TWI838812B

TWI838812B - 用於治療法布瑞氏症之組合物及方法

Info

Publication number: TWI838812B
Application number: TW111129566A
Authority: TW
Inventors: 牛道明; 盧昱穎; 鄭彥甫; 陳韻如; 顏靜慈; 黃淳瑩
Original assignee: 臺北榮民總醫院
Priority date: 2021-08-06
Filing date: 2022-08-05
Publication date: 2024-04-11

Abstract

本發明提供一種用於治療法布瑞氏症的組合物，其中該組合物包含一具有基因編輯功能的聚核苷酸，其用以校正法布瑞氏症中GLA基因的特定突變(IVS4 +919 G>A)。本發明也提供一種治療法布瑞氏症的方法，其使用基因編輯系統以校正法布瑞氏症中GLA基因的特定突變(IVS4 +919 G>A)。

Description

用於治療法布瑞氏症之組合物及方法

本發明係關於使用基於常間回文重複序列叢集關聯蛋白(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)/Cas9系統或是腺嘌呤鹼基編輯器(Adenine base editor，ABE)之基因編輯技術對法布瑞氏症上GLA基因中內含子4的突變點(GLA IVS4+919G>A)進行基因校正，以作為法布瑞氏症的基因治療策略。

法布瑞氏症(Fabry disease)是一種X性聯遺傳的溶酶體儲積症(X-linked lysosomal storage disease)，屬於罕見的遺傳疾病，目前全球的發生率約為1：40,000到1：60,000。致病原因為位在X染色體上的GLA基因發生突變，導致細胞內缺乏足夠α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，GLA)酵素的狀況下，鞘糖脂(globotriaosylceramide，Gb3)無法被正常代謝，而大量堆積在不同組織細胞的溶酶體當中，包括血管中的內皮與平滑肌細胞、心臟的心肌細胞與瓣膜纖維細胞、腎臟的腎絲球與腎小管上皮細胞、角膜和結締組織的網狀細胞，以及神經系統的神經節細胞等，Gb3的異常堆積會造成細胞損傷，最終導致器官功能受損，使得心臟、腎臟、腦血管及周邊神經發生病變。

GLA IVS4+919G>A(NM_00016：c.639+919G>A)被報導為晚發的心臟變異型法布瑞氏症相關突變點，該突變點為GLA基因上第四個內含子(intron 4，IVS4)中第919個核苷酸產生了鳥嘌呤(G)變成腺嘌呤(A)的點突變，導致異常的mRNA選擇性剪接(alternative splicing)發生，誤將第四個內含子中一段57個核苷酸的內含子序列辨識成外顯子(Exon)而保留下來，導致第四個和第五個外顯子之間提早出現了TGA終止密碼子，而轉譯出短缺的GLA蛋白。異常的選擇性剪接模式成為了細胞中主要的剪接產物，僅保留少許正常的GLA mRNA剪接模式，使得帶有IVS4+919G>A突變點的細胞GLA酵素活性約正常的5~10%。根據近年的研究報告顯示，此基因突變在台灣人的發生率非常高，每1,471名男性新生兒中即有一人帶有此基因突變點，女性的帶因率更高達1/750。

法布瑞氏症目前最主要的治療方式是酵素替代療法，儘管對於大多數患者而言能夠有效的延緩病情，但需要終生以每兩週一次的頻率靜脈注射蛋白酵素藥物以維持療效，而高注射頻率除了造成患者的不便性以及生活品質下降，同時也因為蛋白酵素藥物價格昂貴，造成健保資源龐大的支出。

而基因編輯技術能夠直接修改基因上的突變，使得細胞本身得以永久產生具有功能的GLA酵素蛋白。CRISPR/Cas9基因編輯技術的問世，對於基因治療領域是一項重大突破。使用Cas9進行對目標雙股DNA(Double-stranded DNA，dsDNA)的辨識及切割，其中Cas9需在引導RNA(guide RNA，gRNA)引領之下而到達目標序列進行作用，隨後造成基因雙股斷裂，最後以細胞內DNA修復機制來達到基因重新編程的效果。

然而，基因編輯技術日新月異，有別於傳統CRISPR/Cas9技術需要誘發DNA雙股斷裂的原理，鹼基編輯系統能夠更準確地修正點突變，以SpCas9缺口酶(nickase)(如nCas9)、gRNA以及去氨酶(Deaminase)為主要組成，其中nCas9在與gRNA結合的非編輯股進行單邊序列的切割時會形成小缺口(nick)，並在目標序列上形成鹼基編輯窗口(Editing window)，接著透過去氨酶在鹼基編輯窗口內進行鹼基的轉換。相較於傳統CRISPR/Cas9，鹼基編輯系統不需要產生DNA雙股斷裂而減少了產生插入與缺失(insertion/deletion，indel)的情形，並且不需依賴外源DNA作為模板便能有效地準確修改單一鹼基。此外，nCas9的使用也能夠降低脫靶效應的發生率，而增加治療疾病以及臨床應用的安全性。

在鹼基編輯系統中，腺嘌呤鹼基編輯器(ABE)可將A‧T轉換成G‧C，使用大腸桿菌TadA作為去氨酶，可將A有效地去氨化轉換成肌苷(Inosine，I)，最終在DNA修復機制或是複製過程中被DNA聚合酶辨識為G，而達到A轉換成G的效果。然而，使用腺嘌呤鹼基編輯器時，鹼基編輯窗口內的A都有可能發生鹼基轉換的情況，此稱為旁觀者效應；並且可能引起無法預期的突變和風險，故不是任何遺傳性疾病都可以使用腺嘌呤鹼基編輯器來治療。

在本發明中以基因編輯技術作為治療策略，應用於心臟型法布瑞氏症患者纖維母細胞進行驗證，實驗結果也證實了基因編輯技術的治療潛力，能夠有效的恢復細胞中GLA基因功能，並達到永久的治療效果。

本發明開發兩個治療策略：(1)第一個策略是透過CRISPR/Cas9介導的非同源性末端接合(Nonhomologous end joining，NHEJ)，修改GLA基因中內含子4的序列，針對GLA IVS4+919G>A突變點上下游皆設計合適的單引導RNA(single guide RNA，sgRNA)，以及使用較新型的HiFi Cas9在目標序列上形成準確的DNA雙股斷裂，使得造成異常剪接的57個核苷酸小片段能以非同源性末端接合的方式進行雙剪刀切除，進而使GLA產生正常的mRNA並恢復基因功能(如圖1A所示)；以及(2)第二個策略則是透過腺嘌呤鹼基編輯器(Adenine base editor，ABE)，設計長度為20個核苷酸的sgRNA，使得目標位點GLA IVS4+919G>A能夠落在sgRNA作用範圍內，使GLA IVS4+919 G>A點突變能準確地被修正。然而，本發明注意到在突變點前後的IVS4+918以及IVS4+920的序列皆為A，並且也落在鹼基編輯窗口內，因此可能會造成旁觀者效應。一般而言，旁觀者效應被認為是必須避免的情況，因為可能會產生非預期的效果，本發明推測在GLA IVS4+918_+920可能會產生高機率的旁觀者效應，使得鹼基編輯策略一般被認為不適用於治療策略的開發。而本發明觀察到，IVS4+920位於造成mRNA異常剪接片段中的剪接供體位點(splicing donor site)中，推測旁觀者效應可能會增加剪接供體位點被破壞的機會而改善GLA mRNA剪接模式。根據實驗結果顯示，本發明突破以往鹼基編輯系統應用上的限制，除了修改目標位置IVS4+919G>A，也利用旁觀者效應使腺嘌呤鹼基編輯策略發揮最大效益，促進基因功能恢復(如圖1B所示)。

目前使用於基因治療上的遞送工具可以分成病毒載體系統以及非病毒系統。其中病毒載體系統中，AAV載體可承載的基因大小約為4.7kb，然而在本發明中所使用的SpCas9序列大小約為4.1kb，再加上啟動子、sgRNA以及去氨酶的序列便會超過AAV的承載限制。為了使AAV能夠攜帶以SpCas9作為核切酶的基因編輯系統感染活體動物，Split-intein系統克服了AAV的承載限制，該系統可以將SpCas9的序列拆成5’端以及3’端，並且分別裝載進兩個AAV載體，被AAV感染的細胞分別轉譯出SpCas9蛋白的N端以及C端後，會透過內含肽(intein)進行蛋白質剪接(protein-splicing)的機制而將SpCas9組裝成具有功能的全長而進行基因編輯。

除了將基因編輯系統的DNA序列裝載至病毒載體送入細胞表現之外，也能以mRNA或是Cas9/sgRNA核糖核蛋白複合物(ribonucleoprotein complexes，RNPs)的形式裝載至非病毒載體，例如：脂微粒(liposome)或是脂質奈米顆粒(lipid nanoparticle)。而此類遞送系統的優點在於進入細胞後便能瞬時的進行基因編輯。此外，由於mRNA以及RNPs在細胞內很快就被降解掉，因此大幅降低脫靶效應。以上的方式使得基因編輯系統在活體內的遞送有更多選擇，期望未來能夠進一步將基因編輯系統應用於心臟型法布瑞氏症患者。

除了將基因編輯系統進行活體內遞送之外，活體外的基因編輯也提供了不同的治療方式。在本發明的實驗中，透過電穿孔的方式將帶有IVS4+919 G>A突變的纖維母細胞進行基因編輯，並且篩選出能夠成功恢復GLA基因單一細胞株，驗證了該策略的可行性。另外，誘導性全能幹細胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)為在活體外進行基因編輯相當有潛力的細胞模型。與本發明實驗方法相同，未來可以將基因編輯應用在帶有IVS4+919G>A突變點之法布瑞氏症患者所培養出的iPSCs。先前的文獻指出由iPSCs所分化的心肌細胞能夠修復受損的心臟，因此若是將心臟型法布瑞氏症患者的iPSCs進行修改和分化後再打回患者體內，可望改善患者心臟的症狀。此外，也能使用CD34+造血幹細胞(hematopoietic stem cells，HSPCs)進行修改，再以自體幹細胞移植的方式治療法布瑞氏症患者，由先前臨床試驗中也指出能夠提升患者血漿中的酵素活性，並且降低血液以及尿液中的lyso-Gb3。

本文中的用語「一」或「一種」係用以敘述本發明之元件及成分。此術語僅為了敘述方便及給予本發明之基本觀念。此敘述應被理解為包括一種或至少一種，且除非明顯地另有所指，表示單數時亦包括複數。於申請專利範圍中和「包含」一詞一起使用時，該用語「一」可意謂一個或超過一個。

本文在申請專利範圍中所使用之術語「或」意指「及/或」，除非有明確表示要僅意指另一個選擇，或除非其他的選擇互相排斥。

基於CRISPR/Cas9系統，本發明提供一種組合物，其包含一聚核苷酸，其包含：(a)一編碼Cas9核酸酶的鹼基序列；(b)一編碼一靶向具有c.639+919G>A突變點之GLA基因內含子(intron)4的第一引導RNA之鹼基序列；以及(c)一編碼一靶向具有c.639+919G>A突變點之 GLA基因內含子4的第二引導RNA之鹼基序列，其中該第一引導RNA和第二引導RNA的序列長度為17至24個核苷酸(nucleotide，nt)，且該第一引導RNA所靶向的目標序列為c.639+919G>A突變點之上游序列，其包含CTCTGAGAAGAAAATTAAAC(SEQ ID NO：1)或TCTCAGAGCTCCACACTATT(SEQ ID NO：2)，和該第二引導RNA所靶向的目標序列為c.639+919G>A突變點之下游序列，其包含TTGACTGTATCTCTCGCATA(SEQ ID NO：3)或GATACAGTCAAAGTCAGACA(SEQ ID NO：4)。

上述突變點位置及GLA基因序列上的基因位置是以人類GLA的NM_000169做為參考序列來判定。

使用Cas9及引導RNA進行基於CRISPR的基因體編輯，可使得基因體DNA達成序列特異性裂解。舉例而言，可將編碼Cas9核酸酶的核酸及編碼適當引導RNA的核酸設置於各別載體上或一同設置於單個載體上且活體內或活體外施予以剔除或校正基因突變。Cas9分子進行適當位置的結合所需要的短序列稱為前間隔相鄰模體(Protospacer adjacent motif，PAM)，PAM 5’端相鄰的序列為前間隔序列(protospacer sequence)，其反向股之間隔序列(spacer sequence)則能夠與引導RNA互相結合。當表現引導RNA及Cas9時，引導RNA與Cas9結合為複合物，Cas9辨識PAM且引導RNA與間隔序列互補結合，使Cas9核酸酶於前間隔序列5’端產生剪切位點，並在該序列中啟動雙股斷裂(DSB)。為了修復此等斷裂，細胞典型地利用容易出錯的非同源末端接合(NHEJ)機制，該機制可經由密碼子插入或缺失、讀框移位而破壞目標基因的功能，或促使過早終止密碼子觸發無義介導的衰減。

由於，GLA基因上IVS4+919G>A突變會造成異常的mRNA選擇性剪接，使得外顯子4與外顯子5之間插入一段57個核苷酸的內含子序列(c.639+867至c.639+922)。因此，本發明所設計CRISPR系統中的2條引導RNA分別靶向之範圍為GLA基因組上57個核苷酸序列之上游及下游。於一具體實施例中，該第一引導RNA所靶向的目標序列包含GLA基因組上c.639+867至c.639+922的上游序列。於另一具體實施例中，該第二引導RNA所靶向的目標序列包含GLA基因組上c.639+867至c.639+922的下游序列。進一步來看，c.639+919G>A突變位於造成異常mRNA剪接的57個核苷酸之內含子序列中(c.639+867至c.639+922)，因此該引導RNA靶向之範圍為c.639+919G>A突變點上游及下游。於一具體實施例中，該第一引導RNA所靶向的序列包含GLA基因組上c.639+919G>A突變點的上游序列。於另一具體實施例中，該第二引導RNA所靶向的序列包含GLA基因組上c.639+919G>A突變點的下游序列。故CRISPR系統作用於GLA基因所造成的缺失序列需包含c.639+919G>A突變點。

於一具體實施例中，該第一引導RNA所靶向的目標序列是位於c.639+919G>A突變點往5’端方向的內含子序列中。於另一具體實施例中，該第二引導RNA所靶向的目標序列是位於c.639+919G>A突變點往3’端方向的內含子序列中。

在本發明中，該引導RNA的型態包含單一RNA分子(單引導RNA，sgRNA)或兩種各別RNA分子(包含tracrRNA及crRNA)形式結合。於一具體實施例中，該引導RNA為單引導RNA。

在本發明中，該Cas9核酸酶包含但不限於SpCas9(化膿鏈球菌Cas9(Streptococcus pyogenes Cas9))核酸酶、SaCas9(金黃色葡萄球菌Cas9(Staphylococcus aureus Cas9))核酸酶、ScCas9(犬鏈球菌Cas9(Streptococcus canis Cas9))核酸酶及其變異體或衍生物。於一具體實施例中，該SpCas9核酸酶包含HiFi Cas9核酸酶。

在一些實施例中，引導RNA將Cas9核酸酶導引至目標序列，且引導RNA與該目標序列雜交，隨後其可發生裂解或切割。Cas9作用的目標序列包括基因體DNA之正股及負股(亦即，指定的序列及該序列之反向股)，因為Cas9之核酸受質為雙股核酸。因此，在引導RNA會與目標序列互補之情況下，應理解，引導RNA可結合至目標序列之反向股。另外，一般設計上，該引導RNA的序列需與該目標序列之反向股完全配對；但是本發明證實該引導RNA的序列與該目標序列之反向股之間有1-2個鹼基對配對錯誤，其並不影響基因編輯的效率。在一實施例中，該第一或第二引導RNA與該目標序列的反向股進行結合，且結合程度為完全配對，或是有1-2個鹼基對配對錯誤(mismatch)。

另外，在一些實施例中，本發明的引導RNA序列之5’端的核苷酸若不為鳥嘌呤(G)時，則將一或多個鳥嘌呤添加至該序列的5’端。在一些情況下轉錄需要5’G在引導RNA的設計中，其可使得CRISPR/Cas9系統作用的效率提升。於一具體實施例中，該第一或第二引導RNA的的序列上5’端之鹼基為鳥嘌呤。

於一具體實施例中，該第一引導RNA和第二引導RNA的序列長度為17至20個核苷酸。於一較佳具體實施例中，該第一引導RNA和第二引導RNA的序列長度為20個核苷酸。

於另一具體實施例中，該第一引導RNA的序列包含GTCTGAGAAGAAAATTAAAC(sgRNA1)(SEQ ID NO：5)或GCTCAGAGCTCCACACTATT(sgRNA2)(SEQ ID NO：6)。該sgRNA1所識別的目標序列為CTCTGAGAAGAAAATTAAAC(SEQ ID NO：1)，且該sgRNA2所識別的目標序列為TCTCAGAGCTCCACACTATT(SEQ ID NO：2)。於一較佳具體實施例中，該第一引導RNA的序列包含SEQ ID NO：6(sgRNA2)。

於一具體實施例中，該第二引導RNA的序列包含GTGACTGTATCTCTCGCATA(sgRNA3)(SEQ ID NO：7)或GATACAGTCAAAGTCAGACA(sgRNA4)(SEQ ID NO：8)。該sgRNA3所識別的目標序列為TTGACTGTATCTCTCGCATA(SEQ ID NO：3)，且該sgRNA2所識別的目標序列為GATACAGTCAAAGTCAGACA(SEQ ID NO：4)。於一較佳具體實施例中，該第二引導RNA的序列包含SEQ ID NO：7(sgRNA3)。

由於GLA基因上IVS4 +919位點產生G>A的突變時，會導致內含子4中產生錯誤的剪接供體位點，進而發生異常的mRNA選擇性剪接，使得外顯子4與外顯子5之間插入一段57個核苷酸的內含子序列。因此，該第一引導RNA靶向該57個核苷酸的序列的上游，而該第二引導RNA靶向該57個核苷酸的序列的下游，透過CRISPR/Cas9系統於GLA基因上進行編輯並將57個核苷酸序列破壞，使細胞能表現正常的GLA mRNA。因此，該GLA基因上包含57個核苷酸的序列AGCTCCACACTATTTGGAAGTATTTGTTGACTTGTTACCATGTCTCCCCACTAAAGT(SEQ ID NO：9)，以及c.639和c.640(NM_000169)之間之可被Cas9核酸酶作用之內含子4序列。

於另一具體實施例中，該聚核苷酸進一步包含一啟動子，其用於調控該編碼靶向具有c.639+919G>A突變點之GLA基因內含子4的第一以及第二引導RNA之鹼基序列或該編碼SpCas9核酸酶之鹼基序列。於一較佳具體實施例中，該啟動子序列包含U6啟動子。該U6啟動子用於表現該編碼靶向具有c.639+919G>A突變點之GLA基因內含子4的第一以及第二引導RNA之鹼基序列。於另一具體實施例中，該啟動子包含CMV啟動子。該CMV啟動子用於表現該編碼SpCas9核酸酶之鹼基序列。

另外，基於腺嘌呤鹼基編輯器(ABE)的系統，本發明也提供一種組合物，其包含一聚核苷酸，其包含：(a)一編碼Cas9缺口酶的鹼基序列；(b)一編碼一靶向具有c.639+919G>A突變點之GLA基因內含子4的引導RNA之鹼基序列；以及(c)一編碼去氨酶的鹼基序列，其中該引導RNA的序列長度為17至24個核苷酸，且該引導RNA靶向一具有c.639+919G>A突變點的目標序列，該目標序列上的c.639+919G>A突變點要對應在該引導RNA的作用範圍內。

上述c.639+919G>A的位置是以人類GLA的NM_000169做為參考序列來判定。

在本發明中，該Cas9缺口酶包含但不限於SpCas9缺口酶、SaCas9缺口酶、ScCas9缺口酶及其變異體或衍生物。Cas9缺口酶的核酸酶域中之保守胺基酸可經取代以降低或改變核酸酶活性。在一些實施例中，Cas9缺口酶可包含RuvC或RuvC樣核酸酶域中之胺基酸取代。RuvC或RuvC樣核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括D10A，如nCas9。於一具體實施例中，該Cas9缺口酶包含nCas9。

該腺嘌呤鹼基編輯器(ABE)是以SpCas9缺口酶(如nCas9)、引導RNA以及去氨酶為主要組成，其中nCas9在與引導RNA結合的非編輯股進行單邊序列的切割時會形成小缺口，並在sgRNA所作用的目標序列上造成鹼基轉換，其中在目標序列上有一範圍稱為鹼基編輯窗口，在此窗口內的鹼基轉換效率最佳。鹼基編輯窗口的範圍隨著Cas9缺口酶以及鹼基編輯系統的演化而有所不同，於ABE7.9中，該的定義為目標序列上5’端往3’端方向的第4至第9個鹼基對的位置之間；ABEmax則為第4至第7個鹼基對的位置之間；ABE8e則為第4至第8個鹼基對的位置之間；其中使用SpCas9-VQR(n)的ABE系統其鹼基編輯窗口範圍為第3至第11個鹼基對的位置之間。因此，該去氨酶會在此鹼基編輯窗口內進行鹼基轉換的效率最高，以達到特定鹼基編輯的效果。最終，該腺嘌呤鹼基編輯器能夠將該鹼基編輯窗口內的腺嘌呤(A)轉變成鳥嘌呤(G)。故在本發明的設計上，該引導RNA要靶向一具有c.639+919G>A突變點的目標序列，而該目標序列上的c.639+919G>A突變點要落在該引導RNA所對應的前間隔序列內，並落在前間隔序列上5’端往3’端方向的第3至第11個鹼基對的位置之間。於一具體實施例中，該引導RNA的作用範圍是位於該引導RNA序列上5’端往3’端方向的第3至第11個鹼基對的位置之間。於一較佳具體實施例中，該引導RNA的作用範圍是位於該引導RNA序列上5’端往3’端方向的第4至第9個鹼基對的位置之間。於一更佳具體實施例中，該引導RNA的作用範圍是位於該引導RNA序列上5’端往3’端方向的第4至第7個鹼基對的位置之間。

由於本發明是針對c.639+919G>A(IVS4+919 G>A)這個點突變做修正，故該編碼靶向GLA基因上包含內含子4之c.639+919G>A突變點的序列的引導RNA的鹼基序列(包含sgRNA5或sgRNA6)能使得目標IVS4+919G>A這個位點能夠落在此鹼基編輯窗口內。如本發明的實施例，sgRNA5可使目標位點落在前間隔序列的第4個位置，而sgRNA6則使目標位點落在第5個位置，並且發現ABE可使得IVS4+919相鄰的A一併被修改成G，可破壞剪接供體位點以促進正常GLA mRNA的恢復。於一具體實施例中，於GLA基因上，該sgRNA5所辨識的目標序列包含CTAAAGTGTAAGTTTCATGA(SEQ ID NO：10)，sgRNA6所辨識的目標序列包含ACTAAAGTGTAAGTTTCATG(SEQ ID NO：11)。

另外，該引導RNA的序列需與該目標序列之反向股完全配對；但是本發明證實該引導RNA的序列與該目標序列之反向股之間有1-2個鹼基對不配對，其並不影響基因編輯的效率。在一實施例中，該引導RNA 與該目標序列的反向股進行結合，且結合程度為完全配對，或是有1-2個鹼基對配對錯誤。

在一些實施例中，本發明的引導RNA序列之5’端的核苷酸若不為鳥嘌呤(G)時，則將一或多個鳥嘌呤添加至該序列的5’端。在一些情況下轉錄需要5’G在引導RNA的設計中，其可使得ABE系統作用的效率提升。於一具體實施例中，該引導RNA的的序列上5’端之鹼基為鳥嘌呤。

於一具體實施例中，該引導RNA的序列長度為17至20個核苷酸。於一較佳具體實施例中，該引導RNA的序列長度為20個核苷酸。

於另一具體實施例中，該引導RNA的序列包含GTAAAGTGTAAGTTTCATGA(sgRNA5)(SEQ ID NO：12)或GCTAAAGTGTAAGTTTCATG(sgRNA6)(SEQ ID NO：13)。於一較佳具體實施例中，該引導RNA的序列包含SEQ ID NO：13(sgRNA6)。

於一具體實施例中，該聚核苷酸進一步包含一啟動子，其用於調控該編碼靶向具有c.639+919G>A突變點之GLA基因內含子4的引導RNA之鹼基序列、該編碼Cas9缺口酶的鹼基序列或該編碼去氨酶的鹼基序列。於一較佳具體實施例中，該啟動子包含U6啟動子。U6啟動子用於表現該編碼靶向具有c.639+919G>A突變點之GLA基因內含子4的引導RNA之鹼基序列。於另一具體實施例中，該啟動子包含EFS啟動子。EFS啟動子用於表現該編碼Cas9缺口酶及去氨酶的鹼基序列。

在本發明中，該聚核苷酸進一步包含一啟動子，其可操作地連接至編碼引導RNA的鹼基序列或是編碼Cas9或去氨酶的鹼基序列。如本文所用，「啟動子」意謂能夠賦予、活化或增強細胞中核酸之表現的合成或天然衍生型分子。啟動子可包含一或多個特定轉錄調節序列，以進一步增強表現及/或改變其空間表現及/或時間表現。在一些實施例中，該啟動子可驅動並連接至該編碼一靶向具有c.639+919G>A突變點之GLA基因內含子4的引導RNA之鹼基序列、該編碼SpCas9核酸酶的鹼基序列、該編碼Cas9缺口酶的鹼基序列及/或該編碼去氨酶的鹼基序列中之各者的上游。可能連接的啟動子並無特定限制，只要其在目標細胞中顯示啟動子活性即可。可能連接至該編碼SpCas9核酸酶的鹼基序列、該編碼Cas9缺口酶的鹼基序列或該編碼去氨酶的鹼基序列之啟動子的實例包括，但不限於：EFS啟動子、CMV(巨大細胞病毒)啟動子、CK8啟動子、MHC啟動子、MYOD啟動子、hTERT啟動子、SRα啟動子、SV40啟動子、LTR啟動子、CAG啟動子、RSV(勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))啟動子及類似者。可能連接至該編碼靶向GLA基因的引導RNA的鹼基序列的啟動子之實例包括，但不限於：U6啟動子、SNR6啟動子、SNR52啟動子、SCR1啟動子、RPR1啟動子、U3啟動子、H1啟動子及tRNA啟動子(其為pol III啟動子)及類似者。

另外，本發明的組合物可進一步包含一載體，其中該載體承載上述聚核苷酸。因此，具有CRISPR/Cas9系統的聚核苷酸或是具有ABE系統的聚核苷酸會位於該載體中。在本發明中，該組合物可以包含一或多個載體，可分別承載不同的鹼基序列片段。於一具體實施例中，該組合物包含一載體，其中該聚核苷酸位於該載體中。

於一具體實施例中，該載體為質體載體、非病毒載體或病毒載體。本發明之載體係質體載體時，意欲使用的質體載體並無特定限制且可為任何質體載體(諸如選殖質體載體及表現質體載體)。質體載體係藉由將本發明之聚核苷酸藉由已知方法插入質體載體中來製備。於一較佳具體實施例中，該病毒載體包含腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒或仙台病毒載體(Sendaivirus vector)。在本說明書中，「病毒載體」亦包括其衍生物。考慮到在基因療法中之用途，出於可以長時間表現轉基因的原因，較佳係使用AAV載體，及其係衍生自非致病性病毒且具有高安全性。可藉由已知方法來製備包含本發明之聚核苷酸之病毒載體。簡言之，製備其中已插入本發明之聚核苷酸的用於病毒表現之質體載體，該載體係經轉染至適宜宿主細胞中以允許短暫產生包含本發明之聚核苷酸之病毒載體，及收集病毒載體。在本發明之一個實施例中，當使用AAV載體時，AAV載體之血清型並無特定限制，及可使用AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10中之任何者及其變體及類似者。於另一具體實施例中，該非病毒載體包含脂微粒(liposome)或是脂質奈米顆粒。

本發明另外提供一種醫藥組合物用於製備一用於治療法布瑞氏症之藥物的用途，其中該醫藥組合物包含一上述組合物。

在本發明中，該醫藥組合物包含具有CRISPR/Cas9系統的聚核苷酸或是其載體。另外，該醫藥組合物包含具有ABE系統的聚核苷酸或是其載體。

如本文中之該組合物可根據待使用之施予模式調配。在組合物為可注射醫藥組合物之情況下，其為無菌、無熱原質且無微粒的。較佳使用等張調配物。一般而言，等張性添加劑可包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇及乳糖。在一些情況下，等張溶液，諸如磷酸鹽緩衝生理鹽水為較佳的。穩定劑包括明膠及白蛋白。在一些實施例中，向調配物中添加血管收縮劑。

該醫藥組合物可進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。醫藥學上可接受之賦形劑可為功能性分子，其呈媒劑、佐劑、載劑或稀釋劑形式。醫藥學上可接受之賦形劑可為轉染促進劑，其可包括表面活性劑，諸如免疫刺激性複合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐劑(Freunds incomplete adjuvant)、包括單磷醯基脂質A之LPS類似物、胞壁醯基肽、醌類似物、囊泡，諸如角鯊烯及角鯊烯、玻尿酸、脂質、脂質體、鈣離子、病毒蛋白質、聚陰離子、聚陽離子或奈米粒子，或其他已知之轉染促進劑。

此外，本發明提供一種治療法布瑞氏症的方法，包含向一罹患法布瑞氏症的個體施予一醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含上述組合物。

於一具體實施例中，該醫藥組合物包含具有CRISPR/Cas9系統的聚核苷酸或是其載體。於另一具體實施例中，該醫藥組合物包含具有ABE系統的聚核苷酸或是其載體。

如本文所使用的，術語「治療」是指緩解症狀或併發症；延緩疾病、病症或病情的進展；減輕或緩解症狀和併發症；及/或治癒或消除疾病，病症或病情。

在一些實施例中，該方法或用途引起基因編輯。在一些實施例中，使用到CRISPR/Cas9系統之方法或用途會引起目標基因內之雙股斷裂。在一些實施例中，使用到CRISPR/Cas9系統之方法或用途會引起在DSB之非同源端連接期間形成插入缺失突變。在一些實施例中，使用到CRISPR/Cas9系統之方法或用途會引起目標基因中之核苷酸插入或缺失。在一些實施例中，目標基因中之核苷酸插入或缺失引起讀框轉移突變或過早終止密碼子產生非功能蛋白質。在一些實施例中，目標基因中之核苷酸插入或缺失引起目標基因表現之阻斷或消除。

在一些實施例中，使用到腺嘌呤鹼基編輯器(ABE)之方法或用途，該編輯器會使目標基因之A和T鹼基對轉化為基因組DNA中之G和C。

如本文所用，「基因編輯」係指改變基因。基因編輯可包括校正或恢復突變基因。基因編輯可包括基因(諸如突變基因或正常基因)之基因剔除。基因編輯可用於藉由改變相關基因來治療疾病。

根據本發明，該罹患法布瑞氏症的個體的GLA基因具有內含子剪接突變(Intronic splicing mutation)IVS4+919G>A，該突變點為GLA基因上第4個內含子(IVS4)中第919個核苷酸產生了鳥嘌呤(G)變成腺嘌呤(A)的點突變。於一具體實施例中，該罹患法布瑞氏症的個體的GLA 基因上具有IVS4+919G>A(c.639+919G>A)突變點。

於另一具體實施例中，該個體為動物，較佳為哺乳類，更佳為人類。

本發明之包含上述聚核苷酸或是具有上述聚核苷酸的載體之組合物可藉由不同途徑施予該個體，包括經口、非經腸、舌下、經皮、經直腸、經黏膜、表面、經由吸入、經由頰內投與、胸膜內、靜脈內、動脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、鼻內鞘內及關節內或其組合。在某些實施例中，將本發明之組合物以肌肉內、靜脈內或其組合形式施予至該個體。組合物可藉由傳統注射器、無針注射裝置、「微彈轟擊槍(microprojectile bombardment gone gun)」或其他物理方法(諸如電穿孔(「EP」))或超音波施予。

根據本發明，包含上述聚核苷酸或是具有上述聚核苷酸的載體之組合物針對個體之劑量並無特定限制，只要其係用於治療之有效量即可。其可根據活性成分、劑型、個體的年齡及體重、投藥時間表、投藥方法及類似者適宜地最佳化。

本發明另提供一種用於對細胞進行基因修飾的方法，其包含將上述組合物遞送至一離體細胞中，其中該離體細胞是來自一罹患法布瑞氏症的個體，且該離體細胞包含一具有c.639+919G>A突變點之GLA基因。

於一具體實施例中，該離體細胞包含幹細胞。於一較佳具體實施例中，該幹細胞包含誘導性全能幹細胞(iPSCs)或造血幹細胞。於一更佳具體實施例中，該幹細胞(如誘導性全能幹細胞或造血幹細胞)是從該罹患法布瑞氏症的個體之細胞進行培養而得。於另一具體實施例中，該罹患法布瑞氏症的個體的GLA基因上具有IVS4+919G>A(c.639+919G>A)突變點。於一較佳具體實施例中，該罹患法布瑞氏症的個體的GLA基因的第4個內含子上具有c.639+919G>A突變點。

該組合物之遞送可為作為在細胞中表現且遞送至細胞表面之核酸分子(如聚核苷酸)的組合物之轉染或電穿孔。核酸分子可使用BioRad基因脈衝發生器或Amaxa核轉染IIb裝置進行電穿孔。可使用若干不同緩衝劑，包括BioRad電穿孔溶液，Sigma磷酸鹽緩衝生理鹽水產品#D8537(PBS)、Invitrogen OptiMEM I(OM)或Amaxa Nucleofector溶液V(N.V.)。轉染可包括轉染試劑，諸如脂染胺2000。

在將本發明之組合物遞送至細胞後，經轉染細胞將表現引導RNA分子及Cas9分子，以改變細胞內基因表現或再工程改造或改變基因組。因此，本發明之組合物可引入至細胞中以基因校正GLA基因。由於該細胞為該罹患法布瑞氏症的個體的誘導性全能幹細胞或造血幹細胞，故該誘導性全能幹細胞或造血幹細胞透過該組合物進行基因校正後，再誘導分化成心肌細胞重新植入該個體體內，以治療法布瑞氏症。

本發明進一步提供一種治療法布瑞氏症的方法，其包含：(a)從一組織分離或培養出幹細胞，其中該組織來自一罹患法布瑞氏症的個體，且該幹細胞包含一具有c.639+919G>A突變點之GLA基因；(b)將上述組合物遞送至該幹細胞中，其中該組合物會對該幹細胞中GLA基因上c.639+919G>A突變點進行基因編輯以修正該突變點；以及(c)使步驟(b)中基因修正後的幹細胞分化成心肌細胞，並將該心肌細胞施予到該罹患法布瑞氏症的個體之心臟內。

因此，本發明透過遞送含有CRISPR/Cas9或是ABE之基因編輯系統的聚核苷酸來治療法布瑞氏症。該些聚核苷酸可建立在一基因構築體。如本文所用，「基因構築體」係指DNA或RNA分子，其包含編碼核酸分子/蛋白質之核苷酸序列。編碼序列包括可操作地連接至調節元件之起始及終止信號，該等調節元件包括能夠導引在施予核酸分子之個體之細胞中表現的啟動子及聚腺苷酸化訊號。因此，該基因構築體含有可操作地連接至編碼核酸分子/蛋白質之編碼序列的必需調節元件，使得當存在於個體之細胞中時，將表現編碼序列。

是以，本發明證實藉由基因編輯的方式直接修改心臟型法布瑞氏症細胞的基因組，確實能夠達到良好的治療效果，使細胞能夠自行產生GLA蛋白酵素而達到永久的治療效果，進而可應用在法布瑞氏症患者的治療方案上。

圖1為實驗設計概念圖，其顯示將基因編輯應用於帶有GLA IVS4+919G>A的患者細胞中。圖1A為CRISPR/Cas9系統之應用。GLA IVS4+919G>A突變狀態下，導致內含子4中57個核苷酸的插入而造成異常的mRNA剪接模式，因此分別在突變點上下游設計合適的sgRNA，透過HiFi Cas9在GLA基因序列上產生雙股斷裂，並以非同源性末端接合(NHEJ)的方式形成缺失。圖1B為腺嘌呤鹼基編輯器(ABE)之應用。設計長度為20個核苷酸的sgRNA，使得目標位點GLA IVS4+919G>A能夠落在sgRNA內，並觀察GLA IVS4+919 G>A、+918及+920的鹼基編輯情況。

圖2顯示運用CRISPR/Cas9系統於IVS4+919G>A的心臟型法布瑞氏症纖維母細胞中之實驗設計以及sgRNA效率的篩選。圖2A顯示透過HiFi Cas9在造成GLA mRNA異常剪接的57個核苷酸的上下游產生雙股斷裂，並以非同源性末端接合的方式形成缺失，進而改變mRNA剪接模式。圖2B顯示代理報導系統之原理。圖2C顯示質體HiFi Cas9-sgRNA2+3。圖2D顯示sgRNA2以及sgRNA3作用在GLA基因上的位置，並預期可產生97bp的缺失。該GLA基因包含以下序列：5’-TCTCAGAGCTCCACACTATTTGGAAGTA-3’(SEQ ID NO：58)、5’-CACTAAAGTGTAAGTTTCATGAGG-3’(SEQ ID NO：59)、5’-TTTGACTGTATCTTCCGCATATGG-3’(SEQ ID NO：60)、3’-AGAGTCTCGAGGTGTGATAAACCTTCAT-5’(SEQ ID NO：61)、3’-GTGATTTCACATTCAAAGTACTCC-5’(SEQ ID NO：62)和3’-AAACTGACATAGAGAGCGTATACC-5’(SEQ ID NO：63)。

圖3顯示將CRISPR/Cas9系統應用於IVS4+919G>A的心臟型法布瑞氏症纖維母細胞。將同時帶有HiFi Cas9以及sgRNA的質體以電穿孔的方式轉染到帶有IVS4+919G>A的心臟型法布瑞氏症纖維母細胞48小時後，並以嘌黴素(puromycin)作用66小時篩選出成功轉染的細胞。圖3A顯示以聚合酶連鎖反應觀察基因編輯效率。未產生缺失之片段大小：293bp；產生缺失之片段預期大小：196bp。圖3B顯示將膠圖以Image J進行定量，分析基因編輯效率。圖3C顯示以定量即時聚合酶連鎖反應針對GLA正常以及異常之mRNA剪接模式進行定量分析，其中以β-肌動蛋白(β-actin)作為標準化依據，並以野生型纖維母細胞的表現量作為1，以及未處理之IVS4細胞作為對照組。利用單因子變異數分析(one-way ANOVA)分析，並以學生t檢定(Student’s t-test)分析兩組之間的差異。柱狀圖以平均值±標準差(mean±SD)呈現，*表示p<0.05。圖3D顯示利用西方墨點法分析GLA蛋白表現量，以GAPDH作為標準化依據。圖3E顯示GLA蛋白表現量之量化結果，並以野生型纖維母細胞的表現量作為1。圖3F顯示偵測細胞內GLA酵素活性，並以野生型纖維母細胞的酵素活性作為100%，以及未處理之IVS4作為對照組。利用單因子變異數分析進行分析，並以學生t檢定分析兩組之間的差異。柱狀圖以平均值±標準差呈現，*表示p<0.05。WT：野生型；ns：無顯著差異。

圖4顯示將腺嘌呤鹼基編輯系統應用於IVS4+919G>A的心臟型法布瑞氏症纖維母細胞。圖4A顯示在GLA基因組上設計2條sgRNA，使得目標位點IVS4+919G>A能夠落在鹼基編輯窗口內，其中sgRNA5可使目標落在前間隔序列的第4個位置，而sgRNA6則使目標落在第5個位置，其中畫底線區域為剪接供體位點。該GLA基因包含5’-GTATTTGTTGACTTGTTACCATGTCTCCCCACTAGAGTGTAAGTTTC ATGAGGGCAGGGAC-3’(SEQ ID NO：64)和3’-CATAAACAACTGAACAATGGTACAGAGGGGTGATCTCACATTCAAAGTGTCCCGTCCCTG-5’(SEQ ID NO：65)。圖4B顯示質體ABEmax-sgRNA5以及ABEmax-sgRNA6。圖4C顯示透過免疫螢光針對SpCas9作染色，並以DAPI進行細胞核定位。圖4D顯示將ABEmax-sgRNA5或ABEmax-sgRNA6的質體以電穿孔的方式轉染到帶有IVS4+919G>A的心臟型法布瑞氏症纖維母細胞，並以嘌黴素篩選出成功轉染的細胞。透過Sanger定序觀察鹼基編輯的狀況。以實心箭頭標示目標位點IVS4+919，空心箭頭標示產生旁觀者效應的位點。在WT中的序列為TGTTGACTTGTTACCATGTCTCCCCACTAGAGTGTAAGTTTCATGAGGGCA(SEQ ID NO：66)，在IVS4+919 G>A中的序列為TGTTGACTTGTTACCATGTCTCCCCACTAAAGTGTAAGTTTCATGAGGGCA(SEQ ID NO：67)，在ABEmax-sgRNA5中的序列為TGTTGACTTGTTACCATGTCTCCCCACTAAGGTGTAAGTTTCATGAGGGCA(SEQ ID NO：68)，以及在ABEmax-sgRNA6中的序列為TGTTGACTTGTTACCATGTCTCCCCACTGGGGTGTAAGTTTCATGAGGGCA(SEQ ID NO：69)。圖4E透過次世代定序分析A轉換成G的比例，定序深度約為10000條讀數。

圖5顯示在經由鹼基編輯作用下的心臟型法布瑞氏症纖維母細胞之細胞團中，探討GLA mRNA以及GLA蛋白恢復情況。將ABEmax-sgRNA5或ABEmax-sgRNA6的質體以電穿孔的方式轉染到帶有IVS4+919G>A的心臟型法布瑞氏症纖維母細胞，並以嘌黴素篩選出成功轉染的細胞。圖5A顯示以定量即時聚合酶連鎖反應針對GLA正常以及異常之mRNA剪接模式進行定量分析，其中以β-肌動蛋白作為標準化依據，並以野生型纖維母細胞的表現量作為1，以及未處理之IVS4細胞作為對照組。圖5B顯示利用西方墨點法分析GLA蛋白表現量，以GAPDH作為標準化依據。圖5C顯示GLA蛋白表現量之量化結果，並以野生型纖維母細胞的表現量作為1，以及未處理之IVS4細胞作為對照組。圖5D顯示偵測細胞內GLA酵素活性，並以野生型纖維母細胞的酵素活性作為100%，以及未處理之IVS4細胞作為對照組。利用單因子變異數分析進行分析，並以杜氏事後檢定(Tukey’s post-hoc test)分析各組之間的差異。柱狀圖以平均值±標準差呈現，*表示p<0.05，**表示p<0.01。WT：野生型。

圖6顯示在經由鹼基編輯作用下的心臟型法布瑞氏症纖維母細胞之細胞團中，探討鹼基編輯作用下對序列產生的改變。針對成功轉染ABEmax-sgRNA5或ABEmax-sgRNA6的細胞團，透過次世代定序分析觀察不同基因編輯情形所佔的比例。WT：野生型。ABEmax-sgRNA5和ABEmax-sgRNA6中WT的序列為CTAGAGTGTAAGTTTCATGA(SEQ ID NO：70)，且ABEmax-sgRNA5和ABEmax-sgRNA6中IVS4+919 G>A的序列為CTAAAGTGTAAGTTTCATGA(SEQ ID NO：71)。

圖7顯示分析經由鹼基編輯作用下，準確修改回野生型序列IVS4+919G的單一細胞株之GLA基因功能恢復情況。圖7A顯示將經由鹼基編輯作用後的心臟變異型法布瑞氏症細胞團，篩選出IVS4+919A準確修改回野生型+919G的單一細胞株。以箭頭標示目標位點IVS4+919。在WT中的序列為 TGTTGACTTGTTACCATGTCTCCCCACTAGAGTGTAAGTTTCATGAGGGCA(SEQ ID NO：66)，在IVS4+919 G>A中的序列為TGTTGACTTGTTACCATGTCTCCCCACTAAAGTGTAAGTTTCATGAGGGCA(SEQ ID NO：67)，以及在細胞株+919 A>G中的序列為TGTTGACTTGTTACCATGTCTCCCCACTAGAGTGTAAGTTTCATGAGGGCA(SEQ ID NO：72)。圖7B顯示以定量即時聚合酶連鎖反應針對GLA正常以及異常之mRNA剪接模式進行定量分析，其中以β-肌動蛋白作為標準化依據，並以野生型纖維母細胞的表現量作為1，以及未處理之IVS4細胞作為對照組。柱狀圖為組內三重複之平均。圖7C顯示利用西方墨點法分析GLA蛋白表現量，以GAPDH作為標準化依據。圖7D顯示GLA蛋白表現量之量化結果，並以野生型纖維母細胞的表現量作為1，以及未處理之IVS4細胞作為對照組。圖7E顯示分析單一細胞株內GLA酵素活性，並以野生型纖維母細胞的酵素活性作為100%，以及未處理之IVS4細胞作為對照組。柱狀圖為組內二重複之平均。圖7F顯示在單一細胞株6-4中將Gb3代謝廢物進行免疫螢光染色，並以LAMP1作為溶酶體標誌物及使用DAPI進行核定位，圖中為600倍顯微鏡倍率拍攝視野。圖7G顯示使用200倍顯微鏡倍率拍攝視野，以Image J定量Gb3螢光強度及細胞核數目，計算出單一細胞之螢光強度，以未處理之IVS4細胞作為對照組。利用單因子變異數分析進行分析，並以杜氏事後檢定分析各組之間的差異。柱狀圖以平均值±標準差呈現，***表示p<0.001。WT：野生型。

圖8顯示分析旁觀者效應影響之下，基因型為IVS4+918_+920GGG的單一細胞株之GLA基因功能恢復情況。圖8A顯示將經由鹼基編輯作用後的心臟變異型法布瑞氏症細胞團，篩選出基因型為IVS4+918_+920GGG的單一細胞株。以實心箭頭標示目標位點IVS4+919，空心箭頭標示產生旁觀者效應的位點。在WT中的序列為TGTTGACTTGTTACCATGTCTCCCCACTAGAGTGTAAGTTTCATGAGGGCA(SEQ ID NO：66)，在IVS4+919 G>A中的序列為TGTTGACTTGTTACCATGTCTCCCCACTAAAGTGTAAGTTTCATGAGGGCA(SEQ ID NO：67)，以及在細胞株+918_+920 AAA>GGG中的序列為TGTTGACTTGTTACCATGTCTCCCCACTGGGGTGTAAGTTTCATGAGGGCA(SEQ ID NO：73)。圖8B顯示以定量即時聚合酶連鎖反應針對GLA正常以及異常之mRNA剪接模式進行定量分析，其中以β-肌動蛋白作為標準化依據，並以野生型纖維母細胞的表現量作為1，以及未處理之IVS4細胞作為對照組。柱狀圖為組內三重複之平均。圖8C顯示利用西方墨點法分析GLA蛋白表現量，以GAPDH作為標準化依據。圖8D顯示GLA蛋白表現量之量化結果，並以野生型纖維母細胞的表現量作為1，以及未處理之IVS4細胞作為對照組。圖8E顯示分析單一細胞株內GLA酵素活性，並以野生型纖維母細胞的酵素活性作為100%，以及未處理之IVS4細胞作為對照組。柱狀圖為組內二重複之平均。圖8F顯示在單一細胞株2-4、2-6以及2-8中將Gb3代謝廢物進行免疫螢光染色，並以LAMP1作為溶酶體標誌物及使用DAPI進行核定位，圖中為600倍顯微鏡倍率拍攝視野。圖8G顯示使用200倍顯微鏡倍率拍攝視野，以Image J定量Gb3螢光強度及細胞核數目，計算出單一細胞之螢光強度，以未處理之IVS4細胞作為對照組。利用單因子變異數分析進行分析，並以杜氏事後檢定分析各組之間的差異。柱狀圖以平均值±標準差呈現，**表示p<0.01，***表示p<0.001。WT：野生型；ns：無顯著差異。

圖9顯示分析旁觀者效應影響之下，將IVS4+920A修改成+920G的單一細胞株之GLA基因功能恢復情況。圖9A顯示將經由鹼基編輯作用後的心臟變異型法布瑞氏症細胞團，篩選出基因型為IVS4+920G的單一細胞株。以箭頭標示產生旁觀者效應的位點。在WT中的序列為TGTTGACTTGTTACCATGTCTCCCCACTAGAGTGTAAGTTTCATGAGGGCA(SEQ ID NO：66)，在IVS4+919 G>A中的序列為TGTTGACTTGTTACCATGTCTCCCCACTAAAGTGTAAGTTTCATGAGGGCA(SEQ ID NO：67)，以及在細胞株+920 A>G中的序列為TGTTGACTTGTTACCATGTCTCCCCACTAAGGTGTAAGTTTCATGAGGGCA(SEQ ID NO：74)。圖9B顯示以定量即時聚合酶連鎖反應針對GLA正常以及異常之mRNA剪接模式進行定量分析，其中以β-肌動蛋白作為標準化依據，並以野生型纖維母細胞的表現量作為1，以及未處理之IVS4細胞作為對照組。柱狀圖為組內三重複之平均。WT：野生型。

圖10顯示在心臟型法布瑞氏症纖維母細胞之細胞團中探討鹼基編輯作用所造成的脫靶效應。將ABEmax-sgRNA6的質體以電穿孔的方式轉染到帶有IVS4+919G>A的心臟型法布瑞氏症纖維母細胞，並以嘌黴素篩選出成功轉染的細胞(數量=3)。在11個產生脫靶效應的潛在序列中透過次世代定序分析A轉換成G的比例，在標靶(on-target)位置的定序深度約為10000條讀數，每個脫靶(off-target)位置的定序深度約為66,279~261,950條讀數。

本發明可以用許多不同的形式來實施並且不應被視為僅限於本文中所闡述之實例。所描述的實例並不限於如權利要求中所述之本發明範圍。

材料及方法

質體構築

本實驗所使用之質體皆委託台灣的中央研究院RNAi Core進行構築。所使用的質體如表1所示。

形質轉移(Transformation)

取1ng質體加入30μL ECOS^TM 101勝任細胞(Competent Cells)[DH5a](YB Biotech #FYE678-10VL)中，輕柔混和後，置於冰上10分鐘，以42℃乾浴槽處理45秒，再置於冰上5分鐘。加入1mL LB培養液進行修復，置於37℃培養箱以240rpm震盪培養1小時。接著以3000 rpm離心1分鐘，去除上清液並保留約100μL，混合均勻後加至含有青黴素(ampicillin)LB平盤(plate)上，均勻塗盤後，於37℃培養14至16小時後，挑選單一菌落進行大量質體的製備。

大量質體DNA的製備

本發明使用NucleoBond^® Xtra Midi Plus(Macherey-Nagel 740412.50)製備大量質體DNA供後續使用。從青黴素LB平盤上挑選單一菌落至3mL含有青黴素(50μg/mL)之LB培養液(broth)中，於37℃培養箱以240rpm震盪培養8小時小量菌液。將小量菌液全部加至150mL含有青黴素(50μg/mL)之LB培養液(broth)於錐形瓶中，於37℃培養箱以240rpm震盪培養14至16小時產生大量菌液。將大量菌液於4℃下以7500rpm高速離心15分鐘後倒掉上清液，以12mL RES緩衝液(buffer)將細菌完全打散，加入12mL LYS緩衝液輕輕翻轉4-5次後靜置5分鐘，加入12mL NEU緩衝液後翻轉數次使蛋白析出，倒入事先以25mL EQU緩衝液潤洗過的管柱(column)中，待過濾完再以8mL EQU緩衝液潤洗管柱後取下白色濾紙，並使用8mL清洗緩衝液(wash buffer)進行清洗，以5mL ELU緩衝液將質體DNA洗滌液(elute)於15mL離心管中，加入3.5mL異丙醇(isopropanol)，翻轉混合至分層消失。將8.5mL的液體利用50mL針筒過過濾器(filter)，為了避免過濾液內有殘留的質體DNA，將過濾液再以針筒過過濾器一次，此時質體DNA將附著於過濾器上，最後再以5mL 70% EtOH清洗後以空氣排乾過濾器，使用900μL Tris緩衝液將質體DNA洗滌液至微量離心管中，加入十分之一體積之3M醋酸鈉(sodium acetate) 混合均勻後，於4℃下以13200rpm離心20分鐘，此時質體DNA會沉澱於管底。加入1mL 70% EtOH清洗，於4℃下以13200rpm離心5分鐘，並重複此清洗步驟一次。將去除酒精的微量離心管放在室溫下，風乾後加入適當體積的水，37℃靜置回溶一小時，並保存於-20℃。將大量製備的質體DNA，透過限制酶消化反應進行確認。

膠體電泳分析

以瓊脂糖(Agarose)(AMRESCO #0710)與0.5X TBE緩衝液製備0.8%洋菜膠，並於配置時加入5μL/dL SafeView。將限制酶消化反應之產物取5μL以及1μL的6X電泳指示劑(loading dye)，並以Bio-1kb^TM Mass DNA梯狀條帶(Ladder)作為標誌(marker)，加至配置完成的洋菜電泳膠中，於電壓100V條件下進行電泳，直到DNA片段清楚地分離，再將瓊脂糖凝膠(agarose gel)以紫外光照膠系統確認片段大小是否正確。

細胞培養

人類心臟型法布瑞氏症患者纖維母細胞株以及人類野生型纖維母細胞株使用的培養液為高葡萄糖DMEM(high-glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium；Gibco #12100-100)，其中含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS；Gibco#10437-028)、1%麩胺酸(Glutamine；BI #03-020-1b)、1%丙酮酸鈉(Sodium pyruvate；BI #03-042-1b)以及1%非必需胺基酸(Non-Essential Amino Acids；BI #01-340-1b)。繼代於10公分培養皿中，培養於37℃、5% CO₂的細胞培養箱中，每2-3天以1：3的比例繼代一次。

細胞電穿孔

使用Ingenio®電穿孔套組和溶液(Electroporation Kits and Solutions)(Mirus #MR-MIR50115)進行細胞電穿孔實驗。將人類纖維母細胞去除培養液後，以PBS溶液清洗一次，接著再以胰蛋白酶(trypsin)於37℃作用5分鐘，使細胞從培養盤上脫落後，接著將細胞從培養盤上沖起後置於離心管中，進行細胞計數。取2x10⁵顆細胞離心後去除上清液，以100μL電穿孔專用溶液進行回溶，並與4μg之質體混合均勻後，將質體-細胞混合物加至電穿孔專用光析管(cuvette)，放置於Lonza Nucleofector^TM 2b裝置，以程式U-030進行電穿孔，最後將電穿孔後的細胞取出並加至含有1ml細胞培養液的12孔培養盤中進行培養。轉染24小時後，吸除死亡的細胞並置換新的細胞培養液，接著觀察細胞貼附狀況，以及控制組GFP的表現來推算成功轉染的細胞數。轉染48小時後，以2μg/ml的嘌黴素(Puromycin)進行篩選，成功轉染帶有嘌黴素篩選標誌(puromycin selection marker)的細胞就會存活下來，待控制組的細胞全數死亡之後，置換回細胞培養液，進行細胞培養以供後續實驗所用。

細胞DNA萃取

使細胞從培養盤上脫落後，將細胞沖起置於離心管中，離心5分鐘(3000rpm，4℃)，去除上清液後加入PBS清洗細胞，離心5分鐘(3000rpm，4℃)，去除所有的上清液後，使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN #51306)進行細胞DNA萃取。首先，加入180μL緩衝液ATL以及20μL蛋白質酶K(proteinase K)，震盪約15秒鐘至細胞完全被打散，置於56℃乾浴槽1~3小時直到細胞完全被打破，使細胞內DNA釋出。接著加入200μL緩衝液AL，震盪約15秒鐘混合均勻後，置於70℃乾浴槽反應10分鐘，再加入200μL 100% EtOH，震盪約15秒鐘混合均勻後，將所有液體轉移至純化管柱(spin column)中，以8000rpm於室溫下離心1分鐘並丟棄過濾液，加入500μL緩衝液AW1清洗，以8000rpm於室溫下離心1分鐘並丟棄過濾液，接著再加入500μL緩衝液AW2清洗，以最高速於室溫下離心3分鐘並丟棄過濾液，再使用最高速於室溫下離心1分鐘以確保DNA無酒精、液體的殘留。將純化管柱置於新的微量離心管上，加入20μL ddH₂O至純化管柱孵育5分鐘後，以8000rpm於室溫下離心1分鐘，所得過濾液即為DNA，保存於-20℃冰箱。

細胞基因型鑑定

將聚合酶連鎖反應(PCR)後產物利用Sanger定序以及次世代定序(Next Generation Sequencing，NGS)來鑑定細胞經由基因編輯後的基因型。引子(primer)設計的位置於GLA基因的第4個內含子(Intron 4)上，其中包含IVS4+919這個位點，使用GLA-IVS4_F以及GLA-IVS4_R可得PCR後產物大小為446bp；使用GLA-IVS4_1F以及GLA-IVS4_1R可得PCR後產物大小為232bp。相關引子內容如表2所示。

表2、核酸引子列表

待PCR反應完成後，以瓊脂糖與0.5X TBE緩衝液製備1.5%洋菜膠，於電壓100V條件下進行膠體電泳，以紫外光照膠系統確認片段大小是否正確後，進一步以定序做基因型鑑定。

脫靶位點分析(Off-target site analysis)

利用Cas-OFFinder預測潛在的脫靶位點，接著使用Illumina設計次世代定序專用之核酸引子(如表3所示)，再進一步利用Illumina MiSeq定序平台進行高通量分析，最後使用variant studio軟體分析是否產生基因變異位點。

細胞RNA萃取

使細胞從培養盤上脫落後，將細胞沖起置於離心管中，離心5分鐘(3000rpm，4℃)，去除上清液後加入PBS清洗細胞，離心5分鐘(3000rpm，4℃)，去除所有的上清液後，使用Gene-spin總RNA純化套組(Total RNA Purification Kit)(Protech #PT-RNA-MS-50)進行細胞RNA萃取。首先，加入350μL RNA裂解物(Lysis)/2-ME溶液，震盪約15秒鐘至細胞完全被打破，使細胞內RNA釋出，接著加入等體積之70% EtOH，震盪約15秒鐘混合均勻後，將所有液體轉移至純化管柱(spin column)中，以最高速於室溫下離心1分鐘並丟棄過濾液，加入500μL RNA清洗溶液1清洗，以最高速於室溫下離心1分鐘並丟棄過濾液。為了確保RNA產物不受DNA污染，將事先混合均勻的80μL DNase I孵育緩衝液(incubation buffer)以及2μL DNase I，加至純化管柱過濾膜的正上方，於室溫下反應 15分鐘，作用完全後加入500μL RNA清洗溶液1清洗，以最高速於室溫下離心1分鐘並丟棄過濾液，接著再加入600μL RNA清洗溶液2清洗，以最高速於室溫下離心1分鐘並丟棄過濾液，並重複此清洗步驟一次，再使用最高速於室溫下離心3分鐘，以確保RNA無酒精、液體的殘留。將純化管柱置於新的微量離心管上，加入20μL ddH₂O至純化管柱孵育5分鐘後，以最高速於室溫下離心1分鐘，所得過濾液即為RNA，保存於-80℃冰箱。

反轉錄聚合酶連鎖反應

利用SuperScript III第一股合成系統(first strand synthesis system)(Thermo Scientific #1622)，將萃取的細胞RNA透過反轉錄聚合酶連鎖反應製備成互補DNA(cDNA)。首先，取500ng RNA以及1μL隨機六聚體(random hexamer)加入PCR小管中，再加無核酸酶的水(nuclease free water)至總體積12μL，於PCR儀器反應65℃ 5分鐘後靜置於4℃。接著加入4μL 5X反應緩衝液、1μL RNase抑制劑、2μL 10mM dNTP以及1μL RevertAid M-MuLV RT，此時總體積為20μL，混合均勻後，於PCR儀器反應25℃ 5分鐘→42℃ 60分鐘→70℃ 5分鐘後靜置於4℃。反應完全後，所得產物即為cDNA，保存於-20℃冰箱。

定量即時聚合酶連鎖反應(Quantitative real time polymerase chain reaction，Q-PCR)

利用SYBR Green(Roche #04887352001)套組，針對細胞中GLA mRNA不同的剪接模式進行定量聚合酶連鎖反應。在正常剪接的情況下，反應所使用之核酸引子為GLA-qE4-5_F以及GLA-qE5_1R(如表4 所示)，設計於GLA基因的外顯子4及5之裂隙接合(gapjunction)和外顯子5上，PCR後產物大小應為122bp；而異常剪接的情況下，反應所使用之核酸引子為GLA-q57nt_F以及GLA-q57nt_R(如表4所示)，設計於造成異常剪接的57個核苷酸片段上以及外顯子5上，PCR後產物大小應為162bp。另外，本發明以Human-beta-actin作為內源性對照(如表4所示)。

Q-PCR操作步驟為利用SYBR Green(Roche)、核酸引子以及水配置反應液，接著將適當濃度之cDNA與反應液混合均勻後，做三重複置於白色96孔盤(LightCycler 480 multiwell plate)中。

相對表現量計算公式：ΔΔCt法，Ct_目標基因-Ct_{內源性對照}=ΔCt，ΔCt_樣本-ΔCt _WT=ΔΔCt，相對表現量=2^-ΔΔCt。

細胞蛋白萃取

在萃取細胞蛋白前配置蛋白萃取試劑，先取994μL RIPA裂解緩衝液(lysis buffer)加入5μL 20% TritonX-100(AMRESCO #0694)及1μL蛋白酶抑制劑(Protease inhibitor)，均勻混合後置於冰上備用。

使細胞從培養盤上脫落後，接著將細胞從培養盤上沖起後置於離心管中，離心5分鐘(3000rpm，4℃)，去除上清液後加入PBS清洗細胞，離心5分鐘(3000rpm，4℃)，去除所有的上清液。將細胞加入適量已配置好的蛋白萃取試劑，震盪約15秒鐘至細胞完全被打散，接著置放在冰上30分鐘，過程中每5分鐘震盪一次，使細胞內蛋白釋出。接著離心10分鐘(13200rpm，4℃)，此時不溶之細胞碎片將被沉澱於管底，將上清液體取出移置新的微量離心管中，保存於-80℃冰箱。

蛋白定量

本實驗以Bio-Rad蛋白定量(Bio-Rad #500-0006)套組進行蛋白定量。首先於透明平底96孔盤中分別加入10μL不同濃度的牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum，BSA；UR#UR-BSA001)作為標準樣本，濃度分別為0mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL，每個濃度皆需二重複。再將待定量之蛋白檢體使用ddH₂O做適當倍率稀釋，取10μL至透明平底96孔盤中，每個檢體皆需二重複。取5倍原液的Bio-rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate(BCA)試劑，加入滅菌水稀釋成1倍後，取190μL至上述含有檢體之透明平底96孔盤中進行反應，於室溫下作用約5分鐘後，使用光譜分析儀於波長595nm之可見光偵測，並根據標準樣本的濃度及吸光值製作標準曲線(Standard curve)，並以內插法透過標準曲線換算出檢體之蛋白濃度。

酵素活性測定

本發明是以4-甲基傘形酮-α-D-半乳糖酶 (4-methylumbelliferone-α-D-Galactoside)(Sigma #M7633)作為反應受質，利用此受質經α-Gal A酵素作用後產生4-甲基傘形酮(4-MU)，並且發出藍綠色螢光的特性，並且利用N-乙醯-D-半乳胺糖(N-Acetyl-D-galactosamine)(Sigma #A2795)來抑制α-Gal B以降低干擾，再藉由讀取其螢光值強度來換算α-Gal A酵素活性值。

首先，取10μg的待測蛋白加入微量離心管中，並以ddH₂O加至總體積5μL，混合均勻後置於冰上，所有樣本皆需二重複。接著取45μL新鮮配置的受質(substrate)加入上述微量離心管中並混合均勻，置於37℃恆溫培養箱中作用2小時，再加入450μL 0.2N甘胺酸(glycine)-NaOH溶液終止反應，混合均勻後取200μL至黑色平底96孔盤中，利用SpetraMax M5多重偵測讀取儀(multi-detection reader)以365nm波長激發後讀取450nm波長的發射光讀值，再利用標準曲線換算出待測蛋白的GLA酵素活性。

而上述反應使用之標準曲線是利用4-甲基傘形酮鈉鹽(4-methylumbelliferone sodium salt)(4-MU；Sigma #M1508-10g)作為標準值樣本。以0.2N甘胺酸-NaOH溶液將100μM 4-MU進行序列稀釋(5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、0nM)。並個別取200μL至黑色平底96孔盤，所有濃度皆需二重複。接著使用SpetraMax M5多重偵測讀取儀於激發光波長365nm/發射光波長450nm之條件下測定目標樣本的螢光量。將上述實驗重複3次，獲得之6組實驗數據後計算其平均螢光量並與標準值樣本的濃度做出標準曲線。

將上述目標樣本螢光讀值扣除空白值(Blank)，代入標準曲線公式即可得目標樣本蛋白質總活性，再將總活性帶入蛋白質活性公式後，即可計算出固定單位下酵素活性數值。

蛋白質活性計算公式：酵素活性值(nmol/hr/mg蛋白質)=(C_{(總活性，nM)} x V_{(反應總體積，mL)} x 10^-3)/T_{(反應時間，hr)}/蛋白質_{(蛋白質總量，mg)}

將固定值放入上述公式中：酵素活性值(nmol/hr/mg蛋白質)=(C_{(總活性，nM)} x 0.5mL x 0.001)/2hr/0.01mg

西方墨點法(Western blot)

膠體配置及電泳

將製膠所需之透明玻璃擦拭乾淨後，裝置於Mini-PROTEAN® Tetra系統(Bio Rad)，加入7ml 10%下層分離膠體(Separating gel)，並以異丙醇將膠面壓平。待下層分離膠體凝固後，倒掉並吸乾異丙醇，再加入5%上層凝集膠體(Stacking gel)，插上齒梳(Comb)後等待上膠凝固。

取目標蛋白檢體，加入6X SDS電泳指示劑(Loading Dye)(最終濃度為1X)，於微量離心管中混合均勻，於100℃加熱10分鐘使蛋白質變性，並置於常溫冷卻。於檢體槽中加入蛋白質標誌(protein marker)和目標蛋白進行蛋白質電泳分析，電源供應器設定為固定電壓80伏特進行凝集(stacking)，待檢體跑到下層分離膠體，並觀察到蛋白質標誌開始出現分離狀況後，將固定電壓改為120伏特，直到目標蛋白被清楚地分離出，即完成電泳，電泳時間總長約為2.5小時。

轉印與抗體染色

電泳結束後，使用Mini-PROTEAN® Tetra系統(Bio Rad)進行轉漬，以固定電流400毫安培轉漬120分鐘。轉漬結束後，拆卸裝置將PVDF轉漬膜取下放置於乾淨盒子中，並以二次水潤洗，目的是為了將轉移緩衝液(transfer buffer)中的甲醇(Methanol)去除掉，避免蛋白質沉澱。接著加入5%脫脂牛奶(skim milk)/TBST(TBS+0.1% Tween 20)進行阻斷(blocking)。於室溫震盪作用一個小時，完成阻斷後，將PVDF轉漬膜加入稀釋於5%脫脂牛奶/TBST中的一級抗體，於4℃震盪進行隔夜反應。隔天回收一級抗體後，先以TBST潤洗一次，接著將PVDF轉漬膜置於震盪器上以TBST清洗5分鐘，並重複此步驟六次，再來加入稀釋於5%脫脂牛奶/TBST的次級抗體，於室溫震盪作用1小時後，先以TBST潤洗一次，接著將PVDF轉漬膜置於震盪器上以TBST清洗5分鐘，並重複此步驟六次，清除轉漬膜上殘留未結合之多餘抗體以及非特異性鍵結。以ECL Western Chemiluminescent HRP Substrate化學冷光試劑反應呈色，並使用UVP BioSpectrum 815 Imaging System偵測並記錄訊號。

免疫螢光染色(IFA)

在六孔培養盤上放置乾淨無菌的蓋玻片，將人類纖維母細胞以每格2x10⁵顆細胞培養在蓋玻片上，隔日確認細胞貼附於蓋玻片後，繼續培養直至48小時，去除細胞培養液後，以PBS溶液清洗2次，接著使用Cytofix/Cytoperm^TM(BD #554722)進行免疫螢光染色。加入200μL含有 4%多聚甲醛(Paraformaldehyde)之固定和穿透性溶液(fixation and permeabilization solution)固定20分鐘，待細胞被固定以及打洞之後，加入200μL Perm/wash緩衝液清洗2次，每次5分鐘，再加入200μL含5% BSA的Perm/wash緩衝液進行阻斷，於室溫下作用1小時後去除玻片上的溶液，加入200μL稀釋於含2% BSA的Perm/wash緩衝液之一級抗體小鼠抗Gb3 1：500(TCI #A2506)以及兔抗LAMP1 1：500(GeneTex #GTX19294)作共同染色，放置於4℃作用隔夜。次日，將一級抗體去除後，加入200μL Perm/wash緩衝液清洗2次，每次5分鐘，再加入200μL稀釋於含2% BSA的Perm/wash緩衝液之二級抗體羊抗小鼠抗體(Goat anti-mouse antibody)(Dylight 488)1：500(GeneTex #GTX213111)以及羊抗兔抗體(Goat anti-rabbit antibody)(Dylight 594)1：1000(GeneTex #GTX213110)，於常溫下作用1小時後並吸除，加入200μL Perm/wash緩衝液清洗2次，每次5分鐘，加入200μL稀釋於含2% BSA的Perm/wash緩衝液之DAPI 1：5000(Sigma # D9542)染色10分鐘，再加入200μL Perm/wash緩衝液清洗2次後，使用螢光專用封片膠封片後即可在螢光顯微鏡下觀察。

Gb3螢光定量

將玻片置於200倍顯微鏡倍率下，每一片拍攝5-10個視野後，以軟體Image J定量Gb3螢光強度及DAPI細胞核數目，以單一細胞之螢光強度(Gb3 fluorescence/cell)呈現其定量結果，並將5-10個視野的結果取其平均，作為Gb3螢光定量結果。

統計分析

利用學生t檢定(Student’s t-test)分析檢定兩組實驗中是否存在顯著差異。大於兩組以上則使用單因子變異數分析(one-way ANOVA)，以杜氏事後檢定(Tukey’s post-hoc test)分析各組之間的差異。所有統計量皆為雙尾檢定，並以p值為0.05作為統計量是否存在顯著差異的基準，並使用GraphPad Prism 5軟體進行統計分析。

結果

策略1：利用非同源性末端接合介導的CRISPR基因編輯技術治療心臟型法布瑞氏症IVS4+919G>A的細胞模型

目前已知當GLA IVS4+919位點產生G>A的突變時，會導致內含子4中產生錯誤的剪接供體位點，進而發生異常的mRNA選擇性剪接，使得外顯子4與外顯子5之間插入一段57個核苷酸的內含子序列。因此實驗設計中，本發明在造成mRNA異常剪接的57個核苷酸的序列上下游，透過HiFi Cas9核酸酶活性在GLA基因序列上產生雙股斷裂。本發明假設在DNA層次會以非同源性末端接合的方式將57個核苷酸片段剪除，接著在mRNA剪接的過程中，細胞就能表現正常的GLA mRNA(圖2A)。

為了使HiFi Cas9能夠有效地作用於目標序列上，本發明在距離GLA IVS4+919G>A突變點的上下游分別皆設計了2條sgRNA(上游：sgRNA1以及sgRNA2；下游：sgRNA3以及sgRNA4)，接著利用代理報導系統(surrogate reporter system)測試不同sgRNA作用之下的核酸酶切割效率。所使用的報導質體包含了上游同框(in-frame)的EGFP蛋白的基因序列以及下游框外(out-of-frame)的mCherry蛋白的基因序列，並將HiFi Cas9 以及sgRNA作用的目標序列(包含PAM)插入於EGFP以及mCherry基因序列之間。在一般情況下只會有綠色螢光的表現，一旦HiFi Cas9在目標序列進行切割，細胞在進行DNA修復機制的過程中就有可能會產生序列的插入與缺失(indel)。因此，mCherry蛋白的基因序列可能會轉為同框(in-frame)，而使紅色螢光能夠表現(圖2B)。透過代理報導系統偵測紅色螢光訊號，結果顯示位於造成mRNA異常剪接的序列上游的sgRNA2(62%)比sgRNA1(53%)有更好的核酸酶切割效率，而序列下游的sgRNA3(76%)比sgRNA4(58%)有更好的核酸酶切割效率(如表5所示)。

因此，構築同時帶有HiFi Cas9、sgRNA2以及sgRNA3的質體HiFi Cas9-sgRNA2+3(圖2C)作為後續實驗所用，並且預期可產生97bp的缺失，其中包含造成mRNA異常剪接的片段(圖2D)。

接著將HiFi Cas9-sgRNA2+3，以電穿孔的方式轉染至心臟型法布瑞氏症患者纖維母細胞中，並於轉染後48小時以嘌黴素作用66小時，篩選出成功被轉染的細胞團(bulk cells)。將成功被轉染的細胞團進行 DNA萃取後，針對GLA內含子4進行聚合酶連鎖反應，透過膠體電泳分析觀察到野生型纖維母細胞以及未處理的心臟型法布瑞氏症患者纖維母細胞之PCR產物大小為293bp，而成功被轉染的細胞團中不僅有293bp的PCR產物，還能觀察到較小片段的產生，片段大小約為196bp。因此推測細胞團中有部分細胞確實有產生基因編輯作用，導致GLA基因有97bp的片段被剪除的情況出現(圖3A)。因此，本發明將膠圖以Image J定量分析，觀察到較小片段約佔所有PCR產物10.8%±3.421%(圖3B)，顯示HiFi Cas9以及sgRNA作用下，確實能以非同源性末端接合的方式將造成mRNA異常剪接的DNA片段進行雙剪刀切除。接著在GLA mRNA的剪接模式的分析實驗中，本發明設計了兩組針對GLA正常以及異常的mRNA剪接模式的引子，透過即時定量聚合酶連鎖反應去將GLA的兩種剪接模式進行定量分析，其中以β-肌動蛋白(beta-actin)作為標準化依據，結果觀察到經由基因編輯作用的細胞團中，正常的GLA mRNA表現量為0.277±0.086，顯著高於未治療的心臟型法布瑞氏患者纖維母細胞的表現量0.06±0.003(P<0.05)；而經由基因編輯作用的細胞團中，異常剪接產生的GLA mRNA表現量為3.505±0.856，與未治療細胞的表現量4.492±0.734相比，雖然統計上無顯著差異，仍然可以看見異常的GLA mRNA表現量有下降的趨勢(圖3C)。

為了進一步驗證GLA蛋白的表現量是否能夠有效地提高，本發明利用西方墨點法分析GLA蛋白表現量，其中以GAPDH作為標準化依據(圖3D)。在實驗結果中發現，與未治療細胞的GLA蛋白表現量0.101 ±0.031相較之下，經由基因編輯後的細胞團中GLA蛋白表現量為0.153±0.085，儘管統計上無顯著差異，仍觀察到GLA蛋白表現量有部分恢復的狀況(圖3E)。同時，本發明藉由GLA酵素活性的分析，以野生型纖維母細胞作為GLA酵素活性100%，結果觀察到經由基因編輯作用之下細胞的GLA酵素活性為16.843%±4.153%，與未治療細胞的酵素活性5.193%±0.935%相比之下，酵素活性有顯著的恢復(P<0.05)(圖3F)。

綜合上述，透過非同源性末端接合介導的基因編輯策略，本發明觀察到IVS4+919 G>A所造成的GLA mRNA異常剪接模式能部分被修正，使得正常的GLA mRNA剪接模式顯著增加，除了能夠使GLA蛋白表現量提升，並使GLA酵素活性顯著的提高，證實透過造成mRNA異常剪接的片段形成缺失的基因編輯方式，能夠在心臟變異型法布瑞氏症纖維母細胞中達到治療效果。

策略2：利用鹼基編輯技術治療心臟型法布瑞氏症IVS4+919G>A的細胞模型

腺嘌呤鹼基編輯器(ABE)能夠將腺嘌呤(A)轉變成鳥嘌呤(G)，因此本發明認為能夠直接將IVS4+919 G>A這個點突變做修正。在鹼基編輯策略的實驗設計中，本發明設計了2條sgRNA，使得目標IVS4+919G>A這個位點能夠落在鹼基編輯窗口內，sgRNA5可使目標落在前間隔序列的第4個位置，而sgRNA6則使目標落在第5個位置(圖4A)。sgRNA5和sgRNA6的序列內容如下所示：sgRNA5：5’-GTAA ₄ AGTGTAAGTTTCATGA-3’(SEQ ID NO：12)

sgRNA6：5’-GCTAA ₅ AGTGTAAGTTTCATG-3’(SEQ ID NO：13)

上述序列有畫底線部分，其為剪接供體位點。該sgRNA5的3’端可以接一段PAM序列，即GGG；以及該sgRNA6的3’端可以接一段PAM序列，即AGG。

本發明構築了同時帶有鹼基編輯器ABEmax以及sgRNA的質體-ABEmax-sgRNA5和ABEmax-sgRNA6(圖4B)。為了確定質體能在細胞中表現，本發明以電穿孔的方式轉染至IVS4心臟型法布瑞氏症患者纖維母細胞中，利用免疫螢光染色法偵測nCas9，並以DAPI定位細胞核，結果確實觀察到nCas9表現於細胞核中(圖4C)。

本發明將質體ABEmax-sgRNA5以及ABEmax-sgRNA6，以電穿孔的方式轉染至IVS4心臟型法布瑞氏症患者纖維母細胞中，並於轉染後48小時以嘌黴素作用66小時，篩選出成功轉染的細胞團。經由DNA萃取並進行Sanger定序，結果發現在ABEmax-sgRNA5的組別當中出現了明顯的旁觀者效應，IVS4+920(座落於前間隔序列的第5個位置)有相當高比例A轉換成G的現象，而在+919卻沒有明顯的鹼基編輯情況；另外，在ABEmax-sgRNA6作用下，除了在目標位置IVS4+919之外，也能看到IVS4+918以及+920(即前間隔序列的第4至第6個核苷酸)的A皆明顯地轉換成G(圖4D)。透過次世代定序去探討細胞團中鹼基編輯的效率，本發明觀察到在ABEmax-sgRNA5的作用下，IVS4+919A轉換成G的比例為1.825%±1.584%，然而在IVS4+920A轉換成G的比例平均為29.4%±34.227%(圖4E)。此外，本發明觀察到在ABEmax-sgRNA6作用下，目標位置IVS4+919的A轉換成G的比例平均高達75.825%±34.298%，也能看到IVS4+918(36.875%±38.428%)以及+920(44.325±37.854%)的A皆明顯地轉換成G(圖4E)。針對目標位置IVS4+919，在其中三次的實驗中，ABEmax-sgRNA6作用後幾乎可將目標位置IVS4+919 A完全轉換成G，效率分別為88.5%、89.7%以及100%，平均為ABEmax-s組別的41.5倍，證明了sgRNA6更能準確修改到IVS4+919。

本發明進一步探討目標位置IVS4+919以及產生明顯旁觀者效應的IVS4+918及+920，在A轉換成G的情況下，整體細胞團中GLA mRNA剪接模式是否有所改變。透過即時定量聚合酶連鎖反應去將正常以及異常的GLA mRNA剪接模式進行定量分析，本發明觀察到經由ABEmax-sgRNA5進行鹼基編輯後的細胞團，正常的GLA mRNA表現量為1.083±0.414，顯著高於未治療細胞的表現量0.099±0.041(P<0.05)；而異常剪接產生的GLA mRNA表現量為3.916±2.211，與未治療細胞的表現量8.763±3.503相比，雖然統計上無顯著差異，仍然可以觀察到異常的GLA mRNA表現量有下降的趨勢(圖5A)。此外，經由ABEmax-sgRNA6進行鹼基編輯後的細胞團，正常的GLA mRNA表現量為1.111±0.494，顯著高於未治療細胞(P<0.05)；異常剪接產生的GLA mRNA表現量為2.968±2.552，與未治療細胞相比則有顯著下降的趨勢(P<0.05)(圖5A)。特別的是，由於本發明觀察到目標位置IVS4+919以及產生明顯旁觀者效應的+920，皆位於IVS4+919 G>A該突變所新產生的剪接供體位點(即為圖4A以底線標示的位置)。因此，本發明推測儘管有明顯的旁觀者效應，卻反而可以增加剪接供體位點序列被破壞的機會，改善IVS4+919 G>A點突變所導致之異常的mRNA選擇性剪接，而更有效的恢復GLA mRNA的剪接模式。接著利用西方墨點法分析GLA蛋白表現量(圖5B)，未治療之心臟型法布瑞氏患者纖維母細胞的GLA蛋白表現量為0.097±0.077，在ABEmax-sgRNA6作用之下GLA蛋白表現量顯著提高至0.839±0.251(P<0.01)；ABEmax-sgRNA5作用之下GLA蛋白表現量提高至0.614±0.317，儘管沒有統計上的顯著差異，也能觀察到GLA蛋白表現量有恢復的趨勢(圖5C)，並藉由GLA酵素活性分析鹼基編輯作用後所恢復的GLA蛋白其功能性，以野生型纖維母細胞作為GLA酵素活性100%，未治療細胞的酵素活性為12.87%±0.3.617%，結果觀察到經由ABEmax-sgRNA5作用之下GLA酵素活性提高至82.779%±45.208%，儘管統計上無顯著差異，也能觀察到GLA酵素活性有大幅提升的現象；另一方面則觀察到ABEmax-sgRNA6作用之下，GLA酵素活性顯著提高至105.552%±46.355%(P<0.05)(圖5D)。

綜合上述，鹼基編輯策略除了能夠有效的修正IVS4+919 G>A的點突變，顯著的旁觀者效應也能改善GLA mRNA的剪接模式，使得心臟變異型法布瑞氏症纖維母細胞中恢復為正常的GLA mRNA剪接模式，並有效增加GLA蛋白表現量以及提高其酵素活性，因此透過腺嘌呤鹼基編輯器所介導的鹼基編輯策略能夠有效的恢復心臟變異型法布瑞氏症纖維母細胞中GLA基因的功能，而達到良好的治療效果。

GLA IVS4+918、+919以及+920三個位置的A皆有潛力被轉換成G，且能有效恢復GLA基因的功能。透過次世代定序分析，本發明觀察到此三個位置的A被轉換成G的比例不盡相同，導致細胞團中包含了多種不同基因型的細胞，其中觀察到IVS4+919A>G、+920A>G以及+918_920AAA>GGG三種基因型在細胞團中所佔的比例相當的高(圖6)。因此在後續實驗中，本發明利用單一細胞株(single cell clone)的方式來個別驗證不同基因型其GLA基因功能。

本發明將經由鹼基編輯作用後的心臟變異型法布瑞氏症細胞團，進行單一細胞株的篩選，所挑選出的單一細胞株6-2、6-4以及6-7為IVS4+919A準確修改回野生型+919G的細胞株(圖7A)。透過即時定量聚合酶連鎖反應去將正常以及異常的GLA mRNA剪接模式進行定量分析，結果觀察到這些經由鹼基編輯而準確修正回野生基因型的單一細胞株，其剪接模式與野生型纖維母細胞相似(圖7B)。透過西方墨點法分析IVS4+919A>G的單一細胞株其GLA蛋白表現量，觀察到與未治療的細胞相比，GLA蛋白表現量也有提高的情況(圖7C和7D)，並且進一步觀察到這些單一細胞株的GLA酵素活性也有明顯地提升的趨勢(圖7E)。由於細胞內缺乏足夠的GLA蛋白酵素時，會使得Gb3無法被正常代謝而大量堆積於溶酶體中，進而造成細胞損傷。因此，本發明透過免疫螢光將單一細胞株6-4進行Gb3染色，並定量分析單顆細胞的Gb3螢光強度(a.u.)，同時也以LAMP1作為溶酶體標誌物；結果觀察到在未治療的心臟型法布瑞氏症患者纖維母細胞溶酶體中有明顯的Gb3堆積，平均Gb3螢光強度為57.868±16.726 a.u.，而在單一細胞株6-4中則發現Gb3能有效地被清除，平均Gb3 螢光強度為14.218±5.308 a.u.(圖7F和7G)。由上述在單一細胞株的結果顯示，透過腺嘌呤鹼基編輯器作用後，可將IVS4+919G>A這個點突變準確修改回野生型序列，並且恢復至與野生型細胞相似的狀態。

在sgRNA6的作用之下，本發明發現IVS4+918至+920連續三個A皆落於鹼基編輯窗口中(座落於前間隔序列的第4-6個位置)，除了在目標位置IVS4+919之外，由於明顯的旁觀者效應影響之下也能發現IVS4+918以及+920的A皆明顯地轉換成G(圖4C)，而形成+918_+920AAA>GGG的基因型。因此，本發明挑選出基因型為+918_+920AAA>GGG的單一細胞株2-2、2-4、2-6以及2-8(圖8A)，透過即時定量聚合酶連鎖反應去將GLA mRNA剪接模式進行定量分析，並觀察到這些基因型為+918_+920AAA>GGG的單一細胞株，正常的GLA mRNA表現量確實有恢復，並且高於野生型細胞1.69至2.77倍，而異常的GLA mRNA表現量不僅相較於未治療細胞有下降的情況，表現量則為野生型細胞的0.02倍至0.24倍，幾乎無法被偵測到(Ct值為37.09至39.26)(圖8B)。與未治療的細胞相比，GLA蛋白表現量也有恢復的情況(圖8C和8D)，且GLA酵素活性顯著上升(圖8E)。最後透過免疫螢光染色，可觀察到未治療的心臟型法布瑞氏症患者纖維母細胞溶酶體中有明顯的Gb3堆積，平均Gb3螢光強度為68.158±4.816 a.u.，在單一細胞株2-4中平均Gb3螢光強度則顯著降低為8.597±6.404 a.u.(P<0.001)，在單一細胞株2-6中則顯著降低為23.301±9.227 a.u.(P<0.01)，皆發現Gb3能有效地被清除。而在單一細胞株2-8觀察到各個視野之間Gb3螢光強度誤差值偏高，因此與未治療細胞無統計上之顯著差異，推測可能是因為細胞代數限制而導致細胞型態改變，並且使GLA蛋白將Gb3清除的能力開始下降。儘管如此，在單一細胞株2-8依舊能觀察到Gb3的平均螢光強度有下降的趨勢，數值為42.921±35.196 a.u.(圖8F和8G)。根據上述單一細胞株的結果顯示，儘管鹼基編輯系統作用後會造成明顯的旁觀者效應而造成+918_+920AAA>GGG的基因型，也能達到很好的治療成效，進而使GLA基因功能恢復與野生型細胞相似的狀態。

在sgRNA5的作用之下，本發明發現+920 A座落於前間隔序列的第5個位置，而在sgRNA6的作用之下，+920 A則座落於前間隔序列的第6個位置，皆在鹼基編輯窗口中，並且也有相當高的機率因為旁觀者效應而被修改成G(圖4C)，而形成+920A>G的基因型(圖9A)。因此，本發明透過單一細胞株5-5以及5-12進一步去探討該基因型對於細胞GLA基因功能的恢復是否產生影響。透過即時定量聚合酶連鎖反應將GLA mRNA剪接模式進行定量分析，觀察到正常的GLA mRNA表現量確實有恢復，而異常的GLA mRNA表現量則相較於未治療細胞有下降的情況，剪接模式與野生型序列的纖維母細胞相似(圖9B)。儘管這些單一細胞株因為代數限制而無法進一步探討GLA蛋白表現量以及功能恢復程度，但從mRNA剪接模式的結果中，本發明推測+920A>G這個基因型也能使GLA基因功能有顯著的恢復，使細胞不受Gb3堆積的傷害，進而恢復成正常健康細胞的狀態。

綜合以上實驗成果，本發明驗證了兩種基因編輯策略的效果，並且發現腺嘌呤鹼基編輯器相較於CRISPR/Cas9介導的非同源性末端接合，有更顯著的基因編輯效率以及治療效果。此外，在腺嘌呤鹼基編輯器作用之下，本發明觀察到sgRNA6相較於sgRNA5，G被轉換成A的效率更好，並且能夠將+919A>G的突變點作高效率的修改，附帶的旁觀者效應也有助於GLA基因功能的恢復。脫靶效應是利用CRISPR/Cas9系統進行基因編輯的隱憂，因此接下來本發明選擇了鹼基編輯策略中ABEmax-sgRNA6所介導的基因編輯是否會造成脫靶效應。本發明使用了線上預測工具CRISPR RGEN Tools找尋在基因組上產生脫靶效應的潛在位置，接著挑選了排名前11個潛在脫靶位置，這些位置的序列與sgRNA6的序列具有2個核苷酸鹼基配對錯誤，以UCSC分析各個序列的基因名稱以及位置(表6)。

在經過ABEmax-sgRNA6編輯後的細胞團中，針對這11個潛在脫靶位置利用次世代定序進行高通量測序，定序深度約為66,279~261,950條讀數(圖10)。除了OT-10以外，本發明在其他10個位置中幾乎沒有看到A轉換成G的現象，在OT-10的定序結果中觀察到第4個位置的A的修改為G的效率為0.853%±1.063%，在第6個位置的A修改為G的效率為6.587%±9.556%，修改的位點位於SHOC2基因的第二個內含子中，並且沒有記載於ClinVar網站以及dbSNP數據庫中。以上證明ABEmax-sgRNA6針對GLA IVS4+919具有極高的專一性且具有一定程度的安全性。

綜合實驗成果，本發明在傳統CRISPR/Cas9技術採用了較新型HiFi Cas9，而提高基因編輯的效率；同時也突破鹼基編輯系統的應用限制，挑選出合適的sgRNA並應用於更具專一性、編輯效率更高的腺嘌呤鹼基編輯器，針對突變點GLA IVS4+919G>A進行基因編輯，附帶的旁觀者效應使該策略發揮最大效益，為法布瑞氏症基因治療策略發展中的重要發明。

本領域技術人員將上述概要理解為對用於傳達所寄存的申請資訊之方法描述。本領域技術人員將認識到這些僅是說明性質，並且許多等效物都是有可能的。

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Claims

一種組合物，其包含一聚核苷酸，其包含：(a)一編碼Cas9缺口酶的鹼基序列；(b)一編碼一靶向具有c.639+919G>A突變點之GLA基因內含子4的引導RNA之鹼基序列；以及(c)一編碼去氨酶的鹼基序列，其中該引導RNA靶向一具有c.639+919G>A突變點的目標序列，該目標序列上的c.639+919G>A突變點要對應在該引導RNA的作用範圍內，且該引導RNA的序列是以SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所組成。
如請求項1所述之組合物，其中該Cas9缺口酶包含nCas9。
如請求項1所述之組合物，其中該聚核苷酸進一步包含一啟動子，其用於調控該編碼靶向具有c.639+919G>A突變點之GLA基因內含子4的引導RNA之鹼基序列、該編碼Cas9缺口酶的鹼基序列或該編碼去氨酶的鹼基序列。
如請求項3所述之組合物，其中該啟動子包含U6啟動子或EFS啟動子。
如請求項1所述之組合物，其進一步包含一載體，其中該聚核苷酸位於該載體中。
如請求項5所述之組合物，其中該載體中包含質體載體、非病毒載體或病毒載體。
如請求項6所述之組合物，其中該非病毒載體包含脂微粒或是脂質奈米顆粒。
如請求項6所述之組合物，其中該病毒載體包含腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒或仙台病毒載體。
一種醫藥組合物用於製備一用於治療法布瑞氏症之藥物的用途，其中該醫藥組合物包含一如請求項1所述之組合物。
一種用於對細胞進行基因修飾的方法，其包含將如請求項1所述之組合物遞送至一離體細胞中，其中該離體細胞是來自一罹患法布瑞氏症的個體，且該離體細胞包含一具有c.639+919G>A突變點之GLA基因。
如請求項10所述之方法，其中該離體細胞包含幹細胞。