CN111727251A - 用于治疗常染色体显性色素性视网膜炎的材料和方法 - Google Patents

用于治疗常染色体显性色素性视网膜炎的材料和方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供了用于离体和体内治疗具有常染色体显性RP的患者的材料和方法；用于在人细胞中编辑RHO基因的材料和方法；以及用于在人细胞中编辑RHO基因中的P23H突变的材料和方法。此外，本申请提供了一种或多种用于编辑RHO基因的gRNA或sgRNA；一种或多种用于编辑RHO基因中的P23H突变的gRNA或sgRNA；以及包含至少一种或多种用于编辑RHO基因中的P23H突变的gRNA或sgRNA的治疗剂。本申请提供了用于治疗具有常染色体显性RP的患者的治疗剂。本申请提供了用于治疗具有常染色体显性RP的患者的试剂盒。此外，本申请提供了自失活CRISPR‑Cas系统。

Description

用于治疗常染色体显性色素性视网膜炎的材料和方法
领域
本申请提供了用于离体和体内治疗具有常染色体显性色素性视网膜炎(RP)的患者的材料和方法。
相关申请
本申请要求2017年11月21日提交的美国临时申请号62/589,111；2018年3月28日提交的美国临时申请号62/649,133；2018年7月2日提交的美国临时申请号62/693,080；以及2018年8月29日提交的美国临时申请号62/724,319(其全部以其整体通过引用并入本文)的益处。
通过引用并入序列表
本申请含有计算机可读形式的序列表(文件名：170621PCT序列表：10,127,343字节 --ASCII文本文件；在2018年11月15日创建)，其以其整体通过引用并入，并且形成本公开的一部分。
背景
色素性视网膜炎(RP)是一种罕见的遗传性疾病，其涉及视网膜中的细胞分解和丢失，所述视网膜是衬在眼后的光敏组织。常见症状包括夜视困难和周围视力丧失。
多种服务和装置可用于帮助具有与RP相关的视力丧失的人实施日常活动并维持其独立性。然而，甚至用这些服务和装置，对于具有RP的个体，生活可以是挑战性的。
尽管世界上的研究人员和医学专业人员已经做出努力来尝试解决RP，仍然存在对开发RP的安全且有效的治疗的关键性需要。
概述
本公开呈现改善常染色体显性RP的新型方法。该新型方法靶向RHO基因中的突变，诸如P23H突变，并且该新型方法可以用少至单次处理减少或消除P23H突变体等位基因在蛋白水平的表达。所得疗法可以改善常染色体显性RP的作用或完全消除常染色体显性RP。
本文提供了用于在人细胞中编辑RHO基因的方法。所述方法包括向所述人细胞中引入一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶，以在RHO基因或编码RHO基因的调节元件的其他DNA序列内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致一个或多个突变的表达或功能的永久缺失、插入、校正或调节，所述突变在RHO基因内或附近或影响RHO基因的表达或功能，由此产生编辑的人细胞。
本文还提供了用于在人细胞中编辑RHO基因中的P23H突变的方法。所述方法包括：向所述人细胞中引入一种或多种DNA核酸内切酶，以在RHO基因中的P23H突变内或附近实现一个或多个SSB或DSB，其导致P23H突变的表达或功能的永久缺失、插入、校正或调节，由此产生编辑的人细胞。
本文还提供了用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法。所述方法包括：在患者的细胞中编辑RHO基因中的P23H突变。
本文还提供了一种或多种向导核糖核酸(gRNA)，其用于在来自具有常染色体显性RP的患者的细胞中编辑RHO基因中的P23H突变。所述一种或多种gRNA包含间隔物序列，其选自序列表的SEQ ID NO:5287-5291、5319-5322和5358中的核酸序列。
本文还提供了用于治疗具有常染色体显性色素性视网膜炎的患者的治疗剂，所述治疗剂包含至少一种或多种用于编辑RHO基因中的P23H突变的gRNA。所述一种或多种gRNA包含选自间隔物序列，其序列表的SEQ ID NO:5287-5291、5319-5322和5358中的核酸序列。
本文还提供了用于治疗具有常染色体显性RP的患者的治疗剂，所述治疗剂通过包括以下的方法形成：引入一种或多种DNA核酸内切酶；引入一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA用于编辑RHO基因中的P23H突变；和任选地引入一种或多种供体模板。所述一种或多种gRNA或sgRNA包含间隔物序列，其选自序列表的SEQ ID NO:5287-5291、5319-5322和5358中的核酸序列。
本文还提供了用于体内治疗具有常染色体显性RP的患者的试剂盒。所述试剂盒包含一种或多种用于编辑RHO基因中的P23H突变的gRNA或sgRNA、一种或多种DNA核酸内切酶；和任选地，一种或多种供体模板。所述一种或多种gRNA或sgRNA包含间隔物序列，其选自序列表的SEQ ID NO:5287-5291、5319-5322和5358中的核酸序列。
本文还提供了包含SEQ ID NO:5287的核酸序列的单分子向导RNA (sgRNA)。
本文还提供了包含SEQ ID NO:5288的核酸序列的单分子向导RNA (sgRNA)。
本文还提供了包含SEQ ID NO:5289的核酸序列的单分子向导RNA (sgRNA)。
本文还提供了包含SEQ ID NO:5290的核酸序列的单分子向导RNA (sgRNA)。
本文还提供了包含SEQ ID NO:5291的核酸序列的单分子向导RNA (sgRNA)。
本文还提供了包含SEQ ID NO:5319的核酸序列的单分子向导RNA (sgRNA)。
本文还提供了包含SEQ ID NO:5320的核酸序列的单分子向导RNA (sgRNA)。
本文还提供了包含SEQ ID NO:5321的核酸序列的单分子向导RNA (sgRNA)。
本文还提供了包含SEQ ID NO:5322的核酸序列的单分子向导RNA (sgRNA)。
本文还提供了包含SEQ ID NO:5358的核酸序列的单分子向导RNA (sgRNA)。
本文还提供了包含SEQ ID NO:5290和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列的单分子向导RNA (sgRNA)。
本文还提供了包含SEQ ID NO:5291和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列的单分子向导RNA (sgRNA)。
本文还提供了包含SEQ ID NO:5319和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列的单分子向导RNA (sgRNA)。
本文还提供了包含SEQ ID NO:5320和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列的单分子向导RNA (sgRNA)。
本文还提供了包含SEQ ID NO:5321和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列的单分子向导RNA (sgRNA)。
本文还提供了包含SEQ ID NO:5322和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列的单分子向导RNA (sgRNA)。
本文还提供了包含SEQ ID NO:5358和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列的单分子向导RNA (sgRNA)。
本文还提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQID NO:5287的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQID NO:5288的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQID NO:5289的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQID NO:5290的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQID NO:5291的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQID NO:5319的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQID NO:5320的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQID NO:5321的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQID NO:5322的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQID NO:5358的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQID NO:5290和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQID NO:5291和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQID NO:5319和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQID NO:5320和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQID NO:5321和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQID NO:5322和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQID NO:5358和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5287的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5288的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5289的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5290的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5291的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5319的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5320的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5321的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5322的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5358的gRNA或sgRNA。
本文还提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用gRNA或sgRNA，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO:5290和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
本文还提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用gRNA或sgRNA，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO:5291和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
本文还提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用gRNA或sgRNA，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO:5319和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
本文还提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用gRNA或sgRNA，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO:5320和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
本文还提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用gRNA或sgRNA，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO:5321和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
本文还提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用gRNA或sgRNA，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO:5322和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
本文还提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用gRNA或sgRNA，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO:5358和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
本文还提供了自失活CRISPR-Cas系统。所述自失活CRISPR-Cas系统包含第一区段、第二区段和一个或多个第三区段。所述第一区段包含编码诱导定点诱变的多肽的核苷酸序列。所述第二区段包含编码向导RNA (gRNA)或单分子向导RNA (sgRNA)的核苷酸序列，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO:5290。一个或多个第三区段包含自失活(SIN)位点。所述gRNA或sgRNA与SIN位点基本上互补。所述gRNA或sgRNA与基因组靶标序列基本上互补。
本文还提供了自失活CRISPR-Cas系统。所述自失活CRISPR-Cas系统包含第一区段、第二区段和一个或多个第三区段。所述第一区段包含编码诱导定点诱变的多肽的核苷酸序列。所述第二区段包含编码向导RNA (gRNA)或单分子向导RNA (sgRNA)的核苷酸序列，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO:5291。一个或多个第三区段包含自失活(SIN)位点。所述gRNA或sgRNA与SIN位点基本上互补。所述gRNA或sgRNA与基因组靶标序列基本上互补。
本文还提供了自失活CRISPR-Cas系统。所述自失活CRISPR-Cas系统包含第一区段、第二区段和一个或多个第三区段。所述第一区段包含编码SaCas9或其任何变体的核苷酸序列。所述第二区段包含编码gRNA或sgRNA的核苷酸序列。一个或多个第三区段包含自失活(SIN)位点。所述gRNA或sgRNA与SIN位点基本上互补。所述gRNA或sgRNA与基因组靶标序列基本上互补。所述SIN位点包含选自SEQ ID NO:5313-5314的序列。
应理解，本说明书中描述的发明不限于本概述中所概述的实例。本文描述和例举各种其他方面。
附图简述
通过参考附图可以更好地理解在本说明书中公开和描述的用于治疗RP的材料和方法的不同方面，在附图中：
图1A-B描绘II型CRISPR/Cas系统。
图1A描绘包括gRNA的II型CRISPR/Cas系统。
图1B描绘包括sgRNA的II型CRISPR/Cas系统。
图2A-C显示10种sgRNA序列各自的靶标DNA序列、单一向导RNA (sgRNA)序列和sgRNA结合的靶标DNA序列的反向链。
图2A显示10种sgRNA序列各自的靶标DNA序列。
图2B显示10种sgRNA序列各自的单一向导RNA (sgRNA)序列。
图2C显示10种sgRNA序列各自的sgRNA结合的靶标DNA序列的反向链。
图2D-F显示4种sgRNA序列各自的靶标DNA序列、单一向导RNA (sgRNA)序列和sgRNA结合的靶标DNA序列的反向链。
图2D显示4种sgRNA序列各自的靶标DNA序列。
图2E显示4种sgRNA序列各自的单一向导RNA (sgRNA)序列。
图2F显示4种sgRNA序列各自的sgRNA结合的靶标DNA序列的反向链。
图2G-I显示1种sgRNA序列的靶标DNA序列、单一向导RNA (sgRNA)序列和sgRNA结合的靶标DNA序列的反向链。
图2G显示1种sgRNA序列的靶标DNA序列。
图2H显示1种sgRNA序列的单一向导RNA (sgRNA)序列。
图2I显示1种sgRNA序列的sgRNA结合的靶标DNA序列的反向链。
图3描述靶向野生型视紫红质基因的gRNA的靶上编辑效率和靶向突变体P23H视紫红质基因的sgRNA的靶外编辑效率。
图4描述靶向突变体P23H视紫红质基因的sgRNA的靶上和靶外编辑效率。
图5A-D描绘SIN-AAV SaCas9版本1 (sEF1α启动子)、SIN-AAV SaCas9版本2 (sEF1α启动子)、非-SIN-AAV SaCas9 (sEF1α启动子)以及pSIA010和pSIA011的AAV序列的结构安排。
图5A描绘SIN-AAV SaCas9版本1 (sEF1α启动子)的结构安排。
图5B描绘SIN-AAV SaCas9版本2 (sEF1α启动子)的结构安排。
图5C描绘非-SIN-AAV SaCas9 (sEF1α启动子)的结构安排。
图5D描绘pSIA010和pSIA011的AAV序列的结构安排。pSIA010是包含编码包含SEQID NO:5290的sgRNA的AAV序列的质粒。pSIA011是包含编码包含SEQ ID NO:5291的sgRNA的AAV序列的质粒。
图6A-N显示用以下共转染的2种不同的HEK 293FT报告细胞系的流式细胞术数据：pSIA010，包含编码P23H 20-聚体sgRNA(包含SEQ ID NO:5290的sgRNA)的AAV序列的质粒，或pSIA011，包含编码P23H 19-聚体sgRNA(包含SEQ ID NO:5291的sgRNA)的AAV序列的质粒，以及(1) SIN-AAV SaCas9版本1 (sEF1α启动子)，(2) SIN- AAV SaCas9版本2 (sEF1α启动子)，或(3)非-SIN-AAV SaCas9 (sEF1α启动子)。
图6A显示具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点并用(1) pSIA010和(2) SIN-AAVSaCas9版本1 (sEF1α)共转染的HEK 293FT报告细胞的流式细胞术数据。
图6B显示具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点并用(1) pSIA011和(2) SIN-AAVSaCas9版本1 (sEF1α)共转染的HEK 293FT报告细胞的流式细胞术数据。
图6C显示具有P23H突变作为Cas9靶标位点并用(1) pSIA010和(2) SIN-AAVSaCas9版本1 (sEF1α)共转染的HEK 293FT报告细胞的流式细胞术数据。
图6D显示具有P23H突变作为Cas9靶标位点并用(1) pSIA011和(2) SIN-AAVSaCas9版本1 (sEF1α)共转染的HEK 293FT报告细胞的流式细胞术数据。
图6E显示具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点并用(1) pSIA010和(2) SIN-AAVSaCas9版本2 (sEF1α)共转染的HEK 293FT报告细胞的流式细胞术数据。
图6F显示具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点并用(1) pSIA011和(2) SIN-AAVSaCas9版本2 (sEF1α)共转染的HEK 293FT报告细胞的流式细胞术数据。
图6G显示具有P23H突变作为Cas9靶标位点并用(1) pSIA010和(2) SIN-AAVSaCas9版本2 (sEF1α)共转染的HEK 293FT报告细胞的流式细胞术数据。
图6H显示具有P23H突变作为Cas9靶标位点并用(1) pSIA011和(2) SIN-AAVSaCas9版本2 (sEF1α)共转染的HEK 293FT报告细胞的流式细胞术数据。
图6I显示具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点并用(1) pSIA010和(2) 非-SIN-AAV SaCas9 (sEF1α)共转染的HEK 293FT报告细胞的流式细胞术数据。
图6J显示具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点并用(1) pSIA011和(2) 非-SIN-AAV SaCas9 (sEF1α)共转染的HEK 293FT报告细胞的流式细胞术数据。
图6K显示具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点且未用任何DNA转染的HEK 293FT报告细胞的流式细胞术数据。
图6L显示具有P23H突变作为Cas9靶标位点并用(1) pSIA010和(2)非-SIN-AAVSaCas9 (sEF1α)共转染的HEK 293FT报告细胞的流式细胞术数据。
图6M显示具有P23H突变作为Cas9靶标位点并用(1) pSIA011和(2)非-SIN-AAVSaCas9 (sEF1α)共转染的HEK 293FT报告细胞的流式细胞术数据。
图6N显示具有P23H突变作为Cas9靶标位点且未用任何DNA转染的HEK 293FT报告细胞的流式细胞术数据。
图7A-B显示用以下共转染的2种不同的HEK 293FT报告细胞系的western印迹数据：pSIA010，包含编码P23H 20-聚体sgRNA(包含SEQ ID NO:5290的sgRNA)的AAV序列的质粒，或pSIA011，包含编码P23H 19-聚体sgRNA(包含SEQ ID NO:5291的sgRNA)的AAV序列的质粒，以及(1) SIN-AAV SaCas9版本1 (sEF1α启动子)，(2) SIN- AAV SaCas9版本2 (sEF1α启动子)，或(3)非-SIN-AAV SaCas9 (sEF1α启动子)。
图7A是显示在具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点的HEK 293FT报告细胞中的SaCas9、肌动蛋白和GFP表达的western印迹。这些HEK 293FT报告细胞用pSIA010或pSIA011转染。HEK 293FT报告细胞还用(1) SIN-AAV SaCas9版本1 (sEF1α启动子)、(2) SIN-AAVSaCas9版本2 (sEF1α启动子)或(3)非-SIN-AAV SaCas9 (sEF1α启动子)转染。
图7B是显示在具有P23H突变作为Cas9靶标位点的HEK 293FT报告细胞中的SaCas9、肌动蛋白和GFP表达的western印迹。这些HEK 293FT报告细胞用pSIA010或pSIA011转染。HEK 293FT报告细胞还用(1) SIN-AAV SaCas9版本1 (sEF1α启动子)、(2) SIN-AAVSaCas9版本2 (sEF1α启动子)或(3)非-SIN-AAV SaCas9 (sEF1α启动子)转染。
图8描绘包含融合至蓝色荧光蛋白的Cas9靶标位点(野生型RHO基因或包含P23H突变的RHO基因)的供体质粒。
图9A-B显示经由同源性引导的修复(HDR)引入基因组DNA的P23H突变和人视紫红质基因的密码子23中的单核苷酸突变。
图9A显示经由HDR引入基因组DNA的P23H突变。
图9B显示人视紫红质基因的密码子23中的单核苷酸突变。
图10描述靶向野生型视紫红质基因的合成sgRNA的靶上/靶外编辑效率和靶向P23H突变视紫红质基因的合成sgRNA的靶上/靶外编辑效率。
图11描述靶向P23H突变体视紫红质基因的质粒编码的sgRNA的靶上/靶外编辑效率。
图12描述靶向P23H突变体视紫红质基因的质粒编码的sgRNA的靶上/靶外编辑效率。
图13显示体内实验，其中经由视网膜下注射将非-SIN AAV-SaCas9和pSIA010递送至P23H-hRHO-RFP小鼠和对照hRHO-GFP小鼠中。
序列表的简述
SEQ ID NO:1-612是Cas核酸内切酶直系同源物序列。
SEQ ID NO:613-4696是微RNA序列。
SEQ ID NO:4697-5265是AAV血清型序列。
SEQ ID NO:5266是RHO核苷酸序列。
SEQ ID NO:5267-5269显示SpCas9与之复合的样品sgRNA主链序列。
SEQ ID NO:5270是化脓链球菌Cas9核酸内切酶的样品向导RNA (gRNA)。
SEQ ID NO:5271显示按其结构分类的归巢核酸内切酶的已知家族。
SEQ ID NO:5272-5281是10种sgRNA序列各自的代表靶标DNA序列的序列。
SEQ ID NO:5282 - 5284是与化脓链球菌Cas9核酸内切酶一起，用于靶向RHO基因或编码RHO基因的调节元件的其他DNA序列内或附近的18-20 bp间隔物序列。
SEQ ID NO:5285 - 5286是与金黄色葡萄球菌Cas9核酸内切酶一起，用于靶向RHO基因或编码RHO基因的调节元件的其他DNA序列内或附近的19-20 bp间隔物序列。
SEQ ID NO:5287-5289是与化脓链球菌Cas9核酸内切酶一起，用于靶向RHO基因中的P23H突变内或附近的18-20 bp间隔物序列。
SEQ ID NO:5290-5291是用于与金黄色葡萄球菌Cas9核酸内切酶靶向RHO基因中的P23H突变内或附近的19-20 bp间隔物序列。
SEQ ID NO:5292-5301是代表10种sgRNA序列各自的代表sgRNA将结合的靶标DNA序列的反向链的序列。
SEQ ID NO:5302是包含SEQ ID NO:5287和5267的全长sgRNA。
SEQ ID NO:5303是包含SEQ ID NO:5288和5267的全长sgRNA。
SEQ ID NO:5304是包含SEQ ID NO:5289和5267的全长sgRNA。
SEQ ID NO:5305-5307不包括序列。
SEQ ID NO:5308是pSIA010，包含编码包含SEQ ID NO:5290和5327的sgRNA的AAV序列的质粒序列。
SEQ ID NO:5309是pSIA011，包含编码包含SEQ ID NO:5291和5327的sgRNA的AAV序列的质粒序列。
SEQ ID NO:5310是包含图5A中描绘的SIN-AAV SaCas9版本1 (sEF1α启动子)的质粒序列。
SEQ ID NO:5311是包含图5B中描绘的SIN-AAV SaCas9版本2 (sEF1α启动子)的质粒序列。
SEQ ID NO:5312是包含图5C中描绘的非-SIN-AAV SaCas9 (sEF1α启动子)的质粒序列。
SEQ ID NO:5313是位于图5A中描绘的SIN-AAV SaCas9版本1中的SaCas9 ORF的上游和图5B中描绘的SIN-AAV SaCas9版本2中的SaCas9 ORF的上游的可能的SIN位点(也称为P23H靶标位点)。
SEQ ID NO:5314是位于天然存在或嵌合插入的内含子内的可能的SIN位点(也称为P23H靶标位点)，所述内含子位于图5A中描绘的SIN-AAV SaCas9版本1或图5B中描绘的SIN-AAV SaCas9版本2中的SaCas9 ORF内。
SEQ ID NO:5315-5318是4种sgRNA序列各自的代表靶标DNA序列的序列。
SEQ ID NO:5319-5322是与金黄色葡萄球菌Cas9核酸内切酶一起，用于靶向跨RHO基因中的P23H突变的基因组序列的21-24 bp原间隔物序列。
SEQ ID NO:5323-5326是代表4种sgRNA序列各自的代表sgRNA将结合的靶标DNA序列的反向链的序列。
SEQ ID NO:5327-5338显示SaCas9与之复合的样品sgRNA主链序列。
SEQ ID NO:5339是pSIA010中的AAV序列。
SEQ ID NO:5340是pSIA011中的AAV序列。
SEQ ID NO:5341是SIN-AAV-SaCas9版本1 (GRK1)中的AAV序列。
SEQ ID NO:5342是SIN-AAV-SaCas9版本2 (GRK1)中的AAV序列。
SEQ ID NO:5343是与化脓链球菌Cas9核酸内切酶靶一起，用于向RHO基因内或附近以产生P23H突变体RHO细胞系的RNA原间隔物序列。
SEQ ID NO:5344是位于RHO基因内或附近的靶标DNA序列，其被靶向以产生P23H突变体RHO细胞系。
SEQ ID NO:5345是位于sgRNA将结合的RHO基因内或附近的靶标DNA序列的反向链。
SEQ ID NO:5346是用作用于同源性引导的修复的模板的单链DNA寡核苷酸。单链DNA寡核苷酸用于产生P23H突变体RHO细胞系。
SEQ ID NO:5347是用于在RHO基因的密码子23周围扩增的正向引物。
SEQ ID NO:5348是用于在RHO基因的密码子23周围扩增的反向引物。
SEQ ID NO:5349是包含SEQ ID NO:5285和5332的全长sgRNA。
SEQ ID NO:5350是包含SEQ ID NO:5286和5332的全长sgRNA。
SEQ ID NO:5351是包含SEQ ID NO:5290和5332的全长sgRNA。
SEQ ID NO:5352是包含SEQ ID NO:5291和5332的全长sgRNA。
SEQ ID NO:5353是包含SEQ ID NO:5319和5332的全长sgRNA。
SEQ ID NO:5354是包含SEQ ID NO:5320和5332的全长sgRNA。
SEQ ID NO:5355是包含SEQ ID NO:5321和5332的全长sgRNA。
SEQ ID NO:5356是包含SEQ ID NO:5322和5332的全长sgRNA。
SEQ ID NO:5357是代表1种sgRNA序列的靶标DNA序列的序列。
SEQ ID NO:5358是与金黄色葡萄球菌Cas9核酸内切酶一起，用于靶向包含RHO基因中的P23H突变的基因组序列的18bp RNA原间隔物序列。
SEQ ID NO:5359是1种sgRNA序列的代表sgRNA将结合的靶标DNA序列的反向链的序列。
SEQ ID NO:5360是包含SEQ ID NO:5358和5332的全长sgRNA。
SEQ ID NO:5361是编码包含SEQ ID NO:5358的sgRNA的质粒序列。
SEQ ID NO:5362是编码包含SEQ ID NO:5291的sgRNA的质粒序列。
SEQ ID NO:5363是编码包含SEQ ID NO:5290的sgRNA的质粒序列。
SEQ ID NO:5364是编码包含SEQ ID NO:5322的sgRNA的质粒序列。
SEQ ID NO:5365是编码包含SEQ ID NO:5321的sgRNA的质粒序列。
SEQ ID NO:5366是编码包含SEQ ID NO:5320的sgRNA的质粒序列。
SEQ ID NO:5367是编码包含SEQ ID NO:5319的sgRNA的质粒序列。
详述
治疗方法
本文提供的方法，无论是细胞方法、离体方法还是体内方法，均可以涉及以下中的一种或组合：1)经由通过由于非同源末端连接(NHEJ)产生的插入或缺失而在RHO基因的P23H突变体等位基因中引入移框突变，在蛋白水平降低或消除P23H突变体等位基因的表达；2)通过HDR校正RHO基因中的P23H突变；或3)将RHO cDNA敲入RHO基因基因座或安全港基因座。
NHEJ移框策略可涉及用一种或多种CRISPR核酸内切酶和gRNA(例如，crRNA +tracrRNA或sgRNA)诱导RHO基因中的P23H突变内或附近的一个单链断裂或双链断裂，或用两种或更多种CRISPR核酸内切酶和两种或更多种sgRNA诱导RHO基因中的P23H突变内或附近的两个或更多个单链断裂或双链断裂。该方法可以通过引起P23H突变体等位基因中的移框来防止P23H突变体等位基因的转录/合成。该方法利用对于RHO基因中的P23H突变特异性的gRNA或sgRNA。
HDR校正策略可涉及，在外源引入以引导对同源性引导的修复的细胞DSB响应的供体DNA模板存在的情况下，用一种或多种CRISPR核酸内切酶和gRNA(例如，crRNA +tracrRNA，或sgRNA)诱导RHO基因中的P23H突变内或附近的一个单链断裂或双链断裂，或用一种或多种CRISPR核酸内切酶(Cas9、Cpf1等)和两种或更多种sgRNA诱导RHO基因中的P23H突变内或附近的两个或更多个单链断裂或双链断裂。所述供体DNA模板可以是短单链寡核苷酸、短双链寡核苷酸、长单链或双链DNA分子。所述方法可以提供gRNA对，其通过对基因进行两次切割来进行缺失，一次gRNA切割在P23H突变的5'末端，且另一次gRNA切割在P23H突变的3'末端切割，其促进插入来自多核苷酸供体模板的新序列以替代RHO基因中的P23H突变。所述切割可以通过一对各自形成DSB的DNA核酸内切酶(在P23H突变的每个末端都有一个DSB)，或通过一起形成DSB的多个切口酶(在P23H突变的每个末端都有一个DSB)来完成。该方法利用对于RHO基因和供体DNA分子中的P23H突变特异性的gRNA或sgRNA。
敲入策略涉及使用gRNA(例如，crRNA + tracrRNA，或sgRNA)或一对靶向所述RHO基因的第一个或其他外显子和/或内含子上游或所述RHO基因的第一个或其他外显子和/或内含子中或安全港基因座(诸如AAVS1)中的gRNA将RHO cDNA敲入RHO基因基因座中。所述供体DNA可以是单链或双链DNA。
以上策略(移框、校正和敲入策略)的优点是相似的，原则上包括短期和长期有益的临床和实验室效果。与移框和校正方法相比，敲入方法提供了至少一种优势 - 能够治疗所有患者，而不是仅一部分患者。
这样的方法使用核酸内切酶，诸如CRISPR相关的(Cas9、Cpf1等)核酸酶，来稳定地校正RHO基因的基因组基因座内的P23H突变。任何CRISPR内切核酸酶都可以用于本发明的方法中，每种CRISPR内切核酸酶具有其自身相关的PAM，其可以是疾病特异性的或可以不是疾病特异性的。例如，已经在序列表的SEQ ID NO.5287-5289中标识了用于用来自化脓链球菌的CRISPR/Cas9核酸内切酶靶向RHO基因中的P23H突变的gRNA间隔物序列。已经在序列表的SEQ ID NO.5290-5291中标识了用于用来自金黄色葡萄球菌的CRISPR/Cas9核酸内切酶靶向RHO基因中的P23H突变的gRNA间隔物序列。
本公开中所示的实例可以在RHO基因的P23H突变内或附近诱导单链断裂或双链断裂，以便用少至单次处理引入移框或纠正RHO基因内的P23H突变(而不是在患者一生中提供潜在的疗法)。
色素性视网膜炎(RP)
色素性视网膜炎(RP)是指引起视网膜变性的一组遗传疾病。已经鉴定了与RP相关的超过60种基因；并且是常染色体隐性的(50-60%)，常染色体显性的(30-40%)或X-连锁的(5-15%)。在许多情况下，RP由RHO基因中的突变引起。RHO中的P23H突变占所有晚期色素性视网膜炎的10%，代表美国大约2500名患者，每年大约30名新患者。所述突变导致与光感受器降解相关的未折叠的突变视紫红质的积累。该病症的特征在于视网膜的光感受器(视杆和视锥)或视网膜色素上皮的异常，以及在周围视网膜中导致进行性视力丧失的色素沉积。典型的RP是视杆-视锥营养不良，其中初始视杆变性，随后视锥变性。该疾病的发生率为1:3000至1:7000个个体，或14至33/100,000。在美国和欧洲的发生率为约1:3500至1:4000，且发病年龄通常为10-30岁。RP没有表现出任何种族特异性，尽管给定基因内的致病变体的范围在人群之间可以不同。
RP是经数十年进化的长期疾病。受该疾病影响的个体首先经历夜盲症，随后在日光下周围视野进行性丧失，且最终导致失明。临床表现包括夜盲症，视敏，眼底外观，后囊内白内障，玻璃体中的尘埃样颗粒，视网膜深处的白点，视神经头的透明体，渗出性血管病和扇区RP。术语“扇区RP”已用于描述每个眼底一个象限或一半的变化。最常见地，下象限和鼻象限对称相关。在常染色体显性RP中，例如在RHO中具有常见P23H致病性变体的人和X-连锁的RP杂合的雌性中，已经观察到这样的扇区变化。通过检眼镜检查、视网膜电图、光学相干断层扫描、荧光素血管造影术评价视网膜，并通过视敏度、视场和色觉进行视力的功能评价。
由RHO基因中的P23H突变引起的RP是具有常染色体显性遗传的单基因病症。如果患者只有一个P23H突变体等位基因，可以将移框引入每个细胞一个P23H突变体等位基因，以防止一个P23H突变等位基因的转录/合成。已经发现一种新型方法，用于通过将移框引入每个细胞一个P23H突变体等位基因以防止一个P23H突变体等位基因的转录/合成，改善常染色体显性RP的作用。
此外，如果患者仅具有一个P23H突变体等位基因，则可以校正一个P23H突变体等位基因以恢复RHO功能。如果患者具有两个P23H突变体等位基因，则可以用HDR校正两个P23H突变体等位基因以恢复RHO功能。
使用基因编辑将移框引入P23H突变体等位基因或校正P23H突变体等位基因提供了相对于现有或潜在疗法的重要改进，诸如由于其精确性和较低的不良反应而通过慢病毒递送和整合引入RHO表达盒。
视紫红质(RHO)基因
RHO也可以被称为视紫红质2；视蛋白-2；OPN2；色素性视网膜炎4，常染色体显性；Opsin2，视杆色素；视杆色素；视蛋白2；CSNBAD1；或RP4。
RHO具有3q22.1的细胞遗传学位置，且如在Ensembl数据库上所见的基因组座标在染色体3上的正向链上的位置129,528,640-129,535,169处。RHO的核苷酸序列显示为SEQID NO:5266。RHO具有826个SNP，4个内含子和5个外显子。来自Ensembl的外显子标识符以及内含子和外显子的起始/终止位点显示于表1中。
表 1：RHO的外显子和内含子
外显子编号 外显子ID 起始/终止 内含子编号 基于外显子ID的内含子 起始/终止
外显子1 ENSE00001079597 129,528,640-129,529,094 内含子1 内含子ENSE00001079597-ENSE00001152211 129,529,095-129,530,875
外显子2 ENSE00001079599 129,533,608-129,535,169 内含子2 内含子ENSE00001152211-ENSE00001152205 129,531,045-129,532,250
外显子3 ENSE00001152199 129,532,533-129,532,772 内含子3 内含子ENSE00001152205-ENSE00001152199 129,532,417-129,532,532
外显子4 ENSE00001152205 129,532,251-129,532,416 内含子4 内含子ENSE00001152199-ENSE00001079599 129,532,773-129,533,607
外显子5 ENSE00001152211 129,530,876-129,531,044
RHO具有826个SNP，且RHO基因的SNP的NCBI rs编号和/或UniProt 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RHO基因提供了用于制备称为视紫红质的蛋白的说明。该蛋白对于正常视觉是必需的，尤其是在弱光条件下。视紫红质在称为视杆的专门光感受器细胞中。作为眼睛后部的感光组织(视网膜)的一部分，视杆在弱光下提供视觉。视网膜中的其他光感受器细胞(称为视锥细胞)负责亮光下的视觉。视紫红质蛋白与称为11-顺式视黄醛(这是维生素A的一种形式)的分子结合。当该分子暴露于光线时，其活化视紫红质并引起一系列化学反应，其产生电信号。这些信号被传输至大脑，在大脑中它们被解释为视觉。
存在与色素性视网膜炎(RP)相关的各种突变，其可以是插入、缺失、错义、无义、移框和其他突变，其具有使RHO基因失活的常见作用。可以修复所述突变中的任何一种或多种，以恢复RHO蛋白活性。例如，可以恢复或纠正病理血变体P23H(参见表2)。
表 2
变体 位置 变体类型
P23H 染色体3：129528801 错义
外显子缺失
另一种基因组工程改造策略涉及外显子缺失。特定外显子的靶向缺失可以是一种用单一治疗性鸡尾酒治疗患者的大子集的有吸引力的策略。缺失可以是单外显子缺失或多外显子缺失。尽管多外显子缺失可以达到更大数量的患者，但对于较大的缺失，缺失的效率随着大小增加而大大降低。因此，缺失范围可以大小为40至10,000个碱基对(bp)。例如，缺失大小可以范围为40-100；100-300；300-500；500-1,000；1,000-2,000；2,000-3,000；3,000-5,000；或5,000-10,000个碱基对。
如前所述，RHO基因含有5个外显子。5个外显子中的任何一个或多个可以含有突变。可以缺失5个突变外显子或异常内含子剪接受体或供体位点中的任何一个或多个，以恢复或部分恢复RHO功能。在一些实施方案中，所述方法提供了可用于缺失突变的外显子1、2、3、4、5或其任何组合中的任何一个或多个的gRNA对。
为了确保前mRNA在缺失后正确处理，可以缺失周围的剪接信号。剪接供体和受体通常是在邻近内含子的100碱基对内。因此，在一些实例中，方法可以提供就每个目标外显子/内含子连接部而言在大约±100-3100碱基对处切割的所有gRNA。
对于任何基因组编辑策略，可以通过测序或PCR分析来证实基因编辑。
基于体内的疗法
本文提供了用于治疗具有常染色体显性RP的患者的方法。在一些方面，所述方法是基于体内细胞的疗法。RP患者中的细胞的染色体DNA可以使用本文所述的材料和方法进行编辑。例如，所述体内方法可以包括编辑患者的细胞、诸如光感受器细胞或视网膜祖细胞中的RHO基因中的P23H突变。
尽管某些细胞呈递用于离体治疗和疗法的有吸引力的靶标，但增加的递送效力可允许直接体内递送至这样的细胞。理想地，将靶向和编辑引导至相关细胞。也可以通过使用仅在某些细胞和/或发育阶段有活性的启动子来防止其他细胞中的切割。另外的启动子是可诱导的，且因此如果核酸酶作为质粒递送，则可以在时间上进行控制。递送的RNA和蛋白保留在细胞中的时间量也可以使用添加以改变半衰期的处理或结构域进行调节。体内处理将消除许多处理步骤，但较低的递送率可能需要较高的编辑率。体内处理可以消除来自离体处理和移植的问题和损失。
体内基因疗法的一个优点可以是，容易生产和施用治疗剂。相同的治疗方案和疗法将具有用于治疗超过一名患者(例如许多具有相同或类似基因型或等位基因的患者)的潜力。相反，离体细胞疗法通常要求使用患者自身的细胞，将其分离、操作和返回至同一名患者。
基于离体的疗法
本文提供了用于治疗具有常染色体显性RP的患者的方法。这样的方法的一个方面是基于离体细胞的疗法。例如，可以产生患者特异性的诱导的多能干细胞(iPSC)。然后，可以使用本文所述的材料和方法来编辑这些iPSC细胞的染色体DNA。例如，所述方法可以包括在iPSC的RHO基因中的P23H突变内或附近进行编辑。接下来，基因组编辑的iPSC可以分化为其他细胞，例如光感受器细胞或视网膜祖细胞。最后，分化的细胞，诸如光感受器细胞或视网膜祖细胞，可以移植入患者中。
这样的方法的另一个方面是基于离体细胞的疗法。例如，可以从患者分离光感受器细胞或视网膜祖细胞。接下来，可以使用本文所述的材料和方法来编辑这些光感受器细胞或视网膜祖细胞的染色体DNA。例如，所述方法可以包括在所述光感受器细胞或视网膜祖细胞的RHO基因中的P23H突变内或附近进行编辑。最后，可以将基因组编辑的光感受器细胞或视网膜祖细胞移植入患者中。
这样的方法的另一个方面是基于离体细胞的疗法。例如，可以从患者分离间充质干细胞，其可以分离自患者骨髓或外周血。接着，可以使用本文描述的材料和方法编辑这些间充质干细胞的染色体DNA。例如，所述方法可以包括在间充质干细胞的RHO基因中的P23H突变内或附近进行编辑。接着，可以使基因组编辑的间充质干细胞分化成任何类型的细胞，例如，光感受器细胞或视网膜祖细胞。最后，可以将这些分化的细胞，例如，光感受器细胞或视网膜祖细胞移植入所述患者中。
离体细胞治疗方案的一个优点是在施用之前进行治疗的综合分析的能力。基于核酸酶的治疗剂可以具有某种水平的靶外(off-target)效应。离体进行基因校正允许人们在植入之前表征经校正的细胞群体。本发明包括对经校正的细胞的整个基因组测序以确保靶外效应(如果有的话)可以是在与患者的最小风险有关的基因组位置。此外，可以在植入之前分离特定细胞的群体，包括克隆群体。
离体细胞疗法的另一个优点涉及与其他原代细胞来源相比在iPSC中的基因校正。iPSC是多产的，使得容易得到大量细胞，所述细胞将是基于细胞的疗法所需要的。此外，iPSC是用于进行克隆分离的理想细胞类型。这允许筛选正确的基因组校正，没有冒生存力降低的风险。相反，其他原代细胞(诸如光感受器细胞或视网膜祖细胞)仅存活几代且难以克隆繁殖。因此，用于治疗常染色体显性RP的iPSC的操作将廉价得多，并且可以缩短产生期望的基因校正所需的时间量。
基因组编辑
基因组编辑是指修饰基因组的核苷酸序列的过程，诸如以精确的或预定的方式。本文描述的基因组编辑的方法的实例包括使用定位核酸酶在基因组的精确靶标位置处切割DNA、由此在基因组内的特定位置处建立单链或双链DNA断裂的方法。这样的断裂可以且经常通过天然的内源性细胞过程、诸如HDR和NHEJ来修复。这两种主要的DNA修复过程由旁路途径家族组成。NHEJ直接连接从双链断裂产生的DNA末端，有时具有核苷酸序列的损失或添加，它们可以破坏或增强基因表达。HDR利用同源序列或供体序列作为在断裂点处插入确定的DNA序列的模板。所述同源序列可以是在内源性基因组(诸如姐妹染色单体)中。或者，所述供体可以是外源核酸，诸如质粒、单链寡核苷酸、双链寡核苷酸、双链体寡核苷酸或病毒，其具有与核酸酶切割的基因座的高同源性区域，但是其还可以含有另外的序列或序列变化，包括可以并入经切割的靶标基因座中的缺失。第三种修复机制可以是微同源性介导的末端连接(MMEJ)，也被称作“替代NHEJ(ANHEJ)”，其中基因结果类似于NHEJ，因为小缺失和插入可以发生在切割位点处。MMEJ可以利用侧接DNA断裂位点的几个碱基对的同源序列来驱动更有利的DNA末端连接修复结果，且最近的报道已经进一步阐明了该过程的分子机制。在一些情况下，基于在DNA断裂位点处的潜在微同源性分析可能预测可能的修复结果。
这些基因组编辑机制中的每一种可以用于建立期望的基因组改变。基因组编辑过程中的一个步骤可以是在接近预期突变位点的靶标基因座中建立一个或两个DNA断裂，后者作为双链断裂或作为两个单链断裂。这可以通过使用定位多肽来实现，如本文中所述和解释的。
定位多肽，诸如DNA核酸内切酶，可以在核酸、例如基因组DNA中引入双链断裂或单链断裂。所述双链断裂可以刺激细胞的内源性DNA-修复途径[例如，同源性依赖性的修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)或(ANHEJ)或(MMEJ)]。NHEJ可以修复经切割的靶标核酸，无需同源模板。这有时可以导致在靶标核酸中在切割位点处的小缺失或插入(插入/缺失(indel))，并且可以导致基因表达的破坏或改变。所述缺失范围可以大小为40至10,000个碱基对(bp)。例如，缺失大小可以范围为40-100；100-300；300-500；500-1,000；1,000-2,000；2,000-3,000；3,000-5,000；或5,000-10,000个碱基对。当同源修复模板或供体可得到时，HDR可以发生。同源供体模板可以包含野生型RHO基因或cDNA的至少一部分。所述野生型RHO基因或cDNA的至少一部分可以是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子区域、其片段或组合或整个RHO基因或cDNA。所述供体模板可以是单链或双链多核苷酸。所述供体模板可以最多达5KB。所述供体模板可以最多达4KB。所述供体模板可以最多达3 KB。所述供体模板可以最多达2 KB。所述供体模板可以最多达1KB。所述供体模板可以通过AAV递送。所述同源供体模板可以包含可以与侧接靶标核酸切割位点的序列同源的序列。例如，所述供体模板可以具有与3q22.1区域同源的臂。所述供体模板也可以具有与病理学变体P23H同源的臂。姐妹染色单体可以被细胞用作修复模板。然而，为了基因组编辑的目的，所述修复模板可以作为外源核酸(诸如质粒、双链体寡核苷酸、单链寡核苷酸、双链寡核苷酸或病毒核酸)来供给。对于外源供体模板，可以在同源性的侧接区域之间引入另外的核酸序列(诸如转基因)或修饰(诸如单个或多个碱基变化或缺失)，使得另外的或改变的核酸序列也变成并入靶标基因座中。MMEJ可以导致与NHEJ类似的基因结果，因为小缺失和插入可以发生在切割位点处。MMEJ可以利用侧接切割位点的几个碱基对的同源序列来驱动有利的末端连接DNA修复结果。在一些情况下，基于在核酸酶靶标区域中的潜在微同源性分析可能预测可能的修复结果。
因此，在一些情况下，可以使用同源重组将外源多核苷酸序列插入靶标核酸切割位点中。一种外源多核苷酸序列在本文中被称作“供体多核苷酸”(或供体或供体序列或多核苷酸供体模板)。将所述供体多核苷酸、所述供体多核苷酸的一部分、所述供体多核苷酸的一个拷贝或所述供体多核苷酸的一个拷贝的部分可以插入靶标核酸切割位点中。所述供体多核苷酸可以是外源多核苷酸序列，即，在靶标核酸切割位点处不天然地发生的序列。
由NHEJ和/或HDR引起的靶标DNA的修饰可以导致，例如，突变、缺失、改变、整合、基因校正、基因替换、基因加标记、转基因插入、核苷酸缺失、基因破坏、易位和/或基因突变。缺失基因组DNA和将非天然核酸并入基因组DNA中的方法是基因组编辑的实例。
CRISPR核酸内切酶系统
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，簇集的规则地间隔的短回文重复序列)基因组基因座可以存在于许多原核生物(例如，细菌和古细菌)的基因组中。在原核生物中，CRISPR基因座编码这样的产物：其作为一类免疫系统起作用以帮助保护所述原核生物免于外来侵入物，诸如病毒和噬菌体。存在CRISPR基因座功能的三个阶段：新序列整合进CRISPR基因座中，CRISPR RNA (crRNA)的表达，和外来侵入核酸的沉默。已经鉴定了五类CRISPR系统(例如，类型I、类型II、类型III、类型U和类型V)。
CRISPR基因座包括许多短的重复序列，被称作“重复序列”。当表达时，所述重复序列可以形成二级结构(例如，发夹)和/或包含未结构化的单链序列。所述重复序列经常发生在簇中且频繁地在物种之间差异化。所述重复序列被独特插入序列(被称作“间隔物”)规则地隔开，从而产生重复序列-间隔物-重复序列基因座体系结构。所述间隔物与已知的外来侵入序列相同或具有高同源性。间隔物-重复单元编码crisprRNA (crRNA)，其被加工成间隔物-重复单元的成熟形式。crRNA包含参与靶向靶标核酸的“种子”或间隔物序列(在原核生物中以天然存在的形式，所述间隔物序列靶向外来侵入核酸)。间隔物序列位于crRNA的5'或3'末端处。
CRISPR基因座也包含编码CRISPR相关(Cas)基因的多核苷酸序列。Cas基因编码参与原核生物中的crRNA功能的生源说和干扰阶段的核酸内切酶。一些Cas基因包含同源的二级结构和/或三级结构。
II型CRISPR系统
在自然界中在II型CRISPR系统中的crRNA生源说要求反式活化的CRISPR RNA(tracrRNA)。所述tracrRNA可以被内源性RNA酶III修饰，然后与前-crRNA阵列中的crRNA重复序列杂交。内源性RNA酶III可以被募集以切割前-crRNA。可以对经切割的crRNA进行核糖核酸外切酶修剪以产生成熟的crRNA形式(例如，5'修剪)。所述tracrRNA可以保持与crRNA杂交，并且tracrRNA和crRNA与定位多肽(例如，Cas9)结合。crRNA-tracrRNA-Cas9复合物的crRNA可以将所述复合物引导至所述crRNA可以与其杂交的靶标核酸。所述crRNA与靶标核酸的杂交可以活化Cas9用于靶向核酸切割。在II型CRISPR系统中的靶标核酸被称作原间隔物邻近基序(PAM)。在自然界中，所述PAM是促进定位多肽(例如，Cas9)与靶标核酸的结合所必需的。II型系统(也被称作Nmeni或CASS4)被进一步细分成类型II-A (CASS4)和II-B(CASS4a)。Jinek等人,Science, 337(6096):816-821 (2012)表明，CRISPR/Cas9系统可用于RNA-可编程的基因组编辑，并且国际专利申请公开号WO2013/176772提供了CRISPR/Cas核酸内切酶系统用于位点特异性的基因编辑的众多实例和应用。
V型CRISPR系统
V型CRISPR系统具有相对于II型系统的几个重要差异。例如，Cpf1是单个RNA指导的核酸内切酶，其与II型系统相比缺乏tracrRNA。实际上，Cpf1-相关的CRISPR阵列可以被加工成成熟的crRNAs，不需要另外的反式活化的tracrRNA。V型CRISPR阵列可以被加工成42-44个核苷酸长度的短的成熟的crRNA，其中每种成熟的crRNA开始于直接重复序列的19个核苷酸，继之以间隔物序列的23-25个核苷酸。相反，在II型系统中的成熟的crRNA可以开始于间隔物序列的20-24个核苷酸，继之以直接重复序列的约22个核苷酸。并且，Cpf1可以利用富含T的原间隔物-邻近基序，使得Cpf1-crRNA复合物有效地切割在短的富含T的PAM之后的靶标DNA，这不同于对于II型系统而言在靶标DNA之后的富含G的PAM。因此，V型系统在远离PAM的点处切割，而II型系统在邻近PAM的点处切割。另外，不同于II型系统，Cpf1通过具有4或5个核苷酸5’突出端的交错DNA双链断裂而切割DNA。II型系统通过钝双链断裂而切割。类似于II型系统，Cpf1含有预测的RuvC-样核酸内切酶结构域，但是缺乏第二个HNH核酸内切酶结构域，这不同于II型系统。
Cas基因/多肽和原间隔物邻近基序
示例性的CRISPR/Cas多肽包括Fonfara等人,Nucleic Acids Research, 42: 2577-2590 (2014)的图1中公开的Cas9多肽。因为发现了Cas基因，CRISPR/Cas基因命名系统已经经历过多次重写。Fonfara (同上)的图5提供了来自不同物种的Cas9多肽的PAM序列。
定位多肽
定位多肽是在基因组编辑中用于切割DNA和/或诱导定点诱变的核酸酶。所述定位核酸酶可以作为一种或多种多肽或一种或多种编码所述多肽的mRNA施用于细胞或患者。SEQ IDNO:1-612中列出或本文公开的任何酶或直系同源物均可用于本文的方法中。
在CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1系统的背景下，定位多肽可以结合向导RNA，所述向导RNA又指定所述多肽所针对的靶标DNA中的位点。在本文公开的CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1系统中，所述定位多肽可以是核酸内切酶，诸如DNA核酸内切酶。
定位多肽可以包含多个核酸切割(即，核酸酶)结构域。两个或更多个核酸切割结构域可以经由接头连接在一起。例如，所述接头可以包含柔性接头。接头可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40个或更多个氨基酸的长度。
天然存在的野生型Cas9酶包含两个核酸酶结构域：HNH核酸酶结构域和RuvC结构域。在本文中，“Cas9”是指天然存在的和重组的Cas9。在本文中预见到的Cas9酶可以包含HNH或HNH-样核酸酶结构域和/或RuvC或RuvC-样核酸酶结构域。
HNH或HNH-样结构域包含McrA-样折叠。HNH或HNH-样结构域包含两个反平行的β-链和一个α-螺旋。HNH或HNH-样结构域包含一个金属结合位点(例如，一个二价阳离子结合位点)。HNH或HNH-样结构域可以切割靶标核酸的一条链(例如，crRNA靶向链的互补链)。
RuvC或RuvC-样结构域包含RNA酶H或RNA酶H-样折叠。RuvC/RNA酶H结构域参与多个系列的基于核酸的功能，包括作用于RNA和DNA。RNA酶H结构域包含被多个α-螺旋包围的5个β-链。RuvC/RNA酶H或RuvC/RNA酶H-样结构域包含一个金属结合位点(例如，一个二价阳离子结合位点)。RuvC/RNA酶H或RuvC/RNA酶H-样结构域可以切割靶标核酸的一条链(例如，双链靶标DNA的非互补链)。
定位多肽可以在核酸(例如，基因组DNA)中引入双链断裂或单链断裂。所述双链断裂可以刺激细胞的内源性DNA-修复途径[例如，HDR或NHEJ或ANHEJ或MMEJ]。NHEJ可以修复经切割的靶标核酸，无需同源模板。这有时可以导致在靶标核酸中在切割位点处的小缺失或插入(插入/缺失(indel))，并且可以导致基因表达的破坏或改变。当同源修复模板或供体可得到时，HDR可以发生。同源供体模板可以包含与侧接靶标核酸切割位点的序列同源的序列。姐妹染色单体可以被细胞用作修复模板。然而，为了基因组编辑的目的，所述修复模板可以作为外源核酸(诸如质粒、双链体寡核苷酸、单链寡核苷酸或病毒核酸)来供给。对于外源供体模板，可以在同源性的侧接区域之间引入另外的核酸序列(诸如转基因)或修饰(诸如单个或多个碱基变化或缺失)，使得另外的或改变的核酸序列也变成并入靶标基因座中。MMEJ可以导致与NHEJ类似的基因结果，因为小缺失和插入可以发生在切割位点处。MMEJ可以利用侧接切割位点的几个碱基对的同源序列来驱动有利的末端连接DNA修复结果。在一些情况下，基于在核酸酶靶标区域中的潜在微同源性分析可能预测可能的修复结果。
因此，在一些情况下，可以使用同源重组将外源多核苷酸序列插入靶标核酸切割位点中。一种外源多核苷酸序列在本文中被称作供体多核苷酸(或供体或供体序列)。将所述供体多核苷酸、所述供体多核苷酸的一部分、所述供体多核苷酸的一个拷贝或所述供体多核苷酸的一个拷贝的部分可以插入靶标核酸切割位点中。所述供体多核苷酸可以是外源多核苷酸序列，即，在靶标核酸切割位点处不天然地发生的序列。
所述定位多肽可以包含与野生型示例性定位多肽[例如，来自化脓链球菌的Cas9，US2014/0068797序列ID No. 8或Sapranauskas等人, Nucleic Acids Res, 39(21):9275-9282 (2011)],和多种其他定位多肽具有至少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。所述定位多肽可以包含与野生型定位多肽(例如，来自化脓链球菌的Cas9, 同上)在10个连续氨基酸上的至少70、75、80、85、90、95、97、99或100%同一性。所述定位多肽可以包含与野生型定位多肽(例如，来自化脓链球菌的Cas9, 同上)在10个连续氨基酸上的至多70、75、80、85、90、95、97、99或100%同一性。所述定位多肽可以包含与野生型定位多肽(例如，来自化脓链球菌的Cas9, 同上)在所述定位多肽的HNH核酸酶结构域中的10个连续氨基酸上的至少70、75、80、85、90、95、97、99或100%同一性。所述定位多肽可以包含与野生型定位多肽(例如，来自化脓链球菌的Cas9, 同上)在所述定位多肽的HNH核酸酶结构域中的10个连续氨基酸上的至多70、75、80、85、90、95、97、99或100%同一性。所述定位多肽可以包含与野生型定位多肽(例如，来自化脓链球菌的Cas9, 同上)在所述定位多肽的RuvC核酸酶结构域的10个连续氨基酸上的至少70、75、80、85、90、95、97、99或100%同一性。所述定位多肽可以包含与野生型定位多肽(例如，来自化脓链球菌的Cas9,同上)在所述定位多肽的RuvC核酸酶结构域的10个连续氨基酸上的至多70、75、80、85、90、95、97、99或100%同一性。
所述定位多肽可以包含野生型示例性定位多肽的修饰形式。所述野生型示例性定位多肽的修饰形式可以包含减小所述定位多肽的核酸切割活性的突变。所述野生型示例性定位多肽的修饰形式可以具有所述野生型示例性定位多肽(例如，来自化脓链球菌的Cas9,同上)的核酸切割活性的小于90%、小于80%、小于70%、小于60%、小于50%、小于40%、小于30%、小于20%、小于10%、小于5%或小于1%。所述定位多肽的修饰形式可以不具有实质的核酸切割活性。当定位多肽是不具有实质的核酸切割活性的修饰形式时，它在本文中被称作“无酶活性的”。
所述定位多肽的修饰形式可以包含突变，使得它可以诱导靶标核酸上的SSB(例如，通过仅切割双链靶标核酸的糖-磷酸主链之一)。所述突变可以导致所述野生型定位多肽(例如，来自化脓链球菌的Cas9, 同上)的多个核酸切割结构域中的一个或多个的小于90%、小于80%、小于70%、小于60%、小于50%、小于40%、小于30%、小于20%、小于10%、小于5%或小于1%的核酸切割活性。所述突变可以导致多个核酸切割结构域中的一个或多个保留切割靶标核酸的互补链的能力、但是减小它的切割靶标核酸的非互补链的能力。所述突变可以导致多个核酸切割结构域中的一个或多个保留切割靶标核酸的非互补链的能力、但是减小它的切割靶标核酸的互补链的能力。例如，野生型示例性化脓链球菌Cas9多肽中的残基(诸如Asp10、His840、Asn854和Asn856)被突变以失活多个核酸切割结构域(例如，核酸酶结构域)中的一个或多个。要突变的残基可以对应于野生型示例性化脓链球菌Cas9多肽中的残基Asp10、His840、Asn854和Asn856 (例如，如通过序列和/或结构比对所确定的)。突变的非限制性实例包括D10A、H840A、N854A或N856A。除了丙氨酸取代以外的突变可以是合适的。
可以将D10A突变与H840A、N854A或N856A突变中的一种或多种组合以产生基本上缺乏DNA裂解活性的定位多肽。可以将H840A突变与D10A、N854A或N856A突变中的一种或多种组合以产生基本上缺乏DNA裂解活性的定位多肽。可以将N854A突变与H840A、D10A或N856A突变中的一种或多种组合以产生基本上缺乏DNA裂解活性的定位多肽。可以将N856A突变与H840A、N854A或D10A突变中的一种或多种组合以产生基本上缺乏DNA裂解活性的定位多肽。包含一个基本上无活性的核酸酶结构域的定位多肽被称作“切口酶”。
RNA指导的核酸内切酶(例如Cas9)的切口酶变体可以用于增加CRISPR介导的基因组编辑的特异性。野生型Cas9通常由单个向导RNA来指导，所述向导RNA被设计成与靶标序列中的指定的约20个核苷酸序列(诸如内源性基因组基因座)杂交。然而，可以在向导RNA和靶标基因座之间容忍几个错配，从而将所述靶标位点中需要的同源性的长度有效地减小至例如小至13个核苷酸的同源性，且由此导致升高的CRISPR/Cas9复合物在靶标基因组别处的结合和双链核酸切割(也被称作靶外切割)的可能性。因为Cas9的切口酶变体为了建立双链断裂各自仅切割一条链，必须使一对切口酶在靶标核酸的相对链紧密靠近处和表面上结合，由此建立一对切口，其为双链断裂的等同物。这要求，两种单独的向导RNA (各自针对一种切口酶)必须在靶标核酸的相对链紧密靠近处和表面上结合。该要求使双链断裂发生所需的同源性的最小长度基本上倍增，由此减小以下可能性：双链切割事件将发生在基因组的别处，在该处所述两个向导RNA位点(如果它们存在的话)不可能彼此充分靠近以使双链断裂形成。如在本领域中描述的，还可以使用切口酶来相对于NHEJ促进HDR。通过使用有效地介导期望的变化的特定供体序列，可以使用HDR将选择的变化引入基因组中的靶标位点。
预见到的突变可以包括取代、添加和缺失，或它们的任何组合。所述突变将突变的氨基酸转化成丙氨酸。所述突变将突变的氨基酸转化成另一种氨基酸(例如，甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸或精氨酸)。所述突变将突变的氨基酸转化成非天然的氨基酸(例如，硒代甲硫氨酸)。所述突变将突变的氨基酸转化成氨基酸模仿物(例如，磷酸模仿物)。所述突变可以是保守突变。例如，所述突变将突变的氨基酸转化成类似于突变的氨基酸(例如，半胱氨酸/丝氨酸突变、赖氨酸/天冬酰胺突变、组氨酸/苯丙氨酸突变)的大小、形状、电荷、极性、构象和/或旋转异构体的氨基酸。所述突变可以引起开放阅读框的转移和/或未成熟终止密码子的建立。突变可以引起基因或基因座的调节区的变化，所述调节区影响一种或多种基因的表达。
所述定位多肽(例如，变体的、突变的、无酶活性的和/或有条件地无酶活性的定位多肽)可以靶向核酸。所述定位多肽(例如，变体的、突变、无酶活性的和/或有条件地无酶活性的核糖核酸内切酶)可以靶向DNA。所述定位多肽(例如，变体的、突变的、无酶活性的和/或有条件地无酶活性的核糖核酸内切酶)可以靶向RNA。
所述定位多肽可以包含一种或多种非天然序列(例如，所述定位多肽是融合蛋白)。
所述定位多肽可以包含与来自细菌(例如，化脓链球菌)的Cas9具有至少15%氨基酸同一性的氨基酸序列、一个核酸结合结构域和两个核酸切割结构域(即，一个HNH结构域和一个RuvC结构域)。
所述定位多肽可以包含与来自细菌(例如，化脓链球菌)的Cas9具有至少15%氨基酸同一性的氨基酸序列和两个核酸切割结构域(即，一个HNH结构域和一个RuvC结构域)。
所述定位多肽可以包含与来自细菌(例如，化脓链球菌)的Cas9具有至少15%氨基酸同一性的氨基酸序列和两个核酸切割结构域，其中所述核酸切割结构域中的一个或两个与来自细菌(例如，化脓链球菌)的Cas9的核酸酶结构域具有至少50%氨基酸同一性。
所述定位多肽可以包含与来自细菌(例如，化脓链球菌)的Cas9具有至少15%氨基酸同一性的氨基酸序列、两个核酸切割结构域(即，一个HNH结构域和一个RuvC结构域)和非天然序列(例如，核定位信号)或将所述定位多肽连接至非天然序列的接头。
所述定位多肽可以包含与来自细菌(例如，化脓链球菌)的Cas9具有至少15%氨基酸同一性的氨基酸序列、两个核酸切割结构域(即，一个HNH结构域和一个RuvC结构域)，其中所述定位多肽包含在所述核酸切割结构域中的一个或两个中的突变，所述突变使所述核酸酶结构域的切割活性减小至少50%。
所述定位多肽可以包含与来自细菌(例如，化脓链球菌)的Cas9具有至少15%氨基酸同一性的氨基酸序列和两个核酸切割结构域(即，一个HNH结构域和一个RuvC结构域)，其中所述核酸酶结构域之一包含天冬氨酸10的突变，和/或其中所述核酸酶结构域之一可以包含组氨酸840的突变，且其中所述突变使所述核酸酶结构域的切割活性减小至少50%。
一种或多种定位多肽(例如DNA核酸内切酶)可以包括两种切口酶，它们一起实现在基因组的特定基因座处的一个双链断裂，或四种切口酶，它们一起实现或引起在基因组的特定基因座处的两个双链断裂。或者，一种定位多肽(例如DNA核酸内切酶)可以实现或引起在基因组的特定基因座处的一个双链断裂。
来自其他细菌菌株的Cas9直系同源物的非限制性实例包括但不限于在以下中鉴定的Cas蛋白：深海单细胞蓝藻(Acaryochloris marina) MBIC11017；阿拉伯糖醋杆菌DSM5501；喜温嗜酸硫杆菌；氧化亚铁嗜酸硫杆菌ATCC 23270；酸热脂环酸杆菌LAA1；酸热脂环酸酸热亚种DSM 446；Allochromatium vinosum DSM 180；Ammonifex degensii KC4；鱼腥藻ATCC 29413；极大节旋藻CS-328；钝顶螺旋藻str. Paraca；节旋藻物种PCC 8005；假蕈状芽孢杆菌DSM 12442；硒化芽孢杆菌MLS10；细菌伯克霍尔德氏菌1_1_47；Caldicelulosiruptor becscii DSM 6725；Candidatus Desulforudis audaxviator MP104C；Caldicellulosiruptor hydrothermalis_108；梭状芽孢杆菌噬菌体c-st；肉毒梭状芽孢杆菌A3 str. Loch Maree；肉毒梭状芽孢杆菌Ba4 str. 657；艰难梭状芽孢杆菌QCD-63q42；Crocosphaera watsonii WH 8501；蓝丝菌属物种ATCC 51142；蓝丝菌属物种CCY0110；蓝丝菌属物种PCC 7424；蓝丝菌属物种PCC 7822；Exiguobacterium sibiricum 255-15；大芬戈尔德菌ATCC 29328；Ktedonobacter racemifer DSM 44963；德氏乳杆菌保加利亚亚种PB2003/044-T3-4；唾液乳杆菌ATCC 11741；无害李斯特菌；林氏藻属物种PCC8106；海杆菌属物种ELB17；Methanohalobium evestigatum Z-7303；微囊藻噬菌体Ma-LMM01；铜绿微囊藻NIES-843；Microscilla marina ATCC 23134；原型微鞘藻PCC 7420；脑膜炎奈瑟氏菌；嗜盐亚硝化球菌Nc4；达氏诺卡氏菌达氏亚种DSM 43111；泡沫节球藻CCY9414；念珠藻属物种PCC 7120；颤藻属物种PCC 6506；Pelotomaculum_ thermopropionicum_SI；运动石袍菌SJ95；Polaromonas naphthalenivorans CJ2；极地单胞菌属物种JS666；河豚毒素假交替单胞菌TAC125；始旋链霉菌ATCC 25486；始旋链霉菌ATCC 25486；嗜热链球菌；绿产色链霉菌DSM 40736；玫瑰链霉菌DSM 43021；聚球藻属物种PCC 7335；和非洲栖热腔菌TCF52B (Chylinski等人, RNA Biol., 2013; 10(5): 726-737)。
除了Cas9直系同源物以外，其他Cas9变体，诸如失活的dCas9和具有不同功能的效应子结构域的融合蛋白，可以充当遗传调节的平台。任何前述酶都可用于本发明。
SEQ ID NO:1-612中提供了可用于本公开中的核酸内切酶的另外的实例。这些蛋白可以在使用前被修饰，或者可以在核酸序列诸如DNA、RNA或mRNA中或在载体构建体诸如本文中教导的质粒或腺相关病毒(AAV)载体中被编码。此外，可以对它们进行密码子优化。
靶向基因组的核酸
本发明提供了靶向基因组的核酸，其可以指导有关多肽(例如，定位多肽)对靶标核酸内的特定靶标序列的活性。所述靶向基因组的核酸可以是RNA。靶向基因组的RNA在本文中被称作“向导RNA”或“gRNA”。向导RNA至少可以包含与目标靶标核酸序列杂交的间隔物序列和CRISPR重复序列。在II型系统中，所述gRNA也包含被称作tracrRNA序列的第二种RNA。在II型gRNA中，CRISPR重复序列和tracrRNA序列彼此杂交以形成双链体。在V型gRNA中，crRNA形成双链体。在两种系统中，所述双链体可以结合定位多肽，使得向导RNA和定位多肽形成复合物。所述靶向基因组的核酸可以通过它与定位多肽的结合为所述复合物提供靶标特异性。所述靶向基因组的核酸因此可以指导所述定位多肽的活性。
示例性的向导RNA包括序列表的SEQ ID NO:5282-5291中的间隔物序列，显示其靶标序列的基因组位置(参见图2A中的SEQ ID NO:5272-5281)和相关的Cas9切割位点，其中所述基因组位置基于GRCh38/hg38人类基因组组装体。
可以将每种向导RNA设计成包括与它的基因组靶标序列互补的间隔物序列。例如，序列表的SEQ ID NO:5282-5291中的每个间隔物序列可以放入单个RNA嵌合体或crRNA中(与对应的tracrRNA一起)。参见Jinek等人, Science, 337, 816-821 (2012)和Deltcheva等人, Nature, 471, 602-607 (2011)。
所述靶向基因组的核酸可以是双分子向导RNA。所述靶向基因组的核酸可以是单分子向导RNA。可以修饰双分子向导RNA或单分子向导RNA。
双分子向导RNA可以包含两条RNA链。第一链在5' 至3'方向包含任选的间隔物延伸序列、间隔物序列和最小CRISPR重复序列。第二链可以包含最小tracrRNA序列(与最小CRISPR重复序列互补)、3' tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。
在II型系统中的单分子向导RNA (sgRNA)在5' 至3'方向可以包含任选的间隔物延伸序列、间隔物序列、最小CRISPR重复序列、单分子向导接头、最小tracrRNA序列、3'tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。所述任选的tracrRNA延伸可以包含给向导RNA贡献另外的功能性(例如，稳定性)的元件。所述单分子向导接头可以连接最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列以形成发夹结构。所述任选的tracrRNA延伸可以包含一个或多个发夹。
sgRNA可以在sgRNA序列的5'末端包含具有17-30个核苷酸的可变长度的间隔物序列(表3)。在其他实例中，sgRNA可以在sgRNA序列的5'末端包含具有17-24个核苷酸的可变长度的间隔物序列。
sgRNA可以在sgRNA序列的5'末端包含20个核苷酸间隔物序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'末端包含少于20个核苷酸间隔物序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'末端包含19个核苷酸间隔物序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'末端包含18个核苷酸间隔物序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'末端包含17个核苷酸间隔物序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'末端包含多于20个核苷酸间隔物序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'末端包含21个核苷酸间隔物序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'末端包含22个核苷酸间隔物序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'末端包含23个核苷酸间隔物序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'末端包含24个核苷酸间隔物序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'末端包含25个核苷酸间隔物序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'末端包含26个核苷酸间隔物序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'末端包含27个核苷酸间隔物序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'末端包含28个核苷酸间隔物序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'末端包含29个核苷酸间隔物序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5'末端包含30个核苷酸间隔物序列。
sgRNA可以在sgRNA序列的3'末端不包含尿嘧啶，诸如在表3的SEQ ID NO:5268、5328、5331、5334或5337中。sgRNA可以在sgRNA序列的3'末端包含一个或多个尿嘧啶，诸如在表3的SEQ ID NO:5267、5269、5327、5329、5330、5332、5333、5335、5336或5338中。例如，sgRNA可以在sgRNA序列的3'末端包含1个尿嘧啶(U)。sgRNA可以在sgRNA序列的3'末端包含2个尿嘧啶(UU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3'末端包含3个尿嘧啶(UUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3'末端包含4个尿嘧啶(UUUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3'末端包含5个尿嘧啶(UUUUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3'末端包含6个尿嘧啶(UUUUUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3'末端包含7个尿嘧啶(UUUUUUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3'末端包含8个尿嘧啶(UUUUUUUU)。
sgRNA可以是未修饰的或修饰的。例如，修饰的sgRNA可以包含一个或多个2'-O-甲基硫代磷酸酯核苷酸。
表3
Figure 621914DEST_PATH_IMAGE001
Figure 726005DEST_PATH_IMAGE002
在V型系统中的单分子向导RNA (sgRNA)在5' 至3'方向可以包含最小CRISPR重复序列和间隔物序列。
作为举例说明，在CRISPR/Cas/Cpf1系统中使用的向导RNA或其他更小的RNA可以通过化学方式容易地合成，如在下面举例说明的和在本领域中描述的。尽管化学合成程序在继续增加，但是通过诸如高效液相色谱法(HPLC，其避免使用凝胶诸如PAGE)等程序对这样的RNA的纯化倾向于变得更有挑战性，因为多核苷酸长度显著地增加超过了100个左右核苷酸。用于制备较大长度的RNA的一个方案是生产连接在一起的两个或更多个分子。通过酶法更容易地制备长得多的RNA，诸如编码Cas9或Cpf1核酸内切酶的那些。在RNA的化学合成和/或酶法制备过程中或之后，可以引入不同类型的RNA修饰，例如，如本领域中描述的增加稳定性、减小先天性免疫应答的可能性或程度、和/或增强其他属性的修饰。
间隔物延伸序列
在靶向基因组的核酸的一些实例中，间隔物延伸序列可以改变活性，提供稳定性和/或提供用于修饰靶向基因组的核酸的位置。间隔物延伸序列可以改变靶上(on-target)或靶外(off-target)活性或特异性。在一些实例中，可以提供了一种间隔物延伸序列。间隔物延伸序列可以具有超过1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000或7000个或更多个核苷酸的长度。间隔物延伸序列可以具有小于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000个或更多个核苷酸的长度。间隔物延伸序列可以具有小于10个核苷酸的长度。间隔物延伸序列可以具有在10-30个核苷酸之间的长度。间隔物延伸序列可以具有在30-70个核苷酸之间的长度。
所述间隔物延伸序列可以包含另一个部分(例如，稳定性控制序列、核糖核酸内切酶结合序列、核酶)。所述部分可以减小或增加靶向核酸的核酸的稳定性。所述部分可以是转录终止子区段(即，转录终止序列)。所述部分可以在真核细胞中起作用。所述部分可以在原核细胞中起作用。所述部分可以在真核和原核细胞中起作用。合适的部分的非限制性实例包括：5' 帽(例如，7-甲基鸟苷酸酯帽(m7 G))、核糖开关序列(例如，以允许由蛋白和蛋白复合物实现的经调节的稳定性和/或经调节的可达性)、形成dsRNA双链体(即，发夹)的序列、将RNA靶向至亚细胞位置(例如，细胞核、线粒体、叶绿体等)的序列、提供跟踪的修饰或序列(例如，直接缀合至荧光分子，缀合至促进荧光检测的部分，允许荧光检测的序列，等)和/或提供蛋白(例如，在DNA上起作用的蛋白，包括转录活化剂、转录阻遏物、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰基转移酶、组蛋白脱乙酰基酶等)的结合位点的修饰或序列。
间隔物序列
所述间隔物序列与目标靶标核酸中的序列杂交。靶向基因组的核酸的间隔物可以通过杂交(即，碱基配对)以序列特异性的方式与靶标核酸相互作用。所述间隔物的核苷酸序列可以随目标靶标核酸的序列变化。
在本文的CRISPR/Cas系统中，可以将间隔物序列设计成与靶标核酸杂交，所述靶标核酸位于在所述系统中使用的Cas9酶的PAM的5'侧。所述间隔物可以与靶标序列完美匹配或可以具有错配。每种Cas9酶具有它在靶标DNA中识别的特定PAM序列。例如，化脓链球菌在靶标核酸中识别包含序列5'-NRG-3'的PAM，其中R包含A或G，其中N是任何核苷酸，且N在被间隔物序列靶向的靶标核酸序列的3'紧邻处。
所述靶标核酸序列可以包含20个核苷酸。所述靶标核酸可以包含小于20个核苷酸。所述靶标核酸可以包含超过20个核苷酸。所述靶标核酸可以包含至少5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。所述靶标核酸可以包含至多5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。所述靶标核酸序列可以包含在PAM的第一个核苷酸的5'侧紧邻的20个碱基。例如，在包含5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3' (SEQ ID NO.5270)的序列中，靶标核酸可以包含与N对应的序列，其中N是任何核苷酸，且标下划线的NRG序列是化脓链球菌PAM。
与靶标核酸杂交的间隔物序列可以具有至少约6个核苷酸(nt)的长度。所述间隔物序列可以是至少约6个核苷酸、至少约10个核苷酸、至少约15个核苷酸、至少约18个核苷酸、至少约19个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约25个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约35个核苷酸或至少约40个核苷酸、约6个核苷酸至约80个核苷酸、约6个核苷酸至约50个核苷酸、约6个核苷酸至约45个核苷酸、约6个核苷酸至约40个核苷酸、约6个核苷酸至约35个核苷酸、约6个核苷酸至约30个核苷酸、约6个核苷酸至约25个核苷酸、约6个核苷酸至约20个核苷酸、约6个核苷酸至约19个核苷酸、约10个核苷酸至约50个核苷酸、约10个核苷酸至约45个核苷酸、约10个核苷酸至约40个核苷酸、约10个核苷酸至约35个核苷酸、约10个核苷酸至约30个核苷酸、约10个核苷酸至约25个核苷酸、约10个核苷酸至约20个核苷酸、约10个核苷酸至约19个核苷酸、约19个核苷酸至约25个核苷酸、约19个核苷酸至约30个核苷酸、约19个核苷酸至约35个核苷酸、约19个核苷酸至约40个核苷酸、约19个核苷酸至约45个核苷酸、约19个核苷酸至约50个核苷酸、约19个核苷酸至约60个核苷酸、约20个核苷酸至约25个核苷酸、约20个核苷酸至约30个核苷酸、约20个核苷酸至约35个核苷酸、约20个核苷酸至约40个核苷酸、约20个核苷酸至约45个核苷酸、约20个核苷酸至约50个核苷酸、或约20个核苷酸至约60个核苷酸。所述间隔物序列可以包含20个核苷酸。所述间隔物可以包含19个核苷酸。在一些实例中，所述间隔物可以包含18个核苷酸。在一些实例中，所述间隔物可以包含22个核苷酸。
在一些实例中，在所述间隔物序列和所述靶标核酸之间的互补性百分比是至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或100%。在一些实例中，在所述间隔物序列和所述靶标核酸之间的互补性百分比是至多约30%、至多约40%、至多约50%、至多约60%、至多约65%、至多约70%、至多约75%、至多约80%、至多约85%、至多约90%、至多约95%、至多约97%、至多约98%、至多约99%或100%。在一些实例中，在所述靶标核酸的互补链的靶标序列的最5'侧6个连续核苷酸上，在所述间隔物序列和所述靶标核酸之间的互补性百分比是100%。在约20个连续核苷酸上，在所述间隔物序列和所述靶标核酸之间的互补性百分比可以是至少60%。所述间隔物序列和所述靶标核酸的长度可以相差1-6个核苷酸，其可以被视作一个或多个凸起物。
可以使用计算机程序设计或选择间隔物序列。所述计算机程序可以使用变量，诸如预测的解链温度、二级结构形成、预测的退火温度、序列同一性、基因组背景、染色质可达性、%GC、基因组发生频率(例如，属于相同或类似的序列，但是由于错配、插入或缺失而在一个或多个斑点中变化)、甲基化状态、SNP的存在等。
最小CRISPR重复序列
最小CRISPR重复序列可以是与参考CRISPR重复序列(例如，来自化脓链球菌的crRNA)具有至少约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%序列同一性的序列。
最小CRISPR重复序列可以包含可以与细胞中的最小tracrRNA序列杂交的核苷酸。所述最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列可以形成双链体，即碱基配对的双链结构。所述最小CRISPR重复序列和所述最小tracrRNA序列可以一起结合定位多肽。所述最小CRISPR重复序列的至少部分与最小tracrRNA序列杂交。所述最小CRISPR重复序列的至少部分可以包含与最小tracrRNA序列的至少约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%互补性。所述最小CRISPR重复序列的至少部分可以包含与最小tracrRNA序列的至多约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%互补性。
所述最小CRISPR重复序列可以具有约7个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，所述最小CRISPR重复序列的长度是约7个核苷酸(nt)至约50个核苷酸、约7个核苷酸至约40个核苷酸、约7个核苷酸至约30个核苷酸、约7个核苷酸至约25个核苷酸、约7个核苷酸至约20个核苷酸、约7个核苷酸至约15个核苷酸、约8个核苷酸至约40个核苷酸、约8个核苷酸至约30个核苷酸、约8个核苷酸至约25个核苷酸、约8个核苷酸至约20个核苷酸、约8个核苷酸至约15个核苷酸、约15个核苷酸至约100个核苷酸、约15个核苷酸至约80个核苷酸、约15个核苷酸至约50个核苷酸、约15个核苷酸至约40个核苷酸、约15个核苷酸至约30个核苷酸、或约15个核苷酸至约25个核苷酸。在一些实例中，所述最小CRISPR重复序列可以是大约9个核苷酸的长度。所述最小CRISPR重复序列可以是大约12个核苷酸的长度。
所述最小CRISPR重复序列可以与参考最小CRISPR重复序列(例如，来自化脓链球菌的野生型crRNA)在至少6、7或8个连续核苷酸的区段上具有至少约60%同一性。例如，所述最小CRISPR重复序列可以与参考最小CRISPR重复序列在至少6、7或8个连续核苷酸的区段上具有至少约65%同一性、至少约70%同一性、至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约95%同一性、至少约98%同一性、至少约99%同一性或100%同一性。
最小tracrRNA序列
最小tracrRNA序列可以是与参考tracrRNA序列(例如，来自化脓链球菌的野生型tracrRNA)具有至少约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%序列同一性的序列。
最小tracrRNA序列可以包含与细胞中的最小CRISPR重复序列杂交的核苷酸。最小tracrRNA序列和最小CRISPR重复序列形成双链体，即碱基配对的双链结构。所述最小tracrRNA序列和所述最小CRISPR重复序列可以一起结合定位多肽。所述最小tracrRNA序列的至少部分可以与所述最小CRISPR重复序列杂交。所述最小tracrRNA序列与所述最小CRISPR重复序列可以具有至少约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%互补性。
所述最小tracrRNA序列可以具有约7个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，所述最小tracrRNA序列可以是约7个核苷酸(nt)至约50个核苷酸、约7个核苷酸至约40个核苷酸、约7个核苷酸至约30个核苷酸、约7个核苷酸至约25个核苷酸、约7个核苷酸至约20个核苷酸、约7个核苷酸至约15个核苷酸、约8个核苷酸至约40个核苷酸、约8个核苷酸至约30个核苷酸、约8个核苷酸至约25个核苷酸、约8个核苷酸至约20个核苷酸、约8个核苷酸至约15个核苷酸、约15个核苷酸至约100个核苷酸、约15个核苷酸至约80个核苷酸、约15个核苷酸至约50个核苷酸、约15个核苷酸至约40个核苷酸、约15个核苷酸至约30个核苷酸或约15个核苷酸至约25个核苷酸的长度。所述最小tracrRNA序列可以是大约9个核苷酸的长度。所述最小tracrRNA序列可以是大约12个核苷酸。所述最小tracrRNA可以由在Jinek等人(同上)中描述的tracrRNA核苷酸23-48组成。
所述最小tracrRNA序列可以与参考最小tracrRNA (例如，来自化脓链球菌的野生型tracrRNA)序列在至少6、7或8个连续核苷酸的区段上具有至少约60%同一性。例如，所述最小tracrRNA序列可以与参考最小tracrRNA序列在至少6、7或8个连续核苷酸的区段上具有至少约65%同一性、约70%同一性、约75%同一性、约80%同一性、约85%同一性、约90%同一性、约95%同一性、约98%同一性、约99%同一性或100%同一性。
在最小CRISPR RNA和所述最小tracrRNA之间的双链体可以包含双螺旋。在最小CRISPR RNA和所述最小tracrRNA之间的双链体可以包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。在最小CRISPR RNA和所述最小tracrRNA之间的双链体可以包含至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。
所述双链体可以包含错配(即，所述双链体的两条链不是100%互补)。所述双链体可以包含至少约1、2、3、4或5个或更多个错配。所述双链体可以包含至多约1、2、3、4或5个或更多个错配。所述双链体可以包含不超过2个错配。
凸起物
在一些情况下，在所述最小CRISPR RNA和所述最小tracrRNA之间的双链体中可以存在“凸起物”。所述凸起物是所述双链体内的核苷酸的未配对区域。所述凸起物可以促进所述双链体与定位多肽的结合。凸起物可以包含在双链体的一侧上的未配对的5'-XXXY-3' (其中X是任何嘌呤，且Y包含可以与相对链上的核苷酸形成摆动对的核苷酸)和在双链体的另一侧上的未配对的核苷酸区域。在双链体的两侧上的未配对的核苷酸的数目可以是不同的。
在一个实例中，所述凸起物可以包含在所述凸起物的最小CRISPR重复序列链上的未配对的嘌呤(例如，腺嘌呤)。在一些实例中，凸起物可以包含所述凸起物的最小tracrRNA序列链的未配对的5'-AAGY-3'，其中Y包含可以与最小CRISPR重复序列链上的核苷酸形成摆动配对的核苷酸。
在所述双链体的最小CRISPR重复序列侧上的凸起物可以包含至少1、2、3、4或5个或更多个未配对的核苷酸。在所述双链体的最小CRISPR重复序列侧上的凸起物可以包含至多1、2、3、4或5个或更多个未配对的核苷酸。在所述双链体的最小CRISPR重复序列侧上的凸起物可以包含1个未配对的核苷酸。
在所述双链体的最小tracrRNA序列侧上的凸起物可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个未配对的核苷酸。在所述双链体的最小tracrRNA序列侧上的凸起物可以包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个未配对的核苷酸。在所述双链体的第二侧(例如，所述双链体的最小tracrRNA序列侧)上的凸起物可以包含4个未配对的核苷酸。
凸起物可以包含至少一个摆动配对。在一些实例中，凸起物可以包含至多一个摆动配对。凸起物可以包含至少一个嘌呤核苷酸。凸起物可以包含至少3个嘌呤核苷酸。凸起物序列可以包含至少5个嘌呤核苷酸。凸起物序列可以包含至少一个鸟嘌呤核苷酸。凸起物序列可以包含至少一个腺嘌呤核苷酸。
发夹
在不同的实例中，一个或多个发夹可以位于3' tracrRNA序列中的最小tracrRNA的3'侧。
所述发夹可以开始于在最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列双链体中的最后一个配对核苷酸的3'侧的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多个核苷酸。所述发夹可以开始于最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列双链体中的最后一个配对核苷酸的3' 侧的至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。
发夹可以包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多个连续核苷酸。发夹可以包含至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15个或更多个连续核苷酸。
发夹可以包含CC二核苷酸(即，两个连续胞嘧啶核苷酸)。
发夹可以包含形成双链体的核苷酸(例如，杂交在一起的在发夹中的核苷酸)。例如，发夹可以包含与3' tracrRNA序列的发夹双链体中的GG二核苷酸杂交的CC二核苷酸。
一个或多个发夹可以与定位多肽的向导RNA-相互作用区域相互作用。
在一些实例中，存在两个或更多个发夹，且在其他实例中，存在三个或更多个发夹。
3' tracrRNA序列
3' tracrRNA序列可以包含与参考tracrRNA序列(例如，来自化脓链球菌的tracrRNA)具有至少约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%序列同一性的序列。
所述3' tracrRNA序列可以具有约6个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，所述3' tracrRNA序列可以具有约6个核苷酸(nt)至约50个核苷酸、约6个核苷酸至约40个核苷酸、约6个核苷酸至约30个核苷酸、约6个核苷酸至约25个核苷酸、约6个核苷酸至约20个核苷酸、约6个核苷酸至约15个核苷酸、约8个核苷酸至约40个核苷酸、约8个核苷酸至约30个核苷酸、约8个核苷酸至约25个核苷酸、约8个核苷酸至约20个核苷酸、约8个核苷酸至约15个核苷酸、约15个核苷酸至约100个核苷酸、约15个核苷酸至约80个核苷酸、约15个核苷酸至约50个核苷酸、约15个核苷酸至约40个核苷酸、约15个核苷酸至约30个核苷酸、或约15个核苷酸至约25个核苷酸的长度。所述3' tracrRNA序列可以具有大约14个核苷酸的长度。
所述3' tracrRNA序列可以与参考3' tracrRNA序列(例如，来自化脓链球菌的野生型3' tracrRNA序列)在至少6、7或8个连续核苷酸的区段上具有至少约60%同一性。例如，所述3' tracrRNA序列可以与参考3' tracrRNA序列(例如，来自化脓链球菌的野生型3'tracrRNA序列)在至少6、7或8个连续核苷酸的区段上具有至少约60%同一性、约65%同一性、约70%同一性、约75%同一性、约80%同一性、约85%同一性、约90%同一性、约95%同一性、约98%同一性、约99%同一性或100%同一性。
所述3' tracrRNA序列可以包含超过一个形成双链体的区域(例如，发夹，杂交的区域)。3' tracrRNA序列可以包含两个形成双链体的区域。
所述3' tracrRNA序列可以包含茎环结构。所述3' tracrRNA中的茎环结构可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多个核苷酸。所述3' tracrRNA中的茎环结构可以包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。所述茎环结构可以包含功能性部分。例如，所述茎环结构可以包含适体、核酶、蛋白-相互作用发夹、CRISPR阵列、内含子或外显子。所述茎环结构可以包含至少约1、2、3、4或5个或更多个功能性部分。所述茎环结构可以包含至多约1、2、3、4或5个或更多个功能性部分。
所述3' tracrRNA序列中的发夹可以包含P-结构域。在一些实例中，所述P-结构域可以包含在发夹中的双链区域。
tracrRNA延伸序列
可以提供tracrRNA延伸序列，无论所述tracrRNA是在单分子向导还是双分子向导的背景下。tracrRNA延伸序列可以具有约1个核苷酸至约400个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以具有超过1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380或400个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以具有约20至约5000个或更多个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以具有超过1000个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以具有小于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400个或更多个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以具有小于1000个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以包含小于10个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以是10-30个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以是30-70个核苷酸的长度。
所述tracrRNA延伸序列可以包含功能性部分(例如，稳定性控制序列、核酶、核糖核酸内切酶结合序列)。所述功能性部分可以包含转录终止子区段(即，转录终止序列)。所述功能性部分可以具有约10个核苷酸(nt)至约100个核苷酸、约10个核苷酸至约20个核苷酸、约20个核苷酸至约30个核苷酸、约30个核苷酸至约40个核苷酸、约40个核苷酸至约50个核苷酸、约50个核苷酸至约60个核苷酸、约60个核苷酸至约70个核苷酸、约70个核苷酸至约80个核苷酸、约80个核苷酸至约90个核苷酸或约90个核苷酸至约100个核苷酸、约15个核苷酸至约80个核苷酸、约15个核苷酸至约50个核苷酸、约15个核苷酸至约40个核苷酸、约15个核苷酸至约30个核苷酸或约15个核苷酸至约25个核苷酸的总长度。所述功能性部分可以在真核细胞中起作用。所述功能性部分可以在原核细胞中起作用。所述功能性部分可以在真核和原核细胞中起作用。
合适的tracrRNA延伸功能性部分的非限制性实例包括3' 聚-腺苷酸化的尾巴、核糖开关序列(例如，以允许由蛋白和蛋白复合物实现的经调节的稳定性和/或经调节的可达性)、形成dsRNA双链体(即，发夹)的序列、将RNA靶向至亚细胞位置(例如，细胞核、线粒体、叶绿体等)的序列、提供跟踪的修饰或序列(例如，直接缀合至荧光分子，缀合至促进荧光检测的部分，允许荧光检测的序列，等)和/或提供蛋白(例如，在DNA上起作用的蛋白，包括转录活化剂、转录阻遏物、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰基转移酶、组蛋白脱乙酰基酶等)的结合位点的修饰或序列。tracrRNA延伸序列可以包含引物结合位点或分子指标(例如，条形码序列)。所述tracrRNA延伸序列可以包含一个或多个亲和标签。
单分子向导接头序列
单分子向导核酸的接头序列可以具有约3个核苷酸至约100个核苷酸的长度。在Jinek等人(同上)中，例如，使用简单的4个核苷酸“四环”(-GAAA-), Science, 337(6096):816-821 (2012)。示例性接头具有约3个核苷酸(nt)至约90个核苷酸、约3个核苷酸至约80个核苷酸、约3个核苷酸至约70个核苷酸、约3个核苷酸至约60个核苷酸、约3个核苷酸至约50个核苷酸、约3个核苷酸至约40个核苷酸、约3个核苷酸至约30个核苷酸、约3个核苷酸至约20个核苷酸、约3个核苷酸至约10个核苷酸的长度。例如，所述接头可以具有约3个核苷酸至约5个核苷酸、约5个核苷酸至约10个核苷酸、约10个核苷酸至约15个核苷酸、约15个核苷酸至约20个核苷酸、约20个核苷酸至约25个核苷酸、约25个核苷酸至约30个核苷酸、约30个核苷酸至约35个核苷酸、约35个核苷酸至约40个核苷酸、约40个核苷酸至约50个核苷酸、约50个核苷酸至约60个核苷酸、约60个核苷酸至约70个核苷酸、约70个核苷酸至约80个核苷酸、约80个核苷酸至约90个核苷酸或约90个核苷酸至约100个核苷酸的长度。单分子向导核酸的接头可以是在4-40个核苷酸之间。接头可以是至少约100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000个或更多个核苷酸。接头可以是至多约100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000个或更多个核苷酸。
接头可以包含许多种序列中的任一种，尽管在一些实例中，所述接头将不包含与向导RNA的其他部分具有广泛同源性区域的序列，所述广泛同源性区域可能引起干扰所述向导物的其他功能区域的分子内结合。在Jinek等人(同上)中，使用简单的4个核苷酸序列-GAAA-, Science, 337(6096):816-821 (2012)，但是同样可以使用众多其他序列，包括更长的序列。
所述接头序列可以包含功能性部分。例如，所述接头序列可以包含一个或多个特征，包括适体、核酶、蛋白-相互作用发夹、蛋白结合位点、CRISPR阵列、内含子或外显子。所述接头序列可以包含至少约1、2、3、4或5个或更多个功能性部分。在一些实例中，所述接头序列可以包含至多约1、2、3、4或5个或更多个功能性部分。
靶向基因组的核酸和定位多肽的复合物
靶向基因组的核酸与定位多肽(例如，核酸引导的核酸酶诸如Cas9)相互作用，由此形成复合物。靶向基因组的核酸将所述定位多肽引导至靶标核酸。
核糖核蛋白复合物(RNP)
可以将定位多肽和靶向基因组的核酸各自分别施用于细胞或患者。另一方面，可以使定位多肽与一种或多种向导RNA、或一种或多种crRNA以及在一起的tracrRNA预先形成复合物。所述定位多肽可以与一种或多种sgRNA预先形成复合物。然后可以将预先形成复合物的物质施用于细胞或患者。这样的预先形成复合物的物质被称作核糖核蛋白颗粒(RNP)。RNP中的定位多肽可以是例如Cas9核酸内切酶或Cpf1核酸内切酶。定位多肽可以在N-末端、C-末端或N-末端和C-末端两者处侧接一个或多个核定位信号(NLS)。例如，Cas9核酸内切酶可以侧接两个NLS，一个NLS位于N-末端，且第二个NLS位于C-末端。NLS可以是本领域已知的任何NLS，诸如SV40 NLS。靶向基因组的核酸与RNP中的定位多肽的重量比可以为1:1。例如，sgRNA与RNP中的Cas9核酸内切酶的重量比可以为1:1。
靶标序列选择
相对于特定参考基因座在5'边界和/或3'边界的位置中的转移可以被用于促进或增强基因编辑的特定应用，这部分地取决于为所述编辑选择的核酸内切酶系统，如在本文中进一步描述和举例说明的。
在这样的靶标序列选择的第一个非限制性实例中，许多核酸内切酶系统具有可以指导初步选择潜在靶标位点用于切割的规则或标准，诸如在CRISPR II型或V型核酸内切酶的情况下在邻近DNA切割位点的特定位置对PAM序列基序的要求。
在靶标序列选择或优化的另一个非限制性实例中，可以相对于在靶标活性的频率评估关于靶标序列和基因编辑核酸内切酶的特定组合的“靶外”活性频率(即在选择的靶标序列以外的位点处发生的DSB的频率)。在一些情况下，已经在期望的基因座处正确地编辑的细胞可以具有相对于其他细胞的选择性优点。选择性优点的示例性的但是非限制性的实例包括属性的获得，诸如增强的复制速率、持久性、对某些条件的抗性、增强的成功移植物植入的比率或引入患者中之后的体内持久性、和与维持有关的其他属性、或增加的这样的细胞的数目或生存力。在其他情况下，通过一种或多种用于鉴定、分类或以其他方式选择已经被正确地编辑的细胞的筛选方法，可以确定地选择已经在期望的基因座处正确地编辑的细胞。选择性优点和定向选择方法可以利用与校正有关的表型。在一些情况下，可以将细胞编辑两次或更多次以便建立第二个修饰，其产生用于选择或纯化预期的细胞群体的新表型。通过添加针对可选择的或可筛选的标志物的第二种gRNA，可以建立这样的第二个修饰。在一些情况下，使用含有cDNA以及选择标记的DNA片段，可以在期望的基因座处正确地编辑细胞。
不论任何选择性优点是否适用或任何定向选择是否应用于特定情况，通过靶外频率的考虑也可以指导靶标序列选择，以便增强应用的有效性和/或减小在期望的靶标以外的位点处的不希望的改变的潜力。如在本文中和在本领域中进一步描述和举例说明的，靶外活性的发生可以受许多因素影响，包括靶标位点和各种靶外位点之间的相似性和不同性、以及使用的特定核酸内切酶。生物信息学工具是可得到的，其辅助靶外活性的预测，且这样的工具经常还可以用于鉴定靶外活性的最可能位点，然后可以将其在实验场合中评估以评价靶外活性与靶上活性的相对频率，由此允许选择具有较高相对靶上活性的序列。这样的技术的示例性实例提供在本文中，且其他是本领域已知的。
靶标序列选择的另一个方面涉及同源重组事件。共享同源性区域的序列可以充当导致插入序列缺失的同源重组事件的焦点。这样的重组事件发生在染色体和其他DNA序列的正常复制过程中，并且也发生在当合成DNA序列时的其他时间，诸如在修复双链断裂(DSB)的情况下，所述双链断裂(DSB)在正常细胞复制周期中定期发生，但是也可以被不同事件(诸如紫外线和DNA断裂的其他诱导物)的发生或某些试剂(诸如不同的化学诱导物)的存在而增强。许多这样的诱导物会引起DSB在基因组中无差别地发生，并且DSB可以经常在正常细胞中被诱导和修复。在修复过程中，可以以完全保真度重构原始序列，然而，在一些情况下，在DSB位点处引入小插入或缺失(被称作“插入/缺失”)。
也可以在特定位置特异性地诱导DSB，如在本文描述的核酸内切酶系统的情况下，其可以用于在选择的染色体位置处引起定向或优先基因修饰事件。在许多情况下可以利用同源序列在DNA修复(以及复制)的背景下发生重组的趋势，并且是基因编辑系统(诸如CRISPR)的一种应用的基础，其中使用同源性引导的修复将目标序列(其通过使用“供体”多核苷酸提供)插入期望的染色体位置。
还可以使用在特定序列(其可以是小的“微同源性”的区域，其可以包含少至10个碱基对或更少)之间的同源性区域来实现期望的缺失。例如，可以将单个DSB引入在表现出与附近序列的微同源性的位点处。在这样的DSB的正常修复过程中，以高频率发生的结果是插入序列的缺失，其原因是DSB和伴随的细胞修复过程促进了重组。
然而，在一些情况下，选择在同源性区域内的靶标序列也可以引起大得多的缺失，包括基因融合(当缺失是在编码区中时)，其在特定情况下可以是或不是期望的。
本文提供的实例进一步举例说明了选择不同靶标区域用于建立DSB，所述DSB被设计成诱导导致RHO蛋白活性的恢复的替换，以及选择这样的区域内的特定靶标序列，其被设计成相对于靶上事件使靶外事件最小化。
同源性引导的修复(HDR)/供体核苷酸
同源性引导的修复是用于修复双链断裂(DSB)的细胞机制。最常见形式是同源重组。存在另外的HDR途径，包括单链退火和替代HDR。基因组工程工具允许研究人员操作细胞的同源重组途径以建立对基因组的位点特异性修饰。已经发现，细胞可以使用以反式提供的合成的供体分子修复双链断裂。因此，通过在特定突变附近引入双链断裂并提供合适的供体，可以在基因组中进行靶向的改变。与1/106的接受单独同源供体的细胞的比率相比，特异性切割会使HDR比率增加超过1,000倍。在特定核苷酸处的同源性引导的修复(HDR)的比率是到切割位点的距离的函数，所以选择重叠的或最近的靶标位点是重要的。基因编辑提供了优于基因添加的优势，因为原位校正使基因组的剩余部分不受干扰。
为HDR编辑供给的供体显著地变化，但是可以含有预期的序列，其具有小或大侧接同源性臂以允许与基因组DNA退火。侧接引入的基因变化的同源区域可以是30个碱基对或更小，或大至可以含有启动子、cDNA等的几千碱基盒。已经使用单链和双链寡核苷酸供体。这些寡核苷酸的大小范围为从小于100个核苷酸至超过许多kb，尽管还可以制备和使用更长的ssDNA。可以使用双链供体，包括PCR扩增子、质粒和小型环。一般而言，已经发现，AAV载体可以是递送供体模板的非常有效的方式，尽管各种供体的包装限制是<5kb。供体的活性转录会使HDR增加3倍，从而指示启动子的包含可以增加转化。相反，供体的CpG甲基化会减少基因表达和HDR。
用于校正突变的供体核苷酸经常很小(＜300bp)。这是有利的，因为HDR效率可以与供体分子的大小成反比。而且，预期供体模板可以适合于大小受限的AAV分子，这已被显示是供体模板递送的有效手段。
除了野生型核酸内切酶(诸如Cas9)以外，存在切口酶变体，其具有一个或其他被失活的核酸酶结构域，从而导致仅一条DNA链的切割。可以从各种Cas切口酶或使用侧接靶标区域的切口酶对指导HDR。供体可以是单链的、切口的或dsDNA。
可以给供体DNA供给核酸酶，或独立地通过多种不同的方法，例如通过转染、纳米颗粒、显微注射或病毒转导。已经提出许多连接选择来增加供体对于HDR的可用性。实例包括将供体连接至核酸酶，连接至结合在附近的DNA结合蛋白，或连接至参与DNA末端结合或修复的蛋白。
修复途径选择可以通过许多培养条件(诸如影响细胞周期的那些)或通过DNA修复和有关蛋白的靶向来引导。例如，为了增加HDR，可以抑制关键的NHEJ分子，诸如KU70、KU80或DNA连接酶IV。
在没有供体存在时，使用几种非同源修复途径可以连接来自DNA断裂的末端或来自不同断裂的末端，其中在连接部处几乎没有或根本没有碱基配对的情况下连接DNA末端。除了规范NHEJ以外，存在类似的修复机制，诸如ANHEJ。如果存在两个断裂，可以缺失或倒置插入区段。NHEJ修复途径可以导致在接头处的插入、缺失或突变。在核酸酶切割之后，使用NHEJ将15-kb可诱导的基因表达盒插入人细胞系中的确定基因座中。已经描述了插入大型诱导型基因表达盒的方法[Maresca, M., Lin, V.G., Guo, N. & Yang, Y., Genome Res23, 539-546 (2013), Suzuki等人 Nature, 540, 144-149 (2016)]。
除了通过NHEJ或HDR进行基因组编辑以外，已经进行了使用NHEJ途径和HR的位点特异性的基因插入。组合方法可能适用于某些设置，可能包括内含子/外显子边界。NHEJ可能证明对内含子中的连接有效，而无错误的HDR可能更适合于编码区域中。
RHO基因内的示例性修饰包括在上面提及的突变内或附近(近端)、诸如在特定突变的上游或下游小于3 kb、小于2kb、小于1kb、小于0.5kb的区域内的替换。考虑到RHO基因中的突变的相对广泛的变异，应理解的是，会预期上面提及的替换的许多变异(包括但不限于较大以及较小的缺失)导致RHO蛋白活性的恢复。
这样的变体可以包括在5'和/或3'方向上比所讨论的特定突变更大或在任一方向上更小的替换。因此，相对于特定替换的“接近”或“近端”，意指与期望的替换边界(在本文中也称为终点)相关的SSB或DSB基因座可以在距参考基因座(例如突变位点)小于约3 kb的区域内。SSB或DSB基因座可以更近端，并且在2 kb内、1 kb内、0.5 kb内或0.1 kb内。在小替换的情况下，期望的终点可以在参考基因座处或“邻近”参考基因座，通过这一点，预期终点可以在距参考基因座的100 bp内、50 bp内、25 bp内或小于约10 bp至5 bp内。
更大或更小的替换可以提供相同的益处，只要恢复RHO蛋白活性。因此，预期本文所述和举例说明的替换的许多变异可以有效地改善色素性视网膜炎(RP)。
关于SSB或DSB的术语“附近”或“近端”是指SSB或DSB在P23H突变的2 kb内、1 kb内、0.5 kb内、0.25 kb内、0.2 kb内或0.1 kb内。
核酸修饰(化学和结构修饰)
在一些情况下，引入细胞中的多核苷酸可以包含一种或多种修饰，所述修饰可以单独地或组合地使用，例如，以增强活性、稳定性或特异性，改变递送，减少在宿主细胞中的先天性免疫应答，或用于其他增强，如在本文中进一步描述的和本领域已知的。
在一些实例中，将修饰的核苷酸可以用在CRISPR/Cas9/Cpf1系统中，在该情况下，可以修饰向导RNA (单分子向导或双分子向导)和/或引入细胞中的编码Cas或Cpf1核酸内切酶的DNA或RNA，如下面描述和举例说明的。这样的修饰的核苷酸可以用在CRISPR/Cas9/Cpf1系统中以编辑任何一个或多个基因组基因座。
为了这样的应用的非限制性举例说明的目的使用CRISPR/Cas9/Cpf1系统，可以使用向导RNA的修饰来增强包含向导RNA(其可以是单分子向导或双分子)和Cas或Cpf1核酸内切酶的CRISPR/Cas9/Cpf1基因组编辑复合物的形成或稳定性。向导RNA的修饰也可以或可替代地用于增强基因组编辑复合物与基因组中的靶标序列之间的相互作用的起始、稳定性或动力学，这可以用于例如增强靶上活性。向导RNA的修饰也可以或可替代地用于增强特异性，例如，靶上位点处的基因组编辑相对于在其他(靶外)位点处的效应的相对比率。
修饰也可以或可替代地用于增加向导RNA的稳定性，例如，通过增加它对存在于细胞中的核糖核酸酶(RNA酶)的降解的抗性，由此引起它在所述细胞中的半衰期增加。在其中通过RNA(其需要翻译才能产生核酸内切酶)将Cas或Cpf1核酸内切酶引入要编辑的细胞中的方面中，增强向导RNA半衰期的修饰可以是特别有用的，因为增加与编码核酸内切酶的RNA同时引入的向导RNA的半衰期可以用于增加所述向导RNA和所述编码的Cas或Cpf1核酸内切酶在细胞中共存的时间。
修饰也可以或可替代地用于减小引入细胞中的RNA引起先天性免疫应答的可能性或程度。这样的应答(其已经在RNA干扰(RNAi)的背景下确定地表征，包括小干扰RNA(siRNA)，如在下面和在本领域中描述的)倾向于与减小的RNA半衰期和/或细胞因子或其他因子(其与免疫应答有关)的引起相关。
还可以对引入细胞中的编码核酸内切酶的RNA做出一种或多种类型的修饰，包括、但不限于，增强RNA的稳定性的修饰(诸如通过增加存在于细胞中的RNA酶对它的降解)，增强得到的产物(即核酸内切酶)的翻译的修饰，和/或减小引入细胞中的RNA引起先天性免疫应答的可能性或程度的修饰。
同样可以使用修饰的组合，诸如前述和其他。在CRISPR/Cas9/Cpf1的情况下，例如，可以对向导RNA (包括上面举例说明的那些)做出一种或多种类型的修饰，和/或可以对编码Cas核酸内切酶的RNA (包括上面举例说明的那些)做出一种或多种类型的修饰。
作为举例说明，在CRISPR/Cas9/Cpf1系统中使用的向导RNA或其他更小的RNA可以通过化学方式容易地合成，从而使许多修饰能容易地并入，如在下面举例说明的和在本领域中描述的。尽管化学合成程序在继续增加，但是通过诸如高效液相色谱法(HPLC，其避免使用凝胶诸如PAGE)等程序对这样的RNA的纯化倾向于变得更有挑战性，因为多核苷酸长度显著地增加超过了100个左右核苷酸。可用于制备较大长度的化学修饰的RNA的一个方案是生产连接在一起的两个或更多个分子。通过酶法更容易地制备长得多的RNA，诸如编码Cas9核酸内切酶的那些。尽管更少类型的修饰可用于用在酶促地生产的RNA中，仍然存在可以用于例如增强稳定性、减小先天性免疫应答的可能性或程度、和/或增强其他属性的修饰，如在下面和本领域中进一步描述的；并且新类型的修饰正在正式开发中。
作为不同类型的修饰的举例说明，特别是经常与较小的化学合成的RNA一起使用的那些，修饰可以包含一个或多个在糖的2'位置处修饰的核苷酸，在一些方面，为2'-O-烷基、2'-O-烷基-O-烷基或2'-氟-修饰的核苷酸。在一些方面，RNA修饰可以包含在嘧啶核糖、脱碱基残基、或位于RNA的3'末端处的倒置碱基上的2'-氟、2'-氨基或2' O-甲基修饰。这样的修饰可以常规地并入寡核苷酸中，且这些寡核苷酸已经被证实具有比2'-脱氧寡核苷酸更高的对给定靶标的Tm (即，更高的靶标结合亲和力)。
已经证实许多核苷酸和核苷修饰使得它们并入其中的寡核苷酸比天然寡核苷酸更耐受核酸酶消化；这些修饰的寡物比未修饰的寡核苷酸完整地存活更长的时间。修饰的寡核苷酸的具体实例包括包含修饰的主链(例如，硫代磷酸酯、磷酸三酯、膦酸甲酯、短链烷基或环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖间键)的那些。一些寡核苷酸是具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的那些，特别是CH2-NH-O-CH2、CH、~N(CH3)~O~CH2 (被称作亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链)、CH2 --O--N (CH3)-CH2、CH2 -N (CH3)-N (CH3)-CH2和O-N (CH3)- CH2 -CH2主链，其中天然磷酸二酯主链被表示为O- P-- O- CH)；酰胺主链[参见De Mesmaeker等人, Ace. Chem. Res., 28:366-374 (1995)]；吗啉代主链结构(参见Summerton和Weller, 美国专利号5,034,506)；肽核酸(PNA)主链(其中寡核苷酸的磷酸二酯主链被聚酰胺主链替代，所述核苷酸直接地或间接地结合至聚酰胺主链的氮杂氮原子，参见Nielsen等人, Science 1991, 254, 1497)。含磷键包括、但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包含3'亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包含3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'键的硼代磷酸酯、这些的2'-5'连接的类似物和具有倒置极性的那些，其中邻近的核苷单元对以3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'连接；参见美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050。
基于吗啉代的寡聚体化合物描述在Braasch和David Corey, Biochemistry, 41(14): 4503-4510 (2002); Genesis, 第30卷, 第3期, (2001); Heasman, Dev. Biol.,243: 209-214 (2002); Nasevicius等人, Nat. Genet., 26:216-220 (2000); Lacerra等人, Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 9591-9596 (2000)；和1991年7月23日授权的美国专利号5,034,506。
环己烯基核酸寡核苷酸模拟物描述在Wang等人, J. Am. Chem. Soc., 122:8595-8602 (2000)中。
在其中不包括磷原子的修饰的寡核苷酸主链具有通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。这些包括具有吗啉代键(部分地从核苷的糖部分形成)的那些；硅氧烷主链；硫化物，亚砜和砜主链；甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链；含有烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其他主链；参见美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439。
还可以包括一个或多个被取代的糖部分，例如，在2'位置处的以下之一：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3 OCH3、OCH3 O(CH2)n CH3、O(CH2)n NH2或O(CH2)n CH3，其中n是从1至约10；C1至C10低级烷基、烷氧基烷氧基、被取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2 CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；被取代的甲硅烷基；RNA切割基团；报告基团；嵌入剂；用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团；或用于改善寡核苷酸的药效动力学性质的基团，和具有类似性质的其他取代基。在一些方面，修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3，也被称作2'-O-(2-甲氧基乙基)) (Martin等人, HeIv. Chim. Acta, 1995, 78, 486)。其他修饰包括2'-甲氧基(2'-O-CH3)、2'-丙氧基(2'-OCH2 CH2CH3)和2'-氟(2'-F)。还可以在寡核苷酸的其他位置、特别是3'末端核苷酸上的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置处做出类似的修饰。寡核苷酸也可以具有糖模拟物，诸如替代呋喃型戊糖基的环丁基。
在一些实例中，可以用新型的基团替代核苷酸单元的糖和核苷间键(即，主链)。可以为了与适当的核酸目标化合物杂交维持碱基单位。一种这样的寡聚体化合物(已经被证实具有优秀杂交性能的寡核苷酸模拟物)被称作肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，可以用含有酰胺的主链(例如，氨基乙基甘氨酸主链)替代寡核苷酸的糖-主链。可以保留核苷碱基，且直接地或间接地结合至主链的酰胺部分的氮杂氮原子。教导PNA化合物的制备的代表性美国专利包含、但不限于美国专利号5,539,082、5,714,331和5,719,262。PNA化合物的其他教导可以参见Nielsen等人, Science, 254: 1497-1500 (1991)。
向导RNA还可以额外地或可替代地包括核苷碱基(经常在本领域中简单地称作“碱基”)修饰或取代。本文中使用的“未修饰的”或“天然的”核苷碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核苷碱基包括在天然核酸中仅稀少地或短暂地发现的核苷碱基，例如，次黄嘌呤，6-甲基腺嘌呤，5-Me嘧啶，特别是5-甲基胞嘧啶(也被称作5-甲基-2' 脱氧胞嘧啶，且经常在本领域中称作5-Me-C)，5-羟基甲基胞嘧啶(HMC)，糖基HMC和龙胆二糖基HMC，以及合成的核苷碱基，例如，2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其他杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N6 (6-氨基己基)腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。Kornberg, A., DNA Replication, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 第75-77页(1980); Gebeyehu等人, Nucl. AcidsRes. 15:4513 (1997)。还可以包括本领域已知的“通用”碱基，例如，肌苷。已经证实5-Me-C取代会使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi, Y. S., 见Crooke, S. T. 和Lebleu, B., 编, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton,1993, 第276-278页)，并且是碱基取代的方面。
修饰的核苷碱基可以包含其他的合成的和天然的核苷碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假-尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫基烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代、特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤(quanine)和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
核苷碱基可以进一步包含在美国专利号3,687,808中公开的那些，在'TheConcise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering', 第858-859页,Kroschwitz, J.I., 编John Wiley & Sons, 1990中公开的那些，由Englisch等人,Angewandle Chemie, International Edition', 1991, 30, 第613页公开的那些，和由Sanghvi, Y. S., 第15章, Antisense Research and Applications', 第289- 302页,Crooke, S.T. 和Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993公开的那些。这些核苷碱基中的某些对于增加本发明的寡聚体化合物的结合亲和力是特别有用的。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包含2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经证实5-甲基胞嘧啶取代会使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2ºC (Sanghvi,Y.S., Crooke, S.T. 和Lebleu, B., 编, 'Antisense Research and Applications',CRC Press, Boca Raton, 1993, 第276-278页)，并且是碱基取代的方面，甚至更具体地当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。修饰的核苷碱基描述在美国专利号3,687,808, 以及4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；5,763,588；5,830,653；6,005,096；和美国专利申请公开2003/0158403。
因此，术语“修饰的”是指非天然的糖、磷酸酯或碱基，其并入向导RNA、核酸内切酶、或向导RNA和核酸内切酶二者中。不一定将给定的寡核苷酸中的所有位置均匀地修饰，并且实际上，前述修饰中的超过一种可以并入单个寡核苷酸中，或甚至并入寡核苷酸内的单个核苷中。
可以将向导RNA和/或编码核酸内切酶的mRNA (或DNA)化学连接至一个或多个增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的部分或缀合物。这样的部分包含，但不限于：脂质部分诸如胆固醇部分[Letsinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6553-6556(1989)]；胆酸[Manoharan等人, Bioorg. Med. Chem. Let., 4: 1053-1060 (1994)]；硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇[Manoharan等人, Ann. N. Y. Acad. Sci., 660: 306-309 (1992)和Manoharan等人, Bioorg. Med. Chem. Let., 3: 2765-2770 (1993)]；硫代胆甾醇[Oberhauser等人, Nucl. Acids Res., 20: 533-538 (1992)]；脂族链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基[Kabanov等人, FEBS Lett., 259: 327-330 (1990)和Svinarchuk等人, Biochimie, 75: 49- 54 (1993)]；磷脂，例如，二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基- 消旋-甘油-3-H-膦酸酯[Manoharan等人, Tetrahedron Lett., 36:3651-3654 (1995)和Shea等人, Nucl. Acids Res., 18: 3777-3783 (1990)]；多胺或聚乙二醇链[Mancharan等人, Nucleosides & Nucleotides, 14: 969-973 (1995)]；金刚烷乙酸[Manoharan等人, Tetrahedron Lett., 36: 3651-3654 (1995)]；棕榈基部分[(Mishra等人, Biochim. Biophys. Acta, 1264: 229-237 (1995)]；或十八烷基胺或己基氨基-羰基-t羟胆甾醇部分[Crooke等人, J. Pharmacol. Exp. Ther., 277: 923-937(1996)]。也参见美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717, 5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241, 5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941。
糖和其他部分可以用于将包含核苷酸的蛋白和复合物(诸如阳离子多核糖体和脂质体)靶向至特定位点。例如，肝细胞指导的转移可以由无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)介导；参见，例如，Hu, 等人, Protein Pept Lett. 21(10):1025-30 (2014)。本领域已知的和正式开发的其他系统可以用于将在本情况下使用的生物分子和/或其复合物靶向至特定目标靶标细胞。
这些靶向部分或缀合物可以包括与官能团(诸如伯或仲羟基)共价地结合的缀合物基团。本发明的缀合物基团包括嵌入剂、报告分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚体的药效动力学性质的基团、和增强寡聚体的药代动力学性质的基团。典型的缀合物基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸盐、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在本发明的上下文中，增强药效动力学性质的基团包括改善摄取、增强对降解的抗性和/或强化与靶标核酸的序列特异性杂交的基团。在本发明的上下文中，增强药代动力学性质的基团包括改善本发明的化合物的摄取、分布、代谢或排泄的基团。代表性的缀合物基团公开在国际专利申请号PCT/US92/09196(1992年10月23日提交，作为WO1993007883公开)和美国专利号6,287,860中。缀合物部分包括、但不限于：脂质部分诸如胆固醇部分、胆酸、硫醚(例如，己基-5-三苯甲基硫醇)、硫代胆甾醇、脂族链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如，二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵l,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸盐)、多胺或聚乙二醇链或金刚烷乙酸、棕榈基部分或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分。参见，例如，美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717, 5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241, 5,391,723；5,416,203, 5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941。
还可以通过多种方式修饰不太容易化学合成且通常通过酶促合成来生产的较长多核苷酸。这样的修饰可以包括，例如，某些核苷酸类似物的引入，特定序列或其他部分在分子的5'或3'末端处的并入，和其他修饰。作为举例说明，编码Cas9的mRNA是大约4 kb长度，且可以通过体外转录来合成。对mRNA的修饰可以用于，例如，增加它的翻译或稳定性(诸如通过增加它对细胞降解的抗性)，或减小RNA的引起先天性免疫应答的趋势，所述先天性免疫应答经常在引入外源RNA、特别是较长RNA(诸如编码Cas9的那种)之后在细胞中观察到。
在本领域中已经描述了众多这样的修饰，诸如聚腺苷酸尾巴、5'帽类似物(例如，抗反向帽类似物(Anti Reverse Cap Analog，ARCA)或m7G(5')ppp(5')G (mCAP))、修饰的5'或3' 非翻译区(UTR)、修饰的碱基(诸如假-UTP、2-硫-UTP、5-甲基胞苷-5'-三磷酸(5-甲基-CTP)或N6-甲基-ATP)的应用、或除去5'末端磷酸酯的磷酸酶处理。这些和其他修饰是本领域已知的，且RNA的新修饰正在正式开发中。
修饰的RNA存在众多商业供应商，包括例如，TriLink Biotech、AxoLabs、Bio-Synthesis Inc.、Dharmacon和许多其他。如TriLink所述的，例如，5-甲基-CTP可以用于赋予合乎需要的特征，诸如增加的核酸酶稳定性、增加的翻译、或减少的先天性免疫受体与体外转录的RNA的相互作用。还已经证实5-甲基胞苷-5'-三磷酸(5-甲基-CTP)、N6-甲基-ATP、以及假-UTP和2-硫-UTP会在培养物中和在体内减少先天性免疫刺激，同时增强翻译，如在下面提及的Kormann等人和Warren等人的出版物所举例说明的。
已经证实，在体内递送的化学修饰的mRNA可以用于实现改善的治疗效果；参见，例 如，Kormann等人, Nature Biotechnology 29, 154-157 (2011)。这样的修饰可以用于，例如，增加RNA分子的稳定性和/或减小它的免疫原性。使用化学修饰诸如假-U、N6-甲基-A、2-硫-U和5-甲基-C，发现分别用2-硫-U和5-甲基-C取代仅1/4的尿苷和胞苷残基会导致小鼠中toll-样受体(TLR)介导的mRNA识别的显著减少。通过减少先天性免疫系统的活化，这些修饰可以用于有效地增加体内mRNA的稳定性和寿命；参见，例如，Kormann等人(同上)。
还已经证实，合成的信使RNA(其并入被设计成绕过先天性抗病毒应答的修饰)的重复施用可以将分化的人细胞重新程序化至多能性的。参见，例如，Warren, 等人, CellStem Cell, 7(5):618-30 (2010)。这样的作为主要重新程序化蛋白起作用的修饰的mRNA可以是重新程序化多种人细胞类型的有效工具。这样的细胞被称作诱导的多能性干细胞(iPSC)，并且发现酶促地合成的包含5-甲基-CTP、假-UTP和抗反向帽类似物(ARCA)的RNA可以用于有效地避免细胞的抗病毒应答；参见，例如，Warren等人(同上)。
在本领域中描述的多核苷酸的其他修饰包括，例如，聚腺苷酸尾巴的应用，5'帽类似物(诸如m7G(5')ppp(5')G (mCAP))的添加，5'或3' 非翻译区(UTR)的修饰，或除去5'末端磷酸酯的磷酸酶处理，且新方案正在正式开发中。
结合RNA干扰(RNAi)(包括小干扰RNA (siRNA))的修饰已经开发了许多适用于制备用于本文中的用途的修饰的RNA的组合物和技术。siRNA提出了特定体内挑战，因为它们通过mRNA干扰对基因沉默的影响通常是短暂的，这可以需要重复施用。另外，siRNA是双链RNA (dsRNA)，且哺乳动物细胞具有已经进化以检测和中和dsRNA(其经常是病毒感染的副产物)的免疫应答。因此，存在哺乳动物酶诸如PKR (dsRNA-响应性的激酶)和潜在地视黄酸-可诱导的基因I (RIG-I)(其可以介导对dsRNA的细胞应答)、以及Toll-样受体(诸如TLR3、TLR7和TLR8)(其可以响应于这样的分子触发细胞因子的诱导)；参见，例如，以下文献的综述：Angart等人, Pharmaceuticals (Basel) 6(4): 440-468 (2013)；Kanasty等人,Molecular Therapy 20(3): 513-524 (2012)；Burnett等人, Biotechnol J. 6(9):1130-46 (2011)；Judge和MacLachlan, Hum Gene Ther 19(2):111-24 (2008)。
已经开发了多种修饰，并用于增强RNA稳定性、减少先天性免疫应答和/或实现其他益处，所述其他益处可以关于多核苷酸向人细胞中的引入是有用的，如本文中所述的；参见，例如，以下文献的综述：Whitehead KA等人, Annual Review of Chemical andBiomolecular Engineering, 2: 77-96 (2011); Gaglione和Messere, Mini Rev MedChem, 10(7):578-95 (2010); Chernolovskaya等人, Curr Opin Mol Ther., 12(2):158-67 (2010); Deleavey等人, Curr Protoc Nucleic Acid Chem Chapter 16:Unit16.3 (2009); Behlke, Oligonucleotides 18(4):305-19 (2008); Fucini等人,Nucleic Acid Ther 22(3): 205-210 (2012); Bremsen等人, Front Genet 3:154(2012)。
如上面所指出的，修饰的RNA存在许多商业供应商，其中的许多已经擅长于被设计成改善siRNA的有效性的修饰。基于在文献中报道的多种发现，提供了多种方案。例如，Dharmacon注意到，用硫对非桥连氧的替换(硫代磷酸酯, PS)已经被广泛地用于改善siRNA的核酸酶抗性，如Kole, Nature Reviews Drug Discovery 11:125-140 (2012)所报道的。已经报道核糖的2'-位置的修饰会改善核苷酸间磷酸酯键的核酸酶抗性，同时增加双链体稳定性(Tm)，这也已经被证实会提供来自免疫活化的保护。适度PS主链修饰与小的良好耐受的2'-取代(2'-O-甲基、2'-氟、2'-氢)的组合已经与用于体内应用的高度稳定的siRNA关联，如Soutschek等人. Nature 432:173-178 (2004)所报道的；并且已经报道2'-O-甲基修饰可有效地改善稳定性，如Volkov, Oligonucleotides 19:191-202 (2009)所报道的。关于减少先天性免疫应答的诱导，已经报道用2'-O-甲基、2'-氟、2'-氢修饰特定序列会减少TLR7/TLR8相互作用，同时通常保留沉默活性；参见，例如，Judge等人, Mol. Ther. 13:494-505 (2006)；和Cekaite等人, J. Mol. Biol. 365:90-108 (2007)。还已经证实另外的修饰(诸如2-硫尿嘧啶、假尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和N6-甲基腺苷)会使由TLR3、TLR7和TLR8介导的免疫效应最小化；参见，例如，Kariko, K. 等人, Immunity 23:165-175 (2005)。
也如本领域已知的和商购可得的，许多缀合物可以应用于本文所用的多核苷酸(诸如RNA)，其可以增强它们的细胞递送和/或摄取，包括例如，胆固醇、生育酚和叶酸、脂质、肽、聚合物、接头和适体；参见，例如，Winkler, Ther. Deliv. 4:791-809 (2013)的综述。
密码子优化
根据本领域的用于在含有目标靶标DNA的细胞中表达的标准方法，可以将编码定位多肽的多核苷酸进行密码子优化。例如，如果预期的靶标核酸是在人细胞中，预见到将人密码子优化的编码Cas9的多核苷酸用于生产Cas9多肽。
编码系统组分的核酸
本发明提供了包含核苷酸序列(其编码本发明的靶向基因组的核酸)的核酸、本发明的定位多肽、和/或进行本发明的方法的方面所必需的任何核酸或蛋白性分子。
编码本发明的靶向基因组的核酸的核酸、本发明的定位多肽和/或进行本发明的方法的方面所必需的任何核酸或蛋白性分子可以包含载体(例如，重组表达载体)。
术语“载体”是指能够运输它已经连接的另一种核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，其是指可以在其中连接另外的核酸区段的圆形双链DNA环。另一类载体是病毒载体；其中可以将另外的核酸区段连接进病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非-附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中之后整合进宿主细胞的基因组中，且由此与宿主基因组一起复制。
在一些实例中，载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。这样的载体在本文中被称作“重组表达载体”，或更简单地称作“表达载体”，其起等同功能。
术语“可操作地连接的”是指，以允许表达核苷酸序列的方式，将目标核苷酸序列连接至调节序列。术语“调节序列”意图包括，例如，启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调节序列是本领域众所周知的，且描述在，例如，Goeddel;Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, SanDiego, CA (1990)。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的那些，和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列的表达的那些(例如，组织特异性的调节序列)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可以取决于诸如靶标细胞的选择、期望的表达水平等因素。
预见到的表达载体包括、但不限于基于痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、逆转录病毒(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒和从逆转录病毒诸如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽造白细胞组织增生病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒衍生出的载体)的病毒载体和其他重组载体。为真核靶标细胞预见到的其他载体包括、但不限于载体pXT1、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40 (Pharmacia)。对于真核靶标细胞预见到的额外载体包括，但不限于，载体pCTx-1、pCTx-2和pCTx-3。可以使用其他载体，只要它们与宿主细胞相容。
在一些实例中，载体可以包含一个或多个转录和/或翻译控制元件。取决于利用的宿主/载体系统，在表达载体中可以使用许多合适的转录和翻译控制元件中的任一种，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等。所述载体可以是失活病毒序列或CRISPR机制的组分或其他元件的自失活载体。
合适的真核启动子(即，在真核细胞中有功能的启动子)的非限制性实例包括来自巨细胞病毒(CMV)立即早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40的那些，来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)，人延伸因子-1启动子(EF1)，包含与鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)融合的巨细胞病毒(CMV)增强子的杂合构建体，鼠干细胞病毒启动子(MSCV)，磷酸甘油酸激酶-1基因座启动子(PGK)，和小鼠金属硫蛋白-I。
为了表达小RNA，包括与Cas核酸内切酶关联使用的向导RNA，多种启动子诸如RNA聚合酶III启动子(包括例如U6和H1)可以是有利的。关于增强这样的启动子的应用的描述和参数是本领域已知的，且另外的信息和方案正在正式描述中；参见，例如，Ma, H.等人, Molecular Therapy - Nucleic Acids 3, e161 (2014) doi:10.1038/mtna.2014.12。
所述表达载体还可以含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。所述表达载体还可以包含用于放大表达的适当序列。所述表达载体还可以包括编码与定位多肽融合的非天然标签(例如，组氨酸标签、血凝素标签、绿色荧光蛋白等)的核苷酸序列，从而产生融合蛋白。
启动子可以是诱导型启动子(例如，热激启动子、四环素-调节型启动子、类固醇-调节型启动子、金属-调节型启动子、雌激素受体-调节型启动子等)。启动子可以是组成型启动子(例如，CMV启动子、UBC启动子)。在一些情况下，所述启动子可以是空间上受限的和/或时间上受限的启动子(例如，组织特异性的启动子、细胞类型特异性的启动子等)。
可以将编码本发明的靶向基因组的核酸和/或定位多肽的核酸包装到递送媒介物内部或递送媒介物的表面上用于递送给细胞。预见到的递送媒介物包括、但不限于纳米球、脂质体、量子点、纳米颗粒、聚乙二醇颗粒、水凝胶和胶束。如在本领域中描述的，多种靶向部分可以用于增强这样的媒介物与期望的细胞类型或位置的优先相互作用。
本发明的复合物、多肽和核酸向细胞中的引入可以通过病毒或细菌噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、颗粒枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等而发生。
微RNA (miRNA)
基因调节区的另一种类型是微RNA (miRNA)结合位点。miRNA是在转录后基因调节中起关键作用的非编码RNA。miRNA可以调节所有编码哺乳动物蛋白的基因中的30%的表达。发现了通过双链RNA (RNAi)实现的特异性的且有效的基因沉默，以及另外的小非编码RNA(Canver, M.C. 等人,Nature (2015))。对于基因沉默重要的非编码RNA的最大类型是miRNA。在哺乳动物中，miRNA首先被转录为长的RNA转录物，其可以是单独的转录单元、蛋白内含子的部分或其他转录物。长转录物被称作初级miRNA (初级-miRNA)，其包括不完美地碱基配对的发夹结构。这些初级-miRNA被微处理器(在细胞核中的蛋白复合物，涉及Drosha)可以切割成一种或多种更短的前体miRNA (前-miRNA)。
前-miRNA是具有2-核苷酸3'-突出端的约70个核苷酸长度的短茎环，其输出成为成熟的19-25核苷酸miRNA:miRNA* 双链体。具有较低碱基配对稳定性的miRNA链(向导链)可以被加载到RNA诱导的沉默复合物(RISC)上。乘客向导链(用*标记)可以是功能性的，但是经常被降解。成熟的miRNA将RISC连接至主要存在于3'非翻译区(UTR)内的靶标mRNA中的部分互补序列基序并诱导转录后基因沉默(Bartel, D.P. Cell 136, 215-233 (2009);Saj, A. & Lai, E.C. Curr Opin Genet Dev 21, 504-510 (2011))。
miRNA在哺乳动物和其他多细胞生物的发育、分化、细胞周期和生长控制中以及在基本上所有的生物途径中可以是重要的。miRNA也可以参与细胞周期控制、细胞凋亡和干细胞分化、血细胞生成、低氧、肌肉发育、神经发生、胰岛素分泌、胆固醇代谢、老化、病毒复制和免疫应答。
单一miRNA可以靶向数百种不同的mRNA转录物，尽管许多不同的miRNA可以靶向单一miRNA转录物。在miRBase的最新版本(v.21)中已经注解了超过28645种微RNA。一些微RNA可以由多个基因座编码，其中的一些可以从串联地共转录的簇表达。所述特征允许具有多个途径和反馈控制的复杂调节网络。miRNA可以是这些反馈和调节回路的组成部分，并且可以通过将蛋白生产保持在限度内来帮助调节基因表达(Herranz, H. & Cohen, S.M.Genes Dev 24, 1339-1344 (2010); Posadas, D.M. & Carthew, R.W. Curr Opin Genet Dev 27, 1-6 (2014))。
miRNA也可以在大量与异常miRNA表达有关的人疾病中是重要的。该关联强调了miRNA调节途径的重要性。最近的miRNA缺失研究已经将miRNA与免疫应答的调节相联系(Stern-Ginossar, N. 等人,Science 317, 376-381 (2007))。
miRNA还具有与癌症的强联系，并且可以在不同类型的癌症中起作用。已经发现miRNA在许多肿瘤中下调。miRNA在关键的癌症相关途径(诸如细胞周期控制和DNA损伤应答)的调节中可以是重要的，且因此可以被用在诊断中且可以在临床上被靶向。miRNA可以微妙地调节血管生成的平衡，使得除去所有miRNA的实验会抑制肿瘤血管生成(Chen, S.等人,Genes Dev 28, 1054-1067 (2014))。
如关于蛋白编码基因已经证实的，miRNA基因也可以出现与癌症一起发生的表观遗传的变化。许多miRNA基因座可以与CpG岛有关，从而增加它们通过DNA甲基化被调节的机会(Weber, B., Stresemann, C., Brueckner, B. & Lyko, F. Cell Cycle 6, 1001-1005 (2007))。大多数研究已经使用染色质改造药物进行治疗来揭示表观遗传上沉默的miRNA。
除了它们在RNA沉默中的作用以外，miRNA还可以活化翻译(Posadas, D.M. &Carthew, R.W. Curr Opin Genet Dev 27, 1-6 (2014))。敲除这些位点可以导致减少的靶向基因的表达，而引入这些位点可以增加表达。
通过突变可以对于结合特异性而言重要的种子序列(miRNA的碱基2-8)，可以最有效地敲除单个miRNA。在该区域切割，随后通过NHEJ修复错误，可以通过阻断与靶标位点的结合而有效地消除miRNA功能。通过邻近回文序列的特定环区域的特异性靶向，也可以抑制miRNA。在催化上无活性的Cas9也可以用于抑制shRNA表达(Zhao, Y. 等人,Sci Rep 4,3943 (2014))。除了靶向miRNA以外，还可以靶向和突变结合位点以防止通过miRNA实现的沉默。
根据本公开内容，任何miRNA或其结合位点可以并入本发明的组合物中。
所述组合物可以具有区域，诸如但不限于，包含SEQ ID NO:613-4696中列出的任何miRNA的序列的区域，SEQ ID NO:613-4696中列出的miRNA的反向互补序列，或SEQ IDNO:613-4696中列出的任何miRNA的miRNA反种子区域。
本发明的组合物可以包含一种或多种miRNA靶标序列、miRNA序列或miRNA种子。这样的序列可以对应于任何已知的miRNA，诸如在美国公开号2005/0261218和美国公开号2005/0059005中教导的那些。作为一个非限制性实例，人基因组中的已知miRNA、其序列和其结合位点序列在下面列于SEQ ID NO:613-4696中。
miRNA序列包含“种子”区域，即成熟miRNA的位置2-8的区域中的序列，该序列与miRNA靶标序列具有完美的沃森-克里克互补性。miRNA种子可以包含成熟miRNA的位置2-8或2-7。在一些实例中，miRNA种子可以包含7个核苷酸(例如，成熟miRNA的核苷酸2-8)，其中相应miRNA靶标中的种子互补位点侧接与miRNA位置1相对的腺嘌呤(A)。在一些实例中，miRNA种子可以包含6个核苷酸(例如，成熟miRNA的核苷酸2-7)，其中相应miRNA靶标中的种子互补位点侧接与miRNA位置1相对的腺嘌呤(A)。参见例如，Grimson A, Farh KK,Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP; Mol Cell. 2007 Jul 6;27(1):91-105。miRNA种子的碱基与靶标序列具有完全互补性。
已经报道了miRNA、miRNA靶标区域的鉴定及其表达模式和在生物学中的作用(Bonauer等人, Curr Drug Targets 2010 11:943-949; Anand和Cheresh Curr OpinHematol 2011 18:171-176; Contreras和Rao Leukemia 2012 26:404-413 (2011 Dec20. doi: 10.1038/leu.2011.356); Bartel Cell 2009 136:215-233; Landgraf等人,Cell, 2007 129:1401-1414; Gentner和Naldini, Tissue Antigens. 2012 80:393-403。
例如，如果不意欲将组合物递送至肝脏、但终止于那些，如果miR-122的一个或多个靶标位点被工程改造化为编码该靶标序列的多核苷酸，则miR-122(肝脏中丰富的miRNA)可以抑制所递送的序列的表达。可以将不同miRNA的一个或多个结合位点的引入工程改造为进一步降低寿命、稳定性和蛋白翻译，因此提供额外的韧性层。
如本文所用，术语“miRNA位点”是指miRNA靶标位点或miRNA识别位点，或与miRNA与之结合或缔合的任何核苷酸序列。应当理解的是，“结合”可以遵循传统的沃森-克里克杂交规则，或者可以反映miRNA与在miRNA位点处或附近的靶标序列的任何稳定的缔合。
相反，对于本发明的组合物的目的，可以将miRNA结合位点工程改造出它们天然发生以增加特定组织中的蛋白表达的序列(即从中去除)。例如，可以去除miR-122结合位点以改善肝脏中的蛋白表达。
具体地，已知miRNA在免疫细胞(也称为造血细胞)(诸如抗原呈递细胞(APC)(例如树突细胞和巨噬细胞)、巨噬细胞、单核细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、粒细胞、天然杀伤细胞等)中差异表达。免疫细胞特异性miRNA涉及免疫原性、自身免疫、对感染的免疫应答、炎症以及基因疗法和组织/器官移植后的不想要的免疫应答。免疫细胞特异性miRNA还调节造血细胞(免疫细胞)的发育、增殖、分化和凋亡的许多方面。例如，miR-142和miR-146仅在免疫细胞中表达，在髓样树突细胞中尤其丰富。将miR-142结合位点引入本发明的多肽的3’-UTR可以通过miR-142介导的mRNA降解选择性抑制抗原呈递细胞中的基因表达，限制抗原在专业APC(例如树突状细胞)中的呈递，且由此防止基因递送后抗原介导的免疫应答(参见，Annoni A等人, blood, 2009, 114, 5152-5161)。
在一个实例中，可以将已知在免疫细胞、尤其是抗原呈递细胞中表达的miRNA结合位点工程改造成多核苷酸，以通过miRNA介导的RNA降解抑制APC中的多核苷酸的表达，抑制抗原介导的免疫应答，而多核苷酸的表达在其中不表达免疫细胞特异性miRNA的非免疫细胞中得以维持。
已经进行许多miRNA表达研究，并在本领域中进行描述，以分析miRNA在各种癌细胞/组织和其他疾病中的差异表达。一些miRNA在某些癌细胞中异常高表达，而其他则表达不足。例如，miRNA在以下中差异表达：癌细胞(WO2008/154098、US2013/0059015、US2013/0042333、WO2011/157294)；癌症干细胞(US2012/0053224)；胰腺癌和疾病(US2009/0131348、US2011/0171646、US2010/0286232、US8389210)；哮喘和炎症(US8415096)；前列腺癌(US2013/0053264)；肝细胞癌(WO2012/151212、US2012/0329672、WO2008/054828、US8252538)；肺癌细胞(WO2011/076143、WO2013/033640、WO2009/070653、US2010/0323357)；皮肤T细胞淋巴瘤(WO2013/011378)；结肠直肠癌细胞(WO2011/0281756、WO2011/076142)；癌阳性淋巴结(WO2009/100430、US2009/0263803)；鼻咽癌(EP2112235)；慢性阻塞性肺病(US2012/0264626、US2013/0053263)；甲状腺癌(WO2013/066678)；卵巢癌细胞(US2012/0309645、WO2011/095623)；乳腺癌细胞(WO2008/154098、WO2007/081740、US2012/0214699)，白血病和淋巴瘤(WO2008/073915、US2009/0092974、US2012/0316081、US2012/0283310、WO2010/018563。
人细胞
为了改善色素性视网膜炎(RP)或与RHO有关的任何病症，如本文中所述和解释的，基因编辑的主要靶标是人细胞。例如，在离体方法中，所述人细胞可以是体细胞，其在使用所述的技术修饰之后，可以产生分化细胞，例如光感受器细胞或视网膜祖细胞。例如，在体内方法中，所述人细胞可以是光感受器细胞或视网膜祖细胞。
通过在源自需要的患者且因此已经与所述患者完全匹配的自体细胞中进行基因编辑，可能产生这样的细胞：其可以安全地重新引入所述患者中，且有效地产生可以有效地改善与患者的疾病有关的一种或多种临床状况的细胞群体。
祖细胞(本文中也称为干细胞)能够繁殖并产生更多的祖细胞，这些又具有产生大量母细胞的能力，所述母细胞又可以产生分化的或可分化的子细胞。所述子细胞本身可以被诱导以繁殖和产生后代，所述后代随后分化成一种或多种成熟的细胞类型，同时也保留一种或多种具有亲本发育潜力的细胞。术语“干细胞”则是指这样的细胞：其在特定情况下，具有分化成更专门的或分化的表型的能力或潜力，且其保留在某些情况下基本上不分化地繁殖的能力。在一个方面，术语祖或干细胞是指一般化的母细胞，其后代(子代)通过分化而专门化(经常在不同的方向)，例如，通过完全获得个体特征，如在胚胎细胞和组织的进行性多样化中发生的。细胞的分化是一个通常通过许多细胞分裂而发生的复杂过程。分化的细胞可以源自多潜能细胞，所述多潜能细胞本身源自多潜能细胞，以此类推。尽管这些多潜能细胞中的每一种可以被视作干细胞，但是每种可以产生的细胞类型的范围可以相当大地变化。一些分化的细胞也具有产生有更大发育潜力的细胞的能力。这样的能力可以是天然的，或可以在用多种因素处理后人工地诱导。在许多生物学情况下，干细胞也可以是“多潜能的”，因为它们可以产生超过一种独特细胞类型的后代，但这不是“干性(stem-ness)”所要求的。
自我更新可以是干细胞的另一个重要方面。在理论上，自我更新可以通过两种主要机制中的任一种发生。干细胞可以不对称地分裂，一个子代保留干状态，且另一个子代表达某种独特的其他特定功能和表型。或者，一个群体中的某些干细胞可以对称地分裂成两个干细胞，从而维持所述群体中的某些干细胞作为整体，而所述群体中的其他细胞仅产生分化的后代。通常，“祖细胞”具有更原始(即，沿着发育途径或进展处于比完全分化的细胞更早的步骤)的细胞表型。祖细胞也经常具有显著的或非常高的增殖潜力。祖细胞可以产生多种不同的分化的细胞类型或单一分化的细胞类型，取决于发育途径和所述细胞在其中发育和分化的环境。
在细胞个体发育的背景下，形容词“分化的”或“分化中的”是相对术语。“分化的细胞”是这样的细胞：其相对于与其进行对比的细胞已经沿着发育途径向下进一步发展。因此，干细胞可以分化成谱系限制的前体细胞(诸如肌细胞祖细胞)，后者又可以沿着所述途径向下进一步分化成其他类型的前体细胞(诸如肌细胞前体)，然后分化成末期分化的细胞，诸如肌细胞，其在某种组织类型中起独特作用，且可以保留或不可以保留进一步增殖的能力。
诱导性多能干细胞
本文描述的遗传工程改造的人细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)。使用iPSC的一个优点是，所述细胞可以源自要给其施用祖细胞的相同个体。也就是说，体细胞可以得自个体，重新程序化成诱导性多能干细胞，然后重新分化成要施用于个体的祖细胞(例如，自体细胞)。因为祖细胞基本上源自自体来源，与使用来自另一个个体或个体组的细胞相比，移植物植入排斥或变应性应答的风险可以减小。另外，iPSC的应用会消除对得自胚胎来源的细胞的需要。因此，在一个方面，在公开的方法中使用的干细胞不是胚胎干细胞。
尽管分化在生理学背景下通常是不可逆的，最近已经开发了几种方法来将体细胞重新程序化为iPSC。示例性的方法是本领域技术人员已知的并在下文中简要描述。
术语“重新程序化”是指改变或逆转分化的细胞(例如，体细胞)的分化状态的过程。换而言之，重新程序化是指驱动细胞向后分化成更未分化的或更原始的细胞类型的过程。应当指出，将许多原代细胞置于培养中可以导致完全分化的特征的某种丧失。因此，在术语分化的细胞中包括的简单地培养这样的细胞不会使这些细胞成为未分化细胞(例如，未分化的细胞)或多能细胞。分化的细胞向多能性的转变要求重新程序化刺激，其超过导致分化特征在培养中的部分丧失的刺激。相对于原代细胞亲本(其通常在培养中具有仅有限分裂次数的能力)，重新程序化的细胞也具有在不丧失生长潜力的情况下长期传代的能力的特征。
可以使要重新程序化的细胞在重新程序化之前部分地或最终地分化。重新程序化可以包括分化的细胞(例如，体细胞)向多能状态或多潜能状态的分化状态的完全逆转。重新程序化可以包括分化的细胞(例如，体细胞)向未分化的细胞(例如，胚胎样细胞)的分化状态的完全或部分逆转。重新程序化可以导致所述细胞对特定基因的表达，其表达进一步促进重新程序化。在本文所述的一些实例中，分化的细胞(例如，体细胞)的重新程序化可以引起分化的细胞呈现未分化的状态(例如，是未分化的细胞)。得到的细胞被称作“重新程序化的细胞”或“诱导性多能干细胞(iPSC或iPS细胞)”。
重新程序化可以涉及在细胞分化过程中发生的核酸修饰(例如，甲基化)、染色质凝聚、表观遗传的变化、基因组印迹等中的至少一些可遗传模式的改变(例如，逆转)。重新程序化不同于简单地维持已经是多能的细胞的既存未分化状态或维持已经是多潜能细胞(例如，肌源性干细胞)的细胞的既存的小于完全分化的状态。重新程序化也不同于促进已经是多能或多潜能的细胞的自我更新或繁殖，尽管本文描述的组合物和方法在一些实例中也可以用于这样的目的。
本领域已知许多可以用于从体细胞产生多能干细胞的方法。将体细胞重新程序化为多能表型的任何这样的方法将适合用在本文所述的方法中。
已经描述了使用转录因子的确定组合产生多能细胞的重新程序化方法。通过Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的直接转导，可以将小鼠体细胞转化成具有扩大的发育潜力的ES细胞-样细胞；参见，例如，Takahashi和Yamanaka, Cell 126(4): 663-76 (2006)。iPSC类似于ES细胞，因为它们会恢复多能性相关的转录线路和许多表观遗传的景象。另外，小鼠iPSC满足多能性的所有标准测定：具体地，在体外分化成三个胚层的细胞类型，畸胎瘤形成，促成嵌合体，种系传递[参见，例如，Maherali和Hochedlinger, Cell Stem Cell. 3(6):595-605 (2008)]，和四倍体互补。
使用类似的转导方法可以得到人iPSC，并且已经将转录因子三重小组OCT4、SOX2和NANOG确立为控制多能性的转录因子的核心集合；参见，例如，Budniatzky和Gepstein,Stem Cells Transl Med. 3(4):448-57 (2014); Barrett等人, Stem Cells Trans Med3:1-6 sctm.2014-0121 (2014); Focosi等人, Blood Cancer Journal 4: e211 (2014)。在历史上通过使用病毒载体将编码干细胞相关基因的核酸序列引入成年体细胞中，可以实现iPSC的生产。
可以从终末分化的体细胞、以及从成年干细胞或成体干细胞产生或衍生iPSC。也就是说，通过重新程序化可以使非多能祖细胞成为多能的或多潜能的。在这样的情况下，可能不必包括象重新程序化终末分化的细胞所需要的那么多的重新程序化因子。此外，通过重新程序化因子的非病毒引入，例如，通过引入所述蛋白本身，或通过引入编码重新程序化因子的核酸，或通过引入在翻译后产生重新程序化因子的信使RNA，可以诱导重新程序化(参见例如，Warren等人, Cell Stem Cell, 7(5):618-30 (2010)。通过引入编码干细胞相关基因的核酸的组合可以实现重新程序化，所述干细胞相关基因包括、例如Oct-4 (也被称作Oct-3/4或Pouf51)、Soxl、Sox2、Sox3、Sox 15、Sox 18、NANOG、Klfl、Klf2、Klf4、Klf5、NR5A2、c-Myc、1-Myc、n-Myc、Rem2、Tert和LIN28。使用本文描述的方法和组合物的重新程序化可以进一步包含向体细胞引入以下的一种或多种：Oct-3/4，Sox家族的一个成员，Klf家族的一个成员，和Myc家族的一个成员。本文描述的方法和组合物还可以包含引入用于重新程序化的Oct-4、Sox2、Nanog、c-MYC和Klf4中的每一种的一种或多种。如上面所指出的，用于重新程序化的确切方法对于本文描述的方法和组合物而言不一定是关键性的。然而，在从重新程序化的细胞分化的细胞要用于例如人治疗中的情况下，在一个方面，所述重新程序化不是通过改变基因组的方法实现。因此，在这样的实例中，例如，在不使用病毒或质粒载体的情况下，可以实现重新程序化。
通过各种试剂(例如，小分子)的添加，可以增强从开始细胞群体衍生出的重新程序化的效率(即，重新程序化的细胞的数目)，如以下文献证实的：Shi等人, Cell-StemCell 2:525-528 (2008); Huangfu等人, Nature Biotechnology 26(7):795-797 (2008)和Marson等人, Cell-Stem Cell 3: 132-135 (2008)。因此，增强诱导性多能干细胞生产的效率或速率的试剂或试剂组合可以用于生产患者特异性的或疾病特异性的iPSC。增强重新程序化效率的试剂的一些非限制性实例包括可溶性的Wnt、Wnt条件培养基、BIX-01294(G9a组蛋白甲基转移酶)、PD0325901 (MEK抑制剂)、DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂、丙戊酸、5'-氮胞苷、地塞米松、suberoylanilide、氧肟酸(SAHA)、维生素C和曲古抑菌素(TSA)，以及其他。
重新程序化增强剂的其他非限制性实例包括：辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA (例如，MK0683, 伏林司他)和其他氧肟酸), BML-210, Depudecin (例如，(-)-Depudecin), HC毒素, Nullscript (4-(l,3-二氧代-lH,3H-苯并[de]异喹啉-2-基)-N-羟基丁酰胺), 苯基丁酸盐(例如，苯基丁酸钠)和丙戊酸((VP A)和其他短链脂肪酸), Scriptaid, 舒拉明钠,曲古抑菌素A (TSA), APHA化合物8, Apicidin,丁酸钠, 丁酸新戊酰基氧基甲酯(Pivanex, AN-9), Trapoxin B, Chlamydocin, 缩肽(也被称作FR901228或FK228), 苯甲酰胺(例如，CI-994 (例如，N-乙酰基地那林)和MS-27-275), MGCD0103, NVP-LAQ-824,CBHA (间-羧基cinnaminic acid双氧肟酸), JNJ16241199, Tubacin, A-161906,proxamide, oxamflatin, 3-Cl-UCHA (例如，6-(3-氯苯基脲基)caproic氧肟酸), AOE(2-氨基-8-氧代-9, 10-环氧癸酸), CHAP31和CHAP 50。其他重新程序化增强剂包括，例如，HDAC的显性失活形式(例如，催化上无活性的形式)，HDAC的siRNA抑制剂，和特异性地结合HDAC的抗体。这样的抑制剂可得自，例如，BIOMOL International, Fukasawa, MerckBiosciences, Novartis, Gloucester Pharmaceuticals, Titan Pharmaceuticals,MethylGene, 和Sigma Aldrich。
为了证实用于与本文所述的方法一起使用的多能干细胞的诱导，可以针对干细胞标志物的表达测试分离的克隆。在从体细胞衍生出的细胞中的这种表达将所述细胞鉴定为诱导性多能干细胞。干细胞标志物可以选自包括SSEA3、SSEA4、CD9、Nanog、Fbxl5、Ecatl、Esgl、Eras、Gdf3、Fgf4、Cripto、Daxl、Zpf296、Slc2a3、Rexl、Utfl和Natl的非限制性集合。在一个情况下，例如，将表达Oct4或Nanog的细胞鉴定为多能的。用于检测这样的标志物的表达的方法可以包括，例如，RT-PCR和检测编码的多肽的存在的免疫学方法，诸如western印迹或流式细胞计数分析。检测不仅可以涉及RT-PCR，而且可以包括蛋白标志物的检测。通过RT-PCR或蛋白检测方法诸如免疫细胞化学，可以最佳地鉴定细胞内标志物，而通过例如免疫细胞化学容易地鉴定细胞表面标志物。
通过评价iPSC的分化成三个胚层中的每一个的细胞的能力的测试，可以证实分离的细胞的多能干细胞特性。作为一个实例，在裸鼠中的畸胎瘤形成可以用于评价分离的克隆的多能特性。可以将所述细胞引入裸鼠中，并可以在从所述细胞产生的肿瘤上进行组织学和/或免疫组织化学。例如，包含来自所有三个胚层的细胞的肿瘤的生长进一步指示，所述细胞是多能干细胞。
视网膜祖细胞和光感受器细胞
在一些实例中，本文所述的基因工程改造的人细胞是光感受器细胞或视网膜祖细胞(RPC)。RPC是多能祖细胞，其可以产生视网膜的所有六种神经元以及Müller神经胶质。Müller胶质细胞是一种类型的视网膜神经胶质细胞，并且是视网膜的主要神经胶质组分。它们的功能是支持视网膜的神经元，并维持视网膜内稳态和完整性。从成人视网膜分离的Müller神经胶质已被显示分化为视杆光感受器。通过膜片钳记录对这样的Müller神经胶质来源的光感受器的功能表征已经揭示，其电学特性与成人视杆相当(Giannelli等人, 2011,Stem Cells, (2):344-56)。在视网膜生成期间，RPC被逐渐被指定为谱系受限的前体细胞，其然后成熟为终末分化的神经元或Müuller神经胶质。胎儿来源的人视网膜祖细胞(hRPC)表现出分子特征，其指示直至第六代的视网膜祖细胞状态。他们证明从第1代到第6代的KI67-、SOX2-和波形蛋白-阳性细胞的百分比逐渐降低，而直至第6代观察到巢蛋白和PAX6的持续表达。第1代hRPC的微阵列分析表明以下视网膜早期发育基因的表达：VIM (波形蛋白)、KI67、NES (巢蛋白)、PAX6、SOX2、HES5、GNL3、OTX2、DACH1、SIX6和CHX10 (VSX2)。hRPC本质上是功能性的，并且对兴奋性神经递质响应(Schmitt等人, 2009, InvestigativeOphthalmology and Visual Sciences. 2009;50(12):5901-8)。视网膜的最外部区域用含有支持性视网膜色素上皮(RPE)层，其通过运输营养物和使脱落的感光器部分再循环来维持光感受器健康。RPE附着至布鲁赫膜，即脉络膜和视网膜之间的界面处的细胞外基质结构。在RPE的另一侧，向眼睛内部的向内移动，存在三层神经元：光敏视杆和视锥光感受器，连接神经元的中间层(无长突的、双极的和水平的细胞)和神经节细胞的最内层，它们将源于光感受器层中的信号通过视神经传输至大脑中。在一些方面，本文所述的基因工程改造的人细胞是光感受器细胞，其是在视网膜中发现的神经元的专门类型。光感受器将光转换成能够刺激生物过程并负责视力的信号。视杆和视锥是为视觉系统提供信息的两种经典光感受器细胞。
分离视网膜祖细胞和光感受器细胞
可以根据本领域已知的任何方法分离视网膜细胞，包括祖细胞。例如，从新鲜的手术样本分离人视网膜细胞。通过用IV型胶原酶消化组织将视网膜色素上皮(RPE)与脉络膜分离，并培养视网膜色素上皮斑块。在来自外植体的100-500个细胞生长后，将原代培养物传代(Ishida M.等人, Current Eye Research 1998; 17(4):392-402)，并针对RPE标志物的表达进行表征。通过使用木瓜蛋白酶破坏活检的视网膜来分离视杆。采取预防措施以避免严重破坏并提高细胞产量。将分离的细胞分选以产生纯视杆杆细胞的群体，并通过免疫染色进一步表征(Feodorova等人, MethodsX 2015; 2:39-46)。
为了分离视锥，鉴定、切出神经视网膜并将其置于10%明胶上。使用激光分离视网膜内层。将分离的视锥单层培养18小时，并通过光学显微镜和透射显微镜与未处理的视网膜进行比较，以检查任何结构损伤。针对视锥特异性标志物的表达表征细胞(Salchow等人,Current Eye Research 2001;22)。
为了分离视网膜祖细胞，将活检的视网膜用双解剖刀切碎，并在37℃下在培养箱中酶促消化。将消化的细胞的上清液离心，并将细胞重悬浮于无细胞的视网膜祖细胞条件培养基中。将细胞转移至含有新鲜培养基的纤连蛋白包被的组织培养瓶中并进行培养(Klassen等人, Jornal of Neuroscience Research 2004; 77:334-343)。
制备患者特异性的iPSC
本发明的离体方法的一个步骤可以包括，制备患者特异性的iPS细胞、患者特异性的iPS细胞或患者特异性的iPS细胞系。在本领域中存在许多确定的用于制备患者特异性的iPS细胞的方法，如在以下文献中所述：Takahashi和Yamanaka 2006; Takahashi, Tanabe等人. 2007。例如，所述制备步骤可以包括：a)从所述患者分离体细胞，诸如皮肤细胞或成纤维细胞；和b)将一组多能性相关基因引入所述体细胞中以诱导所述细胞变成多能干细胞。所述组的多能性相关基因是一种或多种选自以下的基因：OCT4、SOX1、SOX2、SOX3、SOX15、SOX18、NANOG、KLF1、KLF2、KLF4、KLF5、c-MYC、n-MYC、REM2、TERT和LIN28。
进行患者的骨髓的活组织检查或抽吸
活组织检查或抽吸是从身体取出的组织或流体的样品。存在许多不同种类的活组织检查或抽吸。它们几乎全部涉及使用尖锐的工具取出少量组织。如果活组织检查将是在皮肤或其他敏感区域上，可以首先应用麻醉机器。根据本领域的已知方法中的任一种，可以进行活组织检查或抽吸。例如，在骨髓抽吸中，使用大针头进入骨盆骨中以收集骨髓。
分离间充质干细胞
根据本领域已知的任何方法可以分离间充质干细胞，诸如从患者骨髓或外周血。例如，可以将骨髓抽吸物收集进具有肝素的注射器中。可以将细胞洗涤并在Percoll™密度梯度上离心。可以使用密度梯度离心介质Percoll™分离细胞，诸如血细胞、肝细胞、间质细胞、巨噬细胞、肥大细胞和胸腺细胞。然后可以在含有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM) (低葡萄糖)中培养细胞(Pittinger MF, Mackay AM, Beck SC等人,Science 1999; 284:143-147)。
基因组编辑的iPSC分化成其他细胞类型
本发明的离体方法的另一个步骤可以包括，使基因组编辑的iPSC分化成光感受器细胞或视网膜祖细胞。所述分化步骤可以根据本领域已知的任何方法进行。例如，如本领域所述，iPSC可用于产生视网膜类器官和光感受器(Phillips等人, Stem Cells, June 2014,32(6): 第1480-1492页; Zhong等人 Nat. Commun., 2014, 5: pg 4047; Tucker等人,PLoS One, April 2011, 6(4): e18992)。例如，hiPSC使用各种处理(包括Wnt、Nodal和Notch途径抑制剂(Noggin、Dk1、LeftyA和DAPT)和其他生长因子)分化为视网膜祖细胞。所述视网膜祖细胞进一步分化为光感受器细胞，所述处理包括：在共培养系统中暴露于天然视网膜细胞，通过随后用视黄酸和牛磺酸进行处理而暴露于RX+或Mitf+，或暴露于几种外源因子，包括Noggin、Dkk1、DAPT和胰岛素样生长因子(Yang等人, Stem CellsInternational 2016)。
基因组编辑的间充质干细胞分化成光感受器细胞或视网膜祖细胞
本发明的离体方法的另一个步骤可以包括，使基因组编辑的间充质干细胞分化成光感受器细胞或视网膜祖细胞。所述分化步骤可以根据本领域已知的任何方法进行。
将细胞移植入患者中
本发明的离体方法的另一个步骤可以包括，将所述光感受器细胞或视网膜祖细胞移植入患者中。该移植步骤可以使用本领域已知的任何植入方法完成。例如，可以将遗传修饰的细胞直接注射进患者的血液中或以其他方式施用于患者。
本发明的离体方法的另一个步骤包括，将所述光感受器细胞或视网膜祖细胞移植入患者中。该移植步骤可以使用本领域已知的任何植入方法完成。例如，可以将遗传修饰的细胞直接注射进患者的眼中或以其他方式施用于患者。
遗传修饰的细胞
术语“遗传修饰的细胞”是指包含至少一个通过基因组编辑(例如，使用CRISPR/Cas/Cpf1系统)引入的遗传修饰的细胞。在本文的一些离体实例中，所述遗传修饰的细胞可以是遗传修饰的祖细胞。在本文的一些体内实例中，所述遗传修饰的细胞可以是遗传修饰的光感受器细胞或视网膜祖细胞。在本文中预见到遗传修饰的细胞，其包含外源的靶向基因组的核酸和/或外源的编码靶向基因组的核酸的核酸。
术语“对照处理群体”描述了除了加入基因组编辑组分以外，已经用相同的介质、病毒诱导、核酸序列、温度、汇合、烧瓶大小、pH等处理过的细胞群体。本领域已知的任何方法可以用于测量RHO基因或蛋白表达或活性的恢复，例如，RHO蛋白的western印迹分析或用于定量RHO mRNA的实时PCR。
术语“分离的细胞”是指已经从最初发现它的生物取出的细胞，或这样的细胞的后代。任选地，所述细胞可以在体外培养，例如，在确定的条件下，或在有其他细胞存在下。任选地，可以在之后将所述细胞引入第二种生物或重新引入从其中分离出它的生物(或它的来源细胞)。
关于分离的细胞群体的术语“分离的群体”是指，已经从混合的或异质的细胞群体取出和分离的细胞群体。在一些情况下，与从其中分离或富集细胞的异质群体相比，分离的群体可以是基本上纯的细胞群体。在一些情况下，所述分离的群体可以是分离的人祖细胞群体，例如，与包含人祖细胞的细胞和人祖细胞的来源细胞的异质群体相比，基本上纯的人祖细胞群体。
就特定细胞群体而言，术语“基本上增强的”是指这样的细胞群体，其中特定类型的细胞的发生相对于预先存在的水平或参考水平增加了至少2倍、至少3-、至少4-、至少5-、至少6-、至少7-、至少8-、至少9、至少10-、至少20-、至少50-、至少100-、至少400-、至少1000-、至少5000-、至少20000-、至少100000-倍或更多倍，取决于例如用于改善色素性视网膜炎(RP)的这样的细胞的期望水平。
就特定细胞群体而言，术语“基本上富集的”是指相对于构成总细胞群体的细胞占至少约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%或更多的细胞群体。
就特定细胞群体而言，术语“基本上纯的”是指相对于构成总细胞群体的细胞具有至少约75%、至少约85%、至少约90%或至少约95%纯度的细胞群体。也就是说，就祖细胞群体而言，术语“基本上纯的”或“基本上纯化的”是指，含有少于约20%、约15%、约10%、约9%、约8%、约7%、约6%、约5%、约4%、约3%、约2%、约1%或小于1%的不是由本文中的术语定义的祖细胞的细胞的细胞群体。
递送
通过本领域已知的病毒或非病毒递送媒介物，可以递送向导RNA多核苷酸(RNA或DNA)和/或核酸内切酶多核苷酸(RNA或DNA)。或者，通过本领域已知的病毒或非病毒递送媒介物，诸如电穿孔或脂质纳米颗粒，可以递送核酸内切酶多肽。在进一步替代方面，所述DNA核酸内切酶可以作为一种或多种多肽递送，无论是单独地还是与一种或多种向导RNA、或一种或多种crRNA以及在一起的tracrRNA预先形成复合物。
可以通过非病毒递送媒介物来递送多核苷酸，所述非病毒递送媒介物包括、但不限于，纳米颗粒、脂质体、核糖核蛋白、带正电荷的肽、小分子RNA-缀合物、适体-RNA嵌合体和RNA-融合蛋白复合物。一些示例性的非病毒递送媒介物描述在Peer和Lieberman, GeneTherapy, 18: 1127-1133 (2011) (其聚焦于siRNA的非病毒递送媒介物，其也可用于递送其他多核苷酸)。
通过脂质纳米颗粒(LNP)，可以将多核苷酸诸如向导RNA、sgRNA和编码核酸内切酶的mRNA递送给细胞或患者。
LNP是指具有小于1000 nm、500 nm、250 nm、200 nm、150 nm、100 nm、75 nm、50 nm或25 nm的直径的任何颗粒。或者，纳米颗粒可以是在1-1000 nm、1-500 nm、1-250 nm、25-200 nm、25-100 nm、35-75 nm或25-60 nm的大小范围内。
LNP可以由阳离子脂质、阴离子脂质或中性脂质制成。可以在LNP中包括中性脂质(诸如融原(fusogenic)磷脂DOPE或膜组分胆固醇)作为'辅助脂质'来增强转染活性和纳米颗粒稳定性。阳离子脂质的限制包括由差稳定性和快速清除引起的低效力、以及炎症性应答或抗炎应答的产生。
LNP也可以包含疏水脂质、亲水脂质、或疏水脂质和亲水脂质。
本领域已知的任何脂质或脂质的组合可以用于生产LNP。用于生产LNP的脂质的实例是：DOTMA、DOSPA、DOTAP、DMRIE、DC-胆固醇、DOTAP-胆固醇、GAP-DMORIE-DPyPE和GL67A-DOPE-DMPE-聚乙二醇(PEG)。阳离子脂质的实例是：98N12-5、C12-200、DLin-KC2-DMA(KC2)、DLin-MC3-DMA (MC3)、XTC、MD1和7C1。中性脂质的实例是：DPSC、DPPC、POPC、DOPE和SM。PEG修饰的脂质的实例是：PEG-DMG、PEG-CerC14和PEG-CerC20。
所述脂质可以以任何数目的摩尔比组合以生产LNP。另外，所述多核苷酸可以与脂质以宽范围的摩尔比组合以生产LNP。
如以前所述，可以将所述定位多肽和靶向基因组的核酸各自分别施用于细胞或患者。另一方面，可以将所述定位多肽与一种或多种向导RNA、或一种或多种crRNA以及在一起的tracrRNA预先形成复合物。然后可以将所述预先形成复合物的物质施用于细胞或患者。这样的预先形成复合物的物质被称作核糖核蛋白颗粒(RNP)。
RNA能够与RNA或DNA形成特异性相互作用。尽管该性质被用在许多生物学过程中，它也伴有在富含核酸的细胞环境中杂乱相互作用的风险。该问题的一个解决方案是形成核糖核蛋白颗粒(RNP)，其中将所述RNA与核酸内切酶预先形成复合物。所述RNP的另一个益处是保护所述RNA免于降解。
所述RNP中的核酸内切酶可以是修饰的或未修饰的。同样地，所述gRNA、crRNA、tracrRNA或sgRNA可以是修饰的或未修饰的。众多修饰是本领域已知的且可以使用。
所述核酸内切酶和sgRNA通常以1:1摩尔比组合。或者，所述核酸内切酶、crRNA和tracrRNA通常以1:1:1摩尔比组合。然而，宽范围的摩尔比可以用于生产RNP。
AAV(腺相关病毒)
重组腺相关病毒(AAV)载体可以用于递送。用于生产rAAV颗粒的技术是本领域中的标准，其中将要包装的AAV基因组(其包括要递送的多核苷酸、rep和cap基因和辅助病毒功能)提供给细胞。rAAV的生产通常要求，下述组分存在于单个细胞(在本文中称作包装细胞)内：rAAV基因组，与rAAV基因组分离的AAV rep和cap基因(即，不在其里面)，和辅助病毒功能。所述AAV rep和cap基因可以来自重组病毒可以衍生出的任何AAV血清型，且可以来自不同于rAAV基因组ITR的AAV血清型，包括、但不限于，本文所述的AAV血清型。假型化的rAAV的生产公开在，例如，国际专利申请公开号WO 01/83692中。
本文公开的AAV序列可以包含靶向RHO基因内的P23H突变的sgRNA。例如，pSIA010包含AAV序列(SEQ ID NO:5339)，其编码靶向RHO基因内的P23H突变的sgRNA。所述sgRNA包含SEQ ID NO:5290(sgRNA原间隔物序列)和SEQ ID NO:5327(sgRNA主链序列)。pSIA011包含AAV序列(SEQ ID NO:5340)，其编码靶向RHO基因内的P23H突变的sgRNA。所述sgRNA包含SEQ ID NO:5291(sgRNA原间隔物序列)和SEQ ID NO:5327(sgRNA主链序列)。
AAV血清型
包装编码本发明的组合物的多核苷酸(例如本发明的核酸内切酶、供体序列或RNA向导分子)的AAV颗粒可以包含或衍生自任何天然或重组AAV血清型。根据本公开，AAV颗粒可以利用或基于选自任何以下血清型的血清型及其变体，包括但不限于AAV1、AAV10、AAV106.1/hu.37、AAV11、AAV114.3/hu.40、AAV12、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.1/hu.43、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV16.12/hu.11、AAV16.3、AAV16.8/hu.10、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2、AAV2.5T、AAV2-15/rh.62、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV2-3/rh.61、AAV24.1、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV27.3、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV2G9、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV3、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-11/rh.53、AAV3-3、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV3-9/rh.52、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV4-19/rh.55、AAV42.12、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV4-4、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV4-8/r11.64、AAV4-8/rh.64、AAV4-9/rh.54、AAV5、AAV52.1/hu.20、AAV52/hu.19、AAV5-22/rh.58、AAV5-3/rh.57、AAV54.1/hu.21、AAV54.2/hu.22、AAV54.4R/hu.27、AAV54.5/hu.23、AAV54.7/hu.24、AAV58.2/hu.25、AAV6、AAV6.1、AAV6.1.2、AAV6.2、AAV7、AAV7.2、AAV7.3/hu.7、AAV8、AAV-8b、AAV-8h、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAV-b、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAV-h、AAVH-1/hu.1、AAVH2、AAVH-5/hu.3、AAVH6、AAVhE1.1、AAVhER1.14、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhER1.23、AAVhEr1.35、AAVhEr1.36、AAVhEr1.5、AAVhEr1.7、AAVhEr1.8、AAVhEr2.16、AAVhEr2.29、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhEr2.4、AAVhEr3.1、AAVhu.1、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.11、AAVhu.12、AAVhu.13、AAVhu.14/9、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.19、AAVhu.2、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.3、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.4、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.5、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.53、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.6、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.7、AAVhu.8、AAVhu.9、AAVhu.t 19、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVLG-9/hu.39、AAV-LK01、AAV-LK02、AAVLK03、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAVN721-8/rh.43、AAV-PAEC、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAVpi.1、AAVpi.2、AAVpi.3、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.2、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.2R、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.43、AAVrh.44、AAVrh.45、AAVrh.46、AAVrh.47、AAVrh.48、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.50、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.55、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.59、AAVrh.60、AAVrh.61、AAVrh.62、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.65、AAVrh.67、AAVrh.68、AAVrh.69、AAVrh.70、AAVrh.72、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、BAAV、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、牛AAV、山羊AAV、日本AAV 10、真型AAV(ttAAV)、UPENN AAV 10、AAV-LK16、AAAV、AAV穿梭100-1、AAV穿梭100-2、AAV穿梭100-3、AAV穿梭100-7、AAV穿梭10-2、AAV穿梭10-6、AAV穿梭10-8、AAV SM 100-10、AAV SM 100-3、AAVSM 10-1、AAV SM 10-2和/或AAV SM 10-8。
在一些实例中，AV血清型可以是或具有如N Pulicherla等人(Molecular Therapy19(6):1070-1078 (2011))所述的AAV9序列中的突变，诸如但不限于AAV9.9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84。
在一些实例中，AAV血清型可以是或具有如美国专利号US 6156303中所述的序列，诸如但不限于AAV3B (US 6156303的SEQ ID NO:1和10)，AAV6 (US 6156303的SEQ ID NO:2、7和11)，AAV2 (US 6156303的SEQ ID NO:3和8)，AAV3A (US 6156303的SEQ ID NO:4和9)或其衍生物。
在一些实例中，血清型可以是AAVDJ或其变体，诸如AAVDJ8 (或AAV-DJ8)，如Grimm等人 (Journal of Virology 82(12): 5887-5911 (2008)所述. AAVDJ8的氨基酸序列可以包含两个或更多个突变，以去除肝素结合结构域(HBD)。作为一个非限制性实例，在美国专利号7,588,772中描述为SEQ ID NO:1的AAV-DJ序列可以包含两个突变：(1) R587Q，其中氨基酸587处的精氨酸(R；Arg)变为谷氨酰胺(Q；Gln)，和(2) R590T，其中氨基酸590处的精氨酸(R；Arg)变为苏氨酸(T；Thr)。作为另一个非限制性实例，可以包含三个突变：(1)K406R，其中氨基酸406处的赖氨酸(K；Lys)变为精氨酸(R；Arg)，(2)R587Q，其中氨基酸587处的精氨酸(R；Arg)变为谷氨酰胺(Q；Gln)，和(3) R590T，其中氨基酸590处的精氨酸(R；Arg)变为苏氨酸(T；Thr)。
在一些实例中，AAV血清型可以是或具有如国际公开号WO2015121501中所述的序列，诸如但不限于真型AAV (ttAAV) (WO2015121501的SEQ ID NO:2)，“UPenn AAV10”(WO2015121501的SEQ ID NO:8)，“日本AAV10”(WO2015121501的SEQ ID NO:9)或其变体。
根据本公开，AAV衣壳血清型选择或用途可以来自多种物种。在一个实例中，AAV可以是禽AAV (AAAV)。AAAV血清型可以是或具有如美国专利号US 9238800中所述的序列，诸如但不限于AAAV (US 9,238,800的SEQ ID NO:1、2、4、6、8、10、12和14)或其变体。
在一个实例中，AAV可以是牛AAV (BAAV)。BAAV血清型可以是或具有如美国专利号US 9,193,769中所述的序列，诸如但不限于BAAV (US 9193769的SEQ ID NO:1和6)或其变体。BAAV血清型可以是或具有如美国专利号US7427396中所述的序列，诸如但不限于BAAV(US7427396的SEQ ID NO:5和6)或其变体。
在一个实例中，AAV可以是山羊AAV。山羊AAV血清型可以是或具有如美国专利号US7427396中所述的序列，诸如但不限于山羊AAV (US7427396的SEQ ID NO:3)或其变体。
在其他实例中，可以将AAV工程改造为来自两种或更多种亲本血清型的杂合AAV。在一个实例中，AAV可以是AAV2G9，其包含来自AAV2和AAV9的序列。AAV2G9 AAV血清型可以是或具有如美国专利公开号US20160017005中所述的序列。
在一个实例中，AAV可以是由氨基酸390-627 (VP1编号)中具有突变的AAV9衣壳文库产生的血清型，如Pulicherla等人(Molecular Therapy 19(6):1070-1078 (2011)所述。血清型和相应的核苷酸和氨基酸取代可以是，但不限于，AAV9.1 (G1594C; D532H),AAV6.2 (T1418A和T1436X; V473D和I479K), AAV9.3 (T1238A; F413Y), AAV9.4 (T1250C和A1617T; F417S), AAV9.5 (A1235G, A1314T, A1642G, C1760T; Q412R, T548A,A587V), AAV9.6 (T1231A; F411I), AAV9.9 (G1203A, G1785T; W595C), AAV9.10(A1500G, T1676C; M559T), AAV9.11 (A1425T, A1702C, A1769T; T568P, Q590L),AAV9.13 (A1369C, A1720T; N457H, T574S), AAV9.14 (T1340A, T1362C, T1560C,G1713A; L447H), AAV9.16 (A1775T; Q592L), AAV9.24 (T1507C, T1521G; W503R),AAV9.26 (A1337G, A1769C; Y446C, Q590P), AAV9.33 (A1667C; D556A), AAV9.34(A1534G, C1794T; N512D), AAV9.35 (A1289T, T1450A, C1494T, A1515T, C1794A,G1816A; Q430L, Y484N, N98K, V606I), AAV9.40 (A1694T, E565V), AAV9.41 (A1348T,T1362C; T450S), AAV9.44 (A1684C, A1701T, A1737G; N562H, K567N), AAV9.45(A1492T, C1804T; N498Y, L602F), AAV9.46 (G1441C, T1525C, T1549G; G481R,W509R, L517V), 9.47 (G1241A, G1358A, A1669G, C1745T; S414N, G453D, K557E,T582I), AAV9.48 (C1445T, A1736T; P482L, Q579L), AAV9.50 (A1638T, C1683T,T1805A; Q546H, L602H), AAV9.53 (G1301A, A1405C, C1664T, G1811T; R134Q, S469R,A555V, G604V), AAV9.54 (C1531A, T1609A; L511I, L537M), AAV9.55 (T1605A;F535L), AAV9.58 (C1475T, C1579A; T492I, H527N), AAV.59 (T1336C; Y446H),AAV9.61 (A1493T; N498I), AAV9.64 (C1531A, A1617T; L511I), AAV9.65 (C1335T,T1530C, C1568A; A523D), AAV9.68 (C1510A; P504T), AAV9.80 (G1441A,;G481R),AAV9.83 (C1402A, A1500T; P468T, E500D), AAV9.87 (T1464C, T1468C; S490P),AAV9.90 (A1196T; Y399F), AAV9.91 (T1316G, A1583T, C1782G, T1806C; L439R,K528I), AAV9.93 (A1273G, A1421G, A1638C, C1712T, G1732A, A1744T, A1832T;S425G, Q474R, Q546H, P571L, G578R, T582S, D611V), AAV9.94 (A1675T; M559L)和AAV9.95 (T1605A; F535L)。
在一个实例中，AAV可以是包含至少一个AAV衣壳CD8+ T-细胞表位的血清型。作为一个非限制性实例，血清型可以是AAV1、AAV2或AAV8。
在一个实例中，AAV可以是变体，诸如如Deverman. 2016. NatureBiotechnology. 34(2): 204-209中所述的PHP.A或PHP.B。
在一个实例中，AAV可以是选自SEQ ID NO:4697-5265和表4中发现的任何那些的血清型。
在一个实例中，AAV可以由如SEQ ID NO:4697-5265和表4中公开的序列、片段或变体编码。
产生包装细胞的方法涉及产生稳定表达用于产生AAV颗粒的所有必需组分的细胞系。例如，将包含缺乏AAV rep和cap基因的rAAV基因组、从rAAV基因组分离的AAV rep和cap基因以及选择标记(诸如新霉素抗性基因)的一种质粒(或多种质粒)整合至细胞的基因组中。通过程序、诸如GC加尾(Samulski等人, 1982, Proc. Natl. Acad. S6.USA, 79:2077-2081)、添加含有限制性核酸内切酶切割位点的合成接头(Laughlin等人, 1983, Gene,23:65-73)或通过直接的平末端连接(Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem.,259:4661-4666)，已经将AAV基因组引入细菌质粒中。然后可以用辅助病毒、诸如腺病毒感染包装细胞系。该方法的优点是细胞是可选择的并且适合于rAAV的大规模生产。合适方法的其他实例采用腺病毒或杆状病毒而不是质粒，以将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞中。
rAAV生产的一般原理综述在例如Carter, 1992, Current Opinions inBiotechnology, 1533-539；和Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. andImmunol., 158:97-129)中。多种方案描述在Ratschin等人, Mol. Cell. Biol. 4:2072(1984); Hermonat等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin等人, Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin等人, J. Virol., 62:1963(1988)；和Lebkowski等人, 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski等人(1989, J. Virol., 63:3822-3828)；美国专利号5,173,414; WO 95/13365和对应的美国专利号5,658.776; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423)；WO 97/08298 (PCT/US96/13872)；WO 97/21825 (PCT/US96/20777)；WO 97/06243 (PCT/FR96/01064)；WO 99/11764; Perrin等人(1995) Vaccine 13:1244-1250;Paul等人(1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark等人(1996) Gene Therapy 3:1124-1132；美国专利号5,786,211；美国专利号5,871,982；和美国专利号6,258,595中。
AAV载体血清型可以与靶标细胞类型匹配。例如，可以用尤其是指定的AAV血清型转导下述示例性的细胞类型。
表4. 组织/细胞类型和血清型
组织/细胞类型 血清型
肝 AAV3, AA5, AAV8, AAV9
骨骼肌 AAV1, AAV7, AAV6, AAV8, AAV9
中枢神经系统 AAV1, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9
RPE AAV5, AAV4, AAV2, AAV8, AAV9 AAVrh8r
光感受器细胞 AAV5, AAV8, AAV9, AAVrh8R
肺 AAV9, AAV5
心脏 AAV8
胰腺 AAV8
肾 AAV2, AAV8
除了腺相关病毒载体以外，可以使用其他病毒载体。这样的病毒载体包括、但不限于慢病毒、甲病毒、肠道病毒、瘟病毒、杆状病毒、疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、乳多泡病毒、痘病毒、痘苗病毒和单纯疱疹病毒。
在一些情况下，可以将Cas9 mRNA、靶向PCSK9基因中的一个或两个基因座的sgRNA和供体DNA各自分别配制进脂质纳米颗粒中，或者都共配制进一个脂质纳米颗粒中。
在一些情况下，可以将Cas9 mRNA配制进脂质纳米颗粒中，而可以将sgRNA和供体DNA在AAV载体中递送。
可得到将Cas9核酸酶作为DNA质粒、作为mRNA或作为蛋白来递送的选项。所述向导RNA可以从相同DNA表达，或也可以作为RNA递送。可以将所述RNA化学修饰以改变或提高它的半衰期，或减小免疫应答的可能性或程度。所述核酸内切酶蛋白可以在递送之前与gRNA形成复合物。病毒载体允许有效的递送；可以将Cas9的裂解形式和Cas9的更小直系同源物包装进AAV中，对于HDR的供体照样可以。还存在许多可以递送这些组分中的每一种的非病毒递送方法，或者可以串联采用非病毒和病毒方法。例如，纳米颗粒可以用于递送蛋白和向导RNA，而AAV可以用于递送供体DNA。
自失活(SIN) CRISPR-Cas系统
本文公开了“自失活”(SIN) CRISPR-Cas系统。所述SIN CRISPR-Cas系统可包含一个或多个区段。所述SIN CRISPR-Cas系统可以是AAV系统。所述SIN CRISPR-Cas系统可以是AAV5系统。
第一区段可以包含编码一种或多种诱导定点诱变的多肽(例如，Cas9或Cpf1)的核苷酸序列。所述第一区段可以进一步包含起始密码子、终止密码子、聚(A)终止位点和内含子。这样的多肽可以是化脓链球菌Cas9 (SpCas9)、金黄色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)或其任何变体。可以将作为启动子发挥功能的核苷酸序列可操作地连接至所述第一区段。所述启动子可以是空间受限的启动子、驱动一个方向的sgRNA和相反取向的Cas9的双向启动子或诱导型启动子。所述空间受限的启动子可以选自：任何遍在启动子、任何组织或细胞类型特异性启动子、肝细胞特异性启动子、神经元特异性启动子、脂肪细胞特异性启动子、心肌细胞特异性启动子、骨骼肌特异性启动子、肺祖细胞特异性启动子、光感受器特异性启动子和视网膜色素上皮(RPE)选择性启动子。所述启动子可以是sEF1α启动子或GRK1启动子。
第二区段可以包含编码sgRNA的核苷酸序列。所述sgRNA可以包含SEQ ID NO:5287-5291(图2B)、5319-5322(图2E)、5358(图2H)、5302-5304、5351-5356和5360中的任一个。所述sgRNA可以与SIN位点和基因组靶标序列基本上互补。“可杂交的”或“互补的”或“基本上互补的”意指核酸(例如RNA)包含核苷酸序列，其使得其能够在温度和溶液离子强度的适当的体外和/或体内条件下以序列特异性、反平行的方式(即，核酸特异性结合互补核酸)非共价结合另一种核酸，例如：与另一种核酸形成沃森-克里克碱基对、“退火”或“杂交”。如本领域已知，标准的沃森-克里克碱基配对包括：腺嘌呤(A)与胸苷(T)配对，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)配对，和鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对[ DNA，RNA]。在一些实例中，除了在至少一个位置中，所述sgRNA可以与所述SIN位点的核苷酸序列完全互补。在一些实例中，除了在至少两个位置中，所述sgRNA可以与所述SIN位点的核苷酸序列完全互补。
一个或多个第三区段可以位于第一区段的5'末端(起始密码子的上游和/或转录起始位点的下游)，在分开第一区段的内含子(天然或嵌合)内，或在第一区段的3'末端(在终止密码子和聚(A)终止位点之间)。在另一个实例中，一个或多个第三区段可以位于第一区段的5'末端和分开第一区段的内含子(天然或嵌合)内。所述第三区段可以长度为小于100个核苷酸。例如，所述第三区段可以长度为20-99、30-99、40-99、50-99、60-99、70-99、80-99和90-99个核苷酸。所述第三区段可以长度为小于50个核苷酸。例如，所述第三区段可以长度为20-49、25-49、30-49、35-49、40-49和45-49个核苷酸。
一个或多个第三区段可以包含自失活(SIN)位点。如本文所用的SIN位点或P23H靶标位点是包含P23H突变的RHO基因的20-50个核苷酸序列(SEQ ID NO:5313和5314)(表5)。所述SIN位点包含原间隔物邻近基序(PAM)。
表5
Figure 443425DEST_PATH_IMAGE003
gRNA或sgRNA的间隔物序列和与位于SIN位点内的原间隔物序列互补的链杂交，其导致通过gRNA-核酸内切酶复合物或sgRNA-核酸内切酶复合物编辑，并最终导致核酸内切酶(例如Cas9或Cpf1)的失活。可以用包含SEQ ID NO:5287-5291(图2B)、5319-5322(图2E)和5358(图2H)的sgRNA中的任一种靶向包含含有P23H突变的RHO基因的20-50个核苷酸序列的SIN位点，即使sgRNA中的一种或多种可能在至少1-2个位置与所述SIN位点的核苷酸序列不完全互补。
在其他实例中，与表5中列出的序列相比，SIN位点可以长度更短。例如，所述SIN位点可以是SEQ ID NO:5277-5281(图2A)中的序列中的任一个和PAM。所述SIN位点可以是SEQID NO:5315-5318(图2D)中的序列中的任一个和PAM。所述SIN位点可以是SEQ ID NO:5357(图2G)和PAM。所述SIN位点可以是SEQ ID NO:5297-5301(图2C)中的序列中的任一个和PAM。所述SIN位点可以是SEQ ID NO:5323-5326(图2F)中的序列中的任一个和PAM。所述SIN位点可以是SEQ ID NO:5359(图2I)和PAM。
在其他实例中，所述SIN位点可以短于sgRNA的相应原间隔物序列。例如，sgRNA的原间隔物序列可以长度为24个核苷酸，而相应的SIN位点可以含有较短的原间隔物(长度仅为23、22、21、20、19、18或17个核苷酸)和PAM。该缩短的SIN位点(其仍然对应于sgRNA的原间隔物序列)将允许比缩短的SIN位点更有效地切割基因组靶标序列。由于该原因，SEQ IDNO:5277-5281(图2A)、5315-5318(图2D)和5357(图2G)中或SEQ ID NO:5297-5301(图2C)、5323-5326(图2F)和5359(图2I)中的序列中的任一个可以缩短1、2、3、4、5、6或7个核苷酸，并且与PAM序列一起用作SIN位点。在这些实例中，所述SIN位点可以长度大于20个核苷酸或长度小于20个核苷酸。
在SIN-AAV系统中，所述核酸内切酶可以被一种或多种sgRNA指导至一个或多个基因组靶标序列。一个或多个基因组靶标序列可以是RHO基因内的P23H突变。所述核酸内切酶可以被进一步指导至表达所述核酸内切酶的SIN-AAV系统及所述系统的组分。可以靶向的SIN-AAV系统组分的实例包括：SIN-AAV系统的载体的必需序列(例如病毒反向末端重复区)，驱动对于编辑重要的基因(例如sgRNA或核酸内切酶基因)的表达的启动子，Cas9或Cpf1的开放阅读框(ORF)，分开编码的基因的内含子或位于Cas9或Cpf1 ORF的5’或3’或位于内含子中的非编码区(SIN位点)。这导致自我限制的编辑活性，其导致对一个或多个靶标基因组基因座的编辑，并且此后导致核酸内切酶和/或所述系统的其他必需组分(例如sgRNA)的表达减少或消除。SIN-AAV系统中的基因的这种自我限制的表达可以导致靶外编辑减少，和被患者的免疫系统靶向成功编辑的细胞的风险。
一种或多种载体可以编码公开的SIN-AAV系统。如果只有一种载体编码整个SIN-AAV系统，则该系统被称为“多合一” SIN系统。例如，第一区段、第二区段和第三区段可以在“多合一” SIN AAV系统中一起提供。如果两种载体编码整个SIN-AAV系统，则该系统被称为“多合二” SIN系统。例如，对于“多合二” SIN AAV系统，第一区段和第三区段可以在第一载体中提供，并且第二区段可以在第二载体中提供。
多合一SIN-AAV系统
在一个实例中，多合一SIN系统可以包含含有核酸内切酶ORF和sgRNA基因的载体。所述载体可以进一步包含在核酸内切酶ORF的位置5’和3’以及分开核酸内切酶ORF的内含子内的SIN位点。所述sgRNA可以与SIN位点基本上互补。所述sgRNA也可以与基因组靶标序列基本上互补。因此，所述sgRNA的序列使得其可以与载体上的两个SIN位点以及一个或多个基因组靶标序列杂交。当与一个或多个基因组靶标或与SIN位点杂交时，所述sgRNA可以包含一个或多个错配的碱基。所述系统可以导致在靶向的基因组基因座处的自我限制的编辑，随后为核酸内切酶基因的切除和/或失活。
在另一个实例中，多合一SIN系统可以包含含有核酸内切酶ORF、第一sgRNA基因和第二sgRNA基因的载体。所述载体可以进一步在以下位置中的一个或多个处包含SIN位点：核酸内切酶ORF的5’，核酸内切酶ORF的3’或在分开核酸内切酶ORF的内含子内。第一sgRNA的序列使得其可以与一个或多个基因组靶标序列杂交。第二sgRNA的序列使得其可以与载体上的SIN位点杂交。当与一个或多个基因组靶标或与SIN位点杂交时，所述sgRNA可以包含一个或多个错配的碱基。可以将额外的sgRNA并入系统中，以允许编辑额外的基因组或SIN系统靶标。所述系统可以导致在靶向的基因组基因座处的自我限制的编辑，随后为核酸内切酶基因的切除和/或失活。
在另一个实例中，多合一SIN系统可以包含含有核酸内切酶ORF、第一sgRNA基因和第二sgRNA基因的载体。第一sgRNA的序列使得其可以与一个或多个基因组靶标序列杂交。第二sgRNA的序列使得其可以在载体上的核酸内切酶ORF (Cas9或Cpf1)内或附近杂交，导致经由生成插入/缺失而使核酸内切酶基因失活。可以将额外的sgRNA并入系统中，以允许编辑额外的基因组或SIN系统靶标。当与一种或多种基因组靶标或核酸内切酶ORF杂交时，两种或更多种sgRNA可以包含一个或多个错配的碱基。所述系统可以导致在靶向的基因组基因座处的自我限制的编辑，随后为核酸内切酶基因的失活。
在多合一系统、诸如上述那些中，由于核酸内切酶基因的失活比期望的更早发生且诱变的SIN位点在包装在AAV衣壳中的DNA上积累(例如，在选择的细胞系中生产和包装病毒载体期间)，适当的病毒载体的生产可能有挑战性的。为了解决该问题，可以从一个或多个细胞/组织特异性启动子表达核酸内切酶ORF和/或引导在核酸内切酶基因基因座处的编辑的sgRNA基因。所述细胞/组织特异性启动子可以在期望编辑的细胞中有活性，而在用于载体的生产和包装的细胞中更早地无活性。另外，可以使用一种或多种诱导型启动子系统来控制目标基因的表达，诸如四环素-控制的转录活化(即tet-ON或tet-OFF)。过早失活问题的其他解决方案包括用miRNA、小干扰RNA、短发夹RNA或其他反义寡核苷酸调节基因表达，阻断sgRNA的转录(例如，使用tet-OFF系统)或抑制加载至Cas9上的sgRNA。
多合二SIN-AAV系统
在一个实例中，多合二SIN系统可以包含第一载体以提供编码核酸内切酶的ORF(图5A-B)。在第一载体上，SIN位点可以位于核酸内切酶ORF的5’和分开核酸内切酶ORF的内含子内(图5A-B)。所述SIN位点可以是SEQ ID NO:5313-5314中的任一种，如表5中所示。与表5中列出的序列相比，所述SIN位点可以长度更短。例如，所述SIN位点可以是SEQ ID NO:5277-5281(图2A)中的序列中的任一个和PAM。所述SIN位点可以是SEQ ID NO:5315-5318(图2D)中的序列中的任一个和PAM。所述SIN位点可以是SEQ ID NO:5357(图2G)和PAM。所述SIN位点可以是SEQ ID NO:5297-5301(图2C)中的序列中的任一个和PAM。所述SIN位点可以是SEQID NO:5323-5326(图2F)中的序列中的任一个和PAM。所述SIN位点可以是SEQ ID NO:5359(图2I)和PAM。在其他实例中，所述SIN位点可以短于sgRNA的相应原间隔物序列。例如，sgRNA的原间隔物序列可以长度为24个核苷酸，而相应的SIN位点可以含有较短的原间隔物(长度仅为23、22、21、20、19、18或17个核苷酸)和PAM。通过使用缩短的(或截短的)SIN位点(其仍然对应于sgRNA的原间隔物序列)，这将允许RNP复合物与缩短的SIN位点本身相比更有效地切割基因组靶标序列。由于该原因，SEQ ID NO:5277-5281(图2A)、5315-5318(图2D)和5357(图2G)中或SEQ ID NO:5297-5301(图2C)、5323-5326(图2F)和5359(图2I)中的序列中的任一个可以缩短1、2、3、4、5、6或7个核苷酸，并且与PAM序列一起用作SIN位点。在第二载体中，可以编码单个sgRNA(图5D)。所述sgRNA可以包含SEQ ID NO:5287-5291(图2B)、5319-5322(图2E)、5358(图2H)、5302-5304、5351-5356和5360中的任一个。所述sgRNA可以与SIN位点基本上互补。所述sgRNA也可以与基因组靶标序列基本上互补。因此，所述sgRNA的序列可以使得其可以与第一载体上的两个SIN位点以及一个或多个基因组靶标序列(例如，RHO基因内的P23H突变)杂交。当与一个或多个基因组靶标或与SIN位点杂交时，所述sgRNA可以包含一个或多个错配的碱基。所述系统可以导致在靶向的基因组基因座处的自我限制的编辑，随后为核酸内切酶基因的切除和/或失活。
在另一个实例中，多合二SIN系统可以包含第一载体以提供编码核酸内切酶的ORF。在第一载体上，SIN位点可以位于核酸内切酶ORF的5’和分开核酸内切酶ORF的内含子内。所述SIN位点可以是SEQ ID NO:5313-5314中的任一个，如表5中所示。与表5中列出的序列相比，所述SIN位点可以长度更短。例如，所述SIN位点可以是SEQ ID NO:5277-5281(图2A)中的序列中的任一个和PAM。所述SIN位点可以是SEQ ID NO:5315-5318(图2D)中的序列中的任一个和PAM。所述SIN位点可以是SEQ ID NO:5357(图2G)和PAM。所述SIN位点可以是SEQ ID NO:5297-5301(图2C)中的序列中的任一个和PAM。所述SIN位点可以是SEQ ID NO:5323-5326(图2F)中的序列中的任一个和PAM。所述SIN位点可以是SEQ ID NO:5359(图2I)和PAM。在其他实例中，所述SIN位点可以短于sgRNA的相应原间隔物序列。例如，sgRNA的原间隔物序列可以长度为24个核苷酸，而相应的SIN位点可以含有较短的原间隔物(长度仅为23、22、21、20、19、18或17个核苷酸)和PAM。通过使用缩短的(或截短的)SIN位点(其仍然对应于sgRNA的原间隔物序列)，这将允许RNP复合物与缩短的SIN位点本身相比更有效地切割基因组靶标序列。由于该原因，SEQ ID NO:5277-5281(图2A)、5315-5318(图2D)和5357(图2G)中或SEQ ID NO:5297-5301(图2C)、5323-5326(图2F)和5359(图2I)中的序列中的任一个可以缩短1、2、3、4、5、6或7个核苷酸，并且与PAM序列一起用作SIN位点。所述多合二系统可以进一步包含第二载体，其包含两个sgRNA基因。当从第二载体表达时，第一sgRNA可以与核酸内切酶分子结合并引导在一个或多个基因组靶标基因座(例如，RHO基因内的P23H突变)处的编辑。所述第一sgRNA可以包含SEQ ID NO:5287-5291(图2B)、5319-5322(图2E)、5358(图2H)、5302-5304、5351-5356和5360中的任一个。当从第二载体表达时，第二sgRNA可以与核酸内切酶分子结合并在SIN位点处直接编辑。可以将额外的sgRNA并入系统中，以允许编辑额外的基因组或SIN系统靶标。当与一种或多种基因组靶标或与SIN位点杂交时，两种或更多种sgRNA可以包含一个或多个错配的碱基。在一些实例中，可以在第一载体或者第一载体和第二载体两者的组合上编码靶向基因组基因座的一个或多个sgRNA。所述系统可以导致在靶向的基因组基因座处的自我限制的编辑，随后为核酸内切酶基因的切除和/或失活。
在另一个实例中，多合二SIN系统可以含有包含核酸内切酶ORF的第一载体和包含两个sgRNA基因的第二载体。当从第二载体表达时，第一sgRNA可以与核酸内切酶分子结合并引导在一个或多个基因组靶标基因座(例如，RHO基因内的P23H突变)处的编辑。所述sgRNA可以包含SEQ ID NO:5287-5291(图2B)、5319-5322(图2E)、5358(图2H)、5302-5304、5351-5356和5360中的任一个。当从第二载体表达时，第二sgRNA可以与核酸内切酶分子结合，并引导第一载体上的核酸内切酶ORF(Cas9或Cpf1)内或附近的编辑，导致经由生成插入/缺失而使核酸内切酶基因失活。可以将额外的sgRNA并入系统中，以允许编辑额外的基因组或SIN系统靶标。当与一种或多种基因组靶标或在核酸内切酶ORF内或附近杂交时，两种或更多种sgRNA可以包含一个或多个错配的碱基。在一些实例中，可以在第一载体或者第一载体和第二载体两者的组合上编码靶向基因组基因座的一个或多个sgRNA。所述系统可以导致在靶向的基因组基因座处的自我限制的编辑，随后为核酸内切酶基因的失活。
慢病毒
在一些方面，慢病毒载体或颗粒可以用作递送载体。慢病毒是病毒的逆转录病毒科的亚组。慢病毒颗粒能够将其遗传物质整合至靶标/宿主细胞的基因组中。慢病毒的实例包括人免疫缺陷病毒：HIV-1和HIV-2、金布拉纳病病毒(JDV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、马传染性贫血病毒、visna-maedi和山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)。LV由于其通过靶标细胞的完整核膜的独特能力而能够感染分裂细胞和非分裂细胞，Greenberg等人, University of Berkeley,California; 2006)。形成基因递送媒介物的慢病毒颗粒是复制缺陷的，并通过减弱HIV毒力基因而产生。例如，基因Vpu、Vpr、Nef、Env和Tat被切除，使载体生物学安全。例如，源自HIV-1/HIV-2的慢病毒载体可以介导转基因向非分裂细胞中的有效递送、整合和长期表达。如本文所用，术语“重组”是指含有慢病毒序列和非慢病毒逆转录病毒序列两者的载体或其他核酸。
为了产生能够感染宿主细胞的慢病毒，需要在产生病毒的细胞中共表达三种类型的载体：含有目标转基因和自失活3’-LTR区域的骨架载体，表达病毒结构蛋白的一种构建体，和编码用于包封的水疱性口炎病毒糖蛋白(VSVG)的一种载体(Naldini, L. 等人,Science 1996; 272, 263–267)。Rev基因与其他结构基因的分离通过降低反向重组的可能性进一步增加生物安全性。可用于产生高滴度慢病毒颗粒的细胞系可以包括但不限于293T细胞、293FT细胞和293SF-3F6细胞(Witting等人, Human Gene Therapy, 2012; 23: 243–249; Ansorge等人, Joural of Genetic Medicne, 2009; 11: 868–876)。
在本领域中讨论了用于产生重组慢病毒颗粒的方法，例如，WO 2013076309 (PCT/EP2012/073645)；WO 2009153563 (PCT/GB2009/001527)；美国专利号：7,629,153；和6,808, 905。
已经用慢病毒(LV)载体成功地靶向细胞类型，诸如光感受器细胞、视网膜色素上皮和神经节细胞。用AAV递送至光感受器和神经节细胞的效率显著高于LV载体。
药学上可接受的载体
在本文中预见到的将祖细胞施用于个体的离体方法包括，使用包含祖细胞的治疗组合物。
治疗组合物可以含有生理学上可耐受的载体以及细胞组合物和任选的至少一种作为活性成分溶解或分散在其中的如本文中所述的另外的生物活性剂。在一些情况下，当为了治疗目的而施用于哺乳动物或人患者时，所述治疗组合物不是基本上免疫原性的，除非期望如此。
一般而言，可以将本文描述的祖细胞作为含有药学上可接受的载体的混悬液施用。本领域技术人员会认识到，要用在细胞组合物中的药学上可接受的载体不会包括基本上干扰要递送给个体的细胞的生存力的量的缓冲剂、化合物、冷冻保存剂、防腐剂或其他试剂。包含细胞的制剂可以包括例如，允许维持细胞膜完整性的渗透缓冲剂，和任选地，在施用后维持细胞生存力或增强移植物植入的营养物。这样的制剂和混悬液是本领域技术人员已知的，和/或可以适合使用例行实验与如本文中所述的祖细胞一起使用。
还可以将细胞组合物乳化或呈现为脂质体组合物，前提条件是，所述乳化程序不会不利地影响细胞生存力。所述细胞和任何其他活性成分可以以适合用在本文描述的治疗方法中的量与药学上可接受的且与活性成分相容的赋形剂混合。
在细胞组合物中包括的另外的试剂可以包括在其中的组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与以下酸形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基形成)：无机酸例如，盐酸或磷酸，或有机酸诸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等。与游离羧基形成的盐还可以衍生自无机碱，例如，钠、钾、铵、钙或三价铁氢氧化物，和有机碱诸如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
生理学上可耐受的载体是本领域众所周知的。示例性的液体载体是不含有除了活性成分和水以外的物质的无菌水溶液，或含有缓冲剂诸如在生理pH值的磷酸钠、生理盐水或二者，诸如磷酸盐缓冲盐水。更进一步，水性载体可以含有超过一种缓冲盐，以及盐诸如氯化钠和氯化钾、右旋糖、聚乙二醇和其他溶质。液体组合物还可以含有除了水以外和不包括水的液相。这样的另外的液相的示例是甘油、植物油诸如棉籽油、和水-油乳剂。在细胞组合物中使用的有效地治疗特定病症或病症的活性化合物的量可以取决于病症或病症的性质，且可以通过标准的临床技术来确定。
向导RNA制剂
可以用药学上可接受的赋形剂诸如载体、溶剂、稳定剂、佐剂、稀释剂等配制本发明的向导RNA，取决于特定施用模式和剂型。可以配制向导RNA组合物以实现生理上相容的pH，和从约3的pH至约11的pH、约pH 3至约pH 7的范围，取决于制剂和施用途径。在一些情况下，可以将pH调至约pH 5.0至约pH 8的范围。在一些情况下，所述组合物可以包含治疗有效量的至少一种如本文中所述的化合物、以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。任选地，所述组合物可以包含本文所述化合物的组合，或可以包括可用于治疗或预防细菌生长的第二种活性成分(例如、但不限于，抗细菌剂或抗微生物剂)，或可以包括本发明的试剂的组合。
合适的赋形剂包括，例如，载体分子，其包括大的、缓慢代谢的大分子诸如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。其他示例性的赋形剂可以包括抗氧化剂(例如、但不限于，抗坏血酸)、螯合剂(例如、但不限于，EDTA)、碳水化合物(例如、但不限于，糊精、羟基烷基纤维素和羟基烷基甲基纤维素)、硬脂酸、液体(例如、但不限于，油、水、盐水、甘油和乙醇)、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
施用和效力
在通过一种方法或途径将细胞(例如，祖细胞)放入个体中的背景下，术语“施用”、“引入”和“移植”可互换使用，所述方法或途径导致引入的细胞在期望的部位(诸如损伤或修复的部位)处的至少部分定位，从而产生预期的效应。通过任何适当的途径可以施用细胞(例如，祖细胞)或它们的分化的后代，所述途径导致递送至个体中的期望位置，在该处植入的细胞的至少一部分或所述细胞的组分保持存活。施用于个体之后细胞的生存阶段可以短至几小时，例如，24小时，至几天，至长达几年，或甚至患者的生存期，即，长期移植物植入。例如，在本文所述的一些方面，经由全身性施用途径，诸如腹膜内或静脉内途径，施用有效量的光感受器细胞或视网膜祖细胞。
在通过一种方法或途径将RNA、sgRNA和核酸内切酶中的至少一种放入个体中的背景下，术语“施用”、“引入”和“移植”可互换使用，所述方法或途径导致引入的RNA、sgRNA和/或核酸内切酶在期望的部位(诸如损伤或修复的部位)处的至少部分定位，从而产生预期的效应。通过任何适当的途径可以施用RNA、sgRNA和/或核酸内切酶，所述途径导致递送至个体中的期望位置。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换地使用，且是指为其需要诊断、治疗或疗法的任何个体。在一些方面，所述个体是哺乳动物。在一些方面，所述个体是人类。
当预防性地提供时，在常染色体显性RP的任何症状之前，可以将本文描述的祖细胞施用于个体。因此，祖细胞群体的预防性施用用于预防常染色体显性RP。
根据本文所述的方法施用的祖细胞群体可以包含得自一个或多个供体的同种异体祖细胞。这样的祖细胞可以是任何细胞或组织来源的，例如肝脏、肌肉、心脏等。“同种异体的”是指得自相同物种的一个或多个不同供体(其中在一个或多个基因座处的基因不是相同的)的祖细胞或包含祖细胞的生物样品。例如，施用于个体的光感受器或视网膜祖细胞群体可以源自一个更无关的供体个体，或源自一个或多个不相同的同胞。在一些情况下，可以使用同基因的祖细胞群体，诸如得自遗传上相同的动物或得自单卵孪生的那些。所述祖细胞可以是自体细胞；也就是说，所述祖细胞得自或分离自一个个体并施用于相同个体，即，供体和接受者是同一人。
术语“有效量”是指预防或减轻常染色体显性RP的至少一种或多种征象或症状所需的祖细胞或它们的后代的群体的量，且是指足以提供期望的作用(例如，治疗具有常染色体显性RP的个体)的组合物的量。术语“治疗有效量”因此是指，当施用于典型个体(诸如具有常染色体显性RP或处于常染色体显性RP的风险中的个体)时足以促进特定效应的祖细胞或包含祖细胞的组合物的量。有效量也包括足以预防或延迟疾病的症状的发展、改变疾病的症状的进程(例如但不限于，减慢疾病的症状的进展)、或逆转疾病的症状的量。应当理解，对于任何给定的病例，适当的“有效量”可以由本领域普通技术人员使用例行实验确定。
为了用在本文描述的各个方面，祖细胞的有效量包含至少102个祖细胞、至少5 X102个祖细胞、至少103个祖细胞、至少5 X 103个祖细胞、至少104个祖细胞、至少5 X 104个祖细胞、至少105个祖细胞、至少2 X 105个祖细胞、至少3 X 105个祖细胞、至少4 X 105个祖细胞、至少5 X 105个祖细胞、至少6 X 105个祖细胞、至少7 X 105个祖细胞、至少8 X 105个祖细胞、至少9 X 105个祖细胞、至少1 X 106个祖细胞、至少2 X 106个祖细胞、至少3 X 106个祖细胞、至少4 X 106个祖细胞、至少5 X 106个祖细胞、至少6 X 106个祖细胞、至少7 X 106个祖细胞、至少8 X 106个祖细胞、至少9 X 106个祖细胞或它们的倍数。所述祖细胞可以源自一个或多个供体，或可以得自自体来源。在本文所述的一些实例中，在施用于有此需要的个体之前，可以在培养物中扩增所述祖细胞。
对于改善疾病的一种或多种症状、对于增加长期存活和/或对于减小与其他治疗有关的副作用，在具有常染色体显性RP的患者的细胞中表达的功能性RHO蛋白的水平的适度和增量增加可以是有益的。在将这样的细胞施用于人患者后，生产增加的功能性RHO蛋白的水平的祖细胞的存在是有益的。在一些情况下，个体的有效治疗导致相对于治疗的个体中的总RHO而言至少约3%、5%或7%的功能性RHO蛋白。在一些实例中，功能性RHO将是总RHO的至少约10%。在一些实例中，功能性RHO蛋白将是总RHO蛋白的至少约20%至30%。类似地，甚至相对有限的具有显著升高的功能性RHO蛋白的水平的细胞亚群的引入可以在不同的患者中是有益的，因为在某些情况下，正常化的细胞将具有相对于患病细胞的选择性优点。然而，对于改善患者中的常染色体显性RP的一个或多个方面，甚至不大水平的具有升高水平的功能性RHO蛋白的祖细胞可以是有益的。在一些实例中，在给其施用这样的细胞的患者中约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%或更多的光感受器细胞或视网膜祖细胞正在生产增加水平的功能性RHO蛋白。
“施用”是指通过一定方法或途径将祖细胞组合物递送进个体中，所述方法或途径导致所述细胞组合物在期望的部位处的至少部分定位。可以通过导致在个体中的有效治疗的任何适当途径施用细胞组合物，即施用导致向个体中的期望位置的递送，其中递送的组合物的至少一部分(即至少1 x 104个细胞)被递送至期望部位一定的时间段。
在该方法的一个方面，所述药物组合物可以经由诸如但不限于以下的途径施用：肠内(进入肠内)，肠胃，硬膜外(进入硬脑膜)，口服(通过口的方式)，透皮，硬膜外，脑内(进入大脑)，脑室内(进入脑室)，表皮(应用于皮肤上)，皮内(进入皮肤本身)，皮下(在皮肤下)，经鼻施用(通过鼻子)，静脉内(进入静脉)，静脉推注，静脉内滴注，动脉内(进入动脉)，肌肉内(进入肌肉)，心内(进入心脏)，骨内输注(进入骨髓)，鞘内(进入椎管)，腹膜内(输注或注入腹膜)，膀胱内输注，玻璃体内(通过眼睛)，腔内注射(进入病理腔)，腔内(进入阴茎的基部)，阴道内施用，子宫内，羊膜外施用，经皮(通过完整皮肤的扩散用于全身分布)，经粘膜(通过粘膜的扩散)，经阴道，吹入(鼻吸)，舌下，唇下，灌肠，滴眼(至结膜上)，入液耳剂中，耳(耳内或通过耳的方式)，颊(指向脸颊)，结膜，皮肤，牙齿(至一个或多个牙齿)，电渗，宫颈内，鼻窦内，气管内，体外，血液透析，浸润，间质，腹腔内，羊膜内，关节内，胆道内，支气管内，法氏囊内，软骨内(软骨内)，尾内(马尾内)，脑池内(小脑延髓池内)，角膜内(角膜内)，牙科角膜内，冠状动脉内(冠状动脉内)，阴茎海绵体内(在阴茎海绵体的可扩张空间内)，椎间盘内(椎间盘内)，导管内(腺管内)，十二指肠内(十二指肠内)，硬脑膜内(硬脑膜内或下方)，表皮内(至表皮)，食道内(至食道)，胃内(胃内)，牙龈内(牙龈内)，回肠内(小肠远端部分内)，病灶内(在局部病灶内或直接引入局部病灶)，腔内(管腔内)，淋巴内(淋巴内)，髓内(在骨的骨髓腔内)，脑膜内(脑膜内)，心肌内(心肌内)，眼内(眼内)，卵巢内(卵巢内)，心包内(心包内)，胸膜内(胸膜内)，前列腺内(前列腺内)，肺内(肺或其支气管内)，鼻内(鼻或眶周窦内)，脊柱内(脊柱内)，滑膜内(关节的滑膜腔内)，腱内(腱内)，睾丸内(睾丸内)，鞘内(在脑脊髓轴的任何水平处的脑脊液内)，胸内(胸内)，肾小管内(器官小管内)，肿瘤内(肿瘤内)，鼓室内(aurus media内)，血管内(一个或多个血管内)，心室内(心室内)，离子电渗(通过电流的方式，其中可溶性盐的离子迁移至身体的组织)，灌洗(洗涤或冲洗开放性伤口或体腔)，喉(直接在喉部上)，鼻胃(通过鼻子并进入胃)，闭塞包扎技术(局部途径施用，其然后遮盖区域的敷料覆盖)，眼(至外眼)，口咽部(直接至口腔和咽部)，肠胃外，经皮，关节周围，硬膜外，神经周，牙周，直肠，呼吸(通过经口或经鼻吸入在呼吸道内用于局部或全身作用)，球后(脑桥后或眼球后)，心肌内(进入心肌)，软组织，蛛网膜下，结膜下，粘膜下，局部，经胎盘(通过或跨过胎盘)，经气管(通过气管壁)，经鼓膜(跨过或通过鼓膜腔)，尿管(至尿管)，尿道(至尿道)，阴道，骶管阻滞，诊断，神经阻滞，胆道灌注，心脏灌注，光穿刺术和脊髓。
施用模式包括注射、输注、滴注和/或摄取。“注射”包括，但不限于，静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。在一些实例中，所述途径是静脉内的。对于细胞的递送，可以做出通过注射或输注实现的施用。
可以全身性地施用所述细胞。短语“全身施用”、“全身性地施用”、“周围施用”和“在周围施用”是指除了直接进入靶标位置、组织或器官以外的祖细胞群体的施用，使得它替代性地进入个体的循环系统，并因此发生代谢和其他类似的过程。
熟练的临床医师可以确定包含用于治疗常染色体显性RP的组合物的治疗的效力。然而，如果以有益的方式(例如，增加至少10%)改变功能性常染色体显性RP的任何一种或所有征象或症状(但是作为一个实例，其水平)，或改进或改善疾病的其他临床上接受的症状或标志物，认为治疗是“有效的治疗”。通过个体的恶化失败也可以测量效力，如通过住院治疗或对医学干预的需要所评估的(例如，疾病的进展被暂停或至少减慢)。本领域技术人员已知和/或本文描述了测量这些指标的方法。治疗包括个体或动物(一些非限制性实例包括人或哺乳动物)中的疾病的任何治疗，且包括：(1)抑制疾病，例如，阻止或减慢症状的进展；或(2)缓解疾病，例如，引起症状的消退；和(3)预防或减小症状发生的可能性。
根据本发明的治疗可以通过增加、减少或改变个体中的功能性RHO的量来改善一种或多种与常染色体显性RP有关的症状。通常与常染色体显性RP相关的体征包括例如夜盲症，视敏，眼底外观，后囊内白内障，玻璃体中的尘埃样颗粒，视网膜深处的白点，视神经头的透明体，渗出性血管病和扇区常染色体显性RP。
试剂盒
本发明提供了用于实现本文所述的方法的试剂盒。试剂盒可以包括以下一种或多种：靶向基因组的核酸，编码靶向基因组的核酸的多核苷酸，定位多肽，编码定位多肽的多核苷酸，和/或实现本文所述的方法的方面所需的任何核酸或蛋白性分子，或它们的任何组合。
试剂盒可以包含：(1)载体，其包含编码靶向基因组的核酸的核苷酸序列，(2)定位多肽或载体，其包含编码定位多肽的核苷酸序列，和(3)用于重构和/或稀释所述载体和/或多肽的试剂。
试剂盒可以包含：(1)载体，其包含(i)编码靶向基因组的核酸的核苷酸序列，和(ii)编码定位多肽的核苷酸序列，和(2)用于重构和/或稀释所述载体的试剂。
在以上试剂盒中，所述试剂盒可以包含靶向基因组的单分子向导核酸。在以上试剂盒中，所述试剂盒可以包含靶向基因组的双分子核酸。在以上试剂盒中，所述试剂盒可以包含两种或更多种双分子向导或单分子向导。所述试剂盒可以包含编码靶向核酸的核酸的载体。
在以上试剂盒中, 所述试剂盒可以进一步包含要插入以实现期望的遗传修饰的多核苷酸。
试剂盒的组分可以是在单独的容器中，或被组合在单个容器中。
上述的试剂盒可以进一步包含一种或多种另外的试剂，其中这样的另外的试剂选自缓冲液、用于将多肽或多核苷酸引入细胞中的缓冲液、洗涤缓冲液、对照试剂、对照载体、对照RNA多核苷酸、用于从DNA体外生产多肽的试剂、用于测序的衔接子等。缓冲液可以是稳定缓冲液、重构缓冲液、稀释缓冲液等。试剂盒还可以包含一种或多种组分，其可以用于促进或增强核酸内切酶对DNA的靶上结合或切割，或改善靶向的特异性。
除了上述组分以外，试剂盒还可以包含关于使用所述试剂盒的组分来实践所述方法的说明书。关于实践所述方法的说明书可以记录在合适的记录介质上。例如，所述说明书可以印刷在衬底(诸如纸或塑料)等上。所述说明书可以作为包装说明书呈现在试剂盒中，在所述试剂盒或其组分的容器的标签中(即，伴随所述包装或分包装)，等。所述说明书可以作为电子存储数据文件呈现，所述电子存储数据文件存在于合适的计算机可读的存储介质(例如CD-ROM、软盘、闪存等)上。在一些情况下，实际的说明书没有存在于试剂盒中，但是可以提供关于从遥远来源得到说明书的方式(例如经由因特网)。该情况的一个实例是包含网址的试剂盒，在所述网址可以浏览说明书和/或从所述网址可以下载说明书。与说明书一样，关于得到说明书的该方式可以记录在合适的衬底上。
其他可能的治疗方案
使用经工程改造成靶向特定序列的核酸酶可以进行基因编辑。迄今为止，存在4大类核酸酶：大范围核酸酶和它们的衍生物、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化剂如效应物核酸酶(TALEN)、和CRISPR-Cas9核酸酶系统。核酸酶平台在设计难度、靶向密度和作用模式上存在差异，特别是因为ZFN和TALEN的特异性是通过蛋白-DNA相互作用，而RNA-DNA相互作用主要引导Cas9。Cas9切割还需要邻近的PAM基序，其在不同的CRISPR系统之间不同。来自化脓链球菌的Cas9使用NGG PAM切割，来自脑膜炎奈瑟氏菌的CRISPR可以在包括NNNNGATT、NNNNNGTTT和NNNNGCTT的PAM处切割。许多其他Cas9直系同源物靶向与替代PAM相邻的原间隔物。
CRISPR核酸内切酶(诸如Cas9)可以用在本发明的方法中。然而，本文描述的教导，诸如治疗性靶标位点，可以应用于核酸内切酶的其他形式，诸如ZFN、TALEN、HE或MegaTAL，或使用核酸酶的组合。然而，为了将本发明的教导应用于这样的核酸内切酶，人们尤其需要工程改造针对特定靶标位点的蛋白。
可以将另外的结合结构域与Cas9蛋白融合以增加特异性。这些构建体的靶标位点可以映射至鉴定的gRNA指定的位点，但是可以需要另外的结合基序，诸如针对锌指结构域。在Mega-TAL的情况下，可以将大范围核酸酶与TALE DNA-结合结构域融合。大范围核酸酶结构域可以增加特异性和提供切割。类似地，可以将失活的或死的Cas9 (dCas9)与切割结构域融合，并且需要sgRNA/Cas9靶标位点和融合的DNA-结合结构域的邻近结合位点。这可能需要除了催化失活以外的dCas9的某种蛋白工程改造，以减少在没有另外的结合位点时的结合。
锌指核酸酶
锌指核酸酶(ZFN)是包含与II型核酸内切酶FokI的催化结构域连接的、经工程改造的锌指DNA结合结构域的模块蛋白。因为FokI仅作为二聚体起作用，必须将一对ZFN工程改造成结合相反DNA链上的同源靶标“半位点”序列且在它们之间具有精确间距以使催化活性的FokI二聚体能够形成。在FokI结构域(其本身不具有序列特异性)的二聚化后，在ZFN半位点之间产生DNA双链断裂作为基因组编辑中的开始步骤。
每种ZFN的DNA结合结构域通常包含丰富的Cys2-His2体系结构的3-6个锌指，每个指主要识别靶标DNA序列的一条链上的核苷酸的三联体，尽管与第四个核苷酸的交叉链相互作用也可以是重要的。在与DNA发生关键接触的位置中的指的氨基酸的改变会改变给定指的序列特异性。因此，四指锌指蛋白将选择性地识别12碱基对靶标序列，其中所述靶标序列是每个指做出贡献的三联体偏好的复合物，尽管三联体偏好可以在不同程度上受邻近指影响。ZFN的一个重要方面是，简单地通过修饰各个指可以将它们容易地重新靶向至几乎任何基因组地址，尽管也需要大量专家经验才能实现该目的。在ZFN的大多数应用中，使用4-6个指的蛋白，分别识别12-18个碱基对。因此，一对ZFN通常识别24-36个碱基对的组合靶标序列，不包括半位点之间的典型的5-7个碱基对间隔物。所述结合位点可以被更大间隔物(包括15-17个碱基对)进一步隔开。该长度的靶标序列可能是在人基因组中独有的，假定在设计过程中不包括重复序列或基因同系物。尽管如此，ZFN蛋白-DNA相互作用在它们的特异性方面不是绝对的，所以靶外结合和切割事件实际会发生，无论是作为两个ZFN之间的异源二聚体，还是作为一种或其他ZFN的同源二聚体。已经如下有效地消除了后一种可能性：工程改造FokI结构域的二聚化界面以建立“正”和“负”变体，也被称作专性异源二聚体变体，其可以仅彼此二聚化，且不与自身二聚化。强制专性异源二聚体会阻止同源二聚体的形成。这已经极大地增强了ZFN以及采用这些FokI变体的任何其他核酸酶的特异性。
在本领域中已经描述了多种基于ZFN的系统，正式报道了其修改，且众多参考文献描述了用于指导ZFN的设计的规则和参数；参见，例如，Segal等人, Proc Natl Acad SciUSA 96(6):2758-63 (1999); Dreier B等人, J Mol Biol. 303(4):489-502 (2000);Liu Q等人, J Biol Chem. 277(6):3850-6 (2002); Dreier等人, J Biol Chem 280(42):35588-97 (2005); 和Dreier等人, J Biol Chem. 276(31):29466-78 (2001)。
转录活化剂-样效应物核酸酶(TALEN)
转录活化剂-样效应物核酸酶(TALEN)代表模块核酸酶的另一种形式，由此与ZFN一样，经工程改造的DNA结合结构域连接至FokI核酸酶结构域，且一对TALEN以串联方式运行以实现靶向的DNA裂解。与ZFN的主要差别是DNA结合结构域的性质和有关的靶标DNA序列识别性能。TALEN DNA结合结构域源自TALE蛋白，其最初描述在植物细菌性病原体黄单胞菌属(Xanthomonas sp.)中。TALE包含33-35个氨基酸重复序列的串联阵列，每个重复序列识别通常具有多达20个碱基对长度的靶标DNA序列中的单个碱基对，从而产生多达40个碱基对的总靶标序列长度。通过刚好包括在位置12和13处的2个氨基酸的重复可变二残基(RVD)确定每个重复序列的核苷酸特异性。碱基鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶主要被四种RVD分别识别：Asn-Asn、Asn-Ile、His-Asp和Asn-Gly。这构成比锌指简单得多的识别代码，且因此代表就核酸酶设计而言胜过后者的一个优点。尽管如此，与ZFN一样，TALEN的蛋白-DNA相互作用在它们的特异性方面不是绝对的，且TALEN还已经受益于FokI结构域的专性异源二聚体变体用于减小靶外活性的用途。
已经制备了FokI结构域的另外变体，其在它们的催化功能方面被失活。如果TALEN或ZFN对的一半含有无活性的FokI结构域，那么仅单链DNA裂解(产生切口)将发生靶上位点，而不是DSB。所述结果与CRISPR/Cas9/Cpf1“切口酶”突变体的应用相当，在后者中所述Cas9切割结构域之一已经被失活。DNA切口可以用于驱动通过HDR进行的基因组编辑，但是以比使用DSB更低的效率。主要益处是，不同于DSB(其易于发生NHEJ介导的错误修复)，靶外切口被快速地和准确地修复。
在本领域中已经描述了多种基于TALEN的系统，且正式报道了其修改；参见，例如，Boch, Science 326(5959):1509-12 (2009)；Mak等人,Science 335(6069):716-9(2012)；和Moscou等人,Science 326(5959):1501 (2009)。多个小组已经描述了基于“Golden Gate”平台的TALEN或克隆方案的应用；参见，例如，Cermak等人,Nucleic Acids Res. 39(12):e82 (2011)；Li等人,Nucleic Acids Res. 39(14):6315-25(2011)；Weber等人,PLoS One. 6(2):e16765 (2011)；Wang等人,J Genet Genomics 41(6):339-47, 2014年5月17日电子公开(2014)；和Cermak T等人,Methods Mol Biol. 1239:133-59 (2015)。
归巢核酸内切酶
归巢核酸内切酶(HE)是具有长识别序列(14-44个碱基对)并以高特异性(经常在基因组所特有的位点)切割DNA的序列特异性的核酸内切酶。存在至少6个通过它们的结构分类的已知HE家族，包括LAGLIDADG (SEQ ID NO:5271)、GIY-YIG、His-Cis box、H-N-H、PD-(D/E)xK和Vsr-样，它们源自宽范围的宿主，包括真核生物、原生生物、细菌、古细菌、蓝细菌和噬菌体。与ZFN和TALEN一样，HE可以用于在靶标基因座处建立DSB作为基因组编辑的初始步骤。另外，一些天然的和经工程改造的HE仅切割DNA的单链，由此作为位点特异性的切口酶起作用。HE的大靶标序列和它们提供的特异性已经使它们成为有吸引力的建立位点特异性的DSB的候选物。
在本领域中已经描述了多种基于HE的系统，且正式报道了其修改；参见，例如，Steentoft等人,Glycobiology 24(8):663-80 (2014); Belfort和Bonocora, Methods Mol Biol. 1123:1-26 (2014); Hafez和Hausner, Genome 55(8):553-69 (2012)的综述。
MegaTAL/Tev-mTALEN/MegaTev
作为杂合核酸酶的其他实例，MegaTAL平台和Tev-mTALEN平台使用TALE DNA结合结构域和催化活性的HE的融合体，利用TALE的可调节的DNA结合和特异性，以及HE的切割序列特异性；参见，例如，Boissel等人, NAR 42: 2591-2601 (2014)；Kleinstiver等人,G3 4:1155-65 (2014)；和Boissel和Scharenberg, Methods Mol. Biol. 1239: 171-96(2015)。
在另一种变体中，MegaTev体系结构是大范围核酸酶(Mega)与源自GIY-YIG归巢核酸内切酶I-TevI的核酸酶结构域(Tev)的融合体。所述两个活性部位在DNA底物上的位置间隔~30个碱基对，并产生两种具有不相容的粘性末端的DSB；参见，例如，Wolfs等人,NAR 42,8816-29 (2014)。预见到，现有的基于核酸酶的方案的其他组合将演化，并且可用于实现本文描述的靶向基因组修饰。
dCas9-FokI或dCpf1-Fok1和其他核酸酶
组合上述的核酸酶平台的结构和功能性质会提供另一个基因组编辑方案，其可以潜在地克服一些固有缺陷。作为一个实例，CRISPR基因组编辑系统通常使用单一Cas9核酸内切酶来建立DSB。靶向的特异性由向导RNA中的20或24个核苷酸序列驱动，所述序列发生与靶标DNA (在来自化脓链球菌的Cas9的情况下，加上相邻NAG或NGG PAM序列中的另外2个碱基)的沃森-克里克碱基配对。这样的序列具有足以在人基因组中为独特的长度，然而，RNA/DNA相互作用的特异性不是绝对的，有时会耐受显著的混乱，特别是在靶标序列的5’半中，从而有效地减小驱动特异性的碱基的数目。其一个解决方案已经是将Cas9或Cpf1催化功能完全地失活- 仅保留RNA指导的DNA结合功能-和替代性地将FokI结构域与失活的Cas9融合；参见，例如，Tsai等人, Nature Biotech 32: 569-76 (2014)；和Guilinger等人, Nature Biotech. 32: 577-82 (2014)。因为FokI必须二聚化才能变成催化活性的，需要两个向导RNA才能连接紧密靠近的两个FokI融合体以形成二聚体和切割DNA。这基本上使组合的靶标位点中的碱基数目翻倍，由此增加基于CRISPR的系统的靶向严谨性。
作为其他实例，TALE DNA结合结构域与催化活性的HE(诸如I-TevI)的融合利用了TALE的可调节的DNA结合和特异性，以及I-TevI的切割序列特异性，例外是，可以进一步减少靶外切割。
本发明的方法和组合物
因此，本发明具体地涉及以下非限制性方法：
在第一种方法(方法1)中，本公开提供了用于在人细胞中编辑RHO基因的方法，所述方法包括：向所述人细胞中引入一种或多种DNA核酸内切酶，以在RHO基因或编码RHO基因的调节元件的其他DNA序列内或附近实现一个或多个SSB或DSB，其导致一个或多个突变的表达或功能的永久缺失、插入、校正或调节，所述突变在RHO基因内或附近或影响RHO基因的表达或功能，由此产生编辑的人细胞。
在另一种方法(方法2)中，本公开提供了用于在人细胞中编辑RHO基因中的P23H突变的方法，所述方法包括：向所述人细胞中引入一种或多种DNA核酸内切酶，以在RHO基因中的P23H突变内或附近实现一个或多个SSB或DSB，其导致P23H突变的表达或功能的永久缺失、插入、校正或调节，由此产生编辑的人细胞。
在另一种方法(方法3)中，本公开提供了用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，所述方法包括：在患者的细胞中编辑RHO基因中的P23H突变。
在另一种方法(方法4)中，本公开提供了如方法3中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述编辑包括：向所述细胞中引入一种或多种DNA核酸内切酶，以在RHO基因中的P23H突变内或附近实现一个或多个SSB或DSB，其导致P23H突变的表达或功能的永久缺失、插入、校正或调节，且导致RHO蛋白活性的恢复。
在另一种方法(方法5)中，本公开提供了如方法1-2或4中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4或Cpf1核酸内切酶；其同源物，其天然存在的分子的重组物，其密码子优化物或其修饰形式及其组合。
在另一种方法(方法6)中，本公开提供了如方法5中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述方法包括向所述细胞中引入编码一种或多种DNA核酸内切酶的一种或多种多核苷酸。
在另一种方法(方法7)中，本公开提供了如方法5中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述方法包括向所述细胞中引入编码一种或多种DNA核酸内切酶的一种或多种RNA。
在另一种方法(方法8)中，本公开提供了如方法6或7中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述一种或多种多核苷酸或一种或多种RNA是一种或多种修饰的多核苷酸或一种或多种修饰的RNA。
在另一种方法(方法9)中，本公开提供了如方法5中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述DNA核酸内切酶是一种或多种蛋白或多肽。
在另一种方法(方法10)中，本公开提供了如方法1-9中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述方法进一步包括：向所述细胞中引入一种或多种gRNA。
在另一种方法(方法11)中，本公开提供了如方法10中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述一种或多种gRNA是sgRNA。
在另一种方法(方法12)中，本公开提供了如方法10-11中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA是一种或多种修饰的gRNA或一种或多种修饰的sgRNA。
在另一种方法(方法13)中，本公开提供了如方法9-11中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中将所述一种或多种DNA核酸内切酶与一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA预复合。
在另一种方法(方法14)中，本公开提供了如方法1-13中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其进一步包括：向所述细胞中引入包含野生型RHO基因或cDNA的至少一部分的多核苷酸供体模板。
在另一种方法(方法15)中，本公开提供了如方法14中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述野生型RHO基因或cDNA的至少一部分是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子区域、其片段或组合或整个RHO基因或cDNA。
在另一种方法(方法16)中，本公开提供了如方法14-15中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述供体模板是单链或双链多核苷酸。
在另一种方法(方法17)中，本公开提供了如方法14-15中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述供体模板具有与3q22.1区域同源的臂。
在另一种方法(方法18)中，本公开提供了如方法2或4中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其进一步包括：向所述细胞中引入一种gRNA或包含野生型RHO基因的至少一部分的多核苷酸供体模板；其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是一种或多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其在位于RHO基因中的P23H突变内或附近的基因座处实现一个SSB或DSB，其促进将来自多核苷酸供体模板的新序列插入所述基因座处的基因座DNA，其导致RHO基因中的P23H突变的永久插入或校正；且其中所述gRNA包含与位于RHO基因中的P23H突变内或附近的基因座的区段互补的间隔物序列。
在另一种方法(方法19)中，本公开提供了如方法2或4中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其进一步包括：向所述细胞中引入一种或多种gRNA或包含野生型RHO基因的至少一部分的多核苷酸供体模板；其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是一种或多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其在RHO基因中的P23H突变内或附近实现一对单链断裂(SSB)或和双链断裂(DSB)(第一个在5'基因座处，且第二个在3'基因座处)，其促进将来自多核苷酸供体模板的新序列插入所述5'基因座和所述3'基因座之间的染色体DNA中，其导致RHO基因中的P23H突变内或附近的所述5'基因座和所述3'基因座之间的染色体DNA的永久插入或校正；且其中第一向导RNA包含与5'基因座的区段互补的间隔物序列，且第二向导RNA包含与3'基因座的区段互补的间隔物序列。
在另一种方法(方法20)中，本公开提供了如方法18-19中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述一种或多种gRNA是一种或多种sgRNA。
在另一种方法(方法21)中，本公开提供了如方法18-20中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA是一种或多种修饰的gRNA或一种或多种修饰的sgRNA。
在另一种方法(方法22)中，本公开提供了如方法18-21中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中将所述一种或多种DNA核酸内切酶与一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA预复合。
在另一种方法(方法23)中，本公开提供了如方法18-22中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述野生型RHO基因或cDNA的至少一部分是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子区域、其片段或组合或整个RHO基因或cDNA。
在另一种方法(方法24)中，本公开提供了如方法18-23中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述供体模板是单链或双链多核苷酸。
在另一种方法(方法25)中，本公开提供了如方法18-24中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述供体模板具有与3q22.1区域同源的臂。
在另一种方法(方法26)中，本公开提供了如方法18-25中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述SSB或DSB在RHO基因的第一外显子、第二外显子、第三外显子、第四外显子、第五外显子或其组合中。
在另一种方法(方法27)中，本公开提供了如方法10-13或20-22中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述gRNA或sgRNA针对病理学变体P23H。
在另一种方法(方法28)中，本公开提供了如方法1-2或4-27中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述插入或校正通过HDR进行。
在另一种方法(方法29)中，本公开提供了如方法18-19中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述供体模板具有与病理学变体P23H同源的臂。
在另一种方法(方法30)中，本公开提供了如方法2或4中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其进一步包括：向所述细胞中引入两种gRNA或包含野生型RHO基因的至少一部分的多核苷酸供体模板；其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是一种或多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其在RHO基因中的P23H突变内或附近实现一对DSB(第一个在5' DSB基因座处，且第二个在3' DSB基因座处)，其引起所述5' DSB基因座和所述3' DSB基因座之间的染色体DNA的缺失，其导致RHO基因中的P23H突变内或附近的所述5'DSB基因座和所述3' DSB基因座之间的染色体DNA的永久缺失；且其中第一向导RNA包含与5' DSB基因座的区段互补的间隔物序列，且第二向导RNA包含与3' DSB基因座的区段互补的间隔物序列。
在另一种方法(方法31)中，本公开提供了如方法30中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述两种gRNA是两种sgRNA。
在另一种方法(方法32)中，本公开提供了如方法30-31中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述两种gRNA或两种sgRNA是两种修饰的gRNA或两种修饰的sgRNA。
在另一种方法(方法33)中，本公开提供了如方法30-32中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中将所述一种或多种DNA核酸内切酶与两种gRNA或两种sgRNA预复合。
在另一种方法(方法34)中，本公开提供了如方法30-33中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述5' DSB和3' DSB两者均RHO基因的第一外显子、第一内含子、第二外显子、第二内含子、第三外显子、第三内含子、第四外显子、第四内含子、第五外显子、第五内含子或其组合中或附近。
在另一种方法(方法35)中，本公开提供了如方法30-34中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述缺失是1 kb或更少的缺失。
在另一种方法(方法36)中，本公开提供了如方法18-19和30中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中将所述Cas9或Cpf1 mRNA、gRNA和供体模板各自配制成分开的脂质纳米颗粒或全部共配制成脂质纳米颗粒。
在另一种方法(方法37)中，本公开提供了如方法18-19和30中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中将所述Cas9或Cpf1 mRNA、gRNA和供体模板各自配制成分开的AAV载体或全部共配制成AAV载体。
在另一种方法(方法38)中，本公开提供了如方法18-19和30中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中将所述Cas9或Cpf1 mRNA配制成脂质纳米颗粒，并且将所述gRNA和供体模板两者通过AAV载体递送至细胞。
在另一种方法(方法39)中，本公开提供了如方法18-19和30中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中将所述Cas9或Cpf1 mRNA配制成脂质纳米颗粒，并且将所述gRNA通过电穿孔递送至细胞，并且将所述供体模板通过AAV载体递送至细胞。
在另一种方法(方法40)中，本公开提供了如方法37-39中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述AAV载体是自失活的AAV载体。
在另一种方法(方法41)中，本公开提供了如方法1-40中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述RHO基因位于染色体3：129,528,640-129,535,169 (基因组参考协会(Genome Reference Consortium) – GRCh38/hg38)上。
在另一种方法(方法42)中，本公开提供了如方法2或4-41中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中RHO蛋白活性与野生型或正常的RHO蛋白活性相比得到恢复。
在另一种方法(方法43)中，本公开提供了如方法14中所提供的用于通过基因组编辑在人细胞中编辑RHO基因的方法，其中所述多核苷酸供体模板包含RHO的外显子1，且最多达5 KB。
在另一种方法(方法44)中，本公开提供了如方法43中所提供的用于通过基因组编辑在人细胞中编辑RHO基因的方法，其中所述多核苷酸供体模板通过AAV递送。
在另一种方法(方法45)中，本公开提供了如方法1-2中任一项中所提供的用于通过基因组编辑在人细胞中编辑RHO基因的方法，其中所述人细胞是光感受器细胞、视网膜祖细胞或诱导的多能干细胞(iPSC)。
在另一种方法(方法46)中，本公开提供了如方法3-42中任一项中所提供的用于治疗具有常染色体显性RP的患者的体内方法，其中所述细胞是光感受器细胞、视网膜祖细胞或诱导的多能干细胞(iPSC)。
在另一种方法(方法47)中，本公开提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5290的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法48)中，本公开提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5291的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法49)中，本公开提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5319的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法50)中，本公开提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5320的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法51)中，本公开提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5321的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法52)中，本公开提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5322的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法53)中，本公开提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5358的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法54)中，本公开提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5290和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法55)中，本公开提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5291和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法56)中，本公开提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5319和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法57)中，本公开提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5320和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法58)中，本公开提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5321和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法59)中，本公开提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5322和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法60)中，本公开提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5358和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法61)中，本公开提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5290的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法62)中，本公开提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5291的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法63)中，本公开提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5319的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法64)中，本公开提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5320的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法65)中，本公开提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5321的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法66)中，本公开提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5322的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法67)中，本公开提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5358的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法68)中，本公开提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用gRNA或sgRNA，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO:5290和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
在另一种方法(方法69)中，本公开提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO:5291和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
在另一种方法(方法70)中，本公开提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO:5319和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
在另一种方法(方法71)中，本公开提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用gRNA或sgRNA，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO:5320和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
在另一种方法(方法72)中，本公开提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO:5321和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
在另一种方法(方法73)中，本公开提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO:5322和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
在另一种方法(方法74)中，本公开提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO:5358和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
在另一种方法(方法75)中，本公开提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5287的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法76)中，本公开提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5288的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法77)中，本公开提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5289的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法78)中，本公开提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5287的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法79)中，本公开提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5288的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法80)中，本公开提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5289的gRNA或sgRNA。
在另一种方法(方法81)中，本公开提供了用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用自失活CRISPR-Cas系统1-36中任一项的自失活CRISPR-Cas系统。
在另一种方法(方法82)中，本公开提供了用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括施用自失活CRISPR-Cas系统1-36中任一项的自失活CRISPR-Cas系统。
在另一种方法(方法83)中，本公开提供了控制细胞中的Cas9表达的方法，其包括：使所述细胞与自失活CRISPR-Cas系统1-36中任一项的自失活CRISPR-Cas系统接触。
在另一种方法(方法84)中，本公开提供了如方法1中所提供的用于在人细胞中编辑RHO基因的方法，其中所述人细胞具有缺陷活性，且编辑的人细胞表达功能性RHO。
在另一种方法(方法85)中，本公开提供了如方法2中所提供的用于在人细胞中编辑RHO基因中的P23H突变的方法，其中所述人细胞具有缺陷活性，且编辑的人细胞表达功能性RHO。
在第一种组合物(组合物1)中，本公开提供了一种或多种gRNA，其用于在来自具有常染色体显性RP的患者的细胞中编辑RHO基因中的P23H突变，所述一种或多种gRNA包含间隔物序列，其选自序列表的SEQ ID NO:5287-5291、5319-5322和5358中的核酸序列。
在另一种组合物(组合物2)中，本公开提供了组合物1的一种或多种gRNA，其中所述一种或多种gRNA是一种或多种sgRNA。
在另一种组合物(组合物3)中，本公开提供了组合物1-2中任一项的一种或多种gRNA，其中所述一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA是一种或多种修饰的gRNA或一种或多种修饰的sgRNA。
在另一种组合物(组合物4)中，本公开提供了组合物1-3中任一项的一种或多种gRNA，其中所述细胞是光感受器细胞、视网膜祖细胞或诱导的多能干细胞(iPSC)。
在另一种组合物(组合物5)中，本公开提供了单分子向导RNA (sgRNA)，其用于在来自具有常染色体显性CORD的患者的细胞中编辑RHO基因中的P23H突变，所述sgRNA包含SEQ ID NO:5290的核酸序列。
在另一种组合物(组合物6)中，本公开提供了单分子向导RNA (sgRNA)，其用于在来自具有常染色体显性CORD的患者的细胞中编辑RHO基因中的P23H突变，所述sgRNA包含SEQ ID NO:5291的核酸序列。
在另一种组合物(组合物7)中，本公开提供了单分子向导RNA (sgRNA)，其用于在来自具有常染色体显性CORD的患者的细胞中编辑RHO基因中的P23H突变，所述sgRNA包含SEQ ID NO:5319的核酸序列。
在另一种组合物(组合物8)中，本公开提供了单分子向导RNA (sgRNA)，其用于在来自具有常染色体显性CORD的患者的细胞中编辑RHO基因中的P23H突变，所述sgRNA包含SEQ ID NO:5320的核酸序列。
在另一种组合物(组合物9)中，本公开提供了单分子向导RNA (sgRNA)，其用于在来自具有常染色体显性CORD的患者的细胞中编辑RHO基因中的P23H突变，所述sgRNA包含SEQ ID NO:5321的核酸序列。
在另一种组合物(组合物10)中，本公开提供了单分子向导RNA (sgRNA)，其用于在来自具有常染色体显性CORD的患者的细胞中编辑RHO基因中的P23H突变，所述sgRNA包含SEQ ID NO:5322的核酸序列。
在另一种组合物(组合物11)中，本公开提供了单分子向导RNA (sgRNA)，其用于在来自具有常染色体显性CORD的患者的细胞中编辑RHO基因中的P23H突变，所述sgRNA包含SEQ ID NO:5358的核酸序列。
在另一种组合物(组合物12)中，本公开提供了单分子向导RNA (sgRNA)，其用于在来自具有常染色体显性CORD的患者的细胞中编辑RHO基因中的P23H突变，所述sgRNA包含SEQ ID NO:5290和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列。
在另一种组合物(组合物13)中，本公开提供了单分子向导RNA (sgRNA)，其用于在来自具有常染色体显性CORD的患者的细胞中编辑RHO基因中的P23H突变，所述sgRNA包含SEQ ID NO:5291和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列。
在另一种组合物(组合物14)中，本公开提供了单分子向导RNA (sgRNA)，其用于在来自具有常染色体显性CORD的患者的细胞中编辑RHO基因中的P23H突变，所述sgRNA包含SEQ ID NO:5319和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列。
在另一种组合物(组合物15)中，本公开提供了单分子向导RNA (sgRNA)，其用于在来自具有常染色体显性CORD的患者的细胞中编辑RHO基因中的P23H突变，所述sgRNA包含SEQ ID NO:5320和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列。
在另一种组合物(组合物16)中，本公开提供了单分子向导RNA (sgRNA)，其用于在来自具有常染色体显性CORD的患者的细胞中编辑RHO基因中的P23H突变，所述sgRNA包含SEQ ID NO:5321和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列。
在另一种组合物(组合物17)中，本公开提供了单分子向导RNA (sgRNA)，其用于在来自具有常染色体显性CORD的患者的细胞中编辑RHO基因中的P23H突变，所述sgRNA包含SEQ ID NO:5322和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列。
在另一种组合物(组合物18)中，本公开提供了单分子向导RNA (sgRNA)，其用于在来自具有常染色体显性CORD的患者的细胞中编辑RHO基因中的P23H突变，所述sgRNA包含SEQ ID NO:5358和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列。
在另一种组合物(组合物19)中，本公开提供了用于编辑RHO基因中的P23H突变的一种或多种gRNA，所述一种或多种gRNA包含间隔物序列，其选自序列表的SEQ ID NO:5287-5291、5319-5322和5358。
在第一种治疗剂(治疗剂1)中，本公开提供了用于治疗具有常染色体显性色素性视网膜炎的患者的治疗剂，所述治疗剂包含至少一种或多种用于编辑RHO基因中的P23H突变的gRNA，所述一种或多种gRNA包含间隔物序列，其选自序列表的SEQ ID NO:5287-5291、5319-5322和5358中的核酸序列。
在另一种治疗剂(治疗剂2)中，本公开提供了治疗剂2的治疗剂，其中所述一种或多种gRNA是一种或多种sgRNA。
在另一种治疗剂(治疗剂3)中，本公开提供了治疗剂1或2中任一项的治疗剂，其中所述一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA是一种或多种修饰的gRNA或一种或多种修饰的sgRNA。
在另一种治疗剂(治疗剂4)中，本公开提供了用于治疗具有常染色体显性RP的患者的治疗剂，所述治疗剂通过包括以下的方法形成：引入一种或多种DNA核酸内切酶；引入一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA用于编辑RHO基因中的P23H突变；和任选地引入一种或多种供体模板；其中所述一种或多种gRNA或sgRNA包含间隔物序列，其选自序列表的SEQ IDNO:5287-5291、5319-5322和5358中的核酸序列。
在另一种治疗剂(治疗剂5)中，本公开提供了治疗剂，其包含自失活CRISPR-Cas系统1-36中任一项的自失活CRISPR-Cas系统。
在另一种治疗剂(治疗剂6)中，本公开提供了治疗剂5的治疗剂，其中所述治疗剂是无菌的。
在第一种试剂盒(试剂盒1)中，本公开提供了用于体内治疗具有常染色体显性RP的患者的试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种用于编辑RHO基因中的P23H突变的gRNA或sgRNA；一种或多种DNA核酸内切酶；和任选地，一种或多种供体模板，其中所述一种或多种gRNA或sgRNA包含间隔物序列，其选自序列表的SEQ ID NO:5287-5291、5319-5322和5358中的核酸序列。
在另一种试剂盒(试剂盒2)中，本公开提供了试剂盒1的试剂盒，其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4或Cpf1核酸内切酶；其同源物，其天然存在的分子的重组物，其密码子优化物或其修饰形式及其组合。
在另一种试剂盒(试剂盒3)中，本公开提供了试剂盒1或2中任一项的试剂盒，其包含一种或多种供体模板。
在另一种试剂盒(试剂盒4)中，本公开提供了试剂盒3的试剂盒，其中所述供体模板具有与3q22.1区域同源的臂。
在另一种试剂盒(试剂盒5)中，本公开提供了试剂盒3的试剂盒，其中所述供体模板具有与病理学变体P23H同源的臂。
在另一种试剂盒(试剂盒6)中，本公开提供了用于体内治疗具有常染色体显性RP的患者的试剂盒，所述试剂盒包含：自失活CRISPR-Cas系统1-36中的任一种；和任选地，一种或多种供体模板。
在另一种试剂盒(试剂盒7)中，本公开提供了试剂盒6的试剂盒，其包含一种或多种供体模板。
在另一种试剂盒(试剂盒8)中，本公开提供了试剂盒7的试剂盒，其中所述供体模板具有与3q22.1区域同源的臂。
在另一种试剂盒(试剂盒9)中，本公开提供了试剂盒7的试剂盒，其中所述供体模板具有与病理学变体P23H同源的臂。
在第一自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统1)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统，其包含：包含编码诱导定点诱变的多肽的核苷酸序列的第一区段；包含编码向导RNA (gRNA)或单分子向导RNA (sgRNA)的核苷酸序列的第二区段，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO:5290；和一个或多个包含自失活(SIN)位点的第三区段；其中所述gRNA或sgRNA与所述SIN位点基本上互补；其中所述gRNA或sgRNA与基因组靶标序列基本上互补。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统2)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统，其包含：包含编码诱导定点诱变的多肽的核苷酸序列的第一区段；包含编码向导RNA (gRNA)或单分子向导RNA (sgRNA)的核苷酸序列的第二区段，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO:5291；和一个或多个包含自失活(SIN)位点的第三区段；其中所述gRNA或sgRNA与所述SIN位点基本上互补；其中所述gRNA或sgRNA与基因组靶标序列基本上互补。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统3)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统1或2的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述诱导定点诱变的多肽是金黄色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)或其任何变体。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统4)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统1-3的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述诱导定点诱变的多肽是SaCas9或其任何变体；且其中所述SIN位点是位于SaCas9开放阅读框(ORF)的5'的5' SIN位点或位于SaCas9 ORF内定位的天然或嵌合插入的内含子内的3' SIN位点。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统5)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统4的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述5' SIN位点包含SEQ ID NO:5300。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统6)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统4-5的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述3' SIN位点包含SEQ ID NO:5280。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统7)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统4的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述5' SIN位点包含SEQ ID NO:5301。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统8)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统4和7的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述3' SIN位点包含SEQ ID NO:5281。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统9)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统4-5和7的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述5' SIN位点位于SaCas9开放阅读框(ORF)的上游和SV40核定位信号(NLS)的下游。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统10)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统4-5和7的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述5' SIN位点位于SaCas9开放阅读框(ORF)的上游和5'非翻译区(UTR)内的SV40核定位信号(NLS)的上游。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统11)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统4、6和8的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述3' SIN位点位于SaCas9ORF内定位的天然或嵌合插入的内含子内。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统12)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统1-11的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述SIN位点包含原间隔物邻近基序(PAM)。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统13)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统12的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述PAM是NNGRRT或其任何变体。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统14)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统1-13的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述基因组靶标序列是视紫红质(RHO)基因中的P23H突变。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统15)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统1-14的自失活CRISPR-Cas系统，其中包含编码诱导定点诱变的多肽的核苷酸序列的第一区段进一步包含起始密码子、终止密码子和聚(A)终止位点。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统16)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统1-15的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第一区段和所述第三区段一起在第一载体中提供，且所述第二区段在第二载体中提供。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统17)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统1-15的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第一区段、第二区段和第三区段一起在载体中提供。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统18)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统16-17的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第三区段存在于第一或第二载体中的第一区段5'的位置处。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统19)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统16-17的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第三区段存在于第一或第二载体中的第一区段3'的位置处。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统20)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统16-17的自失活CRISPR-Cas系统，其中一个或多个第三区段存在于第一或第二载体中的第一区段的5'和3'末端。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统21)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统16的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第一载体包含SEQ ID NO:5341，且所述第二载体包含SEQ ID NO:5339。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统22)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统16的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第一载体包含SEQ ID NO:5341，且所述第二载体包含SEQ ID NO:5340。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统23)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统16的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第一载体包含SEQ ID NO:5342，且所述第二载体包含SEQ ID NO:5339。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统24)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统16的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第一载体包含SEQ ID NO:5342，且所述第二载体包含SEQ ID NO:5340。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统25)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统1-24的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第三区段长度小于100个核苷酸。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统26)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统25的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第三区段长度小于50个核苷酸。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统27)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统1-26的自失活CRISPR-Cas系统，其中除了在至少一个位置中，所述gRNA或sgRNA与所述SIN位点的核苷酸序列完全互补。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统28)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统1-27的自失活CRISPR-Cas系统，其中除了在至少两个位置中，所述gRNA或sgRNA与所述SIN位点的核苷酸序列完全互补。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统29)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统1-28的自失活CRISPR-Cas系统，其中编码启动子的核酸序列可操作地连接至所述第一区段。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统30)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统29的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述启动子是空间受限的启动子、驱动一个方向的gRNA或sgRNA和相反取向的SaCas9的双向启动子或诱导型启动子。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统31)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统30的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述空间受限的启动子选自：任何组织或细胞类型特异性启动子、肝细胞特异性启动子、神经元特异性启动子、脂肪细胞特异性启动子、心肌细胞特异性启动子、骨骼肌特异性启动子、肺祖细胞特异性启动子、光感受器特异性启动子和视网膜色素上皮(RPE)选择性启动子。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统32)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统16-17的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述载体是一种或多种腺相关病毒(AAV)载体。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统33)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统32的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述腺相关病毒(AAV)载体是AAV5血清型衣壳载体。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统34)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统，其包含：包含编码SaCas9或其任何变体的核苷酸序列的第一区段；包含编码向导RNA (gRNA)或单分子向导RNA (sgRNA)的核苷酸序列的第二区段；和一个或多个包含自失活(SIN)位点的第三区段；其中所述gRNA或sgRNA与所述SIN位点基本上互补；其中所述gRNA或sgRNA与基因组靶标序列基本上互补；其中所述SIN位点包含选自SEQ ID NO:5313-5314的序列。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统35)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统，其包含：包含编码SpCas9或其任何变体的核苷酸序列的第一区段；包含编码向导RNA (gRNA)或单分子向导RNA (sgRNA)的核苷酸序列的第二区段；和一个或多个包含自失活(SIN)位点的第三区段；其中所述gRNA或sgRNA与所述SIN位点基本上互补；其中所述gRNA或sgRNA与基因组靶标序列基本上互补；其中所述SIN位点包含选自SEQ ID NO:5277-5279或SEQ ID NO:5297-5299的序列。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统36)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统35的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述SIN位点包含比选自SEQ IDNO:5277-5279或SEQ ID NO:5297-5299的序列中的任一个短1、2、3、4、5、6或7个核苷酸的序列。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统35)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统，其包含：包含编码SaCas9或其任何变体的核苷酸序列的第一区段；包含编码向导RNA (gRNA)或单分子向导RNA (sgRNA)的核苷酸序列的第二区段；和一个或多个包含自失活(SIN)位点的第三区段；其中所述gRNA或sgRNA与所述SIN位点基本上互补；其中所述gRNA或sgRNA与基因组靶标序列基本上互补；其中所述SIN位点包含选自SEQ ID NO:5280-5281、5315-5318和5357或SEQ ID NO:5300-5301、5323-5326和5359的序列。
在另一种自失活CRISPR-Cas系统(自失活CRISPR-Cas系统36)中，本公开提供了自失活CRISPR-Cas系统35的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述SIN位点包含比选自SEQ IDNO:5280-5281、5315-5318和5357或SEQ ID NO:5300-5301、5323-5326和5359的序列中的任一个短1、2、3、4、5、6或7个核苷酸的序列。
在第一遗传修饰的细胞(遗传修饰的细胞1)中，本公开提供了遗传修饰的细胞，其包含自失活CRISPR-Cas系统1-36中任一项的自失活CRISPR-Cas系统。
在另一种遗传修饰的细胞(遗传修饰的细胞2)中，本公开提供了遗传修饰的细胞1的遗传修饰的细胞，其中所述细胞选自：古细菌细胞、细菌细胞、真核细胞、真核单细胞生物、体细胞、生殖细胞、干细胞、植物细胞、藻类细胞、动物细胞、无脊椎动物细胞、脊椎动物细胞、鱼细胞、青蛙细胞、鸟类细胞、哺乳动物细胞、猪细胞、牛细胞、山羊细胞、绵羊细胞、啮齿动物细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、非人灵长类细胞和人细胞。
在第一种核酸(核酸1)中，本公开提供了核酸，其编码包含选自SEQ ID NO:5287-5291、5319-5322和5358的间隔物序列的gRNA。
在另一种核酸(核酸2)中，本公开提供了核酸1的核酸，其中所述gRNA是sgRNA。
在第一种载体(载体1)中，本公开提供了载体，其编码包含选自SEQ ID NO:5287-5291、5319-5322和5358的间隔物序列的gRNA。
在另一种载体(载体2)中，本公开提供了载体1的载体，其中所述gRNA是sgRNA。
在另一种载体(载体3)中，本公开提供了载体1或2中任一项的载体，其中所述载体是AAV。
在另一种载体(载体4)中，本公开提供了载体1-3中任一项的载体，其中所述载体是AAV5血清型衣壳载体。
定义
除了本文先前阐述的定义以外，以下定义与本公开相关：
术语“改变”或“遗传信息的改变”是指细胞的基因组中的任何改变。在治疗遗传病症的背景下，改变可以包括但不限于插入、缺失和校正。
术语“插入”是指在DNA序列中添加一个或多个核苷酸。插入可以范围为几个核苷酸的小插入到大片段(诸如cDNA或基因)的插入。
术语“缺失”是指DNA序列中的一个或多个核苷酸的丧失或去除或基因的功能的丧失或去除。在一些情况下，缺失可以包括，例如，几个核苷酸、外显子、内含子、基因区段或基因的整个序列的损失。在一些情况下，基因的缺失是指基因或其基因产物的功能或表达的消除或减少。这不仅可以由基因内或附近的序列的缺失导致，而且可以由破坏基因的表达的其他事件(例如，插入、无义突变)导致。
如本文所用的术语“校正”是指细胞中的基因组的一个或多个核苷酸的改变，无论是通过插入、缺失还是取代。这样的校正可以导致对校正的基因组位点在结构或功能上更有利的基因型或表型结果。“校正”的一个非限制性实例包括将突变或缺陷序列校正为野生型序列，其恢复基因或其基因产物的结构或功能。取决于突变的性质，可以经由本文公开的各种策略来实现校正。在一个非限制性实例中，可以通过用野生型对应物替换含有突变的区域来校正错义突变。作为另一个实例，可以通过去除额外的序列来校正基因中的重复突变(例如，重复扩增)。
术语“敲入”是指DNA序列或其片段向基因组中的添加。待敲入的这样的DNA序列可以包括一个或多个整个基因，可以包括与基因相关的调节序列或前述的任何部分或片段。例如，可以将编码野生型蛋白的cDNA插入携带突变基因的细胞的基因组中。敲入策略不必全部或部分替换缺陷基因。在一些情况下，敲入策略可以进一步涉及用提供的序列取代现有序列，例如用野生型拷贝取代突变等位基因。另一方面，术语“敲除”是指基因或基因的表达的消除。例如，可以通过缺失或添加导致阅读框的破坏的核苷酸序列来敲除基因。作为另一个实例，可以通过用无关的序列替换基因的一部分来敲除基因。最后，如本文所用的术语“敲低”是指基因或其基因产物的表达的减少。作为基因敲低的结果，蛋白活性或功能可以减弱，或者蛋白水平可以降低或消除。
术语“包含”或“包括”参考本公开必要的组合物、治疗剂、试剂盒、方法及其各自的组成部分来使用，并且无论是否必要都仍然对未指定的要素保持开放。
术语“基本上由……组成”是指给定的方面要求的那些要素。该术语允许存在不会基本上影响本发明的方面的基础的和新型的或功能性的特征的额外要素。
术语”由……组成”是指本文所述的组合物、治疗剂、试剂盒、方法及其各自的组成部分，其排除在该方面的描述中没有列出的任何要素。
单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式，除非上下文另外清楚地指明。
在本说明书中引用的任何数值范围描述包括在所述范围内的相同数值精度(即，具有相同数目的指定数字)的所有子范围。例如，所述范围“ 1.0至10.0”描述所述最小值1.0和所述最大值10.0之间(且包括端值)的所有子范围，诸如例如“ 2.4至7.6”，即使在说明书的文本中没有明确描述“ 2.4至7.6”的范围。因此，申请人保留修改本说明书(包括权利要求)以明确列举包括在本说明书中明确描述的范围内的相同数值精度的任何子范围的权利。在本说明书中固有地描述所有这样的范围，使得修改以明确地描述任何这样的子范围将符合书面描述、描述的充分性和超范围要求，包括35 U.S.C. § 112(a)和第123(2)EPC条下的要求。另外，除非明确说明或上下文另外要求，本说明书中描述的所有数字参数(诸如表示值、范围、数量、百分比等的那些)都可以读作好像前置词语“约”，即使“约”一没有明确地出现在数字之前。另外，应该根据报告的有效数字的数量、数值精度以及通过应用普通的舍入技术来解释本说明书中描述的数值参数。还应理解，在本说明书中描述的数值参数将必然具有用于确定参数的数值的基础测量技术的固有可变性特征。
除非另有说明，否则在本文中指出的任何专利、出版物或其他公开材料通过引用以其整体并入本说明书，但是仅仅就并入的材料不与在本说明书中明确地阐述的现有描述、定义、陈述或其他公开材料冲突而言。因此，且就必要而言，在本说明书中阐述的明确公开内容替代通过引用并入的任何冲突材料。被说成通过引用并入本说明书、但是与在本文中阐述的现有定义、陈述或其他公开材料冲突的任何材料或其部分仅仅就在并入的材料和现有公开材料之间不产生冲突而言并入。申请人保留修改本说明书以明确地列举通过引用并入本文的任何主题或其部分的权利。
本发明的一个或多个方面的细节在下面的随附实施例中阐明。尽管与本文描述的那些相似或等效的任何材料和方法都可以用于本发明的实践或测试中，但现在描述预见的材料和方法的特定实例。本发明的其他特征、目的和优点将从说明书显而易见。在说明书实例中，单数形式也包括复数形式，除非上下文另有明确规定。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在冲突的情况下，将以本说明书为准。
实施例
通过参考下述实施例将更充分地理解本公开，下述实施例提供了本发明的示例性的非限制性方面。
实施例描述了使用CRISPR系统作为说明性的基因组编辑技术，以在RHO基因中的P23H突变内或附近产生定义的治疗性基因组缺失、插入或替代，在本文中称为“基因组修饰”，其导致突变体基因的表达的移框和沉默或基因组基因座中的P23H突变的永久校正或异源基因座处的表达，其恢复RHO蛋白活性。所确定的治疗性修饰的引入代表色素性视网膜炎(RP)的潜在改善的新型治疗策略，如本文中所述和解释的。
实施例1
用于RHO基因中的P23H突变的CRISPR/化脓链球菌(Sp)Cas9 PAM位点
针对SpCas9原间隔物邻近基序(PAM)扫描RHO基因中的P23H突变。针对具有序列NRG的PAM扫描该区域。然后鉴定位于NRG PAM上游的gRNA间隔物序列(17-24 bp)。
实施例2
用于RHO基因中的P23H突变的CRISPR/金黄色葡萄球菌(Sa)Cas9 PAM位点
针对SaCas9 PAM扫描RHO基因中的P23H突变。针对具有序列NNGRRT的PAM扫描该区域。然后鉴定位于NNGRRT PAM上游的gRNA间隔物序列(17-24 bp)。
实施例3
用于RHO基因中的P23H突变的CRISPR/嗜热链球菌(St)Cas9 PAM位点
针对StCas9 PAM扫描RHO基因中的P23H突变。针对具有序列NNAGAAW的PAM扫描该区域。然后鉴定位于NNAGAAW PAM上游的gRNA间隔物序列(17-24 bp)。
实施例4
用于RHO基因中的P23H突变的CRISPR/齿密螺旋体(Td)Cas9 PAM位点
针对TdCas9 PAM扫描RHO基因中的P23H突变。针对具有序列NAAAAC的PAM扫描该区域。然后鉴定位于NAAAAC PAM上游的gRNA间隔物序列(17-24 bp)。
实施例5
用于RHO基因中的P23H突变的CRISPR/脑膜炎奈瑟氏菌(Nm)Cas9 PAM位点
针对NmCas9 PAM扫描RHO基因中的P23H突变。针对具有序列NNNNGHTT的PAM扫描该区域。然后鉴定位于NNNNGHTT PAM上游的gRNA间隔物序列(17-24 bp)。
实施例6
用于RHO基因中的P23H突变的CRISPR/Cpf1 PAM位点
针对Cpf-1 PAM扫描RHO基因中的P23H突变。针对具有序列YTN的PAM扫描该区域。然后鉴定位于YTN PAM上游的gRNA间隔物序列(17-24 bp)。
实施例7
向导链的生物信息学分析
gRNA或sgRNA能够将RNP复合物引导至靶上位点，诸如期望编辑的基因组序列或不期望编辑的靶外位点。为了了解更多关于哪些候选gRNA或sgRNA可能具有靶上和/或靶外活性的信息，在单一过程或多步过程中筛选和选择候选向导物，所述单一过程或多步过程涉及在靶上和靶外位点处的理论结合和通过实验评估的活性。这些过程允许选择高特异性gRNA或sgRNA用于进一步开发。
作为举例说明，为了评估在目标位置以外的染色体位置处的效应的可能性，使用如在下面更详细地描述和举例说明的可用于评估靶外结合的多种生物信息学工具中的一种或多种，针对它们在具有类似序列的靶外位点处切割的潜力评估这样的候选向导物：其具有使特定靶上位点(诸如在RHO基因中的P23H内或附近的位点)与邻近PAM匹配的序列。
然后通过实验来评估据预测具有相对较低的靶外活性潜力的候选物以测量它们的靶上活性，然后测量在不同位点处的靶外活性。优选这样的向导物，其具有足够高的靶上活性以在选定的基因座处达到期望的基因编辑水平，并具有相对较低的靶外活性以减小在其他染色体基因座处的改变的可能性。靶上活性与靶外活性的比率被称作向导物的“特异性”。
对于预测的靶外活性的初期筛选，存在许多已知的且和公众可得到的生物信息学工具，其用于预测最可能的靶外位点；且由于与CRISPR/Cas9/Cpf1核酸酶系统中的靶标位点的结合由互补序列之间的沃森-克里克碱基配对驱动，不同性的程度(和因此减少的靶外结合潜力)基本上与以下一级序列差异有关：错配和凸起物，即改变成非互补碱基的碱基，和相对于靶标位点在潜在靶外位点中的碱基的插入或缺失。一种被称作COSMID (具有错配、插入和缺失的CRISPR靶外位点) (可在网络上在crispr.bme.gatech.edu得到)的示例性生物信息学工具编译这样的相似性。其他生物信息学工具包括、但不限于autoCOSMID、和CCTop。
使用生物信息学使靶外切割最小化以便减小突变和染色体重排的有害作用。在CRISPR/Cas9系统上的研究提示，由向导链与具有碱基对错配和/或凸起物的DNA序列(特别是在远离PAM区域的位置处)的非特异性杂交引起的靶外活性的可能性。因此，重要的是具有这样的生物信息学工具：其鉴定除了碱基对错配以外还具有在RNA向导链和基因组序列之间的插入和/或缺失的潜在靶外位点。基于靶外预测算法CCTop的生物信息学工具被用于针对潜在CRISPR靶外位点来检索基因组(CCTop可在网络上在crispr.cos.uni-heidelberg.de/得到)。输出基于错配的数目和位置的潜在靶外位点的排序列表，从而允许靶标位点的更知情选择，并避免具有更可能的靶外切割的位点的应用。
采用了另外的生物信息学方式(pipelines)，其权衡一个区域中的gRNA靶向位点的估计靶上和/或靶外活性。用于预测活性的其他特征包括关于目标细胞类型、DNA可达性、染色质状态、转录因子结合位点、转录因子结合数据和其他CHIP-seq数据的信息。权衡另外的因素，其预测编辑效率(诸如gRNA对的相对位置和方向)、局部序列特征和微-同源性。
实施例8
在细胞中针对靶上和靶外活性测试向导物
为了进一步评估先前研究的向导RNA的特异性，通过使用TIDE分析评估插入/缺失频率，在基因工程改造的K562细胞中针对靶上和靶外活性测试预测具有最低靶外活性的选择的向导RNA。获得的数据提供了证据，证明选择的向导RNA在使靶外活性最小化的同时有效地编辑突变体P23H RHO基因。
K562细胞的基因组含有人视紫红质(RHO)基因的两个野生型等位基因，并且工程改造细胞以稳定表达金黄色葡萄球菌Cas9核酸内切酶。这些细胞用靶向野生型RHO基因的gRNA或靶向突变体P23H RHO基因的gRNA转染。靶向野生型RHO基因的gRNA包括：人视紫红质WT 20聚体(SEQ ID NO:5285)和人视紫红质WT 19聚体(SEQ ID NO:5286)。靶向突变体P23HRHO基因的gRNA包括：人视紫红质P23H 20聚体(SEQ ID NO:5290)和人视紫红质P23H 19聚体(SEQ ID NO:5291)(图2B)。将转染的K562细胞与对照细胞进行比较，所述对照细胞是表达金黄色葡萄球菌Cas9蛋白、但未用任何向导RNA转染的K562细胞。
转染后48-72小时从细胞收获基因组DNA，并且在RHO基因的密码子23周围进行PCR扩增。位于RHO基因的第一个外显子的非编码上游区域中的正向引物和位于编码区域中的反向引物用于从基因组DNA扩增野生型RHO基因。因为K562细胞的基因组仅含有RHO基因的野生型版本，所以这些K562细胞用于测量靶向野生型RHO基因的gRNA的靶上编辑效率和靶向突变体P23H RHO基因的gRNA的靶外编辑效率。通过经由游离DNA末端的NHEJ修复引入的插入、缺失和突变的速率来测量靶上和靶外活性。序列分析揭示，对于靶向野生型RHO基因的gRNA(SEQ ID NO:5285-5286)，成功地编辑大于80%的基因座(图3)。对于靶向突变的P23HRHO基因(SEQ ID NO:5290-5291)的gRNA，发现靶外编辑率低，并且与对照细胞中的背景水平相似(图3)。
为了测试靶向突变体P23H RHO基因的gRNA (SEQ ID NO:5290-5291)的靶上和靶外编辑效率，表达金黄色葡萄球菌Cas9蛋白的K562细胞用靶向突变体P23H RHO基因的gRNA转染，并用编码P23H突变体RHO基因或野生型RHO基因的质粒转染。因为基因工程改造的K562细胞在其基因组中仅具有RHO基因的野生型版本，该质粒用于引入RHO基因的外源拷贝(RHO基因的P23H突变版本或RHO基因的野生型版本)。将这些转染的K562细胞与对照细胞进行比较。对照细胞是表达金黄色葡萄球菌Cas9蛋白并用质粒转染、但不用任何向导RNA转染的K562细胞。当分析来自转染的K562细胞的所得序列时，仅使用这些细胞中的质粒DNA(而不是基因组DNA)来确立靶向突变体P23H RHO基因的gRNA(SEQ ID NO:5290-5291)的靶上和靶外编辑效率。例如，K562细胞用靶向突变体P23H RHO基因的gRNA转染，并用编码RHO基因的P23H突变版本的质粒转染，以测试靶向突变体P23H RHO基因的gRNA的靶上活性。在分开的实验中，K562细胞用靶向突变体P23H RHO基因的gRNA转染，并用含有RHO基因的野生型版本的质粒转染，以测试靶向突变体P23H RHO基因的gRNA的靶外活性。位于质粒的启动子区域(不是天然的RHO启动子)中的正向引物和RHO基因中的反向引物用于从任一RHO-编码质粒扩增DNA产物。两种质粒均不含RHO基因的上游非编码区域，且因此使用用于扩增RHO基因的密码子23周围的基因组DNA的引物不能产生PCR产物。然后将所得的质粒或基因组特异性PCR产物用位于相应扩增的PCR产物内部的引物进行测序，并进行TIDE分析，这是一种用于快速评价通过CRISPR-Cas9和向导RNA(gRNA或sgRNA)对靶标基因座的基因组编辑的网络工具。基于来自两个标准毛细管测序反应的定量序列迹线数据，TIDE软件定量编辑效果并确定靶向的细胞合并物的DNA中主要类型的插入和缺失(插入/缺失)。对于详细解释和实例，参见Brinkman等人, Nucl. Acids Res. (2014)。该技术允许比先前使用的Sanger测序快速和便宜得多地对DNA和RNA进行测序，且因此已经彻底改变基因组学和分子生物学的研究。
序列分析揭示，发现靶向突变体P23H RHO基因的19聚体 gRNA(SEQ ID NO:5291)引起比对照细胞高~15-倍的靶上编辑，并且发现靶向突变体P23H RHO基因的20聚体 gRNA(SEQ ID NO:5290)引起比对照细胞高~34-倍的靶上编辑(图4)。19聚体 gRNA显示与对照细胞相似的靶外编辑，而20聚体显示与对照细胞相比略微增加的靶外编辑(图4)。这些数据提供了证据，证明选择的向导RNAs (SEQ ID NO:5290-5291)在使靶外活性最小化的同时有效地编辑突变体P23H RHO基因。
可以在培养的细胞中追踪具有显著编辑活性的gRNA，以测量RHO基因中的P23H突变的移框或校正。可以再次追踪靶外事件。可以转染多种细胞，并测量基因校正水平和可能的靶外事件。这些实验允许核酸酶以及供体设计和递送的优化。
实施例9
在细胞中针对靶外活性测试向导物
为了确定基因组水平上靶外编辑的程度，然后将使用GUIDE-seq、Amplicon-seq和/或Digenome-seq针对靶向全基因组靶外编辑测试具有最佳靶上活性的gRNA(或sgRNA)。将在人细胞上测试靶外效应。
实施例10
测试用于HDR基因编辑的不同方法
在针对靶上活性和靶外活性两者测试gRNA之后，将针对HDR基因编辑测试突变校正和敲入策略。这些测试将允许优化各种HDR基因编辑策略，并将基于其相应的有效性进行比较。
对于突变校正方法，将提供供体DNA模板为短单链寡核苷酸、短双链寡核苷酸(PAM序列完整的/PAM序列突变的)、长单链DNA分子(PAM序列完整的/PAM序列突变的)或长双链DNA分子(PAM序列完整的/PAM序列突变的)。另外，供体DNA模板将通过AAV递送。
对于cDNA敲入方法，具有与RHO染色体区域同源的臂的单链或双链DNA可以包括RHO基因的第一个外显子(第一个编码外显子)的超过40 nt、RHO基因的完整CDS和RHO基因的3' UTR以及后续内含子的至少40 nt。具有与RHO染色体区域同源的臂的单链或双链DNA可以包括RHO基因的第一个外显子的超过80 nt、RHO基因的完整CDS和RHO基因的3' UTR以及后续内含子的至少80 nt。具有与RHO染色体区域同源的臂的单链或双链DNA可以包括RHO基因的第一个外显子的超过100 nt、RHO基因的完整CDS和RHO基因的3' UTR以及后续内含子的至少100 nt。具有与RHO染色体区域同源的臂的单链或双链DNA可以包括RHO基因的第一个外显子的超过150 nt、RHO基因的完整CDS和RHO基因的3' UTR以及后续内含子的至少150 nt。具有与RHO染色体区域同源的臂的单链或双链DNA可以包括RHO基因的第一个外显子的超过300 nt、RHO基因的完整CDS和RHO基因的3' UTR以及后续内含子的至少300 nt。具有与RHO染色体区域同源的臂的单链或双链DNA可以包括RHO基因的第一个外显子的超过400 nt、RHO基因的完整CDS和RHO基因的3' UTR以及后续内含子的至少400 nt。
或者，DNA模板将通过重组AAV颗粒、诸如本文教导的那些递送。
可以将RHO cDNA敲入任何选择的染色体位置中或“安全港”基因座(即白蛋白基因、AAVS 1基因、HRPT基因、CCR5基因、球蛋白基因、TTR基因、TF基因、F9基因、Alb基因、Gys2基因和PCSK9基因)之一中。HDR介导的cDNA敲入第一个外显子的效率的评价可以利用cDNA敲入“安全港”位点，诸如：具有与以下区域之一同源的臂的单链或双链DNA，所述区域例如：AAVS1 19q13.4-qter、HRPT 1q31.2、CCR5 3p21.31、球蛋白11p15.4、TTR 18q12.1、TF3q22.1、F9 Xq27.1、Alb 4q13.3、Gys2 12p12.1、PCSK9 1p32.3；对应于RHO的5'UTR或替代的5' UTR、RHO的完整CDS和RHO的3' UTR或修饰的3' UTR和第一个内含子的至少80 nt，或者相同的DNA模板序列将通过AAV递送。
实施例11
先导CRISPR-Cas9/DNA供体组合的重新评价
在测试用于基因编辑的不同策略之后，将在细胞中针对缺失、重组和靶外特异性的效率重新评价先导CRISPR-Cas9/DNA供体组合。将Cas9 mRNA或RNP配制成脂质纳米颗粒用于递送，将sgRNA配制成纳米颗粒或作为重组AAV颗粒递送，并且将供体DNA配制成纳米颗粒或作为重组AAV颗粒递送。
实施例12
自失活(SIN) CRISPR-Cas系统
当经由病毒载体递送编码Cas9和/或向导RNA的核酸时，使用SIN载体以递送所述核酸中的至少一种可以是有利的。进行实验以便进一步研究各种SIN载体特异性编辑靶向的核酸的能力。
产生两种报告细胞系，其含有在β-微管蛋白基因基因座处与蓝色荧光蛋白(BFP)融合的Cas9靶标位点。第一报告细胞系具有在β-微管蛋白基因基因座处与BFP融合的野生型RHO基因(Cas9靶标位点)。第二报告细胞系具有在β-微管蛋白基因基因座处与BFP融合的包含P23H突变的RHO基因(Cas9靶标位点)。因此，所述报告细胞系所包含的Cas9靶标位点-BFP基因融合体可用于报告Cas9靶标位点处的编辑活性。编辑活性可以经由移框突变引起BFP信号的丢失。发现根据本公开的Cas9载体和向导RNA的各种组合在编辑靶向的RHO P23H突变体Cas9靶标位点中是有效的。各种组合也是特异性的，使得野生型RHO Cas9靶标位点的编辑最少，并且类似于BFP信号丢失的背景水平。
为了产生这两种报告细胞系，使用pDL124和供体质粒。pDL124含有CMV启动子下的SpCas9 ORF和U6启动子驱动的sgRNA，并且通过Gibson组装法构建。U6启动子驱动的sgRNA可以切割对应于从β-微管蛋白的C-末端起第三个残基的密码子。供体质粒(图8)包含Cas9靶标位点(野生型RHO基因或包含P23H突变的RHO基因)。使用GeneArt服务(ThermoFisherScientific)合成这2种供体质粒的每一种。
在程序DN-100下，通过核转染用0.5μg的pDL124和0.5μg的供体质粒转染HEK293FT细胞(200,000个细胞)。pDL124用于在HEK 293FT细胞的β-微管蛋白基因基因座处产生双链断裂，以便整合来自供体质粒的Cas9靶标位点(即野生型RHO基因或包含P23H突变的RHO基因)并整合入两个同源臂之间的HEK 293FT细胞的β-微管蛋白基因基因座(tubb外显子4)。同源重组导致与T2A肽融合的β-微管蛋白的表达。Cas9靶标位点不包括终止密码子，并且蓝色荧光蛋白(mTagBFP2)和杀稻瘟素选择标记(bsd)在与β-微管蛋白相同的阅读框中编码。具有正确整合的Cas9靶标位点的细胞在补充有2-5 µg/ml杀稻瘟素的10% FBS/DMEM中富集，并通过细胞分选进行分离。在转染前24小时，将每种报告细胞系以500,000个细胞/孔接种在6-孔板中的2.5 ml 10% FBS/DMEM中。
图6A显示当使用Lipofectamine 3000用1.25 µg SIN-AAV SaCas9 ver.1 (图5A)和1.25 µg pSIA010 (图5D)转染具有在β-微管蛋白基因基因座处与蓝色荧光蛋白融合的野生型RHO基因(Cas9靶标位点)的报告细胞系时获得的结果。pSIA010是包含AAV序列(SEQID NO:5339)的质粒，所述AAV序列(SEQ ID NO:5339)编码P23H 20-聚体 sgRNA(包含SEQID NO:5290的sgRNA)和EGFP。SIN-AAV SaCas9 ver.1编码SaCas9，并且包括位于SaCas9ORF (SEQ ID NO:5313)的5'的SIN位点(也称为P23H靶标位点)和位于在SaCas9 ORF (SEQID NO:5314)内定位的天然存在或嵌合插入的内含子内的3' SIN位点。SIN-AAV SaCas9ver.1中的5' SIN位点(SEQ ID NO:5313)包含SEQ ID NO:5300，其被包含SEQ ID NO:5290的sgRNA靶向。SIN-AAV SaCas9 ver.1中的3' SIN位点(SEQ ID NO:5314)包含SEQ ID NO:5280，其也被包含SEQ ID NO:5290的sgRNA靶向(表6)。
表 6
SIN-AAV SaCas9版本1和2，其包含两个被包含SEQ ID NO:5290的sgRNA靶向的SIN位点
Figure 524121DEST_PATH_IMAGE004
使用Lipofectamine 3000用1.25 µg SIN-AAV SaCas9 ver.1和1.25 µg pSIA010转染具有在β-微管蛋白基因基因座处与蓝色荧光蛋白融合的包含P23H突变的RHO基因(Cas9靶标位点)的报告细胞系(图6C)。
图6B显示当使用Lipofectamine 3000用1.25 µg SIN-AAV SaCas9 ver.1 (图5A)和1.25 µg pSIA011 (图5D)转染具有在β-微管蛋白基因基因座处与蓝色荧光蛋白融合的野生型RHO基因(Cas9靶标位点)的报告细胞系时获得的结果。pSIA011是包含AAV序列(SEQID NO:5340)的质粒，所述AAV序列(SEQ ID NO:5340)编码P23H 19-聚体 sgRNA(包含SEQID NO:5291的sgRNA)和EGFP。SIN-AAV SaCas9 ver.1编码SaCas9，并且包括位于SaCas9ORF (SEQ ID NO:5313)的5'的SIN位点(也称为P23H靶标位点)和位于在SaCas9 ORF (SEQID NO:5314)内定位的天然存在或嵌合插入的内含子内的3' SIN位点。SIN-AAV SaCas9ver.1中的5' SIN位点(SEQ ID NO:5313)包含SEQ ID NO:5301，其被包含SEQ ID NO:5291的sgRNA靶向。SIN-AAV SaCas9 ver.1中的3' SIN位点(SEQ ID NO:5314)包含SEQ ID NO:5281，其被包含SEQ ID NO:5291的sgRNA靶向(表7)。
表7
SIN-AAV SaCas9版本1和2，其包含两个被包含SEQ ID NO:5291的sgRNA靶向的SIN位点
Figure 89225DEST_PATH_IMAGE005
使用Lipofectamine 3000用1.25 µg SIN-AAV SaCas9 ver.1和1.25 µg pSIA011转染具有在β-微管蛋白基因基因座处与蓝色荧光蛋白融合的包含P23H突变的RHO基因(Cas9靶标位点)的报告细胞系(图6D)。
图6E显示当使用Lipofectamine 3000用1.25 µg SIN-AAV SaCas9 ver.2 (图5B)和1.25 µg pSIA010 (图5D)转染具有在β-微管蛋白基因基因座处与蓝色荧光蛋白融合的野生型RHO基因(Cas9靶标位点)的报告细胞系时获得的结果。SIN-AAV SaCas9 ver.2编码SaCas9，并且包括位于SaCas9 ORF (SEQ ID NO:5313)的5'的SIN位点(也称为P23H靶标位点)和位于在SaCas9 ORF (SEQ ID NO:5314)内定位的天然存在或嵌合插入的内含子内的3' SIN位点。SIN-AAV SaCas9 ver.2中的5' SIN位点(SEQ ID NO:5313)包含SEQ ID NO:5300，其被包含SEQ ID NO:5290的sgRNA靶向。SIN-AAV SaCas9 ver.2中的3' SIN位点(SEQID NO:5314)包含SEQ ID NO:5280，其也被包含SEQ ID NO:5290的sgRNA靶向(表6)。
使用Lipofectamine 3000用1.25 µg SIN-AAV SaCas9 ver.2和1.25 µg pSIA010转染具有在β-微管蛋白基因基因座处与蓝色荧光蛋白融合的包含P23H突变的RHO基因(Cas9靶标位点)的报告细胞系(图6G)。
图6F显示当使用Lipofectamine 3000用1.25 µg SIN-AAV SaCas9 ver.2 (图5B)和1.25 µg pSIA011 (图5D)转染具有在β-微管蛋白基因基因座处与蓝色荧光蛋白融合的野生型RHO基因(Cas9靶标位点)的报告细胞系时获得的结果。SIN-AAV SaCas9 ver.2编码SaCas9，并且包括位于SaCas9 ORF (SEQ ID NO:5313)的5'的SIN位点(也称为P23H靶标位点)和位于在SaCas9 ORF (SEQ ID NO:5314)内定位的天然存在或嵌合插入的内含子内的3' SIN位点。SIN-AAV SaCas9 ver.2中的5' SIN位点(SEQ ID NO:5313)包含SEQ ID NO:5301，其被包含SEQ ID NO:5291的sgRNA靶向。SIN-AAV SaCas9 ver.2中的3' SIN位点(SEQID NO:5314)包含SEQ ID NO:5281，其被包含SEQ ID NO:5291的sgRNA靶向(表7)。
使用Lipofectamine 3000用1.25 µg SIN-AAV SaCas9 ver.2和1.25 µg pSIA011转染具有在β-微管蛋白基因基因座处与蓝色荧光蛋白融合的包含P23H突变的RHO基因(Cas9靶标位点)的报告细胞系(图6H)。
图6I显示当使用Lipofectamine 3000用1.25 µg非-SIN-AAV SaCas9 (图5C)和1.25 µg pSIA010 (图5D)转染具有在β-微管蛋白基因基因座处与蓝色荧光蛋白融合的野生型RHO基因(Cas9靶标位点)的报告细胞系时获得的结果。非-SIN-AAV SaCas9编码SaCas9，并且不包括SIN位点(也称为P23H靶标位点)。
使用Lipofectamine 3000用1.25 µg非-SIN-AAV SaCas9和1.25 µg pSIA010 转染具有在β-微管蛋白基因基因座处与蓝色荧光蛋白融合的包含P23H突变的RHO基因(Cas9靶标位点)的报告细胞系(图6L)。
图6J显示当使用Lipofectamine 3000用1.25 µg非-SIN-AAV SaCas9 (图5C)和1.25 µg pSIA011 (图5D)转染具有在β-微管蛋白基因基因座处与蓝色荧光蛋白融合的野生型RHO基因(Cas9靶标位点)的报告细胞系时获得的结果。
使用Lipofectamine 3000用1.25 µg非-SIN-AAV SaCas9和1.25 µg pSIA011 转染具有在β-微管蛋白基因基因座处与蓝色荧光蛋白融合的包含P23H突变的RHO基因(Cas9靶标位点)的报告细胞系(图6M)。
使用Lipofectamine 3000用仅转染试剂(无DNA)转染具有在β-微管蛋白基因基因座处与蓝色荧光蛋白融合的野生型RHO基因(Cas9靶标位点)的报告细胞系(图6K)。
使用Lipofectamine 3000用仅转染试剂(无DNA)转染具有在β-微管蛋白基因基因座处与蓝色荧光蛋白融合的包含P23H突变的RHO基因(Cas9靶标位点)的报告细胞系(图6N)。
在转染后72小时，通过与胰蛋白酶-EDTA孵育，将报告细胞从板解离，并通过流式细胞术针对蓝色荧光(BFP)和绿色荧光(GFP)进行分析。在HEK 293FT细胞的Cas9靶标位点(无论Cas9靶标位点是野生型RHO基因还是包含P23H突变的RHO基因)处通过基因组编辑诱导的移框导致BFP的丢失。EGFP和sgRNA在同一载体上编码，且EGFP充当转染标志物。因此，用pSIA010(其包含编码P23H 20-聚体 sgRNA - 包含SEQ ID NO:5290的sgRNA的AAV序列)或pSIA011(其包含编码P23H 19-聚体sgRNA - 包含SEQ ID NO:5291的sgRNA的AAV序列)转染的HEK 293FT细胞是GFP阳性的。
在门内绘制的细胞群中估计转染细胞中的基因编辑(图6A-6N)。图6A-6N中的粗体百分比表示门内的BFP阴性和GFP阳性细胞。BFP阴性意指基因编辑发生在这些转染的HEK293FT细胞的Cas9靶标位点处。GFP阳性意指这些转染的HEK 293FT细胞含有编码EGFP和sgRNA的质粒。
图6A显示在门中具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点的转染的HEK 293FT报告细胞的百分比，当用SIN-AAV SaCas9 ver.1和pSIA010(其编码P23H 20-聚体sgRNA(包含SEQ ID NO:5290的sgRNA))转染时，这些细胞中的~0%的野生型RHO基因被编辑。
图6B显示在门中具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点的转染的HEK 293FT报告细胞的百分比，当用SIN-AAV SaCas9 ver.1和pSIA011(其编码P23H 19-聚体 sgRNA(包含SEQ ID NO:5291的sgRNA))转染时，这些细胞中的~0%的野生型RHO基因被编辑。
图6C显示在门中具有P23H突变作为Cas9靶标位点的转染的HEK 293FT报告细胞的百分比，当用SIN-AAV SaCas9 ver.1和pSIA010转染时，这些细胞中的42.41%的P23H突变被编辑。
图6D显示在门中具有P23H突变作为Cas9靶标位点的转染的HEK 293FT报告细胞的百分比，当用SIN-AAV SaCas9 ver.1和pSIA011转染时，这些细胞中的19.42%的P23H突变被编辑。
图6E显示在门中具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点的转染的HEK 293FT报告细胞的百分比，当用SIN-AAV SaCas9 ver.2和pSIA010转染时，这些细胞中的~0%的野生型RHO基因被编辑。
图6F显示在门中具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点的转染的HEK 293FT报告细胞的百分比，当用SIN-AAV SaCas9 ver.2和pSIA011转染时，这些细胞中的~0%的野生型RHO基因被编辑。
图6G显示在门中具有P23H突变作为Cas9靶标位点的转染的HEK 293FT报告细胞的百分比，当用SIN-AAV SaCas9 ver.2和pSIA010转染时，这些细胞中的46.23%的P23H突变被编辑。
图6H显示在门中具有P23H突变作为Cas9靶标位点的转染的HEK 293FT报告细胞的百分比，当用SIN-AAV SaCas9 ver.2和pSIA011转染时，这些细胞中的18.58%的P23H突变被编辑。
图6I显示在门中具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点的转染的HEK 293FT报告细胞的百分比，当用非-SIN-AAV SaCas9和pSIA010转染时，这些细胞中的~0%的野生型RHO基因被编辑。
图6J显示在门中具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点的转染的HEK 293FT报告细胞的百分比，当用非-SIN-AAV SaCas9和pSIA011转染时，这些细胞中的~0%的野生型RHO基因被编辑。
图6K显示在门中具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点的转染的HEK 293FT报告细胞的百分比，当不使用DNA时，这些细胞中的0%的野生型RHO基因被编辑。
图6L显示在门中具有P23H突变作为Cas9靶标位点的转染的HEK 293FT报告细胞的百分比，当用非-SIN-AAV SaCas9和pSIA010转染时，这些细胞中的49.97%的P23H突变被编辑。
图6M显示在门中具有P23H突变作为Cas9靶标位点的转染的HEK 293FT报告细胞的百分比，当用非-SIN-AAV SaCas9和pSIA011转染时，这些细胞中的26.30%的P23H突变被编辑。
图6N显示在门中具有P23H突变作为Cas9靶标位点的转染的HEK 293FT报告细胞的百分比，当不使用DNA时，这些细胞中的0%的P23H突变被编辑。
由于在模拟转染的细胞中没有诱导基因组编辑，所以绝大多数模拟转染的细胞是BFP阳性的(图6K和6N)。
为了确定SIN载体限制Cas9表达的能力，对于图6A-N描述的实验中使用的细胞，通过免疫印迹测量Cas9蛋白的表达水平(图7A-B)。当被包含SEQ ID NO:5290或5291的向导RNA靶向时，SIN Cas9载体在两种报告细胞系中显示Cas9的表达降低。
在转染后72小时，还将报告细胞收获在PBS中，并在0.1 % Triton X-100/TBS (25mM Tris-HCl (pH 7.5)和150 mM NaCl)中提取总蛋白。将五微克总蛋白在NUPAGE 4-12 %聚丙烯酰胺/Tris-Bis凝胶上分离，并转移至硝酸纤维素膜上。分别使用Cas9单克隆抗体、GFP标签多克隆抗体和β肌动蛋白上样对照单克隆抗体检测SaCas9、EGFP(作为转染对照)和β肌动蛋白(作为内部对照)。
图7A(泳道1)显示在具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点并用SIN-AAV SaCas9ver.1 (图5A)和pSIA010(其编码P23H 20-聚体 sgRNA(包含SEQ ID NO:5290的sgRNA))转染的HEK 293FT报告细胞中的Cas9失活。
图7A(泳道2)显示在具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点并用SIN-AAV SaCas9ver.2 (图5B)和pSIA010转染的HEK 293FT报告细胞中的Cas9失活。
图7A(泳道3)显示在具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点并用非-SIN-AAVSaCas9 (图5C)和pSIA010转染的HEK 293FT报告细胞中的Cas9表达。
图7A(泳道4)显示在具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点且未用任何DNA转染的HEK 293FT报告细胞中没有Cas9表达。
图7A(泳道5)显示在具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点并用SIN-AAV SaCas9ver.1 (图5A)和pSIA011(其编码P23H 19-聚体 sgRNA sgRNA(包含SEQ ID NO:5291的sgRNA))转染的HEK 293FT报告细胞中的Cas9失活。
图7A(泳道6)显示在具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点并用SIN-AAV SaCas9ver.2 (图5B)和pSIA011转染的HEK 293FT报告细胞中的Cas9失活。
图7A(泳道7)显示在具有野生型RHO基因作为Cas9靶标位点并用非-SIN-AAVSaCas9 (图5C)和pSIA011转染的HEK 293FT报告细胞中的Cas9表达。
图7B(泳道1)显示在具有P23H突变作为Cas9靶标位点并用SIN-AAV SaCas9 ver.1(图5A)和pSIA010(其编码P23H 20-聚体sgRNA sgRNA(包含SEQ ID NO:5290的sgRNA))转染的HEK 293FT报告细胞中的Cas9失活。
图7B(泳道2)显示在具有P23H突变作为Cas9靶标位点并用SIN-AAV SaCas9 ver.2(图5B)和pSIA010转染的HEK 293FT报告细胞中的Cas9失活。
图7B(泳道3)显示在具有P23H突变作为Cas9靶标位点并用非-SIN-AAV SaCas9(图5C)和pSIA010转染的HEK 293FT报告细胞中的Cas9表达。
图7B(泳道4)显示在具有P23H突变作为Cas9靶标位点且未用任何DNA转染的HEK293FT报告细胞中没有Cas9表达。
图7B(泳道5)显示在具有P23H突变作为Cas9靶标位点并用SIN-AAV SaCas9 ver.1(图5A)和pSIA011(其编码P23H 19-聚体sgRNA sgRNA(包含SEQ ID NO:5291的sgRNA))转染的HEK 293FT报告细胞中的Cas9失活。
图7B(泳道6)显示在具有P23H突变作为Cas9靶标位点并用SIN-AAV SaCas9 ver.2(图5B)和pSIA011转染的HEK 293FT报告细胞中的Cas9失活。
图7B(泳道7)显示在具有P23H突变作为Cas9靶标位点并用非-SIN-AAV SaCas9(图5C)和pSIA011转染的HEK 293FT报告细胞中的Cas9表达。
如上所讨论，产生两个版本的自失活(SIN) AAV载体，其限制转染后它们自己的Cas9表达。在图5A中描绘了版本1载体的实例。在图5B中描绘了版本2载体的实例。版本1和版本2载体两者均包含两个SIN位点(也称为P23H靶标位点)，其容易被Cas9-sgRNA RNP切割。在这些位点之一处的Cas9-介导的双链断裂可导致Cas9基因中启动子或聚腺苷酸化信号的除去。同时发生在这些位点的两个处的Cas9-介导的双链断裂可导致Cas9基因的缺失。两种可能性均会抑制Cas9表达。
已经观察到，版本1载体导致比版本2载体更有效的自失活。版本1载体包含5' SIN位点(P23H靶标位点)，其位于Cas9开放阅读框(ORF)的上游和SV40核定位信号(NLS)的下游。版本2载体包含5' SIN位点(P23H靶标位点)，其位于Cas9开放阅读框(ORF)的上游和5'非翻译区(UTR)内的SV40核定位信号(NLS)的上游。在版本1载体中，由非同源末端连接导致的突变可产生移框，其引起Cas9基因ORF中引入过早的终止密码子。在版本2载体中，这样的突变不太可能在Cas9 ORF中产生这样的变化，因为SIN位点(P23H靶标位点)在ORF外侧的5'UTR中。这些突变仍然可以破坏转录起始，但它们对Cas9表达的总体影响可能小于版本1载体中的突变。此外，一旦在任一载体中产生突变，不太可能产生第二个，因为该位点将不再与sgRNA间隔物序列共享足够的同源性以用于有效的额外编辑。重要的是，确实发生的编辑可能抑制表达。至少由于这些原因，在两个载体版本之间观察到的SIN效率存在差异。
为了证实引入的SIN位点不影响Cas9的转录和翻译，用1.25μg的pDL107(其编码GFP且不编码sgRNA)和(1) SIN-AAV SaCas9 ver.1、(2) SIN-AAV SaCas9 ver.2或(3) 非-SIN-AAV SaCas9转染HEK 293FT细胞。在转染前24小时，将细胞以500,000个细胞/孔接种在6-孔板中的2.5 ml 10 % FBS/DMEM中。在转染后72小时，通过流式细胞术分析所有转染细胞的GFP表达，并在0.1 % Triton X-100/TBS (25 mM Tris-HCl (pH 7.5)和150 mM NaCl)中提取总蛋白。将五微克总蛋白在NUPAGE 4-12 %聚丙烯酰胺/Tris-Bis凝胶上分离，并转移至硝酸纤维素膜上。分别使用Cas9单克隆抗体、GFP标签多克隆抗体和β肌动蛋白上样对照单克隆抗体检测SaCas9、EGFP(作为转染对照)和β肌动蛋白(作为内部对照)。结果显示，在用(1) SIN-AAV SaCas9 ver.1、(2) SIN-AAV SaCas9 ver.2和(3) 非-SIN-AAV SaCas9转染的HEK 293FT细胞中，SaCas9表达相同(数据未显示)。
实施例13
P23H突变体RHO细胞系的产生
为了允许在基因组DNA的背景下(与实施例8中使用的质粒DNA相反)，靶向P23H突变体RHO基因序列的向导RNA的靶上测试，使用野生型K562细胞产生具有纯合子g.129528801C>A突变(P23H突变体RHO细胞系)的K562细胞系。野生型K562细胞含有人视紫红质基因的两个野生型等位基因。用于产生P23H突变体RHO细胞系的野生型K562细胞也先前工程改造，以便在多西环素诱导型启动子下稳定表达金黄色葡萄球菌Cas9核酸内切酶。
使用Lonza的核转染仪和对于K562细胞推荐的程序，用Lonza的Nucleofector™试剂盒、核糖核蛋白(RNP)和单链DNA寡核苷酸(3-6 µg)转染野生型K562细胞。
用2.5 µg TrueCut™ Cas9蛋白v2 (ThermoFisher Scientific)和1µg (~25 pM)合成gRNA (ThermoFisher Scientific)制备核糖核蛋白(RNP)。合成的gRNA包含以下未修饰的原间隔物区域：UAGUACUGUGGGUACUCGA (SEQ ID NO:5343)和ThermoFisher的专有tracrRNA序列。设计用于在野生型K562基因组中引入双断裂的合成gRNA，使得一旦将期望的P23H突变引入基因组，RNP识别的PAM序列将不再充当PAM序列，因此阻止进一步编辑已经经历成功HDR的细胞的基因组(图9B)。
用作HDR的模板的单链DNA寡核苷酸是：
AGTTGATGGGGAAGCCCAGCACGATCAGCAGAAACATGTAGGCGGCCAGCATGGAGAACTGCCATGGCTCAGCCAGGTAGTACTGTGGGTACTCGAAGTGGCTGCGTACCACACCCGTCGCATTGGAGAAGGGCACGTAGAAGTTAGGGCCTTCTGTGCCATTCATGGCTGTGGCCCTTGTGGCTGACCCGTGGCT (SEQ ID NO:5346)。
使转染的细胞在转染后3-7天在培养物中恢复。将单细胞自动分选至96-孔板中，并从单细胞产生集落。从细胞的每个集落分离基因组DNA，并针对人视紫红质基因的密码子23中的期望的单核苷酸突变的存在进行测序。分离几个克隆，其具有引入两个等位基因的P23H突变(图9A-B)。
实施例14
在P23H突变体RHO细胞中针对靶上/靶外活性测试合成的向导RNA
实施例13中构建的细胞系(以及预先存在的野生型RHO细胞系)用于通过使用TIDE分析评估插入/缺失频率来针对靶上/靶外活性测试选择的向导RNA。在这些实验中，合成的向导RNA用于靶向RHO内的P23H突变，而不是如先前的实验中从病毒或质粒载体转录的向导RNA。另外，靶向如基因组DNA中所编码的RHO基因DNA序列。发现在这些条件下，本发明的向导RNA表现出突变体P23H RHO基因座的特异性编辑。
在转染之前，野生型RHO细胞和P23H突变体RHO细胞首先用多西环素处理48小时，以便诱导SaCas9表达。
48小时后，两种细胞类型(200,000/孔)分别用1μg靶向野生型RHO基因的合成sgRNA或1μg靶向P23H突变体RHO基因的合成sgRNA转染。野生型RHO细胞和P23H突变体RHO细胞使用Lonza的核转染仪和对于K562细胞推荐的程序进行转染。靶向P23H突变体RHO基因的sgRNA包含：人视紫红质P23H 20聚体(SEQ ID NO:5290)和人视紫红质P23H 19聚体(SEQ IDNO:5291)(图2B)。靶向野生型RHO基因的sgRNA包含：人视紫红质WT 20聚体(SEQ ID NO:5285)和人视紫红质WT 19聚体(SEQ ID NO:5286)(图2B)。将转染的K562细胞(野生型RHO细胞或P23H突变体RHO细胞)与对照细胞进行比较，所述对照细胞是表达金黄色葡萄球菌Cas9蛋白、但未用任何向导RNA转染的K562细胞。
转染后48-72小时从细胞收获基因组DNA，并且在RHO基因的密码子23周围进行PCR扩增。位于RHO基因的第一个外显子的非编码上游区域中的正向引物(SEQ ID NO:5347)和位于编码区域中的反向引物(SEQ ID NO:5348)用于PCR扩增。
因为野生型RHO细胞的基因组仅含有RHO基因的野生型版本，而不是P23H突变体等位基因，所以这些野生型RHO细胞用于测量靶向野生型RHO基因的gRNA的靶上编辑效率和靶向P23H突变体RHO基因的gRNA的靶外编辑效率。因为P23H突变体RHO细胞的基因组仅含有RHO基因的P23H突变体版本，而不是野生型等位基因，这些P23H突变体RHO细胞用于测量靶向P23H突变体RHO基因的gRNA的靶上编辑效率和靶向野生型RHO基因的gRNA的靶外编辑效率。通过经由当RNP在编辑位点处产生DSB时产生的游离DNA末端的NHEJ修复而引入的插入、缺失和突变的速率来测量靶上和靶外活性。
序列分析揭示，对于靶向P23H突变体RHO基因的包含SEQ ID NO:5290的sgRNA，89%的P23H突变体RHO基因座被成功地编辑(图10，样品6)，并且靶外编辑低(图10，样品3)，并且类似于对照细胞中的背景水平(图10，样品5)。
序列分析揭示，对于靶向P23H突变体RHO基因的包含SEQ ID NO:5291的sgRNA，10.6%的P23H突变体RHO基因座被成功地编辑(图10，样品7)，并且靶外编辑低(图10，样品4)，并且类似于对照细胞中的背景水平(图10，样品5)。
序列分析揭示，对于靶向野生型RHO基因的包含SEQ ID NO:5285的sgRNA，80.6%的野生型RHO基因座被成功地编辑(图10，样品1)，并且靶外编辑为15.5%(图10，样品8)。
序列分析揭示，对于靶向野生型RHO基因的包含SEQ ID NO:5286的sgRNA，84.2%的野生型RHO基因座被成功地编辑(图10，样品2)，并且靶外编辑低(图10，样品9)，并且类似于对照细胞中的背景水平(图10，样品10)。
实施例15
针对靶上/靶外活性测试质粒编码的sgRNA
还测试由转染的质粒编码的sgRNA特异性编辑靶向的基因组P23H突变体RHO基因DNA的能力。使用与实施例14中相同的两种细胞系，发现本公开的sgRNA能够引导特异性编辑靶向的P23H突变体DNA。
通过将18-24个核苷酸的DNA插入物(表8)克隆至质粒中的在U6启动子下，来构建靶向P23H突变体RHO基因的质粒编码的sgRNA，使得DNA插入物将通过RNA聚合酶III转录为sgRNA。除了U6启动子以外，质粒还包括由CMV启动子驱动的绿色荧光蛋白。
用于驱动来自每种质粒的sgRNA表达的U6启动子/RNA聚合酶III在sgRNA的5'末端添加鸟嘌呤(G)核苷酸。例如，添加5'G后，编码长度为19个核苷酸(19 聚体)的sgRNA的克隆的DNA插入物变成20个核苷酸(20 聚体)。对于许多靶向P23H突变体RHO基因的sgRNA，额外的G是视紫红质基因的天然序列(SEQ ID NO:5315、5317、5281和5357)的一部分，而对于靶向P23H突变体RHO基因的其他sgRNA，5' G是错配的核苷酸(即“突出的5' G”)(SEQ ID NO:5316、5318和5280)(表8)。
表8
靶向P23H突变体RHO基因的质粒编码的sgRNA
向导物名称 DNA插入物 SEQ ID NO: (DNA插入物) 添加G后与RHO基因的序列匹配 编码的sgRNA包含SEQ ID NO： SEQ ID NO: (包含DNA插入物的质粒)
Rho-P23HMut-24聚体 CGACGGGTGTGGTACGCAGCCACT 5315 完全匹配 5319 5367
Rho-P23HMut-23聚体 GACGGGTGTGGTACGCAGCCACT 5316 突出的5' G 5320 5366
Rho-P23HMut-22聚体 ACGGGTGTGGTACGCAGCCACT 5317 完全匹配 5321 5365
Rho-P23HMut-21聚体 CGGGTGTGGTACGCAGCCACT 5318 突出的5' G 5322 5364
人视紫红质P23H 20聚体 GGGTGTGGTACGCAGCCACT 5280 突出的5' G 5290 5363
人视紫红质P23H 19聚体 GGTGTGGTACGCAGCCACT 5281 完全匹配 5291 5362
Rho-P23HMut-18聚体 GTGTGGTACGCAGCCACT 5357 完全匹配 5358 5361
在转染之前，野生型RHO细胞和P23H突变体RHO细胞首先用1-10 µg/mL多西环素处理48小时，以便诱导SaCas9表达。
48小时后，将两种细胞类型(200,000/孔)用1μg质粒转染，所述质粒编码靶向P23H突变体RHO基因的sgRNA(表8：SEQ ID NO:5361、5362、5363、5364、5365、5366或5367)。野生型RHO细胞和P23H突变体RHO细胞使用Lonza的核转染仪和对于K562细胞推荐的程序进行转染。将转染的K562细胞(野生型RHO细胞或P23H突变体RHO细胞)与对照细胞进行比较，所述对照细胞是表达金黄色葡萄球菌Cas9蛋白、但未用任何向导RNA转染的K562细胞。
在转染后继续用1-10 µg/mL多西环素处理48-72小时。然后转染后48-72小时从细胞收获基因组DNA，并且在RHO基因的密码子23周围进行PCR扩增。位于RHO基因的第一个外显子的非编码上游区域中的正向引物(SEQ ID NO:5347)和位于编码区域中的反向引物(SEQ ID NO:5348)用于PCR扩增。
因为野生型RHO细胞的基因组仅含有RHO基因的野生型版本，而不是P23H突变体等位基因，野生型RHO细胞用于测量靶向P23H突变体RHO基因的gRNA的靶外编辑效率。因为P23H突变体RHO细胞的基因组仅含有RHO基因的P23H突变体版本，而不是野生型等位基因，这些P23H突变体RHO细胞用于测量靶向P23H突变体RHO基因的sgRNA的靶上编辑效率。
序列分析揭示，对于用编码靶向P23H突变体RHO基因的包含SEQ ID NO:5358的sgRNA的质粒转染的细胞，7.6%的P23H突变体RHO基因座被成功地编辑(图11，样品1)，并且靶外编辑低(图11，样品2)，并且类似于对照细胞中的背景水平(图11，样品16)。
序列分析揭示，对于用编码靶向P23H突变体RHO基因的包含SEQ ID NO:5291的sgRNA的质粒转染的细胞，32.3%的P23H突变体RHO基因座被成功地编辑(图11，样品3)，并且靶外编辑低(图11，样品4)，并且类似于对照细胞中的背景水平(图11，样品16)。
序列分析揭示，对于用编码靶向P23H突变体RHO基因的包含SEQ ID NO:5290的sgRNA的质粒转染的细胞，13.6%的P23H突变体RHO基因座被成功地编辑(图11，样品5)，并且靶外编辑低(图11，样品6)，并且类似于对照细胞中的背景水平(图11，样品16)。
序列分析揭示，对于用编码靶向P23H突变体RHO基因的包含SEQ ID NO:5322的sgRNA的质粒转染的细胞，8.5%的P23H突变体RHO基因座被成功地编辑(图11，样品7)，并且靶外编辑低(图11，样品8)，并且类似于对照细胞中的背景水平(图11，样品16)。
序列分析揭示，对于用编码靶向P23H突变体RHO基因的包含SEQ ID NO:5321的sgRNA的质粒转染的细胞，30.1%的P23H突变体RHO基因座被成功地编辑(图11，样品9)，并且靶外编辑低(图11，样品10)，并且类似于对照细胞中的背景水平(图11，样品16)。
序列分析揭示，对于用编码靶向P23H突变体RHO基因的包含SEQ ID NO:5320的sgRNA的质粒转染的细胞，14.8%的P23H突变体RHO基因座被成功地编辑(图11，样品11)，并且靶外编辑低(图11，样品12)，并且类似于对照细胞中的背景水平(图11，样品16)。
序列分析揭示，对于用编码靶向P23H突变体RHO基因的包含SEQ ID NO:5319的sgRNA的质粒转染的细胞，3.6%的P23H突变体RHO基因座被成功地编辑(图11，样品13)，并且靶外编辑低(图11，样品14)，并且类似于对照细胞中的背景水平(图11，样品16)。
来自第二实验的序列分析揭示，对于用编码靶向P23H突变体RHO基因的包含SEQID NO:5291的sgRNA的质粒转染的细胞，59.6%的P23H突变体RHO基因座被成功地编辑(图12，样品1)。
来自第二实验的序列分析揭示，对于用编码靶向P23H突变体RHO基因的包含SEQID NO:5321的sgRNA的质粒转染的细胞，42.1%的P23H突变体RHO基因座被成功地编辑(图12，样品2)。
实施例16
体内测试
使用两种不同的RHO敲入小鼠品系来进一步证实Cas9-sgRNA系统特异性切割人RHO基因内的P23H突变体等位基因、将移框突变引入P23H突变体RHO等位基因和抑制体内系统中P23H突变体RHO等位基因的表达的能力。
在第一RHO敲入小鼠品系(被称为：hRHO-GFP小鼠)中，RHO基因的两个小鼠拷贝均用野生型人RHO基因(包括所有内含子和外显子)取代，并融合至绿色荧光蛋白(GFP)，产生具有两个hRHO-GFP等位基因且没有剩余的小鼠RHO等位基因的纯合子小鼠。
在第二RHO敲入小鼠品系(被称为：P23H-hRHO-RFP小鼠)中，RHO基因的一个小鼠拷贝用P23H突变体人RHO基因(包括所有内含子和外显子)取代，并融合至红色荧光蛋白(RFP)，产生具有一个P23H- hRHO-RFP突变体等位基因和一个小鼠RHO等位基因的杂合子小鼠。
两种RHO敲入小鼠品系均获得自Theodore Wensel博士的实验室，在该实验室，小鼠品系在贝勒医学院(Houston, Texas; United States)产生。
这些小鼠品系中的荧光标签(例如，GFP或RFP)与RHO蛋白的融合允许监测细胞内的蛋白分布，和监测RHO蛋白表达的水平。使用不同的荧光蛋白对两个人等位基因进行荧光标记也允许区别野生型RHO蛋白和P23H突变体RHO蛋白，其天然序列仅相差一个氨基酸，并且当使用抗体检测天然蛋白时无法彼此区分。
包含非-SIN AAV-SaCas9 (图5C)和pSIA010(图5D)的双重载体系统用于体内实验。使用的非-SIN AAV-SaCas9与图5C中描绘的非-SIN AAV-SaCas9相同，除了本载体包含光感受器细胞特异性人视紫红质激酶启动子以驱动SaCas9表达(而不是sEF1α启动子)。pSIA010编码sgRNA，其由U6启动子(RNA聚合酶III启动子)驱动。所述sgRNA包含SEQ ID NO:5290，其靶向人RHO基因内的P23H突变。使用的pSIA010与图5D中描绘的pSIA010相同，除了本载体编码由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的蓝色荧光蛋白(BFP)(而不是由CMV启动子驱动的EGFP)。BFP提供了一种荧光标记物，其允许分离由pSIA010转导的细胞与未转导的细胞。两种AAV载体(非-SIN AAV-SaCas9和pSIA010)均为血清型AAV5，其为适合于在体内转导光感受器细胞的AAV血清型。
在出生后第14至29天，通过视网膜下注射使用SaCas9-编码载体(非-SIN AAV-SaCas9)和sgRNA-编码载体(pSIA010)的1:1比率，将非-SIN AAV-SaCas9和pSIA010递送至P23H-hRHO-RFP小鼠(图13，样品1)和对照hRHO-GFP小鼠(图13，样品2)中。每种载体具有2.5x 109或5 x 109个载体基因组颗粒的剂量。转导后三周或八周，解剖视网膜并用蛋白水解酶(链霉蛋白酶)的混合物消化以实现单细胞悬浮液，随后进行荧光活化的细胞分选(FACS)以分选转导和未转导的细胞。
从转导的细胞分离基因组DNA，用于随后使用下一代深度测序进行SaCas9/sgRNA-诱导的编辑的定量分析。对于测序，使用仅特异性扩增人RHO序列的引物。作为引物特异性的对照，对于包含人RHO序列的基因组DNA样品，使用测序引物的PCR产生200 bp条带。对于包含小鼠RHO序列而不是人RHO序列的基因组DNA样品，不产生200 bp条带。
当使用编码包含SEQ ID NO:5290的sgRNA的pSIA010 AAV载体时，观察到P23H突变体人RHO等位基因的等位基因特异性的靶上编辑(图13，样品1；和表9，第1-10行)。包含SEQID NO:5290的sgRNA与P23H突变体人RHO等位基因具有完全互补性，并且与野生型人RHO等位基因具有一个错配。
当使用编码包含SEQ ID NO:5290的sgRNA的相同pSIA010 AAV载体时，观察到野生型RHO基因的最小靶外编辑(图13，样品2；和表9，第11-16行)。
表9
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关于示例性实施例的注解
尽管为了举例说明本公开的不同实例和/或它的潜在应用的目的，本公开提供了不同具体方面的描述，但是应当理解，本领域技术人员会做出变化和修改。因此，本文描述的一项或多项发明应当理解为至少如它们所要求保护的一样宽泛，并且不象本文提供的特定示例性实例那样更狭窄地限定。

Claims (142)

1.用于在人细胞中编辑视紫红质(RHO)基因的方法，所述方法包括：
向所述人细胞中引入一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶，以在所述RHO基因或编码所述RHO基因的调节元件的其他DNA序列内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致一个或多个突变的表达或功能的永久缺失、插入、校正或调节，所述突变在所述RHO基因内或附近或影响RHO基因的表达或功能，由此产生编辑的人细胞。
2.用于在人细胞中编辑视紫红质(RHO)基因中的P23H突变的方法，所述方法包括：
向所述人细胞中引入一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶，以在所述RHO基因中的P23H突变内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致所述P23H突变的表达或功能的永久缺失、插入、校正或调节，由此产生编辑的人细胞。
3.用于治疗具有色素性视网膜炎(RP)的患者的体内方法，所述方法包括：在患者的细胞中编辑视紫红质(RHO)基因中的P23H突变。
4.权利要求3的方法，其中所述编辑包括：
向所述细胞中引入一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶，以在所述RHO基因中的P23H突变内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致所述P23H突变的表达或功能的永久缺失、插入、校正或调节，且导致RHO蛋白活性的恢复。
5.权利要求1-2或4中任一项的方法，其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4或Cpf1核酸内切酶；其同源物，其天然存在的分子的重组物，其密码子优化物或其修饰形式及其组合。
6.权利要求5的方法，其中所述方法包括向所述细胞中引入编码一种或多种DNA核酸内切酶的一种或多种多核苷酸。
7.权利要求5的方法，其中所述方法包括向所述细胞中引入编码所述一种或多种DNA核酸内切酶的一种或多种核酸(RNA)。
8.权利要求6或7中任一项的方法，其中所述一种或多种多核苷酸或一种或多种RNA是一种或多种修饰的多核苷酸或一种或多种修饰的RNA。
9.权利要求5的方法，其中所述DNA核酸内切酶是一种或多种蛋白或多肽。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法进一步包括：向所述细胞中引入一种或多种向导核糖核酸(gRNA)。
11.权利要求10的方法，其中所述一种或多种gRNA是单分子向导RNA (sgRNA)。
12.权利要求10-11中任一项的方法，其中所述一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA是一种或多种修饰的gRNA或一种或多种修饰的sgRNA。
13.权利要求9-11中任一项的方法，其中将所述一种或多种DNA核酸内切酶与一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA预复合。
14.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括：向所述细胞中引入包含野生型RHO基因或cDNA的至少一部分的多核苷酸供体模板。
15.权利要求14的方法，其中所述野生型RHO基因或cDNA的至少一部分是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子区域、其片段或组合或整个RHO基因或cDNA。
16.权利要求14-15中任一项的方法，其中所述供体模板是单链或双链多核苷酸。
17.权利要求14-15中任一项的方法，其中所述供体模板具有与3q22.1区域同源的臂。
18.权利要求2或4的方法，其进一步包括：
向所述细胞中引入一种向导核糖核酸(gRNA)或包含所述野生型RHO基因的至少一部分的多核苷酸供体模板；
其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是一种或多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其在位于RHO基因中的P23H突变内或附近的基因座处实现一个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其促进将来自多核苷酸供体模板的新序列插入所述基因座处的基因座DNA，其导致RHO基因中的P23H突变的永久插入或校正；且
其中所述gRNA包含与位于RHO基因中的P23H突变内或附近的基因座的区段互补的间隔物序列。
19.权利要求2或4的方法，其进一步包括：
向所述细胞中引入一种或多种向导核糖核酸(gRNA)或包含所述野生型RHO基因的至少一部分的多核苷酸供体模板；
其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是一种或多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其在RHO基因中的P23H突变内或附近实现一对单链断裂(SSB)或和双链断裂(DSB)，第一个在5'基因座处，且第二个在3'基因座处，其促进将来自所述多核苷酸供体模板的新序列插入所述5'基因座和所述3'基因座之间的染色体DNA中，其导致RHO基因中的P23H突变内或附近的所述5'基因座和所述3'基因座之间的染色体DNA的永久插入或校正；且
其中第一向导RNA包含与5'基因座的区段互补的间隔物序列，且第二向导RNA包含与3'基因座的区段互补的间隔物序列。
20.权利要求18-19中任一项的方法，其中所述一种或多种gRNA是一种或多种单分子向导RNA (sgRNA)。
21.权利要求18-20中任一项的方法，其中所述一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA是一种或多种修饰的gRNA或一种或多种修饰的sgRNA。
22.权利要求18-21中任一项的方法，其中将所述一种或多种DNA核酸内切酶与一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA预复合。
23.权利要求18-22中任一项的方法，其中所述野生型RHO基因或cDNA的至少一部分是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子区域、其片段或组合或整个RHO基因或cDNA。
24.权利要求18-23中任一项的方法，其中所述供体模板是单链或双链多核苷酸。
25.权利要求18-24中任一项的方法，其中所述供体模板具有与3q22.1区域同源的臂。
26.权利要求18-25的方法，其中所述SSB或DSB在所述RHO基因的第一外显子、第二外显子、第三外显子、第四外显子、第五外显子或其组合中。
27.权利要求10-13或20-22的方法，其中所述gRNA或sgRNA针对病理学变体P23H。
28.权利要求1-2或4-27中任一项的方法，其中所述插入或校正通过同源性引导的修复(HDR)进行。
29.权利要求18-19中任一项的方法，其中所述供体模板具有与病理学变体P23H同源的臂。
30.权利要求2或4的方法，其进一步包括：
向所述细胞中引入两种向导核糖核酸(gRNA)或包含所述野生型RHO基因的至少一部分的多核苷酸供体模板；
其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是一种或多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其在RHO基因中的P23H突变内或附近实现一对双链断裂(DSB)，第一个在5' DSB基因座处，且第二个在3' DSB基因座处，其引起所述5' DSB基因座和所述3' DSB基因座之间的染色体DNA的缺失，其导致RHO基因中的P23H突变内或附近的所述5' DSB基因座和所述3' DSB基因座之间的染色体DNA的永久缺失；且
其中第一向导RNA包含与5' DSB基因座的区段互补的间隔物序列，且第二向导RNA包含与3' DSB基因座的区段互补的间隔物序列。
31.权利要求30的方法，其中所述两种gRNA是两种单分子向导RNA (sgRNA)。
32.权利要求30-31中任一项的方法，其中所述两种gRNA或两种sgRNA是两种修饰的gRNA或两种修饰的sgRNA。
33.权利要求30-32中任一项的方法，其中将所述一种或多种DNA核酸内切酶与两种gRNA或两种sgRNA预复合。
34.权利要求30-33中任一项的方法，其中所述5' DSB和3' DSB两者均RHO基因的第一外显子、第一内含子、第二外显子、第二内含子、第三外显子、第三内含子、第四外显子、第四内含子、第五外显子、第五内含子或其组合中或附近。
35.权利要求30-34中任一项的方法，其中所述缺失是1 kb或更少的缺失。
36.权利要求18-19和30中任一项的方法，其中将所述Cas9或Cpf1 mRNA、gRNA和供体模板各自配制成分开的脂质纳米颗粒或全部共配制成脂质纳米颗粒。
37.权利要求18-19和30中任一项的方法，其中将所述Cas9或Cpf1 mRNA、gRNA和供体模板各自配制成分开的腺相关病毒(AAV)载体或全部共配制成AAV载体。
38.权利要求18-19和30中任一项的方法，其中将所述Cas9或Cpf1 mRNA配制成脂质纳米颗粒，并且将所述gRNA和供体模板两者通过AAV载体递送至细胞。
39.权利要求18-19和30中任一项的方法，其中将所述Cas9或Cpf1 mRNA配制成脂质纳米颗粒，并且将所述gRNA通过电穿孔递送至细胞，并且将所述供体模板通过AAV载体递送至细胞。
40.权利要求37-39的方法，其中所述AAV载体是自失活的AAV载体。
41.前述权利要求中任一项的方法，其中所述RHO基因位于染色体3：129,528,640-129,535,169 (基因组参考协会 – GRCh38/hg38)上。
42.权利要求2或4-41中任一项的方法，其中RHO蛋白活性与野生型或正常的RHO蛋白活性相比得到恢复。
43.权利要求14的方法，其中所述多核苷酸供体模板包含RHO的外显子1，且最多达5KB。
44.权利要求43的方法，其中所述多核苷酸供体模板通过AAV递送。
45.权利要求1-2的方法，其中所述人细胞是光感受器细胞或视网膜祖细胞。
46.权利要求3-44的方法，其中所述细胞是光感受器细胞或视网膜祖细胞。
47.一种或多种向导核糖核酸(gRNA)，其用于在来自具有色素性视网膜炎(RP)的患者的细胞中编辑视紫红质(RHO)基因中的P23H突变，所述一种或多种gRNA包含间隔物序列，其选自序列表的SEQ ID NO:5287-5291、5319-5322和5358中的核酸序列。
48.权利要求47的一种或多种gRNA，其中所述一种或多种gRNA是一种或多种单分子向导RNA (sgRNA)。
49.权利要求47或48的一种或多种gRNA或sgRNA，其中所述一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA是一种或多种修饰的gRNA或一种或多种修饰的sgRNA。
50.权利要求47-49的一种或多种gRNA或sgRNA，其中所述细胞是光感受器细胞、视网膜祖细胞或诱导的多能干细胞(iPSC)。
51.治疗剂，其包含至少一种或多种用于编辑RHO基因中的P23H突变的gRNA，所述一种或多种gRNA包含间隔物序列，其选自序列表的SEQ ID NO:5287-5291、5319-5322和5358中的核酸序列。
52.权利要求51的治疗剂，其中所述一种或多种gRNA是一种或多种sgRNA。
53.权利要求51或52的治疗剂，其中所述一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA是一种或多种修饰的gRNA或一种或多种修饰的sgRNA。
54.用于治疗具有常染色体显性色素性视网膜炎(RP)的患者的治疗剂，其通过包括以下的方法形成：
引入一种或多种DNA核酸内切酶；
引入一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA用于编辑RHO基因中的P23H突变；
引入一种或多种供体模板；
其中所述一种或多种gRNA或sgRNA包含间隔物序列，其选自序列表的SEQ ID NO:5287-5291、5319-5322和5358中的核酸序列。
55.用于体内治疗具有色素性视网膜炎(RP)的患者的试剂盒，所述试剂盒包含：
用于编辑RHO基因中的P23H突变的一种或多种gRNA或sgRNA，其中所述一种或多种gRNA或sgRNA包含间隔物序列，其选自序列表的SEQ ID NO:5287-5291、5319-5322和5358中的核酸序列；
一种或多种DNA核酸内切酶；和
任选地，一种或多种供体模板。
56.权利要求55的试剂盒，其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4或Cpf1核酸内切酶；其同源物，其天然存在的分子的重组物，其密码子优化物或其修饰形式及其组合。
57.权利要求55-56中任一项的试剂盒，其包含一种或多种供体模板。
58.权利要求57的试剂盒，其中所述供体模板具有与3q22.1区域同源的臂。
59.权利要求57的试剂盒，其中所述供体模板具有与病理学变体P23H同源的臂。
60.单分子向导RNA (sgRNA)，其包含SEQ ID NO:5290的核酸序列。
61.单分子向导RNA (sgRNA)，其包含SEQ ID NO:5291的核酸序列。
62.单分子向导RNA (sgRNA)，其包含SEQ ID NO:5319的核酸序列。
63.单分子向导RNA (sgRNA)，其包含SEQ ID NO:5320的核酸序列。
64.单分子向导RNA (sgRNA)，其包含SEQ ID NO:5321的核酸序列。
65.单分子向导RNA (sgRNA)，其包含SEQ ID NO:5322的核酸序列。
66.单分子向导RNA (sgRNA)，其包含SEQ ID NO:5358的核酸序列。
67.单分子向导RNA (sgRNA)，其包含SEQ ID NO:5290和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列。
68.单分子向导RNA (sgRNA)，其包含SEQ ID NO:5291和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列。
69.单分子向导RNA (sgRNA)，其包含SEQ ID NO:5319和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列。
70.单分子向导RNA (sgRNA)，其包含SEQ ID NO:5320和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列。
71.单分子向导RNA (sgRNA)，其包含SEQ ID NO:5321和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列。
72.单分子向导RNA (sgRNA)，其包含SEQ ID NO:5322和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列。
73.单分子向导RNA (sgRNA)，其包含SEQ ID NO:5358和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的核酸序列。
74.用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5290的sgRNA。
75.用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5291的sgRNA。
76.用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5319的sgRNA。
77.用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5320的sgRNA。
78.用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5321的sgRNA。
79.用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5322的sgRNA。
80.用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5358的sgRNA。
81.用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5290和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的sgRNA。
82.用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5291和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的sgRNA。
83.用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5319和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的sgRNA。
84.用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5320和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的sgRNA。
85.用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5321和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的sgRNA。
86.用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5322和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的sgRNA。
87.用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:5358和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种的sgRNA。
88.用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5290的sgRNA。
89.用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5291的sgRNA。
90.用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5319的sgRNA。
91.用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5320的sgRNA。
92.用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5321的sgRNA。
93.用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5322的sgRNA。
94.用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含SEQ ID NO:5358的sgRNA。
95.用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用sgRNA，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO:5290和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
96.用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用sgRNA，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO:5291和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
97.用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用sgRNA，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO:5319和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
98.用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用sgRNA，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO:5320和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
99.用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用sgRNA，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO:5321和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
100.用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用sgRNA，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO:5322和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
101.用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用sgRNA，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO:5358和SEQ ID NO:5327-5338中的任一种。
102.自失活CRISPR-Cas系统，其包含：
第一区段，其包含编码诱导定点诱变的多肽的核苷酸序列的；
第二区段，其包含编码向导RNA (gRNA)或单分子向导RNA (sgRNA)的核苷酸序列，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO:5290；和
一个或多个第三区段，其包含自失活(SIN)位点；
其中所述gRNA或sgRNA与所述SIN位点基本上互补；
其中所述gRNA或sgRNA与基因组靶标序列基本上互补。
103.自失活CRISPR-Cas系统，其包含：
第一区段，其包含编码诱导定点诱变的多肽的核苷酸序列；
第二区段，其包含编码向导RNA (gRNA)或单分子向导RNA (sgRNA)的核苷酸序列，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO:5291；和
一个或多个第三区段，其包含自失活(SIN)位点；
其中所述gRNA或sgRNA与所述SIN位点基本上互补；
其中所述gRNA或sgRNA与基因组靶标序列基本上互补。
104.权利要求102或103中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述诱导定点诱变的多肽是金黄色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)或其任何变体。
105.权利要求102-104中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述诱导定点诱变的多肽是SaCas9或其任何变体；且其中所述SIN位点是位于SaCas9开放阅读框(ORF)的5'的5'SIN位点或位于SaCas9 ORF内定位的天然或嵌合插入的内含子内的3' SIN位点。
106.权利要求105的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述5' SIN位点包含SEQ ID NO:5300。
107.权利要求105-106中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述3' SIN位点包含SEQ ID NO:5280。
108.权利要求105的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述5' SIN位点包含SEQ ID NO:5301。
109.权利要求105和108中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述3' SIN位点包含SEQ ID NO:5281。
110.权利要求105-106和108中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述5' SIN位点位于SaCas9开放阅读框(ORF)的上游和SV40核定位信号(NLS)的下游。
111.权利要求105-106和108中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述5' SIN位点位于SaCas9开放阅读框(ORF)的上游和5'非翻译区(UTR)内的SV40核定位信号(NLS)的上游。
112.权利要求105、107和109中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述3' SIN位点位于所述SaCas9 ORF内定位的天然或嵌合插入的内含子内。
113.权利要求102-112中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述SIN位点包含原间隔物邻近基序(PAM)。
114.权利要求113的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述PAM是NNGRRT或其任何变体。
115.权利要求102-114中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述基因组靶标序列是视紫红质(RHO)基因中的P23H突变。
116.前述权利要求中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中包含编码诱导定点诱变的多肽的核苷酸序列的第一区段进一步包含起始密码子、终止密码子和聚(A)终止位点。
117.权利要求102-116中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第一区段和所述第三区段一起在第一载体中提供，且所述第二区段在第二载体中提供。
118.权利要求102-116中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第一区段、第二区段和第三区段一起在载体中提供。
119.权利要求117-118中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第三区段存在于所述第一或第二载体中的第一区段的5'位置处。
120.权利要求117-118中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第三区段存在于所述第一或第二载体中的第一区段的3'位置处。
121.权利要求117-118中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述一个或多个第三区段存在于第一或第二载体中的第一区段的5'和3'末端。
122.权利要求117的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第一载体包含SEQ ID NO:5341，且所述第二载体包含SEQ ID NO:5339。
123.权利要求117的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第一载体包含SEQ ID NO:5341，且所述第二载体包含SEQ ID NO:5340。
124.权利要求117的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第一载体包含SEQ ID NO:5342，且所述第二载体包含SEQ ID NO:5339。
125.权利要求117的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第一载体包含SEQ ID NO:5342，且所述第二载体包含SEQ ID NO:5340。
126.前述权利要求中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第三区段长度小于100个核苷酸。
127.权利要求126的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第三区段长度小于50个核苷酸。
128.前述权利要求中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中除了在至少一个位置中，所述gRNA或sgRNA与所述SIN位点的核苷酸序列完全互补。
129.前述权利要求中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中除了在至少两个位置中，所述gRNA或sgRNA与所述SIN位点的核苷酸序列完全互补。
130.前述权利要求中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中编码启动子的核酸序列可操作地连接至所述第一区段。
131.权利要求130的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述启动子是空间受限的启动子、在一个方向驱动gRNA或sgRNA且在相反取向驱动SaCas9的双向启动子或诱导型启动子。
132.权利要求131的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述空间受限的启动子选自：任何组织或细胞类型特异性启动子、肝细胞特异性启动子、神经元特异性启动子、脂肪细胞特异性启动子、心肌细胞特异性启动子、骨骼肌特异性启动子、肺祖细胞特异性启动子、光感受器特异性启动子和视网膜色素上皮(RPE)选择性启动子。
133.权利要求117-118中任一项的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述第一载体和所述第二载体是腺相关病毒(AAV)载体。
134.权利要求133的自失活CRISPR-Cas系统，其中所述腺相关病毒(AAV)载体是AAV5血清型衣壳载体。
135.自失活CRISPR-Cas系统，其包含：
第一区段，其包含编码SaCas9或其任何变体的核苷酸序列；
第二区段，其包含编码向导RNA (gRNA)或单分子向导RNA (sgRNA)的核苷酸序列；和
一个或多个第三区段，其包含自失活(SIN)位点；
其中所述gRNA或sgRNA与所述SIN位点基本上互补；
其中所述gRNA或sgRNA与基因组靶标序列基本上互补；
其中所述SIN位点包含选自SEQ ID NO:5313-5314的序列。
136.用于编辑RHO基因内的P23H突变的方法，所述方法包括施用权利要求102-135中任一项的自失活CRISPR-Cas系统。
137.用于治疗在RHO基因内具有P23H突变的患者的方法，所述方法包括施用权利要求102-135中任一项的自失活CRISPR-Cas系统。
138.遗传修饰的细胞，其包含权利要求102-135中任一项的自失活CRISPR-Cas系统。
139.权利要求138的遗传修饰的细胞，其中所述细胞选自：古细菌细胞、细菌细胞、真核细胞、真核单细胞生物、体细胞、生殖细胞、干细胞、植物细胞、藻类细胞、动物细胞、无脊椎动物细胞、脊椎动物细胞、鱼细胞、青蛙细胞、鸟类细胞、哺乳动物细胞、猪细胞、牛细胞、山羊细胞、绵羊细胞、啮齿动物细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、非人灵长类细胞和人细胞。
140.控制细胞中的Cas9表达的方法，其包括：使所述细胞与权利要求102-135中任一项的自失活CRISPR-Cas系统接触。
141.用于治疗具有常染色体显性色素性视网膜炎的患者的治疗剂，所述治疗剂包含权利要求102-135中任一项的自失活CRISPR-Cas系统。
142.用于体内治疗具有常染色体显性色素性视网膜炎的患者的试剂盒，所述试剂盒包含：
权利要求102-135的自失活CRISPR-Cas系统；和
任选地，一种或多种供体模板。
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