CN116058432B - 一种柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂及其制备方法和应用，所述柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂的制备方法为：（1）柠檬酸发酵液压滤得柠檬酸菌丝渣，加入离子钙溶液调浆后，得柠檬酸菌丝浆，再经乳化，加入糖蜜、玉米渣蛋白、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰，得到发酵培养基；（2）将产朊假丝酵母种子液、枯草芽孢杆菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液、植物乳杆菌种子液、粪肠球菌种子液和嗜酸乳杆菌种子液接种于发酵培养基中发酵，待发酵结束，过滤，得到的发酵液，即为柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂。本发明采用柠檬酸发酵副产物菌丝渣作为原料，经发酵后，得到的饲料添加剂，可有效将菌丝渣中的大分子分解为小分子，更易被动物吸收。

Description

一种柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂及制备方法和应用。

背景技术

中国的柠檬酸产量约占世界总产量的80%，目前柠檬酸生产主要以黑曲霉突变菌株发酵法生产，在柠檬酸生产过程中，每吨柠檬酸产生柠檬酸菌丝渣150 kg-170 kg。柠檬酸菌丝渣含有多种营养成分，其中，总糖约32.6%，粗脂肪约10%，粗纤维约14.5%，粗灰分约21%，还有余量的甲壳素和壳聚糖等，而甲壳素主要存在于细胞壁中，细胞壁中含有20%~22%的甲壳素，甲壳素具有抗菌活性、激活免疫因子，提高免疫力、调节脂肪代谢，降低血脂胆固醇、调节pH值、改善机体内环境等多种生理功能。

由于柠檬酸菌丝渣中含有多种营养成分，但柠檬酸菌丝渣中甲壳素和纤维素常以大分子的形式存在，不易被动物吸收利用，同时，柠檬酸菌丝渣虽然常作为成年畜禽和反刍动物饲料或饲料添加剂的原料，但目前对柠檬酸菌丝渣作为原料用于水产动物饲料的相关研究较少。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂及其制备方法和应用。本发明采用产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌和嗜酸乳杆菌共同发酵得到微生物饲料添加剂，同时，所述微生物饲料添加剂与水产饲料混合后用于喂养水产动物，其中富含多聚糖、氨基酸、脂肪酸、低分子量甲壳素和壳聚糖营养物质，能更好的被水产动物吸收，同时，能提高水产动物消化能力、免疫能力、促生长能力、水体调节能力。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供了一种柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）将柠檬酸发酵液压滤得到柠檬酸菌丝渣，再加入离子钙溶液进行调浆，得到柠檬酸菌丝浆，将柠檬酸菌丝浆乳化后，再加入糖蜜、玉米渣蛋白、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰，经灭菌后得到发酵培养基；

（2）将产朊假丝酵母种子液、枯草芽孢杆菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液、植物乳杆菌种子液、粪肠球菌种子液和嗜酸乳杆菌种子液分别接种于步骤（1）得到的发酵培养基中进行发酵，待发酵结束，过滤，得到的发酵液即为柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂。

优选的，步骤（1）中，柠檬酸菌丝浆中的固形物的质量分数为10%。

优选的，步骤（1）中，乳化后柠檬酸菌丝浆的目数为100~200目。

优选的，步骤（1）中，发酵培养基的组成为：糖蜜5.0份、柠檬酸菌丝浆80份、玉米渣蛋白2.0份、磷酸氢二钾1.0~3.0份、硫酸镁0.1~0.5份和硫酸锰0.01~0.10份。

优选的，步骤（1）中，发酵培养基的pH为6.5~7.0。

优选的，步骤（1）中，所述离子钙溶液中Ca²⁺浓度为600~700 mg/mL。

优选的，步骤（1）中，灭菌温度为115 ℃，灭菌时间为20 min。

优选的，步骤（2）中，产朊假丝酵母的保藏编号为ACCC 20060，枯草芽孢杆菌的保藏编号为ACCC 60429，地衣芽孢杆菌的保藏编号为ACCC 19372，植物乳杆菌的保藏编号为ACCC11118，粪肠球菌的保藏编号为ACCC 19855，嗜酸乳杆菌的保藏编号为ACCC 11073。

优选的，步骤（2）中，产朊假丝酵母种子液的接种量为发酵培养基体积的0.5~1.5%，枯草芽孢杆菌种子液的接种量为发酵培养基体积的0.5~1.5%，地衣芽孢杆菌种子液的接种量为发酵培养基体积的0.5~1.5%，植物乳杆菌种子液的接种量为发酵培养基体积的2.0~5.0%、粪肠球菌种子液的接种量为发酵培养基体积的2.0~5.0%，嗜酸乳杆菌种子液的接种量为发酵培养基体积的2.0~5.0%。

优选的，步骤（2）中，发酵方法为采用好氧-静态发酵模式。

进一步优选的，好氧-静态发酵处理为：先于33℃、pH为6.0~6.5、搅拌转速为100~150r/min、通风量为0.5~1.5vvm进行好氧发酵，待好氧发酵结束后，调节发酵温度为33℃、pH为6.5，并停止通气和搅拌，进行静态发酵。

进一步优选的，好氧发酵时间为18~22h。

进一步优选的，当发酵体系中pH降低至2.5~3.5、每小时产气量小于5mL、总菌落数≥2×10⁸cfu/g时结束静态发酵。

进一步优选的，静态发酵时间为95~105h。

本发明的第二方面，提供了一种柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂。

本发明的第三方面，提供了一种柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂在水产饲料中的应用，包括以下步骤：

将柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂加水稀释后，得稀释液，将稀释液与水产饲料拌匀，每五天使用一次。

优选的，柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂加水稀释2倍。

优选的，水产饲料和柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂的质量比为100:1。

本发明的有益效果：

1.本发明采用离子钙溶液和柠檬酸菌丝渣进行调浆、并利用剪切泵对柠檬酸菌丝浆进行乳化，使处理后的柠檬酸菌丝浆更均一稳定，从而，更有利于产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌在含有柠檬酸菌丝浆的培养基中发酵。

2.本发明采用现有的柠檬酸发酵副产物菌丝体废渣为主要原料，产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌协同发酵，制得柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂，一方面，通过微生物发酵产生的淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、脂肪酶和几丁质酶将柠檬酸菌丝渣中的营养成分转化为小分子的多聚糖、氨基酸、脂肪酸、甲壳素和壳聚糖，易被动物体吸收；另一方面，发酵产生的乳酸、短链脂肪酸和乙醇，使其具有较好的诱食性和营养性，同时，甲壳素和壳聚糖可防治甲壳类动物蜕壳不遂症，减少疾病发生率，降低动物的死亡率，另外，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌对水体调节有良好的效果，制得的微生物饲料添加剂显著提高水产动物消化能力、免疫能力、促生长能力。

3.本发明还采用好氧-静态发酵模式，其中，好氧发酵有利于酵母菌和芽孢杆菌大量繁殖，酵母菌和芽孢杆菌在有氧发酵过程中，可将柠檬酸菌丝渣中大分子的多聚糖、脂肪、蛋白质、维生素分解成小分子，为乳酸菌厌氧静态发酵提供营养物质。

4.本发明制得的微生物饲料添加剂与水产饲料拌匀喂养时，使用45天后，每100尾虾平均增重6.56g，饲料添加剂中的钙离子、甲壳素和壳聚糖可以缩短脱壳周期，提高虾脱壳率，减少脱壳不遂引起的死亡率；饲料添加剂中的益生菌具有改善肠道微环境的效果，对白便病具有良好的防治效果。

附图说明

图1：（a）试验组柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂在虾养殖中使用45天效果图，（b）对照组微生物饲料添加剂在虾养殖中使用45天效果图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术所述，柠檬酸发酵副产物为柠檬酸菌丝渣，柠檬酸菌丝渣中含有多种大分子营养成分，当柠檬酸菌丝渣作为原料直接用于动物饲养时，其中的营养物质很难被动物体吸收，同时，将柠檬酸菌丝渣作为原料进行发酵处理，用于水产动物的饲料中的相关研究还较少。基于此，本发明提供了一种柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂及其在水产饲料中的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

说明：所述产朊假丝酵母购于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC 20060；所述枯草芽孢杆菌购于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC60429；所述地衣芽孢杆菌购于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC19372；所述植物乳杆菌购于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC 11118；所述粪肠球菌购于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC 19855；所述嗜酸乳杆菌购于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC 11073。

实施例1：

将产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌和嗜酸乳杆菌采用液体活化培养基进行活化处理，液体活化培养基的组成为：葡萄糖3~8份、柠檬酸菌丝渣粉5~15份、磷酸氢二钾1~3份，pH 6.5~7.0，将配置好的液体活化培养基进行高压蒸汽灭菌，灭菌条件为121 ℃维持15 min；

以2.0%接种量，将产朊假丝酵母接种到液体活化培养基中，培养温度为30 ℃，摇床转速220 r/min，培养时间48 h，得产朊假丝酵母种子液；

以1.0%接种量，将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌分别接种到液体活化培养基中，培养温度为37 ℃，摇床转速220 r/min，培养时间12 h，分别得枯草芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液；

以3.0%接种量，将植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌分别接种到液体活化培养基中，培养温度为37 ℃，静置培养时间24 h，分别得植物乳杆菌种子液、嗜酸乳杆菌种子液和粪肠球菌种子液。

实施例2：柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂的制备

（1）将发酵柠檬酸发酵液进行压滤得到柠檬酸菌丝渣，其中柠檬酸菌丝渣的水分含量为65%、绝干固形物含量35%，将柠檬酸菌丝渣中加入Ca²⁺浓度为650 mg/L的离子钙溶液进行调浆，得到柠檬酸菌丝浆，其中柠檬酸菌丝浆中的固形物质量分数为10%，利用三级高剪切乳化泵对檬酸菌丝渣浆料粉碎至其目数为150目并乳化，再加入糖蜜、玉米渣蛋白、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰，于115 ℃下进行高压蒸汽灭菌20 min，得发酵培养基，将发酵培养基通入冷却水，控制发酵培养基的温度为33 ℃，

其中，发酵培养基的组成为：糖蜜5.0份、柠檬酸菌丝浆80份、玉米渣蛋白2.0份、磷酸氢二钾1.0-3.0份、硫酸镁0.3份、硫酸锰0.06份，发酵培养基的pH为 6.7；

（2）将实施例1制得的产朊假丝酵母种子液、枯草芽孢杆菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液、植物乳杆菌种子液、粪肠球菌种子液和嗜酸乳杆菌种子液接种于步骤（1）中的温度为33℃的发酵培养基中，于33℃、pH为6.2，搅拌转速为125 r/min，通风量为0.8 vvm的条件下进行好氧发酵，发酵20 h，待好氧发酵结束后，关闭搅拌、关闭通风，维持发酵温度为33℃，调节pH为6.5进行静态发酵，在静态发酵过程中，每4 h取样测定发酵培养基的pH、产气量和菌量变化，当pH降低至5.0时，流加糖蜜，控制糖蜜终浓度为2~3 g/L，当pH降低至2.5~3.5、每小时产气量小于5 mL、总菌落数≥2×10⁸cfu/g时结束发酵，静态发酵时间为100 h，过滤，得到发酵液即为柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂。

其中，产朊假丝酵母种子液的接种量为发酵培养基体积的0.5%，枯草芽孢杆菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液的接种量分别为发酵培养基体积的1.0%，植物乳杆菌种子液、嗜酸乳杆菌种子液、粪肠球菌种子液的接种量分别为发酵培养基体积的2.0%。

实施例3：柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂的制备

（1）将发酵柠檬酸发酵液进行压滤得到柠檬酸菌丝渣，其中柠檬酸菌丝渣的水分质量分数为65%、绝干固形物质量分数为35%，将柠檬酸菌丝渣中加入Ca²⁺浓度为600 mg/L的离子钙溶液进行调浆，得到柠檬酸菌丝浆，其中柠檬酸菌丝浆中的固形物质量分数为10%，利用三级高剪切乳化泵对檬酸菌丝渣浆料粉碎至其目数为100目并乳化，再加入糖蜜、玉米渣蛋白、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰，于115 ℃下进行高压蒸汽灭菌20 min，得发酵培养基，将发酵培养基通入冷却水，控制发酵培养基的温度为33 ℃，

其中，发酵培养基的组成为：糖蜜5.0份、柠檬酸菌丝浆80份、玉米渣蛋白2.0份、磷酸氢二钾1.0份、硫酸镁0.1份、硫酸锰0.01份，发酵培养基的pH为 6.5；

（2）将实施例1制得的产朊假丝酵母种子液、枯草芽孢杆菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液、植物乳杆菌种子液、粪肠球菌种子液和嗜酸乳杆菌种子液接种于步骤（1）中的温度为33 ℃的发酵培养基中，于33 ℃、pH为6.0，搅拌转速为100 r/min，通风量为0.5 vvm的条件下进行好氧发酵，发酵18 h，待好氧发酵结束后，关闭搅拌、关闭通风，维持发酵温度为33℃，调节pH为6.5进行静态发酵，在静态发酵过程中，每4h取样测定发酵培养基的pH、产气量和菌量变化，当pH降低至5.0时，流加糖蜜，控制糖蜜终浓度为2~3 g/L，当pH降低至2.5~3.5、每小时产气量小于5 mL、总菌落数≥2×10⁸cfu/g时结束发酵，过滤，静态发酵时间为95 h，得到发酵液即为柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂，

其中，产朊假丝酵母种子液的接种量为发酵培养基体积的0.5%，枯草芽孢杆菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液的接种量分别为发酵培养基体积的0.5%，植物乳杆菌种子液、嗜酸乳杆菌种子液、粪肠球菌种子液的接种量分别为发酵培养基体积的2.0%。

实施例4：柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂的制备

（1）将发酵柠檬酸发酵液进行压滤得到柠檬酸菌丝渣，其中柠檬酸菌丝渣的水分含量为65%、绝干固形物含量35%，将柠檬酸菌丝渣中加入Ca²⁺浓度为700 mg/L的离子钙溶液进行调浆，得到柠檬酸菌丝浆，其中柠檬酸菌丝浆中的固形物含量为10%，利用三级高剪切乳化泵对檬酸菌丝渣浆料粉碎至其粒度为200目并乳化，再加入糖蜜、玉米渣蛋白、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰，于115 ℃下进行高压蒸汽灭菌20 min，得发酵培养基，将发酵培养基通入冷却水，控制发酵培养基的温度为33 ℃，

其中，发酵培养基的组成为：糖蜜5.0份、柠檬酸菌丝浆80份、玉米渣蛋白2.0份、磷酸氢二钾3.0份、硫酸镁0.5份、硫酸锰0.10份，发酵培养基的pH为7.0；

（2）将实施例1制得的产朊假丝酵母种子液、枯草芽孢杆菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液、植物乳杆菌种子液、粪肠球菌种子液和嗜酸乳杆菌种子液接种于步骤（1）中的温度为33 ℃的发酵培养基中，于33 ℃、pH为6.5，搅拌转速为150 r/min，通风量为1.5 vvm的条件下进行好氧发酵，发酵22 h，待好氧发酵结束后，关闭搅拌、关闭通风，维持发酵温度为33℃，调节pH为6.5进行静态发酵，在静态发酵过程中，每4 h取样测定发酵培养基的pH、产气量和菌量变化，当pH降低至5.0时，流加糖蜜，控制终浓度为2~3 g/L，当pH降低至2.5~3.5、每小时产气量小于5 mL、总菌落数≥2×10⁸cfu/g时结束发酵，静态发酵时间为105 h，过滤，得到发酵液即为柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂，

其中，产朊假丝酵母种子液的接种量为发酵培养基体积的1.5%，枯草芽孢杆菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液的接种量分别为发酵培养基体积的1.5%，植物乳杆菌种子液、嗜酸乳杆菌种子液、粪肠球菌种子液的接种量分别为发酵培养基体积的5.0%。

实施例5：柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂的制备

（1）将发酵柠檬酸发酵液进行压滤得到柠檬酸菌丝渣，其中柠檬酸菌丝渣的水分含量为65%、绝干固形物含量35%，将柠檬酸菌丝渣中加入Ca²⁺浓度为650 mg/L的离子钙溶液进行调浆，得到柠檬酸菌丝浆，其中柠檬酸菌丝浆中的固形物含量为10%，利用三级高剪切乳化泵对檬酸菌丝渣浆料粉碎至其粒度为150目并乳化，再加入糖蜜、玉米渣蛋白、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰，于115 ℃下进行高压蒸汽灭菌20 min，得发酵培养基，将发酵培养基通入冷却水，控制发酵培养基的温度为33 ℃，

其中，发酵培养基的组成为：糖蜜5.0份、柠檬酸菌丝浆80份、玉米渣蛋白2.0份、磷酸氢二钾2.0份、硫酸镁0.3份、硫酸锰0.06份，发酵培养基的pH为6.7；

（2）将实施例1制得的产朊假丝酵母种子液、枯草芽孢杆菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液、植物乳杆菌种子液、粪肠球菌种子液和嗜酸乳杆菌种子液接种于步骤（1）中的温度为33 ℃的发酵培养基中，于33℃、pH为6.2，搅拌转速为125 r/min，通风量为1.0 vvm的条件下进行好氧发酵，发酵20 h，待好氧发酵结束后，关闭搅拌、关闭通风，维持发酵温度为33℃，调节pH为6.5进行静态发酵，在静态发酵过程中，每4h取样测定发酵培养基的pH、产气量和菌量变化，当pH降低至5.0时，流加糖蜜，控制终浓度为2~3 g/L，当pH降低至2.5~3.5、每小时产气量小于5 mL、总菌落数≥2×10⁸cfu/g时结束发酵，静态发酵时间为100 h，过滤，得到发酵液即为柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂，

其中，产朊假丝酵母种子液的接种量为发酵培养基体积的1.0%，枯草芽孢杆菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液的接种量分别为发酵培养基体积的1.0%，植物乳杆菌种子液、嗜酸乳杆菌种子液、粪肠球菌种子液的接种量分别为发酵培养基体积的3.5%。

对比例1：微生物饲料添加剂的制备

将实施例1制得的产朊假丝酵母种子液按发酵培养基体积的0.5%的接种量接种于实施例2中步骤（1）中的温度为33℃的发酵培养基中，进行好氧-静态发酵，待发酵结束后，过滤，得到发酵液即为微生物饲料添加剂，

其中，好氧-静态发酵的发酵过程与实施例2中步骤（2）中好氧-静态发酵相同。

对比例2：微生物饲料添加剂的制备

将实施例1制得的枯草芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液分别按发酵培养基体积的1.0%的接种量接种于实施例2中步骤（1）中的温度为33 ℃的发酵培养基，进行好氧-静态发酵，待发酵结束后，过滤，得到发酵液即为微生物饲料添加剂，

其中，好氧-静态发酵的发酵过程与实施例2中步骤（2）中好氧-静态发酵相同。

对比例3：微生物饲料添加剂的制备

将实施例1制得的植物乳杆菌种子液、粪肠球菌种子液和嗜酸乳杆菌种子液分别按发酵培养基体积的2.0%的接种量接种于实施例2中步骤（1）中的温度为33 ℃的发酵培养基，进行好氧-静态发酵，待发酵结束后，过滤，得到发酵液即为微生物饲料添加剂，

其中，好氧-静态发酵的发酵过程与实施例2中步骤（2）中好氧-静态发酵相同。

对比例4：微生物饲料添加剂的制备

将实施例1制得的产朊假丝酵母种子液按0.5%的接种量、枯草芽孢杆菌种子液按发酵培养基体积的1.0%的接种量、地衣芽孢杆菌种子液按发酵培养基体积的1.0%的接种量分别接种于实施例2中步骤（1）中的温度为33 ℃的发酵培养基，进行好氧-静态发酵，待发酵结束后，过滤，得到发酵液即为微生物饲料添加剂，

其中，好氧-静态发酵的发酵过程与实施例2中步骤（2）中好氧-静态发酵相同。

对比例5：微生物饲料添加剂的制备

将实施例1制得的产朊假丝酵母种子液按发酵培养基体积的0.5%的接种量、植物乳杆菌种子液按发酵培养基体积的2.0%的接种量、粪肠球菌种子液按发酵培养基体积的2.0%的接种量、嗜酸乳杆菌种子液按发酵培养基体积的2.0%的接种量分别接种于实施例2中步骤（1）中的温度为33 ℃的发酵培养基，进行好氧-静态发酵，待发酵结束后，过滤，得到发酵液即为微生物饲料添加剂，

其中，好氧-静态发酵的发酵过程与实施例2中步骤（2）中好氧-静态发酵相同。

对比例6：微生物饲料添加剂的制备

将实施例1制得的枯草芽孢杆菌种子液按发酵培养基体积的1.0%的接种量、地衣芽孢杆菌种子液按发酵培养基体积的1.0%的接种量、植物乳杆菌种子液按发酵培养基体积的2.0%的接种量、粪肠球菌种子液按发酵培养基体积的2.0%的接种量、嗜酸乳杆菌种子液按发酵培养基体积的2.0%的接种量分别接种于实施例2中步骤（1）中的温度为33℃的发酵培养基，进行好氧-静态发酵，待发酵结束后，过滤，得到发酵液即为微生物饲料添加剂，

其中，好氧-静态发酵的发酵过程与实施例2中步骤（2）中好氧-静态发酵相同。

试验例1：

将实施例2制得的柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂与对比例1~6中的微生物饲料添加剂分别以拌料的形式使用于水产饲料中，每100kg的水产饲料中使用1kg微生物饲料添加剂，将微生物饲料添加剂加水稀释2倍，采用立式饲料搅拌机将微生物饲料添加剂与水产饲料搅拌均匀，每5天使用1次。

挑选健康的南美白对虾幼苗800尾，随机分成8组，每组100尾，以喂养不添加微生物饲料添加剂的水产饲料的虾为对照组，试验组1~7分别为喂养含有实施例2柠檬酸菌丝渣微生物添加剂和对比例1~6的微生物饲料添加剂的水产饲料的虾，每5天喂养1次，根据南美白对虾不同时期生长需求投放适量的饲料，45天后称重对照组和试验组的虾，计算每组虾的平均增重，结果如表1所示，

每组100尾虾平均增重计算公式为：

。

式中：m’—100尾虾平均增重（g）

m₂—实验组100尾虾的重量（g）

m₁—对照组100尾虾的重量（g）

表1对照组和试验组1~7中100尾虾45天平均增重（g）

通过上表可以看出，试验组1为喂养含有实施例2的柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂的水产饲料的虾，试验组1中虾的平均增重为6.56g，通过与试验组2~7喂养含有对比例1~6的微生物饲料添加剂的水产饲料的虾的平均增重相比，喂养含有实施例2的柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂的水产饲料的虾的平均增重均高于喂养含有对比例1~6的微生物饲料添加剂的水产饲料的虾的平均增重。由此可以看出，使用产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌多菌协同发酵可以有效提高虾的重量，产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌可以有效的将柠檬酸菌丝渣中的大分子转化为小分子，促进动物体更好的吸收其中的营养成分。

试验例2

检测实施例2中柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂各氨基酸、壳聚糖的含量和钙离子浓度，结果如表2所示。

其中，氨基酸含量检测方法依据GB/T 18246-2019 饲料中氨基酸的测定；

壳聚糖含量检测方法依据GB/T 38479-2021 壳聚糖含量测定 高效液相色谱法；

钙离子浓度检测方法依据GB/T 15454-2009 工业循环冷却水中钠、铵、钾、镁和钙离子的测定离子色谱法。

表2 实施例2制得的柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂中各营养成分含量（mg/L）

由表2可以看出，该柠檬酸菌丝渣饲料添加剂中的产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌将柠檬酸菌丝渣和玉米渣蛋白中的大分子营养物质分解为小分子多聚糖、氨基酸、脂肪酸、甲壳素和壳聚糖，饲料添加剂中的钙离子、甲壳素和壳聚糖可以缩短脱壳周期，提高虾脱壳率，减少脱壳不遂引起的死亡率；饲料添加剂中的益生菌和壳聚糖具有改善肠道微环境的效果，对白便病具有良好的防治效果。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将柠檬酸发酵液压滤得到柠檬酸菌丝渣，再加入离子钙溶液进行调浆，得到柠檬酸菌丝浆，将柠檬酸菌丝浆乳化，再加入糖蜜、玉米渣蛋白、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰，于115℃下灭菌20min后，得到pH为6.5-7.0的发酵培养基；

柠檬酸菌丝浆中固形物的质量分数为10%，乳化后柠檬酸菌丝浆的目数为100-200目；

所述发酵培养基由如下重量份的原料组成：糖蜜5.0份、柠檬酸菌丝浆80份、玉米渣蛋白2.0份、磷酸氢二钾1.0-3.0份、硫酸镁0.1-0.5份和硫酸锰0.01-0.10份

（2）将产朊假丝酵母种子液、枯草芽孢杆菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液、植物乳杆菌种子液、粪肠球菌种子液和嗜酸乳杆菌种子液接种于步骤（1）得到的发酵培养基中进行发酵，待发酵结束，过滤，得到的发酵液即为柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂；

产朊假丝酵母种子液的接种量为发酵培养基体积的0.5-1.5%，枯草芽孢杆菌种子液的接种量为发酵培养基体积的0.5-1.5%，地衣芽孢杆菌种子液的接种量为发酵培养基体积的0.5-1.5%，植物乳杆菌种子液的接种量为发酵培养基体积的2.0-5.0%，粪肠球菌种子液的接种量为发酵培养基体积的2.0-5.0%，嗜酸乳杆菌种子液的接种量为发酵培养基体积的2.0-5.0%；

发酵方法为：先于33℃、pH为6.0-6.5、搅拌转速为100-150r/min、通风量为0.5-1.5vvm进行好氧发酵，待好氧发酵结束后，维持发酵温度为33℃，调节pH为6.5，停止通气和搅拌，进行静态发酵；

产朊假丝酵母的保藏编号为ACCC 20060，枯草芽孢杆菌的保藏编号为ACCC 60429，地衣芽孢杆菌的保藏编号为ACCC 19372，植物乳杆菌的保藏编号为ACCC 11118，粪肠球菌的保藏编号为ACCC 19855，嗜酸乳杆菌的保藏编号为ACCC 11073。

2.权利要求1所述的制备方法制备得到的柠檬酸菌丝渣微生物饲料添加剂。

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