JP2024506040A - Ａｑｐ１ ＲＮＡを標的とするｓｇＲＮＡ及びそのベクターと使用 - Google Patents

Ａｑｐ１ ＲＮＡを標的とするｓｇＲＮＡ及びそのベクターと使用 Download PDF

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Abstract

ヒトＡｑｐ１ ｍＲＮＡを標的とするｓｇＲＮＡ及びそのベクターと使用を提供する。当該ｓｇＲＮＡは、ターゲティングドメインとフレームワーク配列とを含み、当該ターゲティングドメインは標的核酸Ａｑｐ１ ｍＲＮＡ配列に相補的であり、当該フレームワーク配列はＣａｓタンパク質に結合又は相互作用することができる。ベクターを使用して当該ｓｇＲＮＡを細胞に送達した後、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡを標的とし、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡレベルを低下させることができ、がん、緑内障を含むＡｑｐ１過剰発現に関連する疾患を含むがこれらに限定されないＡｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患を治療するために使用することができる。

Description

本発明は、生物医学の技術分野に関し、特にＡｑｐ１ ｍＲＮＡを標的とするｓｇＲＮＡ及びそのベクターと使用に関する。
アクアポリン１（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ １、Ａｑｐ１）は、体内に広く分布している膜貫通タンパク質の一種である。主に体内の水分輸送の調節に関与しているが、血管新生、細胞移動、及び細胞増殖のプロセスにも重要な役割を果たしている。ＭｅｉｒａＧＴｘ社は遺伝子治療製品ＡＡＶ－Ａｑｐ１を開発した。ＡＡＶベクターを介して損傷した唾液腺でＡｑｐ１遺伝子を過剰発現させることによって放射線誘発性口腔乾燥症（Ｒａｄｉａｔｉｏｎ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｘｅｒｏｓｔｏｍｉａ、ＲＩＸ）を治療する。ＭｅｉｒａＧＴｘ社は現在、ＡＡＶ－Ａｑｐ１遺伝子医薬の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験を行っている。また、Ａｑｐ１は緑内障の発症に関連していることがわかった。
緑内障（Ｇｌａｕｃｏｍａ）は、網膜神経節細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｌ、ＲＧＣ）のアポトーシスとその軸索の変性を病理学的特徴とする神経変性疾患である。神経節細胞のアポトーシスは、主に眼圧（Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ、ＩＯＰ）に関連している。ＩＯＰは主に房水によって維持されるが、房水の生成組織である毛様体（Ｃｉｌｉａｒｙ ｂｏｄｙ、ＣＢ）、及び房水の主な排出組織である小柱網（Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ、ＴＭ）が故障すると、房水の循環系に故障が生じ、最終的にＩＯＰが上昇し、ＲＧＣが圧迫され、最終的には不可逆的な視野の欠損に至ることがある。Ａｑｐ１の機能喪失は房水産生を減少させ、眼圧を低下させる。現在、眼圧を下げることは依然として緑内障を治療するための通常の方法である。
緑内障による視野損傷は不可逆的であるため、現在緑内障を治療するための医薬の主な役割は眼圧（ＩＯＰ）を下げることである。現在、ＩＯＰを下げる医薬には、α－アドレナリン作動薬、β－アドレナリン拮抗薬、コリン作動薬、プロスタグランジン、及び炭酸脱水酵素阻害薬の５つの主要なクラスがある。主に点眼薬の形で投与されるが、頻繁に投与する必要があり、一定の副作用もある。蘇州瑞博生物技術有限公司（Ｓｕｚｈｏｕ Ｒｉｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）は、視神経保護のための革新的なｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）核酸薬ＱＰＩ－１００７を開発し、現在、第ＩＩ／ＩＩＩ相臨床試験の世界的な重要な研究中である。この薬は、アポトーシス促進タンパク質カスパーゼ２の発現を一時的に阻害するように設計されている。また、網膜神経節細胞ＲＧＣのアポトーシスを防ぎ、それによって視野の損傷を軽減する。
研究によると、Ａｑｐ１の発現を減らすと、血管新生を減らし、腫瘍の進行を遅らせることもできる（Ｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２０１０， ２９４（２）：１３５－１３８）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）システムは現在最も広く応用されている遺伝子編集技術である。従来技術において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用してＡｑｐ１遺伝子を編集したことがある。また、従来技術は、Ａｑｐ１遺伝子のエクソン領域を標的とし、ゲノムＤＮＡを切断するため、本来のＡｑｐ１遺伝子に突然変異が生じる。
本発明の目的は、ヒトＡｑｐ１ ｍＲＮＡを標的とすることができるｓｇＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ、シングル分子ｇＲＮＡ）及びそのベクターと使用を提供することである。
第１態様において、本発明はｓｇＲＮＡの保護を請求する。
本発明により請求されるｓｇＲＮＡは、ヒトＡｑｐ１ ｍＲＮＡを標的とすることができる。
図１に示すように、前記ｓｇＲＮＡは、ターゲティングドメイン（ガイド配列）とフレームワークドメイン（フレームワーク配列）とを含む。前記ターゲティングドメインは、標的核酸Ａｑｐ１ ｍＲＮＡ配列に相補的（完全に相補的又は部分的に相補的）であり、前記フレームワーク配列は、Ｃａｓタンパク質に結合又は相互作用することができる。当業者は、必要に応じて前記ガイド配列を前記フレームワーク配列の５’末端又は３’末端に連結することができる。
ここで、前記Ｃａｓタンパク質は、好ましくはＣａｓ１３タンパク質である。前記Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１３ｅ又はＣａｓ１３ｆタンパク質である。
いくつかの実施形態において、前記ターゲティングドメインの配列は、配列番号１～配列番号３１のいずれか１つに示される配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記ターゲティングドメインの配列は、配列番号１～配列番号３１のいずれか１つから選択される。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡのターゲティングドメインの配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１のいずれか１つに示される配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡのターゲティングドメインの配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１のいずれか１つから選択される。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡのターゲティングドメインの配列は、配列番号２、配列番号５、配列番号２１、配列番号２４、配列番号３１のいずれか１つから選択される。
本発明に記載のｓｇＲＮＡのフレームワーク配列は、通常の方法に従って設計してもよい。
前記フレームワーク配列は、異なるＣａｓタンパク質によって異なる選択が可能であり、これは当業者によって容易に実現することができる。いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１３ｅ又はＣａｓ１３ｆに対応するｇＲＮＡフレームワーク配列を使用する。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼ又はＣａｓ１３ヌクレアーゼをコードする核酸分子と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼと組み合わせて使用される。いくつかの実施形態において、前記Ｃａｓ１３ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１３ｅ又はＣａｓ１３ｆである。
前記Ｃａｓ１３ヌクレアーゼとしては、天然のＣａｓ１３タンパク質、人工的に改変されたＣａｓ１３タンパク質、ヌクレアーゼの活性が欠損又は低下したＣａｓ１３突然変異体（例えば、ＨＥＰＮドメインの突然変異、ＲｘｘｘｘＨモチーフの突然変異）、Ｃａｓ１３のコンジュゲート（例えば、核局在シグナルＮＬＳ又は核輸出シグナルＮＥＳとのコンジュゲートなどの非限定的な例）、Ｃａｓ１３の融合タンパク質（例えば、デアミナーゼとの融合によって形成される一塩基エディターなどの非限定的な例）が含まれる。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ａヌクレアーゼと組み合わせて使用され、前記ｓｇＲＮＡのフレームワーク配列は、ガイド配列の５’末端に位置する。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ｂヌクレアーゼと組み合わせて使用され、前記ｓｇＲＮＡのフレームワーク配列は、ガイド配列の３’末端に位置する。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ｃヌクレアーゼと組み合わせて使用され、前記ｓｇＲＮＡのフレームワーク配列は、ガイド配列の５’末端に位置する。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ｄヌクレアーゼと組み合わせて使用され、前記ｓｇＲＮＡのフレームワーク配列は、ガイド配列の５’末端に位置する。
いくつかの実施形態において、前記Ｃａｓ１３ｄヌクレアーゼはＣａｓＲｘである。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼに結合又は相互作用することができる。即ち、ｓｇＲＮＡのフレームワーク配列を介してＣａｓ１３ヌクレアーゼに結合又は相互作用する。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼと複合体を形成することができる。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼを標的核酸Ａｑｐ１ ｍＲＮＡに誘導することができる。即ち、ｓｇＲＮＡのターゲティングドメインと標的核酸Ａｑｐ１ ｍＲＮＡ配列との相補（完全相補又は部分相補）を介して、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼを標的核酸Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの標的配列に誘導する。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼを標的核酸Ａｑｐ１ ｍＲＮＡに誘導し、かつ前記標的核酸Ａｑｐ１ ｍＲＮＡを標的化又は修飾することができる。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼと複合体を形成することができ、前記複合体は、標的核酸Ａｑｐ１ ｍＲＮＡを標的化又は修飾する。
いくつかの実施形態において、前記標的核酸Ａｑｐ１ ｍＲＮＡを標的とすることは、
Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの切断、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの可視化又は検出、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの標識、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの輸送、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡのマスキング、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの転写及び／又は翻訳レベルの向上、並びにＡｑｐ１ ｍＲＮＡの転写及び／又は翻訳レベルの低下の１つ又は複数から選択される。
いくつかの実施形態において、前記標的核酸を修飾することは、
Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの塩基置換、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの塩基欠失、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの塩基挿入、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡのメチル化、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの脱メチル化、及びＡｑｐ１ ｍＲＮＡの脱アミノ化の１つ又は複数から選択される。
本発明のｓｇＲＮＡは、任意のヌクレオチド上で好適に化学修飾することができる。
第２態様において、本発明はｓｇＲＮＡの組み合わせの保護を請求する。
本発明により請求されるｓｇＲＮＡの組み合わせは、第１態様からの任意の２つの異なる前記ｓｇＲＮＡから構成されてもよい。
ここで、前記「第１態様からの任意の２つの異なる前記ｓｇＲＮＡ」のターゲティングドメインの配列は、配列番号１～配列番号３１のいずれか２つから選択される。
好ましくは、いくつかの実施形態において、前記「第１態様からの任意の２つの異なる前記ｓｇＲＮＡ」のターゲティングドメインの配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１のいずれか２つから選択される。
より好ましくは、いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡの組み合わせは、下記のいずれか１つから選択される：
Ｐ１、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号５である前記ｓｇＲＮＡ；
Ｐ２、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２１である前記ｓｇＲＮＡ；
Ｐ３、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２４である前記ｓｇＲＮＡ；
Ｐ４、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡ；
Ｐ５、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号５である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２１である前記ｓｇＲＮＡ；
Ｐ６、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号５である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２４である前記ｓｇＲＮＡ；
Ｐ７、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号５である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡ；
Ｐ８、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２１である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２４である前記ｓｇＲＮＡ；
Ｐ９、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２１である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡ；
Ｐ１０、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２４である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡ。
第３態様において、本発明は、上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡ又は上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせをコードするＤＮＡ分子の保護を請求する。
第４態様において、本発明は、上記の第３態様に記載のＤＮＡ分子を含む発現カセット、発現ベクター、組換え細菌、組換えウイルス又はトランスジェニック細胞株の保護を請求する。
いくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、第１態様に記載のｓｇＲＮＡをコードする２つ以上のヌクレオチド配列を含む。
上記の発現ベクターは、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡを標的とするためのｓｇＲＮＡを発現することができ、当業者は通常の技術を参照して構築することができることが理解できる。
いくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。前記ヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。前記発現ベクターは、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡを標的とするためのｓｇＲＮＡ及びＣａｓ１３ヌクレアーゼを発現することができ、当業者は通常の技術を参照して構築することができることが理解される。
ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列、及びＣａｓ１３ヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列は、同一の発現ベクターに位置していてもよいし、異なる発現ベクターに位置していてもよい。
第５態様において、本発明はキットの保護を請求する。
本発明により請求されるキットは、下記のいずれか１つを含んでもよい：
ｉ、Ｃａｓタンパク質、及び上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡ；
ｉｉ、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター１、及び上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡ；
ｉｉｉ、Ｃａｓタンパク質、及び上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター２；
ｉｖ、前記発現ベクター１及び前記発現ベクター２；
ｖ、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とを含む発現ベクター３；
ｖｉ、Ｃａｓタンパク質、及び上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせ；
ｖｉｉ、前記発現ベクター１、及び上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせ；
ｖｉｉｉ、Ｃａｓタンパク質及び発現ベクター４；前記発現ベクター４は上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの２つのｓｇＲＮＡすべてをコードするヌクレオチド配列を含む；
ｉｘ、Ｃａｓタンパク質、発現ベクター５及び発現ベクター６；前記発現ベクター５は上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせのいずれか１つのｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む；前記発現ベクター６は上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの他のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む；
ｘ、前記発現ベクター１及び前記発現ベクター４；
ｘｉ、前記発現ベクター１、前記発現ベクター５及び前記発現ベクター６；
ｘｉｉ、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの２つのｓｇＲＮＡすべてをコードするヌクレオチド配列とを含む発現ベクター７；
ｘｉｉｉ、発現ベクター８及び発現ベクター９；前記発現ベクタ８はＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせのいずれか１つのｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とを含む；前記発現ベクター９は上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの他のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む；
前記Ｃａｓタンパク質は、前記ｓｇＲＮＡに結合又は相互作用することができる。
いくつかの実施形態において、前記Ｃａｓタンパク質はＣａｓ１３タンパク質である。
いくつかの実施形態において、前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１３ｅ又はＣａｓ１３ｆである。
いくつかの実施形態において、前記キットは、下記のいずれか１つを含む：
ｉ、Ｃａｓ１３タンパク質、及び上記のターゲティングドメインの配列が配列番号５、配列番号２１、配列番号２４又は配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡ；
ｉｉ、Ｃａｓ１３タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター１、及び上記のターゲティングドメインの配列が配列番号５、配列番号２１、配列番号２４又は配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡ；
ｉｉｉ、Ｃａｓ１３タンパク質、及び上記のターゲティングドメインの配列が配列番号５、配列番号２１、配列番号２４又は配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター２；
ｉｖ、前記発現ベクター１及び前記発現ベクター２；
ｖ、Ｃａｓ１３タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、上記のターゲティングドメインの配列が配列番号５、配列番号２１、配列番号２４又は配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とを含む発現ベクター３；
前記Ｃａｓ１３タンパク質は、前記ｓｇＲＮＡに結合又は相互作用することができる。
いくつかの実施形態において、第５態様の発現ベクターにおけるｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列及び／又はＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。前記発現ベクターは、細胞（ヒト細胞を含むがこれに限定されない）においてＡｑｐ１ ｍＲＮＡを標的とするためのｓｇＲＮＡ及び／又はＣａｓタンパク質を発現することができる。
前記キットは、Ａｑｐ１の発現量を有意にダウンレギュレーションするために使用することができる。
第６態様において、本発明は組成物の保護を請求する。
本発明により請求される組成物は、下記のいずれか１つから選択されてもよい：
Ｉ、Ｃａｓタンパク質と、上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡとを含む組成物；
ＩＩ、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸分子１と、上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡとを含む組成物；
ＩＩＩ、Ｃａｓタンパク質と、上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡをコードする核酸分子２とを含む組成物；
ＩＶ、前記核酸分子１と前記核酸分子２とを含む組成物；
Ｖ、Ｃａｓタンパク質及び上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡをコードする核酸分子３を含む組成物；
ＶＩ、Ｃａｓタンパク質と、上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせとを含む組成物；
ＶＩＩ、前記核酸分子１と、上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせとを含む組成物；
ＶＩＩＩ、Ｃａｓタンパク質と核酸分子４とを含む組成物；前記核酸分子４は上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの２つのｓｇＲＮＡすべてをコードする；
ＩＸ、Ｃａｓタンパク質と、核酸分子５と核酸分子６とを含む組成物；前記核酸分子５は上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせのいずれか１つのｓｇＲＮＡをコードする；前記発現ベクター６は上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの他のｓｇＲＮＡをコードする；
Ｘ、前記核酸分子１と前記核酸分子４とを含む組成物；
ＸＩ、前記核酸分子１と、前記核酸分子５と前記核酸分子６とを含む組成物；
ＸＩＩ、Ｃａｓタンパク質及び上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの２つのｓｇＲＮＡすべてをコードする核酸分子７を含む組成物；
ＸＩＩＩ、核酸分子８と核酸分子９とを含む組成物；前記核酸分子８はＣａｓタンパク質及び上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせのいずれか１つのｓｇＲＮＡをコードする；前記核酸分子９は上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの他のｓｇＲＮＡをコードする。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは前記Ｃａｓタンパク質に結合又は相互作用することができる。即ち、ｓｇＲＮＡのフレームワーク配列を介して前記Ｃａｓタンパク質に結合又は相互作用する。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成することができる。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、前記Ｃａｓタンパク質を標的核酸Ａｑｐ１ ｍＲＮＡに誘導することができる。即ち、ｓｇＲＮＡのターゲティングドメインと標的核酸Ａｑｐ１ ｍＲＮＡ配列との相補（完全相補又は部分相補）を介して、前記Ｃａｓタンパク質を標的核酸Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの標的配列に誘導する。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、前記Ｃａｓタンパク質を標的核酸Ａｑｐ１ ｍＲＮＡに誘導し、かつ前記標的核酸Ａｑｐ１ ｍＲＮＡを標的化又は修飾することができる。
いくつかの実施形態において、前記Ｃａｓタンパク質はＣａｓ１３タンパク質である。
いくつかの実施形態において、前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１３ｅ又はＣａｓ１３ｆである。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、下記のいずれか１つから選択される：
Ｉ、Ｃａｓ１３タンパク質と、上記の第１態様に記載のターゲティングドメインの配列が配列番号５、配列番号２１、配列番号２４又は配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡとを含む組成物；
ＩＩ、Ｃａｓ１３タンパク質をコードする核酸分子１と、上記のターゲティングドメインの配列が配列番号５、配列番号２１、配列番号２４又は配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡとを含む組成物；
ＩＩＩ、Ｃａｓ１３タンパク質と、上記の第１態様に記載のターゲティングドメインの配列が配列番号５、配列番号２１、配列番号２４又は配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡをコードする核酸分子２とを含む組成物；
ＩＶ、前記核酸分子１と、前記核酸分子２とを含む組成物；
Ｖ、Ｃａｓ１３タンパク質及び上記の第１態様に記載のターゲティングドメインの配列が配列番号５、配列番号２１、配列番号２４又は配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡをコードする核酸分子３を含む組成物；
前記Ｃａｓ１３タンパク質は、前記ｓｇＲＮＡに結合又は相互作用することができる。
いくつかの実施形態において、第６態様の核酸分子におけるｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列及び／又はＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。前記核酸分子は、細胞（ヒト細胞を含むがこれに限定されない）においてＡｑｐ１ ｍＲＮＡを標的とするためのｓｇＲＮＡ及び／又はＣａｓタンパク質を発現することができる。
前記組成物は、Ａｑｐ１の発現量を有意にダウンレギュレーションするために使用することができる。
第７態様において、本発明は医薬の保護を請求する。
本発明により請求される医薬は、上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡ、上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせ、上記の第３態様に記載のＤＮＡ分子、上記の第４態様に記載の発現カセット、発現ベクター、組換え細菌、組換えウイルス又はトランスジェニック細胞株、或いは上記の第６態様に記載の組成物、及び薬学的に許容される補助材を含む。
いくつかの実施形態において、前記医薬は、ＲＮＰ送達、リポソーム送達、ナノ粒子送達、ウイルス送達、細胞外小胞送達を含むがこれらに限定されない送達システムを使用して送達され得る。
本発明のいくつかの実施形態において、ウイルス送達が使用される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶウイルスベクター送達が使用される。さらに、いくつかの実施形態において、ＡＡＶ－ＳｈＨ１０送達が使用される。
第８態様において、本発明は、下記のいずれか１つにおける、上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡ、上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせ、上記の第３態様に記載のＤＮＡ分子、上記の第４態様に記載の発現カセット、発現ベクター、組換え細菌、組換えウイルス又はトランスジェニック細胞株、上記の第６態様に記載の組成物、或いは上記の第７態様に記載の医薬の使用の保護を請求する：
Ｑ１、Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患を治療するための医薬の製造；
Ｑ２、Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患の治療。
いくつかの実施形態において、前記Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患は、腫瘍、緑内障から選択される。
いくつかの実施形態において、前記Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患は、緑内障から選択される。
第９態様において、本発明は、Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患を治療するための方法の保護を請求する。
本発明により請求されるＡｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患を治療するための方法は、上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡ、上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせ、上記の第３態様に記載のＤＮＡ分子、上記の第４態様に記載の発現カセット、発現ベクター、組換え細菌、組換えウイルス又はトランスジェニック細胞株、上記の第６態様に記載の組成物、或いは上記の第７態様に記載の医薬を使用してＡｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患を治療する。
ここで、前記医薬は、ＲＮＰ送達、リポソーム送達、ナノ粒子送達、ウイルス送達、細胞外小胞送達を含むがこれらに限定されない送達システムを使用して送達され得る。
本発明のいくつかの実施形態において、ウイルス送達が使用される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクター送達が使用される。さらに、いくつかの実施形態において、ＡＡＶ－ＳｈＨ１０送達が使用される。
いくつかの実施形態において、前記Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患は、腫瘍、緑内障から選択される。
いくつかの実施形態において、前記Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患は、緑内障から選択される。
本発明の標的核酸を標的とするｓｇＲＮＡの模式図である。 本発明のＡｑｐ１ ｍＲＮＡ上のいくつかのｓｇＲＮＡの標的配列の模式図１である。 本発明のＡｑｐ１ ｍＲＮＡ上のいくつかのｓｇＲＮＡの標的配列の模式図２である。 本発明のＡｑｐ１ ｍＲＮＡ上のいくつかのｓｇＲＮＡの標的配列の模式図３である。 ＲＦＺＨ－１プラスミドのマップである。 本発明のいくつかのベクターの配列決定ピークマップを例示的に示しており、ここで、Ａ～ＦはそれぞれＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡ１、２、４、７、８、９ベクターの配列決定ピークマップに対応する。 Ａｑｐ１を過剰発現するプラスミドＬｖ－Ａｑｐ１のマップである。
定義：
本明細書において使用される場合、「Ｃａｓタンパク質」、「Ｃａｓ１３タンパク質」又は「Ｃａｓ１３ヌクレアーゼ」と呼ばれるタンパク質又はポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子によってコードされるＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド又はタンパク質に関し、１つ又は複数のガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ、ｇＲＮＡ）と複合体化又は機能的に組み合わされる場合、当該Ｃａｓタンパク質又はＣａｓ１３タンパク質を標的核酸中の標的配列に誘導することができ、場合によってはその後に標的核酸を標的化又は修飾することもできる。ｇＲＮＡの誘導を通じて、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、標的核酸中の特定の標的部位（標的配列又は標的配列の近傍のヌクレオチド配列）、例えばＲＮＡ（例えば、コードＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）分子中の標的部位を認識、標的化又は修飾する。
本明細書において使用される場合、「Ｃａｓ１３タンパク質」及び「Ｃａｓ１３ヌクレアーゼ」は互換的に使用され得る。Ｃａｓ１３タンパク質としては、天然のＣａｓ１３タンパク質、人工的に改変されたＣａｓ１３タンパク質、ヌクレアーゼの活性が欠損又は低下したＣａｓ１３突然変異体、Ｃａｓ１３のコンジュゲート（例えば、核局在シグナルＮＬＳ又は核輸出シグナルＮＥＳとのコンジュゲートなどの非限定的な例）、Ｃａｓ１３の融合タンパク質（例えば、デアミナーゼとの融合によって形成される一塩基エディターなどの非限定的な例）が含まれる。
本明細書において使用される場合、「ｇＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、「ｓｇＲＮＡ」（単一分子ｇＲＮＡ）という用語は、一般に互換的に使用され得、当業者によって一般的に理解される意味を有し、ｇＲＮＡは一般に、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓ１３タンパク質に結合又は相互作用し、かつＣａｓタンパク質又はＣａｓ１３タンパク質を標的核酸／標的ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡ分子）内の特定の位置（標的配列）に誘導／標的化することを容易にすることができるＲＮＡ分子（又はＲＮＡ分子のグループの総称）を指す。ｇＲＮＡには、ガイド配列とダイレクトリピート（ＤＲ）配列が含まれる。ｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと同じ機能を提供するために、又はｇＲＮＡに新しい又は強化された機能（例えば、安定性の向上）を提供するために、１つ又は複数の修飾（例えば、塩基修飾、フレームワーク修飾、ヌクレオシド間結合の修飾など）を含んでもよい。適切なダイレクトリピート（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ、ＤＲ）配列は、原核生物（例えば、細菌、古細菌）のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座構造から見出すことができるか、又は実験的スクリーニングによって得ることができる。ダイレクトリピート配列のサイズは通常数十ｎｔ（ヌクレオチド）以内であり、その断片の一部は相補的であり、これは、ＲＮＡ分子の内部にステムループ構造（しばしばヘアピン構造と呼ばれる）などの二次構造が形成され、他の断片が非構造化として現れることを意味する。ダイレクトリピート配列はｇＲＮＡ分子の一定の部分であり、Ｃａｓ１３タンパク質とｇＲＮＡ分子との間の相互作用を促進する強力な二次構造を含む。
本明細書において使用される場合、「ガイド配列」及び「ターゲティングドメイン」という用語は互換的に使用され得、標的核酸中の標的配列に部分的又は完全に相補的であり、かつＣａｓタンパク質又はＣａｓ１３タンパク質によって促進される塩基対形成を介して標的核酸中の標的配列にハイブリダイズすることができるｇＲＮＡ中の連続ヌクレオチド配列を指す。当該標的核酸中の標的配列とハイブリダイズし、かつＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質とｓｇＲＮＡとの複合体）を当該標的配列に特異的に結合させるように誘導するのに十分な相補性がある限り、本発明に記載のガイド配列と標的配列との完全な相補性は必要ではない。
本明細書において使用される場合、「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」又は「標的ポリヌクレオチド」という用語は、標的配列を含むポリヌクレオチドを指し、本明細書においてしばしば互換的に使用され得る。標的核酸は、ＤＮＡ（標的ＤＮＡ）又はＲＮＡ（標的ＲＮＡ）などの任意のポリヌクレオチドを含むことができる。「標的核酸」とは、ｇＲＮＡによって誘導されるＣａｓタンパク質又はＣａｓ１３タンパク質によって標的化又は修飾される核酸を指す。「標的核酸」という用語は、細胞（例えば、真核細胞）にとって内因性又は外因性の任意のポリヌクレオチドであってもよい。
本明細書において使用される場合、「標的配列」という用語は、ｇＲＮＡ分子のガイド配列に相補的（完全に相補的又は部分的に相補的）であるか、又はハイブリダイズすることができる標的核酸分子中の小さな部分の配列を指す。標的配列の長さは、多くの場合、数十ｂｐであり、例えば、約１０ｂｐ、約２０ｂｐ、約３０ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約６０ｂｐであってもよい。
本明細書において使用される場合、標的核酸Ａｑｐ１ ｍＲＮＡを標的とすることに言及する場合、「標的とする」という用語は、
Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの切断、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの可視化又は検出、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの標識、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの輸送、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡのマスキング、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの転写及び／又は翻訳レベルの向上、並びにＡｑｐ１ ｍＲＮＡの転写及び／又は翻訳レベルの低下、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングの変更の１つ又は複数を含む。
例えば、一実例では、標的ＲＮＡを標的とする方法により、標的ＲＮＡ（Ａｑｐ１ ｍＲＮＡ）が検出、可視化又は標識される。突然変異したＨＥＰＮドメインを有するＣａｓ１３タンパク質、ガイドＲＮＡ、及びエフェクターモジュールを使用することにより、標的ＲＮＡはＣａｓ１３によって認識されるが、切断やニックが発生せず、同時にエフェクターモジュールが活性化される。このような方法は、例えば、眼細胞における標的ＲＮＡの存在又は標的ＲＮＡの発現のレベルを決定するために、細胞系又は無細胞系で使用することができる。一実例では、Ｃａｓ１３タンパク質は蛍光タンパク質又は他の検出可能なマーカーに融合され、標的ＲＮＡへのＣａｓ１３の結合は顕微鏡又は他のイメージング方法によって可視化され得る。
一実例では、標的ＲＮＡを標的とすることにより、標的ＲＮＡの発現を活性化又は増加させることができる。例えば、突然変異したＨＥＰＮドメインを有するＣａｓ１３を翻訳活性化ドメイン（例えば、ｅＩＦ４Ｅや他の翻訳開始因子）に融合し、ガイドＲＮＡとともに、標的ＲＮＡの発現を増加させることができる。
一実例では、標的ＲＮＡを標的とすることにより、標的ＲＮＡの発現を阻害又は低減することができる。例えば、突然変異したＨＥＰＮドメインを有するＣａｓ１３を翻訳阻害ドメイン（例えば、デアデニラーゼ）に融合し、ガイドＲＮＡとともに、標的ＲＮＡの発現を阻害することができる。
本明細書において使用される場合、標的核酸Ａｑｐ１ ｍＲＮＡを修飾することに言及する場合、「修飾する」という用語は、
Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの塩基置換、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの塩基欠失、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの塩基挿入、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡのメチル化、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの脱メチル化、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡの脱アミノ化の１つ又は複数を含む。
本明細書において使用される場合、「Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患」とは、生体内の特定の器官、特定の組織又は特定の細胞（細胞内、細胞外、又は細胞内及び細胞外の両方）のＡｑｐ１ ｍＲＮＡレベル又はＡｑｐ１タンパク質レベルが低下又は減少した場合に、その症状が緩和されるように、予防、治療が可能であるいくつかの疾患を指すことを意図する。例えば、Ａｑｐ１の機能喪失により、房水産生を減少させ、眼圧を低下させ、緑内障の治療に使用される。
本明細書において使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、ベクター中のＣａｓタンパク質若しくはＣａｓ１３タンパク質のコード配列又はｇＲＮＡのコード配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、又は当該ベクターが宿主細胞に導入される場合に、宿主細胞において発現する）方法で１つ又は複数の調節要素に連結されることを意味することを意図する。前記調節要素は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列などの転写終結シグナル）を含むことを意図する。
下記の実施例は本発明の理解を容易にするが、本発明を限定するものではない。下記の実施例において具体的な条件を示さない実験方法は、通常、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の条件、又は製造業者によって提案された条件などの従来の条件に従う。実施例で使用される各種の一般的な化学試薬は、いずれも市販品である。
実施例１、ｓｇＲＮＡベクターの設計と構築
Ａｑｐ１ ｍＲＮＡを標的とするｓｇＲＮＡを設計し、前記ｓｇＲＮＡの核酸配列は、直接連結されたターゲティングドメイン配列とフレームワーク配列とを含み、フレームワーク配列は、ターゲティングドメイン配列の５’末端に位置し、ターゲティングドメイン配列は、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡ分子上の標的配列と逆相補的であり、長さが２０～３０ｎｔである。図１に示された通りである。
本実施例におけるｓｇＲＮＡのフレームワーク配列は、５’－ＣＡＡＧＵＡＡＡＣＣＣＣＵＡＣＣＡＡＣＵＧＧＵＣＧＧＧＧＵＵＵＧＡＡＡＣ－３’（配列番号３２）である。
本発明者らが設計したｓｇＲＮＡのターゲティングドメイン配列は下記の表１に示された通りである。図２～図４は、ヒトＡｑｐ１ ｍＲＮＡ上の設計されたｓｇＲＮＡの対応する標的配列の位置を示す。
ここで、ｓｇＲＮＡ１～ｓｇＲＮＡ３１は、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＲｘシステムを介してプラスミドトランスフェクション細胞実験においてヒトＡｑｐ１ ｍＲＮＡのＣＤＳ領域を標的とするように設計された。


標的配列（ターゲティングドメインの逆相補配列）に対応するオリゴＤＮＡをそれぞれ合成し、ＢｐｉＩ制限酵素切断部位の選択に従って、ＡＡＡＣを標的配列の逆相補配列の５’末端に付加し、ＣＴＴＧを標的配列の５’末端に付加した。
上記の標的配列に対応するオリゴＤＮＡのセンス鎖と対応するアンチセンス鎖とを混合し、９５℃で５分間培養した後、氷上に置いて冷却及びアニーリングして、粘着末端を有する二本鎖ＤＮＡを形成した。
ＲＦＺＨ－１プラスミド（配列番号３３）のマップは図５に示された通りであり、本発明者らによって構築された。このプラスミドは、ＣａｓＲｘ及びｓｇＲＮＡ発現ベクターの構築に使用された。
ＲＦＺＨ－１プラスミドをＢｐｉＩ消化により直線化し、３７℃で１時間反応させた。消化産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、ゲルを切断して消化産物を回収した。
アニール産物とＲＦＺＨ－１－ＢｐｉＩ消化による直線化回収産物をＴ４リガーゼでライゲーションし、ライゲーションした産物をヒートショック法で大腸菌コンピテントセルＳｔｂｌ３に形質転換し、形質転換後、抗生物質を含まないＬＢ液体培地を遠心管に加え、３７℃、２００ｒｐｍの恒温振盪器に入れて振とう培養し、菌を復活させた。
蘇生したＳｔｂｌ３細胞をアンピシリン耐性ＬＢ寒天プレートに広げ、３７℃の恒温インキュベーター内で逆さまに培養した。上記のプレートからそれぞれ単一コロニーを選択し、５０μｌアンピシリンを含む５０ｍＬの液体ＬＢ培地に接種し、プライマーＵ６ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ－Ｆ（５’－ＧＧＧＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＴ－３’、配列番号３４）及びｆ１ｏｒｉ－Ｒ（５’－ＧＣＴＧＧＣＡＡＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＣＡ－３’、配列番号３５）を使用し、上記の細菌液をＰＣＲにより同定した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動した後、陽性クローンを含む菌液を選別し、アンピシリンを含む５０ｍＬ ＬＢ液体培地５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１６時間振とう培養した。
プラスミドを抽出し、プラスミド濃度を測定した後、プラスミドの一部をサンガー配列決定のために採取し、正確に配列決定されたプラスミドは、後で使用できるように－２０℃で保存した。
Ａｑｐ１ ｍＲＮＡを標的とするｓｇＲＮＡｎをコードする配列を含むベクターをＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡｎと命名した（ｎは数の番号であり、ｓｇＲＮＡｎは表１のｓｇＲＮＡ番号に対応した）。
図６はいくつかのベクターの配列決定ピークマップを例示的に示しており、図Ａ～ＦはそれぞれＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡ１、２、４、７、８、９ベクターの配列決定ピークマップに対応する。
実施例２、プラスミドのトランスフェクションと同定
無血清培地を使用してリポフェクタミン２０００リポソームトランスフェクション試薬を希釈し、実施例１で構築したｓｇＲＮＡがクローニングされたＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡｎ１、ＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡｎ２（ｎ１、ｎ２は表１中のｓｇＲＮＡ１～ｓｇＲＮＡ３１をコードする任意の２つのプラスミドを表した）プラスミド及びＡｑｐ１を過剰発現するＬｖ－Ａｑｐ１プラスミドを１２：１２：１（合計２５０ｎｇ）の質量比で同時トランスフェクトした。或いは、１つのｓｇＲＮＡプラスミドのみをトランスフェクトし、実施例１で構築したＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡｎ１（ｎ１は表１中のｓｇＲＮＡ１～ｓｇＲＮＡ３１をコードするいずれか１つのプラスミドを表した）及びＡｑｐ１を過剰発現するＬｖ－Ａｑｐ１プラスミドを２４：１（合計２５０ｎｇ）の質量比で２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。
陰性対照群には、ＲＦＺＨ－１プラスミド及びＬｖ－Ａｑｐ１プラスミドをトランスフェクトした。
空白対照群では、ＲＦＺＨ－１プラスミドのみをトランスフェクトした。
Ａｑｐ１を過剰発現するＬｖ－Ａｑｐ１プラスミド（配列番号３６）は本発明者らによって構築され、そのマップは図７に示された通りである。
２つのプラスミド希釈液を混合し、２０分間保温した後、複合体を２４ウェルプレートに加え、次に細胞懸濁液を複合体に加えた。
プラスミドをトランスフェクトしてから７２時間後、ＡｃｃｕｒａｔｅユニバーサルＲＮＡ抽出キットを使用して２９３Ｔ細胞の全ＲＮＡを抽出した後、Ｅｖｏ Ｍ－ＭＬＶ逆転写キットを使用してｇＤＮＡ消化及び逆転写反応を行い、対応するｃＤＮＡを得た。Ｑ－ＰＣＲ反応では、ＳＹＳＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｏ Ｔａｑ ＨＳプレミックスｑＰＣＲキットを使用し、ＧＡＰＤＨを内部参照として使用し、Ｒｏｃｈｅ ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ＩＩを使用し、各群のターゲット編集後のＡｑｐ１ ｍＲＮＡレベルを得た。Ｑ－ＰＣＲでは、各試料及びプライマーの各ペアに対して並行して３つの複製ウェルを行った。Ｑ－ＰＣＲプライマーは表２に示された通りである。
表２、２９３Ｔ細胞のＱ－ＰＣＲに使用されるプライマー

実施例３、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡ発現量の検出結果
組換えプラスミドによる細胞のトランスフェクション、ＲＮＡの抽出、逆転写によるｃＤＮＡの合成、及びｑＰＣＲでは、３回の独立した生物学的反復実験を実施し、３回の実験の平均結果を２＾－ΔΔＣｔの計算法によって得た。
Ａｑｐ１ ｍＲＮＡ発現試験の結果は下記の表３に示された通りである。結果のデータは、３回の試験結果の平均値で表された。空白対照群のＡｑｐ１ ｍＲＮＡレベルを０として計算し、陰性対照群のＡｑｐ１ ｍＲＮＡレベルを１として計算した。
表３、ＣＲＩＳＰＲシステムによる２９３Ｔ細胞編集後のＡｑｐ１ ｍＲＮＡレベル

注：＊は陰性対照群と比較して統計的差異があることを示す（Ｐ＜０．０５）。
表３のデータは、本発明者らがｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ１３システムを通じてＡｑｐ１ ｍＲＮＡの発現レベルを有意に減少させたことを示している。
ヒト２９３Ｔ細胞では、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡに対する最も強いノックダウン効果はｓｇＲＮＡ １～２、４～５、７～１０、１２、１４～１５、１７～１８、２０～２１、２３～２４、２６、２８、３０～３１であり、続いてｓｇＲＮＡ ３、６、１１、１３、１６、１９、２２、２５、２７、２９である。
以上のことから、本発明者らは、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３システムの構築に成功し、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡのレベルを効果的に低下させることができる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３によりＡｑｐ１ ｍＲＮＡを標的とすることは、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓによりＡｑｐ１ ＤＮＡを直接標的とすることよりも安全である。
実施例４、動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ薬効試験
実施例１の方法を使用して、ＣａｓＲｘ、ｓｇＲＮＡ Ｃ（Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスＡｑｐ１ ｍＲＮＡを標的とした）を発現できるＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡ Ｃプラスミド（その後の陽性対照に使用した）及びＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡ ２１プラスミド（マウスＡｑｐ１ ｍＲＮＡを標的とした）を構築した。ｓｇＲＮＡ Ｃのターゲティングドメイン配列は５’－ＡＣＵＵＵＧＧＧＣＣＡＧＡＧＵＡＧＣＧＡＵ－３’（配列番号４１）であった。
試薬会社では、通常のトリプルトランスフェクション（Ｔｒｉｐｌｅ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）法を使用し、ＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡ ２１又はＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡ Ｃプラスミド、ｓｈｈ１０プラスミド（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃６４８６７）、及び補助プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１１２８６７）をトランスフェクトすることにより、２９３Ｔ細胞で培養し、分離して血清型ＡＡＶ－ＳｈＨ１０（真核細胞内でＣＭＶの駆動によってＣａｓＲｘを発現し、Ｕ６の駆動によってｓｇＲＮＡ ２１又はｓｇＲＮＡ Ｃを発現できた）を得、当該ＡＡＶ－ＳｈＨ１０のキャプシドにパッケージされた配列は、ＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡ ２１又はＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡ ＣプラスミドにおけるＩＴＲ及びそれらの間の配列であった。
上記のトリプルトランスフェクション法に従って、ｇＲＮＡ空プラスミド（ＲＦＺＨ－１）、ｓｈｈ１０プラスミド（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃６４８６７）、補助プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１１２８６７）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、培養し、分離してｓｇＲＮＡ空（ＣＭＶの駆動によってＣａｓＲｘを発現し、Ｕ６の駆動によって発現されたｇＲＮＡはＡｑｐ１を標的とした代わりにトラフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ）のＲＮＡ配列を標的とした）のＡＡＶ－ＳｈＨ１０を得た。
また、上記のトリプルトランスフェクション法を使用し、ＧＦＰプラスミド（配列番号４２）、ｓｈｈ１０プラスミド（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃６４８６７）、補助プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１１２８６７）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、培養し、分離してＧＦＰ（ＣＭＶ駆動発現）を発現できるＡＡＶ－ＳｈＨ１０を得、ＧＦＰ－ＡＡＶ又はＳｈＨ１０－ＧＦＰと呼ばれた。
眼圧が安定している正常な６週齢オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス１０匹を選択し、そのうち５匹のマウスの左目の硝子体にｓｇＲＮＡ ２１を発現するＡＡＶ（２×１０９ ＧＣ ＡＡＶ）及びＧＦＰ ＡＡＶ（２×１０８ ＧＣ ＡＡＶ）を注射し、別の５匹のマウスの左目の硝子体にｓｇＲＮＡ Ｃを発現するＡＡＶ（２×１０９ ＧＣ ＡＡＶ）及びＧＦＰ ＡＡＶ（２×１０８ ＧＣ ＡＡＶ）を注射した。すべての１０匹のマウスの右目の硝子体にｓｇＲＮＡ空ＡＡＶ（２×１０９ ＧＣ ＡＡＶ）及びＧＦＰ ＡＡＶ（２×１０８ ＧＣ ＡＡＶ）を注射した。ここで、ＧＣ＝ゲノムコピー（Ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｉｅｓ）であった。下記の表４に示された通りである。
表４、動物実験の群分け

注射から１週間後、毛様体におけるＧＦＰの被覆率を検出した。ＧＦＰの分布を蛍光検出により検出し、薬物注射が成功したことを示した。注射から３週間後、Ｉｃａｒｅ（登録商標）ＴＯＮＯＬＡＢ眼圧計を使用して両目の眼圧を測定した。各マウスのどちらかの目の眼圧を６回連続的に検査した。結果は下記の表５及び表６に示された通りである。
表５、ｓｇＲＮＡ ２１ ＡＡＶ注射３週間後のマウスの眼圧検査の結果


注：＊は実験群の平均値は陰性対照群の平均値と比較して統計的差異があることを示す（Ｐ＜０．０５）。
表６、ｓｇＲＮＡ Ｃ ＡＡＶ注射３週間後のマウスの眼圧検査の結果


注：＊は実験群の平均値は陰性対照群の平均値と比較して統計的差異があることを示す（Ｐ＜０．０５）。
表５に示すように、ｓｇＲＮＡ ２１は、空のマウスと比較してマウスの眼圧を効果的に低下させることができる。表６は、ｓｇＲＮＡ Ｃが空のマウスと比較してマウスの眼圧を効果的に低下させることができることを示す。従って、ｓｇＲＮＡ２１及びｓｇＲＮＡ Ｃは、緑内障の治療に使用することができる。
眼圧低下の大きさから判断すると、本発明のｓｇＲＮＡ ２１はｓｇＲＮＡ Ｃよりも効果的である。
実施例５、オフターゲットの検出
１、ＥＭＢＯＳＳ－ｗａｔｅｒプログラム及びＮＣＢＩ－Ｂｌａｓｔプログラムにより、標的種（ＩＣＲマウス）の全ゲノム及び全ｃＤＮＡ配列において予測し、それぞれ表１のｓｇＲＮＡ５及びｓｇＲＮＡ３１ガイド配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖を使用して比較し、予測結果をフィルタリングし、予測されたターゲットの長さとｓｇＲＮＡガイド配列の長さの差が４塩基を超えないこと、及びミスマッチ＋ギャップ（ｍｉｓｍａｔｃｈ＋ｇａｐ）が４塩基を超えないことに従ってフィルタリングし、潜在的なオフターゲット情報は下記の通りである：
ｓｇＲＮＡ５：１２５個の潜在的なオフターゲット遺伝子、２５５個の潜在的なオフターゲット転写産物。
ｓｇＲＮＡ３１：１２８５個の潜在的なオフターゲット遺伝子、２４９６個の潜在的なオフターゲット転写産物。
２、オスのＩＣＲマウスの両目の硝子体にＡＡＶ ＳｈＨ１０を投与した。
ＣａｓＲｘ、ｓｇＲＮＡ５及びｓｇＲＮＡ３１を発現できるＡＡＶ ＳｈＨ１０の場合、その製造方法は下記の通りである：通常のトリプルトランスフェクション（Ｔｒｉｐｌｅ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）法を使用する、即ち、ＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡ５＋３１プラスミド（配列番号４３）、ｓｈｈ１０プラスミド（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃６４８６７）、及び補助プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１１２８６７）をトランスフェクトすることにより、２９３Ｔ細胞で培養し、分離して、ＣＭＶの駆動によってＣａｓＲｘを発現でき、Ｕ６の駆動によってｓｇＲＮＡ５及びｓｇＲＮＡ３１を発現できる血清型ＡＡＶ－ＳｈＨ１０が得られ、ＳｈＨ１０－ＣＲＩＳＰＲと命名された。
ＧＦＰを発現できる別のＡＡＶ ＳｈＨ１０の場合、その製造方法は下記の通りである：通常のトリプルトランスフェクション（Ｔｒｉｐｌｅ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）法を使用する、即ち、ＧＦＰプラスミド（配列番号４２）、ｓｈｈ１０プラスミド（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃６４８６７）、及び補助プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１１２８６７）をトランスフェクトすることにより、２９３Ｔ細胞で培養し、分離して、ＧＦＰ（ＣＭＶ駆動発現）を発現できるＡＡＶ－ＳｈＨ１０が得られ、ＳｈＨ１０－ＧＦＰと呼ばれた。
実験群の６匹のマウスの各目にＳｈＨ１０－ＣＲＩＳＰＲ（力価：１Ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌ）とＳｈＨ１０－ＧＦＰ（力価：１Ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌ）を合計２μＬ（体積比：１０：１）で同時に投与し、対照群の６匹のマウスの各目に２μＬのＳｈＨ１０－ＧＦＰ（力価：１Ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌ）を投与した。２７日後、完全な網膜試料を採取し、フェノール・クロロホルム法を使用して試料の全ＲＮＡを抽出し、ＰＥ１５０ｂｐ ＲＮＡ－Ｓｅｑシーケンスを行い、シーケンスにより得られたｆａｓｔｑファイルをＨＩＳＡＴ２及びＳＴＡＲソフトウェアにより標的種（ＩＣＲマウス）の参照ゲノムと比較し、比較後のＢＡＭファイルを得た。ｋａｌｌｉｓｔｏ、ＲＳＥＭ及びＨＴＳｅｑを使用し、転写産物及び各遺伝子の発現量を検出した。
３、ＤＥＳｅｑ２、ｌｉｍｍａ－ｖｏｏｍ、ｅｄｇｅｒを使用して各群間の発現量の差異分析を行い、ｐ．ａｄｊ＜０．０５、｜ｌｏｇ２ＦｏｌｄＣｈａｎｇｅ｜＞＝０．７５、ｂａｓｅｍｅａｎ＞２．５を満たすものを発現差遺伝子（ＤＥＧ）とし、ＤＥＧ情報の合計は下記の通りである：
７３個の有意にアップレギュレーションされたＤＥＧ；８０個の有意にダウンレギュレーションされた転写産物。
３９個の有意にダウンレギュレーションされたＤＥＧ；４２個の有意にダウンレギュレーションされた転写産物。
４、発現差のある遺伝子の中で有意にダウンレギュレーションされた遺伝子と予測される潜在的なオフターゲット遺伝子の交点を取り、より信頼性の高いオフターゲット遺伝子とした。関連情報は下記の通りである：
０個のｓｇＲＮＡ５関連オフターゲット遺伝子、０個の関連転写産物。
６個のｓｇＲＮＡ３１関連オフターゲット遺伝子、６個の関連転写産物。
従って、オフターゲット編集の観点から、ｓｇＲＮＡ５はｓｇＲＮＡ３１よりも安全であることがわかった。
上記の実施形態は本発明の好ましい実施形態であるが、本発明の実施形態は上記の実施形態によって限定されるものではなく、本発明の精神及び原理を逸脱することなく、その他の変更、修正、置換、組み合わせ、及び簡略化は同等の置換方法であるべきであり、すべて本発明の保護範囲に含まれる。
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを初めて使用し、ヒトＡｑｐ１ ｍＲＮＡ配列を標的とするｓｇＲＮＡを提供し、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡレベルの有意なダウンレギュレーションを達成した。ベクターを使用して細胞に送達された後、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡを標的とし、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡレベルを低下させる。ｓｇＲＮＡは、Ａｑｐ１の過剰発現に関連する疾患（がん、緑内障を含む）を含むがこれらに限定されない、Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患の治療、又はＡｑｐ１の通常の発現レベルをダウンレギュレーションすることによって関連疾患を治療するために使用することができる。本発明により提供されるＡｑｐ１遺伝子のｍＲＮＡ配列を標的とするｓｇＲＮＡは、Ａｑｐ１遺伝子を直接標的とするものより安全である。本発明のｓｇＲＮＡは、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡレベルを効果的に低下させることができる。設計を通じて、本発明者らは、いくつかのｓｇＲＮＡ標的部位の近くで有意により優れた効果を有するｓｇＲＮＡを発見し、これはＡｑｐ１ ｍＲＮＡレベルをより効果的に低下させることができる。
本発明は、生物医学の技術分野に関し、特にＡｑｐ１ ＲＮＡを標的とするｓｇＲＮＡ及びそのベクターと使用に関する。
アクアポリン１（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ １、Ａｑｐ１）は、体内に広く分布している膜貫通タンパク質の一種である。主に体内の水分輸送の調節に関与しているが、血管新生、細胞移動、及び細胞増殖のプロセスにも重要な役割を果たしている。ＭｅｉｒａＧＴｘ社は遺伝子治療製品ＡＡＶ－Ａｑｐ１を開発した。ＡＡＶベクターを介して損傷した唾液腺でＡｑｐ１遺伝子を過剰発現させることによって放射線誘発性口腔乾燥症（Ｒａｄｉａｔｉｏｎ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｘｅｒｏｓｔｏｍｉａ、ＲＩＸ）を治療する。ＭｅｉｒａＧＴｘ社は現在、ＡＡＶ－Ａｑｐ１遺伝子医薬の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験を行っている。また、Ａｑｐ１は緑内障の発症に関連していることがわかった。
緑内障（Ｇｌａｕｃｏｍａ）は、網膜神経節細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｌ、ＲＧＣ）のアポトーシスとその軸索の変性を病理学的特徴とする神経変性疾患である。神経節細胞のアポトーシスは、主に眼圧（Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ、ＩＯＰ）に関連している。ＩＯＰは主に房水によって維持されるが、房水の生成組織である毛様体（Ｃｉｌｉａｒｙ ｂｏｄｙ、ＣＢ）、及び房水の主な排出組織である小柱網（Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ、ＴＭ）が故障すると、房水の循環系に故障が生じ、最終的にＩＯＰが上昇し、ＲＧＣが圧迫され、最終的には不可逆的な視野の欠損に至ることがある。Ａｑｐ１の機能喪失は房水産生を減少させ、眼圧を低下させる。現在、眼圧を下げることは依然として緑内障を治療するための通常の方法である。
緑内障による視野損傷は不可逆的であるため、現在緑内障を治療するための医薬の主な役割は眼圧（ＩＯＰ）を下げることである。現在、ＩＯＰを下げる医薬には、α－アドレナリン作動薬、β－アドレナリン拮抗薬、コリン作動薬、プロスタグランジン、及び炭酸脱水酵素阻害薬の５つの主要なクラスがある。主に点眼薬の形で投与されるが、頻繁に投与する必要があり、一定の副作用もある。蘇州瑞博生物技術有限公司（Ｓｕｚｈｏｕ Ｒｉｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）は、視神経保護のための革新的なｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）核酸薬ＱＰＩ－１００７を開発し、現在、第ＩＩ／ＩＩＩ相臨床試験の世界的な重要な研究中である。この薬は、アポトーシス促進タンパク質カスパーゼ２の発現を一時的に阻害するように設計されている。また、網膜神経節細胞ＲＧＣのアポトーシスを防ぎ、それによって視野の損傷を軽減する。
研究によると、Ａｑｐ１の発現を減らすと、血管新生を減らし、腫瘍の進行を遅らせることもできる（Ｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２０１０， ２９４（２）：１３５－１３８）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）システムは現在最も広く応用されている遺伝子編集技術である。従来技術において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用してＡｑｐ１遺伝子を編集したことがある。また、従来技術は、Ａｑｐ１遺伝子のエクソン領域を標的とし、ゲノムＤＮＡを切断する。
本発明の目的は、ヒトＡｑｐ１ ＲＮＡを標的とすることができるｓｇＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ、シングル分子ｇＲＮＡ）及びそのベクターと使用を提供することである。前記Ａｑｐ１ ＲＮＡは、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡでも、Ａｑｐ１ ｐｒｅ－ｍＲＮＡでも、Ａｑｐ１ ｍＲＮＡとＡｑｐ１ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの両方でもよい。
第１態様において、本発明はｓｇＲＮＡの保護を請求する。
本発明により請求されるｓｇＲＮＡは、ヒトＡｑｐ１ ＲＮＡを標的とすることができる。
図１に示すように、前記ｓｇＲＮＡは、ターゲティングドメイン（ガイド配列）とフレームワークドメイン（フレームワーク配列）とを含む。前記ターゲティングドメインは、標的核酸Ａｑｐ１ ＲＮＡ配列に相補的（完全に相補的又は部分的に相補的）であり、前記フレームワーク配列は、Ｃａｓタンパク質に結合又は相互作用することができる。当業者は、必要に応じて前記ガイド配列を前記フレームワーク配列の５’末端又は３’末端に連結することができる。
ここで、前記Ｃａｓタンパク質は、好ましくはＣａｓ１３タンパク質である。前記Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１３ｅ又はＣａｓ１３ｆタンパク質である。
いくつかの実施形態において、前記ターゲティングドメインの配列は、配列番号１～配列番号３１のいずれか１つに示される配列を含む。あるいは、いくつかの実施形態では、前記ターゲティングドメインは、配列番号１～配列番号３１に示される配列のうちいずれかに対して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、又は１００％の配列同一性を有する配列を有する。
いくつかの実施形態において、前記ターゲティングドメインの配列は、配列番号１～配列番号３１のいずれか１つから選択される。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡのターゲティングドメインの配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１のいずれか１つに示される配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡのターゲティングドメインの配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１のいずれか１つから選択される。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡのターゲティングドメインの配列は、配列番号２、配列番号５、配列番号２１、配列番号２４、配列番号３１のいずれか１つから選択される。
本発明に記載のｓｇＲＮＡのフレームワーク配列は、通常の方法に従って設計してもよい。
前記フレームワーク配列は、異なるＣａｓタンパク質によって異なる選択が可能であり、これは当業者によって容易に実現することができる。いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１３ｅ又はＣａｓ１３ｆに対応するｇＲＮＡフレームワーク配列を使用する。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼ又はＣａｓ１３ヌクレアーゼをコードする核酸分子と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼと組み合わせて使用される。いくつかの実施形態において、前記Ｃａｓ１３ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１３ｅ又はＣａｓ１３ｆである。
前記Ｃａｓ１３ヌクレアーゼとしては、天然のＣａｓ１３タンパク質、人工的に改変されたＣａｓ１３タンパク質、ヌクレアーゼの活性が欠損又は低下したＣａｓ１３突然変異体（例えば、ＨＥＰＮドメインの突然変異、ＲｘｘｘｘＨモチーフの突然変異）、Ｃａｓ１３のコンジュゲート（例えば、核局在シグナルＮＬＳ又は核輸出シグナルＮＥＳとのコンジュゲートなどの非限定的な例）、Ｃａｓ１３の融合タンパク質（例えば、デアミナーゼとの融合によって形成される一塩基エディターなどの非限定的な例）が含まれる。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ａヌクレアーゼと組み合わせて使用され、前記ｓｇＲＮＡのフレームワーク配列は、ガイド配列の５’末端に位置する。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ｂヌクレアーゼと組み合わせて使用され、前記ｓｇＲＮＡのフレームワーク配列は、ガイド配列の３’末端に位置する。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ｃヌクレアーゼと組み合わせて使用され、前記ｓｇＲＮＡのフレームワーク配列は、ガイド配列の５’末端に位置する。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ｄヌクレアーゼと組み合わせて使用され、前記ｓｇＲＮＡのフレームワーク配列は、ガイド配列の５’末端に位置する。
いくつかの実施形態において、前記Ｃａｓ１３ｄヌクレアーゼはＣａｓＲｘである。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼに結合又は相互作用することができる。即ち、ｓｇＲＮＡのフレームワーク配列を介してＣａｓ１３ヌクレアーゼに結合又は相互作用する。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼと複合体を形成することができる。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼを標的核酸Ａｑｐ１ ＲＮＡに誘導することができる。即ち、ｓｇＲＮＡのターゲティングドメインと標的核酸Ａｑｐ１ ＲＮＡ配列との相補（完全相補又は部分相補）を介して、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼを標的核酸Ａｑｐ１ ＲＮＡの標的配列に誘導する。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼを標的核酸Ａｑｐ１ ＲＮＡに誘導し、かつ前記標的核酸Ａｑｐ１ ＲＮＡを標的化又は修飾することができる。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼと複合体を形成することができ、前記複合体は、標的核酸Ａｑｐ１ ＲＮＡを標的化又は修飾する。
いくつかの実施形態において、前記標的核酸Ａｑｐ１ ＲＮＡを標的とすることは、
Ａｑｐ１ ＲＮＡの切断、Ａｑｐ１ ＲＮＡの可視化又は検出、Ａｑｐ１ ＲＮＡの標識、Ａｑｐ１ ＲＮＡの輸送、Ａｑｐ１ ＲＮＡのマスキング、Ａｑｐ１ ＲＮＡの転写及び／又は翻訳レベルの向上、並びにＡｑｐ１ ＲＮＡの翻訳レベルの低下の１つ又は複数から選択される。
いくつかの実施形態において、前記標的核酸を修飾することは、
Ａｑｐ１ ＲＮＡの塩基置換、Ａｑｐ１ ＲＮＡの塩基欠失、Ａｑｐ１ ＲＮＡの塩基挿入、Ａｑｐ１ ＲＮＡのメチル化、Ａｑｐ１ ＲＮＡの脱メチル化、及びＡｑｐ１ ＲＮＡの脱アミノ化の１つ又は複数から選択される。
本発明のｓｇＲＮＡは、任意のヌクレオチド上で好適に化学修飾することができる。
第２態様において、本発明はｓｇＲＮＡの組み合わせの保護を請求する。
本発明により請求されるｓｇＲＮＡの組み合わせは、第１態様からの任意の２つの異なる前記ｓｇＲＮＡから構成されてもよい。
ここで、前記「第１態様からの任意の２つの異なる前記ｓｇＲＮＡ」のターゲティングドメインの配列は、配列番号１～配列番号３１のいずれか２つから選択される。
好ましくは、いくつかの実施形態において、前記「第１態様からの任意の２つの異なる前記ｓｇＲＮＡ」のターゲティングドメインの配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１のいずれか２つから選択される。
より好ましくは、いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡの組み合わせは、下記のいずれか１つから選択される：
Ｐ１、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号５である前記ｓｇＲＮＡ；
Ｐ２、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２１である前記ｓｇＲＮＡ；
Ｐ３、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２４である前記ｓｇＲＮＡ；
Ｐ４、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡ；
Ｐ５、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号５である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２１である前記ｓｇＲＮＡ；
Ｐ６、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号５である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２４である前記ｓｇＲＮＡ；
Ｐ７、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号５である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡ；
Ｐ８、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２１である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２４である前記ｓｇＲＮＡ；
Ｐ９、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２１である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡ；
Ｐ１０、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２４である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡ。
第３態様において、本発明は、上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡ又は上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせをコードするＤＮＡ分子の保護を請求する。
第４態様において、本発明は、上記の第３態様に記載のＤＮＡ分子を含む発現カセット、発現ベクター、組換え細菌、組換えウイルス又はトランスジェニック細胞株の保護を請求する。
いくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、第１態様に記載のｓｇＲＮＡをコードする２つ以上のヌクレオチド配列を含む。
上記の発現ベクターは、Ａｑｐ１ ＲＮＡを標的とするためのｓｇＲＮＡを発現することができ、当業者は通常の技術を参照して構築することができることが理解できる。
いくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。前記ヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。前記発現ベクターは、Ａｑｐ１ ＲＮＡを標的とするためのｓｇＲＮＡ及びＣａｓ１３ヌクレアーゼを発現することができ、当業者は通常の技術を参照して構築することができることが理解される。
ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列、及びＣａｓ１３ヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列は、同一の発現ベクターに位置していてもよいし、異なる発現ベクターに位置していてもよい。
第５態様において、本発明はキットの保護を請求する。
本発明により請求されるキットは、下記のいずれか１つを含んでもよい：
ｉ、Ｃａｓタンパク質、及び上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡ；
ｉｉ、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター１、及び上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡ；
ｉｉｉ、Ｃａｓタンパク質、及び上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター２；
ｉｖ、前記発現ベクター１及び前記発現ベクター２；
ｖ、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とを含む発現ベクター３；
ｖｉ、Ｃａｓタンパク質、及び上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせ；
ｖｉｉ、前記発現ベクター１、及び上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせ；
ｖｉｉｉ、Ｃａｓタンパク質及び発現ベクター４；前記発現ベクター４は上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの２つのｓｇＲＮＡすべてをコードするヌクレオチド配列を含む；
ｉｘ、Ｃａｓタンパク質、発現ベクター５及び発現ベクター６；前記発現ベクター５は上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせのいずれか１つのｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む；前記発現ベクター６は上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの他のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む；
ｘ、前記発現ベクター１及び前記発現ベクター４；
ｘｉ、前記発現ベクター１、前記発現ベクター５及び前記発現ベクター６；
ｘｉｉ、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの２つのｓｇＲＮＡすべてをコードするヌクレオチド配列とを含む発現ベクター７；
ｘｉｉｉ、発現ベクター８及び発現ベクター９；前記発現ベクタ８はＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせのいずれか１つのｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とを含む；前記発現ベクター９は上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの他のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む；
前記Ｃａｓタンパク質は、前記ｓｇＲＮＡに結合又は相互作用することができる。
いくつかの実施形態において、前記Ｃａｓタンパク質はＣａｓ１３タンパク質である。
いくつかの実施形態において、前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１３ｅ又はＣａｓ１３ｆである。
いくつかの実施形態において、前記キットは、下記のいずれか１つを含む：
ｉ、Ｃａｓ１３タンパク質、及び上記のターゲティングドメインの配列が配列番号５、配列番号２１、配列番号２４又は配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡ；
ｉｉ、Ｃａｓ１３タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター１、及び上記のターゲティングドメインの配列が配列番号５、配列番号２１、配列番号２４又は配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡ；
ｉｉｉ、Ｃａｓ１３タンパク質、及び上記のターゲティングドメインの配列が配列番号５、配列番号２１、配列番号２４又は配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター２；
ｉｖ、前記発現ベクター１及び前記発現ベクター２；
ｖ、Ｃａｓ１３タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、上記のターゲティングドメインの配列が配列番号５、配列番号２１、配列番号２４又は配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とを含む発現ベクター３；
前記Ｃａｓ１３タンパク質は、前記ｓｇＲＮＡに結合又は相互作用することができる。
いくつかの実施形態において、第５態様の発現ベクターにおけるｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列及び／又はＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。前記発現ベクターは、細胞（ヒト細胞を含むがこれに限定されない）においてＡｑｐ１ ＲＮＡを標的とするためのｓｇＲＮＡ及び／又はＣａｓタンパク質を発現することができる。
前記キットは、Ａｑｐ１の発現量を有意にダウンレギュレーションするために使用することができる。
第６態様において、本発明は組成物の保護を請求する。
本発明により請求される組成物は、下記のいずれか１つから選択されてもよい：
Ｉ、Ｃａｓタンパク質と、上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡとを含む組成物；
ＩＩ、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸分子１と、上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡとを含む組成物；
ＩＩＩ、Ｃａｓタンパク質と、上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡをコードする核酸分子２とを含む組成物；
ＩＶ、前記核酸分子１と前記核酸分子２とを含む組成物；
Ｖ、Ｃａｓタンパク質及び上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡをコードする核酸分子３を含む組成物；
ＶＩ、Ｃａｓタンパク質と、上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせとを含む組成物；
ＶＩＩ、前記核酸分子１と、上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせとを含む組成物；
ＶＩＩＩ、Ｃａｓタンパク質と核酸分子４とを含む組成物；前記核酸分子４は上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの２つのｓｇＲＮＡすべてをコードする；
ＩＸ、Ｃａｓタンパク質と、核酸分子５と核酸分子６とを含む組成物；前記核酸分子５は上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせのいずれか１つのｓｇＲＮＡをコードする；前記核酸分子６は上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの他のｓｇＲＮＡをコードする；
Ｘ、前記核酸分子１と前記核酸分子４とを含む組成物；
ＸＩ、前記核酸分子１と、前記核酸分子５と前記核酸分子６とを含む組成物；
ＸＩＩ、Ｃａｓタンパク質及び上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの２つのｓｇＲＮＡすべてをコードする核酸分子７を含む組成物；
ＸＩＩＩ、核酸分子８と核酸分子９とを含む組成物；前記核酸分子８はＣａｓタンパク質及び上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせのいずれか１つのｓｇＲＮＡをコードする；前記核酸分子９は上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの他のｓｇＲＮＡをコードする。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは前記Ｃａｓタンパク質に結合又は相互作用することができる。即ち、ｓｇＲＮＡのフレームワーク配列を介して前記Ｃａｓタンパク質に結合又は相互作用する。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成することができる。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、前記Ｃａｓタンパク質を標的核酸Ａｑｐ１ ＲＮＡに誘導することができる。即ち、ｓｇＲＮＡのターゲティングドメインと標的核酸Ａｑｐ１ ＲＮＡ配列との相補（完全相補又は部分相補）を介して、前記Ｃａｓタンパク質を標的核酸Ａｑｐ１ ＲＮＡの標的配列に誘導する。
いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、前記Ｃａｓタンパク質を標的核酸Ａｑｐ１ ＲＮＡに誘導し、かつ前記標的核酸Ａｑｐ１ ＲＮＡを標的化又は修飾することができる。
いくつかの実施形態において、前記Ｃａｓタンパク質はＣａｓ１３タンパク質である。
いくつかの実施形態において、前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１３ｅ又はＣａｓ１３ｆである。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、下記のいずれか１つから選択される：
Ｉ、Ｃａｓ１３タンパク質と、上記の第１態様に記載のターゲティングドメインの配列が配列番号５、配列番号２１、配列番号２４又は配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡとを含む組成物；
ＩＩ、Ｃａｓ１３タンパク質をコードする核酸分子１と、上記のターゲティングドメインの配列が配列番号５、配列番号２１、配列番号２４又は配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡとを含む組成物；
ＩＩＩ、Ｃａｓ１３タンパク質と、上記の第１態様に記載のターゲティングドメインの配列が配列番号５、配列番号２１、配列番号２４又は配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡをコードする核酸分子２とを含む組成物；
ＩＶ、前記核酸分子１と、前記核酸分子２とを含む組成物；
Ｖ、Ｃａｓ１３タンパク質及び上記の第１態様に記載のターゲティングドメインの配列が配列番号５、配列番号２１、配列番号２４又は配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡをコードする核酸分子３を含む組成物；
前記Ｃａｓ１３タンパク質は、前記ｓｇＲＮＡに結合又は相互作用することができる。
いくつかの実施形態において、第６態様の核酸分子におけるｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列及び／又はＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。前記核酸分子は、細胞（ヒト細胞を含むがこれに限定されない）においてＡｑｐ１ ＲＮＡを標的とするためのｓｇＲＮＡ及び／又はＣａｓタンパク質を発現することができる。
前記組成物は、Ａｑｐ１の発現量を有意にダウンレギュレーションするために使用することができる。
第７態様において、本発明は医薬の保護を請求する。
本発明により請求される医薬は、上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡ、上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせ、上記の第３態様に記載のＤＮＡ分子、上記の第４態様に記載の発現カセット、発現ベクター、組換え細菌、組換えウイルス又はトランスジェニック細胞株、或いは上記の第６態様に記載の組成物、及び薬学的に許容される補助材を含む。
いくつかの実施形態において、前記医薬は、ＲＮＰ送達、リポソーム送達、ナノ粒子送達、ウイルス送達、細胞外小胞送達を含むがこれらに限定されない送達システムを使用して送達され得る。
本発明のいくつかの実施形態において、ウイルス送達が使用される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶウイルスベクター送達が使用される。さらに、いくつかの実施形態において、ＡＡＶ－ＳｈＨ１０送達が使用される。
第８態様において、本発明は、下記のいずれか１つにおける、上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡ、上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせ、上記の第３態様に記載のＤＮＡ分子、上記の第４態様に記載の発現カセット、発現ベクター、組換え細菌、組換えウイルス又はトランスジェニック細胞株、上記の第６態様に記載の組成物、或いは上記の第７態様に記載の医薬の使用の保護を請求する：
Ｑ１、Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患を治療するための医薬の製造；
Ｑ２、Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患の治療。
いくつかの実施形態において、前記Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患は、腫瘍、緑内障から選択される。
いくつかの実施形態において、前記Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患は、緑内障から選択される。
第９態様において、本発明は、Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患を治療するための方法の保護を請求する。
本発明により請求されるＡｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患を治療するための方法は、上記の第１態様に記載のｓｇＲＮＡ、上記の第２態様に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせ、上記の第３態様に記載のＤＮＡ分子、上記の第４態様に記載の発現カセット、発現ベクター、組換え細菌、組換えウイルス又はトランスジェニック細胞株、上記の第６態様に記載の組成物、或いは上記の第７態様に記載の医薬を使用してＡｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患を治療する。
ここで、前記医薬は、ＲＮＰ送達、リポソーム送達、ナノ粒子送達、ウイルス送達、細胞外小胞送達を含むがこれらに限定されない送達システムを使用して送達され得る。
本発明のいくつかの実施形態において、ウイルス送達が使用される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクター送達が使用される。さらに、いくつかの実施形態において、ＡＡＶ－ＳｈＨ１０送達が使用される。
いくつかの実施形態において、前記Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患は、腫瘍、緑内障から選択される。
いくつかの実施形態において、前記Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患は、緑内障から選択される。
本発明の標的核酸を標的とするｓｇＲＮＡの模式図である。 本発明のＡｑｐ１ ＲＮＡ上のいくつかのｓｇＲＮＡの標的配列の模式図１である。 本発明のＡｑｐ１ ＲＮＡ上のいくつかのｓｇＲＮＡの標的配列の模式図２である。 本発明のＡｑｐ１ ＲＮＡ上のいくつかのｓｇＲＮＡの標的配列の模式図３である。 ＲＦＺＨ－１プラスミドのマップである。 本発明のいくつかのベクターの配列決定ピークマップを例示的に示しており、ここで、Ａ～ＦはそれぞれＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡ１、２、４、７、８、９ベクターの配列決定ピークマップに対応する。 Ａｑｐ１を過剰発現するプラスミドＬｖ－Ａｑｐ１のマップである。
定義：
本明細書において使用される場合、「Ｃａｓタンパク質」、「Ｃａｓ１３タンパク質」又は「Ｃａｓ１３ヌクレアーゼ」と呼ばれるタンパク質又はポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子によってコードされるＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド又はタンパク質に関し、１つ又は複数のガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ、ｇＲＮＡ）と複合体化又は機能的に組み合わされる場合、当該Ｃａｓタンパク質又はＣａｓ１３タンパク質を標的核酸中の標的配列に誘導することができ、場合によってはその後に標的核酸を標的化又は修飾することもできる。ｇＲＮＡの誘導を通じて、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、標的核酸中の特定の標的部位（標的配列又は標的配列の近傍のヌクレオチド配列）、例えばＲＮＡ（例えば、コードＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）分子中の標的部位を認識、標的化又は修飾する。
本明細書において使用される場合、「Ｃａｓ１３タンパク質」及び「Ｃａｓ１３ヌクレアーゼ」は互換的に使用され得る。Ｃａｓ１３タンパク質としては、天然のＣａｓ１３タンパク質、人工的に改変されたＣａｓ１３タンパク質、ヌクレアーゼの活性が欠損又は低下したＣａｓ１３突然変異体、Ｃａｓ１３のコンジュゲート（例えば、核局在シグナルＮＬＳ又は核輸出シグナルＮＥＳとのコンジュゲートなどの非限定的な例）、Ｃａｓ１３の融合タンパク質（例えば、デアミナーゼとの融合によって形成される一塩基エディターなどの非限定的な例）が含まれる。
本明細書において使用される場合、「ｇＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、「ｓｇＲＮＡ」（単一分子ｇＲＮＡ）という用語は、一般に互換的に使用され得、当業者によって一般的に理解される意味を有し、ｇＲＮＡは一般に、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓ１３タンパク質に結合又は相互作用し、かつＣａｓタンパク質又はＣａｓ１３タンパク質を標的核酸／標的ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡ分子）内の特定の位置（標的配列）に誘導／標的化することを容易にすることができるＲＮＡ分子（又はＲＮＡ分子のグループの総称）を指す。ｇＲＮＡには、ガイド配列とダイレクトリピート（ＤＲ）配列が含まれる。ｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと同じ機能を提供するために、又はｇＲＮＡに新しい又は強化された機能（例えば、安定性の向上）を提供するために、１つ又は複数の修飾（例えば、塩基修飾、フレームワーク修飾、ヌクレオシド間結合の修飾など）を含んでもよい。適切なダイレクトリピート（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ、ＤＲ）配列は、原核生物（例えば、細菌、古細菌）のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座構造から見出すことができるか、又は実験的スクリーニングによって得ることができる。ダイレクトリピート配列のサイズは通常数十ｎｔ（ヌクレオチド）以内であり、その断片の一部は相補的であり、これは、ＲＮＡ分子の内部にステムループ構造（しばしばヘアピン構造と呼ばれる）などの二次構造が形成され、他の断片が非構造化として現れることを意味する。ダイレクトリピート配列はｇＲＮＡ分子の一定の部分であり、Ｃａｓ１３タンパク質とｇＲＮＡ分子との間の相互作用を促進する強力な二次構造を含む。
本明細書において使用される場合、「ガイド配列」及び「ターゲティングドメイン」という用語は互換的に使用され得、標的核酸中の標的配列に部分的又は完全に相補的であり、かつＣａｓタンパク質又はＣａｓ１３タンパク質によって促進される塩基対形成を介して標的核酸中の標的配列にハイブリダイズすることができるｇＲＮＡ中の連続ヌクレオチド配列を指す。当該標的核酸中の標的配列とハイブリダイズし、かつＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質とｓｇＲＮＡとの複合体）を当該標的配列に特異的に結合させるように誘導するのに十分な相補性がある限り、本発明に記載のガイド配列と標的配列との完全な相補性は必要ではない。
本明細書において使用される場合、「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」又は「標的ポリヌクレオチド」という用語は、標的配列を含むポリヌクレオチドを指す。標的核酸及び標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（標的ＤＮＡ）又はＲＮＡ（標的ＲＮＡ）などの任意の対応するポリヌクレオチドを含むことができる。「標的核酸」とは、ｇＲＮＡによって誘導されるＣａｓタンパク質又はＣａｓ１３タンパク質によって標的化又は修飾される核酸を指す。「標的核酸」という用語は、細胞（例えば、真核細胞）にとって内因性又は外因性の任意のポリヌクレオチドであってもよい。
本明細書において使用される場合、「標的配列」という用語は、ｇＲＮＡ分子のガイド配列に相補的（完全に相補的又は部分的に相補的）であるか、又はハイブリダイズすることができる標的核酸分子中の小さな部分の配列を指す。標的配列の長さは、多くの場合、数十ｎｔであり、例えば、約１０ｎｔ、約２０ｎｔ、約３０ｎｔ、約４０ｎｔ、約５０ｎｔ、約６０ｎｔであってもよい。
本明細書において使用される場合、標的核酸Ａｑｐ１ ＲＮＡを標的とすることに言及する場合、「標的とする」という用語は、
Ａｑｐ１ ＲＮＡの切断、Ａｑｐ１ ＲＮＡの可視化又は検出、Ａｑｐ１ ＲＮＡの標識、Ａｑｐ１ ＲＮＡの輸送、Ａｑｐ１ ＲＮＡのマスキング、Ａｑｐ１ ＲＮＡの転写及び／又は翻訳レベルの向上、並びにＡｑｐ１ ＲＮＡの翻訳レベルの低下、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングの変更の１つ又は複数を含む。
例えば、一実例では、標的ＲＮＡを標的とする方法により、標的ＲＮＡ（Ａｑｐ１ ＲＮＡ）が検出、可視化又は標識される。突然変異したＨＥＰＮドメインを有するＣａｓ１３タンパク質、ガイドＲＮＡ、及びエフェクターモジュールを使用することにより、標的ＲＮＡはＣａｓ１３によって認識されるが、切断やニックが発生せず、同時にエフェクターモジュールが活性化される。このような方法は、例えば、眼細胞における標的ＲＮＡの存在又は標的ＲＮＡの発現のレベルを決定するために、細胞系又は無細胞系で使用することができる。一実例では、Ｃａｓ１３タンパク質は蛍光タンパク質又は他の検出可能なマーカーに融合され、標的ＲＮＡへのＣａｓ１３の結合は顕微鏡又は他のイメージング方法によって可視化され得る。
一実例では、標的ＲＮＡを標的とすることにより、標的ＲＮＡの発現を活性化又は増加させることができる。例えば、突然変異したＨＥＰＮドメインを有するＣａｓ１３を翻訳活性化ドメイン（例えば、ｅＩＦ４Ｅや他の翻訳開始因子）に融合し、ガイドＲＮＡとともに、標的ＲＮＡの発現を増加させることができる。
一実例では、標的ＲＮＡを標的とすることにより、標的ＲＮＡの発現を阻害又は低減することができる。例えば、突然変異したＨＥＰＮドメインを有するＣａｓ１３を翻訳阻害ドメイン（例えば、デアデニラーゼ）に融合し、ガイドＲＮＡとともに、標的ＲＮＡの発現を阻害することができる。
本明細書において使用される場合、標的核酸Ａｑｐ１ ＲＮＡを修飾することに言及する場合、「修飾する」という用語は、
Ａｑｐ１ ＲＮＡの塩基置換、Ａｑｐ１ ＲＮＡの塩基欠失、Ａｑｐ１ ＲＮＡの塩基挿入、Ａｑｐ１ ＲＮＡのメチル化、Ａｑｐ１ ＲＮＡの脱メチル化、Ａｑｐ１ ＲＮＡの脱アミノ化の１つ又は複数を含む。
本明細書において使用される場合、「Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患」とは、生体内の特定の器官、特定の組織又は特定の細胞（細胞内、細胞外、又は細胞内及び細胞外の両方）のＡｑｐ１ ＲＮＡレベル又はＡｑｐ１タンパク質レベルが低下又は減少した場合に、その症状が緩和されるように、予防、治療が可能であるいくつかの疾患を指すことを意図する。例えば、Ａｑｐ１の機能喪失により、房水産生を減少させ、眼圧を低下させ、緑内障の治療に使用される。
本明細書において使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、ベクター中のＣａｓタンパク質若しくはＣａｓ１３タンパク質のコード配列又はｇＲＮＡのコード配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、又は当該ベクターが宿主細胞に導入される場合に、宿主細胞において発現する）方法で１つ又は複数の調節要素に連結されることを意味することを意図する。前記調節要素は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列などの転写終結シグナル）を含むことを意図する。
下記の実施例は本発明の理解を容易にするが、本発明を限定するものではない。下記の実施例において具体的な条件を示さない実験方法は、通常、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の条件、又は製造業者によって提案された条件などの従来の条件に従う。実施例で使用される各種の一般的な化学試薬は、いずれも市販品である。
実施例１、ｓｇＲＮＡベクターの設計と構築
Ａｑｐ１ ＲＮＡを標的とするｓｇＲＮＡを設計し、前記ｓｇＲＮＡの核酸配列は、直接連結されたターゲティングドメイン配列とフレームワーク配列とを含み、フレームワーク配列は、ターゲティングドメイン配列の５’末端に位置し、ターゲティングドメイン配列は、Ａｑｐ１ ＲＮＡ分子上の標的配列と逆相補的であり、長さが２０～３０ｎｔである。図１に示された通りである。
本実施例におけるｓｇＲＮＡのフレームワーク配列は、５’－ＣＡＡＧＵＡＡＡＣＣＣＣＵＡＣＣＡＡＣＵＧＧＵＣＧＧＧＧＵＵＵＧＡＡＡＣ－３’（配列番号３２）である。
本発明者らが設計したｓｇＲＮＡのターゲティングドメイン配列は下記の表１に示された通りである。図２～図４は、ヒトＡｑｐ１ ＲＮＡ上の設計されたｓｇＲＮＡの対応する標的配列の位置を示す。
ここで、ｓｇＲＮＡ１～ｓｇＲＮＡ３１は、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＲｘシステムを介してプラスミドトランスフェクション細胞実験においてヒトＡｑｐ１ ＲＮＡのＣＤＳ領域を標的とするように設計された。


標的配列（ターゲティングドメインの逆相補配列）に対応するオリゴＤＮＡをそれぞれ合成し、ＢｐｉＩ制限酵素切断部位の選択に従って、ＡＡＡＣを標的配列の逆相補配列の５’末端に付加し、ＣＴＴＧを標的配列の５’末端に付加した。
上記の標的配列に対応するオリゴＤＮＡのセンス鎖と対応するアンチセンス鎖とを混合し、９５℃で５分間培養した後、氷上に置いて冷却及びアニーリングして、粘着末端を有する二本鎖ＤＮＡを形成した。
ＲＦＺＨ－１プラスミド（配列番号３３）のマップは図５に示された通りであり、本発明者らによって構築された。このプラスミドは、ＣａｓＲｘ及びｓｇＲＮＡ発現ベクターの構築に使用された。
ＲＦＺＨ－１プラスミドをＢｐｉＩ消化により直線化し、３７℃で１時間反応させた。消化産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、ゲルを切断して消化産物を回収した。
アニール産物とＲＦＺＨ－１－ＢｐｉＩ消化による直線化回収産物をＴ４リガーゼでライゲーションし、ライゲーションした産物をヒートショック法で大腸菌コンピテントセルＳｔｂｌ３に形質転換し、形質転換後、抗生物質を含まないＬＢ液体培地を遠心管に加え、３７℃、２００ｒｐｍの恒温振盪器に入れて振とう培養し、菌を復活させた。
蘇生したＳｔｂｌ３細胞をアンピシリン耐性ＬＢ寒天プレートに広げ、３７℃の恒温インキュベーター内で逆さまに培養した。上記のプレートからそれぞれ単一コロニーを選択し、５０μｌアンピシリンを含む５０ｍＬの液体ＬＢ培地に接種し、プライマーＵ６ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ－Ｆ（５’－ＧＧＧＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＴ－３’、配列番号３４）及びｆ１ｏｒｉ－Ｒ（５’－ＧＣＴＧＧＣＡＡＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＣＡ－３’、配列番号３５）を使用し、上記の細菌液をＰＣＲにより同定した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動した後、陽性クローンを含む菌液を選別し、アンピシリンを含む５０ｍＬ ＬＢ液体培地５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１６時間振とう培養した。
プラスミドを抽出し、プラスミド濃度を測定した後、プラスミドの一部をサンガー配列決定のために採取し、正確に配列決定されたプラスミドは、後で使用できるように－２０℃で保存した。
Ａｑｐ１ ＲＮＡを標的とするｓｇＲＮＡｎをコードする配列を含むベクターをＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡｎと命名した（ｎは数の番号であり、ｓｇＲＮＡｎは表１のｓｇＲＮＡ番号に対応した）。
図６はいくつかのベクターの配列決定ピークマップを例示的に示しており、図Ａ～ＦはそれぞれＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡ１、２、４、７、８、９ベクターの配列決定ピークマップに対応する。
実施例２、プラスミドのトランスフェクションと同定
無血清培地を使用してリポフェクタミン２０００リポソームトランスフェクション試薬を希釈し、実施例１で構築したｓｇＲＮＡがクローニングされたＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡｎ１、ＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡｎ２（ｎ１、ｎ２は表１中のｓｇＲＮＡ１～ｓｇＲＮＡ３１をコードする任意の２つのプラスミドを表した）プラスミド及びＡｑｐ１を過剰発現するＬｖ－Ａｑｐ１プラスミドを１２：１２：１（合計２５０ｎｇ）の質量比で同時トランスフェクトした。或いは、１つのｓｇＲＮＡプラスミドのみをトランスフェクトし、実施例１で構築したＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡｎ１（ｎ１は表１中のｓｇＲＮＡ１～ｓｇＲＮＡ３１をコードするいずれか１つのプラスミドを表した）及びＡｑｐ１を過剰発現するＬｖ－Ａｑｐ１プラスミドを２４：１（合計２５０ｎｇ）の質量比で２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。
陰性対照群には、ＲＦＺＨ－１プラスミド及びＬｖ－Ａｑｐ１プラスミドをトランスフェクトした。
空白対照群では、ＲＦＺＨ－１プラスミドのみをトランスフェクトした。
Ａｑｐ１を過剰発現するＬｖ－Ａｑｐ１プラスミド（配列番号３６）は本発明者らによって構築され、そのマップは図７に示された通りである。
２つのプラスミド希釈液を混合し、２０分間保温した後、複合体を２４ウェルプレートに加え、次に細胞懸濁液を複合体に加えた。
プラスミドをトランスフェクトしてから７２時間後、ＡｃｃｕｒａｔｅユニバーサルＲＮＡ抽出キットを使用して２９３Ｔ細胞の全ＲＮＡを抽出した後、Ｅｖｏ Ｍ－ＭＬＶ逆転写キットを使用してｇＤＮＡ消化及び逆転写反応を行い、対応するｃＤＮＡを得た。Ｑ－ＰＣＲ反応では、ＳＹＳＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｏ Ｔａｑ ＨＳプレミックスｑＰＣＲキットを使用し、ＧＡＰＤＨを内部参照として使用し、Ｒｏｃｈｅ ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ＩＩを使用し、各群のターゲット編集後のＡｑｐ１ ＲＮＡレベルを得た。Ｑ－ＰＣＲでは、各試料及びプライマーの各ペアに対して並行して３つの複製ウェルを行った。Ｑ－ＰＣＲプライマーは表２に示された通りである。
表２、２９３Ｔ細胞のＱ－ＰＣＲに使用されるプライマー

実施例３、Ａｑｐ１ ＲＮＡ発現量の検出結果
組換えプラスミドによる細胞のトランスフェクション、ＲＮＡの抽出、逆転写によるｃＤＮＡの合成、及びｑＰＣＲでは、３回の独立した生物学的反復実験を実施し、３回の実験の平均結果を２＾－ΔΔＣｔの計算法によって得た。
Ａｑｐ１ ＲＮＡ発現試験の結果は下記の表３に示された通りである。結果のデータは、３回の試験結果の平均値で表された。空白対照群のＡｑｐ１ ＲＮＡレベルを０として計算し、陰性対照群のＡｑｐ１ ＲＮＡレベルを１として計算した。
表３、ＣＲＩＳＰＲシステムによる２９３Ｔ細胞編集後のＡｑｐ１ ＲＮＡレベル

注：＊は陰性対照群と比較して統計的差異があることを示す（Ｐ＜０．０５）。
表３のデータは、本発明者らがｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ１３システムを通じてＡｑｐ１ ＲＮＡの発現レベルを有意に減少させたことを示している。
ヒト２９３Ｔ細胞では、Ａｑｐ１ ＲＮＡに対する最も強いノックダウン効果はｓｇＲＮＡ １～２、４～５、７～１０、１２、１４～１５、１７～１８、２０～２１、２３～２４、２６、２８、３０～３１であり、続いてｓｇＲＮＡ ３、６、１１、１３、１６、１９、２２、２５、２９である。
以上のことから、本開示は、Ａｑｐ１ ＲＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３システムの構築に成功し、Ａｑｐ１ ＲＮＡのレベルを効果的に低下させることができる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３によりＡｑｐ１ ＲＮＡを標的とすることは、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓによりＡｑｐ１ ＤＮＡを直接標的とすることよりも安全である。
実施例４、動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ薬効試験
実施例１の方法を使用して、ＣａｓＲｘ、ｓｇＲＮＡ Ｃ（Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスＡｑｐ１ ＲＮＡを標的とした）を発現できるＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡ Ｃプラスミド（その後の陽性対照に使用した）及びＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡ ２１プラスミド（マウスＡｑｐ１ ＲＮＡを標的とした）を構築した。ｓｇＲＮＡ Ｃのターゲティングドメイン配列は５’－ＡＣＵＵＵＧＧＧＣＣＡＧＡＧＵＡＧＣＧＡＵ－３’（配列番号４１）であった。
試薬会社では、通常のトリプルトランスフェクション（Ｔｒｉｐｌｅ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）法を使用し、ＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡ ２１又はＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡ Ｃプラスミド、ｓｈｈ１０プラスミド（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃６４８６７）、及び補助プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１１２８６７）をトランスフェクトすることにより、２９３Ｔ細胞で培養し、分離して血清型ＡＡＶ－ＳｈＨ１０（真核細胞内でＣＭＶの駆動によってＣａｓＲｘを発現し、Ｕ６の駆動によってｓｇＲＮＡ ２１又はｓｇＲＮＡ Ｃを発現できた）を得、当該ＡＡＶ－ＳｈＨ１０のキャプシドにパッケージされた配列は、ＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡ ２１又はＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡ ＣプラスミドにおけるＩＴＲ及びそれらの間の配列であった。
上記のトリプルトランスフェクション法に従って、ｇＲＮＡ空プラスミド（ＲＦＺＨ－１）、ｓｈｈ１０プラスミド（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃６４８６７）、補助プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１１２８６７）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、培養し、分離してｓｇＲＮＡ空（ＣＭＶの駆動によってＣａｓＲｘを発現し、Ｕ６の駆動によって発現されたｇＲＮＡはＡｑｐ１を標的とした代わりにトラフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ）のＲＮＡ配列を標的とした）のＡＡＶ－ＳｈＨ１０を得た。
また、上記のトリプルトランスフェクション法を使用し、ＧＦＰプラスミド（配列番号４２）、ｓｈｈ１０プラスミド（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃６４８６７）、補助プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１１２８６７）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、培養し、分離してＧＦＰ（ＣＭＶ駆動発現）を発現できるＡＡＶ－ＳｈＨ１０を得、ＧＦＰ－ＡＡＶ又はＳｈＨ１０－ＧＦＰと呼ばれた。
眼圧が安定している正常な６週齢オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス１０匹を選択し、そのうち５匹のマウスの左目の硝子体にｓｇＲＮＡ ２１を発現するＡＡＶ（２×１０９ ＧＣ ＡＡＶ）及びＧＦＰ ＡＡＶ（２×１０８ ＧＣ ＡＡＶ）を注射し、別の５匹のマウスの左目の硝子体にｓｇＲＮＡ Ｃを発現するＡＡＶ（２×１０９ ＧＣ ＡＡＶ）及びＧＦＰ ＡＡＶ（２×１０８ ＧＣ ＡＡＶ）を注射した。すべての１０匹のマウスの右目の硝子体にｓｇＲＮＡ空ＡＡＶ（２×１０９ ＧＣ ＡＡＶ）及びＧＦＰ ＡＡＶ（２×１０８ ＧＣ ＡＡＶ）を注射した。ここで、ＧＣ＝ゲノムコピー（Ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｉｅｓ）であった。下記の表４に示された通りである。
表４、動物実験の群分け

注射から１週間後、毛様体におけるＧＦＰの被覆率を検出した。ＧＦＰの分布を蛍光検出により検出し、薬物注射が成功したことを示した。注射から３週間後、Ｉｃａｒｅ（登録商標）ＴＯＮＯＬＡＢ眼圧計を使用して両目の眼圧を測定した。各マウスのどちらかの目の眼圧を６回連続的に検査した。結果は下記の表５及び表６に示された通りである。
表５、ｓｇＲＮＡ ２１ ＡＡＶ注射３週間後のマウスの眼圧検査の結果


注：＊は実験群の平均値は陰性対照群の平均値と比較して統計的差異があることを示す（Ｐ＜０．０５）。
表６、ｓｇＲＮＡ Ｃ ＡＡＶ注射３週間後のマウスの眼圧検査の結果


注：＊は実験群の平均値は陰性対照群の平均値と比較して統計的差異があることを示す（Ｐ＜０．０５）。
表５に示すように、ｓｇＲＮＡ ２１は、空のマウスと比較してマウスの眼圧を効果的に低下させることができる。表６は、ｓｇＲＮＡ Ｃが空のマウスと比較してマウスの眼圧を効果的に低下させることができることを示す。従って、ｓｇＲＮＡ２１及びｓｇＲＮＡ Ｃは、緑内障の治療に使用することができる。
眼圧低下の大きさから判断すると、本発明のｓｇＲＮＡ ２１はｓｇＲＮＡ Ｃよりも効果的である。
実施例５、オフターゲットの検出
１、ＥＭＢＯＳＳ－ｗａｔｅｒプログラム及びＮＣＢＩ－Ｂｌａｓｔプログラムにより、標的種（ＩＣＲマウス）の全ゲノム及び全ｃＤＮＡ配列において予測し、それぞれ表１のｓｇＲＮＡ５及びｓｇＲＮＡ３１ガイド配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖を使用して比較し、予測結果をフィルタリングし、予測されたターゲットの長さとｓｇＲＮＡガイド配列の長さの差が４塩基を超えないこと、及びミスマッチ＋ギャップ（ｍｉｓｍａｔｃｈ＋ｇａｐ）が４塩基を超えないことに従ってフィルタリングし、潜在的なオフターゲット情報は下記の通りである：
ｓｇＲＮＡ５：１２５個の潜在的なオフターゲット遺伝子、２５５個の潜在的なオフターゲット転写産物。
ｓｇＲＮＡ３１：１２８５個の潜在的なオフターゲット遺伝子、２４９６個の潜在的なオフターゲット転写産物。
２、オスのＩＣＲマウスの両目の硝子体にＡＡＶ ＳｈＨ１０を投与した。
ＣａｓＲｘ、ｓｇＲＮＡ５及びｓｇＲＮＡ３１を発現できるＡＡＶ ＳｈＨ１０の場合、その製造方法は下記の通りである：通常のトリプルトランスフェクション（Ｔｒｉｐｌｅ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）法を使用する、即ち、ＲＦＺＨ－１－Ａｑｐ１－ｓｇＲＮＡ５＋３１プラスミド（配列番号４３）、ｓｈｈ１０プラスミド（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃６４８６７）、及び補助プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１１２８６７）をトランスフェクトすることにより、２９３Ｔ細胞で培養し、分離して、ＣＭＶの駆動によってＣａｓＲｘを発現でき、Ｕ６の駆動によってｓｇＲＮＡ５及びｓｇＲＮＡ３１を発現できる血清型ＡＡＶ－ＳｈＨ１０が得られ、ＳｈＨ１０－ＣＲＩＳＰＲと命名された。
ＧＦＰを発現できる別のＡＡＶ ＳｈＨ１０の場合、その製造方法は下記の通りである：通常のトリプルトランスフェクション（Ｔｒｉｐｌｅ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）法を使用する、即ち、ＧＦＰプラスミド（配列番号４２）、ｓｈｈ１０プラスミド（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃６４８６７）、及び補助プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１１２８６７）をトランスフェクトすることにより、２９３Ｔ細胞で培養し、分離して、ＧＦＰ（ＣＭＶ駆動発現）を発現できるＡＡＶ－ＳｈＨ１０が得られ、ＳｈＨ１０－ＧＦＰと呼ばれた。
実験群の６匹のマウスの各目にＳｈＨ１０－ＣＲＩＳＰＲ（力価：１Ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌ）とＳｈＨ１０－ＧＦＰ（力価：１Ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌ）を合計２μＬ（体積比：１０：１）で同時に投与し、対照群の６匹のマウスの各目に２μＬのＳｈＨ１０－ＧＦＰ（力価：１Ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌ）を投与した。２７日後、完全な網膜試料を採取し、フェノール・クロロホルム法を使用して試料の全ＲＮＡを抽出し、ＰＥ１５０ｂｐ ＲＮＡ－Ｓｅｑシーケンスを行い、シーケンスにより得られたｆａｓｔｑファイルをＨＩＳＡＴ２及びＳＴＡＲソフトウェアにより標的種（ＩＣＲマウス）の参照ゲノムと比較し、比較後のＢＡＭファイルを得た。ｋａｌｌｉｓｔｏ、ＲＳＥＭ及びＨＴＳｅｑを使用し、転写産物及び各遺伝子の発現量を検出した。
３、ＤＥＳｅｑ２、ｌｉｍｍａ－ｖｏｏｍ、ｅｄｇｅｒを使用して各群間の発現量の差異分析を行い、ｐ．ａｄｊ＜０．０５、｜ｌｏｇ２ＦｏｌｄＣｈａｎｇｅ｜＞＝０．７５、ｂａｓｅｍｅａｎ＞２．５を満たすものを発現差遺伝子（ＤＥＧ）とし、ＤＥＧ情報の合計は下記の通りである：
７３個の有意にアップレギュレーションされたＤＥＧ；８０個の有意にアップレギュレーションされた転写産物。
３９個の有意にダウンレギュレーションされたＤＥＧ；４２個の有意にダウンレギュレーションされた転写産物。
４、発現差のある遺伝子の中で有意にダウンレギュレーションされた遺伝子と予測される潜在的なオフターゲット遺伝子の交点を取り、より信頼性の高いオフターゲット遺伝子とした。関連情報は下記の通りである：
０個のｓｇＲＮＡ５関連オフターゲット遺伝子、０個の関連転写産物。
６個のｓｇＲＮＡ３１関連オフターゲット遺伝子、６個の関連転写産物。
従って、オフターゲット編集の観点から、ｓｇＲＮＡ５はｓｇＲＮＡ３１よりも安全であることがわかった。
上記の実施形態は本発明の好ましい実施形態であるが、本発明の実施形態は上記の実施形態によって限定されるものではなく、本発明の精神及び原理を逸脱することなく、その他の変更、修正、置換、組み合わせ、及び簡略化は同等の置換方法であるべきであり、すべて本発明の保護範囲に含まれる。
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを初めて使用し、ヒトＡｑｐ１ ＲＮＡ配列を標的とするｓｇＲＮＡを提供し、Ａｑｐ１ ＲＮＡレベルの有意なダウンレギュレーションを達成した。ベクターを使用して細胞に送達された後、Ａｑｐ１ ＲＮＡを標的とし、Ａｑｐ１ ＲＮＡレベルを低下させる。ｓｇＲＮＡは、Ａｑｐ１の過剰発現に関連する疾患（がん、緑内障を含む）を含むがこれらに限定されない、Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患の治療、又はＡｑｐ１の通常の発現レベルをダウンレギュレーションすることによって関連疾患を治療するために使用することができる。本発明により提供されるＡｑｐ１遺伝子のｍＲＮＡ配列を標的とするｓｇＲＮＡは、Ａｑｐ１遺伝子を直接標的とするものより安全である。本発明のｓｇＲＮＡは、Ａｑｐ１ ＲＮＡレベルを効果的に低下させることができる。設計を通じて、本発明者らは、いくつかのｓｇＲＮＡ標的部位の近くで有意により優れた効果を有するｓｇＲＮＡを発見し、これはＡｑｐ１ ＲＮＡレベルをより効果的に低下させることができる。

Claims (20)

  1. ヒトＡｑｐ１ ｍＲＮＡを標的とすることができることを特徴とする、ｓｇＲＮＡ。
  2. 前記ｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列はターゲティングドメインとフレームワーク配列とを含み、前記ターゲティングドメインは標的核酸Ａｑｐ１ ｍＲＮＡ配列に相補的であり、前記フレームワーク配列はＣａｓタンパク質に相互作用することができることを特徴とする、請求項１に記載のｓｇＲＮＡ。
  3. 前記Ｃａｓタンパク質はＣａｓ１３タンパク質であることを特徴とする、請求項２に記載のｓｇＲＮＡ。
  4. 前記ターゲティングドメインは、配列番号１～配列番号３１のいずれか１つに示される配列を含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡ。
  5. 前記ｓｇＲＮＡのターゲティングドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１のいずれか１つに示される配列を含むことを特徴とする、請求項４に記載のｓｇＲＮＡ。
  6. 前記ｓｇＲＮＡのターゲティングドメインは、配列番号２、配列番号５、配列番号２１、配列番号２４、配列番号３１のいずれか１つに示される配列を含むことを特徴とする、請求項５に記載のｓｇＲＮＡ。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の任意の２つの異なる前記ｓｇＲＮＡから構成される、ｓｇＲＮＡの組み合わせ。
  8. 前記ｓｇＲＮＡの組み合わせは、下記のいずれか１つから選択されることを特徴とする、請求項７に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせ：
    Ｐ１、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号５である前記ｓｇＲＮＡ；
    Ｐ２、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２１である前記ｓｇＲＮＡ；
    Ｐ３、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２４である前記ｓｇＲＮＡ；
    Ｐ４、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡ；
    Ｐ５、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号５である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２１である前記ｓｇＲＮＡ；
    Ｐ６、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号５である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２４である前記ｓｇＲＮＡ；
    Ｐ７、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号５である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡ；
    Ｐ８、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２１である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２４である前記ｓｇＲＮＡ；
    Ｐ９、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２１である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡ；
    Ｐ１０、前記ターゲティングドメインの配列が配列番号２４である前記ｓｇＲＮＡ、及び前記ターゲティングドメインの配列が配列番号３１である前記ｓｇＲＮＡ。
  9. 請求項１～６のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡ、或いは請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせをコードする、ＤＮＡ分子。
  10. 請求項９に記載のＤＮＡ分子を含む発現カセット、発現ベクター、組換え細菌、組換えウイルス又はトランスジェニック細胞株。
  11. 下記のいずれか１つを含むキット：
    ｉ、Ｃａｓタンパク質、及び請求項１～６のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡ；
    ｉｉ、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター１、及び請求項１～６のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡ；
    ｉｉｉ、Ｃａｓタンパク質、及び請求項１～６のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター２；
    ｉｖ、前記発現ベクター１及び前記発現ベクター２；
    ｖ、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、請求項１～６のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とを含む発現ベクター３；
    ｖｉ、Ｃａｓタンパク質、及び請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせ；
    ｖｉｉ、前記発現ベクター１、及び請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせ；
    ｖｉｉｉ、Ｃａｓタンパク質及び発現ベクター４；前記発現ベクター４は請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの２つのｓｇＲＮＡすべてをコードするヌクレオチド配列を含む；
    ｉｘ、Ｃａｓタンパク質、発現ベクター５及び発現ベクター６；前記発現ベクター５は請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせのいずれか１つのｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む；前記発現ベクター６は請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの他のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む；
    ｘ、前記発現ベクター１及び前記発現ベクター４；
    ｘｉ、前記発現ベクター１、前記発現ベクター５及び前記発現ベクター６；
    ｘｉｉ、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの２つのｓｇＲＮＡすべてをコードするヌクレオチド配列とを含む発現ベクター７；
    ｘｉｉｉ、発現ベクター８及び発現ベクター９；前記発現ベクター８はＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせのいずれか１つのｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とを含む；前記発現ベクター９は請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの他のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む；
    前記Ｃａｓタンパク質は、前記ｓｇＲＮＡに相互作用することができる。
  12. 前記Ｃａｓタンパク質はＣａｓ１３タンパク質であることを特徴とする、請求項１１に記載のキット。
  13. 下記のいずれか１つから選択される組成物：
    Ｉ、Ｃａｓタンパク質と、請求項１～６のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡとを含む組成物；
    ＩＩ、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸分子１と、請求項１～６のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡとを含む組成物；
    ＩＩＩ、Ｃａｓタンパク質と、請求項１～６のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡをコードする核酸分子２とを含む組成物；
    ＩＶ、前記核酸分子１と前記核酸分子２とを含む組成物；
    Ｖ、Ｃａｓタンパク質及び請求項１～６のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡをコードする核酸分子３を含む組成物；
    ＶＩ、Ｃａｓタンパク質と、請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせとを含む組成物；
    ＶＩＩ、前記核酸分子１と、請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせとを含む組成物；
    ＶＩＩＩ、Ｃａｓタンパク質と核酸分子４とを含む組成物；前記核酸分子４は請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの２つのｓｇＲＮＡすべてをコードする；
    ＩＸ、Ｃａｓタンパク質と、核酸分子５と核酸分子６とを含む組成物；前記核酸分子５は請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせのいずれか１つのｓｇＲＮＡをコードする；前記発現ベクター６は請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの他のｓｇＲＮＡをコードする；
    Ｘ、前記核酸分子１と前記核酸分子４とを含む組成物；
    ＸＩ、前記核酸分子１と、前記核酸分子５と前記核酸分子６とを含む組成物；
    ＸＩＩ、Ｃａｓタンパク質及び請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの２つのｓｇＲＮＡすべてをコードする核酸分子７を含む組成物；
    ＸＩＩＩ、核酸分子８と核酸分子９とを含む組成物；前記核酸分子８はＣａｓタンパク質及び請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせのいずれか１つのｓｇＲＮＡをコードする；前記核酸分子９は請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせの他のｓｇＲＮＡをコードする；
    前記Ｃａｓタンパク質は、前記ｓｇＲＮＡに相互作用することができる。
  14. 前記Ｃａｓタンパク質はＣａｓ１３タンパク質であることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
  15. 請求項１～６のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡ、或いは請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせ、或いは請求項９に記載のＤＮＡ分子、或いは請求項１０に記載の発現カセット、発現ベクター、組換え細菌、組換えウイルス又はトランスジェニック細胞株、或いは請求項１３又は１４に記載の組成物、及び薬学的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする、医薬。
  16. 前記医薬は、ＲＮＰ送達、リポソーム送達、ナノ粒子送達、ウイルス送達又は細胞外小胞送達を通じて送達されることを特徴とする、請求項１５に記載の医薬。
  17. 下記のいずれか１つにおける、請求項１～６のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡ、或いは請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせ、或いは請求項９に記載のＤＮＡ分子、或いは請求項１０に記載の発現カセット又は発現ベクター又は組換え細菌、組換えウイルス又はトランスジェニック細胞株、或いは請求項１３又は１４に記載の組成物、或いは請求項１５に記載の医薬の使用：
    Ｑ１、Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患を治療するための医薬の製造；
    Ｑ２、Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患の治療。
  18. 前記Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患は、腫瘍又は緑内障から選択されることを特徴とする、請求項１７に記載の使用。
  19. 請求項１～６のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡ、或いは請求項７又は８に記載のｓｇＲＮＡの組み合わせ、或いは請求項９に記載のＤＮＡ分子、或いは請求項１０に記載の発現カセット又は発現ベクター又は組換え細菌、組換えウイルス又はトランスジェニック細胞株、或いは請求項１３又は１４に記載の組成物、或いは請求項１５に記載の医薬を使用することにより、Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患を治療するための方法。
  20. 前記Ａｑｐ１発現のダウンレギュレーションが有益である疾患は、腫瘍又は緑内障から選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
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