JP2022106717A - 微生物集団の改変および微生物相の修飾 - Google Patents

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Abstract

【課題】細菌集団増殖阻害または混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率の改変のための方法、宿主細胞核酸修飾のために改変されたシステム、該システムの要素および工業および製薬へのこれらの応用などを提供する。【解決手段】細菌種の混合集団における第一および第二細菌種の亜集団の相対比率を変えることにより、ヒトまたは動物対象における細菌宿主細胞が介在する疾患または状態の処置または予防における使用のための宿主修飾（ＨＭ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであって、該混合集団は該対象に含まれ、該宿主細胞は該第二細菌種の細胞であり、各宿主細胞について少なくとも下記の要素を含むシステムである：（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列。【選択図】図１２

Description

発明の分野
本発明は、細菌集団の増殖阻害、混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の
相対比率の改変の方法、そのための核酸アレイおよび該アレイを含むベクターに関する。
本発明は、宿主細胞核酸修飾のために改変されたシステム、該システムの要素および工業
および製薬へのこれらの応用に関する。本発明は、例えば、環境、食品および飲料使用の
ための微生物の処理に特に有用である。本発明は、とりわけ産業用または家庭用システム
における基質または流体の微生物学的影響下での腐食(ＭＩＣ)または生物付着の処理方法
に関する。本発明はまた、本方法に使用するための処理された流体およびベクターにも関
する。ある実施態様において、本方法は、アレイの水平伝播を使用する。本発明はまたこ
の目的のために可動遺伝要素(ＭＧＥ)により構成されるアレイおよび該アレイを含むベク
ターも提供する。
発明の背景
細菌集団増殖阻害および共存する細菌種の相対比率の改変は、広範な工場および他の施
設における、水路、飲料水または他の環境施設での処理に応用される。またヒトおよび非
ヒト動物、例えば、家畜における感染症の低減または腸内または口内微生物相のリバラン
スのための細菌改変にも応用される。近年、色々な体重または肥満プロファイルを有する
ヒトにおける腸内細菌の相対比率の分析またはクローン病のような疾患における細菌の影
響の可能性の探索にも興味がもたれている。
ファージに対する細菌自然免疫機序は豊富であるが、広く報告されている細菌適応免疫
システムはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである。改変されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシス
テムは、細菌から動物および植物細胞にわたる、種々のタイプの原核および真核細胞にお
ける核酸の正確な修飾に使用されている(例えば、Jiang W et al (2013)参照)。細菌およ
び古細菌のような原核生物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ(規則的に短い正逆同義の反復(repe
at)の挿入により形成／CRISPR associated)と呼ばれる適応免疫システムをコードして、
ウイルス(例えば、バクテリオファージ)およびプラスミドのような移動性侵入物に対する
耐性を提供する。バクテリオファージ(またはファージ)が地球上で最も多い生命体であり
、その細菌餌食の１０倍を越えると推定される(Seed et al (2013)を参照)。ファージ捕
食の不変の脅威は、広範囲の細菌免疫機序を発生させ、これが、続いて多様なファージ免
疫回避戦略をもたらし、動的共進化的軍備拡張競争に至っている。
宿主免疫は、記憶座位(ＣＲＩＳＰＲアレイ)における侵入物ＤＮＡ配列の取り込み、こ
の座位からのガイドＲＮＡの形成およびプロトスペーサー隣接モチーフ(ＰＡＭ)の隣に位
置する同族侵入物ＤＮＡ(プロトスペーサー)の分解に基づく。例えばＷＯ２０１０／０７
５４２４号参照。宿主ＣＲＩＳＰＲアレイは、種々の要素からなる：反復が同一であり、
スペーサーが異なる１以上の反復－スペーサー－反復単位の直ぐ５’のリーダー(プロモ
ーターを含む)。侵入ウイルスまたはプラスミド核酸からスペーサー配列を獲得すること
により、宿主防御システムは、新規スペーサーをＣＲＩＳＰＲアレイ(各スペーサーは反
復に隣接する)に取り込み、ウイルスまたはプラスミドによる将来の侵襲に対処するため
の記憶として作用することができる。最近獲得されたスペーサーは、宿主アレイのリーダ
ー直後に挿入される傾向にあることが観察されている。
ＣＲＩＳＰＲ座位およびその関連遺伝子(Ｃａｓ)が、細菌および古細菌にファージおよ
び他の侵入遺伝要素に対して適応免疫を与えることが報告されている(Heler et al (2014
)を参照)。あらゆる免疫系の基本的要件は、再発する感染に対してより効率的に対処する
ために過去の感染の記憶を構築する能力である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ免疫システムの適
応特性は、侵入分子のＤＮＡ配列を記憶し、それを‘スペーサー’の形でＣＲＩＳＰＲア
レイの反復配列間に統合する能力に依存する。スペーサーの転写は、小アンチセンスＲＮ
Ａを産生し、これは、ＲＮＡガイドＣａｓヌクレアーゼにより細胞を感染から保護するた
めの侵入核酸の開裂に使用される。新規スペーサーの獲得により、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ
免疫システムは、新規脅威に対して迅速に適応し、それ故に‘適応’(すなわち、ベクタ
ー配列スペーサー獲得)と呼ばれる。
Seed et al (2013)は、ファージコード化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが細菌宿主の
ファージ阻害性染色体島の相殺に使用された、注目すべき事象の転換を報告した。ファー
ジによる溶解性感染の成功は、ＣＲＩＳＰＲスペーサーと標的染色体島の間の配列同一性
に依存すると報告された。このようなターゲティングの非存在下、ファージコード化ＣＲ
ＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ファージ複製回復のための染色体島の効率的ターゲティン
グを迅速にに進化させ、確実にする新規スペーサーを獲得できた。Bondy-Denomy et al (
2012)は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの阻害に介在する遺伝子の早期に観察された例
を記載する。５つの異なる‘抗ＣＲＩＳＰＲ’遺伝子が、バクテリオファージ感染シュー
ドモナス・エルジノーサのゲノムで発見された。ファージの抗ＣＲＩＳＰＲ遺伝子の変異
は、機能的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで細菌の感染を不可能とし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ
ａｓ標的化ファージのゲノムへの同一遺伝子の付加は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの
回避を可能とする。
未成熟ＲＮＡはＣＲＩＳＰＲアレイから転写され、その後成熟してｃｒＲＮＡを形成す
る。あるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムはまたトランス活性化ＲＮＡ(ｔｒａｃｒＲＮＡ)
をコードする配列も含み、これは、未成熟ｃｒＲＮＡにおける反復をハイブリダイズして
プレｃｒＲＮＡを形成でき、それによりさらなるプロセシングが成熟またはｃｒＲＮＡを
産生する。ｃＲＮＡの構造は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが関与するタイプ(タイプ
Ｉ、IIまたはIII)により変わる。
ＣＲＩＳＰＲ関連(ｃａｓ)遺伝子は、しばしばＣＲＩＳＰＲアレイと関連する。大規模
な比較ゲノム解析は、多くの異なるｃａｓ遺伝子を同定しており、４０の細菌および古細
菌のゲノムの初期の解析は、４５ｃａｓ遺伝子ファミリーが存在し、２遺伝子、ｃａｓ１
およびｃａｓ２のみが普遍的に存在する可能性を示唆した。Ｃａｓ１およびＣａｓ２は、
アレイへの新規スペーサー獲得に必須であると考えられ、故に、ファージまたはプラスミ
ドからの侵入物核酸に対する抵抗性の発達に重要な機構である。Nunez et al (2015)は、
Ｃａｓ１－Ｃａｓ２複合体が、スペーサーＤＮＡ獲得を触媒する最小機構であり、Ｃａｓ
１－Ｃａｓ２介在適応免疫の配列および構造特異性の提供におけるＣＲＩＳＰＲ反復の重
要性を説明していると報告した。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムはまた、侵入物ヌクレオチド配列における侵入物核酸隣
接同族認識モチーフ(ＰＡＭ)切断のために、ヌクレアーゼ(例えば、Ｃａｓ９)を発現する
配列も含む。ヌクレアーゼのＰＡＭ認識は、各タイプのＣａｓヌクレアーゼに特異的であ
る。侵入物配列のＰＡＭは、プロトスペーサー配列直ぐ３’に位置でき、ヌクレアーゼは
、一般にＰＡＭの３～４ヌクレオチド上流(５’)を切断する。ＰＡＭ配列の保存は、ＣＲ
ＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム間で異なり、ｃａｓ１およびリーダー配列と進化的に関連する
ように見える。Fineran et al (2014)は、侵入物が、プロトスペーサーまたはその隣接Ｐ
ＡＭの領域(“シード領域”)に点変異を作ることにより、エシェリキア・コリＫ１２のタ
イプＩ－Ｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ免疫を逃れることができるが、宿主は獲得(“プライ
ミング”)を含むポジティブフィードバック過程において新規スペーサーを統合すること
により、免疫を迅速に回復することを観察した。今日まで、ＰＡＭは、多数のタイプＩお
よびタイプIIシステムで十分特徴づけされており、プロトスペーサーにおける変異の影響
は、考証されている(Fineran et al (2014)の引用文献５、１４、２３、４６、４７参照)
。Fineran et al (2014)は、彼らの結果が、先の研究に一致して、ＰＡＭおよびシード配
列の重要な役割を示したと結論付けた。
Semenova et al (2011)はシード配列の役割を探索し、エシェリキア・コリサブタイプ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの場合、ｃｒＲＮＡマッチングの要件は、ＰＡＭ直後のシ
ード領域で厳格であると結論付けた。シード領域における変異が、ｃｒＲＮＡガイドＣａ
ｓｃａｄｅ複合体のプロトスペーサーＤＮＡへの結合親和性を減少させることにより、Ｃ
ＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ介在免疫を無くすことが観察された。
適応免疫の３つの主要なタイプの各々におけるＣＲＩＳＰＲ免疫の段階は次のとおりで
ある。
(１)獲得がＣａｓ１およびＣａｓ２による侵入ＤＮＡの認識およびプロトスペーサーの開
裂により開始する；
(２)プロトスペーサー配列が、リーダー配列に隣接する直接反復にライゲートされる；お
よび
(３)一本鎖伸張がＣＲＩＳＰＲを修復し、直接反復を二本化する。
ｃｒＲＮＡプロセシングおよび干渉段階は、３つの主要なＣＲＩＳＰＲシステムタイプ
の各々において異なって生じる。一次ＣＲＩＳＰＲ転写物はＣａｓにより開裂されて、ｃ
ｒＲＮＡを産生する。タイプＩシステムにおいて、Ｃａｓ６ｅ／Ｃａｓ６ｆは、直接反復
におけるヘアピンループにより形成されたｓｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの接合部で開裂さ
れる。タイプIIシステムは、トランス活性化(ｔｒａｃｒ)ＲＮＡを使用してｄｓＲＮＡを
形成し、これはＣａｓ９およびＲＮａｓｅIIIにより開裂される。タイプIIIシステムは、
開裂に直接反復におけるヘアピンループを必要としないＣａｓ６ホモログを使用する。タ
イプIIおよびタイプIIIシステムにおいて、二次トリミングが５’末端または３’末端で
行われ、成熟ｃｒＲＮＡが産生される。成熟ｃｒＲＮＡはＣａｓタンパク質と結合して、
干渉複合体を形成する。タイプＩおよびタイプIIシステムにおいて、ｃｒＲＮＡとＰＡＭ
間の塩基対形成が侵入ＤＮＡの分解を引き起こす。タイプIIIシステムは、分解の成功に
ＰＡＭを必要とせず、タイプIII－Ａシステムにおいて、塩基対形成は、タイプIII－Ｂシ
ステムにより標的化されるＤＮＡではなく、むしろｃｒＲＮＡとｍＲＮＡの間で生じる。
発明の記載
本発明の第一形態
本発明者らは、次の１以上の特性を用いる、微生物相(ヒト、動物または環境微生物相)
で天然に一緒に生ずる細菌の混合共同体における特定の細菌株の集団増殖の阻害を始めて
示したと確信する。
・野生型細胞のターゲティング；
・野生型内在性Ｃａｓヌクレアーゼ活性の利用；
・必須である抗生物質耐性遺伝子のターゲティング；
・ここで標的は野生型配列である
による集団増殖阻害。
本発明者らは、これを、次の特性を有する混合細菌集団で示した。
・ヒト微生物相(例えば腸内微生物相)種の混合集団における混合集団のターゲティング；
・ここで集団は３種含み；
・これらの種の中の１種の選択的死滅と、他種の細胞の温存を含み；
・このような阻害により温存される系統的に近い他の種の存在下での細胞増殖阻害のター
ゲティング；
・標的ファーミキューテス種および非ファーミキューテス種を含む混合集団における細胞
増殖阻害のターゲティング；
・混合集団中の異なるファーミキューテス種を温存しながら特定のファーミキューテス株
の細胞増殖阻害のターゲティング；
・混合集団における異なるグラム陽性菌種を温存しながら特定のグラム陽性細菌株の細胞
増殖阻害のターゲティング；
・片利共生ヒト腸内細菌種を温存しながら病原性(ヒトにおける)細菌種のターゲティング
；
・プロバイオティクヒト腸内細菌種を温存しながら病原性細菌種のターゲティング；
・表面の混合細菌集団における細胞増殖阻害のターゲティング；
・特定の細菌種単独でのまたは共同体で複数の他の細菌種と混合されているときの少なく
とも１０倍増殖阻害の達成；および
・特定の細菌種の２つの異なる株の少なくとも１０倍増殖阻害の達成。
野生型細胞において内在性Ｃａｓ活性を利用する能力は、生物(例えば、ヒトおよび動
物)および環境における宿主細胞感染のその場での処理に極めて有用である。ヒト、動物
または植物微生物相のような野生型(すなわち、操作されていないまたは予め改変された)
細菌集団の処理は、本発明を使用してまた取り組むことができる。混合集団において選択
的増殖阻害を発揮する能力は、ヒト、動物または植物微生物相のような細菌集団に取り組
むのにまたは環境マイクロバイオームに取り組むのに有用である。この特性はまた医薬(
例えば、ここに開示する何らかの処置または予防のためにヒトまたは動物対象に投与する
ための細菌細胞移植または本発明の製品細菌集団を含む除草剤または殺虫剤組成物の産生
のため)の産生にも有用であり、ここで、選択的死滅を、混合集団における種々の細菌の
比率を選択的に変えて、医薬、除草剤または殺虫剤であるか、またはそこから医薬、除草
剤または殺虫剤が産生される改変細菌集団を産生することができる。例えば、医薬をヒト
または動物レシピエントに鼻腔内的に移植して、このような処置または予防を行い得る。
下記作業実施例において、増殖阻害を、固体表面における細菌集団(グラム陽性ファー
ミキューテス集団)で取り組んだ。＞１０倍集団増殖阻害が達成された。ターゲティング
は抗生物質耐性遺伝子に対して指向された。本発明は、抗生物質耐性細菌の増殖阻害に有
効であり、ここで標的配列は抗生物質耐性遺伝子の配列である。例えば、改変されたヌク
レオチド配列と抗生物質の共投与が有効であり得る。これは、より完全なヒトまたは動物
対象における宿主細胞感染の処置または予防を提供しおよび／またはヒトまたは動物に投
与する治療有効抗生物質用量の減少を可能にすることができる。これは、ヒトおよび動物
集団における抗生物質の過剰投与に関する懸念の増加および耐性発現の観点から有用であ
る。本発明はまた、工業用または医学的流体、表面、装置もしくはコンテナ(例えば、食
品、消費財、化粧品、パーソナルヘルスケア製品、石油または石油製品)の処理または水
路、水、飲料、食糧または化粧品の処理のためのエクスビボおよびインビトロ適用も見出
し、ここで宿主細胞は、流体、表面、装置、コンテナ、水路、水、飲料、食糧または化粧
品に含まれるまたはそれらの上にある。本発明はまた腐食、バイオフィルムおよび生物付
着の制御にも適用が見出される。第一形態は、それ故に、次のコンセプトを提供する。
混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率を変えるための宿主修飾
(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用であって、第二細菌は宿主細胞を含み、
各宿主細胞について、システムは(ｉ)～(iv)の要素を含む。
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ－スペーサー)および反復を含む
宿主細胞標的配列および改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ－
ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞
標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列；
(iv)ここで、システムの該要素は、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの
核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ－ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿
主細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを修飾し；そして
ここで標的配列がＣａｓにより修飾され、それにより宿主細胞が殺されるかまたは宿主細
胞増殖が抑制される。
細菌宿主細胞の標的ヌクレオチド配列修飾のための請求項１の発明の使用のための宿主
修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであって、
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ－スペーサー)および反復を含む
宿主細胞標的配列および改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ－
ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞
標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するためのＤＮＡ
配列；
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくとも一つ
の核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ－ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、
宿主細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを修飾するものである、
(ｉ)～(iv)の要素を含む、システム。
これは、我々が、混合および非混合細胞集団における少なくとも１０倍の選択的宿主細
胞増殖阻害を示す、実施例により例示される。混合物は、ヒト微生物相に見られる種およ
び株の組み合わせを模倣する。
集団の増殖阻害のための細菌宿主細胞集団の野生型内在性Ｃａｓヌクレアーゼ活性の使
用であって、ここで各宿主細胞は野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性を有する内在性ＣＲＩＳ
ＰＲ／Ｃａｓシステムを有し、使用は集団の宿主細胞の形質転換を含み、ここで各形質転
換宿主細胞は、宿主細胞における宿主修飾(ＨＭ)ｃＲＮＡまたはガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)
の提供のために改変されたヌクレオチド配列で形質転換され、ＨＭ－ｃＲＮＡまたはｇＲ
ＮＡは、内在性Ｃａｓを標的にガイドするための宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハ
イブリダイズ可能な配列を含み、ここでｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、該野生型ヌクレアー
ゼ活性を有する宿主細胞の内在性Ｃａｓヌクレアーゼと同属であり、宿主細胞形質転換後
、集団の増殖が阻害される。
細菌宿主細胞の死滅または増殖減少のための宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシス
テムの使用(所望であれば使用は直前の段落の使用に従う)であって、各宿主細胞について
、システムは
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ－スペーサー)および反復を含む
改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを
宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイ
ズする配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列；
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの
核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ－ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿
主細胞における標的配列を修飾し；
ここでＣａｓヌクレアーゼは宿主細胞に内在性であり、そしてここで標的配列がＣａｓに
より修飾され、それにより宿主細胞が死滅するかまたは宿主細胞増殖を減少させるもので
ある
(ｉ)～(iv)の要素を含む。
それ故に、ＨＭ－ｃＲＮＡは、該Ｃａｓを宿主細胞における標的にガイドし、標的配列
を修飾するために、宿主細胞標的配列とハイブリダイズできる。
別法において、ＨＭ－ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮ
Ａ)からなる。
内在性Ｃａｓヌクレアーゼの利用により、本発明の実施態様は、内在性Ｃａｓヌクレア
ーゼ活性を使用する(ヌクレアーゼ活性を活性化または増強するための、宿主細胞の事前
遺伝子修飾を要しない)。それ故に、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼは宿主細胞の野生型遺
伝子によりコードされている。例えば、ヌクレアーゼは、宿主細胞の内在性Ｃａｓヌクレ
アーゼ(またはＣａｓヌクレアーゼ遺伝子)のリプレッサーを不活性化せずに、細胞死滅ま
たは増殖阻害を活性化するために作用する。それ故に、本発明は、効率的Ｃａｓ介在細胞
死滅または増殖減少をもたらすために、先の操作を必要とせずに野生型細菌集団に対処で
きる。それ故に、集団を、該集団がその野生型環境(例えば水路またはヒトまたは動物マ
イクロバイオームからなる)にあるとき、ｃＲＮＡに曝すことができる。
例えば、第一細菌は、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス)細胞である。例えば
、第二細菌はファーミキューテス細胞である。方法は、例えば、腸内微生物相集団(例え
ば、エクスビボまたはインビボ)の比率を変えるために使用され、これは、例えば体重増
加または肥満の処置または予防用である(例えば、ここで第一細菌はファーミキューテス
細胞である)。
第一形態はまた次のものを提供する。第一細菌および第二細菌の亜集団を含む混合細菌
集団中の該亜集団の相対比率を改変する方法であって、ここで第一細菌はファージにより
感染された宿主細胞(例えば、バクテロイデス門細胞)であり、第二細菌は該ファージに感
染されておらず(またはバクテロイデス門細菌ではない)、方法は、ベクター核酸を宿主細
胞に導入し、混合集団における細菌増殖を可能とするために１以上の工程で混合集団と複
数のベクターを合わせることを含み、ここで該第一細菌と第二細菌の相対比率が改変され
、
ここで各ベクターは、細胞における該ファージの標的ヌクレオチド配列を修飾するために
ファージ感染宿主細胞に導入するための改変されたファージ修飾(ＰＭ)ＣＲＩＳＰＲアレ
イを含み、
(ａ)ここでＰＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイは、ＰＭ－ｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列
およびファージ感染宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)ここでＰＭ－ｃｒＲＮＡは感染宿主細胞にＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガ
イドして、標的配列を修飾するために、ファージ標的配列とハイブリダイズできる。
第二形態において、本発明は次のものを
宿主細胞の標的ヌクレオチド配列の修飾のための宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
システム(例えば、第一形態の使用のため)であって、
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ－スペーサー)および反復を含む
改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを
宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主標的配列とハイブリダイズ可
能な配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはＴｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するためのＤＮＡ
配列；
(iv)ここでシステムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくとも一つの
核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ－ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿
主細胞における標的配列を修飾するものである
(ｉ)～(iv)の要素を含み、
ここで、所望により、要素(ｉ)は宿主細胞に内在性である。
第二形態はまた次のものを提供する。ファージのゲノム修飾のための第一形態の方法で
使用するための改変されたファージ修飾(ＰＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、
(ａ)ここでＰＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイは、ＰＭ－ｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列
およびファージ感染宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)ここでＰＭ－ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)を感染宿主細胞に
ガイドして、標的配列を修飾するためにファージゲノム標的配列にハイブリダイズできる
。
例えば、ファージはバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス)ファージ、例えば、ｃ
ｒＡｓｓファージである。
例えば、アレイは宿主細胞ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで機能的であるＣＲＩＳＰＲ
反復を含む。これは、細菌混合物における所望の細胞へのアレイの選択性増加に有益であ
る。これはまた宿主細胞におけるアレイの機能に必要な１以上のＣａｓタンパク質(およ
び／またはｔｒａｃｒＲＮＡ)をコードする嵩高いヌクレオチド配列を包含する必要がな
い可能性があるため、アレイおよび本発明のアレイを含むベクターの産生を単純化する。
別法において、アレイは同族Ｃａｓ９コード化配列および所望により同族ｔｒａｃｒＲＮ
Ａコード化配列と提供される。
第三形態において、本発明は次のものを提供する。
内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む細菌宿主細胞修飾のための改変された核酸
ベクターであって、ベクターは
(ａ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで使用するためのまたは本発明に従い使用するための
複数の異なるｃｒＲＮＡ(例えば、単一ガイドＲＮＡ、すなわち、ｇＲＮＡ)の発現のため
の核酸配列を含み；そして
(ｂ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き、
ここで、該ｃｒＲＮＡの第一は該宿主細胞の第一核酸配列とハイブリダイズでき、そして
該ｃｒＲＮＡの第二は該宿主細胞の第二核酸配列とハイブリダイズでき、ここで該第二配
列は該第一配列と異なり；そして
(ｃ)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は抗抗生物質耐
性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、所望により、これらの遺伝子は異なり；
(ｄ)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病
原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み；
(ｅ)第一配列は必須遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝
子(またはそのＲＮＡ)を含むまたは
(ｆ)第一配列は病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺
伝子(またはそのＲＮＡ)を含む。
第三形態はまた次のものを提供する。本発明の方法において使用するための核酸ベクタ
ー(例えば、プラスミド、ファージまたはファージミド)であって、ベクターは本発明のＣ
ＲＩＳＰＲアレイを含む。
第四形態において、本発明は次のものを提供する。
宿主細菌細胞(例えば、上記したような病原性細菌細胞)のゲノムまたは宿主細胞におけ
るウイルス(例えば、ファージ)のゲノムの標的配列を修飾するための改変されたＣＲＩＳ
ＰＲアレイを含む核酸ベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ファージまたはファー
ジミド)であって、
(ａ)ここでＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡ(例えば、ｇＲＮＡとして提供される)の発現
のための１以上の配列および宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み；
(ｂ)ここでｃｒＲＮＡは宿主細胞におけるＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイド
し、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズできる；
(ｃ)ここでアレイは第一細菌と、異なる種の第二細菌細胞の間で水平伝播できるトランス
ポゾンからなる。
第五形態において、本発明は次のものを提供する。
可動遺伝要素(ＭＧＥ)を含むまたはこれからなる改変されたＣＲＩＳＰＲ核酸ベクター
であって、ここでＭＧＥは宿主細胞(例えば、病原性細菌細胞)のゲノムまたは宿主細胞に
おけるウイルス(例えば、プロファージ)のゲノムの標的配列修飾のための伝達起点(ｏｒ
ｉＴ)およびＣＲＩＳＰＲアレイを含み、
(ａ)ここでＣＲＩＳＰＲアレイは、ｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細
胞における配列の転写のためのプロモーターを含み；
(ｂ)ここでｃｒＲＮＡは宿主細胞におけるＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイド
し、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズでき；
(ｃ)ここでベクターは(ｉ)第一宿主細胞の第一核酸と第二核酸位置間(ここで各位置は染
色体またはプラスミドの位置であり、標的配列は宿主細胞に含まれる)または(ii)第一宿
主細胞と第二宿主細胞間(ここで標的配列は第一および／または第二宿主細胞に含まれる)
で伝達可能である。
第六形態において、本発明は次のものを提供する。
産業用または家庭用システムにおける基質の微生物腐食(ＭＩＣ)または生物付着を制御
する方法であって、ここで基質の表面は基質のＭＩＣまたは生物付着に介在する第一微生
物種の第一宿主細胞の集団と接触し、方法は
(ｉ)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させ、各ベ
クターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、それによりＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞に導入さ
れ、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上のヌクレオチド配列および
宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)各ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標的
配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリダ
イズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり；そして
(ii)宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡを発現させ、それにより宿主細胞において
標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該基質のＭＩＣまたは生物付着の制御を
もたらす
ことを含む。
他の実施態様において、次のことが提供される。
原油、ガスまたは石油化学製品回収、加工、保存または輸送装置に含まれる基質の微生
物腐食(ＭＩＣ)または生物付着を制御する方法であって、ここで基質の表面は第一宿主細
胞の集団と接触し、ここで第一宿主細胞は、基質のＭＩＣまたは生物付着に介在する第一
種の硫黄または硫酸還元細菌(ＳＲＢ)、細胞外重合物質産生細菌(ＥＰＳＢ)、酸産生細菌
(ＡＰＢ)、硫黄または硫化物酸化細菌(ＳＯＢ)、鉄酸化細菌(ＩＯＢ)、マンガン酸化細菌
(ＭＯＢ)、アンモニア産生細菌(ＡｍＰＢ)または酢酸産生細菌(ＡｃＰＢ)であり、ここで
表面および細胞集団は海水、淡水、フラッキング液体または井戸中の液体からなる群から
選択され、方法は
(ｉ)細胞集団とベクターを、液体と第一宿主細胞の形質転換または形質導入が可能な複数
のベクターを混合することにより接触させ、各ベクターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、そ
れによりＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細胞の
配列の転写のためのプロモーターを含み；
(ｂ)各ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標
的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリ
ダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり；
(ｃ)ここで(ａ)の各々の配列は、第一宿主細胞において各ｃｒＲＮＡの発現および産生
のために配列Ｒ１－Ｓ１－Ｒ１’を含み、ここでＲ１は第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ
１’は第二ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１またはＲ１’は任意であり、Ｓ１は該第一宿主
細胞の標的配列と８０％以上同一であるヌクレオチド配列を含むかまたはこれからなる第
一ＣＲＩＳＰＲスペーサーであり、そして
(ii)宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡを発現させ、それにより宿主細胞において
標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該基質のＭＩＣまたは生物付着の制御を
もたらす
ことを含む。
他の実施態様は、次のものを提供する。
本方法に使用するためのベクターであって、ここで第一細胞は硫酸還元細菌(ＳＲＢ)細
胞、例えば、デスルホビブリオまたはデスルホトマキュラム細胞であり、ベクターはＳＲ
Ｂターゲティングのための１以上のＣＲＩＳＰＲアレイを含み、ここで各アレイは(ａ)～
(ｃ)に定義したとおりである。
他の実施態様において、次のものが提供される。産業用または家庭用システムにおける
流体の微生物の生物付着を制御する方法であって、ここで流体は該生物付着に介在する第
一微生物種の第一宿主細胞の集団を含み、方法は
(ｉ)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させ、各ベ
クターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、それによりＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞に導入さ
れ、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上のヌクレオチド配列およ
び宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)各ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標
的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリ
ダイズででき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり；そして
(ii)宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡを発現させ、それにより宿主細胞において
標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該生物付着の制御をもたらす
ことを含む。
例えば、次のものが提供される。船または船舶のバラスト水における細菌生物付着を制
御する方法であって、ここで水は該生物付着に介在する第一微生物種の第一宿主細胞の集
団を含み、方法は
(ｉ)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させ、各ベ
クターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、それによりＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞に導入さ
れ、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細胞の
配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)各ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標
的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリ
ダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり；そして
(ii)宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡを発現させ、それにより宿主細胞において
標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該生物付着の制御をもたらす
ことを含む。
他の実施態様は、ＣＲＩＳＰＲアレイを含むバラスト海水(例えば、海水サンプルまた
はコンテナ中の海水)を提供し、ここでバラスト水は本方法により得るまたは得られる。
バラスト海水は、船、船舶、海上コンテナまたは掘削装置に含まれる。本方法において使
用するベクターであって、ここで第一細胞はコレラ(例えば、ビブリオ、例えば、Ｏ１ま
たはＯ１３９)、エシェリキア・コリまたはエンテロコッカス細胞であり、ベクターは細
胞ターゲティングのための１以上のＣＲＩＳＰＲアレイを含み、ここで各アレイは方法の
(ａ)および(ｂ)において定義したとおりである。
本発明はまたこの第六形態または医学的使用または食品もしくは飲料処理のような他の
適用に使用するのに適するベクターおよびＣＲＩＳＰＲアレイも提供する。この目的で、
次のものが提供される。細菌宿主細胞へのＣＲＩＳＰＲアレイ導入のためのベクターであ
って、ここで細菌は水系伝染が可能であり、ここで
(ａ)ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための配列および該宿主細胞における配列
の転写のためのプロモーターを含み；
(ｂ)ｃｒＲＮＡは、宿主細胞にＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイドし、標的配
列の修飾(例えば、標的配列の切断)のために宿主細胞標的配列とハイブリダイズでき、標
的配列は宿主細胞生存能に介在するヌクレオチド配列であり；
(ｃ)ここで(ａ)の配列はｃｒＲＮＡの発現および産生のために配列Ｒ１－Ｓ１－Ｒ１’を
含み、ここでＲ１は第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１’は第二ＣＲＩＳＰＲ反復であり
、Ｒ１またはＲ１’は任意であり、Ｓ１は宿主細胞標的配列と８０％以上同一であるヌク
レオチド配列を含むまたはそれからなる第一ＣＲＩＳＰＲスペーサーである。
また提供されるのは、複数のこのようなベクターを含む水または食品処理組成物である
。ヒトにおける細菌感染(例えば、ビブリオ・コレラエ感染)の処置または予防用医薬であ
って、複数のこのようなベクターを含む医薬である。本発明はまた、細菌集団、組成物、
食糧および飲料も提供する。例えば、食糧または飲料は乳製品である。
第七形態において、本発明は次のものを提供する。
第一の態様において、
第一Ｃａｓをコードする発現可能な遺伝子を修飾する方法であって、方法は
(ａ)ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ１)とＣａｓ遺伝子を、該遺伝子から発現される第一Ｃａｓの
存在下で合わせ、そして
(ｂ)ｇＲＮＡ１を該Ｃａｓ遺伝子の配列(例えば、そのプロモーターまたは第一Ｃａｓコ
ード化ＤＮＡ配列)とハイブリダイズさせて、第一Ｃａｓを遺伝子にガイドさせ、それに
よりＣａｓがＣａｓ遺伝子を修飾する
ことを含む。
例えば、本方法で使用するための第一核酸ベクターまたは複数ベクターの組み合わせで
あって、ここで
(ａ)第一ベクターまたは該組み合わせのベクターは、第一Ｃａｓをガイドして、第一部位
(ＣＳ１)で予定したプロトスペーサー配列(ＰＳ１)を修飾するためにＰＳ１と相補性であ
るガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ１、例えば、単一ｇＲＮＡ)を含み、ここでＰＳ１は第一Ｃａｓ
と同族であるＰＡＭ(Ｐ１)に隣接するかまたは発現可能な配列はｔｒａｃｒＲＮＡとｇＲ
ＮＡ１を形成するｃｒＲＮＡをコードし；そして
(ｂ)ＰＳ１およびＰ１は発現可能な第一Ｃａｓコード化遺伝子の配列であり、ＰＳ１は第
一ＣａｓによりＣＳ１で修飾され得る。
本発明のこれらの態様は、例えば、細胞またはインビトロで、Ｃａｓ活性を制御するの
に有用である。本発明は、Ｃａｓコード化遺伝子のＣａｓ活性を制限するためのターゲテ
ィングを含み、これは、Ｃａｓの一過性制御に有益である。本発明はまた、例えば、細胞
の修飾ゲノムにおける標的外Ｃａｓ切断の機会を減らすための、高いストリンジェンシー
が望ましい設定にも有用であり得る。適用は、例えば、細胞または細胞を含む組織または
生物の遺伝子治療または遺伝子ターゲティングのために、標的外効果が最小化または排除
されなければならない、例えば、ヒト、動物または植物細胞の修飾における。例えば、Ｃ
ａｓ修飾をヒトにおける遺伝子治療または疾患もしくは状態の処置もしくは予防のために
患者に投与されるヒト細胞(例えば、ｉＰＳ細胞)の所望の変更に使用されるとき、極めて
高いストリンジェンシーが必要である。本開示は、本発明の方法および製品の一部として
これらの適用を提供する。
本発明はまた、ベクター、特にウイルスベクターの制限された挿入容量の課題に取り組
む。
それ故に、本発明の第八形態は次のものを提供する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの要素をコードする１.４kbを超える外来性ＤＮＡ配列
を含む核酸ベクターであって、ここで配列は、宿主細胞(ここでのあらゆる細胞、例えば
、ヒト、動物または細菌または古細菌宿主細胞)における１以上のＨＭ－またはＰＭ－ｃ
ｒＲＮＡまたはｇＲＮＡの発現のための改変されたアレイまたは改変された配列(所望に
よりここに記載されるとおり)を含み、ここでアレイまたは改変された配列はｃＲＮＡま
たはｇＲＮＡと同族であるＣａｓヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含まず、
所望により、少なくとも２個、３個または４個のｃＲＮＡまたはｇＲＮＡが外来性ＤＮＡ
によりコードされる。
１.４kbを超えるまたは４.２kbを超える外来性ＤＮＡ配列を含む核酸ベクターであって
、ここで外来性ＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの１以上の要素をコードし、宿
主細胞において１以上のＨＭ－ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡを発現するための改変されたア
レイまたは配列(例えば、ここに記載する任意のこのようなもの)を含み、ここで外来性配
列は、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡと同族であるＣａｓヌクレアーゼをコードするヌクレオチ
ド配列を欠き、所望により少なくとも２つの異なるｃＲＮＡまたはｇＲＮＡが外来性ＤＮ
Ａによりコードされる。
ここで、あらゆる形態において、例えばｃＲＮＡは１以上の単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮ
Ａ)により提供され、この場合“ＣＲＩＳＰＲアレイ”は、該ｇＲＮＡをコードする１以
上の発現可能なヌクレオチド配列を指し得る。それ故に、配列は、細胞内部でｇＲＮＡを
発現するために宿主細胞において発現され得る。
本発明は主に細菌について記載しているが、変更すべきところは変更して古細菌に適用
可能である。
ここでの一つの形態のあらゆる特性を、例えば、本発明の異なる形態と組み合わせて、
このような組み合わせが本願の１以上の請求項に包含されることを可能とする。
キシロース誘導可能システム。
ＳＴ１－ＣＲＩＳＰＲアレイ。
本実験で使用した株のＴＨ寒天でのスポットアッセイ。全株を、ＴＨ寒天上で、３７℃で２０時間増殖させた。一夜培養物の連続希釈を、エシェリキア・コリ、ラクトコッカス・ラクティスおよびストレプトコッカス・ミュータンスはデュプリケートで行い、個々のコロニーを計数するためにストレプトコッカス・サーモフィルスの両株はトリプリケートで行った。
ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ラクトコッカス・ラクティスおよびエシェリキア・コリの種々の培養条件下での選択的増殖。テトラサイクリンは、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ－９の選択的増殖に使用できなかった。しかしながら、３ｇ・ｌ－１のＰＥＡが、エシェリキア・コリの増殖を制限しながら、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ－９を選択的増殖させることが証明された。
野生型バチルス・メガテリウムオペロン(左)に基づく２つのキシロース誘導カセット(中央、右)の構築。(Xie et al. 2013)
プラスミドｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐｌｄｈａでのストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ－９におけるキシロース誘導可能カセットの特徴づけ。キシロースの量を増やすと共に、蛍光の明確な応答が観察できる。
ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡにおけるＣＲＩＳＰＲアレイの操作。アレイは、誘導可能キシロースプロモーター下にストレプトコッカス・サーモフィルス遺伝子を標的とする２スペーサー配列および強構成的プロモーターＰ３Ａ下にｔｒａｃｒＲＮＡを含む。
プラスミドｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｐｌｄｈ＋Ｘｙｌ Ａ(左)およびｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰＸｙｌＡ(右)でのストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ－９の形質転換効率。
キシロース誘導可能ＣＲＩＳＰＲデバイスの模式図。キシロースの誘導により、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ－９ゲノムのｐｏｌIIIおよびｔｅｔＡをターゲティングするＣＲＩＳＰＲアレイが発現される。構成的に発現されるｔｒａｃｒＲＮＡと共に、複合体がＣａｓ９と形成される。この複合体は、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ－９ゲノムにおけるｔｅｔＡおよびｐｏｌIII遺伝子に二本鎖中断を導入し、細胞生存能の制限をもたらす。
プラスミドｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰＸｙｌＡ(左)またはｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡ(右)でのストレプトコッカス・サーモフィルスＤＳＭ ２０６１７(Ｔ)の増殖阻害。誘導されない(上部パネル)および誘導(下部パネル)。写真は６３時間インキュベーション後に撮った。下左隅のコロニー数(上列：＞１０００、＞１０００、下列：３３６、１１３)。
ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクティスおよびエシェリキア・コリからの１６Ｓ配列の最尤推定系統樹。
ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｘｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｌｄｈＡ＋Ｘｙｌプラスミドを担持するエシェリキア・コリ、ラクトコッカス・ラクティスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスの共培養における選択的ストレプトコッカス・サーモフィルス増殖阻害を示す。ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｘｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｌｄｈＡ＋Ｘｙｌプラスミドを担持するエシェリキア・コリで増殖の差は観察されなかった(中央カラム)。しかしながら、ストレプトコッカス・サーモフィルス(２.５ｇ・ｌ－１ ＰＥＡ添加ＴＨ寒天上で選択的増殖、最後のカラム)は、我々の予想どおり、ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｘｙｌＡ(強)またはｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｌｄｈＡ ＋ＸｙｌＡ(弱)プラスミドの間の形質転換効率を示す。我々は、こうして、細胞の混合集団における標的ストレプトコッカス・サーモフィルス亜集団の選択的増殖阻害を示す。コロニー数は下左隅(上列：＞１０００、＞１０００、６８、下列：＞１０００、＞１０００、３２)。
詳細な記載
微生物集団増殖阻害および微生物比率改変
本発明は、ヒトの微生物相におけるバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス)、ファ
ーミキューテスおよび／またはグラム陽性または陰性細菌の比率の改変のような、細菌集
団増殖阻害または混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率の改変、
例えば、ヒトまたは動物マイクロバイオームの改変のための方法、使用、システム、アレ
イ、ｃＲＮＡ、ｇＲＮＡおよびベクターに関する。例えば、ここに記載する第一～第三形
態参照。本発明は、例えば、宿主細菌細胞、例えば、バクテロイデス門細胞またはファー
ミキューテス細胞の１以上の標的ヌクレオチド配列の修飾を含む。
ヒトおよび無菌マウス両者で、二つの主要な腸内門、バクテロイデス門およびファーミ
キューテスの各レベルが肥満と関連することを指摘する多数の論文がある。これらの論文
の著者らは、炭水化物代謝が重要な因子であろうと推定している。彼らは、肥満個体の微
生物相が、ファーミキューテス門細菌がより重度に富化され、バクテロイデス門に少ない
ことを観察しており、恐らく、この細菌混合物が、痩せた個体(逆の比率を有する)の微生
物相よりも、ある食餌からより効率的にエネルギーを抽出していると推測した。いくつか
の研究において、肥満個体が減量するに連れてバクテロイデス門の相対的豊富さが増加し
、さらに、肥満マウスの微生物相を無菌マウスに移したとき、これらのマウスは、痩せた
マウスから微生物相を受けた対照より脂肪を獲得することが判明した。例えば、Turnbaug
h, P. J., R. E. Ley, M. A. Mahowald, V. Magrini, E. R. Mardis, and J. I. Gordon.
2006, “An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy
harvest”, Nature 444:1027-1131参照。
コンセプト
本発明は、宿主細胞標的を含む次のコンセプトを提供する。
１. 細菌宿主細胞の死滅または増殖減少のための宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシ
ステムの使用であって、各宿主細胞について、システムは
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ－スペーサー)および反復を含む
改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを
宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイ
ズする配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列；
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの
核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ－ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿
主細胞における標的配列を修飾する
(ｉ)～(iv)の要素を含み、
ここでＣａｓヌクレアーゼは宿主細胞に内在性であり、そしてここで標的配列がＣａｓに
より修飾され、それにより宿主細胞を死滅させるかまたは宿主細胞増殖を減少させる。
コンセプト１は、別に次のものを提供する。
混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率を変えるための宿主修飾
(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用であって、第二細菌は宿主細胞に含まれ、各
宿主細胞について、システムは
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ－スペーサー)および反復を含む
改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを
宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイ
ズする配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列；
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの
核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ－ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿
主細胞における標的配列を修飾する
(ｉ)～(iv)の要素を含み、
ここで、所望によりＣａｓヌクレアーゼは宿主細胞に内在性であり、そして
ここで標的配列がＣａｓにより修飾され、それにより宿主細胞が死滅するかまたは宿主細
胞増殖が減少する。
コンセプト１はまた混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率を改
変する方法であって、第二細菌は宿主細胞を含み、方法は、混合集団と宿主修飾(ＨＭ)Ｃ
ＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを合わせ、それにより第二細菌宿主細胞を死滅させるかまた
は該細胞の増殖を減少させ、それにより該比率が変えられ、
ここで各宿主細胞について、システムは
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ－スペーサー)および反復を含む
改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを
宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイ
ズする配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列；
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの
核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ－ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿
主細胞における標的配列を修飾する
(ｉ)～(iv)の要素を含み、
ここで、所望によりＣａｓヌクレアーゼは宿主細胞に内在性であり、そして
ここで標的配列がＣａｓにより修飾され、それにより宿主細胞が死滅するかまたは宿主細
胞増殖が減少する。
コンセプト１はまた次のものを提供する。
混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率を変えるための宿主修飾
(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用であって、第二細菌は各々標的プロトスペー
サー配列を含む複数の宿主細胞を含み、各宿主細胞について、システムは上に定義した要
素(ii)および(iii)を含み、システムはさらにＣａｓヌクレアーゼをコードする少なくと
も一つの核酸配列を含み、ここで該要素(ii)および該Ｃａｓコード化配列は宿主細胞を形
質転換する少なくとも一つの核酸ベクターに含まれ、それにより(ｉ)によりコードされる
ＨＭ－ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓを標的にガイドして宿主細胞における標的配列を修飾し；
ここでＣａｓヌクレアーゼは宿主細胞に内在性であり、そしてここで標的配列がＣａｓに
より修飾され、それにより宿主細胞が死滅するかまたは宿主細胞増殖が減少する。
ある実施態様において、第一細菌の増殖は阻害されないまたは該宿主細胞の増殖阻害は
、第一細胞の増殖阻害の少なくとも２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、
１０ｘ、５０ｘ、１００ｘまたは１０００ｘである。増殖阻害は、阻害倍率または阻害パ
ーセンテージとして計算できる(ここに記載するとおり)。他の例において、阻害を培養サ
ンプルにおいて分光光度計により測定し、ここで光吸光度(例えば、ＯＤ６００)を、予定
したｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡ処理期間の開始時および終了時に測定する(阻害を倍率または
パーセンテージで決定するときのこのような期間の本明細書における記載を参照)。例え
ば、宿主細胞サンプルの吸光度の増加(予定された期間の開始時の吸光度と該期間の終了
時の吸光度の比較)が対照サンプル(該ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡに曝されていない)より少
ない、例えば、前者の増加が後者の少なくとも１０倍、１００倍、１０００倍、１０００
０倍または１０００００倍少ない(例えば、ＯＤ６００として決定)。例えば、増殖阻害の
決定(すなわち、予定された期間の最後)は、各サンプルの対数増殖中期に行う(例えば、
予定された期間の開始６～７時間後)。
例えば、宿主細胞は、生物または環境(例えば、水路微生物相、水微生物相、ヒトまた
は動物腸内微生物相、ヒトまたは動物口腔微生物相、ヒトまたは動物膣微生物相、ヒトま
たは動物皮膚または毛微生物相またはヒトまたは動物腋窩微生物相)に含まれる微生物相
集団に含まれ、集団は、生物または環境と相利共生または片利共生である第一細菌を含み
、第二細菌は該宿主細胞を含み、ここで宿主細胞は、生物または環境に有害(例えば、病
原性)である。ある実施態様において、集団はエクスビボである。
第一細菌亜集団対第二細菌亜集団の比率は増加する。
コンセプト１はまたさらに下に記載する宿主細胞増殖阻害の使用を提供する。
２. 宿主細胞の標的ヌクレオチド配列の修飾のため(例えば、コンセプト１の使用のため)
の宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであって、システムは
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ－スペーサー)および反復を含む
改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを
宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主標的配列とハイブリダイズ可
能な配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するためのＤＮＡ
配列；
(iv)ここで、システムの該要素は、宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくとも一
つの核酸ベクターに分けられ、それによりＨＭ－ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、
宿主細胞における標的配列を修飾する；
(ｉ)～(iv)の要素を含み、
ここで、所望により、要素(ｉ)は宿主細胞に内在性である。
別法において、ＨＭ－ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮ
Ａ)からなる。
内在性Ｃａｓヌクレアーゼの利用により、本発明の実施態様は、内在性Ｃａｓヌクレア
ーゼ活性を使用する(すなわち、ヌクレアーゼ活性を活性化または増強するために、宿主
細胞の予めの遺伝子修飾を必要とせずに)。それ故に、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼは宿
主細胞の野生型遺伝子によりコードされる。例えば、ヌクレアーゼは、宿主細胞における
内在性Ｃａｓヌクレアーゼ(またはＣａｓヌクレアーゼ遺伝子)リプレッサーを阻害せずに
、細胞死滅または増殖減少を達成するために活性である。それ故に、本発明は、効率的Ｃ
ａｓ介在細胞死滅または増殖減少をもたらすために前もっての操作の必要なく、野生型細
菌集団に取り組むことができる。それ故に、集団を、集団がその野生型環境(例えば水路
またはヒトまたは動物マイクロバイオームからなる)にあるとき、ｃＲＮＡに曝すことが
できる。
例えば、第二細菌はバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス)細胞である。例えば、
第二細菌はファーミキューテス細胞である。使用、システムまたは方法は、例えば、腸内
微生物相集団(例えば、エクスビボまたはインビボ)の比率を変えるために使用され、これ
は、例えば体重増加または肥満の処置または予防用である(例えば、ここで第二細菌はフ
ァーミキューテス細胞である)。
例えば、使用、方法、システム、ベクター、改変されたヌクレオチド配列、ｃＲＮＡま
たはｇＲＮＡは、例えば、肥満、糖尿病、ＩＢＤ、ＧＩ管状態または口腔状態の処置また
は予防のための、混合集団を含むヒトまたは非ヒト動物の微生物相の治療的または予防的
リバランスのためである。
例えば、ここに記載する微生物相はヒトまたは動物マイクロバイオーム(例えば、腸、
膣、頭皮、腋窩、皮膚、血流、咽頭または口腔マイクロバイオーム)の微生物相である。
例えば、ここに記載する微生物相は腋窩微生物相であり、使用、方法、システム、ベク
ター、改変されたヌクレオチド配列、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、ヒトの体臭の予防また
は軽減のためである。
例えば、宿主細胞集団または混合集団は、ヒト消費のための飲料または水(例えば、水
路または飲料水)に含まれる。
例えば、使用、方法、システム、ベクター、改変されたヌクレオチド配列、ｃＲＮＡま
たはｇＲＮＡは、病原性感染の減少または腸内または口内微生物相リバランス、例えば、
ヒトまたは動物における肥満または疾患の処置または予防用である。例えば、使用、方法
、システム、ベクター、改変されたヌクレオチド配列、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、腸内
微生物相におけるクロストリジウム・ディフィシル細菌ノックダウンのためである。
例えば、第一細菌はバクテロイデス細菌であり、第二細菌はファーミキューテスまたは
病原性細菌、例えば、腸内細菌である。例えば、宿主細胞または第二細菌は例えば、スト
レプトコッカス(例えば、サーモフィルスおよび／またはピオゲネス)、バチルス、ラクト
バチルス、リステリア、クロストリジウム、ヘリコバクターおよびスタフィロコッカス細
胞から選択されるファーミキューテス細胞である。例えば、混合集団はバクテロイデスお
よびメトロニダゾール(ＭＴＺ)耐性クロストリジウム・ディフィシル株６３０亜集団を含
み、ここで宿主細胞は該クロストリジウム・ディフィシル細胞を含む。
例えば、宿主細胞集団、混合集団またはシステムは、その腸内または口内微生物相の定
植またはリバランスのためにヒトまたは非ヒト動物に投与するための組成物(例えば、飲
料、口腔洗浄剤または食糧)に含まれる。
例えば、使用または方法のための製品またはシステム、ベクター、改変されたヌクレオ
チド配列、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、粘膜、腸、経口、鼻腔内、直腸内、膣内、眼また
はバッカル投与によりヒトまたは非ヒト動物に投与するためである。
ここに記載するあらゆる形態の例えば、混合集団(アレイ、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまた
は改変された配列と合わせる前)は、ヒトまたは動物対象の微生物相、例えば、ここに開
示する腸または任意の他の微生物相またはここに開示する任意のマイクロバイオームの微
生物相のサンプルである。例えば、この場合、本発明使用の製品は、ここに開示するヒト
または動物対象の処置または治療に有用な修飾微生物相集団である。
３. １個または複数個のベクターがＣａｓ(例えば、Ｃａｓ９)ヌクレアーゼコード化配列
を欠く、コンセプト２のシステム。
４. 各宿主細胞がヒト微生物相に見られる株または種のものであり、所望によりここで宿
主細胞は細胞と異なる株または種の混合であり、ここで異なる細胞はヒト(例えば、ヒト
腸における)とプロバイオティク、片利共生または相利共生である腸内細菌科または細菌
である、前記コンセプトの何れかの使用、方法またはシステム。例えば、宿主細胞はファ
ーミキューテス細胞、例えば、ストレプトコッカス細胞である。
５. 混合細菌集団(例えば、ヒト微生物相におけるようなヒトにおける)におけるバクテロ
イデス門(例えば、バクテロイデス)細菌の比率の改変のための、前記コンセプトの何れか
の使用、方法またはシステム。
６. ファーミキューテスに対するバクテロイデス門の相対的比率を増加させるための、コ
ンセプト５の使用、方法またはシステム。
７. 該Ｃａｓヌクレアーゼが該細胞の内在性タイプII ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに
より提供される、前記コンセプトの何れかの使用、方法またはシステム。
８. 要素(iii)が宿主細胞に内在性である、前記コンセプトの何れかの使用、方法または
システム。
９. 標的配列が宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子または必須遺伝子に含まれ
る、前記コンセプトの何れかの使用、方法またはシステム。
１０. アレイが抗生物質組成物に含まれ、ここでアレイが抗生物質と組み合わされる、前
記コンセプトの何れかの使用、方法またはシステム。
１１. あるいはＨＭ－ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)
からなる、例えばベクターにより提供される、前記コンセプトの何れかの使用、方法また
はシステム。
１２. 宿主細胞が目的のＨＭ配列をコードする遊離末端(ＨＭ－ＤＮＡ)を有するデオキシ
リボ核酸鎖を含むおよび／またはシステムがＨＭ－ＤＮＡをコードする配列を含み、ここ
でＨＭ－ＤＮＡは、ＨＭ－ＤＮＡを宿主ゲノム(例えば、染色体またはエピソーム部位)に
挿入するために標的配列内にあるまたは隣接する１個以上の配列にそれぞれ相同である１
個以上の配列を含む、前記コンセプトの何れかの使用、方法またはシステム。
１３. 内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む細菌宿主細胞修飾のための改変された
核酸ベクターであって、ベクターは
(ａ)前記何れかのコンセプトに記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、方法または使用に
おいて使用するための複数の異なるｃｒＲＮＡ(例えば、ｇＲＮＡ)を発現する核酸配列を
含み；そして
(ｂ)所望によりＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き、
ここで、該ｃｒＲＮＡの第一は該宿主細胞の第一核酸配列とハイブリダイズでき、そして
該ｃｒＲＮＡの第二は該宿主細胞の第二核酸配列とハイブリダイズでき、ここで該第二配
列は該第一配列と異なり；そして
(ｃ)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は抗抗生物質耐
性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、所望により、これらの遺伝子は異なり；
(ｄ)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病
原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み；
(ｅ)第一配列は必須遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝
子(またはそのＲＮＡ)を含むまたは
(ｆ)第一配列は病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺
伝子(またはそのＲＮＡ)を含む。
１４. ベクターによりコードされるｃＲＮＡ(例えば、単一ガイドＲＮＡ)と共に動作可能
(operable)である１以上のＣａｓを含む宿主細胞内の、コンセプト１３のベクター。
１５. ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイが同じスペーサーの複数コピーを含む、前記コンセプト
の何れかの使用、方法、システムまたはベクター。
１６. ベクターが複数のＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイを含む、前記コンセプトの何れかの使
用、方法、システムまたはベクター。
１７. 各ベクターがプラスミド、コスミド、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミ
ドまたはプロファージである、前記コンセプトの何れかの使用、方法、システムまたはベ
クター。
１８. システムまたはベクターがｃｒＲＮＡ(例えば、ｇＲＮＡ)をコードする核酸配列の
２、３またはそれ以上のコピーを含み、ここでコピーが宿主細胞配列(例えば、病原性、
耐性または必須遺伝子配列)のターゲティングのための同じスペーサー配列を含む、前記
コンセプトの何れかの使用、方法、システムまたはベクター。
１９. コピーが２以上のベクターＣＲＩＳＰＲアレイ間に別れる、コンセプト１８の使用
、方法、システムまたはベクター。
２０. 前記コンセプトの何れかに記載のシステムまたはベクターを含む、細菌宿主細胞。
２１. 抗生物質(例えば、ベータ－ラクタム抗生物質)と組み合わせられる、コンセプト２
～２０の何れかのシステム、ベクターまたは細胞。
２２.各宿主細胞がスタフィロコッカス、ストレプトコッカス、シュードモナス、サルモ
ネラ、リステリア、エシェリキア・コリ、デスルホビブリオまたはクロストリジウム宿主
細胞である、前記コンセプトの何れかの使用、方法、システム、ベクターまたは細胞。例
えば、各宿主細胞はファーミキューテス細胞、例えば、スタフィロコッカス、ストレプト
コッカス、リステリアまたはクロストリジウム細胞である。
例えば、各ＣＲＩＳＰＲアレイは宿主細胞における各ｃｒＲＮＡの発現および産生のた
めの配列Ｒ１－Ｓ１－Ｒ１’を含み(例えば、単一ガイドＲＮＡに含まれる)、(ｉ)ここで
Ｒ１は第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１’は第二ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１または
Ｒ１’は任意であり、(ii)Ｓ１は該標的配列に９５％以上同一であるヌクレオチド配列を
含むまたはそれからなる第一ＣＲＩＳＰＲスペーサーである。
例えば、Ｒ１およびＲ１’は、それぞれ第二宿主細胞種のＣＲＩＳＰＲアレイの第一お
よび第二反復配列と少なくとも９５％同一である。例えば、Ｒ１およびＲ１’は、該種、
例えば、該種の該宿主細胞のＣＲＩＳＰＲアレイの第一(最も５’)および第二(第一反復
の直ぐ３’の反復)反復配列とそれぞれ少なくとも９５％(例えば、９６％、９７％、９８
％、９９％または１００％)同一である。例えば、Ｒ１およびＲ１’は、該宿主細胞にお
ける標的を修飾するために、タイプII Ｃａｓ９ヌクレアーゼ(例えば、ストレプトコッ
カス・サーモフィルス、ストレプトコッカス・ピオゲネスまたはスタフィロコッカス・ア
ウレウスＣａｓ９)を用いて機能的である。
本発明の代替的コンセプト１使用は、作業実験実施例におり示されるとおり、次のもの
を提供する。
集団の増殖阻害のための細菌宿主細胞集団の野生型内在性Ｃａｓヌクレアーゼ活性の使
用であって、ここで各宿主細胞は野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性を有する内在性ＣＲＩＳ
ＰＲ／Ｃａｓシステムを有し、使用は集団の宿主細胞の形質転換を含み、ここで各形質転
換宿主細胞は、宿主細胞における宿主修飾(ＨＭ)ｃＲＮＡまたはガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)
の提供のために改変されたヌクレオチド配列で形質転換され、ＨＭ－ｃＲＮＡまたはｇＲ
ＮＡは、内在性Ｃａｓを標的にガイドするための宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハ
イブリダイズ可能な配列を含み、ここでｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、該野生型ヌクレアー
ゼ活性を有する宿主細胞の内在性Ｃａｓヌクレアーゼと同属であり、宿主細胞形質転換後
、集団の増殖が阻害される。
下記作業実施例において、阻害を固体表面上の細菌集団(グラム陽性ファーミキューテ
ス)で取り組んだ。宿主細胞集団増殖の＞１０倍阻害が達成された。ターゲティングは抗
生物質耐性遺伝子および必須遺伝子に指向させた。本発明は抗生物質耐性細菌の増殖阻害
に有用であり、ここで標的配列は抗生物質耐性遺伝子の配列である。例えば、改変された
ヌクレオチド配列と抗生物質の共投与が有効であり得る。これは、より完全なヒトまたは
動物対象における宿主細胞感染の処置または予防を提供するおよび／またはヒトまたは動
物に投与する治療有効抗生物質用量の減少を可能にする可能性がある。ヒトおよび動物集
団における抗生物質の過剰投与に関する懸念の増加および耐性発現の観点から有用である
。
表面上の宿主細胞増殖を阻害する本発明の能力の証明は、本発明がヒトまたは動物対象
におけるここに開示する微生物相により介在されるまたは引き起こされる疾患または状態
の処置または予防のためである実施態様において重要かつ望ましい。このような微生物相
は、一般に対象の組織(例えば、腸、口腔、肺、腋窩、眼、膣、肛門、耳、鼻または咽頭
組織)と接触しており、故に我々は、表面上の微生物相細菌種(ストレプトコッカスにより
例示される)の増殖阻害の活性の証明は、この有用性を支持すると考える。
例えば、野生型宿主細胞内在性Ｃａｓ９またはｃｆｐ１活性を使用する。改変されたヌ
クレオチド配列は、外来性Ｃａｓヌクレアーゼコード化配列と組み合わせなくてよい。
例えば、宿主細胞は野生型(例えば、操作されていない)細菌細胞である。他の例におい
て、宿主細胞は、操作されており(例えば外来性ヌクレオチド配列を染色体性に導入する
ためにまたは、例えば、宿主細胞の染色体またはプラスミド上の内在性ヌクレオチド配列
を修飾するために)、ここで宿主細胞は、ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡと共に動作可能な野
生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性を有する内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む。例え
ば、該宿主細胞の細菌コロニーの形成は、該形質転換後阻害される。例えば、宿主細胞の
増殖は、該形質転換後阻害される。例えば、宿主細胞は、該形質転換後殺される。
“同族”により、内在性Ｃａｓが、宿主細胞における標的にガイドされるのにｃｒＲＮ
ＡまたはｇＲＮＡ配列と共に動作可能であることを意図する。当業者である対象者は、こ
のようなＣａｓガイドが一般に細菌細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性例えば、内在
性活性野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを有する細菌細胞における野生型ＣＲＩＳＰ
Ｒ／Ｃａｓ活性の特性であることを理解する。
“野生型”Ｃａｓ活性により、当業者である対象者には明らかなとおり、内在性Ｃａｓ
が改変されたＣａｓではないかまたは細胞が内在性Ｃａｓ活性の抑制解除のために操作さ
れていないことを意図する。これは、Ｃａｓヌクレアーゼ活性が天然に抑制されるある細
菌と対照的である(すなわち、野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性がないかまたは何れも本発
明で有用ではなく、これは、対照的に、例えば内在性Ｃａｓ活性が細胞集団増殖阻害実施
に使用できるインサイチュでの野生型宿主細胞の取り組みに適用可能である)。
例えば、宿主細胞集団増殖阻害は、該改変されたヌクレオチド配列に曝されていない該
宿主細胞の増殖と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９
倍または１０倍である。例えば、増殖阻害は、宿主細胞の第二サンプル(単独または混合
細菌集団)のコロニー数と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、
８倍、９倍または１０倍宿主細胞の第一サンプル(単独または混合細菌集団)の低細菌コロ
ニー数により示され、ここで第一細胞は該改変されたヌクレオチド配列により形質転換さ
れているが、第二サンプルは該改変されたヌクレオチド配列に曝されていない。ある実施
態様において、コロニー数は、第一サンプルが改変された配列に曝された１２時間、２４
時間、３６時間または４８時間後に決定する。ある実施態様において、コロニーは、イン
ビトロで、固形寒天で増殖させる(例えば、ペトリ皿)。従って、増殖阻害が、標的配列を
含む細胞または集団の増殖の減少(非処理、すなわち、対照サンプル増殖と比較して＜１
００％増殖)により示すことができるまたはこのような増殖の完全排除であり得ることは
理解される。例えば、宿主細胞集団の増殖は、予定した期間にわたり(例えば、宿主細胞
においてｃＲＮＡまたはｇＲＮＡを合わせた後２４時間または４８時間)少なくとも１０
％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％減
少され、すなわち、宿主細胞集団の増殖は、該ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡに曝されていない
が、それ以外は該予定期間、同じ条件下に維持されている対照宿主細胞集団の増殖より、
少なくともこのようなパーセント少ない。例えば、増殖のパーセント減少は、該期間の最
後(例えば、対照サンプルの対数増殖中期の時点)に各集団のサンプルにおけるコロニー数
の比較により決定する。例えば、試験集団を０時にｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡに曝した後
、試験および対照集団のサンプルを採り、各サンプルを寒天プレートに播種し、該予定さ
れた期間同一条件下でインキュベートする。期間の最後に、各サンプルのコロニー数を計
数し、差異パーセンテージを得る(すなわち、試験コロニー数を対照コロニー数で除し、
それを１００倍し、その結果を１００から減じてパーセンテージ増殖減少を得る)。差異
倍率を、対照コロニー数を試験コロニー数で除して計算する。
集団増殖の阻害は、それ故に、集団における宿主細胞数の増殖の減少により示され得る
。これは、ヌクレアーゼによる細胞死滅および／または標的プロトスペーサー配列上のヌ
クレアーゼの作用による宿主細胞増殖(分裂および／または細胞増殖)の下方制御によるも
のであり得る。ここに開示する処置または予防の実施態様において、ヒトまたは動物対象
の宿主細胞負荷が減少され、それにより疾患または状態が処置(例えば、軽減または排除)
または予防(すなわち、対象が疾患または状態を発症するリスクが軽減または排除)される
。
本発明は、飲料および食糧(またはこれらを製造、加工または保存する装置)に含まれる
環境(例えば、水または水路、冷却または加熱装置における)に天然に見られる野生型細菌
集団またはヒトまたは動物微生物相に含まれる野生型細菌集団のターゲティングに有用で
ある。それ故に、本発明は、宿主細胞の前修飾により死滅または増殖阻害に感受性とする
ことが不可能であるまたは望ましくない状況で有用である(例えば、対象における腸また
は他の位置の微生物相のインサイチュでの処理が望まれるとき)。他の適用において、本
発明は、宿主細胞が原因であるまたは介在する疾患または状態の処置または予防のために
ヒトまたは動物対象に投与する医薬のエクスビボの産生に有用であり、ここで医薬は、修
飾混合細菌集団(例えば、１以上のヒトドナーの糞便または腸内微生物相から得た)を含み
、これは本発明の使用または方法のための製品であり、ここで集団は、宿主細胞の種また
は株と異なる種または株の細菌の亜集団を含む。この亜集団細胞は標的を含まず、故に本
使用または方法により修飾されない。それ故に、例えば、方法は、例えば、ここに開示す
る代謝またはＧＩ状態または疾患の処置または予防のための医薬の産生のために、混合集
団における特定のファーミキューテス亜集団の比率を下げ、バクテロイデス門を温存でき
る。この方法で、本発明は、このような使用またはヒトまたは動物における該処置または
予防のための修飾細菌移植(例えば、修飾糞便移植)医薬を提供できる。例えば、方法は、
医学的使用(例えば、代謝状態(例えば肥満または糖尿病)またはＧＩ管状態(例えば、ここ
に記載する任意のこのような状態)または癌(例えば、ＧＩ管癌)の処置または予防)または
化粧品または個人衛生使用(例えば、ヒトの腋窩またはヒトの他の関連位置に局所適用す
ることによる腋窩または他の体臭の軽減のための、例えば、ヒトの局所使用)ためにヒト
または動物に投与するための細菌の修飾収集物のインビトロでの１以上の微生物相の修飾
に使用され得る。他の例において、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡまたは改変されたヌク
レオチド配列をヒトまたは動物に投与し、宿主細胞はヒトまたは動物に保持され、例えば
、ヒトまたは動物の微生物相(例えば腸内微生物相またはここに開示する任意の他のタイ
プの微生物相)に含まれる。この方法で、宿主細胞により介在されるまたは引き起こされ
る疾患または状態を処置または予防できる。例えば、形質転換をインビトロで実施し、所
望によりアレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡまたは改変されたヌクレオチド配列は、宿主細胞
に電気穿孔される核酸に含まれる。例えば、核酸はＲＮＡ(例えば、ｇＲＮＡのコピー)で
ある。他の例において、核酸は、宿主細胞での発現のためのｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡを
コードするＤＮＡである。
それ故に、例えば、本発明は、対象の微生物相の宿主細胞により介在されるまたは引き
起こされる疾患または状態の処置または予防のためのヒトまたは動物対象の微生物相に含
まれる野生型細菌宿主細胞の集団における宿主細胞修飾(ＨＭ)ｃＲＮＡまたはガイドＲＮ
Ａ(ｇＲＮＡ)を提供するための改変されたヌクレオチド配列であって、ｃＲＮＡまたはｇ
ＲＮＡは標的にＣａｓをガイドするために宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハイブリ
ダイズ可能な配列を含み、ここでｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは野生型ヌクレアーゼ活性を有
する内在性宿主細胞Ｃａｓヌクレアーゼと同族であり、ここで集団の宿主細胞の形質転換
後、集団の増殖は阻害され、疾患または状態が処置または予防される。
例えば、改変されたヌクレオチド配列は、ここに定義するＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイを
含む。例えば、改変されたヌクレオチド配列は単一ガイドＲＮＡをコードする。例えば、
改変されたヌクレオチド配列は、ガイドＲＮＡ(例えば、単一ガイドＲＮＡ)またはｃｒＲ
ＮＡである。例えば、改変された配列は宿主細胞に感染できるバクテリオファージに含ま
れ、ここで形質転換は、バクテリオファージによる宿主細胞の形質導入を含む。バクテリ
オファージは、ここに記載するバクテリオファージであり得る。例えば、改変されたヌク
レオチド配列は、宿主細胞を形質転換できるプラスミド(例えば、接合性プラスミド)に含
まれる。プラスミドここに記載するプラスミドであり得る。例えば、改変されたヌクレオ
チド配列は宿主細胞内および／または間を伝達できるトランスポゾンに含まれる。トラン
スポゾンはここに記載するトランスポゾンであり得る。
本発明の任意の使用または方法は、細胞においてｃＲＮＡまたはｇＲＮＡを産生するた
めに宿主細胞を核酸ベクターで形質転換することを含む。例えば、改変されたヌクレオチ
ド配列を含むベクターまたは核酸を、混合細菌集団(例えば、ヒトまたは動物の微生物相
の一部として)を含むヒトまたは動物に経口、静脈内、局所的、眼、鼻腔内、吸入、直腸
投与、耳、膣投与または任意の他のここに開示する投与経路またはその他で投与し、ここ
で投与は、ベクターまたは核酸で宿主細胞を形質転換する。
例えば、宿主細胞集団はエクスビボである。例えば、混合集団はヒトまたは動物対象お
よびに含まれ、対象における宿主細胞感染が処置または予防される。
例えば、第一細菌および第二細菌は微生物共同体に含まれ、ここで該細菌は相利共生的
に生存する例えば、共同体はヒトまたは動物微生物相であり、例えば共同体はヒトまたは
動物に含まれる(例えば、ここで使用、システム、改変された配列、ベクターまたは細胞
は、ヒトまたは動物における共同体の宿主細胞の感染処置であり、例えば、ここで宿主細
胞は、ヒトまたは動物における抗生物質耐性または有害な疾患もしくは状態に介在するま
たは引き起こす)。下記作業実施例において使用される種(エシェリキア・コリ、ラクトコ
ッカス・ラクティスおよびストレプトコッカス・サーモフィルス)は、ヒトおよび動物腸
内微生物相において相利共生的に共存する株である。実施例はまた混合グラム陽性および
グラム陰性細菌集団におけるターゲティングにも取り組む。さらに、実施例はまたファー
ミキューテス(ストレプトコッカス・サーモフィルス)の集団および腸内細菌科(エシェリ
キア・コリ)の集団にも取り組み、この両者はヒト微生物相に見られる。腸内細菌科の他
の例は、サルモネラ、エルシニア・ペスチス、クレブシエラ、シゲラ、プロテウス、エン
テロバクター、セラチアおよびシトロバクターである。
例えば、方法、使用、改変されたヌクレオチド配列、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、
ベクターまたはシステムはヒト腸内微生物相集団における宿主細胞感染の処置のためであ
り、所望により集団はまたヒト片利共生腸内細菌および／または腸内細菌科である第一細
菌も含み、例えば、ここで宿主細胞および片利共生細胞(第一細菌および第二細菌)はヒト
腸内微生物相で相利共生的に生存する。
例えば、使用またはシステムは、バクテロイデス門細菌および他の細菌を含む混合細菌
集団におけるバクテロイデス門細菌の比率を変えるためである。例えば、ｓｙ通段におけ
る１、それ以上または全ファーミキューテス(例えば、対ストレプトコッカス)に対してバ
クテロイデス門の相対比率を上げるためである。この場合、宿主細胞は、標的を含むファ
ーミキューテス細胞であり得る。例えば、集団は、ヒトまたは動物対象に含まれる微生物
相の細菌集団であり、方法、使用、改変されたヌクレオチド配列、ベクターまたはシステ
ムは、(ｉ)含まれる該宿主細胞(例えば、混合集団に含まれる)による対照の感染の処置；
(ii)対象における該宿主細胞が介在する状態または疾患の処置または予防；(iii)該宿主
細胞により引き起こされるまたは介在されるヒト体臭の軽減または(iv)ヒトの個人衛生の
ためである。例えば、本発明の改変されたヌクレオチド配列、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲ
ＮＡまたはベクターは、本発明のこのようなシステムまたは使用における使用のためであ
る。
例えば、状態または疾患は、代謝または消化器疾患または状態、例えば、肥満、ＩＢＤ
、ＩＢＳ、クローン病または潰瘍性大腸炎である。例えば、状態または疾患は、癌、例え
ば、固形腫瘍またはＧＩ癌(例えば、胃癌)、肝臓癌または膵臓癌である。例えば、状態は
抗生物質への耐性または応答低下である(例えば、ここに開示する何れかの抗生物質)。
例えば、細胞は、細胞における該ＨＭ－ｃｒＲＮＡの産生における要素(ii)と共に動作
可能な内在性ＲＮａｓｅ IIIを含む。別法において、ベクターの１以上は、宿主細胞に
おけるＲＮａｓｅ III発現のためのこのようなＲＮａｓｅ IIIをコードするヌクレオチ
ド配列を含む。
例えば、必須遺伝子(標的を含む)は、細胞のＤＮＡポリメラーゼをコードする。これを
下に例示する。
使用、システム、ベクターまたは細胞の例えば、アレイ、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、
ＮＧＧ、ＮＡＧ、ＮＧＡ、ＮＧＣ、ＮＧＧＮＧ、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＡＧＡＡＷプロ
トスペーサー隣接モチーフ(ＰＡＭ)、例えば、ＡＡＡＧＡＡＡまたはＴＡＡＧＡＡＡ Ｐ
ＡＭに隣接する宿主細胞標的プロトスペーサー配列にハイブリダイズ可能な配列を含む(
これらの配列は５’から３’で示す)。ある実施態様において、ＰＡＭは、プロトスペー
サー配列の３’末端の直ぐ隣にある。例えば、Ｃａｓは、スタフィロコッカス・アウレウ
ス、ストレプトコッカス・サーモフィルスまたはストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ
である。例えば、ＣａｓはＣｐｆ１であるおよび／またはＰＡＭはＴＴＮまたはＣＴＡで
ある。
例えば、改変されたヌクレオチド配列、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡまたはアレイは抗生物質
と組み合わされ、例えば、ここで標的は抗生物質耐性遺伝子に含まれ、ここで抗生物質が
該薬剤である。ある実施態様において、宿主細胞は抗生物質に感受性である。例えば、宿
主細胞(例えば、集団を含むヒトまたは製造コンテナ／装置において)存在下で感染を排除
するための抗生物質の使用に感受性が不十分であるかもしれないが、抗生物質は、本発明
に従いさらに死滅または増殖阻害をＣａｓ修飾(例えば、標的切断)を使用して実施しなが
ら、宿主細胞亜集団サイズまたは増殖を鎮静または減少できる。
本発明は、ヒトまたは動物対象の宿主細胞の感染の抗生物質(第一抗生物質)処置の方法
のための使用、システム、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、改変されたヌクレオチド配列
、ベクターまたは細胞を提供し、ここで抗生物質耐性遺伝子(第一抗生物質への耐性のた
めの)が宿主細胞におけるシステムまたはベクターによりＣａｓ標的化され、ここで方法
は、対象にシステム、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、改変されたヌクレオチド配列、ベ
クターまたは細胞および抗生物質を投与することを含む。遺伝子は下方制御される、すな
わち、遺伝子によりコードされるタンパク質産物の発現が宿主細胞で減少または排除され
、それにより抗生物質耐性が下方制御される。対象において感染が軽減または予防される
。例えば、抗生物質を、システム、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、改変されたヌクレオ
チド配列、ベクターまたは細胞と同時に投与する；他の例において、投与は逐次的である
(例えば、システム、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、改変されたヌクレオチド配列、ベ
クターまたは細胞の前に抗生物質)。本発明のこの特性は、例えば、抗生物質単独がこの
ような宿主細胞感染の処置に十分効率的でないとき、対象における抗生物質処置の増強に
有用であり得る。抗生物質は、ここに開示する何れかの抗生物質、例えば、テトラサイク
リンであり得る。
例えば、各改変されたヌクレオチド配列またはベクターは該ＣＲＩＳＰＲアレイまたは
該ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする配列を含み、さらに抗生物質耐性遺伝子(例え
ば、カナマイシン耐性)を含み、ここでＨＭ－ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡは抗生物質耐性
遺伝子を標的としない。例えば、標的配列は宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子に含まれ、こ
こで抗生物質は第一抗生物質(例えば、カナマイシン)と異なる。この方法で、システム、
改変された配列またはベクターは、宿主を、それ自体ターゲティングすることなく標的と
できる。宿主細胞を第一抗生物質に曝すことにより、第一抗生物質耐性遺伝子を含む細胞
が、第一抗生物質存在下で生存優位性を有するため、改変された配列またはベクターのそ
の中への保持を、正の選択圧により促進できる(改変された配列またはベクターにより形
質転換されていない宿主細胞が第一抗生物質に耐性でないとき)。それ故に、例えば、宿
主細胞におけるｃＲＮＡまたはｇＲＮＡコード化配列の維持を促進するための、宿主細胞
または混合集団を抗生物質(例えば、カナマイシン)および該改変された配列またはベクタ
ーに曝すことを含む、または本発明のシステム、改変された配列、アレイまたはベクター
が該抗生物質と組み合わせである本発明の使用が提供される。
例えば、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする配列または要素(ii)は、宿主細胞種で動
作可能な構成的プロモーター(例えば、強プロモーター)下または誘導可能プロモーター下
にある。例えば、要素(iii)は、宿主細胞種で動作可能な構成的プロモーターまたは誘導
可能プロモーター下にある。
例えば、各宿主細胞はグラム陽性細胞である。他の例において、各宿主細胞はグラム陰
性細胞である。
例えば、方法、使用、システム、改変された配列またはベクターはヒト腸内微生物相集
団における宿主細胞感染の処置のためであり、所望により集団はヒト片利共生腸内細菌を
含む(すなわち、ヒトと片利共生である腸内細菌)。
方法、使用、システム、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、改変された配列またはベクタ
ーの例えば、宿主細胞はヒトまたは動物対象に含まれる混合細菌集団に含まれ、方法、使
用、システム、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、改変された配列またはベクターは、(ｉ)
混合集団に含まれる宿主細胞による対象における感染の処置；(ii)対象における該宿主細
胞が介在する状態または疾患の処置または予防；(iii)該宿主細胞により引き起こされる
または介在されるヒト体臭の軽減または(iv)ヒトの個人衛生のためである。
方法、使用、システム、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、改変された配列またはベクタ
ーの例えば、工業用または医学的流体、固体表面、装置またはコンテナのインビトロ処理
(例えば、食品、消費財、化粧品、パーソナルヘルスケア製品、石油または石油製品)また
は水路、水、飲料、食糧または化粧品の処理、ここで宿主細胞は、流体、表面、装置、コ
ンテナ、水路、水、飲料、食糧または化粧品に含まれるまたはこの上にある。
本発明はまた、ここでのコンセプトの何れかの使用または方法により得ることができる
細菌のエクスビボ混合集団を提供する。
例えば、混合集団または使用または方法の製品は、医学的または栄養学的使用のための
コンテナにある。例えば、コンテナは、例えば、吸入器またはシリンジもしくはＩＶ針に
連結された滅菌容器である。
例えば、使用または方法の製品集団はヒトまたは動物に、そのマイクロバイオームを定
植させるために投与するのに有用である。
本発明は、使用または方法のための集団製品を含む、ヒトまたは非ヒト動物消費用の食
糧または飲料を提供する。
ここで、形態、コンセプトまたは態様の何れかの例えば、バクテロイデスは、カッカエ
、カピロスス、セルロシリティカス、コプロコラ、コプロフィルス、コプロスイス、ディ
スタソニス、ドレイ、エガーシイ、ファエシス、ファインゴールディー、フルクサス、フ
ラジリス、インテスティナリス、メラニノゲニカス、ノルディイ、オレイシプレヌス、オ
ラーリス、オバータス、ペクチノフィルス、プレビウス、スターコリス、シータイオタオ
ミクロン、ユニフォルミス、ブルガタスおよびキシラニソルベンスから選択される種であ
る。例えば、バクテロイデスはシータイオタオミクロンであり、例えば、ここで宿主細胞
または混合集団は、エクスビボまたはインビトロの腸内微生物相集団である。例えば、宿
主細胞、第一または第二細菌亜集団は、複数の異なるバクテロイデス門種または複数のバ
クテロイデス種(例えば、バクテロイデス・シータイオタオミクロンおよびバクテロイデ
ス・フラジリスを含む)またはバクテロイデスおよびプレボテラ種を含む。ここで、例え
ば、プレボテラは、ベルゲンシス、ビビア、ブッカエ、ブッカリス、コプリ、メラニノジ
ェニカ、オリス、ルミニコラ、タネラエ、チモネンシスおよびベルオラーリスから選択さ
れる種である。別法において、宿主細胞、第一または第二細菌はファーミキューテス細胞
である。例えば、宿主細胞、第一または第二亜集団は、アナエロツルンカス、アセトアナ
エロバクテリウム、アセチトマクラム、アセチビブリオ、アナエロコッカス、アナエロフ
ィルム、アナエロシヌス、アナエロスティペス、アナエロボラックス、ブチリビブリオ、
クロストリジウム、カプラコッカス、デハロバクター、ディアリスター、ドレア、エンテ
ロコッカス、エタノリゲネンス、フィーカリバクテリウム、フソバクテリウム、ラシリバ
クター、グッゲンハイメラ、ヘスペリア、ラクノバクテリウム、ラクノスピラ、ラクトバ
チルス、リューコノストック、メガモナス、モリエ、ミツオケラ、オリバクテリウム、オ
キソバクター、パピリバクター、プロプリオニスピラ、シュードブチリビブリオ、シュー
ドラミバクター、ロゼブリア、ルミノコッカス、サルチナ、セイノネラ、シャトレワーシ
ア、スポロバクター、スピロバクテリウム、ストレプトコッカス、サブドリグラヌラム、
シントロフォコッカス、サーモバチルス、ツリシバクターおよびワイセラから選択される
１以上のファーミキューテスを含むまたはこれからなる。例えば、宿主細胞または第一ま
たは第二亜集団はクロストリジウム細胞からなる(および所望により他の亜集団はバクテ
ロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)細胞からなる)。例えば、宿主細胞または第
一または第二亜集団はエンテロコッカス細胞からなる(および所望により他の亜集団はバ
クテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)細胞からなる)。例えば、宿主細胞また
は第一または第二亜集団はルミノコッカス細胞からなる(および所望により他の亜集団は
バクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)細胞からなる)。例えば、宿主細胞ま
たは第一または第二亜集団はストレプトコッカス細胞からなる(および所望により他の亜
集団はバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)細胞からなる)。例えば、宿主
細胞または第一または第二亜集団はフィーカリバクテリウム細胞からなる(および所望に
より他の亜集団はバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)細胞からなる)。例
えば、フィーカリバクテリウムはフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ(例えば
、Ａ２－１６５、Ｌ２－６、Ｍ２１／２またはＳＬ３／３)である。
例えば、宿主細胞または第一または第二亜集団は、アナエロツルンカス、アセトアナエ
ロバクテリウム、アセチトマクラム、アセチビブリオ、アナエロコッカス、アナエロフィ
ルム、アナエロシヌス、アナエロスティペス、アナエロボラックス、ブチリビブリオ、ク
ロストリジウム、カプラコッカス、デハロバクター、ディアリスター、ドレア、エンテロ
コッカス、エタノリゲネンス、フィーカリバクテリウム、フソバクテリウム、ラシリバク
ター、グッゲンハイメラ、ヘスペリア、ラクノバクテリウム、ラクノスピラ、ラクトバチ
ルス、リューコノストック、メガモナス、モリエ、ミツオケラ、オリバクテリウム、オキ
ソバクター、パピリバクター、プロプリオニスピラ、シュードブチリビブリオ、シュード
ラミバクター、ロゼブリア、ルミノコッカス、サルチナ、セイノネラ、シャトレワーシア
、スポロバクター、スピロバクテリウム、ストレプトコッカス、サブドリグラヌラム、シ
ントロフォコッカス、サーモバチルス、ツリシバクターおよびワイセラから選択される１
以上のファーミキューテスを含むまたはこれからなる。例えば、宿主細胞または第一また
は第二亜集団はクロストリジウム(例えば、ディフィシル)細胞からなる(および所望によ
り他の亜集団はバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)細胞からなる)。例え
ば、宿主細胞または第一または第二亜集団はエンテロコッカス細胞からなる(および所望
により他の亜集団はバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)細胞からなる)。
例えば、宿主細胞または第一または第二亜集団はルミノコッカス細胞からなる(および所
望により他の亜集団はバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)細胞からなる)
。例えば、宿主細胞または第一または第二亜集団はストレプトコッカス細胞からなる(お
よび所望によりの亜集団はバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)および／ま
たは腸内細菌科(例えば、エシェリキア・コリ)細胞からなる)。例えば、宿主細胞または
第一または第二亜集団はフィーカリバクテリウム細胞からなる(および所望により他の亜
集団はバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)細胞からなる)。例えば、宿主
細胞または第一または第二亜集団はストレプトコッカス細胞(所望によりストレプトコッ
カス・サーモフィルスおよび／またはピオゲネス細胞)からなり、他の亜集団はバクテロ
イデス(例えば、シータイオタオミクロン)および／または腸内細菌科(例えば、エシェリ
キア・コリ)細胞からなる。
集団本発明の使用または方法のための製品は、ある実施態様において、粘膜、腸、経口
、鼻腔内、直腸内、膣内、眼またはバッカル投与によりヒトまたは非ヒト動物に投与する
ためである。
所望により、宿主細胞または第一または第二亜集団細菌はバクテロイデス・フラジリス
細菌であり、集団は水に含まれる。
本発明のアレイ、システム、改変された配列、ベクターまたはｇＲＮＡを含む適当な飲
料は、例えば、プロバイオティク飲料、例えば、適合させたYakult(商標)、Actimel(商標
)、Kevita(商標)、Activia(商標)、Jarrow(商標)またはヒト消費のための類似飲料である
。
ファージ配列標的
本発明のある態様において、標的配列は、宿主細菌細胞に感染するファージの配列であ
る。本発明により達成されるファージゲノムの所望の修飾は、ファージ死滅またはノック
ダウンに関するだけでなく、むしろ宿主細胞における所望のファージ遺伝子または調節要
素活性化であり得る(例えば、ファージが、宿主細胞生存能または増殖の増加と関連する
所望のタンパク質または他の産物を発現するとき)。あるいは、修飾は、例えば、本発明
によりファージ標的部位に標的化される誘導可能Ｃａｓの使用により、誘導可能ファージ
遺伝子発現制御であり得る。ある実施態様において、本発明は、宿主細胞におけるＣａｓ
ヌクレアーゼでの切断によるファージ標的部位の修飾のために提供される。これは、例え
ば、以下の種々の理由により有用であり得る。
Ａ. 標的部位を、それを活性化または不活性化するための変異のため(例えば、抗宿主遺
伝子の遺伝子ノックダウンまたは不活性化のためまたはファージ標的が宿主染色体に統合
されているとき宿主細胞死滅のため)；
Ｂ. 標的配列または標的配列を含む大型配列欠失のため(例えば、本発明をファージゲノ
ムの空間部位を標的とする第一および第二ＰＭ－ｃｒＲＮＡと使用するとき、ここで各部
位の切断は、切断間のファージ核酸の欠失をもたらす)；
Ｃ. 宿主細胞ゲノムに所望のＰＭ－ＤＮＡ配列を挿入するため(例えば所望のＰＭ－ＤＮ
Ａの相同組換え挿入のために宿主核酸において１以上のＰＭ－ｃｒＮＡガイド切断を提供
することにより)。
本発明は次の態様を提供する。
１. 第一細菌および第二細菌の亜集団を含む混合細菌集団中の該亜集団の相対比率を改変
する方法であって、ここで第一細菌は宿主細胞(例えば、バクテロイデス門宿主細胞)であ
り(ここで第一細菌は所望によりファージにより感染され、第二細菌は該ファージにより
感染されない(またはバクテロイデス門ではない))、方法は、ベクター核酸(例えば、その
ＰＭ含有トランスポゾン)の宿主細胞への導入のために１以上の工程で混合集団と複数の
ベクターを合わせ、混合集団において細菌増殖をさせることを含み、ここで該第一細菌と
第二細菌の相対比率が改変され；
ここで各ベクターは、細胞における標的ヌクレオチド配列(例えば、該ファージの)の修飾
のために宿主細胞に導入するための改変されたファージ修飾(ＰＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイを
含む、
(ａ)ここでＰＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイはそれぞれＰＭ－ｃｒＲＮＡの１以上の発現のため
の配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)ここでＰＭ－ｃｒＲＮＡは宿主細胞におけるＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)を
ガイドし、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズできる。
ファージ生存能、増殖または感染性に必要な遺伝子の不活性化のためにファージ配列を
ターゲティングすることにより、ある態様において、本発明は、ファージに感染された宿
主細胞いよる取り込みおよび保持が促進され得る陽性選択的優位性を有するアレイを提供
する。宿主細胞が殺されるか増殖が低減するとき、集団おける第一細菌対第二細菌の相対
的比率が減少する。本発明は、例えば、ヒトまたは動物対象における疾患または状態の処
置または予防(リスク軽減)のための医薬として使用するための、このような製品集団を提
供し、ここで医薬は対象に投与される。疾患または状態は、ここに開示する疾患または状
態の何れであってもよい。例えば、単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)はｃｒＲＮＡを提供する
ように宿主細胞で発現され、各ベクターは、このようなｇＲＮＡをコードする発現可能な
改変されたヌクレオチド配列を含む。
ＰＭ－アレイを使用する例において、標的配列はバクテロイデス・シータイオタオミク
ロン配列である。所望により標的配列はバクテロイデス・フラジリスに含まれない。これ
は、例えば、修飾が標的配列を切断するか他の態様で非機能的とするとき有利であり、そ
れによりバクテロイデス・シータイオタオミクロン宿主細胞の比率は、例えば、混合集団
がここに記載する腸内微生物相集団であるとき、バクテロイデス・フラジリスをターゲテ
ィングすることなく増加する。バクテロイデス・フラジリスは、ある設定において膿瘍と
関連し、それ故に、例えば、肥満または糖尿病またはＩＢＤの処置または予防のために、
例えば、腸内微生物相のリバランスに有用である本発明により、この例はこのリスクを軽
減し、同時に比率の改変を可能とする(バクテロイデス・シータイオタオミクロン細胞比
率の増加)。
プロモーター(またはＨＭ－またはＰＭ－アレイ)は、宿主細胞において動作可能である
。例えば、プロモーターは、ウイルスまたはファージプロモーター、例えば、Ｔ７プロモ
ーターである。他の例において、プロモーターは細菌プロモーター(例えば、宿主細胞種
のプロモーター)である。
２. 第一細菌がバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロンまたはフラジリス)、ア
リスティペス、アルカリフレックス、パラバクテロイデス、タンネレラ、キシラニバクタ
ーおよび／またはプレボテラ細菌である、態様１の方法。
３. 第二細菌がファーミキューテス細菌である(例えば、第一細菌がバクテロイデス門ま
たはバクテロイデスであるとき)、態様１または２の方法。
４. 第一細菌亜集団対第二細菌亜集団の比率が増加する、すなわち、該方法を適用した後
、前より大きい、前記態様の何れかの方法。
５. 混合集団がヒトまたは非ヒト動物にその腸内または口内微生物相の定植またはリバラ
ンスのために投与するための組成物(例えば、飲料、口腔洗浄剤または食糧)からなり、例
えば、ここで混合集団がヒトまたは非ヒト動物におけるインビトロまたはインビボである
、態様４の方法。
６. 第一細菌亜集団対第二細菌亜集団の比率が減少する、すなわち、該方法を適用した後
、前より小さい、態様１、２または３の方法。
７. 混合集団がヒト消費のための飲料または水(例えば、水路または飲料水)に含まれる、
態様６の方法。
８. 各ベクターがプラスミド、ファージ(例えば、パッケージ化ファージ)またはファージ
ミドである、前記態様の何れかの方法。
９. 各ベクターがファージ(例えば、パッケージ化ファージ)であり、ベクター核酸が宿主
細胞へのファージベクター核酸形質導入により、すなわち、ファージベクターによる宿主
細胞の感染により宿主細胞に導入される、態様８の方法。例えば、ファージはここに記載
する１以上のトランスポゾンを含む。
１０. 各ベクターがプラスミドであり、ベクター核酸がベクターを含む細菌からの形質転
換または水平プラスミド伝達により宿主細胞に導入される、態様８の方法。例えば、プラ
スミドはここに記載する１以上のトランスポゾンを含む。例えば、ベクターを含む細菌は
非バクテロイデス門または非バクテロイデス種である。
これに加えてまたはこれとは別に、ベクターを含む細菌は非ファーミキューテス種であ
る。例えば、ベクターを含む細菌は、ラクトバチルス種(例えば、アシドフィルス(例えば
、Ｌａ－５、Ｌａ－１４またはＮＣＦＭ)、ブレビス、ブルガリクス、プランタルム、ラ
ムノサス、ファーメンタム、コーカシクス、ヘルベティカス、ラクティス、ロイテリまた
はカゼイ、例えば、カゼイ・シロタ)、ビフィドバクテリウム種(例えば、ビフィドゥム、
ブレベ、ロングムまたはインファンティス)、ストレプトコッカス・サーモフィルスおよ
びエンテロコッカス・フェシウムからなる群から選択される１以上の種の細菌である。例
えば、細菌はラクトバチルス・アシドフィルスまたはラクティス細菌である。
１１. 該バクテロイデス門ファージのゲノム修飾のために前記態様の何れかの方法におい
て使用するための改変されたバクテロイデス門ファージ修飾(ＰＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイで
あって、
(ａ)ここでＰＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイは、ＰＭ－ｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列
およびバクテロイデス門ファージ感染宿主細胞における該配列の転写のためのプロモータ
ーを含み；そして
(ｂ)ここでＰＭ－ｃｒＲＮＡは感染宿主細胞においてＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアー
ゼをガイドし、標的配列を修飾するためにバクテロイデス門ファージゲノム標的配列とハ
イブリダイズできる。
１２. 態様１１のＰＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイを含む、態様１～１０の何れかの方法おいて
使用するための核酸ベクター(例えば、プラスミド、ファージまたはファージミド)。
本発明の一般的な実施態様において、別に提供される態様１２がある。
宿主細菌細胞(例えば、上記したような病原性細菌細胞)のゲノムまたは宿主細胞におけ
るウイルス(例えば、ファージ)のゲノムの標的配列を修飾するために改変されたＨＭ－Ｃ
ＲＩＳＰＲアレイを含む核酸ベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ファージまたは
ファージミド)であって、
(ａ)ここでＣＲＩＳＰＲアレイは、ｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細
胞における配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)ここでｃｒＲＮＡは宿主細胞におけるＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイド
し、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズできる。
プロモーターは宿主細胞において動作可能である。例えば、プロモーターは、ウイルス
またはファージプロモーター、例えば、Ｔ７プロモーターである。他の例において、プロ
モーターは細菌プロモーター(例えば、宿主細胞種のプロモーター)である。
例えば、アレイは、ここに記載するトランスポゾンに含まれる。例えば、アレイはここ
に記載する運搬体細菌に含まれる。例えば、複数のアレイはファージまたは宿主細胞の１
以上の標的ヌクレオチド配列のターゲティングのために提供され、ここで複数のアレイは
、ここに記載する細菌細胞、例えば、運搬体、第一レシピエントまたは第二レシピエント
細胞に含まれる。例えば、運搬体細胞は、ここに記載する飲料(例えば、ヒト消費用のプ
ロバイオティク飲料)または食糧に含まれる。例えば、アレイまたは運搬体細菌は、ヒト
または動物の感染の処置または予防のためにヒトまたは非ヒト動物に投与するためであり
、例えばここで宿主細胞は病原性である。例えば、アレイまたは運搬体細菌は、ヒトまた
は動物の肥満、糖尿病またはＩＢＤの処置または予防のためにヒトまたは非ヒト動物の腸
に投与するためである。
１３. アレイまたはベクターがヒトまたは非ヒト動物消費のための細菌細胞、例えば、プ
ロバイオティク細胞に含まれる、態様１１または１２のアレイまたはベクター。
１４. ベクターが、混合集団との該組み合わせに使用されるまたは混合集団と組み合わせ
るためであり、それによりベクター核酸は、形質転換(例えば、第三細菌から第一細菌宿
主細胞への水平プラスミドベクターまたはトランスポゾン伝達による)または形質導入(例
えば、第一細菌宿主細胞のファージベクター感染による)により宿主細胞に導入される、
前記態様の何れかの方法、アレイまたはベクター。
１５. 本または各アレイまたはベクターがヒトまたは非ヒト動物腸片利共生または相利共
生細菌細胞(例えば、ここに記載する運搬体細菌細胞)に含まれる、前記態様の何れかの方
法、アレイまたはベクター。それ故に、細胞は、ヒトまたは非ヒト動物と片利共生または
相利共生する腸内細菌種のものである。
１６. 各ベクターが、ファーミキューテス宿主細胞またはバクテロイデス門ファージ感染
宿主細胞(例えば、バクテロイデス細胞)と共に動作可能である複製起点を含むプラスミド
、ファージまたはファージミドであり、所望により態様１５に定義したとおり片利共生ま
たは相利共生細菌細胞において動作可能である、態様１２～１５の何れかの方法またはベ
クター。例えば、複製起点は、ｏｒｉＴまたはここに記載する任意の他の複製起点である
。
１７. 各ベクターが(１)バクテロイデス細胞ではないヒトまたは非ヒト動物片利共生また
は相利共生細菌細胞と(２)バクテロイデス細胞であるファージ感染細胞の間または(３)フ
ァーミキューテス細胞ではないヒトまたは非ヒト動物片利共生または相利共生細菌細胞と
(４)標的配列含有ファーミキューテス細胞の間の水平伝播ができる配列(例えば、ここに
記載するトランスポゾン)を含むプラスミドまたはファージミドである、態様１２～１６
の何れかの方法またはベクター。
１８. 各ベクターが(１)バクテロイデス細胞であるファージ感染細胞と(２)ヒトまたは非
ヒト動物腸へのプロバイオティク投与に適する細菌細胞の間または(３)標的配列含有ファ
ーミキューテス細胞および(４)ヒトまたは非ヒト動物腸へのプロバイオティク投与に適す
る細菌細胞の間の水平伝播が可能なプラスミドまたはファージミド配列(例えば、ここに
記載するトランスポゾン)である、態様１２～１７の何れかの方法またはベクター。
１９. 片利共生、相利共生またはプロバイオティク種がラクトバチルス種(例えば、アシ
ドフィルス(例えば、Ｌａ－５、Ｌａ－１４またはＮＣＦＭ)、ブレビス、ブルガリクス、
プランタルム、ラムノサス、ファーメンタム、コーカシクス、ヘルベティカス、ラクティ
ス、ロイテリまたはカゼイ、例えば、カゼイ・シロタ)、ビフィドバクテリウム種(例えば
、ビフィドゥム、ブレベ、ロングムまたはインファンティス)、ストレプトコッカス・サ
ーモフィルスおよびエンテロコッカス・フェシウムからなる群から選択される、態様１５
～１８の何れかの方法またはベクター。
プロモーターが該ファージ感染バクテロイデス門宿主細胞および態様１５～１９の何れ
かに定義の片利共生、相利共生またはプロバイオティク細菌細胞または態様１５～１９の
何れかに定義の標的配列含有ファーミキューテス細胞および片利共生、相利共生またはプ
ロバイオティク細菌細胞において該配列の転写が可能である、前記態様の何れかの方法、
アレイまたはベクター。例えば、プロモーターはウイルスまたは細菌プロモーター、例え
ば、Ｔ７プロモーターである。例えば、プロモーターは宿主細胞プロモーター、例えば、
宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓアレイのプロモーターである。
２０. 修飾が(ｉ)標的配列の切断、(ii)標的配列含有遺伝子の転写下方制御、(iii)標的
配列含有遺伝子の転写上方制御または(iv)標的での核酸配列の付加、欠失または置換であ
る、前記態様の何れかの方法、アレイまたはベクターまたはここでのあらゆる使用。
２１. バクテロイデス門ファージがｃｒＡｓｓファージ、ＧＢ－１２４ファージ、ＧＡ－
１７ファージ、ＨＢ－１３ファージ、Ｈ１６－１０ファージ、Ｂ４０－８ファージおよび
バクテロイデス・フラジリスファージＡＴＣＣ５１４７７－Ｂ１から選択される、前記態
様の何れかの方法、アレイまたはベクター。Nat Commun. 2014 Jul 24;5:4498. doi: 10.
1038/ncomms5498, "A highly abundant bacteriophage discovered in the unknown
sequences of human faecal metagenomes", Dutilh BE et al.を参照のこと。ｃｒＡ
ｓｓファージ約９７kbpゲノムは、全ての他の既知ファージをあわせたよりも、公的に利
用可能なメタゲノムで６倍豊富であり、ウイルス様粒子(ＶＬＰ)由来メタゲノムおよび総
合コミュニティメタゲノムの全読取のそれぞれ最大９０％および２２％を構成し、公的デ
ータベースにおける全ヒト糞便メタゲノム配列の配列決定読取の１.６８％に上る。新規
共発生プロファイリングアプローチの使用により、Dutilh et alは、バクテロイデス関連
タンパク質ホモログおよびファージゲノムにおいてコードされる独特な炭水化物結合ドメ
インと一致する、このファージのバクテロイデス宿主を予測した。
２２. 標的配列が宿主細胞感染性、ファージ溶原性または溶解性サイクルまたはファージ
生存能、例えば、必須遺伝子またはコートタンパク質遺伝子に必要なファージ遺伝子に含
まれる、前記態様の何れかの方法、アレイまたはベクター、またはここでのあらゆる使用
。
２３. 標的配列がＢＡＣＯＮ(バクテロイデス門関連炭水化物結合)ドメインコード化配列
(例えば、ここで宿主はバクテロイデス宿主である)またはエンドリシンコード化配列に含
まれる、前記態様の何れかの方法、アレイまたはベクター。FEBS Lett. 2010 Jun 3;584(
11):2421-6, doi:10.1016/j.febslet.2010.04.045. Epub 2010 Apr 21, “Mining metage
nomic data for novel domains: BACON, a new carbohydrate-binding module”, Mello
L et al.を参照のこと。ファージ構造タンパク質へのＢＡＣＯＮドメインの存在は、粘液
モデルへの提唱されるバクテリオファージ粘着性を説明するはずである。このモデルによ
ると、ファージは、カプシド提示炭水化物結合ドメイン(例えば免疫グロブリン様折りた
たみまたはＢＡＣＯＮドメイン)を経て腸管粘液層を構成するムチン糖タンパク質に結合
し、ファージが感染する細菌のより頻繁な相互作用を促進する。
２５. ＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞でのｃｒＲＮＡ発現および産生のために配列Ｒ１－
Ｓ１－Ｒ１’を含み、
(ｉ)ここでＲ１は第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１’は第二ＣＲＩＳＰＲ反復であり、
Ｒ１またはＲ１’は任意であり、
(ii)Ｓ１は該標的配列に９５％以上同一であるヌクレオチド配列を含むまたはそれからな
る第一ＣＲＩＳＰＲスペーサーである、
前記態様の何れかの方法、アレイまたはベクターまたはここでのあらゆる使用。例えば、
標的配列はプロトスペーサーを含むかまたは本発明のアレイが宿主細胞にあるときＣａｓ
と同族プロトスペーサー隣接モチーフ(ＰＡＭ)に直ぐに隣接したプロトスペーサー配列に
含まれ、ここでＣａｓはまた該アレイから発現されるｃｒＲＮＡとも同族である。ある実
施態様において、Ｃａｓは細胞に内在性である。他の例において、Ｃａｓは細胞に外来性
である、例えば、本発明のベクターにより提供される。
２６. Ｒ１およびＲ１’が、宿主細胞と同種の細胞のＣＲＩＳＰＲアレイの反復配列と少
なくとも９５％(例えば、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％)同一である、
態様２５の方法、アレイまたはベクター。
２７. Ｒ１およびＲ１’がシータイオタオミクロンおよびフラジリス(例えば、バクテロ
イデス・フラジリスＮＣＴＣ ９３４３)から選択されるバクテロイデス種のＣＲＩＳＰ
Ｒアレイ(例えば、タイプII－Ｃアレイ)の反復配列と各少なくとも９５％(例えば、９６
％、９７％、９８％、９９％または１００％)同一であり、ここで宿主細胞が反復配列と
機能的であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含み、例えば、該種、バクテロイデス細胞
である、態様２５の方法、アレイまたはベクター。
２８. Ｒ１およびＲ１’は、該種、例えば、該種の該宿主細胞のＣＲＩＳＰＲアレイの第
一(最も５’)および第二(第一反復の直ぐ３’の反復)反復配列とそれぞれ少なくとも９５
％(例えば、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％)同一である、態様２７の方
法、アレイ、使用またはベクター。例えば、アレイはタイプII－Ｃアレイである。例えば
、アレイまたはベクターはさらにＲ２－Ｓ２－Ｒ２’を含み、ここでスペーサーＳ２はス
ペーサーＳ１と同一または異なり(例えば、宿主細胞またはファージゲノムにおける異な
る標的部位のターゲティングのため)、ここでＲ２およびＲ２’は宿主細胞において機能
的であり、所望によりＲ１と同一である。例えば、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２およびＲ２’の各
々はバクテロイデス・フラジリスＣＲＩＳＰＲ反復である。
２９. (iii)Ｒ１およびＲ１’の各々はバクテロイデス種細胞のＣＲＩＳＰＲアレイ(例え
ば、タイプII－Ｃアレイ)の反復配列と同一であり、ここで種はカッカエ、カピロスス、
セルロシリティカス、コプロコラ、コプロフィルス、コプロスイス、ディスタソニス、ド
レイ、エガーシイ、ファエシス、ファインゴールディー、フルクサス、フラジリス(例え
ば、フラジリスＮＣＴＣ ９３４３)、インテスティナリス、メラニノゲニカス、ノルデ
ィイ、オレイシプレヌス、オラーリス、オバータス、ペクチノフィルス、プレビウス、ス
ターコリス、シータイオタオミクロン、ユニフォルミス、ブルガタスおよびキシラニソル
ベンスからなる群から選択され、そして(iv)ここで宿主細胞は反復配列と機能的であるＣ
ＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含み、該群から選択される種のバクテロイデス細胞(例え
ば、(iii)の選択種と同じ種)である、態様２５の方法、アレイ、使用またはベクター。
３０. Ｒ１およびＲ１’が標的配列修飾のために宿主バクテロイデス門またはファーミキ
ューテス細胞のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと共に機能的である、態様２５の方法、ア
レイ、使用またはベクター。例えば、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２およびＲ２’は、同じ細菌種、
例えば、シータイオタオミクロンまたはフラジリスのようなバクテロイデスまたはストレ
プトコッカス・サーモフィルスまたはピオゲネスのようなストレプトコッカスのタイプII
(例えば、タイプII－Ｃ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム反復である。
３１. Ｒ１およびＲ１’がバクテロイデス門(例えば、バクテロイデスまたはプレボテラ)
またはファーミキューテス(例えば、ストレプトコッカス)細胞のＣＲＩＳＰＲアレイ(例
えば、タイプII－Ｃアレイ)の反復配列と少なくとも９５％(例えば、９６％、９７％、９
８％、９９％または１００％)同一である、態様２５の方法、アレイ、使用またはベクタ
ー。
３２. Ｒ１およびＲ１’の各々が表２の配列番号１～５から選択される配列と少なくとも
９５％(例えば、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％)同一であり、所望によ
り第一細菌細胞が、例えば、表２における種または株(例えば、種または選択配列に対し
て列記した株)のバクテロイデス細胞である、態様２５の方法、アレイ、使用またはベク
ター。
３３. Ｒ１およびＲ１’の各々が表２の配列番号６～１１から選択される配列と少なくと
も９５％(例えば、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％)同一であり、所望に
より第一細菌細胞が、例えば、表２における種または株(例えば、種または選択配列に対
して列記した株)のプレボテラ細胞である、態様２５の方法、アレイ、使用またはベクタ
ー。
３４. 各アレイが宿主細胞でｃｒＲＮＡと機能的であり、標的配列を修飾する１以上のＣ
ａｓヌクレアーゼとの組み合わせである、前記態様の何れかの方法、アレイまたはベクタ
ー。例えば、標的配列はプロトスペーサー隣接モチーフ(ＰＡＭ)に直ぐ隣接してプロトス
ペーサー配列を含み、所望によりここでＰＡＭはバクテロイデス門宿主細胞に含まれるＣ
ａｓヌクレアーゼと同族である。例えば、ＣａｓはタイプII－Ｃ Ｃａｓヌクレアーゼで
ある。
３５. 各アレイが、宿主細胞におけるｃｒＲＮＡと機能的であり、標的配列を修飾する１
以上のＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸配列との組み合わせである、前記態様の何れ
かの方法、アレイまたはベクター。
３６. Ｒ１およびＲ１’が宿主細胞における標的を修飾するためにタイプII Ｃａｓ９ヌ
クレアーゼ(例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・サーモフ
ィルスまたはスタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９)と共に機能的である、態様２５
の方法、アレイ、使用またはベクターであって、所望によりここで方法、アレイまたはベ
クターはさらに態様３４または３５に従い、ここでＣａｓは該Ｃａｓ９である。
３７. 態様１～１０または１４～３６の方法により得られる細菌のエキソビボ混合集団ま
たはここでの使用。例えば、混合集団は医学的または栄養学的使用のための容器にある。
例えば、コンテナは滅菌容器である。
３８. ヒトまたは非ヒト動物に治療的、予防的、美容的ヒトまたは非ヒト動物体重減少(
例えば、美容的減少)または栄養学的使用のために投与する組成物であって、態様３７の
混合集団を含む組成物。例えば、組成物は、経口、全身、吸入、直腸内、眼、バッカルま
たは膣内投与用である。例えば、組成物は、ヒトまたは非ヒト動物の腸または口腔への投
与用である。
３９. 態様３７の混合集団または態様３８の組成物を含む、ヒトまたは非ヒト動物消費の
ための食糧または飲料。
４０. 栄養補助またはプロバイオティク飲料または食糧である、態様３９の食糧または飲
料。
４１. ヒトまたは非ヒト動物または飲料水におけるバクテロイデス門感染の処置または予
防のための抗生物質組成物であって、ここで組成物は態様１１～３６の何れかのアレイま
たはベクターを含み、所望によりここで修飾は態様２１(iii)または(iv)に従う。
４２. ヒトまたは非ヒト動物における腸バクテロイデス門の比率を上げるためのプロバイ
オティク組成物(例えば、肥満、糖尿病(例えば、Ｉ型)またはＧＩ炎症状態の処置または
予防のため)であって、ここで組成物は態様１１～３６の何れかのアレイまたはベクター
を含み、所望によりここで修飾は態様２１(iii)または(iv)に従う。
４３. ヒトまたは動物における腸バクテロイデス対ファーミキューテスの相対的比率を上
げるため、例えば肥満、糖尿病(例えば、Ｉ型糖尿病)またはＧＩ状態(例えば、クローン
病、ＩＢＤ、ＩＢＳまたは潰瘍性大腸炎)の処置または予防のための、態様３８、４１ま
たは４２の組成物。
別法において、本発明のあらゆる形態における“アレイ”は、宿主細胞における発現の
ためのＨＭ－ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする改変されたヌクレオチド配列が代わ
りとなり得る。アレイに関するここでの態様の何れかの特性は、それ故に、このような改
変された配列に変更すべきところは変更して代替的に適用され得る。
可動遺伝要素およびＣＲＩＳＰＲシステム
４４. 宿主細菌細胞(例えば、ファーミキューテスまたは上記したような病原性細菌細胞)
のゲノムまたは宿主細胞におけるウイルス(例えば、ファージ)のゲノムの標的配列修飾の
ための改変されたＣＲＩＳＰＲアレイを含む核酸ベクター(例えば、プラスミド、ウイル
ス、ファージまたはファージミド)であって、
(ａ)ここでＣＲＩＳＰＲアレイは、ｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列(例えば、ｇ
ＲＮＡに含まれる)および宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み；
(ｂ)ここでｃｒＲＮＡは宿主細胞におけるＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイド
し、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズでき；
(ｃ)ここでアレイは第一細菌と、異なる種の第二細菌細胞の間で水平伝播できるトランス
ポゾンからなる。
所望により、Ｃａｓヌクレアーゼは、宿主細胞の野生型内在性Ｃａｓヌクレアーゼであ
る。
４５. アレイはヒトまたは非ヒト動物への投与のためであり、第一細胞種がヒトまたは動
物に非病原性であり、第二細胞種がヒトまたは動物に病原性であり、ここでアレイは第一
細胞に含まれる、態様４４のベクター。
４６. 第一細胞種がヒトまたは動物と片利共生または相利共である種、例えば、腸内微生
物相種である、態様４５のベクター。
４７. 第一細胞種がラクトバチルス種(例えば、アシドフィルス(例えば、Ｌａ－５、Ｌａ
－１４またはＮＣＦＭ)、ブレビス、ブルガリクス、プランタルム、ラムノサス、ファー
メンタム、コーカシクス、ヘルベティカス、ラクティス、ロイテリまたはカゼイ、例えば
、カゼイ・シロタ)、ビフィドバクテリウム種(例えば、ビフィドゥム、ブレベ、ロングム
またはインファンティス)、ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびエンテロコッカ
ス・フェシウムからなる群から選択される、態様４５または４６のベクター。
４８. ベクターがヒトまたは動物消費用の飲料(例えば、プロバイオティク飲料)または食
糧に含まれる、態様４４～４７の何れかのベクター。
４９. ベクターが標的配列ターゲティングのための少なくとも一つの反復－スペーサー－
反復単位を含み、ここで、反復が宿主細胞のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの反復と少な
くとも９５％(例えば、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％)同一であり、そ
れによりベクターの反復が宿主システムのＣａｓをガイドし、標的ヌクレオチド配列を修
飾するために宿主細胞において動作可能である、態様４４～４８の何れかのベクター。
５０. ベクターがＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)コード化配列を欠く、態様４９の
ベクター。
本発明による宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのヌクレオチド配列のターゲティング
は、宿主細胞耐性のベクターへの移動(例えば、侵入ウイルス)または耐性発現もしくは増
加の減少に有用である。例えば、本発明は、それにより、新規ベクター(例えば、ファー
ジ)スペーサー獲得阻害されるように、内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの活性のタ
ーゲティングおよびノックダウンの利点を提供する。
可動化の特性は、伝達に必要なシス作用性領域(ｏｒｉＴ)の存在である。この領域は、
ＤＮＡプロセシングの開始部位であり、そこで、部位および鎖特異的ニックが、伝達事象
開始のためにプラスミドで作られる。本発明は、次のとおり可動遺伝要素(ＭＧＥ)を用い
るさらなる実施態様を提供する。
１. 可動遺伝要素(ＭＧＥ)を含むまたはこれからなる改変されたＣＲＩＳＰＲ核酸ベクタ
ーであって、ここでＭＧＥは宿主細胞(例えば、病原性細菌細胞)のゲノムまたは宿主細胞
におけるウイルス(例えば、プロファージ)のゲノムの標的配列修飾のための伝達起点(ｏ
ｒｉＴ)およびＣＲＩＳＰＲアレイを含み、
(ａ)ここでＣＲＩＳＰＲアレイは、ｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細
胞における配列の転写のためのプロモーターを含み；
(ｂ)ここでｃｒＲＮＡは宿主細胞におけるＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイド
し、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズでき；
(ｃ)ここでベクターは(ｉ)第一宿主細胞の第一核酸と第二核酸位置間(ここで各位置は染
色体またはプラスミドの位置であり、標的配列は宿主細胞に含まれる)または(ii)第一宿
主細胞と第二宿主細胞間(ここで標的配列は第一および／または第二宿主細胞に含まれる)
で伝達される。
ＭＧＥの例は、ＩＣＥ、トランスポゾン、プラスミドおよびバクテリオファージである
。伝達起点(ｏｒｉＴ)は、コンジュゲーション中、ＤＮＡのそれを含む細菌宿主からレシ
ピエントへの伝達に必要である短配列(例えば、最大５００bp)である。ｏｒｉＴはシス作
用性である － 伝達される同じＤＮＡ上に見られ該ＤＮＡと共に伝達される。典型的伝
達起点は、ニッキングドメイン、伝達ドメインおよび終結ドメインの３つの機能的に定義
されたドメインを含む。
所望により、プロモーターは、第一および第二(および所望により第三)細胞における該
配列の転写に動作可能である。
所望により標的配列は第二細胞に含まれる。所望により標的配列は第二細胞に含まれな
い。
例えば、第一および第二細胞は異なる細菌種のものである(例えば、例えば、腸、腋窩
、膣または口腔のヒトマイクロバイオーム集団に見られる種)。例えば、第一および第二
細胞はエクスビボである。他の例において、第一および第二細胞は、インビボまたはエク
スビボでヒト腸、膣、腋窩または口腔マイクロバイオームに含まれる。
２. ＭＧＥが組込みおよび接合性要素(ＩＣＥ)であるまたはそれを含む、実施態様１のベ
クター。あるいは、ＭＧＥは、可動性ＭＧＥである(すなわち、可動のためにＭＧＥに担
持される遺伝子によりコードされる因子を使用できる)。ＭＧＥに関する用語“可動性”
および“接合性”は、業者である対象者には容易に明らかである。
本発明の適するＩＣＥおよび適当なｏｒｉＴの源の例を提供する、ＩＣＥｂｅｒｇデー
タベース(http://db-mml.sjtu.edu.cn/ICEberg/)を参照のこと。例えば、ＩＣＥは、群１
～２８から選択されるＩＣＥを含むＩＣＥファミリーのメンバーであるかまたはｏｒｉＴ
は、このようなファミリーのメンバーのｏｒｉＴである：１＝ＳＸＴ／Ｒ３９１；２＝Ｔ
ｎ９１６；３＝Ｔｎ４３７１；４＝ＣＴｎＤＯＴ／ＥＲＬ；５＝ＩＣＥｃｌｃ；６＝ＩＣ
ＥＢｓ１；７＝ＩＣＥＨｉｎ１０５６；８＝ＰＡＰＩ－１；９＝ＩＣＥＭｌＳｙｍ(Ｒ７
Ａ)；１０＝ＩＣＥＳｔ１；１１＝ＳＰＩ－７；１２＝ＩＣＥ６０１３；１３＝ＩＣＥＫ
ｐ１；１４＝ＴｎＧＢＳ１；１５＝Ｔｎ５２５３；１６＝ＩＣＥＳａ２６０３；１７＝Ｉ
ＣＥＹｅ１；１８＝１０２７０－ＲＤ.２；１９＝Ｔｎ１２０７.３；２０＝Ｔｎ１８０６
；２１＝ＩＣＥＡ５６３２；２２＝ＩＣＥＦ－Ｉ／II；２３＝ＩＣＥＡＰＧ２；２４＝Ｉ
ＣＥＭ；２５＝１０２７０－ＲＤ.１；２６＝Ｔｎ５８０１；２７＝ＰＰＩ－１；２８＝
ＩＣＥＦ－III。ファミリー記述はＩＣＥｂｅｒｇデータベースにある。例えば、Ｔｎ９
１６ファミリーは、Roberts et al (2009) (Trends Microbiol. 2009 Jun;17(6):251-8.
doi: 10.1016/j.tim.2009.03.002. Epub 2009 May 20; “A modular master on the move
: the Tn916 family of mobile genetic elements”, Roberts A, Mullany P)により定義
された。Ｔｎ９１６ファミリーに属する要素は次の基準により定義される：Roberts et a
lに示される一般的組織化を有さなければならず、ＤＮＡレベルで元のＴｎ９１６と配列
および構造が類似するコア領域(コンジュゲーションおよび制御モジュール)を有しなけれ
ばならない。このファミリーに以前に分類されたＴｎ１５４９および対応する対照と記載
したとおりの高い程度のタンパク質相同性を有するもののようないくつかの接合性トラン
スポゾンは例外である。
３. ＩＣＥがトランスポゾン、例えば、接合性トランスポゾンである、実施態様２のベク
ター。例えば、ＭＧＥは機能的ヘルパー要素存在下で可動性である可動性トランスポゾン
であり、所望によりここでトランスポゾンは該ヘルパー要素と組み合わされる。
４. ベクターがプラスミドであり、所望によりここでＭＧＥがプラスミドに含まれるトラ
ンスポゾンである、前記の実施態様の何れかのベクター。例えば、トランスポゾンは接合
性トランスポゾンである。例えば、トランスポゾンは可動性トランスポゾンである(例え
ば、プラスミド、例えば、プラスミドのトランスポゾン配列の外側の遺伝子によりコード
される１以上の因子を使用して可動性)。所望により、トランスポゾンはタイプＩトラン
スポゾンである。所望により、トランスポゾンはタイプIIトランスポゾンである。
５. ｏｒｉＴが第一および第二宿主細胞で機能的である、前記の実施態様の何れかのベク
ター。これは、例えば、第一細胞と第二細胞が異なる種のものであるとき、細菌集団の細
菌にわたり拡散および増殖を促進するのに有用である。
６. 第一細胞に含まれるときの実施態様５のベクターであって、ここで第一細胞は第二細
胞にＭＧＥを伝達するために動作可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み
、ここで配列はＭＧＥに含まれない。これは、このような配列のためのＭＧＥにおける空
間の使用を避けるために有用である。例えば、これは細胞間の伝達のためのより小型のＭ
ＧＥの構築を可能にするまたは大型のまたはより多いＣＲＩＳＰＲアレイの挿入を可能に
する、例えば、宿主細胞における各配列を標的とするための複数のスペーサーを含むため
または第一および第二宿主細胞における異なる配列を標的とするため、より多いＣＲＩＳ
ＰＲアレイの挿入を可能にする。
７. 配列がベクターに含まれない、実施態様６のベクター。これは、このような配列のた
めのベクターまたはＭＧＥにおける空間の使用を避けるために有用である。例えば、これ
は、細胞間の伝達のためのより小型のベクターまたはＭＧＥの構築を可能にする細胞また
は大型のまたはより多いＣＲＩＳＰＲアレイの挿入を可能にする、例えば、宿主細胞にお
ける各配列を標的とするための複数のスペーサーを含むためまたは第一および第二宿主細
胞における異なる配列を標的とするためおよび／またはＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ
９をコードする１以上の配列を含むため、より多いＣＲＩＳＰＲアレイの挿入を可能にす
る。
８. 配列が第一細胞の接合性トランスポゾンに含まれる、実施態様６または７のベクター
。これは、本発明のＭＧＥの第一および第二宿主細胞(例えば、ヒトマイクロバイオーム
における異なる細菌種の)間の水平伝播のための、接合性転位を行うためにＭＧＥの外側
の因子の利用を可能とするため、有用である。
９. トランスポゾンが第二細胞にＭＧＥを伝達するためにトランスで動作可能である、実
施態様８のベクター。これは、本発明のＭＧＥの第一および第二宿主細胞(例えば、ヒト
マイクロバイオームにおける異なる細菌種の)間の水平伝播のための、接合性転位を行う
ためにＭＧＥの外側の因子の利用を可能とするため、有用である。例えば、本発明のＭＧ
ＥのｏｒｉＴは、宿主細胞の接合性トランスポゾンに含まれるｏｒｉＴと同じである。こ
れは、本発明のＭＧＥがＭＧＥの第一および第二宿主細胞(例えば、異なる種、例えば、
ヒトマイクロバイオーム種の細菌細胞)間の水平伝播を行うのに宿主細胞によりコードさ
れる因子と共に動作可能とするのに有用である。これは、上記のとおりＭＧＥをより小型
化しまたはＣＲＩＳＰＲアレイおよび／またはＣａｓ遺伝子の空間を解放することを可能
とする。
用語“トランスで動作可能”は、ＭＧＥ(ＩＣＥ)が、ＭＧＥ(またはＭＧＥを含むプラ
スミドのようなベクター全体)の第二細胞への伝達のために、ベクターヌクレオチド配列
の外の宿主ヌクレオチド配列から発現されるタンパク質(例えば、宿主細胞の接合性トラ
ンスポゾンにより発現されるタンパク質)を使用して水平伝播に動作可能であることを意
味する。
１０. 第一細胞に含まれるときの、前記の実施態様の何れかのベクターであって、ここで
ＭＧＥのｏｒｉＴは第一細胞のＩＣＥに含まれるｏｒｉＴと同一であり、ここでＩＣＥが
第二細胞にＭＧＥを伝達するためにトランスで動作可能である。
１１. ベクターｏｒｉＴがバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス科またはバクテロ
イデス)またはプレボテラトランスポゾンのｏｒｉＴである、前記の実施態様の何れかの
ベクター。これは、第一および／または第二宿主細胞がそれぞれバクテロイデス門(例え
ば、バクテロイデス科またはバクテロイデス)またはプレボテラ細胞であるとき、有用で
ある。例えば、第一細胞はこのような種の細胞であり、第二細胞はファーミキューテス細
胞であり、標的配列は第二細胞に含まれるが第一細胞に含まれず、それによりＣＲＩＳＰ
Ｒアレイは第二細胞におけるＣａｓを指向し、標的配列を切断する。例えば、標的配列は
第二細胞の必須遺伝子または抗生物質耐性遺伝子に含まれる(および後者に関して、所望
によりベクターは抗生物質と組み合わされまたは抗生物質と組み合わせてヒトまたは非ヒ
ト動物に投与される)。所望により、トランスポゾンはＣＴｎＤｏｔであるかまたはＣＴ
ｎＥＲＬトランスポゾンおよびベクターはテトラサイクリンと組み合わされるかまたはテ
トラサイクリンと組み合わせてヒトまたは非ヒト動物に投与される。
１２. ベクターｏｒｉＴがＣＴｎＤｏｔ、ＣＴｎＥＲＬ ＳＸＴ／Ｒ３９１、Ｔｎ９１６
またはＴｎ４３７１ファミリートランスポゾンｏｒｉＴである、前記の実施態様の何れか
のベクター。
１３. ＭＧＥが第一および第二末端反復配列および反復配列間のＣＲＩＳＰＲアレイを含
む、前記の実施態様の何れかのベクター。
１４. ＭＧＥがトランスポゾンコピーを(１)第二位置に伝達されているとき第一核酸位置
にまたは(２)第二細胞に伝達されているとき第一細胞に残す、前記の実施態様の何れかの
ベクター。これは、宿主細胞を含む細菌集団におけるＭＧＥの増殖および維持の促進に有
用である。別法において、ＭＧＥは、トランスポゾンコピーを(ｉ)第二位置に伝達されて
いるとき第一核酸位置にまたは(ii)第二細胞に伝達されているとき第一細胞に残さない。
１５. 第一および／または第二細胞に含まれているときの(例えば、第一および第二細胞
に含まれるベクターの第一および第二コピー)、前記の実施態様の何れかのベクター。
１６. 第一および第二細胞が異なる種の細胞である、実施態様１５のベクター。例えば、
第一細胞がラクトバチルス細胞(例えば、ここに記載するとおり)および／または第二細胞
がバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス細胞、例えば、例えばここに記載するよう
な細胞)またはファーミキューテス細胞(例えば、例えばここに記載するような細胞)であ
る。例えば、例えば、ＧＩ状態または糖尿病の処置または予防のためのまたは肥満の処置
または予防のためのヒトの腸マイクロバイオームの投与のため、第一細胞がバクテロイデ
ス門(例えば、バクテロイデス細胞、例えば、例えばここに記載するような細胞)および第
二細胞がファーミキューテス細胞(例えば、例えばここに記載するような細胞)である。
１７. 第一および第二細胞が細菌または古細菌細胞である、実施態様１５または１６のベ
クター。
１８. 第一細胞がヒトに非病原性であり(例えば、片利共生または相利共生細菌細胞)、所
望により第二細胞がヒトに病原性細胞である、実施態様１６または１７のベクター。別法
において、第二細胞はヒトに非病原性細胞である。用語“ヒトに非病原性”は、ヒトのマ
イクロバイオーム(例えば、腸、膣、腋窩または口腔マイクロバイオーム)に病原性なくま
たは実質的に病原性なく存在できるが、ヒトの他の環境において病原性である、ある細菌
種(例えば、バクテロイデス種、例えばフラジリス)のような細胞を含む。当業者は、第一
細胞型がヒトにおいてまたはヒト上で保持でき、第二細胞型がヒトにおいてまたはヒト上
で低減すべきであることを理解する。例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイは、ヒトにおいてまた
はヒト上で第二細胞のゲノムを、死滅させまたは細胞生存能もしくは増殖を低減させるよ
うに修飾する。例えば、標的部位は第二細胞に含まれ、部位はＣａｓヌクレアーゼにより
切断され、それにより標的部位に含まれる遺伝子を不活性化または下方制御する。例えば
、遺伝子は第二細胞の必須遺伝子または抗生物質耐性遺伝子である。例えば、遺伝子は病
原性遺伝子である。
１９. 第二細胞(各宿主細胞)が、(ｉ)例えば、メチシリン、バンコマイシン耐性およびテ
イコプラニンから選択される抗生物質に耐性のスタフィロコッカス・アウレウス細胞、(i
i)例えば、セファロスポリン類(例えば、セフタジジム)、カルバペネム類(例えば、イミ
ペネムまたはメロペネム)、フルオロキノロン類、アミノグリコシド類(例えば、ゲンタマ
イシンまたはトブラマイシン)およびコリスチンから選択される抗生物質に耐性のシュー
ドモナス・エルギノーサ細胞、(iii)例えば、カルバペネムに耐性のクレブシエラ(例えば
、ニューモニエ)細胞、(iv)例えば、エリスロマイシン、クリンダマイシン、ベータ－ラ
クタム、マクロライド、アモキシシリン、アジスロマイシンおよびペニシリンから選択さ
れる抗生物質に耐性のストレプトコッカス(例えば、ニューモニエまたはピオゲネス)細胞
、(ｖ)例えば、セフトリアキソン、アジスロマイシンおよびシプロフロキサシンから選択
される抗生物質に耐性のサルモネラ(例えば、血清型チフィ)細胞、(vi)例えば、シプロフ
ロキサシンおよびアジスロマイシンから選択される抗生物質に耐性のシゲラ細胞、(vii)
例えば、イソニアジド(ＩＮＨ)、リファンピシン(ＲＭＰ)、フルオロキノロン、アミカシ
ン、カナマイシンおよびカプレオマイシンから選択される抗生物質に耐性のマイコバクテ
リウム・ツベルクローシス細胞、(viii)例えば、バンコマイシンに耐性のエンテロコッカ
ス細胞、(ix)例えば、セファロスポリンおよびカルバペネムから選択される抗生物質に耐
性の腸内細菌科細胞、(ｘ)例えば、トリメトプリム、ニトロフラントイン、セファレキシ
ンおよびアモキシシリンから選択される抗生物質に耐性のエシェリキア・コリ細胞、(xi)
例えば、フルオロキノロン抗生物質およびカルバペネムムから選択される抗生物質に耐性
のクロストリジウム(例えば、ディフィシル)細胞、(xii)例えば、セフィキシム(例えば、
経口セファロスポリン)、セフトリアキソン(注射可能セファロスポリン)、アジスロマイ
シンおよびテトラサイクリンから選択される抗生物質に耐性のナイセリア・ゴノレー細胞
、(xiii)例えば、ベータ－ラクタム、メロペネムおよびカルバペネムから選択される抗生
物質に耐性のアシネトバクター・バウマンニ細胞または(xiv)例えば、シプロフロキサシ
ンおよびアジスロマイシンから選択される抗生物質に耐性のカンピロバクター細胞から選
択される細胞である、前記の実施態様の何れかのベクターまたはここでのあらゆる使用。
このような種はヒトに病原性であり得る。
２０. 標的部位が第二細胞の抗生物質耐性遺伝子に含まれており、ここで抗生物質が実施
態様１９に記載する各抗生物質である、実施態様１９のベクターまたは使用。
２１. 第一細胞がバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス科またはバクテロイデス)細
胞、ラクトバチルス(例えば、アシドフィルス(例えば、Ｌａ－５、Ｌａ－１４またはＮＣ
ＦＭ)、ブレビス、ブルガリクス、プランタルム、ラムノサス、ファーメンタム、コーカ
シクス、ヘルベティカス、ラクティス、ロイテリまたはカゼイ、例えば、カゼイ・シロタ
)、ビフィドバクテリウム(例えば、ビフィドゥム、ブレベ、ロングムまたはインファンテ
ィス)、ストレプトコッカス・サーモフィルス、エンテロコッカス・フェシウム、アリス
ティペス、アルカリフレックス、パラバクテロイデス、タンネレラまたはキシラニバクタ
ー細胞である、実施態様１５～２０の何れかのベクター。
２２. (ｉ)の第一および／または第二核酸位置がバクテロイデス門(例えば、バクテロイ
デス科またはバクテロイデス)細胞に含まれるまたは(ii)の第一および／または第二宿主
細胞がバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス科またはバクテロイデス)またはプレボ
テラ細胞である、前記の実施態様の何れかのベクター。
２３. 第一細胞がバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス科またはバクテロイデス)細
胞であり、第二細胞がファーミキューテス(例えば、クロストリジウムまたはスタフィロ
コッカス)細胞であり、例えば、ここでベクターがＧＩ状態または糖尿病の処置または予
防のためのまたは肥満の処置または予防のためのヒトの腸マイクロバイオームに投与する
ためである、実施態様２２のベクター。
２４. 第一細胞(各第一細胞)が環境(例えば、水または土壌環境中)において環境的に許容
され、所望により第二細胞(各宿主細胞)が環境において許容されない、実施態様１６また
は１７のベクター(またはここでのあらゆる使用)。水環境は当業者には容易に明らかであ
り、例えば、海または水路(例えば、湖、運河、川または貯留槽)環境であり得る。例えば
、水環境はヒト消費が意図される飲料水または汚水である。例えば、土壌環境は耕地の土
壌または採鉱場所(例えば、鉱物または金属採鉱場所)の土壌である。
“許容される”および“許容されない”により、当業者は、第一細胞型を環境で保持で
き、第二細胞型を環境で減少させるべきであることを容易に理解する。例えば、ＣＲＩＳ
ＰＲアレイは、第二細胞のゲノムを、環境において死滅させるかまたは細胞生存能もしく
は増殖を低減させるように修飾する。例えば、標的部位は第二細胞に含まれ、部位はＣａ
ｓヌクレアーゼにより切断され、それにより標的部位に含まれる遺伝子を不活性化または
下方制御する。例えば、遺伝子は第二細胞の必須遺伝子または抗生物質耐性遺伝子である
。例えば、遺伝子は病原性遺伝子である。
例えば、環境はヒトのマイクロバイオーム、例えば、口腔マイクロバイオームまたは腸
マイクロバイオームまたは血流である。例えば、環境はヒトに関する環境ではない。例え
ば、環境は非ヒト動物に関する環境ではない。ある実施態様において、環境は空気環境で
ある。ある実施態様において、環境は農業環境である。ある実施態様において、環境は石
油または石油回収環境、例えば、油または石油採掘場または井戸である。例えば、環境は
、ヒトまたは非ヒト動物消費のための食糧または飲料に関する環境である。
例えば、ベクター、システム、ベクター、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、方法または
ここでのあらゆる使用が産業における使用であるかまたは環境が産業用環境であり、ここ
で産業は、医療および健康管理、薬剤、ヒト食品、動物食品、植物肥料、飲料、乳製品、
食肉加工、農業、家畜飼育、家禽飼育、魚介類飼育、獣医、石油、ガス、石油化学製品、
水処理、汚水処理、包装、電子機器およびコンピューター、パーソナルヘルスケアおよび
トイレタリー、化粧品、歯科、非医学的歯科、眼、非医学的眼、鉱物採鉱および加工、金
属採鉱および加工、採石、航空、自動車、鉄道、船舶、宇宙、環境、土壌処理、パルプお
よび紙、衣料品製造、染料、印刷、接着剤、空気処理、溶媒、生物兵器防衛、ビタミンサ
プリメント、低温保存、繊維浸漬および製造、生命工学、化学、産業用洗浄製品、家庭用
洗浄製品、石鹸および洗剤、消費財、林業、漁業、娯楽、リサイクリング、プラスチック
、皮革、革製品およびスエード、廃棄物管理、葬儀および葬儀業、燃料、建築、エネルギ
ー、鋼、およびタバコ産業分野からなる群から選択される分野の産業である。
２５. 修飾標的部位での取り込みのために核酸(例えば、ＤＮＡ)と組み合わされた、前記
の実施態様の何れかのベクター。
例えば、修飾が標的部位の切断であり、核酸(例えばＤＮＡ)が宿主細胞に相同組換えに
より取り込まれる。これは、本発明のベクターを使用して宿主細胞ゲノムの正確な標的化
修飾を行うのに有用である。
２６. 取り込みのための核酸が調節要素またはエクソン配列、例えばヒト配列であるまた
はそれを含む、実施態様２５のベクター。
２７. ＭＧＥの可動化のためにトランスポザーゼと組み合わされる、前記の実施態様の何
れかのベクター。
２８. ベクターまたはＭＧＥが第一宿主細胞と共に動作可能な毒素－抗毒素モジュールを
含み、所望によりここで毒素－抗毒素モジュールが第一細胞以外の細胞と共に動作可能で
はないまたは動作性が減少している抗毒素遺伝子を含む、前記の実施態様の何れかのベク
ター。
２９. ベクターまたはＭＧＥが第二宿主細胞と共に動作可能な毒素－抗毒素モジュールを
含み、所望によりここで毒素－抗毒素モジュールが第二細胞以外の細胞と共に動作可能で
はないまたは動作性が減少している抗毒素遺伝子を含む、前記の実施態様の何れかのベク
ター。
３０. ベクターまたはＭＧＥが第一および第二宿主細胞と共に動作可能な毒素－抗毒素モ
ジュールを含み、所望によりここで毒素－抗毒素モジュールが第一および第二細胞以外の
細胞と共に動作可能ではないまたは動作性が減少している抗毒素遺伝子を含む、前記の実
施態様の何れかのベクター。毒素－抗毒素モジュールの使用は、選択的優位性の提供、故
に、ＭＧＥ保持および拡散に有用である。例えば、モジュールはタイプＩモジュール、例
えば、Ｈｏｋ－Ｓｏｋモジュールである。例えば、モジュールはタイプIIモジュール、例
えば、ＨｉＣａ－ＨｉｃＢモジュールである。例えば、モジュールはｔａｄ－ａｔａタイ
プ毒素－抗毒素モジュールである。例えば、モジュールはプラスミドアディクションモジ
ュールである。例えば、第一および／または第二細胞はバクテロイデス細胞であり、モジ
ュールは、バクテロイデス種のモジュール、例えば、Ｔｘｅ／ＹｏｅＢファミリーアディ
クションモジュール(例えば、http://www.uniprot.org/uniprot/F0R9D1参照)、ＲｅｌＥ
／ＳｔｂＥファミリーアディクションモジュール(例えば、http://www.uniprot.org/unip
rot/F0R9A0参照)、ＨｉｇＡファミリーアディクションモジュール(例えば、http://www.u
niprot.org/uniprot/D7J8V2またはhttp://www.uniprot.org/uniprot/D2ESD0参照)、Ｒｅ
ｌＥ／ＳｔｂＥファミリーアディクションモジュール(例えば、http://www.uniprot.org/
uniprot/F0R5F4参照)である。ベクターまたはＭＧＥにおける毒素－抗毒素の使用は、所
望の細胞(例えば、第一および第二および／または第三細菌細胞)以外のベクター担持細胞
の破壊を可能とするのに有用であり得る。この例において、ＭＧＥまたはベクターは細菌
毒素－抗毒素モジュールの毒素遺伝子および同族抗毒素遺伝子を含み、ここで毒素および
抗毒素遺伝子の発現は、例えば、異なるプロモーターにより、別々に制御される。例えば
、毒素遺伝子は、毒素が常に産生されるように、第一、第二(および第三)細胞において構
成的に活性であるプロモーターを含み得る。抗毒素遺伝子は、第一および／または第二細
胞における１以上の因子(例えば、発現されたタンパク質)により誘導可能であるが、異な
る株または種の非標的細胞では誘導可能ではない、プロモーターを含むことができる。既
知のとおり、抗毒素は、本質的に細菌毒素／抗毒素システムにおいて毒素より安定が低く
、故に、標的細胞ではない(例えば、第一および／または第二細胞ではない)細胞へのベク
ターまたはＭＧＥの伝達は、抗毒素発現非存在下または低抗毒素活性下の毒素発現をもた
らし、故に非標的細胞の細胞死に至る。これは、それ故に、標的細胞(第一、第二および
第三細胞)に本発明のベクターを取り込み、保持するための選択圧を作り、そうして、そ
れらは所望のＣＲＩＳＰＲアレイ活性をその中に含み、集団(例えば腸内微生物相)におけ
る標的細胞にわたり増殖できる。これはまたアレイの効果が集団内で制御されるように、
ベクターまたはＭＧＥの非標的細胞への拡散も制御する － この点に関し、非標的細胞
にベクターを取り込まないよう圧がかかり、もし取り込めば、レシピエント細胞は集団で
生存せず、それによりＭＧＥおよびアレイを有する非標的細胞の複製が制限される。
３１. 第一および第二細胞が同じ門のものであり(例えば、両細菌細胞)、ベクターが、(
ｄ)同じ門の他の細胞ではなく、第一細胞および／または第二細胞で、(ｅ)同じ目の他の
細胞においてではなく、第一細胞および／または第二細胞で、(ｆ)同じ綱の他の細胞にお
いてではなく、第一細胞および／または第二細胞で、(ｇ)同じ目の他の細胞においてでは
なく、第一細胞および／または第二細胞で、(ｈ)同じ科の他の細胞においてではなく、第
一細胞および／または第二細胞で、(ｉ)同じ属の他の細胞においてではなく、第一細胞お
よび／または第二細胞で、(ｊ)同じ種の他の細胞においてではなく、第一細胞および／ま
たは第二細胞で、(ｋ)同じ株の他の細胞においてではなく、第一細胞および／または第二
細胞で複製可能または動作可能である、前記の実施態様の何れかのベクター。
これは、マイクロバイオームにおいて本発明のベクターの選択性を提供する(例えば、
混合細菌集団における第二宿主細胞型の選択的死滅のため)。こでは、例えば、複製また
は動作(例えば、ｃｒＲＮＡを産生するための発現)のために特定のタンパク質の発現を必
要とするように、ＭＧＥまたはアレイ(例えば、そのプロモーター)を操作することにより
達成できる。例えば、プロモーターは、第一および／または第二細胞と共に動作可能であ
るが、他の細胞では可能ではないプロモーターから選択されるかまたはここでＭＧＥは、
その複製開始部位の１以上が第一および／または第二細胞において産生されるが他の細胞
では産生されないタンパク質または他の因子に依存するように操作される。
３２. 細胞の混合集団における、前記の実施態様の何れかのベクターの第一および第二コ
ピーであって、ここで第一ベクターは第一細胞に含まれ、第二ベクターは第二細胞に含ま
れ、細胞が異なる種(例えば、異なる細菌種)の細胞であり、ベクターＭＧＥの一方または
両方が第三細胞(例えば、細菌細胞)へ伝達可能であり、ここで第三細胞種は第一または第
二細胞と同じ種であるかまたは第一および第二細胞種と異なる種である。これは、第一細
胞が運搬体(例えば、それが非病原性であるとき、ヒトまたは動物で、マイクロバイオー
ムのように定植するように、ヒトまたは動物に投与できる)として作用できるため、有用
である。水平伝播により、運搬体は、第三細胞に本発明のＣＲＩＳＰＲアレイを伝達し、
増殖できる(直接的にまたは第二細胞を経て、後者はアレイの貯蔵所として作用する)。そ
の後、アレイは第三細胞における標的配列のＣａｓ修飾(例えば、切断)に介在し、例えば
、第三細胞の必須または抗生物質耐性遺伝子を不活性化または下方制御することができる
。
ここで一般に、標的配列が細胞の抗生物質耐性遺伝子に含まれるとき、本発明のベクタ
ー、改変された配列またはアレイを、ヒトまたは動物に、抗生物質と共に(同時にまたは
逐次的に)投与できる。これは、標的配列を含む細胞を死滅させるまたは増殖を低減させ
るのに有用である。この点に関し、ベクター、改変された配列またはアレイは抗生物質を
含む組成物に含まれ、ここで標的配列は該抗生物質への耐性をコードする遺伝子の配列で
ある。
所望により、混合集団は第三細胞を含む。
例えば、各々本発明のベクターを含む、複数の第一細胞が提供される。例えば、各々本
発明のベクターを含む、複数の第二細胞が提供される。例えば、各々本発明のベクターを
含む、複数の第二細胞と組み合わせた複数の第一細胞が提供される。例えば、複数の第二
細胞および複数の第三細胞と組み合わせた複数の第一細胞が提供され、該複数の細胞の少
なくとも２(または全て)が本発明のベクターを含む。
３３. ベクターまたはＭＧＥが第一、第二および第三宿主細胞と共に動作可能である毒素
－抗毒素モジュールを含み、所望によりここで毒素－抗毒素モジュールが第一、第二およ
び第三細胞以外の細胞で動作不可能であるまたは動作性が低下した(すなわち、低い)抗毒
素遺伝子を含む、実施態様３２のベクター。
３４. ＭＧＥが接合性トランスポゾンであり、ｏｒｉＴが第一および第二宿主細胞で機能
的であり、ＭＧＥが第一および第二末端反復配列および反復配列間のＣＲＩＳＰＲアレイ
を含み、ここで第一および第二細胞が細菌細胞であり、第二細胞はヒト微生物相細胞種(
例えば、病原性種)のものであり、ここで標的部位は第二細胞に含まれるが、第一細胞に
含まれず、ここで該修飾が、第二細胞における標的を含む遺伝子または制御配列を不活性
化または下方制御する、前記の実施態様の何れかのベクター。
有用なことに、それにより第一細胞が本発明のアレイの運搬体および貯蔵庫として作用
でき、これは、ＭＧＥの水平伝播により伝達され得る。
例えば、ＭＧＥは接合性バクテロイデス門トランスポゾンであり、ｏｒｉＴは第一およ
び第二宿主細胞で機能的なバクテロイデス門ｏｒｉＴであり、ＭＧＥが第一および第二末
端反復配列および反復配列間のＣＲＩＳＰＲアレイを含み、ここで第一および第二細胞が
細菌細胞であり、第一細胞はバクテロイデス門細胞であり、第二細胞はファーミキューテ
ス細胞(例えば、クロストリジウムまたはスタフィロコッカス細胞)であり、ここで標的部
位は第二細胞に含まれるが、第一細胞に含まれず、ここで該修飾が、第二細胞における標
的を含む遺伝子または制御配列を不活性化または下方制御する。
３５. 第一または第二細胞に含まれるときの、実施態様３４のベクター。
３６. 第一および第二細胞が混合細菌細胞集団、例えば、ヒトまたは非ヒト動物(例えば
、イヌ、ネコまたはウマ)腸、膣、腋窩または口内微生物相種の細胞の集団に含まれる、
前記の実施態様の何れかのベクター。上に説明したとおり、集団は、ヒトまたは動物に、
そのマイクロバイオームを定植させるために投与するのに有用である。
３７. 実施態様２２に規定する複数の細胞を含む、エクスビボ組成物であって、ここで各
細胞は実施態様１～３６の何れかのベクターを含む。あるいは、組成物は、インビボ、例
えば、非ヒト動物内にある。
３８. 実施態様１～３６の何れかのベクターまたは実施態様３７の組成物を含む、ヒトま
たは非ヒト動物消費用飲料または食糧。飲料は、例えば、ヒトまたは動物における肥満ま
たはＧＩ状態を処置または予防するために、例えば、ヒトまたは動物により連日、２日毎
または毎週消費されるための、例えば、プロバイオティク飲料であり得る。
３９. 複数のバクテロイデス細胞を含む、組成物であって、ここで各細胞は実施態様１～
３６の何れかのベクターを含む。
有用なことに、細胞は、例えば、ヒトまたは動物における肥満またはＧＩ状態を処置ま
たは予防するために、ヒトまたは動物のマイクロバイオーム(例えば、腸マイクロバイオ
ーム)に投与するための本発明のアレイの運搬体および貯蔵庫として作用できる。
４０. 第一細胞の亜集団および第二細胞の亜集団を含む、細菌細胞の混合集団であって、
ここで第一細胞は実施態様１～３６の何れかのベクターを含み、ここでベクターは、第一
および第二細胞亜集団間の水平伝播が可能である。このような集団は、細菌がヒトまたは
動物の１以上のマイクロバイオーム(例えば、腸マイクロバイオーム)で定植するようにヒ
トまたは動物に投与(例えば、鼻腔内)できるため、有用である。第一(および所望により
また第二)細胞は、特にこれらの細胞がヒトまたは動物(例えば、腸マイクロバイオームに
おいて非病原性)に非病原性であるとき、本発明のＣＲＩＳＰＲアレイの運搬体として作
用できる。マイクロバイオームは、ここに開示する任意の他のマイクロバイオームまたは
微生物相集団であり得る。
４１. 第一細菌および第二細菌種の一方または両方がヒトまたは非ヒト動物の腸内微生物
相で定植でき、所望により第一細菌がヒトまたは動物と片利共生または相利共生である、
実施態様４０の集団。有用なことに、第一細菌をヒトまたは動物に安全に投与でき、その
後微生物相の他の細胞への伝達のための本発明のアレイの運搬体として作用できる。
４２. 混合集団が飲料または水(例えば、水路またはヒト消費用の飲料水)または土壌に含
まれる、実施態様４０の集団。水または土壌における集団の提供は、環境または(水につ
いて)加熱、冷却または工業用システムにおいてまたは飲料水保存コンテナにおいてこれ
らを処理するのに有用である。
実施態様の何れかの例えば、第二細胞は、標的配列を含むコレラ細胞であり、ここで標
的配列が修飾されたとき、細胞は殺されるかまたは細胞増殖が減少する。例えば、第二細
胞はヒト消費のための水(例えば、ヒト消費用に加工する前または後のこのような水)に含
まれる。例えば、ベクターは、ヒトにおけるコレラの処置または予防のためにヒトに投与
する医薬組成物に含まれる。
４３. インビトロで実施態様１～３６の何れかの複数のベクターを含む、組成物。例えば
、組成物を、工業用装置またはコンテナ中で多種細菌集団と混合する(例えば、食品、消
費財、化粧品、パーソナルヘルスケア製品、石油または石油製品のため)。
４４. ヒトまたは非ヒト動物にそのマイクロバイオームを治療的または予防的に定植およ
びリバランスするためまたはヒトまたは動物を美容的に変化させるための(例えば、美容
的減量)に投与するための、前記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料また
は集団。
４５. 宿主細胞における標的ヌクレオチド配列を修飾する方法であって、
(１)宿主細胞と運搬体細胞を合わせ、
(ａ)ここで運搬体細胞は、標的修飾のためのＣＲＩＳＰＲアレイを含むＣＲＩＳＰＲ核
酸ベクターを含み、
(ｂ)ここでＣＲＩＳＰＲアレイは、ｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主
細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み；
(ｃ)ここでｃｒＲＮＡは宿主細胞におけるＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイ
ドし、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズでき；そして
(２)これらの細胞を一緒に培養し、ここでベクターが運搬体細胞から宿主細胞に伝達され
、それによりｃｒＲＮＡが宿主細胞におけるＣａｓをガイドするために標的配列とハイブ
リダイズし、標的が修飾される
ことを含む、方法。
例えば、方法はエクスビボで実施される。例えば、方法は美容的方法であって、治療的
または予防的医学的方法ではない。
４６. ベクターが実施態様１～３６の何れかに従う、実施態様４５の方法。
４７. 宿主細胞がヒトまたは非ヒト動物マイクロバイオーム細菌種の細胞であり、所望に
よりここで宿主細胞が病原性細菌種の細胞である、実施態様４５または４６の方法。例え
ば、ここでのあらゆるマイクロバイオームは、腸、膣、腋窩、頭皮、皮膚または口腔マイ
クロバイオームから選択される。
４８. 運搬体細胞が、片利共生または相利共生ヒトまたは非ヒト動物マイクロバイオーム
細菌種である種のものである、実施態様４５～４７の何れかの方法。例えば、運搬体細胞
は、例えば、鼻腔内、局所的または経口で投与したとき、ヒトに非病原性である。
ここでのあらゆる形態、コンセプト、態様、実施態様または例等において、本発明のベ
クター、組成物、アレイまたは集団はヒトまたは非ヒト動物に鼻腔内、局所的または経口
で投与するまたはそのような投与のためである。ヒトまたは動物のマイクロバイオームの
処置を目的とする当業者は、目的のマイクロバイオームにより、最良の投与経路を決定で
きる。例えば、マイクロバイオームが腸マイクロバイオームであるとき、投与は鼻腔内ま
たは経口であり得る。マイクロバイオームが頭皮または腋窩マイクロバイオームであると
き、投与は局所的であり得る。マイクロバイオームが口腔または咽頭にあるとき、投与は
経口であり得る。
４９. 宿主細胞がヒトまたは非ヒト動物の腸マイクロバイオーム細菌種のものである、実
施態様４５～４８の何れかの方法。
５０. 第一細菌および第二細菌宿主細胞種の亜集団の比率を、該該亜集団を含む細菌の混
合集団において改変する方法であって、
Ａ：該第一細菌を宿主細胞に提供し；
Ｂ：該第二細菌を宿主細胞に提供し、ここで第二細胞は第一細胞と異なる種または株の細
胞であり；
Ｃ：改変されたＣＲＩＳＰＲアレイを第一細菌宿主細胞に導入し、ここで各ＣＲＩＳＰＲ
アレイは、ｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および該第二宿主細胞における配列の
転写のためのプロモーターを含み、ここでｃｒＲＮＡは宿主細胞におけるＣａｓ(例えば
、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列を修飾するために第二細胞に含まれる標的
配列とハイブリダイズでき；
Ｄ：混合細菌集団を産生するために第一細菌および第二細菌細胞を一緒に合わせ；そして
Ｅ：ＣＲＩＳＰＲアレイの第一細菌細胞から第二細菌細胞への水平伝播が生じるように混
合集団において細菌を増殖させ、ここで第二細胞における標的配列がＣａｓ修飾され、そ
れにより該第一細菌と第二細菌の相対比率が変えられる
ことを含む、方法。
５１. 各ＣＲＩＳＰＲアレイが実施態様１～２６の何れかに従う、実施態様５０の方法。
５２. さらに工程Ｅの混合集団の第一サンプルを得て、所望により第一サンプル中の第二
細胞の比率と、細胞の第二サンプルにおける第二細胞の比率を比較することを含み、ここ
で第二サンプルは、工程Ｂにおいて第二細胞を提供するのに使用した細菌細胞の混合集団
のサンプルであり、比較は、工程Ｅの後第二細胞の比率が増加または減少していることを
示す、実施態様５０または５１の方法。
５３. 第二サンプルがヒトまたは動物マイクロバイオーム(例えば、腸、膣、頭皮、腋窩
、皮膚または口腔細胞)のサンプルである、実施態様５２の方法。
５４. ヒトまたは動物マイクロバイオーム(例えば、腸、膣、頭皮、腋窩、皮膚または口
腔細胞)のサンプルが工程Ｂの第二細胞の提供に使用される、実施態様５０～５３の何れ
かの方法。
５５. 第一細胞の組み換え、培養集団が工程Ａのために使用される、実施態様５０～５４
の何れかに記載の方法。
５６. プラスミド、ＩＣＥまたはトランスポゾン水平伝播が工程Ｅに使用され、ここで各
プラスミド、ＩＣＥまたはトランスポゾンがＣＲＩＳＰＲアレイを含む、実施態様５０～
５５の何れかの方法。
５７. ヒトまたは非ヒト動物の微生物相の治療的または予防的リバランスのための、例え
ば、肥満、糖尿病、ＩＢＤ、ＧＩ管状態または口腔状態の処置または予防のための、実施
態様５０～５６の何れかの方法。糖尿病はＩ型でもII型でもよい。例えば、予防が医学的
である。例えば、ここでの予防は非医学的、例えば、美容または衛生目的である。例えば
、微生物相は腋窩微生物相であり、方法はヒトの体臭の予防または軽減のためである。例
えば、この場合、方法は、ヒト体臭の発生および／または持続に介在する宿主細菌細胞の
増殖または生存能を下方制御する。
５８. 運搬体および宿主細胞と異なる種または株の第三細菌宿主細胞を提供することを含
み、ここで第三細胞は工程Ｅにおける混合集団に含まれるかまたは工程Ｅ後外集団と合わ
せられ、ここでＣＲＩＳＰＲアレイの第三宿主細胞への水平伝播が起こる、実施態様５０
～５７の何れかの方法。
５９. 第三細胞が標的配列を含まない、実施態様５８の方法。
この方法で、第三細胞がアレイの運搬体として作用でき、標的配列を含む宿主細胞にア
レイを水平に伝達できる。
６０. 第三細胞がＣａｓ修飾のための標的配列を含まない、実施態様５８の方法。
６１. 運搬体(および所望によりまた第三)細胞が実施態様２１に記載する種のもの、例え
ば、バクテロイデス門細胞である、実施態様５０～６０の何れかの方法。
６２. 宿主細胞が実施態様１９に記載の種のものまたはファーミキューテス細胞である、
実施態様５０～６０の何れかの方法。
６３. 各ベクターがプラスミド、ファージ(例えば、パッケージ化ファージ)またはファー
ジミドであるまたはこれに含まれる、前記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、
飲料、集団または方法。
６４. 修飾が(ｉ)標的配列の切断、(ii)標的配列を含む遺伝子の転写下方制御、(iii)標
的配列を含む遺伝子の転写上方制御または(iv)標的での核酸配列の付加、欠失または置換
である、前記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。
６５. 各標的配列が宿主細胞の調節要素または遺伝子に含まれる配列であり、ここで遺伝
子が必須遺伝子、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子または抗生物質耐性遺伝子であり、所望によりここ
で調節要素がこのような遺伝子の要素である、前記実施態様の何れかのベクター、組成物
、食糧、飲料、集団または方法。別法において、遺伝子は病原性遺伝子である。
６６. 各標的配列がファージゲノムに含まれる配列であり、ここでファージは宿主細胞に
含まれる、前記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。例
えば、標的配列が宿主細胞感染性、ファージ溶原性または溶解性サイクルまたはファージ
生存能、例えば、必須遺伝子またはコートタンパク質遺伝子に必要なファージ遺伝子に含
まれる。
例えば、バクテロイデス門ファージがｃｒＡｓｓファージ、ＧＢ－１２４ファージ、Ｇ
Ａ－１７ファージ、ＨＢ－１３ファージ、Ｈ１６－１０ファージ、Ｂ４０－８ファージお
よびバクテロイデス・フラジリスファージＡＴＣＣ５１４７７－Ｂ１から選択される。こ
れは、例えば、ヒトまたは動物の腸マイクロバイオームにおけるバクテロイデス門への生
存優位性の提供のために、有用である。この方法で、バクテロイデス門対ファーミキュー
テスの比率を、前者対後者の比率が増加するように改変することができる(例えば、肥満
の処置または予防のため)。例えば、標的配列がＢＡＣＯＮ(バクテロイデス門関連炭水化
物結合)ドメインコード化配列(例えば、ここで宿主はバクテロイデス宿主である)または
エンドリシンコード化配列に含まれる。
６７. 各ＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞における各ｃｒＲＮＡの発現および製造のために
配列Ｒ１－Ｓ１－Ｒ１’を含み、
(ｉ)ここでＲ１は第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１’は第二ＣＲＩＳＰＲ反復であり、
Ｒ１またはＲ１’は任意であり、
(ii)Ｓ１は該標的配列に９５％以上同一であるヌクレオチド配列を含むまたはそれからな
る第一ＣＲＩＳＰＲスペーサーである、
前記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。
６８. Ｒ１およびＲ１’が、それぞれ第二宿主細胞種のＣＲＩＳＰＲアレイの第一および
第二反復配列と少なくとも９５％同一である、実施態様６７のベクター、組成物、食糧、
飲料、集団または方法。
６９. Ｒ１およびＲ１’が標的配列の修飾のために宿主細胞のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシス
テムで機能的である、実施態様６７または６８のベクター、組成物、食糧、飲料、集団ま
たは方法。
７０. 各アレイが、標的配列を修飾するために宿主細胞における各ｃｒＲＮＡと機能する
１以上のＣａｓヌクレアーゼと組み合わされる、前記実施態様の何れかのベクター、組成
物、食糧、飲料、集団または方法。標的配列はプロトスペーサー隣接モチーフ(ＰＡＭ)に
直ぐ隣接してプロトスペーサー配列を含む。
７１. 各アレイが、標的配列を修飾するために宿主細胞における各ｃｒＲＮＡ機能する１
以上のＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸配列と組み合わされる、組成物、食糧、飲料
、集団または方法。
７２. Ｒ１およびＲ１’が、該宿主細胞における標的の修飾のためにタイプII Ｃａｓ９
ヌクレアーゼ(例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスまたはスタフィロコッカス・ア
ウレウスＣａｓ９)と共に機能的であり、所望によりここでベクター、組成物、食糧、飲
料、集団または方法がさらに実施態様７０または７１に従い、ここでＣａｓが該Ｃａｓ９
である、実施態様６７～７１の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法
。
７３. 実施態様５０～７２の方法により得られる細菌のエキソビボ混合集団。
７４. 実施態様７３の混合集団を含む、ヒトまたは非ヒト動物に治療的、予防的、美容的
ヒトまたは非ヒト動物体重減少(例えば、美容的減少)または栄養学的使用のために投与す
る組成物。
７５. 実施態様７３の混合集団または実施態様７４の組成物を含む、ヒトまたは非ヒト動
物消費のための食糧または飲料。
７６. 栄養補助またはプロバイオティク飲料または食糧である、実施態様７５の食糧また
は飲料。
７７. 実施態様１～３６および６３～７２の何れかのベクターを含む、ヒトもしくは非ヒ
ト動物または飲料水または土壌における細菌感染を処置または予防するための抗生物質組
成物。
７８. 実施態様１～３６および６３～７２の何れかのベクターを含む、ヒトまたは非ヒト
動物における腸バクテロイデス門の比率を上げるため(例えば、肥満、糖尿病またはＧＩ
炎症状態を処置または予防するため)のプロバイオティク組成物。
７９. 例えば肥満、糖尿病またはＧＩ状態の処置または予防のために、ヒトまたは動物に
おける腸バクテロイデス対フィルミクテス門の相対的比率を上げるための、実施態様７４
、７７または７８の組成物。
８０. ベクターがアレイと共に動作可能なＣａｓヌクレアーゼコード化配列を含まない、
前記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。これは、ベク
ターにおける空間を確保するために有用である(例えば、宿主細胞ターゲティングのため
に大型アレイまたはより多くのアレイの挿入を可能とするため － これは、本発明のア
レイに対する耐性の発生の可能性を軽減するために複数ゲノム位置を標的とするのに有用
である)。
８１. ＭＧＥがアレイと共に動作可能なＣａｓヌクレアーゼコード化配列を含まない、前
記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。これは、ＭＧＥ
における空間を確保するために有用である(例えば、宿主細胞ターゲティングのために大
型アレイまたはより多くのアレイの挿入を可能とするため － これは、本発明のアレイ
に対する耐性の発生の可能性を軽減するために複数ゲノム位置を標的とするのに有用であ
る)。例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする大配列を含むことを避けること
が可能である。
８２. アレイが、第一および／または第二細胞と同じ種または株の細胞で見られるＣａｓ
エンドヌクレアーゼと共に動作可能である、実施態様８０または８１のベクター、組成物
、食糧、飲料、集団または方法。例えば、アレイは、宿主細胞または第三細胞と同じ種ま
たは株の細胞で見られるＣａｓエンドヌクレアーゼと共に動作可能である。これは、ベク
ターにおける空間を確保するために有用であるまたはＭＧＥ(例えば、宿主細胞ターゲテ
ィングのために大型アレイまたはより多くのアレイの挿入を可能とするため － これは
、本発明のアレイに対する耐性の発生の可能性を軽減するために複数ゲノム位置を標的と
するのに有用である)。
８３. 第一および第二細胞が異なる種の細菌細胞であり、ここで第二細胞がヒト微生物相
種のものであり、第一細胞がヒト微生物相における非病原性である種のものであり、ここ
で標的配列が第一細胞のゲノムに含まれず、ＭＧＥは第一および第二細胞で動作可能なｏ
ｒｉＴを含み、ここでＭＧＥが第一細胞から第二細胞への水平伝播が可能である、前記実
施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料または集団。
別法において、次のことが提供される。
運搬体および宿主細胞が異なる種の細菌細胞であり、ここで宿主細胞がヒト微生物相種
のものであり、運搬体細胞がヒト微生物相における非病原性である種のものであり、ここ
で標的配列が運搬体細胞のゲノムに含まれず、ＭＧＥが運搬体および宿主細胞において動
作可能であるｏｒｉＴを含み、ここでＭＧＥが運搬体細胞から宿主細胞に水平伝播可能で
ある、前記の実施態様の何れかの方法。
８４. ベクターがバクテリオファージに含まれ、バクテリオファージが第一細胞(運搬体)
に感染してＭＥＧを第一(運搬体)細胞に導入することが可能である、請求項８３のベクタ
ー、組成物、食糧、飲料、集団または方法。
８５. 標的配列が第二(宿主)細胞のゲノムに含まれる(例えばゲノムの必須または抗生物
質耐性遺伝子に含まれる)、実施態様８３または８４のベクター、組成物、食糧、飲料、
集団または方法。
８６. 第二(宿主)細胞種がヒト微生物相において病原性であり、ここで標的配列が標的配
列の切断または標的配列を含む遺伝子の下方制御により修飾される、実施態様８５のベク
ター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。例えば、第二(宿主)細胞は実施態様１９の
特性(ｉ)～(xiv)の何れかに従う細胞である。例えば、第二(宿主)細胞はファーミキュー
テス細胞であり、例えば、ここでベクターは、ヒトにおける肥満の処置または予防のため
である。
８７. 第二(宿主)細胞種がヒト微生物相において非病原性である、実施態様８３、８４ま
たは８５のベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。
８８. 第二(宿主)細胞がバクテロイデス門またはプレボテラ細胞であり、所望によりここ
でＭＧＥが第二(宿主)細胞種からヒト微生物相のファーミキューテス種に水平伝播可能で
ある、実施態様８３～８７の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。
後者は、標的配列がファーミキューテスに含まれるが、第一(運搬体)または第二(宿主)細
胞に含まれないとき、例えば、ヒトにおける肥満の処置または予防のために有用である。
８９. ＭＧＥが第二(宿主)細胞種からヒト微生物相の第三細菌細胞種に水平伝播可能であ
り、ここで第三細胞種がヒト微生物相において病原性であり、標的配列を含む、実施態様
８３～８８の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。例えば、第一(
運搬体)および第二(宿主)細胞は標的配列を含まない。
９０. ここで第三細胞が請求項１９の特性(ｉ)～(xiv)の何れかに従う細胞である、実施
態様８９のベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。
９１. ＭＧＥがアレイの反復配列と共に動作可能であるＣａｓエンドヌクレアーゼをコー
ドする配列を欠き、ここでベクターがＭＧＥ外にこのような配列(例えば、Ｃａｓ９をコ
ードする)を含む、前記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または
方法。
一般的特性の何れも本形態にも適用可能である。ここでの他の形態、態様、段落、例、
実施態様またはコンセプトの何らかの特性を、ＭＧＥを用いる本形態と組み合わせてもよ
い。
それ故に、本発明は、段落として番号を付した次の特性を提供し、これらの段落は引用
する態様または実施態様１～９１の何れかまたはここのあらゆる他の態様に適用される。
１. 標的配列が宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのヌクレオチド配列であり、それによ
りｃｒＲＮＡが宿主細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを修飾するようにＣ
ａｓを標的にガイドする、態様４４～５０の何れかのベクター。
２. 宿主ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがタイプＩ、IIまたはIIIシステムであり、標的
配列が少なくとも１、２または３のさらなる宿主株または種における該タイプのシステム
で保存されたヌクレオチド配列であり、ここで該さらなる株または種が宿主と異なる、段
落１のベクター。
３. 標的配列がストレプトコッカス種(例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルスま
たはストレプトコッカス・ピオゲネス)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム配列と同一である
、前記段落の何れかのベクター。
４. 前記段落の何れかのベクター、ここで宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの標的配列
が
ｉ. 第一反復の最も５’ヌクレオチドと隣接するＣＲＩＳＰＲアレイリーダーまたはリー
ダープロモーター配列(および所望により反復の該最も５’ヌクレオチドを含む、例えば
、第一反復の５’末端に最初の３ヌクレオチドを含む)；
ii. 第一反復の直ぐ５’の最大２０(例えば、３、５、７、９、１０、１２、１５、２０
、３０または３２)ヌクレオチド連続ヌクレオチドの配列；
iii. 第一反復の最も５’ヌクレオチドの最大２０(例えば、３、５、７、９、１０、１２
、１５、２０、３０または３２)連続ヌクレオチドの配列または
iv. 第一スペーサー反復の直ぐ３’の最大２０(例えば、３、５、７、９、１０、１２、
１５、２０、３０または３２)連続ヌクレオチドの配列(および所望によりここで配列は第
一スペーサー最も３’ヌクレオチドを含む、例えば、第一反復の３’末端３’末端に最後
の３ヌクレオチドを含む)。
５. アレイが核酸ベクター(例えば、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミドまた
はプロファージ)に含まれ、そして
ｉ. ｃｒＲＮＡが構造Ｒ－Ｓ－Ｒを含むかまたはこれからなり、ここでＲ＝ＣＲＩＳＰＲ
反復およびＳ＝ＣＲＩＳＰＲスペーサーであり、ここでＳは(５’から３’方向で)Ｖ－Ｈ
ＲまたはＨＲ－Ｖを含みまたは、ここでＶ＝ベクターのＤＮＡ配列と同一の配列およびＨ
Ｒ＝宿主細胞ＣＲＩＳＰＲアレイのＣＲＩＳＰＲアレイの反復のＤＮＡ配列であり；
ii. ここでＨＲの配列は宿主ＣＲＩＳＰＲアレイのＶの配列と直ぐ隣接し；そして
iii. ここでが細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲアレイの修飾のためにＣａｓを宿主標的に
ガイドするために宿主ＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサーとハイブリダイズできる、
段落１、２または３のベクター。
例えば、Ｖはファージベクターコートタンパク質コード化配列の配列である。この点に
関し、Heler et alは、細菌耐性の研究において、３ＣＲＩＳＰＲ非依存的、バクテリオ
ファージ耐性変異体がファージ吸着の顕著な欠損を示し(約５０％)、これらがエンベロー
プ耐性変異を運搬する可能性が最も高いことを示した。
６. 第一ｃｒＲＮＡがベクターに存在する核酸とハイブリダイズしないまたは実質的にし
ない、段落５のベクター。例えば、第一ｃｒＲＮＡは、ベクターにおけるＶとハイブリダ
イズしないか、宿主アレイのスペーサーとハイブリダイズするより低強度でハイブリダイ
ズする。ハイブリダイゼーション試験は、当業者にとって日常的なことである。例えば、
インビトロでベクターＤＮＡを単離または合成し、それとｃｒＲＮＡをインキュベートす
ることにより決定できる。例えば、ＰＣＲを使用する、標準技術を、ハイブリダイゼーシ
ョンが起こるか否かの検出に使用できる(例えば、宿主細胞に見られるｐＨおよび温度条
件下で試験)。
７. Ｖ＝ベクターＤＮＡの１または最大４０(例えば、最大１５)連続ヌクレオチドである
、段落５または６のベクター。標的配列に見られるプロトスペーサーにおけるＰＡＭの直
ぐ５’のシード配列は、ｃｒＲＮＡ対形成およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの切断の
ための機能に重要である。このシード配列は、ＰＡＭの直ぐ５’の約１５または１２連続
ヌクレオチドを含む。
８. アレイがベクターに含まれ、(５’から３’方向で)第一反復配列、第一スペーサー配
列および第二反復配列を含み、ここでスペーサー配列が宿主細胞における標的配列とハイ
ブリダイズでき(例えば、同一であるまたは９０％を超える同一性を有する)、アレイがさ
らなる宿主細胞における反復およびスペーサーの転写のためのプロモーターを含み、所望
によりベクターが宿主細胞における機能的Ｃａｓおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を
コードするためのＣａｓヌクレアーゼコード化配列および／またはｔｒａｃｒＲＮＡコー
ド化配列を含み、ここでｔｒａｃｒＲＮＡ配列が第一または第二反復と相補的である配列
を含む、前記態様または段落の何れかの方法、アレイまたはベクター。
９. ＣＲＩＳＰＲアレイがベクターに含まれ、(５’から３’方向で)第一反復配列、第一
スペーサー配列および第二反復配列を含み、ここでスペーサー配列が宿主細胞における標
的配列とハイブリダイズでき(例えば、同一であるまたは９０％を超える同一性を有する)
、アレイがさらなる宿主細胞における反復およびスペーサーの転写のためのプロモーター
を含み、ここでベクターが宿主細胞におけるｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードするためのＣ
ａｓヌクレアーゼコード化配列および／またはｔｒａｃｒＲＮＡコード化配列を含まず、
ここでｔｒａｃｒＲＮＡ配列が第一または第二反復と相補的である配列を含み、ここでＨ
Ｍ－ＣＲＩＳＰＲアレイが宿主標的部位にＣａｓ(例えば、内在性宿主Ｃａｓヌクレアー
ゼ)をガイドするために宿主細胞において、所望により宿主ｔｒａｃｒＲＮＡを使用して
、機能的である、前記態様または段落の何れかの方法、アレイまたはベクター。
１０. 反復が宿主アレイにおける反復と同一であり、ここで本発明のＣＲＩＳＰＲアレイ
が宿主ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、
Ｃａｓ９)により認識されるＰＡＭを含まない、段落８または９の方法、アレイまたはベ
クター。Ｃａｓ配列を省く能力は、本発明のアレイの空間を解放する。
“必須遺伝子”は、存在または発現が宿主細胞増殖または細胞生存能促進または持続の
ために必要である、宿主における遺伝子である。耐性遺伝子は、存在または発現が抗宿主
剤、例えば、抗生物質、例えば、ベータ－ラクタム抗生物質の完全なまたは部分的な耐性
の提供に必要である、宿主における遺伝子である。病原性遺伝子は、存在または発現が、
宿主細胞が感染可能である生物の感染性に必要である宿主における遺伝子であり、例えば
、ここで宿主は病原体である(例えば、植物、動物、ヒト、家畜、ペット、植物、鳥類、
魚類または昆虫の)。
１１. ＣＲＩＳＰＲアレイが非宿主細胞Ｃａｓ(例えば、宿主システムはタイプIIまたはI
IIであるときタイプＩシステムＣａｓ、宿主システムがタイプＩまたはIIIであるときタ
イプIIシステムＣａｓまたは宿主システムがタイプＩまたはIIであるときタイプIIIシス
テムＣａｓ)と組み合わされ、所望によりここで宿主細胞が非宿主Ｃａｓと同じタイプの
Ｃａｓを含まないかまたは発現しない、前記態様または段落の何れかの方法、アレイまた
はベクター。これは、ＣＲＩＳＰＲアレイがそれ自体(例えばベクター内)または宿主にお
けるベクターコード化Ｃａｓの配列を標的としないため有用である。
１２. ＣＲＩＳＰＲアレイがｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコード
する配列と組み合わされ(例えば、アレイと同じ核酸上)、所望によりここでｔｒａｃｒＲ
ＮＡ配列およびＨＭ－ｃｒＲＮＡが単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)からなる、前記態様また
は段落の何れかの方法、アレイまたはベクター。
１３. ＣＲＩＳＰＲアレイがＣａｓまたはＣａｓをコードする配列と組み合わされ、所望
によりここでアレイが宿主細胞ゲノムに統合され、Ｃａｓが宿主細胞に内在性であるかま
たは外来性配列によりコードされる、前記態様または段落の何れかの方法、アレイまたは
ベクター。例えば、Ｃａｓコード化配列は、例えば、プラスミドまたはウイルス、例えば
ファージから、宿主に導入されている外来性配列である。
１４. ＣＲＩＳＰＲアレイがプラスミド、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド
またはプロファージのヌクレオチド配列に含まれる、前記態様または段落の何れかの方法
。ファージミドはパッケージ化ファージ、アレイまたはベクターである。プロファージは
、細胞における宿主染色体またはエピソームに統合されたファージである。
１５. ＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞ゲノム、例えば、染色体またはエピソーム核酸に統
合される、前記態様または段落の何れかの方法、アレイまたはベクター。
一例において、アレイは、標的配列または標的配列を含む遺伝子で作用する転写または
翻訳アクティベーターとコンジュゲートしたdead Ｃａｓ(例えば、ｄＣａｓ９)と組み合
わされる。これは、例えば、宿主細胞における遺伝子(例えば、宿主が微生物であるとき
抗生物質をコードするためまたは、例えば、食品、飲料、医薬またはここに開示する本発
明の他の任意の適用のために、宿主培養において製造するための所望の外来性タンパク質
をーコードするため、例えば、所望の遺伝子、例えば、宿主細胞内において予め操作され
ている外来性遺伝子配列の)発現のスイッチングに有用である。
１６. 例えば、細胞、例えば、微生物を感染させるためまたは医療または歯科で使用する
ための、前記態様または段落の何れかのＣＲＩＳＰＲアレイを含む、ウイルス(例えば、
ビリオン、ファージ、ファージミドまたはプロファージ)。
１７. 段落１６のビリオンの集団であって、その第一および第二ビリオンが異なるアレイ
リーダーまたはプロモーターを含むおよび／または該宿主細胞または異なる宿主株におけ
る異なる標的配列のターゲティングのためのもの。
１８. ＣＲＩＳＰＲアレイの収集物であって、各アレイは前記態様または段落の何れかに
従い、ここで第一アレイはｃｒＲＮＡ転写のための第一プロモーターを含み、第二アレイ
は第一プロモーターと異なるｃｒＲＮＡ転写のための第二プロモーターを含み、ここで各
プロモーターは宿主プロモーターと同一であるかまたはそのホモログであり、所望により
ここで第一または両プロモーターが宿主Ｃａｓ(例えば、Ｃａｓ１、２、９またはＣｓｎ
２)プロモーターまたは宿主ＣＲＩＳＰＲアレイプロモーターと同一であるもの。例えば
、第一プロモーターは、内在性Ｃａｓヌクレアーゼプロモーターまたは内在性Ｃａｓ１ま
たはＣａｓ２プロモーターまたは宿主細胞で高度にまたは構成的に発現されるまたは必須
、病原性もしくは耐性遺伝子である内在性遺伝子のプロモーターである。内在性プロモー
ターの使用により、宿主の進化中に宿主プロモーターを保存するような圧力がかかり、こ
れにより、宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ防御システムがアレイの１以上のプロモーターをタ
ーゲティングする可能性が低下する。
１９. 本発明のＣＲＩＳＰＲアレイの収集物であって、ここで、第一アレイは１以上のス
ペーサー(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０以
上のスペーサー)を含み、第二アレイは１を超えるスペーサー(例えば、２、３、４、５、
６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０以上のスペーサー)を含み、ここで第二
アレイのスペーサーは第一アレイの１以上のスペーサーと同一である。これは、ＨＭ－ア
レイ(またはさらに複数のアレイにわたるスペーサーの分配)への多くのこのようなスペー
サーの提供が、宿主細胞がスペーサーのいくつかを削除したとしても、一部のＨＭ－アレ
イスペーサーが宿主細胞に残る機会を増やすため、ＨＭ－アレイスペーサーの相同指向組
換えにより宿主耐性を回避するのに有用である。削除に対する防御はまた、異なるアレイ
におけるスペーサーの同一コピーに隣接する異なる反復の使用によっても増強される。
それ故に、本発明は次のものを提供する。
２０. 第一アレイのスペーサー(または該スペーサー)が同一である第一反復に隣接し、第
二アレイのスペーサー(または該スペーサー)が同一である第二反復に隣接し、ここで第一
反復が第二反復と異なる、段落１８または１９の収集物。
２１. 第一反復が宿主細胞ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおける反復と同一である、段
落２０の収集物。
２２. 第一反復が宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおける反復と異なる、段落２０の
収集物。
２３. 第一および第二アレイが同じ宿主細胞または同じベクター(例えば、プラスミド、
ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミドまたはプロファージ)に含まれる、段落１
８～２２の何れかの収集物。
２４. 第一アレイが第一ベクターに含まれ、第二アレイが第一アレイを含まない第二ベク
ターに含まれる(例えば、ここでベクターはプラスミドまたはビリオン(例えば、同じウイ
ルスタイプの)またはパッケージ化ファージ(例えば、同じファージタイプの)である)、段
落１８～２２の何れかの収集物。
ある実施態様において、本発明の方法において使用されるベクターは、段落１８～２４
の何れかのアレイに含まれるベクターである。
２５. 前記段落の何れかのアレイ、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロ
ファージ、集団または収集物を含む、宿主細胞。
一般的特性の何れか(下記参照)も、本形態に適用し得る。
本発明の１例は、アレイに対する宿主適応および耐性のリスクを低減するために次のも
のを提供する。
宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を修飾するための本発明のＣＲＩＳＰＲアレイまたは
ベクターであって、
ａ. ここで宿主細胞は標的配列転写のための第一内在性プロモーター(第一宿主プロモー
ター)を含み；
ｂ. ここでＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡをコードする配列およびｃｒＲＮＡ転写のた
めの第一プロモーターを含み、ｃｒＲＮＡは所望により単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)に含
まれ、Ｃａｓを、標的配列を修飾するために宿主細胞における標的にガイドするために宿
主標的配列とハイブリダイズでき；
ｃ. ここで第一プロモーターの配列は、第一宿主プロモーターの配列と異なる第二内在性
宿主プロモーターの配列である。
例えば、プロモーターは、宿主における必須遺伝子のプロモーターである各ベクター(
例えば、ファージ)ＣＲＩＳＰＲ単位のために使用される － この方法で、宿主はｃｒ
ＲＮＡを十分発現する(およびプロモーターが常にまたは頻繁にスイッチオンにされなけ
ればならない宿主遺伝子由来であるならば、構成的に)。宿主はプロモーターから離れて
用意に適合されず、よって、耐性を容易に発現しない。所望により宿主適応(耐性)の機会
を減らすために、異なるベクターＣＲＩＳＰＲ単位のための異なる必須プロモーターを使
用することが可能である。アレイ(または異なるアレイ)により宿主において標的化される
病原性または必須または耐性遺伝子のプロモーターを使用できる。ファージに対する耐性
を発現するために、宿主は内在性遺伝子プロモーターおよび遺伝子ターゲティング部位を
範囲させる必要があり(これは、例えば、細胞増殖、生存能または抗宿主剤(例えば、抗生
物質)耐性に必須のコード配列内であり得る)、この方法で遺伝子を不活性化するリスクも
ある。
本発明に従うｃｒＲＮＡをコードする核酸配列の複数コピーの提供であって、ここでコ
ピーは本発明に従う宿主細胞配列のターゲティングのための同じスペーサー配列を含むも
のは、ベクターからの有用ターゲティングスペーサーの宿主除去(例えば、宿主細胞相同
指向組換えによる)の機会を減らすために有利である。複数ターゲティングスペーサーは
、耐性を回避する代替法を提供するために本発明の同じまたは複数ＨＭ－アレイに、柔軟
に提供できる。
それ故に、本発明は次のコンセプトを提供する。
１. 宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を修飾するための宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ
ａｓシステム(例えば、タイプＩ、IIまたはIII)であって、(ｉ)～(iv)
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列(例えば、Ｃａｓ９)；
(ii)スペーサー配列(ＨＭ－スペーサー)およびＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードする反復を含む
改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイ(例えば、上記アレイ)であって、ＨＭ－ｃ
ｒＲＮＡは、標的配列を修飾するためにＣａｓを宿主細胞にガイドするために宿主標的配
列とハイブリダイズ可能な配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するためのＤＮＡ
配列；
(iv)ここで、システムの該要素は、２、３以上ー(例えば、２、３、４、５、６、７、８
、９、１０、２０、３０、４０、５０以上)のｃｒＲＮＡをコードする核酸配列のコピー
を含み、ここでコピーは、宿主細胞配列をターゲティングための同じスペーサー配列を含
む(例えば、宿主病原性、耐性または必須遺伝子配列またはベクター適応に介在する宿主
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム要素の配列)
の要素を含む、システム。
例えば、システムは、同じスペーサーを含む４以上または５以上のｃｒＲＮＡをコード
する核酸配列のコピーを含む。これは、宿主における所望のｃＲＮＡの発現増加に有利で
ある。さらに、これは、１を超える配列が標的化に必要であるため、宿主耐性を回避する
大きな機会を提供する(特に５、１０、１５、２０、３０、４０、５０または１００以上
のような多くのコピーが存在するならば)。異なるアレイにわたるコピー、例えば、同じ
ＤＮＡ鎖に分けられた、これらを含むベクターの分配は、所望のｃＲＮＡコード化配列の
削除にいたり得る、スペーサー間またはフランキング反復間の組換えの機会の減少に有用
である。宿主が全コピーを削除する機会は、多くのベクターアレイにわたり分配されたコ
ピーの提供により減少し、これはまた所望のスペーサーの多くのコピーの包含によっても
減少する(例えば、第一ベクターアレイにおける多くのコピーおよび第二ベクターアレイ
における多くのコピー － 少なくとも２、３、４、５、６、１０以上のこのようなアレ
イを含むことが可能であり、各々所望のスペーサーの２、３、４、５、６、７、８、９、
１０、２０、３０、４０、５０または１００以上のコピーを含む)。
２. システムの要素が、同じスペーサーを含むｃｒＲＮＡをコードする核酸配列の４、５
、１０、１５または２０以上のコピーを含む、コンセプト１のシステム。
３. コピーが２以上の核酸ベクターＣＲＩＳＰＲアレイに分けられる、コンセプト１また
は２のシステム。
４. システムが第一および第二ＨＭ－アレイを含み、ここで第一および第二ベクターＣＲ
ＩＳＰＲアレイが同じ宿主細胞または同じベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ビ
リオン、ファージ、ファージミドまたはプロファージ)に含まれる、コンセプト３のシス
テム。
５. 第一アレイが第一ベクターに含まれ、第二アレイが第一アレイを含まない第二ベクタ
ー(例えば、ここでベクターは、プラスミドまたはビリオン(例えば、同じウイルスタイプ
の)またはファージミド(例えば、同じファージタイプの)である)に含まれる、コンセプト
３または４のシステム。
６. 反復が宿主ＣＲＩＳＰＲアレイにおける反復と同一である、前記コンセプトの何れか
のシステム。
７. 反復が宿主ＣＲＩＳＰＲアレイにおける反復と同一ではない、コンセプト１～５の何
れかのシステム。
８. 前記コンセプトの何れかのシステム、ベクター、ウイルス、ビリオン、ファージ、フ
ァージミドまたはプロファージを含む、宿主細胞。
９. コンセプト１～８の何れかのシステム、ベクター、ウイルス、ビリオン、ファージ、
ファージミドまたはプロファージを含む、抗微生物組成物(例えば、抗生物質、例えば、
医薬、殺菌剤または口腔洗浄剤)。
一般的特性の何れか(下記参照)はまた本コンセプトにも適用される。
スプリットＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム
この形態は、外来性配列運搬のための限定的な容量しか有しない標的ベクター、例えば
ウイルスまたはファージにおける空間を解放するのに有利である。空間の解放により、宿
主耐性回避に有用である多くのターゲティングスペーサーまたはアレイを含むことができ
る。これは、例えば、ベクターにおいてコードするよりむしろ内在性Ｃａｓエンドヌクレ
アーゼの利用に有利である － 特にｓｐまたはｓａＣａｓ９のようなかさ高いＣａｓ配
列について。さらに、非宿主源由来のいくつかの外来性Ｃａｓで見られ得るような、適合
性が劣る機会はない。ウイルス、例えば、ファージゲノムサイズを減少させる能力は、ま
た宿主細胞取り込み(宿主細胞におけるウイルス感染および／または維持)にも有利であり
得る。いくつかの例において、ベクター(例えば、ファージ)による宿主の侵襲は、宿主Ｃ
ａｓヌクレアーゼの発現の増加を含み、宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性を情報制御し得る
ことが利点である － 宿主が侵入核酸を退治する試みにおいて。しかしながら、これは
また、この発明形態のアレイ、ベクター、システムおよび他の態様での使用のために、こ
れらが、宿主Ｃａｓにより認識される１以上の反復を含むとき、内在性Ｃａｓを提供する
のに有利である。本発明が宿主ＣＲＩＳＰＲアレイをターゲティングする１以上のスペー
サーを含む場合(また本発明の第一形態のとおり)、これは、宿主ＣＲＩＳＰＲアレイ自体
の不活性化を促進し、“自殺”宿主細胞と同類であり、次いで、これがそれ自体のＣＲＩ
ＳＰＲシステムの不活性化のためにそれ自体のＣａｓヌクレアーゼを使用する。
それ故に、本発明は、例として番号付けする次の特性を提供する。
１. 宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を修飾するための宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ
ａｓ９システム(例えば、タイプＩ、IIまたはIII)であって、(ｉ)～(iv)
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列(例えば、Ｃａｓ９)；
(ii)スペーサー配列(ＨＭ－スペーサー)およびＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードする反復を含む
改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイ(例えば、上記の本発明のアレイ)であって
、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために
宿主標的配列とハイブリダイズ可能な配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはＴｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するためのＤＮＡ
配列；
(iv)ここでシステムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくとも一つの
核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ－ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿
主細胞における標的配列を修飾する、
の要素を含む、システム。
ここでの“スプリット”は、ベクターがシステムの要素の１以上の(しかし全てではな
い)を含み、宿主細胞が要素の１以上の(しかし全てではない)を含み、ベクターが宿主細
胞に含まれない１以上の要素を含むことを意味する。ある実施態様において、ベクターお
よび宿主細胞は要素の何れも共有せず、例えば、宿主細胞は要素(ｉ)を含み、ベクターは
要素(ii)を含み、ベクターが要素(iii)を含むおよび／または宿主細胞が要素(iii)を含む
何れかである。ベクターが宿主細胞内にあるとき(例えば、統合されたまたはエピソーム
ベクター、例えば、プロファージのように)、ベクターが、宿主細胞を形質転換している
ベクターにより提供されている核酸であることが意図される(およびこのような核酸を提
供するシステムの要素は、この場合、宿主細胞要素として解釈されない)。これは、形質
転換宿主の核酸(例えば、染色体およびエピソーム核酸)を配列決定し、これを同じタイプ
の非形質転換宿主(例えば、宿主が微生物、例えば、細菌または古細菌であるとき、例え
ば、同じ宿主親コロニーまたはクローン)からの配列と比較することにより容易に決定で
きる。
所望により、システムはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。所望により、(ａ)の
ヌクレアーゼはタイプＩ Ｃａｓヌクレアーゼである。所望により、(ａ)のヌクレアーゼ
はタイプII Ｃａｓヌクレアーゼ(例えば、Ｃａｓ９)である。所望により、(ａ)のヌクレ
アーゼはタイプIII Ｃａｓヌクレアーゼである。
２. 要素の少なくとも一つが宿主細胞に内在性である、例１のシステム。
３. 要素(ｉ)が宿主細胞に内在性である、例１または２のシステム。
４. 要素(iii)が宿主細胞に内在性である、例１～３の何れかのシステム。
５. 宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を修飾するための、宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／
Ｃａｓシステム(例えば、タイプＩ、IIまたはIII)であって、(ａ)～(ｅ)
ａ. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列(例えば、Ｃａｓ９)；
ｂ. スペーサー配列(ＨＭ－スペーサー)およびＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードする反復を含む
改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは、該Ｃａｓ
を宿主細胞における標的にガイドするために宿主標的配列とハイブリダイズ可能な配列を
含むもの；
ｃ. 任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはＴｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するためのＤＮＡ配
列；
ｄ. ここでシステムの要素は少なくとも第一および第二核酸ベクターに分けられ、ここで
第一ベクターは要素(ａ)を含むが、第二ベクターは要素(ａ)を欠き；そして
ｅ. ここでベクターは宿主細胞に同時にまたは逐次的に共形質転換でき、それによりＨＭ
－ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿主細胞における標的配列を修飾する
に従う要素を含む、システム。
上記の“スプリット”の定義は、変更すべきところは変更して第一および第二ベクター
を含む本例に適用される。
ある実施態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列はベクターにより提供されないが、内在
性宿主細胞ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｔｒａｃｒＲＮＡ配列であり、ここでｔｒａ
ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓを宿主細胞における標的にガイドするために成熟ｃｒＲＮＡにその
後プロセシングされるために、細胞におけるＨＭ－ｃｒＲＮＡとハイブリダイズできる。
６. 第一ベクターが要素(ａ)を含み、第二ベクターが要素(ｂ)および(ｃ)を含む、例５の
システム。
７. 第一および／または第二ベクターが、各々１、２、３以上のさらに改変されたＨＭ－
ＣＲＩＳＰＲ－アレイを含む、例５または６のシステム。
８. 第一および第二ベクターの一方がファージミドであり、他方のベクターがヘルパーフ
ァージである、例５～７の何れかのシステム。
９. ｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列が、例えば、ベクターにより提供される
、単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)に含まれる、前記例の何れかのシステム(例えば、例３ま
たは６)。
１０. 各ベクターが、外来性核酸を挿入する容量が限定されている、前記例の何れかのシ
ステム。
１１. １個または複数個のベクターがウイルス(例えば、ビリオン、パッケージ化ファー
ジ、ファージミドまたはプロファージ)である、前記例の何れかのシステム。
１２. 宿主細胞が目的のＨＭ配列をコードする遊離末端を備えたデオキシリボ核酸鎖(Ｈ
Ｍ－ＤＮＡ)および／またはここでシステムがＨＭ－ＤＮＡをコードする配列を含み(例え
ば、ベクターまたは宿主細胞ゲノムもしくはそのエピソームに統合されている)、ここで
ＨＭ－ＤＮＡが、標的配列におけるまたは隣接する配列または複数配列とそれぞれ相同で
ある配列または複数配列を含む、前記例の何れかのシステム。
鎖は遊離末端、すなわち、鎖が１または２遊離末端を有するように宿主またはベクター
ＤＮＡに統合されていない末端を有し、すなわち、ＤＮＡは、それぞれ直ぐ５’およびま
たは３’の隣接ヌクレオチドと結合していない。
１３. 標的部位が宿主細胞においてＣａｓにより切断され(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ
がＣａｓ９であるとき、Ｃａｓ９により)、ＨＭ－ＤＮＡ宿主ゲノム(例えば、染色体また
はエピソーム部位に)にＨＭ－ＤＮＡを挿入するために、切断部分に隣接するそれぞれ５
’および３’と相同である第一および第二配列を含む、例１２のシステム。
１４. 挿入が相同指向組換え(ＨＤＲ)による、例１３の方法。
１５. 挿入が非相同末端連結(ＮＨＥＪ)による、例１３のシステム。
１６. ＨＭ配列が調節要素(例えば、プロモーター、例えば、内在性プロモーターに置き
換わる誘導可能プロモーター)、転写阻害配列、転写増強配列、標識または外来性タンパ
ク質もしくはドメインをコードする配列であるまたはこれをコードする、例１２～１５の
何れかのシステム。
１７. システムが第一および第二ＨＭ－ＤＮＡを含み、ここで第一ＨＭ－ＤＮＡの配列が
第二ＤＮＡの配列と相補性であり、それによりＤＮＡが宿主細胞ゲノム(例えば、染色体
またはエピソーム部位に)への挿入のために組み合わせＨＭ－ＤＮＡを形成するために相
同指向組換えにより宿主細胞内で組み合わされ得る、例１２～１６の何れかのシステム。
１８. １個または複数個のベクターが細胞内へシステム要素を含むベクター核酸を導入す
るために宿主細胞に感染できる、前記例の何れかのシステム。
１９. Ｃａｓヌクレアーゼがニッカーゼである、前記例の何れかのシステム。
２０. 細胞が細菌または古細菌であり、Ｃａｓヌクレアーゼが細菌または古細菌の内在性
タイプII ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより提供される、前記例の何れかのシステム
。
２１. １個または複数個のベクターが宿主細胞内であり、所望により宿主ＤＮＡに統合さ
れている、前記例の何れかのシステム。
２２. １個または複数個のベクターがＣａｓヌクレアーゼ(例えば、ａＣａｓ９)コード化
配列を欠く、前記例の何れかのシステム。
２３. 内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む微生物宿主細胞感染のための改変され
た核酸ウイルスベクター(例えば、上記ベクター、ビリオンまたはパッケージ化ファージ)
であって、
(ａ)先の例の何れかに従うＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて使用するための複数の
異なるｃｒＲＮＡを発現するための核酸配列を含み；そして
(ｂ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き(例えば、Ｃａｓ９)、
ここで、該ｃｒＲＮＡの第一は該宿主細胞の第一核酸配列とハイブリダイズでき、そして
該ｃｒＲＮＡの第二は該宿主細胞の第二核酸配列とハイブリダイズでき、ここで該第二配
列は該第一配列と異なり；そして
(ｃ)第一配列は抗微生物(例えば、抗生物質)耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)に含まれ、第
二配列は抗微生物耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)に含まれ、所望により、これらの遺伝子
は異なり；
(ｄ)第一配列は抗微生物耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)に含まれ、第二配列は必須または
病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み；
(ｅ)第一配列は必須遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝
子(またはそのＲＮＡ)を含むまたは
(ｆ)第一配列は病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺
伝子(またはそのＲＮＡ)を含む、
ベクター。
２４. 内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む宿主細胞を形質転換するための改変さ
れた(ベクターが宿主を形質転換する改変されたベクターに由来するとき、直接的に改変
されたまたは宿主細胞におけるベクターから単離された)核酸ベクターであって、所望に
より上記のベクターであり、そして
(ａ’)先の例の何れかに従うＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて使用するための複数
の異なるｃｒＲＮＡを発現するための核酸配列を含み；そして
(ｂ’)Ｃａｓヌクレアーゼ(例えば、Ｃａｓ９)をコードする核酸配列を欠き、
ここで、該ｃｒＲＮＡの第一は該宿主細胞の第一核酸配列とハイブリダイズでき、そして
該ｃｒＲＮＡの第二は該宿主細胞の第二核酸配列とハイブリダイズでき、ここで該第二配
列は該第一配列と異なり；そして
第一および／または第二配列が宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの標的配列であり、こ
の配列は
(ｃ’)宿主ＣＲＩＳＰＲアレイにおける反復ＤＮＡまたはＲＮＡ配列(例えば、ここで反
復は最も５’反復である(第一反復))；
(ｄ’)ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡコード化ＤＮＡ配列；
(ｅ’)ＣＲＩＳＰＲアレイリーダー配列；
(ｆ’)Ｃａｓ遺伝子プロモーター(例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２またはＣｓｎ２プロモー
ター)；
(ｇ’)ＣＲＩＳＰＲアレイリーダープロモーター配列または
(ｈ’)Ｃａｓコード化ＤＮＡまたはＲＮＡ配列((例えば、ここでＣａｓはＣａｓ９、Ｃａ
ｓ１、Ｃａｓ２またはＣｓｎ２である)、例えば、ここで第一のｃｒＲＮＡは宿主Ｃａｓ
１遺伝子配列(またはそのＲＮＡの配列)をターゲティングでき、第二のｃｒＲＮＡは宿主
Ｃａｓ２遺伝子配列(またはそのＲＮＡの配列)をターゲティングできる)
であるまたはこれを含む、
ベクター。
２５. 第一および／または第二標的配列が
ｉ. 第一反復の最も５’ヌクレオチドと隣接するＣＲＩＳＰＲアレイリーダーまたはリー
ダープロモーター配列(および所望により反復の該最も５’ヌクレオチドを含む)、例えば
、第一反復の５’末端に最初の３ヌクレオチドを含み；
ii. 第一反復の直ぐ５’の最大２０(例えば、３、５、７、９、１０、１２、１５、２０
、３０または３２)連続ヌクレオチドの配列；
iii. 第一反復の最も５’ヌクレオチドの最大２０(例えば、３、５、７、９、１０、１２
、１５、２０、３０または３２)連続ヌクレオチドの配列または
iv. 第一スペーサーの直ぐ３’の最大２０(例えば、３、５、７、９、１０、１２、１５
、２０、３０または３２)連続ヌクレオチドの配列(および所望によりここで配列は第一ス
ペーサー最も３’ヌクレオチドを含む)、例えば、第一反復の３’末端３’末端に最後の
３ヌクレオチドを含むもの
であるまたはこれを含む、
例２４のベクター。
２６. 各標的配列が配列番号１～４４からなる群から選択される配列に含まれるまたはそ
の相補体である、例２４または２５のベクター。
２７. 第一ｃｒＲＮＡが構造Ｒ－Ｓ－Ｒを含みまたはこれからなり、ここでＲ＝ＣＲＩＳ
ＰＲ反復およびＳ＝ＣＲＩＳＰＲスペーサーであり、ここでＳは(５’から３’方向で)Ｖ
－ＨＲまたはＨＲ－Ｖを含みまたは、ここでＶ＝ベクターのＤＮＡ配列と同一の配列およ
びＨＲ＝宿主細胞ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣＲＩＳＰＲアレイの反復のＤＮＡ配
列であり、ここで第一ｃｒＲＮＡは、細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲアレイの修飾のため
にＣａｓをｃｒＲＮＡにガイドするために宿主ＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサーとハイブ
リダイズできる、例２４～２６の何れかのベクター。
２８. 第一ｃｒＲＮＡがベクターに存在する核酸と実質的にハイブリダイズしない、例え
ば、ここで第一ｃｒＲＮＡは、ベクターにおけるＶとハイブリダイズしないか、宿主アレ
イのスペーサーとハイブリダイズするより低強度でハイブリダイズする、例２７のベクタ
ー。これを決定することについての上の記載はこの例にも適用される。
２９. Ｖ＝ベクターＤＮＡの１または最大４０(例えば、最大１５)連続ヌクレオチドであ
る、例２７または２８のベクター。例えば、Ｖ＝ベクターＤＮＡの１、２、３、４、５、
６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０
、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、
３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０連続ヌクレオチドである。
３０.
ｉ. 宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが同族ＰＡＭを認識できる；
ｊ. ここでベクターＤＮＡがこのようなＰＡＭをプロトスペーサー配列の直ぐ３’に含み
；
ｋ. ここでＶ＝プロトスペーサーの１または最大４０(例えば、最大１５)ヌクレオチドで
あり；そして
ｌ. ここでＨＲ＝宿主ＣＲＩＳＰＲアレイの反復の連続配列と同一の配列である、
例２９のベクター。
３１. 宿主アレイの反復の連続配列が宿主反復の配列の少なくとも５０％である(例えば
、宿主反復の最も５’または最も３’ヌクレオチドを含む)、例３０のベクター。
３２. Ｖ＝最も３’プロトスペーサー連続ヌクレオチドの１～４０(例えば、最大１５)で
あり、そして所望により反復の連続配列は宿主反復の最も５’ヌクレオチドを含む、例３
０または３１のベクター。
３３. Ｖ＝最も５’プロトスペーサー連続ヌクレオチドの１～４０(例えば、最大１５)で
あり、所望により反復の連続配列は宿主反復の最も３’ヌクレオチドを含む、例３０また
は３１のベクター。
３４. Ｒ＝宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより認識される反復である、例２７～３
３の何れかのベクター。あるいは、Ｒ＝宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより認識さ
れない反復である。この場合、好ましくは、ベクターはＲと同族である、すなわち、宿主
細胞においてＲと共に機能できる、Ｃａｓヌクレアーゼ(および所望によりｔｒａｃｒＲ
ＮＡ)のヌクレオチド配列を含む。
３５. 第一配列が(ｃ’)～(ｈ’)の何れかに従い、第二配列が宿主必須遺伝子、病原性遺
伝子または耐性遺伝子から選択される、例２４～３４の何れかのベクター。
３６. 内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む微生物宿主細胞を感染するために、例
１～２２の何れかのシステムにおいて使用するための改変された核酸ウイルスベクター(
例えば、ビリオンまたはパッケージ化ファージ)であって、ここで、
ａ. ベクターは宿主における第一ｃｒＲＮＡを発現するための第一核酸配列を含み；そし
て
ｂ. ここで第一配列は(５’から３’方向で)Ｒ１ａ－Ｓ１－Ｒ１ｂを含み、ここでＲ１ａ
＝第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、ここでＲ１ａは任意であり；Ｒ１ｂ＝第二ＣＲＩＳＰＲ
反復であり、Ｓ１＝宿主配列に相補的なＣＲＩＳＰＲスペーサー(例えば、例２３または
２４に記載する宿主配列)であり、ここでＲ１ａおよびＲ１ｂは宿主Ｃａｓヌクレアーゼ(
例えば、タイプIIヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９)により認識され；
ｃ. ここでベクターは、(ｉ)(ｂ)の反復を認識するＣａｓヌクレアーゼ(例えば、Ｃａｓ
９)をコードする核酸配列および／または(ii)第一配列によりコードされるｃｒＲＮＡ配
列に相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードする核酸配列を欠く。
例えば、ベクターはファージに含まれる核酸ベクターである。
３７.
ｄ. ベクターが宿主における第二ｃｒＲＮＡを発現するための第二核酸配列を含み、ここ
で第二ｃｒＲＮＡは第一ｃｒＲＮＡと異なり；
ｅ. ここで第二配列が(５’から３’方向で)Ｒ２ａ－Ｓ２－Ｒ２ｂを含み、ここでＲ２ａ
＝第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、ここでＲ２ａは任意であり；Ｒ２ｂ＝第二ＣＲＩＳＰＲ
反復およびＳ２＝宿主配列に相補的なＣＲＩＳＰＲスペーサー(例えば、例２３または２
４に記載する宿主配列)、ここでＲ２ａおよびＲ２ｂが宿主Ｃａｓヌクレアーゼ(例えば、
タイプＩまたはIIヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ６)により認識される、
例３６のベクター。
それ故に、例えば、第一および第二核酸配列は、同じパッケージ化ファージミドに含ま
れる、例えば、同じまたは異なるＣＲＩＳＰＲアレイにある。
３８. ベクターが、(iii)(ｅ)の反復を認識するＣａｓ(例えば、Ｃａｓ６)をコードする
核酸配列および／または(iv)第二配列によりコードされるｃｒＲＮＡ配列に相補的である
ｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードする核酸配列を欠く、例３７のベクター。
３９. 内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む微生物宿主細胞を共感染するための、
例１～２２の何れかのシステムに従い使用するための改変された核酸ウイルスベクター(
例えば、上記ベクター、ビリオンまたはパッケージ化ファージ)の収集物であって、収集
物は第一ベクターおよび第二ベクターを含み、
ｆ. ここで第一ベクターは例３６に従う；
ｇ. ここで第二ベクターは宿主における第二ｃｒＲＮＡを発現するための第二核酸配列を
含み、ここで第二ｃｒＲＮＡは第一ｃｒＲＮＡと異なり；
ｈ. ここで第二配列は(５’から３’方向で)Ｒ２ａ－Ｓ２－Ｒ２ｂを含み、ここでＲ２ａ
＝第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、ここでＲ２ａは任意であり；Ｒ２ｂ＝第二ＣＲＩＳＰＲ
反復およびＳ２＝宿主配列に相補的なＣＲＩＳＰＲスペーサー、ここでＲ２ａおよびＲ２
ｂは宿主Ｃａｓヌクレアーゼ(例えば、タイプＩまたはIIヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ
６)により認識される。
例えば、第一ベクターは第一パッケージ化ファージミドに含まれ、第二ベクターは第二
パッケージ化ファージミドに含まれる。
４０. 第二ベクターが、(ｖ)(ｂ)の反復を認識するＣａｓ(例えば、Ｃａｓ９)をコードす
る核酸配列および／または(vi)第一配列によりコードされるｃｒＲＮＡ配列に相補的であ
るｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードする核酸配列を含む、例３９の収集物。
例えば、この場合、Ｃａｓ機能は内在性宿主システムにより提供される。これはベクタ
ー空間を確保し(例えば、より多くの宿主ターゲティングＨＭ－アレイスペーサーの挿入
のため)、ベクターおよびアレイ構築を単純化する。
４１. 第二ベクターが(vii)(ｈ)の反復を認識するＣａｓ(例えば、Ｃａｓ６)をコードす
る核酸配列および／または(viii)第二配列によりコードされるｃｒＲＮＡ配列に相補的で
あるｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードする核酸配列を欠く、例３９または４０の収集物。
例えば、この場合、Ｃａｓ機能は内在性宿主システムにより提供される。
４２. 第一および第二ベクターが各々(ix)(ｂ)の反復を認識するＣａｓ(例えば、Ｃａｓ
９)をコードする核酸配列および(ｘ)(ｈ)の反復を認識するＣａｓ(例えば、Ｃａｓ６)を
コードする核酸配列を欠き、所望によりここで収集物が(ｂ)および(ｈ)の反復を認識する
１以上のＣａｓを含む宿主細胞に含まれる、例３９の収集物。
４３. さらに(ix)および／または(ｘ)に従う核酸配列を含む第三ベクター(例えば、ビリ
オンまたはファージ)を含む、例４２の収集物。
４４. 各ベクターが各パッケージ化ビリオンまたはファージミドまたは各ビリオンまたは
ファージ核酸に含まれる、例３９～４３の何れかの収集物。
４５. Ｒ１ａおよびＲ１ｂが同じ反復配列に含まれる、例３６～４４の何れかのベクター
または収集物。
４６. Ｒ２ａおよびＲ２ｂが同じ反復配列に含まれる、例３７～４５の何れかのベクター
または収集物。
４７. (ｂ)の反復が、(ｅ)の反復を認識するＣａｓヌクレアーゼと異なるＣａｓヌクレア
ーゼにより認識される、例３７～４６の何れかのベクターまたは収集物。
４８. 宿主が種々のタイプのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム(例えば、タイプＩおよびタ
イプIIシステム；タイプＩおよびタイプIIIシステム；タイプIIおよびタイプIIIシステム
またはタイプＩ、IIおよびIIIシステム)を含む、例３７～４７の何れかのベクターまたは
収集物。
４９. (ｂ)の反復がタイプII Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９により認識される
、例３６～４８の何れかのベクターまたは収集物。
５０. (ｅ)の反復がタイプＩまたはIII Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ６により
認識される、例３７～４９の何れかのベクターまたは収集物。
５１. ベクターがウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミドまたはプロファージであ
る、例２３～５０の何れかのベクターまたは収集物。
５２. ベクターによりコードされるｃＲＮＡと共に動作可能である１以上のＣａｓを含む
宿主細胞内の、例２３～５１の何れかのベクターまたは収集物。
５３. Ｃａｓ９を含む宿主細胞内の、例２３～５２の何れかのベクターまたは収集物。
５４. ＨＭ－ＤＮＡと組み合わされており(例えば、ベクター、プラスミドまたは宿主細
胞ゲノムもしくはそのエピソームに統合されている)、ここでＨＭ－ＤＮＡが例１２～１
７の何れかに記載するとおりである、例２３～５３の何れかのベクターまたは収集物。
５５. 複数の異なるｃｒＲＮＡを発現するための核酸配列を含み、ここで該ｃｒＲＮＡが
宿主細胞における少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５
個、２０個、３０個、４０個、５０個または１００個のＤＮＡ配列をターゲティングでき
る、前記例の何れかのシステム、ベクターまたは収集物。
５６. 該Ｃａｓヌクレアーゼ(例えば、Ｃａｓ９)ではないが、宿主ベクター適応に介在す
るＣａｓヌクレアーゼ(またはそのＲＮＡの配列)のＤＮＡ配列をターゲティングできる第
一ｃＲＮＡをコードする第一ｃｒＲＮＡまたは核酸配列を含み、所望により宿主における
耐性、病原性または必須宿主遺伝子の配列(またはそのＲＮＡ)をターゲティングできる第
二ｃＲＮＡをコードする第二ｃｒＲＮＡまたは核酸配列を含む、前記例の何れかのシステ
ム、ベクターまたは収集物。
５７. ２、３またはそれ以上のコピーのｃｒＲＮＡをコードする核酸配列を含み、ここで
コピーは、宿主細胞配列をターゲティングための同じスペーサー配列を含む(例えば、病
原性、耐性または必須遺伝子配列またはベクター適応に介在するが、該Ｃａｓヌクレアー
ゼではない宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム要素の配列)、前記例の何れかのシステム
、ベクターまたは収集物。
５８. コピーが２以上のベクターＣＲＩＳＰＲアレイ間に別れる、例５７のシステム、ベ
クターまたは収集物。
５９. ベクター反復がまたは宿主ＣＲＩＳＰＲアレイ中のまたはそれと同一である(例え
ば、各ベクター反復は、宿主反復に少なくとも９５％配列同一性を有する)、前記例の何
れかのシステム、ベクターまたは収集物。
６０. ベクター反復が宿主ＣＲＩＳＰＲアレイにおける反復またはそれと同一ではない、
例１～５８の何れかのシステム、ベクターまたは収集物。
６１. 同じ宿主細胞または同じベクター(例えば、プラスミドまたはウイルスまたはビリ
オンまたはファージまたはプロファージまたはファージミド)に含まれる第一および第二
ベクターＣＲＩＳＰＲアレイを含む、前記例の何れかのシステム、ベクターまたは収集物
。
６２. 第一アレイが第一ベクターに含まれ、第二アレイが第一アレイを含まない第二ベク
ターに含まれる(例えば、ここでベクターは、プラスミドまたはビリオン(例えば、同じウ
イルスタイプの)またはファージミド(例えば、同じファージタイプの)である、例６１の
システム、ベクターまたは収集物。
６３. 前記例の何れかに従うシステム、ベクター、収集物、ウイルス、ビリオン、ファー
ジ、ファージミドまたはプロファージを含む、宿主細胞。
６４. 例１～６２の何れかに従うシステム、ベクター、ウイルス、ビリオン、ファージ、
ファージミドまたはプロファージを含む、抗微生物組成物(例えば、抗生物質、例えば、
医薬、殺菌剤または口腔洗浄剤)。
複数微生物の一括コンディショニング
本発明は、共進化を促進するための宿主およびウイルスの一括コンディショニングおよ
びそれゆえに宿主のウイルス(例えば、ファージ)へのコンディショニングおよびその逆を
含む、微生物(例えば、ファージおよび／または細菌集団)を産生する方法を提供する。発
現または活性のｃｒＲＮＡの抑制可能制御を使用して、本発明は、所望のスペーサー活性
が、宿主におけるスペーサガイドＣａｓ作用により課せられる負荷存在下または非存在下
、例えば、抗生物質耐性遺伝子ターゲティング存在下または非存在下で生じるのをコンデ
ィショニングすることを可能にするためにオンまたはオフに切り替えできる、意図的に共
進化を制御可能な方法で調節する。この方法で、細菌集団を、所望の遺伝子のファージ不
活性化に遭遇し得る状況(例えば、乳製品または食品製造発酵物)における使用または細菌
を死滅させまたは調整する、例えば、抗生物質耐性ノックダウンのために使用するファー
ジの調整における使用において、調整できる。この形態は、さらに、ある実施態様におい
て、本方法が意図的に宿主との培養中にのアレイ抗生物質耐性遺伝子不活性化の活性を抑
制するため、抗生物質耐性細菌宿主と、宿主の抗生物質耐性遺伝子を標的とする１以上の
本発明のＣＲＩＳＰＲアレイを含むウイルス、例えば、ファージの培養を可能とする。そ
れ故に、耐性細菌宿主集団を培養においてファージの増殖に使用でき(例えば、工業用培
養コンテナまたはプラント中)、ファージおよび宿主が共進化し、増殖、故に、宿主細胞
の培養能力(これはそうしなければファージ拡大を最小化する)を妨害する抗生物質耐性不
活性化効果なしに相互に調整されることを可能とし、一方所望のファージの他の全ての要
素が培養宿主集団に対して調整されることをなお可能とする。得られたファージ集団のサ
ンプルの試験を、例えば、実験室規模で、抗生物質耐性宿主細胞集団を使用して、しかし
、宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子をターゲティングするアレイが抑制解除された試験ファ
ージを用いて、実施できる。原核細胞およびファージ設定における遺伝子発現の天然に存
在するおよび合成の抑制、例えば、ｔｅｔシステムまたは光誘発可能システムは当業者に
周知である。
それ故に、本発明は、段落として番号付けする次の特性を提供する。
１. 微生物の製造方法であって、
(ａ)宿主細胞においてヌクレオチド配列ターゲティングのための宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ
ｓシステムを含む宿主細胞を提供し；
(ｂ)宿主細胞に感染可能であるウィルスを提供し、ここで
(ｉ)ウイルスは宿主細胞の標的ヌクレオチド配列修飾のための１以上の改変された宿主
修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイ(例えば、上記アレイ)を含み；
(ii)第一該ＨＭ－アレイは、Ｃａｓを宿主細胞における標的にガイドし、標的配列を修
飾するように第一宿主標的配列とハイブリダイズできるスペーサー配列(ＨＭ－スペーサ
ー)を含む第一ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードし、所望によりここで第一標的配列の修飾が宿
主細胞増殖または生存能を低下させ；そして
(iii)第一ＨＭ－アレイが第一ＨＭ－ｃｒＲＮＡの転写について可逆性に抑制可能であ
るおよび／または第一ＨＭ－ｃｒＲＮＡ活性が抑制可能であり；
(ｃ)１以上のＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイを細胞に導入するために宿主細胞をウイルスで感
染させ；
(ｄ)細胞における第一ＨＭ－ｃｒＲＮＡの転写および／または第一ＨＭ－ｃｒＲＮＡ活性
を抑制し；
(ｅ)ウイルスの集団(ＰＶ１)を含む宿主細胞の集団(ＰＨ１)を産生するために感染宿主細
胞を培養し；そして
(ｆ)ウイルス集団ＰＶ１および／または培養宿主細胞集団を得る
ことを含む、方法。
例えば、第一ＨＭ－ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓを宿主細胞における標的にガイドし、標的配
列を修飾するために第一宿主標的配列とハイブリダイズできるＨＭ－スペーサーを含み、
ここで標的配列は宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのヌクレオチド配列であり、それに
より第一ＨＭ－ｃｒＲＮＡが宿主細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを修飾
するようにＣａｓを標的にガイドし、ここで標的配列の修飾は宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
システムの機能を低下または排除する。
別法として、修飾は、宿主における遺伝子を増強するまたは抑制を阻止する。ある実施
態様において、遺伝子は必須遺伝子、病原性遺伝子または耐性遺伝子(例えば、抗生物質
耐性遺伝子)である。ある実施態様において、修飾は、宿主に内在性または外来性である
遺伝子産物の発現を増強する。例えば、宿主は、外来性ヌクレオチド配列(例えば、所望
のタンパク質産生のため)を含む改変された宿主であり、修飾は宿主細胞における所望の
タンパク質の発現を増強または阻害する。例えば、所望のタンパク質は抗生物質であり、
宿主細胞は微生物、例えば、細菌または古細菌細胞である。それ故に、方法は、宿主細胞
を、ウイルス集団を産生するために培養することを可能とし、ここで抗生物質は発現され
ず、これは、そうでなければ宿主細胞集団の増殖に有害である。その後、単離ウイルス集
団の１以上のウイルスを、第一ＨＭ－ｃｒＲＮＡ抑制を単離後に除去でき、それにより能
動的抗生物質ウイルス組成物を提供するため、宿主細胞増殖または生存能の低下のために
抗微生物組成物において使用できる。本発明は、それ故にまた、宿主細胞において抗生物
質を発現できるウイルスを含む、このような方法およびこのような抗生物質組成物も提供
する。発現を活性化するための修飾は、例えば、転写アクティベーターにコンジュゲート
したＣａｓ(例えば、Ｃａｓ９)の提供により実施でき、ここでＣａｓは第一ＨＭ－ｃｒＲ
ＮＡに対して同族Ｃａｓであり、アクティベーターは所望の外来性または内在性遺伝子の
転写を活性化する。発現を阻害するための修飾は、例えば、死Ｃａｓ(例えば、ｄＣａｓ
９)の提供により実施でき、ここでＣＡｓは第一ＨＭ－ｃｒＲＮＡに対して同族Ｃａｓで
あり、所望の外来性または内在性遺伝子の転写を阻害する。
ｃｒＲＮＡ転写または活性の抑制は、部分的でも完全(すなわち、宿主におけるアレイ
からのｃｒＲＮＡの活性がないまたは転写がない)でもよい。活性は、Ｃａｓを修飾のた
めの第一宿主標的部位にガイドするために同族宿主配列とハイブリダイズする、ｃｒＲＮ
Ａの能力をいう。
例えば、ウイルスは細胞に導入されたときそのように抑制されず、方法は、ウイルスが
細胞に感染した後に、例えば、抑制を引き起こすために化学、物理的、機械的、磁力、光
または他の薬剤の使用により、工程(ｄ)を実施することを含む。ある実施態様において、
第一ＨＭ－アレイは、第一ＨＭｃｒＲＮＡの転写の抑制可能プロモーター(ＨＭ－プロモ
ーター)を含み、プロモーターは、第一ＨＭ－アレイが細胞に導入された後抑制される(例
えば、リプレッサー剤、例えば、化学またはタンパク質のプロモーターへの結合により)
。
他の例において、ウイルスは、例えば、抑制を引き起こすために化学的、物理的、機械
的、磁気的、光学的または他の抑制因子の使用により、工程(ｃ)の前にそのように抑制さ
れる。ある実施態様において、第一ＨＭ－アレイは、第一ＨＭｃｒＲＮＡの転写の抑制可
能プロモーター(ＨＭ－プロモーター)を含み、プロモーターは、第一ＨＭ－アレイが細胞
に導入される前に抑制され(例えば、リプレッサー剤、例えば、化学またはタンパク質の
プロモーターへの結合により)、ここでその後抑制された第一ＨＭ－アレイが細胞に導入
される。
ある実施態様において、工程(ｆ)は、ＰＶ１の単離を含む。ある実施態様において、工
程は、ＰＨ１の宿主細胞からＰＶ１またはそのウイルスを分離することを含んだ。
２. さらに工程(ｅ)または(ｆ)の後ウイルス集団における第一ＨＭ－ｃｒＲＮＡの転写お
よび／または第一ＨＭ－ｃｒＲＮＡ活性の抑制解除し、所望によりその後さらなる宿主細
胞を培養することを含む、段落１の方法。
３.
Ａ. 所望により(ａ)、(ｆ)の宿主細胞または段落２のさらに培養した細胞と同一である宿
主細胞の集団(ＰＨ２)を得て；
Ｂ. Ａの宿主細胞を集団ＰＶ１からのウイルスで感染させ；
Ｃ. 細胞における第一ＨＭ－ｃｒＲＮＡの転写および／または第一ＨＭ－ｃｒＲＮＡ活性
を抑制し；
Ｄ. 感染宿主細胞を培養してウイルスの集団(ＰＶ２)を含む宿主細胞の集団(ＰＨ３)を産
生し；そして
Ｅ. ウイルス集団ＰＶ２(またはそのウイルス)および／または培養宿主細胞集団を得る
ことを含む、前段落の何れかの方法。
４. さらに工程(Ｄ)または(Ｅ)の後ウイルス集団における第一ＨＭ－ｃｒＲＮＡの転写お
よび／または第一ＨＭ－ｃｒＲＮＡ活性を抑制解除し、所望によりその後さらなる宿主細
胞を培養することを含む、段落３の方法。
５. 宿主細胞のさらなる宿主細胞または集団(ＰＨ４)上でウイルス集団ＰＶ１またはＰＶ
２の単離サンプルを試験することを含み、所望によりここでさらなる細胞または集団ＰＨ
４は(ａ)の細胞と同一であり、試験はさらなる細胞または集団ＰＨ４をサンプルのウイル
スで感染させ、何らかの宿主細胞増殖を可能とする期間待機し、さらなる細胞または集団
ＰＨ４の予め決定した活性(例えば、細胞増殖または生存能)が修飾されているか(例えば
、宿主細胞増殖またはその生存能の低下のような抑制*)または生じているかを決定し、こ
こでウイルスは細胞内にあるかまたは細胞は該期間中第一ＨＭ－ｃｒＲＮＡの転写および
／または第一ＨＭ－ｃｒＲＮＡ活性が抑制解除されている、前段落の何れかの方法。
* これは、サンプルのウイルスが観点上に播種された細胞またはＰＨ４に添加されると
き、プラーク形成の標準アッセイを使用して試験できる。
６. 宿主細胞の全てが微生物細胞(例えば、細菌または古細菌細胞)であり、第一標的配列
の修飾が宿主細胞増殖または生存能を低下させ、その決定が抗微生物活性**が生じること
を決定する、前段落５の何れかの方法。
** これは、標準プラークアッセイを使用して決定できる。
７. 期間が少なくとも１分、５分、１０分、３０分、６０分または１２０分である、段落
５または６の方法。
８. (ａ)の細胞および所望によりＰＨ１、ＰＨ２および／またはＰＨ３細胞が第一標的配
列を含まず、ここでさらなる細胞または集団ＰＨ４細胞が第一標的配列を含む、段落５～
７の何れかの方法。
９. (ａ)の細胞および所望によりＰＨ１、ＰＨ２および／またはＰＨ３細胞が第一抗生物
質への耐性を付与する遺伝子を含まず、ここで第一標的配列がこのような遺伝子の標的配
列であり、所望によりここでさらなる細胞または集団ＰＨ４細胞が該遺伝子を含む、段落
１～８の何れかの方法。
１０. (ａ)の細胞および所望によりＰＨ１、ＰＨ２および／またはＰＨ３細胞が第一抗生
物質への耐性を付与する遺伝子を含み、ここで第一標的配列がこのような遺伝子の標的配
列である、段落１～７の何れかの方法。
１１. 宿主細胞の全てが微生物細胞(例えば、細菌または古細菌細胞)であり、第一標的配
列の修飾が宿主細胞増殖または生存能を低下させまたは抗生物質に対する宿主細胞耐性を
低減させる、前段落の何れかの方法。
１２. 宿主細胞の全てがヒト、動物(例えば、非ヒト動物)または植物の感染性疾患病原体
である、前段落の何れかの方法。
１３. 宿主細胞の全てが、例えば、エシェリキア(例えば、エシェリキア・コリＯ１５７
：Ｈ７またはＯ１０４：Ｈ４)、シゲラ(例えば、ディセンテリアエ)、サルモネラ(例えば
、チフィまたはエンテリカ、例えば、血清型チフィリウム、例えば、ＤＴ１０４)、エル
ウィニア、エルシニア(例えば、ペスティス)、バチルス、ビブリオ、レジオネラ(例えば
、ニューモフィラ)、シュードモナス(例えば、エルギノーサ)、ナイセリア(例えば、ゴノ
レーまたはメニンギティディス)、ボルデテラ(例えば、パータシス)、ヘリコバクター(例
えば、ピロリ)、リステリア(例えば、モノサイトゲネス)、アグロバクテリウム、スタフ
ィロコッカス(例えば、アウレウス、例えば、ＭＲＳＡ)、ストレプトコッカス(例えば、
ピオゲネスまたはサーモフィルス)、エンテロコッカス、クロストリジウム(例えば、ディ
フィシルまたはボツリヌム)、コリネバクテリウム(例えば、アミコラツム)、マイコバク
テリウム(例えば、ツベルクローシス)、トレポネーマ、ボレリア(例えば、ブルグドルフ
ェリ)、フランシセラ、ブルセラ、カンピロバクター(例えば、ジェジュニ)、クレブシエ
ラ(例えば、ニューモニエ)、フランキア、バルトネラ、リケッチア、シュワネラ、セラチ
ア、エンテロバクター、プロテウス、プロビデンシア、ブロコトリックス、ビフィドバク
テリウム、ブレビバクテリウム、プロピオニバクテリウム、ラクトコッカス、ラクトバチ
ルス、ペディオコッカス、リューコノストック、ビブリオ(例えば、コレラ、例えば、Ｏ
１３９またはバルニフィカス)、ヘモフィルス(例えば、インフルエンザエ)、ブルセラ(例
えば、アボルタス)、フランシセラ、キサントモナス、エーリキア(例えば、シャフェンシ
ス)、クラミジア(例えば、ニューモニエ)、パラクラミジア、エンテロコッカス(例えば、
フェカーリスまたはフェシウム、例えば、リネゾリド耐性)、オエノコッカスおよびアシ
ネトバクター(例えば、バウマンニ、例えば、複数薬物耐性)の種から選択される、同じ種
である、前段落の何れかの方法。
１４. 宿主細胞の全が例えば、メチシリン、バンコマイシン耐性およびテイコプラニンか
ら選択される抗生物質に耐性のスタフィロコッカス・アウレウス細胞である、請求項１３
の方法。
１５. 宿主細胞の全てが例えば、セファロスポリン類(例えば、セフタジジム)、カルバペ
ネム類(例えば、イミペネムまたはメロペネム)、フルオロキノロン類、アミノグリコシド
類(例えば、ゲンタマイシンまたはトブラマイシン)およびコリスチンから選択される抗生
物質に耐性のシュードモナス・エルギノーサ細胞である、請求項１３の方法。
１６. 宿主細胞の全てが例えば、カルバペネムに耐性のクレブシエラ(例えば、ニューモ
ニエ)細胞である、請求項１３の方法。
１７. 宿主細胞の全てが例えば、エリスロマイシン、クリンダマイシン、ベータ－ラクタ
ム、マクロライド、アモキシシリン、アジスロマイシンおよびペニシリンから選択される
抗生物質に耐性のストレプトコッカス(例えば、ニューモニエまたはピオゲネス)細胞であ
る、請求項１３の方法。
１８. 宿主細胞の全てが例えば、セフトリアキソン、アジスロマイシンおよびシプロフロ
キサシンから選択される抗生物質に耐性のサルモネラ(例えば、血清型チフィ)細胞である
、請求項１３の方法。
１９. 宿主細胞の全てが例えば、シプロフロキサシンおよびアジスロマイシンから選択さ
れる抗生物質に耐性のシゲラ細胞である、請求項１３の方法。
２０. 宿主細胞の全てが例えば、イソニアジド(ＩＮＨ)、リファンピシン(ＲＭＰ)、フル
オロキノロン、アミカシン、カナマイシンおよびカプレオマイシンから選択される抗生物
質に耐性のマイコバクテリウム・ツベルクローシス細胞である、請求項１３の方法。
２１. 宿主細胞の全てが例えば、バンコマイシンに耐性のエンテロコッカス細胞である、
請求項１３の方法。
２２. 宿主細胞の全てが例えば、セファロスポリンおよびカルバペネムから選択される抗
生物質に耐性の腸内細菌科細胞である、請求項１３の方法。
２３. 宿主細胞の全てが例えば、トリメトプリム、ニトロフラントイン、セファレキシン
およびアモキシシリンから選択される抗生物質に耐性のエシェリキア・コリ細胞である、
請求項１３の方法。
２４. 宿主細胞の全てが例えば、フルオロキノロン抗生物質およびカルバペネムムから選
択される抗生物質に耐性のクロストリジウム(例えば、ディフィシル)細胞である、請求項
１３の方法。
２５. 宿主細胞の全てが例えば、セフィキシム(例えば、経口セファロスポリン)、セフト
リアキソン(注射可能セファロスポリン)、アジスロマイシンおよびテトラサイクリンから
選択される抗生物質に耐性のナイセリア・ゴノレー細胞である、請求項１３の方法。
２６. 宿主細胞の全てが例えば、ベータ－ラクタム、メロペネムおよびカルバペネムから
選択される抗生物質に耐性のアシネトバクター・バウマンニ細胞である、請求項１３の方
法。
２７. 宿主細胞の全てが例えば、シプロフロキサシンおよびアジスロマイシンから選択さ
れる抗生物質に耐性のカンピロバクター細胞である、請求項１３の方法。
２８. 宿主細胞がベータ(β)－ラクタマーゼを産生する、前段落の何れかの方法。
２９. 宿主細胞が段落１４～２７の何れかに記載の抗生物質に対する耐性である、前段落
の何れかの方法。
３０. 第一標的配列が該抗生物質に対する宿主細胞耐性を付与する産物をコードする遺伝
子の配列である、段落２９の方法。
３１. 第一標的配列が抗生物質耐性遺伝子の配列(すなわち、抗生物質に対する宿主細胞
耐性、例えば、メチシリン耐性を付与するため)および／または集団ＰＨ１、集団ＰＨ２
、集団ＰＨ３および集団ＰＨ４の一つ、複数または全てが抗生物質または該抗生物質に耐
性である(例えば、段落１３～２７の何れかに記載の抗生物質)、前段落の何れかの方法。
３２. ウイルス集団ＰＶ１またはＰＶ２の抑制解除されたウイルスが抗微生物活性を有し
(例えば、ウイルスがファージであるときのような抗細菌活性)、所望によりここで宿主細
胞または細胞が段落３０に記載する第一標的配列を含み、ここで第一標的の修飾が該抗微
生物活性を提供する、前段落の何れかの方法。
３３. ＰＨ４の細胞が抗生物質(例えば、段落１３～２７の何れかに記載の抗生物質)に耐
性であり、(ａ)の細胞およびＰＨ２が該抗生物質に耐性ではない、段落５に従属するとき
の前段落の何れかの方法。これは、培養および拡大が抗生物質耐性宿主細胞を扱うリスク
なしに比較的に安全に実施できるため、薬物使用のためのウイルスの製造を助ける(およ
び、例えばこれらの不適切な汚染および薬物製造プラントからの回避の危険)。それにも
係らず、ＰＨ４に対する試験は、抗生物質耐性宿主株の使用が設定されている併設研究室
または他の施設で実施できる。ＰＨ４に対して試験するとき、第一ＨＭ－ｃｒＲＮＡは、
宿主細胞における耐性遺伝子の修飾が本発明のＨＭ－アレイにより可能であるように抑制
解除される。
３４. 宿主ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがタイプＩ、IIまたはIIIシステムであり、標
的配列が(ａ)の宿主細胞と同じ属の少なくとも１、２または３のさらなる宿主株または種
における該タイプのシステムで保存されたヌクレオチド配列である、前段落の何れかの方
法。
３５. ウイルスがファージまたはファージミドである、前段落の何れかの方法。
３６. (ｂ)のウイルスがコルチコウイルス科、シストウイルス科、イノウイルス科、レビ
ウイルス科、ミクロウイルス科、ミオウイルス科、ポドウイルス科、シホウイルス科また
はテクティウイルス科ウイルスである、段落３５の方法。
３７. (ｂ)のウイルスが、ファージ、例えば、(ａ)の細胞と同じ株のものである細胞から
誘発されたファージで自然に生じる、段落３５または３６の方法。
３８. (ｂ)のファージが、ファージ耐性細菌を使用する選択圧を経て得られた変異ファー
ジである、段落３５、３６または３７の方法。
３９. (ｂ)において
(iv)該１以上のＨＭ－アレイが、Ｃａｓを宿主細胞における第二標的にガイドし、標的配
列を修飾するように第二宿主標的配列とハイブリダイズできるＨＭ－スペーサーを含む第
二ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードするＨＭ－アレイを含み、ここで第二標的配列は宿主ＣＲＩ
ＳＰＲ／Ｃａｓシステムのヌクレオチド配列であり、それにより第二ＨＭ－ｃｒＲＮＡは
、Ｃａｓを第二標的にガイドして、宿主細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
を修飾し、ここで第二標的配列の修飾は宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの機能を低減
または排除し；そして
(ｖ)ここで(iv)のＨＭ－アレイは、第二宿主標的配列とハイブリダイズできる第二ＨＭ－
ｃｒＲＮＡの転写のために(ａ)の細胞で活性である、
前段落の何れかの方法。
ある実施態様において、(ii)および(iv)のＨＭ－アレイは同じＨＭ－アレイである。他
の実施態様において、それらは異なるＨＭ－アレイである(例えば、異なるＣＲＩＳＰＲ
／Ｃａｓタイプのアレイ、例えば、タイプＩおよびIIまたはタイプIIおよびIIIまたはタ
イプＩおよびIIIまたは異なるタイプIIアレイ)。
４０. ＰＨ１～４の何れか一つまたは全ての細胞が該第二標的配列を含む、段落３９の方
法。
４１. 第二標的配列が、段落１１～２４の何れかに記載する細胞の属または種(例えば、
ストレプトコッカス・サーモフィルスまたはストレプトコッカス・ピオゲネスまたはスタ
フィロコッカス・アウレウス)のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム配列と同一である、段落
３９または４０の方法。
４２. 第二標的配列が配列番号１～４４からなる群から選択される配列に含まれるまたは
その相補体である、段落３９～４１の何れかの方法。
４３. 第二標的配列が
Ａ. 宿主ＣＲＩＳＰＲアレイにおける反復ＤＮＡまたはＲＮＡ配列(例えば、ここで反復
は最も５’反復である(第一反復))；
Ｂ. ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡコード化ＤＮＡ配列；ＣＲＩＳＰＲア
レイリーダー配列；
Ｃ. Ｃａｓ遺伝子プロモーター(例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２またはＣｓｎ２プロモータ
ー)；
Ｄ. ＣＲＩＳＰＲアレイリーダープロモーター配列または
Ｅ. Ｃａｓコード化ＤＮＡまたはＲＮＡ配列(例えば、ここでＣａｓはＣａｓ９、Ｃａｓ
１、Ｃａｓ２またはＣｓｎ２である)
を含む、段落３９～４２の何れかの方法。
４４. 第二標的配列が
Ｆ. 第一反復の最も５’ヌクレオチドと隣接するＣＲＩＳＰＲアレイリーダーまたはリー
ダープロモーター配列(および所望により反復の該最も５’ヌクレオチドを含む)；
Ｇ. 第一反復の直ぐ５’の最大２０連続ヌクレオチドの配列；
Ｈ. 第一反復の最も５’ヌクレオチドの最大２０連続ヌクレオチドの配列または
Ｉ. 第一スペーサー反復の直ぐ３’の最大２０連続ヌクレオチドの配列(および所望によ
りここで配列は第一スペーサー最も３’ヌクレオチドを含む)
を含む、段落３９～４３の何れかの方法。
４５.
Ｊ. 第二ＨＭ－ｃｒＲＮＡが構造Ｒ－Ｓ－Ｒを含みまたはこれからなり、ここでＲ＝ＣＲ
ＩＳＰＲ反復およびＳ＝ＣＲＩＳＰＲスペーサーであり、ここでＳは(５’から３’方向
で)Ｖ－ＨＲまたはＨＲ－Ｖを含みまたは、ここでＶ＝(ｂ)のウイルスのＤＮＡ配列と少
なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列であり、ＨＲ＝該
宿主細胞ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣＲＩＳＰＲ反復のＤＮＡ配列であり；
Ｋ. ここでＨＲの配列は、宿主ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムにおけるＶの配列に直ぐ隣
接し；そして
Ｌ. ここで第二ＨＭ－ｃｒＲＮＡは、細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを
修飾(例えば、開裂または不活性化)するためにＣａｓをスペーサーにガイドするために宿
主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのスペーサーとハイブリダイズできる、
段落３９～４４の何れかの方法。
４６. Ｖ＝ウイルスＤＮＡの１または最大４０(例えば、最大１５)連続ヌクレオチドであ
る、段落４５の方法。
４７. 第二ＨＭ－ｃｒＲＮＡが(ｂ)のウイルスの核酸に実質的にハイブリダイズしない、
段落３９～４６の何れかの方法。
４８.
ａ. 宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが同族ＰＡＭを認識でき；
ｂ. ここで(ｂ)のウイルスの核酸がこのようなＰＡＭをプロトスペーサー配列の直ぐ３’
に含み；
ｃ. ここでＶ＝プロトスペーサーの１または最大４０(例えば、最大１５)ヌクレオチドで
あり；そして
ｄ. ここでＨＲ＝宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの反復の連続配列と同一の配列であ
る、
段落４５～４７の何れかの方法。
４９. 宿主システムの反復の連続配列が宿主反復の少なくとも５０％の配列である(例え
ば、宿主反復の５’または３’ヌクレオチドを含む)、段落４８の方法。
５０. Ｖ＝３’プロトスペーサー連続ヌクレオチドの１～４０(例えば、最大１５)であり
；そして所望により反復の連続配列は宿主反復の５’ヌクレオチドを含む、段落４５また
は４６の方法。
５１. Ｖ＝５’プロトスペーサー連続ヌクレオチドの１～４０(例えば、最大１５)であり
、所望により反復の連続配列は宿主反復の３’ヌクレオチドを含む、段落４８または４９
の方法。
５２. Ｒ＝宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより認識される反復である、段落４５～
５１の何れかの方法。
５３. 各ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲが(５’から３’方向で)第一反復配列、第一スペーサー配列
および第二反復配列を含み、ここでスペーサー配列ｃが宿主細胞における各標的配列とハ
イブリダイズ可能な配列を含み、アレイはさらなる宿主細胞における反復およびスペーサ
ーの転写のためのプロモーターを含み、所望によりｔｈｅ(ｂ)のウイルスの核酸が宿主細
胞における機能的Ｃａｓおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードするためのＣａｓ
ヌクレアーゼコード化配列および／またはｔｒａｃｒＲＮＡコード化配列を含み、ここで
ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が第一または第二反復と相補的である配列を含む、前段落の何れか
の方法。
５４. 各ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイが(５’から３’方向で)第一反復配列、第一スペーサ
ー配列および第二反復配列を含み、ここでスペーサー配列ｃが宿主細胞における各標的配
列とハイブリダイズ可能な配列を含み、アレイはさらなる宿主細胞における反復およびス
ペーサーの転写のためのプロモーターを含み、ここでベクターが宿主細胞におけるｔｒａ
ｃｒＲＮＡ配列をコードするためのＣａｓヌクレアーゼコード化配列および／またはｔｒ
ａｃｒＲＮＡコード化配列を含まず、ここでｔｒａｃｒＲＮＡ配列が第一または第二反復
と相補的である配列を含み、ここでＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイが、所望により宿主ｔｒａ
ｃｒＲＮＡを使用して、Ｃａｓ(例えば、内在性宿主Ｃａｓヌクレアーゼ)を各宿主標的部
位にガイドするために宿主細胞において機能的である、前段落の何れかの方法。
５５. 反復が宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおける反復と同一であり、ここで各Ｈ
Ｍ－ＣＲＩＳＰＲアレイが宿主ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓ(例えば、Ｃａｓ
ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９)により認識されるＰＡＭを含まない、段落５３または
５４の方法。
５６. 各ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイが１を超えるコピーのＨＭ－スペーサーを含む(例え
ば、少なくとも２、３または４コピー)、前段落の何れかの方法。
５７. 第二または第三ＨＭ－ｃｒＲＮＡ(さらなるＨＭ－ｃｒＲＮＡ)をコードし、ここで
さらなるＨＭ－ｃｒＲＮＡがＣａｓを宿主細胞における標的にガイドするために宿主標的
配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列を含み、所望により標的配列が宿主細胞の
必須、病原性または耐性遺伝子または宿主細胞のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの必須要
素のヌクレオチド配列である、前段落の何れかの方法。
５８. 各ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞における各ＨＭ－ｃｒＲＮＡ産生のための
宿主細胞の内在性ＣＲＩＳＰＲ反復配列と同一であるＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む、前段
落の何れかの方法。
５９. (ｂ)のウイルスが(ａ)の宿主細胞において機能的であるＣａｓ(非宿主Ｃａｓ)をコ
ードするヌクレオチド配列を含み(例えば、ここで非宿主ＣａｓはタイプＩシステムＣａ
ｓであり、ここで宿主システムはタイプIIもしくはIIIである、非宿主ＣａｓはタイプII
システムＣａｓであり、ここで宿主システムはタイプＩもしくはIIIである、または非宿
主ＣａｓはタイプIIIシステムＣａｓであり、ここで宿主システムはタイプＩもしくはII
である)、所望によりここで宿主細胞は非宿主Ｃａｓと同じタイプのＣａｓを含まないか
または発現しない、前段落の何れかの方法。
６０. (ｂ)のウイルスがｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列を含み、所
望によりここでｔｒａｃｒＲＮＡ配列および第一ＨＭ－ｃｒＲＮＡは単一ガイドＲＮＡ(
ｇＲＮＡ)からなる、前段落の何れかの方法。
６１. 各ＨＭ－ｃｒＲＮＡが各単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)に含まれる、前段落の何れか
の方法で。
６２. 第一ＨＭ－アレイが第一標的配列においてＣａｓ開裂、第一標的配列(または第一
標的配列の遺伝子)の活性化、第一標的配列(または第一標的配列の遺伝子)のノックダウ
ンまたは第一標的配列の変異を引き起こすために動作可能である、前段落の何れかの方法
。
６３. 前段落の何れかの方法により得られるウイルス、宿主細胞またはウイルス集団であ
って、所望によりここで集団はＰＶ１またはＰＶ２と同一であるかまたはウイルスはこの
ような集団から得られる。
６４. 前段落の何れかの方法により得られる宿主細胞(例えば、細菌細胞)集団であって、
所望によりここで集団はＰＨ１、ＰＨ２、ＰＨ３もしくはＰＨ４または先の段落の何れか
に記載した培養細胞集団と同一である。
６５. 集団が(ｂ)のウイルスの核酸を含まないかまたは該第一ＨＭ－アレイまたは該第二
ＨＭ－アレイを含まない(例えば、ＰＣＲで決定して)、段落６４の宿主細胞集団。
６６. 医薬または歯科または眼科使用のため(例えば、生物における感染の処置もしくは
予防または生物における感染拡大制限のため)の、段落６３～６５の何れかのウイルス、
宿主細胞または集団。
６７. 食品、飲料、乳製品または化粧品における使用(例えば、化粧品製品、例えば、化
粧品における使用)または衛生用品における使用(例えば、衛生製品、例えば、石鹸におけ
使用)のための、段落６３～６６の何れかに従うウイルス、宿主細胞または集団を含む、
組成物。
６８. 医薬におけるまたは歯科治療または予防使用のための、段落６３～６７の何れかに
従う組成物、ウイルス、宿主細胞または集団の使用。
６９. 化粧品における使用(例えば、化粧品製品、例えば、化粧品における使用)または衛
生用品における使用(例えば、衛生製品、例えば、石鹸における使用)のための、段落６３
～６８の何れかに従う組成物、ウイルス、宿主細胞または集団の使用。
７０. 微生物宿主細胞修飾のための(例えば、細胞または微生物細胞の培養の死滅または
増殖減少のため)の、段落６３～６９の何れかの使用、ウイルス、宿主細胞または集団。
７１. ウイルスまたは該集団におけるウイルスが宿主細胞溶解のためのホリンおよび／ま
たはエンドリシンを発現し、所望によりここでエンドリシンがファージファイ１１、ファ
ージＴｗｏｒｔ、ファージＰ６８、ファージファイＷＭＹまたはファージＫエンドリシン
(例えば、ＭＶ－ＬエンドリシンまたはＰ－２７／ＨＰエンドリシン)である、段落１～６
３および６６～７０の何れかの方法、ウイルスまたはウイルス集団。
７２. ウイルスまたは該集団におけるウイルスが宿主細胞溶解のためのホリンおよび／ま
たはエンドリシンを発現しない、段落１～６３および６６～７０の何れかの方法、ウイル
スまたはウイルス集団。
７３. ウイルス(例えば、(ｂ)のウイルス)または各該集団におけるウイルスが(ａ)の宿主
細胞における抗微生物機能性、例えば、抗生物質、例えば、ベータ－ラクタム抗生物質(
例えば、段落１３～２７の何れかに記載の抗生物質)と組み合わされる、段落１～６３お
よび６６～７０の何れかの方法、ウイルスまたはウイルス集団。
腐食、バイオフィルムおよび生物付着の制御
本発明は、とりわけ産業用または家庭用システムにおける基質または流体の微生物腐食
(ＭＩＣ)または生物付着を制御する方法に関する。本発明はまた本方法に使用するための
処理流体およびベクターに関する。
腐食は、金属(例えば、鋼または鉄)、プラスチックおよび石のような物質の劣化に至る
一連の化学的、物理的および(微)生物学的過程である。これは、大きな社会的および経済
的意義がある世界的問題である。現在の化学製造製品に基づく腐食制御戦略は、厳しい環
境規制の増え続ける圧力下にある。さらに、それらはむしろ非効率的であり、使用する薬
剤に対する微生物(例えば、細菌)耐性により妨害され得る。それ故に、環境にやさしいお
よび持続可能腐食制御戦略の火急の必要性がある。腐食は、異なる電気化学反応を行い、
二次効果を有し得るタンパク質および代謝物を分泌する種々の微生物の複合工程に影響さ
れる。
微生物腐食過程の重大性は、工業でおよび家庭で使用されるステンレス鋼、ニッケルお
よびアルミニウム含有合金のような金属および合金ならびにコンクリート、アスファルト
およびポリマーのような物質の多くが、微生物により容易に分解される事実から明らかで
ある。保護コーティング、阻害剤、油およびエマルジョンも微生物分解の対象である。
微生物腐食(ＭＩＣ)は、炭化水素製造および加工装置、水分配システム、船舶、鉄道、
自動車および他のタイプの金属製および非金属製工業用および家庭用システムに影響する
費用の問題である。特に、ＭＩＣは、製造、輸送および保存システムを含む炭化水素燃料
基盤の相当な損傷の原因として知られ、しばしば破局的環境汚染結果となる。石油産業の
パイプ腐食の約４０％が微生物学的腐食に起因し、毎年石油の製造、輸送および保存にお
ける莫大な経済損失をもたらす。パイプバイオフィルムが、壁へのインクラステーション
の過程のため、装置における流体速度の減少をもたらし得る。さらに、パイプ漏出が腐食
の結果として生じ、環境および生産性に結果的に影響を与える。
ＭＩＣは、土壌、淡水および海水のような環境で起こり、全腐食損傷の３０パーセント
超を担うと推定される。ＭＩＣは、細菌のような微生物の固定、代謝物の放出および通常
腐食過程を誘発または加速するバイオフィルムの形成により生じる。腐食過程に関与する
多数の細菌群は、硫黄または硫酸還元細菌(ＳＲＢ)、細胞外重合物質産生細菌(ＥＰＳＢ)
、酸産生細菌(ＡＰＢ)、硫黄または硫化物酸化細菌(ＳＯＢ)；鉄またはマンガン酸化細菌
(ＩＯＢ)、アンモニア産生細菌(ＡｍＰＢ)および酢酸産生細菌(ＡｃＰＢ)である。小サブ
ユニットリボソームＲＮＡ遺伝子ピロシーケンス調査は、酢酸産生細菌(アセトバクター
属およびグルコンアセトバクター属)が、燃料グレードエタノールおよび水に曝された環
境において蔓延していることを示す。
環境条件下での微生物増殖は、直接的または間接的に電気化学反応に影響する。微生物
－基質相互作用は、最初の接着およびバイオフィルム形成に至る。細菌のような微生物の
基質への結合、代謝物の放出およびバイオフィルムの形成は、基質表面で電気化学状態に
影響し、腐食過程を誘発または加速し、それによりＭＩＣの過程に介在する。金属製基質
上の細菌バイオフィルム形成は次の段階を含む：Ｉ － 金属上の有機および無機分子の
吸着を介するフィルムの形成、これは金属製表面上の荷重分配を修飾し、そして、また細
菌の栄養源として働き、液体に存在する浮遊性微生物の粘着性を促進する；II － 微小
コロニーを形成する好気性細菌の接着および増殖；III － ある固着細菌による細胞外
重合物質(ＥＰＳ)の製造；IV － 厳密な嫌気性細菌に必要とされるバイオフィルムにお
ける局所嫌気性環境を作る、呼吸により酸素を消費する好気性浮遊性微生物細胞によるコ
ロニー形成および；Ｖ － 外部層の遮蔽に好ましいものであり得るバイオフィルム厚の
増加。細菌により産生されたＥＰＳは、増殖のためのバイオフィルム補足必須イオンに接
着し、それらは結合の手段として使用され、細菌を差次的通気領域の発生を助けることに
より腐食機構を妨害する殺生物剤から保護し、それ以外に、低栄養可用性の場合、栄養源
として働く。差次的通気による腐食の過程は、通気領域(バイオフィルム周囲)および非通
気領域(バイオフィルムの下)を備える金属基質上のバイオフィルムの不均一な分配におよ
り生じる。金属表面上のバイオフィルム形成は酸素含量を減らし、ほぼ完全嫌気状態のレ
ベルに達する。シュードモナスが主ＥＰＳ生産体属である。
腐食性細菌が介在するＭＩＣ生物腐食過程がの例は次のとおりである。(Ａ)淡水、海水
、工業用／家庭用システムまたは貯蔵タンクからの好気性腐食性細菌が、表面上にコンデ
ィショニングフィルムを有する産業用または家庭用システムの装置およびパイプラインに
到達する。(Ｂ)ＥＰＳ産生細菌が装置／パイプライン壁に付着し、ＥＰＳを産生し、これ
が他の微生物による接着に好ましい環境を作る。(Ｃ)パイプライン壁への他の群の腐食性
細菌の接着が起こり、これがその代謝物を放出し、細胞分裂により微小コロニーに発展し
、利用可能な酸素を消費する。鉄酸化細菌の作用は、三価鉄沈殿の多量の蓄積をもたらし
、装置／パイプラインの遮断にいたる；硫黄酸化細菌により放出される硫酸は、環境の酸
性化を促進する。(Ｄ)低酸素濃度および酸産生細菌により放出される有機酸は、硫化水素
(Ｈ２Ｓ)を産生する硫酸還元細菌の接着および発展に好ましく、それにより腐食過程を加
速し、局所ｐＨを下げる。(Ｅ)腐食装置／パイプラインが生じ、これは、微小漏出を伴う
鉄沈殿により部分的に遮蔽され、細菌バイオフィルムを含む。Ｈ２Ｓは、侵されたシステ
ムを操作する者に重篤な健康リスクを与える。さらに、厚いバイオフィルムおよびスラッ
ジの製造は、生物付着に至り、システムの機能を妨害する。
同様に、細菌集団水貯蔵所または貯留槽のような流体(例えば、飲料水または冷却シス
テム中の水)でも繁殖でき、それにより流体の生物付着に介在する。これはまた流体の酸
性化とも称される。例は、水路または飲料水貯留槽酸性化である。
本発明は、次の態様１以下の提供により、ＭＩＣおよび生物付着の課題に取り組む。
１. 産業用または家庭用システムにおける基質の微生物腐食(ＭＩＣ)または生物付着を制
御する方法であって、ここで基質の表面は基質のＭＩＣまたは生物付着に介在する第一微
生物種の第一宿主細胞の集団と接触しており、
(ｉ)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させ、各ベ
クターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、それによりＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞に導入さ
れ、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上のヌクレオチド配列および
宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)各ｃｒＲＮＡはＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９またはＣｐ
ｆ１)を宿主細胞にガイドし、標的配列を修飾(例えば、標的配列を切断)するために宿主
細胞における標的配列とハイブリダイズでき；標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝
子配列であり；そして
(ii)宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡを発現させ、それにより宿主細胞において
標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該基質のＭＩＣまたは生物付着の制御を
もたらす
ことを含む、方法。
例えば、システムは装置(例えば、工業工程において使用するため)を含み、表面は該装
置の表面である。例えば、各アレイは、改変されたアレイ、例えば、ここに開示する任意
の改変されたアレイである。ある実施態様において、ベクターは、ここに記載する改変さ
れたＣＲＩＳＰＲ核酸ベクターである。例えば、生物付着は微生物バイオフィルムおよび
／またはスラッジ形成、増殖または維持を含む。例えば、第一宿主細胞は固着である。態
様１または４(下記)の例えば、“制御”は、システムにおける該ＭＩＣまたは生物付着の
阻止、減少または排除または該ＭＩＣまたは生物付着の拡散減少を含む。細菌がどのよう
にＭＩＣまたは生物付着に介在するかの非限定的例は上に記載する。細胞増殖または増殖
または維持は、例えば、細胞生存能の特徴である。それ故に、例えば、方法は宿主細胞増
殖および／または維持を減少させる。例えば、方法は宿主細胞を死滅させる。
２. 該宿主細胞が該基質と接触する微生物バイオフィルムに含まれる、態様１の方法。
３. 該表面および宿主細胞が水溶液のような流体(例えば、海水、淡水、貯蔵された水ま
たは飲用水)と接触している、前記態様の何れかの方法。
淡水は、氷床、氷冠、氷河、氷山、沼地、池、湖、川および小川として地表に、そして
帯水層および地下小川において地下水として地下に自然に存在する水である。淡水は、一
般に溶解している塩および他の総溶解固体の濃度が低いことにより特徴付けられる。本用
語は、特に海水および半鹹水を除くが、鉄泉のような鉱物に富む水は含む。例えば、該淡
水はこれらのタイプの淡水の何れかである。飲用水は、ヒトまたは動物(例えば、家畜)消
費用の水である。例えば、流体は、工業用冷却水(ここでシステムは冷却システムである)
、汚水(ここでシステムは汚水処理または保存システムである)、飲料水(ここでシステム
は飲料水処理、保存、輸送または配送システムである)、製紙用水(ここでシステムは、紙
製造または加工システムである)、スイミングプール水(ここでシステムはスイミングプー
ルまたはスイミングプール水処理または保存システムである)、消火器水(ここでシステム
は消火システムである)またはパイプ、タンク、穴、池または溝の何れかにおける工業工
程水から選択される。
４. 産業用または家庭用システムにおける流体の微生物の生物付着を制御する方法であっ
て(例えば、貯留槽またはコンテナにおける液体の細菌酸性化制御のため)、ここで流体は
該生物付着に介在する第一微生物種の第一宿主細胞の集団を含み、方法は
(ｉ)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させること
を含み、各ベクターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、それによりＣＲＩＳＰＲアレイが宿主
細胞に導入され、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細胞の
配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)各ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標
的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリ
ダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり；そして
ここで方法は、宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡを発現させ、それにより宿主細
胞において標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該生物付着の制御をもたらす
ことを含む。
例えば、流体は液体である。例えば、流体はガス状流体である。
システム：何れかの態様のためのシステムの例は次のものからなる群から選択される。
石油化学製品回収、加工、保存または輸送システム、炭化水素回収、加工、保存または輸
送システム、原油回収、加工、保存または輸送システム、天然ガス回収、加工、保存また
は輸送システム(例えば、油井、石油掘削装置、石油採掘装置、石油ポンプ輸送システム
、石油パイプライン、ガス掘削装置、ガス抽出装置、ガスポンプ輸送装置、ガスパイプラ
イン、石油タンカー、ガスタンカー、石油貯蔵装置またはガス貯蔵装置)、水プロセシン
グまたは貯蔵装置、水貯留槽(例えば、飲用水貯留槽)、空気または水コンディショニング
(例えば、冷却または加熱)装置、例えば、冷媒管、凝縮装置または熱交換機、医療または
外科的装置、環境(例えば、土壌、水路または空気)処理装置、製紙またはリサイクリング
装置、発電装置、例えば、火力または核発電装置、燃料(例えば、炭化水素燃料、例えば
、石油、ディーゼルまたはＬＰＧ)貯蔵装置、採鉱または冶金、鉱物または燃料回収シス
テム、例えば、採掘または採鉱装置、工学系、船舶装置、貨物または物品貯蔵装置(例え
ば、輸送コンテナ)、食品または飲料製造、加工または包装装置、洗浄装置(例えば、洗濯
装置、例えば、洗濯機または食器洗浄機)、配膳(例えば、家庭用または商業的配膳)装置
、飼育装置、構築(例えば、建築、公共施設基盤または道路構築)装置、航空装置、航空宇
宙装置、輸送装置(例えば、動力車(例えば、自動車、大型トラックまたは小型トラック)
、列車、航空機(例えば、飛行機)または海または水路輸送媒体(例えば、船舶または船、
潜水艦またはホバークラフト))、包装装置、例えば、消費財包装装置または食品または飲
料包装装置、電子機器(例えば、コンピューターまたは携帯電話またはその電子機器要素)
または電子機器製造または包装装置、歯科装置、産業用または家庭用配管(例えば、海中
パイプ)または保存コンテナ(例えば、水タンクまたは燃料タンク(例えば、ガソリンタン
ク、例えば、輸送媒体用ガソリンタンク))、地下装置、建築(例えば、住居または会社ま
たは商業的施設または工場または発電所)、車道、橋、農業装置、工場システム、原油ま
たは天然ガス探査装置、会社システム、および家庭用システム。
例えば、システムは、農業、石油または石油産業、食品または飲料産業、衣料品産業、
包装産業、電子機器産業、コンピューター産業、環境産業、化学産業、航空宇宙産業、自
動車産業、生命工学産業、医療産業、健康管理産業、歯科産業、エネルギー産業、消費財
産業、製薬産業、採鉱産業、清掃産業、林業、漁業産業、娯楽産業、リサイクリング産業
、化粧品産業、プラスチック産業、パルプまたは紙産業、繊維製品産業、衣料品産業、革
製品またはスエードまたは動物の皮革産業、タバコ産業および鋼産業からなる群から選択
される産業または業界で使用される。例えば、表面または流体は、該選択産業において使
用する装置の表面または流体の処理のためである。例えば、システムは粗製石油産業にお
いて使用される。例えば、システムは天然ガス産業において使用される。例えば、システ
ムは石油産業において使用される。例えば、システムは海上コンテナ、プラットフォーム
または掘削装置(例えば、海で使用するための石油またはガスプラットフォームまたは掘
削装置)、船または船舶である。ある実施態様において、このようなシステムは海に固定
される、例えば、海に一時的でなく固定される、例えば、海に１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、
４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１
３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２
１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２４ヶ月以上(例えば、連続した月数)固定される。ある実
施態様において、このようなシステムは国または州の海に固定され、例えば、このような
海水中に一時的でなく固定され、例えば、該国の水中に１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月
、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月
、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月
、２２ヶ月、２３ヶ月、２４ヶ月以上(例えば、連続した月数)ある。
例えば、処理すべき基質表面は、ステンレス鋼、炭素鋼、銅、ニッケル、真鍮、アルミ
ニウム、コンクリート、プラスチックまたは木材を含む。例えば、基質は金属溶接または
接合である。例えば、表面は金属製(例えば、鋼または鉄)または非金属製(例えば、プラ
スチック、コンクリート、アスファルト、木材、ゴムまたは石)表面である。例えば、金
属は合金(例えば、ステンレス鋼、真鍮またはニッケル合金、亜鉛合金、銅合金、ニッケ
ル合金またはアルミニウム合金)である。例えば、表面は、人工ポリマー表面である。例
えば、表面は基質コーティングである。例えば、基質は土壌、淡水または海水と接触して
いる。
例えば、流体は、飲用水、水路、半鹹水または液体燃料、例えば、ガソリンまたはディ
ーゼル(例えば、自動車または電動輸送媒体用)、ＬＰＧ、灯油、アルコール(例えば、エ
タノール、メタノールまたはブタノール)、液体水素または液体アンモニア)であり、例え
ば、燃料は貯蔵液体燃料である。例えば、流体は油または非水溶液である。例えば、流体
は、水路または水塊、例えば、海水、淡水、飲用水、川、小川、池、湖、貯留槽、貯蔵さ
れた水(例えば、貯水タンクまたは冷却装置)、地下水、井戸水、岩石層中の水、土壌水ま
たは雨水に含まれる液体である。例えば、液体は海水である。例えば、基質は本段落に記
載する液体と接触している。例えば、流体または液体は、油、水溶液、水圧破砕流体、燃
料、二酸化炭素、天然ガス、油／水混合物、燃料／水混合物、塩含有水、大洋または海水
、半鹹水、水源、湖、川、小川、沼地、池、沼地、雪または氷が解けた水、泉、地下水、
帯水層、沈殿、環境温度(例えば、ｒｔｐで)で液体であるあらゆる物質からなる群から選
択され、疎水性であるが、有機溶媒、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、ジ
エチルエーテル、植物油、石油化学油、原油、精錬石油化学製品、揮発性必須油、化石燃
料、ガソリン、炭化水素混合物、ジェット燃料、ロケット燃料、生物燃料に可溶性である
。例えば、流体は油／水混合物である。
ここで使用する用語“微生物腐食“または”ＭＩＣ”は、特に断らない限り、システム
の何らかの要素(基質)が微生物集団、例えば、細菌または古細菌集団の少なくとも一員の
作用により構造的に傷つけられる過程をいう。ここで使用する用語“生物付着”は、特に
断らない限り、流体(例えば、水または水溶液または炭化水素または石油化学)と接触して
いる基質表面に微生物(例えば細菌および／または古細菌)が蓄積する過程をいう。流体(
例えば、水または水溶液または炭化水素または石油化学)中の微生物(例えば細菌および／
または古細菌)の望ましくない蓄積および増殖、すなわち、流体の“酸性化”も含まれる
。例えば、細菌は船または船舶バラスト水に含まれ、細菌は環境的に望ましくない。ここ
で使用する用語“基質”は、細胞が接着でき、バイオフィルムが形成および増殖できるか
または生物付着(例えば軟泥またはスラッジ形成)が生じ得るあらゆるタイプの表面をいう
。基質は、石油化学製品、燃料、原油またはガス配管システムにおける装置表面のような
“産業用”基質または調理台またはシャワー基質または庭基質のような“非産業用”(例
えば、家庭用、例えば、家庭用または会社)基質であり得る。
これらの態様の何れかの別法において、宿主細菌細胞の集団の代わりに、集団は第一種
の古細菌細胞の集団である。
５. 該流体が水溶液(例えば、海水、淡水、貯蔵された水または飲用水)である、態様４の
方法。
６. 方法が流体とベクターを混合し、それにより宿主細胞とベクターを接触させることを
含む、態様３～５の何れかの方法。例えば、ベクターを液体(所望により抗生物質または
殺生物剤とも)と前混合し、次いで混合物を表面(態様１)または態様４の流体と接触して
いる流体に添加してよい。
７. 各標的配列が宿主細胞病原性、耐性または必須遺伝子配列、例えば、そのエクソンま
たは制御配列である、態様１～６の何れかの方法。耐性は抗生物質耐性であり得る。例え
ば、宿主細胞を、宿主細胞生存能を低下させるために該抗生物質および該ベクターと接触
させる。
８. 標的配列の修飾が宿主細胞死滅および／または宿主細胞増殖減少をもたらす、態様１
～７の何れかの方法。増殖は、例えば、表面と接触している細胞の拡張または拡散である
。
９. ベクターが同一ＣＲＩＳＰＲアレイを含む、態様１～８の何れかの方法。
１０. 宿主細胞が細菌または古細菌細胞である、態様１～９の何れかの方法。代替的に、
その代わり第一細胞は藻類細胞である。
１１. 第一宿主細胞が硫酸還元細菌(ＳＲＢ)細胞(例えば、デスルホビブリオまたはデス
ルホトマキュラム細胞)である、態様１～１０の何れかの方法。例えば、細胞はデスルホ
トマキュラム・ニグリフィカンス、デスルファシナム・インフェルナム、サーモデスルフ
ォバクテリア・モバイル、サーモデスルフォラブダス・ノルベジカス、アーキオグロブス
・フルジダス、デスルホミクロビウム・アピスヘロナム、デスルホビブリオ・ガボネンシ
ス、デスルホビブリオ・ロンガス、デスルホビブリオ・ベトナメンシス、デスルホバクテ
リウム・セトニクム、デスルホマクラム・ハロフィルム、出スルホバクター・ビブリオフ
ォルミスおよびデスルホトマキュラム・サーモシステルナム細胞からなる群から選択され
る。例えば、集団はこれら細胞種の２以上の混合物を含む。
１２. 表面または流体が原油、ガスまたは石油化学製品回収、加工、保存または輸送装置
に含まれる、態様１１の方法。原油は世界中で最も重要なエネルギー資源の一つである。
原油がガソリン、石油、パラフィン油、滑沢剤、アスファルト、家庭用燃料油、ワセリン
およびポリマーのような消費財に種々の技術的過程を経て精錬される、石油精製化学工業
を含む多数の工業で原料として使用される。石油由来製品も多くの他の化学過程で一般に
使用される。別法において、流体は、該消費製品であるかまたは表面がこのような消費製
品と接触している。
１３. 表面が海水、フラッキング液体または井戸の液体と接触しているかまたはここで流
体が海水、フラッキング液体または井戸の液体である、態様１１または１２の方法。
１４. 方法の工程(ｉ)が第二種の微生物細胞の集団(第二宿主細胞)を提供し、第二細胞が
該ベクターを含み、ここでベクターが第二宿主細胞から第一宿主細胞に伝達可能であり、
そして第二宿主細胞と第一宿主細胞を合わせ、それによりベクターが第一宿主細胞に導入
されることを含む、態様１～１３の何れかの方法。例えば、第二細胞は、環境(例えば、
水または土壌環境中)において環境的に、産業的にまたは家庭的に許容され、第一宿主細
胞は環境において許容されない。
１５. 第一宿主細胞が該ベクターとの接触前に微生物細胞の混合物に含まれ(例えば、微
生物バイオフィルムに含まれ)、ここで混合物が該第二種の細胞を含む、１４の方法。
１６. 該第二種がバチルスまたは硝酸還元細菌または硝酸還元硫化物酸化細菌(ＮＲＢ)の
種である、態様１４または１５の方法。
１７. ＮＲＢがカンピロバクター属、ニトロバクター属、ニトロソモナス属、チオミクロ
スピラ属、スルフロスピリラム属、サウエラ属、パラコッカス属、シュードモナス属、ロ
ドバクター属およびデスルホビブリオ属からなる群から選択されるかまたは該種の少なく
とも２種を含む、態様１６の方法。
１８. ＮＲＢがニトロバクター・ブルガリス、ニトロソモナス・ヨーロペア、シュードモ
ナス・スツッツェリ、シュードモナス・エルジノーサ、パラコッカス・デニトリフィカン
ス、スルフロスピリラム・デレイアナムおよびロドバクター・スフェロイデスからなる群
から選択される、態様１７の方法。
１９. 方法が、該第一種の宿主細胞と殺生物剤を、該ベクターと同時にまたは逐次的に接
触させることを含む、態様１～１８の何れかの方法。例えば、ベクターおよび殺生物剤は
、宿主細胞と接触する組成物に予め混合されて提供される。
２０. 殺生物剤がテトラキスヒドロキシメチルホスホニウムスルフェート(ＴＨＰＳ)、グ
ルタラルデヒド、一酸化塩素、二酸化塩素、次亜塩素酸カルシウム、次亜塩素酸カリウム
、次亜塩素酸ナトリウム、ジブロモニトリロプロプリオンアミド(ＤＢＮＰＡ)、メチレン
ビス(チオシアネート)(ＭＢＴ)、２－(チオシアノメチルチオ)ベンゾチアゾール(ＴＣＭ
ＴＢ)、ブロノポール、２－ブロモ－２－ニトロ－１,３－プロパンジオール(ＢＮＰＤ)、
トリブチルテトラデシルホスホニウムクロライド(ＴＴＰＣ)、タウリンアミドおよびその
誘導体、フェノール、４級アンモニウム塩、塩素含有剤、キノアクリジニウム塩、ラクト
ン、有機染料、チオセミカルバゾン、キノン、カルバメート、尿素、サリチルアミド、カ
ルバニリド、グアニド、アミジン、イミダゾリン、酢酸、安息香酸、ソルビン酸、プロピ
オン酸、ホウ酸、デヒドロ酢酸、亜硫酸、バニリン酸、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル
、イソプロパノール、プロピレングリコール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、
フェニルエチルアルコール、ホルムアルデヒド、ヨウ素およびその溶液、ポビドン－ヨウ
素、ヘキサメチレンテトラミン、ノキシチオリン、１－(３－クロロアリル)－３,５,７－
トリアゾ－１－アゾニアアダマンタンクロライド、タウロリジン、タウラルタム、Ｎ－(
５－ニトロ－２－フルフリリデン)－１－アミノ－ヒダントイン、５－ニトロ－２－フラ
ルデヒドセミカルバゾン、３,４,４’－トリクロロカルバニリド、３,４’,５－トリブロ
モサリチルアニリド、３－トリフルオロメチル－４,４’－ジクロロカルバニリド、８－
ヒドロキシキノリン、１－シクロプロピル－６－フルオロ－１,４－ジヒドロ－４－オキ
ソ－７－(１－ピペラジニル)－３－キノリンカルボン酸、１,４－ジヒドロ－１－エチル
－６－フルオロ－４－オキソ－７－(１－ピペラジニル)－３－キノリンカルボン酸、過酸
化水素、過酢酸、ナトリウムオキシクロロセン、パラクロロメタキシレノール、２,４,４
’－トリクロロ－２’－ヒドロキシジフェノール、チモール、クロルヘキシジン、塩化ベ
ンザルコニウム、セチルピリジニウムクロライド、銀スルファジアジン、硝酸銀、臭素、
オゾン、イソチアゾロン、ポリオキシエチレン(ジメチルイミノ)エチレン(ジメチルイミ
ノ)エチレンジクロライド、２－(ｔｅｒｔ－ブチルアミノ)－４－クロロ－６－エチルア
ミノ－５’－トリアジン(テルブチラジン)およびこれらの組み合わせからなる群から選択
される、態様１９の方法。例えば、殺生物剤はテトラキスヒドロキシメチルホスホニウム
スルフェート(ＴＨＰＳ)である。例えば、殺生物剤は４級アンモニウム化合物である。
２１. システムが採鉱、船舶、原油、ガスまたは石油化学製品回収または加工、水圧破砕
、空気または水加熱または冷却、飲用水製造、保存または配送、炭化水素輸送、および廃
水処理からなる群から選択される産業手段で利用される、態様１～２０の何れかの方法。
２２. 表面が該選択産業における装置の表面であるかまたはここで流体が該選択産業にお
いて使用される装置に含まれる流体である、態様２１の方法。
２３. 表面が台所、入浴または園芸装置の表面であるまたはここで流体が台所、入浴また
は園芸装置に含まれる、態様１～２２の何れかの方法。例えば、装置は家庭用設定で使用
される。
２４. 流体がコンテナ(例えば、水タンクまたはビン)に含まれる携行液体であり、表面が
液体と接触しているコンテナの表面である、態様３に従属しているときの、態様１～２３
の何れかの方法。
２５. 各ベクターが可動遺伝要素(ＭＧＥ)を含み、ここでＭＧＥが伝達起点(ｏｒｉＴ)お
よび該ＣＲＩＳＰＲアレイを含み、ここでＭＧＥが該第一種の宿主細胞と該産業用または
家庭用システムにおけるさらなる微生物宿主細胞で伝達可能である、態様１～２４の何れ
かの方法。例えば、さらなる細胞は環境(例えば、水または土壌環境中)において環境的に
、産業的にまたは家庭的に許容され、第一宿主細胞は環境において許容されない。
２６. ｏｒｉＴが第一およびさらなる宿主細胞において機能的である、態様２５の方法。
２７. 該第一およびさらなる宿主細胞が該表面と接触している流体のバイオフィルムに含
まれるかまたはここで該細胞が該流体に含まれる、態様２５または２６の方法。
２８. 該さらなる細胞が態様１６～１８の何れかに記載する種の細胞である、態様２５、
２６または２７の方法。例えば、ＭＧＥはさらなる細胞から第一宿主細胞および／または
その逆に伝達可能である。
２９. さらなる細胞が該第一種の細胞である、態様２５～２７の何れかの方法。
例えば、この実施態様において、ＭＧＥは該システムにおける集団の第一細胞間で伝達
可能である。ＭＧＥが他の細胞への伝達過程でそれ自体のコピーを残したら、その後これ
がＭＧＥ、故に、システムにおける細胞集団にわたるＣＲＩＳＰＲアレイの増殖および拡
散の手段を提供し、それによりアレイの標的配列修飾効果が拡散される。これは、例えば
、表面と接触しているまたは流体中のバイオフィルムにおけるアレイの拡散を起こすため
に有効であり、バイオフィルムの浸透として有用であり、これにより慣用の殺生物剤は最
適量以下に減量できる。
３０. 各ＭＧＥは組込みおよび接合性要素(ＩＣＥ)であるまたはそれを含むかまたはここ
で各ベクターが該第一種の宿主細胞に感染可能であるファージであり、各ＭＧＥが細胞間
の該伝達が可能であるファージ核酸である、態様２５～２９の何れかの方法。
３１. 各ＩＣＥがトランスポゾン、例えば、接合性トランスポゾンである、態様３０の方
法。
３２. 各ベクターがプラスミドであり、所望により態様２５～３１の何れかに従うＭＧＥ
を含む、態様１～３１の何れかの方法。
３３. 第一および／またはさらなる細胞がＭＧＥの他の細胞への伝達のために動作可能で
あるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで配列がＭＧＥに含まれない
、態様２５～３２の何れかの方法。
３４. 配列がベクターに含まれない、態様３３の方法。
３５. 配列が第一細胞および／またはさらなる細胞の接合性トランスポゾンに含まれる、
態様３３の方法。
３６. トランスポゾンが第一およびさらなる細胞間でのＭＧＥの伝達のためにトランスで
動作可能である、態様３５の方法。
３７. ＭＧＥのｏｒｉＴが第一細胞および／またはさらなる細胞のＩＣＥに含まれるｏｒ
ｉＴと同一であり、ここでＩＣＥが第一およびさらなる細胞間でのＭＧＥの伝達のために
トランスで動作可能である、態様２５～３６何れかの方法。
３８. ベクターｏｒｉＴがＳＲＢまたはＮＲＢトランスポゾンのｏｒｉＴである、態様２
５～３７の何れかの方法。
３９. 各ＭＧＥが反復配列間に一および第二末端反復配列および該ＣＲＩＳＰＲアレイを
含む、態様２５～３８の何れかの方法。
４０. ＭＧＥがＣＲＩＳＰＲアレイコピーを(１)該さらなる宿主細胞に伝達されていると
き第一宿主細胞のゲノムまたは(２)第一宿主細胞に伝達されているとき該さらなる宿主細
胞に残す、態様２５～３９の何れかの方法。例えば、コピーは細胞のゲノムに残されたト
ランスポゾンまたはプロファージに含まれ、そこから伝達が起こる。
４１. 第一およびさらなる細胞が異なる種の細菌細胞である(例えば、それぞれＳＲＢお
よびＮＲＢまたはＳＲＢおよびバチルス細胞)、態様２５～４０の何れかの方法。
４２. ＭＧＥの可動化のためにトランスポザーゼと組み合わされる、態様３０に従属する
ときの態様２５～４１の何れかの方法。
４３. ベクターまたはＭＧＥが該第一種の宿主細胞において動作可能である毒素－抗毒素
モジュールを含み、所望によりここで毒素－抗毒素モジュールは他の種で動作不可能であ
るまたは動作性が低減している抗毒素遺伝子を含む、態様１～４２の何れかの方法。これ
らの実施態様は、標的配列を含む第一宿主細胞におけるベクター／ＭＧＥ(および故にＣ
ＲＩＳＰＲアレイ)の保持に好ましい選択圧を作るのに有用である。
４４. ベクターまたはＭＧＥが該第二またはさらなる細胞において動作可能である毒素－
抗毒素モジュールを含み、所望によりここで毒素－抗毒素モジュールが第二またはさらな
る細胞で動作不可能であるまたは動作性が低減している抗毒素遺伝子を含む、態様１～４
３の何れかの方法。これは、第二またはさらなる細胞におけるＣＲＩＳＰＲアレイの集団
を維持するが(例えば、このような細胞が第一細胞も含むバイオフィルムに存在するとき)
、ここで毒素－抗毒素モジュールが第一宿主細胞におけるさらなる死滅(標的配列修飾の
作用にわたりおよびそれを越えて)を提供するのに有用である。例えば、ベクターまたは
ＭＧＥは、第一宿主細胞および該第二またはさらなる細胞で動作可能である毒素－抗毒素
モジュールを含む。
４５. 毒素－抗毒素モジュールが第一および第二またはさらなる細胞以外の細胞で動作不
可能であるまたは動作性が低減している、態様４３または４４の方法。それ故に、ＣＲＩ
ＳＰＲアレイを維持するために第一および第二(またはさらなる)細胞両者における選択圧
が存在し得る。有用なことに、これは、次いで、混合集団における細胞間のＭＧＥにおけ
るアレイの水平伝播のための貯留槽を提供する(例えば、表面と接触するバイオフィルム
または流体に含まれる集団)。
４６. 第一および第二細胞(または第一およびさらなる細胞)が同じ門のものであり(例え
ば、両細菌細胞)、ベクターが(Ａ)同じ門の他の細胞においてではなく第一細胞および／
または第二(またはさらなる)細胞において、(Ｂ)同じ目の他の細胞においてではなく、第
一細胞および／または第二(またはさらなる)細胞において、(Ｃ)同じ綱の他の細胞におい
てではなく、第一細胞および／または第二(またはさらなる)細胞において、(Ｄ)同じ目の
他の細胞においてではなく、第一細胞および／または第二(またはさらなる)細胞において
、(Ｅ)同じ科の他の細胞においてではなく、第一細胞および／または第二(またはさらな
る)細胞において、(Ｆ)同じ属の他の細胞においてではなく、第一細胞および／または第
二(またはさらなる)細胞において、または(Ｇ)同じ種の他の細胞においてではなく、第一
細胞および／または第二(またはさらなる)細胞において、複製可能または動作可能である
、態様２５～４５の何れかの方法。
４７. 各ＭＧＥが接合性トランスポゾンであり、ｏｒｉＴが第一およびさらなる(または
第二)宿主細胞において機能的であり、ＭＧＥが反復配列間に一および第二末端反復配列
および該ＣＲＩＳＰＲアレイを含み、ここで第一およびさらなる(または第二)細胞が細菌
細胞であり、ここで標的部位は第一細胞に含まれるがさらなる(または第二)細胞には含ま
れず、ここで該修飾は第一細胞における該標的に含まれる遺伝子または制御配列を不活性
化または下方制御し、第一宿主細胞生存能の低下および該ＭＩＣまたは生物付着の制御を
もたらす、態様２５または態様２５に従属するときの態様２６～４６の何れかの方法。
４８. 各ＣＲＩＳＰＲアレイが第一宿主細胞における各ｃｒＲＮＡの発現および製造のた
めに配列Ｒ１－Ｓ１－Ｒ１’を含み、
(ｉ)ここでＲ１は第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１’は第二ＣＲＩＳＰＲ反復であり、
Ｒ１またはＲ１’は任意であり、
(ii)Ｓ１は該第一宿主細胞の標的配列と９５％以上同一であるヌクレオチド配列を含むか
またはそれからなる第一ＣＲＩＳＰＲスペーサーである、
態様１～４７の何れかの方法。
４９. Ｒ１およびＲ１’が、第一宿主細胞種のＣＲＩＳＰＲアレイの第一および第二反復
配列にそれぞれ少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、態
様４８の方法。ある実施態様において、Ｒ１およびＲ１’の両者が存在する。
５０. Ｒ１およびＲ１’が、標的配列の修飾のために該第一種の宿主細胞のＣＲＩＳＰＲ
／Ｃａｓシステムと共に機能的である、態様４８または４９の方法。
５１. 第一宿主細胞が、第一宿主細胞種のＣＲＩＳＰＲアレイの反復配列(例えば、第一
反復)とそれぞれ少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、
態様４８～５０の何れかの方法。
５２. Ｒ１およびＲ１’が、配列番号５０～７４からなる群から選択される反復配列とそ
れぞれ少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、態様５１の
方法。表１参照。ある実施態様において、Ｒ１およびＲ１’の両者が存在する。
５３. Ｒ１およびＲ１’が、配列番号５１、５４および６９からなる群から選択される反
復配列とそれぞれ少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、
態様５１の方法。配列番号５１、５４および６９は１種を超えるＳＲＢ種に見られる。こ
れは、特に本発明のＣＲＩＳＰＲアレイで１種を超えるＳＲＢタイプをターゲティングす
るのに、例えば、ＳＲＢタイプが処理する産業用または家庭用システムにおいて共存する
とき、例えば基質と接触させる集団またはバイオフィルムまたは処理する流体に共存する
とき、有用である。ある実施態様において、Ｒ１およびＲ１’の両者が存在する。
５４. Ｒ１およびＲ１’の配列が同一である、態様４８～５３の何れかの方法。
５５. 第一宿主細胞に導入された各アレイが、宿主細胞において各ｃｒＲＮＡと機能し、
その標的配列を修飾する、１以上のＣａｓヌクレアーゼ(例えば、Ｃａｓ９および／また
はＣｆｐ１)と組み合わせて導入される、態様１～５４の何れかの方法。
例えば、任意の形態のここでのＣａｓはヌクレアーゼ活性について脱活性化され、所望
により標的配列アクティベーターまたはデプレッサーを含む。ここでのＣａｓ９は、例え
ばストレプトコッカス・ピオゲネスまたはスタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９であ
る。
５６. 第一宿主細胞に導入された各アレイが宿主細胞における各ｃｒＲＮＡと機能し、標
的配列を修飾する１以上のＣａｓヌクレアーゼ(例えば、Ｃａｓ９および／またはＣｆｐ
１)をコードする核酸配列と組み合わせて導入される、態様１～５５の何れかの方法。
５７. Ｒ１およびＲ１’が該第一宿主細胞における標的配列を修飾するのにタイプII Ｃ
ａｓ９ヌクレアーゼと機能的であり、所望によりここで方法はさらに態様５５または５６
に従い、ここでＣａｓは該Ｃａｓ９である、態様４８～５６の何れかの方法。
５８. 該ベクターまたはＭＧＥの全てまたは一部が、各アレイと共に動作可能であるＣａ
ｓヌクレアーゼコード化配列を含まない、態様１～５７の何れかの方法。
５９. 各該各アレイが第一種の細胞に見られるＣａｓエンドヌクレアーゼと共に動作可能
である、態様５８の方法。
６０. 各ＭＧＥがアレイの反復配列と共に動作可能であるＣａｓエンドヌクレアーゼをコ
ードする配列を欠き、ここで各ベクターがＭＧＥの外にこのような配列(例えば、Ｃａｓ
９またはＣｆｐ１をコードする)を含む、態様２５または態様２５に従属するときの態様
２６～５９の何れかの方法。
６１. 原油、ガスまたは石油化学製品回収、加工、保存または輸送装置(例えば、粗製石
油タンカー、石油掘削装置または石油採掘装置)に含まれる基質の微生物腐食(ＭＩＣ)ま
たは生物付着を制御する方法であって、ここで基質の表面は第一宿主細胞の集団と接触し
、ここで第一宿主細胞は、基質のＭＩＣまたは生物付着に介在する第一種の硫黄または硫
酸還元細菌(ＳＲＢ)、細胞外重合物質産生細菌(ＥＰＳＢ)、酸産生細菌(ＡＰＢ)、硫黄ま
たは硫化物酸化細菌(ＳＯＢ)、鉄酸化細菌(ＩＯＢ)、マンガン酸化細菌(ＭＯＢ)、アンモ
ニア産生細菌(ＡｍＰＢ)または酢酸産生細菌(ＡｃＰＢ)であり、ここで表面および細胞集
団は海水、淡水、フラッキング液体または井戸中の液体からなる群から選択され(例えば
、石油または天然ガス井戸)、方法は
(ｉ)細胞集団とベクターを、液体と第一宿主細胞の形質転換または形質導入が可能な複数
のベクターを混合することにより接触させ、各ベクターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、そ
れによりＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細胞の
配列の転写のためのプロモーターを含み；
(ｂ)各ｃｒＲＮＡは宿主細胞におけるＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、
Ｃａｓ９またはＣｆｐ１)ををガイドして標的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断す
る)ために宿主細胞の標的配列とハイブリダイズ可能であり；標的配列は宿主細胞生存能
に介在する遺伝子配列であり；
(ｃ)ここで(ａ)の各々の配列は、第一宿主細胞において各ｃｒＲＮＡの発現および産生
のために配列Ｒ１－Ｓ１－Ｒ１’を含み、ここでＲ１は第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ
１’は第二ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１またはＲ１’は任意であり、Ｓ１は該第一宿主
細胞の標的配列に７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上同一である
ヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる第一ＣＲＩＳＰＲスペーサーであり、そして
(ii)宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡを発現させ、それにより宿主細胞において
標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該基質のＭＩＣまたは生物付着の制御を
もたらす
ことを含む。ある実施態様において、Ｒ１およびＲ１’の両者が存在する。
６２. 態様１または態様１に従属するときの前態様の何れかに従う、態様６１の方法。
６３. 各ベクターが第一宿主細胞を含むファージであるかまたはＣＲＩＳＰＲアレイを含
むＭＧＥ(例えば、トランスポゾン)を含むベクターであり、ここでＭＧＥが第一宿主細胞
への伝達が可能である、態様６１または６２の方法。
６４. 第一細胞が硫酸還元細菌(ＳＲＢ)細胞、例えば、デスルホビブリオまたはデスルホ
トマキュラム細胞である、態様６１、６２または６３の方法。
６５. Ｒ１およびＲ１’が第一宿主細胞種のＣＲＩＳＰＲアレイの反復配列(例えば、第
一反復)とそれぞれ少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり
、ベクターアレイが第一種の細胞に見られるＣａｓエンドヌクレアーゼと共に動作可能で
ある、態様６４の方法。例えば、Ｒ１およびＲ１’は同一配列である。
６６. Ｒ１およびＲ１’が配列番号５０～７４からなる群から選択される反復配列とそれ
ぞれ少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、態様６５の方
法。例えば、Ｒ１およびＲ１’は同一配列である。
６７. Ｒ１およびＲ１’が、配列番号５１、５４および６９からなる群から選択される反
復配列とそれぞれ少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、
態様６６の方法。表１参照。これは、特に本発明のＣＲＩＳＰＲアレイで１を超えるＳＲ
Ｂタイプをターゲティンするとき、例えば、ＳＲＢタイプが処理する産業用または家庭用
システムにおいて共存するとき、例えば基質と接触させる集団またはバイオフィルムまた
は処理する流体に共存するとき、有用である。例えば、Ｒ１およびＲ１’は同一配列であ
る。
６８. 該複数のベクターがさらなるベクターを含み、ここで各さらなるベクターが該集団
に含まれるさらなる宿主細胞をターゲティングするために１以上のＣＲＩＳＰＲアレイを
含み、ここでさらなる宿主細胞種が第一宿主細胞種と異なり、ここで工程(ｉ)において、
集団の該さらなる細胞はさらなる細胞を形質転換またはトランスデュース可能な複数の該
さらなるベクターと接触しており、各ベクターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、それにより
ＣＲＩＳＰＲアレイがさらなる宿主細胞に導入され、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細胞の配
列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)各ｃｒＲＮＡが宿主細胞におけるＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイドし、
標的配列を修飾(例えば、標的配列を切断)するために該さらなる宿主細胞の標的配列とハ
イブリダイズ可能であり；標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり；そし
て
工程(ii)は該さらなる宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡの発現を可能にすること
を含み、それによりさらなる宿主細胞における標的配列を修飾する、
態様１～６７の何れかの方法。
６９. さらなる宿主細胞が該基質または流体のＭＩＣまたは生物付着に介在し、ここで工
程(ii)がさらなる宿主細胞生存能の低下および該基質または流体のＭＩＣまたは生物付着
の制御をもたらす、態様６８の方法。
７０. 船または船舶のバラスト水における細菌生物付着を制御する方法であって、ここで
水が該生物付着に介在する第一微生物種の第一宿主細胞の集団を含み、方法は
(ｉ)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させ、各ベ
クターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、それによりＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞に導入さ
れ、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細胞の
配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)各ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標
的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリ
ダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり；そして
(ii)宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡを発現させ、それにより宿主細胞において
標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該生物付着の制御をもたらす
ことを含む。
７１. 第一宿主細胞がビブリオ・コレラエ、エシェリキア・コリまたはエンテロコッカス
細胞である、態様７０の方法。
７２. 工程(ｉ)が、例えば、船または船舶の船体において、バラスト水とベクターを混合
することを含む、態様７０または７１の方法。
７３. 船または船舶が海上輸送媒体であり、水が海水である、態様７０～７２の何れかの
方法。
７４. 船または船舶の代わりに、バラスト水が海でのコンテナまたは掘削プラットフォー
ム、例えば、石油プラットフォームまたは石油掘削装置に含まれる、態様７０～７２の何
れかの方法。例えば、船、船舶、コンテナ、プラットフォームまたは掘削装置が海で固定
されている(すなわち、その場所に一時的にではない)。
７５. 船または船舶からバラスト水を放出する方法であって、ここで放出バラスト水が態
様７０～７４の何れかの方法による水処理を含む、方法。
７６. 水が水塊、例えば、海、大洋または水路(例えば、川、運河、湖または貯留槽)また
はコンテナに放出される、態様７５の方法。
７７. ＣＲＩＳＰＲアレイを含むバラスト海水であって、ここでバラスト水は態様７０～
７６の何れかの方法により得るまたは得られる。
７８. 態様７７のバラスト海水を含む、船、船舶、コンテナまたは掘削装置。
７９. 態様６１～６９の何れかの方法において使用するベクターであって、ここで第一細
胞が硫酸還元細菌(ＳＲＢ)細胞、例えば、デスルホビブリオまたはデスルホトマキュラム
細胞である、各ベクターはＳＲＢターゲティングのための１以上のＣＲＩＳＰＲアレイを
含み、ここで各アレイが態様６１の(ａ)～(ｃ)において定義されている。
８０. Ｒ１およびＲ１’が態様６５～６７の何れかに従う、態様７９のベクター。
８１. 態様７０～７６の何れかの方法において使用するベクターであって、ここで第一細
胞はコレラ(例えば、ビブリオ、例えば、Ｏ１またはＯ１３９)、エシェリキア・コリまた
はエンテロコッカス細胞であり、ベクターは細胞のターゲティングのために１以上のＣＲ
ＩＳＰＲアレイを含み、ここで各アレイが態様７０の(ａ)および(ｂ)において定義される
。
８２. ベクターが該細胞に感染できるバクテリオファージである、態様７９～８１の何れ
かのベクター。
８３. ベクターが該細胞に伝達可能なトランスポゾンまたはＭＧＥである、態様７９～８
１の何れかのベクター。
８４. 複数のベクターであって、ここで各ベクターが態様８２または８３に従い、所望に
より該細胞の生存能を低下できる殺生物剤または抗生物質と組み合わされる。
ＭＩＣまたは生物付着に介在する細菌：例えば、第一宿主細胞は、硫黄または硫酸還元細
菌(ＳＲＢ)、細胞外重合物質産生細菌(ＥＰＳＢ、例えば、シュードモナス)、酸産生細菌
(ＡＰＢ)、硫黄または硫化物酸化細菌(ＳＯＢ)、鉄またはマンガン酸化細菌(ＩＯＢ)、ア
ンモニア産生細菌(ＡｍＰＢ)および酢酸産生細菌(ＡｃＰＢ)からなる群から選択される。
例えば、第一宿主細胞は、ＡｃＰＢ(例えば、アセトバクター属および／またはグルコナ
セトバクター属)であり、表面は炭化水素燃料(例えば、燃料グレードエタノール)および
／または水と接触している。
次は、本発明のために関連する細菌の例である(例えば、第一宿主細胞は次の種の何れ
かである)。アシドチオバシラス細菌は硫酸を産生する。アシドチオバシラス細菌の亜属
であるアシディチオバシラス・チオオキシダンスは、しばしば管路パイプを損傷させる。
フェロバチルス・フェロオキシダンスは、鉄を酸化鉄および水酸化鉄に直接酸化する。他
の細菌は、種々の有機および無機両方の酸またはアンモニアを産生する。酸素存在下、チ
オバチルス・チオオキシダンス、チオバシラス・チオパルスおよびチオバシラス・コンク
レチボラスのような好気性細菌(全３種とも環境に広く存在する)は、生物起源硫化物腐食
をもたらす一般的腐食原因因子である。酸素非存在下では、嫌気性細菌、特にデスルホビ
ブリオおよびデスルホトマクルムが一般的である。デスルホビブリオ・サレキシゲンスは
少なくとも２.５％濃度の塩化ナトリウムを必要とするが、デスルホビブリオ・ブルガリ
スおよびデスルホビブリオ・デスルフリカンスは淡水および塩水両者で生存できる。デス
ルホビブリオ・アフリカヌスは、他の一般的腐食原因微生物である。デスルホトマクルム
属は、硫酸還元胞子形成細菌である。デスルホトマクルム・オリエンティスおよびニグリ
フィカンスは腐食過程に関与する。硫酸還元因子は還元環境を必要とし、少なくとも－１
００mVの電極電位がそれらの繁殖に必要である。しかしながら、産生される硫化水素が小
量でも、この転換が達成され、故に増殖が、開始されたら、加速される傾向にある。
例えば、第一宿主細胞は、セラチア・マルセッセンス、ガリオネラ属、シュードモナス
属、バチルス属(例えば、バチルス・スブチリス、バチルス・セレウス、バチルス・プミ
ルスまたはバチルス・メガテリウム)、チオバチルス属、スルフォロブス属、クレブシエ
ラ・オキシトカ、シュードモナス・エルジノーサ、シュードモナス・スツッツェリ、ミク
ロコッカス、エンテロコッカス、スタフィロコッカス(例えば、スタフィロコッカス・ア
ウレウス)、エンテロコッカス・フェカーリスまたはミクロコッカス・ルテウス細胞であ
る。例えば、第一宿主細胞は該種の２以上の混合物を含む。これらの種は、インドの北西
および南西領域に位置するディーゼルおよびナフサ輸送パイプラインから単離されており
、これらのコンソーシアム存在下のパイプライン鋼のが実証された。種々の欧州航空機製
造業者の共同事業は、航空機構築に一般に使用されるアルミニウム合金における強腐食損
傷へのミクロコッカス属、エンテロコッカス属、スタフィロコッカス属およびバチルス属
の単離体の関与を確認した。これらの細菌は、微小酸性環境(酸産生細菌)を作り得て、こ
れは他の細菌に好ましいかまたはＥＰＳを産生し、バイオフィルムの形成(ＥＰＳ産生細
菌)を支持する。それ故に、本発明の実施態様において、処理するシステムの表面(例えば
、鋼表面)は、ディーゼルまたはナフサと接触しているかまたは処理する流体はディーゼ
ルまたはナフサである(および所望により第一宿主細胞は、この段落で定義した１以上の
種のものである)。本発明の実施態様において、処理するシステムの表面(例えば、アルミ
ニウム含有表面、例えば、航空機表面)は、ミクロコッカス、エンテロコッカス、スタフ
ィロコッカスおよびバチルス(第一宿主細胞)の１属、２属、３属または全属と接触する。
本段落の実施態様の何れかの例えば、表面は、システムの鋼またはアルミニウム要素の表
面である。
酸産生細菌：好気性細菌は、酢酸、ギ酸、乳酸、プロピオン酸および酪酸のような短鎖有
機酸を、有機物質の発酵性代謝からの代謝産物として産生できる。それらはまた好気性代
謝により最初の生着菌である。これらの微生物は、ガススタンドおよび石油を含む多様な
環境に存在する。有機酸は、ＳＲＢの基質として働き、腐食過程を加速し、それ加えて周
辺媒体のｐＨを下げる。さらに、大量の産生された有機酸は金属脱分極に作用し、局所腐
食性過程を開始する。
硫黄酸化細菌：硫黄酸化細菌は、硫化物、亜硫酸、チオ硫酸およびある場合硫黄のような
無機硫黄化合物の酸化から増殖に必要なエネルギーを得る好気性および通性嫌気性微生物
である。酸化的代謝は、硫酸の産生に至り、これは環境酸性化を促進する。この群は多く
の属を含み、アシドチオバシラス属が最も研究されている。この群はまたスルフォロブス
属、チオミクロスピラ属、ベギアトア属、アシドチオバシラス属およびチオトリクス属か
ら選択される細菌種ならびにチオスフェラ・パントトロファ種およびパラコッカス・デニ
トリフィカンス種を含む。例えば、第一宿主細胞はこれらの種の何れか一つの細胞である
。
鉄酸化細菌：鉄酸化細菌は、代謝に必要なエネルギーを鉄酸化により得る、大きくかつ多
様な群に属する好気性微生物である。結果として、一般に基質表面に不溶性沈殿を形成す
る水酸化鉄の形成があり、種々の酸素レベルを有する領域を促進する。川、湖からの水お
よび石油製品に広く発見されている。大部分自発運動鞘を有し、その存在は、腐食産物と
しての沈殿三価鉄の大量の蓄積により検出される。この蓄積または無機付着物は、石油パ
イプラインの遮断のような工業用装置に問題を起こす。最も一般的なのは、チオバチルス
・フェロオキシダンスおよびクレノスリクス属、ガリオネラ属、レプトスリックス属およ
びスフェロチルス属である。例えば、第一宿主細胞はこれらの種の何れか一つの細胞であ
る。
硫黄または硫酸還元細菌(ＳＲＢ)：ＳＲＢは、細菌および限定嫌気性古細菌を含む形態学
的および系統学的に異質の群を形成するが、いくつかの種は、酸素に相当耐容性である。
それらは主にグラム陰性細菌であり、中温性およびいくつかは好熱性の、一般に胞子形成
性である。これらの微生物は、電子受容体として硫酸イオンまたは他の硫黄化合物(チオ
硫酸、亜硫酸など)を使用する、モノまたはジカルボン酸脂肪族酸、アルコール、炭化水
素および芳香族化合物のような種々の低分子量有機化合物の酸化が可能である。アセテー
ト、ラクテート、ピルベートおよびエタノールがＳＲＢにより使用されるとりわけ基質で
ある。ＳＲＢ増殖の刺激は、微生物と組み合わさった腐食産物の沈着により説明されるバ
イオフィルムにおける、および、硫酸に富む海水のような水性媒体の注入がある石油回収
中による嫌気性状態の存在のためである。大量の生物起源硫化水素が産生でき、パイプラ
インおよび他の石油、ガスまたは石油化学製品回収、加工、保存または輸送装置または掘
削装置で形成される大量のＨ２ＳはＳＲＢの代謝活性に端を発する。石油産業における他
の経済的影響は、Ｈ２Ｓによる石油およびガスの酸性化である。
ＳＲＢの代謝活性と関連する多くの経済的損失を考慮して、モリブデート、ニトレート
およびニトライトのような環境的に有害かつ毒性の代謝阻害剤の使用およびＳＲＢの代謝
活性制御およびその後の生物起源Ｈ２Ｓ産生の阻害を助ける殺生物剤の制御に労力が向け
られている。
いくつかの機構が代謝阻害剤を使用する生物起源Ｈ２Ｓの形成過程に関与する：Ｉ －
競合的ＳＲＢ排除に至る、ＳＲＢと通常の電子供与体によるニトライトまたはニトレー
トの還元因子である従属栄養性細菌の間の競合；II － Ｈ２Ｓの生物学的産生は低酸化
還元能(－１００mV未満)でのみ生じるため、ニトレート還元(亜酸化窒素および一酸化窒
素)の中間体の存在による酸化還元能増加；III － 硫酸ではなくニトレートを還元する
、いくつかのＳＲＢのエネルギー代謝変化；IV － Ｈ２Ｓ除去に至るＨ２Ｓ再酸化にニ
トレートまたはニトライトを使用する硫化物酸化細菌およびニトレートまたはニトライト
還元細菌；Ｖ － ＳＲＢにおける硫酸減少を経て最終酵素工程を阻害するニトライトに
よる異化性亜硫酸レダクターゼの阻害。
本発明のある実施態様において、処理する基質と接触しているまたは処理する流体に含
まれる宿主細胞集団はまた、本発明のベクター存在下で１以上のニトレートおよび／また
は１以上のニトライトと接触している。例えば、工程(ｉ)において、同時にまたは逐次的
にベクター、ニトレート／ニトライトおよびベクターが、産業用または家庭用システムに
含まれる石油、ガス、石油化学製品、水または他の流体と合わせられる(例えば、注入さ
れる)。同様に、これに加えてまたはこれとは別に、モリブデートも、ＳＲＢの機構の制
御としてシステムで使用してよい。それ故に、ある実施態様において、処理する基質と接
触しているまたは処理する流体に含まれる宿主細胞集団はまた本発明のベクター存在下で
１以上のモリブデートと接触する。例えば、工程(ｉ)において、同時にまたは逐次的にベ
クター、モリブデートおよびベクターが、産業用または家庭用システムに含まれる石油、
ガス、石油化学製品、水または他の流体と合わせられる(例えば、注入される)。
他の実施態様において、集団は、本発明のベクター存在下、硝酸還元細菌および／また
はニトレート還元硫化物酸化細菌(ＮＲＳＯＢ)(ここでは集合的に、“ＮＲＢ”)と接触さ
れる。例えば、同時にまたは逐次的に、ベクター、ＮＲＢは、産業用または家庭用システ
ムに含まれる石油、ガス、石油化学製品、水または他の流体と合わせられる(例えば、注
入される)。例えば、ＮＲＢは本発明のベクターを含み、ここでベクターは、ＮＲＢ細胞
から第一宿主細胞(ＳＲＢ細胞)に伝達可能であり、ＮＲＢおよびＳＲＢ細胞を組み合わせ
た後、ベクターはＳＲＢ細胞に導入される。例えば、該ベクターとの接触前にＳＲＢ細胞
が微生物細胞の混合物に含まれ(例えば、微生物バイオフィルムに含まれ)、ここで混合物
はＮＲＢ種の細胞を含む。それ故に、この場合、本発明は、ＳＲＢ細胞とＮＲＢ細胞(ベ
クター含有)の接触を含み、ここで、ＮＲＢ細胞種は標的とするバイオフィルムにおいて
ＳＲＢと既に共存しており、これは、故に、ベクター含有ＮＲＢのバイオフィルム細胞集
団への取り込みの適合性および機会を増やす。これは、ベクターがバイオフィルムに含ま
れる機会を増やし、それによりＳＲＢ細胞修飾のための有効性の機会およびバイオフィル
ム内の本発明のＣＲＩＳＰＲアレイの増殖の機会を増やすのに有用である(特にここに記
載するとおり、アレイがトランスポゾンのような可動遺伝要素に含まれているまたはファ
ージに含まれているとき)。
ＳＲＢおよびＮＲＢは、一般に細菌増殖に必要なある油田および工業用水システムに存
在する同じ非ポリマー炭素源(例えばアセテート)について競合する。ＳＲＢに対してＮＲ
Ｂの増殖速度を上げることにより、ＮＲＢは、利用可能な非ポリマー炭素源の消費におい
てＳＲＢと競合して排除でき、ＳＲＢの増殖し、望ましくない硫化物を産生する能力を奪
い、腐食速度を減少させる。さらにＳＲＢの増殖率を下げることにより、ＮＲＢが優勢と
なることができ、同様にシステム、例えば、油田または工業用水システムにおける利用可
能な非ポリマー炭素についてＳＲＢと競合して排除し得る。それ故に、集団におけるＳＲ
Ｂ細胞とＮＲＢの接触は、集団におけるＮＲＢ対ＳＲＢの比率の増加により、ＳＲＢ細胞
生存能を低下させることを助ける。
ある実施態様において、本発明は、第一宿主細胞(例えば、ＳＲＢ)を含む集団と、有機
および／または無機ニトレートおよびニトライトの接触を含む。これらは、存在するＮＲ
Ｂの増殖の刺激に働き、故に、ＮＲＢがＳＲＢを負かすことを助ける。有機および無機ニ
トレートまたは無機ニトライトは、ある油田および工業用水システムへの注入により使用
し得る。本発明における使用に利用可能な無機ニトレートおよび無機ニトライトは、例え
ば、硝酸カリウム、亜硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、硝酸アンモニ
ウムおよびこれらの混合物である。これらの有機および無機ニトレートおよび無機ニトラ
イトは一般的に利用可能であるが、非限定的であり、あらゆる適切なニトレートまたはニ
トライトが使用され得る。
使用する有機または無機ニトレートまたはニトライトの量は、システムの集団に存在す
る硫酸および／または有機酸の量およびＳＲＢに対抗するのに必要なＮＲＢの予測量を含
む、多数の因子による。ある実施態様において、液体と接触している基質のＭＩＣの処理
のためにまたは本発明に従う液体の生物付着の処理のために、使用する有機または無機ニ
トレートまたはニトライトの濃度は、バッチ適用法により適用したとき液体重量で２００
０ppm未満、あるいは重量で５００～１６００ppmあるいは重量で約９００～１１００ppm
であり得る。連続操作により適用したとき、有機または無機ニトレートまたはニトライト
の濃度は、重量で液体の５００ppm未満、あるいは１０～５００ppmあるいは１０～１００
ppmであり得る。
ある実施態様において、集団は、本発明のベクターおよび同時にまたは逐次的にＮＲＢ
(例えば、ベクターを含むもの)およびニトレートおよび／またはニトライトと接触される
。
適当なＮＲＢは、従属栄養性硝酸還元細菌および硝酸還元硫化物酸化細菌のような嫌気
性ニトレート還元の実施ができるあらゆるタイプの細菌を含む。例えば、ＮＲＢは、カン
ピロバクター属、ニトロバクター属、チオバチルス属、ニトロソモナス属、チオミクロス
ピラ属、スルフロスピリラム属、サウエラ属、パラコッカス属、シュードモナス属および
ロドバクター属からなる群から選択される１、２、３以上(例えば、１以上)のＮＲＢを含
み、例えば、ＮＲＢはニトロバクター・ブルガリス、ニトロソモナス・ヨーロペア、シュ
ードモナス・スツッツェリ、シュードモナス・エルジノーサ、パラコッカス・デニトリフ
ィカンス、スルフロスピリラム・デレイアナムおよびロドバクター・スフェロイデスの１
以上から選択される。
ある実施態様において、ＮＲＢは、原油、ガス、石油化学製品または水回収、加工、輸
送または貯蔵システム(例えば、その装置における)において見られるＮＲＢ株であるかま
たは水井戸または油井のような地下層において見られる。ＮＲＢは、システム条件下で代
謝するよう最適化され得る。ＮＲＢは、例えば、ＮＲＢ株のライブラリーから選択される
かまたは処理するシステムまたは類似システムから培養され得る。
システムにおいてＳＲＢ細胞と接触させるＮＲＢの量は、予測されるＳＲＢの量、なら
びに存在し得る何らかの殺生物剤を含む多数の因子により得る。地下層に注入されるとき
、地下層の透過性および空隙率も同様に考慮し得る。本発明のある実施態様において、液
体に注入するＮＲＢの量は、１～１０８細菌数／液体mlまたはあるいは１０～１０４細菌
数／液体mlである。
ＮＲＢのＳＲＢとの競合を刺激することに加えて、本発明のある実施態様においてさら
なるＳＲＢ阻害剤をニトレートと共に導入することが望ましい場合がある。例えば、ＳＲ
Ｂを、９,１０－アントラキノン、モリブデート(例えばモリブデン酸ナトリウムおよび／
またはモリブデン酸リチウム)およびこれらの混合物からなる群から選択される１以上の
ＳＲＢ阻害剤と接触させる。本発明のある実施態様において、モリブデートを、液体に液
体の重量の５～１００ppmの範囲で添加する。
例えば、本発明のベクターおよび１以上の殺生物剤(すなわち、ＳＲＢ殺生物剤のよう
な第一宿主細胞の殺生物剤)を、第一細胞と混合物の混合前に、例えば、混合物の処理す
る表面と接触している液体に注入することによりまたは混合物の処理する流体への注入に
より混合する。
ベクター含有ＮＲＢ細胞に加えてまたはこれとは別に、本発明は、本発明のベクターを
含むバチルス細胞の種の使用を企図する。
ある実施態様において、ベクターは、ＳＲＢに感染可能なバクテリオファージであり、
ファージは第一宿主細胞(例えば、ＳＲＢ)と接触され、それによりファージに含まれるＣ
ＲＩＳＰＲアレイが、本発明に従うその修飾のために第一宿主細胞に導入される。ある実
施態様において、第一細胞がＳＲＢであるとき、ＳＲＢはまた本発明のファージベクター
および同時にまたは逐次的にＮＲＢと接触する。ＮＲＢとの接触の代わりにまたはそれに
加えて、ＳＲＢをニトレートおよび／またはニトライトと接触させる。
ＭＩＣに含まれる例示機構は次のとおりであり、ある実施態様において、方法を使用す
る“制御”は、
・金属表面上の水酸化鉄堆積によるバイオミネラル化の微生物(例えば、細菌)促進、界面
金属／溶液の電気化学過程を修飾し、腐食を誘発する；
・バイオフィルムの形成を支持するＥＰＳの製造；
・金属の腐食に作用する、酵素アリール炭化水素ヒドロキシラーゼ(ＡＨＨ)の放出による
石油製品の分解の微生物(例えば、細菌)促進；
・腐食過程を増加させる硫酸の製造；および
・硫黄の酸化
から選択される、機構の減少を含む。
ある実施態様において、方法は、
・金属製表面表面上への水酸化鉄の堆積によるバイオミネラル化の細菌促進；
・ＥＰＳの製造；
・金属製表面である酵素アリール炭化水素ヒドロキシラーゼ(ＡＨＨ)の放出によるシステ
ムにおける石油製品の分解の細菌促進；
・硫酸の製造；および
・硫黄の酸化
から選択される機構を減少させる。
ＭＩＣまたは生物付着制御のための適応例
細菌と関連した腐食および／または生物付着の減少のための、本発明により企図される
具体的適応例がある。下記適応は、本発明のコンセプトを限定する意図はなく、本発明が
細菌誘導腐食の制御または環境汚染減少にどのように使用できるかを単に説明するもので
ある。
酸採掘抗排水：酸採掘抗排水において、細菌増殖は環境における酸性度を増加させ得る。
反応スキームが酸産生のために存在し、それ故に、環境を毀損する可能性がある。酸採掘
抗排水の問題は、重大な環境問題として世界的に認識されている。酸採掘抗排水の起源は
、黄鉄鉱および他の硫化物含有鉱物の風化および酸化である。採掘抗排水は、黄鉄鉱、硫
化鉄が空気および水に曝され、反応して硫酸を形成し、鉄を溶解するとき形成される。こ
の鉄の一部または全てが沈殿して、採掘抗排水を含む小川の底に赤色、橙色または黄色の
沈殿物を形成し得る。酸排水はさらに底または表面水に銅、鉛、水銀のような重金属を溶
解させる。酸採掘抗排水が進む割合および程度は、ある種の細菌の作用により増加され得
る。
例えば、システムは、それ故に採掘抗であるかまたは採掘抗に含まれる。流体は採掘抗
排水流体であり、本方法は採掘抗排水が原因の硫酸を減少させる。例えば、表面は採掘抗
排水流体と接触する。
例えば、第一宿主細胞は、アシドチオバシラス・フェロオキシダンス、アシディチオバ
シラス・チオオキシダンス、アシドチオバシラス・デニトリフィカンス、レプトスピリラ
ム・フェロオキシダンスまたはスルホバチルス・サーモサルフィドオキシダンス細胞また
はこれらの２以上の混合物である。
水圧破砕：水圧破砕は、ガスおよび他の炭化水素の抽出を容易にするために岩層を破壊す
る方法である。本質的に、ガス担持層が特定されたら、ガスに近づくために、井戸が地中
で垂直および水平両方向に掘削される。その後、井戸は高圧水、砂および大量の化学物質
を使用して頁岩破壊に使用され、裂け目および亀裂が、水圧破砕完了後過負荷の強烈な重
荷により閉じられないように維持する。何百万ガロンもの水が井戸の水圧破砕に使用され
る。水圧破砕流体の３０％～７０％が表面に“逆流”して戻る。逆流は、塩を含む、水圧
破砕水に溶解されている何らかの物質を含む。何が溶解されているかは土地による。逆流
は、廃棄前に輸送および処理されるまで、井戸部位でプラスチック補強坑道に保持される
。ある時点で大流量および比較的低い塩分濃度水が、“逆流”水から区別される、小流量
であるが、はるかに高塩分濃度の“生産水”に変換される。
何れの場合も微生物誘起腐食(ＭＩＣ)の問題が存在する。特に興味深いのはＳＲＢであ
る。例えば、それ故に、システムは、水圧破砕系であり、流体は水圧破砕液体(例えば、
逆流水または生産水)であるかまたは処理する表面がこのような液体と接触している。方
法は、例えば、ＳＲＢ生存能を減少させ(例えば、液体中のＳＲＢを殺すおよび／または
ＳＲＢ増殖を減少させる)、第一宿主細胞はＳＲＢである。
例えば、第一宿主細胞は、アシドチオバシラス細菌、アシディチオバシラス・チオオキ
シダンス、フェロバチルス・フェロオキシダンス、チオバチルス・チオオキシダンス、チ
オバシラス・チオパルス、チオバシラス・コンクレチボラス、デスルフォビブリオ(例え
ば、サレキシゲンス、ブルガリス、デスルフリカンスまたはアフリカヌス)またはデスル
ホトマクルム(例えば、オリエンティスまたはニグリフィカンス)細胞またはこれらの２以
上の混合物種である。
冷却装置(例えば、冷却塔)：冷却塔のような冷却装置における細菌の存在は、いくつかの
経過で冷却機能に悪影響を与え得る。例えば、ＳＲＢは冷却塔、熱交換機などの壁に酸性
条件が形成されること促し、修復可能とはいえ、これが腐食および冷却システムのシャッ
トダウンの可能性を導く。さらに、例えば、熱交換機の壁のバイオフィルムは、熱交換機
の熱伝達係数を低下させ、冷却システムの動作効率低下をもたらす。
さらに、鉄含有要素の腐食は特に有害であり得る。鉄から鉄(II)への酸化および硫酸塩
から硫化物への還元とそれに続く鉄硫化物の沈殿およびその場での腐食性水素イオンの発
生がＳＲＢを経て起こり得る。硫酸還元細菌による鉄の腐食は急速であり、通常の錆付き
と異なり、自然制御的ではない。デスルフォビブリオにより産生される小瘤は二価鉄硫化
物の軟い黒色中心部を含み、黒色磁性酸化鉄と混合された赤色酸化三価鉄の外殻部からな
る。
例えば、それ故に、システムは冷却システムであり、流体はシステムに含まれる流体(
例えば、水または水溶液)であるかまたは処理する表面はこのような流体と接触している
冷却装置の表面である。例えば、第一宿主細胞はＳＲＢである(例えば、ここに開示する
何れかのＳＲＢ)。例えば、表面は鉄含有表面である。
例えば、第一宿主細胞はレジオネラ細胞である。このような種は、ヒト健康に有害であ
り、水冷却、加熱、加工または貯蔵装置で増殖する。例えば、それ故に、システムはこの
ような装置である。
パイプライン腐食：炭化水素および石油化学製品パイプラインは、しばしば細菌増殖を可
能とするのに十分な湿気を含み、例えば、ＳＲＢによるＭＩＣがもたらされる。ＭＩＣは
しばしば好気性細菌のバイオフィルムにより生じ、これは、嫌気性であって、パイプライ
ン内部表面と直接接触しているＳＲＢを保護する。これは酸条件および他の金属腐食条件
を形成し、パイプの局在化腐食および最終的故障に至る。
例えば、システムは、第一宿主細胞(例えば、ＳＲＢ)と接触している表面に含まれる装
置表面(例えば、パイプラインまたは掘削装置)を含む。例えば、システムは、原油、炭化
水素、石油化学製品(例えば、ディーゼルまたは石油)、ガスまたは水回収、加工、保存ま
たは輸送システムである。例えば、パイプラインは石油化学製品パイプラインである。例
えば、パイプラインは石油またはガス掘削装置である。例えば、パイプライン表面は海水
と接触する。例えば、パイプライン表面は石油化学流体、原油または天然ガスと接触する
。
廃水処理：廃水処理は、有機汚染物質除去のための廃水処理プラント下流への活性化スラ
ッジの添加を含む。それ故に、水が廃棄物処理施設で処理された後、多くの有機汚染物質
が存在し、これが細菌により“消化”され得る。それ故に、活性化スラッジを、廃水処理
施設からの廃水処理のためにタンク／コンテナの処理水に添加する。
しかしながら、タンク／コンテナ(活性化スラッジ、廃水自体または周囲環境何れに由
来するものであれ)における細菌は、極めて急速に支配し、増殖することがある。このよ
うな急速な増殖は、繊維状形態細菌増殖をもたらし得る。繊維は、タンクまたはコンテナ
の細菌集団の最大２０～３０％を構成でき、浮遊する。この繊維状増殖は、バルキングス
ラッジとして知られるものをもたらす。本発明は、廃水処理における重要な態様であるバ
ルキングスラッジ制御のために使用できる。
それ故に、例えば、システムは水処理システムであり、表面はシステムのコンテナの表
面であり、ここで表面は水と接触し、第一宿主細胞または処理する流体は該水および細胞
を含む。例えば、本方法は、廃水システムのスラッジにおける細菌増殖を制御する。
船舶および輸送：船および船舶は、海水または水路(例えば、川、湖、池または淡水)と接
触している外表面(例えば、船体)でＭＩＣを経験し得る。内部船体表面も、ＭＩＣ介在細
菌のような微生物を含み得る湿気または液体と接触している、例えば、バラスト水と接触
しているため、ＭＩＣの対象であり得る。例えば、海水はしばしば海での安定性を得るた
めに、船舶(例えば石油タンカー)の船体で運ばれ、このような海水はＳＲＢに介在できる
細菌を含む。原動機駆動輸送媒体(自動車、トラック、小型トラックまたは大型トラック)
、列車、航空機および航空機のような他の輸送媒体も感受性であり得る。
それ故に、例えば、システムは輸送媒体(例えば、物品および／または人間または家畜
輸送用、例えば、自動車、トラック、小型トラックまたは大型トラック、列車、航空機ま
たは航空機)である。例えば、媒体は船または船舶、例えば、石油、ガスまたは石油化学
製品船舶(例えば、石油タンカー)である。例えば、処理する表面は海水と接触する。例え
ば、表面は、船または船舶の外部表面である。例えば、表面は船または船舶の内部表面で
ある。
バラスト水における細菌持続または増殖(生物付着)：本発明の特定の適用は、ビブリオ・
コレラエ、エシェリキア・コリおよび／またはエンテロコッカスのような望ましくない細
菌を減少させるための海上輸送媒体(例えば、船または船舶)バラスト水の処理である。
船舶は、世界中の商品の９０％超を輸送し、約２０～３０億トンのバラスト水の世界的
輸送を担い、このバラスト水は船舶により安定性を維持するために日常的に輸送されてい
る。同等量のバラスト水がまた国内的に国の内でおよび地域内で毎年輸送されている(Glo
Ballast Partnerships, www.globallast.imo.org)。バラスト水は、自然に進化した生物
多様性(その重要性の認識は高まっている)を脅かす侵略的海生物の主要な供給源として認
識されている(Anil et al. 2002)。発生場所から輸送されるか輸送中に形成された意図的
ではない疾患原因病原性細菌の導入は、社会およびヒト健康に直接の影響を有し得る。船
舶バラストタンクは、種々の非土着脊椎動物、無脊椎動物、植物、微細藻類、細菌などを
維持する(Williams et al. 1988; Carlton and Geller 1993; Smith et al. 1996; Ruiz
et al. 2000; Drake et al. 2002, 2005, 2007; Mimura et al. 2005)。細菌のような微
生物が、外来環境に、高天然存在度、休止段階を形成する能力および広範な環境条件に耐
える能力により他の生物より多数で導入される。バラストタンクに搭載された全ての生物
が生存するわけではないが、細菌および微細藻類は、嚢胞、胞子または他の生理学的休止
段階の形成により、好ましくない条件で長期間十分生存できる(Roszak et al. 1983; Hal
legraeff and Bolch 1992; Anil et al. 2002; Carney et al. 2011)。放出されたら、こ
れらの微生物は受動的散布を容易にする小サイズおよび後生動物より単純な生存要件によ
り、侵略的であるのに適する(Deming 1997)。シンガポール港の船舶で試験されたバラス
トサンプルにおけるビブリオ種の細胞濃度は、１.１～３.９×１０４ml-１の範囲であっ
た(Joachimsthal et al. 2004)。意図的ではない疾患原因病原性細菌の導入は、ヒト健康
に対する影響を含め、直接の社会的影響を有し得る。先の研究において、チェサピーク湾
に導入された病原体の大部分は、水柱自体よりむしろプランクトンと関連する細菌に由来
することが判明した(Ruiz et al. 2000)。それ故に、細菌および古細菌のようなバラスト
水微生物が、バラスト水処理／管理プログラムにおける主要な懸念である。
国際海事機関(ＩＭＯ)は、２００４年の船舶のバラスト水および沈殿物の規制および管
理のための国際条約(バラスト水管理条約)に適合する、これらの有害な効果の帽子を目的
とした会議おｗ行った。米国において、米国水域におけるバラスト水排水に適用されるア
メリカ沿岸警備隊のバラスト水管理に対する最終規則が２０１２年７月に施行された。
海でのバラスト水交換は、バラスト水管理の理想的方法とは考えられておらず、処理方
法の開発に相当な努力がなされている。これらの方法は、ＩＭＯのバラスト水管理条約の
スタンダードＤ－２に従わなければならない。スタンダードＤ２は、処理および放出され
るバラスト水は
・最小寸法５０マイクロメートルの立方メートル以上あたり１０未満の生存可能生物
・最小寸法５０マイクロメートル未満または最小寸法１０マイクロメートルのミリリット
ル以上あたり１０未満の生存可能生物
でなければならないことを特定する。
さらに、スタンダードＤ２は、指標微生物の放出が次の特定濃度を超えてはならないこ
とを特定する。
・１００ミリリットルあたり１コロニー形成単位(cfu)未満または１グラム(湿重量)動物
プランクトンサンプルあたり１cfu未満の毒素性ビブリオ・コレラエ(Ｏ１およびＯ１３９
)
・１００ミリリットルあたり２５０cfu未満のエシェリキア・コリ
・１００ミリリットルあたり１００cfu未満の腸管腸球菌。
これらは、ヒト健康標準としての指標微生物であるが、これらのタイプに限定されない
。実際、事実上、ある場合使用するバラスト水処理使用は、事態を悪化させ得ることが示
唆されている。細菌を食する小生物の除去により、ある処理システムは、バラストタンク
を細菌インキュベーターに変え、それにより処理放出物が、一貫して高濃度の、ある試験
においては、未処理であった放出物より１０００倍高い、細菌を放出する。増加した細菌
にはヒト病原体が含まれ得る。
本発明の例えば(例えば態様７０または態様７０に従属する態様による)、それ故に、シ
ステムは船または船舶または海上輸送媒体である(例えば、船または船舶、例えば、港、
ドックまたは海での石油タンカー)。例えば、第一宿主細胞を含む流体は船または船舶海
上輸送媒体のバラスト水である(例えば、船または船舶バラスト水、例えば、石油タンカ
ーバラスト水)。例えば、システムは、例えば、海での海上コンテナまたはプラットフォ
ームまたは掘削装置(例えば、石油またはガス掘削装置)である。例えば、流体は、このよ
うなコンテナ、プラットフォームまたは掘削装置のバラスト水である。
ある実施態様において、有害細菌(本発明、例えば、態様７０または態様７０に従属す
る態様による第一宿主細胞)は、ビブリオ・コレラエ、ビブリオ・ルモイエンシス、ビブ
リオ属、エシェリキア・コリ、エンテロコッカス属、シュードモナス・シンキサンタ、シ
ュードモナス・スツッツェリ、ビブリオ・レンタス、シュードアルテロモナス・マリナ、
シュードアルテロモナス・テトラオドニス、シュードアルテロモナス属、シュードモナス
・プチダ、シュードモナス・オレオボランス、ビブリオ・スプレンディドゥス、ビブリオ
・サイクリトロフィカス、エンテロコッカス・ヒラエ、エンテロコッカス・フェシウム、
ビブリオ・ロティフェリ アヌス、シュードアルテロモナス・ウンディナ、セラチア・プ
リムシカ、シュードモナス・フルバ、シュードモナス・トラシー、シュードモナス・スツ
ッツェリ、シュードモナス・スツッツェリ、ビブリオ・ツビアシイ、ハロモナス・ベヌス
タ、イディオマリナ・ロイヒエンシス、ビブリオ・サイクリトロフィカス、ビブリオ・ツ
ビアシイ、セラチア・プリムシカ、シュードアルテロモナス属、シュードアルテロモナス
・アトランティカ、シュードモナス・シンキサンタ、シュードモナス・スツッツェリ、シ
ュードアルテロモナス・カーラゲーノボラ、テナシバキュラム属、バチルス・ミコイデス
、ビブリオ・ナトリージェンス、バチルス・ベキュリュンゲンシス、エンテロコッカス・
ヒラエ、ラクトバチルス・ペントーサス、シュードアルテロモナス・カーラゲーノボラお
よびシュードモナス・エルジノーサからなる群から選択される種のものである。
例えば、第一宿主細胞は好気性従属栄養性細菌である。例えば、第一宿主細胞はビブリ
オ・コレラエ細胞(例えば、株Ｏ１および／またはＯ１３９)である。例えば、第一宿主細
胞はエシェリキア・コリ細胞である。例えば、第一宿主細胞はエンテロコッカス属細胞で
ある。
“Characterization of Bacteria in Ballast Water Using MALDI-TOF Mass Spectrome
try”, Kaveh E et al, PLoS One. 2012; 7(6): e38515; Published online 2012 Jun 7.
doi: 10.1371/journal.pone.0038515(引用によりここに包含させる)は、バラスト水中
の細菌のモニタリングのための適当な迅速かつ費用効果の高い方法を開示する。
本発明の特定の例は次のとおりである。
船または船舶のバラスト水における細菌生物付着を制御する方法であって、ここで水は
該生物付着に介在する第一微生物種(例えばコレラ、エシェリキア・コリまたはエンテロ
コッカス)の第一宿主細胞の集団を含み、方法は
(ｉ)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させ、各ベ
クターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、それによりＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞に導入さ
れ、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細胞の
配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)各ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標
的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリ
ダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり；そして
(ii)宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡを発現させ、それにより宿主細胞において
標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の減少および該生物付着の制御をもたらす
ことを含む。
例えば、工程(ｉ)が、例えば、船または船舶の船体において、バラスト水とベクターを
混合することを含む。
例えば、船または船舶が海上輸送媒体であり、水が海水である。船または船舶の代わり
に、代替法において、バラスト水が海でのコンテナまたは掘削プラットフォーム、例えば
、石油プラットフォームまたは石油掘削装置に含まれる。
本発明はまた船または船舶からバラスト水を放出する方法であって、ここで放出バラス
ト水が上記具体例の方法により処理された水を含む。例えば、水は、水塊、例えば、海、
大洋または水路(例えば、川、運河、湖または貯水池)に放出される。
本発明はまたＣＲＩＳＰＲアレイを含む船または船舶バラスト水も含み、ここでバラス
ト水は、上記具体例により得るまたは得られる。本発明はまたＣＲＩＳＰＲアレイを含む
海上コンテナバラスト水も含み、ここでバラスト水は、上記具体例により得るまたは得ら
れる。本発明はまた海のプラットフォームまたは掘削装置(例えば、石油またはガス掘削
装置)のバラスト水であって、ＣＲＩＳＰＲアレイを含む水も含み、ここでバラスト水は
、上記具体例により得るまたは得られる。アレイは、具体例の(ａ)および(ｂ)に記載のと
おりである。
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本発明はまた次のベクターおよびＣＲＩＳＰＲアレイも提供する。
８５. 細菌宿主細胞へのＣＲＩＳＰＲアレイ導入のためのベクターであって、ここで細菌
は水系伝染が可能であり、ここで
(ａ)ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための配列および該宿主細胞における配列
の転写のためのプロモーターを含み；
(ｂ)ｃｒＲＮＡは、宿主細胞にＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイドし、標的配
列の修飾(例えば、標的配列の切断)のために宿主細胞標的配列とハイブリダイズでき、標
的配列は宿主細胞生存能介在のためのヌクレオチド配列(例えば、遺伝子または制御配列)
であり；
(ｃ)ここで(ａ)の配列はｃｒＲＮＡの発現および産生のために配列Ｒ１－Ｓ１－Ｒ１’を
含み、ここでＲ１は第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１’は第二ＣＲＩＳＰＲ反復であり
、Ｒ１またはＲ１’は任意であり、Ｓ１は宿主細胞標的配列と８０％以上同一(例えば、
８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％または１００％同一)であるヌクレオチド配列を含むまたはこれからなる第一ＣＲ
ＩＳＰＲスペーサーである、
ベクター。
“水系伝染”は、該細菌の細胞が、水または水溶液中で、異なる生物間、生物内、異な
る環境間または生物と環境間で拡散できることをいう。例は、ビブリオ・コレラエ、エン
テロコッカス属およびエシェリキア・コリである。ビブリオ・コレラエは、極性鞭毛を有
するグラム陰性コンマ形細菌である。ガンマプロテオバクテリアの綱に属する。主要な２
生物型のビブリオ・コレラエ、古典的およびＥｌ Ｔｏｒおよび多数の血清型がある。ビ
ブリオ・コレラエは、小腸の重篤な細菌感染であり、開発途上国での主要な死亡原因であ
るコレラの病原学的因子である。ビブリオ・コレラエの病原性遺伝子は、ビブリオ・コレ
ラエ感染の検出および研究のための興味深い標的である。これらの遺伝子の大部分は、プ
ロファージ１,２として組織かされる、ＴＣＰ(毒素同時制御線毛)およびＣＴＸ(コレラ毒
素)と名づけられる二つの病原性島に位置する。ＴＣＰは、線毛を経る宿主接着に関与す
る遺伝子の集合を含み、一方ＣＴＸ遺伝子はコレラ毒素３の合成に関与する。
ある実施態様において、ベクターは単離ベクター(すなわち、該宿主細胞中にないベク
ター)である。例えば、ベクターは改変されたまたは合成ベクター(すなわち、天然に存在
しないベクター)である。
例えば、アレイはＩＣＰ１アレイ、すなわち、ＩＣＰ１ビブリオ・コレラエファージの
アレイであり、例えば、ここでファージはＩＣＰ１＿２００３＿Ａ、ＩＣＰ１＿２００４
＿Ａ、ＩＣＰ１＿２００５＿Ａ、ＩＣＰ１＿２００６＿ＥまたはＩＣＰ１＿２００１１＿
Ａである。例えば、アレイはＣＲ１またはＣＲ２ ＩＣＰ１ファージアレイ、例えば、こ
のようなアレイの改変されたまたは天然に存在しない誘導体である。
例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイおよびＣａｓはタイプ１－Ｅまたはタイプ１－Ｆ、例えば
、サブタイプシステム１７である。
例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイは、各々が各ｃｒＲＮＡの発言のためであり、該宿主細胞
における配列の転写のためのプロモーターと結合している複数の配列を含む。
例えば、ベクターまたは各ベクターは、複数(例えば、２、３、４、５、６、７、８、
９、１０以上)の該ＣＲＩＳＰＲアレイを含む。
例えば、ベクターは該Ｃａｓをコードするヌクレオチド配列を含む。
他の例において、ベクターはこのような配列を欠く。例えば、この場合、アレイは宿主
細胞により産生される１以上のＣａｓと共に動作可能である。
８６. 該細胞がビブリオ・コレラエ、エンテロコッカスまたはエシェリキア・コリ細胞で
ある、態様８５のベクター。
８７. ベクターが該Ｃａｓ発現可能なヌクレオチド配列を欠く、態様８５または８６のベ
クター。
例えば、それ故に、ベクターはＣａｓヌクレアーゼをコードしない。別法では、ベクタ
ーは該Ｃａｓをコードする。
８８. 標的配列が１７～４５連続ヌクレオチド、例えば、１８、１９、２０または２１連
続ヌクレオチドのプロトスペーサー配列である、態様８５、８６または８７のベクター。
例えば、各スペーサー(Ｓ１)は１７～４５連続ヌクレオチド、例えば、１８、１９、２
０、２１、３０、３１、３２または３３連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。ビ
ブリオ・コレラエＰＬＥのプロトスペーサー配列は、例えば、３２連続ヌクレオチドであ
り、これをターゲティングするベクターは、例えば、３２ヌクレオチドＰＬＥ配列と１０
０％または少なくとも８０％、９０％または９５％同一である３２連続ヌクレオチドのス
ペーサー配列を有する。ベクターが複数のスペーサーを含むとき、スペーサーは異なるス
ペーサーの混合物であっても同一スペーサーであってもよい。例えば、アレイは複数のス
ペーサーを含み、ここでスペーサーのサブセットは同一である。同一スペーサーは、例え
ば、宿主細胞の病原性因子をコードする遺伝子のプロトスペーサー配列と相同であり得る
。複数スペーサーの使用は、宿主が、ベクターが細胞内にあれば、スペーサーの１以上を
切断するならば有利であり得る － 未切断スペーサーはなおｃｒＲＮＡを形成し、標的
配列に誘導されることが可能である。ベクターまたはアレイにおける異なるスペーサーの
混合物の使用は、宿主の侵入ベクターへの適応のリスクを最小化し、それにより耐性を最
小化するために有利である。
８９. 標的配列が病原性、耐性または必須遺伝子配列である、態様８５～８８の何れかの
ベクター。例えば、標的配列はＰＩＣＩ様要素(ＰＬＥ)、例えば、ビブリオ・コレラエＰ
ＬＥの配列である。例えば、ＰＬＥ１。
９０. 標的配列が病原性島配列であり、所望によりここで宿主細胞がビブリオ・コレラエ
細胞であり、標的配列がＴＣＰ、ＣＴＸまたはＶＰＩ配列である、態様８５～８９の何れ
かのベクター。例えば(例えば、ここで宿主はビブリオである)病原性島は、ＴＣＰ(毒素
同時制御線毛)またはＣＴＸ(コレラ毒素)である。ビブリオ病原性島(ＶＰＩ)は、毒素同
時制御線毛(ＴＣＰ)の製造に主に含まれる遺伝子を含む。これは、２反復領域(ａｔｔ様
部位)に隣接された大遺伝要素(約４０kb)であり、構造はファージゲノムを模倣する。Ｖ
ＰＩは２遺伝子クラスター、ＴＣＰクラスターおよびＡＣＦクラスターを、いくつかの他
の遺伝子と共に含む。ａｃｆクラスターはａｃｆＡＢＣＤの４遺伝子からなる。ｔｃｐク
ラスターはｔｃｐＡＢＣＤＥＦＨＩＪＰＱＲＳＴおよび制御遺伝子ｔｏｘＴの１５遺伝子
からなる。
９１. 宿主細胞がビブリオ・コレラエであり、標的配列がＣＴＸφ遺伝子配列である、態
様８５～９０の何れかのベクター。コレラ毒素の遺伝子は、ビブリオ・コレラエゲノムに
挿入された溶原バクテリオファージであるＣＴＸファイ(ＣＴＸφ)により運搬される。Ｃ
ＴＸφは、コレラ毒素遺伝子をあるビブリオ・コレラエ株から別の株に伝達でき、水平遺
伝子伝達の一つの形態である。毒素同時制御線毛の遺伝子はＶＰＩ病原性島(ＶＰＩ)によ
りコードされる。
９２. 宿主細胞がビブリオ・コレラエであり、標的配列がｃｔｘＢ、ｔｃｐＡ、ｃｔｘＡ
、ｔｃｐＢ、ｗｂｅｔ、ｈｌｙＡ、ｈａｐＲ、ｒｓｔＲ、ｍｓｈＡまたはｔｃｐＰ配列で
ある、態様８５～９０の何れかのベクター。
９３. 標的配列が１７～４５連続ヌクレオチド(例えば、１８、１９、２０または２１連
続ヌクレオチド)であり、グラム陽性細菌のファージ誘導可能染色体島(ＰＩＣＩ)、例え
ば、スタフィロコッカス・アウレウス病原性島(ＳａＰＩ)の配列と少なくとも８０％(例
えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％または１００％同一)同一である、態様８５～９２の何れかのベクター。Ｉ
ＣＰ１ファージ(別名ＩＣＰ１関連ファージ)スペーサー配列の例を下に提供する。これら
のスペーサー配列は、ビブリオ・コレラエにおける標的配列(プロトスペーサー配列)と相
同である。
９４. 宿主細胞がビブリオ・コレラエであり、ｃｒＲＮＡがビブリオ・コレラエ細胞にお
けるプロトスペーサー隣接モチーフ(ＰＡＭ)の５、４または３ヌクレオチド内の標的配列
とハイブリダイズ可能であり、ここでＰＡＭがＧＡである、態様８５～９３の何れかのベ
クター。
９５. 宿主細胞がビブリオ・コレラエであり、細胞がＥｌ Ｔｏｒ、Ｏ１またはＯ１３９
ビブリオ・コレラエ細胞である、態様８５～９４の何れかのベクター。例えば、ビブリオ
・コレラエは血清型Ｏ１ Ｅｌ Ｔｏｒ Ｎ１６９６１、Ｅｌ Ｔｏｒ生物型１８または
Ｅｌ Ｔｏｒ株ＭＪ－１２３６である。例えば、宿主細胞はエシェリキア・コリＯ１５７
：Ｈ７細胞である。
９６. ベクターが該宿主細胞に感染可能であるバクテリオファージである、態様８５～９
５の何れかのベクター。例えば、宿主細胞はエシェリキア・コリであり、ファージはラム
ダまたはＴ４ファージである。例えば、宿主細胞はエンテロコッカス細胞であり、ファー
ジはエンテロコッカスファージＩＭＥ－ＥＦ１、ファイＥＦ２４Ｃ、ψＥｆ１またはＥＦ
ＤＧ１である(Appl Environ Microbiol. 2015 Apr;81(8):2696-705. doi: 10.1128/AEM.0
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therapy”, Khalifa L et al参照)。
９７. 宿主細胞がビブリオ・コレラエであり、ベクターがビブリオ・コレラエ細胞に感染
できるバクテリオファージである、態様９６のベクター。
９８. バクテリオファージがＣＴＸφ、ＩＣＰＩファージおよびミオウイルスから選択さ
れ、例えば、ここでファージがＩＣＰ１＿２００３＿Ａ、ＩＣＰ１＿２００４＿Ａ、ＩＣ
Ｐ１＿２００５＿Ａ、ＩＣＰ１＿２００６＿ＥまたはＩＣＰ１＿２００１１＿Ａであり、
所望により改変されたおよび天然に存在しないファージ、態様９７のベクター。
９９. ベクターがＩＣＥであるまたはそれを含む、例えば、トランスポゾンである、態様
８５～９８の何れかのベクター。ＩＣＥは、ここに記載するＩＣＥの特性の何れかを含み
得る。
１００. トランスポゾンが第一から第二該宿主細胞に伝達可能である接合性トランスポゾ
ンである、態様９９のベクター。
１０１. トランスポゾンが第一細胞にＣＲＩＳＰＲアレイのコピーを残す、態様９９また
は１００のベクター。
１０２. 本または各アレイが各可動遺伝要素(ＭＧＥ)に含まれ、ここでＭＧＥが宿主細胞
において動作可能な伝達起点(ｏｒｉＴ)を含む、態様８５～１０１の何れかのベクター。
ＭＧＥは、ここに記載する任意のＭＧＥに従い得る。
１０３. ベクターが改変されたベクターである、態様８５～１０２の何れかのベクター。
１０４. 態様８５～１０３の何れかの複数のベクターを含む、水または食品処理組成物。
例えば、水はバラスト水、海水、半鹹水、淡水、飲料水、水路水(例えば、河口半塩水)
または工業用水である。例えば、水は、ヒトＧＩ管流体における水である。
例えば、宿主細胞は甲殻類、魚類、米または穀物に含まれる。例えば、組成物は食品処
理のためであり、宿主細胞はエシェリキア・コリＯ１５７：Ｈ７細胞である。例えば、標
的配列は、エシェリキア・コリ(例えば、Ｏ１５７：Ｈ７)宿主細胞における志賀毒素をコ
ードする配列である。ここまで記載してきた水系種の代替として、宿主細胞はサルモネラ
またはリステリア細胞である。
１０５. 態様８５～１０３の何れかの複数のベクターを含む、ヒトにおけるビブリオ・コ
レラエ感染の処置または予防用医薬。代替として、本発明は、複数の本発明のベクターを
含む、ヒトにおけるエシェリキア・コリ感染の処置または予防用医薬を提供する。代替と
して、本発明は、複数の本発明のベクターを含む、ヒトにおけるエンテロコッカス感染の
処置または予防用医薬を提供する。
１０６. さらに抗宿主細胞抗生物質または抗宿主細胞殺生物剤を含む、態様１０４または
１０５の組成物または医薬。
下記例５はコレラに関する例である。
一般的特性の何れか(下記参照)も、本形態に適用し得る(第六形態)。下記のあらゆる形
態を本形態と組み合わせ、例えば、ここに請求する１以上の特性の組み合わせを提供する
ことができる。
ＣＡＳ活性制御
本発明のこれらの態様は、例えば、細胞またはインビトロで、Ｃａｓ活性を制御するの
に有用である。本発明は、Ｃａｓコード化遺伝子のＣａｓ活性を制限するためのターゲテ
ィングに関し、これは、Ｃａｓの一過性制御に有益である。本発明はまた、例えば、細胞
の修飾ゲノムにおける標的外Ｃａｓ切断の機会を減らすための、高いストリンジェンシー
が望ましい設定でも有用であり得る。適用は、例えば、細胞または細胞を含む組織または
生物の遺伝子治療または遺伝子ターゲティングのために、標的外効果が最小化または排除
されなければならない、例えば、ヒト、動物または植物細胞の修飾における。例えば、極
めて高いストリンジェンシーが、Ｃａｓ修飾をヒトにおける遺伝子治療または疾患もしく
は状態の処置もしくは予防のために患者に投与されるヒト細胞(例えば、ｉＰＳ細胞)の所
望の変更に使用されるとき、必要である。本開示は、本発明の方法および製品の一部とし
てこれらの適用を提供する。
本発明は、故に、次の各項を提供する。
１. 第一Ｃａｓをコードする発現可能な遺伝子を修飾する方法であって、
(ａ)ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ１)とＣａｓ遺伝子を、該遺伝子から発現される第一Ｃａｓの
存在下で合わせ、そして
(ｂ)ｇＲＮＡ１を該Ｃａｓ遺伝子の配列(例えば、そのプロモーターまたは第一Ｃａｓコ
ード化ＤＮＡ配列)とハイブリダイズさせて、第一Ｃａｓを遺伝子にガイドさせ、それに
よりＣａｓがＣａｓ遺伝子を修飾する
ことを含む、方法。
例えば、方法はインビトロでの無細胞方法(例えば、リコンビニアリング方法)である。
他の例において、方法は細胞で実施され、例えば、ここで遺伝子はそれ自体コードするＣ
ａｓにより切断される(すなわち、内在性Ｃａｓが遺伝子切断に使用される)。
２. Ｃａｓがヌクレアーゼであり、Ｃａｓ遺伝子が切断される、項１の方法。
３. Ｃａｓ遺伝子が変異、下方制御または不活性化されている、項１または２の方法。
４. 第一ＣａｓがＣａｓ９である、項１～３の何れかの方法。
５. ｇＲＮＡ１が単一ガイドＲＮＡである、項１～４の何れかの方法。
６. 方法が宿主細胞内で実施される、項１～５の何れかの方法。
７. 該細胞が原核細胞、例えば、細菌または古細菌細胞(例えば、エシェリキア・コリ細
胞)である、項６の方法。
８. 方法がリコンビニアリング方法である、項６の方法。
９. 該細胞がヒトまたは非ヒト動物病原体種または株(例えば、スタフィロコッカス・ア
ウレウス)である、項６、７または８の方法。
１０. 該細胞がヒトマイクロバイオーム種、例えば、ヒト腸マイクロバイオーム種の細胞
である、項６～９の何れかの方法。
１１. Ｃａｓ遺伝子が宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに含まれる、項６～１０の何れ
かの方法。
所望により外来性第一Ｃａｓコード化配列は、例えば宿主細胞がｇＲＮＡ１と同族であ
る野生型内在性Ｃａｓヌクレアーゼを含むとき、方法において使用されない。
１２. 該細胞が真核細胞(例えば、ヒト、非ヒト動物、酵母または植物細胞)である、項６
の方法。
１３. 方法が非ヒト胚、非ヒト接合体、非ヒト生殖細胞またはヒトまたは動物(例えば、
ここで方法は美容的方法)で実施され、所望によりここで方法が手術または治療によりヒ
トまたは動物を処置するもしくは診断のための方法ではない、項１２の方法。
１４. Ｃａｓ遺伝子が工程(ａ)において細胞に導入される核酸に含まれる、項６～３の何
れかの方法。
１５. 核酸ベクターによる形質転換に対する宿主細胞耐性発現の減少または宿主細胞にお
ける核酸ベクターの維持のための、項６～４の何れかの方法。
１６. ヒトまたは動物の治療、予防または診断のための、項１～１５の何れかの方法また
はその核酸または細胞産物(例えば、方法をヒトまたは動物細胞実施するときヒトまたは
動物、ヒトまたは動物細胞の遺伝子治療のためまたは方法を細菌細胞で実施するときヒト
または動物における細菌感染処置または予防のため)。
１７. 方法がインビトロで実施される、項１～６の何れかの方法。
１８. 方法がインビボで実施され、所望によりヒト胚においてではなく、所望によりここ
で方法が手術または治療によりヒトまたは動物を処置するもしくは診断のための方法では
ない、項１～１６の何れかの方法。
１９. ｇＲＮＡ１が工程(ａ)におけるＣａｓ遺伝子と組み合わさった第一核酸からの転写
により産生される、項１～１８の何れかの方法。
２０. 方法が細胞で実施され、ｇＲＮＡ１をコードする第一核酸が工程(ａ)において細胞
に導入されるかまたはｃｒＲＮＡをコードする第一核酸が工程(ａ)において細胞に導入さ
れ、ここでｃｒＲＮＡが細胞におけるｔｒａｃｒＲＮＡとｇＲＮＡ１を形成する、項１９
の方法。
２１. Ｃａｓ遺伝子が第一Ｃａｓにより修飾される標的部位(ＣＳ－ｔ)を含む標的核酸と
組み合わされ、ここで
Ｉ. Ｃａｓ遺伝子が第一Ｃａｓと同族であるＰＡＭ(Ｐ１)に隣接する第一プロトスペーサ
ー(ＰＳ１)を含み、ここでＰＳ１が第一Ｃａｓにより第一部位(ＣＳ１)で修飾(例えば、
切断)され；
II. ｇＲＮＡ１が第一ＣａｓのガイドのためにＰＳ１と相補性である配列を含み、ここで
ＰＳ１が工程(ｂ)においてＣＳ１で修飾され；
III. 標的核酸がＰＡＭ(Ｐ－ｔ)に隣接するプロトスペーサー配列(ＰＳ－ｔ)を含み、こ
こでＰ－ｔは第一Ｃａｓと同族であり；
IV. 工程(ｂ)の前または間に、方法はガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ－ｔ)と標的核酸および該遺
伝子により発現される第一Ｃａｓを接触させることを含み、ここでｇＲＮＡ－ｔはＰＳ－
ｔとハイブリダイズし、第一ＣａｓをＣＳ－ｔの修飾のためにガイドし；そして
Ｖ. 方法は、所望により修飾標的核酸の単離または配列決定を含む、
項１９または２０の方法。
２２. ｇＲＮＡ－ｔが工程IVにおいてＣａｓと組み合わされる核酸(例えば、該第一核酸)
からの転写により産生される、項２１の方法。
２３. 方法が細胞で実施され、核酸がｃｒＲＮＡをコードし、ここでｃｒＲＮＡが細胞に
おいてｔｒａｃｒＲＮＡを有するｇＲＮＡ－ｔを形成する、項２２の方法。
２４. ｇＲＮＡ１の製造がｇＲＮＡ－ｔの製造後に開始され、それによりＰＳ１が第一Ｃ
ａｓ発現の下方制御または不活性化のために修飾(例えば、切断)される前に、ＰＳ－ｔが
標的核酸のコピーにおいて修飾(例えば、切断)される、項２１～２３の何れかの方法。
２５. さらに切断標的核酸とさらなる核酸を合わせることを含み、それにより核酸間の相
同指向組換えが起こり、そして
(ｉ)標的核酸のヌクレオチド配列が削除され；
(ii)さらなる核酸のヌクレオチド配列が削除され；
(iii)標的核酸のヌクレオチド配列がさらなる核酸に挿入され；および／または
(iv)さらなる核酸のヌクレオチド配列が標的核酸に挿入される、
項１～２４の何れかの方法。
２６. (ｉ)が起こり、それにより標的核酸のヌクレオチド配列または調節要素が不活性化
される、項２５の方法。
２７. (ｉ)が起こり、それにより標的核酸のヌクレオチド配列または調節要素が活性化さ
れる、項２５の方法。
２８. (ii)が起こり、それによりさらなる核酸のヌクレオチド配列または調節要素が不活
性化される、項２５、２６または２７の方法。
２９. (ii)が起こり、それによりさらなる核酸のヌクレオチド配列または調節要素が活性
化される、項２５、２６または２７の方法。
３０. (iii)が起こり、所望により挿入配列をさらなる核酸の調節要素と機能的相関させ
および／または新規マーカー配列を作る、項２５～２９の何れかの方法。
３１. (iv)が起こり、所望により挿入配列を標的核酸の調節要素と機能的相関させおよび
／または新規マーカー配列を作る、項２５～３０の何れかの方法。
３２. さらに相同指向組換えが生じていることを決定するために新規マーカー配列または
その発現産物を検出することを含む、項３０または３１の方法。
３３. さらに標的核酸産物、さらなる核酸産物および／または第一ベクター産物の単離ま
たは配列決定を含む、項２１～３２の何れかの方法。
３４. 第一ベクターが項３５～５５の何れかに定義されている、項１～３３の何れかの方
法。
３５. 例えば、項１の方法における使用のための、第一(例えば、単離)核酸ベクターまた
はベクターの組み合わせであって、ここで
(ａ)第一ベクターまたは該組み合わせのベクターは、第一Ｃａｓをガイドして、第一部位
(ＣＳ１)で予定したプロトスペーサー配列(ＰＳ１)を修飾するためにＰＳ１と相補性であ
るガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ１、例えば、単一ｇＲＮＡ)を含み、ここでＰＳ１は第一Ｃａｓ
と同族であるＰＡＭ(Ｐ１)に隣接するかまたは発現可能な配列はｔｒａｃｒＲＮＡとｇＲ
ＮＡ１を形成するｃｒＲＮＡをコードし；そして
(ｂ)ＰＳ１およびＰ１は発現可能な第一Ｃａｓコード化遺伝子の配列であり、ＰＳ１は第
一ＣａｓによりＣＳ１で修飾され得る。
何れかの形態におけるここでの各ベクターは、特定の配列を運搬する直線状または環状
(例えば、閉鎖環状、所望によりスーパーコイル)ＤＮＡであり得る。
３６. 第一Ｃａｓがヌクレアーゼであり、ここでＣＳ１がヌクレアーゼにより切断可能で
ある、項３５のベクターまたは組み合わせ。
３７. 第一ＣａｓがＣａｓ９である、項３５または３６のベクターまたは組み合わせ。
３８. ｇＲＮＡ１が単一ガイドＲＮＡである、項３５～３７の何れかのベクターまたは組
み合わせ。
３９. ヌクレオチド配列が、ｇＲＮＡ１産生のために原核細胞(例えば、細菌または古細
菌細胞)において発現可能である、項３５～３８の何れかのベクターまたは組み合わせ。
４０. 項３９のベクターまたは組み合わせを含む、リコンビニアリングキット(例えば、
ここで該細胞はリコンビニアリング許容エシェリキア・コリ細胞である)。
４１. ヌクレオチド配列がｇＲＮＡ１産生のために真核細胞(例えば、ヒト、動物、植物
または酵母細胞)で発現可能である、項３５～３８の何れかのベクターまたは組み合わせ
。
４２. 第一ベクターまたは該組み合わせのベクター(例えば、第二ベクター)が第一Ｃａｓ
をガイドし、ＰＳ－ｔを修飾(例えば、切断)するために標的核酸の予定したプロトスペー
サー配列(ＰＳ－ｔ)と相補的であるガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ－ｔ、例えば、単一ｇＲＮＡ)
をコードする発現可能なヌクレオチド配列を含むまたは発現可能な配列がｔｒａｃｒＲＮ
Ａと共にｇＲＮＡ－ｔを形成するｃｒＲＮＡをコードし、標的核酸がＰＡＭ(Ｐ－ｔ)に隣
接するＰＳ－ｔをコードし、ここでＰ－ｔはＰＳ－ｔ修飾のために第一Ｃａｓと同族であ
る、項３５～４１の何れかのベクターまたは組み合わせ。
４３. さらに該標的核酸と組み合わされる、項４２のベクターまたは組み合わせ。
４４. 該標的核酸が細胞の染色体またはエピソーム核酸である、項４３のベクターまたは
組み合わせ。
４５. 該細胞がヒトまたは非ヒト動物病原体種または株の細胞(例えば、スタフィロコッ
カス・アウレウス)である、項４４のベクターまたは組み合わせ。
４６. 該細胞がヒトマイクロバイオーム種、例えば、ヒト腸マイクロバイオーム種の細胞
である、項４４または４５のベクターまたは組み合わせ。
４７. ＰＳ－ｔが細胞(例えば、原核細胞)の必須遺伝子、病原性遺伝子または抗生物質耐
性遺伝子配列に含まれる、項４４～４６の何れかのベクターまたは組み合わせ。
４８. 遺伝子が、第一ＣａｓがＰＳ－ｔを修飾(例えば、切断)したとき、下方制御または
不活性化される、項４７のベクターまたは組み合わせ。
４９. 遺伝子が、第一ＣａｓがＰＳ－ｔを修飾したとき上方制御または活性化される、項
４７のベクターまたは組み合わせ。
５０. 第一Ｃａｓをコードする該遺伝子と組み合わされる(例えば、第一ベクターに含ま
れる)、項３５～４９の何れかのベクターまたは組み合わせ。
５１. 細胞内にあるときの項３５～５０の何れかのベクターまたは組み合わせであって、
ここで該細胞が第一Ｃａｓをコードする該遺伝子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを
含む。
５２. ヒトまたは非ヒト動物における疾患または状態の処置、予防または診断のための、
例えば、方法をヒトまたは動物細胞で実施するときヒトまたは動物、ヒトまたは動物細胞
の遺伝子治療のためまたは方法を細菌細胞で実施するときヒトまたは動物における細菌感
染処置または予防のための、項３５～５１の何れかのベクターまたは組み合わせ。
５３. 項３５～５２の何れかの第一ベクターまたは組み合わせを含む、食糧、食品成分ま
たは前駆体成分、飲料、水(例えば、ヒト消費用が意図される)、工業用または環境物質(
例えば、石油、石油製品、土壌または水路または貯留槽または石油、石油製品、土壌、水
、食糧、食糧成分または前駆体または飲料または飲料成分の前駆体回収または加工用装置
)。
５４. 項３５～５２の何れかの第一ベクターまたは組み合わせを含む、抗生物質(例えば
、抗細菌または抗古細菌)組成物。
５５. 項３５～５２の何れかの第一ベクターまたは組み合わせを含む、ヒトまたは動物に
おける疾患または状態(例えば、細菌感染または肥満)処置または予防のための医薬。
例えば、ベクター、組み合わせ、医薬または抗生物質は医薬デバイスまたは医薬容器(
例えば、シリンジ、吸入器またはIVバッグ)に含まれる。
一般的特性の何れか(下記参照)も、本形態に適用し得る。下記のあらゆる形態は、本形
態と組み合わせ可能であり、例えば、ここで請求する１以上のものに包含させるための特
性の組み合わせを提供する。
一般に適用可能な特性
次の特性を、本発明のあらゆる形態(例えば、その態様、実施態様、コンセプト、段落
または例の何れか)に適用する。
例えば、標的配列は染色体配列、内在性宿主細胞配列、野生型宿主細胞配列、非ウイル
ス染色体宿主細胞配列であり、外来性配列および／または非ファージ配列ではなく(すな
わち、これらの１以上または全て)、例えば、配列は宿主細胞染色体に含まれる抗生物質
耐性遺伝子または必須遺伝子配列のような野生型宿主染色体細胞配列である。例えば、配
列は宿主細胞プラスミド配列、例えば、抗生物質耐性遺伝子配列である。
例えば、少なくとも２標的配列、例えば抗生物質耐性遺伝子および必須遺伝子がＣａｓ
により修飾される。この方法での複数ターゲティングは、回避変異体宿主細胞の進化を減
らすのに有用であり得る。
例えば、Ｃａｓは野生型内在性宿主細胞Ｃａｓヌクレアーゼであり、／または各宿主細
胞は野生型宿主細胞である。それ故に、ある実施態様において、本発明は、関連するＣａ
ｓ活性を提供するために、まず内在性Ｃａｓを抑制解除する必要なく、宿主細胞を使用す
る。例えば、各宿主細胞は構成的Ｃａｓヌクレアーゼ活性、例えば、構成的野生型Ｃａｓ
ヌクレアーゼ活性を有する。例えば、宿主細胞は細菌細胞であり、他の例において、宿主
細胞は古細菌細胞である。内在性Ｃａｓの使用は、ＨＭ－またはＰＭ－ｃＲＮＡまたはｇ
ＲＮＡをコードするベクターのための空間の解放を可能とするため、有利である。例えば
、タイプII Ｃａｓ９ヌクレオチド配列は大きく、代わりの宿主細胞の内在性Ｃａｓの使
用は、タイプII ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが本発明において宿主細胞修飾のために
使用されるとき、有利である。４.２キロベース(kb)の寸法である、最も一般的に用いら
れるＣａｓ９はストレプトコッカス・ピオゲネス由来である。効率的なヌクレアーゼでは
あるが、分子の長さにより、どの程度の遺伝子材料をベクターが収容できるかの制限が付
され、生存動物の組織およびここに記載する他の設定におけるＣＲＩＳＰＲの使用の障壁
を作る(F.A. Ran et al., “In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas
9,” Nature, doi:10.1038/nature14299, 2015参照)。それ故に、ある実施態様において
、本発明のベクターはＡＡＶベクターであるかまたはＡＡＶベクターを超えない外来性Ｄ
ＮＡ挿入容量を有し、Ｃａｓは宿主細胞の内在性Ｃａｓであり、ここで該細胞は細菌また
は古細菌細胞である。
ストレプトコッカス・サーモフィルスＣａｓ９(UniProtKB - G3ECR1(CAS9_STRTR))ヌク
レオチド配列は１.４kbのサイズを有する。
ある実施態様において、それ故に、本発明は
１.４kbを超えるまたは４.２kbを超えるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの要素をコード
する外来性ＤＮＡ配列を含む核酸ベクターを提供し、ここで配列は、宿主細胞(ここでの
あらゆる細胞、例えば、ヒト、動物または細菌または古細菌宿主細胞)における１以上の
ＨＭ－またはＰＭ－ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡの発現のための改変されたアレイまたは改
変された配列(所望によりここに記載されるとおり)を含み、ここでアレイまたは改変され
た配列はｃＲＮＡまたはｇＲＮＡと同族であるＣａｓヌクレアーゼをコードするヌクレオ
チド配列を含まない、所望によりここで少なくとも２、３または４ｃＲＮＡまたはｇＲＮ
Ａが外来性ＤＮＡによりコードされる。ある実施態様において、宿主細胞は、ｃｒＲＮＡ
またはｇＲＮＡと同族であるＣａｓヌクレアーゼを発現する細菌または古細菌細胞である
。ヒトまたは動物(例えば、齧歯類、ラットまたはマウス)細胞での使用のためのような他
の例において、Ｃａｓヌクレアーゼは異なる核酸ベクターによりコードされる。例えば、
ここで該細胞はヒトまたは動物細胞であり、ベクターはＡＡＶまたはレンチウイルスベク
ターである。例えば、本発明は、このようなベクターを含む宿主細胞を含み、ここで宿主
細胞は該Ｃａｓを発現する。例えば、宿主細胞はエクスビボでのヒトまたは動物細胞であ
る。
本発明はまた
１.４kbを超えるまたは４.２kbを超える外来性ＤＮＡ配列を含む核酸ベクターを提供し
、ここで外来性ＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの１以上の要素をコードし、宿
主細胞において１以上のＨＭ－ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡを発現するための改変されたア
レイまたは配列(例えば、ここに記載する任意のこのようなもの)を含み、ここで外来性配
列は、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡと同族であるＣａｓヌクレアーゼをコードするヌクレオチ
ド配列を欠き、所望により少なくとも２つの異なるｃＲＮＡまたはｇＲＮＡが外来性ＤＮ
Ａによりコードされる。例えば、本発明はこのようなベクターを含む宿主細胞を含み、こ
こで宿主細胞は該Ｃａｓを発現する。例えば、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは各標的プロトス
ペーサー配列に対して宿主細胞においてハイブリダイズでき、ここで各プロトスペーサー
配列は抗生物質耐性または必須宿主遺伝子に含まれる。これは、我々が、混合および非混
合細胞集団における少なくとも１０倍の選択的宿主細胞増殖阻害を示す、実施例により例
示される。混合物は、ヒト微生物相に見られる種および株の組み合わせを模倣する。
“ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの要素をコードする外来性ＤＮＡ配列”は、ベクター
主鎖に挿入されたＤＮＡまたは該挿入が先に行われているベクターの子孫におけるこのよ
うなＤＮＡを意味する(例えば、リコンビニアリングのような組み換えＤＮＡ技術を使用
して)。例えば、外来性ＤＮＡは、ベクターの挿入容量の９５％、９０％、８０％、８５
％、７０％または６０％である。
例えば、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターは外来性ＤＮＡ挿入に
ついて特に容量が制限されており、故にウイルス包装容量を考慮する必要がある。コート
タンパク質およびポリメラーゼ発現のためのような、重要なウイルス機能をコードする配
列のための余地を残しておく必要がある。例えば、ベクターはファージベクターまたはＡ
ＡＶまたはレンチウイルスベクターである。ファージベクターは、宿主が細菌細胞である
とき有用である。
本発明は、組み合わせ製品キット(例えば、ここに記載するヒトまたは動物対象におけ
る疾患または状態の処置または予防のため)を提供し、ここでキットはアレイ、ベクター
、システム、細胞、改変されたｃＲＮＡまたはｇＲＮＡコード化配列またはｃＲＮＡまた
はｇＲＮＡを含み、これは抗生物質(第一抗生物質)と組み合わされ、ここでｃＲＮＡまた
はｇＲＮＡは細菌宿主細胞抗生物質耐性遺伝子に含まれるプロトスペーサー配列とハイブ
リダイズ可能であり、ここで抗生物質は該第一抗生物質である。抗生物質はここに開示す
る何れかの抗生物質であり得る。ある実施態様において、抗生物質は、製剤中、アレイ、
ベクター、システム、細胞、改変されたｃＲＮＡまたはｇＲＮＡコード化配列またはｃＲ
ＮＡまたはｇＲＮＡと組み合わされる。例えば、キットは、アレイ、ベクター、システム
、細胞、改変されたｃＲＮＡまたはｇＲＮＡコード化配列またはｃＲＮＡまたはｇＲＮＡ
を含む容器と別の容器に抗生物質を含む。
ある実施態様において、特に断らない限り、本または各細胞は細菌細胞、古細菌細胞、
藻類細胞、真菌細胞、原生動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚類細胞、鳥類細
胞、哺乳動物細胞、コンパニオン・アニマル細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウマ細胞、マウ
ス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、真核細胞、原核細胞、ヒト細胞、動物細胞、齧歯類細
胞、昆虫細胞または植物細胞である。さらに、この場合好ましくは細胞が同じ門、目、科
または属のものである。
用語“改変された”の使用により、当業者である対象者には、本発明のアレイ、配列、
ベクター、ＭＧＥまたは任意の他の形態、コンセプト、態様、実施態様、段落または例等
が天然に存在しないことは容易に明らかである。例えば、１以上の配列または要素を含む
ＭＧＥ、ベクターまたはアレイは、ＭＧＥ、ベクターまたはアレイの他の配列または要素
と一緒には天然で見られない。例えば、アレイは、本または各宿主細胞にとって組み換え
、人工、合成または外来性(すなわち、非内在性または野生型ではない)である。
例えば、アレイまたは本発明のベクターは、単離され、例えば宿主細胞から単離される
。例えば、アレイまたはベクターは、アレイの反復配列の反復と共に細胞において天然で
見られるＣａｓエンドヌクレアーゼコード化配列と組み合わされていない。
例えば、ベクター、ＭＧＥまたはアレイは、宿主細胞にないとき、Ｃａｓエンドヌクレ
アーゼコード化配列と組み合わされていない。例えば、ベクターまたはＭＧＥはＣａｓエ
ンドヌクレアーゼコード化配列を含まない。
例えば、標的修飾または切断はｄｓＤＮＡ Ｃａｓヌクレアーゼ(例えば、Ｃａｓ９、
例えば、ｓｐＣａｓ９またはｓａＣａｓ９)により実施され、それにより切断の修復が非
相同末端連結(ＮＨＥＪ)による。これは、一般に修復部位に変異(インデル)を導入し、こ
れは、標的部位の不活性化に有用である(例えば、必須遺伝子またはその調節要素のよう
なファージ遺伝子または調節要素)。他の例において、切断は、一本鎖(二本鎖ＤＮＡ切断
を行わない)に切断するｓｓＤＮＡ Ｃａｓヌクレアーゼ(例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ
)により行われる。これは、インデルの機会を減少させる、切断のＨＤＲ修復の支持に有
用である。これは、標的部位(または遺伝子またはそれを含む調節要素)が望ましいとき、
例えば、ＨＭ－ＤＮＡまたはＰＭ－ＤＮＡが所望の修飾部位のための標的部位に挿入され
るとき、有用である。例えば、この場合、修飾遺伝子は、宿主ＤＮＡコード化配列に融合
したＨＭ－ＤＮＡコード化アミノ酸またはファージＤＮＡコード化配列に融合したＰＭ－
ＤＮＡコード化アミノ酸配列を含む融合タンパク質を産生する。本発明はまた、このよう
な方法により得られたまたは得ることができる融合タンパク質をコードする配列を提供す
る。他の例において、ＨＭ－ＤＮＡまたはＰＭ－ＤＮＡは、融合産物が宿主またはファー
ジ遺伝子または調節要素ＤＮＡに融合した該ＤＮＡを含み、それにより融合遺伝子を産生
するように、調節要素(例えば遺伝子発現を制御するためのプロモーター、エンハンサー
、リプレッサーまたは誘導可能スイッチ)を含む。本発明はまた、このような方法により
得たまたは得ることができる融合遺伝子を提供する。ある実施態様において、本発明は、
このような融合遺伝子を含むベクター(例えば、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファー
ジミド、プロファージまたはプラスミド)を提供し、所望によりここでベクターは細菌細
胞(例えば、原核、真核、細菌、古細菌または酵母細胞)に含まれる。例えば、細胞はイン
ビトロである。
例えば、ＨＭ－ＤＮＡまたはＰＭ－ＤＮＡは、細胞内のベクターＤＮＡである。例えば
、ベクター内のＨＭ－ＤＮＡまたはＰＭ－ＤＮＡは、部位特異的組換え部位(例えば、ｆ
ｒｔまたはｌｏｘ部位)により隣接され得て、これは宿主細胞またはベクター配列により
コードされる部位特異的リコンビナーゼの作用により切断される。他の例において、ベク
ターは、ＲＮＡからのＨＭ－ＤＮＡまたはＰＭ－ＤＮＡ産生のためにＨＭ－ＤＮＡまたは
ＰＭ－ＤＮＡのＲＮＡコピーに転写されるＤＮＡおよび逆転写酵素(例えば、ベクター核
酸配列によりコードされる)である。これは、標的部位の１以上での能率的および効率的
導入の機会を増やすために所望のＨＭ－ＤＮＡまたはＰＭ－ＤＮＡの多コピーを産生する
のに有用である。他の実施態様において、ＨＭ－ＤＮＡまたはＰＭ－ＤＮＡは、宿主細胞
を形質導入または形質転換する第二ベクターの核酸(例えば、第二ファージまたはプラス
ミド)であるかまたはこれによりコードされる。例えば、これは、ヘルパーファージであ
る(これはまた第一ファージベクターの包装に必要な１以上のコートタンパク質もコード
し得る)。他の例において、ＤＮＡはベクターＤＮＡに提供され、アームに隣接され、こ
こで５’アームは、ベクターが宿主細胞にあるときＣａｓヌクレアーゼにより認識される
ＰＡＭを含み、３’アームは、このようなＰＡＭが直ぐ下流(３’)に隣接し、それにより
宿主細胞においてＣａｓ開裂は、ＨＭ－ＤＮＡまたはＰＭ－ＤＮＡをその隣接アームと共
に有利し、これは、宿主標的配列における切断に隣接する宿主配列と相同であり、それに
よりＨＭ－ＤＮＡが宿主ゲノムに統合されるようにまたはＰＭ－ＤＮＡがファージゲノム
に統合されるように設計できる。ある態様において、本発明は、このようなＨＭ－ＤＮＡ
またはＰＭ－ＤＮＡおよびアームを含む核酸またはこのような核酸を含むベクター(例え
ば、ファージまたはパッケージ化ファージ)を提供し、所望によりここでベクターは宿主
細胞に含まれる。所望により、ＨＭ－ＤＮＡは、ここに記載するＨＭ－アレイと組み合わ
される。所望により、ＰＭ－ＤＮＡは、ここに定義するＰＭ－アレイと組み合わされる。
本発明の特定の適用は、エクスビボまたはインビボで混合細菌集団におけるバクテロイ
デス門(例えば、バクテロイデス)細菌の比率を変えることである。上記のとおり、これは
、望ましくないバクテロイデス門に感染した水路または飲料水処理のような環境処理また
は、例えば、細菌培養産生のために、このような目的でヒトまたは動物に投与するための
ヒトまたは動物における有用な片利共生または相利共生バクテロイデス門を支持するため
に有用であり得る。後者の例えば、本発明は、ファーミキューテスに対するバクテロイデ
ス門の相対的比率を増加させるために有用であり、これは体重減少と関連しており、故に
医学的または美容目的での肥満処置または予防に有用性が見られる。
バクテロイデスがクロストリジウム・ディフィシル感染予防に役割を有することを示唆
する試験がある。潜在的病原体の侵入および増殖を制限する免疫応答の発達は、大いにバ
クテロイデス・フラジリスに依存する。また、パネート細胞タンパク質は、バクテロイデ
ス・シータイオタオミクロンによる刺激に応答して抗細菌ペプチドを産生でき、これらの
分子は病原体が腸でコロニー形成するのを妨げる。さらに、バクテロイデス・シータイオ
タオミクロンは、パネート細胞の殺菌性レクチン、ＲｅｇIII産生を誘発でき、これはそ
の抗微生物効果を、グラム陽性生物のペプチドグリカンとの結合により発揮する。それ故
に、腸内細菌の混合集団におけるバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロンおよ
び／またはフラジリス)の比率増加のためのその何れかの形態での本発明の使用は、集団
またはヒトまたは非ヒト動物の腸の病原性細菌コロニー形成の限定に有用である。
Hooper et alは、バクテロイデス・シータイオタオミクロンが、フコースリプレッサー
遺伝子およびシグナル伝達システムが介在する複雑な相互作用において腸フコシル化を修
飾できることを示した。転写分析を使用して、バクテロイデス・シータイオタオミクロン
は、栄養素吸収、粘膜バリア強化および血管新生因子産生に関与するものを含む、多様な
宿主遺伝子の発現を調節できることが示された。
ある実施態様において、混合集団は第一細菌および第二細菌からなる(すなわち、さら
なる細菌集団はいない)。
例えば、本または各アレイは、ベクターにおける組み換えアレイおよび／またはベクタ
ーにおける単離アレイである。例えば、アレイは宿主細胞(例えば、微生物、細菌または
古細菌細胞)に含まれる。
例えば、該Ｃａｓは、宿主細胞の内在性Ｃａｓヌクレアーゼ(例えばＣａｓ９)である。
宿主のＣａｓを利用することにより、アレイにおける宿主タイプ反復の能率的使用および
内在性ｃｒＲＮＡを使用する可能性も可能とする － ウイルスまたはファージのような
ベクターにおいてそうでなければ制限される容量を解放する(タイプII Ｃａｓ９のよう
なＣａｓ遺伝子配列は大きいのとは違う)。
例えば、宿主ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはタイプＩシステムである。例えば、宿主
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはタイプIIシステムである。例えば、宿主ＣＲＩＳＰＲ／
ＣａｓシステムはタイプIIIシステムである。
本発明のＨＭ－ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡによりガイドされるｃａｓは、標的配列にお
けるＰＡＭと適合性である宿主内在性Ｃａｓまたはベクターコード化Ｃａｓである。
所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はグラム陰性細菌(例えば、ス
ピリルムまたはビブリオ)である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌
)はグラム陽性細菌である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はマ
イコプラズマ、クラミジア、スピロヘータまたはマイコバクテリウムである。所望により
、宿主(または第一および／または第二細菌)はストレプトコッカス(例えば、ピオゲネス
またはサーモフィルス)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細
菌)はスタフィロコッカス(例えば、アウレウス、例えば、ＭＲＳＡ)宿主である。所望に
より、宿主(または第一および／または第二細菌)はエシェリキア・コリ(例えば、Ｏ１５
７：Ｈ７)宿主であり、例えば、ここでＣａｓはベクターによりコードされるかまたは内
在性宿主Ｃａｓヌクレアーゼ活性は抑制解除される。所望により、宿主(または第一およ
び／または第二細菌)はシュードモナス(例えば、エルギノーサ)宿主である。所望により
、宿主(または第一および／または第二細菌)はビブリオ(例えば、コレラエ(例えば、Ｏ１
３９)またはバルニフィカス)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または
第二細菌)はナイセリア(例えば、ゴノレーまたはメニンギティディス)宿主である。所望
により、宿主(または第一および／または第二細菌)はボルデテラ(例えば、パータシス)宿
主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はヘモフィルス(例え
ば、インフルエンザエ)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細
菌)はシゲラ(例えば、ディセンテリアエ)宿主である。所望により、宿主(または第一およ
び／または第二細菌)はブルセラ(例えば、アボルタス)宿主である。所望により、宿主(ま
たは第一および／または第二細菌)はフランシセラ宿主である。所望により、宿主(または
第一および／または第二細菌)はキサントモナス宿主である。所望により、宿主(または第
一および／または第二細菌)はアグロバクテリウム宿主である。所望により、宿主(または
第一および／または第二細菌)はエルウィニア宿主である。所望により、宿主(または第一
および／または第二細菌)はレジオネラ(例えば、ニューモフィラ)宿主である。所望によ
り、宿主(または第一および／または第二細菌)はリステリア(例えば、モノサイトゲネス)
宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はカンピロバクター
(例えば、ジェジュニ)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細
菌)はエルシニア(例えば、ペスティス)宿主である。所望により、宿主(または第一および
／または第二細菌)はボレリア(例えば、ブルグドルフェリ)宿主である。所望により、宿
主(または第一および／または第二細菌)はヘリコバクター(例えば、ピロリ)宿主である。
所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はクロストリジウム(例えば、デ
ィフィシルまたはボツリヌム)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または
第二細菌)はエーリキア(例えば、シャフェンシス)宿主である。所望により、宿主(または
第一および／または第二細菌)はサルモネラ(例えば、チフィまたはエンテリカ、例えば、
血清型チフィリウム、例えば、ＤＴ１０４)宿主である。所望により、宿主(または第一お
よび／または第二細菌)はクラミジア(例えば、ニューモニエ)宿主である。所望により、
宿主(または第一および／または第二細菌)はパラクラミジア宿主である。所望により、宿
主(または第一および／または第二細菌)はコリネバクテリウム(例えば、アミコラツム)宿
主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はクレブシエラ(例え
ば、ニューモニエ)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)
はエンテロコッカス(例えば、フェカーリスまたはフェシウム、例えば、リネゾリド耐性)
宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はアシネトバクター
(例えば、バウマンニ、例えば、複数薬物耐性)宿主である。
例えば、細胞は原核細胞である。例えば、細胞は細菌細胞である。例えば、細胞は古細
菌細胞である。例えば、細胞は微生物細胞である。例えば、細胞は原生動物細胞である。
例えば、細胞は魚類細胞である。例えば、細胞は鳥類細胞である。例えば、細胞は爬虫類
細胞である。例えば、細胞はクモ類細胞である。例えば、細胞は酵母細胞(例えば、サッ
カロミセス細胞)である。例えば、宿主細胞は植物細胞である。例えば、宿主細胞は動物
細胞(例えば、ヒト細胞ではない、例えば、齧歯類細胞ではない)である。例えば、宿主細
胞はヒト細胞(例えば、胚またはヒトにおける細胞ではない)である、例えばインビトロ宿
主細胞である。例えば、細胞は家畜またはペット動物細胞(例えば、ウシ、ブタ、ヤギ、
ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコまたはウサギ細胞)である。例えば、宿主細胞は昆虫細胞(その
生活環の任意の期、例えば、卵、幼虫または蛹の昆虫)である。例えば、宿主細胞は原生
動物細胞である。例えば、細胞は頭足類細胞である。
所望により、アレイ、システム、改変されたヌクレオチド配列またはベクター核酸は、
さらに、例えば、宿主細胞が真核細胞、例えば、植物または動物であるとき、核へのター
ゲティングのために、(例えば、１、２以上)核移行シグナル(ＮＬＳ)を含む。例えば、Ｎ
ＬＳは、本発明のＣａｓコード化核酸配列および／または本発明のアレイの各末端が隣接
する － 特に真核宿主細胞におけるターゲティングに使用するため。
ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、例えばｔｒａｃｒＲＮＡを使用しないタイプのＣａｓシステ
ムについて、本発明のアレイまたはベクターから除去できる。
例えば、標的にガイドされたＣａｓはエキソヌクレアーゼである。所望によりここで記
載するニッカーゼは、ダブル・ニッカーゼである。
ニッカーゼの例はＣａｓ９ニッカーゼ、すなわち、２ヌクレアーゼドメインの一方が不活
性化されているＣａｓ９である － ＲｕｖＣおよび／またはＨＮＨドメイン何れか。
所望により宿主システムはタイプＩシステムである(および所望によりアレイ、ＨＭ－
ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡは異なるＣＲＩＳＰＲシステム、例えば、タイプIIまたはIII
のものである)。所望によりアレイまたは改変された配列は、例えば、Ｃａｓが宿主シス
テムと共に動作しないかまたは能率的に動作しないとき、アレイと同じシステムのＣａｓ
をコードするヌクレオチド配列、ＨＭ－ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡを有するウイルスまた
はプラスミドと組み合わされる。所望により宿主システムはタイプIIシステムである(お
よび所望によりアレイ、ＨＭ－ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡは異なるＣＲＩＳＰＲシステム
、例えば、タイプＩまたはIIIのものである)。所望によりアレイまたは改変された配列ｉ
は、例えば、Ｃａｓが宿主システムと共に動作しないかまたは能率的に動作しないとき、
アレイと同じシステムのＣａｓをコードするヌクレオチド配列、ＨＭ－ｃｒＲＮＡまたは
ｇＲＮＡを有するウイルスまたはプラスミドと組み合わされる。所望により宿主システム
はタイプIIIシステムである(および所望によりアレイ、ＨＭ－ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡ
は異なるＣＲＩＳＰＲシステム、例えば、タイプＩまたはIIのものである)。所望により
改変された配列のアレイは、例えば、Ｃａｓが宿主システムと共に動作しないかまたは能
率的に動作しないとき、アレイと同じシステムのＣａｓをコードするヌクレオチド配列と
ウイルスまたはプラスミドにおいて組み合わされる。
ベクターＤＮＡを使用するここでの記載は、代替的実施態様において、変更すべきとこ
ろは変更して、状況が許すならば、ベクターＲＮＡに適用される。例えば、ベクターがＲ
ＮＡベクターであるときである。本発明の全特性は、それ故に別法において、状況が許す
ならば、ベクターＤＮＡに言及するとき“ＤＮＡ”の代わりに“ＲＮＡ”として開示され
、解釈される。例えば、各ベクターはまた逆転写酵素も含む。
例えば、本または各アレイまたは改変されたヌクレオチド配列はナノ粒子ベクターまた
はリポソームに提供される。
例えば、Ｃａｓは切断のためのＣａｓヌクレアーゼ、妨害のためのdeadＣａｓ(ｄＣａ
ｓ)または標的活性化のための転写アクティベーターとコンジュゲートしたｄＣａｓであ
る。
例えば、宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、宿主ＣＲＩＳＰＲアレイおよび宿主に
おけるヌクレオチド配列ターゲティングのための同族宿主Ｃａｓを含む。例えば、宿主標
的配列は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、２０、３０または４０連続ヌクレオチ
ド含む。例えば、標的配列はＣａｓ、例えば、Ｃａｓ９により切断される。ある実施態様
において、配列はスペーサーにない。
例えば、本または各アレイまたは改変された配列は、宿主におけるｃｒＲＮＡまたはｇ
ＲＮＡ転写に機能的な外来性プロモーターを含む。
例えば、本または各アレイ反復は宿主アレイにおける反復と同一であり、ここでＣＲＩ
ＳＰＲアレイが宿主ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアー
ゼ、例えば、Ｃａｓ９)により認識されるＰＡＭを含まない。これは、変更すべきところ
は変更して、ＨＭ－ｃｒＲＮＡおよびｇＲＮＡの反復配列に適用される。この実施態様は
、ＣＲＩＳＰＲアレイが、宿主標的配列標的のために単純に内在性宿主Ｃａｓを使用する
ことを可能とするため、有利である。次いで、これは、アレイが宿主機構による使用のた
めに合わせられ、故に、宿主細胞における機能を助けるため、能率的である。これに加え
てまたはこれとは別に(例えばアレイが外来性(非宿主内在性)Ｃａｓコード化配列と組み
合わされるとき)、この実施態様は、ＣＲＩＳＰＲアレイ反復がプレｃｒＲＮＡ製造のた
めに内在性ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズし、宿主標的配列とハイブリダイズする成
熟ｃｒＲＮＡに加工されるため、ＣＲＩＳＰＲアレイが内在性コード化ｔｒａｃｒＲＮＡ
を使用することを可能とする。後者の複合体は、その後、内在性Ｃａｓヌクレアーゼ(例
えば、Ｃａｓ９)をガイドするまたはＣＲＩＳＰＲアレイに含まれる配列から産生された
Ｃａｓをガイドする。この実施態様は、それ故に、ＣＲＩＳＰＲアレイを含むが、ｔｒａ
ｃｒＲＮＡ－および／またはＣａｓヌクレアーゼコード化配列を含まないベクター(例え
ば、パッケージ化ウイルスまたはファージ)の単純な構築の柔軟性を提供する。これは、
ベクター構築についてより簡単であり、またベクター、特にウイルスベクター(例えば、
ファージ)の容量制限を考慮して有用である、ベクター(例えば、ウイルスまたはファージ
)における有用な空間も解放する。さらなる空間は、宿主遺伝子不活性化または宿主にお
ける発現のための所望の非宿主配列における取り込みのためのような、例えば、修飾のた
めに宿主ゲノムを標的とするために、例えば、アレイにおいてさらに多くのスペーサーを
挿入するために、有用である。これに加えてまたはこれとは別に、空間を、ベクターにお
ける複数のＣＲＩＳＰＲアレイの包含に使用できる。これらは、例えば、第一アレイが第
一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタイプ(例えば、タイプIIまたはタイプII－Ａ)のものであり、第
二アレイが第二タイプ(例えば、タイプＩまたはIIIまたはタイプII－Ｂ)であるときの配
置であり得る。これに加えてまたはこれとは別に、アレイは、宿主における異なるＣａｓ
ヌクレアーゼを使用できる(例えば、一方のアレイは宿主Ｃａｓヌクレアーと共に動作可
能であり、第二アレイは外来性Ｃａｓヌクレアーゼ(すなわち、ベクターコード化ヌクレ
アーゼ)と共に動作可能である)。これらの態様は、ベクターが導入されたら宿主における
ターゲティングのための機構を提供し、これは、宿主がその後要素の広範囲を標的とする
必要があるため、ベクターの宿主耐性減少に有利であり得る。例えば、宿主が第一ＣＲＩ
ＳＰＲアレイ配列に基づく新規スペーサーを獲得したとしても、第二ＣＲＩＳＰＲアレイ
はなお宿主において宿主細胞における各標的配列の標的として機能できる。それ故に、こ
の実施態様は、ベクターへの宿主適応の減少に有用である。
他の利点は、(例えば、この配置で)ＣＲＩＳＰＲアレイ(またはベクターにおける複数
ののこのようなアレイにわたり分散される)に、複数コピーの同じスペーサー(例えば、宿
主細胞において標的部位標的に使用されるスペーサー)を包含することが可能であること
である。これは、細菌および古細菌のような宿主の適応は、スペーサーが有利な宿主ＤＮ
Ａを標的とするときのアレイからのスペーサーの喪失が関与し得ることが提唱されるため
、有利である(PLoS Genet. 2013;9(9):e1003844. doi: 10.1371/journal.pgen.1003844.
Epub 2013 Sep 26, “Dealing with the evolutionary downside of CRISPR immunity: b
acteria and beneficial plasmids”, Jiang W et al)。スペーサー－反復単位の除去は
、反復配列の組換えを介して起こると考えられる。それ故に、本発明のこの態様により、
宿主標的配列にハイブリダイズするための複数の(例えば、２、３、４、５、１０、１５
、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００
以上)コピーのスペーサーを含む、１、２、３、４、５、６以上の本発明のＣＲＩＳＰＲ
アレイまたは改変された配列が提供される。これは、これらのスペーサー全部が宿主細胞
において組換えにより喪失される機会を減少させる。この態様のさらなる適用において、
ＣＲＩＳＰＲアレイは、１以上の(例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、
３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０以上)のスペーサーコピ
ーを含む第一アレイおよび１以上の(例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５
、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０以上)の同一スペーサ
ーコピーを含む第二アレイを含み、ここで第一アレイにおけるスペーサーコピーは、各第
一反復に隣接しており、第二アレイにおける同一スペーサーコピーは、各第二反復に隣接
しており、ここで第一反復が第二反復と異なる。これは、第一および第二反復の少なくと
も一つが、１を超えるアレイが関与する宿主適応の機会を減少するために、宿主Ｃａｓヌ
クレアーゼ(または同じ宿主Ｃａｓヌクレアーゼ)に認識されないように選択できる利点を
有する。例えば、第一アレイは、宿主細胞によりコードされず、第一反復と同族Ｃａｓで
あるＣａｓヌクレアーゼ配列と組み合わされる。所望により、また第二アレイは、宿主細
胞によりコードされず、第二反復と同族ＣａｓであるＣａｓヌクレアーゼ配列(例えば、
第一アレイのものと同一または異なる)と組み合わされる。
ある実施態様は、第一ベクターに含まれる第一アレイおよび第一アレイに含まれない第
二ベクターに含まれる第二アレイ(例えば、ここでベクターはプラスミドまたはビリオン(
例えば、同じウイルスタイプの)またはパッケージ化ファージ(例えば、同じファージタイ
プの)を提供する。これは、ベクターが同時にまたは逐次的に同じ宿主細胞に導入できる
ため、有用である。それ故に、宿主が第一アレイに対する耐性を発現したとき、第二を導
入して、耐性宿主(例えば、細菌または古細菌)が先に共進化していない第二アレイを提供
し、それにより宿主細胞に対し第二修飾(例えば、ノックダウン)波を提供する。これはま
た、第一および第二アレイおよびスペーサーと異なるスペーサーまたはアレイを含む第三
のこのようなベクターを、宿主細胞に第二ベクターと同時にまたは逐次的に導入でき、第
一アレイにおけるスペーサーに耐性である宿主の進化中に先に存在していない宿主細胞修
飾へのさらなる経路を提供するため、柔軟性を提供する。アレイの代わりに、本発明の改
変されたヌクレオチド配列が使用され得る。
それ故に、ある実施態様において、本発明は、宿主細胞の修飾のための組成物を提供し、
ここで組成物は、ここに記載する任意のアレイまたは改変された配列を提供する。それ故
に、ある実施態様において、本発明は宿主細胞の修飾のための組成物を提供し、ここで組
成物は、第一ベクター(例えば、ビリオンまたはパッケージ化ファージ)におけるここに記
載する第一アレイおよび第二ベクター(例えば、それぞれビリオンまたはパッケージ化フ
ァージ)におけるここに記載する第二のこのようなアレイを提供し、ここで第二アレイは
１以上の宿主標的配列を標的とし、第一アレイに含まれない１以上のスペーサーを含む。
アレイの代わりに、本発明の改変されたヌクレオチド配列が使用され得る。
ある実施態様において、アレイまたは改変された配列は、ヴィロファージベクターに含
まれ、宿主は、あるいは細胞に感染できるウイルスである。例えば、宿主は、アメーバ細
胞が感染されているかもしれない大ウイルスである。例えば、宿主は、スプートニクウイ
ルス、ピソウイルス、ミミウイルス、ママウイルス、メガウイルスまたはパンドラウイル
スであり、例えば、ここで宿主ウイルスは水中にある。この実施態様の例えば、本発明は
水または汚水処理のためである(例えば、精製、例えば、水路、川、湖、池または海処理)
。
ある実施態様において、本または各ベクターまたは改変された配列はΦΝΜ１ファージ
であるかまたはこれに含まれ、例えば、ここで宿主細胞はスタフィロコッカス・アウレウ
ス(例えば、ＭＲＳＡ)細胞である。
一般的特性はまた次の各項も提供する
１. 本発明の態様の何れかによるアレイ、改変された配列、ウイルス、ビリオン、ファー
ジ、ファージミド、プロファージ、集団または収集物を含む、抗微生物組成物(例えば、
抗生物質、例えば、医薬、殺菌剤または口腔洗浄剤)。
２. 医薬または歯科または眼科使用のための(例えば、生物における感染の処置もしくは
予防または生物における感染拡大制限のための、項１の組成物。
例えば、生物は、植物または動物、例えば、脊椎動物(例えば、ここに開示する任意の
哺乳動物またはヒト)または作物または食品植物である。
３. 本発明のアレイ、改変された配列、システム、収集物、ウイルス、ビリオン、ファー
ジ、ファージミド、プロファージ、組成物、集団、収集物、使用または方法を含む、化粧
品使用(例えば、化粧品製品、例えば、化粧品における使用)または衛生使用(例えば、衛
生製品、例えば、石鹸における使用)のための組成物。
４. 医薬におけるまたは歯科治療または予防使用のための、項１～３５の何れかのアレイ
、改変された配列、収集物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファー
ジ、集団または収集物を含む組成物の使用。
５. 化粧品使用(例えば、化粧品製品、例えば、化粧品における使用)または衛生使用(例
えば、衛生製品、例えば、石鹸における使用)のための、本発明のアレイ、改変された配
列、収集物、システム、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、
組成物、集団、収集物、使用または方法を含む組成物の使用。
６. 宿主細胞の標的ヌクレオチド配列の修飾が可能である宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／
Ｃａｓ９システム(例えば、タイプＩ、IIまたはIII)における本発明のアレイ、改変され
た配列、システム、収集物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファー
ジ、組成物、集団または収集物の使用であって、ここでアレイ、改変された配列、システ
ム、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団または収集物は
本発明のものである。
７. アレイ、改変された配列、システム、収集物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファ
ージミド、プロファージ、集団または収集物が宿主細胞にない、項４、５または６の使用
。
８. アレイ、改変された配列、収集物、システム、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファ
ージミド、プロファージ、集団または収集物が宿主細胞(例えば、微生物、細菌または古
細菌細胞)にある、項５または６の使用。
９. 微生物細胞修飾のための(例えば、細胞または微生物細胞の培養の死滅または増殖減
少のため)、項４～６の何れかの使用。
１０. 宿主細胞(例えば微生物、細菌または古細菌)における標的ヌクレオチド配列を修飾
する方法であって、宿主細胞を本発明のアレイ、改変された配列、システム、収集物、ウ
イルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、集団または収集物で形質転換することを含
み、それにより標的ヌクレオチド配列がＣａｓ修飾され、ここで宿主標的配列が細胞の宿
主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのヌクレオチド配列である、方法。
１１. 核酸ベクターによる形質転換に対する宿主細胞耐性の発現を減少するまたは宿主細
胞における核酸ベクターを維持する方法であって、ここで宿主細胞は標的ヌクレオチド配
列を含み、宿主細胞を本発明のアレイ、改変された配列、収集物、システム、ウイルス、
ビリオン、ファージ、ファージミド、集団または収集物で形質転換することを含み、それ
により標的ヌクレオチド配列がＣａｓ修飾(例えば、切断、変異またはノックダウン)され
る、方法。
１２. ベクターが宿主細胞に感染可能であるウイルスであり、形質転換工程が宿主細胞の
ベクターでの感染を含む、項１１の方法。
１３. 宿主細胞が細菌または古細菌細胞であり、ベクターがファージまたはファージミド
である、項１１または１２の方法。
１４. 宿主標的配列がベクター配列スペーサーの宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ介在獲得に必
須である、項１１～１３の何れかの方法。
１５. 少なくとも要素(ii)が宿主細胞溶解のためのエンドリシンを発現できるウイルス(
例えば、ファージ)に含まれ、所望によりここでエンドリシンがファージファイ１１、フ
ァージＴｗｏｒｔ、ファージＰ６８、ファージファイＷＭＹまたはファージＫエンドリシ
ン(例えば、ＭＶ－ＬエンドリシンまたはＰ－２７／ＨＰエンドリシン)である、先の項の
何れかのアレイ、改変された配列、システム、ベクター、細胞、収集物、組成物、使用ま
たは方法。
１６. 宿主細胞溶解のためのエンドリシンと組み合わされる、例えば、ＭＶ－Ｌエンドリ
シンまたはＰ－２７／ＨＰエンドリシンまたはその機能的ホモログと組み合わされた、項
１５のアレイ、改変された配列、システム、ベクター、収集物、細胞、組成物、使用また
は方法。
１７. 抗微生物、例えば、抗生物質薬剤、例えば、ベータ－ラクタム抗生物質と組み合わ
される、先の項の何れかのアレイ、改変された配列、システム、ベクター、収集物、細胞
、組成物、使用または方法。
１８. 宿主細胞がスタフィロコッカス、ストレプトコッカス、シュードモナス、サルモネ
ラ、リステリア、エシェリキア・コリ、デスルホビブリオまたはクロストリジウム宿主細
胞である、先の項の何れかのアレイ、改変された配列、システム、ベクター、収集物、細
胞、組成物、使用または方法。
１９. 宿主細胞がスタフィロコッカス(例えば、スタフィロコッカス・アウレウス)宿主細
胞であり、少なくとも要素(ii)がクラスＩ、IIまたはIIIスタフィロコッカスファージ(例
えば、パッケージ化ファージ)、所望によりカウドウイルス目またはミオウイルス科ファ
ージに含まれる、先の項の何れかのアレイ、改変された配列、システム、ベクター、収集
物、細胞、組成物、使用または方法。
２０. 宿主細胞がベータ－ラクタム抗生物質耐性ストレプトコッカスアウレウス、メチシ
リン耐性ストレプトコッカスアウレウス(ＭＲＳＡ)、バンコマイシン耐性ストレプトコッ
カスアウレウスまたはテイコプラニン耐性ストレプトコッカスアウレウスであり、所望に
より標的配列がそれぞれ宿主ベータ－ラクタム抗生物質耐性遺伝子、メチシリン耐性遺伝
子、バンコマイシン耐性遺伝子またはテイコプラニン耐性遺伝子の配列である、先の項の
何れかのアレイ、改変された配列、システム、ベクター、細胞、収集物、組成物、使用ま
たは方法。
本発明のファージベクターの産生および試験に適する適当な方法は、例えば、ＷＯ２０
１４／１２４２２６号に開示の一般的方法である。
可動遺伝要素、トランスポゾンおよび運搬体(本発明のあらゆる形態のための)
プラスミドはバクテロイデス種で極めて一般的であり、株の２０～５０％に見られる。
多くのプラスミドがｏｒｉＴおよびトランス作用性可動化遺伝子を有し、これによりコン
ジュゲーションによる伝達が可能となる。それ故に、例えば、ベクターは、ｏｒｉＴおよ
び／または可動化遺伝子を含むプラスミドであり、例えば、ここで第一または第二細菌は
バクテロイデスである。例えば、改変された配列はこのようなベクターに含まれる。
例えば、宿主細胞または第一もしくは第二細菌は、天然にトランスポゾンを含む。トラ
ンスポゾンは、可動性および接合性の両者とも、独立して複製せず、むしろ、切り取られ
、そして染色体ＤＮＡに統合されて、染色体ＤＮＡと共に複製される。接合性トランスポ
ゾンは、プラスミドおよびバクテリオファージの両者のいくつかの特性を模倣する切除お
よび組込みの機序を有する。接合性トランスポゾンは、実際にバクテロイデスで偏在性で
あり、８０％を超えるバクテロイデス株が少なくとも一つの接合性トランスポゾンを含む
。バクテロイデスの接合性トランスポゾンは、少なくとも２つのファミリーに属し、ＣＴ
ｎＤｏｔは最も良く記載されている。しばしば、それらが発見される株の名前が命名に加
えられる(例えば、ＣＴｎＤｏｔは、バクテロイデス・シータイオタオミクロンのＤＯＴ
株で発見)。染色体に挿入することが可能であることに加えて、バクテロイデス接合性ト
ランスポゾンは共在プラスミドに挿入でき、プラスミドにそれら自体統合することにより
それらをシスで可動化し(すなわち、物理的に隣接する物に対して作用できる)、プラスミ
ド－接合性トランスポゾンハイブリッドの他の細胞への伝達を促進する。それらはまた共
在プラスミドを、プラスミドから物理的に離れたままで、プラスミドの伝達の促進に必要
な因子の提供により“トランスで”も可動化できる。
接合性トランスポゾンは、プラスミドのように互いに排除せず、従って、株は１を超え
る接合性トランスポゾンを蓄積できる。さらに、株における１を超えるコピーの接合性ト
ランスポゾンの存在が転位(トランス活性化)を刺激するいくつかの証拠がある。理論的に
、これは、接合性トランスポゾンが環境で蓄積されればされるほど、他の細菌へのトラン
スポゾン遺伝子の伝達も増加し、遺伝子の分配の顕著な上向きのスパイラルがあることを
示唆する。バクテロイデストランスポゾンの多くはｔｅｔＱ遺伝子を運搬し、故にテトラ
サイクリン耐性を与える。さらに、自己伝達および他の活性が、ｔｅｔＱ－ｒｔｅＡ－ｒ
ｔｅＢオペロンで制御される、低レベルのテトラサイクリンで顕著に刺激される。テトラ
サイクリンは、２要素制御システムのセンサーおよびアクティベーター要素をコードする
、ｒｔｅＡおよび－Ｂの転写を増加させる。その後、ＲｔｅＢが自己伝達に必要なｒｔｅ
Ｃの発現を活性化する。
例えば、ベクター(例えば、改変された配列を含むベクター)はトランスポゾンを含み、
ここでトランスポゾンは本発明の改変された配列、ＨＭ－またはＰＭ－アレイを含み、こ
こでトランスポゾンは宿主細胞または第一もしくは第二細菌宿主細胞種において動作可能
である。ある実施態様において、トランスポゾンは、バクテロイデストランスポゾン(例
えば、ＣＴｎＤｏｔトランスポゾン、例えば、バクテロイデス・シータイオタオミクロン
またはバクテロイデス・フラジリスＣＴｎＤｏｔトランスポゾン)であり、宿主細胞また
は第一もしくは第二細菌はバクテロイデスであるかこれを含む(例えば、該ＣＴｎＤｏｔ
トランスポゾンと同じ種のもの)。例えば、トランスポゾンは接合性トランスポゾンであ
る。例えば、トランスポゾンは可動性トランスポゾンである。例えば、トランスポゾンは
バクテロイデス細胞間で伝達可能である。例えば、トランスポゾンはｉｎｔＤＯＴ配列を
含む。例えば、トランスポゾンはｏｒｉＴを含む。例えば、トランスポゾンは、宿主細胞
間のトランスポゾン接合性伝達のための１以上の接合細孔タンパク質をコードする。
例えば、本発明は、バクテロイデスｔｅｔＱ遺伝子を含むトランスポゾンを提供する。
例えば、トランスポゾンは、さらにバクテロイデスｔｅｔＱ－ｒｔｅＡ－ｒｔｅＢオペロ
ンを含む。例えば、第一または第二細菌はバクテロイデスである。例えば、トランスポゾ
ンは、宿主細胞間のトランスポゾン接合性伝達のための１以上の接合細孔タンパク質をコ
ードするバクテロイデスＣＴｎＤｏｔトランスポゾンであり、本発明の１以上のアレイま
たは改変された配列、ｏｒｉＴ、ｉｎｔＤＯＴ配列およびｔｅｔＱ－ｒｔｅＡ－ｒｔｅＢ
オペロンを含み、所望によりテトラサイクリンと組み合わせてここに記載する該ヒトまた
は非ヒト動物に投与するためであるかまたは投与される。大部分のバクテロイデスＣＴｎ
ｓの伝達はテトラサイクリンにより刺激される。トランスポゾンは、宿主細胞におけるイ
ンテグラーゼと共に動作可能であるかまたはトランスポゾンと同じもしくは異なるベクタ
ーに担持される外来性インテグラーゼと共に動作可能である。ある実施態様において、ベ
クターは、トランスポゾンおよび同族インテグラーゼをコードするヌクレオチド配列を含
むファージ(例えば、パッケージ化ファージ)である。ファージは、トランスポゾンの複製
および切除のために、例えば、混合細菌集団(例えば、腸内微生物相集団)における隣接宿
主細胞への接合性伝達のために、宿主細菌細胞に感染可能である。
ある実施態様において、トランスポゾンは、宿主細胞間のトランスポゾン伝達に必要な
１以上の遺伝子配列を運搬するベクターに含まれ、ここで該遺伝子配列は、ベクター核酸
上のトランスポゾンの外側である。例えば、ベクターは、宿主細胞(例えば、バクテロイ
デス宿主細胞)に感染可能であるパッケージ化ファージであり、ここでファージ核酸は、
本発明のアレイおよびトランスポゾンの上流または下流にトランスポゾンの接合性伝達の
ために動作可能な１以上の遺伝子(例えば、トランスポゾン接合性伝達のためのリラクサ
ーゼ、共役タンパク質および／または接合橋タンパク質をコードする１以上の遺伝子；お
よび／またはｍｏｂおよびｔｒａオペロンの一方または両方)を含む該トランスポゾンを
含む、ここでこれらの遺伝子の一つ、複数または全てはトランスポゾンに含まれない。例
えば、これらの遺伝子は、第一宿主細胞内の染色体ＤＮＡからのトランスポゾン切除のた
めの遺伝子である。それ故に、トランスポゾンは、その細胞内で可動化でき、それと共に
その後の第二宿主細胞への接合性伝達に必要な遺伝子を運搬する。トランスポゾン外側の
ベクターにこの方法でトランスポゾン遺伝子のいくつかを提供することにより、本発明の
改変された配列またはアレイＤＮＡの挿入のためのトランスポゾンの空間を解放し、それ
により、可動化トランスポゾンにより収容および運搬され得る。本発明は、本発明の方法
、使用またはシステムにおいて使用するためのまたは一般に細菌細胞への導入のための(
この場合ファージ配列ターゲティングの代わりに、トランスポゾンに含まれるアレイは、
配列を修飾するために、例えば、トランスポゾンを有する細胞におけるＣａｓを使用して
それを切断するために、細菌標的配列を標的とする)１以上のこのようなトランスポゾン
を含むこのようなベクターを提供する。
ＣＴｎＤｏｔ切除および組込みの分子機構は、転位よりむしろバクテリオファージのも
のを模倣する。ＣＴｎＤＯＴインテグラーゼおよび切除タンパク質自体、バクテリオファ
ージからのものに極めて類似する。それ故に、ある実施態様において、本発明のトランス
ポゾンの１以上のインテグラーゼおよび／または切除タンパク質の機能は、それぞれファ
ージインテグラーゼおよび／または切除タンパク質により提供され、トランスポゾンは機
能がファージタンパク質により提供されるこのようなインテグラーゼまたは切除タンパク
質をコードする対応する遺伝子を含まない。
例えば、トランスポゾンはｒｔｅＣおよびオペロンｘｉｓ２ｃ－ｘｉｓ２ｄ－ｏｒｆ３
－ｅｘｃを含む。所望により、さらにベクターは、トランスポゾン外側(例えば、ベクタ
ー核酸におけるトランスポゾンの上流または下流)にｍｏｂおよびｔｒａオペロンを含む
。それ故に、これは、本発明のＣＲＩＳＰＲアレイ配列または改変された配列を提供する
ためにトランスポゾンにおける空間を解放する。
多くの接合性トランスポゾンが他の要素を可動化できる。例えば、多くの共在プラスミ
ドは、接合性トランスポゾンによりトランスで可動化される。これは、ｏｒｉＴを含むプ
ラスミドが、レシピエント細胞への伝達のためにＣＴｎ提供接合細孔タンパク質を利用す
るとき生じる。バクテロイデスＣＴｎｓはまたＣＴｎｓでは典型的ではない特性である、
シスのときも、要素を可動化できることが示されている。例えば、ＣＴｎＤＯＴが染色体
から切除され、プラスミドに統合されたとしても、接合細孔、ｏｒｉＴおよび可動化(リ
ラクサーゼ／共役)タンパク質を提供でき、“シスで”作動することによりプラスミド全
体を伝達することを可能とする。可動化のトランスおよびシス機構両者を使用する能力は
珍しく、バクテロイデスＣＴｎｓが他の要素の可動化のための大きな容量を有することを
示唆する。
例えば、本発明のベクターは、１以上の本発明の改変された配列またはアレイおよび接
合細孔タンパク質をコードする宿主細胞種ＣＴｎＤｏｔトランスポゾンと同族であるｏｒ
ｉＴを含むプラスミドであり、それによりプラスミドは、該ＣＴｎＤｏｔトランスポゾン
を含む宿主細胞において可動性である。それ故に、プラスミドは宿主細胞間で水平伝播可
能であり、それによりこのような宿主細胞(例えば、バクテロイデス細胞)集団で本発明の
アレイを拡散する。例えば、本発明は、運搬体細菌の集団を含む組成物を提供し、ここで
運搬体細菌はこのような本発明のプラスミドベクターと適合性であり、それによりベクタ
ーは、運搬体とレシピエント細菌が混合されたとき、同族ＣＴｎＤｏｔトランスポゾンを
含むレシピエント宿主細菌細胞(例えば、バクテロイデスまたはファーミキューテス、例
えば、ストレプトコッカス細胞)に水平伝播され得る。例えば、運搬体細菌はヒトまたは
非ヒト動物消費用の飲料(例えば、ここに記載するもののようなプロバイオティク飲料)ま
たは食糧に含まれ、それにより運搬体細菌は、ヒトまたは動物が有する(例えば、口腔ま
たは腸に)レシピエント細菌と混合され得る。ＣＴｎＤＯＴ様ファミリー内の他のトラン
スポゾンはＣＴｎＥＲＬおよびＣＴｎ３４１を含むが、これらの要素はＣＴｎＤＯＴと異
なり、故にＣＴｎＤｏｔトランスポゾンの代わりに、本発明の一般的態様のトランスポゾ
ンは、トランスポゾンが細菌または古細菌宿主細胞に含まれるとき、１以上の細菌または
ファージヌクレオチド標的部位のターゲティングのための１以上の所望のＣＲＩＳＰＲア
レイまたは改変された配列を運搬するＣＴｎＥＲＬまたはＣＴｎ３４１トランスポゾンで
あり得る。
接合性トランスポゾンの伝達を生じさせるために、行われるべき主３工程がある。第一
工程は、共有結合で閉鎖された環状中間体を形成させるための染色体からの切除である。
第二に、一本鎖コピーが、続いて、レシピエント細胞に接合細孔を介して伝達され、その
後、コピーが二本鎖となる。第三に、インタクト二本鎖ＣＴｎがレシピエントの染色体に
統合される。接合性転位は、ＣＴｎのコピーがドナー細胞に残されているため、反復的で
ある。要素が染色体内に存在するため、子孫細胞に垂直にも伝達される。これは、所望の
ＣＲＩＳＰＲアレイまたは改変された配列(および所望によりＣａｓ配列)がＣＴｎｓに存
在するとき、集団内で容易に伝達されるだけでなく、次世代へと極めて安定にも維持され
るため、重要である。これは、例えば、保持抗生物質耐性決定因子で見られるとおりであ
る。さらに、バクテロイデスは、抗生物質耐性決定因子の貯留槽であり、これらの遺伝子
をバクテロイデス属以外の他の生物に散在し、一過性に腸を通る生物にさえ、これらの要
素を伝達すると考えられる。同様に、本発明のアレイまたは改変された配列の貯留槽を、
例えば、肥満、糖尿病またはＩＢＤまたはここに開示する他の何らかの疾患または状態の
処置または予防のため、ヒトまたは非ヒト動物に投与される本発明のベクターに作ること
ができる。
例えば、バクテロイデス細胞(例えば、ヒトまたは非ヒト動物の腸または口腔において)
に含まれることが可能なトランスポゾン(例えば、ＣＴｎＤｏｔ)に含まれる１以上のアレ
イまたは配列の使用により、所望のＣＲＩＳＰＲアレイまたは改変された配列の貯留槽を
利用でき、ここでアレイ／配列は、宿主バクテロイデス細胞の配列を標的とせず、異なる
種(例えば、ファーミキューテス細胞または病原性細菌細胞、例えば、ストレプトコッカ
ス、クロストリジウム・ディフィシル、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ、リステリ
ア、エルシニア、シゲラまたはカンピロバクター細胞)の腸内微生物相細胞(例えば、細菌
細胞)に含まれるヌクレオチド配列を標的とする。それ故に、この方法で、本発明のアレ
イまたは配列の隣接するレシピエントである病原性または望ましくない細菌への伝達を実
施でき、レシピエント細胞の中に入ったら、本発明のアレイは、宿主細胞における各標的
部位にＣａｓをガイドし、その部位を修飾(例えば、切断)するのに動作可能である。この
場合、アレイ／配列は、アレイ／配列がレシピエント細胞内の内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ
ｓシステムと共に動作可能であり得るように、目的のレシピエント細胞に見られる反復配
列を含み得る。これは、本発明のベクター、改変された配列またはトランスポゾンにＣａ
ｓおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡコード化配列を包含させる必要性をなくし、それによ
り空間を解放し、構築を単純化する。空間の増加は、より多くのスペーサーを、レシピエ
ント細胞におけるより多くの標的部位を標的とするために挿入することを可能とするのに
有用である。代替として、トランスポゾンアレイまたは配列は、タイプII Ｃａｓ９コー
ド化配列および同族反復配列を含む。例えば、Ｃａｓ９(ここに記載する任意のＣａｓ９)
はストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・サーモフィルスまたはスタフ
ィロコッカス・アウレウスＣａｓ９であり、所望によりニッカーゼまたはｄＣａｓ９(“
死Ｃａｓ９”)であり得る。バクテロイデスが偏性嫌気性菌(または嫌気性環境を強く好む
)であり、一般に腸環境外で病原性であるため、例えば、ヒトまたは動物の腸または口腔
に投与するとき、本発明のベクターまたはトランスポゾンの運搬体としてバクテロイデス
細胞を使用することは望ましくないかもしれない。これに取り組むため、本発明は、本発
明のベクター、改変された配列またはトランスポゾンを有する細菌の運搬体集団を提供し
、ここで運搬体細菌はこのようなベクター、配列またはトランスポゾンと適合性であり、
それによりベクター、配列またはトランスポゾンが、運搬体とレシピエント細菌が混合さ
れたとき、腸内微生物相におけるレシピエント宿主細菌細胞(例えば、バクテロイデス)に
水平伝播可能である。例えば、運搬体細菌は、ヒトまたは非ヒト動物消費用飲料(例えば
、ここに記載するもののようなプロバイオティク飲料)または食糧に含まれ、それにより
運搬体細菌は、ヒトまたは動物が有する(例えば、口腔または腸に)レシピエント細菌と混
合され得る。ある実施態様において、ベクター、配列またはトランスポゾンは本発明のＣ
ＲＩＳＰＲアレイを含み、ここでアレイ標的ヌクレオチド配列は、標的配列を、例えば、
配列を切断して、標的配列を含む遺伝子を不活性化することにより、修飾するために、レ
シピエント細胞に含まれる。代替として、ベクター、配列またはトランスポゾンは、第一
レシピエント細菌と異なる種である細菌の第二レシピエント集団に水平伝播(例えば、接
合性トランスポゾン伝達)可能であり、ここでヌクレオチド配列標的部位は第二レシピエ
ント細菌に含まれるが、第一レシピエント細菌に含まれず、それにより標的部位が第二レ
シピエント細菌(宿主細胞)におけるＣａｓにより修飾される。
例えば、第一レシピエント細菌はバクテロイデス細菌であり、第二レシピエント細菌は
ファーミキューテスまたは病原性細菌、例えば、腸内細菌である。例えば、運搬体細菌は
、運搬体細菌、第一細菌および第二細菌に含まれることができる１以上の接合性トランス
ポゾン(例えば、ＣＴｎＤｏｔトランスポゾン)を含む本発明のベクター(例えば、ファー
ジまたはプラスミド)を含み、例えば、ここでトランスポゾンはｏｒｉＴおよび運搬体細
菌を含み、第一細菌および第二細菌はｏｒｉＴと適合性である。
代替として、運搬体細菌は、例えば、動物または非ヒト動物、例えば、腸、口腔または
全身(例えば、血中)のファーミキューテスまたは病原性細菌に、本発明のベクター、改変
された配列またはトランスポゾンを直接伝達できる。例えば、病原性細菌は、クロストリ
ジウム・ディフィシル、ヘリコバクター・ピロリ、病原性エシェリキア・コリ、サルモネ
ラ、リステリア、エルシニア、シゲラ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコ
ッカスまたはカンピロバクター細菌である。
例えば、運搬体細菌は、ラクトバチルス種(例えば、アシドフィルス(例えば、Ｌａ－５
、Ｌａ－１４またはＮＣＦＭ)、ブレビス、ブルガリクス、プランタルム、ラムノサス、
ファーメンタム、コーカシクス、ヘルベティカス、ラクティス、ロイテリまたはカゼイ、
例えば、カゼイ・シロタ)、ビフィドバクテリウム種(例えば、ビフィドゥム、ブレベ、ロ
ングムまたはインファンティス)、ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびエンテロ
コッカス・フェシウムからなる群から選択される１以上の種の細菌である。例えば、細菌
はラクトバチルス・アシドフィルス細菌である。
可動性トランスポゾンは、可動性プラスミドと同様、自己伝達できないが、ＴｃＲヘル
パー要素存在間、細胞間で伝達され得る。最も一般的に検討されているこのクラスのバク
テロイデストランスポゾンは、Ｔｎ４３９９、Ｔｎ４５５５および非複製的バクテロイデ
ス単位を含む。可動性トランスポゾンＴｎ４５５５は、例えば、臨床単離バクテロイデス
・ブルガタスにおける伝播性セフォキシチン耐性の研究中に最初に検出された。ある実施
態様において、それ故に、本発明のトランスポゾンは、１以上の本発明のアレイまたは配
列を含む、可動性トランスポゾン(例えば、バクテロイデス可動性トランスポゾン)、例え
ば、Ｔｎ４３９９またはＴｎ４５５５である。トランスポゾンはＴｃＲヘルパー要素と組
み合わされる。
例えば、本発明のトランスポゾンは、エンテロコッカスＴｎ９１６またはグラム陽性Ｔ
ｎ１５４６トランスポゾンである。トランスポゾン(例えば、ＣＴｎＤｏｔ、Ｔｎ４３９
９またはＴｎ４５５５トランスポゾンに関して)は、例えばその末端反復および／または
トランスポザーゼまたはリゾルバーゼコード化配列により特徴付けできる。別の例におい
て、ベクターまたはトランスポゾンは、ｐＭＢ１、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、Ｒ６Ｋ(
ｐｉｒ遺伝子との組み合わせ)、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、Ｆ１およびｐＵＣから選択さ
れる複製起点を含む。例えば、トランスポゾンは、トランスポゾン可動化または伝達に必
要な因子(例えば、抗生物質、例えば、テトラサイクリン)と組み合わされる。例えば、ト
ランスポゾンは抗生物質耐性遺伝子(例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子)を含み、トラ
ンスポゾンは該抗生物質と組み合わされる(例えば、ヒトに該抗生物質と同時にまたは逐
次的に投与される)。例えば、トランスポゾンは同族トランスポザーゼと組み合わされた
ｐｉｇｇｙＢａｃ、ＭａｒｉｎｅｒまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾ
ンである。例えば、トランスポゾンはクラスＩトランスポゾンである。例えば、トランス
ポゾンはクラスIIトランスポゾンである。例えば、トランスポゾンはＴｎファミリートラ
ンスポゾンである。
細菌宿主における抗生物質耐性ターゲティング
抗生物質耐性は、世界的な問題である。抗生物質耐性の新規形態は国境を越え、大陸間
を容易に拡散できる。多くの形態の耐性が、相当な速度で拡散した。世界保健リーダーは
、抗生物質耐性微生物を“悪夢細菌”であり、世界の全ての国の人々に“壊滅的脅威をも
たらす”と述べている。米国で、毎年少なくとも２百万人が、感染処置が企図される抗生
物質の１以上に耐性である細菌による重度感染を獲得する。少なくとも２３,０００人が
これらの抗生物質耐性感染の直接の結果として毎年死亡する。さらに多くが、抗生物質耐
性感染に合併する他の状態により死亡する。さらに、毎年約２５０,０００人が、クロス
トリジウム・ディフィシル(C. difficile)感染による入院加療を必要とする。これらの感
染の大部分で、抗生物質の使用が、病気に至る主要因である。米国で少なくとも１４,０
００名が、C. difficile感染により毎年死亡する。これらの感染の多くが予防できたはず
である。抗生物質耐性感染は、既に負担が掛かりすぎている米国および他の健康管理シス
テムに相当なかつ不可避の費用を加える。大部分、抗生物質で用意に処置可能な感染と比
較して、抗生物質耐性感染は長期および／または高価な処置を必要とし、長期入院、さら
なる通院および健康管理使用を必要とし、大きな身体障害および死亡にいたる。米国経済
への抗生物質耐性の総経済的費用は計算が困難である。見積もりは多様であるが、２００
億ドル超もの高額が直接健康管理費用であり、これに加えて生産性喪失による社会へのさ
らなる費用は年間３５０億ドルもの高額である(２００８ドル)とされる。抗生物質の使用
は、世界中で抗生物質耐性に至る唯一の最も重要な因子である。抗生物質は、ヒト医薬で
使用される最も一般的に処方されている薬物の一つである。しかしながら、人々に処方さ
れる全抗生物質の最大５０％が不要であるかまたは処方するには最適に効果的ではない。
抗生物質は、疾患の管理および処置のために、さらに食糧生産動物の成長を促すために、
食用動物にでも一般的に使用されている。成長を促すための抗生物質の使用は必要ではな
く、この実施は減らすべきである。米国食品医薬品局(ＦＤＡ)の最近のガイドラインは、
この目標に向けた行程を記載している。食用動物で使用されている薬物の量とヒトで使用
されている量を直接比較するのは困難であるが、食品生産において使用される抗生物質が
多いとの証拠がある。
抗生物質耐性増加の他の主要因子は、細菌の耐性株の人から人へのまたは環境における
食品を含む非ヒト源から人への拡散である。これらのこれらの致命的感染との戦いを助け
る次の４つの中心的活動がある。１. 感染予防および耐性拡散予防、２. 耐性細菌追跡、
３. 現在の抗生物質使用の改善および４. 新規抗生物質開発の促進および耐性細菌の新規
診断の開発。細菌は、必然的に我々が開発した抗生物質に耐性となる方法を見つけ、これ
が、なぜ新規耐性の出現を抑制し、既に拡散している耐性を阻止するために積極的活動が
現在必要であるかという理由である。
本発明は、抗生物質耐性宿主をターゲティングするおよび宿主が本発明の組成物にさら
なる耐性を発現する可能性を減らす改善された手段を提供する。
宿主細胞および本発明を使用するこのような細胞における抗生物質耐性のターゲティン
グのさらなる例は次のとおりである。
１. 所望により宿主細胞が、例えば、メチシリン、バンコマイシン、リネゾリド、ダプト
マイシン、キヌプリスチン、ダルホプリスチンおよびテイコプラニンから選択される抗生
物質に耐性であるスタフィロコッカス・アウレウス細胞であり、宿主標的部位(または標
的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
２. 所望により宿主細胞が、例えば、セファロスポリン類(例えば、セフタジジム)、カル
バペネム類(例えば、イミペネムまたはメロペネム)、フルオロキノロン類、アミノグリコ
シド類(例えば、ゲンタマイシンまたはトブラマイシン)およびコリスチンから選択される
抗生物質に耐性のシュードモナス・エルギノーサ細胞であり、宿主標的部位(または標的
部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
３. 所望により宿主細胞が、例えば、カルバペネムに耐性のクレブシエラ(例えば、ニュ
ーモニエ)細胞であり、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿
主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
４. 所望により宿主細胞が、例えば、エリスロマイシン、クリンダマイシン、ベータ－ラ
クタム、マクロライド、アモキシシリン、アジスロマイシンおよびペニシリンから選択さ
れる抗生物質に耐性に耐性であるストレプトコッカス(例えば、サーモフィルス、ニュー
モニエまたはピオゲネス)細胞であり、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生
物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
５. 所望により宿主細胞が、例えば、セフトリアキソン、アジスロマイシンおよびシプロ
フロキサシンから選択される抗生物質に耐性のサルモネラ(例えば、血清型チフィ)細胞で
あり、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する
遺伝子に含まれる。
６. 所望により宿主細胞が、例えば、シプロフロキサシンおよびアジスロマイシンから選
択される抗生物質に耐性のシゲラ細胞であり、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が
該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
７. 所望により宿主細胞が、例えば、イソニアジド(ＩＮＨ)、リファンピシン(ＲＭＰ)、
フルオロキノロン、アミカシン、カナマイシンおよびカプレオマイシンから選択される抗
生物質に耐性のマイコバクテリウム・ツベルクローシス細胞であり、アジスロマイシンお
よび宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺
伝子に含まれる。
８. 所望により宿主細胞が、例えば、バンコマイシンに耐性のエンテロコッカス細胞であ
り、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺
伝子に含まれる。
９. 所望により宿主細胞が、例えば、セファロスポリンおよびカルバペネムから選択され
る抗生物質に耐性の腸内細菌科細胞であり、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該
抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
１０. 所望により宿主細胞が、例えば、トリメトプリム、ニトロフラントイン、セファレ
キシンおよびアモキシシリンから選択される抗生物質に耐性のエシェリキア・コリ細胞で
あり、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する
遺伝子に含まれる。
１１. 所望により宿主細胞が、例えば、フルオロキノロン抗生物質およびカルバペネムム
から選択される抗生物質に耐性のクロストリジウム(例えば、ディフィシル)細胞であり、
宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子
に含まれる。
１２. 所望により宿主細胞が、例えば、セフィキシム(例えば、経口セファロスポリン)、
セフトリアキソン(注射可能セファロスポリン)、アジスロマイシンおよびテトラサイクリ
ンから選択される抗生物質に耐性のナイセリア・ゴノレー細胞であり、宿主標的部位(ま
たは標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
１３. 所望により宿主細胞が、例えば、ベータ－ラクタム、メロペネムおよびカルバペネ
ムから選択される抗生物質に耐性のアシネトバクター・バウマンニ細胞であり、宿主標的
部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれ
る。
１４. 所望により宿主細胞が、例えば、シプロフロキサシンおよびアジスロマイシンから
選択される抗生物質に耐性のカンピロバクター細胞であり、宿主標的部位(または標的部
位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
１５. 所望により、宿主細胞がベータ(β)－ラクタマーゼを産生する。
１６. 所望により、宿主細胞が、例１～１４の何れかに記載の抗生物質に耐性である細菌
宿主細胞である。
ある実施態様において、宿主細胞はＵＳＡ３００スタフィロコッカス・アウレウス株細
胞である。
例えば、本または各宿主標的配列は、宿主細胞、例えば、スタフィロコッカス・アウレ
ウスプラスミド(例えば、ＵＳＡ３００株)のプラスミドに含まれる、例えば、スタフィロ
コッカス・アウレウス細胞のｐＵＳＡ０１、ｐＵＳＡ０２またはｐＵＳＡ０３プラスミド
に含まれる標的である。例えば、第一および／または第二標的は宿主ｍｅｃＡ、ｍｅｃＡ
２またはｓｅｋ遺伝子配列(例えば、スタフィロコッカス・アウレウス株細胞の)に含まれ
る。例えば、第一および／または第二標的は宿主病原性島ヌクレオチド(例えば、ＤＮＡ)
配列に含まれる。例として、本発明のスペーサーは、ＷＯ２０１４／１２４２２６号の２
６頁の表１に開示されたスペーサーを含むかまたはこれからなり、このスペーサー配列を
引用によりここに包含させる。例えば、改変された配列、ＨＭ－ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮ
Ａはこのようなスペーサーを含む。
マウス皮膚コロニー形成アッセイにおいて抗生物質耐性細菌宿主を減らすまたは殺すま
たは増殖を阻害するのに有効である本発明の組成物、使用、方法システム、ベクター、収
集物、アレイ、改変された配列、ウイルス、ファージ、ファージミド、プロファージまた
はビリオン(例えば、ＷＯ２０１４／１２４２２６号、Kugelberg E, et al. Establishme
nt of a superficial skin infection model in mice by using Staphylococcus aureus
and Streptococcus pyogenes. Antimicrob Agents Chemother. 2005;49:3435-3441または
Pastagia M, et al. A novel chimeric lysin shows superiority to mupirocin for ski
n decolonization of methicillin-resistant and -sensitive Staphylococcus aureus s
trains. Antimicrob Agents Chemother. 2011;55:738-744に開示のとおり)であり、ここ
で第一および／または第二標的は該抗生物質に耐性を与える宿主遺伝子に含まれ、例えば
、ここで宿主はスタフィロコッカス・アウレウス(例えば、ＵＳＡ３００株)宿主である。
対照ストレプトコッカス・ピオゲネス配列は、Genbank accession number NC_002737下
利用可能であり、ｃａｓ９遺伝子は８５４７５７～８５８８６３位である。ストレプトコ
ッカス・ピオゲネスＣａｓ９アミノ酸配列は番号NP_269215の下入手可能である。これら
の配列は、本発明における使用のために、引用によりここに包含させる。２０１５００７
９６８０号に、明示的であれ、その中での引用により包含されるものであれ、開示されて
いるさらなる配列も、本発明における使用のために引用によりここに包含させる。引用に
よりここに包含させるＷＯ２０１３／１７６７７２号の配列および方法もまた参照のこと
。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列例は、本発明における使用のために引用によりここに包含させる
ＷＯ２０１４／１２４２２６号の１５頁に開示のものである。
例えば、本および各反復は、２０～５０(例えば、２４～４７、例えば、３０、２９、
２８、２７、２６、２５または２４)連続ヌクレオチド長を含むまたはこれからなる。
例えば、本および各スペーサーは、１８～５０(例えば、２４～４７または２０～４０
、例えば、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９
、１８)、例えば、１９または２０連続ヌクレオチド長を含むまたはこれからなる。
例えば、第一反復(本発明のＨＭ－アレイにおける最も５’)は、第一宿主標的を含む配
列に相補的であるスペーサー配列に直ぐ５’である。これは、新たに獲得されたスペーサ
ー(例えば侵入ファージ配列の)が、細菌のこの位置に一般に取り込まれるために有用であ
り、故に本発明の第一スペーサーのこの方法での配置は、その使用の促進に有用である。
例えば、ウイルス(例えば、ファージ)核酸は複製起点(ｏｒｉ)および包装部位を含む。
例えば、ウイルスの核酸は、必須カプシドタンパク質をコードする一つ、複数または全遺
伝子、例えば、ｒｉｎＡ、ｔｅｒＳおよびｔｅｒＬ遺伝子も含む。例えば、これらの一つ
、複数または全ては、代わりに、本発明のウイルスと共感染させるためであるコンパニオ
ンヘルパーウイルス(例えば、ヘルパーファージ)に含まれる － これは、宿主で動作可
能な多くのＨＭ－アレイ核酸および／多くのＣａｓコード化核酸を包含させるために、本
発明ウイルスの空間を解放する。例えば、ウイルス核酸は野生型ファージゲノムのフラグ
メントを含み、ここでフラグメントは少なくともｒｉｎＡ、ｔｅｒＳおよびｔｅｒＬ遺伝
子またはファージタンパク質をコードする同等遺伝子を含むゲノムの連続的ヌクレオチド
からなる。
例えば、宿主細胞は、ヒト微生物相に見られる株または種のものである。
例えば、本または各標的部位は、宿主病原性接着、コロニー形成、侵襲、免疫応答阻害
、病原性、必須タンパク質もしくは機能発現または毒素産生に介在する遺伝子に含まれる
。例えば、遺伝子は、細胞毒、アルファ－ヘモリシン、ベータ－ヘモリシン、ガンマ－ヘ
モリシン、ロイコシジン、Panton-Valentineロイコシジン(ＰＶＬ)、外毒素、ＴＳＳＴ－
１、エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣｎ、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ＳＥＧ、ＳＥＨ、
ＳＥＩ、表皮剥脱毒素、ＥＴＡまたはＥＴＢをコードする遺伝子であり、所望によりここ
で宿主はスタフィロコッカス・アウレウス、例えば、ＭＲＳＡである。
例えば、本または各ＣＲＩＳＰＲアレイは、ここに開示する形態、実施態様、例、コン
セプト、態様、段落または項の何れかのアレイである。例えば、本または各改変されたヌ
クレオチド配列は、ここに開示する形態、実施態様、例、コンセプト、態様、段落または
項の何れかの改変されたヌクレオチド配列である。
例えば、本または各ベクターは、ここに開示する形態、実施態様、例、コンセプト、態
様、段落または項の何れかのベクターである。
ここに開示する形態、実施態様、例、態様、段落または項による例えば、ベクターまた
はＭＧＥはｃａｓｐｏｓｏｎであるまたはこれを含む。ＭＧＥはさらに下に記載する。例
えば、ｃａｓｐｏｓｏｎは、ファミリー１、２または３のｃａｓｐｏｓｏｎである。例え
ば、本発明のＭＧＥは、ｃａｓｐｏｓｏｎ末端逆向き反復および所望によりｃａｓｐｏｓ
ｏｎ Ｃａｓ１コード化配列を含む。例えば、本発明のＭＧＥは、ｃａｓｐｏｓｏｎマイ
ナスＣａｓ１であるかまたはこれを含み、宿主細胞のＣａｓ１と共に可動化のために動作
可能である。MC Biol. 2014 May 19;12:36. doi: 10.1186/1741-7007-12-36, “Casposon
s: a new superfamily of self-synthesizing DNA transposons at the origin of proka
ryotic CRISPR-Cas immunity”, Krupovic M et al for details of casposons参照。
本発明のさらなる適用例
例えば、組成物(例えば、抗生物質と組み合わされたＨＭ－組成物または改変された配
列)は次の何れかである。例えば、組成物は、医科、眼科、歯科または医薬組成物(例えば
、抗宿主ワクチンに含まれる)である。例えば、組成物は抗微生物組成物、例えば、抗生
物質または抗ウイルス、例えば、医薬、殺菌剤または口腔洗浄剤である。例えば、組成物
は、化粧品組成物(例えば、顔または体のメイクアップ組成物)である。例えば、組成物は
除草剤である。例えば、組成物は殺虫剤(例えば、宿主がバチルス(例えば、チューリンゲ
ンシス)宿主であるとき)である。例えば、組成物は飲料(例えば、ビール、ワインまたは
アルコール飲料)添加物である。例えば、組成物は食品添加物(例えば、宿主がエシェリキ
ア・コリ、サルモネラ、リステリアまたはクロストリジウム(例えば、ボツリヌム)宿主で
あるとき)である。例えば、組成物は水添加物である。例えば、組成物は、水生動物環境(
例えば、魚用水槽における)添加物である。例えば、組成物は石油または石油化学工業組
成物であるかまたはこのような組成物に含まれる(例えば、宿主が硫酸還元細菌、例えば
、デスルホビブリオ宿主であるとき)。例えば、組成物は石油または石油化学添加物であ
る。例えば、組成物は化学添加物である。例えば、組成物は殺菌剤(例えば、ヒトまたは
動物使用のため、例えば、外科的または医学的使用または赤ちゃんの食餌のための装置の
殺菌)である。例えば、組成物は、ヒトまたは動物使用のための個人衛生組成物である。
例えば、組成物は環境使用、例えば、土壌処理または環境除染のための組成物(例えば、
汚水または石油、石油化学または化学から、例えば、宿主が硫酸還元細菌、例えば、デス
ルホビブリオ宿主であるとき)である。例えば、組成物は植物成長刺激因子である。例え
ば、組成物は、石油、石油化学、金属または鉱物抽出において使用するための組成物であ
る。例えば、組成物は布処理または添加物である。例えば、組成物は動物皮革、革製品ま
たはスエード処理または添加物である。例えば、組成物は染料添加物である。例えば、組
成物は飲料(例えば、ビールまたはワイン)醸造または発酵添加物(例えば、宿主がラクト
バチルス宿主であるとき)である。例えば、組成物は紙添加物である。例えば、組成物は
インク添加物である。例えば、組成物は接着剤添加物である。例えば、組成物は抗ヒトま
たは動物または植物寄生虫組成物である。例えば、組成物は空気添加物(例えば、エアコ
ンディショニング装置におけるまたはそれにより産生される空気のための、例えば、宿主
がレジオネラ宿主)である。例えば、組成物は凍結防止添加物(例えば、宿主がレジオネラ
宿主であるとき)である。例えば、組成物は洗眼または眼科組成物(例えば、コンタクトレ
ンズ流体)である。例えば、組成物は乳製品食品(例えば、組成物はミルクまたは乳製品で
あるまたはこれに含まれる；例えば、ここで宿主はラクトバチルス、ストレプトコッカス
、ラクトコッカスまたはリステリア宿主である)に含まれる。例えば、組成物は家庭用ま
たは工業用洗浄製品(例えば、宿主がエシェリキア・コリ、サルモネラ、リステリアまた
はクロストリジウム(例えば、ボツリヌム)宿主であるとき)であるまたはこれに含まれる
。例えば、組成物は燃料に含まれる。例えば、組成物は溶媒(例えば、水以外)に含まれる
。例えば、組成物はベーキング添加物(例えば、食品ベーキング添加物)である。例えば、
組成物は研究室試薬(例えば、生命工学または組み換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術において
使用)である。例えば、組成物は、繊維浸漬剤に含まれる。例えば、組成物は、ビタミン
合成過程に使用するためであるる。例えば、組成物は抗作物または植物腐敗組成物(例え
ば、宿主が腐生栄養性細菌であるとき)である。例えば、組成物は、例えば、金属腐食を
阻止または減少するための、抗腐食化合物(例えば、宿主が硫酸還元細菌、例えば、デス
ルホビブリオ宿主であるとき、例えば石油抽出、処理または封じ込め装置、金属抽出、処
理または封じ込め装置または鉱物抽出、処理または封じ込め装置の腐食の減少または阻止
に使用するため)である。例えば、組成物は農業または畜産組成物であるかまたはこのよ
うな組成物に含まれる。例えば、組成物は貯蔵牧草添加物である。本発明は、この段落に
記載する組成物の何れかの使用またはこの段落に記載する適用の何れかにおける使用のた
めの、ここに記載するＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイ、ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
、ＨＭ－ｃｒＲＮＡ、ＨＭ－スペーサー、ＨＭ－ＤＮＡ、ＨＭ－Ｃａｓ、ＨＭ－組成物ま
たはｇＲＮＡを提供し、例えば、ここで宿主細胞は微生物細胞または細菌もしくは古細菌
細胞である。本発明は、この段落に記載した適用の何れかのための方法を提供し、ここで
方法は、本発明のＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイ、ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｈ
Ｍ－ｃｒＲＮＡ、ＨＭ－スペーサー、ＨＭ－ＤＮＡ、ＨＭ－Ｃａｓ、ｇＲＮＡまたはＨＭ
－組成物と、宿主細胞(例えば、微生物、細菌または古細菌細胞)をあわせることを含む。
ある実施態様において、宿主細胞はヒト(またはヒト胚)または動物中または上に存在しな
い。
本発明の態様の何れも、産業用または家庭用使用のためであるかまたはこのような使用
のための方法に利用される。例えば、農業、石油または石油産業、食品または飲料産業、
衣料品産業、包装産業、電子機器産業、コンピューター産業、環境産業、化成品産業、航
空宇宙産業、自動車産業、生命工学産業、医療産業、健康産業、歯科産業、エネルギー産
業、消費財産業、製薬産業、採鉱産業、清掃産業、林業、漁業、娯楽産業、リサイクリン
グ産業、化粧品産業、プラスチック産業、パルプまたは紙産業、繊維産業、衣料品産業、
革製品またはスエードまたは動物皮革の産業、タバコ産業または製鋼産業用であるかまた
はこれらで使用される。
ここで、デスルホビブリオ宿主が記載されているとき、宿主は、代わりにデスルフォバ
ルブス、デスルフォバクター、デスルフォバクテリウム、デスルフォコッカス、デスルホ
モニレ、デスルフォネーマ、デススルホボトラスまたはデススルホアルクラス宿主である
かまたはここに開示する任意の他の硫黄還元細菌である。ある実施態様において、油、水
、汚水または環境適用のために、宿主はデスルホビブリオ・キャピラタス宿主である。
大規模な微生物学的分析および１６Ｓ ｒＲＮＡ配列決定は、デスルホビブリオ属が、
環境から単離され得る約８つの異なる硫酸還元性真正細菌群のうちの１つに過ぎないこと
を示している。これらの群の７種はグラム陰性であるが、１種はグラム陽性細菌(デスル
ホトマキュラム)である。デスルホビブリオ属は、むしろ小さいゲノムを有する。最初の
推定はデスルホビブリオ・ブルガリスおよびデスルホビブリオ・ギガス(これは本発明の
宿主であり得る)のゲノムについてそれぞれ１.７Mbpおよび１.６Mbpであった。これは、
本発明において使用するための所望の標的配列(例えば、必須または耐性遺伝子における
配列)の同定を助ける。デスルホビブリオ・デスルフリカンス(これは本発明の宿主であり
得る)Ｇ２００の常在性プラスミドの特徴づけは、シャトルベクターの構築を可能とし(Wa
ll 1993、このベクターは本発明のベクターとして使用し得る)、デスルホビブリオ・ブル
ガリス・ヒルデンバラ(これは本発明の宿主であり得る)からの２バクテリオファージの単
離および特徴づけ(Seyedirashti, 1992)は、デスルホビブリオ属の能率的遺伝子操作の他
の方法を提供し得る。例えば、ベクターはミューまたはミュー様バクテリオファージであ
る。
宿主の例はデスルホビブリオ・ブルガリス亜種ブルガリス・ポストゲイトおよびキャン
ベル(ＡＴＣＣ(登録商標)２９５７９TM)株命名：NCIB 8303[DSM 644、ヒルデンバラ]であ
る。
細菌のマイトマイシンＣまたはＵＶでの処理が、以前、細菌からのファージの誘発に使
用されており(Driggers & Schmidt)、これは、本発明の例または態様の何れかにおけ
る使用のためのベクターを産生するために適当な宿主適合ファージを得るための適当な方
法である。
本発明の適用は、乳製品産業(例えば、チーズまたはバターまたは乳製品製造)または発
酵(例えば、ワインまたは酢または大豆)またはビール醸造または製パン産業における。例
えば、乳製品産業適用のために、本発明の方法は、培養から乳酸を産生するために一定期
間乳酸産生細菌(例えば、ラクトバチルス宿主細胞)の培養を発酵させ、その後細菌と混合
した１以上の本発明のアレイ、システム、ベクター、集団または収集物からｃｒＲＮＡを
発現させることにより細菌の増殖を阻止し、それにより細菌による乳酸製造を減少または
阻止することを含む、乳製品食品の製造方法である。これは、食品／飲料の腐敗または望
ましくない食品／飲料の味および／または香りの抑制に有用である。一例において、細菌
に誘導可能ＨＭ－アレイが含まれ、ここで方法は、最初の期間の後誘発剤を添加すること
を含む。
引用文献
Wall, J. D., B. J. Rapp-Giles, and M. Rousset. 1993. “Characterization of a sma
ll plasmid from Desulfovibrio desulfuricans and its use for shuttle vector const
ruction”. J. Bacteriol. 175:4121-4128;
Seyedirashti S et al; J Gen Microbiol. 1992 Jul;138(7):1393-7, “Molecular chara
cterization of two bacteriophages isolated from Desulfovibrio vulgaris NCIMB 830
3 (Hildenborough)”;
Driggers & Schmidt, J. gen. Virol. (I97O), 6, 421-427, “Induction of Defect
ive and Temperate Bacteriophages in Caulobacter”
コンセプト：
混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率の改変、例えば、ｉｎ微生
物相
１. 混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率を変えるための宿主修
飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用であって、第二細菌は宿主細胞に含まれ、
各宿主細胞について、システムは(ｉ)～(iv)
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ－スペーサー)および反復を含む
宿主細胞標的配列および改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ－
ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞
標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列；
(iv)ここで、システムの該要素は、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの
核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ－ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿
主細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを修飾し；そして
ここで標的配列がＣａｓにより修飾され、それにより宿主細胞を死滅させるかまたは宿主
細胞増殖を減少させる
の要素を含む。
２. 細菌宿主細胞の標的ヌクレオチド配列修飾のためのコンセプト１の使用のための宿主
修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであって、ｉ)～(iv)
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ－スペーサー)および反復を含む
宿主細胞標的配列および改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ－
ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞
標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するためのＤＮＡ
配列；
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくとも一つ
の核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ－ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、
宿主細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを修飾する
の要素を含む、システム。
３. ベクターまたはベクターがＣａｓ(例えば、Ｃａｓ９)ヌクレアーゼコード化配列を欠
、コンセプト２のシステム。
４. 各宿主細胞がヒト微生物相に見られる株または種のものである、先のコンセプトの何
れかの使用またはシステム。
５. (ａ)混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率の改変、(ｂ)混合細菌集団に
おけるファーミキューテス亜集団(宿主細胞)の比率の減少、(ｃ)混合集団における第一フ
ァーミキューテス種(宿主細胞)の比率の減少であって、ここで混合集団は該ｃＲＮＡによ
り増殖が阻害されない第二ファーミキューテス種を含むもの、(ｄ)混合細菌集団における
第一グラム陽性細菌種(宿主細胞)の比率の減少であって、ここで混合集団は該ｃＲＮＡに
より増殖が阻害されない第二グラム陽性細菌種を含むもの、(ｅ)混合細菌集団におけるあ
る細菌種(宿主細胞)の比率の減少であって、ここで混合集団は該ｃＲＮＡにより増殖が阻
害されない異なる細菌種を含み、ここで第一種は、他の種の１６ｓリボソームＲＮＡコー
ド化ＤＮＡ配列と少なくとも８０％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％または９
５％同一である１６ｓリボソームＲＮＡコード化ＤＮＡ配列を有するもの、(ｆ)混合細菌
集団における第一細菌ヒト腸内微生物相種(宿主細胞、例えば、ファーミキューテス)の比
率の減少であって、ここで混合集団は異なる細菌種を含み、ここで異なる種は該ｃＲＮＡ
により増殖が阻害されないヒト腸プロバイオティク種であるものまたは(ｇ)混合細菌集団
における細菌ヒト腸内微生物相種(宿主細胞、例えば、ファーミキューテス)の比率の減少
であって、ここで混合集団は異なる細菌種を含み、ここで異なる種は該ｃＲＮＡにより増
殖が阻害されないヒト腸片利共生種であるもののためである、コンセプト１または４の使
用。
６. (ａ)混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率の改変、(ｂ)混合細菌集団に
おけるファーミキューテス亜集団(宿主細胞)の比率の減少、(ｃ)混合集団における第一フ
ァーミキューテス種(宿主細胞)の比率の減少であって、ここで混合集団は該ｃＲＮＡによ
り増殖が阻害されない第二ファーミキューテス種を含むもの、(ｄ)混合細菌集団における
第一グラム陽性細菌種(宿主細胞)の比率の減少であって、ここで混合集団は該ｃＲＮＡに
より増殖が阻害されない第二グラム陽性細菌種を含むもの、(ｅ)混合細菌集団におけるあ
る細菌種(宿主細胞)の比率の減少であって、ここで混合集団は該ｃＲＮＡにより増殖が阻
害されない異なる細菌種を含み、ここで第一種は、他の種の１６ｓリボソームＲＮＡコー
ド化ＤＮＡ配列と少なくとも８０％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％または９
５％同一である１６ｓリボソームＲＮＡコード化ＤＮＡ配列を有するもの、(ｆ)混合細菌
集団における第一細菌ヒト腸内微生物相種(宿主細胞、例えば、ファーミキューテス)の比
率の減少であって、ここで混合集団は異なる細菌種を含み、ここで異なる種は該ｃＲＮＡ
により増殖が阻害されないヒト腸プロバイオティク種であるものまたは(ｇ)混合細菌集団
における細菌ヒト腸内微生物相種(宿主細胞、例えば、ファーミキューテス)の比率の減少
であって、ここで混合集団は異なる細菌種を含み、ここで異なる種は該ｃＲＮＡにより増
殖が阻害されないヒト腸片利共生種であるもののための、コンセプト２または３のシステ
ムであって、ここで(ａ)～(ｇ)は、ヒトまたは動物対象における(ｉ)比率が減少される該
細菌種による微生物相感染または(ii)比率が減少される該細菌種が介在する疾患または状
態の処置または予防のためである。
７. ファーミキューテスに対するバクテロイデス門の相対的比率を増加させるための、コ
ンセプト５または６の使用またはシステム。
８. 該Ｃａｓヌクレアーゼが該細胞の内在性タイプII ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに
より提供される、先のコンセプトの何れかの使用またはシステム。
９. 要素(ｉ)が宿主細胞に内在性である、先のコンセプトの何れかの使用またはシステム
。
１０. 標的配列が宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子または必須遺伝子に含ま
れる、先のコンセプトの何れかの使用またはシステム。
１１. 標的配列が宿主染色体配列である、先のコンセプトの何れかの使用またはシステム
。
１２. 代替的にＨＭ－ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)
からなる、例えばベクターにより提供される、先のコンセプトの何れかの使用またはシス
テム。
１３. 宿主細胞が目的のＨＭ配列をコードする遊離末端(ＨＭ－ＤＮＡ)を有するデオキシ
リボ核酸鎖を含むおよび／またはここでシステムがＨＭ－ＤＮＡをコードする配列を含み
、ここでＨＭ－ＤＮＡは、ＨＭ－ＤＮＡを宿主ゲノム(例えば、染色体またはエピソーム
部位)に挿入するために標的配列内にあるまたは隣接する１個以上の配列にそれぞれ相同
である１個以上の配列を含む、先のコンセプトの何れかの使用またはシステム。
１４. 内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む細菌宿主細胞の修飾のためのコンセプ
ト１の使用のための改変された核酸ベクターであって、
(ｇ)前記コンセプトの何れかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは使用における使用の
ための複数の異なるｃｒＲＮＡを発現するための核酸配列を含み(例えば、ｇＲＮＡに含
まれる)；そして
(ｈ)所望によりＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き、
ここで、該ｃｒＲＮＡの第一は該宿主細胞の第一核酸配列とハイブリダイズでき、そして
該ｃｒＲＮＡの第二は該宿主細胞の第二核酸配列とハイブリダイズでき、ここで該第二配
列は該第一配列と異なり；そして
(ｉ)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は抗抗生物質耐
性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、所望により、これらの遺伝子は異なり；
(ｊ)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病
原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み；
(ｋ)第一配列は必須遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝
子(またはそのＲＮＡ)を含むかまたは
(ｌ)第一配列は病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺
伝子(またはそのＲＮＡ)を含む、
ベクター。
１５. ベクターによりコードされるｃＲＮＡ(例えば、単一ガイドＲＮＡ)により動作可能
である１以上のＣａｓを含む宿主細胞内にある、コンセプト１４のベクター。
１６. ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイが同じスペーサーの複数コピーを含む、前記コンセプト
の何れかの使用、システムまたはベクター。
１７. ベクターが複数のＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイを含む、前記コンセプトの何れかの使
用、システムまたはベクター。
１８. 各ベクターがウイルスまたはファージである、前記コンセプトの何れかの使用、シ
ステムまたはベクター。
１９. システムまたはベクターがｃｒＲＮＡ(例えば、ｇＲＮＡ)をコードする核酸配列の
２、３またはそれ以上のコピーを含み、ここでコピーが宿主細胞配列(例えば、病原性、
耐性または必須遺伝子配列)のターゲティングのための同じスペーサー配列を含む、前記
コンセプトの何れかの使用、システムまたはベクター。
２０. コピーが２以上のベクターＣＲＩＳＰＲアレイ間に別れる、コンセプト２０の使用
、システムまたはベクター。
２１. 前記コンセプトの何れかに記載のシステムまたはベクターを含む、細菌宿主細胞。
２２. アレイが抗生物質薬剤と組み合わされるまたは使用が宿主細胞の第一抗生物質への
暴露を含み、ここで標的配列が該第一抗生物質への耐性のために抗生物質耐性遺伝子に含
まれる、前記コンセプトの何れかの使用、システム、ベクターまたは細胞。
２３. 宿主細胞がスタフィロコッカス、ストレプトコッカス、シュードモナス、サルモネ
ラ、リステリア、エシェリキア・コリ、デスルホビブリオまたはクロストリジウム宿主細
胞である、前記コンセプトの何れかの使用、システム、ベクターまたは細胞。
２４. 各ベクターがコンセプト１４または１５に従う、コンセプト１～１３または１６～
２３の何れかの使用、システムまたは細胞。
２５. 宿主細胞集団増殖が、該ＨＭ－アレイまたは該ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド
配列で形質転換されていない該宿主細胞の集団の増殖と比較して少なくとも５倍減少して
いる、前記コンセプトの何れかの使用、システム、ベクターまたは細胞。
２６. 表面上の宿主細胞集団増殖が阻害される、前記コンセプトの何れかの使用、システ
ム、ベクターまたは細胞。例えば、集団はヒト組織表面と接触している(例えば、腸組織
表面、例えば、インビボまたはエクスビボ)。
２７. 第一細菌がヒトとプロバイオティク、片利共生または相利共生である(例えば、ヒ
ト腸における)、前記コンセプトの何れかの使用、システム、ベクターまたは細胞。
２８. 第一細菌および第二細菌が何れもファーミキューテスであり、異なる種または株の
細菌であるかまたはここで第一細菌が腸内細菌科であり、第二細菌がファーミキューテス
である、前記コンセプトの何れかの使用、システム、ベクターまたは細胞。
２９. 宿主細胞が細菌細胞ではなくて古細菌細胞であるかまたは各集団が細菌集団ではな
くて古細菌集団である、前記コンセプトの何れかの使用、システム、ベクターまたは細胞
。
３０. 工業用またはエクスビボ医学的流体、表面、装置またはコンテナまたは水路、水、
飲料、食糧または化粧品の処理のための、コンセプト１、４、５、７～１３、１６～２０
および２２～２９の使用であって、ここで宿主細胞が流体、表面、装置、コンテナ、水路
、水、飲料、食糧または化粧品に含まれるまたは上にある。
３１. ＨＭ－ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡがＮＮＡＧＡＡＷまたはＮＧＧＮＧプロトスペーサ
ー隣接モチーフ(ＰＡＭ)に隣接する宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズ
可能な配列を含む、前記コンセプトの何れかの使用、システム、ベクターまたは細胞。
３２. 前記コンセプトの何れかの使用、システムまたは細胞に従うまたはそれにおいて使
用するための核酸ベクターであって、１.４kbを超える外来性ＤＮＡ配列を含み、ここで
外来性ＤＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの１以上の要素をコードし、宿主細胞にお
けるＨＭ－ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡの発現のための改変されたアレイを含み、ここで外
来性配列は、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡと同族であるＣａｓヌクレアーゼをコードするヌク
レオチド配列を欠き、ここで少なくとも２つの異なるｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは外来性Ｄ
ＮＡにより(例えば、少なくとも２ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイにより)コードされるもの。
３３. ここでベクターが宿主細胞を形質転換できるウイルスベクターである、コンセプト
３２のベクター。
３４. ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは各標的プロトスペーサー配列に対して宿主細胞において
ハイブリダイズでき、ここで各プロトスペーサー配列は抗生物質耐性または必須宿主遺伝
子に含まれる、コンセプト３２または３３のベクター。
３５. 宿主細胞がヒト微生物相種の細胞である、コンセプト３４～３６の何れかのベクタ
ー。
実施態様：
表面の細菌の集団増殖阻害および処理のための野生型内在性Ｃａｓの利用
１. 集団の増殖阻害のための細菌宿主細胞集団の野生型内在性Ｃａｓヌクレアーゼ活性の
使用であって、ここで集団は複数の宿主細胞を含み、各宿主細胞は野生型Ｃａｓヌクレア
ーゼ活性を有する内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを有し、使用は集団の宿主細胞の
形質転換を含み、ここで各形質転換宿主細胞は、宿主細胞における宿主修飾(ＨＭ)ｃＲＮ
ＡまたはガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)の提供のために改変されたヌクレオチド配列で形質転換
され、ＨＭ－ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、内在性Ｃａｓを標的にガイドするための宿主細
胞標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズ可能な配列を含み、ここでｃＲＮＡまたは
ｇＲＮＡが該野生型ヌクレアーゼ活性を有する宿主細胞の内在性Ｃａｓヌクレアーゼと同
族であり、宿主細胞の該形質転換後、集団の増殖が阻害されるもの。
宿主細胞は同じ種または株のものでよい。
２. 宿主細胞集団増殖阻害が、該改変されたヌクレオチド配列で形質転換されていない該
宿主細胞の集団の増殖と比較して、増殖が少なくとも５倍減少している、実施態様１の使
用。
３. 表面上の集団増殖が阻害される、実施態様１の使用。
４. 表面上の集団増殖が阻害される、実施態様２の使用。
５. 該阻害が該宿主細胞の死滅または増殖減少のためのＨＭ－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシス
テムの使用を含み、各宿主細胞について、システムは(ｉ)～(iv)
(ｉ)該Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)スペーサー配列(ＨＭ－スペーサー)および該ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードする反復を含
む改変された宿主修飾ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイ；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列；
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの
核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ－ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを標的にガイドして
、標的配列を修飾するもの；
の要素を含む、実施態様１の使用であって、ここで標的配列はＣａｓにより宿主細胞にお
いて修飾され、それにより宿主細胞が死滅するかまたは宿主細胞増殖が減少する
に従う要素を含む。
６. 混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率の改変のための、先の
実施態様の何れかの使用であって、第二細菌は該宿主細胞を含む。
７. 宿主細胞がヒト微生物相に見られる株または種のものである、実施態様６の使用。
８. 宿主細胞が異なる株または種の細胞と混合され、ここで異なる細胞はヒト(例えば、
ヒト腸における)とプロバイオティク、片利共生または相利共生である腸内細菌科または
細菌である)、実施態様６または７の使用。
９. バクテロイデス門細菌および他の細菌を含む混合細菌集団におけるバクテロイデス門
細菌の比率を変えるための、所望により集団におけるバクテロイデス門の一つ、複数また
は全ファーミキューテス種(例えば、対ストレプトコッカス)に対する比率を増加するため
の、先の実施態様の何れかの使用。
１０. 混合集団における第一細菌対第二細菌の相対比率を変えるための、先の実施態様の
何れかの使用であって、ここで第一細菌および第二細菌が何れもファーミキューテスであ
り、異なる種または株の細菌であり、第二細菌は宿主細胞を含む。例えば、使用は第一対
第二細菌の比率を増加させる。
１１. 改変されたヌクレオチド配列が外来性Ｃａｓヌクレアーゼコード化配列と組み合わ
されない、実施態様１の使用。
１２. １個または複数のベクターがＣａｓヌクレアーゼコード化配列を欠く、実施態様５
の使用。
１３. 各宿主細胞がヒト微生物相に見られる株または種のものである、実施態様１の使用
。
１４. 各宿主細胞がヒト微生物相に見られる株または種のものである、実施態様６の使用
。
１５. 各宿主細胞が異なる株または種の細胞と混合され、ここで異なる細胞はヒト(例え
ば、ヒト腸における)とプロバイオティク、片利共生または相利共生である腸内細菌科ま
たは細菌である)、実施態様１３の使用。
１６. 使用がバクテロイデス門細菌および他の細菌を含む混合細菌集団におけるバクテロ
イデス門細菌の比率を変え、所望によりここで使用が集団におけるバクテロイデス門対一
つ、複数または全ファーミキューテス(例えば、ストレプトコッカス)種の相対比率を変え
る、実施態様１の使用。
１７. 第一細菌および第二細菌が両者ともファーミキューテスであり、使用が混合集団に
おける第一対第二細菌の相対比率を変える、実施態様１の使用。例えば、使用は第一対第
二細菌の比率を増加させる。
１８. 該Ｃａｓヌクレアーゼが宿主細胞内在性タイプII ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
および／またはＨＭ－ｃＲＮＡにより提供されるかまたはｇＲＮＡが５’－ＮＮＡＧＡＡ
Ｗ－３’プロトスペーサー隣接モチーフ(ＰＡＭ)に隣接する宿主細胞標的プロトスペーサ
ー配列とハイブリダイズ可能な配列を含む、実施態様１の使用。
１９. 該Ｃａｓヌクレアーゼが宿主細胞内在性タイプII ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
により提供される、実施態様５の使用。
２０. 要素(iii)が宿主細胞に内在性である、実施態様５の使用。
２１. 各形質転換宿主細胞が細胞における該ＨＭ－ｃｒＲＮＡの産生における要素(ii)と
共に動作可能な内在性ＲＮａｓｅ IIIを含む、実施態様５の使用。
２２. 標的配列が宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子または必須遺伝子に含ま
れる、実施態様１の使用。
２３. 改変されたヌクレオチド配列が抗生物質薬剤と組み合わされる、実施態様１の使用
。
２４. ＨＭ－ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)からなる
、実施態様５の使用。
２５. 形質転換が各々目的のＨＭ配列をコードする遊離末端(ＨＭ－ＤＮＡ)を含むデオキ
シリボ核酸鎖を含み、ここでＨＭ－ＤＮＡが、ＨＭ－ＤＮＡの宿主ゲノムへの挿入のため
に標的配列におけるまたは隣接する配列または複数配列とそれぞれ相同である配列または
複数配列を含み、ここでＨＭ－ＤＮＡ配列が宿主細胞ゲノムに挿入される、実施態様１の
使用。
２６. 宿主細胞プロトスペーサー標的配列とのハイブリダイズのために宿主細胞複数の異
なるｃｒＲＮＡ(またはｇＲＮＡ)での発現を含み、ここで、該ｃｒＲＮＡ(またはｇＲＮ
Ａ)の第一は第一プロトスペーサー核酸配列とハイブリダイズでき、そして該ｃｒＲＮＡ(
またはｇＲＮＡ)の第二は第二プロトスペーサー核酸配列とハイブリダイズでき、ここで
該第二配列は該第一配列と異なり；そして
(ａ)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は抗抗生物質耐
性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、所望により、これらの遺伝子は異なり；
(ｂ)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病
原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み；
(ｃ)第一配列は必須遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝
子(またはそのＲＮＡ)を含むかまたは
(ｄ)第一配列は病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺
伝子(またはそのＲＮＡ)を含む、
実施態様１の使用。
２７. 宿主細胞がヒトまたは動物対象に含まれる混合細菌集団に含まれ、使用が(ｉ)混合
集団に含まれる該宿主細胞による対象における感染を処置する；(ii)対象における該宿主
細胞が介在する状態または疾患を処置するまたはリスクを減少させる；(iii)該宿主細胞
が原因であるまたは介在するヒトの体臭を減少させるまたは(iv)ヒトの個人衛生である、
実施態様６の使用。
２８. 使用がヒトまたは動物対象における該宿主細胞による感染を処置するかまたはリス
クを減少させ、ここで宿主細胞が各々該標的プロトスペーサー配列を含む抗生物質耐性遺
伝子(第一抗生物質への耐性のため)を含み、ここで使用が改変されたヌクレオチド配列お
よび第一抗生物質の対象への投与を含み、ここで対象において感染が軽減または予防され
る、実施態様１の使用。
２９. 各改変されたヌクレオチド配列がさらに抗生物質耐性遺伝子を含み、ここでＨＭ－
ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡは抗生物質耐性遺伝子を標的とせず、使用が該抗生物質および
複数の該改変された配列に集団を曝すことを含み、それにより宿主細胞におけるＨＭ－ｃ
ｒＲＮＡまたはｇＲＮＡコード化配列の維持が促進される、実施態様１の使用。
３０. 宿主細胞がグラム陽性細胞またはストレプトコッカス、スタフィロコッカス、シュ
ードモナス、サルモネラ、リステリア、エシェリキア・コリ、デスルホビブリオ、ビブリ
オ・コレラエまたはクロストリジウム細胞である、実施態様１の使用。
３１. 工業用または医学的流体、表面、装置またはコンテナの処理または水路、水、飲料
、食糧または化粧品の処理のためであり、ここで宿主細胞が流体、表面、装置、コンテナ
、水路、水、飲料、食糧または化粧品に含まれるかまたはその上にあり、ここで宿主細胞
集団の増殖が阻害され、それにより該処理が実施される、実施態様１の使用。
代替として、任意の実施態様は、任意の先の実施態様に従属する。
態様：
混合集団における運搬体と宿主細胞間の水平伝播
１. 運搬体細菌を含む混合細菌集団を産生する方法であって、ここではそれぞれ第一細菌
および第二細菌の第一および第二亜集団を含み、ここで亜集団は互いに異なる第一および
第二種の細菌であり、第二細菌は複数の宿主細胞を含み、ここで運搬体細菌は、各々宿主
細胞における宿主細胞修飾(ＨＭ)ｃＲＮＡまたはガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)を提供するため
の改変されたヌクレオチド配列を含む第一細菌細胞であり、ＨＭ－ｃＲＮＡまたはｇＲＮ
Ａは、第一Ｃａｓヌクレアーゼを標的にガイドし、標的を修飾するために宿主細胞標的プ
ロトスペーサー配列とハイブリダイズ可能な配列を含み、ここで運搬体細菌は標的配列を
含まず、方法は
ａ. 各々該改変されたヌクレオチド配列を含む複数の核酸を提供し；
ｂ. 該複数の核酸と、それぞれ第一細菌および第二細菌種の第一および第二亜集団を含む
第一混合集団を合わせ、第二亜集団は宿主細胞を含み；
ｃ. 宿主細胞の存在下該第一亜集団の細胞を核酸で形質転換させ、それにより該運搬体細
胞および該宿主細胞を含む第二混合集団を産生することを含み、ここで運搬体細胞に含ま
れる該改変されたヌクレオチド配列は形質転換宿主細胞における該ＨＭ－ｃＲＮＡまたは
ｇＲＮＡの産生のために宿主細胞を形質転換するために宿主細胞に水平伝播可能である、
方法。
２. さらに第二混合集団を得ることを含む、態様１の方法。
３. さらに第二混合集団から複数の運搬体細胞を単離することを含む、態様１の方法。
４. さらに形質転換宿主細胞における該ＨＭ－ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡの産生を含み、こ
こで該ＨＭ－ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡ配列が該形質転換宿主細胞における標的プロトス
ペーサー配列とハイブリダイズして第一Ｃａｓヌクレアーゼを標的にガイドし、それによ
り標的が第一Ｃａｓヌクレアーゼで修飾される、態様１の方法。
５. さらに該標的修飾を含む宿主細胞を得ることを含む(例えば、ここで宿主細胞は該第
一細菌種を含む混合集団に含まれる)、態様４の方法。
６. ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡが宿主細胞の内在性Ｃａｓヌクレアーゼと同族であり、ここ
でヌクレアーゼが該第一Ｃａｓヌクレアーゼである、態様１の方法。
７. ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡが運搬体細胞の内在性Ｃａｓヌクレアーゼと同族であり、こ
こでヌクレアーゼが該第一Ｃａｓヌクレアーゼである、態様１の方法。
８. ヌクレアーゼが野生型ヌクレアーゼ活性を有する、態様７の方法。
９. 第一ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ９である、態様１、６、７または８の方法。
１０. Ｃａｓ９がストレプトコッカスＣａｓ９である、態様９の方法。
１１. 各改変されたヌクレオチド配列が各核酸ベクターに含まれ、ここでベクターが運搬
体と宿主細胞間で水平伝播可能である、態様１の方法。
１２. 各改変された配列が各可動遺伝要素、例えば、トランスポゾンまたはプラスミドを
含む、態様１または１１の方法。
１３. 宿主細胞の該形質転換後、宿主細胞亜集団の増殖が阻害される、態様１の方法。
１４. 宿主細胞集団増殖阻害が、該改変されたヌクレオチド配列で形質転換されていない
該宿主細胞の集団の増殖と比較して少なくとも５倍である、態様１３の方法。
１５. 表面上の宿主細胞集団増殖が阻害される、態様１３または１４の方法。
代替として、任意の態様は先の態様の何れかに従属する。
例えば、方法は、例えば、ここに記載する、ヒト、動物または植物対象における疾患ま
たは状態の処置または予防の方法であって、ここで方法は該処置または予防に有効である
。本発明は、処置または予防のこのような方法により得たまたは得ることができる混合細
菌集団を提供する。
例えば、方法は、例えば、ここに記載する、環境、装置、装置、コンテナ、水路、水、
流体、食糧、飲料、微生物相、マイクロバイオームまたは化粧品の混合細菌集団で実施し
、ここで方法は、第一細胞と比較して、宿主細胞の比率を減少させる。
例えば、方法の製品はヒトまたは動物の肥満、糖尿病またはＩＢＤの処置または予防の
ため、ヒトまたは非ヒト動物の腸に投与するためである。
例えば、第一および第二種は、ヒトまたは非ヒト動物腸片利共生または相利共生細菌の
種である。
方法の製品は、細菌がヒトまたは動物の１以上のマイクロバイオーム(例えば、腸マイ
クロバイオーム)で定植するように、ヒトまたは動物に投与(例えば、鼻腔内)できるため
、有用である。第一細胞は、特にこれらの細胞がヒトまたは動物(例えば、腸マイクロバ
イオームにおいて非病原性)に非病原性であるとき、運搬体として働く。マイクロバイオ
ームは、ここに開示する任意の他のマイクロバイオームまたは微生物相集団であり得る。
例えば、第一第二細菌種がヒトまたは非ヒト動物の腸内微生物相で定植でき、第一細菌
がヒトまたは動物と片利共生または相利共生である。有用なことに、第一細菌をヒトまた
は動物に安全に投与でき、微生物相の宿主細胞にその後改変された配列を伝達するための
運搬体として働くことができる。
例えば、改変された配列はここに開示する任意のアレイまたはベクターに含まれる。例
えば、方法は、ここに開示する任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用する。
例えば、第一細胞は、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス科またはバクテロイ
デス)細胞、ラクトバチルス(例えば、アシドフィルス(例えば、Ｌａ－５、Ｌａ－１４ま
たはＮＣＦＭ)、ブレビス、ブルガリクス、プランタルム、ラムノサス、ファーメンタム
、コーカシクス、ヘルベティカス、ラクティス、ロイテリまたはカゼイ、例えば、カゼイ
・シロタ)、ビフィドバクテリウム(例えば、ビフィドゥム、ブレベ、ロングムまたはイン
ファンティス)、ストレプトコッカス・サーモフィルス、エンテロコッカス・フェシウム
、アリスティペス、アルカリフレックス、パラバクテロイデス、タンネレラ、エシェリキ
ア・コリまたはキシラニバクター細胞である。
例えば、宿主細胞はヒト微生物相種のものであり、運搬体細胞はヒト微生物相において
非病原性である種の細胞であり、ここで標的配列が運搬体細胞のゲノムに含まれず、改変
された配列は、運搬体および宿主細胞において動作可能であるｏｒｉＴを含むＭＧＥに含
まれ、ここでＭＧＥが運搬体細胞から宿主細胞に水平伝播可能である。例えば、改変され
た配列、ＭＧＥまたはベクターがバクテリオファージに含まれ、バクテリオファージが第
一細胞(運搬体)に感染してＭＥＧを第一(運搬体)細胞に導入することが可能である。その
後、ＭＧＥは宿主細胞に水平伝播可能である。
例えば、第一細胞はバクテロイデス門またはプレボテラ細胞であり、所望によりここで
ＭＧＥは該ヒト微生物相の第一細胞種からファーミキューテス種(宿主細胞)に水平伝播可
能である。後者は、標的配列がファーミキューテスに含まれるが、第一(運搬体)細胞に含
まれないとき、例えば、ヒトにおける肥満の処置または予防のために有用である。
さらなる例
実施例１：環境処理または除染
石油、金属および鉱物工業
ある実施態様において、宿主細胞は鉱物採掘抗または地域、金属採掘抗または地域、油
田または石油または石油化学産業(例えば、宿主が嫌気性硫酸還元細菌、例えば、デスル
ホビブリオ細菌であるときの、これらの何れかのため)に存在する。例えば、本組成物は
、酸化剤(例えば、次亜塩素酸ナトリウム)、４級アンモニウム化合物またはイソチアゾロ
ンを含むかまたは次亜塩素酸ナトリウム、４級アンモニウム化合物またはイソチアゾロン
と同時にまたは逐次的に施用される。デスルホビブリオ細菌宿主修飾のための本発明にお
ける使用に適当なベクターの例はバクテリオファージである。下記引用文献は、デスルホ
ビブリオに感染するファージの単離のための適当な方法を記載する。本発明におけるベク
ターとしての使用のために、引用文献の何れかに記載されるバクテリオファージが使用さ
れ得る。あるいは、ベクターはナノ粒子により提供される。
Heidelberg et alは、２コピーのほぼ同一のミュー様バクテリオファージＤＶＵＯ１８
９－２２１、ＤＶＵ２８４７－７９、ＤＶＵ２６８８－７３３およびバクテリオファージ
の残遺物(remnants)がデスルホビブリオ・ブルガリス・ヒルデンバラのゲノムに存在する
ことを記載している。このようなファージは、本発明における使用のためのファージベク
ター改変の基礎となり得る。
引用文献：
Seyedirashti S et al, J Gen Microbiol. 1991 Jul;137(7):1545-9, “Induction and p
artial purification of bacteriophages from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough
) and Desulfovibrio desulfuricans ATCC 13541;
Seyedirashti S et al, J Gen Microbiol. 1992 Jul;138(7):1393-7, “Molecular chara
cterization of two bacteriophages isolated from Desulfovibrio vulgaris NCIMB 830
3 (Hildenborough)”;
*Walker CB et al; Environ Microbiol. 2006 Nov;8(11):1950-9, “Recovery of temper
ate Desulfovibrio vulgaris bacteriophage using a novel host strain”;
Miranda et al, Corrosion Science 48 (2006) 2417-2431, “Biocorrosion of carbon s
teel alloys by an hydrogenotrophic sulfate-reducing bacterium Desulfovibrio capi
llatus isolated from a Mexican oil field separator”;
Eydal et al, The ISME Journal (2009) 3, 1139-1147; doi:10.1038/ismej.2009.66; pu
blished online 11 June 2009, “Bacteriophage lytic to Desulfovibrio aespoeensis
isolated from deep groundwater”;
Walker CB et al; Environ Microbiol. 2009 Sep;11(9):2244-52. doi: 10.1111/j.1462-
2920.2009.01946.x, “Contribution of mobile genetic elements to Desulfovibrio vu
lgaris genome plasticity”
*[この文献に記載される配列は、Accession No. DQ826728-DQ826732の下にGenBankに寄託
されており、引用によりここに包含させる]
実施例２：水または汚水処理または環境(例えば、土壌)金属除染
本発明の代替的適用は、水または汚水処理のためのここに記載するＨＭ－ＣＲＩＳＰＲ
アレイ、ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＨＭ－ｃｒＲＮＡ、ＨＭ－スペーサー、
ＨＭ－ＤＮＡ、ＨＭ－ＣａｓまたはＨＭ－組成物を提供し、例えばここで宿主は硫酸還元
細菌、例えば、デスルホビブリオ細菌である。
例えば、宿主における標的ヌクレオチド配列は、重金属耐性遺伝子の配列である。所望
によりまた宿主はデスルホビブリオ細菌、例えば、デスルホビブリオ・ブルガリスである
。
実施例３：医学的使用
本発明の別の適用は、ヒトまたは動物における細菌感染の処置、予防または減少(例え
ば、拡散または拡大の減少)のための、ここに記載するＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイ、ＨＭ
－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＨＭ－ｃｒＲＮＡ、ＨＭ－スペーサー、ＨＭ－ＤＮＡ
、ＨＭ－ＣａｓまたはＨＭ－組成物を提供する。
第一の例において、感染は、ヒトにおけるＭＲＳＡ宿主細胞が原因である。宿主細胞は
スタフィロコッカス・アウレウス宿主細胞であり、本発明のＨＭ－アレイは、クラスＩ、
IIまたはIIIスタフィロコッカスパッケージ化ファージ(カウドウイルス目またはミオウイ
ルス科ファージ)の集団に含まれる。ファージ集団を、メチシリンまたはバンコマイシン
と併用してまたは併用せずにＭＲＳＡ感染患者に投与する。一つの治験で、ファージＨＭ
－アレイは、(ｉ)内在性スタフィロコッカス・アウレウスＣＲＩＳＰＲアレイのリーダー
プロモーターの３’の２０ヌクレオチドの領域および(ii)メチシリン宿主細胞における耐
性遺伝子を標的とする。バンコマイシンを投与するとき、常用量より低用量が患者に投与
される。宿主細胞感染がノックダウンされ、ファージ医薬に対する耐性が確立されないか
通常より低い割合または重度で確立されると考えられる。他の治験において、これらの治
験におけるファージがまた必須スタフィロコッカス・アウレウス遺伝子ｆｔｓＺを標的と
する以外、設計は同一である(Liang et al, Int J Infect Dis. 2015 Jan;30:1-6. doi:
10.1016/j.ijid.2014.09.015. Epub 2014 Nov 5, “Inhibiting the growth of methicil
lin-resistant Staphylococcus aureus in vitro with antisense peptide nucleic acid
conjugates targeting the ftsZ gene”)。
さらなる治験は、ファージＫエンドリシンをメチシリンに加えてまたはその代わりに投
与した以外、上記の治験を反復した。
引用文献
1. Jiang W et al, Nucleic Acids Res. 2013 Nov;41(20):e188. doi: 10.1093/nar/gkt7
80. Epub 2013 Sep 2, “Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene
modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice”;
2. Seed KD et al, Nature. 2013 Feb 28;494(7438):489-91. doi: 10.1038/nature11927
, “A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host i
nnate immunity”;
3. Semenova E et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jun 21;108(25):10098-103. do
i: 10.1073/pnas.1104144108. Epub 2011 Jun 6, “Interference by clustered regular
ly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed seque
nce”;
4. Heler R et al, Mol Microbiol. 2014 Jul;93(1):1-9. doi: 10.1111/mmi.12640. Epu
b 2014 Jun 4, “Adapting to new threats: the generation of memory by CRISPR-Cas
immune systems”;
5. Gomaa A et al, MBio. 2014 Jan 28;5(1):e00928-13. doi: 10.1128/mBio.00928-13,
“Programmable removal of bacterial strains by use of genome-targeting CRISPR-Ca
s systems”;
6. Fineran PC et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Apr 22;111(16):E1629-38. doi
: 10.1073/pnas.1400071111. Epub 2014 Apr 7, “Degenerate target sites mediate ra
pid primed CRISPR adaptation”;
7. Wiedenheft et al, Nature. 2011 Sep 21;477(7365):486-9. doi: 10.1038/nature104
02, “Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune
system;
8. Bondy-Denomy et al, Nature 493, 429-432 (17 January 2013) doi:10.1038/nature1
1723, “Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune syst
em”;
9. Nunez JK et al, Nature. 2015 Mar 12;519(7542):193-8. doi: 10.1038/nature14237
. Epub 2015 Feb 18, “Integrase-mediated spacer acquisition during CRISPR-Cas ad
aptive immunity”
実施例４：混合腸内微生物相集団における細菌の比率の改変
細菌の比率の改変を、混合腸内微生物相サンプルにおけるクロストリジウム・ディフィ
シル細菌のノックダウンを参照して記載する本例に従い実施する。サンプルは、バクテロ
イデスおよびメトロニダゾール(ＭＴＺ)耐性クロストリジウム・ディフィシル株６３０亜
集団を含む。エクスビボで、混合集団を、ＣＲＩＳＰＲアレイを含むように本発明により
改変されている運搬体細菌(ラクトバチルスアシドフィルスＬａ－１４および／またはＬ
ａ－５)の集団と合わせる。
各ＣＲＩＳＰＲアレイは、運搬体細菌およびクロストリジウム・ディフィシル細胞と適
合性であるプラスミドに含まれる。アレイは、ｏｒｉＴ、ｉｎｔＤＯＴ配列、ｔｅｔＱ－
ｒｔｅＡ－ｒｔｅＢオペロン、ｒｔｅＣおよびオペロンｘｉｓ２ｃ－ｘｉｓ２ｄ－ｏｒｆ
３－ｅｘｃも含む、バクテロイデスシータイオタオミクロンＣＴｎＤｏｔトランスポゾン
に含まれる。一つの実験において、ｍｏｂおよびｔｒａオペロンを除外する(代わりにト
ランスポゾンが運搬体細菌と組み合わされた混合物において伝達されるバクテロイデス細
胞により供給されるこれらに依存する)。他の実験において、ｍｏｂおよびｔｒａオペロ
ンはトランスポゾンに含まれる。
細胞質膜を超えるタンパク質転座が全細菌において必須過程である。コアにＡＴＰａｓ
ｅ、ＳｅｃＡおよび膜溝、ＳｅｃＹＥＧを含むＳｅｃシステムは、このタンパク質輸送の
大部分を担う。第二並行Ｓｅｃシステムは、多数のグラム陽性種において報告されている
。このアクセサリーＳｅｃシステムは、活性化させるＡＴＰａｓｅ、ＳｅｃＡ２の第二コ
ピーの存在により特徴付けられ、そこで、試験されており、ＳｅｃＡ２はＳｅｃ基質のサ
ブセットの転座を担う。多くの病原性グラム陽性種と共通して、クロストリジウム・ディ
フィシルは２コピーのＳｅｃＡを有する。Ｓ層タンパク質(ＳＬＰ)およびさらなる細胞壁
タンパク質(ＣｗｐＶ)の輸出はＳｅｃＡ２に依存する。細胞壁における成熟ＳＬＰレベル
の減少に一致する、ＳＬＰの細胞質前駆体ＳｌｐＡおよび他の細胞壁タンパク質の蓄積が
、ドミナントネガティブｓｅｃＡ１またはｓｅｃＡ２アレルを発現する細胞で観察される
。さらに、ＳｅｃＡ１またはＳｅｃＡ２のドミナントネガティブアレル発現またはアンチ
センスＲＮＡノックダウンが増殖を劇的に遮断し、両Ｓｅｃシステムがクロストリジウム
・ディフィシルで必須であることを示す。
クロストリジウム・ディフィシル株６３０(伝染性タイプＸ)は、４,２９０,２５２bp(
Ｇ＋Ｃ含量＝２９.０６％)の単一環状染色体および７,８８１bp(Ｇ＋Ｃ含量＝２７.９％)
の環状プラスミドを有する。全ゲノムが配列決定されており、ゲノムの１１％が接合性ト
ランスポゾンのような可動遺伝要素からなることが判明している。これらの要素は、クロ
ストリジウム・ディフィシルにその抗微生物耐性、病原性、宿主相互作用および表面構造
製造を担う遺伝子を提供する。例えば、クロストリジウム・ディフィシルのｃｄｅＡ遺伝
子は、多剤および毒性化合物放出(ＭＡＴＥ)ファミリーにおける既知排出輸送体と相同で
あることが示された多剤排出ポンプを産生する。タンパク質は、細胞からの薬物のエネル
ギー依存性およびナトリウム共役排出を促進する。さらに、クロストリジウム・ディフィ
シルにおけるｃｍｅ遺伝子は、他の細菌における多剤耐性を提供することが示されている
。
アレイは、クロストリジウム・ディフィシル細胞の必須遺伝子(ＳｅｃＡ２)における配
列のターゲティングのためのＲ１－Ｓ１－Ｒ１’ ＣＲＩＳＰＲ単位を含む。他の実験に
おいて、ターゲティングは、ＭＴＺおよび所望により１以上の他の抗クロストリジウム・
ディフィシル抗生物質存在下、ｃｄｅＡ遺伝子に対する。各スペーサー(Ｓ)は、ＳｅｃＡ
またはｃｄｅＡ遺伝子の２０量体ヌクレオチド配列を含み、ここで配列は反復配列と同族
であるクロストリジウム・ディフィシル株６３０ ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＰＡ
Ｍを含む。各反復は、クロストリジウム・ディフィシル株６３０反復と同一であり、配列
5’-ATTTACATACCACTTAGTTAATATAAAAC-3’ (配列番号１１８)
を有する。
別のセットの実験において、次の配列を反復用に使用する。
5’-GTTTTATATTAACTAAGTGGTATGTAAAT-3’ (配列番号１１９)
反復は、混合集団におけるクロストリジウム・ディフィシル細胞に内在性であるＣａｓ
と共に機能する。細菌の混合集団は、クロストリジウム・ディフィシル感染を有するヒト
患者の便サンプルからエクスビボサンプルとして回収する。混合集団を運搬体細菌とイン
ビトロで混合し、３７℃で嫌気性条件下インキュベートして、テトラサイクリン存在下腸
条件を模倣する。ＣＲＩＳＰＲアレイを含むトランスポゾンが混合物中のバクテロイデス
およびクロストリジウム・ディフィシル細胞に伝達されることが予測される。さらに、後
者の細胞における標的部位がＣａｓヌクレアーゼ作用により切断され、故に混合集団にお
けるクロストリジウム・ディフィシルの比率を減少する(およびバクテロイデス対クロス
トリジウム・ディフィシルの比率を増加する)と予測される。
後続実験において、運搬体細菌を含む飲料を産生し、これを数日間連続してヒト患者に
１回または２回消費させる。患者に処置期間中テトラサイクリンも投与する。便分析が、
便サンプル中のクロストリジウム・ディフィシルの比率が減少する(およびバクテロイデ
ス対クロストリジウム・ディフィシルの比率が増加する)ことを確認すると予測される。
実施例５：コレラ処置または予防
世界保健機構(ＷＨＯ)コレラファクトシート１０７番(２０１５年７月更新)を参照する
。コレラは、細菌ビブリオ・コレラエに汚染された食品または水の摂取により引き起こさ
れる急性下痢性感染である。研究者らは、毎年凡そ１４０～４３０万症例があり、世界的
に毎年２８０００～１４２０００名がコレラにより死亡すると推定している。２時間～５
日間の短潜伏期間が、大流行の爆発的パターンの可能性を誘発する因子である。コレラは
、極めて病原性の疾患である。小児および成人の両方を襲い、数時間以内に死亡し得る。
ビブリオ・コレラエに感染した人の約８０％は何の症状も発症しないが、細菌は糞便中に
感染後１～１０日残り、環境に排出されて戻り、他の人に感染する可能性がある。症状を
発症した人の中で、８０％は軽度または中程度の症状であるが、約２０％が急性水様下痢
と重度脱水を発症する。これは、未処置だと死をもたらし得る。
ビブリオ・コレラエの２つの血清型 － Ｏ１およびＯ１３９ － が大流行し得る。
ビブリオ・コレラエＯ１は大流行の大部分の原因であり、一方Ｏ１３９ － １９９２年
にバングラデシュで初めて同定された － は、東南アジアに限局性である。非Ｏ１およ
び非Ｏ１３９ビブリオ・コレラエは、軽度下痢を引き起こしうるが、伝染病とはならない
。近年、新規バリアント株がアジアおよびアフリカの数箇所で検出されている。所見は、
これらの株が、致死率が高いより重度のコレラをもたらすことを示唆する。ビブリオ・コ
レラエの主貯留槽はヒトおよび半鹹水および河口半塩水のような水系源であり、藻類異常
発生としばしば関連する。
Nature. 2013 Feb 28;494(7438):489-91. doi: 10.1038/nature11927, “A bacterioph
age encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity”
, Seed KD et al(引用によりここに包含させる)を参照し、これはビブリオ・コレラエ血
清型Ｏ１が重度下痢性疾患コレラの主要原因因子であることを記載し、溶解性ビブリオ・
コレラエファージが特にベンガル湾周囲の流行地における疾患負荷への影響と関連付けら
れている。著者らは、その刊行物に記載された試験において、２００１～２０１１１４年
に回収したコレラ患者の米とぎ汁様便サンプルに遍在するＩＣＰ１(国際下痢疾患研究セ
ンターについて、バングラデシュコレラファージ１)関連ビブリオ・コレラエＯ１特異的
病原性ミオウイルスの単離を記載した。
著者らは、ＩＣＰ１ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが２ＣＲＩＳＰＲ座位(ＣＲ１お
よびＣＲ２と命名)および６ｃａｓ遺伝子からなり、その組織およびタンパク質産物がタ
イプ１－Ｆ(エルシニア・ペスチス)サブタイプシステム１７のＣａｓタンパク質と最も相
同であると説明する。ビブリオ・コレラエは、２つの生物型、古典的およびＥｌ Ｔｏｒ
に分類され、前者は早期の大流行と関連しており、その後Ｅｌ Ｔｏｒ生物型１８に置き
換わっている。古典的株、ビブリオ・コレラエＯ３９５は、タイプＩ－Ｅ(エシェリキア
・コリ)サブタイプ１７に属するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを有し、今日までＣＲＩ
ＳＰＲ／Ｃａｓシステムを有するＥｌ Ｔｏｒ株に関する記載は何もない。それ故に、Ｉ
ＣＰ１ファージにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの起源は未知である。
ｃｒＲＮＡにおける予測幹を形成する部分的パリンドローム配列に下線を付したＣＲ１
およびＣＲ２コンセンサス直接反復のＲＮＡ配列は次のとおりである。
GUUAGCAGCCGCAUAGGCUGCUUAAAUA [配列番号７５]
本発明の例えば、アレイの本および各反復は、配列番号７５と少なくとも８０、９０、
９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一(または配列番号７５と同一)である配
列を含むまたはこれからなる。
ＩＣＰ１ ＣＲＩＳＰＲにおけるスペーサーの大部分は、インドで１９６４に単離され
た古典的株Ｏ３９５、バングラデシュで１９９４に単離されたＥｌ Ｔｏｒ株ＭＪ－１２
３６および２００１～２０１１年にＩＣＤＤＲ,Ｂで採取された数Ｅｌ Ｔｏｒ株を含む
、ビブリオ・コレラエ株のサブセットに見られる１８kb島内の配列と１００％同一性を示
す。１８kb島は、プロトタイプスタフィロコッカス・アウレウス病原性島(ＳａＰＩｓ)を
含むグラム陽性細菌のファージ誘導可能染色体島(ＰＩＣＩｓ)を模倣する。ＳａＰＩｓは
、あるファージによる感染後、切除され、環状化し、複製するように誘発される。これら
は、自身の無差別の拡散を可能とするためにファージ繁殖サイクルを妨害する種々の機構
を使用し、これが周囲の細菌集団をさらなるファージ捕食から保護し得る。ＩＣＰ１ Ｃ
ＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより標的化されるビブリオ・コレラエ１８kb島の組織は長
さ、塩基組成および組織がＰＩＣＩｓのＳａＰＩｓサブセットで見られるものに類似し、
１端にインテグラーゼホモログを有し、ＧＣ含量が宿主種より少ない(３７％対４７.５％
)。１８kb要素は、それ故にビブリオ・コレラエＰＩＣＩ様要素(ＰＬＥ)と称される。
Figure 2022106717000002
 [ヌクレオチド配列＝配列番号７６(３２bpプロトスペーサー配列(配列番号７７)は灰色を
付し、本開示は灰色の最初のＴから開始し、灰色の最後のＣで終わる配列を含む；および
アミノ酸配列＝配列番号７８]
Seed et alは、ＣＲ１およびＣＲ２アレイがＧＡ ＰＡＭ配列の認識により作動するこ
とを決定した。Seed et alらはまた試験したＩＣＰ１関連ファージＣＲＩＳＰＲアレイに
おけるスペーサーの大部分が、ビブリオ・コレラエＰＬＥと同一性を示すことも発見した
。スペーサーを次の表３に示し、本発明のアレイにおけるＳ１は、例えば、これらの配列
の何れか一つから選択される。ある実施態様において、Ｓ１は、下線を付した配列の何れ
か一つから選択される。
例えば、本発明のアレイ(または各アレイ)は、下線を付したスペーサー配列の一つ、複
数または全てを含む改変されたアレイである。アレイスペーサーは、次のとおり、天然に
存在しない配置を含み得る。
例えば、アレイは、タイプ８ａおよび／または９ａのスペーサーおよびタイプ１ａ～７
ａの０、１、２、３、４、５または６(しかし７ではない)を含む。例えば、アレイは、タ
イプ４ｂのスペーサーおよび１ｂ～３ｂの０、１または２、３(しかし３以上ではない)を
含むを含む。例えば、アレイは、タイプ８ａのスペーサーおよび９ａ、４ｂ、１ｃ、３ｄ
、１ｅおよび３ｅの一つ、複数または全てを含む。例えば、アレイは、タイプ９ａのスペ
ーサーおよび８ａ、４ｂ、１ｃ、３ｄ、１ｅおよび３ｅの一つ、複数または全てを含む。
例えば、アレイは、タイプ４ｂのスペーサーおよび８ａ、９ａ、１ｃ、３ｄ、１ｅおよび
３ｅの一つ、複数または全てを含む。例えば、アレイは、タイプ１ｃのスペーサーおよび
８ａ、９ａ、４ｂ、３ｄ、１ｅおよび３ｅの一つ、複数または全てを含む。例えば、アレ
イは、タイプ３ｄのスペーサーおよび８ａ、９ａ、４ｂ、１ｃ、１ｅおよび３ｅの一つ、
複数または全てを含む。例えば、アレイは、タイプ１ｅのスペーサーおよび８ａ、９ａ、
４ｂ、１ｃ、３ｄおよび３ｅの一つ、複数または全てを含む。例えば、アレイは、タイプ
３ｅのスペーサーおよび８ａ、９ａ、４ｂ、１ｃ、３ｄおよび１ｅの一つ、複数または全
てを含む。
他の天然に存在しない配置において、ベクターは本発明の第一および第二アレイを含み
、ここでアレイは、１ａ～１ｇから選択される少なくとも２スペーサー(例えば、８ａ、
９ａ、４ｂ、１ｃ、３ｄ、１ｅおよび３ｅから選択される少なくとも２スペーサー)を含
み、ここでスペーサー同じＩＣＰ１ファージゲノムのスペーサーではなく、例えば、ＩＣ
Ｐ１＿ ２０１１＿ＡまたはＩＣＰ１＿ ２００６＿ＥまたはＩＣＰ１＿ ２００５＿Ａ
またはＩＣＰ１＿ ２００４＿Ａの全スペーサーではない(上記表のスペーサー参照)。そ
れ故に、ある実施態様において、
第一アレイはＩＣＰ１＿ ２０１１＿Ａスペーサー配列(例えば、８ａおよび／または
９ａ)を含み、第二アレイはＩＣＰ１＿ ２００６＿Ｅ、ＩＣＰ１＿ ２００５＿Ａまた
はＩＣＰ１＿ ２００４＿Ａのスペーサー配列(例えば、４ｂ、１ｃ、３ｄ、１ｅおよび
３ｅから選択される１以上のスペーサー)を含む。
例えば、ベクターは、８ａ、９ａ、４ｂ、１ｃ、３ｄ、１ｅおよび３ｅから選択される
１、２、３、４、５、６または全７スペーサータイプを含む。例えば、ベクターは、該選
択タイプの１以上の複数コピーを含む。例えば、ベクターにおけるこの、いくつかのまた
は各アレイは、第一スペーサー(アレイのプロモーターの最近接)を含み、ここで第一スペ
ーサーは８ａ、９ａ、４ｂ、１ｃ、３ｄ、１ｅおよび３ｅから選択される。この方法での
位置決めは、天然アレイが第一スペーサーを最も頻繁に使用するため、有利である。
Nucleic Acids Res. 2013 Oct;41(19):9033-48. doi: 10.1093/nar/gkt654. Epub 2013
Jul 30, “High-resolution definition of the Vibrio cholerae essential gene set
with hidden Markov model-based analyses of transposon-insertion sequencing data
”, Chao MC et al(引用により包含させる)を参照し、これは、高密度トランスポゾン変
異誘発のハイスループットＤＮＡ配列決定(トランスポゾン－挿入配列決定)への連結が、
細菌増殖および生存に対する個々の座位の寄与の同時かつゲノムワイド評価を可能にする
ことを開示する。ＨＭＭ結果は、１２８遺伝子がＬＢにおけるビブリオ・コレラエの最適
増殖に必要であることを示す。本発明の標的配列は、これらの遺伝子の何れか一つの配列
であり得る(この遺伝子名および配列は、本発明のベクターの標的配列の提供における使
用およびここでの特許請求の範囲への包含が可能であるものとして、引用によりここに包
含させる)。
例えば、それぞれ平均読み取り５.６および４.７を有したｖｃ０３０９およびｖｃ０７
５３における挿入変異体は、増殖が激しく減弱した。同様に、ｖｃ０２３７およびｖｃ１
７７３変異体は、インビトロ競合実験において野生型細胞より適切でなかった。リストは
またｖｃａ０３６０、ｖｃａ０４７７、ｖｃａ０４８６およびｖｃａ０４８８を含む推定
毒素／抗毒素アディクション座位からの多数の抗毒素遺伝子も含む。このような遺伝子は
、活性毒素と関連するとき、必須であると推定される。
著者らは、表４における必須ビブリオ・コレラエ遺伝子を発見した。著者らは、必須で
あると考えられる２００を超える遺伝子間領域を同定した。
それ故に、本発明の例えば、宿主細胞がビブリオ・コレラエ細胞であるとき、標的配列
はｖｃ０６３１、ｖｃ２０２４、ｖｃ２６２６、ｖｃ２７６３－ｖｃ２７６７またはｖｃ
２７６８－ｖｃ２７７０配列である。本発明の例えば、宿主細胞がビブリオ・コレラエ細
胞であるとき、標的配列はｖｃ０３０９およびｖｃ０７５３、ｖｃ０２３７およびｖｃ１
７７３、ｖｃａ０３６０、ｖｃａ０４７７、ｖｃａ０４８６またはｖｃａ０４８８配列で
ある。
Infect Immun. 2015 Sep;83(9):3381-95. doi: 10.1128/IAI.00411-15. Epub 2015 Jun
8, “A Genome-Wide Screen Reveals that the Vibrio cholerae Phosphoenolpyruvate
Phosphotransferase System Modulates Virulence Gene Expression”, Wang Q et alを
参照する(引用により包含させる)。著者らは、トランスポゾン挿入部位(ＴＩＳ)配列決定
ベースの戦略を使用して、生物の主要な腸管定着因子である、ＴＣＰの主要サブユニット
をコードするｔｃｐＡの発現に必要な新規因子を同定した。ｔｃｐＡ発現を調節すること
が知られる遺伝子の大部分の同定以外に、スクリーニングはｐｔｓＩおよびｐｔｓＨを生
じ、これは、酵素Ｉ(ＥＩ)およびビブリオ・コレラエホスホエノールピルベートホスホト
ランスフェラーゼシステム(ＰＴＳ)のＨｐｒ要素を生じた。ＴｃｐＡの発現減少に加えて
、ＥＩ、Ｈｐｒまたは関連ＥIIＡ(Ｇｌｃ)タンパク質を欠く株で産生されるコレラ毒素(
ＣＴ)は少なく、マウス仔腸でコロニー形成する能力が減少している。ＰＴＳは、ｔｃｐ
ＰＨおよびａｐｈＡＢの発現制御により病原性遺伝子発現を発現制御し、ｔｃｐＰＨおよ
びａｐｈＡＢ自体、病原性遺伝子発現の中心的アクティベーターであるｔｏｘＴの発現を
制御する。
それ故に、本発明の例えば、宿主細胞がビブリオ・コレラエ細胞であるとき、標的配列
はｔｃｐＡ配列またはｔｃｐＡモジュレーター配列(すなわち、ｔｃｐＡ自体またはその
発現産物を介して調節するヌクレオチド配列)である。例えば、配列はｐｔｓＩまたはｐ
ｔｓＨ配列である。例えば、標的配列は、ホスホエノールピルベートホスホトランスフェ
ラーゼシステム(ＰＴＳ)の配列またはｔｃｐＰＨ、ａｐｈＡＢまたはｔｏｘＴ配列である
。例えば、標的配列はＥIIＡ(Ｇｌｃ)タンパク質をコードする遺伝子である。
本発明のための適当な標的配列はまた表５にも示す － 次の何れか一つの配列(病原
性遺伝子は下線を付す)。
ある実施態様において、細胞はビブリオ(例えば、コレラ)細胞であり、標的配列はこれ
らの遺伝子の何れかの配列である。
病原性遺伝子を表６に示す。
ある実施態様において、細胞はビブリオ(例えば、コレラ)細胞であり、標的配列はこれ
らの遺伝子の何れかの配列である。
ＴＣＰおよびＣＴＸ病原性島からの遺伝子
ある実施態様において、細胞はビブリオ(例えば、コレラ)細胞であり、標的配列はａｃ
ｅ、ｃｅｐ、ｃｔｘＡ、ｃｔｘＢ、ｏｒｆＵ、ｚｏｔ、ｒｓｔＡ、ｒｓｔＢ、ｒｓｔＲ、
ａｃｆＡ、ａｃｆＢ、ａｃｆＣ、ｔａｇＥ、ａｌｄＡ、ｉｎｔ、ｔａｇＡ、ｔａｇＤ、ｔ
ｃｐＡ、ｔｃｐＢ、ｔｃｐＣ、ｔｃｐＤ、ｔｃｐＥ、ｔｃｐＦ、ｔｃｐＨ、ｔｃｐＩ、ｔ
ｃｐＪ、ｔｃｐＰ、ｔｃｐＱ、ｔｃｐＲ、ｔｃｐＳ、ｔｃｐＴまたはｔｏｘＴ配列である
。
実施例６：野生型内在性Ｃａｓを利用する特異的微生物相細菌集団増殖阻害
１. 材料および方法
１.１. 株
次の株を、この実施例および実施例７および８の過程で使用した：エシェリキア・コリ
MG1655、エシェリキア・コリTOP10、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD-9(ATCC BA
A-491, Manassas, Virginia)、ストレプトコッカス・サーモフィルスDSM 20617(T)(DSMZ,
Braunschweig, Germany)、ラクトコッカス・ラクティスMG1363およびストレプトコッカ
ス・ミュータンスClarke 1924DSM 20523(DSMZ, Braunschweig, Germany)。
培地選択および遺伝子構築物の試験の経過中、種々のストレプトコッカス株を使用した
。ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ－９(ATCC BAA-491)およびエシェリキア・
コリＴＯＰ１０を、その適合性増殖要件のために考慮した。全株をトッドヘヴィットブロ
ス(ＴＨ)(T1438 Sigma-Aldrich)で、特に断らない限り、好気性条件および３７℃で培養
した。株を２５％グリセロール中、－８０℃で保存した。
１.２. 差次的増殖培地
全株を、ＴＨ培地で３７℃で２０時間増殖させた。ストレプトコッカス・サーモフィル
スの選択培地は、３ｇ・ｌ－１の２－フェニルエタノール(ＰＥＡ)を添加したＴＨ培地で
あった。ＰＥＡを培地に添加し、１２１℃で１５分、１５psiでオートクレーブに付した
。寒天プレートを、１.５％(wt／vol)寒天を対応する培地に添加することにより調製した
。選択またはプラスミド維持に必要であるとき、３０μg ml－１カナマイシンを両ストレ
プトコッカス・サーモフィルス株およびエシェリキア・コリおよび５００μg ml－１をス
トレプトコッカス・ミュータンスに使用した。
ある場合、株およびプラスミドによって、４８時間までの長いインキュベーションが、
ＰＥＡ添加培地での増殖を見るために必要である可能性がある。使用する生物の生存能の
対照として、対照ＴＨ寒天を並行して実施すべきである。
１.３. クローニング
エシェリキア・コリ(One Shot(登録商標)ThermoFischer TOP10 Chemically Competent
細胞)を全サブクローニング手順において使用した。ＰＣＲを、Phusionポリメラーゼを使
用して実施した。全ＰＣＲ産物を、製造業者のプロトコールに従い、Nucleospin Gelおよ
びMacherey-NagelによるPCR Clean-upで精製した。精製フラグメントを３４μl総体積で
、１μl酵素添加１×ＦＤ緩衝液中制限酵素ＤｐｎＩで消化させた。消化反応物を再び製
造業者のプロトコールに従い、Nucleospin GelおよびMacherey-NagelによるPCR Clean-up
で精製した。Gibsonアセンブリーを、製造業者(NewEngland Biolab)のプロトコールに従
い、１０μl反応物中で実施した。
プラスミドＤＮＡを、製造業者の指示に従いQiagenキットを使用して調製した。グラム
陽性株についての修飾は、細胞溶解を促進するため細菌の０.５％グリシンおよびリゾチ
ーム添加培地での増殖を含んだ。
１.４. 形質転換
１.４.１ エレクトロコンピテントエシェリキア・コリ細胞および形質転換
市販のエレクトロコンピテント細胞をクローニングおよび実験に使用した(One Shot(登
録商標)ThermoFischer TOP10 Chemically Competentエシェリキア・コリ)。エレクトロポ
レーションを標準設定を使用して実施した：Electro Cell Manipulator(BTX Harvard App
aratus ECM630)を使用する１８００Ｖ、２５μFおよび２００Ω。パルス後、１ml ＬＢ
－ＳＯＣ培地を添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。形質転換細胞を、５
０μg ml－１のカナマイシン含有ＬＢ寒天に播種した。
１.４.２ エレクトロコンピテントストレプトコッカス・サーモフィルス細胞の調製
エレクトロポレーションプロトコールは、Somkuti and Steinberg, 1988を改変した。
４０mM ＤＬ－スレオニン(T8375 Sigma-Aldrich)添加ＴＨブロス中のストレプトコッカ
ス・サーモフィルスの一夜培養を同じ培地５ml中、１００倍に希釈し、ＯＤ６０００.３
～０.５まで増殖させた(接種約２.５時間後)。細胞を１０,０００×ｇで１０分の４℃で
の遠心分離により採取し、５mlの氷冷洗浄緩衝液(０.５Ｍスクロース＋１０％グリセロー
ル)で３回洗浄した。細胞洗浄後、ＯＤ６００１５～３０でエレクトロポレーション緩衝
液(０.５Ｍ スクロース、１０％グリセロールおよび１mM ＭｇＣｌ２)中に懸濁させた
。エレクトロポレーション緩衝液中の細胞は、使用するまで４℃に維持しても(１時間以
内)または後に使用するためにエッペンドルフチューブに５０μlで等分し、液体窒素で冷
凍し、－８０℃で保存してもよい。
１.４.３ エレクトロポレーションストレプトコッカス・サーモフィルス細胞
１μlの精製プラスミドＤＮＡを５０μlの細胞懸濁液に添加し、エレクトロポレーショ
ンを予め冷やした２mm－ギャップエレクトロポレーションキュベットで実施した。エレク
トロポレーション設定は、Electro Cell Manipulator(BTX Harvard Apparatus ECM630)を
使用して２５００Ｖ、２５μFおよび２００Ωであった。電気パルス直後、１mlのＴＨブ
ロスを細胞に添加し、懸濁液を１０分氷上に維持し、その後細胞を３時間、３７℃でイン
キュベートした。耐性遺伝子を発現させるための時間の後、細胞を３０μg ml－１のカナ
マイシン含有ＴＨ寒天プレートに播種した。構築物により、コロニーは３７℃でインキュ
ベーション１２～４８時間後可視化した。
１.５. ＸｙｌＳプラスミドの構築
本試験で使用した全プラスミドは、ストレプトコッカス・クレモリスからの潜在性プラ
スミドｐＷＶ０１に由来する広宿主範囲発現ベクターであるｐＢＡＶ１Ｋ－Ｔ５に基づき
(Bryksin & Matsumura, 2010)、主鎖をGibson法を使用して他のフラグメントとアセ
ンブリーするためのオーバーハングを有するものを使用して増幅した。
キシロース誘導可能システムを、ＸｙｌＲリプレッサーの前にプロモーターｇｙｒＡを
クローニングすることにより構築した(図１)。ＸｙｌＲリプレッサーは、バチルス・スブ
チリス株ＳＣＫ６(Zhang et al. 2011)から、Gibsonアセンブリーのためのオーバーハン
グを含むリバースプライマーおよびｇｙｒＡプロモーターを導入するために使用するウル
トラマーであるフォワードプライマー(Xie et al. 2013)およびｐＢＡＶ１ＫＴ５主鎖へ
のアセンブリーのための対応するオーバーハングを用いて増幅した。得られたフラグメン
トは、Ｐｌｄｈａ＋ＰｘｙｌＡハイブリッドプロモーター(Xie et al. 2013)を含むウル
トラマーを用いてｐＣＬ００２(未公開研究)から増幅させたｍＣｈｅｒｒｙを隣接させた
。３つの得られたＰＣＲ産物を、製造業者の指示に従いGibson Master Mix(登録商標)(Ne
wEngland Biolab)で構築した。産物を最後にエシェリキア・コリＴＯＰ１０エレクトロコ
ンピテント細胞に形質転換した。図１参照。
１.６. ＣＲＩＳＰＲアレイプラスミドの設計および構築
ストレプトコッカス・サーモフィルスは、４つの異なるＣＲＩＳＰＲシステムを有し(S
apranauskas, et al. 2011)、この研究のために、タイプII ＣＲＩＳＰＲ１ (ＳＴ１－
ＣＲＩＳＰＲ)システムを選択した。標的配列の設計は、ＬＭＤ－９の利用可能なゲノム
配列(GenBank: CP000419.1)に基づいた。ＳＴ１－ＣＲＩＳＰＲアレイを、ＣＲＩＳＰＲ
アレイ反復およびスペーサーのみを、キシロース誘導可能プロモーター下に含み(Xie et
al. 2013)、続いてストレプトコッカス種の強構成的プロモーター下の対応するｔｒａｃ
ｒＲＮＡがあるように設計した(Sorg et al. 2014)(図２、配列番号)。
ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの成熟に役割を有し、ストレプトコッカス・サーモフ
ィルス内在性ＲＮａｓｅ IIIにより支持され、ｃｒＲＮＡと複合体を形成する。この複
合体は、エンドヌクレアーゼＳＴ１－Ｃａｓ９のガイドとして働く(Horvath & Barra
ngou, 2010)。キシロース誘導可能プロモーターからの合成アレイの転写後、内在性Ｃａ
ｓ９およびＲＮＡｅは、それを機能的ｇＲＮＡに処理する。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は
、標的位置での二本鎖中断をもたらす。
アレイの設計は、高ＧＣ含量およびｃｒＲＮＡの適切な成熟に必要ではないことが示唆
されているｔｒａｃｒＲＮＡ部分を減少した(すなわち、完全ｔｒａｃｒＲＮＡ配列)２つ
の特異的標的配列を使用した(Horvath & Barrangou, 2010)。
２標的は、必須遺伝子(ＤＮＡポリメラーゼIIIサブユニットアルファ)および抗生物質
耐性遺伝子(ｔｅｔＡ様遺伝子)(配列番号)であった。
プライマーをｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＰｌｄｈＡ主鎖増幅に使用した。ＣＲＩＳ
ＰＲアレイｇＢｌｏｃｋおよびオーバーハングを有する主鎖を、製造業者(NewEngland Bi
olabs)の指示に従いGibson Master Mix(登録商標)で混合した。産物を最後にエシェリキ
ア・コリＴＯＰ１０エレクトロコンピテント細胞に形質転換した。
１.７. ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ－９におけるキシロース誘導可能の
特徴づけ
一夜固定相培養物を、対応する抗生物質含有ＴＨブロスで１：１００に希釈した。対数
中期細胞を、種々の濃度のＤ－(＋)－キシロース(０％wt／vol、０.００１％wt／vol、０
.０１％wt／vol、０.１％wt／vol、０.５％wt／volおよび１％wt／vol)で誘発させ、細胞
培養を培地の自己蛍光の程度を評価するために培地で直接、細胞懸濁液または懸濁液緩衝
液(ＰＢＳ緩衝液)で測定した。細胞培養物の２０μlサンプルを平底９６ウェルプレート
で、ＰＢＳ緩衝液で１／１０希釈した。細胞懸濁液または培地の蛍光をプレートリーダー
で読んだ。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を、励起波長５５８nmおよび放出波長６１２nmを使用して
測定した。再懸濁細胞の吸光度をＯＤ６００nmで測定した。最低３回の独立した生物学的
反復を各実験で行った。
１.８. ストレプトコッカス・サーモフィルスにおけるＣＲＩＳＰＲアレイの活性化
両方ともＤＮＡポリメラーゼIIIをターゲティングするＣＲＩＳＰＲアレイおよびスト
レプトコッカス・サーモフィルスのｔｅｔＡを含むプラスミドを備えたストレプトコッカ
ス・サーモフィルスＬＭＤ－９およびエシェリキア・コリＴＯＰ１０を、一夜、プラスミ
ド維持のために３０μg ml－１のカナマイシンを添加した３ml培養で増殖させた。翌日、
９６ウェル深ウェルプレートで、５００μlの一夜培養物の１／１００を、３０μg ml－
１カナマイシン添加新鮮ＴＨ培地に接種した。対数中期細胞培養を１％キシロースで誘発
した。死滅効果をストレプトコッカス・サーモフィルスおよびエシェリキア・コリ単独で
試験した。試験した各株および条件について、陰性対照をキシロース非存在下に維持した
。細胞をＯＤ約０.５まで増殖させ、次にＴＨ培地で１０倍連続希釈し、９６ウェルレプ
リケーター(Mettler Toledo LiquidatorTM 96)を使用して、５μL体積滴をＴＨ寒天に維
持し、ＴＨ寒天をｇ・ｌ－１ ＰＥＡプレートで添加した。プレートを２４時間、３７℃
でインキュベートし、コロニー形成単位(ＣＦＵ)をトリプリケート測定から計算した。
２. 結果
２.１ 増殖条件および選択培地
我々は、まず、最初に細菌株および我々が共培養実験に使用することを意図していた全
株の増殖を支持する培養プロトコールの確立に着手した。我々は、３７℃でＴＨブロスに
おけるエシェリキア・コリと類似した増殖を支持できたストレプトコッカス・サーモフィ
ルス株ＬＭＤ－９を使用した(図３)。
混合培養からの種々の細菌の鑑別は、それぞれの種の細胞数を決定するために重要であ
る。マッコンキー寒天を用いてエシェリキア・コリを選択的に増殖させることは可能であ
るが、ストレプトコッカス・サーモフィルスの選択的増殖のための特定の培地はない。Ｐ
ＥＡ寒天は、グラム陰性菌(エシェリキア・コリ)からグラム陽性菌(ストレプトコッカス
・サーモフィルス)を単離するのに使用される選択培地である。さらに、我々は、種々の
濃度のＰＥＡが他のグラム陽性菌の増殖を一部阻害し、これが本実験で使用する他のグラ
ム陽性細菌間の選択を可能とすることを発見した(図４)。３ｇ・ｌ－１のＰＥＡが、エシ
ェリキア・コリの増殖を制限しながら、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ－９
を選択的増殖させることが証明された。
２. ２ 誘導可能システムの設計および検証
ストレプトコッカス種のための誘導システムは、先に、異種性キシロース誘導カセット
(Ｘｙｌ－Ｓ)を作ることによりバチルス・メガテリウムキシロースオペロン(図５)に基づ
き開発された。ｘｙｌＲおよびｘｙｌＡプロモーターを、それぞれ、ストレプトコッカス
・ミュータンスの構成的に発現されるｇｙｒＡおよびｌｄｈプロモーターと置き換えた。
ストレプトコッカス種のためのこの発現カセットは、様々な種間で感度および発現レベル
の差を示従、しかしながらシステムはストレプトコッカス・サーモフィルスで試験されな
かった(Xie et al. 2013)。それ故に我々は、まずストレプトコッカス・サーモフィルス
におけるキシロース誘導カセットの検証に着手した。
誘導カセットの別バージョンを、ｘｙｌＲプロモーターのみをストレプトコッカス・ミ
ュータンスのｇｙｒＡプロモーターで置換し、内在性バチルス・メガテリウムｘｙｌＡプ
ロモーターをそのままにすることにより構築した。キシロース誘導可能システムの設計中
、我々は、両バージョンの誘導可能プロモーター、バチルス・メガテリウムに見られる天
然ＰＸｙｌＡプロモーターおよびＰＸｙｌＡプロモーターのリプレッサー結合部位に融合
した高度に保存されたプロモーターＰｌｄｈａのハイブリッドプロモーターを考慮した(
図５)。数ストレプトコッカス種のみがキシロースを代謝すると報告されており、故に他
のストレプトコッカス種におけるｘｙｌＡプロモーターを認識するための制御機構の存在
の可能性はない。それ故に我々は両キシロース誘導システムを構築従、ｍＣｈｅｒｒｙの
Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡシステムでの誘導性のみ試験した。
キシロースでのｍＣｈｅｒｒｙ誘導可能発現を決定するために、プラスミド(ｐＢＡＶ
１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡ)との細胞の対数中期培養
物を、種々の濃度のキシロースで誘発した。誘導６時間後、我々はｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を
培養物で測定し、我々は、プラスミド担持細胞での実質的に高い全体的発現レベルを観察
した(図６)。残念ながらシステムが、キシロースを添加していない培養物でも相当レベル
の基底発現を示したことが見られた。これは、システムが‘漏出性’であり、死滅－アレ
イでは、システムがキシロースで誘導される前から細胞死をもたらし得ることを意味する
。しかしながら、その後の研究で、我々は両バージョンのプラスミド(ｐＢＡＶ１ＫＴ５
－ＸｙｌＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡおよびｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ
－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＰｘｙｌＡ)を使用した。
２.３ ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９アレイの設計
ＣＲＩＳＰＲアレイにおけるゲノムターゲティングスペーサーが、ストレプトコッカス
・サーモフィルスＬＭＤ－９の死滅を誘発できるかを決定するために、我々は、先に構築
した２キシロース誘導可能システム(ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ
ｌｄｈａ＋ＸｙｌＡおよびｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＰｘｙｌＡ)
にＣＲＩＳＰＲアレイを挿入した。これらのプラスミドで、我々はｍＣｈｅｒｒｙを、Ｃ
ＲＩＳＰＲアレイ含有ｇＢｌｏｃｋと置き換えた(図７)。Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡプロモー
ターを有するバリアントは、ＰｘｙｌＡより強力であり、高い基底活性を有することが予
測された(Xie et al. 2013)。
２.４ 内在性Ｃａｓ９を使用する細菌集団増殖阻害
エシェリキア・コリにおいてプラスミドを構築後、我々は、プラスミドをストレプトコ
ッカス・サーモフィルスに形質転換した。これは、我々が特定の細菌種の細胞死を誘発で
きたかどうかの決定を可能とする。興味深いことに、強Ｐｌｄｈ＋ＸｙｌＡハイブリッド
プロモーター含有プラスミドに曝したストレプトコッカス・サーモフィルスの細菌宿主集
団サイズ(増殖細菌および寒天プレート上のコロニー数計数により示す)は、弱い、通常の
ＰｘｙｌＡプロモーターを含むプラスミドに曝したストレプトコッカス・サーモフィルス
と比較して１０倍低く(図８；強アレイ発現での５２コロニー対弱アレイ発現での５５６
コロニー、１０.７倍差)、２株は、同じバッチのエレクトロコンピテントストレプトコッ
カス・サーモフィルス細胞を使用して並行して形質転換されている。これは、我々に、Ｃ
ＲＩＳＰＲアレイターゲティングストレプトコッカス・サーモフィルス遺伝子担持プラス
ミドが、内在性ＣａｓヌクレアーゼおよびＲＮａｓｅ IIIを使用して細胞を殺し、それ
により集団増殖を１０倍阻害することを示唆した。
我々は、ＰｘｙｌＡプロモーター含有プラスミドで形質転換した宿主細胞における弱ア
レイ発現が、強プロモータープラスミドよりはるかに低くても、ある程度の細胞死をもた
らすと予測した。我々は、観察された１０倍阻害より大きな集団増殖阻害が、強アレイ発
現の活性の比較を、何れのアレイコード化プラスミドにも曝していないストレプトコッカ
ス・サーモフィルス(例えば腸内微生物相から直接単離された細菌)と行ったときに見られ
ることを予測した。それ故に、我々は、内在性Ｃａｓヌクレアーゼを利用するための宿主
細胞におけるアレイ(または単一ガイドＲＮＡ)発現は、ここに記載する環境、医薬および
他の設定における標的宿主細胞の効率的増殖阻害提供に有用であることを確信する。抗生
物質の共投与も、、特に１以上の抗生物質耐性遺伝子が標的であるとき、増殖阻害の増強
に有用である。
３. 考察および展望
この研究において、我々は、内在性Ｃａｓ９システムを使用してストレプトコッカス・
サーモフィルスを特異的に死滅させるＣＲＩＳＰＲ－アレイの設計に着手した。死滅シグ
ナルの制御を獲得するために、我々は、ストレプトコッカス・サーモフィルスで適用でき
る誘導可能システムを探索した。バチルス・メガテリウムからのキシロース誘導可能Ｘｙ
ｌＲシステムは先にストレプトコッカス・ミュータンスで適用されていたが(Xie, 2013)
、ストレプトコッカス・サーモフィルスではなかった。この研究において、我々は、スト
レプトコッカス・サーモフィルスでのＸｙｌＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐｌｄｈａ回路設計を
使用して、ｘｙｌＲ誘導システムの機能性を示した。我々は、０.１％wt／volがストレプ
トコッカス・サーモフィルスでＸｙｌＲシステムを完全に誘発するのに十分であることを
発見した(図６)。
共培養ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびエシェリキア・コリの存在比を観察
するために、我々は、培養培地への３ｇ・ｌ－１のＰＥＡの添加が、エシェリキア・コリ
の増殖を制限しながら、ストレプトコッカス・サーモフィルスの選択的増殖を可能とする
ことを確立した(図４)。
ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ－９ゲノムにおけるＤＮＡポリメラーゼII
IサブユニットアルファおよびｔｅｔＡ様遺伝子をターゲティングするＳＴ１－ＣＲＩＳ
ＰＲアレイを、キシロース誘導可能プロモーター(Xie et al. 2013)下においた。これら
の領域のターゲティングは、二本鎖中断をもたらし、故にストレプトコッカス・サーモフ
ィルス生存能を制限するはずである(図９)。改変されたアレイを、コード化ＣＲＩＳＰＲ
アレイ加工のために内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ機構を使用してストレプトコッカス・サ
ーモフィルスゲノムを標的とするよう設計したため、アレイは、エシェリキア・コリのよ
うな無関係株の増殖に、そのゲノムに類似する標的が見られるとしても、影響がないこと
が予測される。これは、実施例８に記載するとおり、混合細菌集団(ヒト微生物相の態様
を模倣)で試験して、成功した。
表面上の宿主細胞増殖を阻害する本発明の能力の証明は、本発明がヒトまたは動物対象
におけるここに開示する微生物相が介在するまたは引き起こされる疾患または状態の処置
または予防のためである実施態様において重要かつ望ましい。このような微生物相は、一
般に対象の組織(例えば、腸、口腔、肺、腋窩、眼、膣、肛門、耳、鼻または咽頭組織)と
接触しており、故に我々は、表面上の微生物相細菌種(ストレプトコッカスにより例示さ
れる)の増殖阻害の活性の証明は、この有用性を支持すると考える。
実施例７：種々の株における特異的微生物相細菌集団増殖阻害
実施例６は、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ－９の特異的増殖阻害を示し
た。ここで、我々は、増殖阻害が、また第二株：ストレプトコッカス・サーモフィルスＤ
ＳＭ ２０６１７でも得ることができることを示す。実施例６に記載した方法を(ストレ
プトコッカス・サーモフィルスＤＳＭ ２０６１７の選択培地は、２.５ｇ・ｌ－１の２
－フェニルエタノール(ＰＥＡ)添加ＴＨ培地であった以外)、それ故に、後者の株に適用
した。
ＣＲＩＳＰＲアレイプラスミドで形質転換したストレプトコッカス・サーモフィルスＤ
ＳＭ ２０６１７を、回復のために液体培地で３時間、３７℃でインキュベートし、これ
はカナマイシン耐性の発現を可能とした。回復期間後、細胞死を誘発するための１％キシ
ロース存在下および対照としてキシロース非存在下で、細胞を種々の選択培地に播種した
(図１０)。(１)キシロース誘導により、ストレプトコッカス・サーモフィルスの増殖が阻
害できる(‘強’プロモータープラスミド対対照で約１０倍)、(２)‘強’システム(ｐＢ
ＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｌｄｈＡ)が‘弱’システム(ｐＢＡＶ１ＫＴ
５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｘｙｌＡ)より多い増殖減少をもたらすことが示される
。
実施例８：種々の微生物相種の混合共同体における選択的細菌集団増殖阻害
我々は、次に、３種の混合集団における特定の細菌種の選択的増殖阻害を示した。我々
は、ヒトおよび動物の腸内微生物相に見られる種を選択した(ストレプトコッカス・サー
モフィルスＤＳＭ ２０６１７(Ｔ)、ラクトバチルス・ラクティスおよびエシェリキア・
コリ)。我々は２グラム陽性種(ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトコッカ
ス・ラクティス)を包含させ、これが前者の種の選択的死滅に対する能力に影響するかを
調べ、さらに困難性を上げるために(および微生物相をより密接に模倣するために)、スト
レプトコッカス・サーモフィルスと系統的に関連する種であるためラクトコッカス・ラク
ティスを選択した(２種間の高１６ｓリボソームＲＮＡ配列同一性により示される)。スト
レプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトコッカス・ラクティスは、両者ともファー
ミキューテスである。さらに、微生物相を模倣するため、ヒト片利共生腸種(エシェリキ
ア・コリ)を包含させた。
１. 材料および方法
実施例６に示す方法を株に使用した(選択培地が２.５ｇ・ｌ－１の２－フェニルエタノ
ール(ＰＥＡ)添加ＴＨ培地であった以外)。
１. １ エレクトロコンピテントラクトコッカス・ラクティス細胞の調製
０.５Ｍスクロースおよび１％グリシン添加ＴＨ培地でのラクトコッカス・ラクティス
の一夜培養物を５mlの同じ培地で１００倍希釈し、３０℃でＯＤ６０００.２～０.７まで
増殖させた(接種約２時間後)。細胞を７０００×ｇで５分、４℃で回収し、５mlの氷冷洗
浄緩衝液(０.５Ｍスクロース＋１０％グリセロール)で３回洗浄した。細胞洗浄後、ＯＤ
６００１５～３０でエレクトロポレーション緩衝液(０.５Ｍスクロース、１０％グリセロ
ールおよび１mM ＭｇＣｌ２)に懸濁した。エレクトロポレーション緩衝液中の細胞を使
用するまで４℃に維持するか(１時間以内)または後に使用するためにエッペンドルフチュ
ーブに５０μlで等分し、液体窒素で冷凍し、－８０℃で保存した。
全種のエレクトロポレーション条件は実施例６に記載のとおりであった。
１.２ ＣＲＩＳＰＲアレイの活性化：共同体実験
ストレプトコッカス・サーモフィルスＤＳＭ ２０６１７、ラクトコッカス・ラクティ
スＭＧ１３６３およびエシェリキア・コリＴＯＰ１０を、ＤＮＡポリメラーゼIIIをター
ゲティングするＣＲＩＳＰＲアレイおよびストレプトコッカス・サーモフィルスのｔｅｔ
Ａを含むプラスミドで遺伝学的に形質転換した。形質転換後、全細胞を単独および共培養
で３時間、３７℃で培養し、プラスミドによりコードされる抗生物質耐性発現のための回
復をさせた。我々は、ＣＲＩＳＰＲコード化増殖阻害の読み出し情報として形質転換効率
を使用することを決定した。そして、細胞を回復させた後、培養物を、全てカナマイシン
が添加されたＴＨ培地、ＰＥＡ添加ＴＨおよびマッコンキー寒天に播種し、１％キシロー
スで誘導した。
２. 結果
２.０ ラクトコッカス・ラクティス、エシェリキア・コリおよびストレプトコッカス・
サーモフィルスの系統的距離
ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトコッカス・ラクティスの１６Ｓ ｒ
ｒＮＡコード化ＤＮＡ配列における計算された配列類似性は８３.３％と決定された。次
の１６Ｓ配列を使用した：エシェリキア・コリ：ＡＢ０３０９１８.１、ストレプトコッ
カス・サーモフィルス：ＡＹ１８８３５４.１、ラクトコッカス・ラクティス：ＡＢ０３
０９１８。配列を次のパラメータを用いてニードルでアラインした(http://www.ebi.ac.u
k/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html)：－gapopen 10.0 -gapextend 0.5 -endo
pen 10.0 -endextend 0.5 -aformat3 pair -snucleotide1 -snucleotide2。図１１は、ス
トレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクティスおよびエシェリキア・
コリからの１６Ｓ配列の最尤推定系統樹を示す。
２.１ 増殖条件および選択培地
ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトコッカス・ラクティスは、多くの発
酵食品およびヨーグルトで一般に組み合わせで使用される。我々は、宿主と密接に関係す
る腸微生物として一般に知られ、ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトコッ
カス・ラクティスの１６ＳリボソームＲＮＡ領域の先の特徴づけがこれらの生物が系統学
的に密接に関係することを示していたため、これらの株を選択した(Ludwig et al., 1995
)。並行して、我々はまたエシェリキア・コリがまた腸微生物共同体で一般に見られるた
め、我々の混合集団共培養実験においてこの生物の増殖も評価した。我々はまず細菌株お
よび我々が共培養実験に使用することを意図していた全株の増殖を支持する培養プロトコ
ールの確立に着手した。我々は、全株がＴＨブロスで３７℃で増殖が支持され得ることを
発見した(図３)。
混合培養からの種々の細菌の鑑別は、様々な種の細胞数を決定するために重要である。
マッコンキー寒天を用いてエシェリキア・コリを選択的に増殖させることは可能であるが
、ストレプトコッカス・サーモフィルスの選択的増殖のための特定の培地はない。ＰＥＡ
寒天は、グラム陰性菌(エシェリキア・コリ)からグラム陽性菌(ストレプトコッカス・サ
ーモフィルス)を単離するのに使用される選択培地である。さらに、種々の濃度のＰＥＡ
が他のグラム陽性菌の増殖を一部阻害し、これが本実験で使用する他のグラム陽性細菌間
の選択を可能とする。２.５ｇ・ｌ－１のＰＥＡの使用が、ラクトコッカス・ラクティス
およびエシェリキア・コリの増殖を制限しながら、ストレプトコッカス・サーモフィルス
を選択的増殖させることを確実とした。
全株をカナマイシン選択マーカーを有するｐＢＡＶ１ＫＴ５のベクター主鎖を使用した
プラスミドで形質転換し、我々は、３０μg ml－１のカナマイシン添加培地が、プラスミ
ドを維持しながら細胞を増殖させるのに十分であることを発見した。
２.３ 混合集団における形質転換および選択的増殖阻害
我々は、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクティスおよびエ
シェリキア・コリをＣＲＩＳＰＲアレイを含むプラスミドで形質転換し、当量部で合わせ
た全細菌種の共同体でこれらを培養し、これはまた我々がストレプトコッカス・サーモフ
ィルスに特異的に細胞死をもたらすことができたかを決定することも可能とした。我々は
、全種をｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰＸｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ
５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｐｌｄｈａ＋Ｘｙｌプラスミドで形質転換した。
図１２は、ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｘｙｌＡまたはｐＢＡＶ１
ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｌｄｈＡ＋Ｘｙｌプラスミドを担持するエシェリキ
ア・コリ、ラクトコッカス・ラクティスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスの共
培養における選択的ストレプトコッカス・サーモフィルス増殖阻害を示す。ｐＢＡＶ１Ｋ
Ｔ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｘｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩ
ＳＰＲ－ＰｌｄｈＡ＋Ｘｙｌプラスミドを担持するエシェリキア・コリで増殖差異は観察
されない(中央カラム)。しかしながら、ストレプトコッカス・サーモフィルス(２.５ｇ・
ｌ－１ ＰＥＡ添加ＴＨ寒天上で選択的増殖、最後のカラム)は、我々が予想したとおり
、ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｘｙｌＡ(強)またはｐＢＡＶ１ＫＴ５
－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｌｄｈＡ＋ＸｙｌＡ(弱)プラスミドで形質転換効率の減少
を示した。こうして、我々は、細胞の混合集団における標的ストレプトコッカス・サーモ
フィルス亜集団の選択的増殖阻害を示した。
引用文献
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0.x
表
Figure 2022106717000003
Figure 2022106717000004
Figure 2022106717000005
Figure 2022106717000006
エントリーは次の例に説明されるとおり解釈する。
Figure 2022106717000007
 ＣＲＩＳＰＲアレイは、デスルホビブリオ・デスルフリカンスＮＤ１３２で３４９１６
５３位から開始して、３４９８１９１位で終わり、見られ、ここでアレイは９８スペーサ
ー配列を有し、各々反復が隣接し、ここで、反復は各々配列番号５１の配列を有する。こ
のような反復はまた備考番号１(表の最後の列)の他の細菌のアレイでも見られる。
Figure 2022106717000008
Figure 2022106717000009
Figure 2022106717000010
Figure 2022106717000011
Figure 2022106717000012
Figure 2022106717000013
配列：
例えば、本発明の１以上のスペーサーは、この配列表における各配列を標的とする。配
列番号１－４４は、タイプII ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム配列、例えば、ストレプト
コッカス配列である。
Figure 2022106717000014
Figure 2022106717000015
Figure 2022106717000016
Figure 2022106717000017
Figure 2022106717000018
Figure 2022106717000019
Figure 2022106717000020

Claims (29)

  1. 細菌種の混合集団における第一および第二細菌種の亜集団の相対比率を変えることによ
    り、ヒトまたは動物対象における細菌宿主細胞が介在する疾患または状態の処置または予
    防における使用のための宿主修飾（ＨＭ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであって、該混
    合集団は該対象に含まれ、該宿主細胞は該第二細菌種の細胞であり、各宿主細胞について
    下記要素（ｉ）～（ｉｉｉ）
    （ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
    （ｉｉ）ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列（ＨＭ－スペーサー）および反復
    を含む宿主細胞標的配列および改変された宿主修飾（ＨＭ）ＣＲＩＳＰＲアレイであって
    、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために
    宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの；
    （ｉｉｉ）ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくと
    も一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ－ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイ
    ドし、宿主細胞における標的配列を修飾し；そして
    ここで、第一の細菌種がエシェリキア・コリである、
    を含む、システム。
  2. 細菌種のエクスビボの混合集団における第一および第二細菌種の亜集団の相対比率を変
    えるための宿主修飾（ＨＭ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用であって、第二細菌種
    の細胞が宿主細胞を含み、各宿主細胞についてシステムが下記要素（ｉ）～（ｉｉｉ）
    （ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
    （ｉｉ）ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列（ＨＭ－スペーサー）および反復
    を含む宿主細胞標的配列および改変された宿主修飾（ＨＭ）ＣＲＩＳＰＲアレイであって
    、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために
    宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの；
    （ｉｉｉ）ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくと
    も一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ－ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイ
    ドし、宿主細胞における標的配列を修飾し；
    ここで標的配列がＣａｓにより修飾され、それにより宿主細胞が死滅するかまたは宿主細
    胞増殖が抑制され、
    ここで、第一の細菌種がエシェリキア・コリである、
    を含む、使用。
  3. 工業用またはエクスビボ医学的流体、表面、装置もしくはコンテナの処理または水路、
    水、飲料、食糧または化粧品の処理のためであって、ここで宿主細胞は、流体、表面、装
    置、コンテナ、水路、水、飲料、食糧または化粧品に含まれるまたはそれらの上にある、
    請求項２に記載の使用。
  4. ヒトまたは動物における片利共生または相利共生であるバクテロイデス門を支持するた
    めにヒトまたは動物に投与するための細菌培養を産生する、請求項２に記載の使用。
  5. 混合集団がエクスビボ腸内微生物相集団であり、所望により宿主細胞がファーミキュー
    テスまたはクロストリジウム・ディフィシル細胞である、請求項２または４に記載の使用
    。
  6. （ａ）各宿主細胞がヒト微生物相に見られる株または種のものであり；
    （ｂ）各宿主細胞がスタフィロコッカス、ストレプトコッカス、シュードモナス、サルモ
    ネラ、リステリア、デスルホビブリオまたはクロストリジウム宿主細胞であり；
    （ｃ）第一細菌がヒトとプロバイオティク、片利共生または相利共生であり（例えば、ヒ
    ト腸における）；または
    （ｄ）第一細菌が腸内細菌科であり、第二細菌がファーミキューテスである、
    請求項２～５の何れかに記載の使用。
  7. （ａ）各宿主細胞がヒト微生物相に見られる株または種のものであり；
    （ｂ）各宿主細胞がスタフィロコッカス、ストレプトコッカス、シュードモナス、サルモ
    ネラ、リステリア、デスルホビブリオまたはクロストリジウム宿主細胞であり；
    （ｃ）第一細菌がヒトとプロバイオティク、片利共生または相利共生であり（例えば、ヒ
    ト腸における）；または
    （ｄ）第一細菌が腸内細菌科であり、第二細菌がファーミキューテスである、
    請求項１に記載のシステム。
  8. （ａ）混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率の改変、（ｂ）混合細菌集団
    におけるファーミキューテス亜集団（宿主細胞）の比率の減少、（ｃ）混合集団における
    第一ファーミキューテス種（宿主細胞）の比率の減少であって、ここで混合集団が該ｃＲ
    ＮＡにより増殖が阻害されない第二ファーミキューテス種を含むもの、（ｄ）混合細菌集
    団における第一グラム陽性細菌種（宿主細胞）の比率の減少であって、ここで混合集団が
    該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されない第二グラム陽性細菌種を含むもの、（ｅ）混合細菌
    集団におけるある細菌種（宿主細胞）の比率の減少であって、ここで混合集団が該ｃＲＮ
    Ａにより増殖が阻害されない異なる細菌種を含み、ここで第一種が他の種の１６ｓリボソ
    ームＲＮＡコード化ＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡコ
    ード化ＤＮＡ配列を含むもの、（ｆ）混合細菌集団における第一細菌ヒト腸内微生物相種
    （宿主細胞、例えば、ファーミキューテス）の比率の減少であって、ここで混合集団は異
    なる細菌種を含み、ここで異なる種が該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されないヒト腸プロバ
    イオティク種であるものまたは（ｇ）混合細菌集団における細菌ヒト腸内微生物相種（宿
    主細胞、例えば、ファーミキューテス）の比率の減少であって、ここで混合集団が異なる
    細菌種を含み、ここで異なる種が該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されないヒト腸片利共生種
    であるもののための、請求項２～６の何れかに記載の使用。
  9. （ａ）混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率の改変、（ｂ）混合細菌集団
    におけるファーミキューテス亜集団（宿主細胞）の比率の減少、（ｃ）混合集団における
    第一ファーミキューテス種（宿主細胞）の比率の減少であって、ここで混合集団が該ｃＲ
    ＮＡにより増殖が阻害されない第二ファーミキューテス種を含むもの、（ｄ）混合細菌集
    団における第一グラム陽性細菌種（宿主細胞）の比率の減少であって、ここで混合集団が
    該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されない第二グラム陽性細菌種を含むもの、（ｅ）混合細菌
    集団におけるある細菌種（宿主細胞）の比率の減少であって、ここで混合集団が該ｃＲＮ
    Ａにより増殖が阻害されない異なる細菌種を含み、ここで第一種が他の種の１６ｓリボソ
    ームＲＮＡコード化ＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡコ
    ード化ＤＮＡ配列を含むもの、（ｆ）混合細菌集団における第一細菌ヒト腸内微生物相種
    （宿主細胞、例えば、ファーミキューテス）の比率の減少であって、ここで混合集団が異
    なる細菌種を含み、ここで異なる種が該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されないヒト腸プロバ
    イオティク種であるものまたは（ｇ）混合細菌集団における細菌ヒト腸内微生物相種（宿
    主細胞、例えば、ファーミキューテス）の比率の減少であって、ここで混合集団が異なる
    細菌種を含み、ここで異なる種が該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されないヒト腸片利共生種
    であるものであって、ここで（ａ）～（ｇ）は、ヒトまたは動物対象における（ｉ）比率
    が減少される該細菌種による微生物相感染または（ｉｉ）比率が減少される該細菌種が介
    在する疾患または状態の処置または予防のためである、請求項１および７の何れかに記載
    のシステム。
  10. （ａ）細菌の混合集団における第一および第二亜集団の相対比率を変えるためであって、
    ここで、第二細菌がファーミキューテスであるもの；
    （ｂ）ファーミキューテスに対するバクテロイデス門の相対的比率を増加させるため；ま
    たは
    （ｃ）混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率を変えるための、
    請求項２～６および８の何れかに記載の使用。
  11. （ａ）細菌の混合集団における第一および第二亜集団の相対比率を変えるためであって、
    ここで、第二細菌がファーミキューテスであるもの；
    （ｂ）ファーミキューテスに対するバクテロイデス門の相対的比率を増加させるため；ま
    たは
    （ｃ）混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率を変えるための、
    請求項１、７および９の何れかに記載のシステム。
  12. あるいはＨＭ－ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）か
    らなる、例えばベクターにより提供される、請求項２～６、８および１０の何れかに記載
    の使用。
  13. あるいはＨＭ－ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）か
    らなる、例えばベクターにより提供される、請求項１、７、９および１１の何れかに記載
    のシステム。
  14. 宿主細胞集団増殖が、該ＨＭ－アレイまたは該ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列
    で形質転換されていない該宿主細胞の集団の増殖と比較して少なくとも５倍減少している
    、請求項２～６、８、１０および１２の何れかに記載の使用。
  15. 宿主細胞集団増殖が、該ＨＭ－アレイまたは該ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列
    で形質転換されていない該宿主細胞の集団の増殖と比較して少なくとも５倍減少している
    、請求項１、７、９、１１および１３の何れかに記載のシステム。
  16. 表面上の宿主細胞集団増殖が阻害される、請求項２～６、８、１０、１２および１４の
    何れかに記載の使用。
  17. 表面上の宿主細胞集団増殖が阻害される、請求項１、７、９、１１、１３および１５の
    何れかに記載のシステム。
  18. ポイント（ｉ）において、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列
    が宿主細胞に内在性である、請求項２～６、８、１０、１２、１４および１６の何れかに
    記載の使用。
  19. ポイント（ｉ）において、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列
    が宿主細胞に内在性である、請求項１、７、９、１１、１３、１５および１７の何れかに
    記載のシステム。
  20. ベクターが、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする配列を欠く、請求項２～６、８、１０、
    １２、１４、１６および１８の何れかに記載の使用。
  21. ベクターが、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする配列を欠く、請求項１、７、９、１１、
    １３、１５、１７および１９の何れかに記載のシステム。
  22. ベクターがファージベクターである、請求項２～６、８、１０、１２、１４、１６、１
    ８および２０の何れかに記載の使用。
  23. ベクターがファージベクターである、請求項１、７、９、１１、１３、１５、１７、１
    ９および２１の何れかに記載のシステム。
  24. 各宿主細胞について、システムが、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列
    を発現するためのＤＮＡ配列をさらに含む、請求項２～６、８、１０、１２、１４、１６
    、１８、２０および２２の何れかに記載の使用。
  25. 各宿主細胞について、システムが、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列
    を発現するためのＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１、７、９、１１、１３、１５、１７
    、１９、２１および２３の何れかに記載のシステム。
  26. 混合集団が対象の腸内微生物相に含まれる、請求項１、７、９、１１、１３、１５、１
    ７、１９、２１、２３および２５の何れかに記載のシステム。
  27. 請求項１、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５および２６の何
    れかに記載のシステムにおける使用のための改変された核酸ベクターを含む組成物であっ
    て、ベクターは、請求項１～２６の何れかに記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおけ
    る使用または使用のための複数の異なるｃｒＲＮＡを発現するための核酸配列を含み（例
    えば、ｇＲＮＡに含まれる）；そして
    ここで、該ｃｒＲＮＡの第一は該宿主細胞の第一核酸配列とハイブリダイズでき、そして
    該ｃｒＲＮＡの第二は該宿主細胞の第二核酸配列とハイブリダイズでき、ここで該第二配
    列は該第一配列と異なり；そして
    （ａ）第一配列は抗生物質耐性遺伝子（またはそのＲＮＡ）を含み、第二配列は抗生物質
    耐性遺伝子（またはそのＲＮＡ）を含み、所望により、これらの遺伝子は異なり；
    （ｂ）第一配列は抗生物質耐性遺伝子（またはそのＲＮＡ）を含み、第二配列は必須また
    は病原性遺伝子（またはそのＲＮＡ）を含み；
    （ｃ）第一配列は必須遺伝子（またはそのＲＮＡ）を含み、第二配列は必須または病原性
    遺伝子（またはそのＲＮＡ）を含むまたは
    （ｄ）第一配列は病原性遺伝子（またはそのＲＮＡ）を含み、第二配列は必須または病原
    性遺伝子（またはそのＲＮＡ）を含む、
    組成物。
  28. １．４ｋｂを超える外来性ＤＮＡ配列を含み、ここで外来性ＤＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃ
    ａｓシステムの１以上の要素をコードし、宿主細胞におけるＨＭ－ｃｒＲＮＡまたはｇＲ
    ＮＡの発現のための改変されたアレイを含み；外来性配列はｃＲＮＡまたはｇＲＮＡと同
    族であるＣａｓヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を欠き、ここで少なくとも２
    つの異なるｃＲＮＡまたはｇＲＮＡが外来性ＤＮＡによりコードされる（例えば、少なく
    とも２ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイにより）、請求項１～２６の何れかに記載の使用または
    システムにおける使用のための核酸ベクター。
  29. ベクターがファージベクターである、請求項２７または２８に記載の組成物またはベク
    ター。
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