 상기 MMRE는 MYC 단백질과 MAX 단백질이 결합된 Myc-Max complex가 결합되어 전사를 촉진시키는 부위로서 CACGTG 서열을 포함하며, 바람직하게는 양끝에 MYC-MAX 결합을 용이하게 하기위한 스페이스(space)를 포함하는 서열번호1의 염기서열이 4번 반복된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 종양 특이적 아폽틴 발현 카세트에 있어서, 상기 아폽틴(apoptin) 유전자는 서열번호3의 121 amino acids으로 구성된 chicken anemia virus (CAV) 유래의 아폽틴(Apoptin) 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 DNA로서, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 본 발명의 종양 특이 적 아폽틴 발현 카세트를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터는, 바람직하게는 상기 종양 특이적 아폽틴 발현 카세트를 아데노바이러스 재조합 벡터인 pShuttle의 KpnI/SalI 부위에 삽입하여 제조되는 도 1c의 개열지도를 갖는 아데노바이러스 발현 벡터 pS-MMRE-apoptin-enh인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터를 패키징 세포에서 증식시켜 얻은 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-apoptin-enh을 제공한다.
본 발명의 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-apoptin-enh 은 바람직하게는 상기 아데노바이러스 발현 벡터를 바이러스 증식을 위한 아데노바이러스 모체 벡터 pAdEasy-1와 함께 아데노바이러스 재조합 대장균 BJ5183에 공동형질감염시킨 후 여기서 추출된 재조합 아데노바이러스 DNA를 패키징 세포 QBI-293A에 형질감염한 후 증식하여 얻은 수탁번호 (KCCM-10574)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 본 발명의 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-apoptin-enh 를 유효성분으로 함유하는 항암 유전자 요법 치료제를 제공한다.
본 발명의 항암 유전자 요법 치료제는 바람직하게는 myc family가 과발현되는 암, 예컨대 피부암, 유방암, 전립선암, 버킷 림포마 등 (Nesbit et al., oncogene 18, 2004-3016 참조) 의 치료, 더욱 바람직하게는 소세포 폐암(small cell lung cancer; SCLC)의 치료에 사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 항암 유전자요법 치료제는 본 발명의 유효성분인 아데노바이러스 클론 외에 생물제제에 통상 사용되는 안정화제 및 담체, HSV-TK, CD, IL-2 등의 보조 활성성분 등을 더 포함할 수 있으며, 암의 치료를 위해 주사제 형태로 인체에 투여될 수 있다. 이 때 환자에게 투여될 아데노바이러스 클론 입자의 적정 수는 환자의 중한 상태에 따라 다르나 바람직하게는 체중 kg당 500~2000 MOI 정도이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 MMRE, SV40 인핸서에 의해 암세포만 살상하는 apoptin를 과발현하는 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 본 발명의 아데노바이러스를 제조하기 위하여, 아데노바이러스의 게놈 DNA에서 E1 유전자 부위를 제거하고 그 자리에 MMRE, SV40 프로모터, apoptin, SV40 후 아데닌 다중화 신호 및 SV40 인핸서로 구성되는 발현 카세트를 대신 삽입함으로써 종양 특이적 자살유전자 발현 아데노바이러스 벡터를 제조한다. 구체적으로, 본 발명은 루시퍼라제 발현 벡터인 pGL3-Control 벡터 (미 프로메가사 제품)의 시미언 바이러스 (simian virus; SV40) 의 최전 프로모터(immediate early promoter) 뒤의 루시퍼라제 유전자를 제거하고 apoptin 유전자를 삽입하였다. MMRE 부위는 (CACGTG)X4 로 구성되는 MMRE oligomer 쌍을 상보 결합시켜 SV40 promoter 앞 쪽의 KpnI/BglII 부위에 cloning한 후에 KpnI/SalI 카세트를 아데노바이러스 발현 벡터인 pShuttle의 KpnI/SalI 부위에 삽입하여 MMRE, SV40 프로모터, apoptin 유전자, SV40 의 후 아데닌 다중화 신호 및 SV40 인핸서로 구성되는 발현 카세트를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터 pS-MMRE-apoptin-enh 를 이용하여 재조합 아데노바이러스 Ad-MMRE-apoptin-enh 을 제조한다. 구체적으로는, 아데노바이러스가 증식하는데 필요한 유전자를 포함하는 아데노바이러스 모체 벡터로는 아데노바이러스 벡터 pAd-Easy-1을 사용하여 아데노바이러스 재조합 대장균인 BJ5183에서 재조합한 후 패키징 세포인 QBI-293A 세포를 사용하여 증식시켰다. 본 발명에서 선별한 아데노바이러스 클론을 Ad-MMRE-apoptin-enh 로 명명하고 이를 2004년 5월 24 일에 한국 미생물 보존센터에 기탁하였다 (수탁번호 : KCCM-10574). 본 발명의 상기 아데노바이러스 클론이 종양 세포에만 특이적으로 작용하는지 조사하기 위하여, 상기 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-apoptin-enh를 소세포폐암(SCLC) 및 정상 섬유 아세포에 감염시켜 종양세포의 특이적 사멸 및 세포 성장 억제 효과를 확인한다 (도 7, 도 8). 구체적으로 본 발명은 암 세포주로 소세포 폐암에서 유래한 NCI-H417 세포주를 사용한다. 또, 정상 세포주에 미치는 영향을 살펴보기 위해 정상 섬유 아세포 (fibroblast)인 Wi-38을 대조군으로 사용한다.
본 발명의 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-apoptin-enh 가 세포 성장에 미치는 효과는 트리판 블루 염색법 (cell exclusion assay)으로 측정한다.이 때 대조군으로 어떤 유전자도 발현하지 않는 아데노바이러스 Ad-CMV null 과 SV40 인핸서를 갖지 않는 Ad-apoptin, SV40 인핸서를 갖는 Ad-apoptin-enh 로 세포를 감염시킨다. 그 결과 NCI-H417 세포에서 세포수가 감소하는 현상을 관찰하였으며, 특히 Ad-MMRE-apoptin-enh의 경우 그 효과가 탁월하였다 (도 7). 그러나 정상 피브로브라스트(fibroblast) 세포는 거의 영향을 받지 않음을 확인한다 (도 7).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 각 세포주의 배양
본 발명에 사용된 소세포 폐암 세포주 NCI-H417(한국 세포주 은행 KCLB-90417)와 대조군인 인간 정상피부 피브로브라스트 세포인 Wi-38(한국 세포주 은행 KCLB-10075) 등은 10% 소태아 혈청을 포함하는 배지 RPMI1640 에서 배양하여 사용하였다. 세포주들은 모두 한국 세포주 은행에서 구입하였다. 재조합 아데노바이러스 제조 세포 QBI-293A 세포주(Q-bio 사 제품, AES 0503) 는 미 퀀텀사에서 구입하였다.
실시예 2 MMRE , SV 40 인핸서의 프로모터 활성 증가 효과 검증
다음은 MMRE와 SV40 enhancer에 의한 promoter 활성 증가 효과를 알아 보기 위해 SV40 enhancer를 갖는 pGL3-Control 벡터(미 프로메가사 제품, 도 1a) 의 SV40 프로모터 앞 쪽의 KpnI/BglII 부위에 MMRE를 삽입하였다. MMRE는 서열번호 1의 (CACGTG)X4 로 구성되는 MMRE oligomer 쌍을 합성 한 후 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA 버퍼에서 80℃, 30 분간 방치하여 상보 결합시켜 제조하였다. (도 2) 이렇게 만든 pGL3-MMRE-enh 를 QBI-293A 세포주 트랜스 팩션 시켰다. MMRE 와 SV40 enhancer 를 갖는 pGL3-MMRE-enh 경우 pGL3-con 에 비해 6 배나 많은 루시퍼라제의 발현 정도를 보였다 (도 6). C-Myc 과발현에 의한 MMRE의 텔로머라제 프로모터의 활성 증가 정도를 알아보기 위해 QBI-293A 세포주에 c-Myc 발현 플라스미드 (pCMV-c-myc)를 트랜스팩션 후, 다음날 pGL3-MMRE-enh 플라스미드를 트랜스팩션 시켰다. 그 결과 그냥 pGL3-MMRE-enh 보다 약 3배의 루시퍼라제 발현 증가 효과를 관찰함으로써 MMRE의 프로모터 발현 증가 효과는 c-Myc 단백질에 의함을 확인한다 ( 도 6 레인 3). NCI-H417 SCLC cells 은 c-Myc protein 이 과발현되는 세포주로서 (Barr et al., Cancer Res 60:143-149, 2000). 도 7에서 보듯 MMRE 와 SV 40 enhancer 에 의해 프로모터의 활성이 control에 비해 6배 이상 증가함을 확인한다. 이러한 결과는 소세포폐암에서 MMRE와 SV40 enhancer 가 프로모터의 활성을 증가시킴을 확인한다.
실시예 2 MMRE, SV40 프로모터, Apoptin, SV40 후 아데닌다중화신호 및 SV40 인핸서를 포함하는 발현 카세트 및 아데노바이러스 발현 벡터의 제조
본 발명은 apoptin, MMRE, SV40 인핸서 등을 포함하는 발현 카세트 및 아데노바이러스 발현 벡터를 제조하기 위하여, 우선 pGL3-control 벡터(미 프로메가사 제품, 도 1a)를 NcoI /XbaI으로 처리하여 시미언 바이러스 (simian virus; SV40) 의 최전 프로모터(immediate early promoter) 뒤의 루시퍼라제 유전자를 제거하고 apoptin 유전자를 삽입하였다. 이때 apoptin 유전자는 chicken anemia virus (CAV) genome 내 서열번호 2의 apoptin 유전자 (nt427~868)와 앞뒤에 붙은 NcoI/XbaI 부위를 oligo DNA assemble method (Takara, Japan)를 사용하여 인위적으로 합성하였다(도 3). MMRE 부위는 서열번호 1의 (CACGTG)X4 로 구성되는 MMRE oligomer 쌍을 상보 결합시켜 제조한 후(도 2), SV 40 promoter 앞 쪽의 KpnI/BglII 부위에 cloning하였다. 그 후 KpnI/SalI로 처리하여 MMRE 부위 앞의 KpnI 과 SV 인핸서 뒤의 SalI 사이의 KpnI/SalI 발현 카세트를 제조하였다(도 1). 다음 제조된 KpnI/SalI 발현 카세트를 아데노바이러스 재조합벡터인 pShuttle(Q-bio 사 제품 AES1020, 도 1b)의 KpnI/SalII 부위에 삽입하여 MMRE, SV40 프로모터, apoptin, SV40 후 아데닌다중화 신호 및 SV40 인핸서로 구성되는 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터 pS-MMRE-apoptin-enh를 제조하였다 (도1c 참조).
실시예 3 MMRE 및 SV 40 인핸서에 의해 종양 세포내에서 apoptin 유전자 과량 생산할 수 있는 아데노바이러스 클론의 제조
종양 세포에 감염되어 apoptin을 과량 생산할 수 있는 아데노바이러스 클론을 제조하기 위하여, 본 발명의 아데노바이러스 발현벡터 pS-MMRE-apoptin-enh 를 아데노바이러스 재조합 대장균 (E.coli) 인 BJ5183 (Q-bio 사 제품, AES1005K)에 아데노바이러스 모체 벡터 pAdEasy-1 (Quantum 사 제품, AES1010, 미국, 도 4)와 함께 공동 형질감염 시킨 후, 카나마이신 배지에서 살아남은 40개의 후보 클론을 선별하여 그들에서 추출한 재조합 아데노바이러스 DNA를 패키징 세포주인 QBI-293A 세포(Q-bio 사 제품, AES 0503)에 리포좀 (로쉬 사 제품, FuGENE 6)을 이용하여 형질감염시켰다. 이 때 형질전환(transfection)은 24-웰 플레이트를 사용하여 수행하였고, 그 결과 10개의 웰에서 바이러스에 의한 플라크가 생성됨을 확인하였다. 모든 과정은 Quantum 사의 재조합 아데노바이러스 제조 kit인 AdEasyTM의 방법을 사용하였다. 이렇게 제조된 아데노바이러스 클론을 Ad-MMRE-apoptin-enh 로 명명하고 이를 2004년 5월 24일에 한국 미생물 보존센터에 기탁하였다 (수탁번호 : KCCM-10574). Enhancer와 MMRE를 갖지않는 control apoptin 아데노바이러스 Ad-apoptin, Ad-apoptin-enh는 위와 같은 방법으로 pGL3-Promoter, pGL3-Control (미프로메가사 제품) 이용해 제조하였다(도 5).
실시예 4 아데노바이러스 Ad- MMRE - apoptin - enh 의 항암 효과
본 발명의 아데노바이러스 클론을 항암 유전자 요법에 효과적으로 사용할 수 있는지 확인하기 위하여, 종양 세포주에 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-apoptin-enh 를 처리한 후 이로부터 항암 효과를 조사한다. 본 발명의 아데노바이러스 Ad-MMRE-apoptin-enh의 감염이 세포 성장에 미치는 효과는 트리판 블루 염색법 (trypan blue dye exclusion assay) 으로 측정한다. 대략 5×104 개의 세포를 60 mm 디시에 심어 하루 배양 후, 아데노바이러스 Ad-MMRE-apoptin-enh, Ad-apoptin-enh, Ad-apoptin 또는 음성조절인자 (negative control)로 Ad-CMV null 을 50 pfu/세포로 처리한 후 5 일 후 세포 수를 측정한다. 그 결과, 종양 세포 NCI-H417 에서 Ad-MMRE-apoptin-enh, Ad-apoptin-enh, Ad-apoptin 에 의한 세포 세포사멸 효과가 91, 79, 67 % 로 나타났다. 정상 세포 Wi-38 에는 별다른 영향이 없음을 확인한다 (도 8). Ad-MMRE-apoptin-enh 에 의한 아폽토시스 세포사멸 시 생성되는 세포질 히스톤 연관 DNA 절편은 Cell Death Detection ELISA PLUS (Roche, Germany)에 의해 측정되었다. 즉, Ad-CMV, Ad-apoptin, Ad-apoptin-enh, Ad-MMRE-apoptin-enh 감염 세포를 streptavidin - coated micro plate에 올려 놓고 Anti-histone-biotin, Anti-DNA-POD 복합체를 넣어 15~25 ℃ 에서 2시간 배양 후 비결합 항체를 제거 후 POD 를 405 nm 에서 ABTS 를 기질로 하여 ELISA reader 로 읽은 결과 Ad-apoptin, Ad-apoptin-enh해 Ad-MMRE-apoptin-enh가 각 2 배, 4 배 이상 높은 세포 사멸 효과를 보임을 알았다 (도 9).
이상 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터 pS-MMRE-apoptin-enh 및 이로부터 얻은 바이러스 클론 Ad-MMRE-apoptin-enh 는 암세포를 사멸시키거나 성장을 억제시키는데 탁월한 효과를 나타냄을 확인할 수 있다. 본 발명의 아데노바이러스 Ad-MMRE-apoptin-enh 는 특히 c-myc 이 과발현되는 소세포폐암 세포에서 과발현되는 특징이 있는 반면 정상 세포에는 영향을 주지 않으므로, 독성이나 부작용이 적은 장점을 갖는 것으로 생각되어 항암 유전자 요법에 사용할 경우 매우 우수한 안전성과 강한 항암 효과를 나타내게 된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

  1. 서열번호1의 염기서열이 4번 반복된 MMRE(Myc-Max response element), SV40 프로모터, 아폽틴(apoptin) 유전자, SV40후 아데닌다중화신호 및 SV인핸서가 전사방향으로 연결되어 구성된 종양특이적 아폽틴 발현 카세트.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 아폽틴(apoptin) 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 종양 특이적 아폽틴 발현 카 세트.
  4. 제1항의 종양 특이적 아폽틴 발현 카세트를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 종양 특이적 아폽틴 발현 카세트를 아데노바이러스 재조합 벡터인 pShuttle의 KpnI/SalI 부위에 삽입하여 제조되는 것을 특징으로 하는 도 1c의 개열지도를 갖는 아데노바이러스 발현 벡터 pS-MMRE-apoptin-enh.
  6. 제4항의 아데노바이러스 발현 벡터를 패키징 세포에서 증식시켜 얻은 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-apoptin-enh.
  7. 제6항에 있어서, 상기 아데노바이러스 발현 벡터를 바이러스 증식을 위한 아데노바이러스 모체 벡터 pAdEasy-1와 함께 아데노바이러스 재조합 대장균 BJ5183에 공동형질감염시킨 후 여기서 추출된 재조합 아데노바이러스 DNA를 패키징 세포 QBI-293A에 형질감염한 후 증식하여 얻은 것을 특징으로 하는 수탁번호 (KCCM -10574 )의 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-apoptin-enh.
  8. 제6항의 아데노바이러스 클론 Ad-MMRE-apoptin-enh 를 유효성분으로 함유하는 항암 유전자 요법 치료제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 myc family가 과발현되는 암의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 항암 유전자 유법 치료제
  10. 제9항에 있어서, 소세포 폐암(small cell lung cancer; SCLC)의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 항암 유전자 유법 치료제.
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