ES2905525T3 - Alteración de poblaciones microbianas y modificación de la microbiota - Google Patents

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Abstract

Un vector de ácido nucleico que comprende una matriz de CRISPR modificadora del hospedador (HM) modificada genéticamente para su uso en el tratamiento o prevención, en un sujeto humano o animal, de una afección o enfermedad mediada por células hospedadoras bacterianas mediante la alteración de la relación relativa de subpoblaciones de la primera y segunda bacteria en una población mixta de bacterias, en el que la segunda bacteria comprende células hospedadoras, en el que la población mixta está comprendida por el sujeto, en el que la segunda subpoblación consiste en una especie bacteriana diferente a la de la primera subpoblación, en el que cada célula hospedadora tiene una secuencia diana hospedadora y al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas endógena a la célula hospedadora, en el que la matriz CRISPR de modificación del hospedador (HM) modificada genéticamente comprende una secuencia espaciadora (espaciador HM) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, y el ARNcr-HM comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con la secuencia diana hospedadora; en el que el vector puede transformar la célula hospedadora, en el que el ARNcr-HM guía la nucleasa Cas a la diana para modificar la secuencia diana en la célula hospedadora, mediante lo cual se destruye la célula hospedadora o se reduce el crecimiento de la célula hospedadora, en el que el vector de ácido nucleico es un vector de plásmido comprendido por una bacteria portadora, o el vector es un vector de fagos.

Description

DESCRIPCIÓN
Alteración de poblaciones microbianas y modificación de la microbiota
Campo de la invención
La invención se refiere a procedimientos para inhibir el crecimiento de la población bacteriana, alterando la relación relativa de subpoblaciones de la primera y la segunda bacteria en una población mixta de bacterias, matrices de ácidos nucleicos para este fin y vectores que comprenden las matrices. La invención se refiere a sistemas modificados genéticamente para modificar el ácido nucleico de la célula hospedadora, los componentes de dichos sistemas y la aplicación de estos en la industria y la medicina. La invención es particularmente útil, por ejemplo, para el tratamiento de microbios, por ejemplo, para el uso ambiental, para alimentos y bebidas. La invención se refiere, entre otros, a procedimientos para controlar la corrosión influenciada por actividad microbiológica (MIC, por sus siglas en inglés) o bioincrustación de un sustrato o fluido influenciada microbiológicamente en un sistema industrial o doméstico. La invención también se refiere a fluidos y vectores tratados para su uso en los procedimientos. En algunas realizaciones, los procedimientos utilizan transferencia horizontal de matrices. La invención también proporciona matrices compuestas por elementos genéticos móviles (MGE, por sus siglas en inglés) para este fin y vectores que comprenden estas matrices.
Antecedentes de la invención
La inhibición del crecimiento de la población bacteriana y la alteración de las proporciones relativas de diferentes especies bacterianas en una mezcla se aplica en una amplia gama de industrias y entornos, por ejemplo, para el tratamiento de vías fluviales, agua potable u otros entornos ambientales. La aplicación también se encuentra en la alteración de bacterias en seres humanos y animales no humanos, por ejemplo, ganado, para reducir infecciones patógenas o para reequilibrar el intestino o la microbiota oral. Recientemente, ha habido interés en analizar las proporciones relativas de bacterias intestinales en humanos con diferentes perfiles de masa corporal u obesidad, o en investigar la posible influencia bacteriana en contextos de enfermedades como la enfermedad de Crohn.
Aunque abundan los mecanismos inmunitarios innatos bacterianos contra el fago, un sistema inmunitario adaptativo bacteriano ampliamente documentado es el sistema CRISPR/Cas. Los sistemas CRISPR/Cas modificados genéticamente se han utilizado para la modificación exacta del ácido nucleico en varios tipos de células procariotas y eucariotas, que van desde células bacterianas a células animales y vegetales (por ejemplo, véase Jiang W y col. (2013)). Los procariotas, tales como bacterias y arqueas, codifican sistemas inmunitarios adaptativos, llamados CRISPR/Cas (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas/asociadas a CRISPR), para proporcionar resistencia contra invasores móviles, tales como virus (por ejemplo, bacteriófagos) y plásmidos. Se hace referencia a Seed y col. (2013), que explica que los bacteriófagos (o fagos) son las entidades biológicas más abundantes en la tierra, y se estima que superan en número a sus presas bacterianas en diez veces. La amenaza constante de depredación de fagos ha llevado a la evolución de una amplia gama de mecanismos de inmunidad bacteriana que a su vez resultan en la evolución de diversas estrategias de evasión inmunitaria de fagos, lo que conduce a una carrera armamentista coevolutiva dinámica.
La inmunidad del hospedador se basa en la incorporación de secuencias de ADN del invasor en un locus de memoria (matriz de CRISPR), la formación de ARN guía de este locus y la degradación del ADN del invasor cognado (protoespaciador) situado adyacente a un motivo adyacente del protoespaciador (PAM, por sus siglas en inglés). Véase, por ejemplo, el documento W02010/075424. La matriz de CRISPR del hospedador comprende varios elementos: un líder (que incluye un promotor) inmediatamente 5' de una o más unidades de repetición-espaciadorrepetición donde las repeticiones son idénticas y los espaciadores difieren. Al adquirir la secuencia espaciadora a partir del virus invasor o ácido nucleico de plásmido, el sistema de defensa del hospedador es capaz de incorporar nuevos espaciadores en la matriz de CRISPR (cada espaciador flanqueado por repeticiones) para actuar como una memoria para abordar la invasión futura por el virus o plásmido. Se ha observado que los espaciadores adquiridos recientemente tienden a insertarse en la matriz del hospedador directamente después del líder.
Se hace referencia a Heler y col. (2014), que explica que los locus CRISPR y sus genes asociados (Cas) confieren a las bacterias y arqueas inmunidad adaptativa contra fagos y otros elementos genéticos invasores. Un requisito fundamental de cualquier sistema inmunológico es la capacidad de construir un recuerdo de infecciones pasadas para tratar de manera más eficiente las infecciones recurrentes. La característica adaptativa de los sistemas inmunológicos CRISPR-Cas depende de su capacidad para memorizar secuencias de ADN de moléculas invasoras e integrarlas entre las secuencias repetitivas de la matriz de CRISPR en forma de «espaciadores». La transcripción de un espaciador genera un ARN antisentido pequeño que es utilizado por las nucleasas Cas guiadas por ARN para escindir el ácido nucleico invasor con el fin de proteger la célula de la infección. La adquisición de nuevos espaciadores permite que el sistema inmunitario CRISPR-Cas se adapte rápidamente contra nuevas amenazas y, por lo tanto, se denomina «adaptación» (es decir, adquisición de espaciador de secuencia vectorial).
Seed y col. (2013) informaron un giro notable de los eventos, en los que se utilizó un sistema CRISPR/Cas codificado por fagos para contrarrestar una isla cromosómica inhibidora de fagos del hospedador bacteriano. Una infección lítica exitosa por el fago supuestamente dependía de la identidad de secuencia entre los espaciadores CRISPR y la isla cromosómica diana. En ausencia de dicho direccionamiento, el sistema CRISPR/Cas codificado por fagos podría adquirir nuevos espaciadores para evolucionar rápidamente y garantizar un direccionamiento eficaz de la isla cromosómica para restaurar la replicación de fagos. Bondy-Denomy y col. (2012) describen los primeros ejemplos observados de genes que median la inhibición de un sistema CRISPR/Cas. Se encontraron cinco genes «anti-CRISPR» distintos en los genomas de los bacteriófagos que infectan a Pseudomonas aeruginosa. La mutación del gen anti-CRISPR de un fago lo hizo incapaz de infectar bacterias con un sistema CRISPR/Cas funcional, y la adición del mismo gen al genoma de un fago dirigido a CRISPR/Cas le permitió evadir el sistema CRISPR/Cas.
Los ARN inmaduros se transcriben a partir de matrices CRISPR y posteriormente se maduran para formar ARNcr. Algunos sistemas CRISPR/Cas también comprenden secuencias que codifican ARN de transactivación (ARNtracr) que son capaces de hibridarse con repeticiones en los ARNcrinmaduros para formar pre-ARNcr, mediante lo cual el procesamiento adicional produce ARN maduros, o ARNcr. La arquitectura de los ARNc varía según el tipo (tipo I, II o III) del sistema CRISPR/Cas involucrado.
Los genes asociados a CRISPR (cas) a menudo están asociados con las matrices de CRISPR. La genómica comparativa extensa ha identificado muchos genes cas diferentes; un análisis inicial de 40 genomas bacterianos y arqueales sugirió que puede haber 45 familias de genes cas, con solo dos genes, cas1 y cas2, universalmente presentes. Se cree que Cas1 y Cas2 son esenciales para la adquisición de nuevos espaciadores en matrices, por lo que son importantes en los mecanismos de desarrollo de resistencia al ácido nucleico invasor a partir de fagos o plásmidos. Nunez y col. (2015) demostraron que el complejo Cas1-Cas2 es la maquinaria mínima que cataliza la adquisición de ADN espaciador y aparentemente explican la importancia de las repeticiones de CRISPR para proporcionar la secuencia y la especificidad estructural para la inmunidad adaptativa mediada por Cas1-Cas2.
Los sistemas CRISPR/Cas también incluyen secuencias que expresan nucleasas (por ejemplo, Cas9) para cortar motivos de reconocimiento de cognados (PAM) de ácidos nucleicos adyacentes al invasor en secuencias de nucleótidos del invasor. El reconocimiento de PAM de nucleasas es específico para cada tipo de nucleasa Cas. Los PAM en las secuencias del invasor pueden estar inmediatamente 3' de una secuencia protoespaciadora, con nucleasas que típicamente cortan 3-4 nucleótidos corriente arriba del (5' del) PAM. La conservación de la secuencia PAM difiere entre los sistemas CRISPR-Cas y parece estar evolutivamente vinculada a Cas1 y la secuencia líder. Fineran y col. (2014) observaron que los invasores pueden escapar de lainmunidad CRISPR-Cas tipo I-E en Escherichia coli K12 al realizar mutaciones puntuales en una región (la «región de la semilla») del protoespaciador o su PAM adyacente, pero los hospedadores restauran rápidamente la inmunidad al integrar nuevos espaciadores en un proceso de retroalimentación positiva que implica la adquisición («cebado»). Hasta la fecha, el PAM se ha caracterizado bien en una serie de sistemas tipo I y tipo II y se ha documentado el efecto de las mutaciones en el protoespaciador (véanse las referencias 5,14, 23, 46, 47 en Fineran y col. (2014)). Fineran y col. (2014) concluyeron que sus resultados demostraron el papel crítico del PAM y la secuencia de la semilla, según trabajos anteriores.
Semenova y col. (2011) investigaron el papel de la secuencia de la semilla y concluyeron que en el caso del sistema CRISPR/Cas del subtipo Escherichia coli, los requisitos para la coincidencia de ARNcr son estrictos para la región de la semilla inmediatamente después del PAM. Observaron que las mutaciones en la región de la semilla suprimen la inmunidad mediada por CRISPR/Cas al reducir la afinidad de unión del complejo Cascade guiado por ARNcral ADN del protoespaciador.
Las etapas de la inmunidad CRISPR para cada uno de los tres tipos principales de inmunidad adaptativa son las siguientes:
(1) la adquisición comienza por el reconocimiento del ADN invasor por Cas1 y Cas2 y la escisión de un protoespaciador;
(2) una secuencia protoespaciadora está ligada a la repetición directa adyacente a la secuencia líder; y
(3) la extensión de una sola hebra repara el CRISPR y duplica la repetición directa.
Las etapas de procesamiento e interferencia de ARNcr se producen de manera diferente en cada uno de los tres tipos principales de sistemas CRISPR. La transcripción CRISPR primaria es escindida por Cas para producir ARNcr. En los sistemas de tipo I, Cas6e/Cas6f se escinden en la unión de ARNcs y ARNcd formada por bucles de horquilla en la repetición directa. Los sistemas de tipo II utilizan un ARN transactivador (tracr) para formar ARNcd, que es escindido por Cas9 y RNasallI. Los sistemas de tipo III utilizan un homólogo de Cas6 que no requiere bucles de horquilla en la repetición directa para la escisión. En los sistemas de tipo II y tipo III, el recorte secundario se realiza en el extremo 5' o 3' para producir ARNcr maduros. Los ARNcr maduros se asocian con las proteínas Cas para formar complejos de interferencia. En los sistemas tipo I y tipo II, el apareamiento de bases entre el ARNcr y el PAM provoca la degradación del ADN invasor. Los sistemas de tipo III no requieren un PAM para una degradación exitosa y en los sistemas de tipo III-A el emparejamiento de bases se produce entre el ARNcr y el ARNm en lugar del ADN, dirigido por los sistemas de tipo III-B.
Afirmaciones de la invención
La invención es como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 15, que incluyen las siguientes afirmaciones:
Un vector de ácido nucleico que comprende una matriz de CRISPR modificadora del hospedador (HM) modificada genéticamente para su uso en el tratamiento o prevención, en un sujeto humano o animal, de una afección o enfermedad mediada por células hospedadoras bacterianas mediante la alteración de la relación relativa de subpoblaciones de la primera y segunda bacteria en una población mixta de bacterias, en el que la segunda bacteria comprende células hospedadoras, en el que la población mixta está comprendida por el sujeto,
en el que la segunda subpoblación consiste en una especie bacteriana diferente a la de la primera subpoblación,
en el que cada célula hospedadora tiene una secuencia diana hospedadora y al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas endógena a la célula hospedadora,
en el que la matriz CRISPR de modificación del hospedador (HM) modificada genéticamente comprende una secuencia espaciadora (espaciador HM) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, y el ARNcr-HM comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con la secuencia diana hospedadora;
en el que el vector puede transformar la célula hospedadora,
en el que el ARNcr-HM guía la nucleasa Cas a la diana para modificar la secuencia diana en la célula hospedadora, mediante lo cual se destruye la célula hospedadora o se reduce el crecimiento de la célula hospedadora,
en el que el vector de ácido nucleico es un vector de plásmido comprendido por una bacteria portadora, o el vector es un vector de fagos.
Un vector de ácido nucleico que comprende una matriz de CRISPR modificadora del hospedador (HM) modificada genéticamente y una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas para el uso en el tratamiento o prevención, en un sujeto humano o animal, de una afección o enfermedad mediada por células hospedadoras bacterianas mediante la alteración de la relación relativa de subpoblaciones de la primera y segunda bacteria en una población mixta de bacterias, en el que la segunda bacteria comprende células hospedadoras, en el que la población mixta está comprendida por el sujeto,
en el que la segunda subpoblación consiste en una especie bacteriana diferente a la de la primera subpoblación,
en el que cada célula hospedadora tiene una secuencia diana hospedadora,
en el que el vector puede transformar la célula hospedadora, en el que la matriz CRISPR de modificación del hospedador (HM) modificada genéticamente comprende una secuencia espaciadora (espaciador HM) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, y el ARNcr-HM comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con la secuencia diana hospedadora,
en el que el ARNcr-HM guía la nucleasa Cas a la diana para modificar la secuencia diana en la célula hospedadora, mediante lo cual se destruye la célula hospedadora o se reduce el crecimiento de la célula hospedadora,
en el que el vector de ácido nucleico es un vector de plásmido comprendido por una bacteria portadora, o el vector es un vector de fagos.
El uso de un vector de ácido nucleico que comprende una matriz de CRISPR/Cas de modificación de hospedador (HM) modificada genéticamente para alterar la relación relativa de subpoblaciones de la primera y la segunda bacteria en una población mixta ex vivo de bacterias, donde la segunda bacteria comprende células hospedadoras,
en el que la segunda subpoblación consiste en una especie bacteriana diferente a la de la primera subpoblación,
en el que cada célula hospedadora tiene una secuencia diana hospedadora y al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas endógena a la célula hospedadora,
en el que la matriz CRISPR de modificación del hospedador (HM) modificada genéticamente comprende una secuencia espaciadora (espaciador HM) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, y el ARNcr-HM comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con la secuencia diana hospedadora;
en el que el vector puede transformar la célula hospedadora,
en el que el ARNcr-HM guía la nucleasa Cas a la diana para modificar la secuencia diana en la célula hospedadora, mediante lo cual se destruye la célula hospedadora o se reduce el crecimiento de la célula hospedadora,
en el que el vector de ácido nucleico es un vector de plásmido comprendido por una bacteria portadora, o el vector es un vector de fagos.
El uso de un vector de ácido nucleico que comprende una matriz de CRISPR/Cas de modificación de hospedador (HM) modificada genéticamente y una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas para alterar la relación relativa de subpoblaciones de la primera y la segunda bacteria en una población mixta ex vivo de bacterias, donde la segunda bacteria comprende células hospedadoras,
en el que la población mixta está comprendida por el sujeto,
en el que la segunda subpoblación consiste en una especie bacteriana diferente a la de la primera subpoblación, en el que cada célula hospedadora tiene una secuencia diana hospedadora,
en el que el vector puede transformar la célula hospedadora,
en el que la matriz CRISPR de modificación del hospedador (HM) modificada genéticamente comprende una secuencia espaciadora (espaciador HM) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, y el ARNcr-HM comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con la secuencia diana hospedadora,
en el que el ARNcr-HM guía la nucleasa Cas a la diana para modificar la secuencia diana en la célula hospedadora, mediante lo cual se destruye la célula hospedadora o se reduce el crecimiento de la célula hospedadora, en el que el vector de ácido nucleico es un vector de plásmido comprendido por una bacteria portadora, o el vector es un vector de fagos.
Cualquier parte de la descripción que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones 1-15 y estas afirmaciones no forman parte de la invención, pero sirven en la comprensión de la invención reivindicada.
Configuraciones descritas
En este documento se describen:
Primera configuración
Los inventores creen que han demostrado por primera vez la inhibición del crecimiento poblacional de una cepa bacteriana específica en un consorcio mixto de bacterias que se encuentran naturalmente juntas en la microbiota (microbiota humana, animal o ambiental) con una o más de las siguientes características:
Inhibición del crecimiento de la población por
• el direccionamiento de células de tipo salvaje;
• aprovechamiento de la actividad endógena de Cas de tipo salvaje;
• el direccionamiento de genes esenciales y resistentes a los antibióticos;
• en el que las dianas son secuencias de tipo salvaje.
Los inventores han demostrado esto en una población bacteriana mixta con las siguientes características:
• el direccionamiento de la inhibición del crecimiento bacteriano en una población mixta de especies de microbiota humana (como la microbiota intestinal);
• en la que la población comprende tres especies diferentes;
• que comprende el exterminio selectivo de una de esas especies y la conservación de las células de las otras especies;
• el direccionamiento de la inhibición del crecimiento celular en presencia de una otra especie filogenéticamente cercana, que se salva de dicha inhibición;
• el direccionamiento de la inhibición del crecimiento celular en una población mixta que comprende especies Firmicutes diana y especies no Firmicutes;
• el direccionamiento de la inhibición del crecimiento celular de una cepa específica de Firmicutes mientras se evita una especie diferente de Firmicutes en una población mixta;
• el direccionamiento de la inhibición del crecimiento celular de una cepa bacteriana grampositiva específica mientras se escatima una especie bacteriana grampositiva diferente en una población mixta;
• el direccionamiento de una especie bacteriana patógena (en humanos), escatimando al mismo tiempo una especie bacteriana intestinal humana comensal;
• el direccionamiento de una especie bacteriana patógena escatimando al mismo tiempo una especie bacteriana intestinal humana priobiótica;
• el direccionamiento de la inhibición del crecimiento celular en una población bacteriana mixta en una superficie;
• la consecución de al menos una inhibición de crecimiento de 10 veces de una especie bacteriana específica sola o cuando se mezcla con una pluralidad de otras especies bacterianas en un consorcio; y
• la consecución de al menos una inhibición de crecimiento 10 veces mayor de dos cepas diferentes de una especie bacteriana específica.
La capacidad de aprovechar la actividad endógena de Cas en células de tipo salvaje es muy útil para el tratamiento in situ de infecciones de células hospedadoras en organismos (humanos y animales, por ejemplo) y el medio ambiente. El tratamiento de poblaciones bacterianas de tipo salvaje (es decir, no modificadas o premanipuladas), tales como microbiota humana, animal o vegetal también se puede abordar mediante la invención. La capacidad de efectuar la inhibición selectiva del crecimiento en una población mixta es útil para abordar poblaciones bacterianas, tales como microbiota humana, animal o vegetal, o para abordar microbiomas ambientales. Esta característica también es útil para producir medicamentos (por ejemplo, trasplantes de células bacterianas para administración a un sujeto humano o animal para cualquier tratamiento o prevención descritos en esta invención; o para producir una composición herbicida o insecticida que comprende la población bacteriana del producto de la descripción), en los que la destrucción selectiva se puede utilizar para alterar selectivamente la relación de diferentes bacterias en una población mixta para producir una población bacteriana alterada que es el medicamento, herbicida o insecticida; o a partir de la cual se produce el medicamento, herbicida o insecitcida. Por ejemplo, el medicamento se puede trasplantar intranasalmente a un receptor humano o animal para efectuar dicho tratamiento o prevención.
En el Ejemplo de trabajo a continuación, la inhibición del crecimiento se abordó en una población bacteriana (una población de Firmicutes grampositiva) en una superficie sólida. Se logró una inhibición del crecimiento de la población >10 veces. El direccionamiento estaba dirigido a un gen de resistencia a antibióticos. La invención será útil para inhibir el crecimiento de bacterias resistentes a antibióticos, en el que la secuencia diana es una secuencia de un gen de resistencia a antibióticos. En un ejemplo, la coadministración de la secuencia de nucleótidos modificada con el antibiótico puede ser eficaz. Esto puede proporcionar un tratamiento o prevención más completa de la infección de células hospedadoras en sujetos humanos o animales y/o permitir la reducción de la dosis de antibiótico terapéuticamente eficaz para su administración a un ser humano o animal. Esto es útil en vista de la creciente preocupación con respecto a la sobreadministración de antibióticos y el desarrollo de resistencia en poblaciones humanas y animales. La invención también encuentra una aplicación ex vivo e in vitro para tratar un fluido, superficie, aparato o recipiente industrial o médico (por ejemplo, para alimentos, bienes de consumo, cosméticos, productos de salud personal, petróleo o producción de aceite); o para tratar una vía navegable, agua, una bebida, un producto alimenticio o un cosmético, en los que las células hospedadoras están comprendidas por o sobre el fluido, superficie, aparato, recipiente, vía navegable, agua, bebida, producto alimenticio o cosmético. La invención encuentra aplicación también en el control de corrosión, biopelículas y bioincrustación. La primera configuración proporciona los siguientes conceptos:
El uso de un sistema CRISPR/Cas de modificación del hospedador (HM) para alterar la relación relativa de subpoblaciones de la primera y la segunda bacteria en una población mixta de bacterias, y la segunda bacteria comprende células hospedadoras, y para cada célula hospedadora el sistemacomprende componentes según (i) a (iv):
(i) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas;
(ii) una secuencia diana de célula hospedadora y una matriz de CRISPR de modificación de hospedador (HM) modificada genéticamente que comprende una secuencia espaciadora (HM-espaciador) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, donde el ARNcr-HM comprende una secuencia que se hibrida con la secuencia diana de la célula hospedadora para guiar dicha Cas a la diana en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana;
(iii) una secuencia de ARNtracr opcional o una secuencia de ADN que expresa una secuencia de ARNtracr;
(iv) en el que dichos componentes del sistema se dividen entre la célula hospedadora y al menos un vector de ácido nucleico que transforma la célula hospedadora, mediante lo cual el ARNcr-HM guía a Cas a la diana para modificar el sistema CRISPR/Cas hospedador en la célula hospedadora; y
en el que la secuencia diana se modifica mediante Cas mediante la cual se destruye la célula hospedadora o se reduce el crecimiento de la célula hospedadora.
Un sistema CRISPR/Cas de modificación de hospedador (HM) para el uso de la reivindicación 1 para modificar una secuencia de nucleótidos diana de una célula hospedadora bacteriana, donde el sistema comprende componentes según (i) a (iv):
(i) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas;
(ii) una secuencia diana de célula hospedadora y una matriz de CRISPR de modificación de hospedador (HM) modificada genéticamente que comprende una secuencia espaciadora (HM-espaciador) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, donde el ARNcr-HM comprende una secuencia capaz de hibridarse con la secuencia diana de la célula hospedadora para guiar dicha Cas a la diana en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana;
(iii) una secuencia de ARNtracr opcional o una secuencia de ADN para expresar una secuencia de ARNtracr;
(iv) en el que dichos componentes del sistema se dividen entre la célula hospedadora y al menos un vector de ácido nucleico que puede transformar la célula hospedadora, mediante lo cual el ARNcr-HM guía a Cas a la diana para modificar el sistema CRISPR/Cas hospedador en la célula hospedadora.
Esto se ejemplifica por los Ejemplos de trabajo en esta invención donde se muestra la inhibición selectiva del crecimiento de células hospedadoras de al menos 10 veces en una población de células mezcladas y no mezcladas. La mezcla simula una combinación de especies y cepas que se encuentran en la microbiota humana.
El uso de la actividad de nucleasa Cas endógena de tipo salvaje de una población de células hospedadoras bacterianas para inhibir el crecimiento de la población, en el que cada célula hospedadora tiene un sistema CRISPR/Cas endógeno que tiene actividad de nucleasa Cas de tipo salvaje, y el uso comprende transformar las células hospedadoras de la población, en el que cada célula hospedadora transformada se transforma con una secuencia de nucleótidos modificada para proporcionar
ARNc de modificación del hospedador (HM) o ARN guía (ARNg) en la célula hospedadora, y el ARNc-HM o ARNg comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con una secuencia protoespaciadora diana de la célula hospedadora para guiar la Cas endógena a la diana, en la que el ARNc o ARNg es cognado con una nucleasa Cas endógena de la célula hospedadora que tiene dicha actividad de nucleasa de tipo salvaje y se inhibe tras la transformación del crecimiento de las células hospedadoras de la población.
El uso (opcionalmente, el uso es según el uso del párrafo inmediatamente anterior) de un sistema CRISPR/Cas modificador de hospedador (HM) para matar o reducir el crecimiento de células hospedadoras bacterianas, para cada célula hospedadora el sistema comprende componentes según (i) a (iv):
(i) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas;
(ii) una matriz de CRISPR de modificación de hospedador (HM) modificada genéticamente que comprende una secuencia espaciadora (HM-espaciador) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, donde el ARNcr-HM comprende una secuencia que se hibrida con una secuencia diana de célula hospedadora para guiar dicha Cas a la diana en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana;
(iii) una secuencia de ARNtracr opcional o una secuencia de ADN que expresa una secuencia de ARNtracr;
(iv) en el que dichos componentes del sistema se dividen entre la célula hospedadora y al menos un vector de ácido nucleico que transforma la célula hospedadora, mediante lo cual el ARNcr-HM guía Cas a la diana para modificar la secuencia diana en la célula hospedadora;
en el que la nucleasa Cas es endógena a la célula hospedadora; y en el que la secuencia diana es modificada por Cas mediante lo cual la célula hospedadora es destruida o el crecimiento de la célula hospedadora es reducido.
Por lo tanto, el ARNc-HM es capaz de hibridarse con la secuencia diana de la célula hospedadora para guiar dicha Cas a la diana en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana.
En una alternativa, el ARNcr-HM y el ARNtracr están comprendidos por un único ARN guía (ARNg).
Al aprovechar la nucleasa Cas endógena, las realizaciones de la invención utilizan actividad de nucleasa Cas endógena (es decir, sin necesidad de modificación genética previa de la célula hospedadora para activar o mejorar la actividad de nucleasa). Por lo tanto, en un ejemplo, la nucleasa Cas está codificada por un gen de tipo salvaje de la célula hospedadora. En un ejemplo, la nucleasa es activa para lograr la destrucción celular o inhibición del crecimiento sin inactivar una nucleasa Cas endógena (o gen de nucleasa Cas) represora en la célula hospedadora. Por lo tanto, la invención puede dirigirse a poblaciones bacterianas de tipo salvaje sin necesidad de manipulación previa para provocar una destrucción celular o reducción del crecimiento mediada por Cas eficaz. Por lo tanto, la población puede exponerse al ARNc cuando la población se encuentra en su entorno de tipo salvaje (tal como una vía fluvial o comprendida por un microbioma humano o animal).
En un ejemplo, las primeras bacterias son células Bacteroidetes (por ejemplo, Bacteroides). En un ejemplo, las segundas bacterias son células Firmicutes. El procedimiento se utiliza, por ejemplo, para alterar las relaciones en una población de microbiota intestinal (por ejemplo, ex vivo o in vivo), que es, por ejemplo, para tratar o prevenir el aumento de la masa corporal u obesidad (por ejemplo, en el que las primeras bacterias son células Firmicutes).
La primera configuración también proporciona: Un procedimiento para alterar la relación relativa de subpoblaciones de la primera y la segunda bacteria en una población mixta de bacterias que comprende dichas subpoblaciones, en el que las primeras bacterias son células hospedadoras (por ejemplo, células Bacteroidetes) infectadas por un fago y las segundas bacterias no están infectadas por dicho fago (o bacterias no Bacteroidetes), y el procedimiento comprende combinar la población mixta con una pluralidad de vectores en una o más etapas para la introducción de ácido nucleico vectorial en las células hospedadoras y permitir el crecimiento bacteriano en la población mixta, en el que las proporciones relativas de dichas primeras y segundas bacterias se alteran;
en el que cada vector comprende una matriz CRISPR de modificación de fagos (PM) modificada genéticamente para su introducción en una célula hospedadora infectada con fagos para modificar una secuencia de nucleótidos diana de dicho fago en la célula,
(a) en el que la matriz de PM-CRISPR comprende una o más secuencias para la expresión de un ARNcr-PM y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en una célula hospedadora infectada con fagos; y
(b) en el que el ARNcr-PM es capaz de hibridarse con la secuencia diana de fagos para guiar Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora infectada para modificar la secuencia diana.
Segunda configuración:
Un sistema CRISPR/Cas de modificación de hospedador (HM) para modificar una secuencia de nucleótidos diana de una célula hospedadora (por ejemplo, para el uso de la primera configuración), donde el sistema comprende componentes según (i) a (iv):
(i) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas;
(ii) una matriz CRISPR de modificación de hospedador (HM) modificada genéticamente que comprende una secuencia espaciadora (espaciador HM) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, el ARNcr-HM que comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con una secuencia diana hospedadora para guiar dicha Cas a la diana en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana;
(iii) una secuencia de ARNtracr opcional o una secuencia de ADN para expresar una secuencia de ARNtracr;
(iv) en el que dichos componentes del sistema se dividen entre la célula hospedadora y al menos un vector de ácido nucleico que puede transformar la célula hospedadora, mediante lo cual el ARNcr-HM guía Cas a la diana para modificar la secuencia diana en la célula hospedadora;
en el que opcionalmente el componente (i) es endógeno a la célula hospedadora.
La segunda configuración también proporciona: Una matriz CRISPR de modificación de fagos (PM) diseñada para el uso en el procedimiento de la primera configuración para modificar el genoma de dicho fago,
(a) en el que la matriz de PM-CRISPR comprende una o más secuencias para la expresión de un ARNcr-PM y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en una célula hospedadora infectada con fagos; y
(b) en la que el ARNcr-PM es capaz de hibridarse con una secuencia diana del genoma del fago para guiar a Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora infectada para modificar la secuencia diana.
En un ejemplo, el fago es un fago Bacteroidetes (por ejemplo, Bacteroides), por ejemplo, crAssphage.
En un ejemplo, la matriz comprende repeticiones de CRISPR que son funcionales con un sistema CRISPR/Cas de célula hospedadora. Esto es beneficioso para aumentar la selectividad de la matriz para la célula deseada en una mezcla bacteriana. Esto también simplifica la producción de la matriz y los vectores que contienen la matriz de la invención, ya que puede no ser necesario incluir secuenos de nucleótidos voluminosos que codifican una o más proteínas Cas (y/o ARNtracr) necesarias para el funcionamiento de la matriz en la célula hospedadora. En una alternativa, la matriz se proporciona con una secuencia de codificación de Cas9 cognada y opcionalmente una secuencia de codificación de ARNtracr cognada.
Tercera configuración:
Un vector de ácido nucleico modificado genéticamente para modificar una célula hospedadora bacteriana que comprende un sistema CRISPR/Cas endógeno, y el vector
(a) comprende secuencias de ácido nucleico para expresar una pluralidad de ARNcr diferentes (por ejemplo, ARN guía simple, es decir, ARNg) para su uso en un uso de la invención o un sistema CRISPR/Cas según la descripción; y
(b) carece de una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas,
en el que uno de dichos ARNcr es capaz de hibridarse con una primera secuencia de ácido nucleico en dicha célula hospedadora; y un segundo de dichos ARNcr es capaz de hibridarse con una segunda secuencia de ácido nucleico en dicha célula hospedadora, en el que dicha segunda secuencia es diferente de dicha primera secuencia; y (c) la primera secuencia está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos (o ARN del mismo); opcionalmente en el que los genes son diferentes;
(d) la primera secuencia está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen esencial o de virulencia (o ARN del mismo);
(e) la primera secuencia está comprendida por un gen esencial (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen esencial o de virulencia (o ARN del msimo); o
(f) la primera secuencia está comprendida por un gen de virulencia (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen esencial o de virulencia (o ARN del mismo).
La tercera configuración también proporciona: Un vector de ácido nucleico para el uso en el procedimiento de la invención, donde el vector comprende una matriz CRISPR de la invención.
Cuarta configuración:
Un vector de ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido, virus, fago o fagémido) que comprende una matriz CRISPR modificada genéticamente para modificar una secuencia diana del genoma de una célula bacteriana hospedadora (por ejemplo, célula bacteriana patógena, tal como se describió anteriormente) o el genoma de un virus (por ejemplo, fago) en una célula hospedadora,
(a) en el que la matriz CRISPR comprende una o más secuencias para la expresión de un ARNcr (por ejemplo, proporcionado como un ARNg) y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en la célula hospedadora; (b) en el que el ARNcr es capaz de hibridarse con la secuencia diana para guiar Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana;
(c) en el que la matriz está compuesta por un transposón que tiene capacidad de transferencia horizontal entre primeras y segundas células bacterianas de diferentes especies.
Quinta configuración:
Un vector de ácido nucleico de CRISPR modificado genéticamente que comprende o consiste en un elemento genético móvil (MGE), en el que el MGE comprende un origen de transferencia (oriT) y una matriz de CRISPR para modificar una secuencia diana del genoma de una célula hospedadora (por ejemplo, célula bacteriana patógena) o el genoma de un virus (por ejemplo, profago) en una célula hospedadora,
(a) en el que la matriz de CRISPR comprende una o más secuencias para la expresión de un ARNcr y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en la célula hospedadora;
(b) en el que el ARNcr es capaz de hibridarse con la secuencia diana para guiar Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana;
(c) en el que el vector tiene capacidad de transferencia entre (i) la primera y segunda posición de ácido nucleico de una primera célula hospedadora, en el que cada posición es una posición en un cromosoma o un plásmido y la secuencia diana está comprendida por la célula hospedadora, o (ii) la primera y segunda célula hospedadora, en el que la secuencia diana está comprendida por la primera y/o segunda célula hospedadora.
Sexta configuración:
Un procedimiento para controlar la corrosión influenciada por actividad microbiológica (MIC) o bioincrustación de un sustrato en un sistema industrial o doméstico, en el que una superficie del sustrato está en contacto con una población de primeras células hospedadoras de una primera especie microbiana que media la MIC o bioincrustación del sustrato, y el procedimiento comprende
(i) poner en contacto la población con una pluralidad de vectores que son capaces de transformar o transducir las células, en el que cada vector comprende una matriz de CRISPR mediante el cual se introducen matrices de CRISPR en las células hospedadoras, en el que
(a) cada matriz de CRISPR comprende una o más secuencias de nucleótidos para la expresión de un ARNcr y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en una célula hospedadora; y
(b) cada ARNcr es capaz de hibridarse con una secuencia diana de una célula hospedadora para guiar Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana (por ejemplo, para cortar la secuencia diana); la secuencia diana es una secuencia génica para mediar la viabilidad de la célula hospedadora; y
(ii) permitir la expresión de dichos ARNc en presencia de Cas en células hospedadoras, modificando así las secuencias diana en células hospedadoras, lo que da como resultado la reducción de la viabilidad de la célula hospedadora y el control de MIC o bioincrustación de dicho sustrato.
En otra realización, se proporciona:
Un procedimiento para controlar la corrosión influenciada microbiológicamente (MIC) o bioincrustación de un sustrato comprendido por un equipo de recuperación, procesamiento, almacenamiento o transporte de petróleo, gas o petroquímicos crudos, en el que una superficie del sustrato está en contacto con una población de primeras células hospedadoras, en el que las primeras células hospedadoras son bacterias reductoras de azufre o sulfato (SRB), bacterias productoras de sustancia polimérica extracelular (EPSB), bacterias productoras de ácido (APB), bacterias oxidantes de azufre o sulfuro (SOB), bacterias oxidantes de hierro (IOB), bacterias oxidantes de manganeso (MOB), bacterias productoras de amoníaco (AmPB) o bacterias productoras de acetato (AcPB) de una primera especie que media la MIC o bioincrustación del sustrato, en el que la superficie y la población celular están en contacto con un líquido seleccionado de entre agua de mar, agua dulce, un líquido de fracturación o en un pozo, en el que el procedimiento comprende
(i) poner en contacto la población celular con vectores mezclando el líquido con una pluralidad de vectores que son capaces de transformar o transducir las primeras células hospedadoras, en el que cada vector comprende una matriz de CRISPR mediante el cual se introducen matrices de CRISPR en las células hospedadoras, en el que
(a) cada matriz de CRISPR comprende una o más secuencias para la expresión de un ARNcr y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en una célula hospedadora;
(b) cada ARNcr es capaz de hibridarse con una secuencia diana de una célula hospedadora para guiar Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana (por ejemplo, para cortar la secuencia diana); la secuencia diana es una secuencia génica para mediar la viabilidad de la célula hospedadora;
(c) en el que cada secuencia de (a) comprende una secuencia R1 -S1 -R1' para la expresión y producción del ARNcr respectivo en una primera célula hospedadora, en el que R1 es una primera repetición de CRISPR, R1' es una segunda repetición de CRISPR y R1 o R1' es opcional; y S1 es un primer espaciador de CRISPR que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es en un 80 % o más idéntica a una secuencia diana de dicha primera célula hospedadora y
(ii) permitir la expresión de dichos ARNc en presencia de Cas en células hospedadoras, modificando así las secuencias diana en células hospedadoras, lo que da como resultado la reducción de la viabilidad de la célula hospedadora y el control de MIC o bioincrustación de dicho sustrato.
Otras realizaciones proporcionan:
Un vector para el uso en el procedimiento, en el que las primeras células son células reductoras de sulfato (SRB), por ejemplo, células Desulfovibrio o Desulfotomaculum, el vector comprende una o más matrices de CRISPR para dirigirse a la SRB, en el que cada matriz es como se define en (a)-(c).
En otra realización, se proporciona: Un procedimiento para controlar la bioincrustación microbiana de un fluido en un sistema industrial o doméstico, en el que el fluido comprende una población de primeras células hospedadoras de una primera especie microbiana que media dicha bioincrustación, en el que el procedimiento comprende
(i) poner en contacto la población con una pluralidad de vectores que son capaces de transformar o transducir las células, en el que cada vector comprende una matriz de CRISPR mediante el cual se introducen matrices de CRISPR en las células hospedadoras, en el que
(a) cada matriz de CRISPR comprende una o más secuencias de nucleótidos para la expresión de un ARNcr y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en una célula hospedadora; y
(b) cada ARNcr es capaz de hibridarse con una secuencia diana de una célula hospedadora para guiar Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana (por ejemplo, para cortar la secuencia diana); la secuencia diana es una secuencia génica para mediar la viabilidad de la célula hospedadora; y (ii) permitir la expresión de dichos ARNc en presencia de Cas en células hospedadoras, modificando así las secuencias diana en células hospedadoras, lo que da como resultado la reducción de la viabilidad de la célula hospedadora y el control de dicha bioincrustación.
Por ejemplo, se proporciona: Un procedimiento para controlar la bioincrustación bacteriana en las aguas de lastre de un buque o embarcación, en el que el agua comprende una población de primeras células hospedadoras de una primera especie microbiana que media dicha bioincrustación, y el procedimiento comprende
(i) poner en contacto la población con una pluralidad de vectores que son capaces de transformar o transducir las células, en el que cada vector comprende una matriz de CRISPR mediante el cual se introducen matrices de CRISPR en las células hospedadoras, en el que
(a) cada matriz de CRISPR comprende una o más secuencias para la expresión de un ARNcr y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en una célula hospedadora; y
(b) cada ARNcr es capaz de hibridarse con una secuencia diana de una célula hospedadora para guiar Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana (por ejemplo, para cortar la secuencia diana); la secuencia diana es una secuencia génica para mediar la viabilidad de la célula hospedadora; y (ii) permitir la expresión de dichos ARNc en presencia de Cas en células hospedadoras, modificando así las secuencias diana en células hospedadoras, lo que da como resultado la reducción de la viabilidad de la célula hospedadora y el control de dicha bioincrustación.
Otras realizaciones proporcionan: Aguas de mar de lastre (por ejemplo, una muestra de agua de mar o agua de mar en un recipiente) que comprende matrices de CRISPR, en el que el agua de lastre se obtiene u puede obtenerse mediante el procedimiento. Un buque, embarcación, contenedor marítimo o plataforma que comprende las aguas de mar de lastre. Un vector para uso en el procedimiento, en el que las primeras células son cólera (por ejemplo, vibrio, por ejemplo, O1 o O139), células sp de E coli o Enterococci, en el que el vector comprende uno o más matrices de CRISPR para dirigirse a las células, en el que cada matriz es tal como se define en (a) y (b) del procedimiento. La invención también proporciona vectores y matrices de CRISPR adecuados para uso en esta sexta configuración o para otras aplicaciones, tales como para uso médico, o para el tratamiento de alimentos o bebidas. A tal fin, se proporciona lo siguiente: Un vector que comprende una matriz de CRISPR para su introducción en una célula hospedadora bacteriana, en el que la bacteria es capaz de transmisión por agua, en el que
(a) la matriz de CRISPR comprende una secuencia para la expresión de un ARNcr y un promotor para la transcripción de la secuencia en una célula hospedadora;
(b) el ARNcr es capaz de hibridarse con una secuencia diana de célula hospedadora para guiar un Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana (por ejemplo, para cortar la secuencia diana); la secuencia diana es una secuencia de nucleótidos para mediar la viabilidad de la célula hospedadora; (c) en el que la secuencia de (a) comprende una secuencia R1-S1-R1' para la expresión y producción del ARNcr, en el que R1 es una primera repetición de CRISPR, R1' es una segunda repetición de CRISPR, y R1 o R1' es opcional; y S1 es un primer espaciador de CRISPR que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es en un 80 % o más idéntica a la secuencia diana de la célula hospedadora.
También se proporcionan: Una composición de tratamiento de agua o alimentos que comprende una pluralidad de dichos vectores. Un medicamento para el tratamiento o la prevención de una infección bacteriana (por ejemplo, una infección por Vibrio cholerae) en un ser humano, donde el medicamento comprende una pluralidad de dichos vectores. La descripción también proporciona poblaciones bacterianas, composiciones, productos alimenticios y bebidas. Por ejemplo, el producto alimenticio o bebida es un producto lácteo.
Séptima configuración:
En un primer aspecto:
Un procedimiento de modificación de un gen expresable que codifica una primera Cas, donde el procedimiento comprende
(a) combinar un ARN guía (ARN1g) con el gen Cas en presencia del primer Cas que se expresa a partir de dicho gen; y
(b) permitir que ARN1g se hibride con una secuencia de dicho gen Cas (por ejemplo, un promotor o una primera secuencia de ADN que codifica Cas del mismo) y para guiar la primera Cas al gen, mediante lo cual la Cas modifica el gen Cas.
Un primer vector de ácido nucleico o combinación de vectores, por ejemplo, para el uso en el procedimiento, en el que (a) el primer vector o un vector de dicha combinación comprende una secuencia de nucleótidos expresable que codifica un ARN guía (ARN1g, por ejemplo, un único ARNg) que es complementario a una secuencia protoespaciadora predeterminada (PS1 para guiar un primer Cas para modificar PS1 en un primer sitio (CS1), en el que PS1 es un PAM (P1) adyacente que es cognado con el primer Cas; o la secuencia expresable codifica un ARNcr que forma ARN1g con un ARNtracr; y
(b) PS1 y P1 son secuencias de un primer gen que codifica Cas expresable y PS1 es capaz de ser modificado en CS1 por el primer Cas.
Estos aspectos de la invención son útiles para regular la actividad de Cas, por ejemplo, en una célula o in vitro. La invención implica dirigirse a un gen que codifica Cas para restringir la actividad de Cas, lo cual es ventajoso para la regulación temporal de Cas. La invención también puede ser útil en entornos donde es deseable un aumento de la rigurosidad de la actividad de Cas, por ejemplo, para reducir las posibilidades de que Cas se corte fuera de la diana cuando se modifica el genoma de una célula. Las aplicaciones son, por ejemplo, en la modificación de células humanas, animales o vegetales donde los efectos fuera de la diana deben minimizarse o evitarse, por ejemplo, para la terapia génica o el direccionamiento génico de la célula o un tejido o un organismo que comprende la célula. Por ejemplo, se requiere una rigurosidad muy alta cuando se utiliza la modificación de Cas para realizar los cambios deseados en una célula humana (por ejemplo, célula iPS) que se va a administrar a un paciente para la terapia génica o para tratar o prevenir una enfermedad o afección en el ser humano. La descripción proporciona estas aplicaciones como parte de los procedimientos y productos de la invención.
La invención también aborda el problema de la capacidad de inserción restringida en vectores, particularmente en vectores virales.
Octava configuración:
Un vector de ácido nucleico que comprende más de 1,4 kb de secuencia de ADN exógeno que codifica componentes de un sistema CRISPR/Cas, en el que la secuencia comprende una matriz modificada o secuencia modificada (opcionalmente tal como se describe en la presente memoria) para expresar uno o más ARNcr o ARNg de HM o PM en células hospedadoras (cualquier célula en esta invención, por ejemplo, células hospedadoras humanas, animales o bacterianas o arqueales), en el que la matriz o secuencia modificada no comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una nucleasa Cas que es cognada con los ARNc o ARNg; opcionalmente en el que al menos 2, 3 o 4 ARNc o ARNg están codificados por el ADN exógeno.
Un vector de ácido nucleico que comprende más de 1,4 kb o más de 4,2 kb de secuencia de ADN exógeno, en el que el ADN exógeno codifica uno o más componentes de un sistema CRISPR/Cas y comprende una matriz o secuencia modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en esta invención) para expresar uno o más ARNcr-HM o ARNg en células hospedadoras, en el que la secuencia exógena está desprovista de una secuencia de nucleótidos que codifica una nucleasa Cas que es cognada con los ARNc o ARNg; opcionalmente en el que al menos 2 ARNc o ARNg diferentes están codificados por el ADN exógeno.
En esta invención, en cualquier configuración, por ejemplo, el o los ARNc son proporcionados por uno o más ARN guía individuales (ARNg), y en este caso, la «matriz de CRISPR» puede hacer referencia a una o más secuencias de nucleótidos expresables que codifican dicho o dichos ARNg. Por lo tanto, las secuencias pueden expresarse en células hospedadoras para expresar los ARNg dentro de las células.
La descripción se describe principalmente en términos de bacterias, pero también es aplicable mutatis mutandis a las arqueas.
Breve descripción de las figuras
FIGURA 1: Sistema inducible de xilosa.
FIGURA 2: Matriz ST1 -CRISPR.
FIGURA 3: Ensayo de mancha en agar TH de las cepas utilizadas en este trabajo. Todas las cepas se cultivaron en agar TH a 37 °C durante 20 horas. Se realizaron diluciones seriadas de cultivos nocturnos por duplicado para E.coli, L Lactis y S.mutans, y por triplicado para ambas cepas de S. thermophilus para contar colonias individuales.
FIGURA 4: Crecimiento selectivo de S. thermophilus, S. mutans, L. lactis y E. co lien diferentes condiciones de cultivo. La tetraciclina no se puede usar para cultivar selectivamente S. thermophilus LMD-9. Sin embargo, 3 g l-1 de PEA demostró cultivar selectivamente S. thermophilus LMD-9 mientras limitaba el crecimiento de E. coli.
FIGURA 5: Construcción de dos casetes de inducción de xilosa (central, derecha) basados en el operón en B. megaterium de tipo salvaje (izquierda). (Xie y col. 2013)
FIGURA 6: Caracterización del casete inducible en xilosa en Streptoccocus thermophilus LMD-9 con el plásmido pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha. Se puede observar una respuesta clara en fluorescencia con el aumento de la cantidad de xilosa.
FIGURA 7: Diseño d la matriz de CRISPR en pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+xyiA La matriz contiene 2 secuencias espaciadoras que se dirigen a genes de S. thermophilus bajo un promotor de xilosa inducible y un ARNtracr bajo un promotor P3A constitutivo fuerte.
FIGURA 8: Eficiencia de transformación de Streptoccocus thermophilus LMD-9 con el pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PIdh+xylA (izquierda) y con pBAV1 KT5-XylR-CRISPR-PXylA (derecha).
FIGURA 9: Un esquema del dispositivo CRISPR inducible por xilosa. Tras la inducción de xilosa, se expresa la matriz de CRISPR que se dirige tanto a pollll como a tetA en el genoma de S. thermophiles LMD-9. Junto con el ARNtracr expresado de forma constitutiva, se forma un complejo con Cas9. Este complejo introducirá una ruptura de doble hebra en los genes tetA y pollll en el genoma de S. thermophilus LMD-9, lo que resulta en una viabilidad celular limitada.
FIGURA 10: Inhibición del crecimiento de Streptoccocus thermophilus DSM 20617(T) con el plásmido pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PXylA (izquierda) o pBAV1KT5-XylR-CRISPR-Pldha+XylA (derecha). No inducido (panel superior) e inducido (panel inferior). Foto tomada después de 63H de incubación. Conteo de colonias en la esquina inferior izquierda (fila superior: >1000, >1000, fila inferior: 336, 113).
FIGURA 11: Árbol filogenético de máxima probabilidad de secuencias 16s de S. thermophilus, L. lactis y E. coli.
FIGURA 12: Muestra la inhibición selectiva del crecimiento de S thermophilus en un co-cultivo de E. coli, L. Iactis y S. thermophiles que albergan el plásmido pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA o el pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA. No se observa diferencia de crecimiento entre E. coli que alberga el plásmido pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA o el plásmido pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA (columna central). Sin embargo, S. thermophiles (cultivado selectivamente en agar Th complementado con 2,5 gl-1 GUISANTE, última columna) muestra una disminución en la eficiencia de transformación entre el plásmido pBAV1 KT5-XylR-CRISPR-PxylA (fuerte) o el plásmido pBAV1 KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA (débil) como esperábamos. Por lo tanto, demostramos una inhibición selectiva del crecimiento de la subpoblación de S thermophilus diana en la población mixta de células. Conteo de colonias en la esquina inferior izquierda (fila superior: >1000, >1000, 68, fila inferior: >1000, >1000, 32).
Descripción detallada
INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE LA POBLACIÓN MICROBIANA Y ALTERACIÓN DE LAS RELACIONES MICROBIANAS
La descripción se refiere a procedimientos, usos, sistemas, matrices, ARNc, ARNg y vectores para inhibir el crecimiento de la población bacteriana o alterar la relación relativa de subpoblaciones de la primera y la segunda bacteria en una población mixta de bacterias, por ejemplo, para alterar microbiomas humanos o animales, tal como para la alteración de la proporción de Bacteroidetes (por ejemplo, Bacteroides), Firmicutes y/o bacterias grampositivas o negativas en la microbiota de un ser humano. Véase, por ejemplo, la primera a la tercera configuración descrita en esta invención. La invención implica modificar una o más secuencias de nucleótidos diana de una célula bacteriana hospedadora, por ejemplo, una célula de Bacteroidetes o célula de Firmicutes.
Hubo una serie de estudios que señalan que los niveles respectivos de los dos filos intestinales principales, Bacteroidetes y Firmicutes, están vinculados a la obesidad, tanto en humanos como en ratones sin gérmenes. Los autores de los estudios deducen que el metabolismo de los carbohidratos es el factor importante. Observan que la microbiota de los individuos obesos está más enriquecida con bacterias del filo Firmicutes y menos con Bacteroidetes, y suponen que esta mezcla bacteriana puede ser más eficiente en la extracción de energía de una dieta dada que la microbiota de los individuos magros (que tienen las proporciones opuestas). En algunos estudios, encontraron que la abundancia relativa de Bacteroidetes aumenta a medida que los individuos obesos pierden peso y, además, que cuando la microbiota de ratones obesos se transfiere a ratones sin gérmenes, estos ratones ganan más grasa que un grupo de control que recibió microbiota de ratones magros. Véase, por ejemplo, Turnbaugh, P. J., R. E. Ley, M. A. Mahowald, V. Magrini, E. R. Mardis y J. I. Gordon. 2006, «An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest», Nature 444:1027-1131.
CONCEPTOS
En esta invención se describen los siguientes conceptos que implican un objetivo de célula hospedadora:
en un primer concepto, se proporciona el uso de un sistema CRISPR/Cas modificador de hospedador (HM) para destruir o reducir el crecimiento de células hospedadoras bacterianas, para cada célula hospedadora el sistema comprende componentes según (i) a (iv):
(i) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas;
(ii) una matriz de CRISPR de modificación de hospedador (HM) modificada genéticamente que comprende una secuencia espaciadora (HM-espaciador) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, donde el ARNcr-HM comprende una secuencia que se hibrida con una secuencia diana de célula hospedadora para guiar dicha Cas a la diana en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana;
(iii) una secuencia de ARNtracr opcional o una secuencia de ADN que expresa una secuencia de ARNtracr;
(iv) en el que dichos componentes del sistema se dividen entre la célula hospedadora y al menos un vector de ácido nucleico que transforma la célula hospedadora, mediante lo cual el ARNcr-HM guía Cas a la diana para modificar la secuencia diana en la célula hospedadora;
en el que la secuencia diana se modifica mediante Cas mediante la cual se destruye la célula hospedadora o se reduce el crecimiento de la célula hospedadora.
Alternativamente, el primer concepto proporciona:
El uso de un sistema CRISPR/Cas de modificación del hospedador (HM) para alterar la relación relativa de subpoblaciones de la primera y la segunda bacteria en una población mixta de bacterias, y la segunda bacteria comprende células hospedadoras, y para cada célula hospedadora el sistema comprende componentes según (i) a (iv):
(i) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas;
(ii) una matriz de CRISPR de modificación de hospedador (HM) modificada genéticamente que comprende una secuencia espaciadora (HM-espaciador) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, donde el ARNcr-HM comprende una secuencia que se hibrida con una secuencia diana de célula hospedadora para guiar dicha Cas a la diana en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana;
(iii) una secuencia de ARNtracr opcional o una secuencia de ADN que expresa una secuencia de ARNtracr;
(iv) en el que dichos componentes del sistema se dividen entre la célula hospedadora y al menos un vector de ácido nucleico que transforma la célula hospedadora, mediante lo cual el ARNcr-HM guía Cas a la diana para modificar la secuencia diana en la célula hospedadora;
en el que opcionalmente la nucleasa Cas es endógena a la célula hospedadora; y
en el que la secuencia diana se modifica mediante Cas mediante la cual se destruye la célula hospedadora o se reduce el crecimiento de la célula hospedadora.
El primer concepto también establece: Un procedimiento para alterar la relación relativa de subpoblaciones de la primera y la segunda bacteria en una población mixta de bacterias, en el que la segunda bacteria comprende células hospedadoras y el procedimiento comprende combinar la población mixta con un sistema CRISPR/Cas de modificación del hospedador (HM) mediante el cual se eliminan las segundas células hospedadoras de bacterias o se reduce el crecimiento de dichas células, alterando así dicha relación, en el que para cada célula hospedadora el sistema comprende componentes según (i) a (iv):
(i) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas;
(ii) una matriz de CRISPR de modificación de hospedador (HM) modificada genéticamente que comprende una secuencia espaciadora (HM-espaciador) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, donde el ARNcr-HM comprende una secuencia que se hibrida con una secuencia diana de célula hospedadora para guiar dicha Cas a la diana en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana;
(iii) una secuencia de ARNtracr opcional o una secuencia de ADN que expresa una secuencia de ARNtracr;
(iv) en el que dichos componentes del sistema se dividen entre la célula hospedadora y al menos un vector de ácido nucleico que transforma la célula hospedadora, mediante lo cual el ARNcr-HM guía Cas a la diana para modificar la secuencia diana en la célula hospedadora;
en el que opcionalmente la nucleasa Cas es endógena a la célula hospedadora; y
en el que la secuencia diana se modifica mediante Cas mediante la cual se destruye la célula hospedadora o se reduce el crecimiento de la célula hospedadora.
El primer concepto también establece:
El uso de un sistema CRISPR/Cas de modificación de hospedador (HM) para alterar la relación relativa de subpoblaciones de la primera y la segunda bacteria en una población mixta de bacterias, en el que la segunda bacteria comprende una pluralidad de células hospedadoras, y cada una comprende una secuencia protoespaciadora diana, y para cada célula hospedadora el sistema comprende los componentes (ii) y (iii) definidos anteriormente, en el que el sistema comprende además al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una nucleasa Cas; en el que dicho componente (ii) y dicha secuencia que codifica Cas están comprendidos por al menos un vector de ácido nucleico que transforma la célula hospedadora, mediante lo cual el ARNcr-HM codificado por (i) guía Cas a la diana para modificar la secuencia diana en la célula hospedadora;
en el que la secuencia diana se modifica mediante Cas mediante la cual se destruye la célula hospedadora o se reduce el crecimiento de la célula hospedadora.
En una realización, el crecimiento de las primeras bacterias no se inhibe; o la inhibición de crecimiento de dichas células hospedadoras es al menos 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 50x, 100x o 1000x la inhibición de crecimiento de las primeras células. La inhibición del crecimiento se puede calcular como una inhibición multiplicada o como un porcentaje de inhibición (como se describe en la presente memoria). En otro ejemplo, la inhibición se mide en una muestra de cultivo mediante un espectrofotómetro, en el que la absorbancia de la luz (por ejemplo, en OD600) se determina al inicio y al final de un período de tratamiento de ARNcr/ARNg predeterminado (ver la descripción de dicho período en esta invención cuando se determina la inhibición por veces o porcentaje). En un ejemplo, el aumento de la absorbancia (comparando la absorbancia al comienzo del período predeterminado con la absorbancia al final de ese período) para la muestra de célula hospedadora es menor que para la muestra de control (que no ha sido expuesta a dicho ARNc o ARNg), por ejemplo, el aumento para la primera es al menos 10, 100, 1000, 10000 o 100000 veces menor que para la segunda (por ejemplo, determinado como OD600). En un ejemplo, la determinación de la inhibición del crecimiento (es decir, el final del período predeterminado) se realiza en la fase de crecimiento exponencial medio de cada muestra (por ejemplo, 6-7 horas después del inicio del período predeterminado).
En un ejemplo, las células hospedadoras están comprendidas por una población de microbiota comprendida por un organismo o entorno (por ejemplo, una microbiota de vía acuática, microbiota de agua, microbiota intestinal humana o animal, microbiota de cavidad oral humana o animal, microbiota vaginal humana o animal, microbiota de piel o cabello humana o animal o microbiota de axila humana o animal), y la población comprende primeras bacterias que son simbióticas o comensales con el organismo o entorno y segundas bacterias que comprenden dichas células hospedadoras, en el que las células hospedadoras son perjudiciales (por ejemplo, patógenas) para el organismo o entorno. En una realización, la población es ex vivo.
La relación de la primera subpoblación de bacterias con respecto a la segunda subpoblación de bacterias aumenta.
El primer concepto también proporciona un uso para inhibir el crecimiento de la célula hospedadora tal como se describe adicionalmente más adelante.
Un segundo concepto se refiere a un sistema CRISPR/Cas de modificación de hospedador (HM) para modificar una secuencia de nucleótidos diana de una célula hospedadora (por ejemplo, para el uso del primer concepto), y el sistema comprende componentes según (i) a (iv):
(i) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas;
(ii) una matriz CRISPR de modificación de hospedador (HM) modificada genéticamente que comprende una secuencia espaciadora (espaciador HM) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, el ARNcr-HM que comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con una secuencia diana hospedadora para guiar dicha Cas a la diana en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana;
(iii) una secuencia de ARNtracr opcional o una secuencia de ADN para expresar una secuencia de ARNtracr;
(iv) en el que dichos componentes del sistema se dividen entre la célula hospedadora y al menos un vector de ácido nucleico que puede transformar la célula hospedadora, mediante lo cual el ARNcr-HM guía Cas a la diana para modificar la secuencia diana en la célula hospedadora;
en el que opcionalmente el componente (i) es endógeno a la célula hospedadora.
En una alternativa, el ARNcr-HM y el ARNtracr están comprendidos por un único ARN guía (ARNg).
Al aprovechar la nucleasa Cas endógena, las realizaciones de la invención utilizan actividad de nucleasa Cas endógena (es decir, sin necesidad de modificación genética previa de la célula hospedadora para activar o mejorar la actividad de nucleasa). Por lo tanto, en un ejemplo, la nucleasa Cas está codificada por un gen de tipo salvaje de la célula hospedadora. En un ejemplo, la nucleasa es activa para lograr la destrucción celular o la reducción del crecimiento sin inhibición de una nucleasa Cas endógena (o gen de nucleasa Cas) represora en la célula hospedadora. Por lo tanto, la invención puede dirigirse a poblaciones bacterianas de tipo salvaje sin necesidad de manipulación previa para provocar una destrucción celular o reducción del crecimiento mediada por Cas eficaz. Por lo tanto, la población puede exponerse al ARNc cuando la población se encuentra en su entorno de tipo salvaje (tal como una vía fluvial o comprendida por un microbioma humano o animal).
En un ejemplo, las segundas bacterias son células Bacteroidetes (por ejemplo, Bacteroides). En un ejemplo, las segundas bacterias son células Firmicutes. El uso, sistema o procedimiento se usa, por ejemplo, para alterar las relaciones en una población de microbiota intestinal (por ejemplo, ex vivo o in vivo), que es, por ejemplo, para tratar o prevenir el aumento de la masa corporal u obesidad (por ejemplo, en el que las segundas bacterias son células Firmicutes).
En un ejemplo, el uso, procedimiento, sistema, vector, secuencia de nucleótidos modificada, ARNc o ARNg es para reequilibrar de forma terapéutica o profiláctica la microbiota de un ser humano o animal no humano que comprende la población mixta, por ejemplo, para tratar o prevenir la obesidad, diabetes IBD, una afección del tracto Gl o una afección de la cavidad oral.
En un ejemplo, la microbiota mencionada en la presente es microbiota de un microbioma humano o animal (por ejemplo, microbioma de intestino, vaginal, cuero cabelludo, axila, torrente sanguíneo cutáneo, garganta o cavidad oral).
En un ejemplo, la microbiota mencionada en esta invención es una microbiota de axila y el uso, procedimiento, sistema, vector, secuencia de nucleótidos modificada, ARNc o ARNg es para prevenir o reducir el olor corporal de un ser humano.
En un ejemplo, la población de células hospedadoras o población mixta está albergada por una bebida o agua (por ejemplo, una vía de agua o agua potable) para consumo humano.
En un ejemplo, el uso, procedimiento, sistema, vector, secuencia de nucleótidos modificada, ARNc o ARNg es para reducir infecciones patógenas o para reequilibrar la microbiota intestinal u oral, por ejemplo, para tratar o prevenir la obesidad o enfermedad en un ser humano o animal. Por ejemplo, el uso, procedimiento, sistema, vector, secuencia de nucleótidos modificada, ARNc o ARNg es para eliminar bacterias de Clostridium dificile en una microbiota intestinal. En un ejemplo, las primeras bacterias son bacterias Bacteroides y las segundas bacterias son Firmicutes o bacterias patógenas, por ejemplo, bacterias intestinales. En un ejemplo, las células hospedadoras o la segunda bacteria son células Firmicutes, por ejemplo, seleccionadas de entre células Streptococcus (por ejemplo, thermophilus y/o pyogenes), Bacillus, Lactobacillus, Listeria, Clostridium, Heliobacteriumy Staphylococcus. En un ejemplo, la población mixta contiene subpoblaciones de Bacteroides y de la cepa 630 de C dificile resistente al metronidazol (MTZ), en el que las células del hospedador comprenden dichas células C dificile.
En un ejemplo, la población de células hospedadoras, la población mixta o el sistema está comprendido por una composición (por ejemplo, una bebida, enjuague bucal o alimento) para su administración a un ser humano o animal no humano para poblar y reequilibrar el intestino o la microbiota oral del mismo.
En un ejemplo, el producto del uso o procedimiento, o el sistema, vector, secuencia de nucleótidos modificada, ARNc o ARNg es para administración a un ser humano o animal no humano mediante administración por vía mucosa, intestinal, oral, intranasal, intrarrectal, intravaginal, ocular o bucal.
En un ejemplo de cualquier configuración de esta invención, la población mixta (antes de combinarse con la matriz, ARNg, ARNcr o secuencia modificada) es una muestra de una microbiota de un sujeto humano o animal, por ejemplo, un intestino o cualquier otra microbiota descrita en esta invención o una microbiota de cualquier microbioma descrito en esta invención.
En un ejemplo, en este caso el producto del uso de la invención es una población de microbiota modificada que es útil para un tratamiento o terapia de un sujeto humano o animal, tal como se describe en esta invención.
Un tercer concepto se refiere al sistema del segundo concepto, en el que el vector o vectores carecen de una secuencia que codifica la nucleasa Cas (por ejemplo, una Cas9).
Un cuarto concepto se refiere al uso, procedimiento o sistema de cualquier concepto anterior, en el que cada célula hospedadora es de una cepa o especie que se encuentra en la microbiota humana, opcionalmente en el que las células hospedadoras se mezclan con células de una cepa o especie diferente, en el que las diferentes células son Enterobacteriaceae o bacterias que son probióticas, comensales o simbióticas con humanos (por ejemplo, en el intestino humano. En un ejemplo, la célula hospedadora es una célula Firmicutes, por ejemplo, Streptococcus. Un quinto concepto se refiere al uso, procedimiento o sistema de cualquier concepto anterior para la alteración de la proporción de bacterias Bacteroidetes (por ejemplo, Bacteroides) en una población bacteriana mixta (por ejemplo, en un ser humano, tal como en la microbiota humana).
Un sexto concepto se refiere al uso, procedimiento o sistema del quinto concepto para aumentar la relación relativa de Bacteroidetes versus Firmicutes.
Un séptimo concepto se refiere al uso, procedimiento o sistema de cualquier concepto anterior, en el que dicha nucleasa Cas es proporcionada por un sistema CRISPR/Cas tipo II endógeno de la célula.
Un octavo concepto se refiere al uso, procedimiento o sistema de cualquier concepto anterior, en el que el componente (iii) es endógeno a la célula hospedadora.
Un noveno concepto se refiere al uso, procedimiento o sistema de cualquier concepto anterior, en el que la secuencia diana está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos, un gen de virulencia o un gen esencial de la célula hospedadora. Un décimo concepto se refiere al uso, procedimiento o sistema de cualquier concepto anterior, en el que la matriz está comprendida por una composición antibiótica, en el que la matriz está en combinación con un agente antibiótico.
Un décimo primer concepto se refiere al uso, procedimiento o sistema de cualquier concepto anterior, en el que alternativamente ARNcr-HM y ARNtracrestán comprendidos por un único ARN guía (ARNg), por ejemplo, proporcionado por el vector.
Un décimo segundo concepto se refiere al uso, procedimiento o sistema de cualquier concepto anterior, en el que la célula hospedadora comprende una cadena de ácido desoxirribonucleico con un extremo libre (ADNHM) que codifica una secuencia HM de interés y/o en el que el sistema comprende una secuencia que codifica el ADN-HM, en el que el ADN-HM comprende una secuencia o secuencias que son homólogas respectivamente a una secuencia o secuencias en o que flanquean la secuencia diana para insertar el ADN-HM en el genoma hospedador (por ejemplo, en un sitio cromosómico o episómico).
Un décimo tercer concepto se refiere a un vector de ácido nucleico modificado genéticamente para modificar una célula hospedadora bacteriana que comprende un sistema CRISPR/Cas endógeno, el vector
(a) comprende secuencias de ácidos nucleicos para expresar una pluralidad de ARNcr diferentes (por ejemplo, ARNg) para su uso en un sistema, procedimiento o uso de CRISPR/Cas según cualquier concepto anterior; y
(b) carece opcionalmente de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una nucleasa Cas,
en el que uno de dichos ARNcr es capaz de hibridarse con una primera secuencia de ácido nucleico en dicha célula hospedadora; y un segundo de dichos ARNcr es capaz de hibridarse con una segunda secuencia de ácido nucleico en dicha célula hospedadora, en el que dicha segunda secuencia es diferente de dicha primera secuencia; y (c) la primera secuencia está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos (o ARN del mismo); opcionalmente en el que los genes son diferentes;
(d) la primera secuencia está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen esencial o de virulencia (o ARN del mismo);
(e) la primera secuencia está comprendida por un gen esencial (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen esencial o de virulencia (o ARN del msimo); o
(f) la primera secuencia está comprendida por un gen de virulencia (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen esencial o de virulencia (o ARN del mismo).
Un décimo cuarto concepto se refiere al vector del décimo tercer concepto dentro de una célula hospedadora que comprende una o más Cas que son operativos con ARNc (por ejemplo, ARN guía simple) codificado por el vector. Un décimo quinto concepto se refiere al uso, procedimiento, sistema o vector de cualquier concepto anterior, en el que la matriz HM-CRISPR comprende múltiples copias del mismo espaciador.
Un décimo sexto concepto se refiere al uso, procedimiento, sistema o vector de cualquier concepto anterior, en el que el o los vectores comprenden una pluralidad de matrices HM-CRISPR.
Un décimo séptimo concepto se refiere al uso, procedimiento, sistema o vector de cualquier concepto anterior, en el que cada vector es un plásmido, cósmido, virus, un virión, fago, fagémido o profago.
Un décimo octavo concepto se refiere al uso, procedimiento, sistema o vector de cualquier concepto anterior, en el que el sistema o vector comprende dos, tres o más copias de secuencias de ácidos nucleicos que codifican ARNcr (por ejemplo, ARNg), en el que las copias comprenden la misma secuencia espaciadora para dirigirse a una secuencia de célula hospedadora (por ejemplo, una virulencia, resistencia o secuencia génica esencial).
Un décimo noveno concepto se refiere al uso, procedimiento, sistema o vector del décimo octavo concepto, en el que las copias se dividen entre dos o más matrices de CRISPR vectoriales.
Un vigésimo concepto se refiere a una célula hospedadora bacteriana que comprende un sistema o vector mencionado en cualquier concepto precedente.
Un vigésimo primer concepto se refiere al sistema, vector o célula de cualquiera de los conceptos segundo a vigésimo en combinación con un agente antibiótico (por ejemplo, un antibiótico betalactámico).
Un vigésimo segundo concepto se refiere al uso, procedimiento, sistema, vector o célula de cualquier concepto precedente, en el que la o cada célula hospedadora es una célula hospedadora Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Salmonella, Listeria, E coli, Desulfovibrio o Clostridium. En un ejemplo, la o cada célula hospedadora es una célula Firmicutes, por ejemplo, una célula Staphylococcus, Streptococcus, Listeria o Clostridium.
En un ejemplo, cada matriz de CRISPR comprende una secuencia R1-S1-R1' para la expresión y producción del ARNcr respectivo (por ejemplo, comprendido por un único ARN guía) en la célula hospedadora, (i) en la que R1 es una primera repetición de CRISPR, R1' es una segunda repetición de CRISPR y R1 o R1' es opcional; y (ii) S1 es un primer espaciador de CRISPR que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es en un 95 % o más idéntica a dicha secuencia diana.
En un ejemplo, R1 y R1' son al menos en un 95 % idénticos respectivamente a la primera y segunda secuencias de repetición de una matriz de CRISPR de la segunda especie de célula hospedadora. En un ejemplo, R1 y R1' son al menos en un 95 % (por ejemplo, en un 96, 97, 98, 99 o 100 %) idénticas respectivamente a la primera (5' -más) y segunda (la repetición inmediatamente 3' de la primera repetición) secuencias de repetición de una matriz de CRISPR de dicha especie, por ejemplo, de una célula hospedadora de dicha especie. En un ejemplo, R1 y R1' son funcionales con una nucleasa Cas9 tipo II (por ejemplo, un S thermophilus, S pyogenes o S aureus Cas9) para modificar la diana en una célula hospedadora.
Un primer concepto alternativo, el uso de la invención proporciona lo siguiente, como lo demuestra el Ejemplo experimental de trabajo:
El uso de la actividad de nucleasa Cas endógena de tipo salvaje de una población de células hospedadoras bacterianas para inhibir el crecimiento de la población, en el que cada célula hospedadora tiene un sistema CRISPR/Cas endógeno que tiene actividad de nucleasa Cas de tipo salvaje, y el uso comprende transformar células hospedadoras de la población, en el que cada célula hospedadora transformada se transforma con una secuencia de nucleótidos modificada genéticamente para proporcionar ARNc modificador del hospedador (HM) o ARN guía (ARNg) en la célula hospedadora, y el ARNc-HM o ARNg comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con una secuencia protoespaciadora diana de la célula hospedadora para guiar Cas endógeno a la diana, en el que el ARNc o ARNg es cognado con una nucleasa Cas endógena de la célula hospedadora que tiene dicha actividad de nucleasa de tipo salvaje y se inhibe tras la transformación del crecimiento de células hospedadoras de la población.
En el Ejemplo trabajado a continuación, la inhibición se abordó en una población bacteriana (un Firmicutes grampositivo) en una superficie sólida. Se logró una inhibición >10 veces del crecimiento de la población de células hospedadoras. El direccionamiento se dirigió a un gen de resistencia a antibióticos y un gen esencial. La invención será útil para inhibir el crecimiento de bacterias resistentes a antibióticos, en el que la secuencia diana es una secuencia de un gen de resistencia a antibióticos. En un ejemplo, la coadministración de la secuencia de nucleótidos modificada con el antibiótico puede ser eficaz. Esto puede proporcionar un tratamiento o prevención más completa de la infección de células hospedadoras en sujetos humanos o animales y/o permitir la reducción de la dosis de antibiótico terapéuticamente eficaz para su administración a un ser humano o animal. Esto es útil en vista de la creciente preocupación con respecto a la sobreadministración de antibióticos y el desarrollo de resistencia en poblaciones humanas y animales.
La demostración de la capacidad de la invención para inhibir el crecimiento de células hospedadoras en una superficie es importante y deseable en realizaciones donde la invención es para tratar o prevenir enfermedades o afecciones mediadas o causadas por la microbiota tal como se describe en esta memoria en un sujeto humano o animal. Típicamente, dicha microbiota está en contacto con tejido del sujeto (por ejemplo, intestino, cavidad oral, pulmón, axila, tejido ocular, vaginal, anal, oído, nariz o garganta) y, por lo tanto, creemos que la demostración de actividad para inhibir el crecimiento de una especie bacteriana de microbiota (ejemplificada por Streptococcus) en una superficie respalda esta utilidad.
En un ejemplo, se utiliza actividad Cas9 o cfp1 endógena de célula hospedadora de tipo salvaje. La secuencia de nucleótidos modificada puede no estar en combinación con una secuencia que codifica la nucleasa Cas exógena.
En un ejemplo, las células hospedadoras son células bacterianas de tipo salvaje (por ejemplo, no modificadas). En otro ejemplo, las células hospedadoras se modifican genéticamente (tal como introducir una secuencia de nucleótidos exógena cromosómicamente o modificar una secuencia de nucleótidos endógena, por ejemplo, en un cromosoma o plásmido de la célula hospedadora), y en el que las células hospedadoras comprenden un sistema CRISPR/Cas endógeno que tiene actividad de nucleasa Cas de tipo salvaje que es operativa con el ARNcr o ARNg. En un ejemplo, la formación de colonias bacterianas de dichas células hospedadoras se inhibe después de dicha transformación. En un ejemplo, la proliferación de células hospedadoras se inhibe después de dicha transformación. En un ejemplo, las células hospedadoras se destruyen después de dicha transformación.
Por «cognado con» se pretende que la Cas endógena sea operativa con una secuencia de ARNcr o ARNg para ser guiada a la diana en la célula hospedadora. El destinatario experto entenderá que dicha guía de Cas es generalmente una característica de la actividad de CRISPR/Cas en células bacterianas, por ejemplo, actividad de CRISPR/Cas de tipo salvaje en células bacterianas que tienen sistemas de CRISPR/Cas de tipo salvaje endógenos activos.
Mediante la actividad de Cas «de tipo salvaje» se pretende, como será evidente para el destinatario experto, que la Cas endógena no sea una Cas modificada genéticamente o que la célula no haya sido modificada genéticamente para reducir la actividad de Cas endógena. Esto está en contraste con determinadas bacterias donde la actividad de nucleasa Cas está naturalmente reprimida (es decir, no hay actividad de nucleasa Cas de tipo salvaje o ninguna que sea útil para la presente invención, que por el contrario es aplicable para dirigirse a células hospedadoras de tipo salvaje in situ, por ejemplo, donde la actividad de Cas endógena se puede aprovechar para efectuar la inhibición del crecimiento de la población celular).
En un ejemplo, la inhibición del crecimiento de la población de células hospedadoras es de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces en comparación con el crecimiento de dichas células hospedadoras no expuestas a dicha secuencia de nucleótidos modificada. Por ejemplo, la inhibición del crecimiento se indica mediante una cantidad de colonias bacterianas menor de una primera muestra de células hospedadoras (solas o en una población bacteriana mixta), al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces, en comparación con la cantidad de colonias de una segunda muestra de células hospedadoras (solas o en una población bacteriana mixta), en la que las primeras células se han transformado mediante dicha secuencia de nucleótidos modificada, pero la segunda muestra no se ha expuesto a dicha secuencia de nucleótidos modificada. En una realización, el recuento de colonias se determina 12, 24, 36 o 48 horas después de que la primera muestra haya sido expuesta a la secuencia modificada. En una realización, las colonias se cultivan en agar sólido in vitro (por ejemplo, en una placa de Petri). Por lo tanto, se entenderá que la inhibición del crecimiento se puede indicar mediante una reducción (<100 % de crecimiento en comparación con ningún tratamiento, es decir, crecimiento de muestra de control) en el crecimiento de células o poblaciones que comprenden la secuencia diana, o puede ser una eliminación completa de dicho crecimiento. En un ejemplo, el crecimiento de la población de células hospedadoras se reduce en al menos un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 95 %, es decir, durante un período de tiempo predeterminado (por ejemplo, 24 horas o 48 horas después de la combinación con el ARNc o ARNg en las células hospedadoras), es decir, el crecimiento de la población de células hospedadoras es al menos en tal porcentaje menor que el crecimiento de una población de células hospedadoras de control que no ha estado expuesta a dicho ARNc o ARNg pero que de otro modo se ha mantenido en las mismas condiciones durante la duración de dicho período predeterminado. En un ejemplo, el porcentaje de reducción del crecimiento se determina mediante la comparación del número de colonias en una muestra de cada población al final de dicho período (por ejemplo, en un momento de la fase de crecimiento exponencial medio de la muestra de control). Por ejemplo, después de exponer la población de prueba al ARNcr o ARNg un tiempo cero, se toma una muestra de las poblaciones de prueba y control y cada muestra se coloca en una placa de agar y se incuba en condiciones idénticas para dicho período predeterminado. Al final del período, se cuenta el número de colonia de cada muestra y la diferencia porcentual (es decir, el número de colonias de prueba dividido entre el número de colonias de control y a continuación multiplicado por 100, y a continuación el resultado se resta de 100 para dar una reducción porcentual del crecimiento). La diferencia de veces se calcula dividiendo el número de colonia de control entre el número de colonias de prueba.
La inhibición del crecimiento de la población puede indicarse, por lo tanto, mediante una reducción en la proliferación del número de células hospedadoras en la población. Esto puede deberse a la destrucción celular por la nucleasa y/o por la regulación por disminución de la proliferación de células hospedadoras (división y/o crecimiento celular) por la acción de la nucleasa en la secuencia protoespaciadora diana. En una realización de un tratamiento o prevención tal como se describe en esta invención, la carga de células hospedadoras del sujeto humano o animal se reduce, mediante lo cual la enfermedad o afección se trata (por ejemplo, se reduce o se elimina) o se previene (es decir, el riesgo de que el sujeto desarrolle la enfermedad o afección) se reduce o se elimina.
La invención es útil para dirigirse a poblaciones bacterianas de tipo salvaje que se encuentran naturalmente en el medio ambiente (por ejemplo, en agua o vías fluviales, equipos de enfriamiento o calentamiento), comprendidas por bebidas y productos alimenticios (o equipos para fabricar, procesar o almacenar estos) o poblaciones bacterianas de tipo salvaje comprendidas por microbiota humana o animal. Por tanto, la presente invención resulta útil en situaciones en las que no es posible o deseable la premodificación de las células hospedadoras para hacerlas receptivas a la destrucción o la inhibición del crecimiento (por ejemplo, cuando se desea el tratamiento in situ de la microbiota en el intestino u otras ubicaciones de un sujeto). En otra aplicación, la invención encuentra utilidad para producir ex vivo un medicamento para administración a un sujeto humano o animal para tratar o prevenir una enfermedad o afección causada o mediada por las células hospedadoras, en el que el medicamento comprende una población bacteriana mixta modificada (por ejemplo, obtenida de heces o microbiota intestinal de uno o más donantes humanos) que es el producto del uso de la invención o procedimiento de la descripción, en el que la población comprende una subpoblación de bacterias de una especie o cepa que es diferente a la especie o cepa de las células hospedadoras. Las células de subpoblación anteriores no comprenden la diana y, por lo tanto, no se modifican mediante el uso o el procedimiento. Así, por ejemplo, el procedimiento puede utilizarse para reducir la proporción de una subpoblación específica de Firmicutes específica y reservar Bacteroidetes en la población mixta, por ejemplo, para producir un medicamento para tratar o prevenir una afección o enfermedad metabólica o de Gl descrita en esta invención. De esta manera, la invención puede proporcionar un medicamento de trasplante bacteriano modificado (por ejemplo, un trasplante fecal modificado) para dicho uso o para dicho tratamiento o prevención en un ser humano o animal. Por ejemplo, el procedimiento puede utilizarse para modificar una o más microbiotas in vitro para producir una colección modificada de bacterias para su administración a un ser humano o animal para uso médico (por ejemplo, tratamiento o prevención de una afección metabólica (tal como obesidad o diabetes) o una afección del tracto Gl (por ejemplo, cualquier afección mencionada en esta invención) o un cáncer (por ejemplo, un cáncer del tracto Gl)) o para uso cosmético o de higiene personal (por ejemplo, para uso tópico en un ser humano, por ejemplo, para reducir el olor de la axila u otro olor corporal mediante aplicación tópica a una axila de un ser humano u otra ubicación relevante de un ser humano). En otro ejemplo, la matriz, el ARNcr, el ARNg o la secuencia de nucleótidos modificada se administra a un ser humano o animal y las células hospedadoras son albergadas por el ser humano o animal, por ejemplo, comprendidas por una microbiota del ser humano o animal (tal como una microbiota intestinal o cualquier otro tipo de microbiota descrita en esta invención). De esta manera, se puede tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada o causada por las células hospedadoras. En un ejemplo, la transformación se realiza in vitro y opcionalmente la matriz, el ARNcr, el ARNg o secuencia de nucleótidos modificada está comprendida por ácido nucleico que se electropora a células hospedadoras. En un ejemplo, el ácido nucleico es ARN (por ejemplo, copias del ARNg). En otro ejemplo, el ácido nucleico es ADN que codifica el ARNcr o ARNg para su expresión en células hospedadoras.
Por lo tanto, en un ejemplo, la invención proporciona una secuencia de nucleótidos modificada genéticamente para proporcionar ARNc modificador de células hospedadoras (HM) o ARN guía (ARNg) en una población de células hospedadoras bacterianas de tipo salvaje comprendidas por una microbiota de un sujeto humano o animal para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada o causada por células hospedadoras de la microbiota del sujeto, en la que el ARNc o ARNg comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con una secuencia protoespaciadora diana de célula hospedadora para guiar a Cas hacia la diana, en la que el ARNc o ARNg está relacionado con una nucleasa Cas de célula hospedadora endógena que tiene actividad de nucleasa de tipo salvaje, en el que se inhibe tras la transformación del crecimiento de células hospedadoras de la población y la enfermedad o afección se trata o se previene.
En un ejemplo, la secuencia de nucleótidos modificada comprende una matriz HM-CRISPR tal como se define en esta invención. En un ejemplo, la secuencia de nucleótidos modificada codifica un único ARN guía. En un ejemplo, la secuencia de nucleótidos modificada genéticamente es un ARN guía (por ejemplo, un ARN guía simple) o ARNcr. En un ejemplo, la secuencia modificada está comprendida por un bacteriófago que es capaz de infectar las células hospedadoras, en la que la transformación comprende la transducción de las células hospedadoras por el bacteriófago. El bacteriófago puede ser un bacteriófago como se describe en la presente memoria. En un ejemplo, la secuencia de nucleótidos modificada está comprendida por un plásmido (por ejemplo, un plásmido conjugativo) que es capaz de transformar células hospedadoras. El plásmido puede ser un plásmido como se describe en la presente memoria. En un ejemplo, la secuencia de nucleótidos modificada está comprendida por un transposón que tiene capacidad de transferencia hacia y/o entre células hospedadoras. El transposón puede ser un transposón como se describe en la presente memoria.
Cualquier uso o procedimiento de la invención puede comprender transformar células hospedadoras con vectores de ácido nucleico para producir ARNc o ARNg en las células. Por ejemplo, los vectores o ácidos nucleicos que comprenden la secuencia de nucleótidos modificada se administran por vía oral, intravenosa, tópica, ocular, intranasal, por inhalación, por administración rectal, en el oído, por administración vaginal o por cualquier otra vía de administración descrita en esta invención o de otro modo a un ser humano o animal que comprende la población bacteriana mixta (por ejemplo, como parte de la microbiota del ser humano o animal), en LOS que la administración transforma las células hospedadoras con los vectores o ácido nucleico.
En un ejemplo, la población de células hospedadoras es ex vivo. En un ejemplo, la población mixta está compuesta por un sujeto humano o animal y se trata o previene una infección de células hospedadoras en el sujeto.
En un ejemplo, la primera y la segunda bacteria están comprendidas por un consorcio microbiano en el que las bacterias viven simbióticamente. En un ejemplo, el consorcio es una microbiota humana o animal; en un ejemplo, el consorcio está comprendido por un ser humano o animal (por ejemplo, en el que el uso, sistema, secuencia modificada, vector o célula es para tratar la infección por células hospedadoras del consorcio en el ser humano o animal, por ejemplo, en el que las células hospedadoras median o causan resistencia a antibióticos o una enfermedad o afección perjudicial en el ser humano o animal). Las especies (E coli, L lactis y S thermophilus) utilizadas en el Ejemplo de trabajo a continuación son cepas que coexisten simbióticamente en la microbiota intestinal humana y animal. El Ejemplo también aborda el direccionamiento en una población bacteriana grampositiva y gramnegativa mixta. Además, el Ejemplo se refiere a una población de Firmicutes (S thermophilus) y una población de Enterobacteriaceae (E coli), las cuales se encuentran en la microbiota humana. Otros ejemplos de Enterobacteriaceae son Salmonella, Yersinia pestis, Klebsiella, Shigella, Proteus, Enterobacter, Serratia y Citrobacter.
En un ejemplo, el procedimiento, uso, secuencia de nucleótidos modificada, matriz, ARNcr, ARNg, vector o sistema es para tratar la infección de células hospedadoras en una población de microbiota intestinal humana, opcionalmente la población también comprende primeras bacterias que son bacterias intestinales comensales humanas y/o Enterobacteriaceae, por ejemplo, en el que las células hospedadoras y células comensales (primera y segunda bacteria) viven simbióticamente en microbiota intestinal humana.
En un ejemplo, el uso o sistema es para la alteración de la proporción de bacterias Bacteroidetes en una población bacteriana mixta que comprende bacterias Bacteroidetes y otras bacterias. Por ejemplo, para aumentar la relación relativa de Bacteroidetes frente a uno, más o todos los Firmicutes (por ejemplo, frente a Streptococcus) en la población. En este caso, las células hospedadoras pueden ser células Firmicutes que comprenden la (s) diana(s). En un ejemplo, la población es una población bacteriana de una microbiota comprendida por un sujeto humano o animal y el procedimiento, uso, secuencia de nucleótidos modificada genéticamente, vector o sistema es para (i) tratar una infección en el sujeto por dichas células hospedadoras comprendidas (por ejemplo, comprendidas por la población mixta); (ii) tratar o prevenir en el sujeto una afección o enfermedad mediada por dichas células hospedadoras; (iii) reducir el olor corporal del ser humano que es causado o mediado por dichas células hospedadoras; o (iv) tratamiento de higiene personal del ser humano. En un ejemplo, la secuencia de nucleótidos, matriz, ARNcr, ARNg o vector de la descripción modificada es para uso en dicho sistema o uso de la descripción.
En un ejemplo, la afección o enfermedad es una enfermedad o afección metabólica o gastrointestinal, por ejemplo, obesidad, IBD, IBS, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa. En un ejemplo, la afección o enfermedad es un cáncer, por ejemplo, un tumor sólido o un cáncer GI (por ejemplo, cáncer de estómago), cáncer de hígado o cáncer de páncreas. En un ejemplo, la afección es resistencia o capacidad de respuesta reducida a un antibiótico (por ejemplo, cualquier antibiótico descrito en esta invención).
En un ejemplo, la célula comprende una RNasa III endógena que es operativa con el componente (ii) en la producción de dicho ARNcr-HM en la célula. En una alternativa, uno o más de los vectores comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica dicha RNasa III para la expresión de la RNasa III en la célula hospedadora.
En un ejemplo, el gen esencial (que comprende la diana) codifica una ADN polimerasa de la célula. Esto se ejemplifica a continuación.
En un ejemplo del uso, el sistema, el vector o la célula, la matriz, el ARNc o el ARNg comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con una secuencia protoespaciadora diana de célula hospedadora que es una adyacente a un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) NGG, NAG, NGA, NGC, NGGNG, Nn GRRT o NNAGAAW, por ejemplo, un PAM AAAGAAA oTAAGAAA (estas secuencias se escriben de 5' a 3'). En una realización, el PAM es inmediatamente adyacente al extremo 3' de la secuencia protoespaciadora. En un ejemplo, Cas es una Cas de S aureus, S theromophilus o S pyogenes. En un ejemplo, Cas es Cpf1 y/o el PAM es TTN o CTA.
En un ejemplo, la secuencia de nucleótidos modificada, ARNcr, ARNg o matriz se encuentra en combinación con un agente antibiótico, por ejemplo, en la que la diana está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos en el que el antibiótico es dicho agente. En una realización, las células hospedadoras son sensibles al antibiótico. Por ejemplo, puede haber una sensibilidad insuficiente para usar el antibiótico para erradicar la infección de la presencia de las células hospedadoras (por ejemplo, en un recipiente/equipo humano o de fabricación que comprende la población), pero el antibiótico puede amortiguar o reducir el tamaño o crecimiento de la subpoblación de células hospedadoras mientras se realiza una destrucción o inhibición del crecimiento adicional mediante el uso de modificación Cas (por ejemplo, corte de la diana) según la invención.
La descripción proporciona el uso, sistema, matriz, ARNcr, ARNg, secuencia de nucleótidos modificada, vector o célula para un procedimiento de tratamiento con antibióticos (primer antibiótico) de una infección de dichas células hospedadoras en un sujeto humano o animal, en el que un gen de resistencia a antibióticos (para resistencia al primer antibiótico) es dirigido a Cas por el sistema o vector en células hospedadoras, en el que el procedimiento comprende administrar el sistema, matriz, ARNcr, ARNg, secuencia de nucleótidos modificada, vector o célula y el antibiótico al sujeto. El gen se regula por disminución, es decir, la expresión de un producto proteico codificado por el gen se reduce o elimina en la célula hospedadora, por lo que la resistencia a los antibióticos se regula por disminución. La infección se reduce o se previene en el sujeto. En un ejemplo, el antibiótico se administra simultáneamente con el sistema, matriz, crARN, gARN, secuencia de nucleótidos modificada, vector o célula; en otro ejemplo, la administración es secuencial (por ejemplo, el antibiótico antes del sistema, matriz, crARN, gARN, secuencia de nucleótidos modificada, vector o célula). Esta característica de la invención puede ser útil para mejorar el tratamiento con antibióticos en el sujeto, por ejemplo, cuando el antibiótico solo no es completamente eficaz para tratar dicha infección de células hospedadoras. El antibiótico puede ser cualquier antibiótico descrito en esta invención, por ejemplo, tetraciclina.
En un ejemplo, cada secuencia o vector de nucleótidos modificado genéticamente comprende una matriz de CRISPR o una secuencia que codifica un ARNcr o ARNg y comprende además un gen de resistencia a antibióticos (por ejemplo, resistencia a kanamicina), en la que el ARNcr-HM o ARNg no se dirige al gen de resistencia a antibióticos.
En un ejemplo, la secuencia diana está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos de la célula hospedadora, en el que el antibiótico es diferente del primer antibiótico (por ejemplo, kanamicina). De esta manera, el sistema, secuencia modificada o vector es capaz de dirigirse al hospedador sin dirigirse a sí mismo. Al exponer las células hospedadoras al primer antibiótico, se puede promover la retención de la secuencia o vector modificado genéticamente en este mediante presión de selección positiva ya que las células que contienen el primer gen de resistencia a antibióticos tendrán una ventaja de supervivencia en presencia del primer antibiótico (cuando las células hospedadoras que no se transforman por la secuencia o vectores modificados genéticamente no son resistentes al primer antibiótico). Por consiguiente, un ejemplo proporciona:
El uso de la descripción que comprende exponer la célula hospedadora o población mixta a dicho antibiótico (por ejemplo, kanamicina) y dicha secuencia modificada o vector(es), para promover el mantenimiento de secuencias que codifican ARNc o ARNg en células hospedadoras; o el sistema, secuencia modificada, matriz o vector de la descripción está en combinación con dicho antibiótico.
En un ejemplo, la secuencia que codifica el ARNc o ARNg o el componente (ii) se encuentra bajo un promotor constitutivo (por ejemplo, un promotor fuerte) operativo en la especie de célula hospedadora, o un promotor inducible. En un ejemplo, el componente (iii) se encuentra bajo un promotor constitutivo operativo en la especie de célula hospedadora, o un promotor inducible.
En un ejemplo, la célula hospedadora o cada célula hospedadora es una célula grampositiva. En otro ejemplo, la célula hospedadora o cada célula hospedadora es una célula grampositiva.
En un ejemplo, el procedimiento, uso, sistema, secuencia modificada o vector es para tratar la infección de la célula hospedadora en una población de microbiota intestinal humana, opcionalmente la población que comprende bacterias intestinales comensales humanas (es decir, bacterias intestinales que son comensales con humanos).
En un ejemplo del procedimiento, uso, sistema, matriz, ARNcr, ARNg, secuencia modificada o vector, las células hospedadoras están comprendidas por una población bacteriana mixta comprendida por un sujeto humano o animal y el procedimiento, uso, sistema, matriz, ARNcr, ARNg, secuencia modificada o vector es para (i) tratar una infección en el sujeto por dichas células hospedadoras comprendidas por la población mixta; (ii) tratar o prevenir en el sujeto una afección o enfermedad mediada por dichas células hospedadoras; (iii) reducir el olor corporal del ser humano que es causado o mediado por dichas células hospedadoras; o (iv) tratamiento de higiene personal del ser humano.
En un ejemplo del procedimiento, el uso, sistema, matriz, ARNcr, ARNg, secuencia modificada o vector es para el tratamiento in vitro de un fluido, superficie sólida, aparato o recipiente industrial o médico (por ejemplo, para alimentos, bienes de consumo, cosméticos, productos de atención médica personal, producción de petróleo o aceite); o para el tratamiento de una vía fluvial, agua, una bebida, un producto alimenticio o un cosmético, en el que las células hospedadoras están comprendidas por o sobre el fluido, superficie, aparato, recipiente, vía fluvial, agua, bebida, producto alimenticio o cosmético.
La descripción también proporciona: Una población mixta ex vivo de bacterias que se puede obtener mediante el uso o procedimiento de cualquier concepto de esta invención.
En un ejemplo, la población mixta o el producto del uso o procedimiento está en un recipiente para uso médico o nutricional. Por ejemplo, el envase es un envase esterilizado, por ejemplo, un inhalador o conectado a una jeringa o aguja IV.
En un ejemplo, la población de productos del uso o procedimiento es útil para la administración a un ser humano o animal para poblar un microbioma del mismo.
La descripción proporciona: Un producto alimenticio o bebida para consumo humano o animal no humano que comprende el producto de población del uso o procedimiento.
En esta invención, en un ejemplo de cualquier configuración, concepto o aspecto, Bacteroides es una especie seleccionada de entre caccae, capillosus, cellulosilyticus, coprocola, coprophilus, coprosuis, distasonis, dorei, eggerthii, faecis, finegoldii,fluxus, fragalis, intestinalis, melaninogenicus, nordii, oleiciplenus, oralis, ovatus, pectinophilus, plebeius, stereoris, thetaiotaomicron, uniformis, vulgatus y xilanisolvens. Por ejemplo, la Bacteroides es thetaiotaomicron, por ejemplo, en el que la célula hospedadora o población mixta es una población de microbiota intestinal ex vivo o in vitro. En un ejemplo, la primera o segunda subpoblación de bacterias de las células hospedadoras comprende una pluralidad de especies de Bacteroidetes diferentes, o una pluralidad de especies de Bacteroides (por ejemplo, que comprenden especies de B thetaiotaomicron y B fragalis), o Bacteroides y Prevotella. En esta invención, en un ejemplo, la Prevotella es una especie seleccionada de entre bergensis, bivia, buccae, buccalis, copri, melaninogenica, oris, ruminicola, tannerae, timonensis y veroralis. Como alternativa, las células hospedadoras, la primera o segunda bacteria son células Firmicutes. En un ejemplo, la primera o segunda subpoblación de células hospedadoras comprende o consiste en uno o más Firmicutes seleccionados de entre Anaerotruncus, Acetanaerobacterium, Acetitomaculum, Acetivibrio, Anaerococcus, Anaerofilum, Anaerosinus, Anaerostipes, Anaerovorax, Butyrivibrio, Clostridium, Capracoccus, Dehalobacter, Dialister, Dorea, Enterococcus, Ethanoligenens, Faecalibacterium, Fusobacterium, Gracilibacter, Guggenheimella, Hespellia, Lachnobacterium, Lachnospira, Lactobacillus, Leuconostoc, Megamonas, Moryella, Mitsuokella, Oribacterium, Oxobacter, Papillacter, Proprionispira, Pseudobutyrivibrio, Pseudoramibacter, Roseburia, Ruminococcus, Sarcina, Seinonella, Shuttleworthia, Sporobacter, Sporobacterium, Streptococcus, Subdoligranulum, Syntrophococcus, Thermobacillus, Turibacter y Weisella. En un ejemplo, las células hospedadoras, o la primera o segunda subpoblación consiste en células de Clostridium (y opcionalmente la otra subpoblación consiste en células de Bacteroides (por ejemplo, tetaiotaomicrón)). En un ejemplo, las células hospedadoras, o la primera o segunda subpoblación consiste en células Enterococcus (y opcionalmente la otra subpoblación consiste en células Bacteroides (por ejemplo, tetaiotaomicrón)). En un ejemplo, las células hospedadoras, o la primera o segunda subpoblación consiste en células Ruminococcus (y opcionalmente la otra subpoblación consiste en células Bacteroides (por ejemplo, tetaiotaomicrón)). En un ejemplo, las células hospedadoras, o la primera o segunda subpoblación consiste en células de estreptococo (y opcionalmente la otra subpoblación consiste en células de Bacteroides (por ejemplo, tetaiotaomicrón)). En un ejemplo, las células hospedadoras, o la primera o segunda subpoblación consiste en células de Faecalibacterium (y opcionalmente la otra subpoblación consiste en células de Bacteroides (por ejemplo, tetaiotaomicrón)). Por ejemplo, la Faecalibacterium es una Faecalibacterium prausnitzii (por ejemplo, A2-165,L2-6, M21/2 o SL3/3).
En un ejemplo, las células hospedadoras, o la primera o segunda subpoblación, comprenden o consisten en uno o más Firmicutes seleccionados de entre Anaerotruncus, Acetanaerobacterium, Acetitomaculum, Acetivibrio, Anaerococcus, Anaerofilum, Anaerosinus, Anaerostipes, Anaerovorax, Butyrivibrio, Clostridium, Capracoccus, Dehalobacter, Dialister, Dorea, Enterococcus, Ethanoligenens, Faecalibacterium, Fusobacterium, Gracilibacter, Guggenheimella, Hespellia, Lachnobacterium, Lachnospira, Lactobacillus, Leuconostoc, Megamonas, Moryella, Mitsuokella, Oribacterium, Oxobacter, Papillibacter, Proprionispira,Pseudobutyrivibrio, Pseudoramibacter, Roseburia, Ruminococcus, Sarcina, Seinonella, Shuttleworthia, Sporobacter, Sporobacteríum, Streptococcus, Subdoligranulum, Syntrophococcus, Thermobacillus, Turibacter y Weisella. En un ejemplo, las células hospedadoras, o la primera o segunda subpoblación consiste en células de Clostridium (por ejemplo, dificile) (y opcionalmente la otra subpoblación consiste en células de Bacteroides (por ejemplo, tetaiotaomicrón)). En un ejemplo, las células hospedadoras, o la primera o segunda subpoblación consiste en células Enterococcus (y opcionalmente la otra subpoblación consiste en células Bacteroides (por ejemplo, tetaiotaomicrón)). En un ejemplo, las células hospedadoras, o la primera o segunda subpoblación consiste en células Ruminococcus (y opcionalmente la otra subpoblación consiste en células Bacteroides (por ejemplo, tetaiotaomicrón)). En un ejemplo, las células hospedadoras, o la primera o segunda subpoblación consiste en células Streptococcus (y opcionalmente la otra subpoblación consiste en células Bacteroides (por ejemplo, tetaiotaomicrón) y/o Enterobacteriaceae (por ejemplo, E coli)). En un ejemplo, las células hospedadoras, o la primera o segunda subpoblación consiste en células de Faecalibacterium (y opcionalmente la otra subpoblación consiste en células de Bacteroides (por ejemplo, tetaiotaomicrón)). En un ejemplo, las células hospedadoras, o la primera o segunda subpoblación consiste en células Streptococcus (opcionalmente células S thermophilus y/o pyogenes) y la otra subpoblación consiste en células Bacteroides (por ejemplo, tetaiotaomicrón) y/o Enterobacteriaceae (por ejemplo, E coli).
El producto de población del uso de la invención o procedimiento de la descripción es, en una realización, para administración a un ser humano o animal no humano mediante administración por vía mucosa, intestinal, oral, intranasal, intrarrectal, intravaginal, ocular o bucal.
Opcionalmente, las células hospedadoras, o la primera o segunda bacteria de la subpoblación son bacterias de B fragalis y la población está albergada por agua.
Una bebida adecuada que comprende una matriz, un sistema, una secuencia modificada, un vector o ARNg de la descripción es, por ejemplo, una bebida probiótica, por ejemplo, una bebida adaptada Yakult (marca registrada), Actimel (marca registrada), Kevita (marca registrada), Activia (marca registrada), Jarrow (marca registrada) o bebida similar para consumo humano.
DIANAS DE LA SECUENCIA DE FAGOS
En algunos aspectos de la descripción, la secuencia diana es una secuencia de un fago que infecta una célula bacteriana hospedadora. La modificación deseada de genomas de fagos, tal como se logra mediante la descripción, no solo se refiere a la destrucción o inactivación de fagos, sino que en su lugar se puede desear la activación del gen del fago o del elemento regulador en la célula hospedadora (por ejemplo, cuando el fago expresa una proteína deseada u otro producto que se asocia con una mayor viabilidad o proliferación de la célula hospedadora). De manera alternativa, la modificación puede ser regulación de la expresión génica del fago inducible, por ejemplo, mediante el uso de un Cas inducible que se dirige según la descripción al sitio diana del fago. En una realización, la descripción proporciona modificar el sitio diana del fago cortando con una nucleasa Cas en la célula hospedadora. Esto puede ser útil por varias razones, por ejemplo:
A. para mutar el sitio diana para activarlo o inactivarlo (por ejemplo, para la eliminación o inactivación de un gen antihospedador; o para destruir la célula hospedadora cuando la diana de fagos está integrada en el cromosoma del hospedador);
B. para eliminar la secuencia diana o una secuencia más grande que comprende la secuencia diana (por ejemplo, cuando la descripción se utiliza con un primer y segundo ARNcr-MP que se dirigen a sitios separados en el genoma de fago, en el que los cortes en cada sitio dan como resultado la eliminación de ácidos nucleicos del fago entre los cortes);
C. para insertar una secuencia de ADN-MP deseada en el genoma de la célula hospedadora (por ejemplo, proporcionando uno o más cortes guiados por ARNcrPm en un ácido nucleico hospedador para la inserción de recombinación homóloga del ADN-MP deseado).
La descripción proporciona los siguientes aspectos:
en un primer aspecto, se proporciona un procedimiento para alterar la relación relativa de subpoblaciones de la primera y segunda bacteria en una población mixta de bacterias que comprende dichas subpoblaciones, en el que las primeras bacterias son células hospedadoras (por ejemplo, células hospedadoras Bacteroidetes) (en el que las primeras bacterias están opcionalmente infectadas por un fago y las segundas bacterias no están infectadas por dicho fago (o no Bacteroidetes)), en el que el procedimiento comprende combinar la población mixta con una pluralidad de vectores en una o más etapas para la introducción de ácido nucleico vectorial (por ejemplo, un transposón que contiene PM del mismo) en células hospedadoras y permitir el crecimiento bacteriano en la población mixta, en el que se alteran las relaciones relativas de dichas primeras y segundas bacterias;
en el que cada vector comprende una matriz de CRISPR de modificación de fagos (PM) modificada genéticamente para su introducción en la célula hospedadora para modificar una secuencia de nucleótidos diana (por ejemplo, de dicho fago) en la célula,
(a) en el que la matriz PM-CRISPR comprende una o más secuencias para la expresión de un ARNcr-MP respectivamente y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en una célula hospedadora; y
(b) en el que el ARNcr-MP es capaz de hibridarse con la secuencia diana para guiar Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana.
Al dirigirse a secuencias de fagos para inactivar genes necesarios para la viabilidad, propogación o infectividad del fago, en un aspecto, la descripción proporciona a la matriz una ventaja selectiva positiva que puede promover su absorción y retención por parte de las células hospedadoras infectadas con el fago. Cuando se destruyen las células hospedadoras o se reduce el crecimiento, se reduce la relación relativa de la primera a la segunda bacteria en la población. La descripción proporciona dicha población de productos, por ejemplo, para su uso como un medicamento para el tratamiento o la prevención (que reduce el riesgo) de una enfermedad o afección en un sujeto humano o animal, en el que el medicamento se administra al sujeto. La enfermedad o afección puede ser cualquier enfermedad o afección descrita en esta invención. En un ejemplo, se expresa un único ARN guía (ARNg) en las células hospedadoras para proporcionar el ARNcr y cada vector comprende una secuencia de nucleótidos modificada expresible que codifica dicho ARNg.
En un ejemplo que utiliza una matriz PM, la secuencia diana es una secuencia de Bacteroides thetaiotaomicron. Opcionalmente, la secuencia diana no está comprendida por B fragalis. Esto es útil, por ejemplo, cuando la modificación corta o de otro modo hace que la secuencia diana no funcione, por lo que la relación de células hospedadoras de B thetaiotaomicron aumenta sin dirigirse a B fragalis, por ejemplo, donde la población mixta es una población de microbiota intestinal como se describe en la presente memoria. B fragalis se asocia en algunos entornos con abscesos y, por lo tanto, este ejemplo reduce el riesgo de esto, al tiempo que permite la alteración de las relaciones (aumento de la proporción de células B thetaiotaomicron) según la descripción que es útil, por ejemplo, para reequilibrar la microbiota intestinal, por ejemplo, para tratar o prevenir la obesidad o diabetes o IBD.
El promotor (o una matriz HM o PM) es operativo en una célula hospedadora. En un ejemplo, el promotor es un promotor viral o de fagos, por ejemplo, un promotor T7. En otro ejemplo, el promotor es un promotor bacteriano (por ejemplo, un promotor de la especie de célula hospedadora).
Un segundo aspecto se refiere al procedimiento del primer aspecto, en el que las primeras bacterias son Bacteroides (por ejemplo, thetaiotamicron o fragalis), Alistipes, Alkaliflexus, Parabacteroides, Tannerella, Xylanibactery/o bacterias Prevotella.
Un tercer aspecto se refiere al procedimiento del primer o segundo aspecto, en el que las segundas bacterias son bacterias Firmicutes (por ejemplo, cuando las primeras bacterias son Bacteroidetes o Bacteroides).
Un cuarto aspecto se refiere al procedimiento de cualquier aspecto anterior, en el que la relación de la primera subpoblación de bacterias con respecto a la segunda subpoblación de bacterias aumenta, es decir, es mayor después de que dicho procedimiento se haya llevado a cabo que antes.
Un quinto aspecto se refiere al procedimiento del cuarto aspecto, en el que la población mixta está compuesta por una composición (por ejemplo, una bebida, enjuague bucal o alimento) para la administración a un animal humano o no humano para poblar y reequilibrar la microbiota intestinal u oral del mismo, por ejemplo, en el que la población mixta está in vitro, o in vivo en el animal humano o no humano. El procedimiento del aspecto 1,2 o 3, en el que la relación de la primera subpoblación de bacterias con respecto a la segunda subpoblación de bacterias disminuye, es decir, es menor después de que dicho procedimiento se haya llevado a cabo que antes.
Un sexto aspecto se refiere al procedimiento del quinto aspecto, en el que la población mixta está albergada por una bebida o agua (por ejemplo, una vía fluvial o agua potable) para consumo humano.
Un séptimo aspecto se refiere al procedimiento de cualquier aspecto anterior, en el que cada vector es un plásmido, fago (por ejemplo, un fago empaquetado) o fagémido.
Un octavo aspecto se refiere al procedimiento del séptimo aspecto, en el que cada vector es un fago (por ejemplo, un fago empaquetado) y el ácido nucleico del vector se introduce en las células hospedadoras mediante transducción de ácido nucleico del vector del fago en células hospedadoras, es decir, mediante infección de células hospedadoras mediante vectores de fagos. En un ejemplo, el fago comprende uno o más transposones como se describe en la presente memoria.
Un noveno aspecto se refiere al procedimiento del octavo aspecto, en el que cada vector es un plásmido y el ácido nucleico del vector se introduce en las células hospedadoras mediante transformación o transferencia de plásmido horizontal de bacterias que albergan los vectores. En un ejemplo, el plásmido comprende uno o más transposones como se describe en la presente memoria. En un ejemplo, la bacteria que alberga los vectores es una especie no-Bacteroidetes o no-Bacteroides .
De forma adicional o alternativa, la bacteria que alberga los vectores es una especie no-Firmicutes. En un ejemplo, las bacterias que albergan los vectores son bacterias de una o más especies seleccionadas del grupo que consiste en una especie de Lactobacillus (por ejemplo, acidophilus (por ejemplo, La-5, La-14 o NCFM), brevis, bulgarícus, plantarum, rhammosus, fermentum, caucasicus, helveticus, lactis, reuteri o casei, por ejemplo, cose/'Shirota), una especie de Bifidobacterium (por ejemplo, bifidum, breve, longum o infantis), Streptococcus thermophilus y Enterococcus faecium. Por ejemplo, las bacterias son bacterias L acidophilus o lactis.
Un décimo aspecto se refiere a una matriz de CRISPR de modificación de fagos de Bacteroidetes (PM) modificada genéticamente para su uso en el procedimiento de cualquier aspecto anterior para modificar el genoma de dicho fago de Bacteroidetes,
(a) en el que la matriz PM-CRISPR comprende una o más secuencias para la expresión de un ARNcr-MP y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en una célula hospedadora infectada con fagos de Bacteroidetes; y
(b) en el que el ARNcr-MP es capaz de hibridarse con una secuencia diana del genoma del fago de Bacteroidetes para guiar Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora infectada para modificar la secuencia diana.
Un undécimo aspecto se refiere a un vector de ácidos nucleicos (por ejemplo, un plásmido, fago o fagémido) para su uso en el procedimiento de cualquiera de los aspectos primero a décimo, donde el vector comprende una matriz de PM-CRISPR del décimo aspecto.
En una realización general, se proporciona alternativamente un duodécimo aspecto:
Un vector de ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido, virus, fago o fagémido) que comprende una matriz HM-CRISPR modificada genéticamente para modificar una secuencia diana del genoma de una célula bacteriana hospedadora (por ejemplo, célula bacteriana patógena, tal como se describió anteriormente) o el genoma de un virus (por ejemplo, fago) en una célula hospedadora,
(a) en el que la matriz de CRISPR comprende una o más secuencias para la expresión de un ARNcr y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en la célula hospedadora; y
(b) en el que el ARNcr es capaz de hibridarse con la secuencia diana para guiar Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana.
El promotor es operativo en una célula hospedadora. En un ejemplo, el promotor es un promotor viral o de fagos, por ejemplo, un promotor T7. En otro ejemplo, el promotor es un promotor bacteriano (por ejemplo, un promotor de la especie de célula hospedadora).
En un ejemplo, la matriz es comprendida por un transposón descrito en esta invención. En un ejemplo, la matriz está compuesta por una bacteria portadora tal como se describe en la presente memoria. En un ejemplo, se proporciona una pluralidad de las matrices para clasificar una o más secuencias de nucleótidos diana del fago o célula hospedadora, en el que la pluralidad de matrices están comprendidas por células bacterianas, por ejemplo, portadoras, primer receptor o segundo receptor tal como se describe en la presente memoria. En un ejemplo, las células portadoras están comprendidas por una bebida (por ejemplo, una bebida probiótica para consumo humano) o producto alimenticio tal como se describe en la presente memoria. En un ejemplo, la matriz o bacteria portadora son para administración a un ser humano o animal no humano para tratar o prevenir una infección del ser humano o animal, por ejemplo, en el que la célula hospedadora es patógena. En un ejemplo, la matriz o bacteria portadora son para administración al intestino de un ser humano o animal no humano para tratar o prevenir la obesidad, diabetes o IBD del ser humano o animal.
Un décimo tercer aspecto se refiere a la matriz o vector del undécimo o duodécimo aspecto en el que la matriz o vector está comprendida por una célula bacteriana, por ejemplo, una célula probiótica para consumo del humano o animal no humano. Un décimo cuarto aspecto se refiere al procedimiento, matriz o vector de cualquier aspecto anterior, en el que los vectores están comprendidos por una tercera población bacteriana (por ejemplo, bacterias portadoras descritas en esta invención) que se utiliza para dicha combinación con la población mixta o es para la combinación con la población mixta, mediante lo cual el ácido nucleico vectorial se introduce en las células hospedadoras mediante transformación (por ejemplo, mediante transferencia de plásmido horizontal o transposón desde la tercera bacteria a las primeras células hospedadoras bacterianas) o transducción (por ejemplo, mediante inefección de vector de fagos de las primeras células hospedadoras bacterianas).
Un décimo quinto aspecto se refiere al procedimiento, matriz o vector de cualquier aspecto anterior, en el que la o cada matriz o vector está comprendido por una célula bacteriana simbiótica o comensal intestinal humana o animal no humana (por ejemplo, una célula bacteriana portadora tal como se describe en la presente memoria). Por lo tanto, la célula es de una especie bacteriana intestinal que es comensal o simbiótica con el ser humano o animal no humano.
Un décimo sexto aspecto se refiere al procedimiento o vector de cualquiera de los aspectos duodécimo a décimo quinto, en el que el o cada vector es un plásmido, fago o fagémido que comprende un origen de replicación que es operativo en una célula hospedadora Firmicutes o en una célula hospedadora infectada con fagos Bacteroidetes (por ejemplo, una célula Bacteroides), y que es operativo opcionalmente en una célula bacteriana comensal o simbiótica tal como se define en el aspecto 15. En un ejemplo, el origen de la replicación es or/T o cualquier otro origen de replicación descrito en esta invención.
Un décimo séptimo aspecto se refiere al procedimiento o vector de cualquiera de los aspectos duodécimo a décimo sexto, en el que el o cada vector es un plásmido o fagémido que comprende una secuencia (por ejemplo, un transposón descrito en esta invención) que tiene capacidad de transferencia horizontal entre (1) una célula bacteriana comensal o simbiótica humana o animal no humano que no es una célula Bacteroides y (2) dicha célula infectada con fagos que es una célula Bacteroides; o entre (3) una célula bacteriana comensal o simbiótica humana o animal no humano que no es una célula Firmicutes y (4) una célula Firmicutes que comprende la secuencia diana.
Un décimo octavo aspecto se refiere al procedimiento o vector de cualquiera de los aspectos duodécimo a décimo séptimo, en el que el o cada vector es una secuencia de plásmidos o fagémidos (por ejemplo, un transposón descrito en esta invención) que tiene capacidad de transferencia horizontal entre (1) una célula infectada con fagos que es una célula Bacteroides y (2) una célula bacteriana que es adecuada para la administración probiótica a un intestino humano o animal no humano; o entre (3) una célula Firmicutes que comprende la secuencia diana y (4) una célula bacteriana que es adecuada para la administración probiótica a un intestino humano o animal no humano.
Un décimo noveno aspecto se refiere al procedimiento o vector de cualquiera de los aspectos décimo quinto a décimo octavo, en el que la especie comensal, simbiótica o probiótica se selecciona del grupo que consiste en una especie de Lactobacillus (por ejemplo, acidophilus (por ejemplo, La-5, La-14 o NCFM), brevis, bulgaricus, plantarum, rhammosus, fermentum, caucasicus, helveticus, lactis, reuteri o casei, por ejemplo, casei Shirota), una especie de Bifidobacterium (por ejemplo, bifidum, breve, longum o infantis), Streptococcus thermophilus y Enterococcus faecium.
El procedimiento, matriz o vector de cualquier aspecto anterior, en el que el promotor es operativo para la transcripción de dicha o dichas secuencias en una célula hospedadora de Bacteroidetes infectada con fagos y en una célula bacteriana comensal, simbiótica o probiótica tal como se define en cualquiera de los aspectos 15 a 19; o en una célula Firmicutes que comprende la secuencia diana y en una célula bacteriana comensal, simbiótica o probiótica tal como se define en cualquiera de los aspectos 15 a 19. Por ejemplo, el promotor es un promotor viral o bacteriano, por ejemplo, un promotor T7. En un ejemplo, el promotor es un promotor de célula hospedadora, por ejemplo, un promotor de una matriz CR/SPR/Cas hospedadora.
Un vigésimo aspecto se refiere al procedimiento, matriz o vector de cualquier aspecto anterior, o cualquier uso en esta invención, en el que la modificación es (i) cortar la secuencia diana, (ii) regular por disminución la transcripción de un gen que comprende la secuencia diana, (iii) regular por aumento la transcripción de un gen que comprende la secuencia diana o (iv) agregar, eliminar o sustituir una secuencia de ácidos nucleicos en la diana.
Un vigésimo primer aspecto se refiere al procedimiento, matriz o vector de cualquier aspecto anterior, en el que el fago de Bacteroidetes es un fago de Bacteroides seleccionado de entre un crAssphage, un fago GB-124, un fago GA-17, un fago HB-13, un fago H16-10, un fago B40-8 y un fago B fragalis ATCC51477-B1. Se hace referencia a Nat Commun.
2014 Jul 24;5:4498. doi: 10.1038/ncomms5498, «A highly abundant bacteriophage discovered in the unknown sequences of human fecal metagenomes», Dutilh BE y col. El genoma de crAssphage de ~97 kbp es seis veces más abundante en metagenomas disponibles públicamente que todos los otros fagos conocidos juntos; comprende hasta el 90 % y el 22 % de todas las lecturas en metagenomas derivados de partículas similares a virus (VLP) y metagenomas comunitarios totales, respectivamente; y totaliza el 1,68 % de todas las lecturas de secuenciación metagenómica fecal humana en las bases de datos públicas. Mediante un nuevo enfoque de perfil de coincidencia, Dutilh y col. predijeron un hospedador de Bacteroides para este fago, consistente con homólogos de proteína relacionados con Bacteroides y un dominio de unión a carbohidratos único codificado en el genoma del fago. Un vigésimo segundo aspecto se refiere al procedimiento, matriz o vector de cualquier aspecto anterior, o cualquier uso en esta invención, en el que la secuencia diana está comprendida por un gen de fago requerido para la infectividad de la célula hospedadora, el ciclo lisogénico o lítico del fago o la viabilidad del fago, por ejemplo, un gen esencial o gen de proteína de recubrimiento.
Un vigésimo tercer aspecto se refiere al procedimiento, matriz o vector de cualquier aspecto anterior, en el que la secuencia diana está comprendida por una secuencia codificante de dominio de BACON (Bacteroidetes-associated carbohydrate-binding) (por ejemplo, en el que el hospedador es un hospedador de Bacteroides) o una secuencia codificante de endolisina. Se hace referencia a FEBS Lett. 3 junio 2010;584(11 ):2421 -6, doi:10.1016/j.febslet.2010.04.045. Epub 2010 Apr 21, «Mining metagenomic data for novel domains: Ba Co N, a new carbohydrate-binding module», Mello L y col. La presencia del dominio BACON en una proteína estructural de fagos podría explicarse por la adhesión de bacteriófagos propuesta al modelo de moco. Según este modelo, el fago se adhiere a las glucoproteínas de mucina que componen la capa de moco intestinal a través de dominios de unión a carbohidratos mostrados por la cápside (como el pliegue similar a la inmunoglobulina o el dominio BACON), facilitando interacciones más frecuentes con las bacterias que infecta el fago.
Un vigésimo cuarto aspecto se refiere al procedimiento, matriz o vector de cualquier aspecto anterior, o cualquier uso en esta invención, en el que la matriz de CRISPR comprende una secuencia R1 -S1 -R1' para la expresión y producción del ARNcr en la célula hospedadora,
(i) en el que R1 es una primera repetición de CRISPR, R1' es una segunda repetición de CRISPR, y R1 o R1' es opcional; y
(ii) S1 es un primer espaciador CRISPR que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es en un 95 % o más idéntica a dicha secuencia diana. Por ejemplo, la secuencia diana comprende un protoespaciador o está comprendida por una secuencia protoespaciadora que es inmediatamente adyacente a un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) que es cognado con una Cas cuando la matriz de la invención está en la célula hospedadora, en el que la Cas también es cognada con el ARNcr expresado de la matriz. En una realización, Cas es endógena a la célula.
En otro ejemplo, Cas es exógena a la célula hospedadora, por ejemplo, proporcionada por un vector de la invención.
Un vigésimo quinto aspecto se refiere al procedimiento, matriz o vector del vigésimo cuarto aspecto, en el que R1 y R1' son al menos en un 95 % (por ejemplo, en un 96, 97, 98, 99 o 100 %) idénticos a las secuencias repetidas de una matriz de CRISPR de una célula de la misma especie que la célula hospedadora.
Un vigésimo sexto El procedimiento, la matriz o el vector del vigésimo cuarto aspecto, en el que R1 y R1' es cada uno al menos en un 95 % (por ejemplo, en un 96, 97, 98, 99 o 100 %) idéntico a una secuencia de repetición de una matriz de CRISPR (por ejemplo, una matriz Tipo II-C) de una especie Bacteroides seleccionada de entre thetaiotamicron y fragalis (por ejemplo, Bacteroides fragalis NCTC 9343), en el que las células hospedadoras comprenden un sistema CRISPR/Cas que es funcional con la secuencia de repetición y son células Bacteroides, por ejemplo, de dicha especie.
Un vigésimo séptimo aspecto se refiere al procedimiento, matriz, uso o vector del vigésimo sexto aspecto, en el que R1 y R1' son al menos en un 95 % (por ejemplo, en un 96, 97, 98, 99 o 100 %) idénticos respectivamente a la primera (5'-más) y segunda (la repetición inmediatamente 3' de la primera repetición) secuencias de repetición de una matriz de CRISPR de dicha especie, por ejemplo, de una célula hospedadora de dicha especie. En un ejemplo, la matriz es una matriz tipo II-C. En un ejemplo, la matriz o vector comprende además R2-S2-R2', en el que el separador S2 es igual o diferente del separador S1 (por ejemplo, para dirigirse a un sitio diana diferente en la célula hospedadora o genoma de fago), en el que R2 y R2' son funcionales en la célula hospedadora y son opcionalmente iguales que R1. Por ejemplo, cada uno de R1, R1', R2 y R2' es una repetición CRISPR de B fragalis R1'.
Un vigésimo octavo aspecto se refiere al procedimiento, matriz, uso o vector del vigésimo cuarto aspecto, en el que
(iii) cada uno de R1 y R1' es idéntico a una secuencia de repetición de una matriz de CRISPR (por ejemplo, una matriz tipo II-C) de una célula de especie Bacteroides, en el que la especie se selecciona del grupo que consiste en caccae, capillosus, cellulosilyticus, coprocola, coprophilus, coprosuis, distasonis, dorei, eggerthii, faecis, finegoldii, fluxus, fragalis (por ejemplo, fragalis NCTC 9343), intestinalis, melaninogenicus, nordii, oleiciplenus, oralis, ovatus, pectinophilus, plebeius, stereoris, thetaiotaomicron, uniformis, vulgatus y xylanisolvens, y (iv) en el que la célula hospedadora comprende un sistema CRISPR/Cas que es funcional con la secuencia de repetición y una célula Bacteroides de una especie seleccionada de dicho grupo (por ejemplo, como la especie seleccionada (iii)).
Un vigésimo noveno aspecto se refiere al procedimiento, matriz, uso o vector del vigésimo cuarto aspecto, en el que R1 y R1' son funcionales con un sistema CRISPR/Cas de una célula de Bacteroidetes o Firmicutes hospedadora para la modificación de la secuencia diana. En un ejemplo, R1, R1', R2 y R2' son repeticiones del sistema CRISPR/Cas Tipo II (por ejemplo, Tipo II-C) de la misma especie bacteriana, por ejemplo, un Bacteroides, tal como thetaiotamicron o fragalis o Streptococcus, tal como thermophilus o pyogenes.
Un trigésimo aspecto se refiere al procedimiento, matriz, uso o vector del vigésimo cuarto aspecto, en el que R1 y R1' son al menos en un 95 % (por ejemplo, en un 96, 97, 98, 99 o 100 %) idénticos a secuencias repetidas de una matriz de CRISPR (por ejemplo, una matriz tipo II-C) de una célula Bacteroidetes (por ejemplo, Bacteroides o Prevotella) o Firmicutes (por ejemplo, Streptococcus). Un trigésimo primer aspecto se refiere al procedimiento, matriz, uso o vector del vigésimo cuarto aspecto, en el que cada uno de R1 y R1' es al menos en un 95 % (por ejemplo, en un 96, 97, 98, 99 o 100 %) idéntico a una secuencia seleccionada de SEQ.
ID NO: 1 a 5 de la Tabla 2 y opcionalmente las primeras células bacterianas son células Bacteroides, por ejemplo, de una especie o cepa (por ejemplo, la especie o cepa enumerada contra la secuencia seleccionada) en la Tabla 2.
Un trigésimo segundo aspecto se refiere al procedimiento, matriz, uso o vector del vigésimo cuarto aspecto, en el que cada uno de R1 y R1' es al menos en un 95 % (por ejemplo, en un 96, 97, 98, 99 o 100 %) idéntico a una secuencia seleccionada de SEQ. ID NO: 6 a 11 La Tabla 2 y, opcionalmente, las primeras células bacterianas son células de Prevotella, por ejemplo, de una especie o cepa (por ejemplo, la especie o cepa enumerada contra la secuencia seleccionada) en la Tabla 2.
Un trigésimo tercer aspecto se refiere al procedimiento, matriz o vector de cualquier aspecto anterior, en el que la matriz o cada matriz está en combinación con una o más nucleasas de Cas que funcionan con el ARNcr en una célula hospedadora para modificar la secuencia diana. Por ejemplo, la secuencia diana comprende una secuencia protoespaciadora inmediatamente adyacente a un motivo adyacente al protoespaciador (PAM), opcionalmente en el que el PAM es cognadocon una nucleasa Cas comprendida por las células hospedadoras Bacteroidetes. En un ejemplo, Cas es una nucleasa Cas de tipo II-C.
Un trigésimo cuarto aspecto se refiere al procedimiento, matriz o vector de cualquier aspecto anterior, en el que la matriz o cada matriz está en combinación con secuencias de ácido nucleico que codifican una o más nucleasas de Cas que funcionan con el ARNcr en una célula hospedadora para modificar la secuencia diana.
Un trigésimo quinto aspecto se refiere al procedimiento, matriz, uso o vector del vigésimo cuarto aspecto, en el que R1 y R1' son funcionales con una nucleasa Cas9 de Tipo II (por ejemplo, una Cas9 de S pyogenes, S thermophilus o S aureus) para modificar la diana en una célula hospedadora, opcionalmente en el que el procedimiento, matriz o vector es además según el trigésimo cuarto o trigésimo quinto aspecto en el que Cas es dicha Cas9.
Un trigésimo sexto aspecto se refiere a una población mixta ex vivo de bacterias que se puede obtener mediante el procedimiento de cualquiera de los aspectos primero a décimo o décimo quinto a trigésimo quinto o un uso en esta invención. Por ejemplo, la población mixta está en un recipiente para uso médico o nutiricional. Por ejemplo, el recipiente es un recipiente esterilizado.
Un trigésimo séptimo aspecto se refiere a una composición para administración a un ser humano o animal no humano para reducción de masa corporal terapéutica, profiláctica, cosmética, humana o no humana (por ejemplo, reducción cosmética) o uso nutricional, la composición comprende la población mixta del trigésimo sexto aspecto. En un ejemplo, la composición es para administración oral, sistémica, inhalada, intrarrectal, ocular, bucal o intravaginal. En un ejemplo, la composición es para administración al intestino o cavidad oral de un animal humano o no humano.
Un trigésimo octavo aspecto se refiere a un producto alimenticio o bebida para consumo humano o animal no humano que comprende la población mixta del trigésimo sexto aspecto o la composición del trigésimo séptimo aspecto.
Un trigésimo noveno aspecto se refiere al producto alimenticio o bebida del trigésimo octavo aspecto, que es un suplemento nutricional o una bebida probiótica o producto alimenticio.
Un cuadragésimo aspecto se refiere a una composición antibiótica para tratar o prevenir una infección por Bacteroidetes en un ser humano o animal no humano o en agua potable, en el que la composición comprende una matriz o vector de cualquiera de los aspectos undécimo a trigésimo quinto, opcionalmente en el que la modificación es según el vigésimo segundo aspecto (iii) o (iv).
Un cuadragésimo primer aspecto se refiere a una composición probiótica para aumentar la proporción de Bacteroidetes intestinales (por ejemplo, para tratar o prevenir la obesidad, diabetes (por ejemplo, tipo I) o una afección inflamatoria del Gl) en un ser humano o animal no humano, en el que la composición comprende una matriz o vector de cualquiera de los aspectos undécimo a trigésimo quinto, opcionalmente en el que la modificación es según el vigésimo segundo aspecto (iii) o (iv).
Un cuadragésimo segundo aspecto se refiere a la composición del trigésimo séptimo, cuadragésimo o cuadragésimo primer aspecto para aumentar las proporciones relativas de Bacteroides intestinales a Firmicutes en el ser humano o animal, por ejemplo, para tratar o prevenir la obesidad, diabetes (por ejemplo, diabetes tipo I) o una afección del Gl (por ejemplo, enfermedad de Crohn, IBD, IBS o colitis ulcerosa).
En una alternativa, «matriz» en cualquier configuración como se menciona en las reivindicaciones 1 -15 puede ser en cambio una secuencia de nucleótidos modificada genéticamente que codifica un ARNcr-HM o ARNg para la expresión en una célula hospedadora. Por lo tanto, las características de cualquiera de los aspectos de esta invención relacionados con una matriz pueden, en forma alternativa, aplicarse mutatis mutandis a dicha secuencia modificada.
ELEMENTOS GENÉTICOS MÓVILES Y SISTEMAS CRISPR
Un cuadragésimo tercer aspecto se refiere a un vector de ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido, virus, fago o fagémido) que comprende una matriz de CRISPR modificada genéticamente para modificar una secuencia diana del genoma de una célula bacteriana hospedadora (por ejemplo, Firmicutes o célula bacteriana patógena, tal como se describió anteriormente) o el genoma de un virus (por ejemplo, fago) en una célula hospedadora,
(a) en el que la matriz de CRISPR comprende una o más secuencias para la expresión de un ARNcr (por ejemplo, comprendido por un ARNg) y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en la célula hospedadora;
(b) en el que el ARNcr es capaz de hibridarse con la secuencia diana para guiar Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana;
(c) en el que la matriz está compuesta por un transposón que tiene capacidad de transferencia horizontal entre primeras y segundas células bacterianas de diferentes especies.
Opcionalmente, la nucleasa Cas es una nucleasa Cas endógena de tipo salvaje de la célula hospedadora.
Un cuadragésimo cuarto aspecto se refiere al vector del cuadragésimo tercer aspecto, en el que la matriz es para administración a un ser humano o animal no humano; y la primera especie celular no es patógena para el ser humano o animal y la segunda especie celular es patógena para el ser humano o animal, en el que la matriz está comprendida por la primera célula.
Un cuadragésimo quinto aspecto se refiere al vector del cuadragésimo cuarto aspecto, en el que la primera especie celular es una especie que es comensal o simbiótica con la especie humana o animal, por ejemplo, una especie de microbiota intestinal.
Un cuadragésimo sexto aspecto se refiere al vector del cuadragésimo cuarto o cuadragésimo quinto aspecto, en el que la primera especie celular se selecciona del grupo que consiste en una especie de Lactobacillus (por ejemplo, acidophilus (por ejemplo, La-5, La-14 o NCFM), brevis, bulgaricus, plantarum, rhammosus, fermentum, caucasicus, helveticus, lactis, reuteri o casei, por ejemplo, casei Shirota), una especie de Bifidobacterium (por ejemplo, bifidum, breve, longum o infantis), Streptococcus thermophilus y Enterococcus faecium.
Un cuadragésimo séptimo aspecto se refiere al vector de cualquiera de los aspectos cuadragésimo cuarto a cuadragésimo sexto, en el que el vector está comprendido por una bebida (por ejemplo, una bebida probiótica) o alimento para consumo humano o animal.
Un cuadragésimo octavo aspecto se refiere al vector de cualquiera de los aspectos cuadragésimo cuarto o cuadragésimo séptimo, en el que el vector comprende al menos una unidad de repetición-espaciador-repetición para dirigirse a la secuencia diana, en el que las repeticiones son al menos en un 95 % (por ejemplo, en un 96, 97, 98, 99 o 100 %) idénticas a las repeticiones de un sistema CRISPR/Cas de la célula hospedadora, en el que las repeticiones del vector son operativas en la célula hospedadora para guiar a Cas del sistema hospedador para modificar la secuencia de nucleótidos diana.
Un cuadragésimo noveno aspecto se refiere al vector del cuadragésimo octavo aspecto, en el que el vector carece de una secuencia codificante de Cas (por ejemplo, nucleasa Cas).
El direccionamiento de una secuencia de nucleótidos del sistema CRISPR/Cas hospedador según la invención es útil para eliminar la resistencia de la célula hospedadora a un vector (por ejemplo, virus invasor) o reducir el desarrollo o aumento de la resistencia. Por ejemplo, la invención proporciona de este modo la ventaja de dirigir y derribar la actividad de un sistema CRISPR/Cas endógeno para que se inhiba la adquisición de un espaciador de un nuevo vector (por ejemplo, un fago).
Una característica de la movilización es la presencia de una región de acción cis (oriT) que se requiere para la transferencia. Esta región es el sitio de inicio del procesamiento de ADN en el que se realiza una muesca específica del sitio y la cadena en el plásmido para iniciar el evento de transferencia. La descripción proporciona principios adicionales que emplean elementos genéticos móviles (MGE) de la siguiente manera:
en un primer principio, se proporciona un vector de ácido nucleico de CRISPR modificado genéticamente que comprende o consiste en un elemento genético móvil (MGE), en el que el MGE comprende un origen de transferencia (oriT) y una matriz de CRISPR para modificar una secuencia diana del genoma de una célula hospedadora (por ejemplo, célula bacteriana patógena) o el genoma de un virus (por ejemplo, profago) en una célula hospedadora,
(a) en el que la matriz de CRISPR comprende una o más secuencias para la expresión de un ARNcr y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en la célula hospedadora;
(b) en el que el ARNcr es capaz de hibridarse con la secuencia diana para guiar Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana;
(c) en el que el vector tiene capacidad de transferencia entre (i) la primera y segunda posición de ácido nucleico de una primera célula hospedadora, en el que cada posición es una posición en un cromosoma o un plásmido y la secuencia diana está comprendida por la célula hospedadora, o (ii) la primera y segunda célula hospedadora, en el que la secuencia diana está comprendida por la primera y/o segunda célula hospedadora.
Los ejemplos de MGE son ICE, transposones, plásmidos y bacteriófagos. Un origen de transferencia (oriT) es una secuencia corta (por ejemplo, hasta 500 pb) que es necesaria para la transferencia del ADN que lo contiene de un hospedador bacteriano al receptor durante la conjugación. El oriT actúa en cis; se encuentra en el mismo ADN que se está transfiriendo, y se transfiere junto con el ADN. Un origen típico de transferencia comprende tres dominios funcionalmente definidos: un dominio de corte, un dominio de transferencia y un dominio de terminación.
Opcionalmente, el promotor es operativo para la transcripción de dicha o dichas secuencias en la primera y segunda (y opcionalmente la tercera) célula.
Opcionalmente, la secuencia diana está comprendida por la segunda célula. Opcionalmente, la secuencia diana no está comprendida por la segunda célula.
En un ejemplo, la primera y segunda células son de diferentes especies bacterianas (por ejemplo, especies que se encuentran en una población de microbiomas humanos, por ejemplo, del intestino, axila, vagina o boca). En un ejemplo, la primera y la segunda célula son ex vivo. En otro ejemplo, la primera y la segunda célula están comprendidas por un microbioma intestinal, vaginal, de axila u oral humano in vivo o ex vivo.
Un segundo principio se refiere al vector del primer principio, en el que el MGE es o comprende un elemento integrador y conjugativo (ICE). Alternativamente, el MGE es un MGE movilizable (es decir, capaz de utilizar factores codificados por genes no transportados por el MGE, para ser movilizados). Los términos «movilizable» y «conjugado» en relación con los MGE son fácilmente evidentes para el destinatario experto.
Se hace referencia a la base de datos de ICEberg(http://db-mml.sjtu.edu.cn/ICEberg/), que proporciona ejemplos de ICE adecuados para la invención y fuentes para oriT. En un ejemplo, el ICE es un miembro de una familia de ICE que comprende un ICE seleccionado del grupo 1 al 28, o el oriT es un oriT de un miembro de dicha familia: 1 =SXT/R391; 2=Tn916; 3=Tn4371; 4=CTnDOT/ERL; 5=ICEclc; 6=ICEBs1; 7=ICEHin1056; 8=PAPI-1; 9=ICEMISym(R7A); 10=ICESt1; 11 =SPI-7; 12=ICE6013; 13=ICEKp1; 14=TnGBS1; 15=Tn5253; 16=ICESa2603; 17=ICEYe1; 18=10270-RD.2; 19=Tn1207.3; 20=Tn1806; 21=ICEA5632; 22=ICEF-I/II; 23=ICEAPG2; 24=ICEM; 25=10270-RD.1; 26=Tn5801; 27=PPI-1; 28=ICEF-III. Las descripciones de las familias se encuentran en la base de datos de ICEberg. Por ejemplo, la familia Tn916 fue definida por Roberts y col. (2009) (Trends Microbiol. 2009 Jun;17(6):251-8. doi: 10.1016/j.tim.2009.03.002. Epub 2009 May 20; «A modular master on the move: the Tn916 family of mobile genetic elements», Roberts A, Mullany P). Los elementos pertenecientes a la familia Tn916 se definen por los siguientes criterios: deben tener la organización general mostrada en Roberts y col., y deben tener una región central (módulo de conjugación y regulación) que sea similar en secuencia y estructura a la Tn916 original a nivel de ADN. Excepciones son algunos transposones conjugados, tales como Tn1549 que se han clasificado previamente en esta familia y aquellos con un alto grado de similitud proteica como se describe en las referencias correspondientes.
Un tercer principio se refiere al vector del segundo principio, en el que el ICE es un transposón, por ejemplo, un transposón conjugado. En un ejemplo, el MGE es un transposón movilizable que se puede movilizar en presencia de un elemento auxiliar funcional, opcionalmente en el que el transposón está en combinación con dicho elemento auxiliar.
Un cuarto principio de se refiere al vector de cualquier principio anterior, en el que el vector es un plásmido, opcionalmente en el que el MGE es un transposón comprendido por el plásmido. Por ejemplo, el transposón es un transposón conjugado. En un ejemplo, el transposón es un transposón movilizable (por ejemplo, movilizable al usar uno o más factores codificados por el plásmido, por ejemplo, por genes fuera de la secuencia de transposones del plásmido). Opcionalmente, el transposón es un transposón de tipo I. Opcionalmente, el transposón es un transposón de tipo II.
Un quinto principio se refiere al vector de cualquier principio anterior, en el que oriT es funcional en la primera y segunda célula hospedadora. Esto es útil para promover la extensión y la propogación a través de bacterias en una población bacteriana, por ejemplo, cuando la primera y segunda célula son de diferentes especies.
Un sexto principio se refiere al vector del quinto principio cuando está comprendido por la primera célula, en el que la primera célula comprende secuencias de nucleótidos que codifican proteínas operativas para transferir el MGE a la segunda célula, en el que las secuencias no están comprendidas por el MGE. Esto es útil para evitar el uso de espacio en el MGE para dichas secuencias. Por ejemplo, esto permite la construcción de un MGE más compacto para la transferencia entre células o permite la inclusión de matrices de CRISPR más grandes o más, por ejemplo, para incluir una pluralidad de espaciadores para dirigirse a secuencias respectivas en una célula hospedadora o para dirigirse a diferentes secuencias en la primera y segunda célula hospedadora.
Un séptimo principio se refiere al vector del sexto principio, en el que las secuencias no están comprendidas por el vector. Esto es útil para evitar el uso de espacio en el vector o MGE para dichas secuencias.
Por ejemplo, esto permite la construcción de un vector o MGE más compacto para la transferencia entre células o permite la inclusión de matrices de CRISPR más grandes, por ejemplo, para incluir una pluralidad de espaciadores para dirigirse a secuencias respectivas en una célula hospedadora o para dirigirse a diferentes secuencias en la primera y segunda célula hospedadora, y/o para incluir una o más secuencias para codificar proteínas Cas, por ejemplo, una Cas9.
Un octavo principio se refiere al vector del sexto o séptimo principio, en el que las secuencias están comprendidas por un transposón conjugativo de la primera célula. Esto es útil, ya que permite el aprovechamiento de factores fuera del MGE para efectuar la transposición conjugada, para la transferencia horizontal del MGE de la invención entre la primera y la segunda célula hospedadora (por ejemplo, de diferentes especies bacterianas en un microbioma humano). Un noveno principio se refiere al vector del octavo principio, en el que el transposón es operativo en trans para transferir el MGE a la segunda célula. Esto es útil, ya que permite el aprovechamiento de factores fuera del MGE para efectuar la transposición conjugativa, para la transferencia horizontal del MGE de la descripción entre la primera y segunda célula hospedadora (por ejemplo, de diferentes especies bacterianas en un micribioma humano). Por ejemplo, la oriT del MGE de la descripción es la misma que una oriT comprendida por un transposón conjugativo de la célula hospedadora. Esto es útil para permitir que el MGE de la descripción funcione con factores codificados por la célula hospedadora para efectuar la transferencia horizontal del MGE entre la primera y segunda célula hospedadora (por ejemplo, células bacterianas de diferentes especies, por ejemplo, especies de microbiomas humanos). Esto permite que el MGE sea más compacto o libere espacio para las matrices de CRISPR y/o genes Cas como se analizó anteriormente.
El término «operativo en trans» significa que el MGE (ICE) es operativo para transferencia horizontal usando proteínas expresadas a partir de secuencias de nucleótidos hospedadores fuera de las secuencias de nucleótidos vectoriales (por ejemplo, proteínas expresadas por un transposón conjugativo de la célula hospedadora) para transferir el MGE (o el vector completo, tal como un plásmido que contiene el MGE) en la segunda célula.
Un décimo principio se refiere al vector de cualquier principio anterior cuando está comprendido por la primera célula, en el que la oriT del MGE es la misma que una oriT comprendida por un ICE de la primera célula, en el que el ICE es operativa en trans para transferir el MGE a la segunda célula.
Un décimo primer principio se refiere al vector de cualquier principio anterior, en el que el vector oriT es una oriT de una Bacteroidetes (por ejemplo, Bacteroidales o Bacteroides) o transposón de Prevotella. Esto es útil cuando la primera y/o segunda célula hospedadora es una Bacteroidetes (por ejemplo, Bacteroidales o Bacteroides) o una célula Prevotella respectivamente. Por ejemplo, la primera célula es una célula de dicha especie y la segunda célula es una célula Firmicutes, la secuencia diana está comprendida por la segunda célula pero no la primera célula, por lo que la matriz de CRISPR dirige Cas en la segunda célula para cortar la secuencia diana. En un ejemplo, la secuencia diana está compuesta por un gen esencial o un gen de resistencia a antibióticos de la segunda célula (y para este último, opcionalmente el vector está en combinación con dicho antibiótico o administrado a un ser humano o animal no humano en combinación con dicho antibiótico). Opcionalmente, el transposón es un transposón CTnDot o CTnERL y el vector se encuentra en combinación con tetraciclina o se administra a un ser humano o animal no humano en combinación con tetraciclina.
Un décimo segundo principio se refiere al vector de cualquier principio precedente, en el que el vector oriT es un transposón oriT de la familia CTnDot, CTnERL SXT/R391, Tn916 o Tn4371.
Un décimo tercer principio se refiere al vector de cualquier principio anterior, en el que el MGE comprende una primera y una segunda secuencia de repetición terminal y la matriz de CRISPR entre las secuencias de repetición.
Un décimo cuarto principio se refiere al vector de cualquier principio anterior, en el que el MGE deja una copia de transposón (1) en la primera posición de ácido nucleico cuando se ha transferido a la segunda posición; o (2) en la primera célula cuando se ha transferido a la segunda célula. Esto es útil para promover la propogación y el mantenimiento del MGE en una población bacteriana que comprende la o las células hospedadoras. En una alternativa, el MGE no deja una copia de transposón (i) en la primera posición de ácido nucleico cuando se ha transferido a la segunda posición; o (ii) en la primera célula cuando se ha transferido a la segunda célula.
Un décimo quinto principio se refiere al vector de cualquier principio anterior cuando está comprendido por la primera y/o segunda célula (por ejemplo, primera y segunda copias del vector comprendido por la primera y segunda célula).
Un décimo sexto principio se refiere al vector del décimo quinto principio, en el que la primera y la segunda célula son células de diferentes especies. Por ejemplo, la primera célula es una célula de Lactobacillus (p. ej., como se describe en la presente memoria) y/o la segunda célula es un Bacteroidetes (p. ej., célula de Bacteroides, p. ej., dicha célula descrita en esta invención) o una célula de Firmicutes (p. ej., dicha célula descrita en esta invención). En un ejemplo, la primera célula es un Bacteroidetes (por ejemplo, una célula Bacteroides, por ejemplo, dicha célula descrita en esta invención) y la segunda célula es una célula Firmicutes (por ejemplo, dicha célula descrita en esta invención), por ejemplo, para la administración a un micribioma intestinal de un ser humano para tratar o prevenir una afección de Gl o diabetes; o para tratar o prevenir la obesidad.
Un décimo séptimo principio se refiere al vector del décimo quinto o décimo sexto principio, en el que la primera y la segunda célula son células bacterianas o arqueales.
Un décimo octavo principio se refiere al vector del décimo sexto o décimo séptimo principio, en el que la primera célula no es patógena en un ser humano (por ejemplo, una célula bacteriana comensal o simbiótica) y opcionalmente la segunda célula es una célula patógena en un ser humano. En una alternativa, la segunda célula es una célula no patógena en un ser humano. El término «no patógeno en un ser humano» incluye células, tales como determinadas especies bacterianas (por ejemplo, especies de Bacteroides, tales como fragalis) que pueden residir en microbiomas del ser humano (por ejemplo, el microbioma intestinal, vaginal, de axila u oral) sin patogenicidad o patogenicidad sustancial, pero en otros entornos del ser humano son patógenos. El experto en la técnica comprenderá fácilmente que el primer tipo de célula se puede retener en o sobre un ser humano y el segundo tipo de célula se debe reducir en o sobre el ser humano. Por ejemplo, la matriz de CRISPR modifica el genoma de la segunda célula para destruir o reducir la viabilidad o el crecimiento celular en o sobre el ser humano. Por ejemplo, el sitio diana está comprendido por la segunda célula y el sitio está cortado por dicha nucleasa de Cas, inactivando o regulando por disminución un gen que comprende el sitio diana. Por ejemplo, el gen es un gen esencial o un gen de resistencia a antibióticos de la segunda célula. En un ejemplo, el gen es un gen de virulencia.
Un décimo noveno principio se refiere al vector de cualquier principio anterior, o cualquier uso en esta invención, en el que la segunda célula (cada célula hospedadora) es una célula seleccionada de entre (i) una célula de Staphylococcus aureus, por ejemplo, resistente a un antibiótico seleccionado de entre meticilina, resistente a vancomicina y teicoplanina; (ii) una célula de Pseudomonas aeuroginosa, por ejemplo, resistente a un antibiótico seleccionado de entre cefalosporinas (por ejemplo, ceftazidima), carbapenemas (por ejemplo, imipenem o meropenem), fluoroquinolonas, aminoglucósidos (por ejemplo, gentamicina o tobramicina) y colistina; (iii) una célula de Klebsiella (por ejemplo, pneumoniae), por ejemplo, resistente a carbapenem; (iv) un Streptococus (por ejemplo, pneumoniae o pyogenes), por ejemplo, resistente a un antibiótico seleccionado de entre eritromicina, clindamicina, betalactámico, macrólido, amoxicilina, azitromicina y penicilina; (v) una célula de Salmonella (por ejemplo, serotipo Typhi), por ejemplo, resistente a un antibiótico seleccionado de entre ceftriaxona, azitromicina y ciprofloxacina; (vi) una célula de Shigella, por ejemplo, resistente a un antibiótico seleccionado de entre ciprofloxacina y azitromicina; (vii) una célula de mycobacterium tuberculosis, por ejemplo, resistente a un antibiótico seleccionado de entre resistencia a isoniazida (INH), rifampicina (RMP), fluoroquinolona, amikacina, kanamicina y capreomicina; (viii) una célula de Enterococcus, por ejemplo, resistente a vancomicina; (ix) una célula de Enterobacteriaceae, por ejemplo, resistente a un antibiótico seleccionado de entre cefalosporina y carbapenem; (x) una célula de E. coli, por ejemplo, resistente a un antibiótico seleccionado de entre trimetoprim, itrofurantoína, cefalexina y amoxicilina; (xi) una célula de Clostridium (por ejemplo, dificile), por ejemplo, resistente a un antibiótico seleccionado de entre un antibiótico de fluoroquinolona y carbapenem; (xii) una célula de Neisseria gonnorrhoea, por ejemplo, resistente a un antibiótico seleccionado de entre cefixima (por ejemplo, una cefalosporina oral), ceftriaxona (una cefalosporina inyectable), azitromicina y tetraciclina; (xiii) una célula de Acinetoebacter baumannii, por ejemplo, resistente a un antibiótico seleccionado de entre betalactámico, meropenem y carbapenem; o (xiv) una célula de Campylobacter, por ejemplo, resistente a un antibiótico seleccionado de entre ciproxina y azicina. Dichas especies pueden ser patógenas para los seres humanos.
Un vigésimo principio se refiere al vector o uso del principio décimo noveno, en el que el sitio diana está comprendido por un gen de resistencia a antibióticos de la segunda célula, en el que el antibiótico es un antibiótico respectivo mencionado en el principio décimo noveno.
Un vigésimo primer principio se refiere al vector de cualquiera de los principios décimo quinto a vigésimo, en el que la primera célula es una célula Bacteroidetes (por ejemplo, Bacteroidales o Bacteroides); Lactobacillus (por ejemplo, acidophilus (por ejemplo, La-5, La-14 o NCFM), brevis, bulgaricus, plantarum, rhammosus, fermentum, caucasicus, helveticus, lactis, reuteri o casei, por ejemplo, casei Shirota); Bifidobacterium (por ejemplo, bifidum, breve, longum o infantis); Streptococcus thermophiles; Enteroccus faecium; Alistipes; Alkaliflexus; Parabacteroides; Tannerella; o una célula de Xylanibacter.
Un vigésimo segundo principio se refiere al vector de cualquier principio anterior, en el que la primera y/o segunda posición de ácido nucleico de (i) están comprendidas por una célula Bacteroidetes (por ejemplo, Bacteroidales o Bacteroides); o la primera y/o segunda célula hospedadora de (ii) son células Bacteroidetes (por ejemplo, Bacteroidales o Bacteroides) o Prevotella.
Un vigésimo tercer principio se refiere al vector del vigésimo segundo principio, en el que la primera célula es una célula Bacteroidetes (por ejemplo, Bacteroidales o Bacteroides) y la segunda célula es una célula Firmicutes (por ejemplo, Clostridium o Staphylococcus), por ejemplo, en el que el vector es para la administración a un micribioma intestinal de un ser humano para tratar o prevenir una afección de Gl o diabetes; o para tratar o prevenir la obesidad.
Un vigésimo cuarto principio se refiere al vector del décimo sexto o décimo séptimo principio (o cualquier uso en esta invención), en el que la primera célula (cada primera célula) es ambientalmente aceptable en un entorno (por ejemplo, en un entorno de agua o suelo) y opcionalmente la segunda célula (cada célula hospedadora) no es aceptable en el entorno. El entorno acuático será fácilmente evidente para el experto en la técnica y puede, por ejemplo, ser un entorno marino o fluvial (por ejemplo, lago, canal, río o embalse). En un ejemplo, el medio acuático es el agua potable destinada al consumo humano o el agua de alcantarillado. En un ejemplo, el entorno del suelo es el suelo de tierra de cultivo o suelo en un sitio minero (por ejemplo, un sitio minero mineral o metálico).
Por «aceptable» y «no aceptable», el experto en la técnica comprenderá fácilmente que el primer tipo de célula se puede retener en el entorno y el segundo tipo de célula se debe reducir en el entorno. Por ejemplo, la matriz de CRISPR modifica el genoma de la segunda célula para destruir o reducir la viabilidad o el crecimiento celular en el entorno. Por ejemplo, el sitio diana está comprendido por la segunda célula y el sitio está cortado por dicha nucleasa de Cas, inactivando o regulando por disminución un gen que comprende el sitio diana. Por ejemplo, el gen es un gen esencial o un gen de resistencia a antibióticos de la segunda célula. En un ejemplo, el gen es un gen de virulencia.
En un ejemplo, el entorno es un microbioma de un ser humano, por ejemplo, el microbioma de la cavidad oral o el microbioma intestinal o el torrente sanguíneo. En un ejemplo, el medio ambiente no es un entorno en o sobre un ser humano. En un ejemplo, el ambiente no es un ambiente en o sobre un animal no humano. En una realización, el entorno es un entorno aéreo. En una realización, el entorno es un entorno agrícola. En una realización, el entorno es un entorno de recuperación de petróleo o gasolina, por ejemplo, un campo o pozo de petróleo o gasolina. En un ejemplo, el medio ambiente es un entorno en o sobre un producto alimenticio o bebida para consumo humano o animal no humano.
En un ejemplo, el vector, sistema, vector, matriz, ARNcr, ARNg, procedimiento o cualquier uso en esta invención es para uso en una industria o el medio ambiente es un entorno industrial, en el que la industria es una industria de un campo que se selecciona del grupo que consiste en la medicina y la salud; farmacéutica; alimentación humana; alimentación animal; fertilizantes vegetales; bebidas; productos lácteos; procesamiento de carne; agricultura; ganadería; cría de aves; piscicultura y mariscos; veterinaria; petróleo; gas; petroquímica; tratamiento de aguas; tratamiento de aguas residuales; empaquetado; electrónica e informática; cuidado personal y artículos de tocador; cosmética; dental; dental no médico; oftálmico; oftálmico no médico; minería y procesamiento de minerales; extracción y procesamiento de metales; cantera; aviación; automotriz; ferrocarril; transporte marítimo; espacio; medio ambiente; tratamiento de suelos; pulpa y papel; confección; tintes; impresión; adhesivos; tratamiento de aire; solventes; biodefensa; suplementos vitamínicos; almacenamiento y producción de fibra fría; biotecnología; productos químicos; limpieza; productos domésticos; productos de limpieza y detergentes; productos de consumo; silvicultura; pesca; reciclaje; plásticos; piel, cuero y ante; gestión de residuos; funerarias y empresas; combustibles; construcción; energía; siderurgia; e industria del tabaco.
Un vigésimo quinto principio se refiere al vector de cualquier principio anterior en combinación con un ácido nucleico (por ejemplo, un ADN) para su incorporación en el sitio diana modificado.
En un ejemplo, la modificación es el corte del sitio diana y el ácido nucleico (por ejemplo, ADN) se incorpora mediante recombinación homóloga en la célula hospedadora. Esto es útil para efectuar una modificación dirigida precisa del genoma de la célula hospedadora usando el vector de la invención.
Un vigésimo sexto principio se refiere al vector del vigésimo quinto principio, en el que el ácido nucleico para la incorporación es o comprende un elemento regulador o una secuencia de exones, por ejemplo, una secuencia humana.
Un vigésimo séptimo principio se refiere al vector de cualquier principio anterior en combinación con una transposasa para la movilización del MGE.
Un vigésimo octavo principio se refiere al vector o cualquier principio anterior, en el que el vector o MGE comprende un módulo de toxina-antioxina que es operativo en la primera célula hospedadora; opcionalmente en el que el módulo de toxina-antitoxina comprende un gen antitoxina que no es operativo o tiene una operación reducida en células que no sean la primera célula.
Un vigésimo noveno principio se refiere al vector o cualquier principio precedente, en el que el vector o MGE comprende un módulo de toxina-antioxina que es operable en la segunda célula hospedadora; opcionalmente en el que el módulo de toxina-antitoxina comprende un gen antitoxina que no es operable o tiene una operación reducida en células que no sean la segunda célula.
Un trigésimo principio se refiere al vector o cualquier principio anterior, en el que el vector o MGE comprende un módulo de toxina-antioxina que es operativo en la primera y segunda célula hospedadora; opcionalmenteen el que el módulo de toxina-antitoxina comprende un gen antitoxina que no es operativo o tiene una operación reducida en células que no sean la primera y la segunda célula. El uso de un módulo de toxina-antitoxina es útil para conferir ventajas selectivas y, por lo tanto, retención y propagación de MGE. Por ejemplo, el módulo es un módulo Tipo I, por ejemplo, un módulo Hok-Sok. Por ejemplo, el módulo es un módulo de tipo II, por ejemplo, un módulo HiCa-HicB. Por ejemplo, el módulo es un módulo de toxina-antitoxina tipo tad-ata. Por ejemplo, el módulo es un módulo de adicción a plásmidos. En un ejemplo, la primera y/o segunda célula es una célula de Bacteroides y el módulo es un módulo de una especie de Bacteroides, por ejemplo, el módulo de adicción de la familia Txe/YoeB (ver, por ejemplo, http://www.uniprot.org/uniprot/F0R9D1); el módulo de adicción de la familia RelE/StbE (ver, por ejemplo, http://www.uniprot.org/uniprot/F0R9A0); el módulo de adicción de la familia HigA (ver, por ejemplo, http://www.uniprot.org/uniprot/D7J8V2 o http://www.uniprot.org/uniprot/D2ESD0); el módulo de adicción de la familia RelE/StbE (ver, por ejemplo, http://www.uniprot.org/uniprot/F0R5F4). El uso de una toxina-antitoxina en el vector o MGE puede ser útil para permitir la destrucción de una célula portadora de vector que no sea una célula que se desea (por ejemplo, la primera y segunda y/o tercera célula bacteriana). En este ejemplo, el MGE o vector comprende un gen de toxina de un módulo de toxina bacteriana-antitoxina y un gen de antitoxina cognado, en el que la expresión de los genes de toxina y antitoxina se regulan por separado, por ejemplo, desde diferentes promotores. Por ejemplo, el gen de toxina puede comprender un promotor que es constitutivamente activo en la primera, segunda (y tercera) células de modo que la toxina siempre se produce. El gen antitoxina puede comprender un promotor que es inducible por uno o más factores (por ejemplo, una proteína expresada) en la primera y/o segunda célula, pero no en células no diana de diferentes cepas o especies. Como se sabe, la antitoxina es inherentemente menos estable que la toxina en un sistema de toxina bacteriana/antitoxina, y por lo tanto, la transferencia del vector o MGE a una célula que no es una célula diana (por ejemplo, no la primera y/o segunda célula) conducirá a la expresión de toxina en ausencia de expresión de antitoxina o menor actividad antitoxina, lo que conduce a la muerte celular de la célula no diana. Por lo tanto, esto crea una presión de selección para que las células diana (primera, segunda y tercera célula) tomen y retengan el vector de la invención para que pueda tener la actividad de la matriz de CRISPR deseada en este y también se propague a través de células diana en una población (tal como la microbiota intestinal). Esto también limita la propagación del vector o MGE a células no diana de modo que el efecto de la matriz se controla en la población; en este sentido habrá una presión para que las células no diana no tomen el vector y si lo hacen, las células receptoras no sobrevivirán en la población, limitando así la replicación de células no diana con el MGE y la matriz.
Un trigésimo primero principio se refiere al vector de cualquier principio anterior, en el que la primera y la segunda célula son del mismo filo (por ejemplo, ambas células bacterianas) y el vector es replicable u operativo (d) en la primera célula y/o segunda célula pero no en otra célula del mismo filo; (e) en la primera célula y/o segunda célula pero no en otra célula del mismo orden; (f) en la primera célula y/o segunda célula pero no en otra célula de la misma clase; (g) en la primera célula y/o segunda célula, pero no en otra célula del mismo orden; (h) en la primera célula y/o segunda célula, pero no en otra célula de la misma familia; (i) en la primera célula y/o segunda célula, pero no en otra célula del mismo género; (j) en la primera célula y/o segunda célula, pero no en otra célula de la misma especie; (k) en la primera célula y/o segunda célula, pero no en otra célula de la misma cepa.
Esto proporciona selectividad del vector de la invención (por ejemplo, para la destrucción selectiva del segundo tipo de célula hospedadora en una población bacteriana mixta) en un microbioma. Esto se puede lograr, por ejemplo, modificando genéticamente el MGE o matriz (por ejemplo, el promotor del mismo) para que requiera la expresión de una proteína particular para replicación u operación (por ejemplo, expresión para producir ARNcr). Por ejemplo, el promotor se puede seleccionar de un promotor que funciona en la primera y/o segunda célula pero no en otras células, o en el que el MGE se modifica genéticamente de modo que uno o más de los sitios de inicio de replicación de este dependan de una proteína u otro factor producido en la primera y/o segunda célula pero no en otras células. Un trigésimo segundo principio se refiere a la primera y segunda copia del vector de cualquier principio anterior en una población mixta de células, en el que el primer vector está comprendido por la primera célula, el segundo vector está comprendido por la segunda célula, las células son células de diferentes especies (por ejemplo, diferentes especies bacterianas) y el uno o ambos de los MGE del vector son capaces de transferirse a una tercera célula (por ejemplo, una célula bacteriana), en el que la tercera especie celular es la misma que la especie de la primera o segunda célula o es una especie que es diferente de la primera y segunda especie celular. Esto es útil, ya que la primera célula puede actuar como portadora (por ejemplo, cuando no es patógena se puede administrar a un ser humamano o animal para que pueble al ser humano o animal, tal como un microbioma del mismo). Mediante transferencia horizontal, el portador puede transferir y propogar matrices de CRISPR de la invención a terceras células (directamente o a través de segundas células, y esta última actúa como un reservorio para matrices). Las matrices pueden entonces mediar la modificación de Cas (por ejemplo, corte) de la secuencia diana en las terceras células, por ejemplo, para desactivar o regular a la baja un gen de resistencia a antibióticos o esencial de las terceras células.
En general en esta invención, cuando la secuencia diana está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos de una célula, el vector, secuencia modificada o matriz de la invención se puede administrar a un ser humano o animal junto con (de forma simultánea o secuencial) el antibiótico. Esto es útil para destruir o reducir la proliferación de células que comprenden la secuencia diana. En este sentido, el vector, secuencia modificada o matriz está comprendida por una composición que comprende un antibiótico, en el que la secuencia diana es una secuencia de un gen que codifica para la resistencia a dicho antibiótico.
Opcionalmente, la población mixta comprende la tercera célula.
En un ejemplo, se proporciona una pluralidad de las primeras células, cada una comprende un vector de la invención. En un ejemplo, se proporciona una pluralidad de las segundas células, cada una comprende un vector de la invención. En un ejemplo, se proporciona una pluralidad de las primeras células en combinación con una pluralidad de las segundas células, cada célula comprende un vector de la invención. En un ejemplo, se proporciona una pluralidad de las primeras células en combinación con una pluralidad de las segundas células y una pluralidad de las terceras células, células de al menos 2 (o todas) de dichas pluralidades que comprenden un vector de la invención.
Un trigésimo tercer principio se refiere a los vectores del trigésimo segundo principio, en el que el vector o MGE comprende un módulo de toxina-antioxina que es operativo en la primera, segunda y tercera células hospedadoras; opcionalmente en el que el módulo de toxina-antitoxina comprende un gen antitoxina que no es operativo o tiene una acción reducida (es decir, menor) en células que no sean la primera, segunda y tercera células.
Un trigésimo cuarto principio se refiere al vector de cualquier principio precedente, en el que el MGE es un transposón conjugado, oriT es funcional en la primera y segunda células hospedadoras, el MGE comprende una primera y segunda secuencias de repetición terminales y la matriz de CRISPR entre las secuencias de repetición, y en el que la primera y segunda células son células bacterianas, la segunda célula es de una especie de célula de microbiota humana (por ejemplo, una especie patógena), en el que el sitio diana está comprendido por la segunda célula pero no la primera célula, y en el que dicha modificación inactiva o regula por disminución un gen o secuencia reguladora que comprende dicha diana en la segunda célula.
De manera útil, las primeras células pueden actuar como portadores y depósitos para las matrices de la invención, que se pueden transferir mediante transferencia horizontal de los MGE.
En un ejemplo, el MGE es un transposón conjugado de Bacteroidetes, oriT es un oriT de Bacteroidetes funcional en la primera y segunda células hospedadoras, el MGE comprende una primera y segunda secuencias de repetición terminal y la matriz de CRISPR entre las secuencias de repetición, y en el que la primera y segunda células son células bacterianas, la primera célula es una célula de Bacteroidetes y la segunda célula es una célula Firmicutes (por ejemplo, célula de Clostridium o Staphylococcus), en el que el sitio diana está comprendido por la segunda célula pero no la primera célula, y en el que dicha modificación inactiva o regula por disminución un gen o secuencia reguladora que comprende dicha diana en la segunda célula.
Un trigésimo quinto principio se refiere al vector del principio trigésimo cuarto cuando está comprendido por la primera o segunda célula.
Un trigésimo sexto principio se refiere al vector de cualquier principio anterior, en el que la primera y segunda células están comprendidas por una población de células bacterianas mixtas, por ejemplo, una población de células de especies de microbiota intestinal, vaginal, de axila u oral humana o animal no humano (por ejemplo, perro, gato o caballo). Como se explicó anteriormente, la población es útil para la administración a un ser humano o animal para poblar un microbioma del mismo.
Un trigésimo séptimo principio se refiere a una composición ex vivo que comprende una pluralidad de células tal como se define en el vigésimo segundo principio, en el que cada célula comprende un vector según cualquiera de los principios primero a trigésimo sexto. Alternativamente, la composición es in vivo, por ejemplo, en un animal no humano.
Un trigésimo octavo principio se refiere a una bebida o producto alimenticio para consumo humano o animal no humano que comprende un vector de cualquiera de los principios primero a trigésimo sexto o la composición del principio trigésimo séptimo. La bebida puede ser, por ejemplo, una bebida probiótica, por ejemplo, para consumo diario, una vez cada dos días o semanalmente por parte de un ser humano o animal, por ejemplo, para tratar o prevenir la obesidad o una afección de Gl en el ser humano o animal.
Un trigésimo noveno principio se refiere a una composición que comprende una pluralidad de células Bacteroides, en el que cada célula comprende un vector según cualquiera de los principios primero a trigésimo sexto.
De forma útil, las células pueden actuar como portadoras y un reservorio de matrices de la invención, para la administración a un microbioma (por ejemplo, microbioma intestinal) de un ser humano o animal, por ejemplo, para tratar o prevenir la obesidad o una afección del GI en el ser humano o animal,
Un cuadragésimo principio se refiere a una población mixta de células bacterianas que comprende una subpoblación de primeras células y una subpoblación de segundas células, en el que las primeras células comprenden vectores según cualquiera del primer a trigésimo sexto principio, en el que los vectores son capaces de transferencia horizontal entre la primera y la segunda subpoblación celular. Dicha población es útil, ya que se puede administrar (por ejemplo, por vía intranasal) a un ser humano o animal de modo que las bacterias pueblen uno o más microbiomas (por ejemplo, microbioma intestinal) del ser humano o animal. La primera (y opcionalmente también la segunda) célula pueden actuar como portadoras de las matrices de CRISPR de la invención, especialmente cuando esas células no son patógenas para el ser humano o animal (por ejemplo, no patógenas en el microbioma intestinal). El microbioma puede ser cualquier otra población de microbioma o micribiota descrita en esta invención.
Un cuadragésimo primero principio se refiere a la población del principio cuadragésimo, en el que una o ambas de la primera y segunda especies bacterianas son capaces de poblar la microbiota intestinal de un animal humano o no humano, y opcionalmente las primeras bacterias son comensales o simbióticas con humanos o animales. De manera útil, las primeras bacterias se pueden administrar de forma segura al ser humano o animal y pueden actuar como un portador de las matrices de la invención para su transferencia posterior a otras células de la microbiota.
Un cuadragésimo segundo principio se refiere a la población del principio del cuadragésimo, en el que la población mixta está albergada por una bebida o agua (por ejemplo, una vía fluvial o agua potable para consumo humano) o suelo. La provisión de la población en agua o suelo es útil para tratarla en el medio ambiente o (para el agua) en sistemas de calefacción, refrigeración o industriales, o en recipientes de almacenamiento de agua potable.
En un ejemplo de cualquier principio, la segunda célula es una célula de cólera que comprende la secuencia diana, en el que cuando se modifica la secuencia diana, la célula se destruye o se reduce la proliferación celular. En un ejemplo, la segunda célula está comprendida por agua para consumo humano (por ejemplo, dicha agua antes o después del procesamiento para consumo humano). En un ejemplo, el vector está comprendido por una composición farmacéutica para administración a un ser humano para tratar o prevenir el cólera en el ser humano.
Un cuadragésimo tercer principio se refiere a una composición que comprende una pluralidad de vectores según cualquiera de los principios primero a trigésimo sexto in vitro. Por ejemplo, la composición se mezcla con una población bacteriana de múltiples especies en un aparato o recipiente industrial (por ejemplo, para alimentos, bienes de consumo, cosméticos, productos de atención médica personal, producción de petróleo o petróleo).
Un cuadragésimo cuarto principio se refiere al vector, la composición, el producto alimenticio, la bebida o la población de cualquier principio anterior para su administración a un ser humano o animal no humano para poblar y reequilibrar terapéutica o profilácticamente un microbioma del mismo o para cambiar cosméticamente el ser humano o animal (por ejemplo, para la pérdida de peso cosmética).
Un cuadragésimo quinto principio se refiere a un procedimiento de modificación de una secuencia de nucleótidos diana en una célula hospedadora, y el procedimiento comprende
(1) combinar la célula hospedadora con una célula portadora,
(a) en el que la célula portadora comprende un vector de ácido nucleico de CRISPR que comprende una matriz de CRISPR para modificar el objetivo,
(b) en el que la matriz de CRISPR comprende una o más secuencias para la expresión de un ARNcr y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en la célula hospedadora;
(c) en el que el ARNcr es capaz de hibridarse con la secuencia diana para guiar a Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana; y
(2) cultivar las células juntas, en las que el vector se transfiere de la célula portadora a la célula hospedadora, mediante lo cual el ARNcr se hibrida con la secuencia diana para guiar Cas en la célula hospedadora y se modifica la diana. En un ejemplo, el procedimiento se lleva a cabo ex vivo. En un ejemplo, el procedimiento es un procedimiento cosmético y no es un procedimiento médico terapéutico o profiláctico.
Un cuadragésimo sexto principio se refiere al procedimiento del principio cuadragésimo quinto, en el que el vector es según cualquiera de los principios 1 a 36.
Un cuadragésimo séptimo principio se refiere al procedimiento del principio cuadragésimo quinto o cuadragésimo sexto, en el que la célula hospedadora es una célula de una especie bacteriana de microbioma humano o animal no humano, opcionalmente en el que la célula hospedadora es una célula de una especie bacteriana patógena. En un ejemplo, cualquier microbioma en esta invención se selecciona de un microbioma intestinal, vaginal, de axila, cuero cabelludo, piel u oral.
Un cuadragésimo octavo principio se refiere al procedimiento de cualquiera de los principios cuadragésimo quinto a cuadragésimo séptimo, en el que la célula portadora es de una especie que es una especie bacteriana comensal o simbiótica de microbioma humano o animal no humano. En un ejemplo, la célula portadora no es patógena para los seres humanos, por ejemplo, cuando se administra por vía intranasal, tópica u oral.
En cualquier configuración, concepto, aspecto, realización o ejemplo, etc. en esta invención, el vector, composición, matriz o población de la descripción se administra por vía intranasal, tópica u oral a un animal humano o no humano, o es para dicha administración. El experto en la técnica que pretenda tratar un microbioma del ser humano o animal podrá determinar la mejor vía de administración, dependiendo del microbioma de interés. Por ejemplo, cuando el microbioma es un microbioma intestinal, la administración puede ser por vía intranasal u oral. Cuando el microbioma es un microbioma del cuero cabelludo o la axila, la administración puede ser por vía tópica. Cuando el microbioma está en la boca o la garganta, la administración puede ser por vía oral.
Un cuadragésimo noveno principio se refiere al procedimiento de cualquiera de los principios cuadragésimo quinto a cuadragésimo octavo, en el que la célula hospedadora es de una especie bacteriana del microbioma intestinal de un ser humano o animal no humano.
Un quincuagésimo principio se refiere a un procedimiento de alteración de la relación relativa de subpoblaciones de la primera y segunda especie de células hospedadoras de bacterias en una población mixta de bacterias que comprende dichas subpoblaciones, donde el
procedimiento comprende
A: proporcionar dichas primeras células hospedadoras bacterianas;
B: proporcionar las segundas células hospedadoras bacterianas, en el que las segundas células son células de una especie o cepa diferente a las primeras células;
C: introducir matrices de CRISPR modificadas genéticamente en las primeras células hospedadoras bacterianas, en el que cada
matriz de CRISPR comprende una o más secuencias para la expresión de un ARNcr y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en una segunda célula hospedadora, en la que el ARNcr es capaz de hibridarse con una secuencia diana comprendida por dicha segunda célula para guiar Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana;
D: combinar la primera y segunda células bacterianas para producir una población bacteriana mixta; y
E: permitir el crecimiento bacteriano en la población mixta de tal manera que la transferencia horizontal de matrices de CRISPR de las primeras células bacterianas a las segundas células bacterianas, en el que las secuencias diana en las segundas células se modifican con Cas, en el que se alteran las proporciones relativas de dichas primera y segunda bacterias.
Un quincuagésimo primer principio se refiere al procedimiento del quincuagésimo principio, en el que cada matriz de CRISPR es según cualquiera de los principios 1 a 26, del primero al vigésimo sexto.
Un quincuagésimo segundo principio se refiere al procedimiento del quincuagésimo o quincuagésimo primer principio, que comprende además obtener una primera muestra de la población mixta de la etapa E y opcionalmente comparar la proporción de segundas células en la primera muestra con la proporción de segundas células en una segunda muestra de células, en el que la segunda muestra es una muestra de una población mixta de células bacterianas usadas para proporcionar las segundas células en la etapa B y la comparación muestra que la proporción de segundas células ha aumentado o disminuido después de la etapa E.
Un quincuagésimo tercer principio se refiere al procedimiento del quincuagésimo segundo principio, en el que la segunda muestra es una muestra de un microbioma humano o animal (por ejemplo, intestino, vaginal, cuero cabelludo, axila, piel o células de la cavidad oral).
Un quincuagésimo cuarto principio se refiere al procedimiento de cualquiera de los principios quincuagésimo a quincuagésimo tercero, en el que una muestra de un microbioma humano o animal (por ejemplo, intestino, vaginal, cuero cabelludo, axila, piel o células de la cavidad oral) se utiliza para proporcionar las segundas células de la etapa B.
Un quincuagésimo quinto principio se refiere al procedimiento de cualquiera de los principios quincuagésimo a quincuagésimo cuarto, en el que se utiliza una población cultivada recombinante de las primeras células para la etapa A.
Un quincuagésimo sexto principio se refiere al procedimiento de cualquiera de los principios quincuagésimo a quincuagésimo quinto, en el que se utiliza transferencia horizontal de plásmido, ICE o transposón en la etapa E, en el que cada plásmido, ICE o transposón comprende dicha matriz de CRISPR.
Un quincuagésimo séptimo principio se refiere al procedimiento de cualquiera de los principios quincuagésimo a quincuagésimo sexto para reequilibrar terapéutica o profilácticamente la microbiota de un ser humano o animal no humano, por ejemplo, para tratar o prevenir la obesidad, diabetes IBD, una afección del sistema Gl o una afección de la cavidad oral. La diabetes puede ser de tipo I o II. En un ejemplo, la profilaxis es médica. En un ejemplo, la profilaxis
en esta invención es no médica, por ejemplo, cosmética o para fines de higiene. Por ejemplo, la microbiota es una microbiota de la axila y el procedimiento es para prevenir o reducir el olor corporal de un ser humano. Por ejemplo, en este caso, el procedimiento regula por disminución el crecimiento o viabilidad de células bacterianas hospedadoras que median la generación y/o persistencia del olor corporal humano.
Un quincuagésimo octavo principio se refiere al procedimiento de cualquiera de los principios quincuagésimo a quincuagésimo séptimo, que comprende proporcionar terceras células hospedadoras bacterianas de una especie o cepa que es diferente a las células portadoras y hospedadoras, en el que las terceras células están comprendidas por la población mixta en la etapa E o combinadas con dicha población después de la etapa E, en el que se produce la transferencia horizontal de matrices de CRISPR a terceras células hospedadoras.
Un quincuagésimo noveno principio se refiere al procedimiento del principio quincuagésimo octavo, en el que las terceras células no comprenden dicha secuencia diana.
De esta manera, las terceras células pueden actuar como portadoras de las matrices y son capaces de transferir horizontalmente matrices a células hospedadoras que comprenden la secuencia diana.
Un sexagésimo principio se refiere al procedimiento del quincuagésimo octavo principio, en el que las terceras células comprenden una secuencia diana para la modificación de Cas.
Un sexagésimo primer principio se refiere al procedimiento de cualquiera de los principios quincuagésimo a sexagésimo, en el que las células portadoras (y opcionalmente también las terceras) son de una especie mencionada en el principio vigésimo primero, por ejemplo, células Bacteroidetes.
Un sexagésimo segundo principio se refiere al procedimiento de cualquiera de los principios quincuagésimo a sexagésimo, en el que las células hospedadoras son de una especie mencionada en el décimo noveno principio o células Firmicutes.
Un sexagésimo tercer principio se refiere al vector, composición, producto alimenticio, bebida, población o procedimiento de cualquier principio anterior en el que cada vector es o está comprendido por un plásmido, fago (por ejemplo, un fago empaquetado) o fagémido.
Un sexagésimo cuarto principio se refiere al vector, la composición, el producto alimenticio, la bebida, la población o el procedimiento de cualquier principio anterior, en el que la modificación es (i) el corte de la secuencia diana, (ii) la transcripción de regulación por disminución de un gen que comprende la secuencia diana, (iii) la transcripción de regulación por aumento de un gen que comprende la secuencia diana o (iv) la adición, eliminación o sustitución de una secuencia de ácido nucleico en la diana.
Un sexagésimo quinto principio se refiere al vector, composición, producto alimenticio, bebida, población o procedimiento de cualquier principio anterior, en el que cada secuencia diana es una secuencia comprendida por un elemento regulador o gen de la célula hospedadora, en el que el gen es un gen esencial, un gen CRISPR o un gen de resistencia a antibióticos, opcionalmente en el que el elemento regulador es un elemento de dicho gen. Como alternativa, el gen es un gen de virulencia.
Un sexagésimo sexto principio se refiere al vector, composición, producto alimenticio, bebida, población o procedimiento de cualquier principio anterior, en el que cada secuencia diana es una secuencia comprendida por un genoma de fago, en el que el fago está comprendido por la célula hospedadora. En un ejemplo, la secuencia diana está comprendida por un gen de fago requerido para la infectividad de la célula hospedadora, el ciclo lisogénico o lítico del fago o la viabilidad del fago, por ejemplo, un gen esencial o un gen de proteína de recubrimiento.
En un ejemplo, el fago de Bacteroidetes es un fago de Bacteroides seleccionado de entre un fago crAssphage, un fago GB-124, un fago GA-17, un fago HB-13, un fago H16-10, un fago B40-8 y un fago B fragalis ATCC51477-B1. Esto es útil, por ejemplo, para proporcionar una ventaja de supervivencia a Bacteroidetes en el microbioma intestinal de un ser humano o animal. De esta manera, la relación de Bacteroidetes a Firmicutes se puede alterar para aumentar la proporción de los primeros frente a los segundos (por ejemplo, para tratar o prevenir la obesidad). En un ejemplo, la secuencia diana está comprendida por una secuencia codificante de dominio de BACON (Bacteroidetes-associated carbohydrate-binding) (por ejemplo, en el que el hospedador es un hospedador de Bacteroides) o una secuencia codificante de endolisina.
Un sexagésimo séptimo principio se refiere al vector, composición, producto alimenticio, bebida, población o procedimiento de cualquier principio anterior, en el que cada matriz de CRISPR comprende una secuencia R1-S1 -R1' para la expresión y producción del ARNcr respectivo en la célula hospedadora,
(i) en el que R1 es una primera repetición de CRISPR, R1' es una segunda repetición de CRISPR, y R1 o R1' es opcional; y
(ii) S1 es un primer espaciador CRISPR que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es en un 95 % o más idéntica a dicha secuencia diana.
Un sexagésimo octavo principio se refiere al vector, composición, producto alimenticio, bebida, población o procedimiento del sexagésimo séptimo principio, en el que R1 y R1' son al menos en un 95 % idénticos respectivamente a la primera y segunda secuencias de repetición de una matriz de CRISPR de la segunda especie de célula hospedadora.
Un sexagésimo noveno principio se refiere al vector, composición, producto alimenticio, bebida, población o procedimiento del sexagésimo octavo principio, en el que R1 y R1' son funcionales con un sistema CRISPR/Cas de dicha célula hospedadora para la modificación de la secuencia diana.
1. Un septuagésimo principio se refiere al vector, composición, producto alimenticio, bebida, población o procedimiento de cualquier principio anterior, en el que la o cada matriz está en combinación con una o más nucleasas de Cas que funcionan con el ARNcr respectivo en una célula hospedadora para modificar la secuencia diana. La secuencia diana comprende una secuencia protoespaciadora inmediatamente adyacente a un motivo adyacente al protoespaciador (PAM).
Un septuagésimo primero principio se refiere al vector, composición, producto alimenticio, bebida, población o procedimiento de cualquier principio anterior, en el que la o cada matriz está en combinación con secuencias de ácido nucleico que codifican una o más nucleasas de Cas que funcionan con el ARNcr respectivo en una célula hospedadora para modificar la secuencia diana.
Un septuagésimo segundo principio se refiere al vector, la composición, el producto alimenticio, la bebida, la población o el procedimiento de cualquiera de los principios sexagésimo séptimo a septuagésimo primero, en el que R1 y R1' son funcionales con una nucleasa Cas9 tipo II (por ejemplo, una Cas9 de S pyogenes o S aureus) para modificar la diana en una célula hospedadora, opcionalmente en el que el vector, la composición, el producto alimenticio, la bebida, la población o el procedimiento son además según el principio septuagésimo o septuagésimo primero, en el que Cas es dicha Cas9.
Un septuagésimo tercer principio se refiere a una población mixta ex vivo de bacterias que se puede obtener por el procedimiento de cualquiera de los principios quincuagésimo a septuagésimo segundo.
Un septuagésimo cuarto principio se refiere a una composición para administración a un ser humano o animal no humano para reducción de masa corporal terapéutica, profiláctica, cosmética, humana o no humana (por ejemplo, reducción cosmética) o uso nutricional, y la composición comprende la población mixta del septuagésimo tercer principio.
Un septuagésimo quinto principio se refiere a un alimento o bebida para el consumo de seres humanos o animales no humanos
que comprende la población mixta del septuagésimo tercer principio o la composición del septuagésimo cuarto principio.
Un septuagésimo sexto principio se refiere al producto alimenticio o bebida del septuagésimo quinto principio, que es un suplemento nutricional o una bebida probiótica o producto alimenticio.
Un septuagésimo séptimo principio se refiere a una composición antibiótica para tratar o prevenir una infección bacteriana en un ser humano o animal no humano o en agua potable o en el suelo, en el que la composición comprende un vector de cualquier a del primero al trigésimo sexto y del sexagésimo tercero al septuagésimo segundo principio.
Un septuagésimo octavo principio se refiere a una composición probiótica para aumentar la proporción de Bacteroidetes intestinales (por ejemplo, para tratar o prevenir la obesidad, diabetes o una afección inflamatoria del GI) en un ser humano o animal no humano, en el que la composición comprende un vector de cualquiera de los principios primero a trigésimo sexto y sexagésimo tercero a septuagésimo segundo.
Un septuagésimo noveno principio se refiere a la composición del septuagésimo cuarto, septuagésimo séptimo y septuagésimo octavo principio para aumentar las proporciones relativas de Bacteroides intestinales frente a Fermicutes en un ser humano o animal, por ejemplo, para tratar o prevenir la obesidad, la diabetes o una afección del Gl.
Un octogésimo principio se refiere al vector, la composición, el producto alimenticio, la bebida, la población o el procedimiento de cualquier principio anterior, en el que el vector no comprende una secuencia que codifica la nucleasa Cas que funciona con la matriz. Esto es útil para ahorrar espacio en el vector (por ejemplo, para permitir la inclusión de matrices más grandes o más matrices para el direccionamiento de células hospedadoras; esto es útil para dirigirse a múltiples ubicaciones del genoma para reducir la probabilidad de evolución de la resistencia a las matrices de la invención).
Un octogésimo primer principio se refiere al vector, la composición, el producto alimenticio, la bebida, la población o el procedimiento de cualquier principio anterior, en el que el MGE no comprende una secuencia que codifica la nucleasa Cas que funciona con la matriz. Esto es útil para ahorrar espacio en el MGE (por ejemplo, para permitir la inclusión de matrices más grandes o más matrices para el direccionamiento de células hospedadoras; esto es útil para dirigirse a múltiples ubicaciones del genoma para reducir la probabilidad de evolución de la resistencia a las matrices de la invención). Por ejemplo, es posible evitar incluir la endonucleasa Cas9 que codifica una secuencia grande.
Un octogésimo segundo principio se refiere al vector, la composición, el producto alimenticio, la bebida, la población o el procedimiento del principio octogésimo primero, en el que la matriz es operativa con una endonucleasa Cas que se encuentra en células de la misma especie o cepa que la primera y/o la segunda célula. En un ejemplo, la matriz es operativa con una endonucleasa Cas que se encuentra en células de la misma especie o cepa que una célula hospedadora o tercera célula.
Esto es útil para ahorrar espacio en el vector o MGE (por ejemplo, para permitir la inclusión de matrices más grandes o más matrices para el direccionamiento de células hospedadoras; esto es útil para dirigirse a múltiples ubicaciones del genoma para reducir la probabilidad de evolución de la resistencia a las matrices de la invención).
Un octogésimo tercer principio se refiere al vector, composición, alimento, bebida o población de cualquier principio anterior, en el que la primera y segunda células son células bacterianas de diferentes especies, en el que la segunda célula es de una especie de microbiota humana y la primera célula es de una especie que no es patógena en dicha microbiota humana, en el que la secuencia diana no está comprendida por el genoma de la primera célula, el MGE comprende un oriT que es operativo en la primera y segunda célula, en el que el MGE tiene capacidad de transferencia horizontal de la primera célula a la segunda célula.
Como alternativa, se prevé lo siguiente:
El procedimiento de cualquier principio anterior, en el que las células portadoras y hospedadoras son células bacterianas de diferentes especies, en el que la célula hospedadora es de una especie de microbiota humana y la célula portadora es de una especie que no es patógena en dicha microbiota humana, en el que la secuencia diana no está comprendida por el genoma de la célula portadora, en el que el MGE comprende un oriT que es operativo en las células portadoras y hospedadoras, en el que el MGE tiene capacidad de transferencia horizontal de la célula portadora a la célula hospedadora.
Un octogésimo cuarto principio se refiere al vector, composición, producto alimenticio, bebida, población o procedimiento del octogésimo tercer principio, en el que el vector está comprendido por un bacteriófago, y el bacteriófago es capaz de infectar la primera célula (portadora) para introducir el MGE en la primera célula (portadora).
Un octogésimo quinto principio se refiere al vector, composición, producto alimenticio, bebida, población o procedimiento de los principios octogésimo tercero u octogésimo cuarto, en el que la secuencia diana está comprendida por el genoma de la segunda célula (hospedadora) (por ejemplo, comprendida por un gen esencial o de resistencia a antibióticos del genoma).
Un octogésimo sexto principio se refiere al vector, la composición, el producto alimenticio, la bebida, la población o el procedimiento del octogésimo quinto, en el que la segunda especie de célula (hospedadora) es patógena en dicha microbiota humana, en el que la secuencia diana se modifica cortando la secuencia diana o regulando por disminución un gen que comprende dicha secuencia diana. En un ejemplo, la segunda célula (hospedadora) es una célula según cualquiera de las características (i) a (xiv) del décimo noveno principio. En un ejemplo, la segunda célula (hospedadora) es una célula Firmicutes, por ejemplo, en el que el vector es para tratar o prevenir la obesidad en un ser humano.
Un octogésimo séptimo principio se refiere al vector, la composición, el producto alimenticio, la bebida, la población o el procedimiento de los principios octogésimo tercero, octogésimo cuarto u octogésimo quinto, en el que la segunda especie de célula (hospedadora) no es patógena en dicha microbiota humana.
Un octogésimo octavo principio se refiere al vector, composición, producto alimenticio, bebida, población o procedimiento de cualquiera de los principios octogésimo tercero a octogésimo séptimo, en el que la segunda célula (hospedadora) es una célula Bacteroidetes o Prevotella; opcionalmente en el que el MGE tiene capacidad de transferencia horizontal desde la segunda especie (hospedadora) de células a especies Firmicutes de dicha microbiota humana. Este último es útil, por ejemplo, para tratar o prevenir la obesidad en un ser humano cuando la secuencia objetivo está comprendida por los Firmicutes, pero no la primera (portadora) o segunda (hospedadora) célula.
Un octogésimo noveno principio se refiere al vector, la composición, el producto alimenticio, la bebida, la población o el procedimiento de cualquiera de los principios octogésimo tercero u octogésimo octacvo, en el que el I/ZIGE tiene capacidad de transferencia horizontal desde la segunda especie de célula (hospedadora) a una tercera especie de célula bacteriana de dicha microbiota humana, en el que la tercera especie de célula es patógena en dicha microbiota humana y comprende dicha secuencia diana. En un ejemplo, la primera (portadora) y la segunda (hospedadora) célula no comprenden la secuencia diana. Un nonagésimo principio se refiere al vector, la composición, el producto alimenticio, la bebida, la población o el procedimiento del octagésimo noveno principio, en el que la tercera célula es una célula según cualquiera de las características (i) a (xiv) del décimo noveno principio.
Un nonagésimo primer principio se refiere al vector, la composición, el producto alimenticio, la bebida, la población o el procedimiento de cualquier principio anterior, en el que el MGE carece de una secuencia que codifica una endonucleasa Cas que es operativa con secuencias de repetición de la matriz, y en el que el vector comprende dicha secuencia (por ejemplo, que codifica una Cas9) fuera del MGE.
Cualquiera de las características generales también puede aplicarse a la presente configuración. Cualquiera de las características de cualquier otra configuración, aspecto, párrafo, ejemplo, realización o concepto en esta invención también se puede combinar con las presentes configuraciones que emplean MGE.
Por lo tanto, la invención proporciona las siguientes características, numeradas como párrafos; estos párrafos se aplican a cualquiera de los aspectos tal como se mencionan, o a cualquiera de los principios primero a nonagésimo primero, o a cualquier otra configuración en esta invención:
en un primer párrafo, se proporciona un vector de cualquiera de los aspectos cuadragésimo tercero a cuadragésimo noveno, en el que la secuencia diana es una secuencia de nucleótidos de un sistema CRISPR/Cas hospedador, en el que el ARNcr guía Cas a la diana para modificar el sistema CRISPR/Cas hospedador en la célula hospedadora.
Un segundo párrafo se refiere al vector del primer párrafo 1, en el que el sistema CRISPR/Cas hospedador es un sistema Tipo I, II o III y la secuencia diana es una secuencia de nucleótidos conservada en dicho tipo de sistema en al menos una, dos o tres cepas o especies hospedadoras adicionales, en el que dichas cepas o especies adicionales son diferentes de dicho hospedador.
Un tercer párrafo se refiere al vector de cualquier párrafo anterior, en el que la secuencia diana es idéntica a una secuencia del sistema CRISPR/Cas de una especie de Streptococcus (por ejemplo, S thermophilus o S pyogenes).
Un cuarto párrafo se refiere al vector de cualquier párrafo anterior, en el que la secuencia diana del sistema CRISPR/Cas hospedador comprende
i. una matriz líder de CRISPR o una secuencia promotora líder contigua con el nucleótido 5' más cercano de la primera repetición (y que comprende opcionalmente dicho nucleótido 5' más cercano de la repetición, por ejemplo, que comprende los primeros 3 nucleótidos en el extremo 5' de la primera repetición);
ii. una secuencia de hasta 20 (por ejemplo, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 30 o 32) nucleótidos contiguos inmediatamente 5' de la primera repetición;
iii. una secuencia de hasta 20 (por ejemplo, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 30 o 32) nucleótidos contiguos de los nucleótidos del 5' más cercanos de la primera repetición; o
iv. una secuencia de hasta 20 (por ejemplo, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 30 o 32) nucleótidos contiguos inmediatamente 3' de la primera repetición de espaciador (y opcionalmente en el que la secuencia comprende el nucleótido más cercano al 3' del primer espaciador, por ejemplo, que comprende los últimos 3 nucleótidos en el extremo 3' de la primera repetición).
Un quinto párrafo se refiere al vector del primer, segundo o tercer párrafo, en el que la matriz está compuesta por un vector de ácido nucleico (por ejemplo, un virus, virión, fago, fagémido o profago) y
i. el ARNcr comprende o consiste en la estructura R-S-R, en la que R=una repetición CRISPR y S=un espaciador CRISPR, en la que S comprende, (en dirección 5' a 3') V-Hr o Hr -V o, en la que V=una secuencia idéntica a una secuencia de ADN del vector y HR=una secuencia de ADN de una repetición de una matriz de CRISPR de dicha matriz de CRISPR de la célula hospedadora;
ii. en el que la secuencia de Hr es inmediatamente contigua con la secuencia de V en la matriz de CRISPR hospedadora; y
iii. en el que el ARNcr es capaz de hibridarse con un espaciador de la matriz de CRISPR del hospedador para guiar a Cas a la diana del hospedador para la modificación de la matriz de CRISPR del hospedador en la célula.
Por ejemplo, V es una secuencia de una secuencia de codificación de proteína de recubrimiento de vector de fagos. En este sentido, Heler y col. hallaron en un estudio de resistencia bacteial que tres mutantes resistentes a bacteriófagos independientes de CRISPR mostraron un defecto marcado en la adsorción de fagos (alrededor del 50 %), lo que indica que lo más probable es que tengan mutaciones de resistencia de envoltura.
Un sexto párrafo se refiere al vector del quinto párrafo, en el que el primer ARNcr no se hibrida o no se hibrida sustancialmente con el ácido nucleico presente en el vector. Por ejemplo, el primer ARNcrno se hibrida con V en el vector o se hibrida menos fuertemente de lo que se hibrida con el espaciador de la matriz del hospedador. Las pruebas de hibridación son rutinarias para el experto en la técnica. Por ejemplo, se puede determinar in vitro aislando o sintetizando el ADN del vector e incubándolo con el ARNcr. Las técnicas estándar, por ejemplo, mediante PCR pueden usarse para detectar si se ha producido o no la hibridación (por ejemplo, probado bajo condiciones de pH y temperatura que se encontrarían en la célula hospedadora).
Un séptimo párrafo se refiere al vector del quinto o sexto párrafo, en el que V=uno o hasta 40 (por ejemplo, hasta 15) nucleótidos contiguos del ADN del vector. La secuencia de la semilla inmediatamente 5' del PAM en el protoespaciador encontrado en una secuencia diana es importante para el apareamiento de ARNcr y el funcionamiento del sistema CRISPR/Cas para cortar. Esta secuencia de la semilla incluye alrededor de 15 o 12 nucleótidos contingentes inmediatamente 5' del PAM.
Un octavo párrafo se refiere al procedimiento, matriz o vector de cualquier aspecto o párrafo anterior, en el que la matriz está comprendida por un vector y comprende (en dirección 5' a 3') una primera secuencia de repetición, una primera secuencia espaciadora y una segunda secuencia de repetición, en el que la secuencia espaciadora comprende una secuencia que es capaz de hibridarse (por ejemplo, es idéntica o tiene más de un 90 % de identidad) con la secuencia diana en la célula hospedadora, y la matriz comprende además un promotor para la transcripción de las repeticiones y espaciador en la célula hospedadora, y opcionalmente el vector comprende una secuencia que codifica la nucleasa Cas y/o una secuencia que codifica el ARNtracr para codificar una secuencia funcional de Cas y/o ARNtracr en la célula hospedadora, en el que la secuencia de ARNtracr comprende una secuencia que es complementaria a la primera o segunda repetición.
Un noveno párrafo se refiere al procedimiento, matriz o vector de cualquier aspecto o párrafo anterior, en el que la matriz de CRISPR está comprendida por un vector y comprende (en dirección 5' a 3') una primera secuencia de repetición, una primera secuencia espaciadora y una segunda secuencia de repetición, en el que la secuencia espaciadora comprende una secuencia que es capaz de hibridarse (por ejemplo, es idéntica o tiene más de un 90 % de identidad) con la secuencia diana en la célula hospedadora, y la matriz comprende además un promotor para la transcripción de las repeticiones y espaciador en la célula hospedadora, y en el que el vector no comprende una secuencia que codifica la nucleasa Cas y/o una secuencia que codifica el ARNtracr para codificar una secuencia de ARNtracr en la célula hospedadora, en el que la secuencia de ARNtracr comprende una secuencia que es complementaria a la primera o segunda repetición, en el que la matriz de HM-CRISPR es funcional en la célula hospedadora para guiar Cas (por ejemplo, nucleasa hospedadora endógena) al sitio hospedador, utilizando opcionalmente una secuencia de ARNtracr hospedador.
Un décimo párrafo se refiere al procedimiento, matriz o vector del octavo o noveno párrafo, en el que las repeticiones son idénticas a las repeticiones en una matriz hospedadora, en el que la matriz de CRISPR de la invención no comprende un PAM reconocido por un Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas, por ejemplo, Cas9) de un sistema CRISPR/Cas hospedador. La capacidad de omitir secuencias de Cas libera espacio en la matriz de la invención.
Un «gen esencial» es un gen en el hospedador cuya presencia o expresión se requiere para el crecimiento de la célula hospedadora o para promover o mantener la viabilidad celular. Un gen de resistencia es un gen en el hospedador cuya presencia o expresión se requiere para proporcionar resistencia completa o parcial a un fármaco antihospedador, por ejemplo, un antibiótico, por ejemplo, un antibiótico betalactámico. Un gen de virulencia es un gen en el hospedador cuya presencia o expresión se requiere para la infectividad de un organismo que la célula hospedadora es capaz de infectar, por ejemplo, en el que el hospedador es un patógeno (por ejemplo, de una planta, animal, ser humano, ganado, animal de compañía, planta, ave, pez o insecto).
Un décimo primer párrafo se refiere al procedimiento, matriz o vector de cualquier aspecto o párrafo anterior, en el que la matriz de CRISPR está en combinación con una Cas de célula no hospedadora (por ejemplo, un sistema Cas de tipo I en el que el sistema hospedador es un tipo II o III; un sistema Cas de Tipo II en el que el sistema hospedador es un tipo I o III; o un sistema Cas de tipo III en el que el sistema hospedador es un tipo I o II), opcionalmente en el que la célula hospedadora no comprende o expresa una Cas de un tipo que es el mismo que el tipo de la Cas no hospedadora. Esto es útil ya que la matriz de CRISPR no se dirige a una secuencia en sí misma (tal como en el vector) o una Cas codificada por vector en el hospedador.
Un décimo segundo párrafo se refiere al procedimiento, matriz o vector de cualquier aspecto o párrafo anterior, en el que la matriz de CRISPR está en combinación con una secuencia de ARNtracr o una secuencia que codifica una secuencia de ARNtracr (por ejemplo, en el mismo ácido nucleico que la matriz), opcionalmente en el que la secuencia de ARNtracr y ARNcr-HM están comprendidas por un único ARN guía (ARNg)).
Un décimo tercer párrafo se refiere al procedimiento, matriz o vector de cualquier aspecto o párrafo anterior, en el que matriz de CRISPR está en combinación con una Cas o una secuencia que codifica una Cas, opcionalmente en el que la matriz está integrada en un genoma de célula hospedadora y la Cas es endógena a la célula hospedadora o está codificada por una secuencia exógena. En un ejemplo, la secuencia que codifica Cas es una secuencia exógena que se ha introducido en el hospedador, por ejemplo, a partir de un plásmido o virus, tal como un fago.
Un décimo cuarto párrafo se refiere al procedimiento, matriz o vector de cualquier aspecto o párrafo anterior, en el que la matriz de CRISPR está comprendida por una secuencia de nucleótidos de un plásmido, virus, virión, fago, fagémido o profago. El fagémido es un fago empaquetado. El profago es un fago integrado en el cromosoma hospedador o episomal en la célula.
Un décimo quinto párrafo se refiere al procedimiento, matriz o vector de cualquier aspecto o párrafo anterior, en el que la matriz de CRISPR está integrada en un genoma de célula hospedadora, por ejemplo, en un cromosoma o ácido nucleico episomal.
En un ejemplo, la matriz está en combinación con una Cas muerta (por ejemplo, dCas9) conjugadora con un activador de transcripción o traducción que actúa sobre la secuencia diana o un gen que comprende la secuencia diana. Esto es útil, por ejemplo, para activar la expresión génica en la célula hospedadora (por ejemplo, de un gen deseado, por ejemplo, una secuencia génica exógena que se modificó previamente en la célula hospedadora, por ejemplo, para codificar un antibiótico donde el hospedador es un microbio, o para codificar una proteína exógena deseada para su producción en el cultivo hospedador, por ejemplo, para alimentos, bebidas, medicamentos o cualquier otra aplicación de la invención como se describe en esta invención).
Un décimo sexto párrafo se refiere a un virus (por ejemplo, un virión, fago, fagémido o profago) que comprende una matriz de CRISPR de cualquier aspecto o párrafo anterior, por ejemplo, para infectar una célula, por ejemplo, un microbio o para su uso en medicina u odontología.
Un décimo séptimo párrafo se refiere a una población de viriones según el décimo sexto párrafo, un primer y un segundo virión del mismo que comprende diferentes líderes de matriz o promotores y/o para dirigirse a diferentes secuencias diana en la célula hospedadora o en diferentes cepas hospedadoras.
Un décimo octavo párrafo se refiere a una colección de matrices de CRISPR, en la que cada matriz es según cualquier aspecto o párrafo anterior, en la que una primera matriz comprende un primer promotor para la transcripción de ARNcr; una segunda matrtiz comprende un segundo promotor para la transcripción de ARNcr que es diferente del primer promotor; y en la que cada promotor es idéntico a un promotor hospedador o es un homólogo del mismo; opcionalmente en la que el primer o ambos promotores son idénticos a un promotor Cas hospedador (por ejemplo, Cas1, 2, 9 o Csn2) o un promotor de la matriz de CRISPR hospedadora. Por ejemplo, el primer promotor es un promotor de nucleasa Cas endógeno o un promotor Cas1 o Cas2 endógeno; o el promotor de un gen endógeno que se expresa alta o constitutivamente o es un gen esencial, de virulencia o resistencia de la célula hospedadora. Mediante el uso de promotores endógenos, habrá presión durante la evolución del hospedador para preservar los promotores del hospedador y, por lo tanto, esto disminuye la probabilidad de que el sistema de defensa CRISPR/Cas del hospedador se dirija a uno o más promotores de las matrices.
Un décimo noveno párrafo se refiere a una colección de matrices de CRISPR de la invención, en la que una primera matriz comprende uno o más espaciadores (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 20, 30, 40, 50 o más espaciadores); y la segunda matriz comprende más de un espaciador (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 20, 30, 40, 50 o más espaciadores), en la que dichos espaciadores de la segunda matriz son idénticos al uno o más espaciadores de la primera matriz. Esto es útil para evadir la resistencia del hospedador mediante la recombinación homóloga de espaciadores de la matriz HM, ya que probar muchos de dichos espaciadores en la matriz HM (o además distribuir los espaciadores a través de una pluralidad de matrices) aumenta las posibilidades de que algunos espaciadores de la matriz HM permanezcan en la célula hospedadora incluso si la célula hospedadora elimina algunos de los espaciadores. La defensa contra la eliminación también se mejora mediante el uso de diferentes repeticiones que flanquean copias idénticas de los espaciadores en diferentes matrices. Por lo tanto, la descripción proporciona lo siguiente:
Un vigésimo párrafo se refiere a la colección del décimo octavo o décimo noveno párrafo, en la que los espaciadores (o dichos espaciadores) de la primera matriz están flanqueados por primeras repeticiones que son idénticas; los espaciadores (o dichos espaciadores) de la segunda matriz están flanqueados por segundas repeticiones que son idénticas; y en la que las primeras repeticiones son diferentes de las segundas repeticiones.
Un vigésimo primer párrafo se refiere a la recopilación del vigésimo párrafo, en la que las primeras repeticiones son idénticas a las repeticiones en un sistema CRISPR/Cas de célula hospedadora.
Un vigésimo segundo párrafo se refiere a la recopilación del vigésimo párrafo, en la que las primeras repeticiones son diferentes de las repeticiones en un sistema CRISPR/Cas hospedador.
Un vigésimo tercer párrafo se refiere a la colección de cualquiera de los párrafos décimo octavo a vigésimo segundo, en la que la primera y segunda formación están contenidas en la misma célula hospedadora o en el mismo vector (por ejemplo, plásmido, virus, virión, fago, fagémido o profago).
Un vigésimo cuarto párrafo se refiere a la colección de cualquiera de los párrafos décimo octavo a vigésimo segundo, en la que la primera matriz está contenida en un primer vector y la segunda matriz está contenida en un segundo vector que no contiene la primera matriz (por ejemplo, en el que los vectores son plásmidos o viriones (por ejemplo, del mismo tipo de virus) o fagos empaquetados (por ejemplo, del mismo tipo de fago).
En una realización, los vectores utilizados en el procedimiento de la invención son vectores comprendidos por una matriz de cualquiera de los párrafos décimo octavo a vigésimo cuarto.
Un vigésimo quinto párrafo se refiere a una célula hospedadora que comprende una matriz, virus, virión, fago, fagémido, profago, población o colección según cualquier párrafo anterior.
Cualquiera de las características generales (ver más abajo) también puede aplicarse a la presente configuración.
Un ejemplo de la invención proporciona lo siguiente para reducir el riesgo de adaptación del hospedador y resistencia a la matriz:
la matriz de CRISPR o vector de la invención para modificar una secuencia de nucleótidos diana de una célula hospedadora,
a. en el que la célula hospedadora comprende un primer promotor endógeno (primer promotor hospedador) para
la transcripción de la secuencia diana;
b. en el que la matriz de CRISPR comprende una secuencia que codifica un ARNcr y un primer promotor para la transcripción del ARNcr, en el que el ARNcr está opcionalmente comprendido por un ARN guía simple (ARNg) y es capaz de hibridarse con la secuencia diana hospedadora para guiar a Cas hacia la diana en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana;
c. en el que la secuencia del primer promotor es la secuencia de un segundo promotor hospedador endógeno que es diferente a la secuencia del primer promotor hospedador.
En un ejemplo, se utiliza un promotor para cada unidad CRISPR de vector (por ejemplo, fago) que es un promotor de un gen esencial en el hospedador; de esa manera el hospedador expresará bien el ARNcr (y constitutivamente si el promotor es de un gen hospedador que siempre o a menudo debe estar encendido). El hospedador no se adaptará fácilmente lejos de ese promotor, por lo que no ganará resistencia fácilmente. Opcionalmente es posible utilizar diferentes promotores esenciales para diferentes unidades CRISPR vectoriales para disminuir la posibilidad de adaptación del hospedador (resistencia). Uno puede usar el promotor de la virulencia o gen esencial o de resistencia que es dirigido en el hospedador por la matriz (o una matriz diferente). Para obtener resistencia al fago, el hospedador necesitaría mutar el promotor génico endógeno y el sitio de direccionamiento génico (que puede, por ejemplo, estar en una secuencia codificante que es esencial para el crecimiento celular, la viabilidad o la resistencia al fármaco antihospedador (por ejemplo, antibiótico)) y, por lo tanto, también arriesgar inactivar el gen de esa manera.
La provisión según la invención de múltiples copias de secuencias de ácido nucleico que codifican ARNcr, en lasque las copias comprenden la misma secuencia espaciadora para dirigirse a una secuencia de célula hospedadora según la invención es ventajosa para reducir las posibilidades de eliminación de hospedador (por ejemplo, mediante recombinación homóloga de célula hospedadora) de espaciadores de direccionamiento útiles del vector. Se pueden proporcionar múltiples espaciadores de direccionamiento de forma flexible, en la misma o múltiples matrices HM de la invención para proporcionar formas alternativas de evadir la resistencia.
Por lo tanto, la descripción proporciona los siguientes conceptos: En un primer concepto, se proporciona un sistema CRISPR/Cas modificador de hospedador (HM) (por ejemplo, Tipo I, II o III) para modificar una secuencia de nucleótidos diana de una célula hospedadora, comprendiendo el sistema componentes según
(i) a (iv):
(i) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas (por ejemplo, una Cas9);
(ii) una matriz de CRISPR de modificación de hospedador (HM) modificada genéticamente (por ejemplo, una matriz como se describió anteriormente) que comprende una secuencia espaciadora (HM-espaciador) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, y el ARNcr-HM comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con una secuencia diana hospedadora para guiar a Cas a la diana en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana;
(iii) una secuencia de ARNtracr opcional o una secuencia de ADN para expresar una secuencia de ARNtracr;
(iv) en el que dichos componentes del sistema comprenden dos, tres o más copias (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 20, 30, 40, 50 o más); de secuencias de ácido nucleico que codifican ARNcr, en el que las copias comprenden la misma secuencia espaciadora para dirigirse a una secuencia de célula hospedadora (por ejemplo, una virulencia hospedadora, resistencia o secuencia génica esencial o una secuencia de un componente del sistema CRISPR/Cas del hospedador que media la adaptación del vector).
Por ejemplo, el sistema comprende 4 o más; o 5 o más; de dichas copias de secuencias de ácido nucleico que codifican ARNcr que comprenden el mismo espaciador. Esto es ventajoso para aumentar la expresión de ARNc deseados en el hospedador. Además, esto proporciona una mayor probabilidad de evitar la resistencia del hospedador, ya que se necesitará seleccionar más de una secuencia (especialmente si puede haber copias como 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o 100 o más). La distribución de las copias en diferentes matrices, por ejemplo, el vector comprende estos espaciados en la misma cadena de ADN, es útil para reducir las posibilidades de recombinación entre espaciadores o entre repeticiones flanqueantes que a continuación podrían conducir a la escisión de las secuencias codificantes de ARNc deseadas. Las posibilidades de que el hospedador extirpe todas las copias se reducen al proporcionar copias distribuidas a través de muchas matrices de vectores, también se reduce al incluir muchas copias de los espaciadores deseados (por ejemplo, muchas copias en una primera matriz de vectores y muchas copias en una segundo matriz de vectores - es posible incluir al menos 2, 3, 4, 5, 6, 10 o más de dichas matrices, cada uno que comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 o más copias del espaciador deseado).
Un segundo concepto se refiere al sistema del primer concepto, en el que dichos componentes del sistema comprenden 4, 5, 10,15 o 20 más de dichas copias de secuencias de ácido nucleico que codifican ARNcr que comprenden el mismo espaciador.
Un tercer concepto se refiere al sistema del primer o segundo concepto, en el que las copias se dividen entre dos o más matrices de vectores de ácido nucleico CRISPR.
Un cuarto concepto se refiere al sistema del tercer concepto, en el que el sistema comprende una primera y una segunda matriz HM, en el que una primera y una segunda matriz de CRISPR de vector están contenidas en la misma célula hospedadora o en el mismo vector (por ejemplo, un plásmido, virus, virión, fago, fagémido o profago).
Un quinto concepto se refiere al sistema del tercer o cuarto concepto, en el que la primera matriz está contenida en un primer vector y la segunda matriz está contenida en un segundo vector que no contiene la primera matriz (por ejemplo, en el que los vectores son plásmidos o viriones (por ejemplo, del mismo tipo de virus) o fagémidos (por ejemplo, del mismo tipo de fago).
Un sexto concepto se refiere al sistema de cualquier concepto anterior, en el que las repeticiones son idénticas a las repeticiones en una matriz de CRISPR hospedadora.
Un séptimo concepto se refiere al sistema de cualquiera del primero al quinto concepto, en el que las repeticiones no son idénticas a las repeticiones en una matriz de CRISPR hospedadora.
Un octavo concepto se refiere a una célula hospedadora que comprende un sistema, vector, virus, virión, fago, fagémido o profecía según cualquier concepto precedente.
Un noveno concepto se refiere a una composición antimicrobiana (por ejemplo, un antibiótico, por ejemplo, un medicamento, desinfectante o enjuague bucal), que comprende un sistema, vector, virus, virión, fago, fagémido o profago según cualquiera de los conceptos primero u octavo.
Cualquiera de las características generales (ver más abajo) también puede aplicarse a los presentes conceptos.
DIVIDIR EL SISTEMA CRISPR/CAS9
Esta configuración es ventajosa para liberar espacio en los vectores diana, por ejemplo, virus o fagos que tienen capacidad restringida para transportar secuencias exógenas. Al liberar espacio, uno es capaz de incluir más espaciadores de direccionamiento o matrices, que es útil para evadir la resistencia del hospedador. Es ventajoso, por ejemplo, aprovechar la endonucleasa Cas endógena en lugar de codificarla en el vector, especialmente para secuencias Cas voluminosas como sp o saCas9. Además, no hay posibilidad de compatibilidad inferior como se puede ver con algunos Cas exógenos de fuentes no hospedadoras. La capacidad de reducir el virus, por ejemplo, el tamaño del genoma del fago, también puede ser beneficiosa para promover la captación de células hospedadoras (infección y/o mantenimiento del virus en células hospedadoras). En algunos ejemplos, una ventaja es que la invasión del hospedador por el vector (por ejemplo, fago) puede regular por aumento la actividad de CRISPR/Cas del hospedador, que incluye una mayor expresión de nucleasas Cas del hospedador, en un intento del hospedador de combatir el ácido nucleico invasor. Esto, sin embargo, también es útil para proporcionar Cas endógena para su uso con las matrices, vectores, sistemas y otros aspectos de esta descripción de configuración cuando estos comprenden una o más repeticiones que son reconocidas por la Cas hospedadora. En el caso en que la invención implique uno o más espaciadores dirigidos a una matriz de CRISPR hospedadora, esto favorece la desactivación de la matriz de CRISPR hospedadora en sí, similar a una célula hospedadora «suicida» que a continuación utiliza su propia nucleasa Cas para desactivar sus propios sistemas CRISPR.
Por lo tanto, la descripción proporciona las siguientes características, numeradas como posiciones: En una primera posición, se proporciona un sistema CRISPR/Cas9 modificador de hospedador (HM) (por ejemplo, tipo I, II o III) para modificar una secuencia de nucleótidos diana de una célula hospedadora, comprendiendo el sistema componentes según (i) a (iv):
(i) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas (por ejemplo, una Cas9);
(ii) una matriz de CRISPR de modificación de hospedador (HM) modificada genéticamente (por ejemplo, una matriz de la invención descrita anteriormente) que comprende una secuencia espaciadora (HM-espaciador) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, y el ARNcr-HM comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con una secuencia diana hospedadora para guiar dicha Cas a la diana en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana;
(iii) una secuencia de ARNtracr opcional o una secuencia de ADN para expresar una secuencia de ARNtracr;
(iv) en la que dichos componentes del sistema se dividen entre la célula hospedadora y al menos un vector de ácido nucleico que puede transformar la célula hospedadora, mediante lo cual el ARNcr-HM guía Cas a la diana para modificar la secuencia diana en la célula hospedadora.
«Dividir» aquí significa que el vector comprende uno o más (pero no todos) de los componentes del sistema y la célula hospedadora comprende uno o más (pero no todos) de los componentes, y el vector comprende uno o más componentes que no están comprendidos por la célula hospedadora. En una realización, el vector y la célula hospedadora no comparten ninguno de los componentes comunes, por ejemplo, la célula hospedadora comprende el componente (i) y el vector comprende el componente (ii), y o bien el vector comprende el componente (iii) y/o la célula hospedadora comprende el componente (iii). Cuando el vector está dentro de la célula hospedadora (p. ej., como un vector integrado o episomal, p. ej., un profago), se pretende que el vector sea el ácido nucleico que ha sido proporcionado por un vector que ha transformado la célula hospedadora (y los componentes del sistema proporcionados por dicho ácido nucleico no se interpretan en ese caso como componentes de la célula hospedadora). Esto se puede determinar fácilmente mediante la secuenciación de ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico cromosómico y episómico) del hospedador transformado y compararlo con las secuencias de un hospedador no transformado del mismo tipo (por ejemplo, de la misma colonia o clon parental hospedador, por ejemplo, cuando el hospedador es un microbio, por ejemplo, una bacteria o arqueo).
Opcionalmente, el sistema es un sistema CRISPR/Cas9. Opcionalmente, la nucleasa de (a) es una nucleasa Cas de Tipo I. Opcionalmente, la nucleasa de (a) es una nucleasa Cas de Tipo II (por ejemplo, una Cas9). Opcionalmente, la nucleasa de (a) es una nucleasa Cas de Tipo III.
Una segunda posición se refiere al sistema de la primera posición, en el que al menos uno de los componentes es endógeno a la célula hospedadora.
Una tercera posición se refiere al sistema de la primera o segunda posición, en el que el componente (i) es endógeno a la célula hospedadora.
Una cuarta posición se refiere al sistema de una cualquiera de la primera a la tercera posición, en el que el componente (iii) es endógeno a la célula hospedadora.
Una quinta posición se refiere a un sistema CRISPR/Cas de modificación de hospedador (HM) (por ejemplo, Tipo I, II o III) para modificar una secuencia de nucleótidos objetivo de una célula hospedadora, donde el sistema comprende componentes según (a) a (e):
a. al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas (por ejemplo, una Cas9);
b. una matriz de CRISPR de modificación de hospedador (HM) modificado genéticamente que comprende una secuencia espaciadora (HM-espaciador) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, el ARNcr-HM comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con una secuencia diana hospedadora para guiar dicha Cas a la diana en la célula hospedadora;
c. una secuencia de ARNtracr opcional o una secuencia de ADN para expresar una secuencia de ARNtracr;
d. en el que dichos componentes del sistema se dividen entre al menos un primer y un segundo vector de ácido nucleico, en el que en el primer vector comprende el componente (a) pero el segundo vector carece del componente (a); y
e. en el que los vectores pueden cotransformar simultánea o secuencialmente la célula hospedadora, mediante lo cual el ARNcr-HM guía Cas a la diana para modificar la secuencia diana en la célula hospedadora.
La definición de «división» proporcionada anteriormente se aplica mutatis mutandis al presente ejemplo que comprende un primer y un segundo vector.
En una realización, los vectores no proporcionan una secuencia de ARNtracr, sino que es una secuencia de ARNtracr de un sistema CRISPR/Cas de célula hospedadora endógena, en el que el ARNtracr es capaz de hibridarse con el ARNcr-HM en la célula para el procesamiento posterior en ARNcr maduro para guiar Cas a la diana en la célula hospedadora.
Una sexta posición se refiere al sistema de la quinta posición, en el que el primer vector comprende el componente
(a) y el segundo vector comprende los componentes (b) y (c).
Una séptima posición se refiere al sistema de la quinta o sexta posición, en el que cada uno del primer y/o segundo vector comprende una, dos, tres o más matrices HM-CRISPR modificadas genéticamente.
Una octava posición se refiere al sistema de cualquiera de la quinta a la séptima posición, en el que uno del primer y segundo vector es un fagémido y el otro vector es un fago auxiliar.
Una novena posición se refiere al sistema de cualquier posición anterior (por ejemplo, tercera o sexta posición), en el que la secuencia de ARNcr y la secuencia de ARNtracr están comprendidas por un único ARN guía (ARNg), por ejemplo, proporcionado por el vector.
Una décima posición se refiere al sistema de cualquier posición anterior, en el que cada vector tiene una capacidad restringida para la inserción de ácido nucleico exógeno.
Una décima primera posición se refiere al sistema de cualquier posición anterior, en el que el vector o vectores son virus (por ejemplo, viriones, fagos empaquetados, fagémidos o profagio).
Una décima segunda posición se refiere al sistema de cualquier posición anterior, en el que la célula hospedadora comprende una cadena de ácido desoxirribonucleico con un extremo libre (ADN-HM) que codifica una secuencia HM de interés y/o en el que el sistema comprende una secuencia que codifica el ADN-HM (por ejemplo, integrada en el vector o en el genoma de célula hospedadora o un episoma del mismo), en el que el ADN-HM comprende una secuencia o secuencias que son homólogas respectivamente a una secuencia o secuencias en o flanqueando la secuencia diana.
La cadena comprende un extremo libre, es decir, un extremo no integrado en el ADN hospedador o vector de modo que la cadena tiene uno o dos extremos libres, es decir, el ADN se desvincula de un nucleótido vecino inmediatamente 5' y/o 3' de forma respectiva.
Una décima tercera posición se refiere al sistema de la décima segunda posición, en el que el sitio diana se corta en la célula hospedadora mediante Cas (por ejemplo, mediante Cas9 cuando dicha nucleasa Cas es un Cas9), y el ADN-HM comprende una primera y segunda secuencia que son homólogas 5' y 3' respectivamente que flanquean el corte para insertar el ADN-HM en el genoma hospedador (por ejemplo, en un sitio cromosómico o episómico).
Una décima cuarta posición se refiere al sistema de la décima tercera posición, en el que la inserción es mediante recombinación dirigida por homología (HDR).
Una décima quinta posición se refiere al sistema de la décima tercera posición, en el que la inserción es mediante unión terminal no homóloga (NHEJ).
Una décima sexta posición se refiere al sistema de cualquiera de las posiciones décima segunda a décima quinta, en el que la secuencia HM- es o codifica un elemento regulador (por ejemplo, un promotor, por ejemplo, un promotor inducible que reemplaza a un promotor endógeno), una secuencia inhibidora de transcripción, una secuencia potenciadora de transcripción, una etiqueta o una secuencia que codifica una proteína o dominio exógeno.
Una décima séptima posición se refiere al sistema de cualquiera de las posiciones décima segunda a décima sexta, en el que el sistema comprende un primer y un segundo ADN-HM en el que una secuencia del primer ADN-HM es complementaria a una secuencia del segundo ADN por lo que los ADN son capaces de combinarse en la célula hospedadora
mediante recombinación homologa para formar un ADN-HM combinado para su inserción en el genoma de la célula hospedadora (por ejemplo, en un sitio cromosómico o episómico).
Una décima octava posición se refiere al sistema de cualquier posición anterior, en el que el vector o vectores son capaces de infectar la célula hospedadora para introducir ácido nucleico vectorial que comprende un componente del sistema en la célula.
Una décima novena posición se refiere al sistema de cualquier posición anterior, en el que dicha nucleasa Cas es una nickasa.
Una vigésima posición se refiere al sistema de cualquier posición anterior, en el que la célula es una bacteria o arquea y dicha nucleasa Cas es proporcionada por un sistema CRISPR/Cas tipo II endógeno de la bacteria o arquea.
Una vigésima primera posición se refiere al sistema de cualquier posición anterior, en el que el vector o vectores se encuentran dentro de dicha célula hospedadora, opcionalmente integrada en un ADN hospedador.
Una vigésima segunda posición se refiere al sistema de cualquier posición anterior, en el que el vector o los vectores carecen de una secuencia de codificación de Cas (por ejemplo, una Cas9).
Una vigésima tercera posición se refiere a un vector viral de ácido nucleico modificado genéticamente (por ejemplo, un vector, un virión o un fago empaquetado como se describió anteriormente) para infectar una célula hospedadora de microbios que comprende un sistema CRISPR/Cas endógeno, el vector
(a) que comprende secuencias de ácido nucleico para expresar una pluralidad ARNcr diferentes para su uso en un sistema CRISPR/Cas según cualquier posición anterior; y
(b) carecer de una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas (por ejemplo, una Cas9), en el que uno de dichos ARNcr es capaz de hibridarse con una primera secuencia de ácido nucleico en dicha célula hospedadora; y un segundo de dichos ARNcr es capaz de hibridarse con una segunda secuencia de ácido nucleico en dicha célula hospedadora, en el que dicha segunda secuencia es diferente de dicha primera secuencia; y (c) la primera secuencia está comprendida por un gen de resistencia antimicrobiano (por ejemplo, antibiótico) (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen de resistencia antimicrobiana (o ARN del mismo); opcionalmente en el que los genes son diferentes;
(d) la primera secuencia está comprendida por un gen de resistencia antimicrobiana (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen esencial o de virulencia (o ARN de este);
(e) la primera secuencia está comprendida por un gen esencial (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen esencial o de virulencia (o ARN del msimo); o
(f) la primera secuencia está comprendida por un gen de virulencia (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen esencial o de virulencia (o ARN del mismo).
Una vigésima cuarta posición se refiere a un vector de ácido nucleico modificado genéticamente (modificado genéticamente o aislado de un vector en una célula hospedadora, donde ese vector se derivó de un vector modificado genéticamente que transformó el hospedador) para transformar una célula hospedadora que comprende un sistema CRISPR/Cas endógeno, el vector opcionalmente es un vector como se describió anteriormente y (a') comprende secuencias de ácido nucleico para expresar una pluralidad de ARNcr diferentes para su uso en un sistema CRISPR/Cas según cualquier posición anterior; y
(b') que carece de una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas (por ejemplo, una Cas9), en el que uno de dichos ARNcr es capaz de hibridarse con una primera secuencia de ácido nucleico en dicha célula hospedadora; y un segundo de dichos ARNcr es capaz de hibridarse con una segunda secuencia de ácido nucleico en dicha célula hospedadora, en el que dicha segunda secuencia es diferente de dicha primera secuencia; y la primera y/o segunda secuencia es una secuencia diana del sistema CRISPR/Cas hospedador cuya secuencia es o comprende
(c') una secuencia de ADN o ARN de repetición (por ejemplo, en el que la repetición es la repetición más cercana al 5' (la primera repetición) en dicha matriz de CRISPR hospedadora;
(d') una secuencia de ARNtracr o una secuencia de ADN que codifica ARNtracr;
(e') una secuencia líder de la matriz de CRISPR;
(f') un promotor del gen Cas (por ejemplo, un promotor Cas1, Cas2 o Csn2);
(g') una secuencia promotora líder de la matriz de CRISPR; o
(h') una secuencia de ADN o ARN que codifica Cas (por ejemplo, en el que Cas es Cas9, Cas1, Cas2 o Csn2), por ejemplo, en la que un primero de dichos ARNcr es capaz de dirigirse a una secuencia del gen Cas1 del hospedador (o una secuencia de un ARN del mismo) y un segundo de dichos ARNcres capaz de dirigirse a una secuencia del gen Cas2 del hospedador (o una secuencia de un ARN del mismo).
Una vigésima quinta posición se refiere al vector de la vigésima cuarta posición, en el que la primera y/o segunda secuencia diana es o comprende
i una matriz líder de CRISPR o una secuencia promotora líder contigua con el nucleótido 5' más cercano de la primera repetición (y que comprende opcionalmente dicho nucleótido 5' más cercano de la repetición, por ejemplo, que comprende los primeros 3 nucleótidos en el extremo 5' de la primera repetición;
ii. una secuencia de hasta 20 (por ejemplo, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 30 o 32) nucleótidos contiguos inmediatamente 5' de la primera repetición;
iii. una secuencia de hasta 20 (por ejemplo, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 30 o 32) nucleótidos contiguos de los nucleótidos del 5' más cercanos de la primera repetición; o
iv. una secuencia de hasta 20 (por ejemplo, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 30 o 32) nucleótidos contiguos inmediatamente 3' del primer espaciador (y opcionalmente en el que la secuencia comprende el nucleótido más cercano a 3' del primer espaciador), por ejemplo, que comprende los últimos 3 nucleótidos en el extremo 3' de la primera repetición.
Una vigésima sexta posición se refiere al vector de la vigésima cuarta o vigésima quinta posición, en el que la secuencia diana o cada una de las secuencias diana está comprendida por una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en los SEQ. ID NO: 1 a 44, o un complemento de los mismos.
Una vigésima séptima posición se refiere al vector de cualquiera de las posiciones vigésima cuarta a vigésima sexta, en el que el primer ARNcr comprende o consiste en la estructura R-S-R, en la que R=una repetición de CRISPR y S=un espaciador de CRISPR, en la que S comprende, (en dirección 5' a 3') V-Hr o Hr-V o, en la que V=una secuencia idéntica a una secuencia de ADN del vector y h|R=una secuencia de ADN de una repetición de una matriz de CRISPR de dicho sistema de CRISPR/Cas de célula hospedadora, en el que el primer ARNcr es capaz de hibridarse con un espaciador de la matriz de CRISPR hospedera para guiar a Cas a la diana del ARNcr para la modificación de la matriz de CRISPR hospedera en la célula.
Una vigésima octava posición se refiere al vector de la vigésima séptima posición, en el que el primer ARNcr no se hibrida sustancialmente con el ácido nucleico presente en el vector, por ejemplo, en el que el primer ARNcr no se hibrida con V en el vector o se hibrida menos fuertemente que con el espaciador de la matriz hospedadora. El análisis anterior sobre la determinación de esto también se aplica a esta posición.
Una vigésima novena posición se refiere al vector de la vigésima séptima o vigésima octava posición, en el que V=uno o hasta 40 (por ejemplo, hasta 15) nucleótidos contiguos del ADN del vector. Por ejemplo, V=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleótidos contiguos del ADN del vector.
Una trigésima posición se refiere al vector de la vigésima novena posición, en el que
i. el sistema CRISPR/Cas hospedador es capaz de reconocer un PAM cognado;
j. en el que el ADN vector comprende dicho PAM inmediatamente 3' de una secuencia protoespaciadora;
k. en el que V=uno o hasta 40 (por ejemplo, hasta 15) nucleótidos del protoespaciador; y
l. en el que F|R=una secuencia idéntica a una secuencia contigua de la repetición de la matriz de CRISPR hospedadora.
Una trigésima primera posición se refiere al vector de la trigésima posición, en el que dicha secuencia contigua de la repetición de la matriz hospedadora es una secuencia de al menos un 50 % de una repetición hospedadora (por ejemplo, que incluye el nucleótido más 5' o más 3' de la repetición hospedadora).
Una trigésima segunda posición se refiere al vector de la trigésima o trigésima primera posición, en el que V=de 1 a 40 (por ejemplo, hasta 15) de los nucleótidos contiguos protoespaciadores más cercanos al 3'; y opcionalmente dicha secuencia contigua de la repetición incluye el nucleótido más cercano al 5' de la repetición hospedadora.
Una trigésima tercera posición se refiere al vector de la trigésima o trigésima primera posición, en el que V=de 1 a 40 (por ejemplo, hasta 15) de los nucleótidos contiguos protoespaciadores más cercanos al 5'; y opcionalmente dicha secuencia contigua de la repetición incluye el nucleótido más cercano al 3' de la repetición hospedadora.
Una trigésima cuarta posición se refiere al vector de cualquiera de las posiciones vigésima séptima a trigésima tercera, en el que R=una repetición que es reconocida por el sistema CRISPR/Cas hospedador. Alternativamente, R=una repetición que no es reconocida por el sistema CRISPR/Cas hospedador. En este caso, preferentemente el vector comprende una secuencia de nucleótidos de una nucleasa Cas (y opcionalmente un ARNtracr) que es cognada con R, es decir, es capaz de funcionar con R en la célula hospedadora.
Una trigésima quinta posición se refiere a un vector según cualquiera de las posiciones vigésima cuarta a trigésima cuarta, en el que la primera secuencia es según cualquiera de (c') a (h') y la segunda secuencia se selecciona a partir de un gen esencial del hospedador, un gen de virulencia o un gen de resistencia.
Una trigésima sexta posición se refiere a un vector viral de ácido nucleico modificado genéticamente (por ejemplo, un virión o fago empaquetado) para su uso en el sistema de cualquiera de la primera a la vigésima segunda posición para infectar una célula hospedadora de microbio que comprende un sistema CRISPR/Cas endógeno,
a. el vector que comprende una primera secuencia de ácido nucleico para expresar un primer ARNcr en el hospedador; y
b. en el que la primera secuencia comprende (en dirección 5' a 3') R1 a-S1 -R1 b, en la que R1 a=una primera repetición de CRISPR, en el que R1a es opcional; R1b =una segunda repetición de CRISPR y S1=un espaciador de CRISPR complementario a una secuencia hospedadora (por ejemplo, una secuencia hospedadora mencionada en la posición 23 o 24), en el que R1a y R1b son reconocidas por una nucleasa Cas hospedadora (por ejemplo, una nucleasa tipo II, por ejemplo, una Cas9);
c. en el que el vector carece (i) de una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas (por ejemplo, una Cas9) que reconoce la(s) repetición(es) de (b) y/o (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de ARNtracr que es complementaria a una secuencia de ARNcr codificada por la primera secuencia.
Por ejemplo, el vector es un vector de ácido nucleico comprendido por un fago.
Una trigésima séptima posición se refiere al vector de la trigésima sexta posición, en el que
d. el vector comprende una segunda secuencia de ácido nucleico para expresar el segundo ARNcr en el hospedador, en el que el segundo ARNcres diferente del primer ARNcr;
e. en el que la segunda secuencia comprende (en dirección 5' a 3') R2a-S2-R2b, en la que R2a=una primera repetición de CRISPR, en la que R2a es opcional; R2b=una segunda repetición de CRISPR y S2=un espaciador de CRISPR complementario a una secuencia hospedadora (por ejemplo, una secuencia hospedadora mencionada en la posición 23 o 24), en el que R2a y R2b son reconocidos por una nucleasa Cas hospedadora (por ejemplo, una nucleasa tipo I o II, por ejemplo, una Cas6).
Por lo tanto, por ejemplo, la primera y segunda secuencias de ácido nucleico están comprendidas por el mismo fagémido empaquetado, por ejemplo, en las mismas o diferentes formaciones de CRISPR.
Una trigésima octava posición se refiere al vector de la trigésima séptima posición, en la que el vector carece de (iii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un Cas (por ejemplo, un Cas6) que reconoce la repetición o repeticiones de (e) y/o (iv) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de ARNtracr que es complementaria a una secuencia de ARNcr codificada por la segunda secuencia.
Una trigésimo novena posición se refiere a una colección de vectores virales de ácido nucleico modificados genéticamente (por ejemplo, vectores, viriones o fagos empaquetados como se describió anteriormente) para su uso en el sistema de cualquiera de la primera a la vigésima segunda posición para la coinfección de una célula hospedadora de microbios que comprende un sistema CRISPR/Cas endógeno, y la colección comprende un primer vector y un segundo vector,
f. en el que el primer vector es según la trigésima sexta posición;
g. en el que el segundo vector comprende una segunda secuencia de ácido nucleico para expresar el segundo ARNcr en el hospedador, en el que el segundo ARNcr es diferente del primer ARNcr;
h. en el que la segunda secuencia comprende (en dirección 5' a 3') R2a-S2-R2b, en el que R2a=una primera repetición de CRISPR, en el que R2a es opcional; R2b=una segunda repetición de CRISPR y S2=un espaciador de CRISPR complementario a una secuencia hospedadora, en el que R2a y R2b son reconocidos por una nucleasa Cas hospedadora (por ejemplo, una nucleasa de tipo I o II, por ejemplo, una Cas6).
Por ejemplo, el primer vector está comprendido por una primera fagemida empaquetada y el segundo vector está comprendido por una segunda fagemida empaquetada.
Una cuadragésima posición se refiere a la colección de la trigésima novena posición, en la que el segundo vector comprende (v) una secuencia de ácido nucleico que codifica una Cas (por ejemplo, una Cas9) que reconoce la repetición o repeticiones de (b) y/o (vi) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de ARNtracr que es complementaria a una secuencia de ARNcr codificada por la primera secuencia.
Por ejemplo, en este caso las funciones Cas son proporcionadas por el sistema hospedador endógeno. Esto ahorra espacio vectorial (por ejemplo, para la inclusión de más espaciadores de matriz HM dirigidos al hospedador) y simplifica la construcción de vectores y matrices.
Una cuadragésima primera posición se refiere a la colección de la trigésima novena o cuadragésima posición, en la que el segundo vector carece de (vii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un Cas (por ejemplo, un Cas6) que reconoce la(s) repetición(es) de (h) y/o (viii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de ARNtracr que es complementaria a una secuencia de ARNcr codificada por la segunda secuencia.
Por ejemplo, en este caso las funciones Cas son proporcionadas por el sistema hospedador endógeno.
Una cuadragésima segunda posición se refiere a la colección de la trigésima novena posición, en la que el primer y el segundo vector carecen cada uno de (ix) una secuencia de ácido nucleico que codifica una Cas (por ejemplo, una Cas9) que reconoce la repetición o repeticiones de (b) y (x) una secuencia de ácido nucleico que codifica una Cas (por ejemplo, una Cas6) que reconoce la repetición o repeticiones de (h); opcionalmente en la que la colección está comprendida por una célula hospedadora que comprende una o más Cas que reconocen la repetición o repeticiones de (b) y (h).
Una cuadragésima tercera posición se refiere a la colección de la cuadragésima segunda posición, que comprende además un tercer vector (por ejemplo, un virión o un fago) que comprende una secuencia de ácido nucleico según (ix) y/o (x).
Una cuadragésima cuarta posición se refiere a la colección de cualquiera de las posiciones trigésima novena a cuadragésima tercera, en la que cada vector está comprendido por un respectivo virión o fagémido empaquetado, o un respectivo virión o ácido nucleico de fago.
Una cuadragésima quinta posición se refiere al vector o colección de cualquiera de las posiciones trigésima sexta a cuadragésima cuarta, en el que R1a y R1b comprenden la misma secuencia de repetición.
Una cuadragésima sexta posición se refiere al vector o colección de cualquiera de las posiciones trigésima séptima a cuadragésima quinta, en el que R2a y R2b comprenden la misma secuencia de repetición.
Una cuadragésima séptima posición se refiere al vector o colección de cualquiera de las posiciones trigésima séptima a cuadragésima sexta, en la que la repetición o repeticiones de (b) son reconocidas por una nucleasa Cas que es diferente de la nucleasa Cas que reconoce la repetición o repeticiones de (e).
Una cuadragésima octava posición se refiere al vector o colección de cualquiera de las posiciones trigésima séptima a cuadragésima séptima, en el que el hospedador comprende sistemas CRISPR/Cas de diferentes tipos (por ejemplo, sistema de un tipo I y uno de tipo II; sistemas de tipo I y III; sistemas de tipo II y III; o sistemas de tipo I, II y III).
Una cuadragésima novena posición se refiere al vector o colección de cualquiera de las posiciones trigésima sexta a cuadragésima octava, en el que la repetición o repeticiones de (b) son reconocidas por una nucleasa Cas tipo II, por ejemplo, una Cas9.
Una quincuagésima posición se refiere al vector o colección de cualquiera de las posiciones trigésima séptima a cuadragésima novena, en el que la repetición o repeticiones de (e) son reconocidas por una nucleasa Cas tipo I o III, por ejemplo, una Cas6.
Una quincuagésima primera posición se refiere al vector o colección de cualquiera de las posiciones vigésima tercera a quincuagésima, en el que el vector es un virus, un virión, un fago, un fagémido o un profago.
Una quincuagésima segunda posición se refiere al vector o colección de cualquiera de las posiciones vigésima tercera a quincuagésima primera dentro de una célula hospedadora que comprende una o más Cas que operativas con ARNc codificado por el o los vectores.
Una quincuagésima tercera posición se refiere al vector o colección de cualquiera de las posiciones vigésima tercera a quincuagésima segunda dentro de una célula hospedadora que comprende una Cas9.
Una quincuagésima cuarta posición se refiere al vector o colección de cualquiera de los ejemplos vigésima tercera a quincuagésima tercera, en combinación con un ADN-HM (por ejemplo, integrado en el vector, en un plásmido o en el genoma de la célula hospedadora o un episoma del mismo), en el que el ADN-HM es tal como se menciona en cualquiera de las posiciones décima segunda a decima séptima.
Una quincuagésimo quinta posición se refiere al sistema, vector o colección de cualquier posición anterior, que comprende secuencias de ácido nucleico para expresar una pluralidad de ARNcr diferentes, en la que dichos ARNcr son capaces de dirigirse a al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o 100 secuencias de ADN en la célula ho spe da do ra .
Una quincuagésima sexta posición se refiere al sistema, vector o colección de cualquier posición anterior, que comprende un primer ARNcr o una secuencia de ácido nucleico que codifica un primer ARNc que es capaz de dirigirse a una secuencia de ADN de una nucleasa Cas (o secuencia de un ARN de la misma) que no es dicha nucleasa Cas (por ejemplo, Cas9) pero que media la adaptación del vector hospedador; que comprende opcionalmente un segundo ARNcr o una secuencia de ácido nucleico que codifica un segundo ARNc que es capaz de dirigirse a una secuencia de una resistencia, virulencia o gen hospedador esencial (o ARN de la misma) en el hospedador.
Una quincuagésimo séptima posición se refiere al sistema, vector o colección de cualquier posición anterior, que comprende dos, tres o más copias de secuencias de ácido nucleico que codifican ARNcr, en el que las copias comprenden la misma secuencia espaciadora para dirigirse a una secuencia de célula hospedadora (por ejemplo, una virulencia, resistencia o secuencia génica esencial o una secuencia de un componente del sistema CRISPR/Cas hospedador que media la adaptación del vector, pero que no es dicha nucleasa Cas).
Una quincuagésima octava posición se refiere al sistema, vector o colección de la posición quincuagésima séptima, en el que las copias se dividen entre dos o más matrices de CRISPR vectoriales.
Una quincuagésima novena posición se refiere al sistema, vector o colección de cualquier posición anterior, en el que las repeticiones de vector son idénticas a las repeticiones en una o la matriz de CRISPR hospedadora (por ejemplo, cada repetición de vector tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con una repetición hospedadora).
Una sexagésima posición se refiere al sistema, vector o colección de cualquiera de la primera a la quincuagésima octava posición, en el que las repeticiones de vector no son idénticas a las repeticiones en una o la matriz de CRISPR hospedadora.
Una sexagésima primera posición se refiere al sistema, vector o colección de cualquier posición anterior, que comprende una primera y una segunda matriz de CRISPR de vector que están contenidas en la misma célula hospedadora o por el mismo vector (por ejemplo, plásmido o virus o virión o fago o profago o fagémido).
Una sexagésima segunda posición se refiere al sistema, vector o colección de la posición sexagésima primera, en el que la primera matriz está contenida en un primer vector y la segunda matriz está contenida en un segundo vector que no contiene la primera matriz (por ejemplo, en el que los vectores son plásmidos o viriones (por ejemplo, del mismo tipo de virus) o fagémidos (por ejemplo, del mismo tipo de fago).
Una sexagésima tercera posición se refiere a una célula hospedadora que comprende un sistema, vector, colección, virus, virión, fago, fagémido o profago según cualquier posición anterior.
Una sexagésima cuarta posición se refiere a una composición antimicrobiana (por ejemplo, un antibiótico, por ejemplo, un medicamento, desinfectante o enjuague bucal), que comprende un sistema, vector, virus, virión, fago, fagémido o profago según cualquiera de la primera a la sexagésima posición.
ACONDICIONAMIENTO DE MICROBIOS CONJUNTAMENTE
La descripción proporciona procedimientos para producir microbios (por ejemplo, fagos y/o poblaciones bacterianas) que implican acondicionar hospedadores y virus juntos para facilitar la coevolución y, por lo tanto, acondicionar los hospedadores a los virus (por ejemplo, fagos) y viceversa. Mediante el control represible de la expresión o actividad de ARNcr, la descripción modula deliberadamente la coevolución de una manera controlable donde una actividad espaciadora deseada puede activarse o desactivarse para permitir que se produzca la sintonización con o sin tensión impuesta por la acción de Cas guiada por espaciador en el hospedador, por ejemplo, con o sin direccionamiento al gen de resistencia a antibióticos. De esta manera, las poblaciones bacterianas se pueden ajustar para su uso en situaciones (por ejemplo, cultivos lácteos o de producción de alimentos) donde se puede encontrar desactivación de fagos de genes deseables; o para su uso en fagos de ajuste que se utilizarán para matar o modular bacterias, por ejemplo, para eliminar la resistencia a los antibióticos. Esta configuración además permite, en una realización, el cultivo de hospedador bacteriano resistente a antibióticos con virus, por ejemplo, fagos, que albergan una o más matrices CRISPR de la invención que se dirigen al gen de resistencia a antibióticos del hospedador, ya que el procedimiento reprime deliberadamente la actividad de desactivación del gen de resistencia a antibióticos de la matriz durante el cultivo con el hospedador. Por lo tanto, una población hospedadora bacteriana resistente puede usarse para cultivar fagos en cultivo (por ejemplo, en un recipiente o planta de cultivo industrial) que permite que el fago y el hospedador evolucionen conjuntamente y se sintonicen mutuamente sin que el efecto de desactivación de la resistencia a los antibióticos obstaculice el crecimiento y, por lo tanto, la capacidad de cultivo de las células hospedadoras (que de otro modo minimizarían la expansión del fago) y al mismo tiempo permita que todos los demás componentes del fago deseado se sintonicen con la población hospedadora cultivada. Las pruebas de una muestra de la población de fagos resultante se pueden llevar a cabo, por ejemplo, a escala de laboratorio, utilizando una población de células hospedadoras resistentes a antibóticos, pero con el fago de prueba derreprimido para el direccionamiento de la matriz del gen de resistencia a antibióticos de las células hospedadoras. La represión natural y sintética de la expresión génica en entornos de células procariotas y fagos es bien conocida por el experto en la técnica, por ejemplo, sistemas tet o sistemas inducibles por luz.
Por lo tanto, la descripción proporciona las siguientes características, numeradas como párrafos: En un primer párrafo, se proporciona un procedimiento de producción de microbios, donde el procedimiento comprende
(a) proporcionar una célula hospedadora que comprende un sistema CRISPR/Cas hospedador para la selección de la secuencia de nucleótidos en la célula hospedadora;
(b) proporcionar un virus que es capaz de infectar la célula hospedadora, en el que
(i) el virus comprende una o más matrices de CRISPR modificadoras del hospedador (HM) modificadas genéticamente (por ejemplo, una matriz como se describió anteriormente) para modificar secuencias de nucleótidos diana de la célula hospedadora;
(ii) una primera matriz HM codifica un primer ARNcr-HM que comprende una secuencia espaciadora (HM-espaciador) que es capaz de hibridarse con una primera secuencia diana hospedador para guiar a Cas a la diana en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana, opcionalmente en la que la modificación de la primera secuencia diana reduce el crecimiento o viabilidad de la célula hospedadora; y
(iii) la primera matriz HM es reversiblemente represible para la transcripción de la primera actividad de ARNcr-HM y/o ARNcr-HM es represible;
(c) infectar la célula hospedadora con el virus para introducir la una o más matrices de HM-CRISPR en la célula;
(d) reprimir la transcripción del primer ARNcr-HM y/o la primera actividad de ARNcr-HM en la célula;
(e) cultivar la célula hospedadora infectada para producir una población (PH1) de células hospedadoras que comprenden una población (PV1) de virus; y
(f) obtener la población viral PV1 y/o la población de células hospedadoras cultivadas.
En un ejemplo, el primer ARNcr-HM comprende un espaciador-HM que es capaz de hibridarse con la primera secuencia diana hospedadora para guiar a Cas hacia la diana en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana, en la que la secuencia diana es una secuencia de nucleótidos del sistema CRISPR/Cas hospedador, en la que el primer ARNcr-HM guía a Cas hacia la diana para modificar el sistema CRISPR/Cas hospedador en la célula hospedadora, en el que la modificación de la secuencia diana reduce o elimina el funcionamiento del sistema CRISPR/Cas del hospedador.
En una alternativa, la modificación mejora o inhibe la epresión de un gen en el hospedador. En una realización, el gen es un gen esencial, un gen de virulencia o un gen de resistencia (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos). En una realización, la modificación mejora la expresión de un producto génico que es endógeno o exógeno para el hospedador. En un ejemplo, el hospedador es un hospedador modificado genéticamente que comprende una secuencia de nucleótidos exógena (por ejemplo, para producir una proteína deseada) y la modificación mejora o inhibe la expresión de la proteína deseada en la célula hospedadora. En un ejemplo, la proteína deseada es un antibiótico y la célula hospedadora es una célula microbiana, por ejemplo, bacteriana o arqueal. Por lo tanto, el procedimiento permite el cultivo de células hospedadoras para producir la población viral, en el que el antibótico no se expresa, lo que de otro modo obstaculizaría la expansión de la población de células hospedadoras. A continuación, uno o más virus de la población de virus aislados se pueden utilizar en una composición antimicrobiana para reducir el crecimiento o viabilidad de la célula hospedadora, ya que la primera represión de ARNcr-HM se puede eliminar después del aislamiento, proporcionando así una composición de virus antibiótico activa. Por lo tanto, la descripción también proporciona dicho procedimiento y dicha composición antibiótica que comprende virus que son capaces de expresar un antibiótico en una célula hospedadora. La modificación para activar la expresión se puede realizar, por ejemplo, proporcionando una Cas (por ejemplo, Cas9) conjugado con un activador de transcripción, en el que Cas es un Cas cognado con el primer ARNcr-HM y el activador activa la transcripción del gen exógeno o endógeno deseado. La modificación para inhibir la expresión se puede realizar, por ejemplo, proporcionando un Cas muerto (por ejemplo, dCas9), en la que CAS es un Cas cognado con el primer ARNcr-HM e inhibe la transcripción del gen exógeno o endógeno deseado.
La represión de la transcripción o actividad de ARNcr puede ser parcial o completa (es decir, sin actividad o sin transcripción del ARNcr de la matriz en el hospedador). La actividad se refiere a la capacidad del ARNcr de hibridarse con la secuencia hospedadora cognada para guiar Cas al primer sitio diana hospedadora para su modificación.
En un ejemplo, el virus no está tan reprimido cuando se introduce en la célula, el procedimiento comprende llevar a cabo la etapa (d) después de que el virus ha infectado la célula, por ejemplo, mediante el uso de un agente químico, físico, mecánico, magnético, ligero u otro agente para causar represión. En una realización, la primera matriz de HM comprende un promotor represible (promotor de HM) para la transcripción del primer ARNcr-HM y el promotor se reprime (por ejemplo, mediante la unión de un agente represor, por ejemplo, un químico o proteína, al promotor) después de que la primera matriz de HM se introduce en la célula.
En otro ejemplo, el virus se reprime antes de que la etapa (c) se lleve a cabo, por ejemplo, mediante el uso de un agente químico, físico, mecánico, magnético, de luz u otro agente para causar represión. En una realización, la primera matriz de HM comprende un promotor represible (promotor de HM) para la transcripción del primer ARNcr-HM y el promotor se reprime (por ejemplo, mediante la unión de un agente represor, por ejemplo, un químico o proteína al promotor) antes de que la primera matriz de HM se introduzca en la célula, en el que posteriormente la primera matriz de HM reprimida se introduce en la célula.
En una realización, la etapa (f) comprende aislar PV1. En una realización, la etapa comprendía separar PV1 o un virus de este de células hospedadoras de PH1.
Un segundo párrafo se refiere al procedimiento del primer párrafo 1, que comprende además despresionar la transcripción del primer ARNcr-HM y/o la primera actividad de ARNcr-HM en la población de virus después de la etapa (e) o (f), y opcionalmente posteriormente cultivar adicionalmente las células hospedadoras.
Un tercer párrafo se refiere al procedimiento de cualquier párrafo anterior, que comprende
A. obtener una población (PH2) de células hospedadoras que son opcionalmente idénticas a la célula hospedadora de (a), (f) o las células cultivadas adicionales del párrafo 2;
B. infectar las células hospedadoras de A con virus de la población PV1;
C. reprimir la transcripción del primer ARNcr-HM y/o la primera actividad de ARNcr-HM en las células;
D. cultivar las células hospedadoras infectadas para producir una población (PH3) de células hospedadoras que comprenden una población de virus (PV2); y
E. obtener la población viral PV2 (o un virus de la misma) y/o la población de células hospedadoras cultivadas. Un cuarto párrafo se refiere al procedimiento del tercer párrafo, que comprende además desreprimir la transcripción del primer ARNcr-HM y/o la primera actividad de ARNcr-HM en la población de virus después de la etapa (D) o (E), y opcionalmente posteriormente cultivar adicionalmente las células hospedadoras.
Un quinto párrafo se refiere al procedimiento de cualquiera de los párrafos anteriores, que comprende evaluar una muestra aislada de la población de virus PV1 o PV2 en otra célula hospedadora o población (PH4) de células hospedadoras, opcionalmente en el que la célula o población PH4 adicional es idéntica a la célula de (a), la prueba comprende infectar la célula o población PH4 adicional con el virus de dicha muestra, esperar un período de tiempo para permitir que se produzca cualquier crecimiento de célula hospedadora, y determinar si se ha modificado (por ejemplo, reducido, tal como un crecimiento o viabilidad reducida de la célula hospedadora*) o se ha producido una actividad predeterminada de la célula o población PH4 adicional (por ejemplo, crecimiento o viabilidad de célula), en el que el virus dentro de la célula o células han desreprimido la transcripción del primer ARNcr-HM y/o la primera actividad de ARNcr-HM durante dicho período de tiempo.
* Esto se puede probar utilizando un ensayo estándar para la formación de placa cuando el virus de la muestra se agrega a la célula o PH4 en placas en agar).
Un sexto párrafo se refiere al procedimiento de cualquiera de los anteriores al quinto párrafo, en el que todas las células hospedadoras son células microbianas (por ejemplo, células bacterianas o arqueales) y la modificación de la primera secuencia diana reduce el crecimiento o viabilidad de la célula hospedadora, y dicha determinación determina que se ha producido la actividad antimicrobiana**.
**Esto se puede determinar mediante un ensayo de placa estándar.
Un séptimo párrafo se refiere al procedimiento del quinto o sexto párrafo, en el que el período de tiempo es de al menos uno, 5, 10, 30, 60 o 120 minutos.
Un octavo párrafo se refiere al procedimiento de cualquiera de los párrafos quinto a séptimo, en el que la célula de (a) y opcionalmente células PH1, PH2 y/o PH3 no comprenden la primera secuencia diana, en el que las células PH4 de población o célula adicional comprenden la primera secuencia diana.
Un noveno párrafo se refiere al procedimiento de cualquiera de los párrafos primero a octavo, en el que la célula de (a) y opcionalmente células PH1, PH2 y/o PH3 no comprenden un gen que confiere resistencia a un primer antibiótico, en el que la primera secuencia diana es una secuencia diana de dicho gen; opcionalmente en el que la célula o población adicional de células PH4 comprenden dicho gen.
Un décimo párrafo se refiere al procedimiento de cualquiera de los párrafos primero a séptimo, en el que la célula de (a) y opcionalmente células PH1, PH2 y/o PH3 comprenden un gen que confiere resistencia a un primer antibiótico, en el que la primera secuencia diana es una secuencia diana de dicho gen.
Un décimo primer párrafo se refiere al procedimiento de cualquier párrafo anterior, en el que todas las células hospedadoras son células microbianas (por ejemplo, células bacterianas o arqueales) y la modificación de la primera secuencia diana reduce el crecimiento o viabilidad de la célula hospedadora, o reduce la resistencia de la célula h o sp e d a d o ra a un an tib ió tico .
Un décimo segundo párrafo se refiere al procedimiento de cualquier párrafo anterior, en el que todas las células hospedadoras son patógenos de enfermedades infecciosas de seres humanos, un animal (por ejemplo, animal no humano) o una planta.
Un décimo tercer párrafo se refiere al procedimiento de cualquier párrafo anterior, en el que todas las células hospedadoras son de la misma especie, por ejemplo, seleccionadas de una especie de Escherichia (por ejemplo, E co liO157:H7 o O104:H4), Shigella (eg, dysenteriae), Salmonella (por ejemplo, typhio entérica, por ejemplo, serotype typhimurium, por ejemplo, DT 104), Erwinia, Yersinia (por ejemplo, pestis), Bacillus, Vibrio, Legionella (por ejemplo, pneumophilia), Pseudomonas (por ejemplo, aeruginosa), Neisseria (por ejemplo, gonnorrhoea o meningitidis), Bordetella (por ejemplo, pertussus), Helicobacter (por ejemplo, pylori), Listeria (por ejemplo, monocytogenes), Agrobacterium, Staphylococcus (por ejemplo, aureus, por ejemplo, MRSA), Streptococcus (por eje mplo, pyogenes o thermophilus), Enterococcus, Clostridium (por ejemplo, dificile o botulinum), Corynebacterium (por ejemplo, amycolatum), Mycobacterium (por ejemplo, tuberculosis), Treponema, Borrelia (por ejemplo, burgdorferi), Francisella, Brucella, Campylobacter (por ejemplo, jejuni), Klebsiella (por ejemplo, pneumoniae), Frankia, Bartonella, Rickettsia, Shewanella, Serratia, Enterobacter, Proteus, Providencia, Brochothrix, Bifidobacterium, Brevibacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Vibrio (por ejemplo, cholera, por ejemplo, O139, o vulnificus), Haemophilus (por ejemplo, influenzae), Brucella (por ejemplo, abortus), Franciscella, Xanthomonas, Erlichia (por ejemplo, chaffeensis), Chlamydia (por ejemplo, pneumoniae), Parachlamydia, Enterococcus (por ejemplo, faecalis o faceim, por ejemplo, resistente a la linezolida), Oenococcus y Acinetoebacter (por ejemplo, baumannii, por ejemplo, resistente a múltiples fármacos).
Un décimo cuarto párrafo se refiere al procedimiento del décimo tercer párrafo, en el que todas las células hospedadoras son células Staphylococcus aureus, por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre meticilina, resistente a vancomicina y teicoplanina.
Un décimo quinto párrafo se refiere al procedimiento del décimo tercer párrafo, en el que todas las células hospedadoras son células Pseudomonas aeuroginosa, por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre cefalosporinas (por ejemplo, ceftazidima), carbapenemas (por ejemplo, imipenem o meropenem), fluoroquinolonas, aminoglucósidos (por ejemplo, gentamicina o tobramicina) y colistina.
Un décimo sexto párrafo se refiere al procedimiento del décimo tercer párrafo, en el que todas las células hospedadoras son células de Klebsiella (por ejemplo, pneumoniae), por ejemplo, resistentes a carbapenem.
Un décimo séptimo párrafo se refiere al procedimiento del décimo tercer párrafo, en el que todas las células hospedadoras son células Streptoccocus (por ejemplo, pneumoniae o pyogenes), por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre eritromicina, clindamicina, betalactámico, macrólido, amoxicilina, azitromicina y penicilina.
1. Un décimo octavo párrafo se refiere al procedimiento del décimo tercer párrafo, en el que todas las células hospedadoras son células Salmonella (por ejemplo, serotipo Typhi), por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre ceftriaxona, azitromicina y ciprofloxacino.
2. Un décimo noveno párrafo se refiere al procedimiento del décimo tercer párrafo, en el que todas las células hospedadoras son células Shigella, por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre ciprofloxacino y azitromicina.
3. Un vigésimo párrafo se refiere al procedimiento del décimo tercer párrafo, en el que todas las células hospedadoras son células de micobacterium tuberculosis, por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre resistencia a isoniazida (INH), rifampicina (RMP), fluoroquinolona, amikacina, kanamicina y capreomicina. Un vigésimo primer párrafo se refiere al procedimiento del décimo tercer párrafo, en el que todas las células hospedadoras son células Enterococcus, por ejemplo, resistentes a la vancomicina.
Un vigésimo segundo párrafo se refiere al procedimiento del décimo tercer párrafo, en el que todas las células hospedadoras son células Enterobacteriaceae, por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre cefalosporina y carbapenem.
Un vigésimo tercer párrafo se refiere al procedimiento del décimo tercer párrafo, en el que todas las células hospedadoras son células E. coli, por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre trimetoprim, itrofurantoína, cefalexina y amoxicilina.
Un vigésimo cuarto párrafo se refiere al procedimiento del décimo tercer párrafo, en el que todas las células hospedadoras son células Clostridium (por ejemplo, dificile), por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre fluoroquinolona y carbapenem.
Un vigésimo quinto párrafo se refiere al procedimiento del décimo tercer párrafo, en el que todas las células hospedadoras son células de Neisseria gonnorrhoea, por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre cefijima (por ejemplo, una cefalosporina oral), ceftriaxona (una cefalosporina inyectable), azitromicina y tetraciclina.
Un vigésimo sexto párrafo se refiere al procedimiento del décimo tercer párrafo, en el que todas las células hospedadoras son células Acinetoebacter baumannii, por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre betalactámico, meropenem y carbapenem.
Un vigésimo séptimo párrafo se refiere al procedimiento del décimo tercer párrafo, en el que todas las células hospedadoras son células Campylobacter, por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre ciprofloxacino y azitromicina. Un vigésimo octavo párrafo se refiere al procedimiento de cualquier párrafo anterior, en el que las células hospedadoras producen Beta (p)-lactamasa.
Un vigésimo noveno párrafo se refiere al procedimiento de cualquier párrafo anterior, en el que las células hospedadoras son resistentes a un antibiótico mencionado en cualquiera de los párrafos décimo cuarto a vigésimo séptimo.
Un trigésimo párrafo se refiere al procedimiento del vigésimo noveno párrafo, en el que la primera secuencia diana es una secuencia de un gen que codifica un producto que confiere resistencia de la célula hospedadora a dicho antibiótico.
Un trigésimo primer párrafo se refiere al procedimiento de cualquiera de los párrafos anteriores, en el que la primera secuencia diana es una secuencia de un gen de resistencia a antibióticos (es decir, para conferir resistencia a las células hospedadoras a un antibiótico, por ejemplo, resistencia a la meticilina) y/o uno, más o la totalidad de la población PH1, la población PH2, la población PH3 y la población PH4 es resistente a un antibiótico o dicho antibiótico (por ejemplo, un antibiótico mencionado en cualquiera de los párrafos décimo tercero a vigésimo séptimo).
Un trigésimo segundo párrafo se refiere al procedimiento de cualquier párrafo anterior, en el que el virus desreprimido de la población de virus PV1 o PV2 tiene actividad antimicrobiana (por ejemplo, actividad antibacteriana, tal como cuando el virus son fagos); opcionalmente en el que la célula o células hospedadoras comprenden la primera secuencia diana tal como se menciona en el párrafo 30, en el que la modificación de la primera diana proporciona dicha actividad antimicrobiana.
Un trigésimo tercer párrafo se refiere al procedimiento de cualquiera de los párrafos anteriores cuando depende del párrafo 5, en el que las células de PH4 son resistentes a un antibiótico (por ejemplo, un antibiótico mencionado en cualquiera de los párrafos 13 a 27) y las células de (a) y PH2 no son resistentes a dicho antibiótico. Esto ayuda a la fabricación del virus para el uso de fármacos, ya que el cultivo y la expansión se pueden realizar con relativa seguridad sin el riesgo de tener que lidiar con células hospedadoras resistentes a los antibióticos (y el riesgo de contención inadecuada de estas y sustracción de la planta de fabricación de fármacos, por ejemplo). Sin embargo, las pruebas contra PH4 se pueden realizar en un laboratorio de contención u otra instalación que esté configurada para el uso de cepas hospedadoras resistentes a antibióticos. Cuando se realiza una prueba contra PH4, el primer ARNcr-HM se desreprime de modo que es posible la modificación del gen de resistencia en las células hospedadoras mediante la matriz HM de la invención.
Un párrafo trigésimo cuarto se refiere al procedimiento de cualquier párrafo anterior, en el que el sistema CRISPR/Cas hospedador es un sistema de Tipo I, II o III y la secuencia diana es una secuencia de nucleótidos conservada en dicho Tipo de sistema en al menos una, dos o tres cepas hospedadoras adicionales o especies del mismo género que la célula hospedadora de (a).
Un trigésimo quinto párrafo se refiere al procedimiento de cualquier párrafo anterior, en el que el virus es un fago o fagémido.
Un trigésimo sexto párrafo se refiere al procedimiento del trigésimo quinto párrafo, en el que el virus de (b) es un virus Corticoviridae, Cystoviridae, lnoviridae, Leviviridae, Microviridae, Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae o Tectiviridae.
Un trigésimo séptimo párrafo se refiere al procedimiento del trigésimo quinto al trigésimo sexto párrafo, en el que el virus de (b) es un fago de origen natural, por ejemplo, un fago inducido a partir de una célula que es de la misma cepa que la célula de (a).
Un trigésimo octavo párrafo se refiere al procedimiento del trigésimo quinto, trigésimo sexto o trigésimo séptimo párrafo,en el que el fago de (b) es un fago mutado obtenido a través de presión selectiva usando una bacteria resistente al fago.
Un trigésimo noveno párrafo se refiere al procedimiento de cualquier párrafo anterior, en el que en (b)
(iv) dicha una o más matrices HM comprenden una matriz HM que codifica un segundo ARNcr-HM que comprende un espaciador HM que es capaz de hibridarse con una segunda secuencia diana hospedadora para guiar a Cas al segundo objetivo en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana, en la que la segunda secuencia diana es una secuencia de nucleótidos del sistema CRISPR/Cas del hospedador, en el que el segundo ARNcr-HM guía a Cas a la segunda diana para modificar el sistema CRISPR/Cas del hospedador en la célula hospedadora, en el que la modificación de la segunda secuencia diana reduce o elimina el funcionamiento del sistema CRISPR/Cas del h o spe da do r; y
(v) en el que la matriz HM de (iv) está activa en la célula de (a) para la transcripción de un segundo ARNcr-HM capaz de hibridarse con la segunda secuencia diana hospedadora.
En una realización, la matriz HM de (ii) y (iv) son la misma matriz HM. En otra realización, son matrices HM diferentes (por ejemplo, matrices de diferentes tipos CRISPR/Cas, por ejemplo, tipo I y II, o tipo II y III, o tipo I y III, o diferentes matrices tipo II).
Un cuadragésimo párrafo se refiere al procedimiento del trigésimo noveno párrafo, en el que las células de cualquiera o todas de PH1-4 comprenden dicha segunda secuencia diana.
Un cuadragésimo primer párrafo se refiere al procedimiento del trigésimo noveno o cuadragésimo párrafo, en el que la segunda secuencia diana es idéntica a una secuencia del sistema CRISPR/Cas de un género o especie de célula tal como se menciona en cualquiera de los párrafos décimo primero a vigésimo cuarto (por ejemplo, S thermophilus o S pyogenes o S aureus).
Un cuadragésimo segundo párrafo se refiere al procedimiento de cualquiera de los párrafos trigésimo noveno a cuadragésimo primero, en el que la segunda secuencia diana está comprendida por una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en ID NO: 1 a 44, o un complemento de los mismos.
Un tercer párrafo se refiere al procedimiento de cualquiera de los párrafos trigésimo noveno a cuadragésimo segundo, en el que la segunda secuencia diana comprende
A. una secuencia de ADN o ARN de repetición (por ejemplo, en el que la repetición es la repetición más cercana al 5' (la primera repetición) en dicha matriz de CRISPR hospedadora;
B. una secuencia de ARNtracr o una secuencia líder de la matriz de CRISPR del secuenciador de ADN que codifica ARNtracr;
C. un promotor del gen Cas (por ejemplo, un promotor Cas1, Cas2 o Csn2);
D. una secuencia promotora líder de la matriz de CRISPR; o
E. una secuencia de ADN o ARN que codifica Cas (por ejemplo, en el que Cas es Cas9, Cas1, Cas2 o Csn2).
Un cuadragésimo cuarto párrafo se refiere al procedimiento de cualquiera de los párrafos trigésimo noveno a cuadragésimo tercero, en el que la segunda secuencia diana comprende
F. un líder de matriz de CRISPR o una secuencia promotora líder contigua con el nucleótido 5' más cercano de la primera repetición (y que comprende opcionalmente dicho nucleótido más cercano al 5' de la repetición);
G. una secuencia de hasta 20 nucleótidos contiguos inmediatamente 5' de la primera repetición;
H. una secuencia de hasta 20 nucleótidos contiguos de los nucleótidos 5' más cercanos de la primera repetición; o I. una secuencia de hasta 20 nucleótidos contiguos inmediatamente 3' de la primera repetición del espaciador (y opcionalmente en la que la secuencia comprende el nucleótido más cercano al 3' del primer espaciador).
Un cuadragésimo quinto párrafo se refiere al procedimiento de cualquiera de los párrafos trigésimo noveno a cuadragésimo cuarto, en el que
J. el segundo HM-ARNcr comprende o consiste en la estructura R-S-R, en la que R=una repetición CRISPR y S=un espaciador CRISPR, en la que S comprende, (en dirección 5' a 3') V-Hr o Hr-V o, en la que V=una secuencia al menos en un 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a una secuencia de ADN del virus de (b) y HR=una secuencia de ADN de una repetición CRISPR de dicho sistema CRISPR/Cas de la célula hospedadora;
K. en el que la secuencia de Hr es inmediatamente contigua a la secuencia de V en el sistema de CRISPR/Cas hospedador; y
L. en el que el segundo HM-ARNcr es capaz de hibridarse con un espaciador del sistema CRISPR/Cas hospedador para guiar Cas al espaciador para la modificación (por ejemplo, escisión o desactivación) del sistema CRISPR/Cas hospedador en la célula.
Un cuadragésimo sexto párrafo se refiere al procedimiento del cuadragésimo quinto párrafo, en el que V=uno o hasta 40 (por ejemplo, hasta 15) nucleótidos contiguos de ADN de virus.
Un cuadragésimo séptimo párrafo se refiere al procedimiento de cualquiera de los párrafos trigésimo noveno a cuadragésimo sexto, en el que el segundo ARNcr-HM no se hibrida sustancialmente con el ácido nucleico del virus de (b).
Un cuadragésimo octavo párrafo se refiere al procedimiento de cualquiera de los párrafos cuadragésimo quinto a cuadragésimo séptimo, en el que
a. el sistema CRISPR/Cas hospedador es capaz de reconocer un PAM conexo;
b. en el que el ácido nucleico del virus de (b) comprende dicho PAM inmediatamente 3' de una secuencia protoespaciadora;
c. en el que V=uno o hasta 40 (por ejemplo, hasta 15) nucleótidos del protoespaciador; y
d. en el que HR=una secuencia idéntica a una secuencia contigua de la repetición del sistema CRISPR/Cas hospedador.
Un cuadragésimo noveno párrafo se refiere al procedimiento del cuadragésimo octavo párrafo, en el que dicha secuencia contigua de la repetición del sistema hospedador es una secuencia de al menos un 50 % de una repetición hospedadora (por ejemplo, que incluye el nucleótido 5' más estremo o 3' más extremo de la repetición hospedadora).
Un quincuagésimo párrafo se refiere al procedimiento del cuadragésimo quinto o cuadragésimo sexto párrafo, en el que V=de 1 a 40 (por ejemplo, hasta 15) de los nucleótidos contiguos protoespaciadores más cercanos al 3'; y opcionalmente dicha secuencia contigua de la repetición incluye el nucleótido más cercano al 5' de la repetición hospedadora.
Un quincuagésimo primer párrafo se refiere al procedimiento del cuadragésimo octavo o cuadragésimo noveno párrafo, en el que V=de 1 a 40 (por ejemplo, hasta 15) de los nucleótidos contiguos protoespaciadores más cercanos al 5'; y opcionalmente dicha secuencia contigua de la repetición incluye el nucleótido más cercano al 3' de la repetición hospedadora.
Un quincuagésimo segundo párrafo se refiere al procedimiento de cualquiera de los párrafos cuadragésimo quinto a quincuagésimo primero, en el que R=una repetición que es reconocida por el sistema CRISPR/Cas hospedador.
Un quincuagésimo tercer párrafo se refiere al procedimiento de cualquier párrafo anterior, en el que el o cada HM-CRISPR comprende (en dirección 5' a 3') una primera secuencia de repetición, una primera secuencia espaciadora y una segunda secuencia de repetición, en el que la secuencia espaciadora comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con la secuencia diana respectiva en la célula hospedadora, la matriz comprende además un promotor para la transcripción de las repeticiones y espaciador en la célula hospedadora, y opcionalmente el ácido nucleico del virus de (b) comprende una secuencia que codifica la nucleasa Cas y/o una secuencia que codifica el ARNtracr para codificar una secuencia funcional de Cas y/o ARNtracr en la célula hospedadora, en el que la secuencia de ARNtracr comprende una secuencia que es complementaria a la primera o segunda repetición.
Un quincuagésimo cuarto párrafo se refiere al procedimiento de cualquiera de los párrafos anteriores, en el que la o cada matriz de HM- CRISPR comprende (en dirección 5' a 3') una primera secuencia de repetición, una primera secuencia espaciadora y una segunda secuencia de repetición, en el que la secuencia espaciadora comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con la secuencia diana respectiva en la célula hospedadora, la matriz comprende además un promotor para la transcripción de las repeticiones y espaciador en la célula hospedadora, y en el que el vector no comprende una secuencia que codifica la nucleasa Cas y/o una secuencia que codifica el ARNtracr para codificar una secuencia de ARNtracr en la célula hospedadora, en el que la secuencia de ARNtracr comprende una secuencia que es complementaria a la primera o segunda repetición, en el que la matriz de HM-CRISPR es funcional en la célula hospedadora para guiar Cas (por ejemplo, nucleasa Cas hospedadora endógena) al sitio diana respectivo, opcionalmente usando un ARNtracr hospedador.
Un quincuagésimo quinto párrafo se refiere al procedimiento del párrafo quincuagésimo tercero o quincuagésimo cuarto, en el que las repeticiones son idénticas a las repeticiones en el sistema CRISPR/Cas hospedador, en el que la o cada matriz HM-CRISPR no comprende un PAM reconocido por una Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas, por ejemplo, Cas9) del sistema CRISPR/Cas hospedador.
Un quincuagésimo sexto párrafo se refiere al procedimiento de cualquier párrafo anterior, en el que la o cada matriz HM-CRISPR comprende más de una copia de un espaciador HM (por ejemplo, al menos 2, 3 o 4 copias).
Un quincuagésimo séptimo párrafo se refiere al procedimiento de cualquier párrafo anterior, que codifica un segundo o tercer ARNcr-HM (adicionalmente ARNcr-HM), en el que el ARNcr-HM adicional comprende una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse con una secuencia diana hospedadora para guiar a Cas a la diana en la célula hospedadora; opcionalmente en el que la secuencia diana es una secuencia de nucleótidos de un gen esencial, de virulencia o de resistencia de la célula hospedadora, o de un componente esencial del sistema CRISPR/Cas de la célula hospedadora.
Un quincuagésimo octavo párrafo se refiere al procedimiento de cualquiera de los párrafos anteriores, en el que la matriz HM-CRISPR comprende secuencias de repetición de CRISPR que son idénticas a las secuencias de repetición de CRISPR endógenas de la célula hospedadora para producir el ARNcr-HM respectivo en la célula hospedadora.
Un quincuagésimo noveno procedimiento de cualquiera de los párrafos anteriores, en el que el virus de (b) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una Cas (Cas no hospedadora) que es funcional en la célula hospedadora de (a) (por ejemplo, en el que la Cas no hospedadora es una Cas de un sistema de tipo I, en el que el sistema hospedador es un tipo II o III; una Cas de un sistema de tipo II, en el que el sistema hospedador es un tipo I o III; o una Cas de un sistema de tipo III, en el que el sistema hospedador es un tipo I o II), opcionalmente en el que la célula hospedadora no comprende o expresa una Cas de un tipo que es el mismo que el tipo d la Cas no hospedadora.
Un sexagésimo párrafo se refiere al procedimiento de cualquier párrafo anterior, en el que el virus de (b) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de ARNtracr, opcionalmente en el que la secuencia de ARNtracry el primer HM-crARN están comprendidos por un único ARN guía (ARNg)).
Un sexagésimo primer párrafo se refiere al procedimiento de cualquier párrafo anterior, en el que el ARNcr-HM o cada uno de ellos está comprendido por un ARN guía único respectivo (ARNg).
Un sexagésimo segundo párrafo se refiere al procedimiento de cualquiera de los párrafos anteriores, en el que la primera matriz de HM es operativa para provocar la escisión de Cas en la primera secuencia diana, la activación de la primera secuencia diana (o gen que comprende la primera secuencia diana), la desactivación de la primera secuencia diana (o gen que comprende la primera secuencia diana) o la mutación de la primera secuencia diana.
Un sexagésimo tercer párrafo se refiere a una población de virus, célula hospedadora o virus que se puede obtener mediante el procedimiento de cualquier párrafo anterior, opcionalmente en el que la población es idéntica a PV1 o PV2 o el virus se puede obtener a partir de dicha población.
Un sexagésimo cuarto párrafo se refiere a una población de células hospedadoras t (por ejemplo, células bacterianas) que se puede obtener mediante el procedimiento de cualquier párrafo anterior, opcionalmente en el que la población es idéntica a PH1, PH2, PH3 o PH4 o una población de células cultivadas mencionada en cualquier párrafo anterior.
Un sexagésimo quinto párrafo se refiere a la población de células hospedadoras del sexagésimo cuarto párrafo en el que la población no comprende ácido nucleico de un virus de (b), o no comprende dicha primera matriz HM o dicha seguna matriz HM (por ejemplo, según lo determinado por PCR).
Un sexagésimo sexto párrafo se refiere al virus, célula hospedadora o población de cualquiera de los párrafos sexagésimo tercero a sexagésimo quinto, para uso médico u dental u oftálmico (por ejemplo, para tratar o prevenir una infección en un organismo o limitar la propagación de la infección en un organismo.
Un sexagésimo séptimo párrafo se refiere a una composición que comprende un virus, célula hospedadora o población según cualquiera de los párrafos sexagésimo tercero a sexagésimo sexto para uso en alimentos, bebidas, productos lácteos o cosméticos (por ejemplo, uso en un producto cosmético, por ejemplo, maquillaje), o para uso en higiene (por ejemplo, uso en un producto de higiene, por ejemplo, jabón).
Un sexagésimo octavo párrafo se refiere al uso de una composición de un virus, célula hospedadora o población según cualquiera de los párrafos sexagésimo tercero a sexagésimo séptimo, en medicina o para fines terapéuticos o profilácticos dentales.
Un sexagésimo noveno párrafo se refiere al uso de una composición un virus, célula hospedadora o población según cualquiera de los párrafos sexagésimo tercero a sexagésimo octavo, en uso cosmético (por ejemplo, uso en un producto cosmético, por ejemplo, maquillaje), o para uso higiénico (por ejemplo, uso en un producto higiénico, por ejemplo, un jabón).
Un septuagésimo párrafo se refiere al uso, virus, célula hospedadora o población de cualquiera de los párrafos tercero a sexagésimo noveno para modificar una célula hospedadora microbiana (por ejemplo, para destruir o reducir el crecimiento de la célula o un cultivo de células microbianas).
Un septuagésimo primer párrafo se refiere al procedimiento, virus o población de virus de cualquiera de los párrafos primero a sexagésimo tercero y sexagésimo sexto a septuagésimo, en el que el virus o virus en dicha población expresa una holina y/o una endolisina para la lisis de la célula hospedadora, opcionalmente en el que la endolisina es un phage phi11, phage Twort, phage P68, phage phiWMY o endolisina de fago K (por ejemplo, endolisina MV-L o endolisina P-27/HP).
Un septuagésimo séptimo párrafo se refiere al procedimiento, virus o población de virus de cualquiera de los párrafos primero a sexagésimo tercero y sexagésimo sexto a septuagésimo, en el que el virus o virus en dicha población no expresa una holina y/o una endolisina para la lisis de la célula hospedadora.
Un septuagésimo cuarto párrafo se refiere al procedimiento, virus o población de virus de cualquiera de los párrafos primero a sexagésimo tercero y sexagésimo sexto a septuagésimo, en el que el virus (por ejemplo, virus de (b)) o virus en cada dicha población está en combinación con un antimicrobiano funcional en la célula hospedadora de (a), por ejemplo, un agente antibiótico, por ejemplo, un antibiótico betalactámico (por ejemplo, un antibiótico recitado en cualquiera de los párrafos décimo tercero a vigésimo séptimo).
CONTROL DE CORROSIÓN, BIOPELÍCULAS Y BIOINCRUSTACIONES
La invención se refiere, entre otros, a procedimientos para controlar la corrosión influenciada por actividad microbiológica (MIC, por sus siglas en inglés) o bioincrustación de un sustrato o fluido influenciada microbiológicamente en un sistema industrial o doméstico. La descripción también se refiere a fluidos y vectores tratados para su uso en los procedimientos.
La corrosión es el resultado de una serie de procesos químicos, físicos y (micro) biológicos que conducen al deterioro de materiales como el metal (por ejemplo, acero o hierro), el plástico y la piedra. Es un problema mundial con grandes consecuencias sociales y económicas. Las actuales estrategias de control de corrosión basadas en productos producidos químicamente están bajo una presión creciente de estrictas regulaciones ambientales. Además, son bastante ineficientes y pueden verse obstaculizadas por la resistencia microbiana (por ejemplo, bacteriana) a los agentes utilizados. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de estrategias de control de la corrosión respetuosas con el medio ambiente y sostenibles. La corrosión está influenciada por los complejos procesos de diferentes microorganismos que realizan diferentes reacciones electroquímicas y secretan proteínas y metabolitos que pueden tener efectos secundarios.
La gravedad de los procesos de corrosión microbiana es evidente por el hecho de que muchos de los metales y aleaciones utilizados en la industria y en el país, tales como aceros inoxidables, aleaciones a base de níquel y aluminio y materiales tales como hormigón, asfalto y polímeros, son fácilmente degradados por microorganismos. Los recubrimientos protectores, inhibidores, aceites y emulsiones también están sujetos a degradación microbiana.
La corrosión influenciada por actividad microbiológica (MIC) es un problema costoso que afecta a los equipos de producción y procesamiento de hidrocarburos, sistemas de distribución de agua, barcos, vagones y otros tipos de sistemas industriales y domésticos metálicos y no metálicos. En particular, se sabe que la MIC causa daños considerables a la infraestructura de combustible de hidrocarburos, incluidos los sistemas de producción, transporte y almacenamiento, a menudo con resultados catastróficos de contaminación ambiental. Alrededor del 40 % de la corrosión de tuberías en la industria del petróleo se atribuye a la corrosión microbiológica y conduce a enormes pérdidas financieras en la producción, transporte y almacenamiento de petróleo cada año. Las biopelículas de tuberías pueden causar la reducción de la velocidad del fluido en los equipos debido al proceso de incrustación en las paredes. Además, las fugas de tuberías se generan como resultado de la corrosión, con los consiguientes impactos en el medio ambiente y la productividad.
La MIC se produce en entornos como el suelo, el agua dulce y el agua de mar y se estima que es responsable de más del 30 por ciento de todos los daños por corrosión. La MIC se produce debido a la fijación de microbios como bacterias, liberación de metabolitos y generalmente formación de biopelículas que inducen o aceleran el proceso de corrosión. Entre los grupos de bacterias involucradas en el proceso de corrosión se incluyen: bacterias reductoras de azufre o sulfato (SRB, por sus siglas en inglés), bacterias productoras de sustancias poliméricas extracelulares (EPSB), bacterias productoras de ácido (APB, por sus siglas en inglés), bacterias oxidantes de azufre o sulfido (SOB, por sus siglas en inglés); bacterias oxidantes de hierro o manganeso (IOB, por sus siglas en inglés), bacterias productoras de amoníaco (AmPB, por sus siglas en inglés) y bacterias productoras de acetato
(AcPB, por sus siglas en inglés). Los estudios de pirosecuenciación de genes de ARN ribosómico de subunidades pequeñas indican que las bacterias productoras de ácido acético (Acetobacter spp. y Gluconacetobacter spp.) son frecuentes en entornos expuestos al etanol y al agua de grado combustible.
El crecimiento microbiano en condiciones ambientales influye directa o indirectamente en las reacciones electroquímicas. Las interacciones microbio-sustrato conducen a la adhesión inicial y la formación de biopelículas. La unión de microbios como bacterias al sustrato, la liberación de metabolitos y la formación de biopelículas influyen en las condiciones electroquímicas en las superficies del sustrato, induciendo o acelerando el proceso de corrosión, mediando así el proceso de MIC. La formación de una biopelícula bacteriana en un sustrato metálico comprende las siguientes etapas: I - formación de una película, a través de la adsorción de moléculas orgánicas e inorgánicas sobre el metal, que modifica la distribución de la carga sobre la superficie metálica y, además, sirve como fuente nutricional para las bacterias, facilitando la adhesión de microorganismos flotantes presentes en el líquido; II - adhesión y multiplicación de bacterias aerobias que forman microcolonias; III - producción de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) por parte de algunas bacterias sésiles; IV - colonización por células microbianas aerobias flotantes, que consumirán el oxígeno por respiración, creando un entorno anaerobio local en la biopelícula como lo requieren las bacterias anaerobias estrictas y ; V - aumento del espesor de la biopelícula, que puede favorecer el desprendimiento de las capas externas. Las EPS producidas por las bacterias adheridas a la biopelícula captan iones esenciales para su crecimiento; se utilizan como medio de fijación y protegen las bacterias contra los biocidas que interfieren con los mecanismos de corrosión favoreciendo la creación de áreas de aireación diferencial, además de servir como fuente nutricional en caso de baja disponibilidad de nutrientes. El proceso de corrosión por aireación diferencial se produce debido a la distribución desigual de la biopelícula en el sustrato metálico con zonas aireadas (que rodean la biopelícula) y zonas no aireadas (debajo de la biopelícula). La formación de biopelícula en la superficie metálica disminuye el contenido de oxígeno, alcanzando niveles de anaerobiosis casi total. Pseudomonas es el principal género productor de EPS.
Un ejemplo de un proceso de biocorrosión de MIC mediada por bacterias corrosivas es el siguiente: (A) Las bacterias corrosivas aeróbicas de agua dulce, agua de mar, sistemas industriales/domésticos o tanques de almacenamiento llegan a equipos y tuberías de sistemas industriales o domésticos, que tienen una película acondicionadora en la superficie. (b ) Las bacterias productoras de EPS se adhieren a las paredes de los equipos/tuberías y producen EPS, lo que crea un entorno favorable para la adhesión de otros microorganismos. (C) Tiene lugar la adhesión de otros grupos de bacterias corrosivas a las paredes de las tuberías, que liberan sus metabolitos, convirtiéndose en una microcolonia a través de la división celular, consumiendo el oxígeno disponible. La acción de las bacterias oxidantes del hierro resulta en una gran acumulación de precipitación férrica que conduce al bloqueo en el equipo/tubería; el ácido sulfúrico liberado por las bacterias oxidantes del azufre promueve la acidificación del medio ambiente. (D) La baja concentración de oxígeno y los ácidos orgánicos liberados por las bacterias productoras de ácido favorecen la fijación y el desarrollo de bacterias reductoras de sulfato que producen sulfuro de hidrógeno (H2S), lo que acelera el proceso de corrosión y reduce el pH local. (E) Resultados de un equipo/tubería corroído, que está parcialmente bloqueado por precipitados de hierro con microfiltraciones y que contiene una biopelícula bacteriana. E1H2S supone
un riesgo grave para la salud del personal que maneja el sistema afectado. Además, la producción de biopelículas gruesas y lodos conduce a la bioincrustación y obstaculiza el funcionamiento del sistema.
De manera similar, las poblaciones bacterianas pueden propogarse en fluidos, tales como depósitos de agua o reservorios (por ejemplo, en agua potable o en agua de sistemas de enfriamiento), mediando de ese modo la bioincrustación del fluido. Esto también puede denominarse ensuciamiento del fluido. Un ejemplo es el deterioramiento de canales o depósitos de agua potable.
La descripción aborda dichos problemas de MIC y bioincrustación al proporcionar los siguientes Aspectos 1 y siguientes:
En un primer aspecto, se proporciona un procedimiento para controlar la corrosión influenciada por actividad microbiológica (MIC) o bioincrustación de un sustrato en un sistema industrial o doméstico, en el que una superficie del sustrato está en contacto con una población de primeras células hospedadoras de una primera especie microbiana que media la MIC o bioincrustación del sustrato, y el procedimiento comprende
(i) poner en contacto la población con una pluralidad de vectores que son capaces de transformar o transducir las células, en el que cada vector comprende una matriz de CRISPR mediante el cual se introducen matrices de CRISPR en las células hospedadoras, en el que
(a) cada matriz de CRISPR comprende una o más secuencias de nucleótidos para la expresión de un ARNcr y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en una célula hospedadora; y
(b) cada ARNcr es capaz de hibridarse con una secuencia diana de una célula hospedadora para guiar Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas, por ejemplo, una Cas9 o Cpf1) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana (por ejemplo, para cortar la secuencia diana); la secuencia diana es una secuencia génica para mediar la viabilidad de la célula hospedadora; y
(ii) permitir la expresión de dichos ARNc en presencia de Cas en células hospedadoras, modificando así las secuencias diana en células hospedadoras, lo que da como resultado la reducción de la viabilidad de la célula hospedadora y el control de MIC o bioincrustación de dicho sustrato.
En un ejemplo, el sistema comprende un equipo (por ejemplo, para su uso en un proceso industrial) y la superficie es una superficie de dicho equipo. En un ejemplo, cada matriz es una matriz modificada, por ejemplo, cualquier matriz modificada descrita en esta invención. En una realización, el vector es un vector de ácido nucleico CRISPR modificado genéticamente como se describe en la presente memoria. En un ejemplo, la bioincrustación comprende biopelícula microbiana y/o formación, proliferación o mantenimiento de lodo. En un ejemplo, las primeras células hospedadoras son sésiles. En un ejemplo del Aspecto 1 o 4 (a continuación), «controlar» comprende prevenir, reducir o eliminar dicho MIC o bioincrustación, o reducir la propagación de dicho MIC o bioincrustación en el sistema. Ejemplos no limitantes de cómo las bacterias median en MIC o bioincrustación se describen anteriormente. El crecimiento, proliferación o mantenimiento celular es, por ejemplo, una característica de la viabilidad celular. Por lo tanto, en un ejemplo, el procedimiento reduce la proliferación y/o mantenimiento de células hospedadoras. En un ejemplo, el procedimiento destruye células hospedadoras.
Un segundo aspecto se refiere al procedimiento del primer aspecto, en el que dichas células hospedadoras están comprendidas por una biopelícula microbiana que está en contacto con dicho sustrato.
Un tercer aspecto se refiere al procedimiento de cualquier aspecto anterior, en el que dicha superficie y células hospedadoras están en contacto con un fluido, tal como un líquido acuoso (por ejemplo, agua de mar, agua dulce, agua almacenada o agua potable).
El agua dulce es agua natural en la superficie de la tierra en capas de hielo, capas de hielo, glaciares, icebergs, pantanos, estanques, lagos, ríos y arroyos, y subterráneos como agua subterránea en acuíferos y arroyos subterráneos. El agua dulce se caracteriza generalmente por tener bajas concentraciones de sales disueltas y otros sólidos disueltos totales. El término excluye específicamente el agua de mar y el agua salobre, aunque sí incluye aguas ricas en minerales como los manantiales de piedra caliza. En un ejemplo, dicho agua dulce es cualquiera de estos tipos de agua dulce. El agua potable es agua para consumo humano o animal (por ejemplo, ganado). En un ejemplo, el fluido se selecciona de agua de enfriamiento industrial en el que el sistema es un sistema de enfriamiento; agua de alcantarillado en el que el sistema es un sistema de tratamiento o almacenamiento de aguas residuales; agua potable en el que el sistema es un sistema de procesamiento, almacenamiento, transporte o suministro de agua potable; agua de fabricación de papel en el que el sistema es un sistema de fabricación o procesamiento de papel; agua de piscina en el que el sistema es un sistema de acopio o almacenamiento de agua de piscina o piscina; agua de extintor de incendios en el que el sistema es un sistema de extinción de incendios; o agua de proceso industrial en cualquier tubería, tanque, pozo, estanque o canal.
Un cuarto aspecto se refiere a un procedimiento de control de la bioincrustación microbiana de un fluido en un sistema industrial o doméstico (por ejemplo, para controlar la contaminación bacteriana de un líquido en un depósito o recipiente), en el que el fluido comprende una población de primeras células hospedadoras de una primera especie microbiana que media dicha bioincrustación, y el procedimiento comprende
(i) poner en contacto la población con una pluralidad de vectores que son capaces de transformar o transducir las células, en el que cada vector comprende una matriz de CRISPR mediante el cual se introducen matrices de CRISPR en las células hospedadoras, en el que
(a) cada matriz de CRISPR comprende una o más secuencias para la expresión de un ARNcr y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en una célula hospedadora; y
(b) cada ARNcr es capaz de hibridarse con una secuencia diana de una célula hospedadora para guiar Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana (por ejemplo, para cortar la secuencia diana); la secuencia diana es una secuencia génica para mediar la viabilidad de la célula hospedadora; y
en el que el procedimiento comprende permitir la expresión de dichos ARNc en presencia de Cas en células hospedadoras, modificando así las secuencias diana en células hospedadoras, lo que resulta en la reducción de la viabilidad de la célula hospedadora y el control de dicha bioincrustación.
En un ejemplo, el fluido es un líquido. En un ejemplo, el fluido es un fluido gaseoso.
Sistemas: Un sistema de ejemplo para cualquier Aspecto se selecciona del grupo que consiste en: Sistema de recuperación, procesamiento, almacenamiento o transporte petroquímico; sistema de recuperación, procesamiento, almacenamiento o transporte de hidrocarburos; recuperación, procesamiento, almacenamiento o transporte de petróleo crudo; sistema de recuperación, procesamiento, almacenamiento o transporte de gas natural, (por ejemplo, pozo petrolero, plataforma petrolera, equipo de perforación petrolera, sistema de bombeo de petróleo, oleoducto, plataforma de gas, equipo de extracción de gas, equipo de bombeo de gas, gasoducto, petrolero, tanque de gas, equipo de almacenamiento de petróleo o equipo de almacenamiento de gas); equipo de procesamiento o almacenamiento de agua; depósito de agua (por ejemplo, depósito de agua potable); sistema de climatización de aire o de agua (por ejemplo, refrigeración o calefacción), por ejemplo, un tubo de refrigeración, condensador o intercambiador de calor; equipo médico o quirúrgico; equipo de tratamiento ambiental (por ejemplo, suelo, vías navegables o aire); equipo de fabricación o reciclaje de papel; planta de energía, por ejemplo, una planta de energía térmica o nuclear; equipo de almacenamiento de combustible (por ejemplo, combustible de hidrocarburos, por ejemplo, petróleo, diésel o g LP); sistema de recuperación de minerales o combustible minero o metalúrgico, por ejemplo, una mina o equipo de minería; sistema de ingeniería; equipo de envío; equipo de almacenamiento de carga o mercancías (por ejemplo, un contenedor de carga); equipo de fabricación, procesamiento o embalaje de alimentos o bebidas; equipo de limpieza (por ejemplo, equipo de lavandería, por ejemplo, una lavadora o lavavajillas); equipo de restauración (por ejemplo, catering doméstico o comercial); equipo de agricultura; construcción (por ejemplo, construcción, infraestructura de servicios públicos o construcción vial); equipo de aviación; equipo aeroespacial; equipo de transporte (por ejemplo, un vehículo de motor (por ejemplo, un automóvil, camión o furgoneta); un vagón; una aeronave (por ejemplo, un avión) o un vehículo marino o fluvial (por ejemplo, un barco o barco, submarino o aerodeslizador)); equipo de embalaje, por ejemplo, equipo de embalaje de bienes de consumo; o equipo de embalaje de alimentos o bebidas; sistemas electrónicos (por ejemplo, un ordenador o teléfono móvil o un componente electrónico del mismo); o equipo de fabricación o embalaje de sistemas electrónicos; equipo de odontología; tuberías industriales o domésticas (por ejemplo, una tubería submarina) o un buque de almacenamiento (por ejemplo, un tanque de agua o un tanque de combustible (por ejemplo, un tanque de gasolina, por ejemplo, un tanque de gasolina de un vehículo)); equipo subterráneo; edificio (por ejemplo, una vivienda u oficina o local comercial o fábrica o central eléctrica); carretera; puente; equipo agrícola; sistema de fábrica; sistema de exploración de petróleo crudo o gas natural; oficina; y un sistema doméstico.
En un ejemplo, el sistema se utiliza en una industria o negocio seleccionado del grupo que consiste en agricultura, industria petrolera o de petróleo, industria alimenticia o de bebidas, industria de la confección, industria del embalaje, industria electrónica, industria informática, industria ambiental, industria química, industria aeroespacial, industria automotriz, industria biotecnológica, industria médica, industria de la salud, industria odontológica, industria energética, industria de productos de consumo, industria farmacéutica, industria minera, industria de la limpieza, industria forestal, industria pesquera, industria del ocio, industria del reciclaje, industria cosmética, industria plástica, industria de pulpa o papel, industria textil, industria de la confección, industria del cuero o ante o piel animal, industria del tabaco y industria siderúrgica. En un ejemplo, la superficie o fluido a tratar es una superficie o fluido de equipo utilizado en dicha industria seleccionada. En un ejemplo, el sistema se utiliza en la industria del petróleo crudo. En un ejemplo, el sistema se utiliza en la industria del gas natural. En un ejemplo, el sistema se utiliza en la industria del petróleo. En un ejemplo, el sistema es un contenedor marítimo, plataforma o equipo de perforación (por ejemplo, plataforma o equipo de perforación de petróleo o gas para su uso en el mar o en el mar), barco o embarcación. En una realización, dicho sistema está anclado en el mar; por ejemplo, anclado no temporalmente en el mar, por ejemplo, ha estado anclado en el mar durante 1,2, 3, 4, 5, 6,7,8, 9,10, 11, 12, 13,14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22,23, 24 o más meses (por ejemplo, meses contiguos).
En una realización, dicho sistema se encuentra en las aguas de un país o estado; por ejemplo, no temporalmente en el mar en dichas aguas, por ejemplo, ha estado en aguas de dicho país durante 1, 2, 3, 4, 5, 6,7,8, 9,10, 11, 12, 13,14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22,23, 24 o más meses (por ejemplo, meses contiguos).
En un ejemplo, la superficie de sustrato a tratar comprende acero inoxidable, acero al carbono, cobre, níquel, latón, aluminio, concreto, un plástico o madera. En un ejemplo, el sustrato es una soldadura o unión metálica. En un ejemplo, la superficie es una superficie metálica (por ejemplo, acero o hierro) o no metálica (por ejemplo, plástico, hormigón, asfalto, madera, caucho o piedra). En un ejemplo, el metal es una aleación (por ejemplo, acero inoxidable, latón o una aleación de níquel, cinc, cobre, níquel o aluminio). En un ejemplo, la superficie es una superficie de polímero artificial. En un ejemplo, la superficie es un recubrimiento de sustrato. En un ejemplo, el sustrato está en contacto con el suelo, agua dulce o agua de mar.
En un ejemplo, el fluido es agua potable; una vía acuática; agua salobre; o un combustible líquido, por ejemplo, gasolina o diésel (por ejemplo, para un automóvil o vehículo motorizado), GLP, queroseno, un alcohol (por ejemplo, etanol, metanol o butanol), hidrógeno líquido o amoníaco líquido), en un ejemplo, el combustible se almacena como combustible líquido. En un ejemplo, el fluido es un aceite o líquido no acuoso. En un ejemplo, el fluido es un líquido comprendido por una vía fluvial o masa de agua, por ejemplo, agua de mar, agua dulce, agua potable, un río, un arroyo, un estanque, un lago, un depósito, agua almacenada (por ejemplo, en un tanque de almacenamiento de agua o equipo de enfriamiento), agua subterránea, agua de pozo, agua en una formación rocosa, agua del suelo o agua de lluvia. En un ejemplo, el líquido es agua de mar. En un ejemplo, el sustrato está en contacto con un líquido mencionado en este párrafo. En un ejemplo, el fluido o líquido se selecciona del grupo que consiste en un aceite, una solución acuosa, un fluido de fracturación hidráulica, un combustible, dióxido de carbono, un gas natural, una mezcla de aceite/agua, una mezcla de combustible/agua, agua que contiene sales, agua marina o oceánica, agua salobre, fuentes de agua dulce, lagos, ríos, arroyos, turberas, estanques, marismas, escorrentía de la descongelación de nieve o hielo, manantiales, agua subterránea, acuíferos, precipitación, cualquier sustancia que sea un líquido a temperatura ambiente (por ejemplo, a temperatura ambiente) y sea hidrofóbica pero soluble en solventes orgánicos, hexanos, benceno, tolueno, cloroformo, éter dietílico, aceites vegetales, aceites petroquímicos, petróleo crudo, productos petroquímicos refinados, aceites esenciales volátiles, combustibles fósiles, gasolina, mezclas de hidrocarburos, chorro, combustible para cohetes, biocombustibles. En un ejemplo, el fluido es una mezcla de aceite/agua.
Los términos «corrosión influenciada por actividad microbiológica» o «MIC», como se emplean en esta memoria, a menos que se especifique lo contrario, se refieren a procesos en los cuales cualquier elemento (sustrato) de un sistema está estructuralmente comprometido debido a la acción de al menos un miembro de una población microbiana, por ejemplo, población bacteriana o arqueal. El término «bioincrustación», tal como se emplea en esta memoria, a menos que se especifique lo contrario, se refiere a procesos en los que los microorganismos (tales como bacterias y/o arqueas) se acumulan en una superficie del sustrato en contacto con un fluido (por ejemplo, agua o un líquido acuoso, o un hidrocarburo, o un petroquímico). También se incluye la acumulación y proliferación no deseada de microorganismos (tales como bacterias y/o arqueas) en un fluido (por ejemplo, agua o un líquido acuoso, o un hidrocarburo, o un petroquímico), es decir, «ensuciamiento» del fluido. En un ejemplo, las bacterias están compuestas por aguas de lastre de barco o de embarcación y las bacterias no son deseables desde el punto de vista medioambiental. El término «sustrato», tal como se emplea en esta memoria, se refiere a cualquier tipo de superficie en la que las células pueden unirse y una biopelícula puede formarse y crecer o en la que puede producirse bioincrustación (por ejemplo, formación de limo o lodos). El sustrato puede ser un sustrato «industrial» tal como la superficie del equipo en un sistema de tuberías petroquímico, de combustible, de petróleo crudo o de gas, o un sustrato «no industrial» (por ejemplo, doméstico, por ejemplo, doméstico u oficina) tal como un mostrador de cocina o un sustrato de ducha o un sustrato de jardín.
En una alternativa de cualquiera de los aspectos, en lugar de una población de células bacterianas hospedadoras, la población es una población de células arqueales de una primera especie.
Un quinto aspecto se refiere al procedimiento del cuarto aspecto, en el que dicho fluido es un líquido acuoso (por ejemplo, agua de mar, agua dulce, agua almacenada o agua potable).
Un sexto aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera del tercer al quinto aspecto, en el que el procedimiento comprende mezclar el fluido con los vectores, poniendo así en contacto las células hospedadoras con los vectores. Por ejemplo, los vectores se pueden premezclar con un líquido (opcionalmente también con un antibiótico o biocida) y la mezcla a continuación se agrega al fluido que está en contacto con la superficie (aspecto 1) o el fluido del cuarto aspecto.
Un séptimo aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera del primero al sexto aspecto, en el que cada secuencia diana es una virulencia, resistencia o secuencia génica esencial de la célula hospedadora, por ejemplo, un exón o secuencia reguladora del mismo. La resistencia puede ser resistencia a antibióticos. En un ejemplo, las células hospedadoras se ponen en contacto con dicho antibiótico y dichos vectores para reducir la viabilidad de la célula hospedadora.
Un octavo aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos primero a séptimo, en el que la modificación de las secuencias diana produce la destrucción de la célula hospedadora y/o una reducción en el crecimiento o proliferación de la célula hospedadora. La proliferación es, por ejemplo, expansión celular o distribución celular en contacto con la superficie. Un noveno aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera del primer al octavo aspecto, en el que los vectores comprenden matrices de CRISPR idénticas.
Un décimo aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera del primero al noveno aspecto, en el que las células hospedadoras son células bacterianas o arqueales. Como alternativa, en cambio, las primeras células son células de algas.
Un décimo primer aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera del primer al décimo aspecto, en el que las primeras células hospedadoras son células de bacterias reductoras de sulfato (SRB) (por ejemplo, células Desulfovibrio o Desulfotomaculum). En un ejemplo, las células se seleccionan del grupo que consiste en células de Desulfotomaculum nigrificans, Desulfacinum infernum, Thermodesulfobacterium mobile, Thermodesulforhabdus norvegicus, Archaeoglobus fulgidus, Desulfomicrobium apsheronum, Desulfovibrio gabonensis, Desulfovibrio longus, Desulfovibrio vietnamensis, Desulfobacterium cetonicum, Desulphomaculum halophilum, Desulfobacter vibrioformis y Desulfotomaculum thermocisternum. En un ejemplo, la población comprende una mezcla de dos o más de estas especies celulares.
Un décimo segundo aspecto se refiere al procedimiento del décimo primer aspecto, en el que la superficie o fluido está comprendido por un equipo de recuperación, procesamiento, almacenamiento o transporte de petróleo crudo, gas o petroquímicos. El crudo es uno de los recursos energéticos más importantes del mundo. Se utiliza como materia prima en numerosas industrias, incluida la industria de refinería y petroquímica, donde el petróleo crudo se refina a través de diversos procesos tecnológicos en productos de consumo como gasolina, aceites, aceites de parafina, lubricantes, asfalto, aceite combustible doméstico, vaselina y polímeros. Los productos derivados del petróleo también se utilizan comúnmente en muchos otros procesos químicos. En una alternativa, el fluido es un dicho producto de consumo o la superficie está en contacto con dicho producto de consumo.
Un décimo tercer aspecto se refiere al procedimiento del undécimo o duodécimo aspecto, en el que la superficie está en contacto con agua de mar, un líquido de fracturación hidráulica o líquido en un pozo; o en el que el fluido es agua de mar, un líquido de fracturación hidráulica o líquido en un pozo.
Un décimo cuarto aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos primero a décimo tercero, en el que la etapa (i) del procedimiento comprende proporcionar una población de células microbianas de una segunda especie (segundas células hospedadoras), en el que las segundas células comprenden dichos vectores, en el que los vectores son capaces de transferirse desde las segundas células hospedadoras a las primeras células hospedadoras; y combinar las segundas células hospedadoras con las primeras células hospedadoras, mediante lo cual los vectores se introducen en las primeras células hospedadoras. En un ejemplo, la(s) segunda(s) célula(s) son ambiental, industrial o domésticamente aceptables en un entorno (por ejemplo, en un entorno de agua o suelo) y la(s) primera(s) célula(s) hospedadora(s) no son aceptables en el entorno.
Un décimo quinto aspecto se refiere al procedimiento del décimo cuarto aspecto, en el que las primeras células hospedadoras están comprendidas por una mezcla de células microbianas (por ejemplo, comprendidas por una biopelícula microbiana) antes del contacto con dichos vectores, en el que la mezcla comprende células de dicha segunda especie.
Un décimo sexto aspecto se refiere al procedimiento del décimo cuarto o décimo quinto aspecto, en el que dicha segunda especie es una especie de Bacillus o bacterias reductoras de nitrato o bacterias oxidantes de sulfuro reductor de nitrato (Nr B).
Un décimo séptimo aspecto se refiere al procedimiento del décimo sexto aspecto, en el que la NRB se selecciona del grupo que consiste en Campylobacter sp., Nitrobacter sp., Nitrosomonas sp., Thiomicrospira sp., Sulfurospirillum sp., Thauera sp., Paracoccus sp., Pseudomonas sp., Rhodobacter sp. y Desulfovibrio sp; o comprende al menos 2 de dichas especies.
Un décimo octavo aspecto se refiere al procedimiento del décimo séptimo aspecto en el que NRB se selecciona del grupo que consiste en Nitrobacter vulgaris, Nitrosomonas europea, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, Paracoccus denitrificans, Sulfurospirillum deleyianum y Rhodobacter sphaeroides.
Un décimo noveno aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera del primer al décimo octavo aspecto, en el que el procedimiento comprende poner en contacto las células hospedadoras de dicha primera especie con un biocida simultánea o secuencialmente con dichos vectores. En un ejemplo, los vectores y el biocida se proporcionan premezclados en una composición que se pone en contacto con las células hospedadoras.
Un vigésimo aspecto se refiere al procedimiento del décimo noveno aspecto, en el que el biocida se selecciona del grupo que consiste en sulfato de hidroximetilfosfonio de tetrakis (THPS), glutaraldehído, monóxido de cloro, dióxido de cloro, hipoclorito de calcio, hipoclorito de potasio, hipoclorito de sodio, dibromonitriloproprionamida (DBNPA), bis(tiocianato) de metileno (MBT), 2-(tiocianometiltio)benzotiazol (TCMTB), bronopol, 2- bromo-2-nitro-1,3-propanodiol (BNPD), cloruro de tetradecilfosfonio de tributilo (TTPC), taurinamida y derivados de la misma, fenoles, sales de amonio cuaternario, agentes que contienen cloro, sales de quinaldinio, lactonas, colorantes orgánicos, tiosemicarbazonas, quinonas, carbamatos, urea, salicilamida, carbanilida, guanida, amidinas, imidazolinas, ácido acético, ácido benzoico, ácido sórbico, ácido propiónico, ácido bórico, ácido deshidroacético, ácido sulfúrico, ácido vanílico, ésteres de p-hidroxibenzoato, isopropanol, propilenglicol, alcohol bencílico, clorobutanol, alcohol feniletilico, formaldehído, yodo y soluciones del mismo, iodopovidona, hexametilentetramina, noxitiolina, cloruro de 1 -(3-cloroalil)-3,5,7-triazo-1-azoniaadamantano, taurolidina, taurultam, N-(5-nitro-2-furfurilideno)-1-amino-hidantoína, 5-nitro-2-furaldehído semicarbazona, 3,4,4'-triclorocarbanilida, 3,4',5-tribromosalicilanilida, 3-trifluorometil-4,4'-diclorocarbanilida, 8-hidroxiquinolina, ácido 1 -ciclopropil-6-fluoro-1,4-dihidro-4-oxo-7-(1 -piperazinil)-3-quinolinacarboxílico, ácido 1,4-dihidro-1-etil-6-fluoro-4-oxo-7-(1-piperazinil)-3-quinolinacarboxílico, peróxido de hidrógeno, ácido peracético, oxicloroseno sódico, paraclorometaxilenol, 2,4,4'-tricloro-2'-hidroxidifenol, timol, clorhexidina, cloruro de benzalconio, cloruro de cetilpiridinio, sulfadiazina de plata, nitrato de plata, bromo, ozono, isotiazolonas, dicloruro de polioxietileno (dimetilimino) etileno (dimetilimino) etileno, 2-(terc-butilamino)-4-cloro-6-etilamino-5'-triazina (terbutilazina) y combinaciones de los mismos. En un ejemplo, el biocida es sulfato de hidroximetilfosfonio tetrakis (THPS). En un ejemplo, el biocida es un compuesto de amonio cuaternario.
Un vigésimo primer aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos primero a vigésimo, en el que el sistema se utiliza en una operación de la industria que se selecciona del grupo que consiste en minería; transporte marítimo; recuperación o procesamiento de petróleo crudo, gas o productos petroquímicos; fracturación hidráulica; calentamiento o enfriamiento de aire o agua; producción, almacenamiento o suministro de agua potable; transporte de hidrocarburos; y tratamiento de aguas residuales.
Un vigésimo segundo aspecto se refiere al procedimiento del vigésimo primer aspecto, en el que la superficie es una superficie del equipo utilizado en dicha industria seleccionada; o en el que el fluido es un fluido comprendido por el equipo utilizado en dicha industria seleccionada.
Un vigésimo segundo aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera del primer al vigésimo segundo aspecto, en el que la superficie es una superficie del equipo de cocina, baño o jardinería; o en el que el fluido está comprendido por el equipo de cocina, baño o jardinería. Por ejemplo, el equipo se utiliza en un entorno doméstico.
Un vigésimo cuarto aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera del primer al vigésimo tercer aspecto cuando depende del tercer aspecto, en el que el fluido es un líquido potable contenido en un recipiente (por ejemplo, tanque o botella de agua) y la superficie es una superficie del recipiente en contacto con el líquido.
Un vigésimo quinto aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera del primer al vigésimo cuarto aspecto, en el que cada vector comprende un elemento genético móvil (MGE), en el que el MGE comprende un origen de transferencia (oriT) y una dicha matriz de CRISPR; en el que el MGE tiene capacidad de transferencia entre una célula hospedadora de dicha primera especie y una célula hospedadora microbiana adicional en dicho sistema industrial o doméstico. Por ejemplo, la(s) célula(s) adicional(es) son ambiental, industrial o domésticamente aceptables en un ambiente (por ejemplo, en un ambiente de agua o suelo) y la(s) primera(s) célula(s) hospedadora(s) no son aceptables en el ambiente.
Un vigésimo sexto aspecto se refiere al procedimiento del vigésimo quinto aspecto, en el que oriT es funcional en la primera y otras células hospedadoras.
Un vigésimo séptimo aspecto se refiere al procedimiento del vigésimo quinto o vigésimo sexto aspecto, en el que dicha primera y otras células hospedadoras están comprendidas por una biopelícula de fluido en contacto con dicha superficie; o en el que dichas células están comprendidas por dicho fluido.
Un vigésimo octavo aspecto se refiere al procedimiento del vigésimo quinto, vigésimo sexto o vigésimo séptimo aspecto, en el que dicha célula adicional es una célula de una especie tal como se menciona en cualquiera de los aspectos décimo sexto a décimo octavo. En un ejemplo, el MGE tiene capacidad de transferencia desde la célula adicional a la primera célula hospedadora y/o viceversa.
Un vigésimo noveno aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos vigésimo quinto a vigésimo séptimo, en el que la célula adicional es una célula de dicha primera especie.
Por ejemplo, en esta realización, el MGE tiene capacidad de transferencia entre las primeras células en una población en dicho sistema. Cuando el MGE deja una copia de sí mismo en el proceso de transferencia a la otra célula, esto proporciona medios para propagar y extender las matrices de MGE y, por lo tanto, CRISPR a través de las poblaciones celulares en el sistema, extendiendo así el efecto de modificación de la secuencia diana de las matrices.
Esto puede ser eficaz, por ejemplo, para crear propagación de matrices en una biopelícula en contacto con la superficie o en el fluido, y es útil ya que la penetración de biopelículas con biocidas convencionales puede ser subóptima.
Un trigésimo aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos vigésimo quinto a vigésimo noveno, en el que cada MGE es o comprende un elemento integrador y conjugativo (ICE); o en el que cada vector es un fago que es capaz de infectar células hospedadoras de dicha primera especie y cada MGE es un ácido nucleico de fago que tiene capacidad de dicha transferencia entre las células.
Un trigésimo primer aspecto se refiere al procedimiento del trigésimo aspecto, en el que cada ICE es un transposón, por ejemplo, un transposón conjugado.
Un trigésimo segundo aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera del primer al trigésimo primer aspecto, en el que cada vector es un plásmido, que comprende opcionalmente un MGE según cualquiera del vigésimo quinto al trigésimo primer aspecto.
Un trigésimo tercer aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos vigésimo quinto a trigésimo segundo, en el que la primera y/o célula adicional comprende secuencias de nucleótidos que codifican proteínas operativas para transferir el MGE a la otra célula, en el que las secuencias no están comprendidas por el MGE.
Un trigésimo cuarto aspecto se refiere al procedimiento del trigésimo tercer aspecto, en el que las secuencias no están comprendidas por el vector.
Un trigésimo quinto aspecto se refiere al procedimiento del trigésimo tercer aspecto, en el que las secuencias están comprendidas por un transposón conjugativo de la primera célula y/o célula adicional.
Un trigésimo sexto aspecto se refiere al procedimiento del trigésimo quinto aspecto, en el que el transposón es operativo en trans para transferir el MGE entre la primera y otras células.
Un trigésimo séptimo aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos vigésimo quinto a trigésimo sexto, en el que el oriT del MGE es el mismo que un oriT comprendido por un ICE de la primera célula y/o células adicionales, en el que el ICE es operativo en trans para transferir el MGE entre la primera y las células adicionales.
Un trigésimo octavo aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos vigésimo quinto a trigésimo séptimo, en el que el oriT del vector es un oriT de un transposón de SRB o NRB.
Un aspecto trigésimo noveno se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos vigésimo quinto a trigésimo octavo, en el que cada MGE comprende una primera y segunda secuencia de repetición terminal y una matriz de CRISPR entre las secuencias de repetición.
Un cuadragésimo aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos vigésimo quinto a trigésimo noveno, en el que el MGE deja una copia de la matriz de CRISPR (1) en el genoma de una primera célula hospedadora cuando se ha transferido a una célula hospedadora adicional; o (2) en una célula hospedadora adicional cuando se ha transferido a una primera célula hospedadora. Por ejemplo, la copia está comprendida por un transposón o profago que queda en el genoma de la célula desde la que se produce la transferencia.
Un cuadragésimo primer aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos vigésimo quinto a cuadragésimo, en el que la primera y otras células son células bacterianas de diferentes especies (por ejemplo, SRB y NRB; o SRB y células de Bacillus respectivamente).
Un cuadragésimo segundo aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos vigésimo quinto a cuadragésimo primero cuando depende del aspecto 30 en combinación con una transposasa para la movilización del MGE.
Un cuadragésimo tercer aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos primero a cuadragésimo segundo, en el que el vector o MGE comprende un módulo de toxina-antioxina operativo en una célula hospedadora de dicha primera especie; opcionalmente en el que el módulo de toxina-antitoxina comprende un gen antitoxina que no operativo o que tiene una operación reducida en células de otra especie. Estas modalidades son útiles para crear una presión selectiva que favorece la retención del vector/MGE (y, por lo tanto, las matrices de CRISPR) en las primeras células hospedadoras que comprenden las secuencias diana.
Un cuadragésimo cuarto aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera del primer al cuadragésimo tercer aspecto, en el que el vector o MGE comprende un módulo de toxina-antioxina que operativo en una segunda célula o más; opcionalmente, en el que el módulo de toxina-antitoxina comprende un gen antitoxina que no operativo o que tiene una operación reducida en células que no sean la segunda o ulterior célula. Esto es útil para mantener una población de matrices de CRISPR en la segunda o ulterior célula (por ejemplo, cuando dichas células están presentes en una biopelícula que también comprende las primeras células), pero en el que el módulo de toxina-antitoxina proporciona destrucción adicional (por encima y por encima de la acción de la modificación de la secuencia diana) en las primeras células hospedadoras. En un ejemplo, el vector o MGE comprende un módulo de toxina-antioxina que es operativo en una primera célula hospedadora y en dicha segunda célula o célula ulterior.
Un cuadragésimo quinto aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos cuadragésimo tercero o cuadragésimo cuarto, en el que el módulo de toxina-antitoxina no es operativo o tiene una operación reducida en células que no sean la primera y segunda o ulterior célula. Por lo tanto, puede haber una presión selectiva tanto en la primera como en la segunda (o ulterior) célula para mantener las matrices de CRISPR. De manera útil, esto proporciona un reservorio para la transferencia horizontal de las matrices en MGE entre células en una población mixta (por ejemplo, una biopelícula en contacto con la superficie o una población comprendida por el fluido).
Un cuadragésimo sexto aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos vigésimo quinto a cuadragésimo quinto, en el que la primera y la segunda célula (o la primera y las células adicionales) son del mismo filo (por ejemplo, ambas células bacterianas) y el vector es replicable u operable (A) en la primera célula y/o segunda (o más) célula pero no en otra célula del mismo filo; (B) en la primera célula y/o segunda (o ulterior) célula pero no en otra célula del mismo orden; (C) en la primera célula y/o segunda (o ulterior) célula pero no en otra célula de la misma clase; (D) en la primera célula y/o segunda (o ulterior) célula pero no en otra célula del mismo orden; (E) en la primera célula y/o segunda (o ulterior) célula pero no en otra célula de la misma familia; (F) en la primera célula y/o segunda (o ulterior) célula pero no en otra célula del mismo género; o (G) en la primera célula y/o segunda (o ulterior) célula, pero no en otra célula de la misma especie.
Un cuadragésimo séptimo aspecto se refiere al procedimiento del vigésimo quinto aspecto o cualquiera de los aspectos vigésimo sexto a cuadragésimo sexto cuando es dependiente del vigésimo quinto aspecto, en el que cada MGE es un transposón conjugado, oriT es funcional en la primera y ulterior (o segunda) célula hospedadora, el MGE comprende una primera y segunda secuencias de repetición terminal y una matriz de CRISPR entre las secuencias de repetición, y en el que la primera y ulterior (o segunda) célula son células bacterianas, en el que el sitio diana está comprendido por las primeras células pero no por las células adicionales (o segunda), y en el que dicha modificación inactiva o regula por disminución un gen o secuencia reguladora que comprende dicha diana en las primeras células, lo que resulta en la reducción de la viabilidad de la primera célula hospedadora y el control de dicho MIC o bioincrustación.
Un cuadragésimo octavo aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos primero a cuadragésimo séptimo, en el que cada matriz de CRISPR comprende una secuencia R1-S1-R1' para la expresión y producción del ARNcr respectivo en una primera célula hospedadora,
(i) en el que R1 es una primera repetición de CRISPR, R1' es una segunda repetición de CRISPR, y R1 o R1' es opcional; y
(ii) S1 es un primer espaciador de CRISPR que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es en un 95 % o más idéntica a una secuencia diana de dicha primera célula hospedadora.
Un cuadragésimo noveno aspecto se refiere al procedimiento del cuadragésimo octavo aspecto, en el que R1 y R1' son al menos en un 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticos respectivamente a la primera y segunda secuencias de repetición de una matriz de CRISPR de la primera especie de célula hospedadora. En una realización, tanto R1 como R1' están presentes.
Un quincuagésimo aspecto se refiere al procedimiento del cuadragésimo octavo o cuadragésimo noveno aspecto, en el que R1 y R1' son funcionales con un sistema CRISPR/Cas de dichas células hospedadoras de dicha primera especie para la modificación de secuencias diana. El quincuagésimo primer aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos cuadragésimo octavo a quincuagésimo, en el que las primeras células hospedadoras son células de bacterias reductoras de sulfato (SRB) y R1 y R1' son al menos en un 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticas respectivamente a una secuencia repetida (por ejemplo, la primera repetición) de una matriz de CRISPR de la primera especie de célula hospedadora.
Un quincuagésimo segundo aspecto se refiere al procedimiento del quincuagésimo primer aspecto, en el que R1 y R1' son al menos en un 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticos respectivamente a una secuencia de repetición que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 50-74. Véase la tabla 1. En una realización, tanto R1 como R1' están presentes.
Un quincuagésimo tercer aspecto se refiere al procedimiento del quincuagésimo primer aspecto, en el que R1 y R1' son al menos en un 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticos respectivamente a una secuencia de repetición que se selecciona del grupo que consiste en SEQ. ID NO: 51, 54 y 69. SEQ ID NO: 51, 54 y 69 se encuentran en más de una especie de SRB. Esto es particularmente útil para dirigir más de un tipo de SRB con la matriz de CRISPR de la invención, por ejemplo, cuando los tipos de SRB coexisten en el sistema industrial o doméstico a tratar, por ejemplo, coexisten en una población o biopelícula que está en contacto con el sustrato o en el fluido a tratar. En una realización, tanto R1 como R1' están presentes.
Un quincuagésimo cuarto aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos cuadragésimo octavo a quincuagésimo tercero, en el que las secuencias de R1 y R1' son idénticas.
Un quincuagésimo quinto aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos primero a quincuagésimo, en el que cada matriz introducida en una primera célula hospedadora se introduce en combinación con una o más nucleasas de Cas (por ejemplo, una Cas9 y/o Cfp1) que funcionan con el ARNcr respectivo en una célula hospedadora para modificar una secuencia diana de la misma.
En un ejemplo, Cas en esta invención en cualquier configuración se desactiva para la actividad de nucleasa y opcionalmente comprende un activador o depresor de secuencia diana. Un Cas 9 en esta invención es, por ejemplo, una Cas9 de S pyogenes o S aureus.
Un quincuagésimo sexto aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos primero a quincuagésimo quinto, en el que cada matriz introducida en una primera célula hospedadora se introduce en combinación con secuencias de ácido nucleico que codifican una o más nucleasas Cas (por ejemplo, una Cas9 y/o Cfp1) que funcionan con el ARNcr respectivo en una célula hospedadora para modificar la secuencia diana.
Un quincuagésimo séptimo aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos cuadragésimo octavo a quincuagésimo sexto, en el que R1 y R1' son funcionales con una nucleasa Cas9 de tipo II para modificar una secuencia diana en una primera célula hospedadora, opcionalmente en el que el procedimiento es además según los aspectos quincuagésimo primero aquincuagésimo sexto, en el que la Cas es dicha Cas9.
Un quincuagésimo octavo aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos primero a quincuagésimo séptimo, en el que todos o algunos de dichos vectores o MGE no comprenden una secuencia que codifica la nucleasa Cas operativa con la matriz respectiva.
Un quincuagésimo noveno aspecto se refiere al procedimiento del aspecto quincuagésimo octavo, en el que cada una de dichas matrices respectivas son operativas con una endonucleasa Cas que se encuentra en células de la primera especie.
Un sexagésimo aspecto se refiere al procedimiento del vigésimo quinto aspecto, o de cualquiera de los aspectos vigésimo sexto a quincuagésimo noveno cuando depende del vigésimo quinto aspecto, en el que cada MGE está desprovisto de una secuencia que codifica una endonucleasa Cas que es operativa con secuencias repetidas de la matriz, y en el que el vector respectivo comprende dicha secuencia (por ejemplo, que codifica una Cas9 de Cfp1) fuera del MGE.
Un sexagésimo primer aspecto se refiere a un procedimiento para controlar la corrosión influenciada microbiológicamente (MIC) o bioincrustación de un sustrato comprendido por un equipo de recuperación, procesamiento, almacenamiento o transporte de petróleo crudo, gas o petroquímicos (por ejemplo, un petrolero crudo, plataforma petrolífera o equipo de perforación petrolífera), en el que una superficie del sustrato está en contacto con una población de primeras células hospedadoras, en el que las primeras células hospedadoras son bacterias reductoras de azufre o sulfato (SRB), bacterias productoras de sustancia polimérica extracelular (EPSB), bacterias productoras de ácido (APB), bacterias oxidantes de azufre o sulfuro (SOB), bacterias oxidantes de hierro (IOB), bacterias oxidantes de manganeso (MOB), bacterias productoras de amoníaco (AmPB) o bacterias productoras de acetato (AcPB) de una primera especie que media la MIC o bioincrustación del sustrato, en el que la superficie celular y la población están en contacto con un líquido seleccionado a partir de agua de mar, agua dulce, un líquido de fracturación o un líquido en un pozo de petróleo natural, un gas natural o un procedimiento que comprende
(i) poner en contacto la población celular con vectores mezclando el líquido con una pluralidad de vectores que son capaces de transformar o transducir las primeras células hospedadoras, en el que cada vector comprende una matriz de CRISPR mediante el cual se introducen matrices de CRISPR en las células hospedadoras, en el que
(a) cada matriz de CRISPR comprende una o más secuencias para la expresión de un ARNcr y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en una célula hospedadora;
(b) cada ARNcr es capaz de hibridarse con una secuencia diana de una célula hospedadora para guiar Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas, por ejemplo, una Cas9 o Cfp1) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana (por ejemplo, para cortar la secuencia diana); la secuencia diana es una secuencia génica para mediar la viabilidad de la célula hospedadora;
(c) en el que cada secuencia de (a) comprende una secuencia R1-S1-R1' para la expresión y producción del ARNcr respectivo en una primera célula hospedadora, en el que R1 es una primera repetición de CRISPR, R1' es una segunda repetición de CRISPR y R1 o R1' es opcional; y S1 es un primer espaciador de CRISPR que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es en un 70, 75, 80, 85, 90 o 95 % o más idéntica a una secuencia diana de dicha primera célula hospedadora y
(ii) permitir la expresión de dichos ARNc en presencia de Cas en células hospedadoras, modificando así las secuencias diana en células hospedadoras, lo que da como resultado la reducción de la viabilidad de la célula hospedadora y el control de MIC o bioincrustación de dicho sustrato. En una realización, tanto R1 como R1' están presentes.
Un sexagésimo segundo aspecto se refiere al procedimiento del sexagésimo primer aspecto, en el que el procedimiento es según el primer aspecto o cualquier aspecto anterior cuando depende del primer aspecto.
Un sexagésimo tercer aspecto se refiere al procedimiento de los aspectos sexagésimo primero a sexagésimo segundo, en el que cada vector es un fago capaz de infectar una primera célula hospedadora o es un vector que comprende un MGE (por ejemplo, un transposón) que comprende dicha matriz de CRISPR, en el que el MGEtiene capacidad de transferencia horizontal a una primera célula hospedadora.
Un sexagésimo cuarto aspecto se refiere al procedimiento del aspecto sexagésimo primero, sexagésimo segundo o sexagésimo tercero, en el que las primeras células son células de bacterias reductoras de sulfato (SRB), por ejemplo, células de Desulfovibrio o Desulfotomaculum.
Un sexagésimo quinto aspecto se refiere al procedimiento del sexagésimo cuarto aspecto, en el que R1 y R1' son al menos en un 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticos respectivamente a una secuencia de repetición (por ejemplo, la primera repetición) de una matriz de CRISPR de la primera especie de célula hospedadora y las matrices de vectores son operativas con una endonucleasa Cas que se encuentra en células de la primera especie. En un ejemplo, R1 y R1' son secuencias idénticas.
Un sexagésimo sexto aspecto se refiere al procedimiento del sexagésimo quinto aspecto, en el que R1 y R1' son al menos en un 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticos respectivamente a una secuencia de repetición que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 50-74. En un ejemplo, R1 y R1' son secuencias idénticas.
Un sexagésimo séptimo aspecto se refiere al procedimiento del sexagésimo sexto aspecto, en el que R1 y R1' son al menos en un 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticos respectivamente a una secuencia de repetición que se selecciona del grupo que consiste en SEQ. ID NO: 51, 54 y 69. Véase la tabla 1. Esto es particularmente útil para dirigir más de un tipo de SRB con la matriz de CRISPR de la invención, por ejemplo, cuando los tipos de SRB coexisten en el sistema industrial o doméstico a tratar, por ejemplo, coexisten en una población o biopelícula que está en contacto con el sustrato o en el fluido a tratar. En un ejemplo, R1 y R1' son secuencias idénticas.
Un sexagésimo octavo aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera del primero al sexagésimo séptimo aspecto, en el que dicha pluralidad de vectores comprende vectores adicionales, en el que cada vector adicional comprende una o más matrices de CRISPR para dirigirse a células hospedadoras adicionales comprendidas por dicha población, en el que la especie de célula hospedadora adicional es diferente de la primera especie de célula hospedadora, en el que en la etapa (i) dichas células adicionales de la población se ponen en contacto con una pluralidad de dichos vectores adicionales que son capaces de transformar o transducir las células adicionales, en el que cada vector comprende una matriz de CRISPR mediante el cual se introducen matrices de CRISPR en las células hospedadoras adicionales, en el que
(a) cada matriz de CRISPR comprende una o más secuencias para la expresión de un ARNcr y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en una célula hospedadora; y
(b) cada ARNcr es capaz de hibridarse con una secuencia diana de dicha célula hospedadora adicional para guiar Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana (por ejemplo, para cortar la secuencia diana); la secuencia diana es una secuencia génica para mediar la viabilidad de la célula hospedadora; y
la etapa (ii) comprende permitir la expresión de dichos ARNc en presencia de Cas en dichas células hospedadoras adicionales, modificando así las secuencias diana en células hospedadoras adicionales.
Un sexagésimo noveno aspecto se refiere al procedimiento del aspecto sexagésimo octavo, en el que las células hospedadoras adicionales median la MIC o bioincrustación de dicho sustrato o fluido, en el que la etapa (ii) da como resultado la reducción de la viabilidad de la célula hospedadora adicional y el control de la MIC o bioincrustación de dicho sustrato o fluido.
Un septuagésimo aspecto se refiere a un procedimiento de control de bioincrustación bacteriana en el agua de lastre de un buque o embarcación, en el que el agua comprende una población de primeras células hospedadoras de una primera especie microbiana que media dicha bioincrustación, y el procedimiento comprende
(i) poner en contacto la población con una pluralidad de vectores que son capaces de transformar o transducir las células, en el que cada vector comprende una matriz de CRISPR mediante el cual se introducen matrices de CRISPR en las células hospedadoras, en el que
(a) cada matriz de CRISPR comprende una o más secuencias para la expresión de un ARNcr y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en una célula hospedadora; y
(b) cada ARNcr es capaz de hibridarse con una secuencia diana de una célula hospedadora para guiar Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana (por ejemplo, para cortar la secuencia diana); la secuencia diana es una secuencia génica para mediar la viabilidad de la célula hospedadora; y
(ii) permitir la expresión de dichos ARNc en presencia de Cas en células hospedadoras, modificando así las secuencias diana en células hospedadoras, lo que da como resultado la reducción de la viabilidad de la célula hospedadora y el control de dicha bioincrustación.
Un septuagésimo primer aspecto se refiere al procedimiento del septuagésimo aspecto, en el que las primeras células hospedadoras son células sp Vibrio cholerae, E coli o Enterococci.
Un septuagésimo segundo aspecto se refiere al procedimiento del septuagésimo primer aspecto, en el que la etapa (i) comprende mezclar el agua de lastre con los vectores, por ejemplo, en el casco de un barco o embarcación.
Un septuagésimo tercer aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos septuagésimo a septuagésimo segundo, en el que el barco o embarcación es un vehículo marino y el agua es agua de mar.
Un septuagésimo primer aspecto se refiere al procedimiento de cualquiera de los aspectos septuagésimo y septuagésimo segundo, en el que en lugar de un barco o embarcación, el agua de lastre está comprendida por un contenedor o una plataforma de perforación en el mar, por ejemplo, una plataforma petrolífera o equipo de perforación petrolífera. En un ejemplo, el buque, embarcación, contenedor, plataforma o equipo está anclado en el mar (es decir, no temporalmente en su ubicación).
Un septuagésimo quinto aspecto se refiere a un procedimiento para descargar aguas de lastre de un buque o embarcación, en el que las aguas de lastre descargadas comprenden aguas tratadas mediante el procedimiento de cualquiera de los aspectos septuagésimo y septuagésimo cuarto.
Un septuagésimo sexto aspecto se refiere al procedimiento del septuagésimo quinto aspecto, en el que el agua se descarga en una masa de agua, por ejemplo, un mar, océano o vía fluvial (por ejemplo, un río, canal, lago o reservorio) o en un recipiente.
Un septuagésimo séptimo aspecto se refiere al agua de mar de lastre que comprende matrices de CRISPR, en el que el agua de lastre se obtiene u puede obtenerse mediante el procedimiento de cualquiera de los aspectos septuagésimo a septuagésimo sexto.
Un septuagésimo octavo aspecto se refiere a un buque, embarcación, contenedor o plataforma que comprende el agua de mar de lastre del aspecto septuagésimo séptimo.
Un septuagésimo noveno aspecto se refiere a un vector para uso en el procedimiento de cualquiera de los aspectos sexagésimo primero a sexagésimo noveno, en el que las primeras células son células de bacterias reductoras de sulfato (SRB), por ejemplo, células Desulfovibrio o Desulfotomaculum, cada vector comprende una o más matrices de CRISPR para dirigirse a la SRB, en el que cada matriz es como se define en (a)-(c) del aspecto sexagésimo primero.
Un octogésimo aspecto se refiere al vector del aspecto septuagésimo noveno, en el que R1 y R1' son según cualquiera de los aspectos sexagésimo quinto a sexagésimo séptimo.
Un octogésimo primer aspecto se refiere a un vector para uso en el procedimiento de cualquiera de los aspectos septuagésimo a septuagésimo sexto, en el que las primeras células son células de Cholera (por ejemplo, vibrio, por ejemplo, O1 o O139), células sp de E coli o Enterococci, en el que el vector comprende una o más matrices de CRISPR para dirigirse a las células, en el que cada matriz es como se define en (a) y (b) del septuagésimo aspecto.
Un octogésimo segundo aspecto se refiere al vector de cualquiera de los aspectos septuagésimo noveno a octogésimo primero, en el que el vector es un bacteriófago capaz de infectar dicha célula.
Un octogésimo tercer aspecto se refiere al vector de cualquiera de los aspectos septuagésimo noveno a octogésimo primero, en el que el vector es un transposón o MGE capaz de transferirse a una célula.
Un octogésimo cuarto aspecto se refiere a una pluralidad de vectores, en el que cada vector es según los aspectos 82 u 83, opcionalmente en combinación con un biocida o antibiótico que es capaz de reducir la viabilidad de dichas células.
Bacterias que median MIC o Biofouling: En un ejemplo, las primeras células hospedadoras se seleccionan del grupo que consiste en bacterias reductoras de azufre o sulfato (SRB, por sus siglas en inglés), bacterias productoras de sustancias poliméricas extracelulares (EPSB, por ejemplo, Pseudomonas), bacterias productoras de ácido (APB, por sus siglas en inglés), bacterias oxidantes de azufre o sulfido (SOB, por sus siglas en inglés); bacterias oxidantes de hierro o manganeso (IOB, por sus siglas en inglés), bacterias productoras de amoníaco (AmPB, por sus siglas en inglés) y bacterias productoras de acetato (AcPB, por sus siglas en inglés). Por ejemplo, las primeras células hospedadoras son AcPB (por ejemplo, Acetobacter spp. y/o Gluconacetobacter spp) y la superficie está en contacto con un combustible de hidrocarburos (por ejemplo, etanol de grado combustible) y/o agua.
Los siguientes son ejemplos de bacterias relevantes para la presente invención (en un ejemplo, las primeras células hospedadoras son células de cualquiera de las siguientes especies). La bacteria Acidithiobacillus produce ácido sulfúrico. Acidithiobacillus thiooxidans, una bacteria del subgénero Acidithiobacillus, frecuentemente daña las tuberías de alcantarillado. Ferrobacillus ferrooxidans oxida directamente el hierro a óxidos de hierro e hidróxidos de hierro. Otras bacterias producen varios ácidos, tanto orgánicos como minerales, o amoníaco. En presencia de oxígeno, bacterias aerobias como Thiobacillus thiooxidans, Thiobacillus thioparus y Thiobacillus concretivorus, las tres ampliamente presentes en el medio ambiente, son los factores comunes que causan la corrosión que resulta en la corrosión de sulfuros biogénicos. Sin presencia de oxígeno, las bacterias anaerobias, especialmente Desulphovibrio y Desulphotomaculum, son comunes. Desulphovibrio salixigens requiere al menos un 2,5 % de concentración de cloruro de sodio, pero D. vulgaris y D. desulphuricans pueden crecer tanto en agua dulce como salada. D. africanus es otro microorganismo común causante de corrosión. El género Desulphotomaculum comprende bacterias formadoras de esporas reductoras de sulfatos. Desulphotomaculum orientis y nigrificans participan en los procesos de corrosión. Los reductores de sulfato requieren un entorno de reducción, y se requiere un potencial de electrodo de al menos -100 mV para que prosperen. Sin embargo, incluso una pequeña cantidad de sulfuro de hidrógeno producido puede lograr este cambio, por lo que el crecimiento, una vez iniciado, tiende a acelerarse.
En un ejemplo, las primeras células hospedadoras son Serratia marcescens, Gallionella sp., Pseudomonas sp, Bacillus sp.(por ejemplo, B. subtilis, B. cereus, B. pumilus o B. megaterium), Thiobacillus sp., Sulfolobus sp., Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa, P. stutzeri, Micrococcus, Enterococcus, Staphylococcus (por ejemplo, S. aureus), E. faecalis o células M. Iuteus. En un ejemplo, las primeras células hospedadoras comprenden una mezcla de dos o más de dichas especies. Estas especies han sido aisladas de tuberías diésel y de transporte de nafta ubicadas en las regiones noroeste y suroeste de la India; se corroboró la asociación con la corrosión localizada del acero de la tubería en presencia de estos consorcios. Un proyecto conjunto de diferentes fabricantes de aviones europeos confirmó la participación de aislados de los géneros Micrococcus, Enterococcus, Staphylococcus y Bacillus en daños por corrosión en aleaciones de aluminio, comúnmente utilizados en la construcción de aeronaves. Estas bacterias pueden crear un entorno microacídico (bacterias productoras de ácido), que favorece el desarrollo de otras bacterias, o producir EPS, favoreciendo la formación de biopelícula (bacterias productoras de EPS). Por lo tanto, en una realización de la invención, la superficie (por ejemplo, superficie de acero) del sistema a tratar está en contacto con diésel o nafta, o el fluido a tratar es diésel o nafta (y opcionalmente las primeras células hospedadoras son de una o más especies definidas en este párrafo). En una realización de la invención, la superficie (por ejemplo, superficie que contiene aluminio, por ejemplo, una superficie de aeronave) del sistema a tratar está en contacto con uno, dos, tres o todos los géneros: Micrococcus, Enterococcus, Staphylococcus y Bacillus (primeras células hospedadoras). En un ejemplo de cualquier realización de este párrafo, la superficie es una superficie de un componente de acero o aluminio del sistema.
Bacterias productoras de ácido: Las bacterias aerobias son capaces de producir ácidos orgánicos de cadena corta como los ácidos acético, fórmico, láctico, propiónico y butírico como productos de su metabolismo a partir del metabolismo fermentativo de los materiales orgánicos. También son colonizadores iniciales debido al metabolismo aeróbico. Estos microorganismos están presentes en una variedad de ambientes, que incluyen soportes de gas y aceites. Los ácidos orgánicos sirven como sustratos para las SRB, acelerando el proceso de corrosión, además de reducir el pH del medio circundante. Además, la gran cantidad de ácido orgánico producido actúa en la despolarización del metal, iniciando el proceso corrosivo local.
Bacterias oxidantes del azufre: Las bacterias oxidantes del azufre son microorganismos aeróbicos y anaeróbicos facultativos que obtienen la energía necesaria para el crecimiento a partir de la oxidación de compuestos inorgánicos de azufre tales como el sulfuro, el sulfito, el tiosulfato y, en algunos casos, el azufre. El metabolismo oxidativo resulta en la producción de ácido sulfúrico que promueve la acidificación del medio ambiente. Este grupo abarca muchos géneros, siendo el género Acidithiobacillus el más estudiado. El grupo también incluye especies bacterianas de los géneros Sulfolobus, Thiomicrospira, Beggiatoa, Acidithiobacillus y Thiothrix, así como las especies Thiosphaera pantotropha y Paracoccus denitrificans. En un ejemplo, las primeras células hospedadoras son células de cualquiera de estas especies.
Bacterias antioxidantes del hierro: Las bacterias oxidantes de hierro son microorganismos aeróbicos, pertenecientes a un grupo grande y diverso, que obtienen la energía necesaria para su metabolismo a partir de la oxidación del hierro. En consecuencia, existe la formación de hidróxidos de hierro que generalmente forman precipitado insoluble en las superficies del sustrato, promoviendo regiones con diferentes niveles de oxígeno. Se encuentran ampliamente en el agua de ríos, lagos y la producción de petróleo. Tienen principalmente una vaina locomotora y su presencia puede ser detectada por una gran acumulación de precipitados férricos como producto de corrosión. Esta acumulación o ensuciamiento inorgánico conduce a problemas en los equipos industriales, como bloqueos en los oleoductos. Entre los más comunes se encuentran:
Thiobacillus ferrooxidans y los géneros Crenothrix, Gallionella, Leptothrix y Spherotillus. En un ejemplo, las primeras células hospedadoras son células de cualquiera de estas especies.
Bacterias reductoras de azufre o sulfato (SRB): Las SRB forman un grupo morfológico y filogenéticamente heterogéneo que incluye bacterias y arquebacterias anaeróbicas restringidas, aunque algunas especies tienen una tolerancia significativa al oxígeno. Son principalmente bacterias gramnegativas, mesófilas y algunas termofílicas generalmente formadoras de esporas. Estos microorganismos son capaces de oxidar diversos compuestos orgánicos de bajo peso molecular, incluidos ácidos alifáticos mono o dicarboxílicos, alcoholes, hidrocarburos y compuestos aromáticos, utilizando iones de sulfato u otros compuestos de azufre (tiosulfato, sulfito, etc.) como aceptadores de electrones. El acetato, el lactato, el piruvato y el etanol se encuentran entre los sustratos más utilizados por las SRB. La estimulación del crecimiento de SRB se debe a las condiciones anaeróbicas existentes en las biopelículas explicadas por la deposición de productos de corrosión combinados con microorganismos y, durante la recuperación de petróleo, donde hay inyección de medios acuosos como el agua de mar, rica en sulfato. Se pueden producir grandes cantidades de sulfuro de hidrógeno biogénico; la mayor parte del H2S formado en oleoductos y otros equipos de recuperación, procesamiento, almacenamiento o transporte de petróleo, gas o petroquímicos se origina en la actividad metabólica de las SRB. Otro impacto económico en la industria petrolera es la acidificación del petróleo y el gas por el H2S.
Teniendo en cuenta las numerosas pérdidas económicas relacionadas con la actividad metabólica de las SRB, los esfuerzos se han dirigido al uso de inhibidores metabólicos tóxicos y perjudiciales para el medio ambiente, como el molibdato, el nitrato y el nitrito, y la aplicación de biocidas, que ayudan a controlar la actividad metabólica de las SRB y la posterior inhibición de la producción biogénica de H2S.
Varios mecanismos contribuyen a contener el proceso de formación de H2S biogénico mediante el uso de inhibidores metabólicos: I- competencia entre SRB y bacterias heterótrofas que son reductores de nitrito o nitrato por donantes de electrones ordinarios, resultando en exclusión competitiva de SRB; II- aumento del potencial redox debido a la presencia de intermediarios de reducción de nitrato (óxido nitroso y óxido nítrico), ya que la producción biológica de H2S se produce solo a bajo potencial redox (por debajo de -100 mV); III- cambio del metabolismo energético de algunos SRB, al reducir nitrato en lugar de sulfato; IV- bacterias oxidantes de sulfuro y bacaterias reductoras de nitrato o nitrito que utilizan el nitrato o nitrito para reoxidar H2S, lo que resulta en la eliminación de H2S; V- inhibición de la sulfito reductasa disimilatoria por nitrito para inhibir el paso enzimático final a través de la reducción de sulfato en SRB.
En determinadas realizaciones de la presente invención, la población de células hospedadoras en contacto con el sustrato a tratar o comprendido por el fluido a tratar también se pone en contacto con uno o más nitratos y/o uno o más nitritos en presencia de los vectores de la invención. Por ejemplo, en la etapa (i) de forma simultánea o secuencial con los vectores, el nitrato/nitrito y los vectores se combinan con (por ejemplo, se inyectan en) petróleo, gas, petroquímica, agua u otro fluido comprendido por el sistema industrial o doméstico. Asimismo, de manera adicional o alternativa, los molibdatos también se pueden usar en estos sistemas como un mecanismo de control para SRB. Por lo tanto, en una realización, la población de células hospedadoras en contacto con el sustrato a tratar o comprendido por el fluido a tratar también se pone en contacto con uno o más molibdatos en presencia de los vectores de la invención. Por ejemplo,en la etapa (i) de forma simultánea o secuencial con los vectores, los molibdatos y vectores se combinan con (por ejemplo, se inyectan en) petróleo, gas, petroquímico u otro fluido comprendido por el sistema industrial o doméstico.
En otras realizaciones, la población se pone en contacto con bacterias reductoras de nitrato y/o bacterias oxidantes de sulfuro reductor de nitrato (NRSOB) (en esta invención, colectivamente, «NRB») en presencia de los vectores de la invención. Por ejemplo, de forma simultánea o secuencial con los vectores, las NRB se combinan con (por ejemplo, se inyectan en) petróleo, gas, petroquímica, agua u otro fluido comprendido por el sistema industrial o doméstico. En un ejemplo, las NRB comprenden vectores de la invención, en los que los vectores son capaces de transferirse desde las células NRB a las primeras células hospedadoras (células SRB); y después de combinar las células NRB y SRB, los vectores se introducen en las células SRB. En un ejemplo, las células SRB están comprendidas por una mezcla de células microbianas (por ejemplo, comprendidas por una biopelícula microbiana) antes del contacto con dichos vectores, en los que la mezcla comprende células de la especie NRB. Por lo tanto, en este caso la invención implica poner en contacto las células SRB con células NRB (que contienen vectores) donde las especies de células NRB ya están coexistiendo con las SRB en la biopelícula a la que se dirigirá, lo que aumenta la compatibilidad y la posibilidad de absorción de las NRB que contiene el vector en la población de células de biopelícula. Esto es útil para aumentar las posibilidades de que los vectores se lleven a la biopelícula, aumentando así las posibilidades de eficacia para modificar las células SRB y las posibilidades de propagación de las matrices de CRISPR de la invención dentro de la biopelícula (especialmente cuando las matrices están comprendidas por elementos genéticos móviles, tales como transposones o comprendidos por fagos, como se describe en la presente memoria).
Las SRB y las NRB normalmente compiten por la misma fuente de carbono no polimérico (tal como acetatos) presente en determinados yacimientos petrolíferos y sistemas de agua industrial necesarios para el crecimiento de bacterias. Al aumentar la tasa de crecimiento de las NRB en comparación con las SRB, las NRB pueden competir con las SRB en el consumo de la fuente de carbono no polimérico disponible, privando a las SRB de su capacidad de crecer y crear los sulfuros no deseados y reducir las tasas de corrosión. Además, al inhibir la tasa de crecimiento de las s Rb , las NRB pueden predominar, nuevamente fuera de competir con las SRB por el carbono no polimérico disponible en el sistema, por ejemplo, el sistema de agua industrial o de yacimiento petrolífero. Por lo tanto, el contacto de las células SRB en la población con NRB puede ayudar a reducir la viabilidad de las células SRB al aumentar la relación de NRB a SRB en la población.
En una realización, la invención comprende poner en contacto la población que comprende la primera célula hospedadora (por ejemplo, SRB) con nitratos y nitritos orgánicos y/o inorgánicos. Estos sirven para estimular el crecimiento de las NRB presentes, ayudando así a las NRB a competir más que las SRB. Los nitratos orgánicos e inorgánicos o los nitritos inorgánicos pueden usarse inyectados en ciertos yacimientos petrolíferos y sistemas de agua industrial. Los nitratos inorgánicos y nitritos inorgánicos disponibles para su uso en la presente descripción incluyen, por ejemplo, nitrato de potasio, nitrito de potasio, nitrato de sodio, nitrito de sodio, nitrato de amonio y mezclas de los mismos. Estos nitratos orgánicos e inorgánicos y nitritos inorgánicos están comúnmente disponibles, pero no son limitantes y se puede usar cualquier nitrato o nitrito adecuado.
La cantidad de nitrato o nitrito orgánico o inorgánico utilizado depende de una serie de factores, incluida la cantidad de sulfato y/u ácidos orgánicos presentes en la población en el sistema, y la cantidad esperada de NRB necesaria para contrarrestar las SRB. En determinadas realizaciones, para tratar MIC de un sustrato en contacto con un líquido, o para tratar la bioincrustación de un líquido según la invención, la concentración de nitrato o nitrito orgánico o inorgánico utilizada es inferior a 2000 ppm en peso del líquido, alternativamente de 500 a 1600 ppm en peso o alternativamente entre aproximadamente 900 y 1100 ppm en peso cuando se aplica usando un procedimiento de aplicación por lotes. Cuando se aplica mediante operación continua, la concentración del nitrato o nitrito orgánico o inorgánico puede ser inferior a 500 ppm en peso, alternativamente entre 10 y 500 ppm, o alternativamente entre 10 y 100 ppm del líquido.
En una realización, la población se pone en contacto con los vectores de la invención y de forma simultánea o secuencial con NRB (por ejemplo, que comprenden los vectores) y nitrato y/o nitrito.
Las NRB adecuados incluyen cualquier tipo de bacteria capaz de realizar la reducción de nitrato anaeróbico, tal como bacterias reductoras de nitrato heterótrobas y bacterias oxidantes de sulfuro reductoras de nitrato. En un ejemplo, las NRB comprenden uno, dos, tres o más (por ejemplo, uno o más) NRB seleccionadas del grupo que consiste en Campylobacter sp. Nitrobacter sp., Thiobacillus sp., Nitrosomonas sp., Thiomicrospira sp., Sulfurospirillum sp., Thauera sp., Paracoccus sp., Pseudomonas sp. y Rhodobacter sp. Por ejemplo, las NRB se seleccionan de uno o más de entre Nitrobacter vulgaris, Nitrosomonas europea, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, Paracoccus denitrificans, Sulfurospirillum deleyianum y Rhodobacter sphaeroides.
En determinadas realizaciones, las NRB son una cepa de NRB que se encuentra en un sistema de recuperación, procesamiento, transporte o almacenamiento de petróleo crudo, gas, petroquímico o agua (por ejemplo, en un equipo del mismo), o se encuentra en una formación subterránea, tal como un pozo de agua o petróleo. Las NRB pueden optimizarse para metabolizarse bajo las condiciones del sistema. Las NRB se seleccionan, por ejemplo, de una biblioteca de cepas de NRB o se pueden cultivar del sistema a tratar o un sistema similar.
La cantidad de NRB puesta en contacto con las células SRB en el sistema puede depender de una cantidad de factores que incluyen la cantidad de SRB esperada, así como cualquier biocida que pueda estar presente. Cuando se inyecta en la formación subterránea, también se puede considerar la permeabilidad y porosidad de la formación subterránea. En determinadas realizaciones de la presente descripción, la cantidad de n Rb inyectada en el líquido es de entre 1 y 108 unidades en el recuento de bacterias/ml del líquido, o alternativamente entre 10 y 104 unidades en el recuento de bacterias/ml del líquido.
Además de estimular a las NRB para que compitan con las SRB, puede ser deseable introducir inhibidores de SRB adicionales en determinadas realizaciones de la presente descripción junto con los nitratos. En un ejemplo, las SRB se ponen en contacto con uno o más inhibidores de SRB seleccionados del grupo que consiste en 9,10-antraquinona, molibdatos (tales como molibdato de sodio y/o molibdato de litio) y mezclas de los mismos. En determinadas realizaciones de la presente descripción, se añade molibdato al líquido en el intervalo de 5 a 100 ppm en peso de líquido.
En un ejemplo, los vectores de la invención y uno o más biocidas (es decir, biocidas de las primeras células hospedadoras, tales como biocidas de SRB) se mezclan antes de poner en contacto las primeras células con la mezcla, por ejemplo, mediante inyección de la mezcla en líquido que está en contacto con la superficie a tratar o inyección de la mezcla en el fluido a tratar.
De manera adicional o alternativa a las células NRB que contienen vectores, la invención contempla el uso de una especie de células de Bacillus que comprenden vectores de la invención.
En una realización, los vectores son bacteriófagos que son capaces de infectar las SRB y el fago se ponen en contacto con las primeras células hospedadoras (por ejemplo, SRB), mediante lo cual las matrices de CRISPR comprendidas por el fago se introducen en las primeras células hospedadoras para su modificación según la invención. En una realización, cuando las primeras células son SRB, las SRB también se ponen en contacto con los vectores de fagos de la invención y de forma simultánea o secuencial con NRB. En lugar de, o además de entrar en contacto con NRB, las SRB entran en contacto con nitrato y/o nitrito.
Los ejemplos de mecanismos involucrados en MIC son los siguientes; en una realización, el «control» usando el procedimiento comprende reducir un mecanismo seleccionado de entre:
• promoción microbiana (por ejemplo, bacteriana) de la biomineralización debido a la deposición de hidróxidos de hierro en la superficie metálica, que modifica los procesos electroquímicos en el metal/solución de interfaz, induciendo la corrosión;
• producción de EPS que favorece la formación de biopelícula;
• promoción microbiana (por ejemplo, bacteriana) de la degradación de los productos del petróleo debido a la liberación de la enzima aril-hidrocarburo-hidroxilasa (AHH) que actúa sobre la corrosión de los metales;
• producción de ácido sulfúrico, que aumenta el proceso de corrosión; y
• oxidación de azufre.
En una realización, el procedimiento comprende reducir un mecanismo seleccionado de entre:
• promoción bacteriana de la biomineralización debido a la deposición de hidróxidos de hierro en la superficie, en el que la superficie es una superficie metálica;
• producción de EPS;
•promoción bacteriana de la degradación de los productos del petróleo en el sistema debido a la liberación de la enzima aril-hidrocarburo-hidroxilasa (AHH), en el que la superficie es una superficie metálica;
• producción de ácido sulfúrico; y
• oxidación de azufre.
EJEMPLOS APLICABLES AL CONTROL DE MIC O BIOINCRUSTACIÓN
Hay aplicaciones ejemplares específicas previstas por la presente invención para reducir la corrosión y/o bioincrustación asociada con bacterias. Las aplicaciones descritas a continuación no pretenden limitar el concepto de la presente invención, y son sencillamente ilustrativas de cómo se puede utilizar la invención para controlar la corrosión inducida por bacterias o para reducir la contaminación ambiental.
Drenaje ácido de minas: En el drenaje ácido de minas, el crecimiento bacteriano puede aumentar la acidez en el medio ambiente. Existe un esquema de reacción para la creación de ácido y, por lo tanto, posibles daños ambientales. El problema del drenaje ácido de las minas se reconoce en todo el mundo como un grave problema medioambiental. El origen del drenaje ácido de minas es la intemperización y oxidación de minerales piríticos y otros que contienen sulfuros. El drenaje de minas se forma cuando la pirita, un sulfuro de hierro, se expone y reacciona con el aire y el agua para formar ácido sulfúrico y hierro disuelto. Parte o todo este hierro puede precipitarse para formar los sedimentos rojos, anaranjados o amarillos en el fondo de los arroyos que contienen el drenaje de minas. La escorrentía ácida disuelve además metales pesados tales como cobre, plomo, mercurio en aguas subterráneas o superficiales. La velocidad y el grado en que el drenaje ácido de minas procede se puede aumentar por la acción de determinadas bacterias.
En un ejemplo, el sistema es, por lo tanto, una mina o está comprendido por una mina. El fluido es fluido de drenaje de minas y el procedimiento reduce el ácido sulfúrico causado por el drenaje de minas. En un ejemplo, la superficie está en contacto con el fluido de drenaje de minas.
En un ejemplo, las primeras células hospedadoras son células Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus denitrificans Leptospirillum ferrooxidans o Sulfobacillus thermosulfidooxidans o una mezcla de dos o más de estas.
Fracturación hidráulica: La fracturación hidráulica es un procedimiento para fracturar formaciones rocosas para facilitar la extracción de gas y otros hidrocarburos. Esencialmente, una vez que se identifica una formación portadora de gas, se perforan pozos en la tierra en direcciones tanto verticales como horizontales para acceder al gas. Los pozos a continuación se utilizan para fracturar el esquisto mediante agua a alta presión, arena y una plétora de productos químicos para evitar que las fracturas y fisuras se cierren por la presión intensa de la sobrecarga una vez que se completa la hidrofracturación. Millones de galones de agua se usan para fracturar un pozo. Entre el 30 % y el 70 % del fluido de fracturación regresa a la superficie como «flujo de retorno». El flujo de retorno contiene cualquier materia que se disuelve en el agua de fracturación, incluida la sal. Lo que se disuelve depende de la ubicación. El flujo de retorno se mantiene en pozos recubiertos de plástico en el sitio del pozo hasta que se transporta en camión y se trata antes de su eliminación. En algún momento, el agua de alto flujo y relativamente baja salinidad se convierte en un «agua producida» de menor flujo, pero de salinidad mucho más alta, para distinguirla del agua de «retorno».
En cualquier caso, existe el problema de la corrosión inducida por microbios (MIC). Son de particular interés las SRB. En un ejemplo, por lo tanto, el sistema es un sistema de fracturación hidráulica y el fluido es un líquido de fracturación hidráulica (por ejemplo, agua de reflujo o agua producida) o la superficie a tratar está en contacto con dicho líquido. El procedimiento, por ejemplo, reduce la viabilidad de SRB (por ejemplo, destruye SRB y/o reduce la proliferación de SRB en el líquido) y las primeras células hospedadoras son SRB.
Por ejemplo, las primeras células hospedadoras son bacterias Acidithiobacillus, Acidithiobacillus thiooxidans, Ferrobacillus ferrooxidans, Thiobacillus thiooxidans, Thiobacillus thioparus, Thiobacillus concretivorus, células Desulphovibrio (por ejemplo, salixigens, vulgaris, desulfuricans o africanus) o Desulphotomaculum (por ejemplo, orientis o nigrificans), o una mezcla de dos o más de estas especies.
Equipos de refrigeración (por ejemplo, torres de refrigeración): La presencia de bacterias en los equipos de refrigeración, como las torres de refrigeración, puede afectar negativamente el funcionamiento de la refrigeración de varias maneras. Por ejemplo, las SRB apoyan la creación de condiciones ácidas en las paredes de torres de enfriamiento, intercambiadores de calor, etc., lo que conduce a la corrosión y el apagado potencial del sistema de enfriamiento mientras se realizan reparaciones. Además, las biopelículas en las paredes de, por ejemplo, los intercambiadores de calor, reducen el coeficiente de transferencia de calor de los intercambiadores de calor, lo que resulta en una disminución de la eficiencia operativa del sistema de enfriamiento.
Además, la corrosión de los componentes que contienen hierro puede ser especialmente perjudicial. La oxidación de hierro a hierro(II) y la reducción de sulfato a iones de sulfuro con la precipitación resultante de sulfuro de hierro y la generación de iones de hidrógeno corrosivos in situ pueden tener lugar a través de las SRB. La corrosión del hierro por bacterias reductoras de sulfato es rápida y, a diferencia de la oxidación ordinaria, no es autolimitante. Los tubérculos producidos por Desulphovibrio consisten en una capa externa de óxido férrico rojo mezclado con óxido de hierro magnético negro, que contiene un centro negro suave de sulfuro ferroso.
En un ejemplo, por lo tanto, el sistema es un sistema de enfriamiento y el fluido es un fluido (por ejemplo, agua o un líquido acuoso) comprendido por el sistema o la superficie a tratar es una superficie del equipo de enfriamiento en contacto con dicho fluido. En un ejemplo, las primeras células hospedadoras son SRB (por ejemplo, cualquier SRB descrita en esta invención). En un ejemplo, la superficie es una superficie que contiene hierro.
En un ejemplo, las primeras células hospedadoras son células Legionella. Estas especies son perjudiciales para la salud humana y se propagan en equipos de refrigeración, calentamiento, procesamiento o almacenamiento de agua. En un ejemplo, por lo tanto, el sistema es un equipo de este tipo.
Corrosión de la tubería: Las tuberías de hidrocarburos y petroquímicas a menudo incluyen suficiente humedad para permitir el crecimiento bacteriano, lo que resulta en MIC, por ejemplo, causado por SRB. La MIC a menudo es causado por biopelículas de bacterias aeróbicas que protegen las SRB, que son anaeróbicas y están en contacto directo con la superficie interna de la tubería. Esto crea condiciones ácidas y otras condiciones de corrosión de metales, lo que resultará en corrosión localizada y eventualmente avería de la tubería.
En un ejemplo, el sistema comprende una superficie de equipo (por ejemplo, tubería o equipo de perforación) que comprende una superficie en contacto con las primeras células hospedadoras (por ejemplo, SRB). Por ejemplo, el sistema es un sistema de petróleo crudo, hidrocarburo, petroquímico (por ejemplo, diésel o petróleo), recuperación de gas o agua, procesamiento, almacenamiento o transporte. Por ejemplo, la tubería es una tubería petroquímica. Por ejemplo, el gasoducto está comprendido por una plataforma de petróleo o gas. Por ejemplo, la superficie de la tubería está en contacto con el agua de mar. Por ejemplo, la superficie del gasoducto está en contacto con un fluido petroquímico, petróleo crudo o gas natural.
Tratamiento de aguas residuales: El tratamiento de aguas residuales implica la adición de lodos activados corriente abajo de una planta de tratamiento de aguas residuales para eliminar contaminantes orgánicos. Por lo tanto, después de que el agua es tratada en una instalación de tratamiento de desechos, hay muchos contaminantes orgánicos presentes que pueden ser «digeridos» por bacterias. Por lo tanto, el lodo activado se agrega al agua tratada en un tanque/recipiente para tratar el efluente de la instalación de tratamiento de aguas residuales.
Sin embargo, a veces las bacterias en el tanque/contenedor (ya sea que provengan del lodo activado, de las propias aguas residuales o del entorno circundante), dominarán y crecerán muy rápidamente. Dicho crecimiento rápido puede resultar en un crecimiento bacteriano de forma filamentosa. Los filamentos pueden formar hasta el 20-30 % de la población bacteriana en el tanque o contenedor, y flotan. Este crecimiento filamentoso resulta en lo que se conoce como lodo de carga. La presente invención se puede utilizar para el control de lodos de carga, que es un aspecto importante en el tratamiento de aguas residuales.
Por lo tanto, en un ejemplo, el sistema es un sistema de tratamiento de agua y la superficie es una superficie de un recipiente del sistema, en el que la superficie está en contacto con el agua y las primeras células hospedadoras; o el fluido a tratar comprende dicha agua y células. En un ejemplo, el procedimiento controla el crecimiento bacteriano en el lodo de un sistema de aguas residuales.
Envío y transporte: Los buques y embarcaciones pueden experimentar MIC en sus superficies exteriores (por ejemplo, cascos) en contacto con el agua de mar o las vías navegables (por ejemplo, ríos, lagos, estanques o agua dulce). Las superficies interiores del casco también pueden estar sujetas a MIC ya que típicamente están en contacto con humedad o líquidos que pueden albergar microbios mediadores de MIC tales como bacterias, por ejemplo, en contacto con aguas de lastre. Por ejemplo, el agua de mar a menudo se transporta en los cascos de los buques (como los petroleros) para proporcionar estabilidad en el mar; dicha agua de mar alberga bacterias que pueden mediar en las SRB. Otros vehículos de transporte, como los vehículos de motor (automóviles, camiones, furgonetas o camiones), trenes, naves espaciales y aeronaves también pueden ser susceptibles.
Por lo tanto, en un ejemplo, el sistema es un vehículo de transporte (por ejemplo, para transportar mercancías y/o personas o ganado, por ejemplo, un automóvil, camión, camioneta o camión, tren, nave espacial o aeronave). Por ejemplo, el vehículo es un barco o embarcación, por ejemplo, un buque marítimo de petróleo, gas o petroquímicos (por ejemplo, un petrolero). En un ejemplo, la superficie a tratar está en contacto con agua de mar. En un ejemplo, la superficie es una superficie externa de un buque o casco de barco. En un ejemplo, la superficie es una superficie interna de un barco o casco de barco.
Persistencia o crecimiento bacteriano (bioincrustación) en las aguas de lastre: Una aplicación específica de la invención es el tratamiento de aguas de lastre de vehículo marino (por ejemplo, barco o embarcación) para reducir bacterias no deseadas, tales como Vibrio cholerae, E coli y/o Enterococci sp.
El transporte marítimo mueve más del 90 % de los productos básicos del mundo y es responsable de la transferencia mundial de aproximadamente 2-3 mil millones de toneladas de aguas de lastre, que son transportadas habitualmente por los buques para mantener su estabilidad. Un volumen similar de aguas de lastre también puede transferirse a nivel nacional dentro de los países y regiones cada año (GloBallast Partnerships, www.globallast.imo.org). Las aguas de lastre han sido reconocidas como la principal fuente de organismos marinos invasores que amenazan la biodiversidad natural, cuyas consecuencias se están realizando cada vez más (Anil y col. 2002). La introducción involuntaria de bacterias patógenas causantes de enfermedades, que se transportan desde el lugar de origen o se forman durante el transporte, puede tener un impacto directo en la sociedad y la salud humana. Los tanques de lastre de los buques contienen diferentes vertebrados, invertebrados, plantas, algas microscópicas, bacterias, etc. no autóctonos. (Williams y col. 1988;
Carlton y Geller 1993; Smith y col. 1996; Ruiz y col. 2000; Drake y col. 2002, 2005, 2007; Mimura y col. 2005). Los microorganismos, como las bacterias, se introducen en ambientes extraños en mayor número que otros organismos debido a su alta abundancia natural, capacidad para formar etapas de reposo y capacidad para soportar una amplia gama de condiciones ambientales. Aunque todos los organismos llevados a bordo en tanques de lastre podrían no sobrevivir, las bacterias y las microalgas son bien capaces de sobrevivir períodos prolongados de condiciones desfavorables mediante la formación de quistes, esporas u otras etapas de reposo fisiológico (Roszak y col. 1983; Hallegraeff y Bolch 1992; Anil y col. 2002; Carney y col. 2011). Una vez liberados, estos microorganismos son muy adecuados para ser invasivos debido a su pequeño tamaño, lo que facilita su dispersión pasiva y requisitos más sencillos para la supervivencia que los metazoarios (Deming 1997). La concentración de células de la especie Vibrio en muestras de lastre examinadas de buques en el puerto de Singapur estuvo en el intervalo de 1, 1 -3,9 x 104ml1 (Joachimsthal y col. 2004). La introducción no intencional de bacterias patógenas causantes de enfermedades puede tener efectos directos en la sociedad, incluidos efectos en la salud humana. En un estudio anterior se halló que la mayoría de los patógenos introducidos en la bahía de Chesapeake se originaron a partir de bacterias asociadas con el plancton en lugar de la propia columna de agua (Ruiz y col. 2000). Por lo tanto, los microorganismos de aguas de lastre como las bacterias y las arqueas son de gran preocupación en los programas de tratamiento/gestión de aguas de lastre.
La Organización Marítima Internacional (OMI) ha elaborado un convenio destinado a prevenir esos efectos nocivos y en 2004 aprobó el Convenio internacional para el control y la gestión de aguas de lastre y los sedimentos de los buques (Convenio sobre la gestión del agua de lastre). En los Estados Unidos, la Regla Final de la Guardia Costera de los Estados Unidos sobre la Gestión de Aguas de Lastre entró en vigor en junio de 2012, aplicándose a la descarga de aguas de lastre en aguas de los Estados Unidos.
El intercambio de aguas de lastre en el mar no se considera un procedimiento ideal de gestión de aguas de lastre, y se están haciendo esfuerzos considerables para desarrollar procedimientos de tratamiento. Estos procedimientos deberán ajustarse a la norma D-2 del Convenio de la OMI sobre gestión de aguas de lastre. La norma D2 especifica que las aguas de lastre tratadas y vertidas deben tener:
• menos de diez organismos viables mayores o iguales a 50 micrómetros en dimensión mínima por metro cúbico
• menos de diez organismos viables de menos de 50 micrómetros de dimensión mínima y mayor o igual a 10 micrómetros de dimensión mínima por mililitro.
Además, la norma D2 especifica que la descarga de los microbios indicadores no debe exceder las concentraciones especificadas de la siguiente manera:
• Vibrio cholerae tóxico (O1 y O139) con menos de una unidad formadora de colonias (ufc) por 100 mililitros o menos de 1 ufc por 1 gramo (peso húmedo) de muestras de zooplancton
• Escherichia coli inferior a 250 ufc por 100 mililitros
• Enterococos intestinales inferiores a 100 ufc por 100 mililitros.
Estos son los microbios indicadores, como estándar de salud humana, pero no se limitan a estos tipos. Efectivamente, se ha sugerido que, de hecho, en algunos casos, el tratamiento de aguas de lastres utilizado puede empeorar las cosas. Al eliminar pequeños organismos que comen bacterias, algunos sistemas de tratamiento han convertido los tanques de lastre en incubadoras de bacterias, de modo que las descargas tratadas contenían consistentemente concentraciones más altas de bacterias, en algunos ensayos, miles de veces más altas, que las descargas que no se trataron. El aumento de bacterias puede incluir patógenos humanos.
En un ejemplo de la descripción (por ejemplo, según el Aspecto 70 o un Aspecto dependiente del Aspecto 70), por lo tanto, el sistema es un buque o embarcación o vehículo marino (por ejemplo, un buque o embarcación, por ejemplo, un petrolero en un puerto, muelle o en el mar). En un ejemplo, el fluido que comprende las primeras células hospedadoras es agua de lastre de un buque o embarcación, un vehículo marino (por ejemplo, agua de lastre de un buque o embarcación, por ejemplo, agua de lastre de un petrolero). En un ejemplo, el sistema es un contenedor marítimo o una plataforma o plataforma (por ejemplo, una plataforma de petróleo o gas), por ejemplo, en el mar. En un ejemplo, el fluido es agua de lastre de dicho recipiente, plataforma o equipo.
En una realización, las bacterias perjudiciales (primeras células hospedadoras según la invención, por ejemplo, según el Aspecto 70 o un Aspecto dependiente del Aspecto 70) son de una especie seleccionada del grupo que consiste en Vibrio cholerae; Vibrio rumoiensis; Vibrio sp.; E coli; Enterococcus sp.; Pseudomonas synxantha; Pseudomonas stutzeri; Vibrio lentus; Pseudoalteromonas marina
Pseudoalteromonas tetraodonis; Pseudoalteromonas sp.; Pseudomonas putida; Pseudomonas oleovorans; Vibrio splendidus; Vibrio cyclitrophicus; Enterococcus hirae; Enterococcus faecium Vibrio rotiferianus; Pseudoalteromonas undina; Serratia plymuthica; Pseudomonas fulva; Pseudomonas tolaasii; Pseudomonas stutzeri; Pseudomonas stutzeri; Vibrio tubiashii; Halomonas venusta; Idiomarina loihiensis; Vibrio cyclitrophicus; Vibrio tubiashii; Serratia plymuthica; Pseudoalteromonas sp.; Pseudoalteromonas atlantica; Pseudomonas synxantha; Pseudomonas stutzeri; Pseudoalteromonas carrageenovora; Tenacibaculum sp.; Bacillus mycoides; Vibrio natriegens; Bacillus baekryungensis; Enterococcus hirae; Lactobacillus pentosus; Pseudoalteromonas carrageenovora; y Pseudomonas aeruginosa.
En un ejemplo, las primeras células hospedadoras son bacterias heterótrofes aeróbicas. En un ejemplo, las primeras células hospedadoras son células de Vibrio cholerae (por ejemplo, la cepa O1 y/o O139). En un ejemplo, las primeras células hospedadoras son células E coli. En un ejemplo, las primeras células hospedadoras son células Enterococcus sp.
«Characterization of Bacteria in Ballast Water Using MALDI-TOF Mass Spectrometry», Kaveh E y col., PLoS One.
2012; 7(6): e38515; Publicado en línea el 7 de junio de 2012. doi: 10.1371 - journal.pone.0038515 (se incorpora en la presente memoria por referencia) describe un procedimiento rápido y rentable adecuado para monitorear bacterias en aguas de lastre.
Un ejemplo específico de la invención es el siguiente:
Un procedimiento para controlar la bioincrustación bacteriana en aguas de lastre de un barco o embarcación, en el que el agua comprende una población de primeras células hospedadoras de una primera especie microbiana (tal como cólera, E coli o Enterococci sp) que media dicha bioincrustación, y el procedimiento comprende
(i) poner en contacto la población con una pluralidad de vectores que son capaces de transformar o transducir las células, en el que cada vector comprende una matriz de CRISPR mediante el cual se introducen matrices de CRISPR en las células hospedadoras, en el que
(a) cada matriz de CRISPR comprende una o más secuencias para la expresión de un ARNcr y un promotor para la transcripción de la o las secuencias en una célula hospedadora; y
(b) cada ARNcr es capaz de hibridarse con una secuencia diana de una célula hospedadora para guiar Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana (por ejemplo, para cortar la secuencia diana); la secuencia diana es una secuencia génica para mediar la viabilidad de la célula hospedadora; y (ii) permitir la expresión de dichos ARNc en presencia de Cas en células hospedadoras, modificando así las secuencias diana en células hospedadoras, lo que da como resultado la reducción de la viabilidad de la célula hospedadora y el control de dicha bioincrustación.
En un ejemplo, la etapa (i) comprende mezclar el agua de lastre con los vectores, por ejemplo, en el casco de un barco o embarcación.
En un ejemplo, el barco o embarcación es un vehículo marino y el agua es agua de mar. En lugar de un barco o embarcación, en una alternativa, el agua de lastre está comprendida por un contenedor o una plataforma de perforación en el mar, por ejemplo, una plataforma petrolífera o plataforma petrolífera.
La descripción también comprende un procedimiento para descargar agua de lastre de un buque o embarcación, en el que el agua de lastre descargada comprende agua tratada por el procedimiento del ejemplo específico anterior. En un ejemplo, el agua se descarga en un cuerpo de agua, por ejemplo, un mar, océano o vía fluvial (por ejemplo, un río, canal, lago o embalse).
La descripción también comprende aguas de lastre de embarcación o barco y comprende matrices de CRISPR, en el que el agua de lastre se obtiene u puede obtenerse mediante el ejemplo específico anterior. La descripción también comprende un agua de lastre de contenedor marítimo que comprende matrices de CRISPR, en la que el agua de lastre se obtiene u puede obtenerse mediante el ejemplo específico anterior. La descripción también comprende agua de lastre de una plataforma o equipo de perforación (por ejemplo, equipo de perforación de petróleo o gas) en el mar, y el agua comprende matrices de CRISPR, en la que el agua de lastre se obtiene u puede obtenerse mediante el ejemplo específico anterior. Las matrices son como se indica en (a) y (b) del ejemplo específico.
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La invención también proporciona vectores y matrices de CRISPR de la siguiente manera.
Un octogésimo quinto aspecto se refiere vector que comprende una matriz de CRISPR para su introducción en una célula hospedadora bacteriana, en el que la bacteria tiene capacidad de transmisión por agua, en el que
(a) la matriz de CRISPR comprende una secuencia para la expresión de un ARNcr y un promotor para la transcripción de la secuencia en una célula hospedadora;
(b) el ARNcr es capaz de hibridarse con una secuencia diana de célula hospedadora para guiar una Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas) en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana (por ejemplo, para cortar la secuencia diana); la secuencia diana es una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, un gen o secuencia reguladora) para mediar la viabilidad de la célula hospedadora;
(c) en el que la secuencia de (a) comprende una secuencia R1-S1-R1' para la expresión y producción del ARNcr, en la que R1 es una primera repetición de CRISPR, R1' es una segunda repetición de CRISPR, y R1 o R1' es opcional; y S1 es un primer espaciador de CRISPR que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es en un 80 % o más idéntica (por ejemplo, en un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica) a la secuencia diana de célula hospedadora. Por «transmisión por agua» se entiende que las células de dicha bacteria pueden propagarse en agua o un líquido acuoso entre diferentes organismos, dentro de un organismo, entre diferentes entornos o entre un organismo y un entorno. Ejemplos son Vibro cólera, Enterococcus spp y E coli. Vibrio cholerae es una bacteria gramnegativa en forma de coma con un flagelo polar. Pertenece a la clase de las gammaproteobacterias. Existen dos biotipos principales de V. cholerae, clásico y El Tor, y numerosos serogrupos. V. cholerae es el agente etiológico del cólera, una infección bacteriana grave del intestino delgado y una de las principales causas de muerte en los países en desarrollo. Los genes de patogenicidad de V. cholerae son dianas interesantes para detectar y estudiar infecciones por V. cholerae. La mayoría de estos genes se localizan en dos islas de patogenicidad, llamadas TCP (Toxin-Coregulated Pilus) y CTX (Cholera ToXins), organizadas como profagos 1,2. TCP contiene un grupo de genes involucrados en la adhesión del hospedador a través de pili, mientras que los genes CTX están involucrados en la síntesis de la toxina del cólera3.
En una realización, el vector es un vector aislado (es decir, un vector que no se encuentra en dicha célula hospedadora). En un ejemplo, el vector es un vector modificado genéticamente o sintético (es decir, un vector de origen no natural).
En un ejemplo, la matriz es una matriz ICP1, es decir, una matriz de un fago ICP1 de V cholerae, por ejemplo, en el que el fago es ICP1_2003_A, ICP1_2004_A, ICP1_2005_A, ICP1_2006_E o ICP1_20011_A. En un ejemplo, la matriz es una matriz de fagos CR1 o CR2 ICP1, por ejemplo, un derivado modificado genéticamente o de origen no natural de dicha matriz. En un ejemplo, la matriz de CRISPR y Cas son de tipo 1-E o tipo 1 -F, por ejemplo, sistemas de subtipo 17.
En un ejemplo, la matriz de CRISPR comprende una pluralidad de secuencias, cada una para la expresión de un ARNcr respectivo y una asociada con un promotor para la transcripción de la secuencia en una célula hospedadora.
En un ejemplo, el vector o cada vector comprende una pluralidad (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) de dichas matrices de CRISPR.
En un ejemplo, el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicha Cas.
En otro ejemplo, el vector está desprovisto de dicha secuencia. Por ejemplo, en este caso, la matriz o matrices son operativas con una o más Cas producidas por la célula hospedadora.
Un octogésimo sexto aspecto se refiere al vector del aspecto octogésimo quinto, en el que la célula es una célula de Vibrio cholerae, Enterococcus o E coli.
Un octogésimo séptimo aspecto se refiere al vector de los aspectos octogésimo quinto u octogésimo sexto, en el que el vector está desprovisto de una secuencia de nucleótidos que es capaz de expresar dicha Cas.
En un ejemplo, por lo tanto, el vector no codifica una nucleasa Cas. En una alternancia, el vector codifica dicha Cas.
Un octogésimo octavo aspecto se refiere al vector de los aspectos octogésimo quinto, octogésimo sexto u octogésimo séptimo, en el que la secuencia diana es una secuencia protoespaciadora de 17-45 nucleótidos contiguos, por ejemplo, de 18, 19, 20 o 21 nucleótidos contiguos.
En un ejemplo, cada espaciador (S1) es una secuencia de nucleótidos de 17-45 nucleótidos contiguos, por ejemplo, 18, 19, 20, 21, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos contiguos. La secuencia protoespaciadora para el PLE de V cholerae es de, por ejemplo, 32 nucleótidos contiguos y un vector dirigido a esta puede, por ejemplo, tener una secuencia espaciadora de 32 nucleótidos contiguos que es al 100 % o al menos en un 80, 90 o 95 % idéntica a la secuencia de PLE de 32 nucleótidos. Cuando el vector comprende una pluralidad de espaciadores, los espaciadores pueden ser una mezcla de espaciadores diferentes, o pueden ser espaciadores idénticos. Por ejemplo, la matriz comprende una pluralidad de espaciadores, en la que un subconjunto de espaciadores son idénticos. Los espaciadores idénticos pueden ser homólogos a la secuencia protoespaciadora de un gen que codifica un factor de patogenicidad de la célula hospedadora, por ejemplo. El uso de múltiples espaciadores puede ser ventajoso si el hospedador corta uno o más de los espaciadores una vez que el vector está dentro de la célula; los espaciadores sin cortar todavía pueden formar ARNcr y albergar secuencias diana. El uso de una mezcla de diferentes espaciadores en el vector o en una matriz es ventajoso para minimizar el riesgo de adaptación del hospedador al vector invasor, minimizando así la resistencia.
Un octogésimo noveno aspecto se refiere al vector de cualquiera de los aspectos octogésimo quinto a octogésimo octavo, en el que la secuencia diana es una secuencia génica esencial, de virulencia o resistencia. En un ejemplo, la secuencia diana es una secuencia de un elemento similar a PICI (PLE), por ejemplo, un PLE V. cholerae. Por ejemplo, PLE1.
Un nonagésimo aspecto se refiere al vector de cualquiera de los aspectos octogésimo quinto a octogésimo noveno, en el que la secuencia diana es una secuencia de isla de patogenicidad, opcionalmente en el que la célula hospedadora es una célula de Vibrio cholera y la secuencia diana es una secuencia TCP, CTX o VPI. En un ejemplo (por ejemplo, en el que el hospedador es Vibrio) la isla de patogenicidad es TCP (pilus regulado por toxinas) o CTX (toxinas del cólera). La isla de patogenicidad de Vibrio (VPI) contiene genes que participan principalmente en la producción de pilus corregulado por toxinas (TCP). Es un elemento genético grande (cerca de 40 kb) flanqueado por dos regiones repetitivas (sitios fuera-como), que se asemeja a un genoma de fago en estructura. El VPI contiene dos grupos de genes, el grupo TCP y el grupo ACF, junto con varios otros genes. El grupo acf está compuesto por cuatro genes: acfABCD. El grupo tcpestá compuesto por 15 genes: tcpABCDEFHIJPQRSTy el gen regulador toxT.
Un nonagésimo primer aspecto se refiere al vector de cualquiera de los aspectos octogésimo quinto a nonogésimo, en el que la célula hospedadora es Vibrio cólera y la secuencia diana es una secuencia del gen CTX^. Los genes para la toxina del cólera son transportados por CTXphi (CTX^), un bacteriófago templado insertado en el genoma de V. cholerae. CTX^ puede transmitir genes de toxina del cólera de una cepa de V. cholerae a otra, una forma de transferencia horizontal de genes. Los genes para pilus corregulados por toxinas están codificados por la isla de patogenicidad VPI (VPI).
Un nonagésimo segundo aspecto de se refiere al vector de cualquiera de los aspectos octagésimo a nonagésimo, en el que la célula hospedadora es Vibrio cólera y la secuencia diana es una secuencia ctxB, tcpA, ctxA, tcpB, wbet, hlyA, hapR, rstR, mshA o tcpP.
Un nonagésimo tercer aspecto se refiere al vector de cualquiera de los aspectos octogésimo quinto a nonagésimo segundo, en el que la secuencia diana es de 17-45 nucleótidos contiguos (por ejemplo, de 18,19, 20 o 21 nucleótidos contiguos) y al menos en un 80 % (por ejemplo, en un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica) a una secuencia de una isla cromosómica inducible por fagos (PICI) de una bacteria grampositiva, por ejemplo, una isla de patogenicidad de Staphylococcus aureus (SaPI). A continuación se proporcionan ejemplos de secuencias espaciadoras de fagos ICP1 (también conocidas como fagos relacionados con ICP1). Estas secuencias espaciadoras son homólogas a las secuencias diana (secuencias protoespaciadoras) en V cholera.
Un nonagésimo cuarto aspecto se refiere al vector de cualquiera de los aspectos octogésimo quinto a nonagésimo tercero, en el que la célula hospedadora es Vibrio cholera y el ARNcr es capaz de hibridarse con una secuencia diana dentro de 5, 4 o 3 nucleótidos de un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) en una célula Vibrio cholerae, en el que el PAM es GA.
Un nonagésimo quinto aspecto se refiere al vector de cualquiera de los aspectos octogésimo quinto a nonagésimo cuarto, en el que la célula hospedadora es Vibrio cholera y la célula es una célula El Tor, O1 o O139 de Vibrio cholerae.
En un ejemplo, V. cholerae es el serotipo O1 El Tor N16961; El Tor biotipo18; o la cepa El Tor MJ-1236. En un ejemplo, la célula hospedadora es una célula de E. coli O157:H7.
Un nonagésimo sexto aspecto se refiere al vector de cualquiera de los aspectos octogésimo quinto a nonagésimo quinto, en el que el vector es un bacteriófago que es capaz de infectar una célula hospedadora. En un ejemplo, la célula hospedadora es E coli, y el fago es un fago lambda o T4. En un ejemplo, la célula hospedadora es una célula Enterococcus y el fago es un fago Enterococcus IME-EF1, phiEF24C, ^Ef1 o EFDG1 (ver Appl Environ Microbiol. 2015 Abr;81(8):2696-705. doi: 10,1128/AEM.00096-15. Epub 2015 Feb 6, «Targeting Enterococcus faecalis biofilms with phage therapy», Khalifa L y col.).
Un nonagésimo séptimo aspecto se refiere al vector del aspecto nonagésimo sexto, en el que la célula hospedadora es Vibrio cólera y el vector es un bacteriófago capaz de infectar una célula de Vibrio cholerae.
Un nonagésimo octavo aspecto se refiere al vector del aspecto nonagésimo séptimo, en el que el bacteriófago se selecciona de entre CTX^, un fago ICPI y un miovirus, por ejemplo, en el que el fago es ICP1_2003_A, ICP1_2004_A, ICP1_2005_A, ICP1_2006_E o ICP1_20011_A, opcionalmente un fago modificado genéticamente y de origen no natural.
Un nonagésimo noveno aspecto se refiere al vector de cualquiera de los aspectos octogésimo quinto a nonagésimo octavo, en el que el vector es o comprende un ICE, por ejemplo, un transposón. El ICE puede comprender cualquiera de las características de un ICE descrito en esta invención.
Un centésimo aspecto se refiere al vector del aspecto nonagésimo noveno, en el que el transposón es un transposón conjugado con capacidad de transferencia de una primera a una segunda célula hospedadora.
Un centésimo primer aspecto se refiere al vector del aspecto nonagésimo noveno o centésimo, en el que el transposón deja una copia de la matriz de CRISPR en la primera célula.
Un centésimo segundo aspecto se refiere al vector de cualquiera de los aspectos octogésimo quinto a centésimo primero, en el que la matriz o cada una de las matrices está(n) comprendida(s) por un elemento genético móvil (MGE) respectivo, en el que el MGE comprende un origen de transferencia (oriT) operativo en la célula hospedadora. El MGE puede ser según cualquier MGE descrito en esta invención.
Un centésimo tercer aspecto se refiere al vector de cualquiera de los aspectos de octogésimo quinto a centésimo segunda, en el que el vector es un vector modificado genéticamente.
Un centésimo cuarto aspecto se refiere a una composición de tratamiento de agua o alimentos que comprende una pluralidad de vectores según cualquiera de los aspectos octogésimo quinto a centésimo tercero.
En un ejemplo, el agua es agua de lastre, agua de mar, agua salobre, agua dulce, agua potable, agua de vía navegable (por ejemplo, agua de estuario) o agua industrial. En un ejemplo, el agua es agua en fluido del sistema Gl humano.
En un ejemplo, la célula hospedadora está comprendida por mariscos, pescado, arroz o granos. En un ejemplo, la composición es para tratar alimentos y la célula hospedadora es una célula de E. coli O157:H7. En un ejemplo, la secuencia diana es una secuencia que codifica una toxina Shiga en una célula hospedadora de E coli (por ejemplo, O157:H7). Como alternativa a las especies transmitidas por el agua descritas hasta ahora, la célula hospedadora es una célula de Salmonella o Listeria.
Un aspecto centésimo quinto se refiere a un medicamento para el tratamiento o la prevención de la infección por Vibrio cholerae en un ser humano, el medicamento comprende una pluralidad de vectores según cualquiera de los aspectos octogésimo quinto y centésimo tercero. En una alternativa, la invención proporciona un medicamento para el tratamiento o prevención de la infección por E coli en un ser humano, el medicamento comprende una pluralidad de vectores de la invención. En una alternativa, la invención proporciona un medicamento para el tratamiento o prevención de la infección por Enterococcus en un ser humano, el medicamento comprende una pluralidad de vectores de la invención.
Un aspecto centésimo sexto se refiere a la composición o medicamento del aspecto centésimo cuarto o centésimo quinto, que comprende además un antibiótico de célula antihospedador o un biocida de célula antihospedador.
El Ejemplo 5 a continuación es un ejemplo relacionado con el cólera.
Cualquiera de las características generales (véase más adelante) también puede aplicarse a la presente configuración (sexta configuración). Cualquier configuración a continuación es combinable con la presente configuración, por ejemplo, para proporcionar combinaciones de características para su inclusión en una o más reivindicaciones de esta invención.
REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE CAS
Estos aspectos de la invención son útiles para regular la actividad de Cas, por ejemplo, en una célula o in vitro. La invención implica dirigirse a un gen que codifica Cas para restringir la actividad de Cas, lo cual es ventajoso para la regulación temporal de Cas. La invención también puede ser útil en entornos donde es deseable un aumento de la rigurosidad de la actividad de Cas, por ejemplo, para reducir las posibilidades de que Cas se corte fuera de la diana cuando se modifica el genoma de una célula. Las aplicaciones son, por ejemplo, en la modificación de células humanas, animales o vegetales donde los efectos fuera de la diana deben minimizarse o evitarse, por ejemplo, para la terapia génica o el direccionamiento génico de la célula o un tejido o un organismo que comprende la célula. Por ejemplo, se requiere una rigurosidad muy alta cuando se utiliza la modificación de Cas para realizar los cambios deseados en una célula humana (por ejemplo, célula iPS) que se va a administrar a un paciente para la terapia génica o para tratar o prevenir una enfermedad o afección en el ser humano. La descripción proporciona estas aplicaciones como parte de los procedimientos y productos de la invención.
En esta invención se describen las siguientes cláusulas:
en una primera cláusula, se proporciona un procedimiento para modificar un gen expresable que codifica un primer Cas, donde el procedimiento comprende
(a) combinar un ARN guía (ARN1g) con el gen Cas en presencia del primer Cas que se expresa a partir de dicho gen; y
(b) permitir que ARN1g se hibride con una secuencia de dicho gen Cas (por ejemplo, un promotor o una primera secuencia de ADN que codifica cas del mismo) y para guiar la primera Cas al gen, mediante lo cual la Cas modifica el gen Cas.
En un ejemplo, el procedimiento es un procedimiento libre de células (por ejemplo, procedimiento de recombinación) in vitro. En otro ejemplo, el procedimiento se lleva a cabo en una célula, por ejemplo, en el que el gen es cortado por Cas que se codifica a sí mismo (es decir, Cas endógeno se utiliza para cortar el gen).
Una segunda cláusula se refiere al procedimiento de la primera cláusula, en el que la Cas es una nucleasa y se corta el gen Cas.
Una tercera cláusula se refiere al procedimiento de la primera y segunda cláusula, en el que el gen Cas está mutado, regulado descendentemente o desactivado.
Una cuarta cláusula se refiere al procedimiento de una cualquiera de las cláusulas primera a tercera, en el que el primer Cas es un Cas9.
Una quinta cláusula se refiere al procedimiento de una cualquiera de las cláusulas primera a cuarta, en el que ARN1g es un ARN guía único.
Una sexta cláusula se refiere al procedimiento de cualquiera de las cláusulas primera a quinta, en el que el procedimiento se realiza en una célula hospedadora.
Una séptima cláusula se refiere al procedimiento de la sexta cláusula, en el que la célula es una célula procariota, por ejemplo, una célula bacteriana o arqueal (por ejemplo, una célula E coli).
Una octava cláusula se refiere al procedimiento de la sexta cláusula, en el que el procedimiento es un procedimiento de recombinación.
Una novena cláusula se refiere al procedimiento de la sexta, séptima u octava cláusula, en el que la célula es de una especie o cepa patógena para el ser humano o animal no humano (por ejemplo, S aureus).
Una décima cláusula se refiere al procedimiento de una cualquiera de las cláusulas sexta a novena, en el que la célula es una célula de una especie del microbioma humano, por ejemplo, una especie del microbioma intestinal humano.
Una décima primera cláusula se refiere al procedimiento de una cualquiera de las cláusulas sexta a décima, en el que el gen Cas está comprendido por un sistema CRISPR/Cas hospedador.
Opcionalmente, una primera secuencia de codificación de Cas exógena no se utiliza en el procedimiento, por ejemplo, cuando la célula hospedadora comprende una nucleasa Cas endógena de tipo salvaje que es cognada con ARN1g.
Una décima segunda cláusula se refiere al procedimiento de la sexta cláusula, en el que la célula es una célula eucariota (por ejemplo, una célula humana, de un animal no humano, levadura o vegetal).
Una décima tercera cláusula se refiere al procedimiento de la décima segunda cláusula, en el que el procedimiento se lleva a cabo en un embrión no humano; cigoto no humano; célula germinal no humana; o un ser humano o animal (por ejemplo, en el que el procedimiento es un procedimiento cosmético); opcionalmente en el que el procedimiento no es un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia o diagnóstico.
Una décima cuarta cláusula se refiere al procedimiento de cualquiera de las cláusulas sexta a tercera, en el que el gen Cas está comprendido por un ácido nucleico que se introduce en la célula en la etapa (a).
Una décima quinta cláusula se refiere al procedimiento de cualquiera de las cláusulas sexta a cuarta para reducir el desarrollo de resistencia de la célula hospedadora a la transformación por un vector de ácido nucleico o mantenimiento de un vector de ácido nucleico en la célula hospedadora.
Una décima sexta cláusula se refiere al procedimiento de cualquiera de las cláusulas primera a décima quinta, o un ácido nucleico o producto celular del mismo para la terapia médica, profilaxis o diagnóstico humano o animal (por ejemplo, para la terapia génica de una célula humana o animal, humana o animal cuando el procedimiento se realiza en una célula humana o animal; o para tratar o prevenir una infección bacteriana en un ser humano o animal cuando el procedimiento se realiza en una célula bacteriana).
Una décima séptima cláusula se refiere al procedimiento de cualquiera de las cláusulas primera a sexta, en el que el procedimiento se realiza in vitro.
Una décima octava cláusula se refiere al procedimiento de cualquiera de las cláusulas primera a décima sexta, en el que el procedimiento se realiza in vivo, opcionalmente no en un embrión humano y opcionalmente en el que el procedimiento no es un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía, terapia o diagnóstico.
Una décima novena cláusula se refiere al procedimiento de cualquiera de las cláusulas primera a décima octava, en el que el ARN1g se produce mediante transcripción a partir de un primer ácido nucleico que se combina con el gen Cas en la etapa (a).
Una vigésima cláusula se refiere al procedimiento de la cláusula décima novena, en el que el procedimiento se lleva a cabo en una célula y el primer ácido nucleico que codifica ARN1g se introduce en la célula en la etapa (a); o un primer ácido nucleico que codifica un ARNcr se introduce en la célula en la etapa (a) en el que el ARNcr forma ARN1g con un ARNtracr en la célula.
Una vigésima primera cláusula se refiere al procedimiento de la cláusula décima novena o vigésima, en el que el gen Cas se combina con un ácido nucleico diana que comprende un sitio diana (CS-t) que se modificará mediante el primer Cas, y en el que
I. el gen Cas comprende un primer protoespaciador (PS1) adyacente a un PAM (P1) que está relacionado con el primer Cas, en el que la PS1 se modifica (por ejemplo, se corta) en un primer sitio (CS1) mediante el primer Cas;
II. el ARN1g comprende una secuencia que es complementaria a PS1 para guiar el primer Cas en el que PS1 se modifica en CS1 en la etapa (b);
III. el ácido nucleico diana comprende una secuencia protoespaciadora (PS-t) adyacente a una PAM (P-t), en la que P-t es cognada con el primer Cas;
IV. antes o durante la etapa (b) el procedimiento comprende combinar un ARN guía (ARNg-t) con el ácido nucleico diana y el primer Cas expresado a partir de dicho gen, en el que el ARNg-t se hibrida con PS-t y guía el primer Cas para modificar CS-t; y
V. el procedimiento comprende opcionalmente aislar o secuenciar el ácido nucleico diana modificado.
Una vigésima segunda cláusula se refiere al procedimiento de la cláusula vigésima primera, en el que el ARNg-t se produce mediante transcripción a partir de un ácido nucleico (por ejemplo, dicho primer ácido nucleico) que se combina con la Cas en la etapa IV.
Una vigésima tercera cláusula se refiere al procedimiento de la cláusula vigésima segunda, en el que el procedimiento se lleva a cabo en una célula y el ácido nucleico codifica un ARNcr, en el que el ARNcr forma ARNg-t con un ARNtracr en la célula.
Una vigésima cuarta cláusula se refiere al procedimiento de cualquiera de las cláusulas vigésima primera a vigésima tercera, en el que la producción de ARN1g se inicia después de la producción de ARNg-t, en el que PS-t se modifica (por ejemplo, corta) en copias del ácido nucleico diana antes de que se modifique (por ejemplo, corta) la PS1 para regular por disminución o desactivar la primera expresión de Cas.
Una vigésima quinta cláusula se refiere al procedimiento de cualquiera de las cláusulas primera a vigésima cuarta, que comprende además combinar el ácido nucleico diana cortado con un ácido nucleico adicional, mediante lo cual tiene lugar la recombinación homóloga entre los ácidos nucleicos y
(i) se elimina una secuencia de nucleótidos del ácido nucleico diana;
(ii) se elimina una secuencia de nucleótidos del ácido nucleico adicional;
(iii) se inserta una secuencia de nucleótidos del ácido nucleico diana en el ácido nucleico adicional; y/o
(iv) se inserta una secuencia de nucleótidos del ácido nucleico adicional en el ácido nucleico diana.
Una vigésima sexta cláusula se refiere al procedimiento de la cláusula vigésima quinta, en el que (i) tiene lugar, desactivando de este modo una secuencia de nucleótidos o elemento regulador del ácido nucleico diana.
Una vigésima séptima cláusula se refiere al procedimiento de la vigésima quinta cláusula, en el que (i) tiene lugar, activando de este modo una secuencia de nucleótidos o elemento regulador del ácido nucleico diana.
Una vigésima octava cláusula se refiere al procedimiento de la cláusula vigésima quinta, vigésima sexta o vigésima séptima, en el que (ii) tiene lugar, desactivando de este modo una secuencia de nucleótidos o elemento regulador del ácido nucleico adicional.
Una vigésima novena cláusula se refiere al procedimiento de la cláusula vigésima quinta, vigésima sexta o vigésima séptima, en el que (ii) tiene lugar, activando de este modo una secuencia de nucleótidos o elemento regulador del ácido nucleico adicional.
Una trigésima cláusula se refiere al procedimiento de cualquiera de las cláusulas vigésima quinta a vigésima novena, en el que (iii) tiene lugar, al colocar opcionalmente la secuencia insertada en relación funcional con un elemento regulador del ácido nucleico adicional y/o al crear una nueva secuencia marcadora.
Una trigésima primera cláusula se refiere al procedimiento de cualquiera de las cláusulas vigésima quinta a trigésima, en el que (iv) tiene lugar, colocando opcionalmente la secuencia insertada en relación funcional con un elemento regulador del ácido nucleico diana y/o creando una nueva secuencia marcadora.
Una trigésima segunda cláusula se refiere al procedimiento de la cláusula trigésima o trigésima primera, que comprende además detectar la nueva secuencia marcadora o un producto de expresión de esta para determinar que se ha producido la recombinación homóloga.
Una trigésima segunda cláusula se refiere al procedimiento de cualquiera de las cláusulas vigésima primera a trigésima segunda, que comprende además aislar o secuenciar el producto de ácido nucleico diana, el producto de ácido nucleico adicional y/o el primer producto de vector.
Una trigésima cuarta cláusula se refiere al procedimiento de cualquiera de las cláusulas primera a trigésima tercera, en el que el primer vector es como se define en cualquiera de las cláusulas trigésima quinta a quincuagésima quinta. Una trigésima quinta cláusula se refiere a un primer vector de ácido nucleico (por ejemplo, aislado) o combinación de vectores, por ejemplo, para su uso en el procedimiento de la primera cláusula, en el que
(a) el primer vector o un vector de dicha combinación comprende una secuencia de nucleótidos expresable que codifica un ARN guía (ARN1g, por ejemplo, un único ARNg) que es complementario a una secuencia protoespaciadora predeterminada (PS1 para guiar un primer Cas para modificar PS1 en un primer sitio (CS1), en el que PS1 es un PAM (P1) adyacente que es cognado con el primer Cas; o la secuencia expresable codifica un ARNcr que forma ARN1g con un ARNtracr; y
(b) PS1 y P1 son secuencias de un primer gen que codifica Cas expresable y PS1 es capaz de ser modificado en CS1 por el primer Cas.
Cada vector en la presente en cualquier configuración puede ser un ADN lineal o circular (por ejemplo, circular cerrado, opcionalmente superenrollado) que transporta la secuencia o secuencias especificadas.
Una trigésima sexta cláusula se refiere al vector o combinación de la cláusula trigésima quinta, en el que la primera Cas es una nucleasa, en el que CS1 es capaz de ser cortado por la nucleasa.
Una trigésima séptima cláusula se refiere al vector o combinación de la cláusula trigésima quinta o trigésima sexta, en el que la primera Cas es una Cas9.
Una trigésima novena cláusula se refiere al vector o combinación de cualquiera de las cláusulas trigésima quinta a trigésima séptima, en el que ARN1g es un ARN guía único.
Una trigésima novena cláusula se refiere al vector o combinación de cualquiera de las cláusulas trigésimo quinta a trigésimo octava, en el que la secuencia de nucleótidos es expresable en una célula procariota (por ejemplo, una célula bacteriana o arqueal) para producir ARN1g.
Una cuadragésima cláusula se refiere a un kit de recombinación que comprende el vector o combinación de la cláusula 39 (por ejemplo, en el que la célula es una célula E coli que permite la recombinación).
Una cuadragésima primera cláusula se refiere al vector o combinación de cualquiera de las cláusulas trigésima quinta a trigésima octava, en el que la secuencia de nucleótidos es expresable en una célula eucariota (por ejemplo, una célula humana, animal, vegetal o de levadura) para producir ARN1g.
Una cuadragésima segunda cláusula se refiere al vector o combinación de cualquiera de las cláusulas trigésima quinta a cuadragésima primera, en el que el primer vector o un vector de dicha combinación (por ejemplo, el segundo vector) comprende una secuencia de nucleótidos expresable que codifica un ARN guía (ARNg-t, por ejemplo, un único ARNg) que es complementario a una secuencia protoespaciadora predeterminada (PS-t) de un ácido nucleico diana para guiar a la primera Cas a modificar (por ejemplo, cortar) PS-t; o la secuencia expresable codifica un ARNcr que forma ARNg-t con un ARNtracr; el ácido nucleico diana comprende PS-t adyacente a PAM (P-t), en el que P-t es cognado con el primer Cas para modificar PS-t.
Una cuadragésima tercera cláusula se refiere al vector o combinación de la cláusula cuadragésima segunda, además en combinación con dicho ácido nucleico diana.
Una cuadragésima cuarta cláusula se refiere al vector o combinación de la cláusula cuadragésima tercera, en el que dicho ácido nucleico diana es un ácido nucleico cromosómico o episómico de una célula.
Una cuadragésima quinta cláusula se refiere al vector o combinación de la cláusula cuadragésima cuarta, en el que la célula es la célula de una especie o cepa patógena para el ser humano o animal no humano (por ejemplo, S aureus).
Una cuadragésima sexta cláusula se refiere al vector o combinación de la cláusula cuadragésima cuarta o cuadragésima quinta, en el que la célula es una célula de una especie del microbioma humano, por ejemplo, una especie del microbioma intestinal humano.
Una cuadragésima séptima cláusula se refiere al vector o combinación de cualquiera de las cláusulas cuadragésima cuarta a cuadragésima sexta, en el que PS-t está comprendido por un gen esencial, un gen de virulencia o una secuencia de genes de resistencia a antibióticos de la célula (por ejemplo, una célula procariota).
Una cuadragésima octava cláusula se refiere al vector o combinación de la cláusula cuadragésima séptima, en el que el gen se regula por disminución o se inactiva cuando la primera Cas modifica (por ejemplo, corta) PS-t.
Una cuadragésima novena cláusula se refiere al vector o combinación de la cláusula cuadragésima séptima, en el que el gen se regula por aumento o se activa cuando el primer Cas modifica PS-t.
Una quincuagésima cláusula se refiere al vector o combinación de cualquiera de las cláusulas trigésima quinta a cuadragésima novena en combinación con dicho gen que codifica la primera Cas (por ejemplo, comprendida por el primer vector).
Una quincuagésima primera cláusula se refiere al vector o combinación de cualquiera de las cláusulas trigésima quinta a quincuagésima cuando se encuentra dentro de una célula, en el que la célula comprende un sistema CRISPR/Cas que comprende dicho gen que codifica la primera Cas.
Una quincuagésima segunda cláusula se refiere al vector o combinación de cualquiera de las cláusulas trigésima quinta a una cláusula de quincuagésima primera para tratar, prevenir o diagnosticar una enfermedad o afección en un ser humano o animal no humano, por ejemplo, para la terapia génica de una célula humana o animal, humana o animal cuando el procedimiento se realiza en una célula humana o animal; o para tratar o prevenir una infección bacteriana en un ser humano o animal cuando el procedimiento se realiza en una célula bacteriana.
Una cláusula quincuagésima tercera se refiere a un producto alimenticio, ingrediente alimenticio o ingrediente precursor, bebida, agua (por ejemplo, destinada al consumo humano), una sustancia industrial o ambiental (por ejemplo, aceite, producto petrolífero, suelo o una vía fluvial o depósito; o equipo para recuperar o procesar aceite, producto petrolífero, suelo, agua, un producto alimenticio, ingrediente alimenticio o precursor, o una bebida o ingrediente de bebida del precursor) que comprende un primer vector o combinación según cualquiera de las cláusulas trigésima quinta a quincuagésima segunda.
Una cláusula quincuagésima quinta se refiere a una composición antibiótica (por ejemplo, antibacteriana o antiarqueal) un primer vector o combinación según cualquiera de las cláusulas trigésima quinta a quincuagésima quinta.
Una cláusula quincuagésima quinta se refiere a un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad o afección (por ejemplo, una infección bacteriana u obesidad) en un ser humano o animal, y el medicamento comprende un primer vector o combinación según cualquiera de las cláusulas trigésima quinta a quincuagésima segunda.
En un ejemplo, el vector, combinación, medicamento o antibiótico está comprendido por un dispositivo médico o recipiente médico (por ejemplo, una jeringa, inhalador o bolsa IV).
Cualquiera de las características generales (ver más abajo) también puede aplicarse a la presente configuración. Cualquier configuración a continuación es combinable con la presente configuración, por ejemplo, para proporcionar combinaciones de características para su inclusión en una o más reivindicaciones de esta invención.
CARACTERÍSTICAS DE APLICACIÓN GENERAL
Las siguientes características se aplican a cualquier configuración (por ejemplo, en cualquiera de sus aspectos, realizaciones, conceptos, párrafos o ejemplos) de la invención:
En un ejemplo, la secuencia diana es una secuencia cromosómica, una secuencia de células hospedadoras endógenas, una secuencia de células hospedadoras de tipo salvaje, una secuencia de células hospedadoras cromosómicas no virales, no una secuencia exógena y/o una secuencia no fágica (es decir, una o todas estas), p. ej., la secuencia es una secuencia de células cromosómicas hospedadoras de tipo salvaje, tal como un gen de resistencia a antibióticos o una secuencia génica esencial comprendida por un cromosoma de células hospedadoras. En un ejemplo, la secuencia es una secuencia de plásmido de célula hospedadora, por ejemplo, una secuencia génica de resistencia a antibióticos.
En un ejemplo, Cas modifica al menos dos secuencias diana, por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos y un gen esencial. El direccionamiento múltiple de esta manera puede ser útil para reducir la evolución de las células hospedadoras mutantes de escape.
En un ejemplo, la Cas es una nucleasa Cas de célula hospedadora endógena de tipo salvaje y/o cada célula hospedadora es una célula hospedadora de tipo salvaje. Por lo tanto, en una realización, la invención utiliza células hospedadoras sin la necesidad de reducir Cas endógeno primero para proporcionar actividad Cas relevante. En un ejemplo, cada célula hospedadora tiene actividad constitutiva de nucleasa Cas, por ejemplo, actividad constitutiva de nucleasa Cas de tipo salvaje. En un ejemplo, la célula hospedadora es una célula bacteriana; en otro ejemplo, la célula hospedadora es una célula arqueal. El uso de un Cas endógeno es ventajoso, ya que esto permite que el espacio se libere en vectores que codifican ARNc-HM o PM o ARNg. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos Cas9 tipo II es grande y el uso de Cas endógeno de la célula hospedadora en su lugar es ventajoso en ese caso cuando se utiliza un sistema CRISPR/Cas tipo II para la modificación de la célula hospedadora en la presente invención. La Cas9 más comúnmente empleada, que mide 4,2 kilobases (kb), proviene de S pyogenes. Si bien es una nucleasa eficiente, la longitud de la molécula empuja el límite de la cantidad de material genético que un vector puede acomodar, creando una barrera para el uso de CRISPR en los tejidos de animales vivos y otras configuraciones descritas en esta invención (ver F.A. Ran y col., «In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9,» Nature, doi:10.1038/nature14299, 2015). Por lo tanto, en una realización, el vector de la invención es un vector de AAV o tiene una capacidad de inserción de ADN exógeno no más que un vector de AAV, y la Cas es una Cas endógena de la célula hospedadora, en el que la célula es una célula bacteriana o arqueal.
La secuencia de nucleótidos Cas9 (UniProtKB - G3ECR1 (CAS9_STRTR)) de S thermophilus tiene un tamaño de 1,4 kb.
En una realización, por lo tanto, la invención proporciona un vector de ácido nucleico que comprende más de 1,4 kb o más de 4,2 kb de secuencia de ADN exógeno que codifica componentes de un sistema CRISPR/Cas, en el que la secuencia comprende una matriz modificada o secuencia modificada (opcionalmente como se describe en la presente memoria) para expresar uno o más ARNcr o ARNg-HM o PM en células hospedadoras (cualquier célula en esta invención, por ejemplo, células hospedadoras humanas, animales o bacterianas o arqueales), en el que la matriz o secuencia modificada no comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una nucleasa Cas que es cognada con los ARNc o ARNg; opcionalmente en el que al menos 2, 3 o 4 ARNc o ARNg están codificados por el ADN exógeno. En una realización, la célula hospedadora es una célula bacteriana o arqueal que expresa una nucleasa Cas que es cognada con los ARNcr o ARNg. En otro ejemplo, tal como para uso con células humanas o animales (por ejemplo, roedores, ratas o ratones), la nucleasa Cas está codificada por un vector de ácido nucleico diferente. En un ejemplo, en el que la célula es una célula humana o animal, el vector es un AAV o vector lentiviral. En un ejemplo, la invención comprende una célula hospedadora que comprende dicho vector, en el que la célula hospedadora expresa dicha Cas. En un ejemplo, la célula hospedadora es una célula humana o animal ex vivo.
La invención también proporciona un vector de ácido nucleico que comprende más de 1,4 kb o más de 4,2 kb de secuencia de ADN exógeno, en el que el ADN exógeno codifica uno o más componentes de un sistema CRISPR/Cas y comprende una matriz o secuencia modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en esta invención) para expresar uno o más ARNcr-HM o ARNg en células hospedadoras, en el que la secuencia exógena está desprovista de una secuencia de nucleótidos que codifica una nucleasa Cas que es cognada con los ARNc o ARNg; opcionalmente en el que al menos 2 ARNc o ARNg diferentes están codificados por el ADN exógeno. En un ejemplo, la invención comprende una célula hospedadora que comprende dicho vector, en el que la célula hospedadora expresa dicha Cas. En un ejemplo, los ARNc o ARNg son capaces de hibridarse en células hospedadoras con secuencias protoespaciadoras diana respectivas, en las que cada secuencia protoespaciadora está comprendida por una resistencia a antibióticos o un gen hospedador esencial. Esto se ejemplifica mediante los ejemplos de trabajado en esta invención donde se muestra inhibición selectiva del crecimiento de células hospedadoras de al menos 10 veces en una población de células mezcladas y no mezcladas. La mezcla simula una combinación de especies y cepas que se encuentran en la microbiota humana.
Por «secuencia de ADN exógeno que codifica componentes de un sistema CRISPR/Cas» se entiende el ADN que se inserta en una estructura principal de vector, o dicho ADN en una progenie de un vector en el que dicha inserción ha tenido lugar previamente (por ejemplo, utilizando tecnología de ADN recombinante, tal como recombinación). En un ejemplo, el ADN exógeno es de un 95, 90, 80, 85, 70 o 60 % de la capacidad de inserción del vector.
En un ejemplo, el vector es un vector viral. Los vectores virales tienen una capacidad particularmente limitada para la inserción de ADN exógeno, por lo que debe considerarse la capacidad de empaquetado de virus. Es necesario dejar espacio para las secuencias que codifican funciones virales vitales, tales como para expresar proteínas de recubrimiento y polimerasa. En un ejemplo, el vector es un vector de fagos o un AAV o vector lentiviral. Los vectores de fagos son útiles cuando el hospedador es una célula bacteriana.
La descripción proporciona un kit de producto de combinación (por ejemplo, para tratar o prevenir una enfermedad o afección en un sujeto humano o animal como se describe en la presente memoria), en el que el kit comprende una matriz, vector, sistema, célula, secuencia codificante de ARNc o ARNg modificada genéticamente o el ARNc o ARNg, que está en combinación con un antibiótico (primer antibiótico), en el que el ARNc o ARNg es capaz de hibridarse con una secuencia protoespaciadora comprendida por un gen de resistencia a antibióticos de célula hospedadora bacteriana en el que el antibiótico es dicho primer antibiótico. El antibiótico puede ser cualquier antibiótico descrito en esta invención. En una realización, el antibiótico se combina en una formulación con matriz, vector, sistema, célula, secuencia codificante de ARNc o ARNg modificada genéticamente o el ARNc o ARNg. En un ejemplo, el kit comprende el antibiótico en un recipiente separado de un recipiente que comprende la matriz, vector, sistema, célula, secuencia codificante de ARNc o ARNg modificada genéticamente o el ARNc o ARNg.
En una realización, a menos que se especifique lo contrario, cada célula es una célula bacteriana, célula arqueal, célula de algas, célula fúngica, célula protozoaria, célula de invertebrado, célula de vertebrado, célula de pez, célula de ave, célula de mamífero, célula de animal de compañía, célula de perro, célula de gato, célula de caballo, célula de ratón, célula de rata, célula de conejo, célula eucariota, célula procariota, célula humana, célula animal, célula de roedor, célula de insecto o célula de planta. Además, en este caso preferentemente las células son del mismo filo, orden, familia o género.
Mediante el uso del término «modificado genéticamente» será fácilmente evidente para el destinatario experto que la matriz, secuencia, vector, MGE o cualquier otra configuración, concepto, aspecto, realización, párrafo o ejemplo, etc. de la invención no es de origen natural. Por ejemplo, el MGE, vector o matriz comprende una o más secuencias o componentes que no se encuentran naturalmente junto con otras secuencias o componentes del MGE, vector o matriz. Por ejemplo, la matriz es recombinante, artificial, sintética o exógena (es decir, no endógena o no de tipo salvaje) a la o a cada célula hospedadora.
En un ejemplo, la matriz o vector de la invención se aísla, por ejemplo, se aísla de una célula hospedadora. En un ejemplo, la matriz o vector no está en combinación con una secuencia que codifica endonucleasa Cas que se encuentra naturalmente en una célula junto con secuencias repetidas de la matriz.
En un ejemplo, el vector, MGE o matriz no está en combinación con una secuencia de codificación de endonucleasa Cas cuando no está en una célula hospedadora. En un ejemplo, el vector o MGE no comprende una secuencia que codifica la endonucleasa Cas.
En un ejemplo, la modificación o corte diana se lleva a cabo mediante una nucleasa Cas de ADNcd (por ejemplo, una Cas9, por ejemplo, una spCas9 o saCas9), por lo que la reparación del corte se realiza mediante unión de extremos no homóloga (NHEJ). Esto típicamente introduce la mutación (indels) en el sitio de reparación, que es útil para la desactivación del sitio diana (por ejemplo, gen de fago o elemento regulador, tal como un gen esencial o elemento regulador del mismo). En otro ejemplo, el corte se lleva a cabo mediante una nucleasa Cas de ADNcs (por ejemplo, una nucleasa Cas9) que corta en una sola cadena (pero no hace cortes de ADN de doble cadena). Esto es útil para favorecer la reparación HDR del corte, lo que reduce las posibilidades de indels. Esto puede ser útil cuando se desea el sitio diana (o gen o elemento regulador que lo comprende), por ejemplo, cuando se inserta un ADN HM o PM en el sitio diana para la modificación deseada del sitio. Por ejemplo, en este caso el gen modificado produce una proteína de fusión que comprende un aminoácido codificado con ADN-HM fusionado a una secuencia codificada con ADN hospedador, o una secuencia de aminoácidos codificada con ADN-PM fusionada a una secuencia codificada con ADN de fago. La descripción también proporciona una secuencia que codifica una proteína de fusión obtenida u obtenible mediante dicho procedimiento. En otro ejemplo, el ADN HM o PM comprende un elemento regulador (por ejemplo, un promotor, potenciador, represor o interruptor inducible para regular la expresión génica), de modo que el producto de fusión comprende dicho ADN fusionado a un gen hospedador o de fago o ADN del elemento regulador, produciendo así un gen de fusión. La descripción también proporciona un gen de fusión obtenido u obtenible mediante dicho procedimiento. En una realización, la descripción proporciona un vector (por ejemplo, un virus, virión, fago, fagémido, profago o plásmido) que comprende dicho gen de fusión, opcionalmente en el que el vector está contenido en una célula bacteriana (por ejemplo, una célula procariota, eucariota, bacteriana, arqueal o de levadura). En un ejemplo, la célula es in vitro.
En un ejemplo, el ADN HM o PM es ADN de vector dentro de la célula. Por ejemplo, el ADN-HM o PM en el vector puede estar flanqueado por sitios de recombinación específicos del sitio (por ejemplo, sitios frt o lox) que se cortan por la acción de una recombinasa específica del sitio que está codificada por una célula hospedadora o secuencia vectorial. En otro ejemplo, el vector comprende ADN que se transcribe en copias de ARN del ADN-HM o PM y una transcriptasa inversa (por ejemplo, codificada por la secuencia de ácido nucleico del vector) para producir ADN-HM o PM a partir del ARN. Esto es útil para producir muchas copias del ADN-HM o PM deseado para aumentar las posibilidades de introducción eficiente y efectiva en uno o más de los sitios diana. En otra realización, el ADN-HM o PM es, o está codificado por, ácido nucleico de un segundo vector (por ejemplo, un segundo fago o plásmido) que ha transducido o transformado la célula hospedadora. Por ejemplo, esto podría ser un fago auxiliar (que también puede codificar una o más proteínas de recubrimiento necesarias para el empaquetado del primer vector de página). En otro ejemplo, el ADN se proporciona en el ADN del vector y está flanqueado por brazos, en el que el brazo 5' comprende un PAM que es reconocido por una nucleasa Cas cuando el vector está contenido en la célula hospedadora y el brazo 3' está flanqueado inmediatamente corriente abajo (3') por dicho PAM, por lo que en la célula hospedadora la escisión Cas libera el ADN-HM o PM con sus brazos flanqueados que pueden diseñarse para ser homólogos a las secuencias hospedadoras que flanquean el corte en la secuencia diana hospedadora, por lo que el ADN-HM está integrado en el genoma hospedador, o el ADN-PM está integrado en el genoma del fago. En un aspecto, la descripción proporciona un ácido nucleico que comprende dicho ADN-HM o PM y brazos o un vector (por ejemplo, un fago o fago empaquetado) que comprende dicho ácido nucleico, opcionalmente en el que el vector está contenido por una célula hospedadora. Opcionalmente, el ADN-HM está en combinación con una matriz HM como se define en esta invención. Opcionalmente, el ADN-PM está en combinación con una matriz PM como se define en esta invención.
Una aplicación particular de la invención es la alteración de la proporción de bacterias Bacteroidetes (por ejemplo, Bacteroides) en una población bacteriana mixta ex- o in vivo. Tal como se analizó anteriormente, esto puede ser útil para el tratamiento ambiental tal como el tratamiento de vías fluviales o agua potable infectada con Bacteroidetes no deseados, o para favorecer Bacteroidetes comensales o simbióticas útiles en humanos o animales, por ejemplo, para producir cultivos bacterianos para su administración a humanos o animales para tal fin.
En un ejemplo de este último, la invención es útil para aumentar la relación relativa de Bacteroidetes frente a Firmicutes, que se ha asociado con una menor masa corporal y, por lo tanto, encuentra utilidad para tratar o prevenir la obesidad con fines médicos o cosméticos.
Los estudios sugieren que Bacteroides tiene un papel en la prevención de la infección por Clostridium difficile.
El desarrollo de la respuesta inmunitaria que limita la entrada y proliferación de patógenos potenciales depende profundamente de Bfragilis. Además, las proteínas celulares Paneth pueden producir péptidos antibacterianos en respuesta a la estimulación por B thetaiotomicron, y estas moléculas pueden evitar que los patógenos colonicen el intestino. Además, B thetaiotomicron puede inducir a las células Paneth a producir una lectina bactericida, Reglll, que ejerce su efecto antimicrobiano al unirse al peptidoglicano de organismos grampositivos. Por lo tanto, el uso de la invención en cualquiera de sus configuraciones para aumentar la proporción de Bacteroides (por ejemplo, thetaiotomicron y/o fragalis) en una población mixta de bacterias intestinales es útil para limitar la colonización bacteriana patógena de la población o un intestino de un animal humano o no humano.
Hooper y col. demostraron que B thetaiotomicron puede modificar la fucosilación intestinal en una interacción compleja mediada por un gen represor de fucosa y un sistema de señalización. Mediante el análisis transcripcional se demostró que B thetaiotaomicron puede modular la expresión de una variedad de genes hospedadores, incluidos los involucrados en la absorción de nutrientes, la fortificación de la barrera mucosa y la producción de factores angiogénicos.
En una realización, la población mixta consiste en la primera y segunda bacteria (es decir, y ninguna población bacteriana adicional).
En un ejemplo, la o cada matriz es una matriz recombinante en un vector y/o una matriz aislada en un vector. En un ejemplo, la matriz está contenida en una célula hospedadora (por ejemplo, una célula microbiana, bacteriana o arqueal).
En un ejemplo, dicha Cas es una nucleasa Cas endógena (por ejemplo, Cas9) de la célula hospedadora. Al aprovechar la Cas del hospedador, esto permite el uso eficiente de repeticiones de tipo hospedador en la matriz y la posibilidad de usar ARNcr endógeno también, liberando capacidad que de otro modo está limitada en vectores, tales como virus o fagos (observando que la secuencia del gen Cas tal como Cas9 tipo II es grande).
En un ejemplo, el sistema CRISPR/Cas hospedador es un sistema de tipo I. En un ejemplo, el sistema CRISPR/Cas hospedador es un sistema de tipo II. En un ejemplo, el sistema CRISPR/Cas hospedador es un sistema de tipo III.
La Cas guiada por el ARNcr-HM o ARNg de la descripción es una Cas endógena del hospedador o una Cas codificada por vector compatible con el PAM en la secuencia diana.
Opcionalmente, el hospedador (o la primera y/o segunda bacteria) es una bacteria gramnegativa (por ejemplo, una spirilla o vibrio). Opcionalmente, el hospedador (o la primera y/o segunda bacteria) es una bacteria grampositiva. Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un micoplasma, clamidias, espiroqueta o micobacteria. Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador Streptococcus (por ejemplo, pyogenes o thermophilus). Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador Staphylococcus (por ejemplo, aureus, por ejemplo, MRSA). Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) esun hospedador E. coli (por ejemplo, O157:H7), por ejemplo, en el que la Cas está codificada por el vector o se desreprime la actividad de la nucleasa Cas endógena del hospedador.
Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Pseudomonas (por ejemplo, aeruginosa).
Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Vibro (por ejemplo, cholerae (por ejemplo, O139) o vulnificus). Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Neisseria (por ejemplo, gonnorrhoeae o meningitidis). Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Bordetella (por ejemplo, pertussis). Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Haemophilus (por ejemplo, influenzae).
Opcionalmente, el hospedador (o la primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Shigella (por ejemplo, dysenteriae). Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Brucella (por ejemplo, abortus). Opcionalmente, el hospedador (o la primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Francisella. Opcionalmente, el hospedador (o la primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Xanthomonas. Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Agrobacterium. Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Erwinia.
Opcionalmente, el hospedador (o la primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Legionella (por ejemplo, pneumophila). Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Listeria (por ejemplo, monocitogenes). Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Campylobacter (por ejemplo, jejuni). Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Yersinia (por ejemplo, pestis). Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Borelia (por ejemplo, burgdorferi). Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Helicobacter (por ejemplo, pylori). Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Clostridium (por ejemplo, dificile o botulinum). Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Erlichia (por ejemplo, chaffeensis). Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Salmonella (por ejemplo, typhio enterica, por ejemplo, serotipo typhimurium, por ejemplo, DT 104). Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Chlamydia (por ejemplo, pneumoniae).
Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del géneroParachlamydia.
Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Corynebacterium (por ejemplo, amycolatum). Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Klebsiella (por ejemplo, pneumoniae). Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Enterococcus (por ejemplo,faecalis o faecim, por ejemplo, resistente a linezolid). Opcionalmente, el hospedador (o primera y/o segunda bacteria) es un hospedador del género Acinetobacter (por ejemplo, baumannii, por ejemplo, resistente a múltiples fármacos).
En un ejemplo, la célula es una célula procariota. En un ejemplo, la célula es una célula bacteriana. En un ejemplo, la célula es una célula arqueal. En un ejemplo, la célula es una célula microbiana. En un ejemplo, la célula es una célula protozoaria. En un ejemplo, la célula es una célula de pez. En un ejemplo, la célula es una célula de ave. En un ejemplo, la célula es una célula de reptil. En un ejemplo, la célula es una célula de arácnido. En un ejemplo, la célula es una célula de levadura (por ejemplo, una célula de Saccharomyces). En un ejemplo, la célula hospedadora es una célula vegetal. En un ejemplo, la célula hospedadora es una célula animal (por ejemplo, no una célula humana, por ejemplo, no una célula de roedor). En un ejemplo, la célula hospedadora es una célula humana (por ejemplo, no una célula en un embrión o en un ser humano), por ejemplo, una célula hospedadora in vitro. En un ejemplo, la célula es una célula de animal de compañía o de ganado (por ejemplo, una célula de vaca, cerdo, cabra, oveja, caballo, perro, gato o conejo). En un ejemplo, la célula hospedadora es una célula de insecto (un insecto en cualquier etapa de su ciclo de vida, por ejemplo, huevo, larva o pupa). En un ejemplo, la célula hospedadora es una célula protozoaria. En un ejemplo, la célula es una célula de cefalópodo.
Opcionalmente, la matriz, el sistema, la secuencia de nucleótidos modificada o el ácido nucleico vectorial comprende además una (por ejemplo, una, dos o más) señal de localización nuclear (NLS), por ejemplo, para dirigirse al núcleo cuando la célula hospedadora es una célula eucariota, por ejemplo, una planta o un animal. En un ejemplo, una NLS flanquea cada extremo de una secuencia de ácido nucleico que codifica Cas de la invención y/o una matriz de la invención, particularmente para su uso al dirigirse a una célula hospedadora eucariótica.
Se puede omitir una secuencia de ARNtracr de una matriz o vector de la invención, por ejemplo, para sistemas Cas de un tipo que no utiliza ARNtracr.
En un ejemplo, la Cas guiada a la diana es una exonucleasa. Opcionalmente, una nickasa como se menciona en esta invención es una nicasa doble.
Un ejemplo de una nickasa es una nickasa Cas9, es decir, una Cas9 que tiene uno de los dos dominios de nucleasa desactivados, ya sea el dominio RuvC y/o HNH.
Opcionalmente, el sistema hospedador es un sistema de tipo I (y opcionalmente la matriz, ARNcr-HM o ARNg es de un sistema CRISPR diferente, por ejemplo, tipo II o III). Opcionalmente, la matriz o secuencia modificada está en combinación en un virus o plásmido con una secuencia de nucleótidos que codifica una Cas del mismo sistema que la matriz, ARNcr-HM o ARNg, por ejemplo, donde la Cas no opera u opera de manera eficiente con el sistema hospedador. Opcionalmente, el sistema hospedador es un sistema de tipo II (y opcionalmente la matriz, ARNcr-HM o ARNg es de un sistema CRISPR diferente, por ejemplo, tipo I o III). Opcionalmente, la matriz o secuencia modificada está en combinación en un virus o plásmido con una secuencia de nucleótidos que codifica una Cas del mismo sistema que la matriz, ARNcr-HM o ARNg, por ejemplo, donde la Cas no opera u opera de manera eficiente con el sistema hospedador. Opcionalmente, el sistema hospedador es un sistema de tipo III (y opcionalmente la matriz, ARNcr-HM o ARNg es de un sistema CRISPR diferente, por ejemplo, tipo I o II). Opcionalmente, la matriz de secuencia modificada está en combinación en un virus o plásmido con una secuencia de nucleótidos que codifica una Cas del mismo sistema que la matriz, por ejemplo, donde la Cas no funciona u opera de manera eficiente con el sistema hospedador.
La mención en esta invención del uso de ADN de vector también puede, en una realización alternativa, aplicarse mutatis mutandis al ARN de vector donde el contexto lo permita. Por ejemplo, donde el vector es un vector de ARN. Por lo tanto, todas las características de la invención se describen de forma alternativa y deben leerse como «ARN» en lugar de «ADN» cuando se hace referencia al ADN del vector en esta invención cuando el contexto lo permite. En un ejemplo, el vector o cada vector también codifica una transcriptasa inversa.
En un ejemplo, la o cada matriz o secuencia de nucleótidos modificada es proporcionada por un vector de nanopartículas o en liposomas.
En un ejemplo, la Cas es una nucleasa Cas para cortar, Cas muerta (dCas) para interrumpir o una dCas conjugada con un activador de transcripción para activar la diana.
En un ejemplo, el sistema CRISPR/Cas hospedador comprende una matriz de CRISPR hospedadora y una Cas hospedadora cognada para la selección de la secuencia de nucleótidos en el hospedador. En un ejemplo, la secuencia diana hospedadora comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 o 40 nucleótidos contiguos. En un ejemplo, la secuencia diana es cortada por Cas, por ejemplo, una Cas9. En una realización, la secuencia no está en un espaciador.
En un ejemplo, la o cada matriz o secuencia modificada comprende un promotor exógeno funcional para la transcripción del ARNcr o ARNg en el hospedador.
En un ejemplo, la o cada repetición de matriz son idénticas a las repeticiones en la matriz hospedadora, en las que la matriz de CRISPR no comprende un PAM reconocido por una Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas, por ejemplo, Cas9) del sistema CRISPR/Cas hospedador. Esto se aplica mutatis mutandis a la secuencia repetida del ARNcr-HM y ARNg. Esta realización es ventajosa ya que simplemente permite que la matriz de CRISPR use la Cas hospedadora endógena para dirigirse a la secuencia diana hospedadora. Esto, por tanto, es eficiente, ya que la matriz se adapta para su uso por la maquinaria hospedadora, y por lo tanto, ayuda a funcionar en la célula hospedadora. De manera adicional o alternativa (por ejemplo, cuando la matriz se proporciona en combinación con una secuencia de codificación de Cas exógena (no endógena del hospedador)), esta realización permite que la matriz de CRISPR utilice el ARN-tracr codificado de forma endógena, ya que las repeticiones de la matriz de CRISPR se hibridarán con el ARNtracr endógeno para la producción de pre-ARNcr y el procesamiento en ARNcr maduro que se hibrida con la secuencia diana hospedadora. Este último complejo puede, por tanto, guiar la nucleasa Cas endógena (por ejemplo, Cas9) o guiar la Cas producida a partir de la secuencia comprendida por la matriz de CRISPR. Por lo tanto, esta realización proporciona la flexibilidad de construir simplemente un vector (por ejemplo, virus o fago empaquetado) que contiene la matriz de CRISPR pero que no comprende una secuencia de codificación de nucleasa de ARNtracr y/o Cas. Esto es más sencillo para la construcción de vectores y también libera espacio valioso en el vector (por ejemplo, virus o fagos), lo que es útil teniendo en cuenta la limitación de capacidad para vectores, particularmente vectores virales (por ejemplo, fagos). El espacio adicional puede ser útil, por ejemplo, para permitir la inclusión de muchos más espaciadores en la matriz, por ejemplo, para dirigirse al genoma hospedador para su modificación, tal como para desactivar genes hospedadores o traer secuencias no hospedadoras deseadas para su expresión en el hospedador. De manera adicional o alternativa, el espacio se puede utilizar para incluir una pluralidad de matrices de CRISPR en el vector. Estas podrían ser, por ejemplo, una disposición donde una primera matriz es de un primer tipo CRISPR/Cas (por ejemplo, tipo II o tipo II-A) y la segunda matriz podría ser de un segundo tipo (por ejemplo, tipo I o III o tipo II-B). De manera adicional o alternativa, las matrices podrían utilizar diferentes nucleasas Cas en el hospedador (por ejemplo, una matriz es operativa con la nucleasa Cas del hospedador y la segunda matriz es operativa con una nucleasa Cas exógena (es decir, una nucleasa codificada por vector)). Estos aspectos proporcionan maquinaria para dirigirse en el hospedador una vez que se ha introducido el vector, lo que es beneficioso para reducir la resistencia del hospedador al vector, ya que el hospedador entonces necesitaría dirigirse a un mayor rango de elementos. Por ejemplo, si el hospedador fue capaz de adquirir un nuevo espaciador basado en la primera secuencia de matriz de CRISPR, la segunda matriz de CRISPR aún podría funcionar en el hospedador para dirigirse a una secuencia diana respectiva en la célula hospedadora. Por lo tanto, esta realización es útil para reducir la adaptación del hospedador al vector.
Otro beneficio es que es posible (por ejemplo, con esta disposición) incluir en la matriz de CRISPR (o distribuido sobre una pluralidad de dichas matrices en el vector) múltiples copias del mismo espaciador (por ejemplo, un espaciador utilizado para dirigirse a un sitio diana en la célula hospedadora). Esto es beneficioso, ya que se ha propuesto que la adaptación de los hospedadores, como bacterias y arqueas, puede implicar la pérdida de espaciadores de sus matrices donde los espaciadores se dirigen al ADN del hospedador conveniente (PLoS Genet. 2013;9(9):e1003844. doi: 10.1371/journal.pgen.1003844. Epub 2013 Sep 26, «Dealing with the evolutionary downside of CRISPR immunity: bacteria and benefit plasmids», Jiang W y col.). Se cree que la eliminación de las unidades de repetición de espaciador se produce a través de la recombinación de secuencias de repetición. Por lo tanto, según el presente aspecto de la invención, se proporcionan una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más matrices de CRISPR o secuencias modificadas genéticamente de la invención que comprenden una pluralidad (por ejemplo, 2, 3, 45, 10,15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100 o más) copias de un espaciador para hibridarse con una secuencia diana hospedadora. Esto reduce las posibilidades de que todos estos espaciadores se pierdan por recombinación en la célula hospedadora. En una aplicación adicional de este aspecto, las matrices de CRISPR comprenden una primera matriz que comprende una o más (por ejemplo, 2, 3, 45, 10,15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90 o más) de las copias espaciadoras idénticas y una segunda matriz que comprende una o más (por ejemplo, 2, 3, 45, 10,15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90 o más) de las copias espaciadoras idénticas, en las que las copias espaciadoras en la primera matriz están flanqueadas cada una por primeras repeticiones y las copias espaciadoras idénticas en la segunda matriz están flanqueadas cada una por segundas repeticiones, en las que las primeras repeticiones son diferentes de las segundas repeticiones. Esto tiene el beneficio de que al menos una de la primera y segunda repeticiones puede seleccionarse para que no sea reconocida por una nucleasa Cas hospedadora (o la misma nucleasa Cas hospedadora), para reducir las posibilidades de adaptación del hospedador que involucra más de una de las matrices. En un ejemplo, la primera matriz está en combinación con una secuencia de nucleasa Cas que no está codificada por la célula hospedadora y que es un Cas cognado para las primeras repeticiones. Opcionalmente, también la segunda matriz está en combinación con una secuencia de nucleasa Cas (por ejemplo, igual o diferente a la de la primera matriz) que no está codificada por la célula hospedadora y que es una Cas cognada para las segundas repeticiones.
Una realización proporciona una primera matriz contenida en un primer vector y una segunda matriz contenida en un segundo vector que no contiene la primera matriz (por ejemplo, en la que los vectores son plásmidos o viriones (por ejemplo, del mismo tipo de virus) o fagos empaquetados (por ejemplo, del mismo tipo de fago). Esto es útil, ya que los vectores se pueden introducir de manera simultánea o secuencial en la misma célula hospedadora. Por lo tanto, cuando el hospedador gana resistencia a la primera matriz, el segundo se introduce para proporcionar una segunda matriz con la cual el hospedador resistente (por ejemplo, bacteria o arqueo) no ha evolucionado previamente, proporcionando así una segunda onda de modificación (por ejemplo, desactivación) contra la célula hospedadora. Esto también proporciona flexibilidad, ya que un tercer vector de este tipo, que comprende un espaciador o matriz que es diferente de la primera y segunda matriz y espaciadores, se puede introducir en la célula hospedadora de forma simultánea o secuencial con el segundo vector para proporcionar una ruta adicional a la modificación de la célula hospedadora que no ha estado presente anteriormente durante la evolución de los hospedadores que son resistentes a un espaciador en la primera matriz. En lugar de matrices, se pueden usar secuencias de nucleótidos modificadas genéticamente de la descripción.
Por lo tanto, en una realización, la invención proporciona una composición para modificar una célula hospedadora, en la que la composición proporciona cualquier matriz o secuencia modificada como se describe en la presente memoria. Por lo tanto, en una realización, la invención proporciona una composición para modificar una célula hospedadora, en la que la composición proporciona una primera matriz como se describe en la presente memoria en un primer vector (por ejemplo, virión o fago empaquetado) y una segunda primera matriz como se describe en la presente memoria en un segundo vector (por ejemplo, virión o fago empaquetado respectivamente), en la que la segunda matriz comprende uno o más espaciadores que se dirigen a una o más secuencias diana hospedadoras y que no están comprendidas por la primera matriz. En lugar de matrices, se pueden usar secuencias de nucleótidos modificadas genéticamente de la descripción.
En una realización, la matriz o secuencia modificada está contenida en un vector de virofago y el hospedador es alternativamente un virus que puede infectar una célula. Por ejemplo, el hospedador es un virus grande que puede haber infectado una célula de ameba. Por ejemplo, el hospedador es un virus Sputnik, Pithovirus, mimivirus, mamavirus, Megavirus o Pandoravirus, por ejemplo, en el que el virus hospedador está en agua. En un ejemplo de esta realización, la invención es para el tratamiento de aguas o aguas residuales (por ejemplo, purificación, por ejemplo, tratamiento de vías fluviales, ríos, lagos, estanques o mares).
En una realización, el o cada vector o secuencia modificada es o está comprendida por un fago ONM1, por ejemplo, en el que la o las células hospedadoras son una célula de S. aureus (por ejemplo, MRSA).
Las características generales también proporcionan las siguientes cláusulas: En una primera cláusula, se proporciona una composición antimicrobiana (por ejemplo, un antibiótico, por ejemplo, un medicamento, desinfectante o enjuague bucal), que comprende una matriz, secuencia modificada, virus, virión, fago, fagémido, profago, población o colección según cualquier aspecto de la descripción.
Una segunda cláusula se refiere a la composición de la primera cláusula para uso médico u dental u oftálmico (por ejemplo, para tratar o prevenir una infección en un organismo o limitar la propagación de la infección en un organismo.
En un ejemplo, el organismo es una planta o animal, por ejemplo, vertebrado (por ejemplo, cualquier mamífero o humano descrito en la presente) o planta de cultivo o alimento.
Una tercera cláusula se refiere a una composición que comprende una matriz, secuencia modificada, sistema, colección, virus, virión, fago, fagémido, profago, composición, población o colección según la descripción para uso cosmético (por ejemplo, uso en un producto cosmético, por ejemplo, maquillaje), o para uso higiénico (por ejemplo, uso en un producto higiénico, por ejemplo, jabón).
Una cuarta cláusula se refiere al uso de una composición que comprende una matriz, secuencia modificada, recolección, virus, virión, fago, fagémido, profago, población o colección según cualquiera de las cláusulas primera a trigésimo quinta, en medicina o para uso terapéutico o profiláctico dental.
Una quinta cláusula se refiere al uso de una composición que comprende una matriz, secuencia modificada, colección, sistema, virus, virión, fago, fagémido, profago, composición, población o colección según la descripción, en uso cosmético (por ejemplo, uso en un producto cosmético, por ejemplo, maquillaje), o para uso higiénico (por ejemplo, uso en un producto higiénico, por ejemplo, un jabón).
Una sexta cláusula se refiere al uso de una matriz, secuencia modificada, sistema, colección, virus, virión, fago, fagémido, profago, composición, población o colección según la descripción en un sistema Cas9/CRISPR (por ejemplo, tipo I, II o III) modificador del hospedador (HM) que es capaz de modificar una secuencia de nucleótidos diana de una célula hospedadora, en el que la matriz, secuencia modificada, sistema, virus, virión, fago, fagémido, profago, población o colección es según la presente descripción.
Una séptima cláusula se refiere al uso de la cuarta, quinta o sexta cláusula, en la que la matriz, secuencia modificada, sistema, colección, virus, virión, fago, fagémido, profago, población o colección no se encuentra en una célula hospedadora.
Una octava cláusula se refiere al uso de la quinta o sexta cláusula, en la que la matriz, secuencia modificada, colección, sistema, virus, virión, fago, fagémido, profago, población o colección se encuentra en una célula hospedadora (por ejemplo, un microbio, bacteria o célula arqueónica).
Una novena cláusula se refiere al uso de cualquiera de las cláusulas cuarta a sexta para modificar una célula microbiana (por ejemplo, para destruir o reducir el crecimiento de la célula o un cultivo de células microbianas).
Una décima cláusula se refiere a un procedimiento para modificar una secuencia de nucleótidos diana en una célula hospedadora (por ejemplo, una bacteria microbiana o arqueón), el procedimiento comprende transformar la célula hospedadora con la matriz, secuencia modificada, sistema, colección, virus, virión, fago, fagemida, población o colección según la presente descripción, mediante lo cual la secuencia de nucleótidos diana se modifica con Cas, en el que la secuencia diana hospedadora es una secuencia de nucleótidos de un sistema CRISPR/Cas hospedador de la célula.
Una décima primera cláusula se refiere a un procedimiento para reducir el desarrollo de la resistencia de la célula hospedadora a la transformación por un vector de ácido nucleico o mantenimiento de un vector de ácido nucleico en la célula hospedadora, en el que la célula hospedadora comprende una secuencia de nucleótidos diana, y el procedimiento comprende transformar la célula hospedadora con la matriz, secuencia modificada, colección, sistema, virus, virión, fago, fagémido, población o colección según la descripción, por lo que la secuencia de nucleótidos diana se modifica con Cas (por ejemplo, se corta, muta o se inactiva).
Una décima segunda cláusula se refiere al procedimiento de la cláusula décima primera, en el que el vector es un virus que es capaz de infectar la célula hospedadora y la etapa de transformación comprende infectar la célula hospedadora con el vector.
Una décima tercera cláusula se refiere al procedimiento de la décima primera o décima segunda cláusula, en el que la célula hospedadora es una célula bacteriana o arqueal y el vector es un fago o fagémido.
Una décima cuarta cláusula se refiere al procedimiento de cualquiera de las cláusulas décima primera a décima tercera, en el que la secuencia diana hospedadora es esencial para hospedar la adquisición mediada por CRISPR/Cas de espaciadores de secuencia vectorial.
Una décima quinta cláusula se refiere a la matriz, secuencia modificada genéticamente, sistema, vector, célula, colección, composición, uso o procedimiento de cualquier cláusula anterior, en la que al menos el componente (ii) está contenido en un virus (por ejemplo, un fago) que es capaz de expresar una endolisina para la lisis de la célula hospedadora, opcionalmente en el que la endolisina es un fago phi11, fago Twort, fago P68, fago phiWMY o fago K endolisina (por ejemplo, endolisina MV-L o endolisina P-27/HP).
Una décima sexta cláusula se refiere a la matriz, secuencia modificada genéticamente, sistema, vector, colección, célula, composición, uso o procedimiento de la décima quinta cláusula en combinación con una endolisina para la lisis de la célula hospedadora, por ejemplo, en combinación con endolisina MV-L o endolisina P-27/HP o un homólogo funcional de los mismos.
Una décima séptima cláusula se refiere a la matriz, secuencia modificada, sistema, vector, recolección, célula, composición, uso o procedimiento de cualquier cláusula anterior en combinación con un agente antimicrobiano, por ejemplo, antibiótico, por ejemplo, un antibiótico betalactámico.
Una décima octava cláusula se refiere a la matriz, secuencia modificada genéticamente, sistema, vector, colección, célula, composición, uso o procedimiento de cualquier cláusula anterior, en la que la célula hospedadora es una célula hospedadora Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Salmonella, Listeria, E coli, Desulfovibrio o Clostridium.
Una décima novena cláusula se refiere a la matriz, secuencia modificada genéticamente, sistema, vector, colección, célula, composición, uso o procedimiento de cualquier cláusula anterior, en la que la célula hospedadora es una célula hospedadora de Staphylococcus (por ejemplo, S aureus) y al menos el componente (ii) está contenido en un fago de Staphylococcus de clase I, II o III (por ejemplo, un fago empaquetado), opcionalmente un fago de Caudovirales o Myoviridae.
Una cláusula vigésima se refiere a la matriz, secuencia modificada genéticamente, sistema, vector, célula, colección, composición, uso o procedimiento de cualquier cláusula anterior, en el que la célula hospedadora es un Streptococcus aureus, resistente a antibióticos betalactámicos, Streptococcus aureus, resistente a meticilina (MRSA), Streptococcus aureus resistente a vancomicina o Streptococcus aureus resistente a teicoplanina y opcionalmente la secuencia diana es una secuencia de un gen de resistencia a antibióticos betalactámicos del hospedador, gen de resistencia a meticilina, gen de resistencia a vancomicina o gen de resistencia a teicoplanina, respectivamente.
Los procedimientos adecuados para producir y evaluar los vectores de fagos de la invención son, por ejemplo, procedimientos generales descritos en el documento WO2014/124226.
Elementos genéticos móviles, transposones y portadores (para cualquier configuración)
Los plásmidos son muy comunes en las especies de Bacteroides y se encuentran en el 20 al 50 % de las cepas. Muchos plásmidos poseen oriT y un gen de movilización de transacción, que permiten que se transfieran por conjugación. Por lo tanto, en un ejemplo, el vector es un plásmido que comprende oriT y/o un gen de movilización, por ejemplo, en el que la primera o segunda bacteria son Bacteroides. En un ejemplo, la secuencia modificada está comprendida por dicho vector.
En un ejemplo, las células hospedadoras, o la primera o segunda bacteria comprenden naturalmente transposones. Los transposones, tanto movilizables como conjugados, no se replican de forma independiente; más bien, se extirpan e integran en el ADN cromosómico y se copian junto con el ADN cromosómico. Los transposones conjugativos tienen un mecanismo de escisión e integración que se asemejan a algunas características tanto de los plásmidos como de los bacteriófagos. Los transposones conjugados son prácticamente ubicuos entre las Bacteroides: más del 80 % de las cepas de Bacteroides contienen al menos un transposón conjugado. Los transposones conjugados de Bacteroides pertenecen a al menos dos familias; CTnDot es el mejor descrito. A menudo, el nombre de la cepa en la que se encuentran se añade a la designación (por ejemplo, CTnDot, que se encuentra en la cepa DOT de B thetaiotaomicron).
Además de ser capaz de insertar en el cromosoma, los transposones conjugados con Bacteroides pueden insertarse en plásmidos coresidentes y movilizarlos en cis (es decir, pueden actuar sobre entidades que son físicamente adyacentes) al integrarse en el plásmido y facilitar la transferencia del híbrido de transposones conjugados con plásmidos a otra célula. También pueden movilizar plásmidos «in trans» suministrando los factores necesarios para facilitar la transferencia del plásmido, mientras permanecen físicamente separados del plásmido.
Los transposones conjugativos no se excluyen entre sí al igual que los plásmidos, por lo que una cepa puede acumular más de un transposón conjugativo. Además, hay alguna evidencia de que la presencia de más de una copia del transposón conjugativo en la cepa resulta en una estimulación de la transposición (transactivación). Teóricamente, esto sugiere que a medida que se acumulan más transposones conjugados en el entorno, la transferencia de los genes de transposones a otras bacterias también aumentará, y habrá una espiral ascendente significativa de distribución de los genes. Muchos de los transposones Bacteroides llevan el gen tetQ. y, por lo tanto, confieren resistencia a la tetraciclina. Además, la autotransferencia y otras actividades son estimuladas significativamente por bajos niveles de tetraciclina, regulados por el operón tetQ-rteA-rteB. La tetraciclina aumenta la transcripción de rteA y -B, que codifican los componentes del sensor y del activador de un sistema regulador de dos componentes. A su vez, RteB activa la expresión de rteC, que es necesaria para la autotransferencia.
En un ejemplo, el vector (por ejemplo, el vector que comprende la secuencia modificada) comprende un transposón, en el que el transposón comprende la secuencia modificada, la matriz HM o PM de la invención, en el que el transposón es operativo en las células hospedadoras o en la primera o segunda especie de células hospedadoras de bacterias. En una realización, el transposón es un transposón de Bacteroides (por ejemplo, un transposón CTnDot, por ejemplo, un transposón CTnDot de B thetaiotaomicron o B fragalis) y las células hospedadoras, o la primera o segunda bacteria son o comprenden Bacteroides (por ejemplo, de la misma especie que dicho transposón CTnDot). En un ejemplo, el transposón es un transposón conjugado. En un ejemplo, el transposón es un transposón movilizable. En un ejemplo, el transposón es transferible entre células Bacteroides. En un ejemplo, el transposón comprende una secuencia intDOT. En un ejemplo, el transposón comprende un oriT. En un ejemplo, el transpsosón codifica una o más proteínas de poro de unión para la transferencia conjugativa del transposón entre células hospedadoras.
En un ejemplo, la descripción proporciona un transposón que comprende un gen Bacteroides tetG. En un ejemplo, el transposón comprende además un operón Bacteroides tetQ-rteA-rteB. En un ejemplo, la primera o segunda bacteria son Bacteroides. En un ejemplo, el transposón es un transposón Bacteroides CTnDot que codifica una o más proteínas de poro de unión para la transferencia conjugativa del transposón entre células hospedadoras y comprende una o más matrices o secuencias modificadas genéticamente de la invención, un oriT, una secuencia intDOT y un operón tetQ-rteA-rteB, y es opcionalmente para administración o se administra a dicho ser humano o animal no humano tal como se menciona en esta invención en combinación con tetraciclina. La transferencia de la mayoría de los CTn de Bacteroides es estimulada por tetraciclina. El transposón es operable con una integrasa en una célula hospedadora o es operable con una integrasa exógena transportada en el mismo vector o en un vector diferente al transposón. En una realización, el vector es un fago (por ejemplo, un fago empaquetado) que comprende el transposón y una secuencia de nucleótidos que codifica una integrasa cognada. El fago es capaz de infectar una célula bacteriana hospedadora para la replicación y escisión del transposón, por ejemplo, para la transferencia conjugativa a células hospedadoras vecinas en una población bacteriana mixta (por ejemplo, una población de microbiota intestinal).
En una realización, el transposón está comprendido por un vector que porta una o más secuencias génicas necesarias para la transferencia de transposón entre células hospedadoras, en el que dichas secuencias génicas están fuera del transposón en el ácido nucleico vectorial. Por ejemplo, el vector es un fago empaquetado que es capaz de infectar una célula hospedadora (por ejemplo, una célula hospedadora de Bacteroides), en el que el ácido nucleico de fago comprende un dicho transposón que comprende una matriz de la invención y corriente arriba o corriente abajo del transposón uno o más genes operativos para la transferencia conjugativa del transposón (por ejemplo, uno o más genes que codifican relaxasas, proteínas de acoplamiento y/o proteínas de puente de acoplamiento para la transferencia conjugativa de transposones; y/o uno o ambos de operones Moby tra), en el que uno, más o todos estos genes no están comprendidos por el transposón. En un ejemplo, estos genes son genes para la escisión del transposón del ADN cromosómico dentro de una primera célula hospedadora. Por lo tanto, el transposón es capaz de movilizarse dentro de esa célula y lleva consigo los genes necesarios para la transferencia conjugativa posterior a una segunda célula hospedadora. Al proporcionar algunos de los genes de transposón de esta manera en el vector fuera del transposón, esto libera espacio en el transposón para la inclusión de la secuencia modificada o el ADN de la matriz de la invención para que esto se pueda acomodar y transportar por transposones movilizados. La invención proporciona dicho vector que comprende uno o más de dichos transposones para su uso en el uso de la invención o para su uso en el procedimiento o sistema de la descripción o generalmente para su introducción en células bacterianas (en este caso, en lugar de dirigirse a una secuencia de fago, la matriz incluida en el transposón puede dirigirse a una secuencia diana bacteriana para modificar la secuencia, por ejemplo, cortarla usando Cas en una célula que alberga el transposón).
Los mecanismos moleculares de la escisión e integración de CTnDot se asemejan más a los de los bacteriófagos que a los de la transposición. Las proteínas integrasa y de escisión CTnDOT son bastante similares a las de los bacteriófagos. Por lo tanto, en una realización, la función de una o más integrasa y/o proteínas de escisión del transposón de la descripción son proporcionadas por la integrasa de fagos y/o proteínas de escisión, respectivamente, y el transposón no comprende genes correspondientes que codifican dichas integrasa o proteínas de escisión cuyas funciones son proporcionadas por proteínas de fagos.
En un ejemplo, el transpsosón comprende rteC y el operón xis2c-xis2d-orf3-exc. De forma opcional, el vector comprende adicionalmente operones Mob y tra fuera del transpsosón (por ejemplo, corriente arriba o corriente abajo del transposón en el ácido nucleico del vector). Por lo tanto, esto libera espacio en el transposón para proporcionar una secuencia de la matriz de CRISPR o una secuencia modificada genéticamente de la invención.
Muchos transposones conjugados son capaces de movilizar otros elementos. Por ejemplo, muchos plásmidos coresidentes se movilizan mediante un transposón conjugado en trans. Esto se produce cuando un plásmido que contiene un oriT utiliza las proteínas del poro de apareamiento proporcionadas por CTn para la transferencia a una célula receptora. También se ha demostrado que los CTn de Bacteroides movilizan elementos cuando están en cis, una característica que no es típica de los CTn. Por ejemplo, si CTnDOT se extirpa del cromosoma y se integra en un plásmido, puede proporcionar el poro de apareamiento, un oriT y las proteínas de movilización (relajasa/acoplamiento), lo que le permite transferir todo el plásmido mediante actuación «en cis». Esta capacidad de utilizar tanto mecanismos trans como cis de movilización es inusual y sugiere que losCTn de Bacteroides tienen una mayor capacidad para movilizar otros elementos.
En un ejemplo, el vector de la invención es un plásmido que comprende una o más secuencias o matrices modificados genéticamente de la invención y un transposón CTnDot de oriT que es cognado con una especie de célula hospedadora que codifica proteínas de poro de apareamiento, mediante lo cual el plásmido es movilizable en una célula hospedadora que comprende dicho transposón CTnDot. Por lo tanto, el plásmido tiene capacidad de transferencia horizontal entre las células hospedadoras, propagando de esa manera las matrices de la invención en una población de dichas células hospedadoras (por ejemplo, células Bacteroides). En un ejemplo, la invención proporciona una composición que comprende una población de bacterias portadoras, en la que las bacterias portadoras son compatibles con dicho vector de plásmido de la invención, por lo que el vector tiene capacidad de transferencia horizontal a células bacterianas hospedadoras receptoras (por ejemplo, Bacteroides o Firmicutes, por ejemplo, células Streptococcus) que comprenden transposones CTnDot cognados cuando se mezclan las bacterias portadoras y receptoras. En un ejemplo, las bacterias portadoras están comprendidas por una bebida (por ejemplo, bebida probiótica, tal como una descrita en esta invención) o producto alimenticio para consumo humano o animal no humano, por lo que las bacterias portadoras pueden mezclarse con bacterias receptoras protegidas por el ser humano o animal (por ejemplo, en la cavidad oral o en el intestino). Otros transposones dentro de la familia similar a CTnDOT incluyen CTnERL y CTn341, aunque estos elementos difieren de CTnDOT y, por lo tanto, en lugar de un transposón CTnDot, el transposón del aspecto general de la descripción puede ser un transposón CTnERL o CTn341 que porta una o más matrices de CRISPR deseadas o secuencias modificadas genéticamente para dirigirse a uno o más sitios diana de nucleótidos bacterianos o de fagos cuando el transposón está comprendido por una célula hospedadora bacteriana o arqueal.
Para que se produzca la transferencia del transposón conjugado, hay tres etapas principales que tienen lugar. La primera etapa es la escisión del cromosoma para formar un intermedio circular cerrado covalentemente. En segundo lugar, una copia de cadena sencilla se transfiere a través del poro de apareamiento a una célula receptora, después de lo cual la copia se convierte en cadena doble. En tercer lugar, el CT n bicatenario intacto se integra en el cromosoma del receptor. La transposición conjugativa es replicativa, ya que una copia del CTn se retiene en la célula donante. Debido a que el elemento reside dentro del cromosoma, también se transfiere verticalmente a las células de la progenie. Esto es importante porque cuando las matrices de CRISPR deseadas o las secuencias modificadas genéticamente (y opcionalmente la secuencia Cas) están presentes en los CTn, no solo se transfieren fácilmente dentro de la población, sino que también se mantienen de forma muy estable de generación en generación. Esto ocurre como se ha visto, por ejemplo, con determinantes de resistencia antibiótica retenidos. Además, se cree que Bacteroides puede servir como un reservorio de determinantes de resistencia a antibióticos que disemina estos genes a otros organismos fuera del género Bacteroides, posiblemente incluso transfiriendo estos elementos a organismos que están pasando transitoriamente a través del intestino. De manera similar, se puede crear un reservorio de matrices o secuencias modificadas genéticamente de la invención utilizando vectores de la invención que se administran a un ser humano o animal no humano, por ejemplo, para tratar o prevenir la obesidad, diabetes o IBD o cualquier otra enfermedad o afección descrita en esta invención.
En un ejemplo, se puede explotar el reservorio de matrices de CRISPR deseadas o secuencias modificadas mediante el uso de uno o más matrices o secuencias comprendidas por un transposón (por ejemplo, un CTnDot) que es capaz de ser albergado por células Bacteroides (por ejemplo, en el intestino o la cavidad oral de un ser humano o animal no humano), en el que la(s) matriz(ces)/secuencia(s) no se dirigen a una secuencia de la célula Bacteroides hospedadora, pero se dirigen a una secuencia de nucleótidos comprendida por una célula de microbiota intestinal (por ejemplo, célula bacteriana) de una especie diferente (por ejemplo, una célula Firmicutes o célula bacteriana patógena, por ejemplo, Streptococcus, C dificile, H pylori, Salmonella, Listeria, Yersinia, Shigella o célula Campylobacter). Por lo tanto, de esta manera puede tener lugar la transferencia de las matrices o secuencias de la invención a bacterias patógenas o no deseadas receptoras vecinas, y una vez dentro de la célula receptora, las matrices de la invención pueden funcionar para guiar a Cas al sitio diana respectivo en la célula hospedadora para modificar (por ejemplo, cortar) el sitio. En este caso, la matriz/secuencia puede comprender secuencias de repetición que se encuentran en la célula receptora de interés de modo que la matriz/secuencia pueda funcionar con un sistema CRISPR/Cas endógeno dentro de la célula receptora. Esto evita la necesidad de incluir secuencias que codifican Cas y/o ARNtracr en el vector, secuencia modificada o transposón de la descripción, liberando así espacio y simplificando la estructura. El aumento del espacio es útil para permitir la inclusión de más espaciadores para dirigirse a más sitios diana en la célula receptora. En una alternativa, la o las matrices de transposones o secuencias comprenden una secuencia que codifica Cas9 de tipo II y secuencias de repetición cognadas. Por ejemplo, la Cas9 (cualquier Cas9 mencionada en esta invención) es una Cas9 de S pyogenes, S thermophilus o S aureus y puede ser opcionalmente una nickasa o dCas9 («Cas9 muerto»). Dado que los Bacteroides son anaerobios obligados (o tienen una fuerte preferencia por entornos anaerobios) y típicamente son patógenos fuera del entorno intestinal, puede no ser deseable utilizar células Bacteroides como portadoras para los vectores de la invención o transposones de la descripción, por ejemplo, cuando se administran al intestino o la cavidad oral de un ser humano o animal. Para abordar esto, la invención proporciona una población portadora de bacterias que albergan vectores, secuencias modificadas o transposones de la descripción, en la que las bacterias portadoras son compatibles con dicho vector, secuencia o transposón, en la que el vector, secuencia o transposón tiene capacidad de transferencia horizontal a células de bacterias hospedadoras receptoras (por ejemplo, Bacteroides) en la microbiota intestinal cuando se mezclan las bacterias portadoras y receptoras. En un ejemplo, las bacterias portadoras están comprendidas por una bebida (por ejemplo, bebida probiótica, tal como una descrita en esta invención) o producto alimenticio para consumo humano o animal no humano, por lo que las bacterias portadoras pueden mezclarse con bacterias receptoras protegidas por el ser humano o animal (por ejemplo, en la cavidad oral o en el intestino). En una realización, los vectores, secuencias o transposones comprenden matrices de CRISPR de la invención, en los que las matrices de secuencias de nucleótidos diana comprenden las células receptoras para modificar las secuencias diana, por ejemplo, cortando las secuencias para inactivar genes que comprenden las secuencias diana. En una alternativa, los vectores, secuencias o transposones son capaces de transferencia horizontal (por ejemplo, transferencia conjugativa de transposones) a una segunda población receptora de bacterias, que son de una especie diferente a la primera bacteria receptora, en los que los sitios diana de secuencia de nucleótidos están comprendidos por la segunda bacteria receptora pero no están comprendidos por la primera bacteria receptora, por lo que los sitios diana están modificados por Cas en la segunda bacteria receptora (células hospedadoras).
En un ejemplo, las primeras bacterias receptoras son bacterias Bacteroides y las segundas bacterias receptoras son bacterias Firmicutes o patógenas, por ejemplo, bacterias intestinales. En un ejemplo, las bacterias portadoras comprenden vectores de la invención (fagos o plásmidos) que comprenden uno o más transposones conjugados (por ejemplo, trasposones CTnDot) que pueden ser albergados por las bacterias portadoras, la primera bacteria y la segunda bacteria, por ejemplo, en los que los transposones comprenden oriT y las bacterias portadoras, la primera bacteria y la segunda bacteria son compatibles con oriT.
En una alternativa, las bacterias portadoras son capaces de transferir el vector, secuencia modificada o transposón de la descripción directamente a Firmicutes o bacterias patógenas, por ejemplo, en un animal o animal no humano, por ejemplo, en el intestino, cavidad oral o sistémicamente (por ejemplo, en la sangre). En un ejemplo, las bacterias patógenas son bacterias C dificile, H pylori, E coli patógena, Salmonella, Listeria, Yersinia, Shigella, S aureus, Streptococcus o Campylobacter.
En un ejemplo, las bacterias portadoras son bacterias de una o más especies seleccionadas del grupo que consiste en una especie de Lactobacillus (por ejemplo, acidophilus (por ejemplo, La-5, La-14 o NCFM), brevis, bulgaricus, plantarum, rhammosus, fermentum, caucasicus, helveticus, lactis, reuteri o casei, por ejemplo, casei Shirota), una especie de Bifidobacterium (por ejemplo, bifidum, breve, longum o infantis), Streptococcus thermophilus y Enterococcus faecium. Por ejemplo, las bacterias son bacterias L acidophilus.
Los transposones movilizables, como los plásmidos movilizables, no pueden autotransferirse, pero pueden transferirse entre células en presencia del elemento auxiliar TcR. Los transposones de Bacteroides más comúnmente discutidos de esta clase incluyen Tn4399,Tn4555 y las unidades de Bacteroides no replicantes. El transposón movilizable Tn4555, por ejemplo, se detectó por primera vez durante estudios de resistencia a la cefoxitina transmisible en un aislado clínico de Bacteroides vulgatus. En una realización, por lo tanto, el transpsosón de la descripción es un transposón movilizable (por ejemplo, un transposón movilizable de Bacteroides), por ejemplo, un Tn4399 o Tn4555 que comprende uno o más matrices o secuencias de la invención. El transposón está en combinación con un elemento auxiliar de TcR.
En un ejemplo, el transposón de la descripción es el transposón Enterococcus Tn916 o Tn1546 Gram-positivo. Un transposón (por ejemplo, como un transposón CTnDot, Tn4399 o Tn4555) se puede caracterizar, por ejemplo, según sus repeticiones terminales y/o secuencias codificantesde transposasa o resolvasa. En un ejemplo alternativo, el vector o transposón comprende un origen de replicación seleccionado de entre pMB1, pBR322, ColE1, R6K (en combinación con un gen pir), p15A, pSC101, F1 y pUC. En un ejemplo, el transposón está en combinación con un factor (por ejemplo, un antibiótico, por ejemplo, tetraciclina) que se requiere para la movilización o transferencia del transposón. En un ejemplo, el transposón comprende un gen de resistencia a antibióticos (por ejemplo, gen de resistencia a tetraciclina) y el transposón está en combinación con dicho antibiótico (por ejemplo, administrado simultáneamente o secuencialmente al ser humano con dicho antibiótico). En un ejemplo, el transposón es un transposón piggyBac, Mariner o Sleeping Beauty en combinación con una transposasa cognada. En un ejemplo, el transposón es un transposón de Clase I. En un ejemplo, el transposón es un transposón de Clase II. En un ejemplo, el transposón es un transposón de la familia Tn.
DIRIGIRSE A LA RESISTENCIA ANTIBIÓTICA EN HOSPEDADORES BACTERIANOS
La resistencia a los antibióticos es un problema mundial. Nuevas formas de resistencia a los antibióticos pueden cruzar fronteras internacionales y extenderse entre continentes con facilidad. Muchas formas de resistencia se propagan con una velocidad notable. Los líderes de la salud mundial han descrito a los microorganismos resistentes a los antibióticos como «bacterias de pesadilla» que «representan una amenaza catastrófica» para las personas en todos los países del mundo. Cada año en los Estados Unidos, al menos 2 millones de personas adquieren infecciones graves con bacterias que son resistentes a uno o más de los antibióticos diseñados para tratar esas infecciones. Al menos 23000 personas mueren cada año como resultado directo de estas infecciones resistentes a los antibióticos. Muchos más mueren por otras afecciones que se complicaron por una infección resistente a los antibióticos. Además, casi 250000 personas cada año requieren atención hospitalaria para infecciones por Clostridium difficile (C. difficile). En la mayoría de estas infecciones, el uso de antibióticos fue un factor importante que condujo a la enfermedad. Al menos 14000 personas mueren cada año en los Estados Unidos por infecciones por C. difficile. Muchas de estas infecciones podrían haberse prevenido. Las infecciones resistentes a los antibióticos agregan costes considerables y evitables a los ya desbordados sistemas de salud de los Estados Unidos y otros sistemas de salud. En la mayoría de los casos, las infecciones resistentes a los antibióticos requieren tratamientos prolongados y/o más costosos, prolongan las estancias en el hospital, requieren visitas adicionales al médico y el uso de la atención médica, y resultan en una mayor discapacidad y muerte en comparación con las infecciones que son fácilmente tratables con antibióticos. El coste económico total de la resistencia a los antibióticos para la economía estadounidense ha sido difícil de calcular. Las estimaciones varían, pero han llegado a ser de hasta 20 mil millones de dólares en costes sanitarios directos excesivos, con costes adicionales para la sociedad por pérdida de productividad de hasta 35 mil millones de dólares al año (en dólares de 2008).
El uso de antibióticos es el factor más importante que conduce a la resistencia a los antibióticos en todo el mundo. Los antibióticos se encuentran entre los medicamentos recetados más comúnmente utilizados en la medicina humana. Sin embargo, hasta el 50 % de todos los antibióticos recetados para las personas no son necesarios o no son óptimamente eficaces según lo prescrito. Los antibióticos también se usan comúnmente en animales de alimentación para prevenir, controlar y tratar enfermedades, y para promover el crecimiento de animales productores de alimentos. El uso de antibióticos para promover el crecimiento no es necesario, y la práctica debe ser eliminada gradualmente. Las directrices recientes de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) describen un camino hacia este objetivo. Es difícil comparar directamente la cantidad de fármacos utilizados en los animales alimentarios con la cantidad utilizada en los seres humanos, pero hay pruebas de que se utilizan más antibióticos en la producción de alimentos.
El otro factor importante en el crecimiento de la resistencia a los antibióticos es la propagación de las cepas resistentes de bacterias de persona a persona, o de las fuentes no humanas en el medio ambiente, incluidos los alimentos. Hay cuatro acciones principales que ayudarán a combatir estas infecciones mortales: 1. prevenir infecciones y prevenir la propagación de la resistencia; 2. rastrear bacterias resistentes; 3. mejorar el uso de los antibióticos actuales; y 4. promover el desarrollo de nuevos antibióticos y desarrollar nuevas pruebas de diagnóstico para bacterias resistentes. Las bacterias inevitablemente encontrarán formas de resistir los antibióticos que desarrollamos, por lo que ahora se necesita una acción agresiva para evitar que se desarrolle una nueva resistencia y para evitar que la resistencia que ya existe se propague.
La invención proporciona medios mejorados para dirigirse a hospedadores resistentes a antibióticos y para reducir la probabilidad de que los hospedadores desarrollen resistencia adicional a las composiciones de la invención.
Otros ejemplos de células hospedadoras y el direccionamiento de la resistencia a los antibióticos en dichas células mediante la presente invención son los siguientes:
en un primer ejemplo, opcionalmente las células hospedadoras son células de Staphylococcus aureus, por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre meticilina, vancomicina, linezolid, daptomicina, quinupristina, dalfopristina y teicoplanina y el sitio diana hospedador (o uno o más de los sitios diana) está comprendido por un gen que confiere resistencia hospedadora a dicho antibiótico.
En un segundo ejemplo, opcionalmente las células hospedadoras son células de Pseudomonas aeuroginosa, por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de cefalosporinas (por ejemplo, ceftazidima), carbapenemas (por ejemplo, imipenem o meropenem), fluoroquinolonas, aminoglucósidos (por ejemplo, gentamicina o tobramicina) y colistina y el sitio diana hospedador (o uno o más de los sitios diana) está comprendido por un gen que confiere resistencia hospedadora a dicho antibiótico.
En un tercer ejemplo, opcionalmente las células hospedadoras son células de Klebsiella (por ejemplo, pneumoniae), por ejemplo, resistentes a carbapenem y el sitio diana hospedador (o uno o más de los sitios diana) está comprendido por un gen que confiere resistencia hospedadora a dicho antibiótico.
En un cuarto ejemplo, opcionalmente las células hospedadoras son células Streptoccocus (por ejemplo, thermophilus, pneumoniae o pyogenes), por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre eritromicina, clindamicina, betalactámico, macrólido, amoxicilina, azitromicina y penicilina y el sitio diana hospedador (o uno o más de los sitios diana) está comprendido por un gen que confiere resistencia hospedadora a dicho antibiótico.
En un quinto ejemplo, opcionalmente las células hospedadoras son células de Salmonella (por ejemplo, serotipo Typhi), por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre ceftriaxona, azitromicina y ciprofloxacina y el sitio diana hospedador (o uno o más de los sitios diana) está comprendido por un gen que confiere resistencia hospedadora a dicho antibiótico.
En un sexto ejemplo, opcionalmente las células hospedadoras son células de Shigella, por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre ciprofloxacina y azitromicina y el sitio diana hospedador (o uno o más de los sitios diana) está comprendido por un gen que confiere resistencia hospedadora a dicho antibiótico.
En un séptimo ejemplo, opcionalmente las células hospedadoras son células de mycobacterium tuberculosis, por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre resistencia a isoniazida (INH), rifampicina (RMP), fluoroquinolona, amikacina, kanamicina y capreomicina y azitromicina y el sitio diana del hospedador (o uno o más de los sitios diana) está comprendido por un gen que confiere resistencia hospedadora a dicho antibiótico.
En un octavo ejemplo, opcionalmente las células hospedadoras son células Enterococcus, por ejemplo, resistentes a la vancomicina y el sitio diana hospedador (o uno o más de los sitios diana) está comprendido por un gen que confiere resistencia hospedadora a dicho antibiótico.
En un noveno ejemplo, opcionalmente las células hospedadoras son células Enterobacteriaceae, por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre cefalosporina y carbapenem y el sitio diana hospedador (o uno o más de los sitios diana) está comprendido por un gen que confiere resistencia hospedadora a dicho antibiótico.
En un décimo ejemplo, opcionalmente las células hospedadoras son células de E. coli, por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre trimetoprima, itrofurantoína, cefalexina y amoxicilina y el sitio diana hospedador (o uno o más de los sitios diana) está comprendido por un gen que confiere resistencia hospedadora a dicho antibiótico.
En un décimo primer ejemplo, opcionalmente las células hospedadoras son células de Clostridium (por ejemplo, dificile), por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre antibiótico de fluoroquinolona y carbapenem y el sitio diana hospedador (o uno o más de los sitios diana) está comprendido por un gen que confiere resistencia hospedadora a dicho antibiótico.
En un décimo segundo ejemplo, opcionalmente las células hospedadoras son células de Neisseria gonnorrhoea por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre cefixima (por ejemplo, una cefalosporina oral), ceftriaxona (una cefalosporina inyectable), azitromicina y tetraciclina y el sitio diana del hospedador (o uno o más de los sitios diana) está comprendido por un gen que confiere resistencia hospedadora a dicho antibiótico.
En un décimo tercer ejemplo, opcionalmente las células hospedadoras son células de Acinetoebacterbaumannii, por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre betalactámico, meropenem y un carbapenem y el sitio diana hospedador (o uno o más de los sitios diana) está comprendido por un gen que confiere resistencia hospedadora a dicho antibiótico.
En un décimo cuarto ejemplo, opcionalmente las células hospedadoras son células Campylobacter, por ejemplo, resistentes a un antibiótico seleccionado de entre ciprofloxacina y azitromicina y el sitio diana hospedador (o uno o más de los sitios diana) está comprendido por un gen que confiere resistencia hospedadora a dicho antibiótico.
En un décimo quinto ejemplo, opcionalmente, la o las células hospedadoras producen Beta (p)-lactamasa.
En un décimo sexto ejemplo, opcionalmente, las células hospedadoras son células hospedadoras bacterianas que son resistentes a un antibiótico mencionado en cualquiera de los ejemplos primero a décimo cuarto.
En una realización, la célula hospedadora es una célula de cepa USA300 de S aureus.
En un ejemplo, la o cada secuencia diana hospedadora está comprendida por un plásmido de la célula hospedadora, por ejemplo, un plásmido de S aureus (por ejemplo, de una cepa USA300), por ejemplo, una diana comprendida por el plásmido pUSA01, pUSA02 o pUSA03 de una célula S aureus. En un ejemplo, la primera y/o segunda diana está comprendida por una secuencia de genes mecA, mecA2 o sekdel hospedador (por ejemplo, de una célula de la cepa de S aureus). En un ejemplo, la primera y/o segunda diana está comprendida por una secuencia de nucleótidos de isla de patogenicidad hospedadora (por ejemplo, ADN). En un ejemplo, un espaciador de la descripción comprende o consiste en un espaciador descrito en la Tabla 1 en la página 26 del documento WO2014/124226, cuyas secuencias espaciadoras se incorporan a esta invención mediante esta referencia. En un ejemplo, la secuencia modificada, ARNcr-HM o ARNg comprende dicho espaciador.
La composición, el uso, el sistema de procedimiento, el vector, la colección, la matriz, la secuencia modificada genéticamente, el virus, el fago, el fagémido, el profago o el virión de la descripción que es eficaz para reducir o destruir o inhibir el crecimiento de un hospedador bacteriano resistente a los antibióticos en un ensayo de colonización de la piel de ratón (por ejemplo, tal como se describe en el documento WO2014/124226, Kugelberg E, y col. Establishment of a superficial skin infection model in mice by using Staphylococcus aureus and Streptococcus pyogenes. Antimicrob Agents Chemother. 2005;49:3435- 3441 o Pastagia M, y col. A novel chimeric lysin shows superiority to mupirocin for skin decolonization of methicillin-resistant and -sensitive Staphylococcus aureus strains. Antimicrob Agents Chemother. 2011 ;55:738-744) en el que la primera y/o segunda diana está comprendida por un gen hospedador que confiere resistencia a dicho antibiótico, por ejemplo, en el que el hospedador es un hospedador S aureus (por ejemplo, cepa USA300).
La secuencia de S pyogenes de referencia está disponible con el número de acceso de Genbank NC_002737 con el gen cas9 en la posición 854757-858863. La secuencia de aminoácidos de S pyogenes Cas9 está disponible con el número NP_269215. Estas secuencias se incorporan en la presente memoria por referencia para su uso en esta invención. Las secuencias adicionales tal como se describen en el documento 20150079680, ya sea explícitamente o incorporadas mediante esta referencia, también se incorporan a la presente memoria mediante esta referencia para su uso en esta invención. También se hace referencia a la descripción de secuencias y procedimientos en el documento WO2013/176772, que se incorpora a la presente memoria por referencia. Las secuencias de ARNtracr ejemplares son las descritas en la página 15 del documento WO2014/124226, que se incorporan a la presente memoria por referencia para su uso en esta invención.
En un ejemplo, la o cada repetición comprende o consiste en de 20 a 50 (por ejemplo, de 24 a 47, por ejemplo, 30, 29, 28, 27, 26, 25 o 24) nucleótidos contiguos de longitud.
En un ejemplo, el o cada espaciador comprende o consiste en de 18 a 50 (por ejemplo, de 24 a 47, o 20 a 40, por ejemplo, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21,20, 19, 18), por ejemplo, 19 o 20 nucleótidos contiguos de longitud.
En un ejemplo, la primera repetición (la mayoría 5' en la matriz HM de la descripción) está inmediatamente en el 5' de una secuencia espaciadora que es complementaria a una secuencia que comprende la primera diana hospedadora. Esto es útil, en vista de la observación de que los espaciadores recién adquiridos (por ejemplo, de la secuencia de fagos invasora) se incorporan comúnmente en esta posición en bacterias, y por lo tanto, el posicionamiento del primer espaciador de la descripción de esta manera es útil para promover su uso.
En un ejemplo, el ácido nucleico del virus (por ejemplo, fago) comprende un origen de replicación (ori) y un sitio de empaque. En un ejemplo, el ácido nucleico del virus también comprende uno, más o todos los genes que codifican proteínas esenciales de la cápside, por ejemplo, los genes rinA, terS y terL. En un ejemplo, uno, más o todos estos están en cambio comprendidos por un virus ayudante de companio (por ejemplo, fago ayudante) que es para la coninfección con el virus de la descripción; esto libera espacio en el último para incluir más ácido nucleico de la matriz HM y/o más ácido nucleico que codifica Cas operativa en el hospedador. En un ejemplo, el ácido nucleico de virus comprende un fragmento de un genoma de fago de tipo salvaje, en el que el fragmento consiste en nucleótidos consecutivos del genoma que comprenden al menos los genes rinA, terS y terL o genes equivalentes que codifican proteínas de fago.
En un ejemplo, la célula hospedadora es de una cepa o especie que se encuentra en la microbiota humana.
En un ejemplo, el o cada sitio diana está comprendido por un gen que media la adhesión patógena del hospedador, la colonización, la invasión, la inhibición de la respuesta inmunitaria, la virulencia, la expresión de la proteína o función esencial o la generación de toxinas. En un ejemplo, el gen es un gen que codifica una citotoxina, alfa-hemolisina, betahemolisina, gamma-hemolisina, leucocidina, lekocidina Panton-Valentine (PVL), exotoxina, TSST-1, enterotoxina, SEA, SEB, SECn, SED, VER, SEG, SEH, SEI, toxina exfoliante, ETA o ETB, opcionalmente en el que el hospedador es S aureus, por ejemplo, MRSA.
En un ejemplo, la o cada matriz de CRISPR es una matriz según cualquiera de las configuraciones, realizaciones, ejemplos, conceptos, aspectos, párrafos o cláusulas descritos en esta invención. En un ejemplo, la secuencia de nucleótidos modificada genéticamente o cada secuencia de nucleótidos modificada genéticamente es una secuencia de nucleótidos modificada genéticamente según cualquiera de las configuraciones, realizaciones, ejemplos, conceptos, aspectos, párrafos o cláusulas descritos en esta invención.
En un ejemplo, el o cada vector es un vector según cualquiera de las configuraciones, realizaciones, ejemplos, conceptos, aspectos, párrafos o cláusulas descritos en esta invención.
En un ejemplo según cualquiera de las configuraciones, realizaciones, ejemplos, aspectos, párrafos o cláusulas descritos en esta invención, el vector o MGE es o comprende un casposón. Los MGE se describen más adelante. En un ejemplo, el casposón es un casposón de familia 1, 2 o 3. En un ejemplo, un MGE de la descripción comprende repeticiones invertidas de terminal de casposón y opcionalmente una secuencia que codifica Cas1 de casposón. En un ejemplo, un MGE de la descripción es o comprende un casposón menos Cas1 y operativo para la movilización con Cas1 de una célula hospedadora. Véase BMC Biol. 19 de mayo de 2014;12:36. doi: 10.1186/1741- 7007-12-36, «Casposons: a new superfamily of self-synthesizing DNA transposons at the origin of prokaryotic CRISPR-Cas immunity», Krupovic M y col. for details of casposons.
EJEMPLOS ADICIONALES DE APLICACIONES DE LA PRESENTE INVENCIÓN
En un ejemplo, la composición (por ejemplo, composición de HM o secuencia modificada en combinación con antibiótico) es como cualquiera de las siguientes opciones: En un ejemplo, la composición es una composición médica, oftálmica, dental o farmacéutica (por ejemplo, comprendida por una vacuna antihospedador). En un ejemplo, la composición es una composición antimicrobiana, por ejemplo, un antibiótico o antiviral, por ejemplo, un medicamento, desinfectante o enjuague bucal. En un ejemplo, la composición es una composición cosmética (por ejemplo, composición de maquillaje facial o corporal). En un ejemplo, la composición es un herbicida. En un ejemplo, la composición es un pesticida (por ejemplo, cuando el hospedador es un hospedador de Bacillus (por ejemplo, thuringiensis)). En un ejemplo, la composición es un aditivo de bebida (por ejemplo, cerveza, vino o bebida alcohólica). En un ejemplo, la composición es un aditivo alimentario (por ejemplo, donde el hospedador es un hospedador de E coli, Salmonella, Listeria o Clostridium (por ejemplo, botulinum)). En un ejemplo, la composición es un aditivo de agua. En un ejemplo, la composición es un aditivo para ambientes animales acuáticos (por ejemplo, en una pecera). En un ejemplo, la composición es una composición de la industria petrolífera o petroquímica o está comprendida en dicha composición (por ejemplo, cuando el hospedador es una bacteria reductora de sulfato, por ejemplo, un hospedador Desulfovibrio). En un ejemplo, la composición es un aditivo petrolífero o petroquímico.
En un ejemplo, la composición es un aditivo químico. En un ejemplo, la composición es un desinfectante (por ejemplo, para esterilizar equipos para uso humano o animal, por ejemplo, para uso quirúrgico o médico, o para la alimentación del bebé). En un ejemplo, la composición es una composición de higiene personal para uso humano o animal.
En un ejemplo, la composición es una composición para uso ambiental, por ejemplo, para el tratamiento del suelo o la descontaminación ambiental (por ejemplo, de aguas residuales o de petróleo, un petroquímico o un químico, por ejemplo, cuando
el hospedador es una bacteria reductora de sulfato, por ejemplo, un hospedador Desulfovibrio). En un ejemplo, la composición es un estimulador del crecimiento vegetal. En un ejemplo, la composición es una composición para su uso en extracción de petróleo, petroquímica, metal o mineral. En un ejemplo, la composición es un tratamiento de tela o aditivo. En un ejemplo, la composición es un tratamiento o aditivo de piel, cuero o ante de animal. En un ejemplo, la composición es un aditivo de colorante. En un ejemplo, la composición es una bebida (por ejemplo, cerveza o vino) que elabora cerveza o aditivo de fermentación (por ejemplo, cuando el hospedador es un hospedador Lactobacillus).
En un ejemplo, la composición es un aditivo de papel. En un ejemplo, la composición es un aditivo de tinta. En un ejemplo, la composición es un aditivo de pegamento. En un ejemplo, la composición es una composición antihumana o parásita animal o vegetal. En un ejemplo, la composición es un aditivo de aire (por ejemplo, para aire en o producido por equipos de acondicionamiento de aire, por ejemplo, donde el hospedador es un hospedador de Legionella). En un ejemplo, la composición es un aditivo anticongelante (por ejemplo, donde el hospedador es un hospedador de Legionella). En un ejemplo, la composición es una composición oftálmica o de lavado de ojos (por ejemplo, un fluido de lente de contacto). En un ejemplo, la composición está comprendida por un alimento lácteo (por ejemplo, la composición está en o es una leche o un producto lácteo; por ejemplo, en el que el hospedador es un hospedador de Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus o Listeria). En un ejemplo, la composición es o está comprendida por un producto de limpieza doméstico o industrial (por ejemplo, donde el hospedador es un hospedador de Ecoli, Salmonella, Listeria o Clostridium (por ejemplo, botulinum)). En un ejemplo, la composición está comprendida por un combustible. En un ejemplo, la composición está comprendida por un solvente (por ejemplo, que no sea agua). En un ejemplo, la composición es un aditivo para hornear (por ejemplo, un aditivo para hornear alimentos). En un ejemplo, la composición es un reactivo de laboratorio (por ejemplo, para el uso en biotecnología o tecnología de ADN o ARN recombinante). En un ejemplo, la composición está comprendida por un agente de retención de fibra. En un ejemplo, la composición es para el uso en un proceso de síntesis de vitaminas. En un ejemplo, la composición es una composición anticultivo o de deterioro de la planta (por ejemplo, cuando el hospedador es una bacteria saprotrófica). En un ejemplo, la composición es un compuesto anticorrosivo, por ejemplo, para prevenir o reducir la corrosión metálica (por ejemplo, cuando el hospedador es una bacteria reductora de sulfato, por ejemplo, un hospedador Desulfovibrio, por ejemplo, para el uso en la reducción o prevención de la corrosión del equipo de extracción, tratamiento o contención de aceite; equipo de extracción, tratamiento o contención de metales; o equipo de extracción, tratamiento o contención de minerales). En un ejemplo, la composición es una composición agrícola o de cultivo o está comprendida en dicha composición. En un ejemplo, la composición es un aditivo de ensilaje. La descripción proporciona una matriz HM-CRISPR, sistema HM-CRISPR/Cas, ARNcr-HM, HM-espaciador, h M-ADN, HM-Cas, composición HM o gARN tal como se describe en esta invención para el uso en cualquiera de las composiciones descritas en este párrafo o para el uso en cualquier aplicación descrita en este párrafo, por ejemplo, en el que la célula hospedadora es una célula mircrobiana o una célula bacteriana o arqueal. La descripción proporciona un procedimiento para cualquier aplicación descrita en este párrafo, en el que el procedimiento comprende combinar una matriz HM-CRISPR, sistema HM-CRISPR/Cas, ARNcr-HM, espaciador HM, HM-ADN, HM-Cas, ARNg o composición HM de la descripción con una célula hospedadora (por ejemplo, célula mircrobiana, bacteriana o arqueal). En una realización, la célula hospedadora no está presente en o sobre un ser humano (o embrión humano) o animal.
Cualquier aspecto de la presente invención es para uso industrial o doméstico, o se utiliza en un procedimiento para dicho uso. Por ejemplo, es para o se utiliza en la agricultura, la industria petrolera o de petróleo, la industria alimentaria o de bebidas, la industria de la confección, la industria del embalaje, la industria electrónica, la industria informática, la industria ambiental, la industria química, la industria del espacio aéreo, la industria automotriz, la industria biotecnológica, la industria médica, la industria de la salud, la industria odontológica, la industria energética, la industria de productos de consumo, la industria farmacéutica, la industria minera, la industria de la limpieza, la industria forestal, la industria pesquera, la industria del ocio, la industria del reciclaje, la industria cosmética, la industria del plástico, la industria de la pulpa o el papel, la industria textil, la industria de la confección, la industria de cuero o ante o la industria de la piel de animales, la industria del tabaco o la industria siderúrgica.
En esta invención, donde se menciona un hospedador Desulfovibrio, el hospedador puede ser en cambio un hospedador Desulfobulbus, Desulfobacter, Desulfobacterium, Desulfococcus, Desulfomonile, Desulfonema, Desulfobotulus o Desulfoarculus o cualquier otra bacteria reductora de azufre descrita en esta invención. En una realización para aplicaciones de petróleo, agua, aguas residuales o ambientales, el hospedador es un hospedador Desulfovibrio capillatus.
El análisis microbiológico extenso y la secuenciación de ARNr 16s han indicado que el género Desulfovibrio es solo uno de aproximadamente ocho grupos diferentes de eubacterias reductoras de sulfato que se pueden aislar del entorno. Siete de estos grupos son gramnegativos, mientras que uno representa la bacteria grampositiva (Desulfotomaculum). El género Desulfovibrio tiene un genoma bastante pequeño. Las estimaciones iniciales fueron 1.7 Mbp y 1.6 Mbp para los genomas de D. vulgaris y D. gigas (que pueden ser hospedadores según la invención), respectivamente. Esto ayuda a la identificación de secuencias diana deseadas (por ejemplo, una secuencia en un gen esencial o de resistencia) para su uso en la invención. La caracterización de un plásmido autóctono de D. desulfuricans (que puede ser un hospedador según la invención) G200 ha permitido la construcción de un vector lanzadera (Wall 1993, cuyo vector se puede usar como un vector según la presente invención), y el aislamiento y caracterización de dos bacteriófagos de D. vulgaris Hildenborough (que puede ser un hospedador según la invención) (Seyedirashti, 1992) puede proporcionar otras formas de manipular genéticamente de manera eficiente Desulfovibrio spp. En un ejemplo, el vector es un bacteriófago mu o similar a mu.
Un hospedador ejemplar es la designación de cepa Desulfovibrio vulgaris subsp. vulgaris Postgate y Campbell (ATCC® 29579™): NCIB 8303 [DSM 644, Hildenborough].
El tratamiento de las bacterias con mitomicina C o UV se ha utilizado previamente para inducir el fago de las bacterias (Driggers & Schmidt), y este es un procedimiento adecuado para obtener fagos adecuados emparejados con el hospedador para generar un vector para el uso en cualquier ejemplo o aspecto de la presente invención.
Una aplicación de la invención es en la industria láctea (por ejemplo, fabricación de queso o mantequilla o productos lácteos) o fermentación (por ejemplo, vino o vinagre o soja) o industria cervecera o panificadora.
Por ejemplo, para la aplicación en la industria láctea, un procedimiento de la descripción es un procedimiento para producir un alimento lácteo, que comprende fermentar un cultivo de bacterias productoras de ácido láctico (por ejemplo, células hospedadoras de Lactobacillus) durante un período de tiempo para producir ácido láctico a partir del cultivo, y posteriormente inhibir el crecimiento de la bacteria al provocar la expresión de ARNcr de uno o más matrices, sistemas, vectores, poblaciones o colecciones de la descripción mezclados con la bacteria, mediante lo cual se reduce o inhibe la producción de ácido láctico por parte de la bacteria. Esto es útil para reducir el deterioro de los alimentos/bebidas o el sabor y/u olor no deseado de los alimentos/bebidas. En un ejemplo, se incluye una matriz HM inducible en las bacterias, en el que el procedimiento comprende agregar un agente inductor después del primer período.
Referencias
Wall, J. D., B. J. Rapp-Giles, and M. Rousset. 1993. «Characterization of a small plasmid from Desulfovibrio desulfuricans and its use for shuttle vector construction». J. Bacteriol. 175:4121 -4128;
Seyedirashti Set al; i Gen Microbiol. 1992 Jul;138(7):1393-7, «Molecular characterization of two bacteriophages isolated from Desulfovibrio vulgaris NCIMB 8303 (Hildenborough)»;
Driggers & Schmidt, J. gen. Virol. (1970), 6, 421-427, «Induction of Defective and Temperate Bacteriophages in Caulobacter».
CONCEPTOS:
Alteración de la proporción relativa de subpoblaciones de la primera y segunda bacteria en una población mixta de Bacterias, por ejemplo, en Microbiota
En un primer concepto, se proporciona el uso de un sistema CRISPR/Cas modificador de hospedador (HM) para alterar la relación relativa de subpoblaciones de la primera y segunda bacteria en una población mixta de bacterias, donde la segunda bacteria comprende células hospedadoras,
y para cada célula hospedadora, el sistema comprende componentes según (i) a (iv):
(i) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas;
(ii) una secuencia diana de célula hospedadora y una matriz de CRISPR de modificación de hospedador (HM) modificada genéticamente que comprende una secuencia espaciadora (HM-espaciador) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, donde el ARNcr-HM comprende una secuencia que se hibrida con la secuencia diana de la célula hospedadora para guiar dicha Cas a la diana en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana;
(iii) una secuencia de ARNtracr opcional o una secuencia de ADN que expresa una secuencia de ARNtracr;
(iv) en el que dichos componentes del sistema se dividen entre la célula hospedadora y al menos un vector de ácido nucleico que transforma la célula hospedadora, mediante lo cual el ARNcr-HM guía a Cas a la diana para modificar el sistema CRISPR/Cas hospedador en la célula hospedadora; y
en el que la secuencia diana se modifica mediante Cas mediante la cual se destruye la célula hospedadora o se reduce el crecimiento de la célula hospedadora.
Un segundo concepto se refiere a un sistema CRISPR/Cas de modificación de hospedador (HM) para el uso del primer concepto para modificar una secuencia de nucleótidos diana de una célula hospedadora bacteriana, donde el sistema comprende componentes según (i) a (iv):
(i) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas;
(ii) una secuencia diana de célula hospedadora y una matriz de CRISPR de modificación de hospedador (HM) modificada genéticamente que comprende una secuencia espaciadora (HM-espaciador) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, donde el ARNcr-HM comprende una secuencia capaz de hibridarse con la secuencia diana de la célula hospedadora para guiar dicha Cas a la diana en la célula hospedadora para modificar la secuencia diana;
(iii) una secuencia de ARNtracr opcional o una secuencia de ADN para expresar una secuencia de ARNtracr;
(iv) en el que dichos componentes del sistema se dividen entre la célula hospedadora y al menos un vector de ácido nucleico que puede transformar la célula hospedadora, mediante lo cual el ARNcr-HM guía a Cas a la diana para modificar el sistema CRISPR/Cas hospedador en la célula hospedadora.
Un tercer concepto se refiere al sistema del segundo concepto, en el que el vector o vectores carecen de una secuencia que codifica la nucleasa Cas (por ejemplo, una Cas9).
Un cuarto concepto se refiere al uso o sistema de cualquier concepto precedente, en el que cada célula hospedadora es de una cepa o especie que se encuentra en la microbiota humana.
Un quinto concepto se refiere al uso del primer al cuarto concepto para (a) la alteración de la proporción de bacterias Bacteroidetes en una población bacteriana mixta; (b) reducir la proporción de una subpoblación Firmicutes (células hospedadoras) en una población bacteriana mixta; (c) reducir la proporción de una primera especie Firmicutes (células hospedadoras) en una población mixta, en el que la población mixta comprende una segunda especie Firmicutes cuyo crecimiento no es inhibido por dicho ARNc; (d) reducir la proporción de una primera especie bacteriana grampositiva (células hospedadoras) en una población bacteriana mixta, en el que la población mixta comprende una segunda especie bacteriana grampositiva cuyo crecimiento no es inhibido por dicho ARNc; (e) reducir la proporción de una especie bacteriana (células hospedadoras) en una población bacteriana mixta, en la que la población mixta comprende una especie bacteriana diferente cuyo crecimiento no es inhibido por dicho ARNc, en la que la primera especie tiene una secuencia de ADN que codifica ARN ribosómico 16s que es al menos en un 80, 82, 83, 84, 85, 90 o 95 % idéntica a una secuencia ribosómica 16s de ADN que codifica ARN de la otra especie; (f) reducir la proporción de una primera especie de microbiota intestinal humana bacteriana (células hospedadoras, por ejemplo, una Firmicutes) en una población bacteriana mixta, en la que la población mixta comprende una especie bacteriana diferente, en la que la especie diferente es una especie probiótica intestinal humana cuyo crecimiento no es inhibido por dicho ARNc; o (g) reducir la proporción de una especie de microbiota intestinal humana bacteriana ((células hospedadoras, por ejemplo, una Firmicutes) en una población bacteriana mixta, en el que la población mixta comprende una especie bacteriana diferente, en el que la especie diferente es una especie comensal intestinal humana cuyo crecimiento no es inhibido por dicho ARNc.
Un sexto concepto se refiere al sistema del segundo o tercer concepto para (a) la alteración de la proporción de bacterias Bacteroidetes en una población bacteriana mixta; (b) reducir la proporción de una subpoblación Firmicutes (células hospedadoras) en una población bacteriana mixta; (c) reducir la proporción de una primera especie Firmicutes (células hospedadoras) en una población mixta, en el que la población mixta comprende una segunda especie Firmicutes cuyo crecimiento no es inhibido por dicho ARNc; (d) reducir la proporción de una primera bacteria grampositiva especie (células hospedadoras) en una población bacteriana mixta, en el que la población mixta comprende una segunda especie bacteriana grampositiva cuyo crecimiento no es inhibido por dicho ARNc; (e) reducir la proporción de una especie bacteriana (células hospedadoras) en una población bacteriana mixta, en el que la población mixta comprende una especie bacteriana diferente cuyo crecimiento no es inhibido por dicho ARNc, en el que la primera especie tiene una secuencia de ADN que codifica para ARN ribosómico 16s que es al menos en un 80, 82, 83, 84, 85, 90 o 95 % idéntica a una secuencia ribosómica 16s secuencia de ADN que codifica ARN de las otras especies; (f) reducir la proporción de una primera especie de microbiota intestinal humana bacteriana (células hospedadoras, por ejemplo, una Firmicutes) en una población bacteriana mixta, en el que la población mixta comprende una especie bacteriana diferente, en el que la diferente especie es una especie probiótica intestinal humana cuyo crecimiento no es inhibido por dicho ARNc; o (g) reducir la proporción de una especie de microbiota intestinal humana bacteriana (células hospedadoras, por ejemplo, una Firmicutes) en una población bacteriana mixta, en el que la población mixta comprende una especie bacteriana diferente, en el que la diferente especie es una especie comensal intestinal humana cuyo crecimiento no se inhibe por dicho ARNc; en el que (a) a (g) son para tratar o prevenir en un sujeto humano o animal (i) una infección de microbiota por dicha especie bacteriana cuya proporción se reduce; o (ii) una enfermedad o afección mediada por dicha especie bacteriana cuya proporción se reduce.
Un séptimo concepto se refiere al uso o sistema del quinto o sexto concepto para aumentar la relación relativa de Bacteroidetes frente a Firmicutes.
Un octavo concepto se refiere al uso o sistema de cualquier concepto precedente, en el que dicha nucleasa Cas es proporcionada por un sistema CRISPR/Cas tipo II endógeno de la célula.
Un noveno concepto se refiere al uso o sistema de cualquier concepto precedente, en el que el componente (i) es endógeno a la célula hospedadora.
Un décimo concepto se refiere al uso o sistema de cualquier concepto anterior, en el que la secuencia diana está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos, un gen de virulencia o un gen esencial de la célula hospedadora.
Un décimo primer concepto se refiere al uso o sistema de cualquier concepto anterior, en el que la secuencia diana es una secuencia cromosómica hospedadora.
Un décimo segundo concepto se refiere al uso o sistema de cualquier concepto anterior, en el que alternativamente ARNcr-HM y ARNtracr están comprendidos por un único ARN guía (ARNg), por ejemplo, proporcionado por el vector. Un décimo tercer concepto se refiere al uso o sistema de cualquier concepto anterior, en el que la célula hospedadora comprende una cadena de ácido desoxirribonucleico con un extremo libre (ADNHM) que codifica una secuencia HM de interés y/o en el que el sistema comprende una secuencia que codifica el ADN-HM, en el que el ADN-HM comprende una secuencia o secuencias que son homólogas respectivamente a una secuencia o secuencias en o que flanquean la secuencia diana para insertar el ADN-HM en el genoma hospedador (por ejemplo, en un sitio cromosómico o episómico).
Un décimo cuarto concepto se refiere a un vector de ácido nucleico modificado genéticamente para el uso del primer concepto para modificar una célula hospedadora bacteriana que comprende un sistema CRISPR/Cas endógeno, el vector
(g) comprende secuencias de ácido nucleico para expresar una pluralidad de ARNcr diferentes (por ejemplo, comprendidos por ARNg) para su uso en un sistema CRISPR/Cas o su uso según cualquier concepto anterior; y (h) carece opcionalmente de una secuencia de ácido nucleico que codifique una nucleasa Cas, en la que uno de dichos ARNcr es capaz de hibridarse con una primera secuencia de ácido nucleico en dicha célula hospedadora; y un segundo de dichos ARNcr es capaz de hibridarse con una segunda secuencia de ácido nucleico en dicha célula hospedadora, en el que dicha segunda secuencia es diferente de dicha primera secuencia; y
(i) la primera secuencia está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos (o ARN del mismo) y la segunda está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos (o ARN del mismo; opcionalmente en el que los genes son diferentes;
(j) la primera secuencia está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen esencial o de virulencia (o ARN del mismo);
(k) la primera secuencia está comprendida por un gen esencial (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen esencial o de virulencia (o ARN del mismo); o
(l) la primera secuencia está comprendida por un gen de virulencia (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen esencial o de virulencia (o ARN del mismo).
Un décimo quinto concepto se refiere al vector del décimo cuarto concepto dentro de una célula hospedadora que comprende una o más Cas que son operativos con ARNc (por ejemplo, ARN guía simple) codificado por el vector. Un décimo sexto concepto se refiere al uso, sistema o vector de cualquier concepto precedente, en el que la matriz HM-CRISPR comprende múltiples copias del mismo espaciador.
Un décimo séptimo concepto se refiere al uso, sistema o vector de cualquier concepto anterior, en el que el o los vectores comprenden una pluralidad de matrices HM-CRISPR.
Un décimo octavo concepto se refiere al uso, sistema o vector de cualquier concepto anterior, en el que cada vector es un virus o fago.
Un décimo noveno concepto se refiere al uso, sistema o vector de cualquier concepto anterior, en el que el sistema o vector comprende dos, tres o más copias de secuencias de ácido nucleico que codifican ARNcr (por ejemplo, ARNg), en el que las copias comprenden la misma secuencia espaciadora para dirigirse a una secuencia de célula hospedadora (por ejemplo, una virulencia, resistencia o secuencia génica esencial).
Un vigésimo concepto se refiere al uso, sistema o vector del décimo noveno concepto, en el que las copias se dividen entre dos o más matrices de CRISPR vectoriales.
Un vigésimo primer concepto se refiere a una célula hospedadora bacteriana que comprende un sistema o vector mencionado en cualquier concepto anterior.
Un concepto de veinte segundos se refiere al uso, sistema, vector o célula de cualquier concepto anterior, en el que la matriz está en combinación con un agente antibiótico; o el uso que comprende exponer las células hospedadoras a un primer antibiótico, en el que la secuencia diana está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos para la resistencia a dicho primer antibiótico.
Un vigésimo tercer concepto se refiere al uso, sistema, vector o célula de cualquier concepto anterior, en el que la célula hospedadora es una célula hospedadora Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Salmonella, Listeria, E coli, Desulfovibrio o Clostridium.
Un vigésimo cuarto concepto se refiere al uso, sistema o célula de cualquiera de los conceptos primero a décimo tercero o décimo sexto o vigésimo tercero, en el que cada vector es según el concepto décimo cuarto o décimo quinto.
Un vigésimo quinto concepto se refiere al uso, sistema, vector o célula de cualquier concepto anterior, en el que el crecimiento de la población de células hospedadoras se reduce en al menos 5 veces en comparación con el crecimiento de una población de dichas células hospedadoras no transformadas con dicha matriz HM o una secuencia de nucleótidos que codifica dicho ARNg.
Un vigésimo sexto concepto se refiere al uso, sistema, vector o célula de cualquier concepto anterior, en el que se inhibe el crecimiento de la población de células hospedadoras en una superficie. En un ejemplo, la población está en contacto con una superficie de tejido humano (por ejemplo, una superficie de tejido intestinal, por ejemplo, in vivo o ex vivo).
Un vigésimo séptimo concepto se refiere al uso, sistema, vector o célula de cualquier concepto anterior, en el que las primeras bacterias son probióticas, comensales o simbióticas con humanos (por ejemplo, en el intestino humano).
Un vigésimo octavo concepto se refiere al uso, sistema, vector o célula de cualquier concepto anterior, en el que la primera y segunda bacteria son Firmicutes y son bacterias de diferentes especies o cepas; o en el que la primera bacteria es Enterobacteriaceae y la segunda bacteria es Firmicutes.
Un vigésimo noveno concepto se refiere al uso, sistema, vector o célula de cualquier concepto anterior, en el que las células hospedadoras son células arqueales en lugar de células bacterianas o cada población es una población arqueal en lugar de una población bacteriana.
Un trigésimo concepto se refiere al uso de cualquiera de los conceptos primero, cuarto, quinto, séptimo a décimo tercero, décimo sexto a vigésimo y vigésimo segundo a vigésimo noveno para tratar un fluido, superficie, aparato o recipiente médico industrial o ex vivo; o para tratar una vía fluvial, agua, una bebida, un producto alimenticio o un cosmético, en el que las células hospedadoras están comprendidas por o sobre el fluido, superficie, aparato, recipiente, vía fluvial, agua, bebida, producto alimenticio o cosmético.
Un trigésimo primer concepto se refiere al uso, sistema, vector o célula de cualquier concepto anterior, en el que el ARNcHM o ARNg comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con una secuencia protoespaciadora diana de célula hospedadora que es un motivo adyacente a un protoespaciador NNAGAAW o NGGNG adyacente (PAM).
Un trigésimo segundo concepto se refiere a un vector de ácido nucleico según, o para el uso en, el uso, sistema o célula de cualquier concepto anterior, y el vector comprende más de 1,4 kb de secuencia de ADN exógeno, en el que el ADN exógeno codifica uno o más componentes de un sistema CRISPR/Cas y comprende una matriz modificada genéticamente para expresar ARNcr-HM o ARNg en células hospedadoras, en el que la secuencia exógena está desprovista de una secuencia de nucleótidos que codifica una nucleasa Cas que es cognada con los ARNc o ARNg; en el que al menos 2 ARNc o ARNg diferentes están codificados por el ADN exógeno (por ejemplo, por al menos 2 matrices HM- CRISPR).
Un trigésimo tercer concepto se refiere al vector del trigésimo segundo concepto, en el que el vector es un vector viral capaz de transformar las células hospedadoras.
Un trigésimo cuarto concepto se refiere al vector del concepto de trigésimo segundo a trigésimo tercero, en el que los ARNc o ARNg son capaces de hibridarse en células hospedadoras con secuencias protoespaciadoras diana respectivas, en el que cada secuencia protoespaciadora está comprendida por una resistencia a antibióticos o un gen hospedador esencial.
Un trigésimo quinto concepto se refiere al vector de cualquiera de los conceptos trigésimo cuarto a trigésimo sexto, en el que las células hospedadoras son células de una especie de microbiota humana.
CARACTERIZACIONES:
Aprovechamiento de Cas endógenas de tipo salvaje para la inhibición del crecimiento de la población y el tratamiento de bacterias en superficies
En una primera caracterización, se proporciona el uso de la actividad de nucleasa Cas endógena de tipo salvaje de una población de células hospedadoras bacterianas para inhibir el crecimiento de la población, en el que la población comprende una pluralidad de células hospedadoras y cada célula hospedadora tiene un sistema CRISPR/Cas endógeno que tiene actividad de nucleasa Cas de tipo salvaje, y el uso comprende transformar células hospedadoras de la población, en el que cada célula hospedadora transformada se transforma con una secuencia de nucleótidos modificada genéticamente para proporcionar ARNc modificador del hospedador (HM) o ARN guía (ARNg) en la célula hospedadora, y el ARNc-HM o ARNg comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con una secuencia protoespaciadora diana de la célula hospedadora para guiar Cas endógeno a la diana, en el que el ARNc o ARNg es cognado con una nucleasa Cas endógena de la célula hospedadora que tiene dicha actividad de nucleasa de tipo salvaje y se inhibe tras dicha transformación del crecimiento de células hospedadoras de la población.
Las células hospedadoras pueden ser de la misma especie o cepa.
Una segunda caracterización se refiere al uso de la primera caracterización, en el que la inhibición del crecimiento de la población de células hospedadoras es una reducción en el crecimiento de al menos 5 veces en comparación con el crecimiento de una población de dichas células hospedadoras no transformadas con dicha secuencia de nucleótidos modificada genéticamente.
Una tercera caracterización se refiere al uso de la primera caracterización, en el que se inhibe el crecimiento de la población en una superficie.
Una cuarta caracterización se refiere al uso de la segunda caracterización, en el que se inhibe el crecimiento de la población en una superficie.
Una quinta caracterización se refiere al uso de la primera caracterización, dicha inhibición comprende el uso de un sistema HM-CRISPR/Cas para destruir o reducir el crecimiento de dichas células hospedadoras, para cada célula hospedadora el sistema comprende componentes según (i) a (iv):
(i) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha nucleasa Cas;
(ii) una matriz de HM-CRISPR modificadora de hospedador modificado genéticamente que comprende una secuencia espaciadora (HM-espaciador) y repeticiones que codifican dicho ARNcr-HM;
(iii) una secuencia de ARNtracr opcional o una secuencia de ADN que expresa una secuencia de ARNtracr;
(iv) en el que dichos componentes del sistema se dividen entre la célula hospedadora y al menos un vector de ácido nucleico que transforma la célula hospedadora, mediante lo cual el ARNcr-HM guía dicha Cas a la diana para modificar la secuencia diana;
en el que la secuencia diana se modifica en células hospedadoras mediante Cas mediante la cual se destruyen las células hospedadoras o se reduce el crecimiento de las células hospedadoras.
Una sexta caracterización se refiere al uso de cualquier caracterización anterior, para alterar la relación relativa de subpoblaciones de la primera y la segunda bacteria en una población mixta de bacterias, donde la segunda bacteria comprende dichas células hospedadoras.
Una séptima caracterización se refiere al uso de la sexta caracterización, en el que las células hospedadoras son de una cepa o especie que se encuentra en la microbiota humana.
Una octava caracterización se refiere al uso de la sexta o séptima caracterización, en el que las células hospedadoras se mezclan con células de una cepa o especie diferente, en el que las diferentes células son Enterobacteriaceae o bacterias que son probióticas, comensales o simbióticas con humanos (por ejemplo, en el intestino humano).
Una novena caracterización se refiere al uso de cualquier caracterización anterior para la alteración de la proporción de bacterias Bacteroidetes en una población bacteriana mixta que comprende bacterias Bacteroidetes y otras bacterias, opcionalmente para aumentar la relación relativa de Bacteroidetes frente a una, más o todas las especies de Firmicutes (por ejemplo, frente a Streptococcus) en la población.
Una décima caracterización se refiere al uso de cualquier caracterización anterior para alterar la relación relativa de la primera bacteria con respecto a la segunda bacteria en una población mixta, en el que la primera y la segunda bacteria son Firmicutes y son bacterias de diferentes especies o cepas, la segunda bacteria comprende células hospedadoras. En un ejemplo, el uso aumenta la proporción de la primera a la segunda bacteria. Una décima primera caracterización se refiere al uso de la primera caracterización, en el que la secuencia de nucleótidos modificada genéticamente no está en combinación con una secuencia que codifica la nucleasa Cas exógena.
Una décima segunda caracterización se refiere al uso de la quinta caracterización, en el que el vector o vectores carecen de una secuencia que codifique la nucleasa Cas.
Una décima tercera caracterización se refiere al uso de la primera caracterización, en el que cada célula hospedadora es de una cepa o especie que se encuentra en la microbiota humana.
Una décima cuarta caracterización se refiere al uso de la sexta caracterización, en el que cada célula hospedadora es de una cepa o especie que se encuentra en la microbiota humana.
Una décima quinta caracterización se refiere al uso de la décima tercera caracterización, en el que cada célula hospedadora se mezcla con células de una cepa o especie diferente, en el que las diferentes células son Enterobacteriaceae o bacterias que son probióticas, comensales o simbióticas con humanos (por ejemplo, en el intestino humano).
Una décima sexta caracterización se refiere al uso de la primera caracterización, en el que el uso altera la proporción de bacterias Bacteroidetes en una población bacteriana mixta que comprende bacterias Bacteroidetes y otras bacterias, opcionalmente en el que el uso altera la relación relativa de Bacteroidetes frente a una, más o todas las especies Firmicutes (por ejemplo, Streptococcus) en la población.
Una décima séptima caracterización se refiere al uso de la primera caracterización, en el que la primera y la segunda bacteria son Firmicutes y el uso altera la relación relativa de la primera frente a la segunda bacteria en la población mixta. En un ejemplo, el uso aumenta la proporción de la primera a la segunda bacteria.
Una décima octava caracterización se refiere al uso de la primera caracterización, en el que dicha nucleasa Cas es proporcionada por un sistema CRISPR/Cas endógeno de célula hospedadora tipo II y/o el ARNc-HM o ARNg comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con una secuencia protoespaciadora diana de la célula hospedadora que es un motivo adyacente al protoespaciador 5'-NNAGAAW-3' (PAM).
Una décima novena caracterización se refiere al uso de la quinta caracterización, en el que dicha nucleasa Cas es proporcionada por un sistema CRISPR/Cas endógeno de célula hospedadora tipo II.
Una vigésima caracterización se refiere al uso de la quinta caracterización, en el que el componente (iii) es endógeno a la célula hospedadora.
Una vigésima primera caracterización se refiere al uso de la quinta caracterización, en el que cada célula hospedadora transformada comprende una RNasa III endógena que es operativa con el componente (ii) en la producción de dicho ARNcr-HM en la célula.
Una vigésima segunda caracterización se refiere al uso de la primera caracterización, en el que la secuencia diana está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos, un gen de virulencia o un gen esencial de la célula hospedadora. Una vigésima tercera caracterización se refiere al uso de la primera caracterización, en el que la secuencia de nucleótidos modificada está en combinación con un agente antibiótico.
Una vigésima cuarta caracterización se refiere al uso de la quinta caracterización, en el que el ARNcr-HM y el ARNtracr están comprendidos por un único ARN guía (ARNg).
Una vigésima quinta caracterización se refiere al uso de la primera caracterización, en el que las células hospedadoras transformadas comprenden cada una una cadena de ácido desoxirribonucleico con un extremo libre (ADNHM) que codifica una secuencia HM de interés, en el que el ADN-HM comprende una secuencia o secuencias que son homólogas respectivamente a una secuencia o secuencias en o que flanquean la secuencia diana para insertar el ADN-HM en el genoma hospedador, en el que las secuencias del ADN-HM se insertan en los genomas de células hospedadoras.
Una vigésima sexta caracterización se refiere al uso de la primera caracterización, que comprende expresar en células hospedadoras una pluralidad de ARNcr diferentes (o ARNg) para hibridarse con secuencias diana protoespaciadoras de células hospedadoras; en el que un primer ARNcr (o ARNg) es capaz de hibridarse con una primera secuencia de ácido nucleico protoespaciador; y un segundo ARNcr (o ARNg) es capaz de hibridarse con una segunda secuencia de ácido nucleico protoespaciador, en el que dicha segunda secuencia es diferente de dicha primera secuencia; y
(a) la primera secuencia está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos (o ARN de del mismo); opcionalmente en el que los genes son diferentes;
(b) la primera secuencia está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen esencial o de virulencia (o ARN del mismo);
(c) la primera secuencia está comprendida por un gen esencial (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen esencial o de virulencia (o ARN del mismo); o
(d) la primera secuencia está comprendida por un gen de virulencia (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen esencial o de virulencia (o ARN del mismo).
Una décima séptima caracterización se refiere al uso de la sexta caracterización, en el que las células hospedadoras están comprendidas por una población bacteriana mixta comprendida por un sujeto humano o animal y el uso (i) trata en el sujeto una infección por dichas células hospedadoras comprendidas por la población mixta; (ii) trata o reduce el riesgo en el sujeto de una afección o enfermedad mediada por dichas células hospedadoras; (iii) reduce el olor corporal del ser humano que es causado o mediado por dichas células hospedadoras; o (iv) es un tratamiento de higiene personal del ser humano.
Una vigésimo octava caracterización se refiere al uso de la primera caracterización, en el que el uso trata o reduce el riesgo de una infección por dichas células hospedadoras en un sujeto humano o animal, en el que las células hospedadoras comprenden cada una un gen de resistencia a antibióticos (para resistencia a un primer antibiótico) que comprende dicha secuencia protoespaciadora diana, en la que el uso comprende administrar la secuencia de nucleótidos modificada genéticamente y el primer antibiótico al sujeto, en el que la infección se reduce o se previene en el sujeto.
Una vigésima novena caracterización se refiere al uso de la primera caracterización, en el que cada secuencia de nucleótidos modificada comprende además un gen de resistencia a antibióticos, en el que el ARNcr-HM o ARNg no se dirige al gen de resistencia a antibióticos y el uso comprende exponer la población a dicho antibiótico y una pluralidad de dichas secuencias modificadas, promoviendo así el mantenimiento de secuencias que codifican ARNcr-HM o ARNg en células hospedadoras.
Una trigésima caracterización se refiere al uso de la primera caracterización, en el que las células hospedadoras son células grampositivas o células de Streptococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Salmonella, Listeria, E coli, Desulfovibrio, V cholerae o Clostridium.
Una trigésima primera caracterización se refiere al uso de la primera caracterización para tratar un fluido, superficie, aparato o recipiente industrial o médico; o para tratar una vía fluvial, agua, una bebida, un producto alimenticio o un cosmético, en el que las células hospedadoras están comprendidas por o sobre el fluido, superficie, aparato, recipiente, vía fluvial, agua, bebida, producto alimenticio o cosmético, y en el que el crecimiento de la población de células hospedadoras se inhibe mediante lo cual se lleva a cabo dicho tratamiento.
Como alternativa, cualquier caracterización depende de cualquier caracterización anterior.
ASPECTOS:
Transferencia horizontal entre células portadoras y hospedadoras en poblaciones mixtas
En un primer aspecto, se proporciona un procedimiento para producir una población bacteriana mixta que comprende bacterias portadoras, en el que la población comprende una primera y una segunda subpoblación de una primera y una segunda bacteria, respectivamente, en el que las subpoblaciones son bacterias de una primera y una segunda especie que son diferentes entre sí y la segunda bacteria comprende una pluralidad de células hospedadoras, en el que la bacteria portadora es una primera célula bacteriana y cada una comprende una secuencia de nucleótidos modificada genéticamente para proporcionar ARNc o ARN guía (ARNg) de modificación de células hospedadoras en las células hospedadoras, en el que el ARNc o ARNg de HM comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con una secuencia protoespaciadora de células hospedadoras para guiar una primera nucleasa Cas a la diana para modificar la diana, en el que la bacteria portadora no comprende la secuencia diana, en el que el procedimiento comprende
a. proporcionar una pluralidad de ácidos nucleicos, cada uno comprende una secuencia de nucleótidos modificada genéticamente;
b. combinar dicha pluralidad de ácidos nucleicos con una primera población mixta que comprende una primera y una segunda subpoblación de la primera y la segunda especie bacteriana respectivamente, donde la segunda subpoblación comprende células hospedadoras;
c. permitir que los ácidos nucleicos transformen células de dicha primera subpoblación en presencia de las células hospedadoras, produciendo así una segunda población mixta que comprende dichas células portadoras y dichas células hospedadoras, en el que dicha secuencia de nucleótidos modificada genéticamente comprendida por células portadoras tiene capacidad de transferencia horizontal a células hospedadoras para transformar células hospedadoras para la producción de dicho ARNcHM o ARNg en células hospedadoras transformadas.
Un segundo aspecto se refiere al procedimiento del primer aspecto, que comprende además obtener la segunda población mixta.
Un tercer aspecto se refiere al procedimiento del primer aspecto, que comprende además aislar una pluralidad de células portadoras de la segunda población mixta.
Un cuarto aspecto se refiere al procedimiento del primer aspecto, que comprende además producir dicho ARNcHM o ARNg en las células hospedadoras transformadas, en el que dicha secuencia de ARNcHM o ARNg se hibrida con la secuencia protoespaciadora diana en dichas células hospedadoras transformadas y guía la primera nucleasa Cas hacia la diana, modificando así la diana con la primera nucleasa Cas.
Un quinto aspecto se refiere al procedimiento del cuarto aspecto, que comprende además obtener células hospedadoras que comprenden dicha modificación diana (por ejemplo, en el que las células hospedadoras están comprendidas por una población mixta que comprende dicha primera especie bacteriana).
Un sexto aspecto se refiere al procedimiento del primer aspecto, en el que el ARNc o ARNg es cognado con una nucleasa Cas endógena de las células hospedadoras, en el que la nucleasa es dicha primera nucleasa Cas.
Un séptimo aspecto se refiere al procedimiento del primer aspecto, en el que el ARNc o ARNg es cognado con una nucleasa Cas endógena de las células portadoras, en el que la nucleasa es dicha primera nucleasa Cas.
Un octavo aspecto se refiere al procedimiento del séptimo aspecto, en el que la nucleasa tiene actividad de nucleasa de tipo salvaje.
Un noveno aspecto se refiere al procedimiento del primer, sexto, séptimo u octavo aspecto, en el que la primera nucleasa Cas es una Cas9.
Un décimo aspecto se refiere al procedimiento de un noveno aspecto, en el que la Cas9 es una Cas9 de Streptococcus.
Un décimo primer aspecto se refiere al procedimiento del primer aspecto, en el que cada secuencia de nucleótidos modificada está comprendida por un vector de ácido nucleico respectivo, en el que los vectores son capaces de transferencia horizontal entre el portador y las células hospedadoras.
Un décimo segundo aspecto se refiere al procedimiento del primer al décimo primer aspecto, en el que cada secuencia modificada está comprendida por un elemento genético móvil respectivo, por ejemplo, un transposón o plásmido.
Un décimo tercer aspecto se refiere al procedimiento del primer aspecto, en el que después de dicha transformación de células hospedadoras, se inhibe el crecimiento de la subpoblación de células hospedadoras.
Un décimo cuarto aspecto se refiere al procedimiento del décimo tercer aspecto, en el que la inhibición del crecimiento de la población de células hospedadoras es al menos 5 veces mayor en comparación con el crecimiento de una población de dichas células hospedadoras no transformadas con dicha secuencia de nucleótidos modificada.
Un décimo quinto aspecto se refiere al procedimiento del aspecto décimo tercero o décimo cuarto, en el que se inhibe el crecimiento de la población de células hospedadoras en una superficie.
En una alternativa, cualquier aspecto es dependiente de cualquier aspecto precedente.
En un ejemplo, el procedimiento es un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad o afección en un sujeto humano, animal o vegetal, por ejemplo, como se describe en la presente memoria, en el que el procedimiento afecta dicho tratamiento o prevención. La descripción proporciona una población bacteriana mixta obtenida u obtenible mediante el procedimiento para dicho procedimiento de tratamiento o prevención.
En un ejemplo, el procedimiento se lleva a cabo en una población bacteriana mixta de un entorno, equipo, aparato, recipiente, vía fluvial, agua, fluido, alimento, bebida, microbiota, microbioma o cosmético, por ejemplo, tal como se describe en la presente memoria, en el que el procedimiento reduce la proporción de células hospedadoras en comparación con las primeras células.
En un ejemplo, el producto del procedimiento es para la administración al intestino de un animal humano o no humano para tratar o prevenir la obesidad, diabetes o IBD del ser humano o animal.
En un ejemplo, la primera y la segunda especie son especies de bacterias comensales o simbióticas intestinales humanas o no humanas.
El producto del procedimiento es útil, ya que se puede administrar (por ejemplo, intranasalmente) a un ser humano o animal de modo que las bacterias pueblen uno o más microbiomas (por ejemplo, microbioma intestinal) del ser humano o animal. Las primeras células actúan como portadoras, especialmente cuando esas células no son patógenas para el ser humano o el animal (por ejemplo, no patógenas en el microbioma intestinal). El microbioma puede ser cualquier otra población de microbioma o micribiota descrita en esta invención.
En un ejemplo, la primera segunda especie bacteriana es capaz de poblar la microbiota intestinal de un animal humano o no humano, y las primeras bacterias son comensales o simbióticas con humanos o animales. De manera útil, las primeras bacterias se pueden administrar de forma segura al ser humano o animal y pueden actuar como un portador para la transferencia de secuencias modificadas posteriormente a células hospedadoras de la microbiota.
En un ejemplo, la secuencia modificada está comprendida por cualquier matriz o vector descrito en esta invención.
En un ejemplo, el procedimiento utiliza cualquier sistema CRISPR/Cas descrito en esta invención.
En un ejemplo, la primera célula es una célula Bacteroidetes (por ejemplo, Bacteroidales o Bacteroides); Lactobacillus (por ejemplo, acidophilus (por ejemplo, La-5, La-14 o NCFM), brevis, bulgaricus, plantarum, rhammosus, fermentum, caucasicus, helveticus, lactis, reuterio casei, por ejemplo, caseiShirota); Bifidobacterium (por ejemplo, bifidum, breve, longum o infantis); Streptococcus thermophiles; Enterococcus faecium; Alistipes; Alkaliflexus; Parabacteroides; Tannerella; E coli; o célula Xylanibacter.
En un ejemplo, las células hospedadoras son de una especie de microbiota humana y las células portadoras son células de una especie que no es patógena en dicha microbiota humana, en el que la secuencia diana no está comprendida por el genoma de las células portadoras, la secuencia modificada está comprendida por un MGE que comprende un oriT que es operable en las células portadoras y hospedadoras, en el que el MGE tiene capacidad de transferencia horizontal de la célula portadora a la célula hospedadora. En un ejemplo, la secuencia modificada, MGE o vector está comprendido por un bacteriófago, el bacteriófago es capaz de infectar las primeras células (portadoras) para introducir el MGE en las primeras células (portadoras). A partir de entonces, el MGE tiene capacidad de transferencia horizontal a las células hospedadoras.
En un ejemplo, las primeras células son Bacteroidetes o células Prevotella; opcionalmente en el que el MGE tiene capacidad de transferencia horizontal de la primera especie celular a especies Firmicutes (células hospedadoras) de dicha microbiota humana. Este último es útil, por ejemplo, para tratar o prevenir la obesidad en un ser humano cuando la secuencia objetivo está comprendida por los Firmicutes, pero no las primeras células (portadoras).
OTROS EJEMPLOS
EJEMPLO 1: Tratamiento ambiental o descontaminación Industria petrolera, metalúrgica y mineral
En una realización, la célula hospedadora se encuentra en una mina o campo mineral; en una mina o campo metálico; en un campo petrolífero o en petróleo o un petroquímico (por ejemplo, para cualquiera de estos cuando el hospedador es una bacteria anaeróbica reductora de sulfato, por ejemplo, una bacteria Desulfovibrio). En un ejemplo, esta composición comprende un agente oxidante (por ejemplo, hipoclorito de sodio), un compuesto de amonio cuaternario o isotiazolona o se administra simultánea o secuencialmente con hipoclorito de sodio, un compuesto de amonio cuaternario o isotiazolona. Un ejemplo de un vector adecuado para su uso en la presente invención para modificar un hospedador bacteriano Desulfovibrio es un bacteriófago. Las referencias a continuación describen procedimientos adecuados para aislar fagos que infectan Desulfovibrio. Para su uso como vector en la presente invención, se puede utilizar el bacteriófago descrito por cualquiera de las referencias. Alternativamente, el vector es proporcionado por nanopartículas.
Heidelberg y col. describen las dos copias del bacteriófago similar a mu casi idéntico DVUO189-221, DVU2847-79, DVU2688-733 y los restos de bacteriófago están presentes en el genoma de Desufovibrio vulgaris Hildenborough. Dicho fago puede ser una base sobre la cual diseñar un vector de fagos para su uso en la presente invención.
Referencias:
Seyedirashti S etal, J Gen Microbiol. 1991 Jul;137(7):1545-9, "Induction and partial purification of bacteriophages from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough) and Desulfovibrio desulfuricans ATCC 13541;
Seyedirashti S et al, J Gen Microbiol. 1992 Jul;138(7):1393-7, "Molecular characterization of two bacteriophages isolated from Desulfovibrio vulgaris NCIMB 8303 (Hildenborough)";
*Walker CB et al; Environ Microbiol. 2006 Nov;8(11):1950-9, "Recovery of temperate Desulfovibrio vulgaris bacteriophage using a novel host strain";
Miranda et al, Corrosion Science 48 (2006) 2417-2431, "Biocorrosion of carbon steel alloys by an hydrogenotrophic sulfate-reducing bacterium Desulfovibrio capillatus isolated from a Mexican oil field separator";
Eydal etal, The ISME Journal (2009) 3, 1139-1147; doi:10.1038/ismej.2009.66; published online 11 June 2009, "Bacteriophage lytic to Desulfovibrio aespoeensis isolated from deep groundwater";
Walker CB et al; Environ Microbiol. 2009 Sep;11 (9):2244-52. doi: 10.1111/j.1462- 2920.2009.01946.x, "Contribution of mobile genetic elements to Desulfovibrio vulgaris genome plasticity".
*[The sequences described in this article have been deposited in GenBank under Accession No. DQ826728-DQ826732, incorporated herein by reference]
EJEMPLO 2: Tratamiento de agua o aguas residuales o ambiental (por ejemplo, suelo) descontaminación de metales
Una aplicación alternativa de la descripción proporciona una matriz HM-CRISPR, sistema HM-CRISPR/Cas, ARNcr-HM, HM-espaciador, HM-ADN, HM-Cas o HM-composición como se describe en la presente memoria para el tratamiento de agua o aguas residuales, por ejemplo, en la que el hospedador es una bacteria reductora de sulfato, por ejemplo, una bacteria Desulfovibrio.
En un ejemplo, la secuencia de nucleótidos diana en el hospedador es una secuencia de un gen de resistencia a metales pesados. Opcionalmente, también el hospedador es una bacteria Desulfovibrio, por ejemplo, D vulgaris.
EJEMPLO 3: Uso médico
Una aplicación alternativa de la descripción proporciona una matriz HM-CRISPR, sistema HM-CRISPR/Cas, ARNcr-HM, HM-espaciador, HM-ADN, HM-Cas o composición HM como se describe en la presente memoria para tratar, prevenir o reducir (por ejemplo, reducir la propagación o expansión de) una infección bacteriana en un ser humano o animal.
En una primera descripción, la infección es causada por células hospedadoras de MRSA en un ser humano. La célula hospedadora es una célula hospedadora de Staphylococcus aureus y una matriz HM de la invención está contenida en una población de fagos empaquetados de clase I, II o III de Staphylococcus (fagos deCaudovirales o Myoviridae).
La población de fagos se administra a un paciente infectado con MRSA con o sin meticilina o vancomicina. En un ensayo, las matrices HM de fagos se dirigen a (i) la región de 20 nucleótidos en el 3' del promotor líder de las matrices de CRISPR de S aureus endógeno y (ii) los genes de resistencia a la meticilina en las células hospedadoras. Cuando se administra vancomicina, se administra al paciente una dosis inferior a la habitual. Se espera que la infección de la célula hospedadora sea derribada y que la resistencia al medicamento fago no se establezca o establezca a un ritmo o gravedad más bajos de lo habitual. En otros ensayos, el diseño es idéntico excepto que el fago en esos ensayos también se dirige al gen esencial de S aureus/fsZ (Liang y col., lnt J Infect Dis. 2015 Jan;30:1-6. doi: 10.1016/j.ijid.2014.09.015. Epub 2014 Nov 5, «Inhibiting the growth of methicillin- resistant Staphylococcus aureus in vitro with antisense peptide nucleic acid conjugates targeting the ftsZ gene»).
Un ensayo adicional repitió los ensayos anteriores, pero se administró endolisina K de fago en adición o en lugar de meticilina.
Referencias
1. Jiang W et al, Nucleic Acids Res. 2013 Nov;41 (20):e188. doi: 10.1093/nar/gkt780. Epub 2013 Sep 2, "Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice";
2. Seed KD et al, Nature. 2013 Feb 28;494(7438):489-91. doi: 10.1038/nature11927, "A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity";
3. Semenova E et al, Proc Natl Acad Sci USA. 2011 Jun 21;108(25):10098-103. doi: 10.1073/pnas.1104144108. Epub 2011 Jun 6, "Interference by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed sequence";
4. Heler R et al, Mol Microbiol. 2014 Jul;93( 1): 1-9. doi: 10.1111/mmi.12640. Epub 2014 Jun 4, "Adapting to new threats: the generation of memory by CRISPR-Cas immune systems";
5. Gomaa A et al, MBio. 2014 Jan 28;5(1):e00928-13. doi: 10.1128/mBio.00928-13, "Programmable removal of bacterial strains by use of genome-targeting CRISPR-Cas systems";
6. Fineran PCetal, Proc Natl Acad Sci USA. 2014 Apr 22;111 (16):E1629-38. doi: 10.1073/pnas.1400071111. Epub 2014 Apr 7, "Degenerate target sites mediate rapid primed CRISPR adaptation";
7. Wiedenheft et al, Nature. 2011 Sep 21 ;477(7365):486-9. doi: 10.1038/nature10402, "Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system”;
8. Bondy-Denomy et al, Nature 493, 429-432 (17 January 2013) doi:10.1038/nature11723, " Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system";
9. Nunez JK et al, Nature. 2015 Mar 12;519(7542):193-8. doi: 10.1038/nature14237. Epub 2015 Feb 18, "lntegrasemediated spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity".
EJEMPLO 4: Alteración de la proporción de bacterias en una población de microbiota intestinal mixta
La alteración de la relación de bacterias se realizará según el presente ejemplo, que se describe por referencia a la eliminación de bacterias Clostridium dificile en una muestra de microbiota intestinal mixta. La muestra contendrá Bacteroides y subpoblaciones de la cepa 630 de C dificile resistente a metronidazol (MTZ). Ex vivo, la población mixta se combina con una población de bacterias portadoras (Lactobacillus acidophilus La-14 y/o La-5) que se han modificado genéticamente según la invención para que contengan matrices de CRISPR.
Cada matriz de CRISPR está comprendida en un plásmido que es compatible con la bacteria portadora y las células C dificile La matriz está comprendida por un transposón CTnDot de Bacteroides thetaiotamicron que también comprende oriT, una secuencia intDOT, un operón tetQ-rteA-rteB, rteC y el operón xis2c-xis2d-orf3-exc. En un experimento, se excluyen los operones Mob y tra (confiando en estos suministrados por células Bacteroides a las que se transfieren los transposones en la mezcla combinada con las bacterias portadoras). En otro experimento, los operones Mob y tra se incluyen en los transposones.
La translocación de proteínas a través de la membrana citoplasmática es un proceso esencial en todas las bacterias. El sistema SEC, que comprende en su núcleo una ATPasa, SecA, y un canal de membrana, SecYEG, es responsable de la mayor parte de este transporte de proteínas. Se ha descrito un segundo sistema SEC paralelo en varias especies Gram-positivas. Este sistema accesorio Sec se caracteriza por la presencia de una segunda copia de la ATPasa energizante, SecA2; donde se ha estudiado, SecA2 es responsable de la translocación de un subconjunto de sustratos Sec. Al igual que muchas especies patógenas Gram-positivas, Clostridium difficile posee dos copias de SecA. La exportación de las proteínas de capa S (SLP) y una proteína de pared celular adicional (CwpV) depende de SecA2. La acumulación del precursor citoplasmático de las SLP SlpA y otras proteínas de la pared celular se observa en células que expresan alelos secAI o secA2dominantes negativos, concomitantes con una disminución en los niveles de SLP maduras en la pared celular. Además, la expresión de alelo dominante negativo o inactivación de ARN antisentido de SecA1 o SecA2 perjudica drásticamente el crecimiento, lo que indica que ambos sistemas Sec son esenciales en C. clifficile.
La cepa 630 de C. difficile(epidemia tipo X) tiene un único cromosoma circular con 4290252 pb (contenido de G+C = 29,06 %) y un plásmido circular con 7881 pb (contenido de G+C = 27,9 %). Se ha secuenciado todo el genoma y se ha encontrado que el 11 % del genoma consiste en elementos genéticos móviles, tales como transposones conjugados. Estos elementos proporcionan a C. difficile los genes responsables de su resistencia antimicrobiana, virulencia, interacción con el hospedador y la producción de estructuras superficiales. Por ejemplo, el gen cdeA de C. difficile produce una bomba de eflujo multifármaco que demostró ser homóloga a los transportadores de eflujo conocidos en la familia de extrusión de compuestos tóxicos y multifármacos (MATE). La proteína facilita el flujo de fármacos de las células dependiente de la energía y acoplado al sodio. Además, se ha demostrado que el gen cme en C. difficile proporciona resistencia a múltiples fármacos en otras bacterias.
La matriz comprende una unidad de CRISPR R1-S1-R1' para dirigirse a una secuencia en un gen esencial (SecA2) de células de C dificile. En otro experimento, el direccionamiento es al gen cdeA en presencia de MTZ y opcionalmente uno o más antibióticos contra C dificile. Cada espaciador (S) comprende una secuencia de 20 nucleótidos del gen SecA o cdeA, en el que la secuencia comprende un PAM de un sistema CRISPR/Cas de cepa 630 de C dificileque está relacionado con las secuencias de repetición. Cada repetición es idéntica a una repetición de la cepa 630 de C dificile y tiene la secuencia
Figure imgf000111_0001
En un conjunto alternativo de experimentos, se utiliza la siguiente secuencia para las repeticiones:
Figure imgf000111_0002
La función de repeticiones con Cas que es endógena a las células de C dificile en la población mixta. La población mixta de bacterias se recupera como una muestra ex vivo de una muestra de heces de un paciente humano que padece una infección por C dificile. La población mixta se mezcla con la bacteria portadora in vitro y se incuba a 37 grados centígrados en condiciones anaeróbicas para simular las condiciones intestinales en presencia de tetraciclina. Se espera que los transposones que contienen las matrices de CRISPR se transfieran a las células Bacteroides y C dificile en la mezcla. Además, se espera que los sitios diana en estas últimas células se corten por acción de la nucleasa Cas, reduciendo así la proporción de C dificile en la población mixta (y aumentando la relación de Bacteroides frente a C dificile).
En un experimento de seguimiento, se produce una bebida que comprende las bacterias portadoras y esto es consumido por el paciente humano una o dos veces durante varios días consecutivos. Al paciente también se le administra tetraciclina durante el periodo de tratamiento. Se espera que el análisis de heces revele que la proporción de C dificile en las muestras de heces se reducirá (y la proporción de Bacteroides frente a C dificile aumentará). EJEMPLO 5: Tratamiento o prevención del cólera
Se hace referencia a la hoja informativa de la Organización Mundial de la Salud (OMS) sobre el cólera N.° 107 (actualizada en julio de 2015). El cólera es una infección diarreica aguda causada por la ingestión de alimentos o agua contaminada con la bacteria Vibrio cholerae. Los investigadores han calculado que cada año se producen entre 1,4 y 4,3 millones de casos y entre 28000 y 142000 muertes por cólera en todo el mundo. El corto periodo de incubación de 2 horas a 5 días es un factor que desencadena el patrón potencialmente explosivo de los brotes. El cólera es una enfermedad extremadamente virulenta. Afecta tanto a niños como a adultos y puede matar en cuestión de horas. Alrededor del 80 % de las personas infectadas con V. cholerae no desarrollan ningún síntoma, aunque la bacteria está presente en sus heces durante 1-10 días después de la infección y se devuelve al medio ambiente, infectando potencialmente a otras personas. Entre las personas que desarrollan síntomas, el 80 % presenta síntomas leves o moderados, mientras que alrededor del 20 % desarrolla diarrea acuosa aguda con deshidratación grave. Esto puede llevar a la muerte si no se trata.
Dos serogrupos de V. cholerae, O1 y O139, causan brotes. V. cholerae O1 causa la mayoría de los brotes, mientras que O139, identificado por primera vez en Bangladesh en 1992, se limita al Sudeste asiático. V. cholerae No-O1 y no-O139 pueden causar diarrea leve pero no generan epidemias. Recientemente, se han detectado nuevas cepas variantes en varias partes de Asia y África. Las observaciones sugieren que estas cepas causan cólera más grave con mayores tasas de letalidad. Los principales reservorios de V. cholerae son las personas y las fuentes de agua, como el agua salobre y los estuarios, a menudo asociados con floraciones de algas.
Se hace referencia a Nature. 2013 Feb 28;494(7438):489-91. doi: 10.1038/nature11927, «A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity», Seed KD y col. (que se incorpora a la presente memoria por referencia), que describe que Vibrio cholerae serogrupo O1 es el agente causal primario de la enfermedad diarreica grave, el cólera, y los fagos V. cholerae líticos se han implicado en el impacto de la carga de enfermedad particularmente en la zona endémica que rodea la Bahía de Bengala. Los autores describieron el aislamiento de los miovirus virulentos específicos de V. cholerae O1, relacionados con ICP1 (para el fago del cólera 1 del Centro Internacional de Investigación de Enfermedades Diarreicas de Bangladesh), que están omnipresentes entre las muestras de heces de agua de arroz de pacientes con cólera recogidas entre 2001 y 201114 y en el estudio descrito en su publicación.
Los autores explican que el sistema ICP1 CRISPR/Cas consiste en dos locus CRISPR (designados CR1 y CR2) y seis genes cas cuya organización y productos proteicos son más homólogos a las proteínas Cas del sistema del subtipo 17 tipo 1 -F (Yersinia pestis). V. cholerae se divide en dos biotipos, el clásico y el El Tor, el primero de los cuales está asociado con pandemias anteriores y desde entonces ha sido reemplazado por el biotipo El Tor 18. La cepa clásica, V. cholerae O395, tiene un sistema CRISPR/Cas perteneciente al subtipo 17 de tipo I-E (Escherichia coli), y hasta la fecha no se ha descrito ninguna cepa de El Tor que posea un sistema CRISPR/Cas. Por lo tanto, se desconoce el origen del sistema CRISPR/Cas en el fago ICP1.
La secuencia de ARN de la repetición directa de consenso CR1 y CR2 con la secuencia parcialmente palindrómica que forma el vástago predicho en el ARNcr subrayado es la siguiente:
Figure imgf000112_0001
En un ejemplo de la invención, la o cada repetición de la matriz comprende o consiste en una secuencia que es al menos en un 80, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ. ID NO: 75 (o es idéntica a SEQ ID NO: 75).
La mayoría de los espaciadores en el CRISPR ICP1 muestran un 100 % de identidad con las secuencias dentro de una isla de 18 kb encontradas en un subconjunto de cepas V. cholerae que incluyen la cepa clásica O395 aislada en la India en 1964, la cepa El Tor MJ-1236 aislada en Bangladesh en 1994 y varias cepas El Tor recolectadas en el ICDDR,B entre 2001-2011. La isla de 18 kb se asemeja a las islas cromosómicas inducibles por fagos (PICI) de bacterias grampositivas, que incluyen el prototipo de islas de patogenicidad de Staphylococcus aureus (SaPI). Los SaPI son inducidos a extirpar, circularizar y replicar después de la infección por determinados fagos. Utilizan mecanismos variados para interferir con el ciclo de reproducción del fago para permitir su propia propagación promiscua y esto puede proteger a la población bacteriana circundante de una mayor depredación del fago. La organización de la isla de V. cholerae de 18 kb diana del sistema ICP1 CRISPR/Cas es similar en longitud, composición base y organización a la observada en el subconjunto SaPIs de PICIs, con un homólogo de integrasa en un extremo y un contenido de GC menor que el de la especie hospedadora (37 % en comparación con 47,5 %). Por lo tanto, el elemento de 18 kb se denomina elemento similar a PICI de V. cholerae (PLE).
V. cholerae P L E (w t) AAT TTA AAT AGG GAA GAT AAG CAA AGG G T T GAC
N L N R E D K Q R V D
[la secuencia de nucleótidos = SEQ ID NO: 76 (La secuencia protoespaciadora de 32 pb (SEQ ID NO: 77) está sombreada en gris, la presente descripción incluye una secuencia que comienza en el primer gris sombreado T y termina en el último gris sombreado C; y la secuencia de aminoácidos = SEQ ID NO: 78]
Seed y col. determinaron que las matrices CR1 y CR2 funcionan mediante el reconocimiento de una secuencia PAM de GA. Seed y col. también encontraron que la mayoría de los espaciadores en las matrices CRISPR de fagos relacionadas con ICP1 estudiadas mostraron identidad con los PLE de V. cólera. Los espaciadores se muestran en la siguiente Tabla 3; S1 en una matriz de la invención se selecciona, por ejemplo, de cualquiera de estas secuencias. En una realización, el S1 se selecciona de cualquiera de las secuencias subrayadas.
En un ejemplo, la matriz de la invención (o cada matriz) es una matriz modificada genéticamente que comprende una, más o todas las secuencias espaciadoras subrayadas. Los espaciadores de la matriz pueden comprender una disposición de origen no natural de la siguiente manera:
Por ejemplo, la matriz comprende un espaciador del tipo 8a y/o 9a, y 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6 (pero no 7) de los tipos 1 a-7a. Por ejemplo, la matriz comprende un separador de tipo 4b y 0, 1 o 2, 3 (pero no 3 o más) de 1b-3b. Por ejemplo, la matriz comprende un espaciador de tipo 8a y uno, más o todos de 9a, 4b, 1c, 3d, 1e y 3e. Por ejemplo, la matriz comprende un espaciador de tipo 9a y uno, más o todos de 8a, 4b, 1c, 3d, 1e y 3e. Por ejemplo, la matriz comprende un espaciador de tipo 4b y uno, más o todos de 8a, 9a, 1c, 3d, 1e y 3e. Por ejemplo, la matriz comprende un espaciador de tipo 1c y uno, más o todos de 8a, 9a, 4b, 3d, 1e y 3e. Por ejemplo, la matriz comprende un espaciador de tipo 3d y uno, más o todos de 8a, 9a, 4b, 1c, 1e y 3e. Por ejemplo, la matriz comprende un espaciador de tipo 1 e y uno, más o todos de 8a, 9a, 4b, 1c, 3d y 3e. Por ejemplo, la matriz comprende un espaciador de tipo 3e y uno, más o todos de 8a, 9a, 4b, 1c, 3d y 1e.
En otra disposición de origen no natural, el vector comprende una primera y una segunda matriz de la invención, en el que las matrices comprenden al menos dos espaciadores seleccionados de 1a a 1g (por ejemplo, al menos dos espaciadores seleccionados de 8a, 9a, 4b, 1c, 3d, 1e y 3e), en el que los espaciadores no son espaciadores del mismo genoma de fago ICP1, por ejemplo, no todos los espaciadores de ICP1_2011_A, o ICP1_2006_E, o ICP1_2005_A o ICP1_2004_A (por referencia a los espaciadores en la tabla anterior). Por lo tanto, en una realización:
La primera matriz comprende una secuencia espaciadora ICP1_2011_A (por ejemplo, 8a y/o 9a), y la segunda matriz comprende una secuencia espaciadora de ICP1_2006_E, ICP1_2005_A o ICP1_2004_A (por ejemplo, uno o más espaciadores seleccionados de entre 4b, 1c, 3d, 1e y 3e).
En un ejemplo, el vector comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6 o los 7 tipos de espaciadores seleccionados de entre 8a, 9a, 4b, 1c, 3d, 1e y 3e. En un ejemplo, el vector comprende múltiples copias de uno o más de dichos tipos seleccionados. En un ejemplo, las, algunas o cada matriz en el vector comprende un primer espaciador (más cercano al promotor de la matriz), en el que el primer espaciador se selecciona de entre 8a, 9a, 4b, 1c, 3d, 1e y 3e.
El posicionamiento de esta manera es ventajoso, ya que las matrices naturales utilizan el primer espaciador con mayor frecuencia.
Se hace referencia a Nucleic Acids Res. 2013 Oct;41 (19):9033-48. doi: 10.1093/nar/gkt654. Epub 2013 Jul 30, «Highresolution definition of the Vibrio cholerae essential gene set with hidden Markov model-based analysis of transposoninsertion sequencing data», Chao MC y col. (incorporado por referencia), que describe el acoplamiento de mutagénesis de transposones de alta densidad a secuenciación de ADN de alto rendimiento (secuenciación de inserción de transposones) permite una evaluación simultánea y a nivel de genoma de las contribuciones de los loci individuales al crecimiento y supervivencia bacteriana. Los resultados de HMM indican que 128 genes son necesarios para el crecimiento óptimo de V. cholerae en LB. La secuencia diana de la invención puede ser una secuencia de cualquiera de estos genes (cuyos nombres de genes y secuencias se incorporan explícitamente a la presente memoria mediante referencia para su uso en el suministro de secuencias diana de los vectores de la presente invención y para su posible inclusión en las reivindicaciones de esta invención).
Por ejemplo, los mutantes de inserción en vc0309 y vc0753, que tenían lecturas promedio de 5,6 y 4,7, respectivamente, se atenuaron gravemente en el crecimiento. Del mismo modo los mutantes vc0237 y vc1773 fueron menos aptos que las células de tipo salvaje en un experimento de competencia in vitro. La lista también incluye una serie de genes de antitoxina de los loci putativos de adicción a la toxina/antitoxina, que incluyen vca0360, vca0477, vca0486 y vca0488. Se presume que dichos genes son esenciales cuando se asocian con toxinas activas.
Los autores encontraron los genes esenciales de V cholerae en la Tabla 4. Los autores identificaron más de 200 regiones intergénicas que parecen ser esenciales.
Por lo tanto, en un ejemplo de la invención cuando la célula hospedadora es una célula de Vibrio cholerae, la secuencia diana es una secuencia vc0631, vc2024, vc2626, vc2763-vc2767 o vc2768-vc2770. En un ejemplo de la invención, cuando la célula hospedadora es una célula de Vibrio cholerae, la secuencia diana es una secuencia vc0309y vc0753, vc0237 y vc1773, vca0360, vca0477, vca0486 o vca0488.
Se hace referencia a Infect lmmun. 2015 Sep;83(9):3381-95. doi: 10.1128/IAI.00411-15. Epub 2015 Jun 8, «A Genome-Wide Screen Reveals that the Vibrio cholerae Phosphoenolpyruvate Phosphotransferase System Modules Virulence Gene Expression», Wang Qetal (incorporado por referencia). Los autores utilizaron una estrategia basada en la secuenciación del sitio de inserción de transposones (TIS) para identificar nuevos factores necesarios para la expresión de tcpA, que codifica la subunidad principal de TCP, el principal factor de colonización intestinal del organismo. Además de identificar la mayoría de los genes conocidos para modular la expresión de tcpA, la pantalla produjo ptsl y ptsH, que codifican los componentes enzimáticos I (El) y Hpr del sistema fosfoenolpiruvato fosfotransferasa (PTS) de V. cholerae. Además de la expresión reducida de TcpA, las cepas que carecen de El, Hpr o la proteína EllA(Glc) asociada produjeron menos toxina del cólera (CT) y tuvieron una capacidad disminuida para colonizar el intestino del ratón lactante. El PTS modula la expresión génica de virulencia mediante la regulación de la expresión de tcpPH y aphAB, que a su vez controlan la expresión de toxT, el activador central de la expresión génica de virulencia.
Por lo tanto, en un ejemplo de la invención cuando la célula hospedadora es una célula de Vibrio cholerae, la secuencia diana es una secuencia de tcpA o una secuencia moduladora de tcpA (es decir, una secuencia de nucleótidos que modula tcpA en sí o a través de su producto de expresión). Por ejemplo, la secuencia es una secuencia ptsl o ptsH. En un ejemplo, la secuencia diana es una secuencia del sistema de fosfoenolpiruvato fosfotransferasa (PTS), o una secuencia tcpPH, aphAB o toxT. En un ejemplo, la secuencia diana es una secuencia génica que codifica la proteína EllA (Glc).
Las secuencias diana adecuadas para la presente invención también son como se muestra en la Tabla 5; la secuencia de cualquiera de los siguientes (Genes de patogenicidad está subrayada).
En una realización, la célula es una célula de Vibrio (por ejemplo, cholera) y la secuencia diana es una secuencia de cualquiera de estos genes.
Los genes de patogenicidad se muestran en la tabla 6.
En una realización, la célula es una célula de Vibrio (por ejemplo, cholera) y la secuencia diana es una secuencia de cualquiera de estos genes.
Genes de las islas de patogenicidad TCP y CTX
En una realización, la célula es una célula Vibrio (por ejemplo, cholerae) y la secuencia diana es una secuencia ACE, cep, ctxA, ctxB, orfU, zot, rstA, rstB, rstR, acfA, acfB, acfC, tagE, aldA, int, tagA, tagD, tcpA, tcpB, tcpC, tcpD, tcpE, tcpF, tcpH, tcpl, tcpJ, tcpP, tcpQ, tcpR, tcpS, tcpT o toxT.
EJEMPLO COMPARATIVO 6 Inhibición del crecimiento de la población bacteriana específica de la microbiota mediante el aprovechamiento de Cas endógena de tipo salvaje
1. Material y procedimientos
1,1. cepas
A lo largo de este Ejemplo y los Ejemplos 7 y 8 se utilizaron las siguientes cepas: E. coli MG1655, E. coli TOP1O, Streptococcus thermophilus LMD-9 (ATCC BAA-491, Manassas, Virginia), Streptococcus thermophilus DSM 20617(T) (DSMZ, Braunschweig (Alemania)), Lactococcus lactis MG1363 y Streptococcus mutans Clarke 1924 DSM 20523 (DSMZ, Braunschweig (Alemania)).
Durante el curso de la selección de medios y las pruebas de las construcciones genéticas, se utilizaron diferentes cepas de Streptoccoci. Se consideraron Streptococcus thermophilus LMD-9 (ATCC BAA-491) y Escherichia coli TOP1O debido a sus requisitos de crecimiento compatibles. Todas las cepas se cultivaron en caldo Todd-Hewitt (TH) (T1438 Sigma-Aldrich), en condiciones aeróbicas y a 37 °C, a menos que se indique lo contrario. Las cepas se almacenaron en glicerol al 25 % a -80 °C.
1.2. Medios de crecimiento diferencial
Todas las cepas se cultivaron en medio TH a 37 °C durante 20 horas. Los medios selectivos para S.thermophilus fueron medios TH complementados con 3 g I-1 de 2-feniletanol (PEA). EL PEA se añadió a los medios y se esterilizó en autoclave a 121 °C durante 15 minutos a 15 psi. Las placas de agar se prepararon añadiendo agar al 1,5 % (peso/volumen) a los medios correspondientes. Cuando fue necesario para la selección o el mantenimiento del plásmido, se utilizaron 30 gg ml-1 de kanamicina para las cepas de S. thermophilus y E.coli, y 500 gg ml-1 para S.mutans.
En algunos casos, dependiendo de la cepa y el plásmido, puede ser necesaria una incubación más prolongada, de hasta 48 horas, para ver el crecimiento en medios complementados con PEA. Para controlar la viabilidad de los organismos utilizados, se debe realizar un agar TH de control en paralelo.
1. 3. Clonación
En todos los procedimientos de subclonación se utilizó E. coli (células con competencia química One Shot® ThermoFischer TOP1O). La PCR se llevó a cabo utilizando polimerasa Phusion. Todos los productos de PCR se purificaron con Nucleospin Gel y limpieza de PCR por Macherey-Nagel siguiendo el protocolo del fabricante. Los fragmentos purificados se digirieron con la enzima de restricción Dpnl en amortiguador IX FD con enzima 1gl en un volumen total de 34 gl. La reacción digerida se purificó nuevamente con Nucleospin Gel y limpieza por PCR por Macherey-Nagel siguiendo el protocolo del fabricante. El ensamblaje Gibson se realizó en reacciones de 10 gl siguiendo el protocolo del fabricante (NewEngland Biolab).
El ADN del plásmido se preparó usando kits de Qiagen según las instrucciones del fabricante. Las modificaciones para las cepas Gram positivas incluyeron el cultivo de bacterias en un medio complementado con 0,5 % de glicina y lisozima para facilitar la lisis celular.
1 .4. Transformación
1.4.1 Células E.coli electrocompetentes y transformación
Se utilizaron células comercialmente electrocompetentes para la clonación y los experimentos (One Shot® ThermoFischer TOP1O Chemically Competent E. coli). La electroporación se realizó utilizando ajustes estándar: 1800 V, 25 gF y 200 Q con la utilización de un electroporador (BTX Harvard Apparatus ECM630). Después del pulso, se añadieron 1 ml de medio de LB-SOC y las células se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Las células transformadas se colocaron en placas en agar LB que contenía 50 gg ml-1 de kanamicina.
1.4.2 Preparación de células de S. thermophilus electrocompetentes
El protocolo de electroporación fue modificado a partir de Somkuti y Steinberg, 1988. Un cultivo durante la noche de Streptococcus thermophilus en caldo TH complementado con 40 mM de DL-treonina (T8375 Sigma-Aldrich) se diluyó 100 veces en 5 ml del mismo medio y se cultivó a una OD600 entre 0,3-0,5 (aproximadamente 2,5 horas después de la inoculación). Las células se recogieron mediante centrifugación a 10000 x g durante 10 min a 4°C y se lavaron tres veces con 5 ml de amortiguador de lavado en frío con hielo (sacarosa 0,5 M glicerol al 10 %). Después de que las células se lavaron, se suspendieron a una OD600 de 15-30 en amortiguador de electroporación (0,5 M de sacarosa, 10 % de glicerol y MgCh 1 mM). Las células del tampón de electroporación podrán mantenerse a 4 °C hasta su utilización (en el plazo de una hora) o alícuota de 50 pl en tubos eppendorf, congelándolas en nitrógeno líquido y almacenándolas a -80 °C para su utilización posterior.
1.4.3 Electroporación de células de S. thermophilus
Se añadió 1 pl de ADN de plásmido purificado a 50 pl de la suspensión celular y se llevó a cabo la electroporación en cubetas de electroporación de 2 mm de espacio preenfriadas. El ajuste de electroporación fue de 2500 V, 25 pF y 200 Q utilizando un electroporador (BTX Harvard Apparatus ECM630). Inmediatamente después del pulso eléctrico, se añadió 1 ml de caldo TH a las células y la suspensión se mantuvo en hielo durante 10 minutos, posteriormente las células se incubaron durante 3 h a 37 °C. Después de permitir tiempo para la expresión del gen de resistencia, las células se colocaron en placas de agar TH que contenían 30 pg ml-1 de kanamicina. Dependiendo de la construcción, las colonias fueron visibles entre 12 y 48 h de incubación a 37 °C.
1. 5. Construcción del plásmido XylS
Todos los plásmidos utilizados en este trabajo se basaron en pBAV1K-T5, que es un vector de expresión de amplio rango de hospedadores derivado del plásmido críptico pWV01 de Streptococcus cremoris (Bryksin & Matsumura, 2010), la estructura principal se amplificó utilizando el que contiene voladizos para el ensamblaje con los otros fragmentos mediante el procedimiento de Gibson.
El sistema inducible por xilosa se construyó mediante la clonación del promotor gyrA frente al represor XylR (Figura 1). El represor XylR se amplificó a partir de la cepa SCK6 de Bacillus Subtilis (Zhang y col. 2011) con un cebador inverso que incluye un voladizo para el ensamblaje Gibson y un cebador directo, que es un ultrámero utilizado para introducir el promotor gyrA (Xie y col. 2013) y el voladizo correspondiente para el ensamblaje en la estructura principal de pBAV1KT5. El fragmento resultante fue flanqueado por un mCherry amplificado a partir de pCL002 (trabajo no publicado) con un ultrámero que incluye promotor híbrido de Pldha PxylA (Xie y col. 2013). Los tres productos de PCR resultantes se ensamblaron en una Gibson Master Mix® (NewEngland Biolab) según las instrucciones del fabricante. El producto finalmente se transformó en células electrocompetentes de E. coli TOP1O. Véase la Figura 1.
1. 6. Diseño y construcción del plásmido de matriz CRISPR
Streptococcus thermophilus tiene 4 sistemas CRISPR distintos (Sapranauskas, y col. 2011), para este trabajo se eligió el sistema CRISPR1 tipo II (ST1-CRISPR). El diseño de la secuencia diana se basó en la secuencia genómica disponible de LMD-9 (GenBank: CP000419.1). La matriz ST1-CRISPR se diseñó para contener solo las repeticiones y espaciadores de la matriz de CRISPR bajo un promotor inducible con xilosa (Xie y col. 2013), seguido por el ARNtracr correspondiente bajo un fuerte promotor constitutivo para las especies de Streptococci (Sorg y col. 2014) (Figura 2, SEQ ID NO: ).
El ARNtracr juega un papel en la maduración del ARNcr y es procesado por la RNasa III endógena de S. thermophilus, formando un complejo con ARNcr. Este complejo actúa como guía para la endonucleasa ST1-Cas9 (Horvath y Barrangou, 2010). Después de la transcripción de la matriz sintética del promotor inducible por xilosa, las Cas9 y las ARNsas endógenas lo procesarán en un ARNg funcional. El complejo de ARNg Cas9 provocará una ruptura de doble hebra en la ubicación diana.
El diseño de la matriz utilizó 2 secuencias diana específicas con alto contenido de GC y una porción reducida del ARNtracr (es decir, una secuencia de ARNtracr menos que completa), lo que se ha sugerido que no es necesario para la maduración adecuada del ARNcr(Horvath y Barrangou, 2010).
Las 2 dianas fueron un gen esencial (subunidad alfa de ADN polimerasa III) y un gen de resistencia a antibióticos (gen similar a tetA) (SEQ. ID NO:).
Se utilizaron cebadores para amplificar la estructura principal de pBAV1 KT5-XylR-PldhA. La matriz de CRISPR gBIock y la estructura principal con voladizos se ensamblaron en una Gibson Master Mix ® según las instrucciones del fabricante (NewEngland Biolabs). El producto finalmente se transformó en células electrocompetentes E. co liTOP10.
1.7. Caracterización del sistema inducible de xilosa en Streptoccocus thermophilus LMD-9
Los cultivos de fase estacionaria durante la noche se diluyeron 1:100 en caldo TH con el antibiótico correspondiente. Las células logarítmicas medias se indujeron con diferentes concentraciones de D-(+)-xilosa (0, 0,001, 0,01, 0,1, 0,5 y 1 % en peso/vol) y los cultivos celulares se midieron ya sea directamente en medio para evaluar el grado de autofluorescencia del medio, en la suspensión celular o el amortiguador de suspensión (amortiguador PBS). Las muestras de 20 |jl de los cultivos celulares se diluyeron 1/10 en amortiguador PBS, en placas de 96 pocilios con fondos planos. La fluorescencia de suspensiones celulares o medios se leyó en un lector de placas. La fluorescencia de mCherry se midió usando una longitud de onda de excitación de 558 nm y la emisión a 612 nm. La absorbancia de las células resuspendidas se midió a OD 600 nm. Se realizó un mínimo de tres réplicas biológicas independientes para cada experimento.
1,8. Activación de la matriz de CRISPR en S. thermophilus
S. thermophilus LMD-9 y E.coli TOP1O ambos con el plásmido que contiene la matriz de CRISPR dirigida a la ADN polimerasa III y tetA de S. thermophilus se cultivaron durante la noche en cultivos de 3 ml complementados con 30 jg ml-1 de kanamicina para el mantenimiento del plásmido. Al día siguiente, se inocularon placas de 96 pocillos profundos con 500 jl de 1/100 de cultivo durante la noche en medio TH fresco, complementado con 30 jg ml-1 de kanamicina. Se indujeron cultivos celulares de logaritmo medio con xilosa al 1 %. El efecto de muerte se probó solo en S.thermophilus y E.coli. Para cada cepa y condición probada, se mantuvo un control negativo sin xilosa. Las células se cultivaron hasta ~OD 0,5 y las siguientes 10 veces se diluyeron en serie en medio TH y usando un replicador de 96 pocillos (Mettler Toledo Liquidator™ 96) se observaron gotas de volumen de 5 jL en agar TH y agar TH complementado con placas de g I-1 PEA. Las placas se incubaron durante 24 H a 37 °C y las unidades formadoras de colonias (UFC) se calcularon a partir de mediciones por triplicado.
2. Resultados
2.1 Condiciones de crecimiento y medios selectivos
Primero nos propusimos establecer las cepas bacterianas y el protocolo de cultivo que respaldaría el crecimiento de todas las cepas que planeábamos usar para los experimentos de cocultivo. Utilizamos la cepa LMD-9 de S. thermophilus que fue capaz de soportar un crecimiento similar al de E.coli en caldo TH a 37 °C (Figura 3).
Distinguir las diferentes bacterias de un cultivo mixto es importante para determinar el número celular de las diferentes especies. Con el agar MacConkey es posible cultivar selectivamente E.coli, sin embargo, no hay medios específicos para el crecimiento selectivo de S.thermophilus. El agar PEA es un medio selectivo que se utiliza para el aislamiento de bacterias grampositivas (S.thermophilus) de gramnegativas (E.coli). Además, encontramos que las diferentes concentraciones de PEA inhiben parcialmente el crecimiento de otros grampositivos, lo que permite la selección entre las otras bacterias grampositivas utilizadas en este trabajo (figura 4). 3g I-1 de PEA demostró cultivar selectivamente S. thermophilus LMD-9 mientras limitaba el crecimiento de E. coli.
2.2 Diseño y validación del sistema inducible
Anteriormente se desarrolló un sistema de inducción para especies de Streptococcus basado en el operón de xilosa de Bacillus megaterium (Figura 5) mediante la creación de un casete de inducción de xilosa heterólogo (Xyl-S). Los promotores xylR y xylA se reemplazaron con promotores de gyrA y ldh expresados constitutivamente de S. mutans, respectivamente. Este casete de expresión para especies de Streptococcus mostró diferencias en los niveles de sensibilidad y expresión entre diferentes especies, sin embargo, el sistema no se probó en S. thermophilus (Xie y col.
2013). Por lo tanto, primero nos propusimos validar el casete de inducción de xilosa en S. thermophilus.
Se construyó una versión alternativa del casete de inducción reemplazando solamente el promotor xylR con el promotor gyrA de S. mutans, pero dejando intacto el promotor endógeno xylA de B. megaterium. Durante el diseño del sistema inducible de xilosa se consideraron ambas versiones del promotor inducible, el promotor natural Pxy/A hallado en Bacillus megateriumy un promotor híbrido del promotor altamente conservado P/dha fusionado con los sitios de unión al represor del promotor Pxy/A (Figura 5). Solo unas pocas especies de Streptococcus se han reportado para metabolizar la xilosa, y por lo tanto la presencia de una maquinaria reguladora para reconocer el promotor de xylA en las otras especies de Streptococcus no es probable. Por lo tanto, construimos ambos sistemas de inducción de xilosa, pero solo probamos la inducibilidad de mCherry conel sistema P|dha+xy|A .
Con el fin de determinar la expresión inducible de mCherry por xilosa, se indujeron cultivos celulares de logaritmo medio con el plásmido (pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+xylA) con diferentes concentraciones de xilosa. Seis horas después de la inducción, medimos la fluorescencia de mCherry en los cultivos, donde observamos niveles de expresión general sustancialmente más altos en las células que llevan el plásmido (figura 6). Cabe señalar que el sistema mostró un nivel sustancial de expresión basal incluso en los cultivos donde no se añadió xilosa. Esto significa que el sistema tiene «fugas» y en el contexto de la matriz de eliminación esto puede conducir a la muerte celular incluso antes de que el sistema se induzca con xilosa. Sin embargo, en el curso subsiguiente de este estudio utilizamos ambas versiones del plásmido (pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+xylA y pBAV1KT5-XylR-mCherry-PxylA).
2. 3 Diseño de la matriz CRISPR CAS9
Con el fin de determinar si los espaciadores de direccionamiento genómico en una matriz de CRISPR pueden causar la muerte en S.thermophilus LMD-9, insertamos la matriz de CRISPR que diseñamos en los dos sistemas inducibles por xilosa construidos anteriormente (pBAV1 KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA y pBAV1 KT5-XylR-mCherry-PXylA). En estos plásmidos reemplazamos mCherry con el gBIock que contiene la matriz de CRISPR (Figura 7). Se esperaba que la variante con el promotor Pidha+xyiA fuera más fuerte y tuviera una actividad basal más alta que la PxyiA (Xie y col. 2013).
2. 4 Inhibición del crecimiento de la población bacteriana utilizando Cas9 endógena
Después de construir los plásmidos en E.coli, transformamos los plásmidos en S. thermophilus. Esto nos permitiría determinar si podríamos causar la muerte celular de una especie bacteriana específica.
Curiosamente, el tamaño de la población de hospedadores bacterianos (indicado por el crecimiento de bacterias y el recuento de números de colonias en placas de agar) en S. thermophilus expuesto al plásmido que contiene el promotor híbrido fuerte P/dh+xy /A fue 10 veces menor en comparación con S. thermophilus expuesto al plásmido que contiene el promotor normal y débil Pxy/A (figura 8; 52 colonias con la expresión de matriz fuerte frente a 556 colonias con expresión de matriz débil, diferencia de 10,7 veces), las 2 cepas se transformaron en paralelo usando el mismo lote de células de S. thermophilus electrocompetentes. Esto nos sugiere que el plásmido que lleva la matriz de CRISPR dirigida a genes de S. thermophilus es capaz de destruir las células usando la nucleasa Cas endógena y la RNasa III, inhibiendo así el crecimiento de la población en 10 veces.
Esperamos que la expresión de matriz débil en las células hospedadoras transformadas por el plásmido que comprende el promotor Pxy/A conduzca a un grado de destrucción celular, aunque mucho menor que con el plásmido con promotor fuerte. Esperamos que la inhibición del crecimiento de la población que es mayor que la inhibición de 10 veces observada se determinaría si se hiciera una comparación de la actividad de expresión de la matriz fuerte con S thermophilus que no está expuesto a ningún plásmido codificante de matriz (tal como bacterias directamente aisladas de la microbiota intestinal). Por lo tanto, creemos que la expresión de matriz (o ARN guía único) en células hospedadoras para aprovechar la nucleasa Cas endógena será útil para proporcionar una inhibición de crecimiento eficaz de células hospedadoras diana en entornos ambientales, médicos y otros mencionados en esta invención. La coadministración de antibióticos también puede ser útil para mejorar la inhibición del crecimiento, particularmente cuando se dirigen a uno o más genes de resistencia a antibióticos.
3. Discusión y perspectivas
En este estudio nos propusimos diseñar una matriz de CRISPR para matar específicamente S. thermophilus utilizando el sistema Cas9 endógeno. Con el fin de obtener control sobre la señal de muerte, buscamos aplicar un sistema inducible que se pueda aplicar en S. thermophilus. El sistema XylR inducible en xilosa de B. megaterium se aplicó previamente en S. mutans (Xie, 2013) pero no en S. thermophilus. En este estudio demostramos la funcionalidad del sistema de inducción xylR utilizando el circuito diseñado XylR-mCherry-PIdha en S. thermophilus. Encontramos que un 0,1 % p/vol es suficiente para inducir completamente el sistema XylR en S. thermophilus (Figura 6).
Con el fin de observar la abundancia al cocultivar S. thermophilus y E. coli, establecimos que la suplementación de los medios de cultivo con 3 g I-1 de PEA, permite el crecimiento selectivo de S. thermophilus mientras limita el crecimiento de E. coli (Figura 4).
Una matriz de ST1-CRISPR, dirigida a la subunidad alfa de la polimerasa III de ADN y un gen similar a tetA en el genoma de S. thermophilus LMD-9, se colocó bajo el promotor inducible por xilosa (Xie y col. 2013).
Dirigirse a estas regiones debe conducir a una ruptura de doble hebra y, por lo tanto, limitar la viabilidad de S. thermophilus (Figura 9). Dado que la matriz modificada se diseñó para dirigirse al genoma de S. thermophilus usando la maquinaria CRISPR/Cas endógena para procesar la matriz de CRISPR codificada, se espera que la matriz no tenga influencia en el crecimiento de cepas no relacionadas tales como E. coli, incluso se podrían encontrar dianas similares en su genoma. Esto se probó con éxito en una población bacteriana mixta (simulando aspectos de una microbiota humana) como se describe en el Ejemplo 8.
La demostración de la capacidad de la invención para inhibir el crecimiento de células hospedadoras en una superficie es importante y deseable en realizaciones donde la invención es para tratar o prevenir enfermedades o afecciones mediadas o causadas por la microbiota tal como se describe en esta memoria en un sujeto humano o animal. Típicamente, dicha microbiota está en contacto con tejido del sujeto (por ejemplo, intestino, cavidad oral, pulmón, axila, tejido ocular, vaginal, anal, oído, nariz o garganta) y, por lo tanto, creemos que la demostración de actividad para inhibir el crecimiento de una especie bacteriana de microbiota (ejemplificada por Streptococcus) en una superficie respalda esta utilidad.
EJEMPLO COMPARATIVO 7 Inhibición específica del crecimiento de la población bacteriana de microbiota en diferentes cepas
El Ejemplo 6 demostró la inhibición de crecimiento específica de Streptococcus thermophilus LMD-9. Aquí demostramos que la inhibición del crecimiento también se puede obtener en una segunda cepa: Streptococcus thermophilus DSM 20617. Los procedimientos descritos en el Ejemplo 6 se aplicaron, por lo tanto, a esta última cepa (excepto que los medios selectivos para S.thermophilus DSM 20617 fueron medios TH complementados con 2,5g I-1 de 2-feniletanol (PEA)).
Se incubaron Streptococcus thermophilus DSM 20617 transformados con los plásmidos de la matriz de CRISPR para su recuperación en medios líquidos durante un período de 3 horas a 37 °C que permitiría la expresión de la resistencia a kanamicina. Después de un período de recuperación, las células se colocaron en placas en diferentes medios de selección en presencia de xilosa al 1 % para inducir la muerte celular, y sin xilosa como control (figura 10). Es evidente que; (1) por inducción de xilosa se puede inhibir el crecimiento de S. thermophilus (alrededor de 10 veces para el plásmido con promotor «fuerte» frente al control), (2) el sistema «fuerte» (pBAV1KT5-XylR-CRISPR-Pldha) da como resultado una mayor reducción del crecimiento que el sistema 'débil' (pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA).
EJEMPLO 8: Inhibición selectiva del crecimiento de la población bacteriana en un consorcio mixto de diferentes especies de microbiota
A continuación, demostramos la inhibición selectiva del crecimiento de una especie bacteriana específica en una población mixta de tres especies. Se seleccionaron especies encontradas en la microbiota intestinal de humanos y animales (S thermophilus DSM 20617(T), Lactobacillus lactis y E coli). Incluimos dos especies grampositivas (S thermophilus y L lactis) para ver si esto afectaría la capacidad de matar selectivamente a las primeras especies; además, para aumentar la dificultad (y simular más de cerca situaciones en microbiota) se eligió L lactis , ya que esta es una especie filogenéticamente relacionada con S thermophilus (como lo indica la alta identidad de secuencia del ARN ribosómico 16s entre las dos especies). S thermophilus y L lactis son ambos Firmicutes. Además, para simular la microbiota, se incluyó una especie intestinal comensal humana (E coli).
1. Materiales y procedimientos
Los procedimientos, tal como se establece en el Ejemplo 6, se utilizaron cepa (excepto que los medios selectivos fueron medios TH complementados con 2,5 g I-1 de 2-feniletanol (PEA)).
1.1 Preparación de células L.lactis electrocompetentes
Los cultivos nocturnos de L. lactis en medio TH complementado con sacarosa 0,5 M y glicina al 1 % se diluyeron 100 veces en 5 ml del mismo medio y se cultivaron a 30 °C a una OD600 entre 0,2-0,7 (aproximadamente 2 horas después de la inoculación). Las células se recogieron a 7000 x g durante 5 min a 4 °C y se lavaron tres veces con 5 ml de amortiguador de lavado en frío con hielo (sacarosa 0,5 M glicerol al 10 %). Después de que las células se lavaron, se suspendieron a una OD600 de 15-30 en amortiguador de electroporación (0,5 M de sacarosa, 10 % de glicerol y MgCl2 1mM). Las células en el amortiguador de electroporación se mantuvieron a 4 °C hasta su uso (en el plazo de una hora) o alícuota de 50 pl en tubos eppendorf, congelándolas en nitrógeno líquido y almacenándolas a -80 °C para el uso posterior.
Las condiciones de electroporación para todas las especies fueron como se describe en el Ejemplo 6.
1.2 Activación de la matriz de CRISPR: Experimentos del Consorcio.
S. thermophilus DSM 20617, L. lactis MG1363 y E. coli TOP1O se transformaron genéticamente con el plásmido que contiene la matriz de CRISPR dirigida a la ADN polimerasa III y tetA de S. thermophilus. Después de la transformación, todas las células se cultivaron solas y en cocultivo durante 3 horas a 37 °C, lo que permitió la recuperación para desarrollar la resistencia a los antibióticos codificada en el plásmido. Decidimos usar la eficiencia de transformación como una lectura de la inhibición del crecimiento codificada por CRISPR. Por lo tanto, después de permitir la recuperación de las células, los cultivos se colocaron en placas en medio TH, TH complementado con agar PEA y MacConkey, todos complementados con kanamicina e inducidos por xilosa al 1 %.
2. Resultados
2.0 Distancia filogenética entre L. lactis, E. coli y S. thermophilus
La similitud de secuencia caculada en la secuencia de ADN qule codifica ARNr 16S de S. thermophilus y L. Iactis se determinó como del 83,3 %. Se utilizaron las siguientes secuencias 16S: E. coli: AB030918.1, S. thermophilus: AY188354.1, L. lactis: AB030918. Se alinearon las secuencias con la aguja (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html) con los siguientes parámetros: - gapopen 10,0 -gapextend 0,5 -endopen 10,0 -endextend 0,5 -aformat3 pair -snucleotide1 -snucleotide2. La Figura 11 muestra el árbol filogenético de máxima probabilidad de las secuencias 16S de S. thermophilus, L. lactis y E. coli.
2.1 Condiciones de crecimiento y medios selectivos
S. thermophilus y L. lactis se utilizan comúnmente en combinación en muchos alimentos fermentados y yogur. Elegimos estas cepas, ya que se sabe comúnmente que son microbios intestinales que forman una asociación íntima con el hospedador y las caracterizaciones previas de la región de ARN ribosómico 16S de S. thermophilus y L. lactis han demostrado que estos organismos están estrechamente relacionados filogenéticamente (Ludwig y col., 1995). En paralelo, también evaluamos el crecimiento de E. coli para nuestros experimentos de cocultivo de poblaciones mixtas, ya que este organismo también se encuentra comúnmente en comunidades de microbios intestinales. Primero nos propusimos establecer las cepas bacterianas y el protocolo de cultivo que respaldaría el crecimiento de todas las cepas que planeábamos usar para los experimentos de cocultivo. Encontramos que todas las cepas fueron capaces de soportar el crecimiento en caldo TH a 37 °C (Figura 3).
Distinguir las diferentes bacterias de un cultivo mixto es importante para determinar el número celular de las diferentes especies. Con el agar MacConkey es posible cultivar selectivamente E.coli, sin embargo, no hay medios específicos para el crecimiento selectivo de S.thermophilus. El agar PEA es un medio selectivo que se utiliza para el aislamiento de bacterias grampositivas (S.thermophilus) de gramnegativas (E.coli). Además, las diferentes concentraciones de PEA inhiben parcialmente el crecimiento de las diferentes especies y cepas grampositivas, lo que permite la selección entre las otras bacterias grampositivas utilizadas en este trabajo. El uso de 2,5 g I-1 de PEA demostró que S. thermophilus crece selectivamente mientras se limita el crecimiento de L. lactis y E. coli.
Todas las cepas se transformaron con un plásmido que usó la estructura principal del vector de pBAV1 KT5 que tiene un marcador de selección de kanamicina; encontramos que el uso de medios complementados con 30 ug ml-1 de kanamicina fue suficiente para hacer crecer las células mientras se mantenía el plásmido.
2. 3 Transformación e inhibición selectiva del crecimiento en una población mixta
Transformamos S. thermophilus, L. lactis y E. coli con plásmido que contenía la matriz de CRISPR y los cultivamos en un consorcio de todas las especies bacterianas combinadas en partes iguales, lo que nos permitiría determinar si podríamos provocar muerte celular específicamente en S.thermophilus. Se transformaron todas las especies con el plásmido pBAV1 KT5-XylR-CRISPR-PXylA o pBAV1 KT5-XylR-CRISPR-Pldha+XylA
La Figura 12 muestra la inhibición selectiva del crecimiento de S thermophilus en un cocultivo de E. coli, L. Iactis y S. thermophiles que albergan tanto el plásmido pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PXylA como el pBAV1KT5-XylR-CRISPR-Pldha+XylA. No se observa ninguna diferencia de crecimiento entre E. coli que alberga el plásmido pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PXylA o el pBAV1KT5-XylR-CRISPR-Pldha+XylA (columna del centro). Sin embargo, S. thermophiles (cultivado selectivamente en agar TH suplementado con 2,5 gl-1 PEA, última columna) muestra una disminución en la eficiencia de transformación entre el plásmido pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PXylA (fuerte) o el pBAV1KT5-XylR- CRISPR-Pldha+XylA (débil) como esperábamos. Por lo tanto, demostramos una inhibición selectiva del crecimiento de la subpoblación de S thermophilus diana en la población mixta de células.
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Figure imgf000121_0001
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Figure imgf000126_0002
Se encuentra una matriz de CRISPR en Desulphovlbrio desu/p/ruricans ND132 que comienza en la posición 3491653 y termina en la posición 3498191, en la que la matriz tiene 98 secuencias espadadoras, cada una flanqueada por repeticiones, en el que las repeticiones tienen cada una la secuencia de SEQ. ID NO: 51. Dicha repetición también se encuentra en una matriz de las otras bactenas bajo la nota número 1 (última columna de la tabla)
TABLA 2:
REPETICIONES DE BACTEROIDES
Figure imgf000126_0001
REPETICIONES DE PREVOTELLA
Figure imgf000126_0003
Tabla 3: Subrayado = espaciadores CRISPR que tienen un 100 % de identidad con las secuencias dentro de V. cho/erae PLE
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Tabla 4
Figure imgf000128_0001
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Tabla 6
Gen Característica
ctxB toxina B del cólera
tcpA pilina A corregulada por toxinas
ctxA subunidad A de la toxina del cólera
tcpB proteína B de la biosíntesis del pilus corregulada por toxinas
wbet antígeno específico de Ogawa
hlyA hemolisina A
hapR proteína reguladora de la hemaglutinina/proteasa
rstR represor transcripcional del fago críptico ctxphi
mshA hemaglutinina A sensible a la manosa
tcpP proteína P de la biosíntesis del pilus corregulada por toxinas
SECUENCIAS:
En un ejemplo, uno o más espaciadores de la descripción se dirigen a una secuencia respectiva en este listado de secuencias. SEQ ID NO: 1-44 son secuencias del sistema CRISPR/Cas de tipo II, por ejemplo, secuencias de Streptococcus.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un vector de ácido nucleico que comprende una matriz de CRISPR modificadora del hospedador (HM) modificada genéticamente para su uso en el tratamiento o prevención, en un sujeto humano o animal, de una afección o enfermedad mediada por células hospedadoras bacterianas mediante la alteración de la relación relativa de subpoblaciones de la primera y segunda bacteria en una población mixta de bacterias, en el que la segunda bacteria comprende células hospedadoras, en el que la población mixta está comprendida por el sujeto,
en el que la segunda subpoblación consiste en una especie bacteriana diferente a la de la primera subpoblación,
en el que cada célula hospedadora tiene una secuencia diana hospedadora y al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas endógena a la célula hospedadora,
en el que la matriz CRISPR de modificación del hospedador (HM) modificada genéticamente comprende una secuencia espaciadora (espaciador HM) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, y el ARNcr-HM comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con la secuencia diana hospedadora;
en el que el vector puede transformar la célula hospedadora,
en el que el ARNcr-HM guía la nucleasa Cas a la diana para modificar la secuencia diana en la célula hospedadora, mediante lo cual se destruye la célula hospedadora o se reduce el crecimiento de la célula hospedadora,
en el que el vector de ácido nucleico es un vector de plásmido comprendido por una bacteria portadora, o el vector es un vector de fagos.
2. Un vector de ácido nucleico que comprende una matriz de CRISPR modificadora del hospedador (HM) modificada genéticamente y una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas para el uso en el tratamiento o prevención, en un sujeto humano o animal, de una afección o enfermedad mediada por células hospedadoras bacterianas mediante la alteración de la relación relativa de subpoblaciones de la primera y segunda bacteria en una población mixta de bacterias, en el que la segunda bacteria comprende células hospedadoras, en el que la población mixta está comprendida por el sujeto,
en el que la segunda subpoblación consiste en una especie bacteriana diferente a la de la primera subpoblación,
en el que cada célula hospedadora tiene una secuencia diana hospedadora, en el que el vector puede transformar la célula hospedadora,
en el que la matriz CRISPR de modificación del hospedador (HM) modificada genéticamente comprende una secuencia espaciadora (espaciador HM) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, y el ARNcr-HM comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con la secuencia diana hospedadora,
en el que el ARNcr-HM guía la nucleasa Cas a la diana para modificar la secuencia diana en la célula hospedadora, mediante lo cual se destruye la célula hospedadora o se reduce el crecimiento de la célula hospedadora,
en el que el vector de ácido nucleico es un vector de plásmido comprendido por una bacteria portadora, o el vector es un vector de fagos.
3. El uso de un vector de ácido nucleico que comprende una matriz de CRISPR/Cas de modificación de hospedador (HM) modificada genéticamente para alterar la relación relativa de subpoblaciones de la primera y la segunda bacteria en una población mixta ex vivo de bacterias, donde la segunda bacteria comprende células hospedadoras,
en el que la segunda subpoblación consiste en una especie bacteriana diferente a la de la primera subpoblación,
en el que cada célula hospedadora tiene una secuencia diana hospedadora y al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas endógena a la célula hospedadora,
en el que la matriz CRISPR de modificación del hospedador (HM) modificada genéticamente comprende una secuencia espaciadora (espaciador HM) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, y el ARNcr-HM comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con la secuencia diana hospedadora;
en el que el vector puede transformar la célula hospedadora,
en el que el ARNcr-HM guía la nucleasa Cas a la diana para modificar la secuencia diana en la célula hospedadora, mediante lo cual se destruye la célula hospedadora o se reduce el crecimiento de la célula hospedadora,
en el que el vector de ácido nucleico es un vector de plásmido comprendido por una bacteria portadora, o el vector es un vector de fagos.
4. El uso de un vector de ácido nucleico que comprende una matriz de CRISPR/Cas de modificación de hospedador (HM) modificada genéticamente y una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas para alterar la relación relativa de subpoblaciones de la primera y la segunda bacteria en una población mixta ex vivo de bacterias, donde la segunda bacteria comprende células hospedadoras,
en el que la segunda subpoblación consiste en una especie bacteriana diferente a la de la primera subpoblación,
en el que cada célula hospedadora tiene una secuencia diana hospedadora, en el que el vector puede transformar la célula hospedadora,
en el que la matriz CRISPR de modificación del hospedador (HM) modificada genéticamente comprende una secuencia espaciadora (espaciador HM) y repeticiones que codifican un ARNcr-HM, y el ARNcr-HM comprende una secuencia que es capaz de hibridarse con la secuencia diana hospedadora,
en el que el ARNcr-HM guía la nucleasa Cas a la diana para modificar la secuencia diana en la célula hospedadora, mediante lo cual se destruye la célula hospedadora o se reduce el crecimiento de la célula hospedadora,
en el que el vector de ácido nucleico es un vector de plásmido comprendido por una bacteria portadora, o el vector es un vector de fagos.
5. El uso de las reivindicaciones 3 o 4 para tratar un fluido, superficie, aparato o recipiente médico industrial o ex vivo; o para tratar una vía fluvial, agua, una bebida, un producto alimenticio o un cosmético, en el que la o las células hospedadoras están comprendidas por o sobre el fluido, superficie, aparato, recipiente, vía fluvial, agua, bebida, producto alimenticio o cosmético.
6. El uso o vector para el uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que alternativamente ARNcr-HM y ARNtracr están comprendidos por un único ARN guía (ARNg).
7. El uso o vector para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el crecimiento de la población de células hospedadoras se reduce al menos 5 veces en comparación con el crecimiento de una población de dichas células hospedadoras no transformadas con dicha matriz HM o una secuencia de nucleótidos que codifica dicho ARNg.
8. El uso según la reivindicación 3, la reivindicación 4 o cualquiera de las reivindicaciones 5-7 cuando depende de la reivindicación 3 o 4,
en el que se inhibe el crecimiento de la población de células hospedadoras en una superficie.
9. El uso o vector para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, o cualquiera de las reivindicaciones 5-8 cuando
es dependiente de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, en el que cada vector carece de una secuencia de codificación de nucleasa Cas.
10. El uso o vector para el uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el vector comprende una secuencia de ADN para expresar una secuencia de ARNtracr.
11. El uso o vector para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la población mixta comprende S. thermophilus, L. lactis y E. coli.
12. El uso o vector para el uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la nucleasa Cas es una nucleasa Cas tipo I, una nucleasa Cas tipo II o una nucleasa Cas tipo III.
13. Un vector para el uso, o uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el vector que comprende secuencias de ácido nucleico para expresar una pluralidad de ARNcr diferentes (por ejemplo, comprendidos por ARNg) en el que un primero de dichos ARNcr es capaz de hibridarse con una primera secuencia de ácido nucleico en dicha célula hospedadora; y un segundo de dichos ARNcr es capaz de hibridarse con una segunda secuencia de ácido nucleico en dicha célula hospedadora, en el que dicha segunda secuencia es diferente de dicha primera secuencia; y
(a) la primera secuencia está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos (o ARN de del mismo); opcionalmente en la que los genes son diferentes;
(b) la primera secuencia está comprendida por un gen de resistencia a antibióticos (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen esencial o de virulencia (o ARN del mismo);
(c) la primera secuencia está comprendida por un gen esencial (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen esencial o de virulencia (o ARN del mismo); o
(d) la primera secuencia está comprendida por un gen de virulencia (o ARN del mismo) y la segunda secuencia está comprendida por un gen esencial o de virulencia (o ARN del mismo).
14. Un vector para el uso o uso según cualquiera de las reivindicaciones 1,3 y 6-12 cuando depende de la reivindicación 1 o 3, en el que el vector comprende más de 1,4 kb de secuencia de ADN exógeno, en el que el ADN exógeno codifica uno o más componentes de un sistema CRISPR/Cas y comprende una matriz modificada genéticamente para expresar ARNcr-HM o ARNg en células hospedadoras; en el que al menos 2 ARNc o ARNg diferentes están codificados por el ADN exógeno (por ejemplo, por al menos 2 matrices HM-CRISPR).
15. El vector para el uso o el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1,3 y 6-14 cuando depende de la reivindicación 1 o 3, en el que el vector está desprovisto de una secuencia de nucleótidos que codifica una nucleasa Cas que es cognada con los ARNc o ARNg.
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