CN110582570A - 用于治疗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)相关的病症的组合物和方法 - Google Patents

用于治疗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)相关的病症的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供了用于离体或体内治疗具有与PCSK9有关的一种或多种病况的患者的材料和方法。此外，本申请提供了通过基因组编辑来编辑和/或调节细胞中PCSK9基因的表达的材料和方法。

Description

用于治疗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9) 相关的病症的组合物和方法
相关申请
本申请要求于2017年2月22日提交的美国临时申请号62/461,852和于2017年6月29日提交的美国临时申请号62/526,646的优先权和权益，其各自的内容在此以其整体并入。
序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。名为“CRIS-017_001WO_SequenceListing_ST25.txt”的序列表文件于2018年2月8日创建，且大小为16.9MB。序列表的电子格式的信息通过引用以其整体并入本文。
领域
本发明涉及基因编辑的领域，且特别是涉及前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)基因的改变。
背景
基因组工程指的是用于活生物体的遗传信息(基因组)的靶向特异性修饰的策略和技术。因为宽范围的可能的应用，特别是在人健康领域中，基因组工程是一个非常活跃的研究领域。例如，基因组工程可用于改变(例如，校正或敲除)携带有害突变的基因，或探究基因的功能。为将转基因插入活细胞中而开发的早期技术，经常受限于新序列向基因组中的插入的随机性质。随机插入基因组可以导致破坏邻近基因的正常调节，导致严重的不希望的效应。此外，随机整合技术提供很少再现性，因为没有确保序列将在两个不同细胞中插入在相同位置。近来的基因组工程策略(诸如锌指核酸酶(ZFNs)、转录活化因子如效应核酸酶(TALENs)、归巢核酸内切酶(HEs)和MegaTALs)使得DNA的特定区域能够被修饰，由此与早期技术相比增加改变的精确度。这些更新的平台提供大得多的再现性程度，但仍具有它们的限制。
尽管世界上的研究人员和医学专业人员已经做出努力来尝试解决遗传病症，并且尽管基因组工程方案有希望，仍然存在对开发涉及PCSK9相关适应症的安全且有效的治疗的关键性需要。
通过使用基因组工程改造工具来对基因组产生可以用单一治疗解决PCSK9相关的病症或病况的永久性改变，所得疗法可以完全补救某些PCSK9相关的适应症和/或疾病。
概述
本文提供了通过在前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列之内或附近通过基因组编辑而引入至少一个核苷酸的插入、缺失或突变来对基因组产生永久性改变和减少或消除PCSK9基因产物的表达或功能的细胞、离体和体内方法，其可用于治疗PCSK9相关的病况或病症，诸如血脂异常。本文还提供了用于执行此类方法的组分和组合物以及载体。
本文提供了用于通过基因组编辑在细胞中编辑前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)基因的方法，其包括以下步骤：将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入细胞以实现PCSK9基因或PCSK9调节元件之内或附近的一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致PCSK9基因之内或附近的至少一个核苷酸的一个或多个永久性插入、缺失或突变，由此减少或消除PCSK9基因产物的表达或功能。
本文还提供了用于治疗具有PCSK9相关的病况或病症的患者的离体方法，其包括以下步骤：从患者分离肝细胞；在肝细胞的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列之内或附近进行编辑；和将经基因组编辑的肝细胞植入患者。
在一些方面，编辑步骤包括将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入肝细胞以实现PCSK9基因或PCSK9调节元件之内或附近的一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致PCSK9基因之内或附近的至少一个核苷酸的一个或多个永久性插入、缺失或突变，由此减少或消除PCSK9基因产物的表达或功能。
本文还提供了用于治疗具有PCSK9相关的病况或病症的患者的离体方法，其包括以下步骤：产生患者特异性的诱导的多能干细胞(iPSC)；在iPSC的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列之内或附近进行编辑；将经基因组编辑的iPSC分化为肝细胞；和将肝细胞植入患者。
在一些方面，编辑步骤包括将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入iPSC以实现PCSK9基因或PCSK9调节元件之内或附近的一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致PCSK9基因之内或附近的至少一个核苷酸的一个或多个永久性插入、缺失或突变，由此减少或消除PCSK9基因产物的表达或功能。
本文还提供了用于治疗具有PCSK9相关的病况或病症的患者的离体方法，其包括以下步骤：从所述患者分离间充质干细胞；在间充质干细胞的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列之内或附近进行编辑；将经基因组编辑的间充质干细胞分化为肝细胞；和将肝细胞植入患者。
在一些方面，编辑步骤包括将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入间充质干细胞以实现PCSK9基因或PCSK9调节元件之内或附近的一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致PCSK9基因之内或附近的至少一个核苷酸的一个或多个永久性插入、缺失或突变，由此减少或消除PCSK9基因产物的表达或功能。
本文还提供了用于治疗具有PCSK9相关的病症的患者的体内方法，其包括以下步骤：编辑患者的细胞中的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)基因。在一些方面，编辑步骤包括将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入细胞以实现PCSK9基因或PCSK9调节元件之内或附近的一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致PCSK9基因之内或附近的至少一个核苷酸的一个或多个永久性插入、缺失或突变，由此减少或消除PCSK9基因产物的表达或功能。在一些方面，所述细胞是肝细胞。在一些方面，通过局部注射、全身输注或其组合将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶递送至肝细胞。
本文还提供了改变细胞中的PCSK9基因的连续基因组序列的方法，其包括使细胞与一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶接触以实现一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)。在一些方面，连续基因组序列的改变发生在PCSK9基因的一个或多个外显子中。
在一些方面，一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶选自SEQ ID NO:1-620中所列的那些中的任一种，和与SEQ ID NO:1-620中所列的那些中的任一种具有至少70%同源性的变体。
在一些方面，所述一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶是一种或多种蛋白或多肽。在一些方面，所述一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶是编码一种或多种DNA内切核酸酶的一种或多种多核苷酸。在一些方面，所述一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶是编码一种或多种DNA内切核酸酶的一种或多种核糖核酸(RNA)。在一些方面，所述一种或多种核糖核酸(RNA)是一种或多种化学修饰的RNA。在一些方面，所述一种或多种核糖核酸(RNA)在编码区中被化学修饰。在一些方面，所述一种或多种多核苷酸或一种或多种核糖核酸(RNA)是密码子优化的。
在一些方面，所述方法进一步包括将一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA引入细胞。在一些方面，一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA包含与PCSK9基因的编码序列的区段互补的间隔物序列。在一些方面，所述一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA是化学修饰的。
在一些方面，将一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA与一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶预复合。在一些方面，所述预复合涉及一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA与一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶的共价连接。
在一些方面，将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶配制于脂质体或脂质纳米颗粒中。在一些方面，将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶配制于脂质体或脂质纳米颗粒中，所述脂质体或脂质纳米颗粒还包含一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA。
在一些方面，在AAV载体颗粒中编码所述一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶，其中AAV载体血清型选自表4和5中列出的那些。在一些方面，在AAV载体颗粒中编码所述一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA，其中AAV载体血清型选自表4和5中列出的那些。在一些方面，在AAV载体颗粒中编码一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶，所述AAV载体颗粒还编码一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA，其中AAV载体血清型选自表4和5中列出的那些。
本文还提供了单分子导引多核苷酸，其包含至少一个间隔物序列，所述间隔物序列是对应于SEQ ID NO:5,305-28,696中任一个的RNA序列。在一些方面，所述单分子导引多核苷酸进一步包含间隔物延伸区。在一些方面，所述单分子导引多核苷酸进一步包含tracrRNA延伸区。在一些方面，所述单分子导引多核苷酸是化学修饰的。
本文还提供了非天然存在的CRISPR/Cas系统，其包含编码Cas9或Cpf1酶的多核苷酸和至少一种本文所述的单分子导引多核苷酸。在一些方面，编码Cas9或Cpf1酶的多核苷酸选自化脓链球菌Cas9、金黄色葡萄球菌Cas9、脑膜炎奈瑟氏菌Cas9、嗜热链球菌CRISPR1Cas9、嗜热链球菌CRISPR 3 Cas9、齿密螺旋体Cas9、L. bacterium ND2006 Cpf1和氨基酸球菌属物种BV3L6 Cpf1以及与这些酶具有至少70%同源性的变体。在一些方面，编码Cas9或Cpf1酶的多核苷酸包含一个或多个核定位信号(NLS)。在一些方面，至少一个NLS在编码Cas9或Cpf1酶的多核苷酸的氨基末端的50个氨基酸处或之内，和/或至少一个NLS在编码Cas9或Cpf1酶的多核苷酸的羧基末端的50个氨基酸处或之内。在一些方面，将编码Cas9或Cpf1酶的多核苷酸进行密码子优化用于在真核细胞中表达。
本文还提供了编码本文所述的单分子导引多核苷酸的DNA。
本文还提供了编码本文所述的CRISPR/Cas系统的DNA。
本文还提供了包含编码单分子导引多核苷酸和CRISPR/Cas系统的DNA的载体。在一些方面，所述载体是质粒。在一些方面，所述载体是AAV载体颗粒，其中所述AAV载体血清型选自SEQ ID NO:4,734-5,302和表2中列出的那些。
附图简述
通过参考附图可以更好地理解在本说明书中公开和描述的材料和方法的不同方面，在附图中：
图1A-B描绘II型CRISPR/Cas系统：
图1A是包括gRNA的II型CRISPR/Cas系统的描绘；且
图1B是包括sgRNA的II型CRISPR/Cas系统的另一描绘。
图2、3和4描述在HEK293T细胞中靶向PCSK9基因的化脓链球菌Cas9对gRNA的切割效率。
图5描述靶向HuH7细胞中的PCSK9的gRNA的切割效率。
图6A和6B描述靶向从猪、猴和人分离的人原代肝细胞的PCSK9的gRNA的切割效率。
图7A描述靶向原代肝细胞中的PCSK9的gRNA的切割效率。
图7B描述靶向原代肝细胞中的C3的gRNA的切割效率。
图7C描述通过gRNA的基因编辑对原代肝细胞中的PCSK9蛋白分泌的影响。
序列表的简述
SEQ ID NO:1-620是Cas内切核酸酶直向同源物序列。
SEQ ID NO:621-631是有意空白。
SEQ ID NO:632-4,715是微RNA序列。
SEQ ID NO:4,716 – 4,733是有意空白。
SEQ ID NO:4,734 – 5,302是AAV血清型序列。
SEQ ID NO:5,303是PCSK9核苷酸序列。
SEQ ID NO:5,304是包括PCSK9基因的上游和/或下游的1-5千碱基对的基因序列。
SEQ ID NO:5,305 – 5,365是用于与齿密螺旋体Cas9内切核酸酶靶向PCSK9基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列之内或附近的20 bp间隔物序列。
SEQ ID NO:5,366 – 5,545是用于与嗜热链球菌Cas9内切核酸酶靶向PCSK9基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列之内或附近的20 bp间隔物序列。
SEQ ID NO:5,546 – 6,579是用于与金黄色葡萄球菌Cas9内切核酸酶靶向PCSK9基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列之内或附近的20 bp间隔物序列。
SEQ ID NO:6,580 – 7,269是用于与脑膜炎奈瑟氏菌Cas9内切核酸酶靶向PCSK9基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列之内或附近的20 bp间隔物序列。
SEQ ID NO:7,270 – 18,791是用于与化脓链球菌Cas9内切核酸酶靶向PCSK9基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列之内或附近的20 bp间隔物序列。
SEQ ID NO:18,792 – 28,696是用于与氨基酸球菌属、毛螺菌科和新凶手弗朗西斯菌Cpf1内切核酸酶靶向PCSK9基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列之内或附近的22 bp间隔物序列。
SEQ ID NO:28,697 – 28,726是有意空白。
SEQ ID NO:28,727是化脓链球菌Cas9内切核酸酶的样品导引RNA (gRNA)。
SEQ ID NO:28,728-28730显示样品sgRNA序列。
发明详述
I. 引言
基因组编辑
本发明提供了活生物体的遗传信息(基因组)的靶向的、特异性改变的策略和技术。如本文所用，术语“改变”或“遗传信息的改变”是指细胞的基因组中的任何改变。在治疗遗传病症的背景下，改变可以包括但不限于插入、缺失和校正。如本文所用，术语“插入”是指在DNA序列中添加一个或多个核苷酸。插入可以范围为几个核苷酸的小插入到大片段(诸如cDNA或基因)的插入。术语“缺失”是指DNA序列中的一个或多个核苷酸的丧失或去除或基因的功能的丧失或去除。在一些情况下，缺失可以包括，例如，几个核苷酸、外显子、内含子、基因区段或基因的整个序列的损失。在一些情况下，基因的缺失是指基因或其基因产物的功能或表达的消除或减少。这不仅可以由基因内或附近的序列的缺失导致，而且可以由破坏基因的表达的其它事件(例如，插入、无义突变)导致。如本文所用的术语“校正”是指细胞中的基因组的一个或多个核苷酸的改变，无论是通过插入、缺失还是取代。这样的校正可以导致对校正的基因组位点在结构或功能上更有利的基因型或表型结果。“校正”的一个非限制性实例包括将突变或缺陷序列校正为野生型序列，其恢复基因或其基因产物的结构或功能。取决于突变的性质，可以经由本文公开的各种策略来实现校正。在一个非限制性实例中，可以通过用野生型对应物替换含有突变的区域来校正错义突变。作为另一个实例，可以通过去除额外的序列来校正基因中的重复突变(例如，重复扩增)。
在一些方面，改变还可以包括基因敲入、敲除或敲低。如本文所用，术语“敲入”是指DNA序列或其片段向基因组中的添加。待敲入的这样的DNA序列可以包括一个或多个整个基因，可以包括与基因相关的调节序列或前述的任何部分或片段。例如，可以将编码野生型蛋白的cDNA插入携带突变基因的细胞的基因组中。敲入策略不必全部或部分替换缺陷基因。在一些情况下，敲入策略可以进一步涉及用提供的序列置换现有序列，例如用野生型拷贝置换突变等位基因。另一方面，术语“敲除”是指基因或基因的表达的消除。例如，可以通过删除或添加导致阅读框的破坏的核苷酸序列来敲除基因。作为另一个实例，可以通过用无关的序列替换基因的一部分来敲除基因。最后，如本文所用的术语“敲低”是指基因或其基因产物的表达的减少。作为基因敲低的结果，蛋白活性或功能可以减弱，或者蛋白水平可以降低或消除。
基因组编辑通常表示改变基因组的核苷酸序列的过程，优选地以精确的或预定的方式。本文描述的基因组编辑的方法的实例包括使用定位核酸酶在基因组的精确靶位置处切割脱氧核糖核酸(DNA)、由此在基因组内的特定位置处建立单链或双链DNA断裂的方法。这样的断裂可以且经常通过天然的内源性细胞过程诸如同源性指导的修复(HDR)和不同源末端连接(NHEJ)来修复，如最近在Cox等人, Nature Medicine 21(2), 121-31 (2015)中综述的。这两种主要的DNA修复过程由旁路途径家族组成。NHEJ直接连接从双链断裂产生的DNA末端，有时具有核苷酸序列的损失或添加，它们可以破坏或增强基因表达。HDR利用同源序列或供体序列作为在断裂点处插入确定的DNA序列的模板。所述同源序列可以是在内源性基因组(诸如姐妹染色单体)中。可替换地，所述供体可以是外源核酸，诸如质粒、单链寡核苷酸、双链寡核苷酸、双链体寡核苷酸或病毒，其具有与核酸酶切割的基因座的高同源性区域，但是其还可以含有另外的序列或序列变化，包括可以掺入经切割的靶基因座中的缺失。第三种修复机制可以是微同源性介导的末端连接(MMEJ)，也被称作“备选NHEJ”，其中基因结果类似于NHEJ，因为小缺失和插入可以发生在切割位点处。MMEJ可以利用侧接DNA断裂位点的几个碱基对的同源序列来驱动更有利的DNA末端连接修复结果，且最近的报道已经进一步阐明了该过程的分子机制；参见，例如，Cho和Greenberg, Nature 518, 174-76(2015)；Kent等人, Nature Structural and Molecular Biology, Adv. Online doi:10.1038/nsmb.2961(2015); Mateos-Gomez等人, Nature 518, 254-57 (2015);Ceccaldi等人, Nature 528, 258-62 (2015)。在某些情况下，基于在DNA断裂位点处的潜在微同源性分析可能预测可能的修复结果。
这些基因组编辑机制中的每一种可以用于建立期望的基因组改变。基因组编辑过程中的一个步骤可以是在接近预期突变位点的靶基因座中建立一个或两个DNA断裂，后者作为双链断裂或作为两个单链断裂。这可以通过使用定位多肽来实现，如本文中所述和解释的。
CRISPR内切核酸酶系统
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，簇集的规则地间隔的短回文重复序列)基因组基因座可以存在于许多原核生物(例如，细菌和古细菌)的基因组中。在原核生物中，CRISPR基因座编码这样的产物：其作为一类免疫系统起作用以帮助保护所述原核生物免于外来侵入物，诸如病毒和噬菌体。存在CRISPR基因座功能的三个阶段：新序列整合进CRISPR基因座中，CRISPR RNA (crRNA)的表达，和外来侵入核酸的沉默。已经鉴别了五类CRISPR系统(例如，类型I、类型II、类型III、类型U和类型V)。
CRISPR基因座包括许多短的重复序列，被称作“重复序列”。当表达时，所述重复序列可以形成二级结构(例如，发夹)和/或包含未结构化的单链序列。所述重复序列经常发生在簇中且频繁地在物种之间差异化。所述重复序列被独特插入序列(被称作“间隔物”)规则地隔开，从而产生重复序列-间隔物-重复序列基因座体系结构。所述间隔物与已知的外来侵入序列相同或具有高同源性。间隔物-重复单元编码crisprRNA (crRNA)，其被加工成间隔物-重复单元的成熟形式。crRNA包含参与靶向靶核酸的“种子”或间隔物序列(在原核生物中以天然存在的形式，所述间隔物序列靶向外来侵入核酸)。间隔物序列位于crRNA的5'或3'末端处。
CRISPR基因座也包含编码CRISPR相关(Cas)基因的多核苷酸序列。Cas基因编码参与原核生物中的crRNA功能的生源说和干扰阶段的内切核酸酶。一些Cas基因包含同源的二级结构和/或三级结构。
II型CRISPR系统
在自然界中在II型CRISPR系统中的crRNA生源说要求反式活化的CRISPR RNA(tracrRNA)。II型CRISPR系统的非限制性实例显示于图1A和1B中。所述tracrRNA可以被内源性RNA酶III修饰，然后与前-crRNA阵列中的crRNA重复序列杂交。内源性RNA酶III可以被募集以切割前-crRNA。可以对经切割的crRNA进行核糖核酸外切酶修剪以产生成熟的crRNA形式(例如，5'修剪)。所述tracrRNA可以保持与crRNA杂交，并且tracrRNA和crRNA与定位多肽(例如，Cas9)结合。crRNA-tracrRNA-Cas9复合物的crRNA可以将所述复合物引导至所述crRNA可以与其杂交的靶核酸。所述crRNA与靶核酸的杂交可以活化Cas9用于靶向核酸切割。在II型CRISPR系统中的靶核酸被称作原间隔物邻近基序(PAM)。在自然界中，所述PAM是促进定位多肽(例如，Cas9)与靶核酸的结合所必需的。II型系统(也被称作Nmeni或CASS4)被进一步细分成类型II-A (CASS4)和II-B (CASS4a)。Jinek等人,Science, 337(6096):816-821 (2012)表明，CRISPR/Cas9系统可用于RNA-可编程的基因组编辑，并且国际专利申请公开号WO2013/176772提供了CRISPR/Cas内切核酸酶系统用于位点特异性的基因编辑的众多实例和应用。
V型CRISPR系统
V型CRISPR系统具有相对于II型系统的几个重要差异。例如，Cpf1是单个RNA引导的内切核酸酶，其与II型系统相比缺乏tracrRNA。实际上，Cpf1-相关的CRISPR阵列可以被加工成成熟的crRNAs，不需要另外的反式活化的tracrRNA。V型CRISPR阵列可以被加工成42-44个核苷酸长度的短的成熟的crRNA，其中每种成熟的crRNA开始于直接重复序列的19个核苷酸，继之以间隔物序列的23-25个核苷酸。相反，在II型系统中的成熟的crRNA可以开始于间隔物序列的20-24个核苷酸，继之以直接重复序列的约22个核苷酸。并且，Cpf1可以利用富含T的原间隔物-邻近基序，使得Cpf1-crRNA复合物有效地切割在短的富含T的PAM以后的靶DNA，这不同于对于II型系统而言在靶DNA以后的富含G的PAM。因而，V型系统在远离PAM的点处切割，而II型系统在邻近PAM的点处切割。另外，不同于II型系统，Cpf1通过具有4或5个核苷酸5’突出端的交错DNA双链断裂而切割DNA。II型系统通过钝双链断裂而切割。类似于II型系统，Cpf1含有预测的RuvC-样内切核酸酶结构域，但是缺乏第二个HNH内切核酸酶结构域，这不同于II型系统。
Cas基因/多肽和原间隔物邻近基序
示例性的CRISPR/Cas多肽包括如Fonfara等人,Nucleic Acids Research, 42: 2577-2590 (2014)中公开的Cas9多肽。因为发现了Cas基因，CRISPR/Cas基因命名系统已经经历过多次重写。Fonfara等人还提供了来自不同物种的Cas9多肽的PAM序列(还参见SEQ IDNO:1-620)。
II. 本发明的组合物和方法
本文提供了用于使用基因组工程改造工具来通过删除或突变PCSK9基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列来产生对基因组的永久改变的细胞、离体和体内方法。这样的方法使用内切核酸酶，诸如CRISPR相关的(Cas9、Cpf1等)核酸酶，以在PCSK9基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列的基因组基因座之内或附近进行永久编辑。以这种方式，本发明中阐述的实例可以帮助用单一处理来减少或消除PCSK9基因的表达(而不是在患者的一生中提供潜在的疗法)。
定位多肽(内切核酸酶，酶)
定位多肽是在基因组编辑中用于切割DNA的核酸酶。所述定位多肽可以作为一种或多种多肽或一种或多种编码所述多肽的mRNA施用给细胞或患者。SEQ ID NO:1-620中列出或本文公开的任何酶或直向同源物均可用于本文的方法中。
在CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统的背景下，定位多肽可以结合导引RNA，所述导引RNA又指定所述多肽所针对的靶DNA中的位点。在本文公开的CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统中，所述定位多肽可以是内切核酸酶，诸如DNA内切核酸酶。
定位多肽可以包含多个核酸切割(即，核酸酶)结构域。两个或更多个核酸切割结构域可以经由接头连接在一起。例如，所述接头可以包含柔性接头。接头可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40个或更多个氨基酸的长度。
天然存在的野生型Cas9酶包含两个核酸酶结构域：HNH核酸酶结构域和RuvC结构域。在本文中，术语“Cas9”表示天然存在的和重组的Cas9。在本文中预见到的Cas9酶可以包含HNH或HNH-样核酸酶结构域和/或RuvC或RuvC-样核酸酶结构域。
HNH或HNH-样结构域包含McrA-样折叠。HNH或HNH-样结构域包含两个反平行的β-链和一个α-螺旋。HNH或HNH-样结构域包含一个金属结合位点(例如，一个二价阳离子结合位点)。HNH或HNH-样结构域可以切割靶核酸的一条链(例如，crRNA靶向链的互补链)。
RuvC或RuvC-样结构域包含RNA酶H或RNA酶H-样折叠。RuvC/RNA酶H结构域参与多个系列的基于核酸的功能，包括作用于RNA和DNA。RNA酶H结构域包含被多个α-螺旋包围的5个β-链。RuvC/RNA酶H或RuvC/RNA酶H-样结构域包含一个金属结合位点(例如，一个二价阳离子结合位点)。RuvC/RNA酶H或RuvC/RNA酶H-样结构域可以切割靶核酸的一条链(例如，双链靶DNA的非互补链)。
定位多肽可以在核酸(例如，基因组DNA)中引入双链断裂或单链断裂。所述双链断裂可以刺激细胞的内源性DNA-修复途径(例如，同源性依赖性的修复(HDR)或NHEJ或备选非同源末端连接(A-NHEJ)或微同源性介导的末端连接(MMEJ))。NHEJ可以修复经切割的靶核酸，无需同源模板。这有时可以导致在靶核酸中在切割位点处的小缺失或插入(插入/缺失（indel）)，并且可以导致基因表达的破坏或改变。当同源修复模板或供体可得到时，HDR可以发生。同源供体模板可以包含与侧接靶核酸切割位点的序列同源的序列。姐妹染色单体可以被细胞用作修复模板。但是，为了基因组编辑的目的，所述修复模板可以作为外源核酸(诸如质粒、双链体寡核苷酸、单链寡核苷酸或病毒核酸)来供给。对于外源供体模板，可以在同源性的侧接区域之间引入另外的核酸序列(诸如转基因)或修饰(诸如单个或多个碱基变化或缺失)，使得另外的或改变的核酸序列也变成掺入靶基因座中。MMEJ可以导致与NHEJ类似的基因结果，因为小缺失和插入可以发生在切割位点处。MMEJ可以利用侧接切割位点的几个碱基对的同源序列来驱动有利的末端连接DNA修复结果。在某些情况下，基于在核酸酶靶区域中的潜在微同源性分析可能预测可能的修复结果。
因而，在某些情况下，可以使用同源重组将外源多核苷酸序列插入靶核酸切割位点中。一种外源多核苷酸序列在本文中被称作供体多核苷酸(或供体或供体序列)。将所述供体多核苷酸、所述供体多核苷酸的一部分、所述供体多核苷酸的一个拷贝或所述供体多核苷酸的一个拷贝的部分可以插入靶核酸切割位点中。所述供体多核苷酸可以是外源多核苷酸序列，即，在靶核酸切割位点处不天然地发生的序列。
由NHEJ和/或HDR引起的靶DNA的修饰可以导致，例如，突变、缺失、改变、整合、基因校正、基因替换、基因加标记、转基因插入、核苷酸缺失、基因破坏、易位和/或基因突变。删除基因组DNA和将非天然核酸掺入基因组DNA中的方法是基因组编辑的实例。
所述定位多肽可以包含与野生型示例性定位多肽[例如，来自化脓链球菌的Cas9，US2014/0068797序列ID No. 8或Sapranauskas等人, Nucleic Acids Res, 39(21):9275-9282 (2011)],和多种其它定位多肽具有至少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。所述定位多肽可以包含与野生型定位多肽(例如，来自化脓链球菌的Cas9, 出处同上)在10个连续氨基酸上的至少70、75、80、85、90、95、97、99或100%同一性。所述定位多肽可以包含与野生型定位多肽(例如，来自化脓链球菌的Cas9,出处同上)在10个连续氨基酸上的至多70、75、80、85、90、95、97、99或100%同一性。所述定位多肽可以包含与野生型定位多肽(例如，来自化脓链球菌的Cas9, 出处同上)在所述定位多肽的HNH核酸酶结构域中的10个连续氨基酸上的至少70、75、80、85、90、95、97、99或100%同一性。所述定位多肽可以包含与野生型定位多肽(例如，来自化脓链球菌的Cas9, 出处同上)在所述定位多肽的HNH核酸酶结构域中的10个连续氨基酸上的至多70、75、80、85、90、95、97、99或100%同一性。所述定位多肽可以包含与野生型定位多肽(例如，来自化脓链球菌的Cas9, 出处同上)在所述定位多肽的RuvC核酸酶结构域的10个连续氨基酸上的至少70、75、80、85、90、95、97、99或100%同一性。所述定位多肽可以包含与野生型定位多肽(例如，来自化脓链球菌的Cas9, 出处同上)在所述定位多肽的RuvC核酸酶结构域的10个连续氨基酸上的至多70、75、80、85、90、95、97、99或100%同一性。
所述定位多肽可以包含野生型示例性定位多肽的经修饰形式。所述野生型示例性定位多肽的经修饰形式可以包含减小所述定位多肽的核酸切割活性的突变。所述野生型示例性定位多肽的经修饰形式可以具有所述野生型示例性定位多肽(例如，来自化脓链球菌的Cas9, 出处同上)的核酸切割活性的小于90%、小于80%、小于70%、小于60%、小于50%、小于40%、小于30%、小于20%、小于10%、小于5%或小于1%。所述定位多肽的经修饰形式可以不具有实质的核酸切割活性。当定位多肽是不具有实质的核酸切割活性的经修饰形式时，它在本文中被称作“无酶活性的”。
所述定位多肽的经修饰形式可以包含突变，使得它可以诱导靶核酸上的单链断裂(SSB) (例如，通过仅切割双链靶核酸的糖-磷酸主链之一)。在某些方面中，所述突变可以导致所述野生型定位多肽(例如，来自化脓链球菌的Cas9, 出处同上)的多个核酸切割结构域中的一个或多个的小于90%、小于80%、小于70%、小于60%、小于50%、小于40%、小于30%、小于20%、小于10%、小于5%或小于1%的核酸切割活性。在某些方面中，所述突变可以导致多个核酸切割结构域中的一个或多个保留切割靶核酸的互补链的能力、但是减小它的切割靶核酸的非互补链的能力。所述突变可以导致多个核酸切割结构域中的一个或多个保留切割靶核酸的非互补链的能力、但是减小它的切割靶核酸的互补链的能力。例如，野生型示例性化脓链球菌Cas9多肽中的残基(诸如Asp10、His840、Asn854和Asn856)被突变以失活多个核酸切割结构域(例如，核酸酶结构域)中的一个或多个。要突变的残基可以对应于野生型示例性化脓链球菌Cas9多肽中的残基Asp10、His840、Asn854和Asn856 (例如，如通过序列和/或结构比对所确定的)。突变的非限制性实例包括D10A、H840A、N854A或N856A。本领域技术人员会认识到，除了丙氨酸置换以外的突变可以是合适的。
在某些方面中，可以将D10A突变与H840A、N854A或N856A突变中的一种或多种组合以产生基本上缺乏DNA裂解活性的定位多肽。可以将H840A突变与D10A、N854A或N856A突变中的一种或多种组合以产生基本上缺乏DNA裂解活性的定位多肽。可以将N854A突变与H840A、D10A或N856A突变中的一种或多种组合以产生基本上缺乏DNA裂解活性的定位多肽。可以将N856A突变与H840A、N854A或D10A突变中的一种或多种组合以产生基本上缺乏DNA裂解活性的定位多肽。包含一个基本上无活性的核酸酶结构域的定位多肽被称作“切口酶”。
RNA引导的内切核酸酶(例如Cas9)的切口酶变体可以用于增加CRISPR介导的基因组编辑的特异性。野生型Cas9通常由单个导引RNA来导引，所述导引RNA被设计成与靶序列中的指定的约20个核苷酸序列(诸如内源性基因组基因座)杂交。但是，可以在导引RNA和靶基因座之间容忍几个错配，从而将所述靶位点中需要的同源性的长度有效地减小至例如小至13个核苷酸的同源性，且由此导致升高的CRISPR/Cas9复合物在靶基因组别处的结合和双链核酸切割(也被称作靶外切割)的可能性。因为Cas9的切口酶变体为了建立双链断裂各自仅切割一条链，必须使一对切口酶在靶核酸的相对链紧密靠近处和表面上结合，由此建立一对切口，其为双链断裂的等同物。这要求，两种单独的导引RNA(各自针对一种切口酶)必须在靶核酸的相对链紧密靠近处和表面上结合。该要求使双链断裂发生所需的同源性的最小长度基本上倍增，由此减小以下可能性：双链切割事件将发生在基因组的别处，在该处所述两个导引RNA位点(如果它们存在的话)不可能彼此充分靠近以使双链断裂形成。如在本领域中描述的，还可以使用切口酶来相对于NHEJ促进HDR。通过使用有效地介导期望的变化的特定供体序列，可以使用HDR将选择的变化引入基因组中的靶位点。用于用在基因编辑中的各种CRISPR/Cas系统的描述可以参见，例如，国际专利申请公开号WO2013/176772,和Nature Biotechnology 32, 347-355 (2014)，和其中引用的参考文献。
预见到的突变可以包括置换、添加和缺失，或它们的任意组合。所述突变将突变的氨基酸转化成丙氨酸。所述突变将突变的氨基酸转化成另一种氨基酸(例如，甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸或精氨酸)。所述突变将突变的氨基酸转化成非天然的氨基酸(例如，硒代甲硫氨酸)。所述突变将突变的氨基酸转化成氨基酸模仿物(例如，磷酸模仿物)。所述突变可以是保守突变。例如，所述突变将突变的氨基酸转化成类似于突变的氨基酸(例如，半胱氨酸/丝氨酸突变、赖氨酸/天冬酰胺突变、组氨酸/苯丙氨酸突变)的大小、形状、电荷、极性、构象和/或旋转异构体的氨基酸。所述突变可以造成读码框的转移和/或未成熟终止密码子的建立。突变可以造成基因或基因座的调节区的变化，所述调节区影响一种或多种基因的表达。
所述定位多肽(例如，变体的、突变的、无酶活性的和/或有条件地无酶活性的定位多肽)可以靶向核酸。所述定位多肽(例如，变体的、突变、无酶活性的和/或有条件地无酶活性的核糖核酸内切酶)可以靶向DNA。所述定位多肽(例如，变体的、突变的、无酶活性的和/或有条件地无酶活性的核糖核酸内切酶)可以靶向RNA。
所述定位多肽可以包含一种或多种非天然序列(例如，所述定位多肽是融合蛋白)。
所述定位多肽可以包含与来自细菌(例如，化脓链球菌)的Cas9具有至少15%氨基酸同一性的氨基酸序列、一个核酸结合结构域和两个核酸切割结构域(即，一个HNH结构域和一个RuvC结构域)。
所述定位多肽可以包含与来自细菌(例如，化脓链球菌)的Cas9具有至少15%氨基酸同一性的氨基酸序列和两个核酸切割结构域(即，一个HNH结构域和一个RuvC结构域)。
所述定位多肽可以包含与来自细菌(例如，化脓链球菌)的Cas9具有至少15%氨基酸同一性的氨基酸序列和两个核酸切割结构域，其中所述核酸切割结构域中的一个或两个与来自细菌(例如，化脓链球菌)的Cas9的核酸酶结构域具有至少50%氨基酸同一性。
所述定位多肽可以包含与来自细菌(例如，化脓链球菌)的Cas9具有至少15%氨基酸同一性的氨基酸序列、两个核酸切割结构域(即，一个HNH结构域和一个RuvC结构域)和非天然序列(例如，核定位信号)或将所述定位多肽连接至非天然序列的接头。
所述定位多肽可以包含与来自细菌(例如，化脓链球菌)的Cas9具有至少15%氨基酸同一性的氨基酸序列、两个核酸切割结构域(即，一个HNH结构域和一个RuvC结构域)，其中所述定位多肽包含在所述核酸切割结构域中的一个或两个中的突变，所述突变使所述核酸酶结构域的切割活性减小至少50%。
所述定位多肽可以包含与来自细菌(例如，化脓链球菌)的Cas9具有至少15%氨基酸同一性的氨基酸序列和两个核酸切割结构域(即，一个HNH结构域和一个RuvC结构域)，其中所述核酸酶结构域之一包含天冬氨酸10的突变，和/或其中所述核酸酶结构域之一可以包含组氨酸840的突变，且其中所述突变使所述核酸酶结构域的切割活性减小至少50%。
一种或多种定位多肽(例如DNA内切核酸酶)可以包括两种切口酶，它们一起实现在基因组的特定基因座处的一个双链断裂，或四种切口酶，它们一起实现或造成在基因组的特定基因座处的两个双链断裂。可替换地，一种定位多肽(例如DNA内切核酸酶)可以实现或造成在基因组的特定基因座处的一个双链断裂。
来自其它细菌菌株的Cas9直向同源物的非限制性实例包括但不限于在以下中鉴定的Cas蛋白：Acaryochloris marina MBIC11017；阿拉伯糖醋杆菌DSM 5501；喜温嗜酸硫杆菌；氧化亚铁嗜酸硫杆菌ATCC 23270；酸热脂环酸杆菌LAA1；酸热脂环酸酸热亚种DSM446；Allochromatium vinosum DSM 180；Ammonifex degensii KC4；鱼腥藻ATCC 29413；极大节旋藻CS-328；钝顶螺旋藻str. Paraca；节旋藻物种PCC 8005；假蕈状芽孢杆菌DSM12442；硒化芽孢杆菌MLS10；细菌伯克霍尔德氏菌1_1_47；Caldicelulosiruptor becscii DSM 6725；Candidatus Desulforudis audaxviator MP104C；Caldicellulosiruptor hydrothermalis_108；梭状芽孢杆菌噬菌体c-st；肉毒梭状芽孢杆菌A3 str. Loch Maree；肉毒梭状芽孢杆菌Ba4 str. 657；艰难梭状芽孢杆菌QCD-63q42；Crocosphaera watsonii WH 8501；蓝丝菌属物种ATCC 51142；蓝丝菌属物种CCY0110；蓝丝菌属物种PCC 7424；蓝丝菌属物种PCC 7822；Exiguobacterium sibiricum 255-15；大芬戈尔德菌ATCC 29328；Ktedonobacter racemifer DSM 44963；德氏乳杆菌保加利亚亚种PB2003/044-T3-4；唾液乳杆菌ATCC 11741；无害李斯特菌；林氏藻属物种PCC 8106；海杆菌属物种ELB17；Methanohalobium evestigatum Z-7303；微囊藻噬菌体Ma-LMM01；铜绿微囊藻NIES-843；Microscilla marina ATCC 23134；原型微鞘藻PCC 7420；脑膜炎奈瑟氏菌；嗜盐亚硝化球菌Nc4；达氏诺卡氏菌达氏亚种DSM 43111；泡沫节球藻CCY9414；念珠藻属物种PCC 7120；颤藻属物种PCC 6506；Pelotomaculum_thermopropionicum_SI；运动石袍菌SJ95；Polaromonas naphthalenivorans CJ2；极地单胞菌属物种JS666；河豚毒素假交替单胞菌TAC125；始旋链霉菌ATCC 25486；始旋链霉菌ATCC 25486；嗜热链球菌；绿产色链霉菌DSM40736；玫瑰链霉菌DSM 43021；聚球藻属物种PCC 7335；和非洲栖热腔菌TCF52B(Chylinski等人, RNA Biol., 2013; 10(5): 726-737)。
除了Cas9直向同源物以外，其它Cas9变体，诸如失活的dCas9和具有不同功能的效应子结构域的融合蛋白，可以充当遗传调节的平台。任何前述酶都可用于本发明。
SEQ ID NO:1-620中给出可用于本发明中的内切核酸酶的另外的实例。这些蛋白可以在使用前被修饰，或者可以在核酸序列诸如DNA、RNA或mRNA中或在载体构建体诸如本文中教导的质粒或AAV载体中被编码。此外，可以对它们进行密码子优化。
SEQ ID NO:1-620公开了内切核酸酶序列的非穷举列表。
靶向基因组的核酸
本发明提供了一种靶向基因组的核酸，其可以指导有关多肽(例如，定位多肽)对靶核酸内的特定靶序列的活性。所述靶向基因组的核酸可以是RNA。靶向基因组的RNA在本文中被称作“导引RNA”或“gRNA”。导引RNA至少可以包含与目标靶核酸序列杂交的间隔物序列和CRISPR重复序列。在II型系统中，所述gRNA也包含被称作tracrRNA序列的第二种RNA。在II型导引RNA (gRNA)中，CRISPR重复序列和tracrRNA序列彼此杂交以形成双链体。在V型导引RNA (gRNA)中，crRNA形成双链体。在两种系统中，所述双链体可以结合定位多肽，使得导引RNA和定位多肽形成复合物。所述靶向基因组的核酸可以通过它与定位多肽的结合为所述复合物提供靶标特异性。所述靶向基因组的核酸因而可以指导所述定位多肽的活性。
示例性的导引RNA包括间隔物序列15-200个碱基，其中所述基因组位置是基于GRCh38人基因组组件。示例性导引RNA包括基于SEQ ID NO:5,305-28,696中呈现的DNA序列的RNA版本的间隔物序列。本领域普通技术人员会理解，将每种导引RNA可以设计成包括与它的基因组靶序列互补的间隔物序列。例如，每个间隔物序列，例如，SEQ ID NO:5,305-28,696中呈现的DNA序列的RNA版本，可以放入单个RNA嵌合体或crRNA中(与对应的tracrRNA一起)。参见Jinek等人, Science, 337, 816-821 (2012)和Deltcheva等人, Nature, 471,602-607 (2011)。
所述靶向基因组的核酸可以是双分子导引RNA。所述靶向基因组的核酸可以是单分子导引RNA。
双分子导引RNA可以包含两条RNA链。第一链在5' 至3'方向包含任选的间隔物延伸序列、间隔物序列和最小CRISPR重复序列。第二链可以包含最小tracrRNA序列(与最小CRISPR重复序列互补)、3’tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。
在II型系统中的单分子导引RNA (sgRNA)在5' 至3'方向可以包含任选的间隔物延伸序列、间隔物序列、最小CRISPR重复序列、单分子导引接头、最小tracrRNA序列、3’tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。所述任选的tracrRNA延伸可以包含给导引RNA贡献另外的功能性(例如，稳定性)的元件。所述单分子导引接头可以连接最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列以形成发夹结构。所述任选的tracrRNA延伸可以包含一个或多个发夹。
sgRNA可以在sgRNA序列的5’末端包含20个核苷酸间隔物序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5’末端包含少于20个核苷酸间隔物序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5’末端包含多于20个核苷酸间隔物序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5’末端包含具有17-30个核苷酸的可变长度的间隔物序列(参见表1)。
sgRNA可以在sgRNA序列的3’末端不包含尿嘧啶，诸如在表1的SEQ ID NO:28,729中。sgRNA可以在sgRNA序列的3’末端包含一个或多个尿嘧啶，诸如在表1的SEQ ID NO:28,730中。例如，sgRNA可以在sgRNA序列的3’末端包含1个尿嘧啶(U)。sgRNA可以在sgRNA序列的3’末端包含2个尿嘧啶(UU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3’末端包含3个尿嘧啶(UUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3’末端包含4个尿嘧啶(UUUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3’末端包含5个尿嘧啶(UUUUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3’末端包含6个尿嘧啶(UUUUUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3’末端包含7个尿嘧啶(UUUUUUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3’末端包含8个尿嘧啶(UUUUUUUU)。
sgRNA可以是未修饰的或修饰的。例如，修饰的sgRNA可以包含一个或多个2'-O-甲基硫代磷酸酯核苷酸。
表1
在V型系统中的单分子导引RNA (sgRNA)在5' 至3'方向可以包含最小CRISPR重复序列和间隔物序列。
作为举例说明，在CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统中使用的导引RNA或其它更小的RNA可以通过化学方式容易地合成，如在下面举例说明的和在本领域中描述的。尽管化学合成程序在继续增加，但是通过诸如高效液相色谱法(HPLC，其避免使用凝胶诸如PAGE)等程序对这样的RNA的纯化倾向于变得更有挑战性，因为多核苷酸长度显著地增加超过了100个左右核苷酸。用于制备较大长度的RNA的一个方案是生产连接在一起的两个或更多个分子。通过酶法更容易地制备长得多的RNA，诸如编码Cas9或Cpf1内切核酸酶的那些。在RNA的化学合成和/或酶法制备过程中或以后，可以引入不同类型的RNA修饰，例如，如本领域中描述的增加稳定性、减小先天性免疫应答的可能性或程度、和/或增强其它属性的修饰。
间隔物延伸序列
在靶向基因组的核酸的某些实例中，间隔物延伸序列可以改变活性，提供稳定性和/或提供用于修饰靶向基因组的核酸的位置。间隔物延伸序列可以改变在靶(on-target)或靶外(off-target)活性或特异性。在某些实例中，可以提供了一种间隔物延伸序列。间隔物延伸序列可以具有超过1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000或7000个或更多个核苷酸的长度。间隔物延伸序列可以具有小于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000个或更多个核苷酸的长度。间隔物延伸序列可以具有小于10个核苷酸的长度。间隔物延伸序列可以具有在10-30个核苷酸之间的长度。间隔物延伸序列可以具有在30-70个核苷酸之间的长度。
所述间隔物延伸序列可以包含另一个部分(例如，稳定性控制序列、核糖核酸内切酶结合序列、核酶)。所述部分可以减小或增加靶向核酸的核酸的稳定性。所述部分可以是转录终止子区段(即，转录终止序列)。所述部分可以在真核细胞中起作用。所述部分可以在原核细胞中起作用。所述部分可以在真核和原核细胞中起作用。合适的部分的非限制性实例包括：5' 帽(例如，7-甲基鸟苷酸酯帽(m7 G))、核糖开关序列(例如，以允许由蛋白和蛋白复合物实现的经调节的稳定性和/或经调节的可达性)、形成dsRNA双链体(即，发夹)的序列、将RNA靶向至亚细胞位置(例如，细胞核、线粒体、叶绿体等)的序列、提供跟踪的修饰或序列(例如，直接缀合至荧光分子，缀合至促进荧光检测的部分，允许荧光检测的序列，等)和/或提供蛋白(例如，在DNA上起作用的蛋白，包括转录活化剂、转录阻遏物、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰基转移酶、组蛋白脱乙酰基酶等)的结合位点的修饰或序列。
间隔物序列
所述间隔物序列与目标靶核酸中的序列杂交。靶向基因组的核酸的间隔物可以通过杂交(即，碱基配对)以序列特异性的方式与靶核酸相互作用。所述间隔物的核苷酸序列可以随目标靶核酸的序列变化。
在本文的CRISPR/Cas系统中，可以将间隔物序列设计成与靶核酸杂交，所述靶核酸位于在所述系统中使用的Cas9酶的PAM的5'侧。所述间隔物可以与靶序列完美匹配或可以具有错配。每种Cas9酶具有它在靶DNA中识别的特定PAM序列。例如，化脓链球菌在靶核酸中识别包含序列5'-NRG-3'的PAM，其中R包含A或G，其中N是任意核苷酸，且N在被间隔物序列靶向的靶核酸序列的3'紧邻处。
所述靶核酸序列可以包含20个核苷酸。所述靶核酸可以包含小于20个核苷酸。所述靶核酸可以包含超过20个核苷酸。所述靶核酸可以包含至少5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。所述靶核酸可以包含至多5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。所述靶核酸序列可以包含在PAM的第一个核苷酸的5'侧紧邻的20个碱基。例如，在包含5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3' (SEQ ID NO:28727)的序列中，靶核酸可以包含与N对应的序列，其中N是任意核苷酸，且标下划线的NRG序列是化脓链球菌PAM。该靶核酸序列通常被称为PAM链，而互补核酸序列通常被称为非-PAM链。本领域技术人员将认识到间隔物序列与靶核酸的非-PAM链杂交(图1A和1B)。
与靶核酸杂交的间隔物序列可以具有至少约6个核苷酸(nt)的长度。所述间隔物序列可以是至少约6个核苷酸、至少约10个核苷酸、至少约15个核苷酸、至少约18个核苷酸、至少约19个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约25个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约35个核苷酸或至少约40个核苷酸、约6个核苷酸至约80个核苷酸、约6个核苷酸至约50个核苷酸、约6个核苷酸至约45个核苷酸、约6个核苷酸至约40个核苷酸、约6个核苷酸至约35个核苷酸、约6个核苷酸至约30个核苷酸、约6个核苷酸至约25个核苷酸、约6个核苷酸至约20个核苷酸、约6个核苷酸至约19个核苷酸、约10个核苷酸至约50个核苷酸、约10个核苷酸至约45个核苷酸、约10个核苷酸至约40个核苷酸、约10个核苷酸至约35个核苷酸、约10个核苷酸至约30个核苷酸、约10个核苷酸至约25个核苷酸、约10个核苷酸至约20个核苷酸、约10个核苷酸至约19个核苷酸、约19个核苷酸至约25个核苷酸、约19个核苷酸至约30个核苷酸、约19个核苷酸至约35个核苷酸、约19个核苷酸至约40个核苷酸、约19个核苷酸至约45个核苷酸、约19个核苷酸至约50个核苷酸、约19个核苷酸至约60个核苷酸、约20个核苷酸至约25个核苷酸、约20个核苷酸至约30个核苷酸、约20个核苷酸至约35个核苷酸、约20个核苷酸至约40个核苷酸、约20个核苷酸至约45个核苷酸、约20个核苷酸至约50个核苷酸、或约20个核苷酸至约60个核苷酸。所述间隔物序列可以包含20个核苷酸。所述间隔物可以包含19个核苷酸。在某些实例中，所述间隔物可以包含18个核苷酸。在某些实例中，所述间隔物可以包含22个核苷酸。
在某些实例中，在所述间隔物序列和所述靶核酸之间的互补性百分比是至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或100%。在某些实例中，在所述间隔物序列和所述靶核酸之间的互补性百分比是至多约30%、至多约40%、至多约50%、至多约60%、至多约65%、至多约70%、至多约75%、至多约80%、至多约85%、至多约90%、至多约95%、至多约97%、至多约98%、至多约99%或100%。在某些实例中，在所述靶核酸的互补链的靶序列的最5'侧6个连续核苷酸上，在所述间隔物序列和所述靶核酸之间的互补性百分比是100%。在约20个连续核苷酸上，在所述间隔物序列和所述靶核酸之间的互补性百分比可以是至少60%。所述间隔物序列和所述靶核酸的长度可以相差1-6个核苷酸，其可以被视作一个或多个凸起物。
可以使用计算机程序设计或选择间隔物序列。所述计算机程序可以使用变量，诸如预测的解链温度、二级结构形成、预测的退火温度、序列同一性、基因组背景、染色质可达性、%GC、基因组发生频率(例如，属于相同或类似的序列，但是由于错配、插入或缺失而在一个或多个斑点中变化)、甲基化状态、SNP的存在等。
最小CRISPR重复序列
在某些方面中，最小CRISPR重复序列是与参比CRISPR重复序列(例如，来自化脓链球菌的crRNA)具有至少约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%序列同一性的序列。
在某些方面中，最小CRISPR重复序列包含可以与细胞中的最小tracrRNA序列杂交的核苷酸。所述最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列可以形成双链体，即碱基配对的双链结构。所述最小CRISPR重复序列和所述最小tracrRNA序列可以一起结合定位多肽。所述最小CRISPR重复序列的至少部分与最小tracrRNA序列杂交。在某些方面中，所述最小CRISPR重复序列的至少部分包含与最小tracrRNA序列的至少约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%互补性。所述最小CRISPR重复序列的至少部分可以包含与最小tracrRNA序列的至多约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%互补性。
所述最小CRISPR重复序列可以具有约7个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，所述最小CRISPR重复序列的长度是约7个核苷酸(nt)至约50个核苷酸、约7个核苷酸至约40个核苷酸、约7个核苷酸至约30个核苷酸、约7个核苷酸至约25个核苷酸、约7个核苷酸至约20个核苷酸、约7个核苷酸至约15个核苷酸、约8个核苷酸至约40个核苷酸、约8个核苷酸至约30个核苷酸、约8个核苷酸至约25个核苷酸、约8个核苷酸至约20个核苷酸、约8个核苷酸至约15个核苷酸、约15个核苷酸至约100个核苷酸、约15个核苷酸至约80个核苷酸、约15个核苷酸至约50个核苷酸、约15个核苷酸至约40个核苷酸、约15个核苷酸至约30个核苷酸、或约15个核苷酸至约25个核苷酸。在某些方面中，所述最小CRISPR重复序列是大约9个核苷酸的长度。在某些方面中，所述最小CRISPR重复序列是大约12个核苷酸的长度。
所述最小CRISPR重复序列可以与参比最小CRISPR重复序列(例如，来自化脓链球菌的野生型crRNA)在至少6、7或8个连续核苷酸的区段上具有至少约60%同一性。例如，所述最小CRISPR重复序列可以与参比最小CRISPR重复序列在至少6、7或8个连续核苷酸的区段上具有至少约65%同一性、至少约70%同一性、至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约95%同一性、至少约98%同一性、至少约99%同一性或100%同一性。
最小tracrRNA序列
最小tracrRNA序列可以是与参比tracrRNA序列(例如，来自化脓链球菌的野生型tracrRNA)具有至少约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%序列同一性的序列。
最小tracrRNA序列可以包含与细胞中的最小CRISPR重复序列杂交的核苷酸。最小tracrRNA序列和最小CRISPR重复序列形成双链体，即碱基配对的双链结构。所述最小tracrRNA序列和所述最小CRISPR重复序列可以一起结合定位多肽。所述最小tracrRNA序列的至少部分可以与所述最小CRISPR重复序列杂交。所述最小tracrRNA序列与所述最小CRISPR重复序列可以具有至少约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%互补性。
所述最小tracrRNA序列可以具有约7个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，所述最小tracrRNA序列可以是约7个核苷酸(nt)至约50个核苷酸、约7个核苷酸至约40个核苷酸、约7个核苷酸至约30个核苷酸、约7个核苷酸至约25个核苷酸、约7个核苷酸至约20个核苷酸、约7个核苷酸至约15个核苷酸、约8个核苷酸至约40个核苷酸、约8个核苷酸至约30个核苷酸、约8个核苷酸至约25个核苷酸、约8个核苷酸至约20个核苷酸、约8个核苷酸至约15个核苷酸、约15个核苷酸至约100个核苷酸、约15个核苷酸至约80个核苷酸、约15个核苷酸至约50个核苷酸、约15个核苷酸至约40个核苷酸、约15个核苷酸至约30个核苷酸或约15个核苷酸至约25个核苷酸的长度。所述最小tracrRNA序列可以是大约9个核苷酸的长度。所述最小tracrRNA序列可以是大约12个核苷酸。所述最小tracrRNA可以由在Jinek等人(出处同上)中描述的tracrRNA核苷酸23-48组成。
所述最小tracrRNA序列可以与参比最小tracrRNA (例如，来自化脓链球菌的野生型tracrRNA)序列在至少6、7或8个连续核苷酸的区段上具有至少约60%同一性。例如，所述最小tracrRNA序列可以与参比最小tracrRNA序列在至少6、7或8个连续核苷酸的区段上具有至少约65%同一性、约70%同一性、约75%同一性、约80%同一性、约85%同一性、约90%同一性、约95%同一性、约98%同一性、约99%同一性或100%同一性。
在最小CRISPR RNA和所述最小tracrRNA之间的双链体可以包含双螺旋。在最小CRISPR RNA和所述最小tracrRNA之间的双链体可以包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。在最小CRISPR RNA和所述最小tracrRNA之间的双链体可以包含至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。
所述双链体可以包含错配(即，所述双链体的两条链不是100%互补)。所述双链体可以包含至少约1、2、3、4或5个或更多个错配。所述双链体可以包含至多约1、2、3、4或5个或更多个错配。所述双链体可以包含不超过2个错配。
凸起物
在某些情况中，在所述最小CRISPR RNA和所述最小tracrRNA之间的双链体中可以存在“凸起物”。所述凸起物是所述双链体内的核苷酸的未配对区域。所述凸起物可以促进所述双链体与定位多肽的结合。凸起物可以包含在双链体的一侧上的未配对的5'-XXXY-3'(SEQ ID NO:28,731)(其中X是任意嘌呤，且Y包含可以与相对链上的核苷酸形成摆动对的核苷酸)和在双链体的另一侧上的未配对的核苷酸区域。在双链体的两侧上的未配对的核苷酸的数目可以是不同的。
在一个实例中，所述凸起物可以包含在所述凸起物的最小CRISPR重复序列链上的未配对的嘌呤(例如，腺嘌呤)。在某些实例中，凸起物可以包含所述凸起物的最小tracrRNA序列链的未配对的5'-AAGY-3'，其中Y包含可以与最小CRISPR重复序列链上的核苷酸形成摆动配对的核苷酸。
在所述双链体的最小CRISPR重复序列侧上的凸起物可以包含至少1、2、3、4或5个或更多个未配对的核苷酸。在所述双链体的最小CRISPR重复序列侧上的凸起物可以包含至多1、2、3、4或5个或更多个未配对的核苷酸。在所述双链体的最小CRISPR重复序列侧上的凸起物可以包含1个未配对的核苷酸。
在所述双链体的最小tracrRNA序列侧上的凸起物可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个未配对的核苷酸。在所述双链体的最小tracrRNA序列侧上的凸起物可以包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个未配对的核苷酸。在所述双链体的第二侧(例如，所述双链体的最小tracrRNA序列侧)上的凸起物可以包含4个未配对的核苷酸。
凸起物可以包含至少一个摆动配对。在某些实例中，凸起物可以包含至多一个摆动配对。凸起物可以包含至少一个嘌呤核苷酸。凸起物可以包含至少3个嘌呤核苷酸。凸起物序列可以包含至少5个嘌呤核苷酸。凸起物序列可以包含至少一个鸟嘌呤核苷酸。凸起物序列可以包含至少一个腺嘌呤核苷酸。
发夹
在不同的实例中，一个或多个发夹可以位于3' tracrRNA序列中的最小tracrRNA的3'侧。
所述发夹可以开始于在最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列双链体中的最后一个配对核苷酸的3'侧的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多个核苷酸。所述发夹可以开始于最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列双链体中的最后一个配对核苷酸的3' 侧的至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。
发夹可以包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多个连续核苷酸。发夹可以包含至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15个或更多个连续核苷酸。
发夹可以包含CC二核苷酸(即，两个连续胞嘧啶核苷酸)。
发夹可以包含形成双链体的核苷酸(例如，杂交在一起的在发夹中的核苷酸)。例如，发夹可以包含与3' tracrRNA序列的发夹双链体中的GG二核苷酸杂交的CC二核苷酸。
一个或多个发夹可以与定位多肽的导引RNA-相互作用区域相互作用。
在某些实例中，存在两个或更多个发夹，且在其它实例中，存在三个或更多个发夹。
3' tracrRNA序列
3' tracrRNA序列可以包含与参比tracrRNA序列(例如，来自化脓链球菌的tracrRNA)具有至少约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%序列同一性的序列。
所述3' tracrRNA序列可以具有约6个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，所述3' tracrRNA序列可以具有约6个核苷酸(nt)至约50个核苷酸、约6个核苷酸至约40个核苷酸、约6个核苷酸至约30个核苷酸、约6个核苷酸至约25个核苷酸、约6个核苷酸至约20个核苷酸、约6个核苷酸至约15个核苷酸、约8个核苷酸至约40个核苷酸、约8个核苷酸至约30个核苷酸、约8个核苷酸至约25个核苷酸、约8个核苷酸至约20个核苷酸、约8个核苷酸至约15个核苷酸、约15个核苷酸至约100个核苷酸、约15个核苷酸至约80个核苷酸、约15个核苷酸至约50个核苷酸、约15个核苷酸至约40个核苷酸、约15个核苷酸至约30个核苷酸、或约15个核苷酸至约25个核苷酸的长度。所述3' tracrRNA序列可以具有大约14个核苷酸的长度。
所述3' tracrRNA序列可以与参比3' tracrRNA序列(例如，来自化脓链球菌的野生型3' tracrRNA序列)在至少6、7或8个连续核苷酸的区段上具有至少约60%同一性。例如，所述3' tracrRNA序列可以与参比3' tracrRNA序列(例如，来自化脓链球菌的野生型3'tracrRNA序列)在至少6、7或8个连续核苷酸的区段上具有至少约60%同一性、约65%同一性、约70%同一性、约75%同一性、约80%同一性、约85%同一性、约90%同一性、约95%同一性、约98%同一性、约99%同一性或100%同一性。
3' tracrRNA序列可以包含超过一个形成双链体的区域(例如，发夹，杂交的区域)。3' tracrRNA序列可以包含两个形成双链体的区域。
所述3' tracrRNA序列可以包含茎环结构。所述3' tracrRNA中的茎环结构可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多个核苷酸。所述3' tracrRNA中的茎环结构可以包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。所述茎环结构可以包含功能性部分。例如，所述茎环结构可以包含适体、核酶、蛋白-相互作用发夹、CRISPR阵列、内含子或外显子。所述茎环结构可以包含至少约1、2、3、4或5个或更多个功能性部分。所述茎环结构可以包含至多约1、2、3、4或5个或更多个功能性部分。
所述3' tracrRNA序列中的发夹可以包含P-结构域。在某些实例中，所述P-结构域可以包含在发夹中的双链区域。
tracrRNA延伸序列
可以提供tracrRNA延伸序列，无论所述tracrRNA是在单分子导引还是双分子导引的背景下。tracrRNA延伸序列可以具有约1个核苷酸至约400个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以具有超过1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380或400个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以具有约20至约5000个或更多个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以具有超过1000个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以具有小于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400个或更多个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以具有小于1000个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以包含小于10个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以是10-30个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以是30-70个核苷酸的长度。
所述tracrRNA延伸序列可以包含功能性部分(例如，稳定性控制序列、核酶、核糖核酸内切酶结合序列)。所述功能性部分可以包含转录终止子区段(即，转录终止序列)。所述功能性部分可以具有约10个核苷酸(nt)至约100个核苷酸、约10个核苷酸至约20个核苷酸、约20个核苷酸至约30个核苷酸、约30个核苷酸至约40个核苷酸、约40个核苷酸至约50个核苷酸、约50个核苷酸至约60个核苷酸、约60个核苷酸至约70个核苷酸、约70个核苷酸至约80个核苷酸、约80个核苷酸至约90个核苷酸或约90个核苷酸至约100个核苷酸、约15个核苷酸至约80个核苷酸、约15个核苷酸至约50个核苷酸、约15个核苷酸至约40个核苷酸、约15个核苷酸至约30个核苷酸或约15个核苷酸至约25个核苷酸的总长度。所述功能性部分可以在真核细胞中起作用。所述功能性部分可以在原核细胞中起作用。所述功能性部分可以在真核和原核细胞中起作用。
合适的tracrRNA延伸功能性部分的非限制性实例包括3' 聚-腺苷酸化的尾巴、核糖开关序列(例如，以允许由蛋白和蛋白复合物实现的经调节的稳定性和/或经调节的可达性)、形成dsRNA双链体(即，发夹)的序列、将RNA靶向至亚细胞位置(例如，细胞核、线粒体、叶绿体等)的序列、提供跟踪的修饰或序列(例如，直接缀合至荧光分子，缀合至促进荧光检测的部分，允许荧光检测的序列，等)和/或提供蛋白(例如，在DNA上起作用的蛋白，包括转录活化剂、转录阻遏物、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰基转移酶、组蛋白脱乙酰基酶等)的结合位点的修饰或序列。tracrRNA延伸序列可以包含引物结合位点或分子指标(例如，条形码序列)。所述tracrRNA延伸序列可以包含一个或多个亲和标签。
单分子导引接头序列
单分子导引核酸的接头序列可以具有约3个核苷酸至约100个核苷酸的长度。在Jinek等人(出处同上)中，例如，使用简单的4个核苷酸“四环”(-GAAA-), Science, 337(6096):816-821 (2012)。示例性接头具有约3个核苷酸(nt)至约90个核苷酸、约3个核苷酸至约80个核苷酸、约3个核苷酸至约70个核苷酸、约3个核苷酸至约60个核苷酸、约3个核苷酸至约50个核苷酸、约3个核苷酸至约40个核苷酸、约3个核苷酸至约30个核苷酸、约3个核苷酸至约20个核苷酸、约3个核苷酸至约10个核苷酸的长度。例如，所述接头可以具有约3个核苷酸至约5个核苷酸、约5个核苷酸至约10个核苷酸、约10个核苷酸至约15个核苷酸、约15个核苷酸至约20个核苷酸、约20个核苷酸至约25个核苷酸、约25个核苷酸至约30个核苷酸、约30个核苷酸至约35个核苷酸、约35个核苷酸至约40个核苷酸、约40个核苷酸至约50个核苷酸、约50个核苷酸至约60个核苷酸、约60个核苷酸至约70个核苷酸、约70个核苷酸至约80个核苷酸、约80个核苷酸至约90个核苷酸或约90个核苷酸至约100个核苷酸的长度。单分子导引核酸的接头可以是在4-40个核苷酸之间。接头可以是至少约100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000个或更多个核苷酸。接头可以是至多约100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000个或更多个核苷酸。
接头可以包含许多种序列中的任一种，尽管在某些实例中，所述接头将不包含与导引RNA的其它部分具有广泛同源性区域的序列，所述广泛同源性区域可能造成干扰所述导引物的其它功能区域的分子内结合。在Jinek等人(出处同上)中，使用简单的4个核苷酸序列-GAAA-, Science, 337(6096):816-821 (2012)，但是同样可以使用众多其它序列，包括更长的序列。
所述接头序列可以包含功能性部分。例如，所述接头序列可以包含一个或多个特征，包括适体、核酶、蛋白-相互作用发夹、蛋白结合位点、CRISPR阵列、内含子或外显子。所述接头序列可以包含至少约1、2、3、4或5个或更多个功能性部分。在某些实例中，所述接头序列可以包含至多约1、2、3、4或5个或更多个功能性部分。
核酸修饰(化学和结构修饰)
在某些方面中，引入细胞中的多核苷酸可以包含一种或多种修饰，所述修饰可以单独地或组合地使用，例如，以增强活性、稳定性或特异性，改变递送，减少在宿主细胞中的先天性免疫应答，或用于其它增强，如在本文中进一步描述的和本领域已知的。
在某些实例中，将经修饰的核苷酸可以用在CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统中，在该情况下，可以修饰导引RNA (单分子导引或双分子导引)和/或引入细胞中的编码Cas9或Cpf1内切核酸酶的DNA或RNA，如下面描述和举例说明的。这样的经修饰的核苷酸可以用在CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统中以编辑任意一个或多个基因组基因座。
为了这样的应用的非限制性举例说明的目的使用CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统，可以使用导引RNA的修饰来增强包含导引RNA(其可以是单分子导引或双分子)和Cas9或Cpf1内切核酸酶的CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1基因组编辑复合物的形成或稳定性。导引RNA的修饰也可以或可替换地用于增强基因组编辑复合物与基因组中的靶序列之间的相互作用的起始、稳定性或动力学，这可以用于例如增强在靶活性。导引RNA的修饰也可以或可替换地用于增强特异性，例如，在靶位点处的基因组编辑相对于在其它(靶外)位点处的效应的相对比率。
修饰也可以或可替换地用于增加导引RNA的稳定性，例如，通过增加它对存在于细胞中的核糖核酸酶(RNA酶)的降解的抗性，由此造成它在所述细胞中的半衰期增加。在其中通过RNA(其需要翻译才能产生内切核酸酶)将Cas9或Cpf1内切核酸酶引入要编辑的细胞中的方面中，增强导引RNA半衰期的修饰可以是特别有用的，因为增加与编码内切核酸酶的RNA同时引入的导引RNA的半衰期可以用于增加所述导引RNA和所述编码的Cas9或Cpf1内切核酸酶在细胞中共存的时间。
修饰也可以或可替换地用于减小引入细胞中的RNA引起先天性免疫应答的可能性或程度。这样的应答(其已经在RNA干扰(RNAi)的背景下确定地表征，包括小干扰RNA(siRNA)，如在下面和在本领域中描述的)倾向于与减小的RNA半衰期和/或细胞因子或其它因子(其与免疫应答有关)的引起相关。
还可以对引入细胞中的编码内切核酸酶的RNA做出一种或多种类型的修饰，包括、但不限于，增强RNA的稳定性的修饰(诸如通过增加存在于细胞中的RNA酶对它的降解)，增强得到的产物(即内切核酸酶)的翻译的修饰，和/或减小引入细胞中的RNA引起先天性免疫应答的可能性或程度的修饰。
同样可以使用修饰的组合，诸如前述和其它。在CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1的情况下，例如，可以对导引RNA (包括上面举例说明的那些)做出一种或多种类型的修饰，和/或可以对编码Cas内切核酸酶的RNA (包括上面举例说明的那些)做出一种或多种类型的修饰。
作为举例说明，在CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统中使用的导引RNA或其它更小的RNA可以通过化学方式容易地合成，从而使许多修饰能容易地掺入，如在下面举例说明的和在本领域中描述的。尽管化学合成程序在继续增加，但是通过诸如高效液相色谱法(HPLC，其避免使用凝胶诸如PAGE)等程序对这样的RNA的纯化倾向于变得更有挑战性，因为多核苷酸长度显著地增加超过了100个左右核苷酸。可用于制备较大长度的化学修饰的RNA的一个方案是生产连接在一起的两个或更多个分子。通过酶法更容易地制备长得多的RNA，诸如编码Cas9内切核酸酶的那些。尽管更少类型的修饰可用于用在酶促地生产的RNA中，仍然存在可以用于例如增强稳定性、减小先天性免疫应答的可能性或程度、和/或增强其它属性的修饰，如在下面和本领域中进一步描述的；并且新类型的修饰正在正式开发中。
作为不同类型的修饰的例证，特别是经常与较小的化学合成的RNA一起使用的那些，修饰可以包含一个或多个在糖的2'位置处修饰的核苷酸，在某些方面中，为2'-O-烷基、2'-O-烷基-O-烷基或2'-氟-修饰的核苷酸。在某些方面中，RNA修饰包括在嘧啶核糖、脱碱基残基、或位于RNA的3'末端处的倒置碱基上的2'-氟、2'-氨基或2' O-甲基修饰。这样的修饰常规地掺入寡核苷酸中，且这些寡核苷酸已经被证实具有比2'-脱氧寡核苷酸更高的对给定靶标的Tm (即，更高的靶标结合亲和力)。
已经证实许多核苷酸和核苷修饰使得它们掺入其中的寡核苷酸比天然寡核苷酸更耐受核酸酶消化；这些经修饰的寡物比未修饰的寡核苷酸完整地存活更长的时间。经修饰的寡核苷酸的具体实例包括包含经修饰的主链(例如，硫代磷酸酯、磷酸三酯、膦酸甲酯、短链烷基或环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖间键)的那些。一些寡核苷酸是具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的那些，特别是CH2-NH-O-CH2、CH、~N(CH3)~O~CH2(被称作亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链)、CH2 --O--N (CH3)-CH2、CH2 -N (CH3)-N (CH3)-CH2和O-N (CH3)- CH2 -CH2主链，其中天然磷酸二酯主链被表示为O- P-- O- CH)；酰胺主链[参见De Mesmaeker等人, Ace. Chem. Res., 28:366-374 (1995)]；吗啉代主链结构(参见Summerton和Weller, 美国专利号5,034,506)；肽核酸(PNA)主链(其中寡核苷酸的磷酸二酯主链被聚酰胺主链替代，所述核苷酸直接地或间接地结合至聚酰胺主链的氮杂氮原子，参见Nielsen等人, Science 1991, 254, 1497)。含磷键包括、但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包含3'亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包含3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'键的硼代磷酸酯、这些的2'-5'连接的类似物和具有倒置极性的那些，其中邻近的核苷单元对以3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'连接；参见美国专利号3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361；和5,625,050。
基于吗啉代的寡聚体化合物描述在Braasch和David Corey, Biochemistry, 41(14): 4503-4510 (2002); Genesis, 第30卷, 第3期, (2001); Heasman, Dev. Biol.,243: 209-214 (2002); Nasevicius等人, Nat. Genet., 26:216-220 (2000); Lacerra等人, Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 9591-9596 (2000)；和1991年7月23日授权的美国专利号5,034,506。
环己烯基核酸寡核苷酸模拟物描述在Wang等人, J. Am. Chem. Soc., 122:8595-8602 (2000)中。
在其中不包括磷原子的经修饰的寡核苷酸主链具有通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。这些包括具有吗啉代键(部分地从核苷的糖部分形成)的那些；硅氧烷主链；硫化物，亚砜和砜主链；甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链；含有烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其它主链；参见美国专利号5,034,506;5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564;5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225;5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704;5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437；和5,677,439。
还可以包括一个或多个被取代的糖部分，例如，在2'位置处的以下之一：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3 OCH3、OCH3 O(CH2)n CH3、O(CH2)n NH2或O(CH2)n CH3，其中n是从1至约10；C1至C10低级烷基、烷氧基烷氧基、被取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2 CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；被取代的甲硅烷基；RNA切割基团；报告基团；嵌入剂；用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团；或用于改善寡核苷酸的药效动力学性质的基团，和具有类似性质的其它取代基。在某些方面中，修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3，也被称作2'-O-(2-甲氧基乙基)) (Martin等人, HeIv. Chim. Acta, 1995, 78, 486)。其它修饰包括2'-甲氧基(2'-O-CH3)、2'-丙氧基(2'-OCH2 CH2CH3)和2'-氟(2'-F)。还可以在寡核苷酸的其它位置、特别是3'末端核苷酸上的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置处做出类似的修饰。寡核苷酸也可以具有糖模拟物，诸如替代呋喃型戊糖基的环丁基。
在某些实例中，可以用新颖的基团替代核苷酸单元的糖和核苷间键(即，主链)。可以为了与适当的核酸目标化合物杂交维持碱基单位。一种这样的寡聚体化合物(已经被证实具有优秀杂交性能的寡核苷酸模拟物)被称作肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，可以用含有酰胺的主链(例如，氨基乙基甘氨酸主链)替代寡核苷酸的糖-主链。可以保留核苷碱基，且直接地或间接地结合至主链的酰胺部分的氮杂氮原子。教导PNA化合物的制备的代表性美国专利包含、但不限于美国专利号5,539,082、5,714,331和5,719,262。PNA化合物的其它教导可以参见Nielsen等人, Science, 254: 1497-1500 (1991)。
导引RNA还可以额外地或可替换地包括核苷碱基(经常在本领域中简单地称作“碱基”)修饰或置换。本文中使用的“未修饰的”或“天然的”核苷碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核苷碱基包括在天然核酸中仅稀少地或短暂地发现的核苷碱基，例如，次黄嘌呤，6-甲基腺嘌呤，5-Me嘧啶，特别是5-甲基胞嘧啶(也被称作5-甲基-2' 脱氧胞嘧啶，且经常在本领域中称作5-Me-C)，5-羟基甲基胞嘧啶(HMC)，糖基HMC和龙胆二糖基HMC，以及合成的核苷碱基，例如，2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其它杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N6 (6-氨基己基)腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。Kornberg, A., DNA Replication, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 第75-77页(1980); Gebeyehu等人, Nucl. AcidsRes. 15:4513 (1997)。还可以包括本领域已知的“通用”碱基，例如，肌苷。已经证实5-Me-C置换会使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi, Y. S., 见Crooke, S. T. 和Lebleu, B., 编, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton,1993, 第276-278页)，并且是碱基置换的方面。
经修饰的核苷碱基可以包含其它的合成的和天然的核苷碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假-尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫基烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代、特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤(quanine)和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
核苷碱基可以进一步包含在美国专利号3,687,808中公开的那些，在'TheConcise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering', 第858-859页,Kroschwitz, J.I., 编John Wiley & Sons, 1990中公开的那些，由Englisch等人,Angewandle Chemie, International Edition', 1991, 30, 第613页公开的那些，和由Sanghvi, Y. S., 第15章, Antisense Research and Applications', 第289- 302页,Crooke, S.T. 和Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993公开的那些。这些核苷碱基中的某些对于增加本发明的寡聚体化合物的结合亲和力是特别有用的。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包含2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经证实5-甲基胞嘧啶置换会使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2ºC (Sanghvi,Y.S., Crooke, S.T. 和Lebleu, B., 编, 'Antisense Research and Applications',CRC Press, Boca Raton, 1993, 第276-278页)，并且是碱基置换的方面，甚至更具体地当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。经修饰的核苷碱基描述在美国专利号3,687,808, 以及4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187;5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,596,091;5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 5,763,588; 5,830,653; 6,005,096；和美国专利申请公开2003/0158403。
因而，术语“经修饰的”表示非天然的糖、磷酸酯或碱基，其掺入导引RNA、内切核酸酶、或导引RNA和内切核酸酶二者中。不一定将给定的寡核苷酸中的所有位置均匀地修饰，并且实际上，前述修饰中的超过一种可以掺入单个寡核苷酸中，或甚至掺入寡核苷酸内的单个核苷中。
可以将导引RNA和/或编码内切核酸酶的mRNA (或DNA)化学连接至一个或多个增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的部分或缀合物。这样的部分包含，但不限于：脂质部分诸如胆固醇部分[Letsinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6553-6556(1989)]；胆酸[Manoharan等人, Bioorg. Med. Chem. Let., 4: 1053-1060 (1994)]；硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇[Manoharan等人, Ann. N. Y. Acad. Sci., 660: 306-309 (1992)和Manoharan等人, Bioorg. Med. Chem. Let., 3: 2765-2770 (1993)]；硫代胆甾醇[Oberhauser等人, Nucl. Acids Res., 20: 533-538 (1992)]；脂族链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基[Kabanov等人, FEBS Lett., 259: 327-330 (1990)和Svinarchuk等人, Biochimie, 75: 49- 54 (1993)]；磷脂，例如，二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基- 消旋-甘油-3-H-膦酸酯[Manoharan等人, Tetrahedron Lett., 36:3651-3654 (1995)和Shea等人, Nucl. Acids Res., 18: 3777-3783 (1990)]；多胺或聚乙二醇链[Mancharan等人, Nucleosides & Nucleotides, 14: 969-973 (1995)]；金刚烷乙酸[Manoharan等人, Tetrahedron Lett., 36: 3651-3654 (1995)]；棕榈基部分[(Mishra等人, Biochim. Biophys. Acta, 1264: 229-237 (1995)]；或十八烷基胺或己基氨基-羰基-t羟胆甾醇部分[Crooke等人, J. Pharmacol. Exp. Ther., 277: 923-937(1996)]。也参见美国专利号4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599, 928和5,688,941。
糖和其它部分可以用于将包含核苷酸的蛋白和复合物(诸如阳离子多核糖体和脂质体)靶向至特定位点。例如，肝细胞指导的转移可以由无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)介导；参见，例如，Hu, 等人, Protein Pept Lett. 21(10):1025-30 (2014)。本领域已知的和正式开发的其它系统可以用于将在本情况下使用的生物分子和/或其复合物靶向至特定目标靶细胞。
这些靶向部分或缀合物可以包括与官能团(诸如伯或仲羟基)共价地结合的缀合物基团。本发明的缀合物基团包括嵌入剂、报告分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚体的药效动力学性质的基团、和增强寡聚体的药代动力学性质的基团。典型的缀合物基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸盐、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在本发明的上下文中，增强药效动力学性质的基团包括改善摄取、增强对降解的抗性和/或强化与靶核酸的序列特异性杂交的基团。在本发明的上下文中，增强药代动力学性质的基团包括改善本发明的化合物的摄取、分布、代谢或排泄的基团。代表性的缀合物基团公开在国际专利申请号PCT/US92/09196(1992年10月23日提交，作为WO1993007883公开)和美国专利号6,287,860中。缀合物部分包括、但不限于：脂质部分诸如胆固醇部分、胆酸、硫醚(例如，己基-5-三苯甲基硫醇)、硫代胆甾醇、脂族链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如，二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵l,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸盐)、多胺或聚乙二醇链或金刚烷乙酸、棕榈基部分或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分。参见，例如，美国专利号4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465;5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584;5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718;5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941;4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136;5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536;5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463;5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481;5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928和5,688,941。
还可以通过多种方式修饰不太容易化学合成且通常通过酶促合成来生产的较长多核苷酸。这样的修饰可以包括，例如，某些核苷酸类似物的引入，特定序列或其它部分在分子的5'或3'末端处的掺入，和其它修饰。作为举例说明，编码Cas9的mRNA是大约4 kb长度，且可以通过体外转录来合成。对mRNA的修饰可以用于，例如，增加它的翻译或稳定性(诸如通过增加它对细胞降解的抗性)，或减小RNA的引起先天性免疫应答的趋势，所述先天性免疫应答经常在引入外源RNA、特别是较长RNA(诸如编码Cas9的那种)以后在细胞中观察到。
在本领域中已经描述了众多这样的修饰，诸如聚腺苷酸尾巴、5'帽类似物(例如，抗反向帽类似物(Anti Reverse Cap Analog，ARCA)或m7G(5’)ppp(5’)G (mCAP))、经修饰的5'或3' 非翻译区(UTR)、经修饰的碱基(诸如假-UTP、2-硫-UTP、5-甲基胞苷-5'-三磷酸(5-甲基-CTP)或N6-甲基-ATP)的应用、或除去5'末端磷酸酯的磷酸酶处理。这些和其它修饰是本领域已知的，且RNA的新修饰正在正式开发中。
经修饰的RNA存在众多商业供应商，包括例如，TriLink Biotech、AxoLabs、Bio-Synthesis Inc.、Dharmacon和许多其它。如TriLink所述的，例如，5-甲基-CTP可以用于赋予合乎需要的特征，诸如增加的核酸酶稳定性、增加的翻译、或减少的先天性免疫受体与体外转录的RNA的相互作用。还已经证实5-甲基胞苷-5'-三磷酸(5-甲基-CTP)、N6-甲基-ATP、以及假-UTP和2-硫-UTP会在培养物中和在体内减少先天性免疫刺激，同时增强翻译，如在下面提及的Kormann等人和Warren等人的出版物所举例说明的。
已经证实，在体内递送的化学修饰的mRNA可以用于实现改善的治疗效果；参见，例 如，Kormann等人, Nature Biotechnology 29, 154-157 (2011)。这样的修饰可以用于，例如，增加RNA分子的稳定性和/或减小它的免疫原性。使用化学修饰诸如假-U、N6-甲基-A、2-硫-U和5-甲基-C，发现分别用2-硫-U和5-甲基-C取代仅1/4的尿苷和胞苷残基会导致小鼠中toll-样受体(TLR)介导的mRNA识别的显著减少。通过减少先天性免疫系统的活化，这些修饰可以用于有效地增加体内mRNA的稳定性和寿命；参见，例如，Kormann等人(出处同上)。
还已经证实，合成的信使RNA(其掺入被设计成绕过先天性抗病毒应答的修饰)的重复施用可以将分化的人细胞重新程序化至多能性的。参见，例如，Warren, 等人, CellStem Cell, 7(5):618-30 (2010)。这样的作为主要重新程序化蛋白起作用的经修饰的mRNA可以是重新程序化多种人细胞类型的有效工具。这样的细胞被称作诱导的多能性干细胞(iPSC)，并且发现酶促地合成的包含5-甲基-CTP、假-UTP和抗反向帽类似物(ARCA)的RNA可以用于有效地避免细胞的抗病毒应答；参见，例如，Warren等人(出处同上)。
在本领域中描述的多核苷酸的其它修饰包括，例如，聚腺苷酸尾巴的应用，5'帽类似物(诸如m7G(5’)ppp(5’)G (mCAP))的添加，5'或3' 非翻译区(UTR)的修饰，或除去5'末端磷酸酯的磷酸酶处理，且新方案正在正式开发中。
结合RNA干扰(RNAi)(包括小干扰RNA (siRNA))的修饰已经开发了许多适用于制备用于本文中的用途的经修饰的RNA的组合物和技术。siRNA提出了特定体内挑战，因为它们通过mRNA干扰对基因沉默的影响通常是短暂的，这可以需要重复施用。另外，siRNA是双链RNA (dsRNA)，且哺乳动物细胞具有已经进化以检测和中和dsRNA(其经常是病毒感染的副产物)的免疫应答。因而，存在哺乳动物酶诸如PKR (dsRNA-响应性的激酶)和潜在地视黄酸-可诱导的基因I (RIG-I)(其可以介导对dsRNA的细胞应答)、以及Toll-样受体(诸如TLR3、TLR7和TLR8)(其可以响应于这样的分子触发细胞因子的诱导)；参见，例如，以下文献的综述：Angart等人, Pharmaceuticals (Basel) 6(4): 440-468 (2013)；Kanasty等人,Molecular Therapy 20(3): 513-524 (2012)；Burnett等人, Biotechnol J. 6(9):1130-46 (2011)；Judge和MacLachlan, Hum Gene Ther 19(2):111-24 (2008)；和其中引用的参考文献。
已经开发了多种修饰，并用于增强RNA稳定性、减少先天性免疫应答和/或实现其它益处，所述其它益处可以关于多核苷酸向人细胞中的引入是有用的，如本文中所述的；参见，例如，以下文献的综述：Whitehead KA等人, Annual Review of Chemical andBiomolecular Engineering, 2: 77-96 (2011); Gaglione和Messere, Mini Rev MedChem, 10(7):578-95 (2010); Chernolovskaya等人, Curr Opin Mol Ther., 12(2):158-67 (2010); Deleavey等人, Curr Protoc Nucleic Acid Chem Chapter 16:Unit16.3 (2009); Behlke, Oligonucleotides 18(4):305-19 (2008); Fucini等人,Nucleic Acid Ther 22(3): 205-210 (2012); Bremsen等人, Front Genet 3:154(2012)。
如上面所指出的，经修饰的RNA存在许多商业供应商，其中的许多已经擅长于被设计成改善siRNA的有效性的修饰。基于在文献中报道的多种发现，提供了多种方案。例如，Dharmacon注意到，用硫对非桥连氧的替换(硫代磷酸酯, PS)已经被广泛地用于改善siRNA的核酸酶抗性，如Kole, Nature Reviews Drug Discovery 11:125-140 (2012)所报道的。已经报道核糖的2'-位置的修饰会改善核苷酸间磷酸酯键的核酸酶抗性，同时增加双链体稳定性(Tm)，这也已经被证实会提供来自免疫活化的保护。适度PS主链修饰与小的良好耐受的2'-取代(2'-O-甲基、2'-氟、2'-氢)的组合已经与用于体内应用的高度稳定的siRNA关联，如Soutschek等人. Nature 432:173-178 (2004)所报道的；并且已经报道2'-O-甲基修饰可有效地改善稳定性，如Volkov, Oligonucleotides 19:191-202 (2009)所报道的。关于减少先天性免疫应答的诱导，已经报道用2'-O-甲基、2'-氟、2'-氢修饰特定序列会减少TLR7/TLR8相互作用，同时通常保留沉默活性；参见，例如，Judge等人, Mol. Ther. 13:494-505 (2006)；和Cekaite等人, J. Mol. Biol. 365:90-108 (2007)。还已经证实另外的修饰(诸如2-硫尿嘧啶、假尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和N6-甲基腺苷)会使由TLR3、TLR7和TLR8介导的免疫效应最小化；参见，例如，Kariko, K. 等人, Immunity 23:165-175 (2005)。
也如本领域已知的和商购可得的，许多缀合物可以应用于本文所用的多核苷酸(诸如RNA)，其可以增强它们的细胞递送和/或摄取，包括例如，胆固醇、生育酚和叶酸、脂质、肽、聚合物、接头和适体；参见，例如，Winkler, Ther. Deliv. 4:791-809 (2013)的综述，和其中引用的参考文献。
密码子优化
根据本领域的用于在含有目标靶DNA的细胞中表达的标准方法，可以将编码定位多肽的多核苷酸进行密码子优化。例如，如果预期的靶核酸是在人细胞中，预见到将人密码子优化的编码Cas9的多核苷酸用于生产Cas9多肽。
靶向基因组的核酸和定位多肽的复合物
靶向基因组的核酸与定位多肽(例如，核酸引导的核酸酶诸如Cas9)相互作用，由此形成复合物。靶向基因组的核酸将所述定位多肽引导至靶核酸。
核糖核蛋白复合物(RNP)
可以将定位多肽和靶向基因组的核酸各自分别施用给细胞或患者。另一方面，可以使定位多肽与一种或多种导引RNA、或一种或多种crRNA以及在一起的tracrRNA预先形成复合物。然后可以将预先形成复合物的物质施用给细胞或患者。这样的预先形成复合物的物质被称作核糖核蛋白颗粒(RNP)。RNP中的定位多肽可以是例如Cas9内切核酸酶或Cpf1内切核酸酶。定位多肽可以在N-末端、C-末端或N-末端和C-末端两者处侧接一个或多个核定位信号(NLS)。例如，Cas9内切核酸酶可以侧接两个NLS，一个NLS位于N-末端，且第二个NLS位于C-末端。NLS可以是本领域已知的任何NLS，诸如SV40 NLS。靶向基因组的核酸与RNP中的定位多肽的重量比可以为1:1。例如，sgRNA与RNP中的Cas9内切核酸酶的重量比可以为1:1。
编码系统组分的核酸
本发明提供了包含核苷酸序列(其编码本发明的靶向基因组的核酸)的核酸、本发明的定位多肽、和/或进行本发明的方法的方面所必需的任何核酸或蛋白性分子。
编码本发明的靶向基因组的核酸的核酸、本发明的定位多肽和/或进行本发明的方法的方面所必需的任何核酸或蛋白性分子可以包含载体(例如，重组表达载体)。
术语“载体”表示能够运输它已经连接的另一种核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，其表示可以在其中连接另外的核酸区段的圆形双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中可以将另外的核酸区段连接进病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非-附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中以后整合进宿主细胞的基因组中，且由此与宿主基因组一起复制。
在某些实例中，载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。这样的载体在本文中被称作“重组表达载体”，或更简单地称作“表达载体”，其起等同功能。
术语“可操作地连接的”是指，以允许表达核苷酸序列的方式，将目标核苷酸序列连接至调节序列。术语“调节序列”意图包括，例如，启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调节序列是本领域众所周知的，且描述在，例如，Goeddel;Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, SanDiego, CA (1990)。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的那些，和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列的表达的那些(例如，组织特异性的调节序列)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可以取决于诸如靶细胞的选择、期望的表达水平等因素。
预见到的表达载体包括、但不限于基于痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺伴随病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、逆转录病毒(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒和从逆转录病毒诸如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽造白细胞组织增生病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒衍生出的载体)的病毒载体和其它重组载体。为真核靶细胞预见到的其它载体包括、但不限于载体pXT1、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40 (Pharmacia)。可以使用其它载体，只要它们与宿主细胞相容。
在某些实例中，载体可以包含一个或多个转录和/或翻译控制元件。取决于利用的宿主/载体系统，在表达载体中可以使用许多合适的转录和翻译控制元件中的任一种，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等。所述载体可以是失活病毒序列或CRISPR机制的组分或其它元件的自失活载体。
合适的真核启动子(即，在真核细胞中有功能的启动子)的非限制性实例包括来自巨细胞病毒(CMV)立即早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40的那些，来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)，人延伸因子-1启动子(EF1)，包含与鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)融合的巨细胞病毒(CMV)增强子的杂合构建体，鼠干细胞病毒启动子(MSCV)，磷酸甘油酸激酶-1基因座启动子(PGK)，和小鼠金属硫蛋白-I。
为了表达小RNA，包括与Cas内切核酸酶关联使用的导引RNA，多种启动子诸如RNA聚合酶III启动子(包括例如U6和H1)可以是有利的。关于增强这样的启动子的应用的描述和参数是本领域已知的，且另外的信息和方案正在正式描述中；参见，例如，Ma, H.等人, Molecular Therapy - Nucleic Acids 3, e161 (2014) doi:10.1038/mtna.2014.12。
所述表达载体还可以含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。所述表达载体还可以包含用于放大表达的适当序列。所述表达载体还可以包括编码与定位多肽融合的非天然标签(例如，组氨酸标签、血凝素标签、绿色荧光蛋白等)的核苷酸序列，从而产生融合蛋白。
启动子可以是诱导型启动子(例如，热激启动子、四环素-调节型启动子、类固醇-调节型启动子、金属-调节型启动子、雌激素受体-调节型启动子等)。启动子可以是组成型启动子(例如，CMV启动子、UBC启动子)。在某些情况中，所述启动子可以是空间上受限的和/或时间上受限的启动子(例如，组织特异性的启动子、细胞类型特异性的启动子等)。
可以将编码本发明的靶向基因组的核酸和/或定位多肽的核酸包装到递送媒介物内部或递送媒介物的表面上用于递送给细胞。预见到的递送媒介物包括、但不限于纳米球、脂质体、量子点、纳米颗粒、聚乙二醇颗粒、水凝胶和胶束。如在本领域中描述的，多种靶向部分可以用于增强这样的媒介物与期望的细胞类型或位置的优先相互作用。
本发明的复合物、多肽和核酸向细胞中的引入可以通过病毒或细菌噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、颗粒枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等而发生。
治疗方法
本文提供了用于治疗具有血脂异常的患者的方法。这样的方法的一个方面是基于离体细胞的疗法。例如，执行患者的肝的活组织检查。然后，从活组织检查的材料分离肝特异性的祖细胞或原代肝细胞，例如，通过活组织检查。接着，使用本文描述的材料和方法校正这些祖细胞或原代肝细胞的染色体DNA。最后，将所述祖细胞或原代肝细胞移植进所述患者中。任何细胞来源或类型都可以用作祖细胞。
这样的方法的另一个方面是基于离体细胞的疗法。例如，可以产生患者特异性的诱导的多能干细胞(iPSC)。然后，可以使用本文所述的材料和方法来编辑这些iPS细胞的染色体DNA。接下来，基因组编辑的iPSC可以分化为其它细胞。最后，将分化的细胞植入患者中。
这样的方法的又另一个方面是基于离体细胞的疗法。例如，可以从患者分离间充质干细胞，其可以分离自患者骨髓或外周血。接着，可以使用本文描述的材料和方法编辑这些间充质干细胞的染色体DNA。接着，可以使编辑过基因组的间充质干细胞分化成任何类型的细胞，例如，肝细胞。最后，将这些分化的细胞，例如，肝细胞移植进所述患者中。
离体细胞治疗方案的一个优点是在施用之前进行治疗的综合分析的能力。基于核酸酶的治疗剂可以具有某种水平的靶外(off-target)效应。离体执行基因编辑允许人们在植入之前表征经编辑的细胞群体。本发明包括对经编辑的细胞的整个基因组测序以确保靶外效应(如果有的话)可以是在与患者的最小风险有关的基因组位置。此外，可以在植入之前分离特定细胞的群体，包括克隆群体。
离体细胞疗法的另一个优点涉及与其它原代细胞来源相比在iPSC中的基因修饰。iPSC是多产的，使得容易得到大量细胞，所述细胞将是基于细胞的疗法所需要的。此外，iPSC是用于执行克隆分离的理想细胞类型。这允许筛选正确的基因组修饰，没有冒生存力降低的风险。相反，其它原代细胞(诸如肝细胞)仅存活几代且难以克隆繁殖。因而，用于治疗血脂异常的iPSC的操作将廉价得多，并且可以缩短产生期望的基因修饰所需的时间量。
方法还可以包括基于体内的疗法。使用本文描述的材料和方法编辑患者中的细胞的染色体DNA。
尽管某些细胞呈递用于离体治疗和疗法的有吸引力的靶标，但增加的递送效力可允许直接体内递送至这样的细胞。理想地，将靶向和编辑引导至相关细胞。也可以通过使用仅在某些细胞和/或发育阶段有活性的启动子来防止其它细胞中的切割。另外的启动子是可诱导的，且因此如果核酸酶作为质粒递送，则可以在时间上进行控制。递送的RNA和蛋白保留在细胞中的时间量也可以使用添加以改变半衰期的处理或结构域进行调节。体内处理将消除许多处理步骤，但较低的递送率可能需要较高的编辑率。体内处理可以消除来自离体处理和移植的问题和损失。
体内基因疗法的一个优点可以是，容易生产和施用治疗剂。相同的治疗方案和疗法将具有用于治疗超过一位患者(例如许多具有相同或类似基因型或等位基因的患者)的潜力。相反，离体细胞疗法通常要求使用患者自身的细胞，将其分离、操作和返回至同一位患者。
本文还提供了通过基因组编辑来编辑细胞中的PCSK9基因的细胞方法。例如，可以从患者或动物分离细胞。然后，可以使用本文描述的材料和方法编辑细胞的染色体DNA。
本文提供的方法，无论是细胞方法还是离体方法或体内方法，都可以涉及通过在PCSK9基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列之内或附近引入一个或多个插入、缺失或突变来减少(敲低)或消除(敲除)PCSK9基因的表达。
例如，敲低或敲除策略可以涉及通过引入由于不精确的NHEJ修复途径产生的随机插入或缺失(插入/缺失)来破坏PCSK9基因的阅读框。这可以通过如下实现：用一种或多种CRISPR内切核酸酶和gRNA (例如，crRNA + tracrRNA，或sgRNA)在目标基因中诱导一个单链断裂或双链断裂，或用两种或多种CRISPR内切核酸酶和两种或多种sgRNA在目标基因中诱导两个或多个单链断裂或双链断裂。该方案可以需要针对PCSK9基因开发和优化sgRNA。
可替换地，敲低或敲除策略还可以涉及删除PCSK9基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列之内或附近的一个或多个区段。这种删除策略需要至少一对能够结合PCSK9基因之内或附近的两个不同位点的gRNA(例如，crRNA + tracrRNA，或sgRNA)和一种或多种CRISPR内切核酸酶。配置有两个gRNA的CRISPR内切核酸酶可以在期望的位置诱导两个双链断裂。切割之后，两个末端，无论是平端还是突出端，都可以通过NHEJ连接，导致插入区段的缺失。NHEJ修复途径可以导致连接处的插入、缺失或突变。
除了以上基因组编辑策略以外，另一种策略包括通过在调节序列中编辑来调节PCSK9的表达、功能或活性。
除了上面列出的编辑选项以外，Cas9或类似的蛋白可以用于将效应物结构域靶向至可以为编辑而鉴别出的相同靶位，或在效应物结构域范围内的另外靶位。一系列染色质修饰酶、甲基酶或脱甲基酶可以用于改变靶基因的表达。如果突变导致不希望的活性，一种可能性是降低PCSK9蛋白的表达。这些类型的表观遗传调节具有一些优点，特别是因为它们在可能的靶外效应中受到限制。
除了在编码和剪接序列中的突变以外，可以存在许多类型的基因组靶位点。
转录和翻译的调节涉及许多不同种类的与细胞蛋白或核苷酸相互作用的位点。经常可以靶向转录因子或其它蛋白的DNA结合位点进行突变或缺失以研究所述位点的作用，尽管也可以靶向它们来改变基因表达。通过非同源末端连接(NHEJ)或直接基因组编辑(通过同源性指导的修复(HDR))可以添加位点。增加的基因组测序、RNA表达和转录因子结合的全基因组研究的应用已经增加了我们鉴别所述位点如何导致发育或时间基因调节的能力。这些控制系统可以是直接的，或可以涉及广泛协作调节，其可以要求来自多个增强子的活性的整合。转录因子通常结合6-12个碱基长的简并DNA序列。由各个位点提供的低特异性水平提示，在结合和功能结果中涉及复杂的相互作用和规则。具有更低简并性的结合位点可能提供更简单的调节方式。可以设计人工转录因子来指定更长的序列，其具有在基因组中更低相似性的序列且具有关于靶外切割的更低潜力。可以将这些类型的结合位点中的任一种突变、删除或甚至创建以实现基因调节或表达的变化(Canver, M.C. 等人,Nature(2015))。
具有这些特征的基因调节区的另一种类型是微RNA (miRNA)结合位点。miRNA是在转录后基因调节中起关键作用的非编码RNA。miRNA可以调节所有编码哺乳动物蛋白的基因中的30%的表达。发现了通过双链RNA (RNAi)实现的特异性的且有效的基因沉默，以及另外的小非编码RNA(Canver, M.C. 等人,Nature (2015))。对于基因沉默重要的非编码RNA的最大类型是miRNA。在哺乳动物中，miRNA首先被转录为长的RNA转录物，其可以是单独的转录单元、蛋白内含子的部分或其它转录物。长转录物被称作初级miRNA (初级-miRNA)，其包括不完美地碱基配对的发夹结构。这些初级-miRNA被微处理器(在细胞核中的蛋白复合物，涉及Drosha)可以切割成一种或多种更短的前体miRNA (前-miRNA)。
前-miRNA是具有2-核苷酸3’-突出端的约70个核苷酸长度的短茎环，其输出成为成熟的19-25核苷酸miRNA:miRNA* 双链体。具有较低碱基配对稳定性的miRNA链(导引链)可以被加载到RNA诱导的沉默复合物(RISC)上。乘客链(用*标记)可以是功能性的，但是经常被降解。成熟的miRNA将RISC连接至主要存在于3′非翻译区(UTR)内的靶mRNA中的部分互补序列基序并诱导转录后基因沉默(Bartel, D.P. Cell 136, 215-233 (2009); Saj, A.& Lai, E.C. Curr Opin Genet Dev 21, 504-510 (2011))。
miRNA在哺乳动物和其它多细胞生物的发育、分化、细胞周期和生长控制中以及在基本上所有的生物途径中可以是重要的。miRNA也可以参与细胞周期控制、细胞凋亡和干细胞分化、血细胞生成、低氧、肌肉发育、神经发生、胰岛素分泌、胆固醇代谢、老化、病毒复制和免疫应答。
单一miRNA可以靶向数百种不同的mRNA转录物，尽管许多不同的miRNA可以靶向单一miRNA转录物。在miRBase的最新版本(v.21)中已经注解了超过28645种微RNA。一些miRNA可以由多个基因座编码，其中的一些可以从串联地共转录的簇表达。所述特征允许具有多个途径和反馈控制的复杂调节网络。miRNA可以是这些反馈和调节回路的组成部分，并且可以通过将蛋白生产保持在限度内来帮助调节基因表达(Herranz, H. & Cohen, S.M.Genes Dev 24, 1339-1344 (2010); Posadas, D.M. & Carthew, R.W. Curr Opin Genet Dev 27, 1-6 (2014))。
miRNA也可以在大量与异常miRNA表达有关的人疾病中是重要的。该关联强调了miRNA调节途径的重要性。最近的miRNA删除研究已经将miRNA与免疫应答的调节相联系(Stern-Ginossar, N. 等人,Science 317, 376-381 (2007))。
miRNA还具有与癌症的强联系，并且可以在不同类型的癌症中起作用。已经发现miRNA在许多肿瘤中下调。miRNA在关键的癌症相关途径(诸如细胞周期控制和DNA损伤应答)的调节中可以是重要的，且因此可以被用在诊断中且可以在临床上被靶向。微RNA可以微妙地调节血管生成的平衡，使得除去所有微RNA的实验会抑制肿瘤血管生成(Chen, S.等人,Genes Dev 28, 1054-1067 (2014))。
如关于蛋白编码基因已经证实的，miRNA基因也可以出现与癌症一起发生的表观遗传的变化。许多miRNA基因座可以与CpG岛有关，从而增加它们通过DNA甲基化被调节的机会(Weber, B., Stresemann, C., Brueckner, B. & Lyko, F. Cell Cycle 6, 1001-1005 (2007))。大多数研究已经使用染色质改造药物进行治疗来揭示表观遗传上沉默的miRNA。
除了它们在RNA沉默中的作用以外，miRNA还可以活化翻译(Posadas, D.M. &Carthew, R.W. Curr Opin Genet Dev 27, 1-6 (2014))。敲除miRNA位点可以导致减少的靶向基因的表达，而引入这些位点可以增加表达。
通过突变可以对于结合特异性而言重要的种子序列(微RNA的碱基2-8)，可以最有效地敲除单个miRNA。在该区域切割，随后通过NHEJ修复错误，可以通过阻断与靶位点的结合而有效地消除miRNA功能。通过邻近回文序列的特定环区域的特异性靶向，也可以抑制miRNA。在催化上无活性的Cas9也可以用于抑制shRNA表达(Zhao, Y. 等人,Sci Rep 4,3943 (2014))。除了靶向miRNA以外，还可以靶向和突变结合位点以防止通过miRNA实现的沉默。
根据本公开内容，任何微RNA(miRNA)或其结合位点可以掺入本发明的组合物中。
所述组合物可以具有区域，诸如但不限于，包含SEQ ID NO:632-4,715中列出的任何微RNA的序列的区域，SEQ ID NO:632-4,715中列出的微RNA的反向互补序列，或SEQ IDNO:632-4,715中列出的任何微RNA的微RNA反种子区域。
本发明的组合物可以包含一种或多种微RNA靶序列、微RNA序列或微RNA种子。这样的序列可以对应于任何已知的微RNA，诸如在美国公开US2005/0261218和美国公开US2005/0059005中教导的那些。作为一个非限制性实施方案，人基因组中的已知微RNA、其序列和其结合位点序列在下面列于SEQ ID NO:632-4,715中。
微RNA序列包含“种子”序列，即成熟微RNA的位置2-8的区域中的序列，该序列与miRNA靶序列具有完美的沃森-克里克互补性。微RNA种子可以包含成熟微RNA的位置2-8或2-7。在一些方面，微RNA种子可以包含7个核苷酸(例如，成熟微RNA的核苷酸2-8)，其中相应miRNA靶标中的种子互补位点侧接与微RNA位置1相对的腺嘌呤(A)。在一些方面，微RNA种子可以包含6个核苷酸(例如，成熟微RNA的核苷酸2-7)，其中相应miRNA靶标中的种子互补位点侧接与微RNA位置1相对的腺嘌呤(A)。参见例如，Grimson A, Farh KK, Johnston WK,Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP; Mol Cell. 2007 Jul 6;27(1):91-105。微RNA种子的碱基与靶序列具有完全互补性。
已经报道了微RNA、微RNA靶区域的鉴定及其表达模式和在生物学中的作用(Bonauer等人, Curr Drug Targets 2010 11:943-949; Anand和Cheresh Curr OpinHematol 2011 18:171-176; Contreras和Rao Leukemia 2012 26:404-413 (2011 Dec20. doi: 10.1038/leu.2011.356); Bartel Cell 2009 136:215-233; Landgraf等人,Cell, 2007 129:1401-1414; Gentner和Naldini, Tissue Antigens. 2012 80:393-403)。
例如，如果不意欲将组合物递送至肝脏、但终止于那些，如果miR-122的一个或多个靶位点被工程改造化为编码该靶序列的多核苷酸，则miR-122(肝脏中丰富的微RNA)可以抑制所递送的序列的表达。可以将不同微RNA的一个或多个结合位点的引入工程改造为进一步降低寿命、稳定性和蛋白翻译，因此提供额外的韧性层。
如本文所用，术语“微RNA位点”是指微RNA靶位点或微RNA识别位点，或与微RNA与之结合或缔合的任何核苷酸序列。应当理解的是，“结合”可以遵循传统的沃森-克里克杂交规则，或者可以反映微RNA与在微RNA位点处或附近的靶序列的任何稳定的缔合。
相反，对于本发明的组合物的目的，可以将微RNA结合位点工程改造出它们天然发生以增加特定组织中的蛋白表达的序列(即从中去除)。例如，可以去除miR-122结合位点以改善肝脏中的蛋白表达。
具体地，已知微RNA在免疫细胞(也称为造血细胞)(诸如抗原呈递细胞(APC)(例如树突细胞和巨噬细胞)、巨噬细胞、单核细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、粒细胞、天然杀伤细胞等)中差异表达。免疫细胞特异性微RNA涉及免疫原性、自身免疫、对感染的免疫应答、炎症以及基因疗法和组织/器官移植后的不想要的免疫应答。免疫细胞特异性微RNA还调节造血细胞(免疫细胞)的发育、增殖、分化和凋亡的许多方面。例如，miR-142和miR-146仅在免疫细胞中表达，在髓样树突细胞中尤其丰富。将miR-142结合位点引入本发明的多肽的3’-UTR可以通过miR-142介导的mRNA降解选择性抑制抗原呈递细胞中的基因表达，限制抗原在专业APC(例如树突状细胞)中的呈递，且由此防止基因递送后抗原介导的免疫应答(参见，Annoni A等人, blood, 2009, 114, 5152-5161)。
在一个实施方案中，可以将已知在免疫细胞、尤其是抗原呈递细胞中表达的微RNA结合位点工程改造成多核苷酸，以通过微RNA介导的RNA降解抑制APC中的多核苷酸的表达，抑制抗原介导的免疫应答，而多核苷酸的表达在其中不表达免疫细胞特异性微RNA的非免疫细胞中得以维持。
已经进行许多微RNA表达研究，并在本领域中进行描述，以分析微RNA在各种癌细胞/组织和其它疾病中的差异表达。一些微RNA在某些癌细胞中异常高表达，而其它则表达不足。例如，微RNA在以下中差异表达：癌细胞(WO2008/154098、US2013/0059015、US2013/0042333、WO2011/157294)；癌症干细胞(US2012/0053224)；胰腺癌和疾病(US2009/0131348、US2011/0171646、US2010/0286232、US8389210)；哮喘和炎症(US8415096)；前列腺癌(US2013/0053264)；肝细胞癌(WO2012/151212、US2012/0329672、WO2008/054828、US8252538)；肺癌细胞(WO2011/076143、WO2013/033640、WO2009/070653、US2010/0323357)；皮肤T细胞淋巴瘤(WO2013/011378)；结肠直肠癌细胞(WO2011/0281756、WO2011/076142)；癌阳性淋巴结(WO2009/100430、US2009/0263803)；鼻咽癌(EP2112235)；慢性阻塞性肺病(US2012/0264626、US2013/0053263)；甲状腺癌(WO2013/066678)；卵巢癌细胞(US2012/0309645、WO2011/095623)；乳腺癌细胞(WO2008/154098、WO2007/081740、US2012/0214699)，白血病和淋巴瘤(WO2008/073915、US2009/0092974、US2012/0316081、US2012/0283310、WO2010/018563)。
SEQ ID NOs:632-4,715中描述了微RNA序列和被靶向的组织和/或细胞的非限制性实例。
基因组工程改造策略
在某些方面中，本发明的方法可以包含编辑等位基因中的一个或两个。修饰等位基因的基因编辑具有永久改变靶基因或基因产物的优点。
本发明的离体方法的步骤可以包含使用基因组工程编辑从患者分离的肝细胞。可替换地，本发明的离体方法的步骤可以包含编辑患者特异性iPSC或间充质干细胞。同样地，本发明的体内方法的步骤包含使用基因组工程编辑血脂异常患者中的细胞。类似地，本发明的细胞方法中的步骤可以包含通过基因组工程编辑人细胞中的PCSK9基因。
任何CRISPR内切核酸酶都可以用于本发明的方法中，每种CRISPR内切核酸酶具有其自身相关的PAM，其可以是疾病特异性的或可以不是疾病特异性的。
例如，可以通过引入由于不精确的NHEJ修复途径产生的随机插入或缺失(indels)来破坏或消除PCSK9基因的表达。靶区域可以是PCSK9基因的编码序列(即，外显子)。在基因的编码序列中插入或删除核苷酸可以引起“移框”，其中正常的3字母密码子模式被干扰。以此方式，可以减少或消除基因表达和因此蛋白产生。该方法也可用于靶向PCSK9基因的任何内含子、内含子:外显子连接或调节DNA元件，其中序列改变可以干扰PCSK9基因的表达。
作为另一个实例，NHEJ还可以用于删除基因内或附近的区段，无论是直接地还是通过改变剪接供体或受体位点(通过一种靶向几个位置的gRNA或几种gRNA的切割)。如果小的随机插入/缺失不能有效地敲除靶基因，则这可以是有用的。导引链对已经被用于这种类型的缺失。
在没有供体存在时，使用几种非同源修复途径可以连接来自DNA断裂的末端或来自不同断裂的末端，其中在连接部处几乎没有或根本没有碱基配对的情况下连接DNA末端。除了规范NHEJ以外，存在类似的修复机制，诸如alt-NHEJ。如果存在两个断裂，可以删除或倒置插入区段。NHEJ修复途径可以导致在接头处的插入、缺失或突变。
NHEJ还可以导致同源性非依赖性的靶标整合。例如，在供体和染色体两者的体内核酸酶切割后，在供体质粒上包含核酸酶靶位点可以促进转基因整合至染色体双链断裂中(Cristea., Biotechnol Bioeng. 2013 Mar;110(3):871-80)。
在核酸酶切割以后，使用NHEJ将15-kb可诱导的基因表达盒插入人细胞系中的确定基因座中。(参见例如，Maresca, M., Lin, V.G., Guo, N. & Yang, Y., Genome Res23, 539-546 (2013); Cristea等人 Biotechnology and Bioengineering 2013, 871-80, 10.1002/bit.24733; Suzuki等人 Nature, 540, 144-149 (2016))。整合的序列可以破坏PCSK9基因的阅读框或改变基因的结构。
作为一个进一步替代方案，同源直接修复(HDR)也可以用于敲除基因或改变基因功能。HDR基本上是在DSB修复过程中使用供给的同源DNA序列作为模板的无误差机制。HDR的比率是突变和切割位点之间的距离的函数，所以选择重叠或最近靶位是重要的。模板可以包括被同源区域侧接的额外序列，或可以含有不同于基因组序列的序列，从而允许序列编辑。
例如，HDR敲除策略可以包括通过插入基因或用无功能或无关的序列替换基因的部分来破坏PCSK9基因的结构或功能。这可以通过如下实现：在有外源地引入以指导对HDR的细胞DSB应答的供体DNA模板(所述供体DNA模板可以是短的单链寡核苷酸、短的双链寡核苷酸、长的单链或双链DNA分子)存在下，用一种或多种CRISPR内切核酸酶和gRNA (例如，crRNA + tracrRNA，或sgRNA)在目标基因中诱导一个单链断裂或双链断裂，或用一种或多种CRISPR内切核酸酶和两种或更多种gRNA在目标基因中诱导两个或多个单链断裂或双链断裂。该方案可以要求针对PCSK9基因开发和优化gRNA和供体DNA分子。
同源性指导的修复是用于修复DSB的细胞机制。最常见形式是同源重组。存在另外的HDR途径，包括单链退火和备选HDR。基因组工程工具允许研究人员操作细胞的同源重组途径以建立对基因组的位点特异性修饰。已经发现，细胞可以使用以反式提供的合成的供体分子修复双链断裂。与1/106的接受单独同源供体的细胞的比率相比，特异性切割会使HDR比率增加超过1,000倍。在特定核苷酸处的同源性指导的修复(HDR)的比率是到切割位点的距离的函数，所以选择重叠的或最近的靶位点是重要的。
为HDR编辑供给的供体显著地变化，但是可以含有预期的序列，其具有小或大侧接同源性臂以允许与基因组DNA退火。侧接引入的基因变化的同源区域可以是30个碱基对或更小，或大至可以含有启动子、cDNA等的几千碱基盒。已经使用单链和双链寡核苷酸供体。这些寡核苷酸的大小范围为从小于100个核苷酸至超过许多kb，尽管还可以制备和使用更长的ssDNA。可以使用双链供体，包括PCR扩增子、质粒和小型环。一般而言，已经发现，AAV载体可以是递送供体模板的非常有效的方式，尽管各种供体的包装限制是<5kb。供体的活性转录会使HDR增加3倍，从而指示启动子的包含可以增加转化。相反，供体的CpG甲基化会减少基因表达和HDR。
除了野生型内切核酸酶(诸如Cas9)以外，存在切口酶变体，其具有一个或其它被失活的核酸酶结构域，从而导致仅一条DNA链的切割。可以从各种Cas切口酶或使用侧接靶区域的切口酶对指导HDR。供体可以是单链的、切口的或dsDNA。
可以给供体DNA供给核酸酶，或独立地通过多种不同的方法，例如通过转染、纳米颗粒、显微注射或病毒转导。已经提出许多连接选择来增加供体对于HDR的可用性。实例包括将供体连接至核酸酶，连接至结合在附近的DNA结合蛋白，或连接至参与DNA末端结合或修复的蛋白。
修复途径选择可以通过许多培养条件(诸如影响细胞周期的那些)或通过DNA修复和有关蛋白的靶向来引导。例如，为了增加HDR，可以抑制关键的NHEJ分子，诸如KU70、KU80或DNA连接酶IV。
除了通过NHEJ或HDR进行基因组编辑以外，已经进行了使用NHEJ途径和HR的位点特异性的基因插入。
PCSK9基因含有如表3中所示的许多外显子。可以靶向这些外显子或附近内含子中的任何一个或多个，以产生一个或多个插入或缺失，其破坏阅读框并最终消除PCSK9蛋白活性。
在一些实施方案中，所述方法可以提供通过在侧接不想要的序列的位置处将基因切割两次而进行缺失的gRNA对。该序列可以包括一个或多个外显子、内含子、内含子:外显子连接、编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列或其组合。所述切割可以由一对DNA内切核酸酶(其各自在基因组中产生DSB)或多种切口酶(其一起在基因组中产生DSB)完成。
可替换地，所述方法可以提供一种gRNA以在编码或剪接序列内进行一次双链切割。所述双链切口可以由单一DNA内切核酸酶或多种切口酶(其一起在基因组中产生DSB)产生。
剪接供体和受体通常是在邻近内含子的100碱基对内。在某些实例中，方法可以提供就每个目标外显子/内含子连接部而言在大约±100-3100碱基对处切割的gRNA。
对于任何基因组编辑策略，可以通过测序或PCR分析来证实基因编辑。
靶序列选择
相对于特定参比基因座在5'边界和/或3'边界的位置中的转移可以被用于促进或增强基因编辑的特定应用，这部分地取决于为所述编辑选择的内切核酸酶系统，如在本文中进一步描述和举例说明的。
在这样的靶序列选择的第一个非限制性实例中，许多内切核酸酶系统具有可以指导初步选择潜在靶位点用于切割的规则或标准，诸如在CRISPR II型或V型内切核酸酶的情况下在邻近DNA切割位点的特定位置对PAM序列基序的要求。
在靶序列选择或优化的另一个非限制性实例中，可以相对于在靶活性的频率评估关于靶序列和基因编辑内切核酸酶的特定组合的“靶外”活性频率(即在选择的靶序列以外的位点处发生的DSB的频率)。在某些情况下，已经在期望的基因座处正确地编辑的细胞可以具有相对于其它细胞的选择性优点。选择性优点的示例性的但是非限制性的实例包括属性的获得，诸如增强的复制速率、持久性、对某些条件的抗性、增强的成功移植物植入的比率或引入患者中以后的体内持久性、和与维持有关的其它属性、或增加的这样的细胞的数目或生存力。在其它情况下，通过一种或多种用于鉴别、分类或以其它方式选择已经被正确地编辑的细胞的筛选方法，可以确定地选择已经在期望的基因座处正确地编辑的细胞。选择性优点和定向选择方法可以利用与改变有关的表型。在某些情况中，可以将细胞编辑两次或更多次以便建立第二个修饰，其产生用于选择或纯化预期的细胞群体的新表型。通过添加针对可选择的或可筛选的标志物的第二种gRNA，可以建立这样的第二个修饰。在某些情况下，使用含有cDNA以及选择标记的DNA片段，可以在期望的基因座处正确地编辑细胞。
不论任何选择性优点是否适用或任何定向选择是否应用于特定情况，通过靶外频率的考虑也可以指导靶序列选择，以便增强应用的有效性和/或减小在期望的靶标以外的位点处的不希望的改变的潜力。如在本文中和在本领域中进一步描述和举例说明的，靶外活性的发生可以受许多因素影响，包括靶位点和各种靶外位点之间的相似性和不同性、以及使用的特定内切核酸酶。生物信息学工具是可得到的，其辅助靶外活性的预测，且这样的工具经常还可以用于鉴别靶外活性的最可能位点，然后可以将其在实验场合中评估以评价靶外活性与在靶活性的相对频率，由此允许选择具有较高相对在靶活性的序列。这样的技术的示例性实例提供在本文中，且其它是本领域已知的。
靶序列选择的另一个方面涉及同源重组事件。共享同源性区域的序列可以充当导致插入序列缺失的同源重组事件的焦点。这样的重组事件发生在染色体和其它DNA序列的正常复制过程中，并且也发生在当合成DNA序列时的其它时间，诸如在修复双链断裂(DSB)的情况下，所述双链断裂(DSB)在正常细胞复制周期中定期发生，但是也可以被不同事件(诸如紫外线和DNA断裂的其它诱导物)的发生或某些试剂(诸如不同的化学诱导物)的存在而增强。许多这样的诱导物会造成DSB在基因组中无差别地发生，并且DSB可以经常在正常细胞中被诱导和修复。在修复过程中，可以以完全保真度重构原始序列，但是，在某些情况下，在DSB位点处引入小插入或缺失(被称作“插入/缺失”)。
也可以在特定位置特异性地诱导DSB，如在本文描述的内切核酸酶系统的情况下，其可以用于在选择的染色体位置处造成定向或优先基因修饰事件。在许多情况下可以利用同源序列在DNA修复(以及复制)的背景下发生重组的趋势，并且是基因编辑系统(诸如CRISPR)的一种应用的基础，其中使用同源性指导的修复将目标序列(其通过使用“供体”多核苷酸提供)插入期望的染色体位置。
还可以使用在特定序列(其可以是小的“微同源性”的区域，其可以包含少至10个碱基对或更少)之间的同源性区域来实现期望的缺失。例如，可以将单个DSB引入在表现出与附近序列的微同源性的位点处。在这样的DSB的正常修复过程中，以高频率发生的结果是插入序列的缺失，其原因是DSB和伴随的细胞修复过程促进了重组。
但是，在某些情况下，选择在同源性区域内的靶序列也可以引起大得多的缺失，包括基因融合(当缺失是在编码区中时)，其在特定情况下可以是或不是期望的。
本文提供的实例进一步举例说明了选择不同靶区域用于建立DSB，所述DSB被设计成诱导导致PCSK9蛋白活性的降低或消除的插入、缺失或突变，以及选择这样的区域内的特定靶序列，其被设计成相对于在靶事件使靶外事件最小化。
人细胞
为了改善血脂异常或与PCSK9有关的任何病症，如本文中所述和解释的，基因编辑的主要靶标是人细胞。例如，在离体方法中，所述人细胞可以是体细胞，其在使用所述的技术修饰以后，可以产生分化细胞，例如肝细胞或祖细胞。例如，在体内方法中，所述人细胞可以是肝细胞、肾细胞或来自其它受影响的器官的细胞。
通过在源自需要的患者且因此已经与所述患者完全匹配的自体细胞中执行基因编辑，可能产生这样的细胞：其可以安全地重新引入所述患者中，且有效地产生将有效地改善与患者的疾病有关的一种或多种临床状况的细胞群体。
干细胞能够繁殖并产生更多的祖细胞，这些又具有产生大量母细胞的能力，所述母细胞又可以产生分化的或可分化的子细胞。所述子细胞本身可以被诱导以繁殖和产生后代，所述后代随后分化成一种或多种成熟的细胞类型，同时也保留一种或多种具有亲本发育潜力的细胞。术语“干细胞”则表示这样的细胞：其在特定情况下，具有分化成更专门的或分化的表型的能力或潜力，且其保留在某些情况下基本上不分化地繁殖的能力。在一个方面中，术语祖或干细胞表示一般化的母细胞，其后代(子代)通过分化而专门化(经常在不同的方向)，例如，通过完全获得个体特征，如在胚胎细胞和组织的进行性多样化中发生的。细胞的分化是一个通常通过许多细胞分裂而发生的复杂过程。分化的细胞可以源自多潜能细胞，所述多潜能细胞本身源自多潜能细胞，以此类推。尽管这些多潜能细胞中的每一种可以被视作干细胞，但是每种可以产生的细胞类型的范围可以相当大地变化。一些分化的细胞也具有产生有更大发育潜力的细胞的能力。这样的能力可以是天然的，或可以在用多种因素处理后人工地诱导。在许多生物学情况下，干细胞也可以是“多潜能的”，因为它们可以产生超过一种独特细胞类型的后代，但这不是“干性(stem-ness)”所要求的。
自我更新可以是干细胞的另一个重要方面。在理论上，自我更新可以通过两种主要机制中的任一种发生。干细胞可以不对称地分裂，一个子代保留干状态，且另一个子代表达某种独特的其它特定功能和表型。可替换地，一个群体中的某些干细胞可以对称地分裂成两个干细胞，从而维持所述群体中的某些干细胞作为整体，而所述群体中的其它细胞仅产生分化的后代。通常，“祖细胞”具有更原始(即，沿着发育途径或进展处于比完全分化的细胞更早的步骤)的细胞表型。祖细胞也经常具有显著的或非常高的增殖潜力。祖细胞可以产生多种不同的分化的细胞类型或单一分化的细胞类型，取决于发育途径和所述细胞在其中发育和分化的环境。
在细胞个体发育的背景下，形容词“分化的”或“分化中的”是相对术语。“分化的细胞”是这样的细胞：其相对于与其进行对比的细胞已经沿着发育途径向下进一步发展。因而，干细胞可以分化成谱系限制的前体细胞(诸如肌细胞祖细胞)，后者又可以沿着所述途径向下进一步分化成其它类型的前体细胞(诸如肌细胞前体)，然后分化成末期分化的细胞，诸如肌细胞，其在某种组织类型中起独特作用，且可能保留或不保留进一步增殖的能力。
诱导性多能干细胞
本文描述的遗传工程改造的人细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)。使用iPSC的一个优点是，所述细胞可以源自要给其施用祖细胞的相同个体。也就是说，体细胞可以得自个体，重新程序化成诱导性多能干细胞，然后重新分化成要施用给个体的祖细胞(例如，自体细胞)。因为祖细胞基本上源自自体来源，与使用来自另一个个体或个体组的细胞相比，移植物植入排斥或变应性应答的风险可以减小。另外，iPSC的应用会消除对得自胚胎来源的细胞的需要。因而，在一个方面中，在公开的方法中使用的干细胞不是胚胎干细胞。
尽管分化在生理学背景下通常是不可逆的，最近已经开发了几种方法来将体细胞重新程序化为iPSC。示例性的方法是本领域技术人员已知的并在下文中简要描述。
术语“重新程序化”表示改变或逆转分化的细胞(例如，体细胞)的分化状态的过程。换而言之，重新程序化表示驱动细胞向后分化成更未分化的或更原始的细胞类型的过程。应当指出，将许多原代细胞置于培养中可以导致完全分化的特征的某种丧失。因而，在术语分化的细胞中包括的简单地培养这样的细胞不会使这些细胞成为未分化细胞(例如，未分化的细胞)或多能细胞。分化的细胞向多能性的转变要求重新程序化刺激，其超过导致分化特征在培养中的部分丧失的刺激。相对于原代细胞亲本(其通常在培养中具有仅有限分裂次数的能力)，重新程序化的细胞也具有在不丧失生长潜力的情况下长期传代的能力的特征。
可以使要重新程序化的细胞在重新程序化之前部分地或最终地分化。重新程序化可以包括分化的细胞(例如，体细胞)向多能状态或多潜能状态的分化状态的完全逆转。重新程序化可以包括分化的细胞(例如，体细胞)向未分化的细胞(例如，胚胎样细胞)的分化状态的完全或部分逆转。重新程序化可以导致所述细胞对特定基因的表达，其表达进一步促进重新程序化。在本文所述的某些实例中，分化的细胞(例如，体细胞)的重新程序化可以造成分化的细胞呈现未分化的状态(例如，是未分化的细胞)。得到的细胞被称作“重新程序化的细胞”或“诱导性多能干细胞(iPSC或iPS细胞)”。
重新程序化可以涉及在细胞分化过程中发生的核酸修饰(例如，甲基化)、染色质凝聚、表观遗传的变化、基因组印迹等中的至少一些可遗传模式的改变(例如，逆转)。重新程序化不同于简单地维持已经是多能的细胞的既存未分化状态或维持已经是多潜能细胞(例如，肌源性干细胞)的细胞的既存的小于完全分化的状态。重新程序化也不同于促进已经是多能或多潜能的细胞的自我更新或繁殖，尽管本文描述的组合物和方法在某些实例中也可以用于这样的目的。
本领域已知许多可以用于从体细胞产生多能干细胞的方法。将体细胞重新程序化为多能表型的任何这样的方法将适合用在本文所述的方法中。
已经描述了使用转录因子的确定组合产生多能细胞的重新程序化方法。通过Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的直接转导，可以将小鼠体细胞转化成具有扩大的发育潜力的ES细胞-样细胞；参见，例如，Takahashi和Yamanaka, Cell 126(4): 663-76 (2006)。iPSC类似于ES细胞，因为它们会恢复多能性相关的转录线路和许多表观遗传的景象。另外，小鼠iPSC满足多能性的所有标准测定：具体地，在体外分化成三个胚层的细胞类型，畸胎瘤形成，促成嵌合体，种系传递[参见，例如，Maherali和Hochedlinger, Cell Stem Cell. 3(6):595-605 (2008)]，和四倍体互补。
使用类似的转导方法可以得到人iPSC，并且已经将转录因子三重小组OCT4、SOX2和NANOG确立为控制多能性的转录因子的核心集合；参见，例如，Budniatzky和Gepstein,Stem Cells Transl Med. 3(4):448-57 (2014); Barrett等人, Stem Cells Trans Med3:1-6 sctm.2014-0121 (2014); Focosi等人, Blood Cancer Journal 4: e211 (2014)；和其中引用的参考文献。在历史上通过使用病毒载体将编码干细胞相关基因的核酸序列引入成年体细胞中，可以实现iPSC的生产。
可以从终末分化的体细胞、以及从成年干细胞或成体干细胞产生或衍生iPSC。也就是说，通过重新程序化可以使非多能祖细胞成为多能的或多潜能的。在这样的情况下，可能不必包括象重新程序化终末分化的细胞所需要的那么多的重新程序化因子。此外，通过重新程序化因子的非病毒引入，例如，通过引入所述蛋白本身，或通过引入编码重新程序化因子的核酸，或通过引入在翻译后产生重新程序化因子的信使RNA，可以诱导重新程序化(参见例如，Warren等人, Cell Stem Cell, 7(5):618-30 (2010)。通过引入编码干细胞相关基因的核酸的组合可以实现重新程序化，所述干细胞相关基因包括、例如Oct-4 (也被称作Oct-3/4或Pouf51)、Soxl、Sox2、Sox3、Sox 15、Sox 18、NANOG、Klfl、Klf2、Klf4、Klf5、NR5A2、c-Myc、1-Myc、n-Myc、Rem2、Tert和LIN28。使用本文描述的方法和组合物的重新程序化可以进一步包含向体细胞引入以下的一种或多种：Oct-3/4，Sox家族的一个成员，Klf家族的一个成员，和Myc家族的一个成员。本文描述的方法和组合物还可以包含引入用于重新程序化的Oct-4、Sox2、Nanog、c-MYC和Klf4中的每一种的一种或多种。如上面所指出的，用于重新程序化的确切方法对于本文描述的方法和组合物而言不一定是关键性的。但是，在从重新程序化的细胞分化的细胞要用于例如人治疗中的情况下，在一个方面中，所述重新程序化不是通过改变基因组的方法实现。因而，在这样的实例中，例如，在不使用病毒或质粒载体的情况下，可以实现重新程序化。
通过各种试剂(例如，小分子)的添加，可以增强从开始细胞群体衍生出的重新程序化的效率(即，重新程序化的细胞的数目)，如以下文献证实的：Shi等人, Cell-StemCell 2:525-528 (2008); Huangfu等人, Nature Biotechnology 26(7):795-797 (2008)和Marson等人, Cell-Stem Cell 3: 132-135 (2008)。因而，增强诱导性多能干细胞生产的效率或速率的试剂或试剂组合可以用于生产患者特异性的或疾病特异性的iPSC。增强重新程序化效率的试剂的一些非限制性实例包括可溶性的Wnt、Wnt条件培养基、BIX-01294(G9a组蛋白甲基转移酶)、PD0325901 (MEK抑制剂)、DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂、丙戊酸、5'-氮胞苷、地塞米松、suberoylanilide、氧肟酸(SAHA)、维生素C和曲古抑菌素(TSA)，以及其它。
重新程序化增强剂的其它非限制性实例包括：辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA (例如，MK0683, 伏林司他)和其它氧肟酸), BML-210, Depudecin (例如，(-)-Depudecin), HC毒素, Nullscript (4-(l,3-二氧代-lH,3H-苯并[de]异喹啉-2-基)-N-羟基丁酰胺), 苯基丁酸盐(例如，苯基丁酸钠)和丙戊酸((VP A)和其它短链脂肪酸), Scriptaid, 舒拉明钠,曲古抑菌素A (TSA), APHA化合物8, Apicidin,丁酸钠, 丁酸新戊酰基氧基甲酯(Pivanex, AN-9), Trapoxin B, Chlamydocin, 缩肽(也被称作FR901228或FK228), 苯甲酰胺(例如，CI-994 (例如，N-乙酰基地那林)和MS-27-275), MGCD0103, NVP-LAQ-824,CBHA (间-羧基cinnaminic acid双氧肟酸), JNJ16241199, Tubacin, A-161906,proxamide, oxamflatin, 3-Cl-UCHA (例如，6-(3-氯苯基脲基)caproic氧肟酸), AOE(2-氨基-8-氧代-9, 10-环氧癸酸), CHAP31和CHAP 50。其它重新程序化增强剂包括，例如，HDAC的显性失活形式(例如，催化上无活性的形式)，HDAC的siRNA抑制剂，和特异性地结合HDAC的抗体。这样的抑制剂可得自，例如，BIOMOL International, Fukasawa, MerckBiosciences, Novartis, Gloucester Pharmaceuticals, Titan Pharmaceuticals,MethylGene, 和Sigma Aldrich。
为了证实用于与本文所述的方法一起使用的多能干细胞的诱导，可以针对干细胞标志物的表达测试分离的克隆。在从体细胞衍生出的细胞中的这种表达将所述细胞鉴别为诱导性多能干细胞。干细胞标志物可以选自包括SSEA3、SSEA4、CD9、Nanog、Fbxl5、Ecatl、Esgl、Eras、Gdf3、Fgf4、Cripto、Daxl、Zpf296、Slc2a3、Rexl、Utfl和Natl的非限制性集合。在一个情况中，例如，将表达Oct4或Nanog的细胞鉴别为多能的。用于检测这样的标志物的表达的方法可以包括，例如，RT-PCR和检测编码的多肽的存在的免疫学方法，诸如蛋白质印迹或流式细胞计数分析。检测不仅可以涉及RT-PCR，而且可以包括蛋白标志物的检测。通过RT-PCR或蛋白检测方法诸如免疫细胞化学，可以最佳地鉴别细胞内标志物，而通过例如免疫细胞化学容易地鉴别细胞表面标志物。
通过评价iPSC的分化成三个胚层中的每一个的细胞的能力的测试，可以证实分离的细胞的多能干细胞特性。作为一个实例，在裸鼠中的畸胎瘤形成可以用于评价分离的克隆的多能特性。可以将所述细胞引入裸鼠中，并可以在从所述细胞产生的肿瘤上执行组织学和/或免疫组织化学。例如，包含来自所有三个胚层的细胞的肿瘤的生长进一步指示，所述细胞是多能干细胞。
肝细胞
在某些方面中，本文描述的遗传工程改造的人细胞是肝细胞。肝细胞是肝的主要实质组织的细胞。肝细胞占肝的质量的70-85%。这些细胞参与：蛋白合成；蛋白贮存；碳水化合物的转化；胆固醇、胆汁盐和磷脂的合成；外源性和内源性物质的解毒、修饰和排泄；以及胆汁的形成的起始和分泌。
制备患者特异性的iPSC
本发明的离体方法的一个步骤可以包括，制备患者特异性的iPS细胞、患者特异性的iPS细胞或患者特异性的iPS细胞系。在本领域中存在许多确定的用于制备患者特异性的iPS细胞的方法，如在以下文献中所述：Takahashi和Yamanaka 2006; Takahashi, Tanabe等人. 2007。例如，所述制备步骤可以包括：a)从所述患者分离体细胞，诸如皮肤细胞或成纤维细胞；和b)将一组多能性相关基因引入所述体细胞中以诱导所述细胞变成多能干细胞。所述组的多能性相关基因是一种或多种选自以下的基因：OCT4、SOX1、SOX2、SOX3、SOX15、SOX18、NANOG、KLF1、KLF2、KLF4、KLF5、c-MYC、n-MYC、REM2、TERT和LIN28。
执行患者的肝或骨髓的活组织检查或抽吸
活组织检查或抽吸是从身体取出的组织或流体的样品。存在许多不同种类的活组织检查或抽吸。它们几乎全部涉及使用尖锐的工具取出少量组织。如果活组织检查将是在皮肤或其它敏感区域上，可以首先应用麻醉机器。根据本领域的已知方法中的任一种，可以执行活组织检查或抽吸。例如，在活组织检查中，将针头穿过腹部皮肤注射进肝中，从而捕获肝组织。例如，在骨髓抽吸中，使用大针头进入骨盆骨中以收集骨髓。
分离肝特异性的祖细胞或原代肝细胞
根据本领域已知的任意方法可以分离肝特异性的祖细胞和原代肝细胞。例如，从新鲜外科手术样本分离人肝细胞。使用健康的肝组织通过胶原酶消化来分离肝细胞。将得到的细胞混悬液穿过100-mm尼龙网过滤，并通过在50g离心5分钟进行沉淀，再悬浮，并在冷的洗涤介质中洗涤2-3次。通过在严谨条件下培养从新鲜肝制品得到的肝细胞，得到人肝干细胞。将接种在胶原包被的平板上的肝细胞培养2周。2周以后，将存活的细胞取出，并针对干细胞标志物的表达进行表征(Herrera等人, STEM CELLS 2006;24: 2840 -2850)。
分离间充质干细胞
根据本领域已知的任意方法可以分离间充质干细胞，诸如从患者骨髓或外周血。例如，可以将骨髓抽吸物收集进具有肝素的注射器中。可以将细胞洗涤并在Percoll上离心。可以在含有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM) (低葡萄糖)中培养细胞(Pittinger MF, Mackay AM, Beck SC等人, Science 1999; 284:143-147)。
遗传修饰的细胞
术语“遗传修饰的细胞”表示包含至少一个通过基因组编辑(例如，使用CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统)引入的遗传修饰的细胞。在本文的某些离体实例中，所述遗传修饰的细胞可以是遗传修饰的祖细胞。在本文的某些体内实例中，所述遗传修饰的细胞可以是遗传修饰的肝细胞。在本文中预见到遗传修饰的细胞，其包含外源的靶向基因组的核酸和/或外源的编码靶向基因组的核酸的核酸。
术语“对照处理群体”描述了除了加入基因组编辑组分以外，已经用相同的介质、病毒诱导、核酸序列、温度、汇合、烧瓶大小、pH等处理过的细胞群体。本领域已知的任意方法可以用于测量PCSK9基因转录或蛋白表达或活性，例如，PCSK9蛋白的蛋白质印迹分析或用于定量PCSK9 mRNA的实时PCR。
术语“分离的细胞”表示已经从最初发现它的生物取出的细胞，或这样的细胞的后代。任选地，所述细胞可以在体外培养，例如，在确定的条件下，或在有其它细胞存在下。任选地，可以在以后将所述细胞引入第二种生物或重新引入从其中分离出它的生物(或它的来源细胞)。
关于分离的细胞群体的术语“分离的群体”表示，已经从混合的或异质的细胞群体取出和分离的细胞群体。在某些情况中，与从其中分离或富集细胞的异质群体相比，分离的群体可以是基本上纯的细胞群体。在某些情况中，所述分离的群体可以是分离的人祖细胞群体，例如，与包含人祖细胞的细胞和人祖细胞的来源细胞的异质群体相比，基本上纯的人祖细胞群体。
就特定细胞群体而言，术语“实质上增强的”表示这样的细胞群体，其中特定类型的细胞的发生相对于预先存在的水平或参比水平增加了至少2倍、至少3-、至少4-、至少5-、至少6-、至少7-、至少8-、至少9、至少10-、至少20-、至少50-、至少100-、至少400-、至少1000-、至少5000-、至少20000-、至少100000-倍或更多倍，取决于例如用于改善血脂异常的这样的细胞的期望水平。
就特定细胞群体而言，术语“实质上富集的”表示相对于构成总细胞群体的细胞占至少约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%或更多的细胞群体。
就特定细胞群体而言，术语“实质上富集的”或“基本上纯的”表示相对于构成总细胞群体的细胞具有至少约75%、至少约85%、至少约90%或至少约95%纯度的细胞群体。也就是说，就祖细胞群体而言，术语“基本上纯的”或“基本上纯化的”表示，含有少于约20%、约15%、约10%、约9%、约8%、约7%、约6%、约5%、约4%、约3%、约2%、约1%或小于1%的不是由本文中的术语定义的祖细胞的细胞的细胞群体。
编辑过基因组的iPSC分化成其它细胞类型
本发明的离体方法的另一个步骤可以包括，使编辑过基因组的iPSC分化成肝细胞。所述分化步骤可以根据本领域已知的任意方法执行。例如，使用多种治疗，包括激活素和B27补体(Life Technology)，使hiPSC分化成确定内胚层。使确定内胚层进一步分化成肝细胞，所述治疗包括：FGF4、HGF、BMP2、BMP4、制癌蛋白M、地塞米松(Dexametason)等(Duan等人,STEM CELLS; 2010;28:674-686, Ma等人, STEM CELLS TRANSLATIONAL MEDICINE 2013; 2:409-419)。
编辑过基因组的间充质干细胞分化成肝细胞
本发明的离体方法的另一个步骤可以包括，使编辑过基因组的间充质干细胞分化成肝细胞。所述分化步骤可以根据本领域已知的任意方法执行。例如，用多种因子和激素(包括胰岛素、转铁蛋白、FGF4、HGF、胆汁酸)治疗hMSC (Sawitza I等人, Sci Rep. 2015; 5:13320)。
将细胞移植进患者中
本发明的离体方法的另一个步骤可以包括，将所述肝细胞移植进患者中。该移植步骤可以使用本领域已知的任何植入方法完成。例如，可以将遗传修饰的细胞直接注射进患者的血液中或以其它方式施用给患者。
本发明的离体方法的另一个步骤包括，将所述祖细胞或原代肝细胞移植进患者中。该移植步骤可以使用本领域已知的任何植入方法完成。例如，可以将遗传修饰的细胞直接注射进患者的肝中或以其它方式施用给患者。
III. 制剂和递送
药学上可接受的载体
在本文中预见到的将祖细胞施用给个体的离体方法包括，使用包含祖细胞的治疗组合物。
治疗组合物可以含有生理学上可耐受的载体以及细胞组合物和任选的至少一种作为活性成分溶解或分散在其中的如本文中所述的另外的生物活性剂。在某些情况中，当为了治疗目的而施用给哺乳动物或人患者时，所述治疗组合物不是基本上免疫原性的，除非期望如此。
一般而言，可以将本文描述的祖细胞作为含有药学上可接受的载体的混悬液施用。本领域技术人员会认识到，要用在细胞组合物中的药学上可接受的载体不会包括实质上干扰要递送给个体的细胞的生存力的量的缓冲剂、化合物、冷冻保存剂、防腐剂或其它试剂。包含细胞的制剂可以包括例如，允许维持细胞膜完整性的渗透缓冲剂，和任选地，在施用后维持细胞生存力或增强移植物植入的营养物。这样的制剂和混悬液是本领域技术人员已知的，和/或可以适合使用例行实验与如本文中所述的祖细胞一起使用。
还可以将细胞组合物乳化或呈现为脂质体组合物，前提条件是，所述乳化程序不会不利地影响细胞生存力。所述细胞和任意其它活性成分可以以适合用在本文描述的治疗方法中的量与药学上可接受的且与活性成分相容的赋形剂混合。
在细胞组合物中包括的另外的试剂可以包括在其中的组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与以下酸形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基形成)：无机酸例如，盐酸或磷酸，或有机酸诸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等。与游离羧基形成的盐还可以衍生自无机碱，例如，钠、钾、铵、钙或三价铁氢氧化物，和有机碱诸如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
生理学上可耐受的载体是本领域众所周知的。示例性的液体载体是不含有除了活性成分和水以外的物质的无菌水溶液，或含有缓冲剂诸如在生理pH值的磷酸钠、生理盐水或二者，诸如磷酸盐缓冲盐水。更进一步，水性载体可以含有超过一种缓冲盐，以及盐诸如氯化钠和氯化钾、右旋糖、聚乙二醇和其它溶质。液体组合物还可以含有除了水以外和不包括水的液相。这样的另外的液相的示例是甘油、植物油诸如棉籽油、和水-油乳剂。在细胞组合物中使用的有效地治疗特定病症或病症的活性化合物的量可以取决于病症或病症的性质，且可以通过标准的临床技术来确定。
导引RNA制剂
可以用药学上可接受的赋形剂诸如载体、溶剂、稳定剂、佐剂、稀释剂等配制本发明的导引RNA，取决于特定施用模式和剂型。可以配制导引RNA组合物以实现生理上相容的pH，和从约3的pH至约11的pH、约pH 3至约pH 7的范围，取决于制剂和施用途径。在某些情况中，可以将pH调至约pH 5.0至约pH 8的范围。在某些情况中，所述组合物可以包含治疗有效量的至少一种如本文中所述的化合物、以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。任选地，所述组合物可以包含本文所述化合物的组合，或可以包括可用于治疗或预防细菌生长的第二种活性成分(例如、但不限于，抗细菌剂或抗微生物剂)，或可以包括本发明的试剂的组合。
合适的赋形剂包括，例如，载体分子，其包括大的、缓慢代谢的大分子诸如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。其它示例性的赋形剂可以包括抗氧化剂(例如、但不限于，抗坏血酸)、螯合剂(例如、但不限于，EDTA)、碳水化合物(例如、但不限于，糊精、羟基烷基纤维素和羟基烷基甲基纤维素)、硬脂酸、液体(例如、但不限于，油、水、盐水、甘油和乙醇)、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
递送
通过本领域已知的病毒或非病毒递送媒介物，可以递送导引RNA多核苷酸(RNA或DNA)和/或内切核酸酶多核苷酸(RNA或DNA)。可替换地，通过本领域已知的病毒或非病毒递送媒介物，诸如电穿孔或脂质纳米颗粒，可以递送内切核酸酶多肽。在进一步备选方面中，所述DNA内切核酸酶可以作为一种或多种多肽递送，无论是单独地还是与一种或多种导引RNA、或一种或多种crRNA以及在一起的tracrRNA预先形成复合物。
可以通过非病毒递送媒介物来递送多核苷酸，所述非病毒递送媒介物包括、但不限于，纳米颗粒、脂质体、核糖核蛋白、带正电荷的肽、小分子RNA-缀合物、适体-RNA嵌合体和RNA-融合蛋白复合物。一些示例性的非病毒递送媒介物描述在Peer和Lieberman, GeneTherapy, 18: 1127-1133 (2011) (其聚焦于siRNA的非病毒递送媒介物，其也可用于递送其它多核苷酸)。
对于本发明的多核苷酸，该制剂可以选自例如在国际申请PCT/US2012/069610中教导的那些中的任一种。
通过脂质纳米颗粒(LNP)，可以将多核苷酸诸如导引RNA、sgRNA和编码内切核酸酶的mRNA递送给细胞或患者。
LNP表示具有小于1000 nm、500 nm、250 nm、200 nm、150 nm、100 nm、75 nm、50 nm或25 nm的直径的任何颗粒。可替换地，纳米颗粒可以是在1-1000 nm、1-500 nm、1-250 nm、25-200 nm、25-100 nm、35-75 nm或25-60 nm的大小范围内。
LNP可以由阳离子脂质、阴离子脂质或中性脂质制成。可以在LNP中包括中性脂质(诸如融原(fusogenic)磷脂DOPE或膜组分胆固醇)作为'辅助脂质'来增强转染活性和纳米颗粒稳定性。阳离子脂质的限制包括由差稳定性和快速清除引起的低效力、以及炎症性应答或抗炎应答的产生。
LNP也可以包含疏水脂质、亲水脂质、或疏水脂质和亲水脂质。
本领域已知的任何脂质或脂质的组合可以用于生产LNP。用于生产LNP的脂质的实例是：DOTMA、DOSPA、DOTAP、DMRIE、DC-胆固醇、DOTAP-胆固醇、GAP-DMORIE-DPyPE和GL67A-DOPE-DMPE-聚乙二醇(PEG)。阳离子脂质的实例是：98N12-5、C12-200、DLin-KC2-DMA(KC2)、DLin-MC3-DMA (MC3)、XTC、MD1和7C1。中性脂质的实例是：DPSC、DPPC、POPC、DOPE和SM。PEG修饰的脂质的实例是：PEG-DMG、PEG-CerC14和PEG-CerC20。
所述脂质可以以任意数目的摩尔比组合以生产LNP。另外，所述多核苷酸可以与脂质以宽范围的摩尔比组合以生产LNP。
如以前所述，可以将所述定位多肽和靶向基因组的核酸各自分别施用给细胞或患者。另一方面，可以将所述定位多肽与一种或多种导引RNA、或一种或多种crRNA以及在一起的tracrRNA预先形成复合物。然后可以将所述预先形成复合物的物质施用给细胞或患者。这样的预先形成复合物的物质被称作核糖核蛋白颗粒(RNP)。
RNA能够与RNA或DNA形成特异性相互作用。尽管该性质被用在许多生物学过程中，它也伴有在富含核酸的细胞环境中杂乱相互作用的风险。该问题的一个解决方案是形成核糖核蛋白颗粒(RNP)，其中将所述RNA与内切核酸酶预先形成复合物。所述RNP的另一个益处是保护所述RNA免于降解。
所述RNP中的内切核酸酶可以是经修饰的或未修饰的。同样地，所述gRNA、crRNA、tracrRNA或sgRNA可以是经修饰的或未修饰的。众多修饰是本领域已知的且可以使用。
所述内切核酸酶和sgRNA通常以1:1摩尔比组合。可替换地，所述内切核酸酶、crRNA和tracrRNA通常以1:1:1摩尔比组合。但是，宽范围的摩尔比可以用于生产RNP。
AAV(腺伴随病毒)
重组腺伴随病毒(AAV)载体可以用于递送。用于生产rAAV颗粒的技术是本领域中的标准，其中将要包装的AAV基因组(其包括要递送的多核苷酸、rep和cap基因和辅助病毒功能)提供给细胞。rAAV的生产通常要求，下述组分存在于单个细胞(在本文中称作包装细胞)内：rAAV基因组，与rAAV基因组分离的AAV rep和cap基因(即，不在其里面)，和辅助病毒功能。所述AAV rep和cap基因可以来自重组病毒可以衍生出的任何AAV血清型，且可以来自不同于rAAV基因组ITR的AAV血清型，包括、但不限于，本文所述的AAV血清型。假型化的rAAV的生产公开在，例如，国际专利申请公开号WO 01/83692中。
AAV血清型
包装编码本发明的组合物的多核苷酸(例如本发明的内切核酸酶、供体序列或RNA导引分子)的AAV颗粒可以包含或衍生自任何天然或重组AAV血清型。根据本发明，AAV颗粒可以利用或基于选自任何以下血清型的血清型及其变体，包括但不限于AAV1、AAV10、AAV106.1/hu.37、AAV11、AAV114.3/hu.40、AAV12、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.1/hu.43、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV16.12/hu.11、AAV16.3、AAV16.8/hu.10、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2、AAV2.5T、AAV2-15/rh.62、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV2-3/rh.61、AAV24.1、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV27.3、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV2G9、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV3、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-11/rh.53、AAV3-3、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV3-9/rh.52、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV4-19/rh.55、AAV42.12、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV4-4、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV4-8/r11.64、AAV4-8/rh.64、AAV4-9/rh.54、AAV5、AAV52.1/hu.20、AAV52/hu.19、AAV5-22/rh.58、AAV5-3/rh.57、AAV54.1/hu.21、AAV54.2/hu.22、AAV54.4R/hu.27、AAV54.5/hu.23、AAV54.7/hu.24、AAV58.2/hu.25、AAV6、AAV6.1、AAV6.1.2、AAV6.2、AAV7、AAV7.2、AAV7.3/hu.7、AAV8、AAV-8b、AAV-8h、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAV-b、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAV-h、AAVH-1/hu.1、AAVH2、AAVH-5/hu.3、AAVH6、AAVhE1.1、AAVhER1.14、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhER1.23、AAVhEr1.35、AAVhEr1.36、AAVhEr1.5、AAVhEr1.7、AAVhEr1.8、AAVhEr2.16、AAVhEr2.29、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhEr2.4、AAVhEr3.1、AAVhu.1、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.11、AAVhu.12、AAVhu.13、AAVhu.14/9、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.19、AAVhu.2、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.3、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.4、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.5、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.53、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.6、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.7、AAVhu.8、AAVhu.9、AAVhu.t 19、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVLG-9/hu.39、AAV-LK01、AAV-LK02、AAVLK03、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAVN721-8/rh.43、AAV-PAEC、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAVpi.1、AAVpi.2、AAVpi.3、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.2、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.2R、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.43、AAVrh.44、AAVrh.45、AAVrh.46、AAVrh.47、AAVrh.48、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.50、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.55、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.59、AAVrh.60、AAVrh.61、AAVrh.62、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.65、AAVrh.67、AAVrh.68、AAVrh.69、AAVrh.70、AAVrh.72、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、BAAV、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、牛AAV、山羊AAV、日本AAV 10、真型AAV(ttAAV)、UPENN AAV 10、AAV-LK16、AAAV、AAV穿梭100-1、AAV穿梭100-2、AAV穿梭100-3、AAV穿梭100-7、AAV穿梭10-2、AAV穿梭10-6、AAV穿梭10-8、AAV SM 100-10、AAV SM 100-3、AAVSM 10-1、AAV SM 10-2和/或AAV SM 10-8。
在一些方面中，AV血清型可以是或具有如N Pulicherla等人(Molecular Therapy19(6):1070-1078 (2011))所述的AAV9序列中的突变，诸如但不限于AAV9.9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84。
在一些方面中，AAV血清型可以是或具有如美国专利号US 6156303中所述的序列，诸如但不限于AAV3B (US 6156303的SEQ ID NO:1和10)，AAV6 (US 6156303的SEQ ID NO:2、7和11)，AAV2 (US 6156303的SEQ ID NO:3和8)，AAV3A (US 6156303的SEQ ID NO:4和9)或其衍生物。
在一些方面中，血清型可以是AAVDJ或其变体，诸如AAVDJ8 (或AAV-DJ8)，如Grimm等人 (Journal of Virology 82(12): 5887-5911 (2008)所述. AAVDJ8的氨基酸序列可以包含两个或更多个突变，以去除肝素结合结构域(HBD)。作为一个非限制性实例，在美国专利号7,588,772中描述为SEQ ID NO:1的AAV-DJ序列可以包含两个突变：(1) R587Q，其中氨基酸587处的精氨酸(R；Arg)变为谷氨酰胺(Q；Gln)，和(2) R590T，其中氨基酸590处的精氨酸(R；Arg)变为苏氨酸(T；Thr)。作为另一个非限制性实例，可以包含三个突变：(1)K406R，其中氨基酸406处的赖氨酸(K；Lys)变为精氨酸(R；Arg)，(2)R587Q，其中氨基酸587处的精氨酸(R；Arg)变为谷氨酰胺(Q；Gln)，和(3) R590T，其中氨基酸590处的精氨酸(R；Arg)变为苏氨酸(T；Thr)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如国际公开号WO2015121501中所述的序列，诸如但不限于真型AAV (ttAAV) (WO2015121501的SEQ ID NO:2)，“UPenn AAV10”(WO2015121501的SEQ ID NO:8)，“日本AAV10”(WO2015121501的SEQ ID NO:9)或其变体。
根据本发明，AAV衣壳血清型选择或用途可以来自多种物种。在一个实施方案中，AAV可以是禽AAV (AAAV)。AAAV血清型可以是或具有如美国专利号US 9238800中所述的序列，诸如但不限于AAAV (US 9,238,800的SEQ ID NO:1、2、4、6、8、10、12和14)或其变体。
在一个实施方案中，AAV可以是牛AAV (BAAV)。BAAV血清型可以是或具有如美国专利号US 9,193,769中所述的序列，诸如但不限于BAAV (US 9193769的SEQ ID NO:1和6)或其变体。BAAV血清型可以是或具有如美国专利号US7427396中所述的序列，诸如但不限于BAAV (US7427396的SEQ ID NO:5和6)或其变体。
在一个实施方案中，AAV可以是山羊AAV。山羊AAV血清型可以是或具有如美国专利号US7427396中所述的序列，诸如但不限于山羊AAV (US7427396的SEQ ID NO:3)或其变体。
在其它实施方案中，可以将AAV工程改造为来自两种或更多种亲本血清型的杂合AAV。在一个实施方案中，AAV可以是AAV2G9，其包含来自AAV2和AAV9的序列。AAV2G9 AAV血清型可以是或具有如美国专利公开号US20160017005中所述的序列。
在一个实施方案中，AAV可以是由氨基酸390-627 (VP1编号)中具有突变的AAV9衣壳文库产生的血清型，如Pulicherla等人(Molecular Therapy 19(6):1070-1078 (2011)所述。血清型和相应的核苷酸和氨基酸取代可以是，但不限于，AAV9.1 (G1594C; D532H),AAV6.2 (T1418A和T1436X; V473D和I479K), AAV9.3 (T1238A; F413Y), AAV9.4 (T1250C和A1617T; F417S), AAV9.5 (A1235G, A1314T, A1642G, C1760T; Q412R, T548A,A587V), AAV9.6 (T1231A; F411I), AAV9.9 (G1203A, G1785T; W595C), AAV9.10(A1500G, T1676C; M559T), AAV9.11 (A1425T, A1702C, A1769T; T568P, Q590L),AAV9.13 (A1369C, A1720T; N457H, T574S), AAV9.14 (T1340A, T1362C, T1560C,G1713A; L447H), AAV9.16 (A1775T; Q592L), AAV9.24 (T1507C, T1521G; W503R),AAV9.26 (A1337G, A1769C; Y446C, Q590P), AAV9.33 (A1667C; D556A), AAV9.34(A1534G, C1794T; N512D), AAV9.35 (A1289T, T1450A, C1494T, A1515T, C1794A,G1816A; Q430L, Y484N, N98K, V606I), AAV9.40 (A1694T, E565V), AAV9.41 (A1348T,T1362C; T450S), AAV9.44 (A1684C, A1701T, A1737G; N562H, K567N), AAV9.45(A1492T, C1804T; N498Y, L602F), AAV9.46 (G1441C, T1525C, T1549G; G481R,W509R, L517V), 9.47 (G1241A, G1358A, A1669G, C1745T; S414N, G453D, K557E,T582I), AAV9.48 (C1445T, A1736T; P482L, Q579L), AAV9.50 (A1638T, C1683T,T1805A; Q546H, L602H), AAV9.53 (G1301A, A1405C, C1664T, G1811T; R134Q, S469R,A555V, G604V), AAV9.54 (C1531A, T1609A; L511I, L537M), AAV9.55 (T1605A;F535L), AAV9.58 (C1475T, C1579A; T492I, H527N), AAV.59 (T1336C; Y446H),AAV9.61 (A1493T; N498I), AAV9.64 (C1531A, A1617T; L511I), AAV9.65 (C1335T,T1530C, C1568A; A523D), AAV9.68 (C1510A; P504T), AAV9.80 (G1441A,;G481R),AAV9.83 (C1402A, A1500T; P468T, E500D), AAV9.87 (T1464C, T1468C; S490P),AAV9.90 (A1196T; Y399F), AAV9.91 (T1316G, A1583T, C1782G, T1806C; L439R,K528I), AAV9.93 (A1273G, A1421G, A1638C, C1712T, G1732A, A1744T, A1832T;S425G, Q474R, Q546H, P571L, G578R, T582S, D611V), AAV9.94 (A1675T; M559L)和AAV9.95 (T1605A; F535L)。
在一个实施方案中，AAV可以是包含至少一个AAV衣壳CD8+ T-细胞表位的血清型。作为一个非限制性实例，血清型可以是AAV1、AAV2或AAV8。
在一个实例中，AAV可以是变体，诸如如Deverman. 2016. NatureBiotechnology. 34(2): 204-209中所述的PHP.A或PHP.B。
在一个实例中，AAV可以是选自SEQ ID NO:4,734-5,302和表2中发现的任何那些的血清型。
在一个实例中，AAV可以由如SEQ ID NO:,734-5,302和表2中公开的序列、片段或变体编码。
rAAV生产的一般原理综述在例如Carter, 1992, Current Opinions inBiotechnology, 1533-539；和Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. andImmunol., 158:97-129)中。多种方案描述在Ratschin等人, Mol. Cell. Biol. 4:2072(1984); Hermonat等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin等人, Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin等人, J. Virol., 62:1963(1988)；和Lebkowski等人, 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski等人(1989, J. Virol., 63:3822-3828)；美国专利号5,173,414; WO 95/13365和对应的美国专利号5,658.776; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423)；WO 97/08298 (PCT/US96/13872)；WO 97/21825 (PCT/US96/20777)；WO 97/06243 (PCT/FR96/01064)；WO 99/11764; Perrin等人(1995) Vaccine 13:1244-1250;Paul等人(1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark等人(1996) Gene Therapy 3:1124-1132；美国专利号5,786,211；美国专利号5,871,982；和美国专利号6,258,595中。
AAV载体血清型可以与靶细胞类型匹配。例如，可以用尤其是指定的AAV血清型转导下述示例性的细胞类型。
表2. 组织/细胞类型和血清型
组织/细胞类型 血清型
肝 AAV3、AAV5、AAV8、AAV9
骨骼肌 AAV1、AAV7、AAV6、AAV8、AAV9
中枢神经系统 AAV5、AAV1、AAV4、AAV9
RPE AAV5、AAV4
感光细胞 AAV5
肺 AAV9
心脏 AAV8
胰腺 AAV8
肾 AAV2、AAV8
造血干细胞 AAV6
除了腺伴随病毒载体以外，可以使用其它病毒载体。这样的病毒载体包括、但不限于慢病毒、甲病毒、肠道病毒、瘟病毒、杆状病毒、疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、乳多泡病毒、痘病毒、痘苗病毒和单纯疱疹病毒。
在某些方面中，可以将Cas9 mRNA、靶向PCSK9基因中的一个或两个基因座的sgRNA和供体DNA各自分别配制进脂质纳米颗粒中，或者都共配制进一个脂质纳米颗粒中。
在某些方面中，可以将Cas9 mRNA配制进脂质纳米颗粒中，而可以将sgRNA和供体DNA在AAV载体中递送。
可得到将Cas9核酸酶作为DNA质粒、作为mRNA或作为蛋白来递送的选项。所述导引RNA可以从相同DNA表达，或也可以作为RNA递送。可以将所述RNA化学修饰以改变或提高它的半衰期，或减小免疫应答的可能性或程度。所述内切核酸酶蛋白可以在递送之前与gRNA形成复合物。病毒载体允许有效的递送；可以将Cas9的裂解形式和Cas9的更小直系同源物包装进AAV中，对于HDR的供体照样可以。还存在许多可以递送这些组分中的每一种的非病毒递送方法，或者可以串联采用非病毒和病毒方法。例如，纳米颗粒可以用于递送蛋白和导引RNA，而AAV可以用于递送供体DNA。
IV. 给药和施用
在通过一种方法或途径将细胞(例如，祖细胞)放入个体中的背景下，术语“施用”、“引入”和“移植”互换使用，所述方法或途径导致引入的细胞在期望的部位(诸如损伤或修复的部位)处的至少部分定位，从而产生预期的效应。通过任意适当的途径可以施用细胞(例如，祖细胞)或它们的分化的后代，所述途径导致递送至个体中的期望位置，在该处植入的细胞的至少一部分或所述细胞的组分保持存活。施用给个体以后细胞的生存阶段可以短至几小时，例如，24小时，至几天，至长达几年，或甚至患者的生存期，即，长期移植物植入。例如，在本文所述的某些方面中，经由全身性施用途径，诸如腹膜内或静脉内途径，施用有效量的肝祖细胞。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换地使用，且表示为其需要诊断、治疗或疗法的任何个体。在某些方面中，所述个体是哺乳动物。在某些方面中，所述个体是人类。
当预防性地提供时，在血脂异常的任何症状之前，可以将本文描述的祖细胞施用给个体。因此，肝祖细胞群体的预防性施用用于预防血脂异常。
根据本文所述的方法施用的祖细胞群体可以包含得自一个或多个供体的同种异体祖细胞。这样的祖细胞可以是任何细胞或组织来源的，例如肝脏、肌肉、心脏等。“同种异体的”表示得自相同物种的一个或多个不同供体(其中在一个或多个基因座处的基因不是相同的)的祖细胞或包含祖细胞的生物样品。例如，施用给个体的肝祖细胞群体可以源自一个更无关的供体个体，或源自一个或多个不相同的同胞。在某些情况中，可以使用同基因的祖细胞群体，诸如得自遗传上相同的动物或得自单卵孪生的那些。所述祖细胞可以是自体细胞；也就是说，所述祖细胞得自或分离自一个个体并施用给相同个体，即，供体和接受者是同一人。
术语“有效量”表示预防或减轻血脂异常的至少一种或多种征象或症状所需的祖细胞或它们的后代的群体的量，且表示足以提供期望的作用(例如，治疗具有血脂异常的个体)的组合物的量。术语“治疗有效量”因此表示，当施用给典型个体(诸如具有血脂异常或处于血脂异常的风险中的个体)时足以促进特定效应的祖细胞或包含祖细胞的组合物的量。有效量也包括足以预防或延迟疾病的症状的发展、改变疾病的症状的进程(例如但不限于，减慢疾病的症状的进展)、或逆转疾病的症状的量。应当理解，对于任何给定的病例，适当的“有效量”可以由本领域普通技术人员使用例行实验确定。
为了用在本文描述的各个方面中，祖细胞的有效量包含至少102个祖细胞、至少5X 102个祖细胞、至少103个祖细胞、至少5 X 103个祖细胞、至少104个祖细胞、至少5 X 104个祖细胞、至少105个祖细胞、至少2 X 105个祖细胞、至少3 X 105个祖细胞、至少4 X 105个祖细胞、至少5 X 105个祖细胞、至少6 X 105个祖细胞、至少7 X 105个祖细胞、至少8 X 105个祖细胞、至少9 X 105个祖细胞、至少1 X 106个祖细胞、至少2 X 106个祖细胞、至少3 X 106个祖细胞、至少4 X 106个祖细胞、至少5 X 106个祖细胞、至少6 X 106个祖细胞、至少7 X106个祖细胞、至少8 X 106个祖细胞、至少9 X 106个祖细胞或它们的倍数。所述祖细胞可以源自一个或多个供体，或可以得自自体来源。在本文所述的某些实例中，在施用给有此需要的个体之前，可以在培养物中扩增所述祖细胞。
对于改善疾病的一种或多种症状、对于增加长期存活和/或对于减小与其它治疗有关的副作用，在具有PCSK9相关病症的患者的细胞中表达的PCSK9的水平的适度和增量降低可以是有益的。在将这样的细胞施用给人患者后，生产降低的PCSK9水平的祖细胞的存在是有益的。在某些情况中，个体的有效治疗会导致相对于治疗的个体中的总PCSK9而言至少约3%、5%或7%的PCSK9水平的降低。在某些实例中，PCSK9的降低将是总PCSK9的至少约10%。在某些实例中，PCSK9的降低将是总PCSK9的至少约20%至30%。类似地，甚至相对有限的具有显著降低的PCSK9水平的细胞亚群的引入可以在不同的患者中是有益的，因为在某些情况下，正常化的细胞将具有相对于患病细胞的选择性优点。但是，对于改善患者中的血脂异常的一个或多个方面，甚至不大水平的具有降低的PCSK9水平的祖细胞可以是有益的。在某些实例中，在给其施用这样的细胞的患者中约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%或更多的肝祖细胞正在生产降低的水平的PCSK9。
“施用”表示通过一定方法或途径将祖细胞组合物递送进个体中，所述方法或途径导致所述细胞组合物在期望的部位处的至少部分定位。可以通过导致在个体中的有效治疗的任意适当途径施用细胞组合物，即施用导致向个体中的期望位置的递送，其中递送的组合物的至少一部分(即至少1 x 104个细胞)被递送至期望部位一定的时间段。
在该方法的一个方面中，所述药物组合物可以经由诸如但不限于以下的途径施用：肠内(进入肠内)，肠胃，硬膜外(进入硬脑膜)，口服(通过口的方式)，透皮，硬膜外，脑内(进入大脑)，脑室内(进入脑室)，表皮(应用于皮肤上)，皮内(进入皮肤本身)，皮下(在皮肤下)，经鼻施用(通过鼻子)，静脉内(进入静脉)，静脉推注，静脉内滴注，动脉内(进入动脉)，肌肉内(进入肌肉)，心内(进入心脏)，骨内输注(进入骨髓)，鞘内(进入椎管)，腹膜内(输注或注入腹膜)，膀胱内输注，玻璃体内(通过眼睛)，腔内注射(进入病理腔)，腔内(进入阴茎的基部)，阴道内施用，子宫内，羊膜外施用，经皮(通过完整皮肤的扩散用于全身分布)，经粘膜(通过粘膜的扩散)，经阴道，吹入(鼻吸)，舌下，唇下，灌肠，滴眼(至结膜上)，入液耳剂中，耳(耳内或通过耳的方式)，颊(指向脸颊)，结膜，皮肤，牙齿(至一个或多个牙齿)，电渗，宫颈内，鼻窦内，气管内，体外，血液透析，浸润，间质，腹腔内，羊膜内，关节内，胆道内，支气管内，法氏囊内，软骨内(软骨内)，尾内(马尾内)，脑池内(小脑延髓池内)，角膜内(角膜内)，牙科角膜内，冠状动脉内(冠状动脉内)，阴茎海绵体内(在阴茎海绵体的可扩张空间内)，椎间盘内(椎间盘内)，导管内(腺管内)，十二指肠内(十二指肠内)，硬脑膜内(硬脑膜内或下方)，表皮内(至表皮)，食道内(至食道)，胃内(胃内)，牙龈内(牙龈内)，回肠内(小肠远端部分内)，病灶内(在局部病灶内或直接引入局部病灶)，腔内(管腔内)，淋巴内(淋巴内)，髓内(在骨的骨髓腔内)，脑膜内(脑膜内)，心肌内(心肌内)，眼内(眼内)，卵巢内(卵巢内)，心包内(心包内)，胸膜内(胸膜内)，前列腺内(前列腺内)，肺内(肺或其支气管内)，鼻内(鼻或眶周窦内)，脊柱内(脊柱内)，滑膜内(关节的滑膜腔内)，腱内(腱内)，睾丸内(睾丸内)，鞘内(在脑脊髓轴的任何水平处的脑脊液内)，胸内(胸内)，肾小管内(器官小管内)，肿瘤内(肿瘤内)，鼓室内(aurus media内)，血管内(一个或多个血管内)，心室内(心室内)，离子电渗(通过电流的方式，其中可溶性盐的离子迁移至身体的组织)，灌洗(洗涤或冲洗开放性伤口或体腔)，喉(直接在喉部上)，鼻胃(通过鼻子并进入胃)，闭塞包扎技术(局部途径施用，其然后遮盖区域的敷料覆盖)，眼(至外眼)，口咽部(直接至口腔和咽部)，肠胃外，经皮，关节周围，硬膜外，神经周，牙周，直肠，呼吸(通过经口或经鼻吸入在呼吸道内用于局部或全身作用)，球后(脑桥后或眼球后)，心肌内(进入心肌)，软组织，蛛网膜下，结膜下，粘膜下，局部，经胎盘(通过或跨过胎盘)，经气管(通过气管壁)，经鼓膜(跨过或通过鼓膜腔)，尿管(至尿管)，尿道(至尿道)，阴道，骶管阻滞，诊断，神经阻滞，胆道灌注，心脏灌注，光穿刺术和脊髓。
施用模式包括注射、输注、滴注和/或摄取。“注射”包括，但不限于，静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。在某些实例中，所述途径是静脉内的。对于细胞的递送，可以做出通过注射或输注实现的施用。
可以全身性地施用所述细胞。短语“全身施用”、“全身性地施用”、“周围施用”和“在周围施用”表示除了直接进入靶位置、组织或器官以外的祖细胞群体的施用，使得它替代性地进入个体的循环系统，并因而发生代谢和其它类似的过程。
熟练的临床医师可以确定包含用于治疗血脂异常的组合物的治疗的效力。但是，如果以有益的方式(例如，减少至少10%)改变PCSK9的任意一种或所有征象或症状(但是作为一个实例，其水平)，或改进或改善疾病的其它临床上接受的症状或标志物，认为治疗是“有效的治疗”。通过个体的恶化失败也可以测量效力，如通过住院治疗或对医学干预的需要所评估的(例如，疾病的进展被暂停或至少减慢)。本领域技术人员已知和/或本文描述了测量这些指标的方法。治疗包括个体或动物(一些非限制性实例包括人或哺乳动物)中的疾病的任何治疗，且包括：(1)抑制疾病，例如，阻止或减慢症状的进展；或(2)缓解疾病，例如，造成症状的消退；和(3)预防或减小症状发生的可能性。
根据本发明的治疗可以通过减少或改变个体中的PCSK9的量来改善一种或多种与血脂异常有关的症状。
V. 前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)基因的特征和特性
PCSK9与疾病和病症有关，所述疾病和病症诸如但不限于，无β脂蛋白血症，腺瘤，动脉硬化，动脉粥样硬化，心血管疾病，胆石症，冠状动脉硬化，冠心病，非胰岛素依赖性糖尿病，高胆固醇血症，家族性高胆固醇血症，高胰岛素血症，高脂血症，家族性合并高脂血症，低β脂蛋白血症，慢性肾脏衰竭，肝病，肝肿瘤，黑色素瘤，心肌梗塞，嗜睡症，肿瘤转移，肾母细胞瘤，肥胖，腹膜炎，弹性假黄瘤病，脑血管意外，血管疾病，黄瘤病，周围血管疾病，心肌缺血，血脂异常，葡萄糖耐量降低，黄瘤，多基因高胆固醇血症，继发性恶性肝脏肿瘤，痴呆，超重，丙型肝炎，慢性，颈动脉粥样硬化，IIa型高脂蛋白血症，颅内动脉粥样硬化，缺血性中风，急性冠状动脉综合征，主动脉钙化，心血管疾病，IIb型高脂蛋白血症，周围动脉疾病，II型家族性醛固酮过多症，家族性低脂蛋白血症，常染色体隐性高胆固醇血症，常染色体显性高胆固醇血症3，冠状动脉疾病，肝癌，缺血性脑血管意外，和动脉硬化性心血管病NOS。使用本文所述的任何方法编辑PCSK9基因可用于治疗、预防和/或减轻本文所述的疾病和病症的症状。
PCSK9的活性主要限于肝脏，且PCSK9与血脂异常、PCSK9相关的家族性高胆固醇血症、高胆固醇血症(家族性)、胃乳头状腺癌、纯合性家族性高胆固醇血症和鼻咽炎有关。PCSK9相关的家族性高胆固醇血症是一种遗传性疾病(常染色体显性)，其中由于缺乏低密度脂蛋白胆固醇的受体，机体发展危险的血液胆固醇水平。PCSK9相关的家族性高胆固醇血症影响全世界500个杂合性人中的1个至1,000,000个纯合性人中的1个，并且在南非白人、法裔加拿大人、黎巴嫩基督徒和芬兰人群中更常见。PCSK9相关的家族性高胆固醇血症的常见症状包括单独的低密度脂蛋白中含有或极低密度脂蛋白中也含有的循环胆固醇升高。PCSK9相关的家族性高胆固醇血症的当前治疗包括服用他汀类以抑制肝脏中的羟基甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA-还原酶)。用于治疗PCSK9相关的家族性高胆固醇血症的另一种选项是依泽替米贝，以抑制肠道中的胆固醇吸收。
血脂异常是一种遗传性疾病，其特征在于血液中脂质水平升高，其有助于动脉阻塞的发展(动脉粥样硬化)。这些脂质包括血浆胆固醇、甘油三酸酯或高密度脂蛋白。血脂异常增加心脏病发作、中风或其它循环系统忧虑的风险。目前的管控包括生活方式改变，诸如运动和饮食改变，以及降脂药物(诸如他汀类)的使用。非他汀类降脂药物包括胆汁酸螯合剂，胆固醇吸收抑制剂，用于纯合性家族性高胆固醇血症的药物，贝特类，烟酸，ω-3脂肪酸和/或组合产品。治疗选项通常取决于特定的脂质异常，尽管经常共同存在不同的脂质异常。儿童的治疗更有挑战性，因为可能难以实施饮食变化，并且尚未证明降脂疗法有效。
在一个实施方案中，本文所述的组合物和方法的靶组织是肝组织。
在一个实施方案中，所述基因是前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)，其也可以称为枯草杆菌蛋白酶/Kexin样蛋白酶PC9。PCSK9具有1p32.3的细胞遗传学位置，且基因组座标在染色体1上的正向链上的位置55,039,548-55,064,852处。PCSK9的核苷酸序列显示为SEQ ID NO:5,303。BSND是正向链上的PCSK9的上游基因，且RP11-101C11.1是正向链上的PCSK9的下游基因。PCSK9具有255738的NCBI基因ID，Q8NBP7的Uniprot ID，和ENSG00000169174的Ensembl基因ID。PCSK9具有2045个SNP，18个内含子和20个外显子。来自Ensembl的外显子标识符以及内含子和外显子的起始/终止位点显示于表3中。
表3. PCSK9的内含子和外显子
表4提供了基于Ensembl数据库的关于PCSK9基因的所有转录物的信息。表4中提供了来自Ensembl的转录物ID和该转录物的相应NCBI RefSeq ID，来自Ensembl的翻译ID和该蛋白的相应NCBI RefSeq ID，如通过Ensembl分类的转录物序列的生物型以及基于表3中的信息的转录物中的外显子和内含子。
表4. PCSK9的转录物信息
PCSK9具有2045个SNP，且该PCSK9基因的NCBI rs编号和/或UniProt 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在一个实例中，用于本发明中的导引RNA可以包含至少一个表5中列出的20个核苷酸(nt)靶核酸序列。表5中提供了基因符号和基因的序列标识符(基因SEQ ID NO)，包括靶基因的上游和/或下游的1-5个碱基对的基因序列(延伸的基因SEQ ID NO)和20 nt靶核酸序列(20 nt靶序列SEQ ID NO)。在序列表中，对于20 nt靶核酸序列(SEQ ID NO:5,305-28,696)的每一个描述各自的靶基因、用于靶向该基因的链(在序列表中通过(+)链或(-)链表示)、相关的PAM类型和PAM序列。在本领域中理解，间隔物序列(其中“T”是“U”)可以是对应于表5中列出的20 nt序列的RNA序列。
表 5. 核酸序列
基因符号 基因SEQ ID NO 延伸的基因SEQ ID NO 20 nt靶序列SEQ ID NO
PCSK9 5,303 5,304 5,305-28,696
在一个实施方案中，本发明中使用的导引RNA可以包含至少一个间隔物序列，所述间隔物序列(在“T”是“U”的情况下)可以是对应于20个核苷酸(nt)靶序列(诸如但不限于，SEQ ID NO:5,305-28,696中的任一个)的RNA序列。
在一个实施方案中，本发明中使用的导引RNA可以包含至少一个间隔物序列，所述间隔物序列(在“T”是“U”的情况下)是对应于20 nt序列(诸如但不限于，SEQ ID NO:5,305-28,696中的任一个)的RNA序列。
在一个实施方案中，导引RNA可以包含与PAM类型相关的20个核苷酸(nt)靶核酸序列，诸如但不限于，NAAAAC、NNAGAAW、NNGRRT、NNNNGHTT、NRG或YTN。作为一个非限制性实例，特定靶基因和特定PAM类型的20 nt靶核酸序列，在“T”是“U”的情况下，可以是对应于表6中的20 nt核酸序列中的任一个的RNA序列。
表6. 通过PAM类型的核酸序列
在一个实施方案中，导引RNA可以包含与YTN PAM类型相关的22个核苷酸(nt)靶核酸序列。作为一个非限制性实例，特定靶基因的22 nt靶核酸序列可以包含20 nt核序列，其中20 nt核序列，在“T”是“U”的情况下，可以是对应于SEQ ID NO:18,792-28,696的RNA序列。作为另一个非限制性实例，特定靶基因的22 nt靶核酸序列可以包含核心序列，其中核心序列，在“T”是“U”的情况下，可以是对应于SEQ ID NO:18,792-28,696中任一个的RNA序列的片段、区段或区域。
VI. 其它可能的治疗方案
使用经工程改造成靶向特定序列的核酸酶可以进行基因编辑。迄今为止，存在4大类核酸酶：大范围核酸酶和它们的衍生物、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化剂如效应物核酸酶(TALEN)、和CRISPR-Cas9核酸酶系统。核酸酶平台在设计难度、靶向密度和作用模式上存在差异，特别是因为ZFN和TALEN的特异性是通过蛋白-DNA相互作用，而RNA-DNA相互作用主要引导Cas9。
CRISPR内切核酸酶(诸如Cas9)可以用在本发明的方法中。但是，本文描述的教导，诸如治疗性靶位点，可以应用于内切核酸酶的其它形式，诸如ZFN、TALEN、HE或MegaTAL，或使用核酸酶的组合。但是，为了将本发明的教导应用于这样的内切核酸酶，人们尤其需要工程改造针对特定靶位点的蛋白。
可以将另外的结合结构域与Cas9蛋白融合以增加特异性。这些构建体的靶位点可以映射至鉴别出的gRNA指定的位点，但是可以需要另外的结合基序，诸如针对锌指结构域。在Mega-TAL的情况下，可以将大范围核酸酶与TALE DNA-结合结构域融合。大范围核酸酶结构域可以增加特异性和提供切割。类似地，可以将失活的或死的Cas9 (dCas9)与切割结构域融合，并且需要sgRNA/Cas9靶位点和融合的DNA-结合结构域的邻近结合位点。这可能需要除了催化失活以外的dCas9的某种蛋白质工程，以减少在没有另外的结合位点时的结合。
锌指核酸酶
锌指核酸酶(ZFN)是包含与II型内切核酸酶FokI的催化结构域连接的、经工程改造的锌指DNA结合结构域的模块蛋白。因为FokI仅作为二聚体起作用，必须将一对ZFN工程改造成结合相反DNA链上的同源靶“半位点”序列且在它们之间具有精确间距以使催化活性的FokI二聚体能够形成。在FokI结构域(其本身不具有序列特异性)的二聚化后，在ZFN半位点之间产生DNA双链断裂作为基因组编辑中的开始步骤。
每种ZFN的DNA结合结构域通常包含丰富的Cys2-His2体系结构的3-6个锌指，每个指主要识别靶DNA序列的一条链上的核苷酸的三联体，尽管与第四个核苷酸的交叉链相互作用也可以是重要的。在与DNA发生关键接触的位置中的指的氨基酸的改变会改变给定指的序列特异性。因而，四指锌指蛋白将选择性地识别12碱基对靶序列，其中所述靶序列是每个指做出贡献的三联体偏好的复合物，尽管三联体偏好可以在不同程度上受邻近指影响。ZFN的一个重要方面是，简单地通过修饰各个指可以将它们容易地重新靶向至几乎任意基因组地址，尽管也需要大量专家经验才能实现该目的。在ZFN的大多数应用中，使用4-6个指的蛋白，分别识别12-18个碱基对。因此，一对ZFN通常识别24-36个碱基对的组合靶序列，不包括半位点之间的典型的5-7个碱基对间隔物。所述结合位点可以被更大间隔物(包括15-17个碱基对)进一步隔开。该长度的靶序列可能是在人基因组中独有的，假定在设计过程中不包括重复序列或基因同系物。尽管如此，ZFN蛋白-DNA相互作用在它们的特异性方面不是绝对的，所以靶外结合和切割事件实际会发生，无论是作为两个ZFN之间的异源二聚体，还是作为一种或其它ZFN的同源二聚体。已经如下有效地消除了后一种可能性：工程改造FokI结构域的二聚化界面以建立“正”和“负”变体，也被称作专性异源二聚体变体，其可以仅彼此二聚化，且不与自身二聚化。强制专性异源二聚体会阻止同源二聚体的形成。这已经极大地增强了ZFN以及采用这些FokI变体的任意其它核酸酶的特异性。
在本领域中已经描述了多种基于ZFN的系统，正式报道了其修改，且众多参考文献描述了用于指导ZFN的设计的规则和参数；参见，例如，Segal等人,Proc Natl Acad Sci USA 96(6):2758-63 (1999)；Dreier B等人,J Mol Biol. 303(4):489-502 (2000)；Liu Q等人,J Biol Chem. 277(6):3850-6 (2002)；Dreier等人,J Biol Chem 280(42):35588-97 (2005)；和Dreier等人,J Biol Chem. 276(31):29466-78 (2001)。
转录活化剂-样效应物核酸酶(TALEN)
TALEN代表模块核酸酶的另一种形式，由此与ZFN一样，经工程改造的DNA结合结构域连接至FokI核酸酶结构域，且一对TALEN以串联方式运行以实现靶向的DNA裂解。与ZFN的主要差别是DNA结合结构域的性质和有关的靶DNA序列识别性能。TALEN DNA结合结构域源自TALE蛋白，其最初描述在植物细菌性病原体黄单胞菌属(Xanthomonas sp.)中。TALE包含33-35个氨基酸重复序列的串联阵列，每个重复序列识别通常具有多达20个碱基对长度的靶DNA序列中的单个碱基对，从而产生多达40个碱基对的总靶序列长度。通过刚好包括在位置12和13处的2个氨基酸的重复可变二残基(RVD)确定每个重复序列的核苷酸特异性。碱基鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶主要被四种RVD分别识别：Asn-Asn、Asn-Ile、His-Asp和Asn-Gly。这构成比锌指简单得多的识别代码，且因而代表就核酸酶设计而言胜过后者的一个优点。尽管如此，与ZFN一样，TALEN的蛋白-DNA相互作用在它们的特异性方面不是绝对的，且TALEN还已经受益于FokI结构域的专性异源二聚体变体用于减小靶外活性的用途。
已经制备了FokI结构域的另外变体，其在它们的催化功能方面被失活。如果TALEN或ZFN对的一半含有无活性的FokI结构域，那么仅单链DNA裂解(产生切口)将发生在靶位点，而不是DSB。所述结果与CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1“切口酶”突变体的应用相当，在后者中所述Cas9切割结构域之一已经被失活。DNA切口可以用于驱动通过HDR进行的基因组编辑，但是以比使用DSB更低的效率。主要益处是，不同于DSB(其易于发生NHEJ介导的错误修复)，靶外切口被快速地和准确地修复。
在本领域中已经描述了多种基于TALEN的系统，且正式报道了其修改；参见，例如，Boch, Science 326(5959):1509-12 (2009)；Mak等人,Science 335(6069):716-9(2012)；和Moscou等人,Science 326(5959):1501 (2009)。多个小组已经描述了基于“Golden Gate”平台的TALEN或克隆方案的应用；参见，例如，Cermak等人,Nucleic Acids Res. 39(12):e82 (2011)；Li等人,Nucleic Acids Res. 39(14):6315-25(2011)；Weber等人,PLoS One. 6(2):e16765 (2011)；Wang等人,J Genet Genomics 41(6):339-47, 2014年5月17日电子公开(2014)；和Cermak T等人,Methods Mol Biol. 1239:133-59 (2015)。
归巢内切核酸酶
归巢内切核酸酶(HE)是具有长识别序列(14-44个碱基对)并以高特异性(经常在基因组所特有的位点)切割DNA的序列特异性的内切核酸酶。存在至少6个通过它们的结构分类的已知HE家族，包括GIY-YIG、His-Cis box、H-N-H、PD-(D/E)xK和Vsr-样，它们源自宽范围的宿主，包括真核生物、原生生物、细菌、古细菌、蓝细菌和噬菌体。与ZFN和TALEN一样，HE可以用于在靶基因座处建立DSB作为基因组编辑的初始步骤。另外，一些天然的和经工程改造的HE仅切割DNA的单链，由此作为位点特异性的切口酶起作用。HE的大靶序列和它们提供的特异性已经使它们成为有吸引力的建立位点特异性的DSB的候选物。
在本领域中已经描述了多种基于HE的系统，且正式报道了其修改；参见，例如，Steentoft等人,Glycobiology 24(8):663-80 (2014); Belfort和Bonocora, Methods Mol Biol. 1123:1-26 (2014); Hafez和Hausner, Genome 55(8):553-69 (2012)的综述；和其中引用的参考文献。
MegaTAL/Tev-mTALEN/MegaTev
作为杂合核酸酶的其它实例，MegaTAL平台和Tev-mTALEN平台使用TALE DNA结合结构域和催化活性的HE的融合体，利用TALE的可调节的DNA结合和特异性，以及HE的切割序列特异性；参见，例如，Boissel等人, NAR 42: 2591-2601 (2014)；Kleinstiver等人,G3 4:1155-65 (2014)；和Boissel和Scharenberg, Methods Mol. Biol. 1239: 171-96(2015)。
在另一种变体中，MegaTev体系结构是大范围核酸酶(Mega)与源自GIY-YIG归巢内切核酸酶I-TevI的核酸酶结构域(Tev)的融合体。所述两个活性部位在DNA底物上的位置间隔~30个碱基对，并产生两种具有不相容的粘性末端的DSB；参见，例如，Wolfs等人,NAR 42,8816-29 (2014)。预见到，现有的基于核酸酶的方案的其它组合将演化，并且可用于实现本文描述的靶向基因组修饰。
dCas9-FokI或dCpf1-Fok1和其它核酸酶
组合上述的核酸酶平台的结构和功能性质会提供另一个基因组编辑方案，其可以潜在地克服一些固有缺陷。作为一个实例，CRISPR基因组编辑系统通常使用单一Cas9内切核酸酶来建立DSB。靶向的特异性由导引RNA中的20或24个核苷酸序列驱动，所述序列发生与靶DNA (在来自化脓链球菌的Cas9的情况下，加上相邻NAG或NGG PAM序列中的另外2个碱基)的沃森-克里克碱基配对。这样的序列具有足以在人基因组中为独特的长度，但是，RNA/DNA相互作用的特异性不是绝对的，有时会耐受显著的混乱，特别是在靶序列的5’半中，从而有效地减小驱动特异性的碱基的数目。其一个解决方案已经是将Cas9或Cpf1催化功能完全地失活- 仅保留RNA引导的DNA结合功能-和替代性地将FokI结构域与失活的Cas9融合；参见，例如，Tsai等人, Nature Biotech 32: 569-76 (2014)；和Guilinger等人,Nature Biotech. 32: 577-82 (2014)。因为FokI必须二聚化才能变成催化活性的，需要两个导引RNA才能连接紧密靠近的两个FokI融合体以形成二聚体和切割DNA。这基本上使组合的靶位点中的碱基数目翻倍，由此增加基于CRISPR的系统的靶向严谨性。
作为其它实例，TALE DNA结合结构域与催化活性的HE(诸如I-TevI)的融合利用了TALE的可调节的DNA结合和特异性，以及I-TevI的切割序列特异性，例外是，可以进一步减少靶外切割。
VII. 试剂盒
本发明提供了用于实现本文所述的方法的试剂盒。试剂盒可以包括以下一种或多种：靶向基因组的核酸，编码靶向基因组的核酸的多核苷酸，定位多肽，编码定位多肽的多核苷酸，和/或实现本文所述的方法的方面所需的任何核酸或蛋白性分子，或它们的任意组合。
试剂盒可以包含：(1)载体，其包含编码靶向基因组的核酸的核苷酸序列，(2)定位多肽或载体，其包含编码定位多肽的核苷酸序列，和(3)用于重构和/或稀释所述载体和/或多肽的试剂。
试剂盒可以包含：(1)载体，其包含(i)编码靶向基因组的核酸的核苷酸序列，和(ii)编码定位多肽的核苷酸序列，和(2)用于重构和/或稀释所述载体的试剂。
在以上试剂盒中，所述试剂盒可以包含靶向基因组的单分子导引核酸。在以上试剂盒中，所述试剂盒可以包含靶向基因组的双分子核酸。在以上试剂盒中，所述试剂盒可以包含两种或更多种双分子导引或单分子导引。所述试剂盒可以包含编码靶向核酸的核酸的载体。
在以上试剂盒中, 所述试剂盒可以进一步包含要插入以实现期望的遗传修饰的多核苷酸。
试剂盒的组分可以是在单独的容器中，或被组合在单个容器中。
上述的试剂盒可以进一步包含一种或多种另外的试剂，其中这样的另外的试剂选自缓冲液、用于将多肽或多核苷酸引入细胞中的缓冲液、洗涤缓冲液、对照试剂、对照载体、对照RNA多核苷酸、用于从DNA体外生产多肽的试剂、用于测序的衔接子等。缓冲液可以是稳定缓冲液、重构缓冲液、稀释缓冲液等。试剂盒还可以包含一种或多种组分，其可以用于促进或增强内切核酸酶对DNA的在靶结合或切割，或改善靶向的特异性。
除了上述组分以外，试剂盒还可以包含关于使用所述试剂盒的组分来实践所述方法的说明书。关于实践所述方法的说明书可以记录在合适的记录介质上。例如，所述说明书可以印刷在衬底(诸如纸或塑料)等上。所述说明书可以作为包装说明书呈现在试剂盒中，在所述试剂盒或其组分的容器的标签中(即，伴随所述包装或分包装)，等。所述说明书可以作为电子存储数据文件呈现，所述电子存储数据文件存在于合适的计算机可读的存储介质(例如CD-ROM、软盘、闪存等)上。在某些情况下，实际的说明书没有存在于试剂盒中，但是可以提供关于从遥远来源得到说明书的方式(例如经由因特网)。该情况的一个实例是包含网址的试剂盒，在所述网址可以浏览说明书和/或从所述网址可以下载说明书。与说明书一样，关于得到说明书的该方式可以记录在合适的衬底上。
VIII. 本发明的具体方法和组合物
因此，本发明具体地涉及以下非限制性的根据本发明的方法：在第一种方法(方法1)中，本发明提供了用于通过基因组编辑在细胞中编辑前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin9型(PCSK9)基因的方法，其包括以下步骤：将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入细胞以实现PCSK9基因或PCSK9调节元件之内或附近的一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致PCSK9基因之内或附近的至少一个核苷酸的一个或多个永久性插入、缺失或突变，由此减少或消除PCSK9基因产物的表达或功能。
在另一种方法(方法2)中，本发明提供了用于治疗具有PCSK9相关的病况或病症的患者的离体方法，其包括以下步骤：从患者分离肝细胞；在肝细胞的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列之内或附近进行编辑；和将经基因组编辑的肝细胞植入患者。
在另一种方法(方法3)中，本发明提供了方法2的方法，其中所述编辑步骤包括将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入肝细胞以实现PCSK9基因或PCSK9调节元件之内或附近的一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致PCSK9基因之内或附近的至少一个核苷酸的一个或多个永久性插入、缺失或突变，由此减少或消除PCSK9基因产物的表达或功能。
在另一种方法(方法4)中，本发明提供了用于治疗具有PCSK9相关的病况或病症的患者的离体方法，其包括以下步骤：产生患者特异性的诱导的多能干细胞(iPSC)；在iPSC的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列之内或附近进行编辑；将经基因组编辑的iPSC分化为肝细胞；和将肝细胞植入患者。
在另一种方法(方法5)中，本发明提供了方法4的方法，其中所述编辑步骤包括将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入iPSC以实现PCSK9基因或PCSK9调节元件之内或附近的一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致PCSK9基因之内或附近的至少一个核苷酸的一个或多个永久性插入、缺失或突变，由此减少或消除PCSK9基因产物的表达或功能。
在另一种方法(方法6)中，本发明提供了用于治疗具有PCSK9相关的病况或病症的患者的离体方法，其包括以下步骤：从所述患者分离间充质干细胞；在间充质干细胞的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列之内或附近进行编辑；将经基因组编辑的间充质干细胞分化为肝细胞；和将肝细胞植入患者。
在另一种方法(方法7)中，本发明提供了方法6的方法，其中所述编辑步骤包括将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入间充质干细胞以实现PCSK9基因或PCSK9调节元件之内或附近的一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致PCSK9基因之内或附近的至少一个核苷酸的一个或多个永久性插入、缺失或突变，由此减少或消除PCSK9基因产物的表达或功能。
在另一种方法(方法8)中，本发明提供了用于治疗具有PCSK9相关的病症的患者的体内方法，其包括以下步骤：编辑患者的细胞中的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)基因。
在另一种方法(方法9)中，本发明提供了方法8的方法，其中所述编辑步骤包括将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入细胞以实现PCSK9基因或PCSK9调节元件之内或附近的一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致PCSK9基因之内或附近的至少一个核苷酸的一个或多个永久性插入、缺失或突变，由此减少或消除PCSK9基因产物的表达或功能。
在另一种方法(方法10)中，本发明提供了方法8-9中任一项的方法，其中所述细胞是肝细胞。
在另一种方法(方法11)中，本发明提供了方法10的方法，其中通过局部注射、全身输注或其组合将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶递送至肝细胞。
在另一种方法(方法12)中，本发明提供了改变细胞中的PCSK9基因的连续基因组序列的方法，其包括使细胞与一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶接触以实现一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)。
在另一种方法(方法13)中，本发明提供了方法12的方法，其中连续基因组序列的改变发生在PCSK9基因的一个或多个外显子中。
在另一种方法(方法14)中，本发明提供了方法1-13中任一项的方法，其中一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶选自SEQ ID NO:1-620中所列的那些中的任一种，和与SEQ ID NO:1-620中所列的那些中的任一种具有至少70%同源性的变体。
在另一种方法(方法15)中，本发明提供了方法14的方法，其中所述一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶是一种或多种蛋白或多肽。
在另一种方法(方法16)中，本发明提供了方法14的方法，其中所述一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶是编码一种或多种DNA内切核酸酶的一种或多种多核苷酸。
在另一种方法(方法17)中，本发明提供了方法16的方法，其中所述一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶是编码一种或多种DNA内切核酸酶的一种或多种核糖核酸(RNA)。
在另一种方法(方法18)中，本发明提供了方法17的方法，其中所述一种或多种核糖核酸(RNA)是一种或多种化学修饰的RNA。
在另一种方法(方法19)中，本发明提供了方法18的方法，其中所述一种或多种核糖核酸(RNA)在编码区中被化学修饰。
在另一种方法(方法20)中，本发明提供了方法16-19中任一项的方法，其中所述一种或多种多核苷酸或一种或多种核糖核酸(RNA)是密码子优化的。
在另一种方法(方法21)中，本发明提供了方法1-20中任一项的方法，其中所述方法进一步包括将一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA引入细胞。
在另一种方法(方法22)中，本发明提供了方法21的方法，其中一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA包含与PCSK9基因的编码序列的区段互补的间隔物序列。
在另一种方法(方法23)中，本发明提供了方法21-22中任一项的方法，其中所述一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA是化学修饰的。
在另一种方法(方法24)中，本发明提供了方法21-23中任一项的方法，其中将一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA与一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶预复合。
在另一种方法(方法25)中，本发明提供了方法24的方法，其中所述预复合涉及一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA与一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶的共价连接。
在另一种方法(方法26)中，本发明提供了方法14-25中任一项的方法，其中将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶配制于脂质体或脂质纳米颗粒中。
在另一种方法(方法27)中，本发明提供了方法21-25中任一项的方法，其中将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶配制于脂质体或脂质纳米颗粒中，所述脂质体或脂质纳米颗粒还包含一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA。
在另一种方法(方法28)中，本发明提供了方法12或21-22中任一项的方法，其中在AAV载体颗粒中编码所述一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶，其中AAV载体血清型选自表4和5中列出的那些。
在另一种方法(方法29)中，本发明提供了方法21-22中任一项的方法，其中在AAV载体颗粒中编码所述一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA，其中AAV载体血清型选自表4和5中列出的那些。
在另一种方法(方法30)中，本发明提供了方法21-22中任一项的方法，其中在AAV载体颗粒中编码一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶，所述AAV载体颗粒还编码一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA，其中AAV载体血清型选自表4和5中列出的那些。
本发明还提供了组合物(组合物1)，其包含单分子导引RNA，所述单分子导引RNA包含至少一个间隔物序列，所述间隔物序列是对应于SEQ ID NO:5,305-28,696中任一个的RNA序列。
在另一种组合物(组合物2)中，本发明提供了组合物1的单分子导引RNA，其中所述单分子导引RNA进一步包含间隔物延伸区。
在另一种组合物(组合物3)中，本发明提供了组合物1的单分子导引RNA，其中所述单分子导引RNA进一步包含tracrRNA延伸区。
在另一种组合物(组合物4)中，本发明提供了组合物1-3的单分子导引RNA，其中所述单分子导引RNA是化学修饰的。
在另一种组合物(组合物5)中，本发明提供了非天然存在的CRISPR/Cas系统，其包含编码Cas9或Cpf1酶的多核苷酸和至少一种组合物1-4的单分子导引RNA。
在另一种组合物(组合物6)中，本发明提供了组合物5的CRISPR/Cas系统，其中编码Cas9或Cpf1酶的多核苷酸选自化脓链球菌Cas9、金黄色葡萄球菌Cas9、脑膜炎奈瑟氏菌Cas9、嗜热链球菌CRISPR1 Cas9、嗜热链球菌CRISPR 3 Cas9、齿密螺旋体Cas9、L. bacterium ND2006 Cpf1和氨基酸球菌属物种BV3L6 Cpf1以及与这些酶具有至少70%同源性的变体。
在另一种组合物(组合物7)中，本发明提供了组合物6的CRISPR/Cas系统，其中编码Cas9或Cpf1酶的多核苷酸包含一个或多个核定位信号(NLS)。
在另一种组合物(组合物8)中，本发明提供了组合物7的CRISPR/Cas系统，其中至少一个NLS在编码Cas9或Cpf1酶的多核苷酸的氨基末端的50个氨基酸处或之内，和/或至少一个NLS在编码Cas9或Cpf1酶的多核苷酸的羧基末端的50个氨基酸处或之内。
在另一种组合物(组合物9)中，本发明提供了组合物8的CRISPR/Cas系统，其中将编码Cas9或Cpf1酶的多核苷酸进行密码子优化用于在真核细胞中表达。
在另一种组合物(组合物10)中，本发明提供了编码组合物1-3的单分子导引RNA的DNA。
在另一种组合物(组合物11)中，本发明提供了编码组合物7-9的CRISPR/Cas系统的DNA。
在另一种组合物(组合物12)中，本发明提供了包含10或11的组合物的DNA的载体。
在另一种组合物(组合物13)中，本发明提供了组合物12的载体，其中所述载体是质粒。
在另一种组合物(组合物14)中，本发明提供了组合物12的载体，其中所述载体是AAV载体颗粒，且所述AAV载体血清型选自SEQ ID NO:1-620和表2中列出的那些。
IX. 定义
术语“包含”或“包括”参考本发明必要的组合物、方法及其各自的组成部分来使用，并且无论是否必要都仍然对未指定的要素保持开放。
术语“基本上由……组成”表示给定的方面要求的那些要素。该术语允许存在不会实质上影响本发明方面的基础的和新颖的或功能性的特征的额外要素。
术语”由……组成”表示本文所述的组合物、方法及其各自的组成部分，其排除在该方面的描述中没有列出的任何要素。
单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式，除非上下文另外清楚地指明。
本文中呈现的某些数值在前面具有术语“约”。术语“约”是指在列举的数值的±10%内的数值。
本发明的一个或多个实施方案的细节在下面的随附描述中阐明。尽管与本文描述的那些相似或等效的任何材料和方法都可以用于本发明的实践或测试中，但现在描述优选的材料和方法。本发明的其它特征、目的和优点将从说明书显而易见。在说明书中，单数形式也包括复数形式，除非上下文另有明确规定。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。在冲突的情况下，将以本说明书为准。
在本说明书中引用的任何数值范围描述包括在所述范围内的相同数值精度(即，具有相同数目的指定数字)的所有子范围。例如，所述范围“ 1.0至10.0”描述所述最小值1.0和所述最大值10.0之间(且包括端值)的所有子范围，诸如例如“ 2.4至7.6”，即使在说明书的文本中没有明确描述“ 2.4至7.6”的范围。因此，申请人保留修改本说明书(包括权利要求)以明确列举包括在本说明书中明确描述的范围内的相同数值精度的任何子范围的权利。在本说明书中固有地描述所有这样的范围，使得修改以明确地描述任何这样的子范围将符合书面描述、描述的充分性和超范围要求，包括35 U.S.C. § 112(a)和第123(2)EPC条下的要求。另外，除非明确说明或上下文另外要求，本说明书中描述的所有数字参数(诸如表示值、范围、数量、百分比等的那些)都可以读作好像前置词语“约”，即使“约”一没有明确地出现在数字之前。另外，应该根据报告的有效数字的数量、数值精度以及通过应用普通的舍入技术来解释本说明书中描述的数值参数。还应理解，在本说明书中描述的数值参数将必然具有用于确定参数的数值的基础测量技术的固有可变性特征。
本发明的一个或多个方面的细节在下面的随附描述中阐明。尽管与本文描述的那些相似或等效的任何材料和方法都可以用于本发明的实践或测试中，但现在描述优选的材料和方法。本发明的其它特征、目的和优点将从说明书显而易见。在说明书中，单数形式也包括复数形式，除非上下文另有明确规定。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在冲突的情况下，将以本说明书为准。
通过以下非限制性实施例进一步举例说明本发明。
X. 实施例
通过参考下述实施例将更充分地理解本发明，下述实施例提供了本发明的示例性的非限制性方面。
所述实施例描述了CRISPR系统作为示例性基因组编辑技术用于在PSCK9基因中建立确定的治疗性基因组缺失、插入或替换(在本文中称作“基因组修饰”)的用途，所述治疗性基因组缺失、插入或替换导致PSCK9基因的永久缺失或突变，其降低或消除PSCK9蛋白活性。确定的治疗性修饰的引入代表血脂异常的潜在改善的新颖治疗策略，如本文中所述和解释的。
实施例1 – PCSK9基因的CRISPR/SpCas9靶位点
针对靶位点扫描PCSK9基因的区域。针对具有序列NRG的原间隔物邻近基序(PAM)扫描每个区域。然后鉴别出与PAM对应的gRNA 20 bp间隔物序列，如在序列表的SEQ ID NO 7,270-18,791中所示。
实施例2 – PCSK9基因的CRISPR/SaCas9靶位点
针对靶位点扫描PCSK9基因的区域。针对具有序列NNGRRT的原间隔物邻近基序(PAM)扫描每个区域。然后鉴别出与PAM对应的gRNA 20 bp间隔物序列，如在序列表的SEQ ID NO:5,546-6,579中所示。
实施例3 – PCSK9基因的CRISPR/StCas9靶位点
针对靶位点扫描PCSK9基因的区域。针对具有序列NNAGAAW的原间隔物邻近基序(PAM)扫描每个区域。然后鉴别出与PAM对应的gRNA 20 bp间隔物序列，如在序列表的SEQ ID NO:5,366-5,545中所示。
实施例4 – PCSK9基因的CRISPR/TdCas9靶位点
针对靶位点扫描PCSK9基因的区域。针对具有序列NAAAAC的原间隔物邻近基序(PAM)扫描每个区域。然后鉴别出与PAM对应的gRNA 20 bp间隔物序列，如在序列表的SEQ ID NO:5,305-5,365中所示。
实施例5 – PCSK9基因的CRISPR/NmCas9靶位点
针对靶位点扫描PCSK9基因的区域。针对具有序列NNNNGATT的原间隔物邻近基序(PAM)扫描每个区域。然后鉴别出与PAM对应的gRNA 20 bp间隔物序列，如在序列表的SEQ ID NO:6,580-7,269中所示。
实施例6 – PCSK9基因的CRISPR/Cpf1靶位点
针对靶位点扫描PCSK9基因的区域。针对具有序列TTN或YTN的原间隔物邻近基序(PAM)扫描每个区域。然后鉴别出与PAM对应的gRNA 22 bp间隔物序列，如在序列表的SEQ ID NO:18,792-28,696中所示。
实施例7 -导引链的生物信息学分析
然后在单一过程或多步过程中筛选和选择候选导引，所述单一过程或多步过程涉及在靶和靶外位点处的理论结合和通过实验评估的活性。作为举例说明，为了评估在目标位置以外的染色体位置处的效应的可能性，使用如在下面更详细地描述和举例说明的可用于评估靶外结合的多种生物信息学工具中的一种或多种，可以针对它们在具有类似序列的靶外位点处切割的潜力评估这样的候选导引：其具有使特定在靶位点(诸如在PCSK9基因内的位点)与邻近PAM匹配的序列。
然后可以通过实验来评估据预测具有相对较低的靶外活性潜力的候选物以测量它们的在靶活性，然后测量在不同位点处的靶外活性。优选的导引具有足够高的在靶活性以在选定的基因座处达到期望的基因编辑水平，并具有相对较低的靶外活性以减小在其它染色体基因座处的改变的可能性。在靶活性与靶外活性的比率经常被称作导引的“特异性”。
对于预测的靶外活性的初期筛选，存在许多已知的且和公众可得到的生物信息学工具，其可以用于预测最可能的靶外位点；且由于与CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1核酸酶系统中的靶位点的结合由互补序列之间的沃森-克里克碱基配对驱动，不同性的程度(和因此减少的靶外结合潜力)基本上与以下基本序列差异有关：错配和凸起物，即改变成非互补碱基的碱基，和相对于靶位点在潜在靶外位点中的碱基的插入或缺失。一种被称作COSMID(具有错配、插入和缺失的CRISPR靶外位点) (可在网络上在crispr.bme.gatech.edu得到)的示例性生物信息学工具编译这样的相似性。其它生物信息学工具包括、但不限于autoCOSMID、和CCTop。
使用生物信息学使靶外切割最小化以便减小突变和染色体重排的有害作用。在CRISPR/Cas9系统上的研究提示，由导引链与具有碱基对错配和/或凸起物的DNA序列(特别是在远离PAM区域的位置处)的非特异性杂交引起的高靶外活性的可能性。因此，重要的是具有这样的生物信息学工具：其可以鉴别除了碱基对错配以外还具有在RNA导引链和基因组序列之间的插入和/或缺失的潜在靶外位点。基于靶外预测算法CCTop的生物信息学工具被用于针对潜在CRISPR靶外位点来检索基因组(CCTop可在网络上在crispr.cos.uni-heidelberg.de/得到)。输出基于错配的数目和位置的潜在靶外位点的排序列表，从而允许靶位点的更知情选择，并避免具有更可能的靶外切割的位点的应用。
采用了另外的生物信息学方式(pipelines)，其权衡一个区域中的gRNA靶向位点的估计在靶和/或靶外活性。可以用于预测活性的其它特征包括关于目标细胞类型、DNA可达性、染色质状态、转录因子结合位点、转录因子结合数据和其它CHIP-seq数据的信息。权衡另外的因素，其预测编辑效率(诸如gRNA对的相对位置和方向)、局部序列特征和微-同源性。
初始评估和导引设计集中于外显子1-3和内含子1-3的外显子-内含子连接附近的400-500bp序列。初始生物信息学分析鉴定出大约650个CRISPR/Cas9靶序列。
考虑到其脱靶位点的预测数目和位置，产生优先的导引物列表用于基于体外转录的导引物筛选。该列表是用于基于其在Pcsk9序列内的位置进行筛选的进一步优先的gRNA；优择靶向5'外显子的gRNA。基于上述过程，选择192个导引物用于体外导引物筛选。
外显子序列内的gRNA可用于通过蛋白序列的改变和/或蛋白的截短来产生插入/缺失，导致蛋白功能的丧失。5’UTR序列中的gRNA可以单独使用，或与外显子内的gRNA组合使用，以去除翻译起始位点并防止蛋白合成。内含子中的gRNA可以单独使用，或与外显子内的gRNA组合使用，以去除剪接供体和受体位点，导致截短的蛋白的产生和随后功能的丧失。外显子1内的gRNA和上游序列可用于去除转录和/或翻译起始位点。
然后考虑到其脱靶位点的预测数目和位置，优选192个导引物(表7)用于基于体外转录的导引物筛选方案。还优选gRNA用于基于其在Pcsk9序列内的位置进行筛选；优选靶向5'外显子的gRNA用于IVT筛选。
外显子序列内的gRNA可用于通过蛋白序列的改变和/或蛋白的截短来产生插入/缺失，导致蛋白功能的丧失。内含子1序列中的gRNA可以单独使用，或与外显子内的gRNA组合使用，以去除翻译起始位点并防止蛋白合成。内含子中的gRNA可以单独使用，或与外显子内的gRNA组合使用，以去除剪接供体和受体位点，导致截短的蛋白的产生和随后功能的丧失。
在选择导引物中使用以下注意考量：1)删除外显子1(两个导引物)或在编码序列的5’末端处产生移框可用于破坏Pcsk9功能。在内含子1中存在用起始位点注释的重叠lncRNA。选择在内含子1内的变体2的起始位点之外的几个导引物：这些可以充当对照，以确保干扰此转录物不引起有害影响。2)根据UCSC基因组浏览器hg38装配物，从Pcsk9基因座产生的非编码变体RNA中不存在外显子2和3。3)已在人中的外显子3中鉴定出无义、剪接受体和剪接供体突变(参见例如ExAC数据库-Broad Institute)。包括该外显子中的许多导引物用于筛选。4) 5’ UTR、外显子1、内含子1、外显子2和内含子2中的导引物可用于安全港(safe harbor)应用。
实施例8–针对在靶活性在细胞中测试优选导引
为了鉴定能够编辑同源DNA靶区域的大范围的gRNA对，进行体外转录(IVT) gRNA筛选。将相关的基因组序列提交用于使用gRNA设计软件进行分析。如上所述，基于序列的独特性(仅筛选基因组中其它地方没有完美匹配的gRNA)和最少的预测靶标，将所得的gRNA列表缩小至gRNA的选择列表。体外转录该gRNA集合，并使用Lipofectamine MessengerMAX转染至组成型表达Cas9的HEK293T细胞中。转染后48小时收获细胞，分离基因组DNA，并使用TIDE分析评估切割效率。(图2-4)。
在培养的细胞中追踪具有显著活性的gRNA，以测量PCSK9中的基因编辑。可以再次追踪脱靶事件。可以转染多种细胞，并测量基因校正水平和可能的脱靶事件。这些实验允许核酸酶的优化以及供体设计和递送。
表7. HEK293T细胞中的gRNA序列和切割效率
实施例9–针对靶外活性在细胞中测试优选导引
除了其它方法以外，将使用杂交捕获测定、GUIDE Seq和全基因组测序针对靶外活性测试在以上实施例中IVT筛选的具有最佳在靶活性的gRNA。
实施例10 - gRNA的筛选
使用CCTop方案(Stemmer, M., Thumberger, T., del Sol Keyer, M., Wittbrodt,J. 和Mateo, J.L. CCTop: an intuitive, flexible and reliable CRISPR/Cas9 target prediction tool. PLOS ONE (2015). doi:10.1371/journal.pone.0124633)使用PCSK9区域(chr1:55,040,222-55,064,853)来设计20-核苷酸识别位点以设计靶向不同外显子的gRNA。与野猪(Sus scrofa)和食蟹猴(Macaca fascicularis)的PCSK9外显子高度同源的间隔物(包括gRNA的标准：存在NGG PAM，间隔物序列的第1个或第2个位置不超过1个错配)。经设计与人、猕猴和猪交叉反应的23种gRNA购自Integrated DNA Technologies(Alt-R™ CRISPR crRNA)。
在组成性地表达Cas9的HuH7细胞(被慢病毒转导)中测试gRNA的活性，图5。将1万个细胞/孔(96-孔板)铺板，并在铺板后16-18h内转染，简而言之，根据生产商的方案将gRNA与Lipofectamine® RNAiMAX (ThermoFisher Scientific)一起温育，最终gRNA量为130ng。将细胞与gRNA-Lipofectamine复合物一起在补充了10%FBS的、包含DMEM的完全培养基中温育48h。根据生产商的方案在prepGEM™ (ZyGem NX Ltd)中裂解细胞。
通过Tracking of Indels by Decomposition(TIDE)分析(Brinkman EK, ChenT, Amendola M, van Steensel B. Easy quantitative assessment of genome editingby sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 2014 Dec 16;42(22):e168.doi: 10.1093/nar/gku936)来分析gRNA的效率，简而言之，使用KAPA HiFi PCR Kit使用基因组DNA作为PCR模板。
使用AxyPrep Mag PCR清理试剂盒(Axygen)纯化PCR扩增子。将扩增子测序并使用分解算法分析。将gRNA活性测量为邻近预测的S.py. Cas9切割位点(即，在非靶链上在PAM(NGG)的上游核苷酸-4和-3之间，和在靶链上在PAM互补序列(CCN)的下游3-4个核苷酸之间)的具有不同插入/缺失(1-50个核苷酸的插入，或1-50个核苷酸的缺失)的等位基因的比率。gRNA的活性列出在表8中。
该研究表明，靶向PCSK9外显子1的1个导引物和靶向PCSK9外显子-18的1个导引物具有高于60%的体外插入/缺失效率。
表8
实施例11 –原代肝细胞中的靶向PCSK9的gRNA的交叉反应活性
该实施例表明在通过Lipofectamine转染Cas9:gRNA复合物敲除的从猪、食蟹猴和人供体分离的原代肝细胞中的PCSK9 gRNA的有效交叉反应活性。
将从猪(BioreclamationIVT)、食蟹猴(In Vitro ADMET Laboratories)和人(InVitro ADMET Laboratories)分离的原代肝细胞以0.35X106个细胞/孔铺板于24-孔I型胶原包被的板(Corning Biocoat Collagen I Multiwell Plates, 目录号356408)中的汇合单层中，并在37℃下于5% CO2中在InVitroGRO培养铺板培养基(BioreclamationIVT,Z990003)中温育。铺板后3-5小时，用与Cas9 mRNA复合的P9-1 gRNA或P9-18 gRNA转染肝细胞单层。根据制造商的方案，使用Lipofectamine MessengerMax以200ng的最终gRNA量进行gRNA的转染。还用Lipofectamine MessengerMax在Cas9和gRNA复合物不存在的情况下转染肝细胞以产生“ MOCK”样品。转染后16小时，将细胞培养基变为新鲜的InVitroGRO培养基，并与gRNA-Lipofectamine复合物温育48小时，此时根据制造商的方案将其在prepGEM(ZyGem)中裂解。
通过TIDE分析用Cas9和PCSK9gRNA转染的肝细胞和模拟转染子(对照组)。TIDE分析显示，PCSK9导引RNA P9-1和PCSK9 P9-18两者在从猪、猴和人分离的原代肝细胞中均具有活性(参见图6A-6B)。尽管P9-1和P9-18在HuH7细胞中表现出大于60%切割效率，但仅P9-1在原代人肝细胞中表现出相似的切割效率(~60%)。此外，与P9-18相比，P9-1显示更好的跨物种活性；P9-1 gRNA表现出跨物种和物种内更高的插入/缺失频率。
实施例12 –基因编辑的原代人肝细胞中的PCSK9蛋白分泌
本实施例表明原代人肝细胞中通过P9-1 gRNA的有效基因编辑与分泌的PCSK9蛋白的减少之间的相关性。
将原代人肝细胞(In Vitro ADMET Laboratories)以0.35X106个细胞/孔铺板于24-孔I型胶原包被的板(Corning Biocoat Collagen I Multiwell Plates, 目录号356408)中的汇合单层中，并在37℃下于5% CO2中在InVitroGRO培养铺板培养基(BioreclamationIVT, Z990003)中温育。铺板后3-5小时，用与Cas9 mRNA复合的P9-1 gRNA或hC3 gRNA (hC3靶序列:TGGGACTCCCCAGAGCCAGG (SEQ ID NO:28,732)。hC3是无关的gRNA，其有效地敲除人C3基因，但不编辑PCSK9基因)转染肝细胞单层。根据制造商的方案，使用Lipofectamine MessengerMax以200ng的最终gRNA量进行gRNA的转染。还用Lipofectamine MessengerMax在Cas9和gRNA复合物不存在的情况下转染肝细胞以产生“MOCK”样品。转染后16小时，细胞培养基变为新鲜InVitroGRO培养基。将样品与gRNA-脂质体复合物温育48小时，此时收集上清液用于PCSK9蛋白分析，并根据制造商的方案在prepGEM(ZyGem)中裂解细胞。
通过TIDE分析用Cas9和P9-1 gRNA或Cas9和hC3 gRNA转染的肝细胞和模拟转染子(对照组)。TIDE分析显示，PCSK9由P9-1 gRNA(插入/缺失~60%)编辑，而不是由hC3 gRNA编辑，如所预期。同时，hC3有效地编辑C3基因，其中在同一人供体中插入/缺失频率为~65%(分别为图7A和7B)。
用于人PCSK9蛋白的夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)(BioLegend, Legend MAX™人PCSK9 ELISA试剂盒，目录号443107)用于检测从“ MOCK”和基因编辑的样品收集的上清液中的PCSK9的浓度。该研究揭示，“ MOCK”样品中PCSK9的平均水平为~11ng/ml，并且对于从hC3基因编辑的肝细胞收集的上清液为~9ng/mL的类似水平。相比之下，来自揭示P9-1gRNA对PCSK9的~60%基因编辑的原代肝细胞的上清液含有小于1ng/mL的PCSK9蛋白，PCSK9蛋白水平相对于对照组显著降低(图7C)。该研究表明，PCSK9基因的有效编辑导致原代肝细胞中分泌的PCSK9蛋白的功能降低。
实施例13 –相关动物模型中的体内测试
在已评价CRISPR-Cas9/导引组合之后，将在动物模型中体内测试先导制剂。
在先导选择之后，将gRNA和Cas9复合物配制成脂质纳米颗粒用于递送。
选择杂合的LDLR+/-猪作为高胆固醇血症(特征在于胆固醇的血浆浓度升高、随后动脉粥样硬化加速)的模型。用于PCSK9抑制的单克隆抗体疗法已显示降低具有熟悉高胆固醇血症的患者中的LDL-胆固醇，其显现于在LDLR中具有功能丧失突变的患者中。
将与Cas9 mRNA和P9-1 gRNA复合的脂质纳米颗粒注入猪中，并在给药后的第一天每小时并在7天的范围中每三天收集全血样品。对照组包括注入盐水的动物。还进行给药前、基线全血收集。
在整个研究中监测体重，并监测血浆和血清样品的细胞因子和补体活化(炎性应答)和临床脂质组(总胆固醇、HDL、LDL-C和甘油三酸酯)。在7天完成时，收集肝组织并评价PCSK9基因的基因编辑。
将来自对照和给药动物两者的肝组织均质化，并通过TIDE分析进行分析用于证明有效的PCSK9基因编辑。
在研究过程中的TIDE分析和脂质化学的结果将在插入/缺失频率与胆固醇水平改变(其中强调LDL-C的降低)之间产生相关性。
XI. 等效方案和范围
仅仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或者能够确定根据本文所述的本发明的具体实施方案的许多等效方案。本发明的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求中所述。
如果组成员中的一个、多于一个或全部在给定产品或过程中存在、采用或与给定产品或过程另外相关，则包括在组中的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述被认为是满足的，除非有相反的指示或另外从上下文显而易见。本发明包括其中恰好该组的一个成员在给定产品或过程中存在、采用或与给定产品或过程另外相关的实施方案。本发明包括其中多于一个或整个组成员在给定产品或过程中存在、采用或与给定产品或过程另外相关的实施方案。
此外，应当理解，落入现有技术内的本发明的任何具体实施方案可以明确地从权利要求中的任何一项或多项中排除。由于这样的实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，所以即使在本文中未明确提出排除，也可以将其排除。本发明的组合物的任何具体实施方案(例如，任何抗生素、治疗或活性成分；任何生产方法；任何使用方法；等)都可以出于任何原因从任何一项或多项权利要求中排除，无论是否与现有技术的存在有关。
应当理解，已使用的词语是描述性而非限制性的词语，并且可以在所附权利要求的范围内进行改变，而不脱离其更广泛方面的本发明的真实范围和精神。
尽管已经关于几个描述的实施方案以一定长度且以一些细节描述本发明，但并不意图将其限于任何这样的细节或实施方案或任何具体实施方案，但应参考所附权利要求书解释，以鉴于现有技术提供对这样的权利要求的最广泛的可能解释，且因此有效地涵盖本发明的预期范围。
关于示例性实施例的注解
尽管为了举例说明本发明的不同方面和/或它的潜在应用的目的本发明提供了不同具体方面的描述，但是应当理解，本领域技术人员会做出变化和修改。因此，本文描述的一项或多项发明应当理解为至少象声明的它们一样宽，并且不象本文提供的特定示例性方面那样更狭窄地限定。
除非另有说明，否则在本文中指出的任何专利、出版物或其它公开材料通过引用以其整体并入本说明书，但是仅仅就并入的材料不与在本说明书中明确地阐述的现有描述、定义、陈述或其它公开材料冲突而言。因此，且就必要而言，在本说明书中阐述的明确公开内容替代通过引用并入的任何冲突材料。被说成通过引用并入本说明书、但是与在本文中阐述的现有定义、陈述或其它公开材料冲突的任何材料或其部分仅仅就在并入的材料和现有公开材料之间不产生冲突而言并入。申请人保留修改本说明书以明确地列举通过引用并入本文的任何主题或其部分的权利。

Claims (41)

1.用于通过基因组编辑在细胞中编辑前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)基因的方法，其包括以下步骤：将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入细胞以实现PCSK9基因或PCSK9调节元件之内或附近的一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致PCSK9基因之内或附近的至少一个核苷酸的一个或多个永久性插入、缺失或突变，由此减少或消除PCSK9基因产物的表达或功能。
2.用于治疗具有PCSK9相关的病况或病症的患者的离体方法，其包括以下步骤：
（a）从患者分离肝细胞；
（b）在肝细胞的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列之内或附近进行编辑；和
（c）将所述基因组编辑的肝细胞植入患者。
3.权利要求2的方法，其中所述编辑步骤包括将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入肝细胞以实现PCSK9基因或PCSK9调节元件之内或附近的一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致PCSK9基因之内或附近的至少一个核苷酸的一个或多个永久性插入、缺失或突变，由此减少或消除PCSK9基因产物的表达或功能。
4.用于治疗具有PCSK9相关的病况或病症的患者的离体方法，其包括以下步骤：
（a）产生患者特异性的诱导的多能干细胞(iPSC)；
（b）在iPSC的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列之内或附近进行编辑；
（c）将经基因组编辑的iPSC分化为肝细胞；和
（d）将所述肝细胞植入患者。
5.权利要求4的方法，其中所述编辑步骤包括将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入iPSC以实现PCSK9基因或PCSK9调节元件之内或附近的一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致PCSK9基因之内或附近的至少一个核苷酸的一个或多个永久性插入、缺失或突变，由此减少或消除PCSK9基因产物的表达或功能。
6.用于治疗具有PCSK9相关的病况或病症的患者的离体方法，其包括以下步骤：
（a）从所述患者分离间充质干细胞；
（b）在间充质干细胞的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)基因或编码PCSK9基因的调节元件的其它DNA序列之内或附近进行编辑；
（c）将经基因组编辑的间充质干细胞分化为肝细胞；和
（d）将肝细胞植入患者。
7.权利要求6的方法，其中所述编辑步骤包括将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入间充质干细胞以实现PCSK9基因或PCSK9调节元件之内或附近的一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致PCSK9基因之内或附近的至少一个核苷酸的一个或多个永久性插入、缺失或突变，由此减少或消除PCSK9基因产物的表达或功能。
8.用于治疗具有PCSK9相关的病症的患者的体内方法，其包括以下步骤：编辑患者的细胞中的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)基因。
9.权利要求8的方法，其中所述编辑步骤包括将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入细胞以实现PCSK9基因或PCSK9调节元件之内或附近的一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致PCSK9基因之内或附近的至少一个核苷酸的一个或多个永久性插入、缺失或突变，由此减少或消除PCSK9基因产物的表达或功能。
10.权利要求8-9中任一项的方法，其中所述细胞是肝细胞。
11.权利要求10的方法，其中通过局部注射、全身输注或其组合将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶递送至肝细胞。
12.改变细胞中的PCSK9基因的连续基因组序列的方法，其包括使所述细胞与一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶接触以实现一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)。
13.权利要求12的方法，其中连续基因组序列的改变发生在PCSK9基因的一个或多个外显子中。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶选自SEQ ID NO:1-620中所列的那些中的任一种，和与SEQ ID NO:1-620中所列的那些中的任一种具有至少70%同源性的变体。
15.权利要求14的方法，其中所述一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶是一种或多种蛋白或多肽。
16.权利要求14的方法，其中所述一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶是编码一种或多种DNA内切核酸酶的一种或多种多核苷酸。
17.权利要求16的方法，其中所述一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶是编码一种或多种DNA内切核酸酶的一种或多种核糖核酸(RNA)。
18.权利要求17的方法，其中所述一种或多种核糖核酸(RNA)是一种或多种化学修饰的RNA。
19.权利要求18的方法，其中所述一种或多种核糖核酸(RNA)在编码区中被化学修饰。
20.权利要求16-19中任一项的方法，其中所述一种或多种多核苷酸或一种或多种核糖核酸(RNA)是密码子优化的。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述方法进一步包括将一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA引入细胞。
22.权利要求21的方法，其中所述一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA包含与PCSK9基因之内或附近的DNA序列互补的间隔物序列。
23.权利要求21的方法，其中所述一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA包含与侧接PCSK9基因的序列或编码PCSK9基因的调节元件的其它序列互补的间隔物序列。
24.权利要求21-23中任一项的方法，其中所述一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA是化学修饰的。
25.权利要求21-24中任一项的方法，其中将所述一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA与一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶预复合。
26.权利要求25的方法，其中所述预复合涉及所述一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA与一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶的共价连接。
27.权利要求14-26中任一项的方法，其中将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶配制于脂质体或脂质纳米颗粒中。
28.权利要求21-26中任一项的方法，其中将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶配制于脂质体或脂质纳米颗粒中，所述脂质体或脂质纳米颗粒还包含一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA。
29.权利要求12或21-23中任一项的方法，其中在AAV载体颗粒中编码所述一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶，其中所述AAV载体血清型选自SEQ ID NO:4,734-5,302和表2中列出的那些。
30.权利要求21-23中任一项的方法，其中在AAV载体颗粒中编码所述一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA，其中所述AAV载体血清型选自SEQ ID NO:4,734-5,302和表2中列出的那些。
31.权利要求21-23中任一项的方法，其中在AAV载体颗粒中编码一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶，所述AAV载体颗粒还编码一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA，其中所述AAV载体血清型选自SEQ ID NO:4,734-5,302和表2中列出的那些。
32.单分子导引RNA，其包含至少一个间隔物序列，所述间隔物序列是对应于SEQ IDNO:5,305-28,696中任一个的RNA序列。
33.权利要求32的单分子导引多核苷酸，其中所述单分子导引多核苷酸进一步包含间隔物延伸区。
34.权利要求32的单分子导引多核苷酸，其中所述单分子导引多核苷酸进一步包含tracrRNA延伸区。
35.权利要求32-34的单分子导引多核苷酸，其中所述单分子导引多核苷酸是化学修饰的。
36.权利要求32-35中任一项的单分子导引RNA，其与RNA内切核酸酶预复合。
37.权利要求36的单分子导引RNA，其中所述DNA内切核酸酶是Cas9或Cpf1内切核酸酶。
38.权利要求37的单分子导引RNA，其中所述Cas9或Cpf1内切核酸酶选自化脓链球菌Cas9、金黄色葡萄球菌Cas9、脑膜炎奈瑟氏菌Cas9、嗜热链球菌CRISPR1 Cas9、嗜热链球菌CRISPR 3 Cas9、齿密螺旋体Cas9、L. bacterium ND2006 Cpf1和氨基酸球菌属物种BV3L6Cpf1以及与所述酶具有至少70%同源性的变体。
39.权利要求38的单分子导引RNA，其中所述Cas9或Cpf1内切核酸酶包含一个或多个核定位信号(NLS)。
40.权利要求39的单分子导引RNA，其中至少一个NLS在所述Cas9或Cpf1内切核酸酶的氨基末端的50个氨基酸处或之内，和/或至少一个NLS在所述Cas9或Cpf1内切核酸酶的羧基末端的50个氨基酸处或之内。
41.编码权利要求31-34中任一项的单分子导引RNA的DNA。
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