KR20200091499A - 미생물 개체군 변경 및 미생물군 변형 - Google Patents

미생물 개체군 변경 및 미생물군 변형 Download PDF

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모르텐 소머
크리스티안 그뢴달
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Abstract

본 발명은 박테리아 개체군 성장을 억제하거나 박테리아의 혼합된 개체군에서 제1 및 제2 박테리아의 하위 개체군의 상대적 비를 변경하기 위한 방법, 용도, 시스템, 어레이, 조작된 뉴클레오타이드 서열 및 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 예를 들어 환경, 의학, 식품 및 음료 용도와 같은 미생물의 처리에 특히 유용하다. 본 발명은 그 중에서도 산업용 시스템 또는 가정용 시스템에서 기판 또는 유체의 미생물학적으로 영향을 받는 부식 (MIC) 또는 바이오파울링(biofouling)을 제어하는 방법에 관한 것이다.

Description

미생물 개체군 변경 및 미생물군 변형{ALTERING MICROBIAL POPULATIONS ＆ MODIFYING MICROBIOTA}
본 발명은 박테리아 개체군 성장을 억제하는 방법, 박테리아의 혼합된 개체군에서 제1 및 제2 박테리아의 하위 개체군의 상대적 비를 변경하는 방법, 이러한 목적을 위한 핵산 어레이 및 상기 어레이를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 숙주 세포 핵산을 변형시키는 조작된 시스템(engineered system), 이러한 시스템의 구성성분, 및 산업 및 의학 분야에서의 이들의 적용에 관한 것이다. 본 발명은 환경, 식품 및 음료 용도와 같은 미생물의 처리에 특히 유용하다. 본 발명은 그 중에서도 산업용 시스템 또는 가정용 시스템에서 기판 또는 유체의 미생물학적으로 영향을 받는 부식(microbiologically influenced corrosion; MIC) 또는 바이오파울링(biofouling)을 제어하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법에서 사용하기 위한 처리된 유체 및 벡터에 관한 것이다. 실시형태에서, 상기 방법은 어레이의 수평 이동(horizontal transfer)을 사용한다. 본 발명은 또한 이러한 목적을 위한 이동성 유전 요소 (MGE)로 구성된 어레이 및 이들 어레이를 포함하는 벡터를 제공한다.
박테리아 개체군의 성장을 억제하고 혼합물 내 다른 박테리아 종의 상대적 비를 변경하는 것은 수도(waterway), 식수 또는 기타 환경 설정의 처리와 같은 광범위한 산업 및 설정에서 적용된다. 또한, 병원체 감염을 줄이거나 장내 또는 구강 내 미생물군을 재균형시키기 위해 인간과 인간이 아닌 동물, 예를 들어 가축의 박테리아를 변경하는데 적용된다. 최근, 신체 질량이나 비만 프로파일이 다른 인간들에서의 장내 박테리아의 상대적 비를 분석하거나 크론 병과 같은 질병 상황에서 발생할 수 있는 박테리아 영향을 조사하는데 관심이 모아졌었다.
파지에 대한 박테리아의 타고난 면역 기전은 매우 많지만, 광범위하게 문서화된 박테리아 적응 면역 시스템은 CRISPR/Cas 시스템이다. 조작된 CRISPR/Cas 시스템(Engineered CRISPR/Cas system)은 박테리아에서 동물 및 식물 세포에 이르기까지 다양한 유형의 원핵 세포 및 진핵 세포에서 핵산의 정확한 변형에 사용되어 왔다(예: Jiang W외 (2013) 참조). 박테리아와 고세균류와 같은 원핵 생물은 바이러스 (예: 박테리오파지)와 플라스미드와 같은 이동성침입자에 대한 내성을 제공하기 위해 CRISPR/Cas (클러스터링한 일정 간격의 짧은 회귀성 반복 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)과 연관됨)으로 불리우는 적응 면역 시스템을 인코딩한다. 참조문헌 [Seed 외 (2013)]은 박테리오파지 (또는 파지)가 지구상에서 가장 풍부한 생물체이며, 박테리아의 먹이보다 10 배 이상 많다고 추측한다. 파지 포식에 대한 끊임없는 위협은 다양한 박테리아 면역 메카니즘의 진화로 이어져 다양한 파지 면역 회피 전략의 진화를 가져와 역동적인 공동-진화 군비 경쟁으로 이끌었다.
숙주 면역성은 메모리 좌위(CRISPR 어레이)에 침입자 DNA 서열의 통합; 이러한 좌위로부터 가이드 RNA의 형성, 및 프로토스페이서 인접 모티브(protospacer adjacent motif: PAM)에 인접하게 위치한 동족 침입자 DNA (프로토스페이서)의 분해에 기초한다. 예를 들면 WO2010/075424를 참조한다. 숙주 CRISPR 어레이는 다양한 요소: 반복이 동일하고 스페이서가 다른 하나 이상의 반복 - 스페이서 - 반복 단위의 5' 가까이에 리더(프로모터 포함)를 포함한다. 바이러스 또는 플라스미드 핵산 침입으로부터 스페이서 서열을 획득함으로써, 숙주 방어 시스템은 새로운 스페이서를, 바이러스 또는 플라스미드에 의한 장래의 침입에 대처할 메모리로서 작용하는 CRISPR 어레이 (각 스페이서는 반복에 의해 측면에 위치함)에 통합시킬 수 있다. 최근 취득한 스페이서는 리더의 직후에 숙주 어레이에 삽입되는 경향이 관찰되었다.
참조문헌 [Heler 외 (2014)]은 CRISPR 좌위와 그 관련 유전자 (Cas)가 파지 및 기타 침입 유전 요소에 대한 적응 면역을 박테리아와 고세균류에 부여한다고 설명한다. 면역 시스템의 기본적인 요구 사항은 재발성 감염을 보다 효율적으로 처리하기 위해 과거의 감염에 대한 메모리를 구축할 수 있는 능력이다. CRISPR-Cas 면역 시스템의 적응형 특성은 침입 분자의 DNA 서열을 암기하고 '스페이서' 형태의 CRISPR 어레이의 반복 서열 사이에 이들을 통합시키는 능력에 달려있다. 스페이서의 전사는 감염으로부터 세포를 보호하기 위해 침입 핵산을 절단하기 위해 RNA-안내된 Cas 뉴클레아제에 의해 사용되는 작은 안티센스 RNA를 생성한다. 새로운 스페이서를 획득하면 CRISPR-Cas 면역 시스템이 새로운 위협에 신속하게 적응하게 되므로 '적응'(즉, 벡터 서열 스페이서 획득)이라고 한다.
참조문헌 [Seed 외 (2013)]은, 파지-인코딩된CRISPR/Cas 시스템이 박테리아 숙주의 파지 저해 염색체 섬(phage inhibitory chromosomal island)에 대항하기 위해 사용된 놀라운 변화의 사건을 보고했다. 파지에 의한 성공적인 용균 감염은 CRISPR 스페이서와 표적 염색체 섬 사이의 서열 동일성에 달려 있다고 보고되었다. 이러한 표적화가 없다면, 파지-인코딩된 CRISPR/Cas 시스템은 새로운 스페이서를 획득하여 신속하게 진화하고, 파지 복제를 복원하기 위해 염색체 섬을 효과적으로 표적화하는 것을 보장할 수 있다. 참조 문헌 [Bondy-Denomy 외(2012)]은 CRISPR/Cas 시스템의 저해를 매개하는 초기 관찰된 유전자의 예를 기술한다. 녹농균 (슈도모나스 에루지노사: Pseudomonas aeruginosa)을 감염시키는 박테리오파지의 게놈에서 다섯 개의 '항-CRISPR' 유전자가 발견되었다. 파지의 항-CRISPR 유전자를 변이시켜 기능적 CRISPR/Cas 시스템으로 박테리아를 감염시키지 못하도록 하고, 동일한 유전자를 CRISPR/Cas-표적 파지의 게놈에 첨가하여 CRISPR/Cas 시스템을 회피할 수 있었다.
미성숙 RNA는 CRISPR 어레이로부터 전사되고 이어서 crRNA를 형성하도록 성숙된다. 일부 CRISPR/Cas 시스템은, 미성숙 crRNA에서 반복에 혼성화하여 pre-crRNA를 형성할 수 있는 전사-촉진성 RNA (tracrRNAs)를 인코딩하는 서열을 포함하여, 추가 처리하여 성숙한 또는 crRNA가 생성된다. cRNA의 구조는 관련된 CRISPR/Cas 시스템 유형 (유형 I, II 또는 III)에 따라 다양하다.
CRISPR-관련 (cas) 유전자는 CRISPR 어레이와 빈번하게 관련이 있다. 광대한 비교 유전체학은 많은 다른 cas 유전자를 확인하였고; 40개의 박테리아 및 고세균류 게놈에 대한 초기 분석에서 보편적으로 존재하는 단지 2개의 cas1과 cas2 유전자를 가진 45 개의 cas 유전자 가족이 존재할 수 있다고 제안했다. Cas1과 Cas2는 새로운 스페이서를 어레이에 도입하는 데 필수적인 것으로 여겨지므로 파지 또는 플라스미드로부터 침입자 핵산에 대한 내성을 개발하는 메커니즘에서 중요하다. 참조문헌 [(Nunez) 외 (2015)]은 Cas1-Cas2 복합체가 스페이서 DNA 획득을 촉매하는 최소한의 기계임을 입증하며, Cas1-Cas2-매개된 적응 면역에 대한 서열 및 구조 특이성을 제공하는 CRISPR 반복의 중요성을 명백하게 설명한다.
CRISPR/Cas 시스템은 또한 침입자 뉴클레오타이드 서열에서 동족 인식 모티브 (PAM)에 인접한 침입자 핵산을 절단하기 위한 뉴클레아제 (예: Cas9)를 발현하는 서열을 포함한다. 뉴클레아제의 PAM 인식은 Cas 핵산 분해 효소의 각 유형에 특이적이다. 침입자 서열의 PAM은, PAM의 (5') 상류에서 3개 4개의 뉴클레오타이드를 전형적으로 절단하는 뉴클레아제와 함께, 프로토스페이서 서열의 3' 가까이에 위치할 수 있다. PAM 서열의 보존은 CRISPR-Cas 시스템들 사이에서 상이하며, 진화적으로 cas1 및 리더 서열에 연결되는 것으로 보인다. 참조문헌[Fineran 외 (2014)]은 침입자가 프로토스페이서 또는 이와 인접한 PAM의 한 영역 (시드 영역)에서 점 돌연변이를 만들어 대장균 K12에서 유형 I-E CRISPR-Cas 면역을 벗어날 수 있지만, 숙주는 획득("프라이밍")과 관련된 긍정적-피드백 과정에서 새로운 스페이서를 통합함으로써 면역을 신속하게 복원하는 것을 관찰하였다. 현재까지, PAM은 다수의 유형 I 및 유형 II 시스템에서 잘 특성화되어 있으며, 프로토스페이서에서의 돌연변이의 영향이 문서화되어 있다 (Fineran 외 (2014)의 참조 문헌 5, 14, 23, 46, 47 참조). Fineran 외(2014)는 그 결과가 이전 연구와 일치하여 PAM 및 종자 서열의 결정적인 역할을 입증했다고 결론지었다.
참조문헌 [Semenova 외 (2011)]은 시드 서열의 역할을 연구하였고, 대장균 하위 유형 CRISPR/Cas 시스템의 경우, crRNA 정합에 대한 요구 조건이 PAM 가까이에 시드 영역에 대해 엄격하다는 결론을 내렸다. 이들은 시드 영역의 돌연변이가 crRNA-안내된 캐스캐이드 복합체의 프로토스페이서 DNA에 대한 결합 친화력을 감소시킴으로써 CRISPR/Cas 매개 면역을 파괴한다는 것을 관찰하였다.
세 가지 주요 유형의 적응 면역의 각각에 대한 CRISPR 면역의 단계는 다음과 같다:
(1) 획득은 Cas1과 Cas2에 의한 침입 DNA의 인식과 프로토스페이서의 절단으로 시작하고;
(2) 프로토스페이서 서열은 리더 서열에 인접한 직접 반복에 연결되며;
(3) 단일 가닥 확장은 CRISPR을 수리하고 직접 반복을 복제한다.
crRNA 처리 및 간섭 단계는 세 가지 주요 유형의 CRISPR 시스템 각각에서 다르게 발생한다. 1차 CRISPR 전사물은 Cas에 의해 절단되어 crRNA를 생성한다. 유형 I 시스템에서 Cas6e/Cas6f는 직접 반복에서 헤어핀 루프에 의해 형성된 ssRNA 및 dsRNA의 교차점에서 절단한다. 유형 II 시스템은 트랜스-활성 (tracr) RNA를 사용하여 dsRNA를 형성하며, 이는 Cas9와 RNaseIII에 의해 절단된다. 유형 II 시스템은 절단을 위한 직접 반복에서 헤어핀 루프를 필요로 하지 않는 Cas6 동족체를 사용한다. 유형 II 및 유형 III 시스템에서, 2 차 트리밍은 성숙한 crRNA를 생성하기 위해 5' 또는 3'말단에서 수행된다. 성숙한 crRNA는 Cas 단백질과 결합하여 간섭 복합체를 형성한다. 유형 I 및 유형 II 시스템에서, crRNA와 PAM 사이의 염기쌍은 침입하는 DNA의 분해를 일으킨다. 유형 III 시스템은 성공적인 분해를 위해 PAM을 필요로하지 않으며 유형 III-A 시스템에서는 유형 III-B 시스템에 의해 표적화된 DNA보다는 crRNA와 mRNA 사이에서 염기쌍이 발생한다.
본 발명의 제1 구성
본 발명의 발명자들은, 하나 이상의 다음의 특징으로 미생물군 (인간, 동물 또는 환경 미생물군)에서 자연적으로 함께 발생하는 박테리아의 혼합된 컨소시엄에서 특정 박테리아 균주의 개체군 성장을 억제하는 것을 처음으로 입증했다고 생각한다:
* 야생형 세포를 표적화하고;
* 야생형 내인성 Cas 뉴클레아제 활성을 이용하고;
* 필수 및 항생제 내성 유전자를 표적화함으로써 개체군 성장을 억제하는 것으로,
* 여기서, 표적은 야생형 서열이다.
본 발명의 발명자들은 다음의 특징으로 혼합된 박테리아 개체군 내에서 이를 입증하였다:
* 인간 미생물군(소화관 미생물군을 포함함) 종의 혼합된 개체군에서 박테리아 성장 억제를 표적화하고;
* 여기서, 개체군은 3가지 종을 포함하고;
* 이들 종 중 하나와 다른 종의 예비 세포를 선택적으로 사멸시키는 것을 포함하고;
* 이러한 억제에 해를 입지 않은 계통발생적으로 가까운 다른 종의 존재 하에서 세포 성장 억제를 표적화하고;
* 표적인 페르미쿠테스 종 및 비-페르미쿠테스 종을 포함하는 혼합된 개체군에서 세포 성장 억제를 표적화하고;
* 혼합된 개체군에서 다른 페르미쿠테스 종을 절약하면서 특정 페르미쿠테스 균주의 세포 성장 억제를 표적화하고;
* 혼합된 개체군에서 다른 그람 양성 박테리아 종을 절약하면서 특정 그람 양성 박테리아 균주의 세포 성장 억제를 표적화하고;
* 공생 인간 장내 박테리아 종을 절약하면서 병원성 (인간 내) 박테리아 종을 표적화하고;
* 공생 인간 장내 박테리아 종을 절약하면서 병원성 박테리아 종을 표적화하고;
* 표면 상 혼합된 박테리아 개체군에서 세포 성장 억제를 표적화하고;
* 특정 박테리아 종만을 단독으로 또는 컨소시엄에서 다른 여러 박테리아 종과 혼합했을 때 적어도 10 배로 성장 억제를 달성하며;
* 특정 박테리아 종의 2 가지 다른 균주의 성장 억제를 최소 10 배 달성한다.
야생형 세포에서 내인성 Cas 활성을 이용하는 능력은 유기체 (예: 인간 및 동물) 및 환경에서의 숙주 세포 감염의 현장 처리에 매우 유용하다. 인간, 동물 또는 식물 미생물군과 같은 야생형 (즉, 비-조작된 또는 사전-조작된) 박테리아 개체군의 처리도 본 발명을 이용하여 해결할 수 있다. 혼합된 개체군에서 선택적 성장 억제를 수행하는 능력은 인간, 동물 또는 식물 미생물군과 같은 박테리아 개체군을 다루거나 환경 미생물군집을 다루는데 유용하다. 이러한 특징은 또한 약제(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 치료 또는 예방을 위해; 또는 본 발명의 제품 박테리아 개체군을 포함하는 제초제 조성물 또는 살충제 조성물을 제조하기 위해 인간 또는 동물 대상체에 투여하기 위한 박테리아 세포 이식물)를 생산하는데 유용하며, 선택적 살해를 사용하여 혼합된 개체군에서 상이한 박테리아의 비를 선택적으로 변경시켜 약제, 제초제 또는 살충제; 또는 약제, 제초제 또는 살충제로부터 생산된 변경된 박테리아 개체군을 생산한다. 예를 들어, 약제는 인간 또는 동물 수용자에 비강 내로 이식되어 이러한 치료 또는 예방을 가져올 수 있다.
하기의 수행된 예에서, 성장 억제는 고체 표면상의 박테리아 개체군 (그람 양성 페르미쿠테스 개체군)에서 다루어졌다. 10 배를 초과하는 개체군 성장 억제가 달성되었다. 표적화는 항생제 내성 유전자에 관한 것이다. 본 발명은 표적 서열이 항생제 내성 유전자의 서열인 항생제 내성 박테리아의 성장을 억제하는데 유용할 것이다. 하나의 예로, 조작된 뉴클레오타이드 서열을 항생제와 함께 투여하는 것이 효과적일 수 있다. 이는 인간 또는 동물 대상체에서의 숙주 세포 감염의 보다 완전한 치료 또는 예방을 제공하고/하거나 인간 또는 동물에 투여하기 위한 치료학적으로 효과적인 항생제 투여량의 감소를 가능하게 할 수 있다. 이는 항생제의 과다 투여 및 인간 및 동물 개체군의 내성 발달에 대해 우려가 증가한다는 점에서 유용하다. 본 발명은 또한 산업용 또는 의료용 유체, 표면, 장치 또는 컨테이너 (예를 들어, 식품, 소비재, 화장품, 개인 건강 제품, 석유 또는 석유 생산용)를 처리하기 위해; 또는 수로, 물, 음료, 식품 또는 화장품을 처리하기 위해 생체 외 (ex vivo) 및 시험관내 (in vitro)에 적용되고, 여기서 숙주 세포(들)는 유체, 표면, 장치, 컨테이너, 수로, 물, 음료, 식품 또는 화장품으로 구성되거나 또는 이에 포함된다. 본 발명은 부식물, 바이오필름 및 바이오파울링의 제어에도 적용된다. 이에 따라, 제1 구성은 다음 컨셉을 제공한다:
박테리아의 혼합된 개체군에서 제1 박테리아 및 숙주 세포를 포함하는 제2 박테리아의 하위 개체군의 상대적 비를 변경하기 위한 숙주 변형 (Host modifying; HM) CRISPR/Cas 시스템의 용도로서,
각각의 숙주 세포에 대하여, 상기 시스템은 다음의 (i) 내지 (iv)에 따른 성분을 포함하며,
(i) Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열;
(ii) 숙주 세포 표적 서열, 및 스페이서 서열(HM-스페이서)과 HM-crRNA(HM-crRNA는 숙주 세포 표적 서열에 혼성화하는 서열을 포함하여 상기 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시킴)을 인코딩하는 반복을 포함하는, 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이;
(iii) 선택적 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열;
(iv) 시스템의 상기 성분은 숙주 세포 및 숙주 세포를 형질 전환시키는 적어도 하나의 핵산 벡터 사이에서 분할됨에 따라, HM-crRNA는 Cas를 표적으로 안내하여 숙주 세포 내 숙주 CRISPR/Cas 시스템을 변형시키며;
표적 서열이 Cas에 의해 변형됨에 따라, 숙주 세포가 사멸되거나 숙주 세포의 성장이 감소된다.
박테리아 숙주 세포의 표적 뉴클레오타이드 서열을 변형하기 위한 제1항의 용도의 숙주 변형 (HM) CRISPR/Cas 시스템으로서, 상기 시스템은 다음의 (i) 내지 (iv)에 따른 성분을 포함하며,
(i) Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열;
(ii) 숙주 세포 표적 서열, 및 스페이서 서열(HM-스페이서)과 HM-crRNA(HM-crRNA는 숙주 세포 표적 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하여 상기 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시킴)을 인코딩하는 반복을 포함하는, 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이;
(iii) 선택적 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열;
(iv) 시스템의 상기 성분은 숙주 세포 및 숙주 세포를 형질 전환시키는 적어도 하나의 핵산 벡터 사이에서 분할됨에 따라, HM-crRNA는 Cas를 표적으로 안내하여 숙주 세포 내 숙주 CRISPR/Cas 시스템을 변형시킨다;
이는 혼합된 및 비-혼합된 세포 개체군에서 적어도 10 배의 선택적 숙주 세포 성장 억제를 나타내는 본 발명의 수행된 실시예에 의해 예시된다. 혼합물은 인간 미생물군에서 발견된 종과 균주의 조합을 시뮬레이션한다.
개체군의 성장을 억제하는 박테리아 숙주 세포 개체군의 야생형 내인성 Cas 뉴클레아제의 활성의 용도로서, 각각의 숙주 세포가 야생형 Cas 뉴클레아제 활성을 갖는 내인성 CRISPR/Cas 시스템을 가지며, 용도는 개체군의 숙주 세포를 형질 전환시키는 것을 포함하며, 각각의 형질 전환된 숙주 세포는 숙주 세포에서 숙주 변형 (HM) cRNA 또는 가이드 RNA (gRNA)를 제공하기 위해 조작된 뉴클레오타이드 서열로 형질 전환되고, HM-cRNA 또는 gRNA는 내인성 Cas를 표적으로 안내하기 위한 숙주 세포 표적 프로토스페이서 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하고, cRNA 또는 gRNA는 상기 야생형 뉴클레아제 활성을 갖는 숙주 세포의 내인성 Cas 뉴클레아제와 동족이고 상기 숙주 세포의 형질 전환 후에 상기 개체군의 성장이 억제된다.
박테리아 숙주 세포를 사멸 또는 성장을 감소시키기 위한 숙주 변형 (HM) CRISPR/Cas 시스템의 용도(상기 용도는 선택적으로 바로 윗 단락의 용도에 따름)로서, 각각의 숙주 세포에 대하여, 상기 시스템은 다음의 (i) 내지 (iv)에 따른 성분을 포함하며,
(i) Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열;
(ii) 스페이서 서열(HM-스페이서)과 HM-crRNA(HM-crRNA는 숙주 세포 표적 서열에 혼성화하는 서열을 포함하여 상기 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시킴)을 인코딩하는 반복을 포함하는, 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이;
(iii) 선택적 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열;
(iv) 시스템의 상기 성분은 숙주 세포 및 숙주 세포를 형질 전환시키는 적어도 하나의 핵산 벡터 사이에서 분할됨에 따라, HM-crRNA는 Cas를 표적으로 안내하여 숙주 세포 내 표적 서열을 변형시키며;
Cas 뉴클레아제는 숙주 세포에 내인성이고; 표적 서열은 Cas에 의해 변형됨에 따라, 숙주 세포가 사멸되거나 숙주 세포 성장이 감소된다.
이에 따라, HM-cRNA는 숙주 세포 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 상기 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시키게 된다.
하나의 대안으로, HM-crRNA 및 tracrRNA는 단일 가이드 RNA (gRNA)로 구성된다.
내인성 Cas 핵산 분해 효소를 이용함으로써, 본 발명의 실시 형태는 내인성 Cas 뉴클레아제 활성(즉, 뉴클레아제 활성을 활성화 또는 증진시키기 위한 숙주 세포의 사전 유전적 변형을 필요로 하지 않음)을 사용한다. 따라서, 하나의 예에서, Cas 뉴클레아제는 숙주 세포의 야생형 유전자에 의해 인코딩된다. 하나의 예에서, 뉴클레아제는 숙주 세포에서 내인성 Cas 뉴클레아제(또는 Cas 뉴클레아제 유전자) 억제자를 불활성화하지 않고 세포 사멸 또는 성장 억제를 달성하는데 활성을 갖는다. 이에 따라, 본 발명은 효과적인 Cas-매개 세포 사멸 또는 성장 감소를 가져오는데 사전 조작의 필요성 없이 야생형 박테리아 개체군을 처리할 수 있다. 따라서, 개체군이 야생형 환경(예: 수로 또는 인간 또는 동물 미생물군집으로 구성됨)에 있을 때 개체군은 cRNA에 노출될 수 있다.
하나의 예에서, 제1박테리아는 박테로이데테스(Bacteroidetes, 예: 박테로이데스) 세포이다. 하나의 예에서, 제2 박테리아는 페르미쿠테스(Firmicutes) 세포이다. 상기 방법은 예를 들어, 장내 미생물군 개체군(예를 들어, 생체 외 또는 생체 내)의 비를 변경하는데 사용되며, 이는 예를 들면, 증가된 신체 질량 또는 비만을 치료 또는 예방하기 위한 것이다 (여기서, 예를 들어, 제1 박테리아는 페르미쿠테스 세포이다).
제1 구성은 또한 다음을 제공한다: 상기 하위 개체군을 포함하는 혼합된 개체군의 제1 및 제 2 박테리아의 하위 개체군의 상대적 비를 변경하는 방법으로서, 제 1 박테리아는 파지에 의해 감염된 숙주 세포 (예를 들어, 박테로이데테스 세포)이고, 상기 제 2 박테리아는 상기 파지 (또는 박테로이데테스 박테리아가 아님)에 감염되지 않으며, 상기 방법은 벡터 핵산을 숙주 세포에 도입하고 혼합된 개체군에 박테리아 증식을 허용하기 위해 하나 이상의 단계에서 복수의 벡터와 혼합된 개체군을 결합시키는 단계를 포함하며, 제 1 및 제 2 박테리아의 상대적 비가 변경되고; 각각의 벡터는 세포 내에서 상기 파지의 표적 뉴클레오타이드 서열을 변형시키기 위해 파지-감염된 숙주 세포 내로 도입하기 위한 조작 된 파지-변형 (PM) CRISPR 어레이를 포함한다.
(a) PM-CRISPR 어레이는 PM-crRNA의 발현을 위한 하나 이상의 서열 및 파지-감염된 숙주 세포 내 서열의 전사를 위한 프로모터를 포함하며;
(b) PM-crRNA가 파지 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 감염된 숙주 세포에서 Cas (예를 들어, Cas 뉴클레아제)를 안내하여 표적 서열을 변형시킨다.
제2 구성에서, 본 발명은
숙주 세포의 표적 뉴클레오타이드 서열을 변형하기 위한(예를 들면, 제1 구성의 용도를 위한) 숙주 변형 (HM) CRISPR/Cas 시스템으로서, 상기 시스템은 다음의 (i) 내지 (iv)에 따른 성분을 포함하며,
(i) Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열;
(ii) 스페이서 서열(HM-스페이서)과 HM-crRNA(HM-crRNA는 숙주 세포 표적 서열에 혼성화하는 서열을 포함하여 상기 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시킴)을 인코딩하는 반복을 포함하는, 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이;
(iii) 선택적 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열;
(iv) 시스템의 상기 성분은 숙주 세포 및 숙주 세포를 형질 전환시키는 적어도 하나의 핵산 벡터 사이에서 분할됨에 따라, HM-crRNA는 Cas를 표적으로 안내하여 숙주 세포 내 표적 서열을 변형시키며;
여기서, 선택적으로, 성분 (i)은 숙주 세포에 내인성이다.
제2 구성은 또한 다음을 제공한다: 파지의 게놈을 변형시키기 위한 제1 구성의 방법에 사용하기 위한 조작된 파지-변형 (PM) CRISPR 어레이로서,
(a) PM-CRISPR 어레이는 PM-crRNA의 발현을 위한 하나 이상의 서열 및 파지-감염된 숙주 세포 내 서열의 전사를 위한 프로모터를 포함하며;
(b) PM-crRNA가 파지 게놈 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 감염된 숙주 세포에서 Cas (예를 들어, Cas 뉴클레아제)를 안내하여 표적 서열을 변형시킨다.
하나의 예에서, 파지는 박테로이데테스(예: 박테로이데스) 파지, 예를 들면 crAssphage이다.
하나의 예에서, 어레이는 숙주 세포 CRISPR/Cas 시스템과 기능하는 CRISPR 반복을 포함한다. 이는 박테리아 혼합물에서 원하는 세포에 대한 어레이의 선택성을 증가 시키는데 유익하다. 이는 또한 숙주 세포에서 어레이의 기능에 요구되는 하나 이상의 Cas 단백질 (및/또는 tracrRNA)을 인코딩하는 벌키 뉴클레오타이드 서열을 포함할 필요가 없기 때문에 본 발명의 어레이를 함유하는 어레이 및 벡터의 제조를 단순화한다. 대안으로서, 어레이는 동족체 Cas9-인코딩 서열 및 선택적으로 동족체 tracrRNA-인코딩 서열이 제공된다.
제3 구성에서, 본 발명은
내인성 CRISPR/Cas 시스템을 포함하는 박테리아 숙주 세포를 변형하기 위한 조작된 핵산 벡터로서, 벡터는
(a) CRISPR/Cas 시스템에서 사용하기 위한 또는 본 발명의 용도로 사용하기 위한 다수의 상이한 crRNA(예를 들어, 단일 가이드 RNA, 즉, gRNA임)를 발현하기 위한 핵산 서열을 포함하며;
(b) Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열이 결핍되어 있으며, 제1의 상기 crRNA는 상기 숙주 세포에서 제1핵산 서열에 혼성화될 수 있고; 제2의 상기 crRNA는 상기 숙주 세포에서 제2 핵산 서열에 혼성화될 수 있고, 제2 서열은 제1 서열과 상이하며;
(c) 제1 서열은 항생제 내성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되고, 제2 서열은 항생제 내성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되며; 선택적으로 이들 유전자는 상이하며;
(d) 제1 서열은 항생제 내성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되며, 제2 서열은 필수 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되며;
(e) 제1 서열은 필수 유전자(또는 이의 RNA)로 구성되며, 제2 서열은 필수 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되거나; 또는
(f) 제1 서열은 독성 유전자(또는 이의 RNA)로 구성되며, 제2 서열은 필수 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성된다.
제3 구성은 또한 다음을 제공한다: 본 발명의 방법에 사용하기 위한 핵산 벡터(예: 플라스미드, 파지 또는 파지미드)는 본 발명의 CRISPR 어레이를 포함한다.
제4 구성에서, 본 발명은
숙주 박테리아 세포 (예를 들어, 전술한 바와 같은 병원성 박테리아 세포)의 게놈 또는 숙주 세포 내 바이러스 (예를 들면, 파지)의 게놈의 표적 서열을 변형시키기 위한 조작된 CRISPR 어레이를 포함하는 핵산 벡터 (예를 들어, 플라스미드, 바이러스, 파지 또는 파지미드),
(a) CRISPR 어레이는 crRNA(예를 들면, gRNA로 구성됨)의 발현을 위한 하나 이상의 서열 및 숙주 세포 내 서열의 전사를 위한 프로모터를 포함하며;
(b) crRNA가 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 숙주 세포에서 Cas (예를 들어, Cas 뉴클레아제)를 안내하여 표적 서열을 변형시키고;
(c) 어레이는 상이한 종의 제1 및 제2 박테리아 세포 사이에서 수평 이동이 가능한 트랜스포존(transposon)으로 구성된다.
제5 구성에서, 본 발명은
이동성 유전자 요소(MGE)를 포함하거나 MGE로 구성된 조작된 CRISPR 핵산 벡터를 제공하는 것으로, 상기 MGE는 숙주 세포(예를 들어, 병원성 박테리아 세포)의 게놈 또는 숙주 세포 내 바이러스(예를 들어, 프로파지)의 게놈의 표적 서열을 변형시키기 위한 전달 기원 (oriT) 및 CRISPR 어레이를 포함하며,
(a) CRISPR 어레이는 crRNA의 발현을 위한 하나 이상의 서열 및 숙주 세포 내 서열(들)의 전사를 위한 프로모터를 포함하고;
(b) crRNA는 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 숙주 세포에서 Cas(예를 들어, Cas 뉴클레아제)를 안내하여 표적 서열을 변형시키고;
(c) 벡터는 (i) 제1 숙주 세포의 제1 및 제2 핵산 위치 사이에서 이동가능하고, 여기서, 각각의 위치는 염색체 또는 플라스미드 상의 위치이며 표적 서열은 숙주 세포에 포함되거나, 또는 (ii) 제 1 및 제 2 숙주 세포 사이에서 이동가능하고, 여기서, 표적 서열은 제1 및/또는 제2 숙주 세포에 포함된다.
제6 구성에서, 본 발명은
산업용 시스템 또는 가정용 시스템에서 기판의 미생물학적으로 영향을 받는 부식(MIC) 또는 바이오파울링을 제어하는 방법으로서, 기판의 표면은 기판의 MIC 또는 바이오파울링을 매개하는 제1 미생물 종의 제1 숙주 세포의 개체군과 접촉하며, 상기 방법은
(i) 세포를 형질 전환 또는 형질 도입할 수 있는 다수의 벡터와 개체군을 접촉시키는 단계로서, 각각의 벡터는 CRISPR 어레이를 포함함으로써, CRISPR 어레이가 숙주 세포 내로 도입되고,
(a) 각 CRISPR 어레이는 crRNA의 발현을 위한 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 및 숙주 세포 내 서열의 전사를 위한 프로모터를 포함하고;
(b) 각 crRNA는 숙주 세포의 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 Cas (예를 들어, Cas 뉴클레아제)를 숙주 세포에 안내하여 표적 서열을 변형(예를 들어, 표적 서열을 절단)시키고; 표적 서열은 숙주 세포 생존력을 매개하는 유전자 서열이며;
(ii) 숙주 세포 내 Cas의 존재하에 상기 cRNA의 발현을 가능하게함으로써 숙주 세포에서 표적 서열을 변형시켜 숙주 세포 생존력의 감소 및 기판의 MIC 또는 바이오파울링을 제어하게 되는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서,
원유, 가스 또는 석유화학 회수, 처리, 저장 또는 운송 장비에 포함되는 기판의 미생물학적으로 영향을 받는 부식(MIC) 또는 바이오파울링(biofouling)을 제어하는 방법으로서, 기판의 표면은 제1 숙주 세포 개체군과 접촉하고, 제1 숙주 세포는 기판의 MIC 또는 바이오파울링을 매개하는 제1 종의 황- 또는 황산염-환원 박테리아 (SRB), 세포외 고분자 물질-생산 박테리아 (EPSB), 산-생산 박테리아 (APB), 황- 또는 황화물-산화 박테리아 (SOB), 철-산화 박테리아 (IOB), 망간-산화 박테리아 (MOB), 암모니아 생산 박테리아 (AmPB) 또는 아세테이트 생산 박테리아(AcPB)이고, 표면 및 세포 개체군은 해수, 담수, 파쇄액 또는 웰 내의 액체로부터 선택된 액체와 접촉하고, 상기 방법은
(i) 제1 숙주 세포를 형질 전환 또는 형질 도입할 수 있는 다수의 벡터와 액체를 혼합하여 벡터와 세포 개체군을 접촉시키는 단계로서, 각각의 벡터는 CRISPR 어레이를 포함함으로써, CRISPR 어레이가 숙주 세포 내로 도입되고,
(a) CRISPR 어레이는 crRNA의 발현을 위한 하나 이상의 서열 및 숙주 세포에서 서열의 전사를 위한 프로모터를 포함하며;
(b) 각각의 crRNA는 숙주 세포의 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 숙주 세포에서 Cas(예: Cas 뉴클레아제)를 안내하여 표적 서열을 변형(예를 들어, 표적 서열을 절단)시키고; 표적 서열은 숙주 세포 생존력을 매개하는 유전자 서열이고;
(c) (a)의 각 서열은 제1 숙주 세포에서 각각의 crRNA의 발현 및 생산을 위한 서열 R1-S1-R1'을 포함하고, R1은 제1 CRISPR 반복이고, R1'은 제2 CRISPR 반복이고, R1 또는 R1'는 선택적이며; S1은 상기 제 1 숙주 세포의 표적 서열과 80% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 CRISPR 스페이서이고,
(ii) 숙주 세포 내 Cas의 존재하에 상기 cRNA의 발현을 가능하게함으로써 숙주 세포에서 표적 서열을 변형시켜 숙주 세포 생존력의 감소 및 기판의 MIC 또는 바이오파울링을 제어하게 되는 단계를 포함한다.
기타 실시형태는
상기 방법에 사용하기 위한 벡터를 제공하는 것으로, 제1 세포가 데설포비브리오(desulfovibrio) 또는 데설포토마쿨럼(desulfotomaculum) 세포와 같은 황산염 환원 박테리아 (SRB) 세포이고, 벡터는 SRB를 표적화하기 위한 하나 이상의 CRISPR 어레이를 포함하며, 각 어레이는 (a) 내지 (c)에 정의된 바와 같다.
다른 실시형태에서, 산업용 시스템 또는 가정용 시스템에서 유체의 미생물 바이오파울링을 제어하는 방법이 제공되며, 유체는 바이오파울링을 매개하는 제1 미생물 종의 제1 숙주 세포의 개체군을 포함하고, 방법은
(i) 세포를 형질 전환 또는 형질 도입할 수 있는 다수의 벡터와 개체군을 접촉시키는 단계로서, 각각의 벡터는 CRISPR 어레이를 포함함으로써, CRISPR 어레이가 숙주 세포 내로 도입되고,
(a) 각 CRISPR 어레이는 crRNA의 발현을 위한 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 및 숙주 세포 내 서열의 전사를 위한 프로모터를 포함하고;
(b) 각 crRNA는 숙주 세포의 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 Cas (예를 들어, Cas 뉴클레아제)를 숙주 세포에 안내하여 표적 서열을 변형(예를 들어, 표적 서열을 절단)시키고; 표적 서열은 숙주 세포 생존력을 매개하는 유전자 서열이고;
(ii) 숙주 세포 내 Cas의 존재하에 상기 cRNA의 발현을 가능하게함으로써 숙주 세포에서 표적 서열을 변형시켜 숙주 세포 생존력의 감소 및 바이오파울링을 제어하게 되는 단계를 포함한다.
예를 들면, 선박 또는 보트의 밸러스트 수 내 박테리아 바이오파울링을 제어하는 방법이 제공되며, 물은 바이오파울링을 매개하는 제1 미생물 종의 제1 숙주 세포의 개체군을 포함하고, 방법은
(i) 세포를 형질 전환 또는 형질 도입할 수 있는 다수의 벡터와 개체군을 접촉시키는 단계로서, 각각의 벡터는 CRISPR 어레이를 포함함으로써, CRISPR 어레이가 숙주 세포 내로 도입되고,
(a) 각 CRISPR 어레이는 crRNA의 발현을 위한 하나 이상의 서열 및 숙주 세포 내 서열의 전사를 위한 프로모터를 포함하고;
(b) 각 crRNA는 숙주 세포의 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 Cas (예를 들어, Cas 뉴클레아제)를 숙주 세포에 안내하여 표적 서열을 변형(예를 들어, 표적 서열을 절단)시키고; 표적 서열은 숙주 세포 생존력을 매개하는 유전자 서열이고;
(ii) 숙주 세포 내 Cas의 존재하에 상기 cRNA의 발현을 가능하게함으로써 숙주 세포에서 표적 서열을 변형시켜 숙주 세포 생존력의 감소 및 바이오파울링을 제어하게 되는 단계를 포함한다.
기타 실시형태는 CRISPR 어레이를 포함하는 밸러스트 해수(예를 들어, 컨테이너 내의 해수 시료 또는 해수)를 제공하며, 밸러스트 수는 상기 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있다. 밸러스트 해수를 포함하는 선박, 보트, 해수 컨테이너 또는 장비(rig)를 제공한다. 방법에 사용하기 위한 벡터를 제공하고, 제1 세포는 콜레라(예: 비브리오, 예를 들어 O1 또는 O139), 대장균 또는 장구균 종 세포이고, 상기 벡터는 세포를 표적화하기 위한 하나 이상의 CRISPR 어레이를 포함하며, 각각의 어레이는 (a) 및 (b)에 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 제6 구성에서 사용하기 위한 또는 의료용 또는 식품 또는 음료 처리용과 같은 다른 용도에 사용하기에 적합한 벡터 및 CRISPR 어레이를 제공한다. 이를 위해, 박테리아 숙주 세포 내로 도입하기 위한 CRISPR 어레이를 포함하는 벡터를 제공하며, 여기서, 박테리아는 수인성 전달이 가능하며,
(a) CRISPR 어레이는 crRNA의 발현을 위한 서열 및 상기 숙주 세포에서 서열의 전사를 위한 프로모터를 포함하고;
(b) crRNA는 숙주 세포의 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 숙주 세포에서 Cas(예: Cas 뉴클레아제)를 안내하여 표적 서열을 변형(예를 들어, 표적 서열을 절단)시키고; 표적 서열은 숙주 세포 생존력을 매개하는 뉴클레오타이드 서열이고;
(c) (a)의 서열은 crRNA의 발현 및 생산을 위한 서열 R1-S1-R1'을 포함하고, R1은 제1 CRISPR 반복이고, R1'은 제2 CRISPR 반복이고, R1 또는 R1'는 선택적이며; S1은 상기 숙주 세포의 표적 서열과 80% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 CRISPR 스페이서이다.
또한, 다수의 이러한 벡터를 포함하는 물 또는 식품 처리 조성물을 제공한다. 또한, 인간 내 박테리아 감염(예: 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae) 감염)의 치료 또는 예방용 약제로서, 다수의 상기 벡터를 포함하는 약제를 제공한다. 본 발명은 또한 박테리아 개체군, 조성물, 식품 및 음료를 제공한다. 예를 들면, 식품 또는 음료는 유제품이다.
제7 구성에서, 본 발명은
제1 국면에서,
제1 Cas를 인코딩하는 발현 가능한 유전자를 변형시키는 방법으로서, 방법은
(a) 상기 유전자로부터 발현되는 제1 Cas의 존재하에 가이드 RNA(gRNA1)를 Cas 유전자와 결합시키는 단계; 및
(b) gRNA1을 상기 Cas 유전자의 서열(예를 들어, 프로모터 또는 이의 제1 Cas-인코딩 DNA 서열)에 혼성화시키고, 제1 Cas를 유전자에 안내함으로써, Cas가 Cas 유전자를 변형시키는 단계를 포함한다.
제1 핵산 벡터 또는 벡터의 조합은, 예를 들어 상기 방법에서 사용하기 위한 것으로,
(a) 제1 벡터 또는 상기 조합의 벡터는 제1 Cas를 안내하기 위한 소정의 프로토스페이서 서열(PS1)에 상보적인 가이드 RNA(gRNA1, 예를 들어 단일 gRNA)를 인코딩하는, 발현가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함하여 제1 부위(CS1)에서 PS1을 변형시키고, 여기서 PS1은 제 1 Cas에 동족인 PAM (P1)에 인접하거나; 또는 발현가능한 서열은 tracrRNA와 함께 gRNA1을 형성하는 crRNA를 인코딩하며;
(b) PS1 및 P1은 발현가능한 제1 Cas-인코딩 유전자의 서열이고, PS1은 제1 Cas에 의해 CS1에서 변형될 수 있다.
본 발명의 이들 국면은 예를 들어 세포 또는 시험관 내에서 Cas 활성을 조절하는데 유용하다. 본 발명은 Cas 활성을 제한하도록 Cas-인코딩 유전자를 표적화함을 포함하며, Cas의 일시적인 조절에 유리하다. 본 발명은 또한 예를 들어, 세포의 게놈을 변형시킬 때 오프-타겟 Cas 절단에 대한 기회를 감소시키기 위해, Cas 활성의 증가된 엄격성이 바람직한 환경에서 유용할 수 있다. 예를 들면, 세포, 조직 또는 세포를 포함하는 유기체의 유전자 치료 또는 유전자 표적화와 같이 오프-타겟 영향을 최소화하거나 회피해야하는 인간, 동물 또는 식물 세포를 변형시키는데 응용가능하다. 예를 들면, 유전자 치료 또는 인간의 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위해 환자에게 투여되는, 인간 세포(예: iPS 세포)에서 목적하는 변화를 만들기 위해 Cas 변형을 사용하는 경우 매우 높은 엄격성이 요구된다. 본 개시는 본 발명의 방법 및 제품의 일부로서 이들 응용을 제공한다.
본 발명은 또한 벡터, 특히 바이러스 벡터에서 제한된 삽입능의 문제점을 해결한다.
따라서, 본 발명의 제8 구성은
CRISPR/Cas 시스템의 성분을 인코딩하는 1.4kb를 초과하는 외인성 DNA 서열을 포함하는 핵산 벡터를 제공하며, 여기서, 서열은 숙주 세포(본 명세서에서 임의의 세포, 예를 들어, 인간, 암세포 또는 박테리아 또는 고세균류 숙주 세포)에서 하나 이상의 HM- 또는 PM-crRNA 또는 gRNA를 발현시키기 위한 조작된 어레이 또는 조작된 서열(임의로 본 명세서에서 기술된 바와 같음)을 포함하고, 어레이 또는 조작된 서열은 cRNA(들) 또는 gRNA(들)에 동족인 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않으며; 선택적으로 적어도 2, 3 또는 4개의 cRNA 또는 gRNA는 외인성 DNA에 의해 인코딩된다.
1.4 kb를 초과 또는 4.2kb를 초과하는 외인성 DNA 서열을 포함하는 핵산 벡터로서, 여기서, 외인성 DNA는 CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 성분을 인코딩하고, 숙주 세포에서 하나 이상의 HM-crRNA 또는 gRNA를 발현하기 위한 조작된 어레이 또는 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)을 포함하고, 외인성 서열은 cRNA(들) 또는 gRNA(들)에 동족인 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 결여되어 있고; 선택적으로 적어도 2개의 상이한 cRNA 또는 gRNA가 외인성 DNA에 의해 인코딩된다.
본 명세서에서 임의의 구성에서, 예를 들어, cRNA(들)는 하나 이상의 단일 가이드 RNA (gRNA)에 의해 제공되며,이 경우 "CRISPR 어레이"는 상기 gRNA(들)을 인코딩하는 하나 이상의 발현 가능한 뉴클레오타이드 서열을 지칭할 수 있다. 따라서, 서열은 세포(들) 내에서 gRNA(들)를 발현하기 위해 숙주 세포(들)에서 발현될 수 있다.
본 발명은 주로 박테리아의 측면에서 기술되지만, 이는 또한 고세균에 대해서도 준용 적용 가능하다.
본 명세서의 하나의 구성상의 임의의 특징은, 하나의 예에서, 본 명세서의 하나 이상의 청구항에서 이러한 조합을 가능한 포함하기 위해 본 발명의 상이한 구성과 결합한다.
도 1은 자일로스 유도성 시스템을 도시한다.
도 2는 ST1-CRISPR 어레이를 도시한다.
도 3은 이 작업에 사용된 균주의 TH-배지에 대한 스팟 분석을 도시한다. 모든 균주는 37℃에서 20 시간 동안 TH-배지에서 성장시켰다. 각각의 콜로니를 계수하기 위해 하루밤 배양의 연속 희석을, 대장균, 락토코커스 락티스(L Lactis) 및 스트렙토코커스 무탄스(S.mutans)에 대해 2회 행하였고, 스트렙토코커스 서모필러스(S. thermophilus)의 두 균주에 대해 3 번 수행하였다.
도 4는 상이한 배양 조건 하에 스트렙토코커스 서모필러스, 스트렙토코커스 무탄스, 락토코커스 락티스, 및 대장균의 선택적 성장을 도시한다. 테트라시클린(tetracycline)은 스트렙토코커스 서모필러스 LMD-9를 선택적으로 성장시키는데 사용할 수 없다. 그러나, PEA의 3g l-1은 대장균의 성장을 제한하면서 스트렙토코커스 서모필러스 LMD-9를 선택적으로 성장시키는 것으로 입증되었다.
도 5는 야생형 B. 메가테리움(B. megaterium) 오페론 (왼쪽)에 기초한 두 개의 자일로스 유도 카세트 (중간, 오른쪽)의 제작(참조문헌: Xie 외, 2013)을 도시한다.
도 6은 플라스미드 pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha를 이용한 스트렙토코커스 서모필러스 LMD-9 내 자일로스 유도성 카세트의 특성화를 도시한다. 자일로스의 양이 증가함에 따라 형광에서 명확한 반응이 관찰될 수 있다.
도 7은 pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA에서 CRISPR 어레이의 설계를 도시한다. 어레이는 강한 유도성 프로모터 P3A 하에서 유도성 자일로스 프로모터 및 tracrRNA 하에서 스트렙토코커스 서모필러스 유전자를 표적화하는 2개의 스페이서 서열을 함유한다.
도 8은 스트렙토코커스 서모필러스 LMD-9의 플라스미드 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-Pldh+XylA (왼쪽) 및 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PXylA (오른쪽)의 형질 전환 효율을 도시한다.
도 9는 개략적인 자일로스-유도성 CRISPR 장치를 도시한다. 자일로스의 유도시 스트렙토코커스 서모필러스 LMD-9 게놈에서 polIII 및 tetA를 모두 표적화하는 CRISPR 어레이가 발현된다. 구성적으로 발현된 tracrRNA와 함께, 복합체가 Cas9와 형성된다. 이 복합체는 스트렙토코커스 서모필러스 LMD-9 게놈에서 tetA 및 polIII 유전자의 이중 가닥 절단을 도입하여 제한된 세포 생존력을 초래할 것이다.
도 10은 스트렙토코커스 서모필러스 DSM 20617(T)의 플라스미드 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PXylA (왼쪽) 또는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-Pldha + XylA (오른쪽)의 성장 억제를 도시한다. 비유도됨(상부 패널) 및 유도됨(하부 패널). 배양 63시간 후 찍은 사진. 콜로니는 왼쪽 하단에 기재되어 있다 (윗줄:> 1000,> 1000, 아랫줄: 336, 113).
도 11은 스트렙토코커스 서모필러스, 락토코커스 락티스 및 대장균으로부터의 16S 서열의 최대-가능 계통발생수(maximum-likelihood phylogenetic tree)를 도시한다.
도 12는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA 또는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA 플라스미드 중의 하나를 포함하는 대장균, 락토코커스 락티스 및 스트렙토코커스 서모필러스 내 공-배양에서 선택적 스트렙토코커스 서모필러스 성장 억제를 도시한다. pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA 또는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA 플라스미드(중간 컬럼)를 포함하는 대장균 간에는 성장 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, 스트렙토코커스 서모필러스(2.5 gl-1 PEA이 보충된 TH 배지에서 선택적으로 성장시킴, 마지막 컬럼)는 예상했던대로 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA (강) 또는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA + XylA (약) 플라스미드 사이에서 형질전환 효율 감소가 나타난다. 이에 따라, 본 발명자들은 혼합된 세포 개체군에서 표적 스트렙토코커스 서모필러스 하위 개체군의 선택적 성장 억제를 입증하였다. 콜로니는 왼쪽 하단에 기재되어 있다 (윗줄: >1000, >1000, 68, 아랫줄: >1000, >1000, 32)
미생물 개체군 성장 억제 및 미생물 비 변경
본 발명은 박테리아 개체군 성장을 억제하거나 또는 박테리아의 혼합된 개체군에서 제1 및 제2 박테리아의 하위 개체군의 상대적 비를 변경, 예를 들면, 인간의 미생물군에서 박테로이데테스(예: 박테로이데스), 페르미쿠테스, 및/또는 그람 양성 또는 음성 박테리아의 비율을 변경시키기 위한 것과 같은 인간 또는 동물 미생물군집을 변경시키기 위한 방법, 용도, 시스템, 어레이, cRNA, gRNA 및 벡터에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 제1 내지 제3 구성을 참조한다. 본 발명은 예를 들어, 숙주 박테리아 세포, 예를 들어, 박테로이데테스 세포 또는 페르미쿠테스 세포의 하나 이상의 표적 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는 것을 포함한다.
다수의 연구에서, 2개의 주요 창자, 박테로이데테스 및 페르미쿠테스의 각 수준이 인간과 무균 마우스 둘 다에서 비만과 연결되는 것을 지적하고 있다. 이 연구의 저자들은 탄수화물 대사가 중요한 요인이라고 추론한다. 이들은 비만인 개체의 미생물군이 훨씬 많은 페르미테쿠스 문의 박테리아를 함유하고 박테로이데테스는 적게 함유한다는 사실을 관찰하고, 이 박테리아 혼합물이 마른 개체의 미생물군(반대 비율을 가지는 미생물)보다 주어진 식이에서 에너지를 추출하는데 보다 효율적일 수 있다고 추측하였다. 일부 연구에서, 비만 개체군의 체중 감량으로 박테로이데테스의 상대적인 풍요가 증가하고, 또한, 비만 마우스의 미생물군이 무균 마우스에게 옮겨지면, 이들 마우스는 마른 마우스에서 미생물군을 수득한 대조군보다 체중이 증가한다는 사실을 발견했다. 참조문헌 [Turnbaugh, P. J., R. E. Ley, M. A. Mahowald, V. Magrini, E. R. Mardis, and J. I. Gordon. 2006, "An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest", Nature 444:1027-1131].
컨셉
본 발명은 숙주 세포 표적을 포함하는 다음의 컨셉을 제공한다:
1. 박테리아 숙주 세포를 사멸하거나 성장을 감소시키는, 숙주 변형 (HM) CRISPR/Cas 시스템의 용도로서, 각각의 숙주 세포에 대하여, 상기 시스템은 다음의 (i) 내지 (iv)에 따른 성분을 포함하며,
(i) Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열;
(ii) 스페이서 서열(HM-스페이서)과 HM-crRNA(HM-crRNA는 숙주 세포 표적 서열에 혼성화하는 서열을 포함하여 상기 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시킴)을 인코딩하는 반복을 포함하는, 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이;
(iii) 선택적 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열;
(iv) 시스템의 상기 성분은 숙주 세포 및 숙주 세포를 형질 전환시키는 적어도 하나의 핵산 벡터 사이에서 분할됨에 따라, HM-crRNA는 Cas를 표적으로 안내하여 숙주 세포 내 표적 서열을 변형시키며;
Cas 뉴클레아제는 숙주 세포에 내인성이고; 표적 서열은 Cas에 의해 변형됨에 따라, 숙주 세포가 사멸되거나 숙주 세포 성장이 감소된다.
제1 컨셉은 선택적으로 다음을 제공한다:
박테리아의 혼합된 개체군에서 제1 박테리아 및 숙주 세포를 포함하는 제2 박테리아의 하위 개체군의 상대적 비를 변경하기 위한 숙주 변형 (HM) CRISPR/Cas 시스템의 용도로서, 각각의 숙주 세포에 대하여, 상기 시스템은 다음의 (i) 내지 (iv)에 따른 성분을 포함하며,
(i) Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열;
(ii) 스페이서 서열(HM-스페이서)과 HM-crRNA(HM-crRNA는 숙주 세포 표적 서열에 혼성화하는 서열을 포함하여 상기 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시킴)을 인코딩하는 반복을 포함하는, 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이;
(iii) 선택적 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열;
(iv) 시스템의 상기 성분은 숙주 세포 및 숙주 세포를 형질 전환시키는 적어도 하나의 핵산 벡터 사이에서 분할됨에 따라, HM-crRNA는 Cas를 표적으로 안내하여 숙주 세포 내 표적 서열을 변형시키며;
선택적으로, Cas 뉴클레아제는 숙주 세포에 내인성이며;
표적 서열이 Cas에 의해 변형됨에 따라, 숙주 세포가 사멸되거나 숙주 세포의 성장이 감소된다.
제1 컨셉은 또한 다음을 제공한다: 박테리아의 혼합된 개체군에서 제1 박테리아 및 숙주 세포를 포함하는 제2 박테리아의 하위 개체군의 상대적 비를 변경하는 방법으로서, 방법은 혼합된 개체군을 숙주 변형 (HM) CRISPR/Cas 시스템과 혼합함으로써, 제 2 박테리아 숙주 세포를 사멸 시키거나 세포의 성장을 감소시킴으로써 상기 비를 변경시키는 단계를 포함하고,
각각의 숙주 세포에 대하여, 상기 시스템은 다음의 (i) 내지 (iv)에 따른 성분을 포함하며,
(i) Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열;
(ii) 스페이서 서열(HM-스페이서)과 HM-crRNA(HM-crRNA는 숙주 세포 표적 서열에 혼성화하는 서열을 포함하여 상기 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시킴)을 인코딩하는 반복을 포함하는, 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이;
(iii) 선택적 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열;
(iv) 시스템의 상기 성분은 숙주 세포 및 숙주 세포를 형질 전환시키는 적어도 하나의 핵산 벡터 사이에서 분할됨에 따라, HM-crRNA는 Cas를 표적으로 안내하여 숙주 세포 내 표적 서열을 변형시키며;
선택적으로, Cas 뉴클레아제는 숙주 세포에 내인성이며;
표적 서열이 Cas에 의해 변형됨에 따라, 숙주 세포가 사멸되거나 숙주 세포의 성장이 감소된다.
제1 컨셉은 또한 다음을 제공한다:
박테리아의 혼합된 개체군에서 제1 및 제 2 박테리아의 하위 개체군의 상대적 비를 변경하기 위한 숙주 변형 (HM) CRISPR/Cas 시스템의 용도로서, 제 2 박테리아는 표적 프로토스페이서 서열을 각각 포함하는 다수의 숙주 세포를 포함하며, 각각의 숙주 세포에 대하여, 상기 시스템은 위에 정의된 성분 (ii) 및 (iii)을 포함하고, 시스템은 또한, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 추가로 포함하고; 성분 (ii) 및 상기 Cas-인코딩 서열은 숙주 세포를 형질 전환시키는 적어도 하나의 핵산 벡터로 구성됨으로써, (i)에 의해 인코딩된 HM-crRNA는 Cas를 표적으로 안내하여 숙주 세포에서 표적 서열을 변형시키고;
Cas 뉴클레아제는 숙주 세포에 내인성이고; 표적 서열은 Cas에 의해 변형됨에 따라, 숙주 세포가 사멸되거나 숙주 세포 성장이 감소된다.
하나의 실시형태에서, 제1 박테리아의 성장은 억제되지 않거나; 또는 숙주 세포의 성장 억제는 제1 세포의 성장 억제의 적어도 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 50 배, 100 배 또는 1000 배이다. 성장 억제는 배-억제 또는 백분율 억제(본원에 기술된 바와 같음)로서 계산될 수 있다. 다른 예에서, 저해는 분광 광도계에 의한 배양 시료에서 측정되고, 소정의 crRNA/gRNA 처리 기간의 시작과 끝에서 흡광도(예: OD600에서)가 결정된다(배수 또는 백분율로 억제를 결정하는 경우 본 명세서에서 해당 기간의 설명을 참조한다). 하나의 예에서, 숙주 세포 시료에 대한 흡광도의 증가(소정된 기간의 시작에서의 흡광도를 기간의 끝에서의 흡광도와 비교)는 대조 시료(cRNA 또는 gRNA에 노출되지 않은 것)보다 낮으며, 예를 들어 전자에 대한 증가는 후자에 대한 것보다 적어도 10, 100, 1000, 10000 또는 100000 배 더 낮다 (예 : OD600으로 결정됨). 하나의 예에서, 성장 억제의 결정(즉, 소정된 기간의 끝)은 각 시료의 중간 지수 성장 단계(예: 소정된 기간의 시작 후 6 내지 7 시간)에 이루어진다.
하나의 예에서, 숙주 세포는 유기체 또는 환경에 의해 포함된 미생물 개체군(예: 수로 미생물군, 물 미생물군, 인간 또는 동물 장내 미생물군, 인간 또는 동물 구강 미생물군, 인간 또는 동물의 질 미생물군, 인간 또는 동물 피부 또는 모발 미생물군 또는 인간 또는 동물 겨드랑이 미생물군)으로 구성되며, 개체군은 유기체 또는 환경과 생리공생 또는 공생하는 제1 박테리아 및 숙주 세포를 포함하는 제2 박테리아를 포함하고, 숙주 세포는 유기체 또는 환경에 유해하다(예: 병원성). 하나의 실시형태에서, 개체군은 생체 외이다.
제1 박테리아 하위 개체군 대 제2 박테리아 하위 개체군의 비가 증가된다.
제1 컨셉은 또한 하기에 기술되는 바와 같이 숙주 세포 성장을 억제하는 용도를 제공한다.
2. 숙주 세포의 표적 뉴클레오타이드 서열을 변형하기 위한(예를 들면, 제1 컨셉의 용도를 위한) 숙주 개질 (HM) CRISPR/Cas 시스템으로서, 상기 시스템은 다음의 (i) 내지 (iv)에 따른 성분을 포함하며,
(i) Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열;
(ii) 스페이서 서열(HM-스페이서)과 HM-crRNA(HM-crRNA는 숙주 세포 표적 서열에 혼성화하는 서열을 포함하여 상기 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시킴)을 인코딩하는 반복을 포함하는, 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이;
(iii) 선택적 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열;
(iv) 시스템의 상기 성분은 숙주 세포 및 숙주 세포를 형질 전환시키는 적어도 하나의 핵산 벡터 사이에서 분할됨에 따라, HM-crRNA는 Cas를 표적으로 안내하여 숙주 세포 내 표적 서열을 변형시키며;
여기서, 선택적으로, 성분 (i)은 숙주 세포에 내인성이다.
하나의 대안으로, HM-crRNA 및 tracrRNA는 단일 가이드 RNA (gRNA)로 구성된다.
내인성 Cas 핵산 분해 효소를 이용함으로써, 본 발명의 실시 형태는 내인성 Cas 뉴클레아제 활성(즉, 뉴클레아제 활성을 활성화 또는 증진시키기 위한 숙주 세포의 사전 유전적 변형을 필요로 하지 않음)을 사용한다. 따라서, 일례에서, Cas 뉴클레아제는 숙주 세포의 야생형 유전자에 의해 인코딩된다. 하나의 예에서, 뉴클레아제는 숙주 세포에서 내인성 Cas 뉴클레아제(또는 Cas 뉴클레아제 유전자) 억제자를 억제하지 않고 세포 사멸 또는 성장 억제를 달성하는데 활성을 갖는다. 이에 따라, 본 발명은 효과적인 Cas-매개 세포 사멸 또는 성장 감소를 가져오는데 사전 조작의 필요성 없이 야생형 박테리아 개체군을 처리할 수 있다. 따라서, 개체군이 야생형 환경(예: 수로 또는 인간 또는 동물 미생물군집으로 구성됨)에 있을 때 개체군은 cRNA에 노출될 수 있다.
하나의 예에서, 제2 박테리아는 박테로이데테스(Bacteroidetes, 예: 박테로이데스) 세포이다. 하나의 예에서, 제2 박테리아는 페르미쿠테스(Firmicutes) 세포이다. 상기 용도, 시스템 또는 방법은 예를 들어, 장내 미생물군 개체군(예를 들어, 생체 외 또는 생체 내)의 비를 변경하는데 사용되며, 이는 예를 들면, 증가된 신체 질량 또는 비만을 치료 또는 예방하기 위한 것이다(여기서, 예를 들어, 제2 박테리아는 페르미쿠테스 세포이다).
하나의 예에서, 용도, 방법, 시스템, 벡터, 조작된 뉴클레오타이드 서열, cRNA 또는 gRNA는 혼합된 개체군을 포함하는 인간 또는 인간이 아닌 동물의 미생물군을 치료학적으로 또는 예방학적으로 재균형, 예를 들면, 비만, 당뇨병 IBD, 위장관 상태 또는 구강 상태를 치료 또는 예방하기 위한 것이다.
하나의 예에서, 본 명세서에 언급된 미생물군은 인간 또는 동물 미생물군집(예: 장내, 질, 두피, 겨드랑이, 피부 혈류, 인후 또는 구강 내 미생물)의 미생물군이다.
하나의 예에서, 본 명세서에서 언급된 미생물군은 겨드랑이 미생물군이며, 용도, 방법, 시스템, 벡터, 조작된 뉴클레오타이드 서열, cRNA 또는 gRNA는 인간의 신체 냄새를 예방 또는 감소시키기 위한 것이다.
하나의 예에서, 숙주 세포 개체군 또는 혼합된 개체군은 인간 소비를 위한 음료 또는 물(예: 수로 또는 식수)에 보유된다.
하나의 예에서, 용도, 방법, 시스템, 벡터, 조작된 뉴클레오타이드 서열, cRNA 또는 gRNA는 인간 또는 동물의 비만 또는 질병을 치료 또는 예방하기 위해 병원성 감염을 감소시키거나 장내 또는 구강 내 미생물군을 재균형시키기 위한 것이다. 예를 들어, 용도, 방법, 시스템, 벡터, 조작된 뉴클레오타이드 서열, cRNA 또는 gRNA는 장내 미생물군에서 클로스트리디움 디피실(Clostridium dificile) 박테리아를 녹다운하기 위한 것이다.
하나의 예에서, 제1 박테리아는 박테로이데스 박테리아이며 제2 박테리아는 페르미쿠테스 또는 병원성 박테리아, 예를 들어 장내 박테리아이다. 하나의 예에서, 숙주 세포 또는 제 2 박테리아는 스트렙토코커스(예: 서모필러스 및/또는 피오게네스), 바실러스, 락토바실러스, 리스테리아, 클로스트리디움, 헬리오박테리움, 스타필로코커스 세포로부터 선택된 페르미쿠테스 세포이다. 하나의 예에서, 혼합된 개체군은 박테로이데스 및 메트로니다졸 (MTZ) 내성 C 디피실 균주 630 하위 개체군을 포함하며, 숙주 세포는 상기 C 디피실 세포를 포함한다.
하나의 예에서, 숙주 세포 개체군, 혼합된 개체군 또는 시스템은 장내 또는 구강 내 미생물군을 거주시키고 재균형시키기 위해 인간 또는 인간이 아닌 동물에게 투여하기 위한 조성물(예: 음료, 구강 세정제 또는 식품)에 포함된다.
하나의 예에서, 용도 또는 방법의 제품, 시스템, 벡터, 조작된 뉴클레오타이드 서열, cRNA, 또는 gRNA는 점막, 장내, 경구, 비강 내, 직장 내, 질내, 안구 또는 구강 투여에 의한 인간 또는 인간이 아닌 동물로의 투여를 위한 것이다.
본 명세서의 임의의 구성의 예에서, 혼합된 개체군(어레이, gRNA, crRNA 또는 조작된 서열과 결합하기 전에)은 인간 또는 동물 대상체의 미생물군, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 장내 또는 임의의 다른 미생물군 또는 본 명세서에 개시된 임의의 미생물군집의 미생물군의 시료이다. 하나의 예에서, 이 경우, 본 발명의 용도의 제품은 본 명세서에 개시된 바와 같은 인간 또는 동물 대상체의 처리 또는 치료에 유용한 변형된 미생물군 개체군이다.
3. 제2 컨셉에 있어서, 벡터 또는 벡터들은 Cas (예: Cas9) 뉴클레아제-인코딩 서열이 결핍되어 있는, 시스템.
4. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 각각의 숙주 세포는 인간 미생물에서 발견되는 균주 또는 종이며, 선택적으로는, 숙주 세포가 상이한 균주 또는 종의 세포와 혼합되고, 다른 세포는 장내 세균 또는 인간과 프로바이오틱, 공생, 또는 생리공생인 박테리아(예, 인간의 장내에서)인, 용도, 방법 또는 시스템. 하나의 예에서, 숙주 세포는 페르미쿠테스, 예를 들면, 스트렙토코커스 세포이다.
5. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 혼합된 박테리아 개체군 (예: 인간 미생물군과 같은 인간)에서 박테로이데테스 (예: 박테로이데스) 박테리아의 비율을 변경하기 위한 용도, 방법 또는 시스템.
6. 제5 컨셉에 있어서, 박테로이데테스 대 페르미쿠테스의 상대적 비를 높이기 위한 용도, 방법 또는 시스템.
7. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, Cas 뉴클레아제는 세포의 내인성 유형 II CRISPR/Cas 시스템에 의해 제공되는, 용도, 방법 또는 시스템.
8. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 성분 (iii)이 숙주 세포에 내인성인, 용도, 방법 또는 시스템.
9. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 표적 서열은 숙주 세포의 항생제 내성 유전자, 독성 유전자 또는 필수 유전자로 구성되는, 용도, 방법 또는 시스템.
10. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 어레이는 항생 조성물에 포함되며, 상기 어레이는 항생제와 조합되는, 용도, 방법 또는 시스템.
11. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 대안적으로 HM-crRNA 및 tracrRNA가 벡터에 의해 제공되는 단일 가이드 RNA (gRNA)로 구성되는, 용도, 방법 또는 시스템.
12. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 숙주 세포는 관심있는 HM-서열을 인코딩하는 자유 말단(HM-DNA)을 갖는 디옥시리보 핵산 가닥을 포함하고/하거나 시스템은 상기 HM-DNA를 인코딩하는 서열을 포함하고, HM-DNA는 HM-DNA를 숙주 게놈 내(예를 들어, 염색체 또는 에피솜 부위 내)에 삽입하기 위해 표적 서열 내의 또는 측면에 위치한 서열 또는 서열들과 각각 상동인 서열 또는 서열들을 포함하는, 용도, 방법 또는 시스템.
13. 내인성 CRISPR/Cas 시스템을 포함하는 박테리아 숙주 세포를 변형하기 위한 조작된 핵산 벡터로서, 벡터는
(a) 임의의 앞서 기술된 컨셉에 따른 CRISPR/Cas 시스템, 방법 또는 용도에서 사용하기 위한 다수의 상이한 crRNA(예를 들어, gRNA)를 발현하기 위한 핵산 서열을 포함하며;
(b) 선택적으로 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열이 결핍되어 있으며, 제1의 상기 crRNA는 상기 숙주 세포에서 제1핵산 서열에 혼성화될 수 있고; 제2의 상기 crRNA는 상기 숙주 세포에서 제2 핵산 서열에 혼성화 될 수 있고, 제2 서열은 제1 서열과 상이하며;
(c) 제1 서열은 항생제 내성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되고, 제2 서열은 항생제 내성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되며; 선택적으로 이들 유전자는 상이하며;
(d) 제1 서열은 항생제 내성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되며, 제2 서열은 필수 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되며;
(e) 제1 서열은 필수 유전자(또는 이의 RNA)로 구성되며, 제2 서열은 필수 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되거나; 또는
(f) 제1 서열은 독성 유전자(또는 이의 RNA)로 구성되며, 제2 서열은 필수 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성된다.
14. 개념 13에 있어서, 벡터에 의해 인코딩되는 cRNA (예를 들어, 단일 가이드 RNA)로 작동가능한 하나 이상의 Cas를 포함하는 숙주 세포 내에서의 벡터.
15. HM-CRISPR 어레이가 동일한 스페이서의 다중 카피를 포함하는 임의의 앞서 기술된 컨셉의 용도, 방법, 시스템 또는 벡터.
16. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 벡터(들)는 다수의 HM-CRISPR 어레이를 포함하는, 용도, 방법, 시스템 또는 벡터.
17. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 각각의 벡터가 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드 또는 프로파지인 용도, 방법, 시스템 또는 벡터.
18. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 시스템 또는 벡터가 crRNA(예를 들어, gRNA)를 인코딩하는 핵산 서열의 2 개, 3 개 이상의 카피를 포함하고, 카피는 숙주 세포 서열(예를 들어, 독성, 내성 또는 필수 유전자 서열)을 표적화하기 위한 동일한 스페이서 서열을 포함하는, 용도, 방법, 시스템 또는 벡터.
19. 제18 컨셉에 있어서, 카피는 2 개 이상의 벡터 CRISPR 어레이 사이에서 분할되는, 용도, 방법, 시스템 또는 벡터.
20. 임의의 앞서 기술된 컨셉에서 언급된 시스템 또는 벡터를 포함하는 박테리아 숙주 세포.
21. 제2 내지 제20 컨셉 중 하나에 있어서, 항생제(예: 베타-락탐 항생제)와 조합하는 시스템, 벡터 또는 세포.
22. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 상기 또는 각각의 숙주 세포가 스타필로코커스, 스트렙토코커스, 슈도모나스, 살모넬라, 리스테리아, 대장균, 데설포비브리오 또는 클로스트리디움 숙주 세포인, 용도, 방법, 시스템, 벡터 또는 세포. 하나의 예에서, 상기 또는 각각의 숙주 세포는 페르미쿠테스 세포, 예를 들어, 스타필로코커스, 스트렙토코커스, 리스테리아 또는 클로스트리디움 세포이다.
하나의 예에서, 각각의 CRISPR 어레이는 숙주 세포에서 각각의 crRNA (예를 들어, 단일 가이드 RNA로 구성됨)의 발현 및 생산을 위한 서열 R1-S1-R1'을 포함하고, (i) R1은 제1 CRISPR 반복이고, R1'은 제2 CRISPR 반복이고, R1 또는 R1'는 선택적이며; (ii) S1은 상기 표적 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 CRISPR 스페이서이다.
하나의 예에서, R1 및 R1'은 제2 숙주 세포 종의 CRISPR 어레이의 제1 및 제2 반복 서열과 각각 적어도 95% 동일하다. 하나의 예에서, R1 및 R1'이 상기 종, 예를 들면, 상기 종의 상기 숙주 세포의 CRISPR 어레이의 제1 (5'-최다) 및 제 2 (제1 반복의 3' 가까이에 위치한 반복) 반복 서열에 각각 적어도 95% (예: 96, 97, 98, 99 또는 100%) 동일하다. 하나의 예에서, R1 및 R1 '은 상기 숙주 세포에서 표적을 변형시키기 위해 유형 II Cas9 뉴클레아제 (예를 들어, S. 서모필러스, S. 피오게네스 또는 S. 아우레우스 Cas9)와 기능적이다.
본 발명의 대안적 개념 1 용도는 수행된 실험 예에 의해 입증된 바와 같이 다음을 제공한다:
개체군의 성장을 억제하기 위해 박테리아 숙주 세포 개체군의 야생형 내인성 Cas 뉴클레아제 활성의 용도로서, 각각의 숙주 세포는 야생형 Cas 뉴클레아제 활성을 갖는 내인성 CRISPR/Cas 시스템을 가지며, 상기 용도는 개체군의 숙주 세포를 형질 전환시킴을 포함하고, 각각의 형질전환된 숙주 세포는 숙주 세포에서 숙주 변형 (HM) cRNA 또는 가이드 RNA (gRNA)를 제공하기 위한 조작된 뉴클레오타이드 서열로 형질 전환되고, HM-cRNA 또는 gRNA는 내인성 Cas를 표적에 안내하기 위해 숙주 세포 표적 프로토스페이서 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함하고, cRNA 또는 gRNA는 야생형 뉴클레아제 활성을 갖는 숙주 세포의 내인성 Cas 뉴클레아제와 동족이고 숙주 세포의 형질 전환 후에 개체군의 성장이 억제된다.
하기 수행된 실시예에서, 고체 표면상의 박테리아 개체군 (그람 양성 페르미쿠테스)에서 억제를 다루었다. 10 배를 초과하는 숙주 세포 개체군 성장의 억제가 달성되었다. 표적화는 항생제 내성 유전자와 필수 유전자에 관한 것이다. 본 발명은 표적 서열이 항생제 내성 유전자의 서열인 항생제 내성 박테리아의 성장을 억제하는데 유용할 것이다. 하나의 예에서, 조작된 뉴클레오타이드 서열을 항생제와 함께 투여하는 것이 효과적일 수 있다. 이는 인간 또는 동물 대상체에서의 숙주 세포 감염의 보다 완전한 치료 또는 예방을 제공하고/하거나 인간 또는 동물에 투여하기 위한 치료학적으로 효과적인 항생제 투여량의 감소를 가능하게 할 수 있다. 이는 항생제의 과다 투여 및 인간 및 동물 개체군의 내성 발달에 대해 우려가 증가한다는 점에서 유용하다.
표면 상의 숙주 세포 성장을 억제하는 본 발명의 능력의 입증은 본 발명이 인간 또는 동물 대상체에서 본 명세서에 개시된 바와 같이 미생물군에 의해 매개되거나 유발되는 질병 또는 증상을 치료 또는 예방하는 실시형태에서 중요하고 바람직하다. 이러한 미생물군은 전형적으로 대상체의 조직(예, 장내, 구강, 폐, 겨드랑이, 안구, 질, 항문, 귀, 코 또는 목 조직)과 접촉하므로, 본 발명의 발명자들은 표면 상의 미생물군 박테리아 종(스트렙토코커스로 예시됨)의 성장을 억제하는 활성을 입증하는 것이 이러한 유용성을 지지하는 것으로 믿고 있다.
하나의 예에서, 야생형 숙주 세포 내인성 Cas9 또는 cfp1 활성이 사용된다. 조작된 뉴클레오타이드 서열은 외인성 Cas 뉴클레아제- 인코딩 서열과 조합되어 있지 않을 수 있다.
하나의 예에서, 숙주 세포는 야생형 (예: 비-조작된) 박테리아 세포이다. 또 다른 예에서, 숙주 세포는 조작(예를 들어, 외인성 뉴클레오타이드 서열을 도입하거나 숙주 세포의 염색체 또는 플라스미드에 대한 내인성 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는 등)되고, 숙주 세포는 crRNA 또는 gRNA로 작동 가능한 야생형 Cas 뉴클레아제 활성을 갖는 내인성 CRISPR/Cas 시스템을 포함한다. 하나의 예에서, 숙주 세포의 박테리아 콜로니의 형성은 형질전환 후에 억제된다. 하나의 예에서, 형질전환 후에 숙주 세포의 증식이 억제된다. 하나의 예에서, 숙주 세포는 형질 전환 후에 사멸된다.
"동족화 (cognate to)"는 내인성 Cas가 숙주 세포에서 표적으로 안내되도록 crRNA 또는 gRNA 서열로 조작 가능하도록 의도된다. 숙련가는 이러한 Cas 안내가 일반적으로 내인성 활성 야생형 CRISPR/Cas 시스템을 갖는 박테리아 세포에서 야생형 CRISPR/Cas 활성과 같은 박테리아 세포에서의 CRISPR/Cas 활성의 특징임을 이해할 것이다.
숙련가에게 명백한 바와 같이, "야생형" Cas 활성은, 내인성 Cas가 조작된 Cas가 아니거나 세포가 내인성 Cas 활성의 발현을 활성화하도록 조작되지 않은 것으로 의도된다. 이는 Cas 뉴클레아제 활성이 자연적으로 억제되는 특정 박테리아와 대조적이다 (즉, 야생형 Cas 뉴클레아제 활성이 없거나 또는 본 발명에 유용한 것이 없으며, 반대로 예를 들어, 내인성 Cas 활성이 세포 개체군 성장 억제에 영향을 미칠 수 있는 현장에서 야생형 숙주 세포를 처리하는데 적용 가능하다).
하나의 예에서, 숙주 세포 개체군 성장의 억제는 조작된 뉴클레오타이드 서열에 노출되지 않은 숙주 세포의 성장과 비교하여 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배이다. 예를 들어, 성장 억제는 숙주 세포 (단독 또는 혼합된 박테리아 개체군 내)의 제2 시료의 콜로니 수와 비교하여 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 배 정도 낮은 숙주 세포(단독 또는 혼합된 박테리아 개체군 내)의 제1 시료의 박테리아 콜로니 수에 의해 표시되고, 제1 세포는 상기 조작된 뉴클레오타이드 서열에 의해 형질 전환되었지만 제2 시료는 상기 조작된 뉴클레오타이드 서열에 노출되지 않았다. 하나의 실시 형태에서, 제1 시료가 조작된 서열에 노출된 후 12, 24, 36 또는 48 시간에 콜로니 수를 결정한다. 하나의 실시형태에서, 콜로니는 시험관내 (예를 들어, 배양 접시에서)의 고형 배지에서 성장시킨다. 이에 따라, 성장 억제는 표적 서열을 포함하는 세포 또는 개체군의 성장에서의 감소(무 처리에 비해 100 % 미만의 성장, 즉 대조군 시료의 성장)로 나타낼 수 있거나, 이러한 성장의 완전한 제거일 수 있다. 하나의 예에서, 숙주 세포 개체군의 성장은 미리 결정된 기간 (예를 들어, 숙주 세포 내의 cRNA 또는 gRNA와의 조합 후 24 시간 또는 48 시간)에 걸쳐, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95% 만큼 감소하고, 숙주 세포 개체군의 성장은 cRNA 또는 gRNA에 노출되지 않은 대조군 숙주 세포 개체군의 성장보다 적어도 이러한 비율로 낮지만, 그렇지 않은 경우 상기 미리 결정된 기간 동안 동일한 조건으로 유지된다. 하나의 예에서, 성장의 감소율은 상기 기간 마지막에 (예를 들어, 대조군 시료의 중간 지수 성장 단계의 시간에서) 각 개체군의 시료에서의 콜로니 수를 비교함으로써 결정된다. 예를 들어, 시험 개체군을 crRNA 또는 gRNA에 0 시간에 노출시킨 후, 시험 및 대조 개체군의 시료를 취하고 각 시료를 배지 플레이트 상에 도말하고 미리 결정된 기간 동안 동일한 조건하에 항온 처리한다. 이 기간의 마지막에, 각 시료의 콜로니 수를 계수하여 백분율 차이(즉, 시험 콜로니 수를 대조군 콜로니 수로 나누고 100을 곱한 다음 그 결과를 100에서 제하여 성장 감소율을 구한다)를 계산한다. 배수 차이는 대조군 콜로니 수를 시험 콜로니 수로 나눔으로써 계산된다.
이에 따라, 개체군 증가의 억제는 개체군 내 숙주 세포 수의 증식 감소로 나타낼 수 있다. 이는 뉴클레아제 및/또는 표적 프로토스페이서 서열상의 뉴클레아제의 작용에 의한 숙주 세포 증식(분열 및/또는 세포 성장)의 하향 조절에 의한 세포 사멸에 기인할 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 치료 또는 예방의 하나의 실시형태에서, 인간 또는 동물 대상체의 숙주 세포 부담이 감소됨에 따라, 질병 또는 상태가 치료 (예: 감소 또는 제거) 또는 예방, 즉, 질병 또는 상태를 발현하는 대상체의 위험이 감소되거나 제거된다.
본 발명은 환경에서 자연적으로 발견되는 (예를 들어, 물 또는 수로, 냉각 또는 가열 장비), 음료 및 식품(또는 이들을 제조, 가공 또는 저장하기 위한 장비)에 포함된 야생형 박테리아 개체군, 또는 인간 또는 동물 미생물군에 포함된 야생형 박테리아 개체군을 표적화하는데 유용하다. 따라서, 본 발명은 숙주 세포의 사멸 또는 성장 억제하도록 숙주 세포의 예비-변형이 가능하지 않거나 바람직하지 않은 경우 (예를 들어, 대상체의 장내 또는 다른 위치에서 미생물군의 원위치에서의 치료가 바람직한 경우)의 상황에서 유용성을 발견한다. 다른 예에서, 본 발명은 숙주 세포에 의해 유발되거나 매개되는 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위해 인간 또는 동물 대상체에게 투여하기 위한 약제를 생체 외에서 생산하는 유용성을 발견하고, 상기 약제는 본 발명의 용도 또는 방법의 제품인 변형된 혼합된 박테리아 개체군(예를 들어, 하나 이상의 인간 공여자의 배변 또는 장내 미생물군으로부터 수득됨)을 포함하며, 개체군은 숙주 세포의 종 또는 균주와 상이한 종 또는 균주의 박테리아의 하위 개체군을 포함한다. 전자인 하위 개체군 세포는 표적을 포함하지 않으므로 용도 또는 방법에 의해 변형되지 않는다. 따라서, 예를 들어, 방법은 혼합된 개체군에서 특정 페르미쿠테스 하위 개체군을 감소하고 박테로이데테스를 아끼기 위해, 예를 들어, 본원에 개시된 대사성 또는 위장관 증상 또는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명은 인간 또는 동물에서의 이러한 용도 또는 상기 치료 또는 예방을 위한 변형된 박테리아 이식(예: 변형된 대변 이식) 약제를 제공할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법을 사용하여 생체 외에서 하나 이상의 미생물군을 변형하여 의료용 (예를 들어, 대사성 질환(예를 들어, 비만 또는 당뇨병) 또는 위장관 증상 (예: 본원에서 언급한 임의의 모든 상태) 또는 암(예: 위장관 암)의 치료 또는 예방용) 또는 화장용 또는 개인 위생용(예: 인간의 겨드랑이 또는 인간의 다른 관련 위치에 국소 도포하여 겨드랑이 또는 기타 신체 냄새를 줄이기 위한, 인간의 국소적 사용)으로 인간 또는 동물에 투여하기 위한 박테리아의 변형된 무리를 생산할 수 있다. 다른 예에서, 어레이, crRNA, gRNA 또는 조작된 뉴클레오타이드 서열은 인간 또는 동물에 투여되고, 숙주 세포는 예를 들면, 인간 또는 동물의 미생물군 (예를 들어, 장내 미생물군 또는 본 명세서에 개시된 임의의 다른 유형의 미생물군)에 포함된 인간 또는 동물에 보유된다. 이러한 방식으로, 숙주 세포에 의해 매개되거나 유발되는 질환 또는 상태가 치료되거나 예방될 수 있다. 하나의 예에서, 형질 전환은 시험관 내에서 수행되고, 선택적으로 어레이, crRNA, gRNA 또는 조작된 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포 내로 전기천공된 핵산에 의해 포함된다. 하나의 예에서, 핵산은 RNA(예: gRNA의 카피)이다. 다른 예에서, 핵산은 숙주 세포에서의 발현을 위한 crRNA 또는 gRNA를 인코딩하는 DNA이다.
따라서, 하나의 예에서, 본 발명은 대상체의 미생물군의 숙주 세포에 의해 매개되거나 유발된 질환 또는 상태를 치료하거나 예방하기 위해 인간 또는 동물 대상체의 미생물군에 의해 포함된 야생형 박테리아 숙주 세포 개체군에서 숙주 세포 변형 (HM) cRNA 또는 가이드 RNA (gRNA)를 제공하기 위한 조작된 뉴클레오타이드 서열을 제공하고, cRNA 또는 gRNA는 Cas를 표적에 안내하기 위한 숙주 세포 표적 프로토스페이서 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함하고, cRNA 또는 gRNA는 야생형 뉴클레아제 활성을 갖는 내인성 숙주 세포 Cas 뉴클레아제와 동족이며, 숙주 세포의 형질전환 이후 개체군의 성장이 억제되고 질병 또는 상태가 치료되거나 예방된다.
하나의 예에서, 조작된 뉴클레오타이드 서열은 본 명세서에서 정의된 HM-CRISPR 어레이를 포함한다. 하나의 예에서, 조작된 뉴클레오타이드 서열은 단일 가이드 RNA를 인코딩한다. 하나의 예에서, 조작된 뉴클레오타이드 서열은 가이드 RNA (예: 단일 가이드 RNA) 또는 crRNA이다. 하나의 예에서, 조작된 서열은 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 박테리오파지에 포함되며, 형질 전환은 박테리오파지에 의한 숙주 세포의 형질 도입을 포함한다. 박테리오파지는 본 명세서에 기재된 바와 같은 박테리오파지일 수 있다. 하나의 예에서, 조작된 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포를 형질 전환시킬 수 있는 플라스미드(예를 들어, 접합 플라스미드)에 포함된다. 플라스미드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 플라스미드일 수 있다. 하나의 예에서, 조작된 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포 내로 및/또는 숙주 세포간에 전달될 수 있는 트랜스포존에 포함된다. 트랜스포존은 본 명세서에 기재된 바와 같은 트랜스포존일 수 있다.
본 발명의 임의의 용도 또는 방법은 세포에서 cRNA 또는 gRNA를 생산하기 위한 핵산 벡터로 숙주 세포를 형질 전환함을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조작된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터 또는 핵산은, 경구, 정맥 내, 국소, 안구 내, 비강 내, 흡입에 의해, 직장 투여에 의해, 귀에서 투여되거나, 질 투여 또는 본 명세서에 개시된 임의의 다른 투여 경로로 투여 또는 그렇지 않은 경우 혼합된 박테리아 개체군을 포함하는 인간 또는 동물(예를 들어, 인간 또는 동물의 미생물군의 일부로서)에 투여되고, 이때 벡터 또는 핵산을 투여하여 숙주 세포를 형질 전환시킨다.
하나의 예에서, 숙주 세포 개체군은 생체 외이다. 하나의 예에서, 혼합된 개체군은 인간 또는 동물 대상체에 포함되고 대상체에서의 숙주 세포 감염은 치료 또는 예방된다.
하나의 예에서, 제1 및 제2 박테리아는 박테리아가 생리공생적으로 살고있는 미생물 컨소시엄에 포함된다. 하나의 예에서, 컨소시엄은 인간 또는 동물 미생물군이고; 하나의 예에서, 컨소시엄은 인간 또는 동물(예를 들어, 용도, 시스템, 조작된 서열, 벡터 또는 세포가 인간 또는 동물에서 컨소시엄의 숙주 세포에 의한 감염을 치료하기 위한 것으로, 예를 들면, 숙주 세포는 인간 또는 동물에서 항생제 내성 또는 해로운 질병 또는 상태를 매개하거나 유발함)에 포함된다. 아래의 실시된 예에서 사용된 종(대장균, L. 락티스 및 S. 서모필러스)은 인간 및 동물 장내 미생물군에서 생리공생적으로 공존하는 균주이다. 이 예는 혼합된 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 개체군에서의 표적화를 또한 다루고 있다. 또한, 이 예는 인간 미생물에서 발견되는 페르미쿠테스(S. 서모필러스) 개체군 및 장내세균(대장균)의 개체군에 대해 다룬다. 장내세균의 다른 예는 살모넬라(Salmonella), 페스트균(Yersinia pestis), 클렙시엘라(Klebsiella), 시겔라(Shigella), 프로테우스(Proteus), 엔테로박터(Enterobacter), 세라티아(Serratia) 및 시트로박터(Citrobacter)이다.
하나의 예에서, 방법, 용도, 조작된 뉴클레오타이드 서열, 어레이, crRNA, gRNA, 벡터 또는 시스템은 인간 장내 미생물군 개체군에서 숙주 세포 감염을 치료하기 위한 것이며, 선택적으로 개체군은 또한 인간 공생 장내 박테리아 및/또는 장내세균인 제1 박테리아를 포함하고, 예를 들어, 숙주 세포 및 공생 세포(제1 및 제2 박테리아)는 인간 장내 미생물군에서 생리공생적으로 산다.
하나의 예에서, 용도 또는 시스템은 박테로이데테스 박테리아 및 다른 박테리아를 포함하는 혼합된 박테리아 개체군에서 박테로이데테스 박테리아의 비율을 변경하기 위한 것이다. 예를 들어, 개체군에서 박테로이데테스 대 하나 이상의 또는 모든 페르미쿠테스 (예: 스트렙토코커스)의 상대적 비를 증가시키기 위한 것이다. 이 경우, 숙주 세포는 표적(들)을 포함하는 페르미쿠테스 세포일 수 있다. 하나의 예에서, 개체군은 인간 또는 동물 대상체에 포함된 미생물군의 박테리아 개체군이고, 방법, 용도, 조작된 서열, 벡터, 또는 시스템은 (i) 포함된 (예를 들어, 혼합된 개체군에 포함됨) 숙주 세포에 의한 대상체에서 감염을 치료하고; (ii) 대상체에서 상기 숙주 세포에 의해 매개되는 상태 또는 질병을 치료 또는 예방하고; (iii) 상기 숙주 세포에 의해 유발되거나 매개되는 인간의 신체 냄새를 감소시키거나; 또는 (iv) 인간의 개인 위생 처리를 위한 것이다. 하나의 예에서, 본 발명의 조작된 뉴클레오타이드 서열, 어레이, crRNA, gRNA 또는 벡터는 본 발명의 시스템 또는 용도에서 사용하기 위한 것이다.
하나의 예에서, 상태 또는 질병은 대사성 또는 위장관 질환 또는 상태, 예를 들어, 비만, IBD, IBS, 크론 병 또는 궤양성 대장염이다. 하나의 예에서, 상태 또는 질병은 고형 종양 또는 위장관 암 (예: 위암), 간암 또는 췌장암과 같은 암이다. 하나의 예에서, 상기 조건은 항생제(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 항생제)에 대한 내성 또는 감소된 반응성이다.
하나의 예에서, 세포는 세포에서 상기 HM-crRNA의 생산에서 성분 (ii)와 작동가능한 내인성 RNase 를 포함한다. 하나의 대안에서, 하나 이상의 벡터는 숙주 세포에서 RNase 의 발현을위한 이러한 RNase 를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 필수 유전자 (표적을 포함함)는 세포의 DNA 중합 효소를 인코딩한다. 이는 아래에 예시된다.
용도, 시스템, 벡터 또는 세포의 예에서, 어레이, cRNA 또는 gRNA는 NGG, NAG, NGA, NGC, NGGNG, NNGRRT or NNAGAAW 프로토스페이서 인접 모티브(PAM)에 인접한 숙주 세포 표적 프로토스페이서 서열에 혼성화될 수 있는 서열, 예를 들어, AAAGAAA 또는 TAAGAAA PAM (이들 서열은 5'에서 3' 방향으로 기재됨)을 포함한다. 하나의 예에서, PAM은 프로토스페이서 서열의 3' 말단 가까이에 인접한다. 하나의 예에서, Cas는 S. 아우레우스, S. 서모필러스 또는 S. 피오게네스 Cas이다. 하나의 예에서, Cas는 Cpf1이고/이거나 PAM은 TTN 또는 CTA이다.
하나의 예에서, 조작된 뉴클레오타이드 서열, crRNA, gRNA 또는 어레이는 항생제와 조합되며, 예를 들어, 표적은 항생제 내성 유전자에 포함되고 항생제는 상기 제제이다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포는 항생제에 민감하다. 예를 들어, 숙주 세포의 존재의 감염을 근절시키기 위해 항생제를 사용하는 감도가 충분하지 않을 수 있지만(예: 인간 또는 개체군을 포함하는 제조 선박/장비에서), 항생제는 숙주 세포 하위 개체군 크기 또는 성장을 억제하거나 감소시키는 반면에, 사멸 또는 성장 억제는 본 발명에 따른 Cas 변형 (예: 표적 절단)을 사용하여 수행된다.
본 발명은 인간 또는 동물 대상체에서 상기 숙주 세포의 감염의 항생제 (제1 항생제) 치료 방법을위한 용도, 시스템, 어레이, crRNA, gRNA, 조작된 뉴클레오타이드 서열, 벡터 또는 세포를 제공하며, 항생제 내성 유전자(제1 항생제에 대한 내성을 위함)은 숙주 세포에서 시스템 또는 벡터에 의해 Cas-표적화되며, 방법은 시스템, 어레이, crRNA, gRNA, 조작된 뉴클레오타이드 서열, 벡터 또는 세포 및 항생제를 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 유전자가 하향 조절되고, 즉, 유전자에 의해 인코딩된 단백질 제품의 발현이 숙주 세포에서 감소되거나 제거되어 항생제 내성이 하향 조절된다. 감염은 대상체에서 감소되거나 예방된다. 하나의 예에서, 항생제는 시스템, 어레이, crRNA, gRNA, 조작된 뉴클레오타이드 서열, 벡터 또는 세포와 동시에 투여되고; 다른 예에서, 투여는 순차적(예를 들어, 시스템, 어레이, crRNA, gRNA, 조작된 뉴클레오타이드 서열, 벡터 또는 세포 이전에 항생제 투여)이다. 본 발명의 이러한 특징은 예를 들어, 항생제 단독으로 이러한 숙주 세포 감염을 치료하는데 충분히 효과적이지 않은 경우, 대상체에서 항생제 치료를 강화 시키는데 유용할 수 있다. 항생제는 본원에 개시된 임의의 항생제, 예를 들어, 테트라사이클린일 수 있다.
하나의 예에서, 각각의 조작된 뉴클레오타이드 서열 또는 벡터는 상기 CRISPR 어레이 또는 상기 crRNA 또는 gRNA를 코딩하는 서열을 포함하고, 항생제 내성 유전자 (예: 카나마이신 내성)를 추가로 포함하며, HM-crRNA 또는 gRNA는 항생제 내성 유전자를 표적하지 않는다. 하나의 예에서, 표적 서열은 숙주 세포의 항생제 내성 유전자에 의해 포함되며, 항생제는 제1 항생제(예: 카나마이신)와 상이하다. 이러한 방식으로, 시스템, 조작된 서열 또는 벡터는 스스로 표적화하지 않고 숙주를 표적화할 수 있다. 숙주 세포를 제1 항생제에 노출시킴으로써, 제1 항생제 내성 유전자를 함유하는 세포가 제1 항생제의 존재 하에서 생존 이점을 갖기 때문에(조작된 서열 또는 벡터에 의해 형질 전환되지 않은 숙주 세포가 제1 항생제에 내성을 갖지 않은 경우) 양성 선별 압력에 의해 조작된 서열 또는 벡터의 보유를 촉진시킬 수 있다. 따라서, 하나의 예는 숙주 세포에서 cRNA 또는 gRNA-인코딩 서열의 유지를 촉진시키기 위해 숙주 세포 또는 혼합된 개체군을 상기 항생제(예: 카나마이신) 및 상기 조작된 서열 또는 벡터(들)에 노출시키는 것을 포함하는 본 발명의 용도를 제공하거나; 또는 본 발명의 시스템, 조작된 서열, 어레이 또는 벡터는 상기 항생제와 조합된다.
하나의 예에서, cRNA 또는 gRNA 또는 성분 (ii)를 인코딩하는 서열은 숙주 세포 종에서 작동 가능한 구성형 프로모터(예: 강력한 프로모터) 또는 구성적 프로모터 하에 존재한다. 하나의 예에서, 성분 (iii)은 숙주 세포 종에서 작동가능한 구성형 프로모터 또는 유도성 프로모터 하에 존재한다.
하나의 예에서, 상기 또는 각각의 숙주 세포는 그람 양성 세포이다. 다른 예에서, 상기 또는 각각의 숙주 세포는 그람 양성 세포이다.
하나의 예에서, 방법, 용도, 시스템, 조작된 서열 또는 벡터는 인간 장내 미생물군 개체군에서 숙주 세포 감염을 치료하기 위한 것이며, 선택적으로 개체군은 인간 공생 장내 박테리아(즉, 인간과 공생하는 장내 박테리아)를 포함한다.
방법, 용도, 시스템, 어레이, crRNA, gRNA, 조작된 서열 또는 벡터의 예에서, 숙주 세포는 인간 또는 동물 대상체에 포함된 혼합된 박테리아 개체군으로 구성되고, 방법, 용도, 시스템, 어레이, crRNA, gRNA, 조작된 서열 또는 벡터는 (i) 혼합된 개체군에 포함된 숙주 세포에 의한 대상체에서 감염을 치료하고; (ii) 대상체에서 상기 숙주 세포에 의해 매개되는 상태 또는 질병을 치료 또는 예방하고; (iii) 상기 숙주 세포에 의해 유발되거나 매개되는 인간의 신체 냄새를 감소시키거나; 또는 (iv) 인간의 개인 위생 처리를 위한 것이다.
하나의 예에서, 방법, 용도, 시스템, 어레이, crRNA, gRNA, 조작된 서열 또는 벡터는 산업용 또는 의학용 유체, 고체 표면, 장치 또는 컨테이너(예: 식품, 소비재, 화장품, 개인용 의료 제품, 석유 또는 석유 생산)를 생체 외 처리하거나; 수로, 물, 음료, 식품 또는 화장품을 처리하기 위한 것으로, 숙주 세포는 유체, 표면, 장치, 컨테이너, 수로, 물, 음료, 식품 또는 화장품으로 구성되거나 이에 포함된다.
본 발명은 또한, 본 명세서의 임의의 컨셉의 용도 또는 방법에 의해 수득가능한 박테리아의 생체 외 혼합된 개체군을 제공한다.
하나의 예에서, 용도 또는 방법의 혼합된 개체군 또는 제품은 의학 용도 또는 영양학적 용도의 컨테이너에 담겨있다. 예를 들어, 컨테이너는 멸균된 컨테이너, 예를 들어 흡입기이거나 또는 주사기 또는 IV 바늘에 연결된다.
하나의 예에서, 용도 또는 방법의 제품 개체군은 인간 또는 동물에 투여하여 이의 미생물군집을 거주시키는데 유용하다.
본 발명은 상기 용도 또는 방법의 개체군 제품을 포함하는 인간 또는 인간이 아닌 동물 소비를 위한 식품 또는 음료를 제공한다.
본 명세서에서, 임의의 구성, 컨셉 또는 국면의 예에서, 박테로이데스는 카카에 (caccae), 카필로수스(capillosus), 셀룰로실리티쿠스(cellulosilyticus), 코프로콜라(coprocola), 코프로필러스(coprophilus), 코프로수이스(coprosuis), 디스타소니스(distasonis), 도레이(dorei), 에게르티(eggerthii), 파에시스(faecis), 파인골디(finegoldii), 플럭서스(fluxus), 프라질리스(fragalis) (예, 프라질리스NCTC 9343), 인테스티날리스(intestinalis), 멜라니노게니쿠스(melaninogenicus), 노르디(nordii), 올레이시플레누스(oleiciplenus), 오랄리스(oralis), 오바투스(ovatus), 펙티노필러스(pectinophilus), 플레베이우스(plebeius), 스테르코리스(stercoris), 테타이오타오마이크론(thetaiotaomicron), 우니포르미스(uniformis), 불가투스(vulgatus) 및 크실라니솔벤스(xylanisolvens)로부터 선택된 종이다. 예를 들어, 박테로이데스는 테타이오타오마이크론이며, 예를 들어 숙주 세포 또는 혼합된 개체군은 생체 외 또는 시험관내 장내 미생물 개체군이다. 하나의 예에서, 숙주 세포, 제1 또는 제2 박테리아 하위 개체군은 다수의 상이한 박테로이데테스 종, 또는 다수의 박테로이데스 종 (예를 들어, B 테타이오타오마이크론 및 B 프라질리스를 포함함), 또는 박테로이데스 및 프레보텔라 종을 포함한다. 본 명세서에서, 하나의 예에서, 프레보텔라(Prevotella)는 베르겐시스(bergensis), 비비아(bivia), 부카에(buccae), 부칼리스(buccalis), 코프리(copri), 멜라니노게니카(melaninogenica), 오리스(oris), 루미니콜라(ruminicola), 탄네래(tannerae), 티모넨시스(timonensis) 및 베로랄리스(veroralis)로부터 선택된 종이다. 하나의 대안에서, 숙주 세포, 제1 또는 제 2 박테리아는 페르미쿠테스 세포이다. 하나의 예에서, 숙주 세포, 제1 또는 제2 하위 개체군은 아나에로트런쿠스(Anaerotruncus), 아세탄에로박테리움(Acetanaerobacterium), 아세티토마쿨럼(Acetitomaculum), 아세티비브리오(Acetivibrio), 아나에로코커스(Anaerococcus), 아나에로필룸(Anaerofilum), 아나에로시누스(Anaerosinus), 아나에로스티페스(Anaerostipes), 아나에로보락스(Anaerovorax), 부티리비브리오(Butyrivibrio), 클로스트리디움(Clostridium), 카프라코커스(Capracoccus), 데할로박터(Dehalobacter), 디알리스터(Dialister), 도레아(Dorea), 엔테로코커스(Enterococcus), 에타놀리게넨스(Ethanoligenens), 패칼리박테리움(Faecalibacterium), 푸소박테리움(Fusobacterium), 그라실리박터(Gracilibacter), 구겐하이멜라(Guggenheimella), 헤스펠리아(Hespellia), 라크노박테리움(Lachnobacterium), 라크노스피라(Lachnospira), 락토바실러스(Lactobacillus), 루코노스톡(Leuconostoc), 메가모나스(Megamonas), 모리엘라(Moryella), 미츠오켈라(Mitsuokella), 오리박테리움(Oribacterium), 옥소박터(Oxobacter), 파필리박터(Papillibacter), 프로프리오니스피라(Proprionispira), 슈도부티리비브리오(Pseudobutyrivibrio), 슈도라미박터(Pseudoramibacter), 로즈부리아(Roseburia), 루미노코커스(Ruminococcus), 사르시나(Sarcina), 세이노넬라(Seinonella), 셔틀워디아(Shuttleworthia), 스포로박터(Sporobacter), 스포로박테리움(Sporobacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 섭돌리그라눌럼(Subdoligranulum), 신트로포코커스(Syntrophococcus), 서모바실러스(Thermobacillus), 투리박터(Turibacter) 및 바이셀라(Weisella)로부터 선택된 하나 이상의 페르미쿠테스를 포함하거나 또는 하나 이상의 페르미쿠테스로 구성된다. 하나의 예에서, 숙주 세포 또는 제1 또는 제2 하위 개체군은 클로스트리디움 세포(및 임의로 다른 하위 개체군은 박테로이데스 (예를 들어, 테타이오타오마이크론) 세포로 구성됨)로 구성된다. 하나의 예에서, 숙주 세포 또는 제1 또는 제2 하위 개체군은 엔테로코커스 세포(및 임의로 다른 하위 개체군은 박테로이데스 (예를 들어, 테타이오타오마이크론) 세포로 구성됨)로 구성된다. 하나의 예에서, 숙주 세포 또는 제1 또는 제2 하위 개체군은 루미노코커스 세포(및 임의로 다른 하위 개체군은 박테로이데스 (예를 들어, 테타이오타오마이크론) 세포로 구성됨)로 구성된다. 하나의 예에서, 숙주 세포 또는 제1 또는 제2 하위 개체군은 스트렙토코커스 세포(및 임의로 다른 하위 개체군은 박테로이데스 (예를 들어, 테타이오타오마이크론) 세포로 구성됨)로 구성된다. 하나의 예에서, 숙주 세포 또는 제1 또는 제2 하위 개체군은 패칼리박테리움 세포(및 임의로 다른 하위 개체군은 박테로이데스 (예를 들어, 테타이오타오마이크론) 세포로 구성됨)로 구성된다. 예를 들어, 패칼리박테리움은 패칼리박테리움 프라우스니치(Faecalibacterium prausnitzii) (예: A2-165, L2-6, M21/2 또는 SL3/3)이다.
하나의 예에서, 숙주 세포, 제1 또는 제2 하위 개체군은 아나에로트런쿠스(Anaerotruncus), 아세탄에로박테리움(Acetanaerobacterium), 아세티토마쿨럼(Acetitomaculum), 아세티비브리오(Acetivibrio), 아나에로코커스(Anaerococcus), 아나에로필룸(Anaerofilum), 아나에로시누스(Anaerosinus), 아나에로스티페스(Anaerostipes), 아나에로보락스(Anaerovorax), 부티리비브리오(Butyrivibrio), 클로스트리디움(Clostridium), 카프라코커스(Capracoccus), 데할로박터(Dehalobacter), 디알리스터(Dialister), 도레아(Dorea), 엔테로코커스(Enterococcus), 에타놀리게넨스(Ethanoligenens), 패칼리박테리움(Faecalibacterium), 푸소박테리움(Fusobacterium), 그라실리박터(Gracilibacter), 구겐하이멜라(Guggenheimella), 헤스펠리아(Hespellia), 라크노박테리움(Lachnobacterium), 라크노스피라(Lachnospira), 락토바실러스(Lactobacillus), 루코노스톡(Leuconostoc), 메가모나스(Megamonas), 모리엘라(Moryella), 미츠오켈라(Mitsuokella), 오리박테리움(Oribacterium), 옥소박터(Oxobacter), 파필리박터(Papillibacter), 프로프리오니스피라(Proprionispira), 슈도부티리비브리오(Pseudobutyrivibrio), 슈도라미박터(Pseudoramibacter), 로즈부리아(Roseburia), 루미노코커스(Ruminococcus), 사르시나(Sarcina), 세이노넬라(Seinonella), 셔틀워디아(Shuttleworthia), 스포로박터(Sporobacter), 스포로박테리움(Sporobacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 섭돌리그라눌럼(Subdoligranulum), 신트로포코커스(Syntrophococcus), 서모바실러스(Thermobacillus), 투리박터(Turibacter) 및 바이셀라(Weisella)로부터 선택된 하나 이상의 페르미쿠테스를 포함하거나 또는 하나 이상의 페르미쿠테스로 구성된다. 하나의 예에서, 숙주 세포 또는 제1 또는 제2 하위 개체군은 클로스트리디움(예: 디피실) 세포(및 임의로 다른 하위 개체군은 박테로이데스 (예를 들어, 테타이오타오마이크론) 세포로 구성됨)로 구성된다. 하나의 예에서, 숙주 세포 또는 제1 또는 제2 하위 개체군은 엔테로코커스 세포(및 임의로 다른 하위 개체군은 박테로이데스 (예를 들어, 테타이오타오마이크론) 세포로 구성됨)로 구성된다. 하나의 예에서, 숙주 세포 또는 제1 또는 제2 하위 개체군은 루미노코커스 세포(및 임의로 다른 하위 개체군은 박테로이데스 (예를 들어, 테타이오타오마이크론) 세포로 구성됨)로 구성된다. 하나의 예에서, 숙주 세포 또는 제1 또는 제2 하위 개체군은 스트렙토코커스 세포(및 임의로 다른 하위 개체군은 박테로이데스 (예를 들어, 테타이오타오마이크론) 및/또는 장내세균 (예를 들어, 대장균) 세포로 구성됨)로 구성된다. 하나의 예에서, 숙주 세포 또는 제1 또는 제2 하위 개체군은 패칼리박테리움 세포(및 임의로 다른 하위 개체군은 박테로이데스 (예를 들어, 테타이오타오마이크론) 세포로 구성됨)로 구성된다. 하나의 예에서, 숙주 세포 또는 제1 또는 제2 하위 개체군은 스트렙토코커스 세포(선택적으로, S. 서모필러스 및/또는 피오게네스 세포)로 구성되며, 다른 하위 개체군은 박테로이데스 (예를 들어, 테타이오타오마이크론) 및/또는 장내세균 (예를 들어, 대장균) 세포로 구성됨)로 구성된다.
본 발명의 용도 또는 방법의 개체군 제품은 하나의 실시형태에서 점막, 장내, 경구, 비강 내, 직장 내, 질내, 안구 또는 구강 투여에 의한 인간 또는 인간이 아닌 동물로의 투여를 위한 것이다.
선택적으로, 숙주 세포 또는 제1 또는 제2 하위 개체군 박테리아는 B 프라질리스 박테리아이며, 개체군은 물에 의해 보유된다.
본 발명의 어레이, 시스템, 조작된 서열, 벡터 또는 gRNA를 포함하는 적합한 음료는 프로바이오틱 음료, 예를 들어, 적응된 야쿠르트 (Yakult) 상표, 악티멜 (Actimel) (상표), 케비타(Kevita) (상표), 액티비아(Activia) (상표), 재로우(Jarrow) (상표) 또는 이와 유사한 인간 섭취용 음료수이다.
파지 서열 표적(PHAGE SEQUENCE TARGETS)
본 발명의 국면에서, 표적 서열은 숙주 박테리아 세포를 감염시키는 파지의 서열이다. 본 발명에 의해 달성되는 파지 게놈의 바람직한 변형은 파지 사멸 또는 녹-다운(knock-down)과 관련될 뿐만 아니라, 대신에 숙주 세포에서 바람직한 파지 유전자 또는 조절 요소 활성화 (예를 들어, 파지가 목적하는 단백질 또는 증가된 숙주 세포 생존력 또는 증식과 관련된 기타 제품을 발현하는 경우)일 수 있다. 대안적으로, 변형은 예를 들어, 본 발명에 따라 파지 표적 부위로 표적화되는 유도성 Cas의 사용에 의한 유도성 파지 유전자 발현 조절일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 본 발명은 숙주 세포에서 Cas 뉴클레아제로 절단함으로써 파지 표적 부위를 변형시키는 것을 제공한다. 이는 다음의 여러 가지 이유로 유용할 수 있으며, 예를 들면,
A. 표적 부위를 변이시켜 활성 또는 불활성(예를 들어, 유전자 녹-다운, 또는 항-숙주 유전자의 불활성화를 위함, 또는 파지 타겟이 숙주 염색체에 통합될 때 숙주 세포를 사멸시키기 위함)시키고;
B. 표적 서열을 포함하는 표적 서열 또는 더 큰 서열을 삭제(예를 들어, 본 발명이 파지 게놈에서 이격된 부위를 표적하는 제1 및 제2 PM-crRNA와 함께 사용되는 경우, 각 부위의 절단은 절단물 사이의 파지 핵산의 결실을 초래함)하고;
C. 목적하는 PM-DNA 서열을 숙주 세포 게놈에 (예를 들어, 바람직한 PM-DNA의 동종 재조합 삽입을 위해 숙주 핵산에서 하나 이상의 PM-crNA-안내된 절단물을 제공함으로써) 삽입하기 위한 이유이다.
본 발명은 다음 국면을 제공한다:
1. 상기 하위 개체군을 포함하는 혼합된 개체군 내 제1 및 제2 박테리아의 하위 개체군의 상대적 비를 변경하는 방법으로서, 제1 박테리아는 숙주 세포(예를 들어, 박테로이데테스 숙주 세포) (제1 박테리아는 선택적으로 파지에 의해 감염되고 제2 박테리아는 상기 파지에 의해 감염되지 않는다(또는 박테로이데테스가 아님))이고, 방법은 숙주 세포에 벡터 핵산(예: 이의 PM-함유 트랜스포존)을 도입하는 하나 이상의 도입 단계에서 혼합된 개체군과 다수의 벡터를 결합시키는 단계, 및 혼합된 개체군에서 박테리아가 성장을 하는 단계를 포함하고, 제1 및 제 2 박테리아의 상대적 비가 변경되고; 각각의 벡터는 세포에서 표적 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 상기 파지의)을 변형시키기 위해 숙주 세포 내로 도입하기 위한 조작된 파지-변형 (PM) CRISPR 어레이를 포함하고,
(a) PM-CRISPR 어레이는 각각 PM-crRNA의 발현을 위한 하나 이상의 서열 및 숙주 세포에서 서열(들)의 전사를 위한 프로모터를 포함하며;
(b) PM-crRNA는 표적 서열을 혼성화시킬 수 있어서 Cas(예를 들어, Cas 뉴클레아제)를 숙주 세포에 안내하여 표적 서열을 변형시킨다.
파지 생존력, 전파 또는 감염성에 필요한 유전자(들)를 불활성화시키기 위해 파지 서열(들)을 표적화함으로써, 하나의 국면에서, 본 발명은 파지로 감염된 숙주 세포에 의한 이의 흡수 및 보유를 촉진시킬 수 있는 양성 선택적 이점을 가진 어레이를 제공한다. 숙주 세포가 사멸되거나 성장이 감소하면, 개체군 내 제2 박테리아와 제2 박테리아의 상대적 비가 감소한다. 본 발명은 인간 또는 동물 대상체에서 질환 또는 상태의 치료 또는 예방(위험 감소)을 위한, 대상체에게 투여되는 약제로서 사용되는 이러한 제품 개체군을 제공한다. 질환 또는 상태는 본원에 개시된 임의의 질병 또는 상태일 수 있다. 하나의 예에서, 단일 가이드 RNA(gRNA)는 숙주 세포에서 발현되어 crRNA를 제공하고 각 벡터는 이러한 gRNA를 인코딩하는 발현가능한 조작된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
PM-어레이를 사용하는 예에서, 표적 서열은 박테로이데스 테타이오타오마이크론(Bacteroides thetaiotaomicron) 서열이다. 선택적으로, 표적 서열은 박테로이데스 프라질리스(B fragilis)에 포함되지 않는다. 예를 들어, 변형에 의해 표적 서열이 잘리지 않거나 또는 비-기능적인 경우 유용함으로써, 박테로이데스 테타이오타오마이크론 숙주 세포의 비가 박테로이데스 프라질리스를 표적화하지 않고 증가하고, 여기서 예를 들면, 혼합된 개체군은 본 명세서에 기술된 대로 장내 미생물군 개체군이다. 박테로이데스 프라질리스는 종기와 관련된 일부 환경에 놓여 있으며, 따라서 이 예는 종기 위험을 감소 시키며, 예를 들어 장내 미생물군을 재균형시키는데 유용한, 예를 들면, 비만 또는 당뇨병 또는 IBD를 치료 또는 예방하는데 유용한 본 발명에 따른 비의 변경(B 테타이오타오마이크론 세포 비율의 증가)을 가능하게 한다.
프로모터 (또는 HM- 또는 PM-어레이)는 숙주 세포에서 작동 가능하다. 하나의 예에서, 프로모터는 바이러스 또는 파지 프로모터, 예를 들어, T7 프로모터이다. 다른 예에서, 프로모터는 박테리아 프로모터 (예를 들어, 숙주 세포 종의 프로모터)이다.
2. 제1국면에 있어서, 제1 박테리아가 박테로이데스(예를 들어, 테타이오타오마이크론 또는 프라질리스), 알리스티페스(Alistipes), 알칼리플렉서스(Alkaliflexus), 파라박테로이데스(Parabacteroides), 탄네렐라(Tannerella), 자일라니박터(Xylanibacter) 및/또는 Prevotella(프레보텔라) 박테리아인, 방법.
3. 제1 국면 또는 제2 국면에 있어서, 제2 박테리아가 페르미쿠테스 박테리아(예를 들어 제1 박테리아는 박테로이데테스 또는 박테로이데스 인 경우)인, 방법.
4. 임의의 앞서 기술된 국면에 있어서, 제1 박테리아 하위 개체군 대 제2 박테리아 하위 기체군의 비는 증가하고, 즉, 비율이 상기 방법이 수행되기 전 보다 수행된 후 큰, 방법.
5. 제4 국면에 있어서, 혼합된 개체군은 장내 또는 구강 미생물군을 거주시키고 재균형시키기 위해 인간 또는 인간이 아닌 동물에게 투여하기 위한 조성물(예: 음료, 구강 세정제 또는 식품)에 포함되고, 예를 들면, 혼합된 개체군은 인간 또는 인간이 아닌 동물에서 시험관 내 또는 생체 내에 존재하는, 방법.
6. 제1, 제2, 또는 제3 국면에 있어서, 제1 박테리아 하위 개체군 대 제2 박테리아 하위 개체군의 비가 감소하고, 즉, 비가 상기 방법이 수행되기 전 보다 수행된 후 작은, 방법.
7. 제6 국면에 있어서, 혼합된 개체군은 인간 소비를 위한 음료 또는 물(예: 수로 또는 식수)에 의해 보유되는, 방법.
8. 임의의 앞서 기술된 국면에 있어서, 각각의 벡터가 플라스미드, 파지(예: 포장된 파지) 또는 파지미드인, 방법.
9. 제8 국면에 있어서, 각각의 벡터가 파지(예를 들어, 포장된 파지)이고, 벡터 핵산이 숙주 세포 내로 파지 벡터 핵산 도입에 의해, 즉 파지 벡터에 의한 숙주 세포의 감염에 의해 숙주 세포 내로 도입되는, 방법. 하나의 예에서, 파지는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 트랜스포존을 포함한다.
10. 제8 국면에 있어서, 각 벡터가 플라스미드이고, 벡터 핵산이 벡터를 보유하는 박테리아로부터의 형질 전환 또는 수평 플라스미드 이동에 의해 숙주 세포 내로 도입되는, 방법. 하나의 예에서, 플라스미드는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 트랜스포존을 포함한다. 하나의 예에서, 벡터를 보유하는 박테리아는 비-박테로이데테스 또는 비-박테로이데스 종이다.
부가적으로, 또는 대안적으로, 벡터를 보유하는 박테리아는 비-페르미쿠테스 종이다. 하나의 예에서, 벡터를 보유하는 박테리아는 락토바실러스 종(예: 액시도필러스(예: La-5, La-14 또는 NCFM), 브레비스(brevis), 불가리쿠스(bulgaricus), 플랜타룸(plantarum), 람모수스(rhammosus), 페르멘텀(fermentum), 카우카시쿠스(caucasicus), 헬베티쿠스(helveticus), 락티스(lactis), 루테리(reuteri) 또는 카세이(casei), 카세이 시로타(casei Shirota), 비피도박테리움 종 (예: 비피둠, 브레브, 롱굼 또는 인판티스), 스트렙토코커스 서모필러스 및 엔테로코커스 패시움으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 종의 박테리아이다. 예를 들어, 박테리아는 락토바실러스 액시도필러스 또는 락티스 박테리아이다.
11. 상기 박테로이데테스 파지의 게놈을 변형시키기 위한 임의의 앞서 기술된 국면의 방법에서 사용하기 위한 조작된 박테로이데테스 파지-변형 (PM) CRISPR 어레이로서,
(a) CRISPR 어레이는 crRNA의 발현을 위한 하나 이상의 서열 및 박테로이데테스 파지-감염된 숙주 세포에서 서열(들)의 전사를 위한 프로모터를 포함하며;
(b) PM-crRNA가 박테로이데테스 파지 게놈 표적 서열에 혼성화될 수 있어서 Cas(예: Cas 뉴클레아제)를 감염된 숙주 세포에서 안내하여 표적 서열을 변형시키는, 조작된 박테로이데테스 파지-변형 (PM) CRISPR 어레이.
12. 제1 국면 내지 제10 국면 중의 어느 한 방법에서 사용하기 위한 핵산 벡터 (예: 플라스미드, 파지 또는 파지미드)로서, 벡터는 제11 국면의 PM-CRISPR 어레이를 포함하는, 핵산 벡터.
본 발명의 일반적인 실시 형태에서, 제12 국면에 대해 선택적으로 다음이 제공된다: 숙주 박테리아 세포(예를 들어, 위에 기재된 바와 같은 병원성 박테리아 세포)의 게놈 또는 숙주 세포에서의 바이러스(예: 파지)의 게놈의 표적 서열을 변형시키기 위한 조작된 HM-CRISPR 어레이를 포함하는 핵산 벡터(예를 들어, 플라스미드, 바이러스, 파지 또는 파지미드)로서,
(a) CRISPR 어레이가 crRNA의 발현을 위한 하나 이상의 서열을 포함하고 숙주 세포에서 서열(들)의 전사를 위한 프로모터를 포함하며;
(b) crRNA는 표적 서열에 혼성화시킬 수 있어서 Cas(예를 들어, Cas 뉴클레아제)를 숙주 세포에 안내하여 표적 서열을 변형시킨다.
프로모터는 숙주 세포에서 작동 가능하다. 하나의 예에서, 프로모터는 바이러스 또는 파지 프로모터, 예를 들어, T7 프로모터이다. 다른 예에서, 프로모터는 박테리아 프로모터 (예를 들어, 숙주 세포 종의 프로모터)이다.
하나의 예에서, 어레이는 본 명세서에 기술된 트랜스포존으로 구성된다. 하나의 예에서, 어레이는 본 명세서에 기술된 캐리어 박테리아로 구성된다. 하나의 예에서, 다수의 어레이가 파지 또는 숙주 세포의 하나 이상의 표적 뉴클레오타이드 서열을 표적화하기 위해 제공되며, 여기서 다수의 어레이는 박테리아 세포, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 캐리어, 제1 수용체 또는 제 2 수용체 세포로 구성된다. 하나의 예에서, 캐리어 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같은 음료(예를 들어, 인간이 섭취하기 위한 프로바이오틱 음료) 또는 식품에 포함된다. 하나의 예에서, 어레이 또는 캐리어 박테리아는 인간 또는 동물의 감염을 치료 또는 예방하기 위해 인간 또는 인간이 아닌 동물에게 투여하기 위한 것이며, 예를 들어 숙주 세포는 병원성이다. 하나의 예에서, 어레이 또는 캐리어 박테리아는 인간 또는 동물의 비만, 당뇨병 또는 IBD를 치료 또는 예방하기 위해 인간 또는 인간이 아닌 동물의 장내에 투여하기 위한 것이다.
13. 제11 또는 제12 국면에서, 어레이 또는 벡터가 박테리아 세포, 예를 들어 인간 또는 인간이 아닌 동물 소비를 위한 프로바이오틱 세포로 구성되는, 어레이 또는 벡터.
14. 임의의 앞서 기술된 국면의 방법, 어레이 또는 벡터에 있어서, 벡터가 혼합된 개체군과의 결합 또는 혼합된 개체군과의 결합에 사용되는 제3 박테리아 개체군(예를 들어, 본 명세서에 기재된 캐리어 박테리아)로 구성됨으로써, 벡터 핵산은 형질 전환 (예를 들어, 수평 플라스미드 벡터에 의하거나 또는 제3 박테리아로부터 제1 박테리아 숙주 세포로의 트랜스포존 이동에 의함) 또는 형질 도입 (예를 들어, 제 1 박테리아 숙주 세포의 파지 벡터 감염에 의함)에 의해 숙주 세포 내로 도입되는, 방법, 어레이 또는 벡터.
15. 임의의 앞서 기술된 국면의 방법, 어레이 또는 벡터에 있어서, 상기 또는 각각의 어레이 또는 벡터는, 인간 또는 인간이 아닌 동물 장내 공생 또는 생리공생 박테리아 세포 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 캐리어 박테리아 세포)에 의해 포함되는, 방법, 어레이 또는 벡터. 따라서, 세포는 인간 또는 인간이 아닌 동물과 공생 또는 생리공생하는 장내 박테리아 종이다.
16. 제12 국면 내지 제15 국면 중 임의의 한 국면에 있어서, 상기 또는 각각의 벡터는, 페르미쿠테스 숙주 세포 또는 박테로이데테스 파지-감염된 숙주 세포(예, 박테로이데스 세포)에서 작동 가능하고, 제15 국면에서 정의된 바와 같은 공생 또는 생리공생 박테리아 세포에서 선택적으로 작동가능한 복제 기원을 포함하는 플라스미드, 파지 또는 파지미드인, 방법 또는 벡터. 하나의 예에서, 복제 기원은 oriT 또는 본 명세서에 기재된 복제의 임의의 기타 기원이다.
17. 제12 내지 제16 국면 중의 임의의 한 국면에 있어서, 상기 또는 각각의 벡터는 (1) 박테로이데스 세포가 아닌 인간 또는 인간이 아닌 동물 공생 또는 생리공생 박테리아 세포 및 (2) 박테로이데스 세포인 상기 파지-감염된 세포 사이; 또는 (3) 페르미쿠테스 세포가 아닌 인간 또는 인간이 아닌 동물 공생 또는 생리공생 박테리아 세포 및 (4) 표적 서열을 포함하는 페르미테쿠스 세포 사이에서 수평 이동이 가능한 서열 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 트랜스포존)을 포함하는 플라스미드 또는 파지미드인, 방법 또는 벡터.
18. 제12 내지 제17 국면 중의 임의의 한 국면에 있어서, 상기 또는 각각의 벡터는 (1) 박테로이데스 세포인 상기 파지-감염된 세포 및 (2) 인간 또는 인간이 아닌 동물 장내에 프로바이오틱 투여에 적합한 박테리아 세포 사이; 또는 (3) 표적 서열을 포함하는 페르미쿠테스 세포 및 (4) 인간 또는 인간이 아닌 동물 장내에 프로바이오틱 투여에 적합한 박테리아 세포사이에서 수평 이동이 가능한 플라스미드 또는 파지미드 서열 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 트랜스포존)인, 방법 또는 벡터.
19. 제15 내지 제18 국면 중의 임의의 한 국면에 있어서, 공생, 생리공생 또는 프로바이오틱 종은 락토바실러스 종(예: 액시도필러스(예: La-5, La-14 또는 NCFM), 브레비스(brevis), 불가리쿠스(bulgaricus), 플랜타룸(plantarum), 람모수스(rhammosus), 페르멘텀(fermentum), 카우카시쿠스(caucasicus), 헬베티쿠스(helveticus), 락티스(lactis), 루테리(reuteri) 또는 카세이(casei), 카세이 시로타(casei Shirota), 비피도박테리움 종 (예: 비피둠, 브레브, 롱굼 또는 인판티스), 스트렙토코커스 서모필러스 및 엔테로코커스 패시움으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법 또는 벡터.
임의의 앞서 기술된 국문에 있어서, 프로모터는 상기 파지-감염된 박테로이데테스 숙주 세포 및 제15 내지 제19 국면 중 임의의 한 국면에 정의된 바와 같은 공생, 생리공생 또는 프로바이오틱 박테리아 세포; 또는 표적 서열을 포함하는 페르미쿠테스 세포 및 제15 내지 제19 국면 중 임의의 한 국면에 정의된 바와 같은 공생, 생리공생 또는 프로바이오틱 박테리아 세포에서 상기 서열(들)의 전사를 위해 작동 가능한, 방법 또는 어레이 또는 벡터. 예를 들면, 프로모터는 바이러스 또는 파지 프로모터, 예를 들어, T7 프로모터이다. 하나의 예에서, 프로모터는 숙주 세포 프로모터, 예를 들어 숙주 CRISPR/Cas 어레이의 프로모터이다.
20. 임의의 앞서 기술된 국면 또는 본 명세서에서의 임의의 용도에 있어서, 변형은 (i) 표적 서열을 절단시키고, (ii) 표적 서열을 포함하는 유전자의 전사를 하향 조절하고, (iii) 유전자의 전사를 상향 조절하거나, 또는 (iv) 표적에서 핵산 서열을 부가, 결실 또는 치환시키는, 방법, 어레이 또는 벡터.
21. 임의의 앞서 기술된 국면에 있어서, 박테로이데테스 파지는 crAssphage, GB-124 파지, GA-17 파지, HB-13 파지, H16-10 파지, B40-8 파지 및 박테로이데스 프라질리스 파지 ATCC51477-B1로부터 선택된 박테로이데스 파지인, 방법, 어레이 또는 벡터. 문헌[Nat Commun. 2014 Jul 24;5:4498. doi: 10.1038/ncomms5498, "A highly abundant bacteriophage discovered in the unknown sequences of human faecal metagenomes", Dutilh BE 외]을 참조한다. 약 97 kbp crAssphage 게놈은 다른 모든 공지된 파지보다 공개적으로 이용가능한 메타겐에 6 배 더 풍부하고; 바이러스-유사 입자 (VLP)-유도형 메타게놈 및 전체 공동체 메타게놈에서 각각 전체 판독의 90 % 및 22% 까지 포함하며; 공개 데이터베이스에서 모든 인간 대변 메타게놈 시퀀싱의 총 1.68 %이다. 새로운 동시-발생 프로파일링 접근법을 사용하여, 문헌[Dutilh 외]에서는 박테로이데스-관련 단백질 동족체 및 파지 게놈에 인코딩된 고유한 탄수화물-결합 도메인과 일치하는 이 파지에 대한 박테로이데스 숙주를 예측했다.
22. 임의의 앞서 기술된 국면 또는 본 명세서에서의 임의의 용도에 있어서, 표적 서열은 숙주 세포 감염성, 파지 용원화 또는 용균 회로, 또는 파지 생존에 필요한 파지 유전자, 예를 들어 필수 유전자 또는 코트 단백질 유전자에 포함되는, 방법, 어레이 또는 벡터.
23. 임의의 앞서 기술된 국면에 있어서, 표적 서열이 BACON(박테로이데테스-관련 탄수화물-결합) 도메인-인코딩 서열 (예를 들어, 숙주가 박테로이스 숙주인 경우) 또는 엔돌리신-인코딩 서열로 구성되는, 방법, 어레이 또는 벡터. 문헌[FEBS Lett. 2010 Jun 3;584(11):2421-6, doi:10.1016/j.febslet.2010.04.045. Epub 2010 Apr 21, "Mining metagenomic data for novel domains: BACON, a new carbohydrate-binding module", Mello 외]을 참조한다. 파지-구조 단백질에서 BACON 도메인의 존재는 점액 모델에 부착된 제안된 박테리오파지에 의해 설명될 수 있다. 이 모델에 따르면, 파지는 캡시드-표시된 탄수화물-결합 도메인(예: 면역글로불린-유사 배 또는 BACON 도메인)을 통해 장내 점액층을 구성하는 점액 당단백질에 부착되어 파지가 감염하는 박테리아와 보다 빈번한 상호 작용을 촉진한다.
25. 임의의 앞서 기술된 국면 또는 본 명세서에서의 임의의 용도에 있어서, CRISPR 어레이는 숙주 세포에서 crRNA의 발현 및 생산을 위한 서열 R1-S1-R1'을 포함하고, (i) R1은 제1 CRISPR 반복이고, R1'은 제2 CRISPR 반복이고, R1 또는 R1'는 선택적이며; (ii) S1은 상기 제 1 숙주 세포의 표적 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 CRISPR 스페이서인, 방법, 어레이 또는 벡터. 예를 들어, 표적 서열은 프로토스페이서를 포함하거나, 또는 본 발명의 어레이가 숙주 세포에 존재할 때 Cas에 동족인 프로토스페이서 인접 모티브(PAM) 가까이에 인접한 프로토스페이서 서열로 구성되고, Cas는 또한 어레이에서 발현된 crRNA와 동족이다. 하나의 실시 형태에서, Cas는 세포에 내인성이다. 다른 예에서, Cas는 숙주 세포에 외인성이며, 예를 들어, 본 발명의 벡터에 의해 제공된다.
26. 제25 국면에 있어서, R1 및 R1'은 숙주 세포와 동일한 종의 세포의 CRISPR 어레이의 반복 서열과 적어도 95% (예를 들어, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 동일한, 방법, 어레이 또는 벡터.
27. 제25 국면에 있어서, R1 및 R1'은 테타이오타오마이크론 및 프라질리스(예, 박테로이데스 프라질리스 NCTC 9343)로부터 선택된 박테로이데스 종의 CRISPR 어레이(예를 들어, 유형 II-C 어레이)의 반복 서열과 적어도 95% (예를 들어, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 동일하고, 숙주 세포는 반복 서열과 기능적인 CRISPR/Cas 시스템을 포함하고 예를 들어, 상기 종의 박테로이데스 세포인, 방법, 어레이 또는 벡터.
28. 제27 국면에 있어서, R1 및 R1'이 상기 종, 예를 들면, 상기 종의 상기 숙주 세포의 CRISPR 어레이의 제1 (5'-최다) 및 제 2 (제1 반복의 3' 가까이에 위치한 반복) 반복 서열에 각각 적어도 95% (예: 96, 97, 98, 99 또는 100%) 동일한, 방법, 어레이, 용도 또는 벡터. 하나의 예에서, 어레이는 유형 II-C 어레이이다. 하나의 예에서, 어레이 또는 벡터는 R2-S2-R2'를 추가로 포함하고, 스페이서 S2가 스페이서 S1과 동일하거나 상이하고(예를 들어, 숙주 세포 또는 파지 게놈에서 상이한 표적 부위를 표적화 하기 위함) R2 및 R2'는 숙주 세포에서 기능적이며 선택적으로 R1과 동일하다. 예를 들어, 각각의 R1, R1', R2 및 R2'는 박테로이데스 프라질리스 CRISPR 반복이다.
29. 제25 국면에 있어서, (iii) 각각의 R1 및 R1'이 박테로이데스 종 세포의 CRISPR 어레이 (예를 들어, 유형 II-C 어레이)의 반복 서열과 동일하고, 상기 종은 카카에 (caccae), 카필로수스(capillosus), 셀룰로실리티쿠스(cellulosilyticus), 코프로콜라(coprocola), 코프로필러스(coprophilus), 코프로수이스(coprosuis), 디스타소니스(distasonis), 도레이(dorei), 에게르티(eggerthii), 파에시스(faecis), 파인골디(finegoldii), 플럭서스(fluxus), 프라질리스(fragalis) (예, 프라질리스NCTC 9343), 인테스티날리스(intestinalis), 멜라니노게니쿠스(melaninogenicus), 노르디(nordii), 올레이시플레누스(oleiciplenus), 오랄리스(oralis), 오바투스(ovatus), 펙티노필러스(pectinophilus), 플레베이우스(plebeius), 스테르코리스(stercoris), 테타이오타오마이크론(thetaiotaomicron), 우리포르미스(uniformis), 불가투스(vulgatus) 및 크실라니솔벤스(xylanisolvens)로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, (iv) 숙주 세포는 반복 서열과 기능적이며 상기 그룹으로부터 선택된 종(예: (iii)의 선택된 종과 동일한 종)의 박테로이데스 세포인 CRISPR/Cas 시스템을 포함하는, 방법, 어레이, 용도 또는 벡터.
30. 제25국면에 있어서, R1 및 R1'이 표적 서열의 변형을 위한 상기 숙주 박테로이데테스 또는 페르미쿠테스 세포의 CRISPR/Cas 시스템과 기능적인, 방법, 어레이, 용도 또는 벡터. 하나의 예에서, R1, R1', R2 및 R2'는 동일한 박테리아 종, 예를 들어 테타이오타오마이크론 또는 프라질리스와 같은 박테로이데스, 또는 서모필러스 또는 피오게네스와 같은 스트렙토코커스의 유형 II (예를 들어, 유형 II-C) CRISPR/Cas 시스템 반복이다.
31. 제25 국면에 있어서, R1 및 R1'은 박테로이데테스(예, 박테로이데스 또는 프레보텔라) 또는 페르미쿠테스(스트렙토코커스) 세포의 CRISPR 어레이의 반복 서열과 적어도 95% (예를 들어, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 동일한, 방법, 어레이, 용도, 또는 벡터.
32. 제25 국면에 있어서, 각각의 R1 및 R1'는 표2 의 서열 번호 1 내지 5로부터 선택된 서열과 적어도 95 % (예를 들어, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 동일하고, 선택적으로 제1 박테리아 세포는 예를 들어, 표 2에서 종 또는 균주(예: 선택된 서열에 대해 나열된 종 또는 균주)의 박테로이데스 세포인, 방법, 어레이, 용도, 또는 벡터.
33. 제25 국면에 있어서, 각각의 R1 및 R1'는 표2 의 서열 번호 6 내지 11로부터 선택된 서열과 적어도 95 % (예를 들어, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 동일하고, 선택적으로 제1 박테리아 세포는 예를 들어, 표 2에서 종 또는 균주(예: 선택된 서열에 대해 나열된 종 또는 균주)의 프레보텔라 세포인, 방법, 어레이, 용도, 또는 벡터.
34. 임의의 앞서 기술된 국면에 있어서, 상기 또는 각각의 어레이가 상기 숙주 세포에서 crRNA와 함께 기능하는 하나 이상의 Cas 뉴클레아제(들)과 조합되어 표적 서열을 변형시키는, 방법, 어레이 또는 벡터. 예를 들어, 표적 서열은 프로토스페이서 인접 모티브(Protospacer Adjacent Motif: PAM) 가까이에 인접한 프로토스페이서 서열을 포함하며, 선택적으로 PAM은 박테로이데테스 숙주 세포에 포함된 Cas 뉴클레아제와 동족이다. 하나의 예에서, Cas는 유형 II-C Cas 뉴클레아제이다.
35. 임의의 앞서 기술된 국면에 있어서, 상기 또는 각각의 어레이가 상기 숙주 세포에서 crRNA와 함께 기능하는 하나 이상의 Cas 뉴클레아제(들)를 인코딩하는 핵산 서열(들)과 조합되어 표적 서열을 변형시키는, 방법, 어레이 또는 벡터.
36. 제25 국면에 있어서, R1 및 R1'이, 상기 숙주 세포에서 표적을 변형시키기 위해 유형 II Cas9 뉴클레아제(예를 들어, S. 피오게네스, S. 서모필러스 또는 S. 아레우스 Cas9)와 기능적이고, 선택적으로, 방법, 어레이 또는 벡터는 추가로 Cas가 상기 Cas9인 제34 또는 제35 국면에 따르는, 방법, 어레이, 용도 또는 벡터.
37. 제1 내지 제10 국면 또는 제14 내지 제36 국면의 방법 또는 본 명세서 내 용도에 의해 수득가능한 박테리아의 생체 외 혼합된 개체군. 예를 들어, 혼합된 개체군은 의료 또는 영양학적 용도를 위한 컨테이너에 담겨있다. 예를 들어, 컨테이너는 소독된 컨테이너다.
38. 치료, 예방, 미용, 인간 또는 인간이 아닌 동물 체중 감소 (예: 미용학적 감소) 또는 영양학적 용도를 위한 인간 또는 인간이 아닌 동물에게 투여하기 위한 조성물로서, 제37 국면의 혼합된 개체군을 포함하는 조성물. 하나의 예에서, 조성물은 경구, 전신, 흡입, 직장 내, 안구, 구강 또는 질내 투여 용이다. 하나의 예에서, 조성물은 인간 또는 인간이 아닌 동물의 장내 또는 구강 투여용이다.
39. 제37 국면의 혼합된 개체군 또는 제38 국면의 조성물을 포함하는 인간 또는 인간이 아닌 동물 소비용 식품 또는 음료.
40. 영양 보충제 또는 프로바이오틱 음료 또는 식품인 제39 국면의 식품 또는 음료
41. 인간 또는 인간이 아닌 동물 또는 음용수에서의 박테로이데테스 감염을 치료 또는 예방하기 위한 항생 조성물로서, 조성물은 제11 내지 제36 국면 중의 임의의 한 국면의 어레이 또는 벡터를 포함하며, 선택적으로 변형은 제21 (iii) 또는 (iv)를 따르는, 항생 조성물.
42. 인간 또는 인간이 아닌 동물에서 장내 박테로이데테스의 비율을 증가(예를 들어, 비만, 비만증, 당뇨병 (예: I 형) 또는 GI 염증성 질환을 치료 또는 예방하기 위한)시키기 위한 프로바이오틱 조성물로서, 제11 내지 제36 국면 중의 임의의 한 국면의 어레이 또는 벡터를 포함하며, 선택적으로, 변형은 제21 국면 (iii) 또는 (iv)에 따른 것 인, 프로바이오틱 조성물.
43. 제38, 제41, 또는 제42 국면에 있어서, 인간 또는 동물에서 장내 박테로이데스 대 페르미쿠테스의 상대적 비를 증가시키기 위한, 예를 들면, 비만, 당뇨병(예를 들어, I 형 당뇨병) 또는 GI 상태 (예를 들어, 크론병, IBD, IBS, 또는 궤양성 대장염)을 치료 또는 예방하기 위한, 조성물.
대안적으로, 본 발명의 임의의 구성에서의 "어레이"는 숙주 세포에서 발현을위한 HM-crRNA 또는 gRNA를 인코딩하는 조작된 뉴클레오타이드 서열에 의해 대신할 수 있다. 따라서, 어레이와 관련된 본 명세서 내 임의의 국면의 특징은 이러한 조작된 서열에 대해 대안적으로 준용 적용될 수 있다.
이동식 유전 요소 및 CRISPR 시스템
44. 숙주 박테리아 세포 (예를 들어, 전술한 바와 같은 페르미쿠테스 또는 병원성 박테리아 세포)의 게놈 또는 숙주 세포 내 바이러스 (예를 들면, 파지)의 게놈의 표적 서열을 변형시키기 위한 조작된 CRISPR 어레이를 포함하는 핵산 벡터 (예를 들어, 플라스미드, 바이러스, 파지 또는 파지미드)로서,
(a) CRISPR 어레이는 crRNA(예를 들면, gRNA로 구성됨) 및 숙주 세포 내 서열의 전사를 위한 프로모터의 발현을 위한 하나 이상의 서열을 포함하며;
(b) crRNA가 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 숙주 세포에서 Cas (예를 들어, Cas 뉴클레아제)를 안내하여 표적 서열을 변형시키고;
어레이는 상이한 종의 제1 및 제2 세균 박테리아 종 사이에서 수평 이동이 가능한 트랜스포존(transposon)으로 구성되는, 핵산 벡터.
선택적으로, Cas 뉴클레아제는 숙주 세포의 야생형 내인성 Cas 뉴클레아제이다.
45. 제44 국면에 있어서, 어레이는 인간 또는 인간이 아닌 동물에 대한 투여용이고, 제1 세포 종은 인간 또는 동물에게 비-병원성이고, 제2 세포 종은 인간 또는 동물에게 병원성이며, 어레이는 제1 세포에 포함되는, 벡터.
46. 제45 국면에 있어서, 제1 세포 종은 인간 또는 동물과 공생 또는 생리공생하는 종, 예를 들어, 장내 미생물 종인, 벡터.
47. 제45 또는 제46 국면에 있어서, 제1 세포 종은 락토바실러스 종(예: 액시도필러스(예: La-5, La-14 또는 NCFM), 브레비스(brevis), 불가리쿠스(bulgaricus), 플랜타룸(plantarum), 람모수스(rhammosus), 페르멘텀(fermentum), 카우카시쿠스(caucasicus), 헬베티쿠스(helveticus), 락티스(lactis), 루테리(reuteri) 또는 카세이(casei), 예를 들어, 카세이 시로타(casei Shirota), 비피도박테리움 종 (예: 비피둠, 브레브, 롱굼 또는 인판티스), 스트렙토코커스 서모필러스 및 엔테로코커스 패시움으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 벡터.
48. 제44 내지 제47 국면 중 임의의 한 국면에 있어서, 벡터는 인간 또는 동물 소비를 위한 음료(예: 프로바이오틱 음료) 또는 식품에 포함되는, 벡터.
49. 제44 내지 제48 국면 중의 임의의 한 국면에 있어서, 벡터가 표적 서열을 표적화하기 위한 적어도 하나의 반복-스페이서-반복 단위를 포함하며, 반복은 숙주 세포의 CRISPR/Cas 시스템의 반복과 적어도 95%(예를 들어, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 동일함으로써, 벡터의 반복은 숙주 세포에서 작동가능하여 숙주 시스템의 Cas를 안내하여 표적 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는, 벡터.
50. 제49 국면에 있어서, 벡터는 Cas(예를 들어, Cas 뉴클레아제)-인코딩 서열이 결핍되어 있는, 벡터.
본 발명에 따른 숙주 CRISPR/Cas 시스템의 뉴클레오타이드 서열의 표적화는 벡터에 대한 숙주 세포 내성(예, 바이러스 침입)을 제거하거나 내성의 발달 또는 증가를 감소시키는데 유용하다. 예를 들어, 본 발명은 이로써 새로운 벡터(예를 들어, 파지) 스페이서 획득이 억제되도록 내인성 CRISPR/Cas 시스템의 활성을 표적화하고 녹다운하는 이점을 제공한다.
가동화(mobilisation)의 특징은 이동에 필요한 시스-작용 영역(cis-acting region) (oriT)의 존재이다. 이 영역은 이동 과정을 시작하기 위해 플라스미드에서 부위- 및 가닥-특이적인 닉이 만들어지는 DNA 프로세싱의 개시 부위이다. 본 발명은 하기와 같이 이동성 유전자 요소(MGEs)를 사용하는 추가의 실시형태를 제공한다:
1. 이동성 유전자 요소(MGE)를 포함하거나 MGE로 구성된 조작된 CRISPR 핵산 벡터를 제공하는 것으로, MGE는 숙주 세포(예를 들어, 병원성 박테리아 세포)의 게놈 또는 바이러스(예를 들어, 프로파지)의 게놈의 표적 서열을 변형시키기 위한 전달 기원 (oriT) 및 CRISPR 어레이를 포함하며,
(a) CRISPR 어레이는 crRNA의 발현을 위한 하나 이상의 서열 및 숙주 세포 내 서열(들)의 전사를 위한 프로모터를 포함하고;
(b) crRNA는 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 숙주 세포에 Cas(예를 들어, Cas 뉴클레아제)를 안내하여 표적 서열을 변형시키고;
(c) 벡터는 (i) 제1 숙주 세포의 제1 및 제2 핵산 위치 사이에서 이동가능하고, 여기서, 각각의 위치는 염색체 또는 플라스미드 상의 위치이며 표적 서열은 숙주 세포에 포함되거나, 또는 (ii) 제 1 및 제 2 숙주 세포 사이에서 이동가능하고, 여기서, 표적 서열은 제1 및/또는 제2 숙주 세포에 포함되는, 조작된 CRISPR 핵산 벡터.
MGE의 예로는 ICE, 트랜스포존, 플라스미드 및 박테리오파지가 있다. 전달 기원(oriT)은 접합 동안 박테리아 숙주에서 수용체로 DNA를 전달하는데 필요한 짧은 서열(예: 최대 500 bp)이다. oriT는 시스-작용을 하고, 전달되는 동일한 DNA에서 발견되며, DNA와 함께 전달된다. 전달의 일반적인 기원은 기능적으로 정의된 3개의 도메인: 니킹(nicking) 도메인, 전달 도메인 (transfer domain) 및 종료 도메인 (termination domain)을 포함한다.
선택적으로, 프로모터는 제1 및 제2 세포(및 선택적으로는 제3 세포)에서 상기 서열 (들)의 전사를 위해 조작 가능하다.
선택적으로, 표적 서열은 제2 세포에 포함된다. 선택적으로, 표적 서열은 제2 세포에 포함되지 않는다.
하나의 예에서, 제1 및 제2 세포는 상이한 박테리아 종(예를 들어, 장내, 겨드랑이, 질 또는 입의 인간의 미생물군집 개체군에서 발견되는 종)이다. 하나의 예에서, 제1 및 제2 세포는 외인성이다. 다른 예에서, 제1 및 제2 세포는 생체 내 또는 생체 외에서 인간 장내, 질, 겨드랑이 또는 경구 미생물군집에 포함된다.
2. 제1 실시형태에 있어서, MGE가 통합 및 접합 요소(ICE)이거나 또는 ICE를 포함하는, 벡터. 대안적으로, MGE는 동원가능한 MGE(즉, 동원되기 위해 MGE에 의해 운반되지 않은 유전자에 의해 인코딩된 인자를 사용할 수 있음)이다. 용어 MGE와 관련된 "동원가능한" 및 "접합성"은 숙련가에게 즉시 명백해진다.
본 발명에 적합한 ICE의 예와 적합한 oriT의 출처를 제공하는ICEberg 데이터베이스(http://db-mml.sjtu.edu.cn/ICEberg/)를 참조한다. 하나의 예에서, ICE는 1 내지 28 그룹으로부터 선택된 ICE를 포함하는 ICE 계열의 구성원이거나 oriT는 이러한 계열의 구성원: 1=SXT/R391; 2=Tn916; 3=Tn4371; 4=CTnDOT/ERL; 5=ICEclc; 6=ICEBs1; 7=ICEHin1056; 8=PAPI-1; 9=ICEMlSym(R7A); 10=ICESt1; 11=SPI-7; 12=ICE6013; 13=ICEKp1; 14=TnGBS1; 15=Tn5253; 16=ICESa2603; 17=ICEYe1; 18=10270-RD.2; 19=Tn1207.3; 20=Tn1806; 21=ICEA5632; 22=ICEF-I/II; 23=ICEAPG2; 24=ICEM; 25=10270-RD.1; 26=Tn5801; 27=PPI-1; 28=ICEF-III이다. 계열에 대한 설명은 ICEberg 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 예를 들어, Tn916 계열은 Roberts 외(2009) (참조 문헌: Trends Microbiol. 2009 Jun;17(6):251-8. doi: 10.1016/j.tim.2009.03.002. Epub 2009 May 20; "A modular master on the move: the Tn916 family of mobile genetic elements", Roberts A, Mullany P)에 정의되어 있다. Tn916 계열에 속하는 요소는 다음 기준에 따라 정의된다: 이들은 Roberts 외에 나타난 일반적인 조직을 가져야만하며 DNA 수준에서 원래의 Tn916과 서열 및 구조가 유사한 핵심 영역(접합 및 조절 모듈)을 가져야한다. 예외적으로 Tn1549와 같은 일부 접합 트랜스포존(conjugative transposons)은 앞서 이 계열로 분류되었고, 높은 수준의 단백질 유사성을 가지는 것으로 해당 참조 문헌에 기재되어 있다.
3. 제2 실시형태에 있어서, ICE는 트랜스포존, 예를 들어, 접합 트랜스포존인, 벡터. 하나의 예에서, MGE는 기능성 헬퍼 요소의 존재 하에서 동원가능한, 동원가능한 트랜스포존이며, 선택적으로 트랜스포존은 헬퍼 요소와 조합된다.
4. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 벡터는 플라스미드이고 선택적으로 MGE는 플라스미드에 포함된 트랜스포존인, 벡터. 예를 들어, 트랜스포존은 접합 트랜스포존이다. 하나의 예에서, 트랜스포존은 동원가능한 트랜스포존(예: 플라스미드에 의해 인코딩된 하나 이상의 인자, 예를 들어 플라스미드의 트랜스포존 서열 외부의 유전자에 의해 동원가능함)이다. 선택적으로, 트랜스포존은 유형 I 트랜스포존이다. 선택적으로, 트랜스포존은 유형 II 트랜스포존이다.
5. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, oriT는 제1 및 제2 숙주 세포에서 기능적인, 벡터. 이는 예를 들어, 제1 및 제2 세포가 서로 다른 종인 경우, 박테리아 개체군에서 박테리아의 확산과 번식을 촉진하는 데 유용하다.
6. 제5 실시형태에 있어서, 제1 세포에 포함되는 경우, 제 1 세포는, 제2 세포로 MGE를 전달하도록 작용가능한 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 서열은 MGE에 포함되지 않는, 벡터. 이는 이러한 서열에 대해 MGE 내 공간을 사용하지 않는데 유용하다. 예를 들어, 이것은 세포들 사이의 전달을 위한 보다 조밀한 벡터 또는 MGE의 구성을 가능하게 하거나, 또는 보다 크거나 더 많은 CRISPR 어레이의 포함을 가능하게 하여, 예를 들면, 복수의 스페이서를 포함하여 숙주 세포에서 각각의 서열을 표적화하거나 또는 제1 및 제2 숙주 세포에서 상이한 서열을 표적화한다.
7. 제6 실시형태에 있어서, 서열이 벡터에 포함되지 않는, 벡터. 이는 이러한 서열에 대해 벡터 또는 MGE 내 공간을 사용하지 않는데 유용하다. 예를 들어, 이것은 세포들 사이의 전달을 위한 보다 조밀한 MGE의 구성을 가능하게 하거나, 또는 보다 크거나 더 많은 CRISPR 어레이의 포함을 가능하게 하여, 예를 들면, 복수의 스페이서를 포함하여 숙주 세포에서 각각의 서열을 표적화하거나 또는 제1 및 제2 숙주 세포에서 상이한 서열을 표적화하고/하거나, Cas 단백질(들), 예를 들어 Cas9를 인코딩하기 위한 하나 이상의 서열을 포함한다.
8. 제6 또는 제7 실시형태에 있어서, 서열은 제 1 세포의 접합 트랜스포존(conjugative transposon)에 포함되는, 벡터. 이는 제1 및 제2 숙주 세포(예를 들어, 인간 미생물군집에서 상이한 박테리아 종) 사이에서 본 발명의 MGE를 수평으로 이동시키기 위해 접합 전이를 가능하도록 MGE 외부 인자를 보유하는 것을 가능하게 하기 때문에 유용하다.
9. 제8 실시형태에 있어서, 트랜스포존은 MGE를 제2 세포로 전달하기 위해 트랜스에서 작동가능한, 벡터. 이는 제1 및 제2 숙주 세포(예를 들어, 인간 미생물군에서 상이한 박테리아 종) 사이에서 본 발명의 MGE를 수평으로 이동시키기 위해 접합 전이를 수행하도록 MGE 외부 인자를 보유하는 것을 가능하게 하기 때문에 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 MGE의 oriT는 숙주 세포의 접합 트랜스포존에 포함된 oriT와 동일하다. 이는 본 발명의 MGE가 제1 및 제2 숙주 세포(예를 들어, 상이한 종의 박테리아 세포, 예를 들어, 인간 미생물군집 종) 사이에서 MGE의 수평 이동을 수행하기 위해 숙주 세포에 의해 인코딩된 인자로 작동하게하는 데 유용하다. 이는 MGE가 위에서 언급한 것처럼 CRISPR 어레이 및/또는 Cas 유전자에 대한 공간을 확보할 수 있도록 한다.
용어 "트랜스에서 작동 가능한"이라는 용어는 MGE(ICE)가 벡터 뉴클레오타이드 서열 (예를 들어, 숙주 세포의 접합 트랜스포존에 의해 발현된 단백질) 외부의 숙주 뉴클레오타이드 서열로부터 발현된 단백질을 사용하여 수평 이동에 대해 작동 가능하여 MGE(또는 MGE를 함유하는 플라스미드와 같은 전체 벡터)를 제2 세포 내로 이동할 수 있음을 의미한다.
10. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 제1 세포에 포함되는 경우, MGE의 oriT가 제1 세포의 ICE에 포함된 oriT와 동일하고, MGE를 제2 세포로 전달하도록 ICE가 트랜스에서 작동가능한, 벡터.
11. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 벡터 oriT가 박테로이데테스(예: 박테로이드 또는 박테로이데스) 또는 프레보텔라 트랜스포존의 oriT인, 벡터. 이는 제1 및/또는 제2 숙주 세포가 각각 박테로이데테스(예: 박테로이드 또는 박테로이데스) 또는 프레보텔라 세포인 경우, 유용하다. 예를 들어, 제1 세포는 이러한 종의 세포이고 제2 세포는 페르미쿠테스 세포이고, 제2 세포에 포함되는 표적 서열은 제1 세포가 아니며, 이에 따라 CRISPR 어레이는 제 2 세포에서 Cas를 지시하여 표적 서열을 절단한다. 하나의 예에서, 표적 서열은 제2 세포의 필수 유전자 또는 항생제 내성 유전자(및 후자에 대해, 선택적으로, 벡터가 항생제와 조합하거나 또는 항생제와 조합하여 인간 또는 인간이 아닌 동물에 투여됨)에 포함된다. 선택적으로, 트랜스포존은 CTnDot 또는 CTnERL 트랜스포존이고, 벡터는 테트라사이클린과 조합하거나 또는 테트라사이클린과 조합하여 인간 또는 인간이 아닌 동물에게 투여된다.
12. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 벡터 oriT는 CTnDot, CTnERL SXT/R391, Tn916 또는 Tn4371 패밀리 트랜스포존 oriT인, 벡터.
13. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, MGE가 제1 및 제2 말단 반복 서열 및 반복 서열 사이의 CRISPR 어레이를 포함하는, 벡터.
14. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, MGE가 (1) 제2 위치로 이동했을 때 제1 핵산 위치에서 또는 (2) 제2 세포로 이동했을 때 제1 세포에서 트랜스포존 카피를 남기는, 벡터. 이는 숙주 세포 (들)를 포함하는 박테리아 개체군에서 MGE의 증식 및 유지를 촉진시키는데 유용하다. 대안적으로, MGE가 (i) 제2 위치로 이동했을 때 제1 핵산 위치에서 또는 (ii) 제2 세포로 이동했을 때 제1 세포에서 트랜스포존 카피를 남기지 않는다.
15. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 제1 및/또는 제2 세포(예를 들어, 제1 및 제2 세포에 포함된 벡터의 제1 및 제2 카피)에 포함된 경우, 벡터.
16. 제15 실시형태에 있어서, 제1 세포 및 제2 세포는 상이한 종의 세포인, 벡터. 예를 들어, 제1 세포는 락토바실러스 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음) 이고/이거나 제2 세포는 박테로이데테스(예를 들어, 본 명세서에 기재된 세포와 같은 박테로이데스 세포) 또는 페르미쿠테스 세포(예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포)이다. 하나의 예에서, 제1 세포는 박테로이데테스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 박테로이데스 세포)이며, 제 2 세포는 페르미쿠테스 세포(예를 들어, 본원에 기재된 세포)로, 예를 들어 위장관 증상 또는 당뇨병을 치료 또는 예방하기 위해; 또는 비만 치료 또는 예방을 위해 인간의 장내 미생물군 투여를 위한 것이다.
17. 제15 또는 제16 실시형태에 있어서, 제1 세포 및 제2 세포는 박테리아 또는 고세균 세포인, 벡터.
18. 제16 또는 제17 실시형태에 있어서, 제1 세포가 인간(예: 공생 또는 생리공생 박테리아 세포)내 비-병원성이고 선택적으로, 제2 세포가 인간 내 병원성 세포인, 벡터. 하나의 대안에서, 제2 세포는 인간의 비-병원성 세포이다. 용어 "인간에서 비-병원성인"이라는 용어는, 병원성 또는 실질적인 병원성 없이, 인간의 다른 환경에서는 병원성인 인간의 미생물군집(예: 장내, 질, 겨드랑이 또는 구강 내 미생물)서 상주할 수 있는 특정 박테리아 종 (예: 프라질리스와 같은 박테로이데스 종)과 같은 세포를 포함한다. 숙련가는 제1 세포 유형이 인간에서 또는 인간에 대해 유지될 수 있고 제 2 세포 유형이 인간 내 또는 인간 상에서 감소되어야 한다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, CRISPR 어레이는 제2 세포의 게놈을 변형하여 인간의 세포 생존력 또는 성장을 중지시키거나 감소시킨다. 예를 들어, 표적 부위는 제2 세포에 포함되고 부위는 Cas 뉴클레아제에 의해 절단되어, 표적 부위를 포함하는 유전자를 불활성화 또는 하향 조절한다. 예를 들어, 유전자는 제2 세포의 필수 유전자 또는 항생제 내성 유전자이다. 하나의 예에서, 유전자는 독성 유전자이다.
19. 임의의 앞서 기술된 실시형태 또는 본 명세서의 임의의 용도에 있어서, 제2 세포(각각의 숙주 세포)가 (i) 예를 들어, 메티실린, 반코마이신-내성 및 테이코플라닌으로부터 선택되는 항생제에 내성인, 스타필로코커스 아우레우스 세포; (ii) 예를 들어, 세팔로스포린(예: 세프타지딤), 카바페넴스(예: 이미페넴 또는 메로페넴), 플루오로퀴놀론, 아미노글리코사이드(예: 겐타마이신 또는 토브라마이신) 및 콜리스틴으로부터 선택된 항생제에 내성인, 슈도모나스 아우로기노사 세포, (iii) 예를 들어, 카바페넴에 내성인, 클렙시엘라(예: 뉴모니에) 세포; (iv) 예를 들어, 에리스로마이신, 클린다마이신, 베타-락탐, 마크로라이드, 아목시실린, 아지트로마이신 및 페니실린으로부터 선택된 항생제에 내성인, 스트렙토코커스(예를 들어, 뉴모니에 또는 피오게네스) 세포; (v) 예를 들어, 세프트리악손, 아지트로마이신 및 시프로플록사신으로부터 선택된 항생제에 내성인, 살모넬라(예를 들어, 혈청형 타이피) 세포; (vi) 예를 들어, 시프로플록사신 및 아지트로마이신으로부터 선택된 항생제에 내성인, 시겔라 세포; (vii) 예를 들어, 이소니아지드 (INH), 리팜피신 (RMP), 플루오로퀴놀론, 아미카신, 카나마이신 및 카프레오마이신에 대한 내성으로부터 선택된 항생제에 내성인 마이코박테리움 투버쿨로시스(결핵균) 세포; (viii) 예를 들어, 반코마이신으로부터 선택된 항생제에 내성인 장내세균 세포; (ix) 예를 들어, 세팔로스포린 및 카바페넴에 내성인 장내세균 세포; (x) 예를 들어, 트리메토프림, 이트로푸란토인, 세팔렉신 및 아목시실린으로부터 선택된 항생제에 내성인 대장균 세포; (xi) 플루오로퀴놀론 항생제 및 카바페넴으로부터 선택된 항생제에 내성인 클로스트리디움(예, 디피실) 세포; (xii) 예를 들어, 세픽심(예: 구강 세팔로스포린), 세프트리악손 (주사용 세팔로스포린), 아지트로마이신 및 테트라사이클린으로부터 선택된 항생제에 내성인 임질균 세포; (xiii) 예를 들어, 베타-락탐, 메로페넴 및 카바페넴으로부터 선택된 항생제에 내성인 아시네토박터 바우만니 세포; 또는 (xiv) 시프로플록사신 및 아지트로마이신으로부터 선택된 항생제에 내성인 캄필로박터 세포로부터 선택된 세포인, 벡터. 이러한 종은 인간에게 병원성일 수 있다.
20. 제19 실시형태에 있어서, 표적 부위가 제2 세포의 항생제 내성 유전자에 포함되고, 항생제가 제19 실시형태에 기재된 각각의 항생제인, 벡터 또는 용도.
21. 제15 내지 제20 실시형태 중 어느 한 실시형태에서, 제1 세포는 박테로이데테스(예를 들어, 박테로이드 또는 박테로이데테스) 세포; 락토바실러스(예: 액시도필러스(예: La-5, La-14 또는 NCFM), 브레비스(brevis), 불가리쿠스(bulgaricus), 플랜타룸(plantarum), 람모수스(rhammosus), 페르멘텀(fermentum), 카우카시쿠스(caucasicus), 헬베티쿠스(helveticus), 락티스(lactis), 루테리(reuteri) 또는 카세이(casei), 예를 들어, 카세이 시로타(casei Shirota); 비피도박테리움(예: 비피둠, 브레브, 롱굼 또는 인판티스); 스트렙토코커스 서모필러스; 엔테로코커스 패시움; 알리스티페스(Alistipes); 알칼리플렉서스(Alkaliflexus); 파라박테로이데스(Parabacteroides); 탄네렐라(Tannerella); 또는 자일라니박터(Xylanibacter) 세포인, 벡터.
22. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, (i)의 제1 및/또는 제2 핵산 위치가 박테로이데테스(예: 박테로이드 또는 박테로이데스) 세포에 포함되거나; 또는 (ii)의 제1 및/또는 제2 숙주 세포가 박테로이데테스(예: 박테로이드 또는 박테로이데스) 또는 프레보텔라 세포인, 벡터.
23. 제22 실시형태에 있어서, 제1 세포는 박테로이데테스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 박테로이드 또는 박테로이데스 세포)이며, 제 2 세포는 페르미쿠테스(예를 들어, 클로스트리디움 또는 스타필로코커스)세포이며, 예를 들면, 벡터는 위장관 증상 또는 당뇨병을 치료 또는 예방하기 위한; 또는 비만을 치료 또는 예방하기 위한 인간의 장내 미생물군 투여를 위한, 벡터.
24. 제16 또는 제17 실시형태(또는 본 명세서 내 임의의 용도)에 있어서, 제1 세포(각각의 제1 세포)가 환경(예를 들어, 물 또는 토양 환경)에서 환경적으로 수용 가능하며, 선택적으로 제2 세포(각각의 숙주 세포)는 환경적으로 수용가능하지 않은, 벡터. 수질 환경은 당업자의 숙련가에게 쉽게 자명하며, 예를 들어 해양 또는 수로(예를 들어, 호수, 수로, 강 또는 저장조) 환경일 수 있다. 하나의 예에서, 수질 환경은 인간의 소비를 목적으로 한 음용수 또는 하수이다. 하나의 예에서 토양 환경은 경작지의 토양 또는 광산 현장(예: 광물 또는 금속 채광 부지)에서의 토양이다.
"수용가능"및 "수용 가능하지 않음"에 의해 당업자의 숙련가는 제1 세포 유형이 환경에서 유지될 수 있고 제2 세포 유형이 환경에서 감소되어야 한다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, CRISPR 어레이는 제2 세포의 게놈을 변형하여 환경의 세포 생존력 또는 성장을 중지시키거나 감소시킨다. 예를 들어, 표적 부위는 제2 세포에 포함되고 부위는 Cas 뉴클레아제에 의해 절단되어, 표적 부위를 포함하는 유전자를 불활성화 또는 하향 조절한다. 예를 들어, 유전자는 제2 세포의 필수 유전자 또는 항생제 내성 유전자이다. 하나의 예에서, 유전자는 독성 유전자이다.
하나의 예에서, 환경은 인간의 미생물, 예를 들어 구강 내 미생물군집 또는 장내 미생물군집 또는 혈류이다. 하나의 예에서, 환경은 인간 내 또는 인간에 대한 환경이 아니다. 하나의 예에서, 환경은 인간이 아닌 동물 내 또는 인간이 아닌 동물에 대한 환경이 아니다. 하나의 실시형태에서, 환경은 대기 환경이다. 하나의 실시형태에서, 환경은 농업 환경이다. 하나의 실시형태에서, 환경은 오일 또는 유전 또는 유정과 같은 오일 또는 석유 회수 환경이다. 하나의 예에서, 환경은 인간 또는 인간이 아닌 동물 소비를 위한 식품 또는 음료 내 또는 음료에 대한 환경이다.
하나의 예에서, 본 명세서의 벡터, 시스템, 벡터, 어레이, crRNA, gRNA, 방법 또는 임의의 용도는 산업에서 사용하기 위한 것이며, 또는 환경은 산업 환경이며, 산업은 의료 및 건강 관리; 제약; 인간 음식; 동물 음식; 식물 비료; 음료; 낙농; 육류 가공; 농업; 축산업; 가금류 양식; 어패류 양식; 수의사; 기름; 가스; 석유화학 제품; 물 처리; 하수 처리; 포장; 전자 제품 및 컴퓨터; 개인 건강 관리 및 세면용품; 화장품; 치과; 비-의료용 치과; 안과; 비-의료용 안과; 광물 채광 및 가공; 금속 채광 및 가공; 채석; 비행; 자동차; 레일; 해상운송; 공간; 환경; 토양 처리; 펄프 및 종이; 의류 제조; 염료; 인쇄; 접착제; 공기 처리; 용제; 생체 방어; 비타민 보충제; 냉장 보관; 섬유 침수처리 (retting) 및 생산; 생명 공학; 화학 물질; 산업용 청소 제품; 국내 청소 제품; 비누 및 세제; 소비자 제품들; 임학; 어업; 여가; 재활용; 플라스틱; 가죽(hide), 레더 및 스웨이드; 폐기물 관리; 장의업 및 사업; 연료; 건물; 에너지; 강철; 담배 산업 분야로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분야의 산업이다.
25. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 변형된 표적 부위에 혼입시키기 위한 핵산(예를 들어, DNA)과 조합된, 벡터.
하나의 예에서, 변형은 표적 부위의 절단이고, 핵산(예: DNA)은 숙주 세포에서 동종 재조합에 의해 혼입된다. 이는 본 발명의 벡터를 사용하여 숙주 세포 게놈의 정확히 표적화된 변형을 수행하는데 유용하다.
26. 제25 실시형태에 있어서, 혼입용 핵산이 조절 요소 또는 엑손 서열, 예를 들어 인간 서열인, 또는 조절 요소 또는 엑손 서열을 포함하는, 벡터.
27. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, MGE의 동원을 위한 유전자전위효소(transposase)와 조합하는, 벡터.
28. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 벡터 또는 MGE는 제1 숙주 세포에서 작동가능한 독소-항독소 모듈을 포함하고; 선택적으로 독소-항독소 모듈은 제1 세포 이외의 세포에서 작동가능하지 않거나 또는 작동이 감소된 항-독소 유전자를 포함하는, 벡터.
29. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 벡터 또는 MGE는 제2 숙주 세포에서 작동가능한 독소-항독소 모듈을 포함하고; 선택적으로 독소-항독소 모듈은 제2 세포 이외의 세포에서 작동가능하지 않거나 또는 작동이 감소된 항-독소 유전자를 포함하는, 벡터.
30. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 벡터 또는 MGE는 제1 및 제2 숙주 세포에서 작동가능한 독소-항독소 모듈을 포함하고; 선택적으로 독소-항독소 모듈은 제1 및 제2 세포 이외의 세포에서 작동가능하지 않거나 또는 작동이 감소된 항-독소 유전자를 포함하는, 벡터. 독소-항독소 모듈의 사용은 선택적 이점을 부여하고 이에 따라 MGE 보유 및 확산을 유도하는데 유용하다. 예를 들어, 모듈은 Hok-Sok 모듈과 같은 유형 I 모듈이다. 예를 들어, 모듈은 HiCa-HicB 모듈과 같은 유형 II 모듈이다. 예를 들어, 모듈은 tad-ata-유형 독소-항독소 모듈이다. 예를 들어, 모듈은 플라스미드 중독 모듈이다. 하나의 예에서, 제1 및/또는 제2 세포는 박테로이데스 세포이고, 모듈은 박테로이데스 종, 예를 들어, Txe/YoeB 계열 중독 모듈(참조, 예를 들어 http://www.uniprot.org/uniprot/F0R9D1); RelE/StbE 계열 중독 모듈(참조, 예를 들어 http://www.uniprot.org/uniprot/F0R9A0); HigA 계열 중독 모듈(참조, 예를 들어 http://www.uniprot.org/uniprot/D7J8V2 또는 http://www.uniprot.org/uniprot/D2ESD0); RelE/StbE 계열 중독 모듈(참조, 예를 들어, http://www.uniprot.org/uniprot/F0R5F4)의 모듈이다. 벡터 또는 MGE에서 독소-항독소를 사용하면 목적하는 세포(예: 제1 및 제2 및/또는 제3 박테리아 세포) 이외의 벡터-보유 세포를 파괴하는데 유용할 수 있다. 이 예에서, MGE 또는 벡터는 박테리아 독소-항독소 모듈 및 동족 항-독소 유전자의 독소 유전자를 포함하며, 여기서 독소 및 항-독소 유전자의 발현은 예를 들어 상이한 프로모터로부터 별개로 조절된다. 예를 들어, 독소 유전자는 독소가 항상 생성되도록 제1, 제2 (및 제3) 세포에서 구성적으로 활성인 프로모터를 포함할 수 있다. 항-독소 유전자는 제 1 및/또는 제 2 세포에서 하나 이상의 인자(예: 단백질이 발현됨)에 의해 유도가능하지만 다른 균주 또는 종의 비-표적 세포에서는 유도되지 않는 프로모터를 포함할 수 있다. 알려진 바와 같이, 항독소는 본질적으로 박테리아 독소/항독소 시스템에서 독소보다 덜 안정하므로, 벡터 또는 MGE가 표적 세포가 아닌 세포(예를 들어, 제1 및/또는 제2 세포가 아닌 세포)로 전달되면, 항독소 발현 부재 또는 낮은 항독소 활성으로 독소 발현을 유도하여 비-표적 세포의 세포 사멸을 유도할 수 있다. 따라서, 이는 표적 세포(제1 세포, 제2 세포 및 제3 세포)가 본 발명의 벡터를 흡수 및 보유하도록 선택 압력을 생성하여 바람직한 CRISPR 어레이 활성을 가질 수 있고 또한 개체군(예를 들어, 장내 미생물군) 내 표적 세포를 따라 전파될 수 있다. 이는 또한 벡터 또는 MGE의 비 표적 세포로의 전파를 제한하여 어레이의 효과가 개체군에서 통제되도록 하고, 이러한 측면에서, 비-표적 세포가 벡터를 차지하지 못하도록 압력이 가해질 것이고, 이렇게 되면, 수용 세포는 개체군에서 생존하지 못하게됨으로써, MGE 및 어레이를 가진 비-표적 세포의 복제를 제한하게 된다.
31. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 제1 및 제2 세포는 동일한 문(phylum)(예: 둘 다 박테리아 세포)이고 벡터가 (d) 제1 세포 및/또는 제 2 세포에서 복제가능하거나 또는 작동가능하지만, 동일한 문의 다른 세포에서는 가능하지 않고; (e) 제1 세포 및/또는 제2 세포에서 복제가능하거나 또는 작동가능하지만, 동일한 목(order)의 다른 세포에서는 가능하지 않고; (f) 제1 세포 및/또는 제2 세포에서 복제가능하거나 또는 작동가능하지만, 동일한 강(class)의 다른 세포에서는 가능하지 않고; (g) 제1 세포 및/또는 제2 세포에서 복제가능하거나 또는 작동가능하지만, 동일한 목(order)의 다른 세포에서는 가능하지 않고; (h) 제1 세포 및/또는 제2 세포에서 복제가능하거나 또는 작동가능하지만, 동일한 과(family)의 다른 세포에서는 가능하지 않고; (i) 제1 세포 및/또는 제2 세포에서 복제가능하거나 또는 작동가능하지만, 동일한 속(genus)의 다른 세포에서는 가능하지 않고; (j) 제1 세포 및/또는 제2 세포에서 복제가능하거나 또는 작동가능하지만, 동일한 종(species)의 다른 세포에서는 가능하지 않고; (k) 제1 세포 및/또는 제2 세포에서 복제가능하거나 또는 작동가능하지만, 동일한 균주에서는 가능하지 않은, 벡터.
이는 미생물군집에서 본 발명의 벡터의 선택성(예를 들어, 혼합된 박테리아 개체군에서 제2 숙주 세포 유형의 선택적 사멸을 위함)을 제공한다. 상기 선택성의 제공은 복제 또는 작동(예: crRNA 생산을 위한 발현)을 위한 특정 단백질의 발현이 필요하도록 예를 들어, MGE 또는 어레이(예: 이의 프로모터)를 조작함으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 제1 및/또는 제2 세포에서 작용하지만 다른 세포에서는 작용하지 않는 프로모터로부터 선택될 수 있거나, 또는 하나 이상의 복제 개시 부위가 단백질 또는 제1 및/또는 제2 세포에서 생성되지만 다른 세포에서는 생성되지 않은 기타 요소에 의존하도록 MGE가 조작된다.
32. 세포의 혼합된 개체군에서 임의의 앞서 기술된 실시형태의 벡터의 제1 및 제2 카피로서, 제1 벡터가 제1 세포에 포함되고, 제2 벡터가 제2 세포에 포함되고, 세포는 상이한 종의 세포(예를 들어, 상이한 박테리아 종)이고, 벡터 MGE 중 하나 또는 둘 모두가 제3 세포(예를 들어, 박테리아 세포)로 전이될 수 있으며, 제3 세포 종은 제1 또는 제2 세포의 종과 동일하거나 또는 제1 및 제 2세포 종과 상이한, 벡터의 제1 및 제2 카피. 이는, 제1 세포가 캐리어로서 작용할 수 있기 때문에 유용하다(예: 비병원성인 경우 인간 또는 동물, 예를 들어, 이의 미생물군집을 거주시키도록 인간 또는 동물에게 투여할 수 있음). 수평 이동에 의해, 캐리어는 본 발명의 CRISPR 어레이를 제3 세포(직접적으로 또는 어레이용 저장소로 작용하는 제2 세포를 통함)에 전달 및 전파될 수 있다. 이후, 어레이는 제3 세포에서 표적 서열의 Cas 변형(예: 절단)을 매개하여 예를 들어 제3 세포의 필수 또는 항생제 내성 유전자를 비활성화 또는 하향 조절할 수 있다.
일반적으로, 표적 서열이 세포의 항생제 내성 유전자에 포함되는 경우, 본 발명의 벡터, 조작된 서열 또는 어레이는 항생제와 (동시에 또는 순차적으로) 인간 또는 동물에게 투여될 수 있다. 이는 표적 서열을 포함하는 세포의 증식을 막거나 감소시키는데 유용하다. 이와 관련하여, 벡터, 조작된 서열 또는 어레이는 항생제를 포함하는 조성물에 포함되며, 표적 서열은 항생제에 대한 내성을 인코딩하는 유전자의 서열이다.
선택적으로, 혼합된 개체군은 제3 세포를 포함한다.
하나의 예에서, 각각이 본 발명의 벡터를 포함하는 다수의 제1 세포가 제공된다. 하나의 예에서, 각각이 본 발명의 벡터를 포함하는 다수의 제2 세포가 제공된다. 하나의 예에서, 각각의 세포가 본 발명의 벡터를 포함하는, 다수의 제1 세포가 다수의 제2 세포와 조합되어 제공된다. 하나의 예에서, 다수의 제2 세포 및 다수의 제3 세포와 조합된 다수의 제1 세포가 제공되고, 적어도 2개의 (또는 모든) 다수의 세포는 본 발명의 벡터를 포함한다.
33. 제32 실시형태에 있어서, 벡터 또는 MGE는 제1, 제2 및 제3 숙주 세포에서 작동가능한 독소-항독소 모듈을 포함하고; 선택적으로 독소-항독소 모듈은 제1, 제2 및 제3 세포 이외의 세포에서 작동가능하지 않거나 또는 작동이 감소된(즉, 낮은) 항-독소 유전자를 포함하는, 벡터.
34. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, MGE는 접합 트랜스포존이고, oriT가 제1 및 제2 숙주 세포에서 기능적인 박테로이데테스 oriT이고, MGE는 제1 및 제2 말단 반복 서열 및 반복 서열 사이의 CRISPR 어레이를 포함하며, 제1 및 제2 세포는 박테리아 세포이고, 제2 세포는 인간 미생물군 세포 종(예: 병원성 종)이며, 표적 부위는 제2 세포에 포함되지만, 제1 세포에는 포함되지 않으며, 변형은 제2 세포에서 표적을 포함하는 유전자 또는 조절 서열을 불활성화 또는 하향 조절하는, 벡터.
유용하게도, 제1 세포는 MGE의 수평 이동에 의해 전달될 수 있는 본 발명의 어레이를 위한 캐리어 및 저장소로서 작용할 수 있다.
하나의 예에서, MGE는 접합 박테로이데테스 트랜스포존이고, oriT가 1 및 제 2 숙주 세포에서 박테로이데테스 oriT 기능적이고, MGE는 제1 및 제2 말단 반복 서열 및 반복 서열 사이의 CRISPR 어레이를 포함하며, 제1 및 제2 세포는 박테리아 세포이고, 제1 세포는 박테로이데테스 세포이고, 제2 세포는 페르미쿠테스 세포(예: 클로스트리디움 또는 스타필로코커스 세포)이고, 표적 부위는 제1 세포가 아닌 제2 세포에 포함되며, 변형은 제2 세포에서 표적을 포함하는 유전자 또는 조절 서열을 불활성화 또는 하향 조절한다.
35. 제34 실시형태에 있어서, 제1 또는 제2 세포에 포함되는 경우, 벡터.
36. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 제1 및 제2 세포가 혼합된 박테리아 세포 개체군, 예를 들어 인간 또는 인간이 아닌 동물(예를 들어, 개, 고양이 또는 말) 장, 질, 겨드랑이 또는 구강 미생물군 종의 세포의 개체군에 포함되는, 벡터. 위에 설명된 바와 같이, 개체군은 인간 또는 동물에 투여하여 미생물군집을 거주시키는데 유용하다.
37. 제 22 실시형태에서 정의된 바와 같은 다수의 세포를 포함하는 생체 외 조성물로서, 각 세포는 제1 내지 제36 실시형태 중 어느 하나에 따른 벡터를 포함하는, 생체 외 조성물. 대안적으로는, 조성물은 생체 내, 예를 들어, 인간이 아닌 동물에 존재한다.
38. 제1 내지 제36 실시형태 중 어느 하나의 벡터 또는 제37 실시형태의 조성물을 포함하는, 인간 또는 인간이 아닌 동물 소비용의 음료 또는 식품. 음료는 인간 또는 동물에 의해 매일, 2 일마다 또는 1 주일에 1 회 소비하기 위한, 예를 들어, 인간 또는 동물에서 비만 또는 GI 상태를 치료 또는 예방하기 위한 프로바이오틱 음료일 수 있다.
39. 각각의 세포가 제1 내지 제36 실시형태 중 어느 하나에 따른 벡터를 포함하는, 복수의 박테로이데스 세포를 포함하는 조성물.
유용하게도, 세포는 인간 또는 동물의 미생물군집(예를 들어, 장내 미생물군)에 투여하여, 예를 들어 인간 또는 동물에서 비만 또는 위장관 증상을 치료 또는 예방하기 위해 본 발명의 어레이의 캐리어 및 저장소로 작용할 수 있다.
40. 제1 세포의 하위 개체군 및 제 2 세포의 하위 개체군을 포함하는 박테리아 세포의 혼합된 개체군으로서, 제1 세포는 제1 내지 제36 실시형태 중 어느 하나에 따른 벡터를 포함하며, 벡터는 제1 세포 및 제2 세포 하위 개체군 사이에 수평 이동할 수 있는, 혼합된 개체군. 이러한 개체군은 인간 또는 동물에게(예를 들어, 비강 내로) 투여되어 박테리아가 인간 또는 동물의 하나 이상의 미생물군집(예를 들어, 장내 미생물군집)을 거주시키도록 하기 때문에 유용하다. 제1 (및 선택적으로, 또한 제2) 세포는 본 발명의 CRISPR 어레이의 캐리어로서 작용할 수 있는데, 특히 이들 세포가 인간 또는 동물에 비병원성인 경우(예를 들어, 장내 미생물군집에서 비병원성임) 작용할 수 있다. 미생물군집은 본원에 개시된 임의의 다른 미생물군 또는 미생물 개체군일 수 있다.
41. 제40 실시형태에 있어서, 제1 및 제2 박테리아 종 중 하나 또는 둘 모두가 인간 또는 인간이 아닌 동물의 장내 미생물을 거주시킬 수 있고, 선택적으로 제1 박테리아가 인간 또는 동물과 공생 또는 생리공생하는, 개체군. 유용하게도, 제1 박테리아는 인간 또는 동물에게 안전하게 투여될 수 있으며, 이후 미생물의 다른 세포로 이동하도록 본 발명의 어레이의 캐리어로서 작용할 수 있다.
42. 제40 실시형태에 있어서, 혼합된 개체군은 음료 또는 물(예: 수로 또는 인간 소비를 위한 식수) 또는 토양에 의해 보유되는, 개체군. 물 또는 토양에 개체군을 제공하는 것은 환경, 또는 (물에 대한) 난방, 냉각 또는 산업 시스템 또는 식수 저장 컨테이너에서 처리에 유용하다.
임의의 실시형태의 하나의 예에서, 제2 세포는 표적 서열을 포함하는 콜레라 세포이고, 표적 서열이 변형된 경우 세포가 사멸하거나 세포 증식이 감소한다. 하나의 예에서, 제2 세포는 인간이 소비하는 물(예: 인간이 소비하기 위해 처리하기 전 또는 후의 물)에 포함된다. 하나의 예에서, 벡터는 인간에서 콜레라를 치료 또는 예방하기 위해 인간에게 투여하기 위한 약제학적 조성물에 포함된다.
43. 시험관 내에서 제1 내지 제36 실시형태 중 어느 하나에 따른 다수의 벡터를 포함하는 조성물. 예를 들어, 조성물은 산업 장치 또는 컨테이너(예컨대, 식품, 소비재, 화장품, 개인 건강 관리 제품, 석유 또는 오일 생산용)에서 다수의 종 박테리아 개체군과 혼합된다.
44. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 미생물군집을 치료학적으로 또는 예방학적으로 모으고 또는 재균형시키거나 또는 인간 또는 동물을 미용학적으로 변화(예를 들어, 미용학적 체중 감량을 위함)시키기 위해 인간 또는 인간이 아닌 동물에게 투여하기 위한 벡터, 조성물, 식품, 음료 또는 개체군.
45. 숙주 세포에서 표적 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는 방법으로서, 방법은
(1) 숙주 세포를 캐리어 세포와 결합시키는 단계
(여기서 (a) 캐리어 세포는 표적을 변형시키기 위한 CRISPR 어레이를 포함하는 CRISPR 핵산 벡터를 포함하고,
(b) CRISPR 어레이는 숙주 세포에서 서열(들)의 전사를 위한 프로모터 및 crRNA의 발현을 위한 하나 이상의 서열을 포함하고;
(c) crRNA가 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 Cas(예: Cas 뉴클레아제)를 숙주 세포에 안내하여 표적 서열을 변형시킴); 및
(2) 세포를 함께 배양하는 단계(여기서, 벡터는 캐리어 세포로부터 숙주 세포로 전달되어, crRNA가 표적 서열에 혼성화되어 Cas를 숙주 세포에 안내하고 표적이 변형됨)를 포함하는 방법.
하나의 예에서, 방법은 생체 외에서 수행된다. 하나의 예에서, 방법은 미용학적 방법이며 치료학적 방법 또는 예방학적 의학용 방법이 아니다.
46. 제45 실시형태에 있어서, 벡터는 제1 내지 제36 실시형태 중 어느 한 실시형태에 따른, 방법.
47. 제45 또는 제46 실시형태에 있어서, 숙주 세포가 인간 또는 인간이 아닌 동물 미생물군집 박테리아 종의 세포인 경우, 선택적으로, 숙주 세포가 병원성 박테리아 종의 세포인, 방법. 하나의 예에서, 본 명세서의 임의의 미생물군집은 장, 질, 겨드랑이, 두피, 피부 또는 경구 미생물군집으로부터 선택된다.
48. 제45 내지 제47 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 캐리어 세포가 공생 또는 생리공생 인간 또는 인간이 아닌 동물 미생물군집 박테리아 종인, 방법. 하나의 예에서, 캐리어 세포는 예를 들어, 비강 내, 국소 또는 경구로 투여되는 경우 인간에게 비병원성이다.
본 명세서에서 임의의 구성, 컨셉, 국면, 실시형태 또는 실시예에서, 본 발명의 벡터, 조성물, 어레이 또는 개체군은 인간 또는 인간이 아닌 동물에게 비강 내, 국소 또는 경구로 투여되거나 이러한 투여를 위한 것이다. 인간 또는 동물의 미생물군집 처리를 목표로 하는 숙련가는 관심있는 미생물군에 따라 최적의 투여 경로를 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 미생물군집이 장내 미생물군 인 경우, 투여는 비내 또는 구강일 수 있다. 미생물군집이 두피 또는 겨드랑이 미생물군일 때, 투여는 국소적으로 이루어질 수 있다. 미생물군집이 입이나 목에 있을 때, 구강으로 투여될 수 있다.
49. 제45 내지 제48 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 숙주 세포가 인간 또는 인간이 아닌 동물의 장내 미생물군집 박테리아 종인, 방법.
50. 하위 개체군을 포함하는 박테리아의 혼합된 개체군의 제1 및 제2 박테리아 숙주 세포 종의 하위 개체군의 상대적 비를 변경시키는 방법에 있어서, 방법은
A: 제 1 박테리아 숙주 세포를 제공하는 단계;
B: 제2 세포가 제 1 세포와 상이한 종 또는 균주의 세포인 제 2 박테리아 숙주 세포를 제공하는 단계;
C: 조작된 CRISPR 어레이를 제1 박테리아 숙주 세포에 도입하는 단계 (여기서, 각각의 CRISPR 어레이가 제2 숙주 세포에서 서열(들)의 전사를 위한 프로모터 및 crRNA의 발현을 위한 하나 이상의 서열을 포함하고, crRNA는 제2 세포에 포함된 표적 서열을 혼성화시킬 수 있어서 Cas(예를 들어, Cas 뉴클레아제)를 숙주세포에 안내하여 표적 서열을 변형시킴);
D: 제1 및 제2 박테리아 세포를 함께 조합하여 혼합된 박테리아 개체군을 생산하는 단계; 및
E: 제1 박테리아 세포에서 제2 박테리아 세포로의 CRISPR 어레이의 수평 이동이 일어남으로써(여기서, 제2 세포에서 표적 서열은 변형된 Cas임, 제1 및 제2 박테리아의 상대적 비가 변경되도록 혼합된 개체군에서 박테리아 성장을 허용하는 단계를 포함하는, 방법.
51. 제50 실시형태에 있어서, 각각의 CRISPR 어레이는 제1 내지 제26 실시형태 중 어느 한 실시형태에 따른, 방법.
52. 제50 또는 제51 실시형태에 있어서, 단계 E의 혼합된 개체군의 제1 시료를 수득하는 단계를 더 포함하고, 선택적으로 세포의 1 시료의 제2 세포의 비율을 제2 시료의 제2 세포의 비율과 비교하는 단계를 포함하고, 제2 시료는 단계 B에서 제2 세포를 제공하기 위해 사용된 박테리아 세포의 혼합된 개체군의 시료이며, 비교 단계는 단계 E 이후에 제2 세포의 비율이 증가 또는 감소하는 것을 나타내는, 방법.
53. 제52 실시형태에 있어서, 제2 시료는 인간 또는 동물 미생물군집의 시료(예를 들어, 장, 질, 두피, 겨드랑이, 피부 또는 구강 세포)인, 방법.
54. 제50 또는 제53 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 인간 또는 동물 미생물군집의 시료(예를 들어, 장, 질, 두피, 겨드랑이, 피부 또는 구강 세포)를 사용하여 단계 B의 제2 세포를 제공하는, 방법.
55. 제50 내지 제54 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 세포의 재조합 배양 개체군이 단계 A에 사용되는, 방법.
56. 제50 내지 제55 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 플라스미드, ICE 또는 트랜스포존 수평 이동은 단계 E에서 사용되며, 각각의 플라스미드, ICE 또는 트랜스포존은 CRISPR 어레이를 포함하는, 방법.
57. 제50 내지 제56 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 비만, 당뇨병 IBD, 위장관 상태 또는 구강 상태를 치료 또는 예방하기 위한, 예를 들어, 인간 또는 인간이 아닌 동물의 미생물을 치료학적으로 또는 예방학적으로 재균형시키기 위한, 방법. 당뇨병은 유형 I 또는 II일 수 있다. 하나의 예에서, 예방(prophylaxis)은 의학용이다. 하나의 예에서, 본 명세서에서 예방은 비-의학용, 예를 들어, 미용 또는 위생 목적이다. 예를 들어, 미생물군은 겨드랑이 미생물군이고, 방법은 인간의 신체 냄새를 방지 또는 감소하기 위한 것이다. 예를 들어, 이 경우에, 방법은 인체의 냄새 발생 및/또는 지속을 매개하는 숙주 박테리아 세포의 성장 또는 생존 가능성을 하향 조절한다.
58. 제50 내지 제57 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 캐리어 및 숙주 세포와 상이한 종 또는 균주의 제3 박테리아 숙주 세포를 제공하는 단계를 포함하고, 제3 세포는 단계 E에서 혼합된 개체군에 포함되거나 단계 E 이후에 혼합된 개체군과 조합되며, CRISPR 어레이의 제3 숙주 세포로의 수평 이동이 발생하는, 방법.
59. 제58 실시형태에 있어서, 제3 세포는 표적 서열을 포함하지 않는, 방법.
이러한 방식으로, 제3 세포는 어레이의 캐리어로서 작용할 수 있고, 표적 서열을 포함하는 숙주 세포에 어레이를 수평으로 이동할 수 있다.
60. 제58 실시형태에 있어서, 제3 세포는 Cas 변형을 위한 표적 서열을 포함하는, 방법.
61. 제50 내지 제 60 실시형태 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 캐리어(및 선택적으로 제3 세포) 세포는 제21 실시형태에서 기술된 종, 예를 들어, 박테로이데테스 세포인, 방법.
62. 제50 내지 제60 실시형태 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 제19 실시형태에 기재된 종 또는 페르미쿠테스 세포인, 방법.
63. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 각각의 벡터가 플라스미드, 파지(예를 들어, 포장된 파지) 또는 파지미드인 또는 플라스미드, 파지(예를 들어, 포장된 파지) 또는 파지미드에 포함되는, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군 또는 방법.
64. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 변형은 (i) 표적 서열을 절단시키고, (ii) 표적 서열을 포함하는 유전자의 전사를 하향 조절하고, (iii) 표적 서열을 포함하는 유전자의 전사를 상향 조절하거나, 또는 (iv) 표적에서 핵산 서열을 부가, 결실 또는 치환시키는, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군 또는 방법.
65. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 각각의 표적 서열이 숙주 세포의 조절 요소 또는 유전자에 포함된 서열이고, 유전자는 필수 유전자, CRISPR 유전자 또는 항생제 내성 유전자이고, 선택적으로, 조절 요소는 이러한 유전자의 요소인, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군 또는 방법. 하나의 대안에서, 유전자는 독성 유전자이다.
66. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 각각의 표적 서열이 파지 게놈에 포함되는 서열이고, 파지가 숙주 세포에 포함되는, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군 또는 방법. 하나의 예에서, 표적 서열은 숙주 세포 감염성, 파지 용원화 또는 용균 회로, 또는 파지 생존에 필요한 파지 유전자, 예를 들어 필수 유전자 또는 코트 단백질 유전자에 포함된다.
하나의 예에서, 박테로이데테스 파지는 crAssphage, GB-124 파지, GA-17 파지, HB-13 파지, H16-10 파지, B40-8 파지 및 박테로이데스 프라질리스 파지 ATCC51477-B1로부터 선택된 박테로이데스 파지이다. 이는 예를 들어 인간 또는 동물의 장내 미생물군집에서 박테로이데테스에 대한 생존 이점을 제공하는데 유용하다. 이러한 방식에서, 박테로이데테스 대 페르미쿠테스의 비는 전자 대 후자의 비율을 상승(예: 비만 치료 또는 예방)시키기 위해 변경할 수 있다. 하나의 예에서, 표적 서열은 BACON(박테로이데테스-관련 탄수화물-결합) 도메인-인코딩 서열 (예를 들어, 숙주가 박테로이스 숙주인 경우) 또는 엔돌리신-인코딩 서열로 구성된다.
67. 임의의 앞서 기술된 국면에 있어서, CRISPR 어레이는 숙주 세포에서 crRNA의 발현 및 생산을 위한 서열 R1-S1-R1'을 포함하고, (i) R1은 제1 CRISPR 반복이고, R1'은 제2 CRISPR 반복이고, R1 또는 R1'는 선택적이며; (ii) S1은 상기 표적 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 CRISPR 스페이서인, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군, 또는 방법.
68. 제67 실시형태에 있어서, R1 및 R1'이 제2 숙주 세포 종의 CRISPR 어레이의 제1 및 제2 반복 서열 각각과 적어도 95% 동일한, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군 또는 방법.
69. 제67 또는 제68 실시형태에 있어서, R1 및 R1'이 표적 서열의 변형을 위한 상기 숙주 세포의 CRISPR/Cas 시스템과 기능적인, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군, 또는 방법.
70. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 상기 또는 각각의 어레이가 상기 숙주 세포에서 각각의 crRNA와 함께 기능하는 하나 이상의 Cas 뉴클레아제(들)과 조합되어 표적 서열을 변형시키는, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군, 또는 방법. 표적 서열은 프로토스페이서 인접 모티브(PAM) 가까이에 인접한 프로토스페이서 서열을 포함한다.
71. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 상기 또는 각각의 어레이가 상기 숙주 세포에서 각각의 crRNA와 함께 기능하는 하나 이상의 Cas 뉴클레아제(들)를 인코딩하는 핵산 서열(들)과 조합되어 표적 서열을 변형시키는, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군, 또는 방법.
72. 제67 내지 제71 실시형태 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, R1 및 R1'이, 상기 숙주 세포에서 표적을 변형시키기 위해 유형 II Cas9 뉴클레아제(예를 들어, S. 피오게네스, 또는 S. 아우레우스 Cas9)와 기능적이고, 선택적으로, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군, 또는 방법은 추가로 Cas가 상기 Cas9인 제70 또는 제71 실시형태에 따르는, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군, 또는 방법.
73. 제50 내지 제72 실시형태 중 어느 하나의 실시형태의 방법에 의해 수득가능한 박테리아의 생체 외 혼합된 개체군.
74. 치료, 예방, 미용, 인간 또는 인간이 아닌 동물 체중 감소 (예: 미용학적 감소) 또는 영양학적 용도를 위한 인간 또는 인간이 아닌 동물에게 투여하기 위한 조성물로서, 제73 실시형태의 혼합된 개체군을 포함하는 조성물.
75. 제73 실시형태의 혼합된 개체군 또는 제74 실시형태의 조성물을 포함하는 인간 또는 인간이 아닌 동물 소비용 식품 또는 음료.
76. 영양 보충제 또는 프로바이오틱 음료 또는 식품인 제75 실시형태의 식품 또는 음료.
77. 인간 또는 인간이 아닌 동물 또는 식용수 또는 토양에서 박테리아 감염을 치료 또는 예방하기 위한, 제1 내지 제36 및 제63 내지 제72 실시형태 중 어느 하나의 벡터를 포함하는, 항생 조성물.
78. 인간 또는 인간이 아닌 동물에서 장내 박테로이데테스의 비율을 증가(예를 들어, 비만, 당뇨병 또는 GI 염증성 질환을 치료 또는 예방)하기 위한, 제1 내지 제36 및 제63 내지 제72 실시형태 중 어느 하나의 벡터를 포함하는, 프로바이오틱 조성물.
79. 제74, 제77 또는 제78 실시형태에 있어서, 인간 또는 동물에서 장내 박테로이데스 대 페르미쿠테스의 상대적 비를 증가, 예를 들면, 비만, 당뇨병 또는 위장관 증상을 치료 또는 예방하기 위한, 조성물.
80. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 벡터가 어레이로 조작가능한 Cas 뉴클레아제-인코딩 서열을 포함하지 않는, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군 또는 방법. 이는 벡터 내 공간을 절약하는데 유용하다(예를 들어, 숙주 세포 표적화를 위한 보다 큰 어레이 또는 더 많은 어레이를 포함하기 위해서임 - 이것은 다수의 게놈 위치를 표적화하여 본 발명의 어레이에 대한 내성의 진화 가능성을 감소 시키는데 유용하다).
81. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, MGE가 어레이로 조작가능한 Cas 뉴클레아제-인코딩 서열을 포함하지 않는, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군 또는 방법. 이는 MGE 내 공간을 절약하는데 유용하다(예를 들어, 숙주 세포 표적화를 위한 보다 큰 어레이 또는 더 많은 어레이를 포함하기 위해서임 - 이것은 다수의 게놈 위치를 표적화하여 본 발명의 어레이에 대한 내성의 진화 가능성을 감소 시키는데 유용하다). 예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 큰 서열을 포함하는 것을 피할 수 있다.
82. 제80 또는 제81 실시형태에 있어서, 어레이는 제1 및/또는 제2 세포와 동일한 종 또는 균주의 세포에서 발견되는 Cas 엔도뉴클레아제로 작동가능한, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군 또는 방법. 하나의 예에서, 어레이는 숙주 세포 또는 제 3 세포와 동일한 종 또는 균주의 세포에서 발견되는 Cas 엔도뉴클레아제로 작동 가능하다. 이는 벡터 또는 MGE 내 공간을 절약하는데 유용하다(예를 들어, 숙주 세포 표적화를 위한 보다 큰 어레이 또는 더 많은 어레이를 포함하기 위해서임 - 이것은 다수의 게놈 위치를 표적화하여 본 발명의 어레이에 대한 내성의 진화 가능성을 감소 시키는데 유용하다).
83. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 제1 세포 및 제2 세포는 상이한 종의 박테리아 세포이고, 제2 세포는 인간 미생물군 종이며, 제1 세포는 인간 미생물군에서 비병원성 인 종이고, 표적 서열은 제1 세포의 게놈에 포함되지 않으며, MGE는 제1 및 제2 세포에서 작동가능한 oriT를 포함하고, MGE는 제1 세포로부터 제2 세포로의 수평 이동이 가능한, 벡터, 조성물, 식품, 음료 또는 개체군.
하나의 대안에서, 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 캐리어 및 숙주 세포는 상이한 종의 박테리아 세포이며, 숙주 세포는 인간 미생물군 종이며, 캐리어 세포는 인간 미생물군에서 비병원성인 종이며, 표적 서열은 캐리어 세포의 게놈에 포함되지 않고, MGE는 캐리어 및 숙주 세포에서 작동 가능한 oriT를 포함하며, MGE는 캐리어 세포로부터 숙주 세포로의 수평 이동이 가능한, 방법이 제공된다.
84. 제83 실시형태에 있어서, 벡터가 박테리오파지에 포함되고, 박테리오파지가 제1 세포 (캐리어)를 감염시켜 MGE를 제1 (캐리어) 세포에 도입할 수 있는, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군 또는 방법.
85. 제83 또는 제84 실시형태에 있어서, 표적 서열이 제2 (숙주) 세포의 게놈(예를 들어, 게놈의 필수 또는 항생제 내성 유전자에 포함됨)에 포함되는, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군 또는 방법.
86. 제85 실시형태에 있어서, 제2 (숙주) 세포 종은 인간 미생물에서 병원성이고, 표적 서열은 표적 서열의 절단 또는 표적 서열을 포함하는 유전자의 하향 조절에 의해 변형 된, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군 또는 방법. 하나의 예에서, 제2 (숙주) 세포는 제19 실시형태의 특징 (i) 내지 (xiv) 중 어느 하나에 따른 세포이다. 하나의 예에서, 제2 (숙주) 세포는 페르미쿠테스 세포이고, 예를 들어, 벡터가 인간 내 비만을 치료 또는 예방하기 위한 것이다.
87. 제83, 제84 또는 제85 실시형태에 있어서, 제2 (숙주) 세포 종은 인간 미생물에서 비병원성인, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군 또는 방법.
88. 제83 내지 제87 실시형태 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 제2 (숙주) 세포가 박테로이데테스 또는 프레보텔라 세포이고, 선택적으로 MGE는 인간 미생물군의 제2 (숙주) 세포 종에서 페르미쿠테스 종으로의 수평 이동이 가능한, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군 또는 방법. 후자는 예를 들어, 표적 서열이 페르미쿠테스에 포함되지만 제1 (캐리어) 또는 제2 (숙주) 세포가 아닌 경우 인간 내 비만을 치료하거나 예방하는 데 유용하다.
89. 제83 내지 제88 실시형태 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, MGE는 인간 미생물의 제2 (숙주) 세포 종으로부터 제3 박테리아 세포 종으로 수평 이동 가능하고, 제3 세포 종은 인간 미생물에서 병원성이며 표적 서열을 포함하는, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군 또는 방법. 하나의 예에서, 제 1 (캐리어) 및 제 2 (숙주) 세포는 표적 서열을 포함하지 않는다.
90. 제89 실시형태에 있어서, 제3 세포는 제19 항의 특징 (i) 내지 (xiv) 중 어느 하나에 따른 세포인, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군 또는 방법.
91. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, MGE가 어레이의 반복 서열로 작동가능한 Cas 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 갖지 않고, 벡터는 MGE 외 상기 서열(예: Cas9를 인코딩하는 서열)을 포함하는, 벡터, 조성물, 식품, 음료, 개체군 또는 방법.
일반적인 기능 중 일부는 현재 구성에도 적용될 수 있다. 본 명세서의 임의의 다른 구성, 국면, 단락, 예시, 실시형태 또는 컨셉의 임의의 특징은 MGE를 사용하는 본 구성과 결합될 수 있다.
따라서, 본 발명은 단락으로 번호 지어지는 다음 특징을 제공하고, 이들 단락은 인용된 임의의 국면, 또는 제1 내지 제91 실시형태 중 임의의 실시형태, 또는 본 명세서의 임의의 다른 구성에 적용된다.
1. 제44 내지 제50 중 어느 하나의 국면에 있어서, 표적 서열은 숙주 CRISPR/Cas 시스템의 뉴클레오타이드 서열임에 따라, crRNA는 Cas를 표적으로 안내하여 숙주 세포에서 숙주 CRISPR/Cas 시스템을 변형시키는, 벡터.
2. 제1 단락에 있어서, 숙주 CRISPR/Cas 시스템은 유형 I, II 또는 III 시스템이고, 표적 서열은 적어도 하나, 둘 또는 세 개의 추가의 숙주 균주 또는 종에서 상기 유형의 시스템에서 보존된 뉴클레오타이드 서열이며, 추가의 균주 또는 종은 상기 숙주와 상이한, 벡터.
3. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 표적 서열이 스트렙토코커스 종(예를 들어, S. 서모필러스 또는 S. 피오게네스) CRISPR/Cas 시스템 서열과 동일한, 벡터.
4. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 숙주 CRISPR/Cas 시스템의 표적 서열이
i. 제1 반복의 5'-최다의 뉴클레오타이드와 인접하는 CRISPR 어레이 리더 또는 리더 프로모터 서열(및 선택적으로 반복의 5'-최다 뉴클레오타이드를 포함함, 예를 들어, 제1 반복의 5' 말단에서 첫번째 3개 뉴클레오타이드를 포함함);
ii. 제1 반복의 5'에 가까이에 인접한 20 개까지(예를 들어, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 30 또는 32)의 뉴클레오타이드의 서열;
iii. 제1 반복의 5'-최다의 뉴클레오타이드의 인접한 20 개까지(예를 들어, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 30 또는 32)의 뉴클레오타이드의 서열; 또는
iv. 제1 스페이서 반복의 3'에 가까이에 인접한 20 개까지 (예를 들어, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 30 또는 32)의 뉴클레오타이드의 서열(및 선택적으로 서열은 제1 스페이서의 3'-최다 뉴클레오타이드, 예를 들어, 제1 반복의 3' 말단에서 마지막 3개 뉴클레오타이드를 포함함) 포함하는, 벡터.
5. 제1, 제2, 또는 제3 단락에 있어서, 어레이가 핵산 벡터(예를 들어, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드 또는 프로파지)에 포함되고,
i. crRNA는 구조 R-S-R를 포함하거나 또는 구성되며, R은 CRISPR 반복이고, S = CRISPR 스페이서이고, S는 (5'에서 3' 방향으로) V-HR 또는 HR-V를 포함하거나, 또는 V는 벡터의 DNA 서열과 동일한 서열 및 HR은 상기 숙주 세포 CRISPR 어레이의 CRISPR 어레이의 반복의 DNA 서열이며;
ii. HR의 서열은 숙주 CRISPR 어레이에서 V의 서열과 가까이에 인접하고;
iii. crRNA는 숙주 CRISPR 어레이의 스페이서에 혼성화될 수 있어서 Cas를 숙주 세포에 안내하여 세포 내 숙주 CRISPR 어레이를 변형시키기 위한 것이다.
예를 들어, V는 파지 벡터 코트 단백질-인코딩 서열의 서열이다. 이와 관련하여, 헬러(Heler) 외는, 3개의 CRISPR에 독립적인, 박테리오파지-내성인 돌연변이가 파지 흡착(약50 %)에서 뚜렷한 결점을 보이는 박테리아 내성에 대한 연구에서, 대부분이 엔벨롭 내성 돌연변이를 지니고 있음을 발견했다.
6. 제5 단락에 있어서, 제1 crRNA가 벡터에 존재하는 핵산에 혼성화되지 않거나 또는 실질적으로 혼성화되지 않는, 벡터. 예를 들어, 제1 crRNA는 벡터 내 V에 혼성화되지 않거나 숙주 어레이의 스페이서에 혼성화되는 것보다 덜 강하게 혼성화된다. 혼성화 시험은 숙련된 사람에게 일상적이다. 예를 들어, 벡터 DNA를 분리 또는 합성하고 이를 crRNA와 함께 배양함으로써 시험관 내에서 결정할 수 있다. 예를 들어, PCR을 이용한 표준 기술은 혼성화가 발생했는지 여부를 검출하는데 사용될 수 있다(예: 숙주 세포에서 발견될 수 있는 pH 및 온도 조건 하에서 시험됨).
7. 제5 내지 제6 단락에 있어서, V는 벡터 DNA의 1 또는 40 이하(예: 15 이하)의 인접 뉴클레오타이드인, 벡터. 표적 서열에서 발견되는 프로토스페이서에서의 PAM의 5' 가까이에 존재하는 시드 서열은 절단하려는 CRISPR/Cas 시스템의 crRNA 쌍 형성 및 기능에 중요하다. 시드 서열은 PAM의 5' 가까이에 약 15 또는 12 개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다.
8. 임의의 앞서 기술된 국면 또는 단락에 있어서, 어레이는 벡터에 포함되고, 제1 반복 서열, 제1 스페이서 서열 및 제 2 반복 서열을 (5' 에서 3' 방향으로) 포함하고, 스페이서 서열은 숙주 세포에서 표적 서열에 혼성화(예를 들어, 90% 이상의 동일성을 가짐)할 수 있는 서열을 포함하고, 어레이는 숙주 세포에서 반복 및 스페이서의 전사를 위한 프로모터를 추가로 포함하고, 선택적으로 벡터는 숙주 세포에서 기능성 Cas 및/또는 tracrRNA 서열을 인코딩하기 위한 Cas 뉴클레아제-인코딩 서열 및/또는 tracrRNA-인코딩 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 제1 또는 제2 반복에 상보적인 서열을 포함하는, 방법, 어레이, 또는 벡터.
9. 임의의 앞서 기술된 국면 또는 단락에 있어서, CRISPR 어레이는 벡터에 포함되고, 제1 반복 서열, 제1 스페이서 서열 및 제 2 반복 서열을 (5' 에서 3' 방향으로) 포함하고, 스페이서 서열은 숙주 세포에서 표적 서열에 혼성화(예를 들어, 90% 이상의 동일성을 가짐)할 수 있는 서열을 포함하고, 어레이는 숙주 세포에서 반복 및 스페이서의 전사를 위한 프로모터를 추가로 포함하고, 벡터는 숙주 세포에서 tracrRNA 서열을 인코딩하기 위한 Cas 뉴클레아제-인코딩 서열 및/또는 tracrRNA-인코딩 서열을 포함하지 않고, tracrRNA 서열은 제1 또는 제2 반복에 상보적인 서열을 포함하며, HM-CRISPR 어레이는 숙주 세포에서 기능적이어서 선택적으로 숙주 tracrRNA를 사용하여, Cas(예: 내인성 숙주 Cas 뉴클레아제)를 숙주 표적 부위에 안내하는, 방법, 어레이, 또는 벡터.
10. 제8 또는 제9 단락에 있어서, 반복은 숙주 어레이에서의 반복과 동일하고, 본 발명의 CRISPR 어레이는 숙주 CRISPR/Cas 시스템의 Cas 의해 인식되는 PAM(예를 들어, Cas 뉴클레아제, 예를 들어 Cas9)을 포함하지 않는, 방법, 어레이 또는 벡터. Cas 서열을 생략하는 능력은 본 발명의 어레이에서 공간을 확보한다.
"필수 유전자"는 숙주 세포의 성장 또는 세포 생존력을 촉진 또는 유지하기 위해 존재 또는 발현이 요구되는 숙주 내 유전자이다. 내성 유전자는 항-숙주 약물(예: 항생제, 예를 들어, 베타-락탐 항생제)에 대한 전체 또는 부분 내성을 제공하기 위해 존재 또는 발현이 필요한 숙주 내 유전자이다. 독성 유전자는 숙주 세포가 감염할 수 있는 유기체의 감염성을 위해 존재 또는 발현이 요구되는 숙주의 유전자로서, 예를 들어, 숙주는 병원체(예를 들어, 식물, 동물, 인간, 가축, 동물, 식물, 새, 물고기 또는 곤충)이다.
11. 임의의 앞서 기술된 국면 또는 단락에 있어서, CRISPR 어레이가 비-숙주 세포 Cas(예를 들어, 숙주 시스템이 유형 II 또는 III 인 유형 I 시스템 Cas; 숙주 시스템이 유형 I 또는 III인 유형 II 시스템 Cas; 또는 숙주 시스템이 유형 I 또는 II인 유형 III 시스템 Cas)와 조합하거나; 선택적으로 숙주 세포는 비-숙주 Cas의 유형과 동일한 유형의 Cas를 포함하지 않거나 발현하지 않는, 방법, 어레이 또는 벡터. 이는 CRISPR 어레이 자체가 서열(예를 들면 벡터 내 서열) 또는 숙주 내 벡터-인코딩된 Cas를 표적으로 하지 않기 때문에 유용하다.
12. 임의의 앞서 기술된 국면 또는 단락에 있어서, CRISPR 어레이는 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열(예: 어레이와 동일한 핵산)을 인코딩하는 서열과 조합되며, 선택적으로 tracrRNA 서열 및 HM -crRNA는 단일 가이드 RNA(gRNA)에 포함되는, 방법, 어레이 또는 벡터.
13. 임의의 앞서 기술된 국면 또는 단락에 있어서, CRISPR 어레이는 Cas 또는 Cas를 인코딩하는 서열과 조합되어 있고, 선택적으로, 어레이는 숙주 세포 게놈에 통합되고 Cas가 숙주 세포에 내인성이거나 또는 외인성 서열에 의해 인코딩되는, 방법, 어레이 또는 벡터. 하나의 예에서, Cas-인코딩 서열은 숙주로, 예를 들어 파지와 같은 플라스미드 또는 바이러스로부터 도입된 외인성 서열이다.
14. 임의의 앞서 기술된 국면 또는 단락에 있어서, CRISPR 어레이는 플라스미드, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드 또는 프로파지의 뉴클레오타이드 서열로 구성되는, 방법, 어레이 또는 벡터. 파지미드는 포장된 파지이다. 프로파지는 세포 내 숙주 염색체 또는 에피솜에 통합된 파지이다.
15. 임의의 앞서 기술된 국면 또는 단락에 있어서, CRISPR 어레이가 숙주 세포 게놈, 예를 들어 염색체 또는 에피솜 핵산에 통합된, 방법, 어레이 또는 벡터.
하나의 예에서, 어레이는 표적 서열 또는 표적 서열을 포함하는 유전자에 작용하는 전사 또는 번역 활성제에 컨쥬게이트된 사멸 Cas(예: dCas9)와 조합한다. 이는, 예를 들어, (예를 들어 식품, 음료, 약 또는 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 다른 용도에 대해 예를 들어, 숙주가 미생물인 항생제를 인코딩하기 위해 또는 숙주 배양에서 생산을 위해 바람직한 외인성 단백질을 인코딩하기 위해, 예를 들어 숙주 세포 내로 미리 조작된 외인성 유전자 서열과 같은 바람직한 유전자의) 숙주 세포에서 유전자 발현을 스위치 온(switch on)하는 경우에 유용하다.
16. 세포, 예를 들어 미생물을 감염시키기 위한 또는 의학 또는 치과에서의 사용을 위한 임의의 앞서 기술된 국면 또는 단락의 CRISPR 어레이를 포함하는 바이러스(예 : 비리온, 파지, 파지미드 또는 프로파지).
17. 제16 단락에 따른 비리온의 개체군으로서, 제1 및 제2 비리온은 상이한 어레이 리더 또는 프로모터를 포함하고/하거나, 숙주 세포 또는 상이한 숙주 균주에서 상이한 표적 서열을 표적화하기 위한, 개체군.
18. CRISPR 어레이의 콜렉션으로서, 각각의 어레이는 임의의 앞서 기술된 국면 또는 단락에 따르고, 제1 어레이는 crRNA 전사를 위한 제1 프로모터를 포함하고; 제2 어레이는 제1 프로모터와 상이한 crRNA 전사를 위한 제2 프로모터를 포함하고; 각각의 프로모터는 숙주 프로모터와 동일하거나 이의 동족체이며; 선택적으로 제1 또는 프로모터 둘 다는 숙주 Cas(예를 들어, Cas1, 2, 9 또는 Csn2) 프로모터 또는 숙주 CRISPR 어레이 프로모터와 동일한, 콜렉션. 예를 들어, 제1 프로모터는 내인성 Cas 뉴클레아제 프로모터 또는 내인성 Cas1 또는 Cas2 프로모터; 또는 고도로 또는 구조적으로 발현되는 내인성 유전자의 프로모터 또는 숙주 세포의 필수, 독성 또는 내성 유전자이다. 내인성 프로모터를 사용함으로써 숙주가 진화하는 동안 숙주 프로모터를 보존해야 한다는 압력이 가해짐에 따라, 어레이의 하나 이상의 프로모터를 표적화하는 숙주 CRISPR/Cas 방어 시스템의 가능성이 감소된다.
19. 본 발명의 CRISPR 어레이의 콜렉션으로서, 제1 어레이가 하나 이상의 스페이서(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 이상의 스페이서)를 포함하고; 제2 어레이가 하나를 초과하는 스페이서(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 이상의 스페이서)를 포함하며, 제2 어레이의 상기 스페이서는 제1 어레이의 하나 이상의 스페이서와 동일한, 콜렉션. 이는 HM-어레이 스페이서의 상동 재조합에 의한 숙주 내성을 회피하는데 유용하며, 이는 HM-어레이 내의 다수의 스페이서(또는 다수의 어레이에 걸쳐 스페이서를 더 분산시킴)가, 숙주 세포가 스페이서의 일부를 제거하더라도 숙주 세포 내 일부 HM-어레이 스페이서가 남아있는 기회를 증가시키는 것을 입증한다. 결실에 대한 방어는 또한 상이한 어레이에서 스페이서의 동일 카피에 측면에 위치한 다른 반복을 사용함으로써 향상된다. 이에 따라, 본 발명은 다음을 제공한다:
20. 제18 또는 제 19 단락에 있어서, 제1 어레이의 스페이서 (또는 상기 스페이서)는 동일한 제1 반복에 측면에 위치하며; 제2 어레이의 스페이서 (또는 스페이서)는 동일한 제2 반복에 측면에 위치하며, 제1 반복은 제2 반복과 상이한, 콜렉션.
21. 제20 단락에 있어서, 제1 반복이 숙주 세포 CRISPR/Cas 시스템 내 반복과 동일한, 콜렉션.
22. 제20 단락에 있어서, 제1 반복이 숙주 세포 CRISPR/Cas 시스템 내 반복과 상이한, 콜렉션.
23. 제18 내지 제22 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 제1 및 제2 어레이는 동일한 숙주 세포 또는 동일한 벡터(예: 플라스미드, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드 또는 프로파지)에 함유되는, 콜렉션.
24. 제18 내지 제22 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 제1 어레이가 제1 벡터에 함유되고 제2 어레이가 제1 어레이를 함유하지 않는 제2 벡터에 함유되는(예를 들어, 벡터가 플라스미드 또는 비리온(예: 동일한 바이러스 유형) 또는 포장된 파지(예: 동일한 파지 유형)), 콜렉션.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 방법에서 사용된 벡터는 제18 내지 제24 단락 중 어느 하나의 어레이에 포함된 벡터이다.
25. 임의의 앞서 기술된 단락에 따른 어레이, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드, 프로파지, 개체군 또는 콜렉션을 포함하는 숙주 세포.
임의의 일반적인 기능(아래 참조)은 현재 구성에도 적용될 수 있다.
본 발명의 하나의 예는 숙주 적응 및 어레이에 대한 내성의 위험을 감소시키기 위해
숙주 세포의 표적 뉴클레오타이드 서열을 변형시키기 위한 본 발명의 CRISPR 어레이 또는 벡터를 제공하고,
a. 숙주 세포는 표적 서열의 전사를 위한 제1 내인성 프로모터(제1 숙주 프로모터)를 포함하고;
b. CRISPR 어레이는 crRNA를 인코딩하는 서열 및 crRNA의 전사를 위한 제1 프로모터를 포함하고, crRNA는 단일 가이드 RNA(gRNA)에 선택적으로 포함되며 숙주 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시키고;
c. 제1 프로모터의 서열은 제1 숙주 프로모터의 서열과 상이한 제2 내인성 숙주 프로모터의 서열이다.
하나의 예에서, 숙주가 crRNA를 잘 발현할 방식(및 구성적으로, 프로모터가 항상 켜져 있거나 자주 켜져 있어야 하는 숙주 유전자로부터 발생하는 경우)으로 숙주에서 필수 유전자의 프로모터인 각 벡터(예: 파지) CRISPR 단위에 대해 프로모터가 사용된다. 숙주는 프로모터로부터 쉽게 조정할 수 없으므로 쉽게 내성을 얻지 못할 것이다. 선택적으로, 상이한 벡터 CRISPR 단위에 대해 상이한 필수 프로모터를 사용하여 숙주 적응(내성)의 기회를 감소시키는 것이 가능하다. 어레이 (또는 상이한 어레이)에 의해 숙주에서 표적화되는 독성 또는 필수 또는 내성 유전자의 프로모터를 사용할 수 있다. 파지에 대한 내성을 얻기 위해, 숙주는 내인성 유전자 프로모터 및 유전자 표적화 부위(예를 들어, 세포 성장, 생존력 또는 항-숙주 약물(예를 들어, 항생제)에 필수적인 코딩 서열에 존재할 수 있음)를 변형시킬 필요가 있으며, 이에 따라 유전자를 너무 비활성화시킬 위험이 있다.
본 발명에 따라 crRNA를 인코딩하는 핵산 서열의 다중 카피를 제공하고, 카피는 본 발명이 벡터로부터 유용한 표적 스페이서의 숙주 제거(예를 들어, 숙주 세포 상동 재조합에 의한)의 기회를 감소시키는데 유리함에 따라 숙주 세포 서열을 표적하기 위한 동일한 스페이서 서열을 포함한다. 다중 표적 스페이서는 내성을 회피하는 대안적인 방법을 제공하기 위해 본 발명의 동일 또는 다수의 HM-어레이 상에 유연하게 제공될 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 다음 컨셉을 제공한다:
1. 숙주 세포의 표적 뉴클레오타이드 서열을 변형하기 위한 숙주 개질 (HM) CRISPR/Cas 시스템(예를 들어, 유형 I, II, 또는 III)으로서, 상기 시스템은 다음의 (i) 내지 (iv)에 따른 성분:,
(i) Cas 뉴클레아제(예: Cas9)를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열;
(ii) 스페이서 서열(HM-스페이서)과 HM-crRNA(HM-crRNA는 숙주 세포 표적 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하여 상기 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시킴)을 인코딩하는 반복을 포함하는, 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이, 예를 들어, 위에 기재된 임의의 어레이;
(iii) 선택적 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열을 포함하며;
(iv) 시스템의 구성 성분은 crRNA을 인코딩하는 핵산 서열의 2, 3 이상의 카피(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 이상)를 포함하고; 카피는 숙주 세포 서열(예를 들어, 숙주 독성, 내성 또는 필수 유전자 서열 또는 벡터 적응을 매개하는 숙주 CRISPR/Cas 시스템 성분의 서열)을 표적화하기 위한 동일한 스페이서 서열을 포함하는, 숙주 개질 (HM) CRISPR/Cas 시스템.
예를 들어, 시스템은 동일한 스페이서를 포함하는 crRNA를 인코딩하는 핵산 서열의 4 개 이상; 또는 5개 이상의 카피를 포함한다. 이는 숙주 내에서 목적하는 cRNA의 발현을 증가시키는데 유리하다. 또한, 이는 하나 이상의 서열이 표적화될 필요가 있을 때(특히 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 100 이상과 같은 카피가 존재하는 경우) 숙주 내성을 피할 수 있는 더 큰 기회를 제공한다. 상이한 어레이를 통한 카피의 분배(예를 들어, 벡터가 동일한 DNA 가닥 상에 이격되어 있는 벡터를 포함함)는 목적하는 cRNA-인코딩 서열의 절단으로 이어질 수 있는 스페이서 사이 또는 측면에 위치한 반복 사이의 재조합 기회를 감소시키는데 유용하다. 모든 카피를 절단하는 숙주의 가능성은 많은 벡터 어레이에 분산된 카피를 제공함으로써 감소되며 목적하는 스페이서의 많은 카피를 포함함으로써 감소된다(예: 제1 벡터 어레이 내 다수의 카피, 제2 벡터 어레이 내 다수의 카피 - 각각이 목적하는 스페이서의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 또는 100 이상의 카피를 포함하는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 10 이상의 어레이를 포함하는 것이 가능함).
2. 제1 컨셉에 있어서, 시스템의 상기 성분이 동일한 스페이서를 포함하는 crRNA를 인코딩하는 핵산 서열의 카피 중 4, 5, 10, 15 또는 20개 이상을 포함하는, 시스템.
3. 제1 또는 제2 컨셉에 있어서, 카피는 2 개 이상의 핵산 벡터 CRISPR 어레이 사이에서 분할되는, 시스템.
4. 제3 컨셉에 있어서, 시스템이 제1 및 제2 HM-어레이를 포함하고, 제1 및 제2 벡터 CRISPR 어레이가 동일한 숙주 세포 또는 동일한 벡터(예를 들어, 플라스미드, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드 또는 프로파지)에 함유된, 시스템.
5. 제3 또는 제4 컨셉에 있어서, 제1 어레이가 제1 벡터에 함유되고 제2 어레이가 제1 어레이를 함유하지 않는 제2 벡터에 함유되는(예를 들어, 벡터가 플라스미드 또는 비리온(예: 동일한 바이러스 유형) 또는 파지미드(예: 동일한 파지 유형)), 시스템.
6. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 반복이 숙주 CRISPR 어레이에서의 반복과 동일한, 시스템.
7. 제1 내지 제5 컨셉 중의 어느 하나의 컨셉에 있어서, 반복이 숙주 CRISPR 어레이에서의 반복과 동일하지 않은, 시스템.
8. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 따른 시스템, 벡터, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드 또는 프로파지를 포함하는 숙주 세포.
9. 제1 내지 제8 컨셉 중의 어느 하나의 컨셉에 따른 시스템, 벡터, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드 또는 프로파지를 포함하는, 항균 조성물(예를 들어, 약, 소독제 또는 구강 세정제와 같은 항생제).
임의의 일반적인 기능(아래 참조)은 현재 구성에도 적용될 수 있다.
CRISPR/CAS9 분할 시스템
이 구성은 표적 벡터, 예를 들어 외인성 서열을 운반하기 위한 제한된 용량을 갖는 바이러스 또는 파지에서 공간을 확보하는데 유리하다. 공간을 확보함으로써 더 많은 표적 스페이서 또는 어레이를 포함할 수 있으며 이는 숙주 내성을 회피하는데 유용하다. 예를 들어, 내인성 Cas 엔도뉴클레아제를 벡터에서 인코딩하는 것보다 특히 sp 또는 saCas9와 같은 부피가 큰 Cas 서열의 경우 활용하는 것이 유리하다. 또한, 비-숙주 소스로부터의 일부 외인성 Cas에서 볼 수 있는 것과 같은 열등한 호환성의 기회는 존재하지 않는다. 파지 게놈 크기와 같은 바이러스를 감소시키는 능력은 또한 숙주 세포 흡수(숙주 세포에서 바이러스의 감염 및/또는 유지)를 촉진시키는데 유익할 수 있다. 일부 실시예에서, 벡터(예: 파지)에 의한 숙주의 침입은 숙주가 침입하는 핵산에 대항하는 시도에서 숙주 Cas 뉴클레아제의 발현 증가를 포함하여 숙주 CRISPR/Cas 활성을 상향 조절할 수 있다는 것이 장점이다. 그러나, 이러한 점은 숙주 Cas에 의해 인식되는 하나 이상의 반복을 포함하는 경우, 어레이, 벡터, 시스템 및 본 발명의 다른 국면과 함께 사용하기 위한 내인성 Cas를 제공하는 데에도 유용하다. 본 발명이(본 발명의 제1 구성에 따라) 숙주 CRISPR 어레이를 표적으로하는 하나 이상의 스페이서를 포함하는 경우, 이는 숙주 CRISPR 어레이 자체의 비활성화를 촉진하는데, 자체의 CRISPR 시스템을 비활성화시키기 위해 자체 Cas 뉴클레아제를 이용하는 "자살" 숙주 세포와 유사하다.
따라서, 본 발명은 실시예로서 번호매김된 다음과 같은 특징을 제공한다:
1. 숙주 세포의 표적 뉴클레오타이드 서열을 변형하기 위한 숙주 개질 (HM) CRISPR/Cas 시스템(예: 유형 I, II, 또는 III)으로서, 상기 시스템은 다음의 (i) 내지 (iv)에 따른 성분을 포함하며,
(i) Cas 뉴클레아제(예: Cas9)를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열;
(ii) 스페이서 서열(HM-스페이서)과HM-crRNA(HM-crRNA는 숙주 세포 표적 서열에 혼성화하는 서열을 포함하여 상기 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시킴)을 인코딩하는 반복을 포함하는, 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이(예: 위에 기재된 본원의 어레이);
(iii) 선택적 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열;
(iv) 시스템의 상기 성분은 숙주 세포 및 숙주 세포를 형질 전환시키는 적어도 하나의 핵산 벡터 사이에서 분할됨에 따라, HM-crRNA는 Cas를 표적으로 안내하여 숙주 세포 내 표적 서열을 변형시키는, 시스템.
본 명세서에서 "분할"은 벡터가 시스템의 하나 이상(그러나 전부는 아님)의 성분을 포함하고 숙주 세포가 하나 이상(그러나 전부는 아님)의 성분을 포함하고 벡터가 숙주 세포에 포함되지 않은 하나 이상의 성분을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 벡터 및 숙주 세포는 일반적으로 임의의 성분을 공유하지 않으며, 예를 들어 숙주 세포는 성분 (i)을 포함하고 벡터는 성분 (ii)를 포함하고, 벡터는 성분 (iii)을 포함하며/포함하거나 숙주 세포는 성분 (iii)을 포함한다. 벡터가 숙주 세포 내에 존재할 때(예를 들어, 프로파지와 같은 통합 또는 에피솜 벡터로서), 벡터는 숙주 세포(이러한 핵산에 의해 제공되는 시스템의 성분은 이러한 경우 숙주 세포 성분으로 해석되지 않는다)를 형질 전환시킨 벡터에 의해 제공된 핵산으로 의도된다. 이는 형질 전환 된 숙주의 핵산(염색체 및 에피솜 핵산)의 시퀀싱 및 이를 동일한 유형의 비-형질 전환 숙주(예를 들어, 동일한 숙주 부모 콜로니 또는 클론, 예를 들면, 숙주는 미생물, 예를 들어 박테리아 또는 고세균임)로부터의 서열과 비교하여 용이하게 결정할 수 있다.
선택적으로, 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템이다. 선택적으로, (a)의 뉴클레아제는 유형 I Cas 뉴클레아제이다. 선택적으로, (a)의 뉴클레아제는 유형 II Cas 뉴클레아제(예: Cas9)이다. 선택적으로, (a)의 뉴클레아제는 유형 III Cas 뉴클레아제이다.
2. 제1 실시예에 있어서, 성분 중 적어도 하나는 숙주 세포에 내인성인, 시스템.
3. 제1 또는 제2 실시예에 있어서, 성분 (i)는 숙주 세포에 내인성인, 시스템.
4. 제1 내지 제3 실시예 중 어느 하나의 실시예에 있어서, 성분 (iii)는 숙주 세포에 내인성인, 시스템.
5. 숙주 세포의 표적 뉴클레오타이드 서열을 변형하기 위한 숙주 개질 (HM) CRISPR/Cas 시스템(예를 들어, 유형 I, II 또는 III)으로서, 상기 시스템은 다음의 (a) 내지 (e)에 따른 성분을 포함하며,
a. Cas 뉴클레아제(예: Cas9)를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열;
b. 스페이서 서열(HM-스페이서)과 HM-crRNA(HM-crRNA는 숙주 표적 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하여 상기 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내함)을 인코딩하는 반복을 포함하는, 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이;
c. 선택적 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열;
d. 시스템의 상기 성분은 적어도 제1 및 제2 핵산 벡터 사이에서 분할되고, 제1 벡터는 성분 (a)를 포함하지만, 제2 벡터는 성분 (a)가 결핍되어 있고;
e. 벡터는 숙주 세포를 동시에 또는 순차적으로 동시-변형시킬 수 있음에 따라, HM-crRNA는 Cas를 표적으로 안내하여 숙주 세포에서 표적 서열을 변형시킨다.
위에서 제공된 "분할"의 정의는 제1 및 제2 벡터를 포함하는 본 실시예에 대해 준용 적용된다.
하나의 실시형태에서, tracrRNA 서열은 벡터에 의해 제공되지 않지만, 내인성 숙주 세포 CRISPR/Cas 시스템의 tracrRNA 서열이며, tracrRNA는 숙주 세포에서 Cas를 표적으로 안내하기 위해 성숙한 crRNA 내로의 후속 처리를 위해 세포에서 HM-crRNA에 혼성화할 수 있다.
6. 제5 실시예에 있어서, 제1 벡터가 성분 (a)를 포함하고 제2 벡터가 성분 (b) 및 (c)를 포함하는, 시스템.
7. 제5 또는 제6 실시예에 있어서, 제1 및/또는 제2 벡터는 각각 1, 2, 3 이상의 추가 조작된 HM-CRISPR 어레이를 포함하는, 시스템.
8. 제5 내지 제7 실시예 중 어느 하나의 실시예에 있어서, 제1 및 제2 벡터 중 하나는 파지미드이고, 다른 벡터는 헬퍼 파지인, 시스템.
9. 임의의 앞서 기술된 실시예(예, 실시예 3 또는 6)에 있어서, crRNA 서열 및 tracrRNA 서열은 벡터에 의해 제공되는 단일 가이드 RNA(gRNA)에 포함되는, 시스템.
10. 임의의 앞서 기술된 실시예에 있어서, 각각의 벡터는 외인성 핵산의 삽입을 위한 제한된 용량을 갖는, 시스템.
11. 임의의 앞서 기술된 실시예에 있어서, 벡터 또는 벡터(들)은 바이러스(예를 들어, 비리온, 포장된 파지, 파지미드 또는 프로파지)인, 시스템.
12. 임의의 앞서 기술된 실시예에 있어서, 숙주 세포는 관심있는 HM-서열을 인코딩하는 자유 말단 (HM-DNA)을 갖는 디옥시리보핵산 가닥을 포함하고/하거나 시스템은 HM-DNA를 인코딩하는 서열(예를 들어, 벡터 또는 숙주 세포 게놈 또는 이의 에피솜에 통합됨)을 포함하며, HM-DNA는 표적 서열 내 서열(들) 또는 측면에 위치한 서열(들)과 각각 상동인 서열(들)을 포함하는, 시스템.
이러한 가닥은 자유 말단, 즉 숙주 또는 벡터 DNA에 통합되지 않은 말단을 포함하여서 가닥이 1개 또는 2개의 자유말단을 가지게 되어, 즉, DNA는 각각 5' 및/또는 3' 가까이에 이웃 뉴클레오타이드에 결합되지 않는다.
13. 제12 실시예에 있어서, 표적 부위는 Cas(예를 들어, Cas 뉴클레아제가 Cas9 인 경우 Cas9에 의해)에 의해 숙주 세포에서 절단되고, HM-DNA는 HM-DNA를 숙주 게놈(예를 들어, 염색체 또는 에피솜 부위)에 삽입하기 위해 절단부의 측면에 각각 5' 및 3'에 상동인 제1 및 제2 서열을 포함하는, 시스템.
14. 제13 실시예에 있어서, 삽입은 상동 직접 재조합(homologically directed recombination, HDR)에 의해 수행되는, 시스템.
15. 제13 실시예에 있어서, 삽입은 비-상동 말단 부착(non-homologous end joining, NHEJ)에 의해 수행되는, 시스템.
16. 제12 내지 제15 실시예 중 어느 하나의 실시예에 있어서, HM-서열은 조절 요소(예, 프로모터, 예를 들어, 내인성 프로모터를 대체하는 유도성 프로모터), 전사 억제 서열, 전사 증강 서열, 표지 또는 외인성 단백질 또는 도메인을 인코딩하는 서열인, 또는 조절 요소, 전사 억제 서열, 전사 증강 서열, 표지 또는 외인성 단백질 또는 도메인을 인코딩하는, 시스템.
17. 제12 내지 제16 실시예 중 어느 하나의 실시예에 있어서, 시스템은 제1 및 제2 HM-DNA를 포함하고, 제1 HM-DNA의 서열이 제2 DNA의 서열에 상보적임에 따라, DNA가 동종 재조합에 의해 숙주 세포 내에서 결합할 수 있어서 숙주 세포 게놈(예 : 염색체 또는 에피솜 부위)에 삽입을 위해 결합된 HM-DNA를 형성하는, 시스템.
18. 임의의 앞서 기술된 실시예에 있어서, 벡터 또는 벡터가 숙주 세포를 감염시킬 수 있어서 시스템 성분을 포함하는 벡터 핵산을 세포 내로 도입하는, 시스템.
19. 임의의 앞서 기술된 실시예에 있어서, Cas 뉴클레아제는 니카아제인, 시스템.
20. 임의의 앞서 기술된 실시예에 있어서, 세포가 박테리아 또는 고세균이고 Cas 뉴클레아제가 박테리아 또는 고세균의 내인성 유형 II CRISPR/Cas 시스템에 의해 제공되는, 시스템.
21. 임의의 앞서 기술된 실시예에 있어서, 벡터 또는 벡터들이 숙주 세포 내부에 존재하며 선택적으로 숙주 DNA에 통합되는, 시스템.
22. 임의의 앞서 기술된 실시예에 있어서, 벡터 또는 벡터들은 Cas (예: Cas9) 뉴클레아제-인코딩 서열이 결핍되어 있는, 시스템.
23. 내인성 CRISPR/Cas 시스템을 포함하는 미생물 숙주 세포를 감염시키기 위한, 조작된 핵산 바이러스 벡터(예를 들면, 위에 기재된 바와 같은 벡터, 비리온 또는 포장된 파지)로서, 벡터는
(a) 임의의 앞서 기술된 실시예에 따른 CRISPR/Cas 시스템에서 사용하기 위한 다수의 상이한 crRNA를 발현하기 위한 핵산 서열을 포함하며;
(b) Cas 뉴클레아제(예: Cas9)를 인코딩하는 핵산 서열이 결핍되어 있으며, 제1의 상기 crRNA는 상기 숙주 세포에서 제1핵산 서열에 혼성화될 수 있고; 제2의 상기 crRNA는 상기 숙주 세포에서 제2 핵산 서열에 혼성화 될 수 있고, 제2 서열은 제1 서열과 상이하며;
(c) 제1 서열은 항미생물(예: 항생제) 내성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되고, 제2 서열은 항미생물 내성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되며; 선택적으로 이들 유전자는 상이하며;
(d) 제1 서열은 항미생물 내성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되며, 제2 서열은 필수 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되며;
(e) 제1 서열은 필수 유전자(또는 이의 RNA)로 구성되며, 제2 서열은 필수 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되거나; 또는
(f) 제1 서열은 독성 유전자(또는 이의 RNA)로 구성되며, 제2 서열은 필수 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되는, 조작된 핵산 바이러스 벡터.
24. 내인성 CRISPR/Cas 시스템을 포함하는 숙주 세포를 형질 전환시키기 위한, 조작된(숙주 세포 내 벡터로부터 직접 조작되거나 분리되고, 벡터는 숙주를 형질 전환시킨 조작된 벡터로부터 유래되었음) 핵산 벡터로서, 벡터는 선택적으로 위에 기재된 바와 같은 벡터이고,
(a') 임의의 앞서 기술된 실시예에 따른 CRISPR/Cas 시스템에서 사용하기 위한 다수의 상이한 crRNA를 발현하기 위한 핵산 서열을 포함하며;
(b') Cas 뉴클레아제(예: Cas9)를 인코딩하는 핵산 서열이 결핍되어 있으며, 제1의 상기 crRNA는 상기 숙주 세포에서 제1핵산 서열에 혼성화될 수 있고; 제2의 상기 crRNA는 상기 숙주 세포에서 제2 핵산 서열에 혼성화 될 수 있고, 제2 서열은 제1 서열과 상이하며; 제1 및/또는 제2 서열은 다음 서열인 또는 다음 서열:
(c') 반복 DNA 또는 RNA 서열(예를 들어, 반복은 상기 숙주 CRISPR 어레이에서 5'-최다 반복 (제1 반복)임;
(d') tracrRNA 서열 또는 tracrRNA-인코딩 DNA 서열;
(e') CRISPR 어레이 리더 서열;
(f') Cas 유전자 프로모터(예, Cas1, Cas2 또는 Csn2 프로모터);
(g') CRISPR 어레이 리더 프로모터 서열; 또는
(h') Cas-인코딩 DNA 또는 RNA 서열 (예를 들어, Cas가 Cas9, Cas1, Cas2 또는 Csn2임)(예를 들어, 제1의 상기 crRNA는 숙주 Cas1 유전자 서열(또는 이의 RNA 서열)을 표적화할 수 있고, 제2의 상기 crRNA는 숙주 Cas2 유전자 서열(또는 이의 RNA 서열)을 표적화할 수 있음)을 포함하는 숙주 CRISPR/Cas 시스템의 표적 서열인, 조작된 핵산 벡터.
25. 제24 실시예에 있어서, 제1 및/또는 제2 표적 서열은 다음 서열인 또는 다음 서열:
i. 제1 반복의 5'-최다의 뉴클레오타이드와 인접하는 CRISPR 어레이 리더 또는 리더 프로모터 서열(및 선택적으로 반복의 5'-최다 뉴클레오타이드를 포함함, 예를 들어, 제1 반복의 5' 말단에서 첫번째 3개 뉴클레오타이드를 포함함);
ii. 제1 반복의 5'에 가까이에 인접 20 개까지(예를 들어, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 30 또는 32)의 뉴클레오타이드의 서열;
iii. 제1 반복의 5'-최다 뉴클레오타이드의 인접한 20 개까지(예를 들어, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 30 또는 32)의 뉴클레오타이드의 서열;
iv. 제1 스페이서 반복의 3'에 가까이에 인접 20 개까지 (예를 들어, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 30 또는 32)의 뉴클레오타이드의 서열(및 선택적으로 서열은 제1 스페이서의 3'-최다 뉴클레오타이드, 예를 들어, 제1 반복의 3' 말단에서 마지막 3개 뉴클레오타이드를 포함함)을 포함하는 벡터.
26. 제24 또는 제25 실시예에서, 상기 또는 각각의 표적 서열이 서열 번호 1 내지 44 또는 이의 보체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열로 구성되는, 벡터.
27. 제24 내지 제26 중의 어느 하나의 실시예에 있어서, 제1 crRNA는 구조 R-S-R를 포함하거나 또는 구조 R-S-R로 이루어지고, R = CRISPR 반복 및 S = CRISPR 스페이서이고, S는 (5'에서 3' 방향으로) V-HR 또는 HR-V를 포함하거나, 또는 V= 벡터의 DNA 서열과 동일한 서열이고 HR = 숙주 세포 CRISPR/Cas 시스템의 CRISPR 어레이의 반복의 DNA 서열이고, 제1 crRNA는 숙주 CRISPR 어레이의 스페이서에 혼성화할 수 있어서 세포 내 숙주 CRISPR 어레이의 변형을 위해 Cas를 crRNA의 표적으로 안내하는, 벡터.
28. 제27 실시예에 있어서, 제1 crRNA가 벡터에 존재하는 핵산에 실질적으로 혼성화하지 않고, 예를 들어, 제1 crRNA가 벡터에서 V에 혼성화되지 않거나 또는 숙주 어레이의 스페이서에 혼성화되는 것보다 덜 강하게 혼성화되는, 벡터. 이를 결정하는 것에 대한 상기한 내용이 본 예에도 적용된다.
29. 제27 또는 제28 실시예에 있어서, V= 벡터 DNA의 1 또는 40개 이하 (예를 들어, 15개 이하)의 인접 뉴클레오타이드인, 벡터. 예를 들어, V = 벡터 DNA의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 인접 뉴클레오타이드.
30. 제29 실시예에 있어서,
i. 숙주 CRISPR/Cas 시스템은 동족 PAM을 인식할 수 있고;
j. 벡터 DNA는 프로토스페이서 서열의 3' 가까이 존재하는 PAM을 포함하고;
k. V = 프로토스페이서의 1 또는 40개 이하 (예를 들어, 15 개 이하)의 뉴클레오타이드이며;
l. HR = 숙주 CRISPR 어레이의 반복의 인접 서열과 동일한 서열인, 벡터.
31. 제30 실시예에 있어서, 숙주 어레이의 반복의 인접 서열은 숙주 반복의 적어도 50%의 서열(예를 들어, 숙주 반복의 5'-최다 또는 3'-최다 뉴클레오타이드를 포함함)인, 벡터.
32. 제30 또는 제31 실시예에 있어서, V = 1 내지 40개 (예를 들어, 15 개 이하)의 3'-최다 프로토스페이서 인접 뉴클레오타이드이고; 선택적으로, 반복의 상기 인접 서열은 숙주 반복의 5'-최다 뉴클레오타이드를 포함하는, 벡터.
33. 제30 또는 제31 실시예에 있어서, V = 1 내지 40개 (예를 들어, 15 개 이하)의 5'-최다 프로토스페이서 인접 뉴클레오타이드이고; 선택적으로, 반복의 상기 인접 서열은 숙주 반복의 3'-최다 뉴클레오타이드를 포함하는, 벡터.
34. 제27 내지 제33 실시예 중의 어느 하나의 실시예에 있어서, R= 숙주 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식되는 반복인, 벡터. 대안적으로, R = 숙주 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식되지 않는 반복이다. 이 경우, 바람직하게는 벡터는 R에 동족이고, 즉 숙주 세포에서 R로 기능할 수 있는 Cas 뉴클레아제 (및 선택적으로 tracrRNA)의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
35. 제24 내지 제34 실시예 중의 어느 하나의 실시예에 있어서, 제1 서열이 (c') 내지 (h') 중 어느 하나에 따르고, 제2 서열이 숙주 필수 유전자, 독성 유전자 또는 내성 유전자로부터 선택되는, 벡터.
36. 내인성 CRISPR/Cas 시스템을 포함하는 미생물 숙주 세포를 감염시키기 위해 제1 내지 제22 실시예 중 어느 하나의 시스템에서 사용하기 위한 조작된 핵산 바이러스 벡터(예: 비리온 또는 포장된 파지)로서,
a. 벡터는 숙주에서 제1 crRNA를 발현시키기 위한 제1 핵산 서열을 포함하고;
b. 제1 서열은 (5'에서 3' 방향으로) R1a-S1-R1b를 포함하며, 여기서 R1a는 제1 CRISPR 반복이고, R1a는 선택적이며; R1b는 제2 CRISPR 반복이고, S1은 숙주 서열(예를 들어, 제23 또는 제24 실시예에서 인용된 숙주 서열)에 상보적인 CRISPR 스페이서이고, R1a 및 R1b는 숙주 Cas 뉴클레아제(예: 유형 II 뉴클레아제, 예: Cas9임)에 의해 인식되며;
c. 벡터는 (i) (b)의 반복(들)을 인식하는 Cas 뉴클레아제(예: Cas9)를 인코딩하는 핵산 서열 및/또는 (ii) 제1 서열에 인코딩된 crRNA 서열에 상보적인 tracrRNA 서열을 인코딩하는 핵산 서열이 결핍되어 있는, 조작된 핵산 바이러스 벡터.
예를 들어, 벡터는 파지에 포함된 핵산 벡터이다.
37. 제36 실시예에 있어서,
d. 벡터는 숙주에서 제1 crRNA와 상이한 제2 crRNA를 발현하기 위한 제2 핵산 서열을 포함하고;
e. 제2 서열은 (5'에서 3' 방향으로) R2a-S2-R2b를 포함하며, 여기서 R2a는 제1 CRISPR 반복이고, R2a는 선택적이며; R2b는 제2 CRISPR 반복이고, S2는 숙주 서열(예를 들어, 제23 또는 제24 실시예에서 인용된 숙주 서열)에 상보적인 CRISPR 스페이서이고, R2a 및 R2b는 숙주 Cas 뉴클레아제(예: 유형 I 또는 유형 II 뉴클레아제, 예: Cas9임)에 의해 인식되는, 벡터.
이에 따라, 예를 들어, 제1 및 제2 핵산 서열은 동일한 포장된 파지미드, 예를 들면, 동일하거나 상이한 CRISPR 어레이에 포함된다.
38. 제37 실시예에 있어서, 벡터는 (iii) (e)의 반복(들)을 인식하는 Cas 뉴클레아제(예: Cas6)를 인코딩하는 핵산 서열 및/또는 (iv) 제2 서열에 인코딩된 crRNA 서열에 상보적인 tracrRNA 서열을 인코딩하는 핵산 서열이 결핍되어 있는, 벡터.
39. 내인성 CRISPR/Cas 시스템을 포함하는 미생물 숙주 세포를 공-감염시키기 위해 제1 내지 제22 실시예 중 어느 하나의 시스템에서 사용하기 위한 조작된 핵산 바이러스 벡터(예를 들어, 전술한 바와 같은 벡터, 비리온 또는 포장된 파지)의 콜렉션으로서, 콜렉션은 제1 벡터 및 제2 벡터를 포함하고,
f. 제1 벡터는 제36 실시예를 따르고;
g. 제2 벡터는 숙주에서 제1 crRNA와 상이한 제2 crRNA를 발현하기 위한 제2 핵산 서열을 포함하고;
h. 제2 서열은 (5'에서 3' 방향으로) R2a-S2-R2b를 포함하며, 여기서 R2a는 제1 CRISPR 반복이고, R2a는 선택적이며; R2b는 제2 CRISPR 반복이고, S2는 숙주 서열에 상보적인 CRISPR 스페이서이고, R2a 및 R2b는 숙주 Cas 뉴클레아제(예: 유형 I 또는 유형 II 뉴클레아제, 예: Cas6임)에 의해 인식되는, 콜렉션.
예를 들어, 제1 벡터는 제1 포장된 파지미드에 포함되고, 제2 벡터는 제2 포장된 파지미드에 포함된다.
40. 제39 실시예에 있어서, 제2 벡터는 (v) (b)의 반복(들)을 인식하는 Cas 뉴클레아제(예: Cas9)를 인코딩하는 핵산 서열 및/또는 (vi) 제1 서열에 인코딩된 crRNA 서열에 상보적인 tracrRNA 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 콜렉션.
예를 들어, 이 경우 Cas 기능은 내인성 숙주 시스템에 의해 제공된다. 이를 통해 벡터 공간을 절약하고(예: 더 많은 숙주-표적화 HM-어레이 스페이서를 포함하기 위함) 벡터 및 어레이 구성을 단순화한다.
41. 제39 또는 제40 실시예에 있어서, 제2 벡터는 (vii) (h)의 반복(들)을 인식하는 Cas 뉴클레아제(예: Cas6)를 인코딩하는 핵산 서열 및/또는 (viii) 제2 서열에 인코딩된 crRNA 서열에 상보적인 tracrRNA 서열을 인코딩하는 핵산 서열이 결핍되어 있는, 콜렉션.
예를 들어, 이 경우 Cas 기능은 내인성 숙주 시스템에 의해 제공된다.
42. 제39 실시예에 있어서, 제1 및 제 2 벡터 각각은 (ix) (b)의 반복(들)을 인식하는 Cas (예: Cas9)를 인코딩하는 핵산 서열, 및 (x) (h)의 반복(들)을 인식하는 Cas(예 : Cas6)를 인코딩하는 핵산 서열이 결핍되어 있고; 임의적으로 콜렉션은 (b) 및 (h)의 반복(들)을 인식하는 하나 이상의 Cas를 포함하는 숙주 세포에 포함되는, 콜렉션.
43. 제42 실시예에 있어서, (ix) 및/또는 (x)에 따른 핵산 서열을 포함하는 제3 벡터(예: 비리온 또는 파지)를 더 포함하는, 콜렉션.
44. 제39 내지 제43 실시예 중 어느 하나의 실시예에 있어서, 각각의 벡터가 각각의 포장된 비리온 또는 파지미드, 또는 각각의 비리온 또는 파지 핵산에 포함되는, 콜렉션.
45. 제36 내지 제44 실시예 중 어느 하나의 실시예에 있어서, R1a 및 R1b가 동일한 반복 서열을 포함하는, 벡터 또는 콜렉션.
46. 제37 내지 제45 실시예 중 어느 하나의 실시예에 있어서, R2a 및 R2b가 동일한 반복 서열을 포함하는, 벡터 또는 콜렉션.
47. 제37 내지 제46 실시예 중의 어느 하나의 실시예에 있어서, (b)의 반복(들)이 (e)의 반복(들)을 인식하는 Cas 뉴클레아제와는 상이한 Cas 뉴클레아제에 의해 인식되는, 벡터 또는 콜렉션.
48. 제37 내지 제47 실시예 중 어느 하나의 실시예에 있어서, 숙주는 상이한 유형의 CRISPR/Cas 시스템(예를 들어, 유형 I 및 유형 II 시스템; 유형 I 및 유형 III 시스템; 유형 II 및 유형 III 시스템 또는 유형 I, II 및 III 시스템)을 포함하는, 벡터 또는 콜렉션.
49. 제36 내지 제48 실시예 중 어느 하나의 실시예에 있어서, (b)의 반복(들)은 유형 II Cas 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9에 의해 인식되는, 벡터 또는 콜렉션.
50. 제37 내지 제49 실시예 중 어느 하나의 실시예에 있어서, (e)의 반복(들)은 유형 I 또는 III Cas 뉴클레아제, 예를 들어, Cas6에 의해 인식되는, 벡터 또는 콜렉션.
51. 제23 내지 제50 실시예 중 어느 하나의 실시예에 있어서, 벡터는 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드 또는 프로파지인, 벡터 또는 콜렉션.
52. 제23 내지 제51 실시예 중 어느 하나의 실시예에 있어서, 벡터 (들)에 의해 인코딩되는 cRNA로 작동가능한 하나 이상의 Cas를 포함하는 숙주 세포 내부에 존재하는, 벡터 또는 콜렉션.
53. 제23 내지 제52 실시예 중 어느 하나의 실시예에 있어서, Cas9를 포함하는 숙주 세포 내부에 존재하는, 벡터 또는 콜렉션.
54. 제23 내지 제53 실시예 중 어느 하나의 실시예에 있어서, HM-DNA와 조합된,(예를 들어, 벡터, 플라스미드 또는 숙주 세포 게놈 또는 이의 에피솜에 통합된)벡터 또는 콜렉션으로서, HM-DNA는 제12 내지 제17 실시예 중 어느 하나의 실시예에서 기재된 바와 같은, 벡터 또는 콜렉션.
55. 임의의 앞서 기술된 실시예에 잇어서, 다수의 상이한 crRNA를 발현하기 위한 핵산 서열을 포함하는, 시스템, 벡터 또는 콜렉션으로서, crRNA는 숙주 세포에 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 100 개의 DNA 서열을 표적할 수 있는, 시스템, 벡터 또는 콜렉션.
56. 임의의 앞서 기술된 실시예에 있어서, Cas 뉴클레아제 (예: Cas9)는 아니지만 숙주 벡터 적응을 매개하는 Cas 뉴클레아제(또는 이의 RNA의 서열)의 DNA 서열을 표적화할 수 있는 제1 crRNA 또는 제1 crRNA를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고; 선택적으로, 숙주 내에서 내성, 독성 또는 필수 숙주 유전자 (또는 이의 RNA)의 서열을 표적화할 수 있는 제2 crRNA 또는 제2 crRNA를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 시스템, 벡터 또는 콜렉션.
57. 임의의 앞서 기술된 실시예에 있어서, crRNA를 인코딩하는 핵산 서열의 2개, 3개 이상의 카피를 포함하는, 시스템, 벡터 또는 콜렉션으로, 카피는 숙주 세포 서열(예를 들어, 독성, 내성 또는 필수 유전자 서열 또는 벡터 적응을 매개하는 숙주 CRISPR/Cas 시스템 성분의 서열이지만, 위에 기재된 Cas 뉴클레아제가 아님)을 표적화하기 위한 동일한 스페이서 서열을 포함하는, 시스템, 벡터 또는 콜렉션.
58. 제 57 실시예에 있어서, 카피는 2 개 이상의 벡터 CRISPR 어레이 사이에서 분할되는, 시스템, 벡터, 또는 콜렉션.
59. 임의의 앞서 기술된 실시예에 있어서, 벡터 반복은 하나의 또는 상기 숙주 CRISPR 어레이에서의 반복과 동일한(예를 들어, 각 벡터 반복은 숙주 반복과 최소한 95%의 서열 동일성을 가짐), 시스템, 벡터 또는 콜렉션.
60. 제1 내지 제58 실시예 중 어느 하나의 실시예에 있어서, 벡터 반복은 하나의 또는 상기 숙주 CRISPR 어레이의 반복과 동일하지 않은, 시스템, 벡터 또는 콜렉션.
61. 임의의 앞서 기술된 실시예에 있어서, 동일한 숙주 세포 또는 동일한 벡터(예: 플라스미드 또는 바이러스 또는 비리온 또는 파지 또는 프로파지 또는 파지미드)에 함유된 제1 및 제2 벡터 CRISPR 어레이를 포함하는, 시스템, 벡터 또는 콜렉션.
62. 제61 실시예에 있어서,제1 어레이는 제1 벡터에 함유되고, 제2 어레이는 제1 어레이를 함유하지 않는 제2 벡터(예: 벡터는 플라스미드 또는 비리온 (예: 동일한 바이러스 유형) 또는 파지미드(예: 동일한 파지 유형)에 함유되는, 시스템, 벡터 또는 콜렉션.
63. 임의의 앞서 기술된 실시예에 따른 시스템, 벡터, 콜렉션, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드 또는 프로파지를 포함하는 숙주 세포.
64. 제1 내지 제62 실시예 중 어느 하나의 실시예에 따른 시스템, 벡터, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드 또는 프로파지를 포함하는 항균 조성물(예를 들어, 약, 소독제 또는 구강 세정제와 같은 항생제).
미생물을 함께 컨디셔닝(conditioning)하는 공정
본 발명은 공동-진화를 용이하게 하기 위해 숙주 및 바이러스를 함께 컨디셔닝하여 숙주를 바이러스(예: 파지)로 컨디셔닝하고 그 반대의 경우도 마찬가지로 컨디셔닝하는 것을 포함하는 미생물(예: 파지 및/또는 박테리아 개체군)을 생산하는 방법을 제공한다. crRNA 발현 또는 활성의 억제가능한 조절을 사용하여, 본 발명은 목적하는 스페이서 활성을 온 또는 오프로 토글링(toggling)하여 숙주에서 스페이서-안내된 Cas 작용에 의해 부과된 스트레스가 있거나 없이, 예를 들어, 항생제 내성 유전자 표적화가 있거나 없이, 튜닝을 가능하게하는 조절 가능한 방식으로 공동 진화를 의도적으로 조절한다. 이러한 방식으로 박테리아 개체군은 목적하는 유전자의 파지 비활성화가 일어날 수 있는 상황(유제품 또는 식품 생산 배양)에서 사용할 수 있거나; 또는 박테리아를 죽이거나 조절, 예를 들어, 항생 내성을 녹다운하는데 사용되는 파지(phage)를 조정하는데 사용하도록 조정할 수 있다. 이 구성은, 또한 하나의 실시형태에서, 방법이 숙주와 배양하는 동안 어레이의 항생제 내성 비활성화 활성을 의도적으로 하기 때문에, 숙주의 항생 내성 유전자를 표적으로하는 본 발명의 하나 이상의 CRISPR 어레이를 보유하는 바이러스, 예를 들어 파지를 갖는 항생제 내성 박테리아 숙주의 배양을 가능하게한다. 따라서, 내성 박테리아 숙주 개체군을 사용하여 성장을 저해하는 항생제 내성 비활성화 효과없이 파지와 숙주가 공동 진화하여 상호 조정하고 숙주 세포의 능력 (그렇지 않으면 파지 팽창을 최소화 할 수 있음)을 배양하는 반면 여전히 목적하는 파지의 모든 다른 성분을 배양된 숙주 개체군에 조절하는 것을 가능하게 하여 배양물(예를 들어, 산업 배양 컨테이너 또는 식물에서)에서 파지를 성장시킬 수 있다. 생성된 파지 개체군의 시료의 시험은 예를 들어 실험실 규모에서, 항생제 내성 숙주 세포 개체군을 사용하지만 숙주 세포의 항생제 내성 유전자의 어레이 표적화를 위해 시험 파지 발현을 활성화시켜 수행할 수 있다. 원핵 세포 및 파지 환경에서 유전자 발현의 자연 발생 및 합성 억제는 당업자에게 잘 알려져있다(예를 들어, tet 시스템 또는 광 유도성 시스템).
이에 따라, 본 발명은 단락으로서 번호매김된 다음과 같은 특징을 제공한다:
1. 미생물 생산 방법으로서,
(a) 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열 표적화를 위한 숙주 CRISPR/Cas 시스템을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
(b) 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스를 제공하는 단계로서,
(i) 바이러스는 숙주 세포의 표적 뉴클레오타이드 서열을 변형시키기 위한 하나 이상의 조작된 숙주 변형 (HM) CRISPR 어레이(예를 들어, 전술 한 바와 같은 어레이)를 포함하고;
(ii) 제1 HM-어레이는 제1 숙주 표적 서열에 혼성화 될 수 있어서 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시키는 스페이서 서열 (HM- 스페이서)을 포함하는 제 1 HM-crRNA를 인코딩하고, 선택적으로, 제1 표적 서열의 변형이 숙주 세포 성장 또는 생존 가능성을 감소시키며;
(iii) 제1 HM-어레이는 제1 HM-crRNA의 전사에 대해 가역적으로 억제 가능하고/하거나 제1 HM-crRNA 활성은 억제 가능하고;
(c) 숙주 세포를 바이러스로 감염시켜 하나 이상의 HM-CRISPR 어레이를 세포 내로 도입하는 단계;
(d) 세포에서 제1 HM-crRNA의 전사 및/또는 제1 HM-crRNA 활성을 억제하는 단계;
(e) 감염된 숙주 세포를 배양하여 바이러스의 개체군(PV1)을 포함하는 숙주 세포의 개체군 (PH1)을 생성시키는 단계; 및
(f) 바이러스 개체군 PV1 및/또는 배양된 숙주 세포 개체군을 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
하나의 예에서, 제1 HM-crRNA는 제1 숙주 표적 서열에 혼성화될 수 있는 HM- 스페이서를 포함하여 숙주 세포에서 표적으로 Cas를 안내하여 표적 서열을 변형시키고, 표적 서열은 숙주 CRISPR/Cas 시스템의 뉴클레오타이드 서열로서, 제1 HM-crRNA가 표적으로 Cas를 안내하여 숙주 세포 내 숙주 CRISPR/Cas 시스템을 변형시키고, 표적 서열의 변형은 숙주 CRISPR/Cas 시스템의 기능을 감소시키거나 제거한다.
하나의 대안에서, 변형은 숙주에서 유전자의 발현을 증가시키거나 억제한다. 하나의 실시형태에서, 유전자는 필수 유전자, 독성 유전자 또는 내성 유전자(예: 항생제 내성 유전자)이다. 하나의 실시형태에서, 변형은 숙주에 내인성이거나 외인성인 유전자 산물의 발현을 향상시킨다. 하나의 예에서, 숙주는 외인성 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 목적하는 단백질을 생산하기 위함)을 포함하는 조작된 숙주이고, 변형은 숙주 세포에서 목적하는 단백질의 발현을 증진 또는 억제한다. 하나의 예에서, 목적하는 단백질은 항생제이며 숙주 세포는 미생물, 예를 들어 박테리아 또는 고세균이다. 따라서, 방법은 바이러스 개체군을 생산하기 위해 숙주 세포의 배양을 가능하게 하고, 그렇지 않으면 숙주 세포 개체군의 팽창을 방해할 수 있는 항생제가 발현되지 않는다. 이후, 제1 HM-crRNA 억제를 분리후 제거하여 활발한 항생제 바이러스 조성물을 제공할 수 있기 때문에, 분리된 바이러스 개체군의 하나 이상의 바이러스를 숙주 세포 성장 또는 생존력을 감소시키기 위한 항미생물 조성물에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 이러한 방법 및 숙주 세포에서 항생제를 발현할 수 있는 바이러스를 포함하는 항생제 조성물을 제공한다. 발현을 활성화하는 변형은, 예를 들어 전사 활성제에 컨쥬게이트된 Cas(예를 들어, Cas9)를 제공함으로써 수행될 수 있고, 여기서 Cas는 제1 HM-crRNA에 대한 동족체 Cas이며 활성제는 바람직한 외인성 또는 내인성 유전자의 전사를 활성화시킨다. 발현을 억제하는 변형은, 예를 들어 죽은 Cas(예 : dCas9)를 제공함으로써 수행될 수 있고, 여기서 CA는 제 1 HM-crRNA에 대한 동족체 Cas이며, 목적하는 외인성 또는 내인성 유전자의 전사를 억제한다.
crRNA 전사 또는 활성의 억제는 부분적이거나 완전할 수 있다(즉, 숙주의 어레이로부터 crRNA의 활성이 없거나 전사되지 않음). 활성은, 변형을 위해 첫번째 숙주 표적 부위로 Cas를 안내하기 위해 동족 숙주 서열에 혼성화하는 crRNA의 능력을 지칭한다.
하나의 예에서, 바이러스는 세포 내로 도입 될 때 그렇게 억제되지 않으며, 상기 방법은 단계 (d) 바이러스가 화학적, 물리적, 기계적, 자기적, 빛 또는 다른 제제를 사용하여 억제를 야기하여 세포를 감염시킨 후 수행되는 것을 포함한다. 하나의 예에서, 제1 HM-어레이는 제1 HMcrRNA의 전사를 위한 억제가능한 프로모터(HM-프로모터)를 포함하고, 제1 HM-어레이가 세포 내로 도입된 후에 프로모터가 (예를 들어, 억제제, 예를 들어, 화학 물질 또는 단백질을 프로모터에 결합시킴으로써) 억제된다.
다른 예에서, 단계 (c)가 수행되기 전에, 예를 들어, 화학적, 물리적, 기계적, 자기적, 빛 또는 다른 제제를 사용하여 억제를 야기함으로써 바이러스는 억제된다. 하나의 예에서, 제1 HM-어레이는 제1 HMcrRNA의 전사를 위한 억제가능한 프로모터(HM-프로모터)를 포함하고, 제1 HM-어레이가 세포 내로 도입되기 전에 프로모터가 (예를 들어, 억제제, 예를 들어, 화학 물질 또는 단백질을 프로모터에 결합시킴으로써) 억제되고, 이어서 억제된 제1 HM-어레이가 세포 내로 도입된다.
하나의 실시형태에서, 단계 (f)는 PV1을 분리하는 것을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 단계는 PV1 또는 이의 바이러스를 PH1의 숙주 세포로부터 분리하는 것을 포함한다.
2. 제1 단락에 있어서, 단계 (e) 또는 단계 (f) 후에 바이러스 개체군에서 제1 HM-crRNA의 전사 및/또는 제1 HM-crRNA 활성의 발현을 활성화하고, 선택적으로 숙주 세포를 추가로 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
3. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서,
A. (a), (f)의 숙주 세포 또는 제2 단락의 추가 배양된 세포와 선택적으로 동일한 숙주 세포의 개체군(PH2)을 수득하는 단계;
B. 개체군 PV1로부터의 바이러스로 A의 숙주 세포를 감염시키는 단계;
C. 세포에서 제1 HM-crRNA의 전사 및/또는 제1 HM-crRNA 활성을 억제하는 단계;
D. 감염된 숙주 세포를 배양하여 바이러스의 개체군(PV2)을 포함하는 숙주 세포의 개체군 (PH3)을 생성시키는 단계; 및
E. 바이러스 개체군 PV2(또는 이의 바이러스) 및/또는 배양된 숙주 세포 개체군을 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
4. 제3 단락에 있어서, 단계 (D) 또는 단계 (E) 후에 바이러스 개체군에서 제1 HM-crRNA의 전사 및/또는 제1 HM-crRNA 활성의 발현을 활성화하고, 선택적으로 숙주 세포를 추가로 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
5. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 숙주 세포의 추가 숙주 세포 또는 개체군(PH4) 상에 바이러스 개체군 PV1 또는 PV2의 분리된 시료를 시험하는 단계를 포함하며, 선택적으로, 추가의 세포 또는 개체군 PH4가 (a)의 세포와 동일하고, 시험은 추가의 세포 또는 개체군 PH4를 시료의 바이러스로 감염시키는 단계, 임의의 숙주 세포 성장이 일어날 수 있는 기간을 기다리는 단계, 추가 세포 또는 개체군 PH4(예: 세포 성장 또는 생존력)의 소정의 활성이 변형(예: 감소된 숙주 세포 성장 또는 생존력* 감소)되거나 또는 발생되었는지를 결정하는 단계를 포함하고, 세포 또는 세포 내의 바이러스는 상기 기간 동안 제1 HM-crRNA의 전사 및/또는 제1 HM-crRNA 활성의 발현을 활성화하는, 방법.
* 이는 시료의 바이러스가 세포 또는 배지에 놓인 PH4에 추가되는 경우 플라그 형성에 대한 표준 분석을 사용하여 시험할 수 있다.
6. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 모든 숙주 세포는 미생물 세포(예를 들어, 박테리아 또는 고세균 세포)이고, 제1 표적 서열의 변형은 숙주 세포 성장 또는 생존력을 감소시키며, 결정은 항미생물 활성**이 발생하는 것을 결정하는, 방법.
** 이는 표준 플라그 분석을 사용하여 결정할 수 있다.
7. 제5 또는 제6 단락에 있어서, 기간은 적어도 5, 10, 30, 60 또는 120분인, 방법.
8. 제5 내지 제7 단락 중 어느 한 단락에 있어서, (a)의 세포 및 선택적으로 PH1, PH2 및/또는 PH3 세포가 제 1 표적 서열을 포함하지 않는 방법으로서, 추가의 세포 또는 개체군 PH4 세포가 제1 표적 서열을 포함하는, 방법.
9. 제1 내지 제8 단락 중 어느 한 단락에 있어서, (a)의 세포 및 선택적으로 PH1, PH2 및/또는 PH3 세포가 제1 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자를 포함하지 않는 방법으로서, 제1 표적 서열은 이러한 유전자의 표적 서열; 선택적으로, 추가의 세포 또는 개체군 PH4 세포는 상기 유전자를 포함하는, 방법.
10. 제1 내지 제7 단락 중 어느 한 단락에 있어서, (a)의 세포 및 선택적으로 PH1, PH2 및/또는 PH3 세포가 제1 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자를 포함하는 방법으로서, 제1 표적 서열은 이러한 유전자의 표적 서열인, 방법.
11. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 모든 숙주 세포는 미생물 세포(예를 들어, 박테리아 또는 고세균 세포)이고, 제1 표적 서열의 변형은 숙주 세포 성장 또는 생존력을 감소시키며, 항생제에 대한 숙주 세포 내성을 감소시키는, 방법.
12. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 모든 숙주 세포는 인간, 동물(예: 인간이 아닌 동물) 또는 식물의 전염병 병원균인, 방법.
13. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 모든 숙주 세포는 대장균(예: E coli O157:H7 또는 O104: H4), 시겔라(예: 이질균), 살모넬라(예: 타이피 또는 엔테리카, 예: 혈청형 장티푸스, 예: DT 104), 에르비니아, 예르시니아(예: 페스트), 바실러스, 비브리오, 레지오넬라(예: 뉴모필라), 슈도모나스(예: 녹농균), 나이세리아(예: 임질 또는 수막종), 보르데텔라(예: 백일해), 헬리코박터(예: 파일로리), 리스테리아(예: 모노사이토진), 아그로박테리움, 스타필로코커스(예: 아우레우스, 예: MRSA), 스트렙토코커스(예: 피오게네스 또는 서모필러스), 엔테로코커스, 클로스트리디움(예, 디피실 또는 보툴리눔), 코리네박테리움(예: 자살균), 마이코박테리움(예: 투버쿨로시스), 트레포네마, 보렐리아(예: 부르그도르페리), 프란시셀라, 브루셀라, 캄필로박터(예: 제주니), 클렙시엘라(예: 뉴모니에), 프랑키아, 바르토넬라, 리케치아, 쉬와넬라, 세라티아, 엔테로박터, 프로테우스, 프로비덴시아, 브로코트릭스, 비피도박테리움, 브레비박테리움, 프로피오니박테리움, 락토코커스, 락토바실러스, 페디오코커스, 루코노스톡, 비브리오(예: 콜레라, 예를 들어, O139, 또는 불니피쿠스), 해모필러스(예: 인플루엔자), 브루셀라(예: 아보르투스), 프란시셀라, 크산토모나스, 에를리히아(예: 샤펜시스), 클라미디아(예: 뉴모니에), 파라칼라미디아(Parachlamydia), 엔테로코커스(예: 패칼리스 또는 파세임(faceim), 예: 리네졸리드-내성), 오에노코커스 및 아시네토박터(예: 바우마니, 예를 들어, 다중 약 내성)의 종으로부터 선택된 동일한 종인, 방법.
14. 제13 단락에 있어서, 모든 숙주 세포가 스타필로코커스 아우레우스 세포, 예를 들어, 메티실린, 반코마이신 내성 및 테이코플라닌으로부터 선택된 항생제에 내성인, 방법.
15. 제13 단락에 있어서, 모든 숙주 세포가 슈도모나스 에루지노사 세포, 예를 들어 세팔로스포린(예: 세프타지딤), 카바페넴(예: 이미네펨 또는 메로페넴), 플루오로퀴놀론, 아미노글리코시드(예: 겐타마이신 또는 토브라마이신) 및 콜리스틴으로부터 선택된 항생제에 내성인, 방법.
16. 제13 단락에 있어서, 모든 숙주 세포가 클렙시엘라(예: 뉴모니에) 세포, 예를 들어 카바페넴에 내성인, 방법.
17. 제13 단락에 있어서, 모든 숙주 세포가 스트렙토코커스(예를 들어, 뉴모니에 또는 피오게네스) 세포, 예를 들어, 에리스로마이신, 클린다마이신, 베타-락탐, 마크로라이드, 아목시실린, 아지트로마이신 및 페니실린으로부터 선택된 항생제에 대한 내성인, 방법.
18. 제13 단락에 있어서, 모든 숙주 세포가 살모넬라 (예를 들어, 혈청형 타이피) 세포, 예를 들어, 세프리악손, 아지트로마이신 및 시프로플록사신으로부터 선택된 항생제에 내성인, 방법.
19. 제13 단락에 있어서, 모든 숙주 세포가 시겔라 세포, 예를 들어, 시프로플록사신 및 아지트로마이신으로부터 선택된 항생제에 내성인, 방법.
20. 제13 단락에 있어서, 모든 숙주 세포가 마이코박테리움 투버쿨로시스 세포, 예를 들어, 이소니아지드 (INH), 리팜피신 (RMP), 플루오로퀴놀론, 아미카신, 카나마이신 및 카프레오마이신에 대한 내성으로부터 선택된 항생제에 내성인, 방법.
21. 제13 단락에 있어서, 모든 숙주 세포가 엔테로코커스 세포, 예를 들어 반코마이신에 내성인, 방법.
22. 제13 단락에 있어서, 모든 숙주 세포가 장내세균 세포, 예를 들어, 세팔로스포린 및 카바페넴으로부터 선택된 항생제에 내성인, 방법.
23. 제13 단락에 있어서, 모든 숙주 세포가 대장균 세포, 예를 들어 트리메토프림, 이트로푸란토인, 세팔렉신 및 아목시실린으로부터 선택된 항생제에 내성인, 방법.
24. 제13 단락에 있어서, 모든 숙주 세포가 클로스트리디움(예: 디피실) 세포, 예를 들어, 플루오로퀴놀론 항생제 및 카바페넴으로부터 선택된 항생제에 내성인, 방법.
25. 제13 단락에 있어서, 모든 숙주 세포가 임질균 세포, 예를 들어, 세픽심(예를 들어, 구강 세팔로스포린), 세프트리악손(주사용 세팔로스포린), 아지트로마이신 및 테트라사이클린으로부터 선택된 항생제에 내성인, 방법.
26. 제13 단락에 있어서, 모든 숙주 세포가 아시네토박터 바우마니(Acinetoebacter baumannii) 세포, 예를 들어, 베타-락탐, 메로페넴 및 카바페넴으로부터 선택된 항생제에 내성인, 방법.
27. 제13 단락에 있어서, 모든 숙주 세포가 캄필로박터 세포, 예를 들어, 시프로플록사신 및 아지트로마이신으로부터 선택된 항생제에 내성인, 방법.
28. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 숙주 세포가 베타 (β)-락타마제를 생산하는, 방법.
29. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 숙주 세포가 제14 내지 제27 단락 중 어느 한 단락에 기재된 항생제에 내성인, 방법.
30. 제29 단락에 있어서, 제1 표적 서열은 항생제에 대한 숙주 세포 내성을 부여하는 산물을 코딩하는 유전자의 서열인, 방법.
31. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 제1 표적 서열은 항생제 내성 유전자의 서열(즉, 항생제에 대한 숙주 세포 내성, 예를 들면, 메티실린 내성을 부여하기 위함)이고/이거나, 하나 이상 또는 모든 개체군 PH1, 개체군 PH2, 개체군 PH3 및 개체군 PH4이 항생제 또는 상기 항생제(예: 제13 내지 제27 단락 중 어느 하나에 열거된 항생제)에 내성을 갖는, 방법.
32. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 바이러스 개체군 PV1 또는 PV2의 발현을 활성화하는 바이러스는 항균 활성(예를 들어, 바이러스가 파지일 때와 같은 항균 활성)을 가지고; 선택적으로 숙주 세포 또는 세포가 제30 단락에 열거된 제1 표적 서열을 포함하고, 제1 표적의 변형은 항균 활성을 제공하는, 방법.
33. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 제5 단락에 종속적인 경우, PH4의 세포가 항생제(예를 들면, 제13 단락 내지 제 27 단락 중 어느 한 단락에 기재된 항생제)에 내성이고, (a) 및 PH2의 세포가 항생제에 내성인, 방법. 이는 배양과 확장이 항생제 내성 숙주 세포를 다루는 위험(및 이들을 불충분하게 포함하고 약물 제조 공장에서 빠져나오는 위험성)을 갖지 않고 상대적으로 안전하게 수행될 수 있기 때문에 약물 사용을 위한 바이러스 제조를 돕는다. 그럼에도 불구하고, PH4에 대한 시험은 밀폐 실험실 또는 항생제 내성 숙주 균주의 사용을 위해 설정된 다른 시설에서 수행될 수 있다. PH4에 대해 시험할 때, 본 발명의 HM-어레이에 의해 숙주 세포 내에서 내성 유전자의 변형이 가능하도록 제1 HM-crRNA의 발현이 활성화된다.
34. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 숙주 CRISPR/Cas 시스템은 유형 I, II 또는 III 시스템이고, 표적 서열은 (a)의 숙주 세포와 동일한 속의 적어도 하나, 둘 또는 세 개의 추가의 숙주 균주 또는 종에서 상기 유형의 시스템에서 보존된 뉴클레오타이드 서열인, 방법.
35. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 바이러스가 파지 또는 파지미드인, 방법.
36. 제35 단락에 있어서, (b)의 바이러스는 코르티코바이러스과, 시스토바이러스과, 이노바이러스과, 레비 바이러스과, 마이크로바이러스과, 마이오바이러스과, 포도바이러스과, 시포바이러스과, 또는 텍티바이러스과인, 방법.
37. 제35 또는 제36 단락에 있어서, (b)의 바이러스는 자연 발생 파지, 예를 들어, (a)의 세포와 동일한 균주인 세포로부터 유도된 파지인, 방법.
38. 제35, 제36 또는 제37 단락에 있어서, (b)의 파지가 파지 내성 박테리아를 사용하여 선택적 압력을 통해 수득된 돌연변이 파지인, 방법.
39. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, (b)에서, (iv) 하나 이상의 HM-어레이는, 제2 숙주 표적 서열에 혼성화되어 Cas를 숙주 세포 내 제2 표적에 안내하여 표적 서열을 변형시키는 HM-스페이서를 포함하는 제2 HM-crRNA를 인코딩하는 HM-어레이를 포함하고, 제2 표적 서열은 숙주 CRISPR/Cas 시스템의 뉴클레오타이드 서열임에 따라, 제2 HM-crRNA는 제2 표적으로 Cas를 안내하여 숙주 세포에서 숙주 CRISPR/Cas 시스템을 변형시키고, 제2 표적 서열의 변형은 숙주 CRISPR/Cas 시스템의 기능을 감소 시키거나 제거하고; (v) (iv)의 HM-어레이가 제2 숙주 표적 서열에 혼성화될 수 있는 제2 HM-crRNA의 전사를 위해 (a)의 세포에서 활성인, 방법.
하나의 실시형태에 있어서, (ii) 및 (iv)의 HM-어레이는 동일한 HM-어레이이다. 다른 실시형태에 있어서, 이들은 상이한 HM-어레이(예를 들어, 상이한 CRISPR/Cas 유형, 예를 들어, 유형 I 및 II, 또는 유형 II 및 III, 또는 유형 I 및 III의 어레이, 또는 상이한 유형 II어레이)이다.
40. 제39 단락에 있어서, PH1-4 중 어느 하나 또는 모든 세포가 제2 표적 서열을 포함하는, 방법.
41. 제39 또는 제40 단락에 있어서, 제2 표적 서열은 제11 내지 제24 단락 중 어느 한 단락에 기재된 세포의 속 또는 종의 CRISPR/Cas 시스템 서열(예를 들어, S. 서모필러스 또는 S. 피오게네스 또는 S. 아우레우스)과 동일한, 방법.
42. 제39 내지 제41 단락 중 어느 하나의 단락에 있어서, 제2 표적 서열은 서열 번호 : 1 내지 44 또는 이의 보체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열로 구성되는, 방법.
43. 제39 내지 제42 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 제2 표적 서열은,
A. 반복 DNA 또는 RNA 서열(예를 들어, 반복은 숙주 CRISPR 어레이에서 5'-최다 반복 (제1 반복)임);
B. tracrRNA 서열 또는 tracrRNA-인코딩 DNA 서열; CRISPR 어레이 리더 서열;
C. Cas 유전자 프로모터(예: Cas1, Cas2 또는 Csn2 프로모터);
D. CRISPR 어레이 리더 프로모터 서열; 또는
E. Cas-인코딩 DNA 또는 RNA 서열(예를 들어, Cas는 Cas9, Cas1, Cas2 또는 Csn2)을 포함하는 방법.
44. 제39 내지 제43 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 제2 표적 서열은,
F. 제1 반복의 5'-최다 뉴클레오타이드와 인접한 CRISPR 어레이 리더 또는 리더 프로모터 서열 (및 선택적으로 반복의 5'-최다 뉴클레오타이드를 포함함);
G. 제1 반복의5' 가까이에 인접한 20개 이하의 서열;
H. 제1 반복의 5'-최다 뉴클레오타이드의 20개 이하의 인접 뉴클레오타이드의 서열; 또는
I. 제1 스페이서 반복의 3' 가까이에 인접한 20개 이하의 뉴클레오타이드의 서열(및 선택적으로, 서열은 제1 스페이서의 3'-최다 뉴클레오타이드를 포함함)을 포함하는, 방법.
45. 제39 내지 제44 단락 중 어느 하나의 단락에 있어서,
J. 제2 HM-rRNA는 구조 R-S-R를 포함하거나 또는 구성되며, R은 CRISPR 반복이고, S = CRISPR 스페이서이고, S는 (5'에서 3' 방향으로) V-HR 또는 HR-V를 포함하고, V는 (b)의 바이러스의 DNA 서열과 적어도95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열 및 HR은 상기 숙주 세포 CRISPR/Cas 시스템의 CRISPR 반복의 DNA 서열이며;
K. HR의 서열은 숙주 CRISPR/Cas 시스템에서 V의 서열과 가까이에 인접하고;
L. 제2 HM-crRNA는 숙주 CRISPR/Cas 시스템의 스페이서에 혼성화되어 세포 내의 숙주 CRISPR/Cas 시스템의 변형(예, 절단 또는 불활성화)을 위해 Cas를 스페이서로 안내할 수 있는, 방법.
46. 제45 단락에 있어서, V는 바이러스 DNA의 1 또는 40 이하(예: 15 이하)의 인접 뉴클레오타이드인, 방법.
47. 제39 내지 제46 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 제2 HM-crRNA가 (b)의 바이러스의 핵산에 실질적으로 혼성화되지 않는, 방법.
48. 제45 내지 제47 단락 중 어느 하나의 단락에 있어서,
a. 숙주CRISPR/Cas 시스템은 동족 PAM을 인식할 수 있고;
b. (b)의 바이러스의 핵산은 프로토스페이서 서열의 3' 가까이에 위치한 PAM을 포함하고;
c. V는 프로토스페이서의 하나 또는 40 이하 (예를 들어, 15 개 이하)의 뉴클레오타이드이며;
d. HR은 숙주 CRISPR/Cas 시스템의 반복의 인접 서열과 동일한, 방법.
49. 제48 단락에 있어서, 숙주 시스템의 반복의 인접 서열은 숙주 반복의 적어도 50%의 서열(예를 들어, 숙주 반복의 5'- 또는 3'-최다 뉴클레오타이드를 포함함)인, 방법.
50. 제45 또는 제46 단락에 있어서, V는 1 내지 40개(예를 들어, 15 개 이하)의 3'-최다 프로토스페이서 인접 뉴클레오타이드이고; 선택적으로, 반복의 인접 서열은 숙주 반복의 5'-최다 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
51. 제48 또는 제49 단락에 있어서, V는 1 내지 40개(예를 들어, 15 개 이하)의 5'-최다 프로토스페이서 인접 뉴클레오타이드이고; 선택적으로, 반복의 인접 서열은 숙주 반복의 3'-최다 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
52. 제45 내지 51 단락 중 어느 한 단락에 있어서, R = 숙주 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식되는, 방법.
53. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 상기 또는 각각의 HM-CRISPR는 제1 반복 서열, 제1 스페이서 서열 및 제 2 반복 서열을 (5' 에서 3' 방향으로) 포함하고, 스페이서 서열은 숙주 세포에서 각각의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하고, 어레이는 숙주 세포에서 반복 단위 및 스페이서의 전사를 위한 프로모터를 추가로 포함하고, 선택적으로 (b)의 바이러스의 핵산은 숙주 세포에서 기능성 Cas 및/또는 tracrRNA 서열을 인코딩하기 위한 Cas 뉴클레아제-인코딩 서열 및/또는 tracrRNA-인코딩 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 제1 또는 제2 반복에 상보적인 서열을 포함하는, 방법.
54. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 상기 또는 각각의 CRISPR 어레이는 제1 반복 서열, 제1 스페이서 서열 및 제 2 반복 서열을 (5' 에서 3' 방향으로) 포함하고, 스페이서 서열은 숙주 세포에서 각각의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하고, 어레이는 숙주 세포에서 반복 및 스페이서의 전사를 위한 프로모터를 추가로 포함하고, 벡터는 숙주 세포에서 tracrRNA 서열을 인코딩하기 위한 Cas 뉴클레아제-인코딩 서열 및/또는 tracrRNA-인코딩 서열을 포함하지 않고, tracrRNA 서열은 제1 또는 제2 반복에 상보적인 서열을 포함하며, HM-CRISPR 어레이는 숙주 세포에서 기능적이어서 선택적으로 숙주 tracrRNA를 사용하여, Cas(예: 내인성 숙주 Cas 뉴클레아제)를 숙주 표적 부위에 안내하는, 방법.
55. 제53 또는 제54 단락에 있어서, 반복은 숙주 CRISPR/Cas 시스템에서 반복과 동일하고, 상기 또는 각각의 HM-CRISPR 어레이는 숙주 CRISPR/Cas 시스템의 Cas 의해 인식되는 PAM(예를 들어, Cas 뉴클레아제, 예를 들어 Cas9)을 포함하지 않는, 방법.
56. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 상기 또는 각각의 HM-CRISPR 어레이는 HM- 스페이서 (예를 들어, 적어도 2, 3 또는 4 카피)의 하나 이상의 카피를 포함하는, 방법.
57. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 제2 또는 제3 HM-crRNA(추가 HM-crRNA)를 인코딩하는, 방법으로서, 추가 HM-crRNA는 숙주 표적 서열에 혼성화될 수 있어서 숙주 세포 내에서 표적으로 Cas를 유도하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 선택적으로 표적 서열은 숙주 세포의 필수, 독성 또는 내성 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 숙주 세포의 CRISPR/Cas 시스템의 필수 성분의 뉴클레오타이드 서열인, 방법.
58. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 상기 또는 각각의 HM-CRISPR 어레이는 숙주 세포에서 각각의 HM-crRNA를 생산하기 위한 숙주 세포의 내인성 CRISPR 반복 서열과 동일한 CRISPR 반복 서열을 포함하는, 방법.
59. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, (b)의 바이러스가 (a)의 숙주 세포에서 기능적인 Cas (비-숙주 Cas)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고(예를 들어, 비-숙주 Cas는 숙주 시스템이 유형 II 또는 III 인 유형 I 시스템 Cas; 숙주 시스템이 유형 I 또는 III인 유형 II 시스템 Cas; 또는 숙주 시스템이 유형 I 또는 II인 유형 III 시스템 Cas); 선택적으로 숙주 세포는 비-숙주 Cas의 유형과 동일한 유형의 Cas를 포함하지 않거나 발현하지 않는, 방법.
60. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, (b)의 바이러스가 tracrRNA 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 선택적으로 tracrRNA 서열 및 제1 HM-crRNA는 단일 가이드 RNA (gRNA)에 포함되는, 방법.
61. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 상기 또는 각각의 HM-crRNA는 각각의 단일 가이드 RNA (gRNA)에 포함되는, 방법.
62. 임의의 앞서 기술된 단락에 있어서, 제1 HM-어레이는 제1 표적 서열에서 Cas 절단, 제1 표적 서열(또는 제1 표적 서열을 포함하는 유전자)의 활성화, 제1 표적 서열의 녹다운(또는 제1 표적 서열을 포함하는 유전자) 또는 제1 표적 서열의 돌연변이를 야기하도록 작동가능한, 방법.
63. 임의의 앞서 기술된 단락의 방법에 의해 수득가능한 바이러스, 숙주 세포 또는 바이러스 개체군으로서, 개체군은 PV1 또는 PV2와 동일하거나 바이러스가 이러한 개체군으로부터 수득 가능한, 바이러스, 숙주세포 또는 바이러스 개체군.
64. 임의의 앞서 기술된 단락의 방법에 의해 수득가능한 숙주 세포 (예: 박테리아 세포) 개체군으로서, 선택적으로 개체군이 PH1, PH2, PH3 또는 PH4 또는 임의의 앞서 기술된 단락에 기재된 배양된 세포 개체군과 동일한, 숙주 세포 개체군.
65. 제64 단락에 있어서, 개체군이 (b)의 바이러스의 핵산을 포함하지 않거나 또는 (예를 들어, PCR에 결정된 바와 같음) 제1 HM-어레이 또는 제2 HM-어레이를 포함하지 않는, 숙주 세포 개체군.
66. 제63 내지 제65 단락 중의 어느 하나의 단락에 있어서, 의학용 또는 치과 또는 안과용 (예: 유기체에서의 감염을 치료 또는 예방하거나 또는 유기체에서의 감염의 확산을 제한하기 위해)인 바이러스, 숙주 세포 또는 개체군.
67. 식품, 음료, 유제품 또는 미용 용도 (예: 화장용 제품, 예를 들어, 메이크업) 또는 위생 용도(예: 위생 제품, 예를 들어, 비누)를 위한, 제63 내지 제66 단락 중 어느 하나의 단락에 따른 바이러스, 숙주 세포 또는 개체군을 포함하는 조성물.
68. 의학 또는 치과 치료 또는 예방 용도로 제63 내지 제67 단락 중 어느 하나의 단락에 따른 조성물, 바이러스, 숙주 세포 또는 개체군의 용도.
69. 미용 용도 (예: 화장용 제품, 예를 들어, 메이크업) 또는 위생 용도(예: 위생 제품, 예를 들어, 비누)를 위한, 제63 내지 제68 단락 중 어느 하나의 단락에 따른 바이러스, 숙주 세포 또는 개체군의 용도.
70. 제63 내지 제69 단락 중의 어느 하나의 단락에 있어서, 미생물 숙주 세포를 변형(예, 세포 사멸 또는 세포 성장 감소 또는 미생물 세포의 배양)하기 위한 용도, 바이러스, 숙주 세포 또는 개체군.
71. 제1 내지 제63 및 제66 내지 제70 단락 중 어느 하나의 단락에 있어서, 바이러스 또는 개체군 내의 바이러스는 숙주 세포 용해를 위해 홀린(holin) 및/또는 엔도리신을 발현하며, 선택적으로 엔도리신은 파지 phi11, 파지 Twort, 파지 P68, 파지 phiWMY 또는 파지 K 엔도리신 (예: MV-L 엔도리신 또는 P-27/HP 엔도리신)인, 방법, 바이러스 또는 바이러스 개체군.
72. 제1 내지 제63 단락 및 제66 내지 제70단락 중 어느 하나의 단락에 있어서, 바이러스 또는 개체군 내의 바이러스가 숙주 세포 용해를 위해 홀린 및/또는 엔도리신을 발현하지 않는 방법, 바이러스 또는 바이러스 개체군.
73. 제1 내지 제63 및 제66 내지 제70 단락 중 어느 하나의 단락에 있어서, 바이러스(예를 들어, (b)의 바이러스) 또는 각각의 개체군 내 바이러스는 (a)의 숙주 세포에서 기능하는 항균제(예: 베타 락탐 항생제와 같은 항생제(예: 제13 내지 제27 단락 중 어느 하나의 단락에 기재된 항생제)와 조합하는, 방법, 바이러스, 또는 바이러스 개체군.
부식, 바이오필름 및 바이오파울링의 제어
본 발명은 산업용 또는 가정용 시스템에서 기판 또는 유체의 미생물학적으로 영향을 받는 부식 (MIC) 또는 바이오파울링을 제어하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 방법에서 사용하기 위한 처리된 유체 및 벡터에 관한 것이다.
부식은 금속(예: 강철 또는 철), 플라스틱 및 석재와 같은 물질이 저하되는 일련의 화학적, 물리적 및 (미시적) 생물학적 과정의 결과이다. 이는 사회와 경제적으로 큰 영향을 가져오는 전 세계적인 문제이다. 화학적으로 생산된 제품을 기반으로 한 현재의 부식 방지 전략은 엄격한 환경 규제에 대한 압력이 커지고 있다. 또한, 이들은 오히려 비효율적이며 사용된 제제에 대한 미생물(예: 박테리아) 내성에 의해 방해 받을 수 있다. 따라서, 환경 친화적이고 지속 가능한 부식 제어 전략이 절실히 필요하다. 부식은 여러 가지 미생물이 서로 다른 전기 화학 반응을 수행하고 2차 효과를 가질 수 있는 단백질과 대사 물질을 분비하는 복잡한 과정의 영향을 받는다.
미생물 부식 과정의 심각성은 콘크리트, 아스팔트 및 고분자와 같은 스테인레스 강, 니켈 및 알루미늄 기반 합금 및 재료와 같은 산업적으로 또는 국내에서 사용되는 많은 금속 및 합금이 미생물에 의해 쉽게 분해된다는 사실로부터 분명해진다. 보호 코팅제, 억제제, 오일 및 유제는 또한 미생물 분해에 영향을 받는다.
미생물학적으로 영향을 받는 부식(MIC)은 탄화수소 생산 및 처리 장비, 배수 시스템, 선박, 철도 차량 및 기타 유형의 금속 및 비금속 산업 및 가정용 시스템에 영향을 주는, 비싼 가격이 요구되는 문제이다. 특히, MIC는 생산, 차량운송 및 저장 시스템을 포함한 탄화수소 연료 기반 시설에 심각한 피해를 입히는 것으로 알려져 있으며, 종종 치명적인 환경 오염 결과를 초래한다. 석유 산업에서 파이프 부식의 약40 %는 미생물학적 부식으로 인한 것이며, 매년 석유 생산, 차량운송 및 저장에 막대한 재정적 손실을 초래한다. 파이프 바이오 필름은 벽에 묻히는 과정으로 인해 장비의 유체 속도를 저하시킬 수 있다. 또한, 파이프 누수는 부식으로 인해 발생하고 이에 따라 환경 및 생산성에 영향을 미친다.
MIC는 토양, 담수 및 해수와 같은 환경에서 발생하며 모든 부식 손상의 30%를 초과하여 담당하는 것으로 추정된다. MIC는 박테리아와 같은 미생물의 고정, 대사 산물의 방출 및 빈번하게는 부식 과정을 유도하거나 촉진시키는 바이오필름의 형성으로 인해 발생한다. 부식 과정과 관련된 박테리아 그룹은 다음을 포함한다: 황- 또는 황산염-환원 박테리아 (SRB), 세포 외 고분자 물질 생산 박테리아 (EPSB), 산-생산 박테리아 (APB), 황- 또는 황화물-산화 박테리아 (SOB); 철- 또는 망간-산화 박테리아 (IOB), 암모니아 생산 박테리아 (AmPB) 및 아세테이트 생산 박테리아 (AcPB). 작은 하위 단위 리보솜 RNA 유전자 파이로시퀀싱 설문 조사는, 아세트산 생산 박테리아(아세토박터 종 및 글루콘아세토박터 종)는 연료 등급의 에탄올과 물에 노출된 환경에서 만연한 것으로 나타났다.
환경 조건 하에서의 미생물 성장은 직접 또는 간접적으로 전기 화학 반응에 영향을 미친다. 미생물-기판 상호 작용은 초기 접착 및 바이오필름 형성을 유도한다. 기판에 박테리아와 같은 미생물의 부착, 대사 산물의 방출 및 바이오필름의 형성은 기판 표면의 전기 화학적 조건에 영향을 주어 부식 과정을 유도하거나 가속시켜 MIC의 과정을 조정한다. 금속 기판 상에 박테리아 바이오필름을 형성하는 단계는 다음 단계를 포함한다: I - 금속 표면의 하중 분포를 변형시키고 박테리아의 영양 공급원으로 작용하여 액체에 존재하는 자유 부유 미생물의 부착을 촉진하는, 금속 위에 유기 및 무기 분자의 흡착을 통한 막의 형성 단계; II - 미세집락을 형성하는 호기성 박테리아의 부착 및 증식 단계; III - 일부 고정 박테리아에 의한 세포 외 고분자 물질(EPS)의 생산 단계; IV - 엄격한 혐기성 박테리아가 요구하는 대로 바이오필름에서 국소 혐기성 환경을 만들고 호흡에 의해 산소를 소비하는 호기성 자유-부유 미생물 세포에 의한 정착 단계; 및 V - 외부 층의 쉐딩(shedding)을 촉진하는 바이오필름 두께의 증가 단계. 바이오필름에 부착된 박테리아에 의해 생산된 EPS는 성장을 위해 필수 이온을 포획하고; 영양소 공급 가능성이 낮은 경우 영양 공급원 역할을 하는 것 외에도 차별 통기 영역의 생성을 선호하여 부식 기전을 방해하는 살생물제로부터 박테리아를 부착하고 보호하는 수단으로 사용된다. 차별 통기에 의한 부식 과정은 통기된 영역(바이오필름을 둘러싸는)과 비-통기성 영역(바이오필름 아래)이 있는 금속 기판에 바이오필름의 고르지 못한 분포로 인해 발생한다. 금속 표면의 바이오필름 형성은 산소 함량을 감소시켜 거의 전체 혐기성 수준에 도달하게된다. 슈도모나스는 주요한 EPS 생산자 종이다.
부식성 박테리아가 매개하는 MIC 생체 부식 과정의 예는 다음과 같다: (A) 담수, 해수, 산업용/가정용 시스템 또는 저장 탱크의 호기성 부식성 박테리아는 표면에 컨디셔닝 필름을 가진 산업용 시스템 또는 가정용 시스템의 장비와 파이프 라인에 도달한다. (B) EPS-생산 박테리아는 장비/파이프 라인 벽에 부착되어 EPS를 생성하며, 이는 다른 미생물에 의한 접착에 유리한 환경을 생성한다. (C) 다른 그룹의 부식성 박테리아가 파이프 라인 벽에 부착되어 대사물을 방출하여 세포 분열을 통해 미세결장으로 발전하여 가용 산소를 소비한다. 철 산화 박테리아의 작용으로 철 침전량이 크게 축적되어 장비/파이프 라인이 막히고; 황-산화 박테리아에 의해 방출되는 황산은 환경의 산성화를 촉진한다. (D) 산-생산 박테리아에 의해 방출되는 낮은 산소 농도와 유기산은 황화수소 (H2S)를 생성하는 황산염-환원 박테리아의 부착과 발달을 촉진하여 부식 과정을 가속화시키고 국부적인 pH를 감소시킨다. (E) 부식된 장비/파이프 라인 결과, 미세 누설이 있고 박테리아 바이오필름을 함유한 철 침전물에 의해 부분적으로 차단된다. H2S는 영향을 받는 시스템을 운영하는 직원에게 심각한 건강상의 위험을 초래한다. 또한, 두꺼운 바이오필름 및 슬러지의 생산은 바이오파울링(biofouling) 및 시스템 기능의 방해를 초래한다.
유사하게, 박테리아 개체군은 물 저수지 또는 저장소(예: 식수 또는 냉각 시스템의 물)와 같은 유체에서 전염될 수 있으며 이로 인해 유체의 바이오파울링을 매개 할 수 있다. 이는 유체의 산패(souring)라고도 지칭할 수 있다. 하나의 예는 수로 또는 음용수 저장소 산패이다.
본 발명은 다음의 제1 국면 이하를 제공함으로써 MIC 및 바이오파울링의 문제를 다룬다:
1. 산업용 또는 가정용 시스템에서 기판의 미생물학적으로 영향을 받는 부식(MIC) 또는 바이오파울링(biofouling)을 제어하는 방법으로서, 기판의 표면은 기판의 MIC 또는 바이오파울링을 매개하는 제1 미생물 종의 제1 숙주 세포 개체군과 접촉하고, 방법은
(i) 세포를 형질 전환 또는 형질 도입할 수 있는 다수의 벡터와 개체군을 접촉시키는 단계로서, 각각의 벡터는 CRISPR 어레이를 포함함으로써, CRISPR 어레이가 숙주 세포 내로 도입되고,
(a) 각 CRISPR 어레이는 crRNA의 발현을 위한 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 및 숙주 세포 내 서열(들)의 전사를 위한 프로모터를 포함하고;
(b) 각 crRNA는 숙주 세포의 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 Cas (예: Cas 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)를 숙주 세포에 안내하여 표적 서열을 변형(예를 들어, 표적 서열 절단)시키고; 표적 서열은 숙주 세포 생존력을 매개하는 유전자 서열이며;
(ii) 숙주 세포 내 Cas의 존재하에 상기 cRNA의 발현을 가능하게함으로써 숙주 세포에서 표적 서열을 변형시켜 숙주 세포 생존력의 감소 및 기판의 MIC 또는 바이오파울링을 제어하는 단계를 포함하는, 방법.
하나의 예에서, 시스템은 장비(예를 들어, 산업 공정에서 사용하기 위함)를 포함하고, 표면은 상기 장비의 표면이다. 하나의 예에서, 각각의 어레이는 조작된 어레이, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 임의의 조작된 어레이이다. 하나의 실시형태에서, 벡터는 본원에 기재된 바와 같이 조작된 CRISPR 핵산 벡터이다. 하나의 예에서, 바이오파울링은 미생물 바이오필름 및/또는 슬러지 형성, 증식 또는 유지를 포함한다. 하나의 예에서, 제1 숙주 세포가 정착한다. 제1 또는 제4 국면(아래)의 예에서, "제어"는 MIC 또는 바이오파울링을 방지, 감소 또는 제거하거나 시스템에서의 MIC 또는 바이오파울링의 확산을 감소시키는 것을 포함한다. 박테리아가 MIC 또는 바이오파울링을 매개하는 방법의 비-제한적 예가 위에 기술되어 있다. 세포 성장 또는 증식 또는 유지는 예를 들어 세포 생존력의 특성이다. 따라서, 하나의 예에서 상기 방법은 숙주 세포의 증식 및/또는 유지를 감소시킨다. 하나의 예에서, 이러한 방법은 숙주 세포를 죽인다.
2. 제1 국면에 있어서, 숙주 세포는 기판과 접촉하는 미생물 바이오필름에 포함되는, 방법.
3. 임의의 앞서 기술된 국면에 있어서, 표면 및 숙주 세포가 수성 액체(예를 들어, 해수, 담수, 저장수 또는 음용수)와 같은 유체와 접촉하는, 방법.
담수는 빙상, 빙관, 빙하, 빙산, 습지, 연못, 호수, 강 및 하천, 및 대수층 및 지하류의 지하수와 같은 지하에서 지구 표면에 자연적으로 발생하는 물이다. 담수는 일반적으로 낮은 농도의 용해된 염 및 기타 용해된 총 고형물을 갖는 것을 특징으로 한다. 용어는 특히 찰리비트 스프링(chalybeate spring)과 같은 미네랄이 풍부한 물을 포함하고 있지만 해수와 기수를 제외한다. 하나이 예에서, 상기 담수는 이들 담수 유형 중 하나이다. 식수는 인간 또는 동물 (예 : 가축)의 소비를 위한 물이다. 하나의 예에서, 유체는 시스템이 냉각 시스템인 산업용 냉각수; 시스템이 하수 처리 또는 저장 시스템인 하수; 시스템이 음용수 처리, 저장, 차량운송 또는 전달 시스템인 음료수; 시스템이 종이 제조 또는 처리 시스템인 제지 용수; 시스템이 수영장 또는 수영장 물 처리 또는 저장 시스템인 수영장 물; 시스템이 소화시스템인 소화기 물; 또는 파이프, 탱크, 구덩이, 연못 또는 채널의 산업 공정수로부터 선택된다.
4. 산업용 시스템 또는 가정용 시스템에서 유체의 미생물 바이오파울링을 제어하는(예를 들어, 저장조 또는 컨테이너 내의 액체의 박테리아성 산패를 제어하기 위한) 방법이 제공되며, 유체는 바이오파울링을 매개하는 제1 미생물 종의 제1 숙주 세포의 개체군을 포함하고, 방법은 (i) 세포를 형질 전환 또는 형질 도입할 수 있는 다수의 벡터와 개체군을 접촉시키는 단계로서, 각각의 벡터는 CRISPR 어레이를 포함함으로써, CRISPR 어레이가 숙주 세포 내로 도입되고,
(a) 각 CRISPR 어레이는 crRNA의 발현을 위한 하나 이상의 서열 및 숙주 세포에서 서열(들)의 전사를 위한 프로모터를 포함하며;
(b) 각각의 crRNA는 숙주 세포의 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 숙주 세포에서 Cas(예: Cas 뉴클레아제)를 안내하여 표적 서열을 변형(예를 들어, 표적 서열 절단)시키고; 표적 서열은 숙주 세포 생존력을 매개하는 유전자 서열이고;
숙주 세포 내 Cas의 존재하에 상기 cRNA의 발현을 가능하게함으로써 숙주 세포에서 표적 서열을 변형시켜 숙주 세포 생존력의 감소 및 바이오파울링을 제어하게 되는 단계를 포함한다.
하나의 예에서, 유체는 액체이다. 하나의 예에서, 유체는 기체 유체이다.
시스템: 임의의 국면에 대한 하나의 예시 시스템은 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된다:
석유 화학 재생, 가공, 저장 또는 차량운송 시스템; 탄화수소 회수, 처리, 저장 또는 운송 시스템; 원유 회수, 가공, 저장 또는 차량운송 시스템; 천연 가스 회수, 가공, 저장 또는 차량운송 시스템 (예: 유정, 석유 굴착 장치, 석유 시추 장비, 석유 펌프 시스템, 석유 파이프 라인, 가스 장비, 가스 추출 장비, 가스 펌핑 장비, 가스 파이프 라인, 유조선, 가스 유조선, 기름 저장 장비 또는 가스 저장 장비); 수처리 또는 저장 장비; 물 저장고(예: 음료수 저장통); 냉각제 튜브, 응축기 또는 열교환기와 같은 공기 또는 물 조절 장치(예: 냉각 또는 가열) 장비; 의료 또는 수술 장비; 환경(예: 토양, 수로 또는 대기)처리 장비; 종이 제조 또는 재활용 장비; 발전소, 예: 열 또는 원자력 발전소; 연료(예: 석유, 디젤 또는 LPG와 같은 탄화수소 연료) 저장 장치; 광업 또는 야금, 광물 또는 연료 회수 시스템(예: 광산 또는 광산 장비); 공학 시스템; 해상운송 장비; 화물 또는 물품 보관 장비(예:화물 컨테이너); 식품 또는 음료 제조, 가공 또는 포장 장비; 청소 장비(예: 세탁 장비, 예를 들어, 세탁기 또는 식기 세척기); 케이터링(예: 가정용 또는 상업용 취사) 장비; 농업 장비; 건설(예: 건물, 시설 인프라 또는 도로 건설) 장비; 항공 장비; 항공수송 장비; 차량운송 장비(예: 자동차, 예를 들어, 자동차, 트럭 또는 밴), 철도 차량, 항공기(예: 비행기) 또는 해상 또는 수로 운송 수단 (예 : 보트 또는 선박, 잠수함 또는 호버 크래프트); 포장 장비(예: 소비재 포장 장비); 식품 또는 음료 포장 장비; 전자 제품(예: 컴퓨터 또는 휴대폰 또는 전자 부품); 또는 전자 제품 제조 또는 포장 장비; 치과 장비; 산업용 또는 가정용 배관(예: 해저 파이프) 또는 저장 컨테이너(예: 물 탱크 또는 연료 탱크(예: 자동차의 가솔린 탱크와 같은 가솔린 탱크)); 지하 장비; 건물 (예: 주거지 또는 사무실 또는 상업 구내 또는 공장 또는 발전소); 도로; 다리; 농업 기계; 공장 시스템; 원유 또는 천연 가스 탐사 장비; 사무실 시스템; 및 가정용 시스템.
하나의 예에서, 시스템은 농업, 석유 또는 석유 산업, 식품 또는 음료 산업, 의류 산업, 포장 산업, 전자 산업, 컴퓨터 산업, 환경 산업, 화학 산업, 항공 우주 산업, 자동차 산업, 생명 공학 산업, 의료 산업, 건강관리 산업, 치과 산업, 에너지 산업, 소비재 산업, 제약 산업, 광업, 청소 산업, 임업 산업, 어업 산업, 레저 산업, 재활용 산업, 화장품 산업, 플라스틱 산업, 펄프 또는 제지 산업, 섬유 산업, 의류 산업, 가죽 또는 스웨이드 또는 동물 가죽 산업, 담배 산업 및 철강 산업으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 산업 또는 비즈니스에서 사용된다. 하나의 예에서, 처리될 표면 또는 유체는 선택된 산업에서 사용되는 장비의 표면 또는 유체이다. 하나의 예에서 시스템은 원유 산업에서 사용된다. 하나의 예에서 시스템은 천연 가스 산업에서 사용된다. 하나의 예에서 시스템은 석유 산업에서 사용된다. 하나의 예에서, 시스템은 해상 컨테이너, 플랫폼 또는 장비(예: 해상 또는 해상에서 사용하는 석유 또는 가스 플랫폼 또는 장비), 선박 또는 보트이다. 하나의 예에서, 이러한 시스템은 바다에 정박되어 있고; 예를 들면, 바다에 임시 정박되어 있지 않으며, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24개월 이상 (예: 연속 월) 동안 정박해있다. 하나의 예에서, 이러한 시스템은 국가 또는 주(state)의 물에 존재하고; 예를 들면, 이러한 물 중 바다에 비-임시적으로 존재하고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24개월 이상(예: 연속 월) 동안 국가의 물에 존재한다.
하나의 예에서, 처리될 기판 표면은 스테인레스 스틸, 카본 스틸, 구리, 니켈, 황동, 알루미늄, 콘크리트, 플라스틱 또는 목재를 포함한다. 하나의 예에서, 기판은 금속 용접 또는 결합이다. 하나의 예에서, 표면은 금속(예: 강철 또는 철) 또는 비금속(예: 플라스틱, 콘크리트, 아스팔트, 목재, 고무 또는 석재) 표면이다. 하나의 예에서, 금속은 합금(예: 스테인레스 스틸, 황동 또는 니켈, 아연, 구리, 니켈 또는 알루미늄 합금)이다. 하나의 예에서, 표면은 인조로된 고분자 표면이다. 하나의 예에서, 표면은 기판 코팅이다. 하나의 예에서, 기판은 토양, 담수 또는 해수와 접촉한다.
하나의 예에서, 유체는 음용수; 수로; 기수; 또는 액체 연료, 예를 들면, 가솔린 또는 디젤(예: 자동차 또는 전동 차량 경우), LPG, 등유, 알코올(예: 에탄올, 메탄올 또는 부탄올), 액체 수소 또는 액체 암모니아이고, 하나의 예에서, 연료는 저장된 액체 연료이다. 하나의 예에서, 유체는 오일 또는 비 수성 액체이다. 하나의 예에서, 유체는 수로 또는 물줄기에 포함된 액체이고, 예를 들어, 해수, 담수, 식수, 강, 시내, 연못, 호수, 저수지, 저장수 (예: 저수조 또는 냉각 장치), 지하수, 우물물, 암석의 물, 토양 수 또는 빗물이다. 하나의 예에서, 액체는 해수이다. 하나의 예에서 기판은 이 단락에서 기재된 액체와 접촉한다. 하나의 예에서, 유체 또는 액체는 오일, 수용액, 유압 파쇄 유체, 연료, 이산화탄소, 천연 가스, 오일/물 혼합물, 연료/물 혼합물, 염을 함유하는 물, 바닷물 또는 해수, 기수, 담수, 호수, 강, 하천, 습지, 연못, 습지의 공급원, 눈이나 얼음이 해빙된 유출수, 샘물, 지하수, 대수층, 강수, 상온(예: 실온)에서 액체이고, 소수성이지만 유기 용제에 용해되는 물질, 헥산, 벤젠, 톨루엔, 클로로포름, 디에틸 에테르, 식물유, 석유 화학 오일, 원유, 정제된 석유 화학 제품, 휘발성 에센셜 오일, 화석 연료, 가솔린, 탄화수소 혼합물, 제트 연료, 로켓 연료, 바이오 연료로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 예에서, 유체는 오일/물 혼합물이다.
본 명세서에 기재된 "미생물학적으로 영향을 받는 부식" 또는 "MIC"라는 용어는 달리 명시되지 않는 한, 미생물 개체군 중 적어도 한 구성원, 예를 들면, 박테리아 또는 고세균 개체군의 작용으로 시스템의 임의의 요소(기판)이 구조적으로 손상되는 과정을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 용어 "바이오파울링"은 달리 명시되지 않는 한, 미생물(예를 들면, 박테리아 및/또는 고세균)이 유체(예를 들면, 물 또는 수성 액체, 또는 탄화수소 또는 석유화학)가 접촉하여 기판 표면 상에 축적되는 과정을 지칭한다. 또한 유체(예: 물 또는 수성 액체 또는 탄화수소 또는 석유 화학 제품) 내 미생물 (예: 박테리아 및/또는 고세균)의 바람직하지 않은 누적 및 증식, 즉 유체의 "산패"가 포함된다. 하나의 예에서, 박테리아는 배나 보트의 밸러스트 수에 포함되며, 박테리아는 환경적으로 바람직하지 않다. 본 명세서에 사용된 용어 "기판"은 세포가 부착 될 수 있고 바이오필름이 형성 또는 성장될 수 있거나 바이오파울링(예를 들어, 슬라임 또는 슬러지 형성)이 발생할 수 있는 임의의 유형의 표면을 지칭한다. 기판은 석유 화학 제품, 연료, 원유 또는 가스 배관 시스템의 장비 표면과 같은 "산업용" 기판, 또는 부엌 카운터 또는 샤워 기판 또는 정원 기판과 같은 "비-산업용" 기판 (예: 국내용, 예를 들어, 가정용 또는 사무용)일 수 있다.
임의의 국면의 대안에서, 숙주 박테리아 세포의 개체군 대신에, 개체군은 제 1 종의 고세균 세포의 개체군이다.
5. 제4 국면에 있어서, 유체는 수성 액체(예를 들어, 해수, 담수, 저장수 또는 음용수)인, 방법.
6. 제3 내지 제5 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 방법은 벡터와 유체를 혼합함으로써, 숙주 세포를 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법. 예를 들어, 벡터는 액체(선택적으로 항생제 또는 살생물제도 함께)와 미리 혼합될 수 있으며, 이후 혼합물은 표면 (제1 국면) 또는 제4 국면의 유체와 접촉하는 유체에 첨가될 수 있다.
7. 제1 내지 제6 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 각각의 표적 서열이 숙주 세포 독성, 내성 또는 필수 유전자 서열, 예를 들어 이의 엑손 또는 조절 서열인, 방법. 내성은 항생제 내성 일 수 있다. 하나의 예에서, 숙주 세포를 항생제 및 벡터와 접촉시켜 숙주 세포 생존력을 감소시킨다.
8. 제1 내지 제7 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 표적 서열의 변형은 숙주 세포 사멸 및/또는 숙주 세포 성장 또는 증식의 감소를 초래한다. 증식은 예를 들어, 표면과 접촉하는 세포 확장 또는 세포 분포이다.
9. 제1 내지 제8 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 벡터가 동일한 CRISPR 어레이를 포함하는, 방법.
10. 제1 내지 제9 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 숙주 세포가 박테리아 또는 고세균 세포인, 방법. 하나의 대안에서, 제1 세포는 조류 세포가 대신한다.
11. 제1 내지 제10 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 제1 세포가 데설포비브리오(desulfovibrio) 또는 데설포토마쿨럼(desulfotomaculum) 세포와 같은 황산염 환원 박테리아(SRB) 세포인, 방법. 하나의 예에서, 세포는 데설포토마쿨럼 니그리피칸스(Desulfotomaculum nigrificans), 데설파시눔 인페르넘(Desulfacinum infernum), 서모데술포박테리움 모바일(Thermodesulfobacterium mobile), 서모데술포르합두스 노르베기쿠스(Thermodesulforhabdus norvegicus), 아르키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus), 데설포마이크로비움 압스헤로눔(Desulfomicrobium apsheronum), 데설포비브리오 가보넨시스(Desulfovibrio gabonensis), 데설포비브리오 롱구스(Desulfovibrio longus), 데설포비브리오 비엣나멘시스(Desulfovibrio vietnamensis), 데설포박테리움 세토니쿰(Desulfobacterium cetonicum), 데설포마쿨룸 할로필룸(Desulphomaculum halophilum), 데설포박터 비브리오포르미스(Desulfobacter vibrioformis) 및 데설포토마쿨룸 서모시스터눔(Desulfotomaculum thermocisternum) 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 예에서, 개체군은 두개 이상의 이들 세포 종의 혼합물을 포함한다.
12. 제11 국면에 있어서, 표면 또는 유체는 원유, 가스 또는 석유 화학물 회수, 처리, 저장 또는 차량운송 장비에 포함되는, 방법. 원유는 세계에서 가장 중요한 에너지원 중 하나이다. 다양한 기술 공정을 통해 휘발유, 오일, 파라핀 오일, 윤활유, 아스팔트, 가정 연료 오일, 바셀린 및 고분자와 같은 소비재 제품으로 원유를 정제하는 정유/석유 화학 산업을 포함한 수많은 산업에서 원료로 사용된다. 오일-유래 제품은 다른 많은 화학 공정에서도 일반적으로 사용된다. 하나의 대안에서, 유체는 소비자 제품이거나 표면이 소비자 제품과 접촉한다.
13. 제11 또는 제12 국면에 있어서, 표면이 해수, 파쇄액 또는 웰 내의 액체와 접촉하거나; 또는 유체가 해수, 파쇄액 또는 웰 내의 액체인, 방법.
14. 제1 내지 제13 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 상기 방법의 단계 (i)는 제2 종(제 2 숙주 세포)의 미생물 세포의 개체군을 제공하는 단계를 포함하고, 제2 세포는 벡터를 포함하며, 벡터는 제2 숙주 세포로부터 제1 숙주 세포로 이동가능하고; 제2 숙주 세포를 제1 숙주 세포와 조합함으로써, 벡터가 제1 숙주 세포에 도입되는, 방법. 하나의 예에서, 제2 세포(들)는 환경(예: 물 또는 토양 환경)에서 환경적으로, 산업적으로 또는 국내에서 수용가능하며 제1 숙주 세포(들)는 환경에서 허용되지 않는다.
15. 제14 국면에 있어서, 제1 숙주 세포가 벡터와 접촉하기 전에 미생물 세포 혼합물(예: 미생물 바이오필름에 포함됨)에 포함되고, 혼합물은 제2 종의 세포를 포함하는, 방법.
16. 제14 또는 제15 국면에 있어서, 제2 종은 바실러스 또는 질산염 환원 박테리아 또는 질산염 환원 황화물 산화 박테리아(NRB)의 종인, 방법.
17. 제16 국면에 있어서, NRB가 캄필로박터 종(Campylobacter sp.), 니트로박터 종 (Nitrobacter sp.), 니트로소모나스 종(Nitrosomonas sp.), 티오마이크로스피라 종(Thiomicrospira sp.), 설푸로스피릴룸 종(Sulfurospirillum sp.), 타우에라 종(Thauera sp.), 파라코커스 종 (Paracoccus sp.), 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.), 로도박터 종 및 데설포비브리오 종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나; 또는 적어도 2개의 종을 포함하는, 방법.
18. 제17 국면에 있어서, NRB가 니트로박터 불가리스, 니트로소모나스 유로페아, 슈도모나스 스투체리, 슈도모나스 에루지노사, 파라코커스 데니트리피칸스, 설푸로스피릴룸 델레이아눔, 및 로도박터 스페로이데스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
19. 제1 내지 제18 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 방법은 제1 종의 숙주 세포를 살생물제와 접촉시키고 동시에 또는 순차적으로 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법. 하나의 예에서, 벡터 및 살생물제는 숙주 세포와 접촉되는 조성물에 미리 혼합되어 제공된다.
20. 제19 국면에 있어서, 살생물제는 테트라키스 하이드록시메틸 포스포늄 설페이트(THPS), 글루타르알데히드, 일산화염소, 이산화염소, 차아 염소산 칼슘, 차아 염소산 칼륨, 차아 염소산 나트륨, 디브로모니트릴로프로프리온아미드 (DBNPA), 메틸렌 비스(티오시아네이트) (MBT), 2-(티오시아노메틸티오)벤조티아졸 (TCMTB), 브로노폴, 2-브로모-2-니트로-1,3-프로판디올(BNPD), 트리부틸 테트라데실 포스포늄 클로라이드 (TTPC), 타우린아미드 및 이의 유도체, 페놀류, 4차 암모늄염, 염소-함유 제제, 퀸알디늄 염, 락톤, 유기 염료, 티오세미카바존, 퀴논, 카바메이트, 우레아, 살리실아미드, 카바닐리드, 구아니딘, 아미딘, 이미다졸린, 아세트산, 벤조산, 소르빈산, 프로피온산, 붕산, 탈수소아세트산, 아황산, 바닐산, p-하이드록시벤조에이트 에스테르, 이소프로판올, 프로필렌 글리콜, 벤질 알콜, 클로로 부탄올, 페닐에틸 알콜, 포름 알데히드, 요오드 및 이의 용액, 포비돈-요오드, 헥사메틸렌테트라민, 논시티올린, 1-(3-클로로알릴)-3,5,7-트리아조-L-아조니아아다만탄 클로라이드, 타우로리딘, 타우룰탐, N-(5-니트로-2-푸르푸리딜리덴)-1-아미노-히단토인, 5-니트로-2-푸르알데히드 세미카바존, 3,4,4'-트리클로로카바닐리드, 3,4',5-트리브로모살리실닐리드, 3-트리플루오로메틸-4,4'-디클로로카브아닐리드, 8-하이드록시퀴놀린, L-사이클로프로필-6-플루오로-1,4-다이하이드로-4-옥소-7-(L-피페라지닐)-3-퀴놀린카복실산, L,4-디하이드로-1-에틸-6-플루오로-4-옥소-7-(l-피페라지닐)-3-퀴놀린카복실산, 과산화수소, 과아세트산, 나트륨 옥시클로로센, 파라클로로메탁실레놀, 2,4,4'-트리클로로-2'-하이드록시디페놀, 티몰, 클로르헥시딘, 벤즈알코늄 클로라이드, 세틸피리디늄 클로라이드, 은 설파디아진, 질산은, 브롬, 오존, 이소티아졸론, 폴리옥시에틸렌 (디메틸이미노) 에틸렌 (디메틸이미노) 에틸렌 디클로라이드, 2-(3급-부틸 아미노)-4-클로로-6-에틸아미노-5'-트리아진(테르부틸아진), 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법. 하나의 예에서, 살생물제는 테트라키스 하이드록시메틸 포스포늄 설페이트 (THPS)이다. 하나의 예에서, 살생물제는 4급 암모늄 화합물이다.
21. 제1 내지 제20 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 시스템은 채광; 해상운송; 원유, 가스 또는 석유 화학물 회수 또는 가공; 수압 파쇄; 공기 또는 물의 가열 또는 냉각; 식수 생산, 저장 또는 차량운송; 탄화수소 수송; 및 폐수 처리로 이루어진 그룹으로부터 선택된 산업 운영에 사용되는, 방법.
22. 제21 국면에 있어서, 표면은 선택된 산업에서 사용되는 장비의 표면이거나; 또는 유체는 선택된 산업에서 사용되는 장비에 포함된 유체인, 방법.
23. 제1 내지 제22 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 표면은 부엌, 목욕 또는 원예 장비의 표면이거나; 유체는 주방, 목욕 또는 원예 장비에 포함되는, 방법. 예를 들어, 장비는 국내 환경에서 사용된다.
24. 제1 내지 제23 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 제3 국면에 종속적인 경우, 유체는 컨테이너(예를 들어, 물 탱크 또는 병)에 수용된 음용 가능한 액체이고 표면은 상기 액체와 접촉하는 컨테이너의 표면인, 방법.
25. 제1 내지 제24 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 각각의 벡터는 이동성 유전자 요소 (MGE)를 포함하고, MGE는 전달 기원(oriT) 및 CRISPR 어레이를 포함하고; MGE는 제 1 종의 숙주 세포와 산업용 또는 가정용 시스템에서의 또 다른 미생물 숙주 세포 사이에서 이동할 수 있는, 방법. 예를 들어, 추가 세포(들)은 환경(예: 물 또는 토양 환경)에서 환경적으로, 산업적으로 또는 국내에서 수용 가능하며 제1 숙주 세포(들)는 환경에서 허용되지 않는다.
26. 제25 국면에 있어서, oriT는 제1 및 추가 숙주 세포에서 기능적인, 방법.
27. 제25 또는 26 국면에 있어서, 제 1 및 추가 숙주 세포가 상기 표면과 접촉하는 유체의 바이오필름에 포함되거나; 또는 세포가 유체에 포함되는, 방법.
28. 제25, 26 또는 27 국면에 있어서, 추가 세포는 제16 내지 18 국면 중 어느 하나의 국면에 기재된 종의 세포인, 방법. 하나의 예에서, MGE는 추가 세포로부터 제 1 숙주 세포로 이동할 수 있고/있거나 또는 반대로 이동할 수 있다.
29. 제25 내지 제27 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 추가의 세포는 제1 종의 세포인, 방법.
예를 들어, 이 실시형태에서, MGE는 시스템 내의 개체군 내의 제1 세포들 사이에서 이동할 수 있다. MGE가 다른 세포로의 이동 과정에서 자신의 카피를 남기는 경우, 이는 MGE를 전파시키고 확산시키고 이에 따라 시스템의 세포 개체군을 통해 CRISPR 어레이를 확산시킴으로써 어레이의 표적 서열 변형 효과를 확산시키는 수단을 제공한다. 이는, 예를 들어, 표면이나 유체와 접촉하는 바이오필름에서 어레이의 확산을 생성하는 데 효과적일 수 있고, 기존의 살생물제로 바이오필름의 침투가 차선책이 될 수 있으므로 유용하다.
30. 제25 내지 제29 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 각각의 MGE가 통합 및 접합 요소 (ICE)이거나 또는 이를 포함하거나; 또는 각각의 벡터는 제1 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 파지이며, 각각의 MGE는 세포 사이에서 이동이 가능한 파지 핵산인, 방법.
31. 제30 국면에 있어서, 각각의 ICE는 트랜스포존, 예를 들어, 접합 트랜스포존인, 방법.
32. 제1 내지 제31 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 각각의 벡터는 제25 내지 제31 국면 중 어느 하나에 따른 MGE를 선택적으로 포함하는 플라스미드인, 방법.
33. 제25 내지 제32 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 제1 및/또는 추가의 세포는 MGE를 다른 세포로 전달할 수 있는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 서열은 MGE에 포함되지 않는, 방법.
34. 제33 국면에 있어서, 서열이 벡터에 포함되지 않는, 방법.
35. 제33 국면에 있어서, 서열은 제 1 세포 및/또는 추가의 세포의 접합 트랜스포존(conjugative transposon)에 포함되는, 방법.
36. 제35 국면에 있어서, 트랜스포존은 제1 및 추가의 세포 사이에 MGE를 전달하기 위해 트랜스에서 작동가능한, 방법.
37. 제25 내지 36 국면 중 어느 하나의 국면에 있어서, MGE의 oriT는 제1 세포 및/또는 추가의 세포의 ICE에 포함된 oriT와 동일하며, ICE는 제1 및 추가 세포 사이에서 MGE를 전달하기 위해 트랜스에서 작동가능한, 방법.
38. 제25 내지 제37 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 벡터 oriT는 SRB 또는 NRB 트랜스포존의 oriT인, 방법.
39. 제25 내지 제38 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 각각의 MGE가 제1 및 제2 말단 반복 서열 및 반복 서열들 사이의 CRISPR 어레이를 포함하는, 방법.
40. 제25 내지 제39 국면 중 어느 한 국면에 있어서, MGE는 (1) 추가의 숙주 세포로 전달되었을 때 제1 숙주 세포의 게놈; 또는 (2) 제1 숙주 세포에 전달되었을 때 추가 숙주 세포에서 CRISPR 어레이 카피를 남기는, 방법. 예를 들어, 카피는 전달이 일어나는 세포의 게놈에 남겨진 트랜스포존 또는 프로파지에 포함된다.
41. 제25 내지 제40 국면 중 어느 하나의 국면에 있어서, 제1 및 추가 세포가 상이한 종의 박테리아 세포(예: SRB 및 NRB; 또는 SRB 및 바실러스 세포 각각)인, 방법.
42. 제25 내지 제41 국면 중 어느 하나의 국면에 있어서, 제30 국면에 종속하는 경우, MGE의 동원을 위한 유전자전위효소(transposase)와 조합하는, 방법.
43. 제1 내지 제42 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 벡터 또는 MGE는 제1 종의 숙주 세포에서 작동가능한 독소-항독소 모듈을 포함하고; 선택적으로, 독소-항독소 모듈이 다른 종의 세포에서 작동가능하지 않거나 또는 작동이 감소된 항독소 유전자를 포함하는, 방법. 이들 실시 형태는 표적 서열을 포함하는 제1 숙주 세포에서 벡터/MGE (및 이에 따라 CRISPR 어레이)의 보유를 유리하게 하는 선택적 압력을 생성하는데 유용하다.
44. 제1 내지 제43 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 벡터 또는 MGE는 제2 또는 추가 세포에서 작동가능한 독소-항독소 모듈을 포함하고; 선택적으로, 독소-항독소 모듈이 제 2 세포 또는 추가 세포 이외의 세포에서 작동가능하지 않거나 또는 작동이 감소된 항독소 유전자를 포함하는, 방법. 이는 제2 세포 또는 추가의 세포에서 CRISPR 어레이의 개체군을 유지하는데 유용하고(예를 들어, 이러한 세포가 제1 세포를 또한 포함하는 바이오필름에 존재할 때), 그러나, 독소-항독소 모듈은 제1 숙주 세포에서 추가적인 사멸(표적 서열 변형의 작용 이상)을 제공한다. 하나의 예에서, 벡터 또는 MGE는 제1 숙주 세포 및 제2 또는 추가 세포에서 작동가능한, 독소-항산화 모듈을 포함한다.
45. 제43 또는 제44 국면에 있어서, 독소-항독소 모듈은 제1 및 제2 세포 또는 추가의 세포 이외의 세포에서 작동가능하지 않거나 작동이 감소된, 방법. 따라서, CRISPR 어레이를 유지하기 위해 제1 및 제2 (또는 추가의) 세포 모두에 선택적 압력이 존재할 수 있다. 유용하게도, 이는 혼합된 개체군(예: 표면에 접촉하는 바이오필름 또는 유체에 포함된 개체군)의 세포 사이에서 MGE 내 어레이를 수평으로 이동시키기 위한 저장소를 제공한다.
46. 제25 내지 제45 국면 중 어느 하나의 국면에 있어서, 제1 및 제2 세포(또는 제1 및 추가 세포)는 동일한 문(phylum)(예: 둘 다 박테리아 세포)이고 벡터가 (A) 제1 세포 및/또는 제 2(또는 추가) 세포에서 복제가능하거나 또는 작동가능하지만, 동일한 문의 또 다른 세포에서는 가능하지 않고; (B) 제1 세포 및/또는 제2(또는 추가) 세포에서 복제가능하거나 또는 작동가능하지만, 동일한 목(order)의 다른 세포에서는 가능하지 않고; (C) 제1 세포 및/또는 제2(또는 추가) 세포에서 복제가능하거나 또는 작동가능하지만, 동일한 강(class)의 다른 세포에서는 가능하지 않고; (D) 제1 세포 및/또는 제2(또는 추가) 세포에서 복제가능하거나 또는 작동가능하지만, 동일한 목(order)의 다른 세포에서는 가능하지 않고; (E) 제1 세포 및/또는 제2(또는 추가) 세포에서 복제가능하거나 또는 작동가능하지만, 동일한 과(family)의 다른 세포에서는 가능하지 않고; (F) 제1 세포 및/또는 제2(또는 추가) 세포에서 복제가능하거나 또는 작동가능하지만, 동일한 속(genus)의 세포에서는 가능하지 않고; (G) 제1 세포 및/또는 제2(또는 추가) 세포에서 복제가능하거나 또는 작동가능하지만, 동일한 종(species)의 다른 세포에서는 가능하지 않은, 벡터.
47. 제25 국면 또는 제26 내지 제46 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 제25 국면과 종속적인 경우, 각각의 MGE는 접합 트랜스포존이고, oriT가 제1 및 추가 (또는 제 2) 숙주 세포에서 기능적이고, MGE는 제1 및 제2 말단 반복 서열 및 반복 서열 사이의 CRISPR 어레이를 포함하며, 제1 및 추가 (또는 제2) 세포는 박테리아 세포이고, 표적 부위는 제1 세포에 포함되지만, 추가(또는 제2) 세포에는 포함되지 않으며, 변형은 제1 세포에서 표적을 포함하는 유전자 또는 조절 서열을 불활성화 또는 하향 조절하여, 제1 숙주 세포 생존력을 감소시키고 MIC 또는 바이오파울링을 제어하는, 방법.
48. 제1 내지 제47 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 각각의 CRISPR 어레이는 제1 숙주 세포에서 각각의 crRNA의 발현 및 생산을 위한 서열 R1-S1-R1'을 포함하고, (i) R1은 제1 CRISPR 반복이고, R1'은 제2 CRISPR 반복이고, R1 또는 R1'는 선택적이며; (ii) S1은 상기 제 1 숙주 세포의 표적 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 CRISPR 스페이서인, 방법.
49. 제48 국면에 있어서, R1 및 R1'은 제1 숙주 세포 종의 CRISPR 어레이의 제1 및 제2 반복 서열과 각각 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한, 방법. 하나의 실시형태에서, R1 및 R1' 모두가 존재한다.
50. 제48 또는 제49 국면에 있어서, R1 및 R1'은 표적 서열을 변형시키기 위해 제1 종의 숙주 세포의 CRISPR/Cas 시스템과 기능적인, 방법.
51. 제48 내지 제50 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 제1 숙주 세포가 황산염 환원 박테리아 (SRB) 세포이고, R1 및 R1'이 제1 숙주 세포 종의 CRISPR 어레이의 반복 서열(예를 들어, 제1 반복)에 대해 각각 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한, 방법.
52. 제51 국면에 있어서, R1 및 R1'은 서열번호 50 내지 74로 이루어진 그룹으로부터 선택된 반복 서열과 각각 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한, 방법. 표 1을 참조한다. 하나의 실시형태에서, R1 및 R1' 모두가 존재한다.
53. 제51 국면에 있어서, R1 및 R1'은 서열번호 51, 54 및 69로 이루어진 그룹으로부터 선택된 반복 서열과 각각 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한, 방법. 서열번호 51, 54 및 69는 하나를 초과하는 SRB 종에서 발견된다. 이는 특히, 예를 들어, SRB 유형이 처리될 산업용 시스템 또는 가정용 시스템에서 공존하는 경우, 예를 들어 처리될 기판 또는 유체와 접촉하는 개체군 또는 바이오필름에서 공존하는 경우, 본 발명의 CRISPR 어레이로 하나를 초과하는 SRB 유형을 표적화하는데 유용하다. 하나의 실시형태에서, R1 및 R1' 모두가 존재한다.
54. 제48 내지 제53 국면 중 어느 한 국면에 있어서, R1 및 R1'의 서열은 동일한, 방법.
55. 제1 내지 제54 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 제1 숙주 세포에 도입된 각각의 어레이는 숙주 세포에서 각각의 crRNA와 함께 기능하는 하나 이상의 Cas 뉴클레아제(들) (예를 들어, Cas9 및/또는 Cfp1)와 조합하여 도입되어 이의 표적 서열을 변형시키는, 방법.
하나의 예에서, 임의의 구성의 본 명세서의 Cas는 뉴클레아제 활성에 대해 불활성화되고 선택적으로 표적 서열 활성제 또는 억제제를 포함한다. 본 명세서에서 Cas9는 예를 들어 S. 피오게네스 또는 S. 아우레우스 Cas9이다.
56. 제1 내지 제55 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 제1 숙주 세포에 도입된 각각의 어레이는 숙주 세포에서 각각의 crRNA와 함께 기능하는 하나 이상의 Cas 뉴클레아제(들) (예를 들어, Cas9 및/또는 Cfp1)을 인코딩하는 핵산 서열(들)과 조합하여 도입되어 표적 서열을 변형시키는, 방법.
57. 제48 내지 제56 국면 중 어느 한 국면에 있어서, R1 및 R1'가 유형 II Cas9 뉴클레아제와 기능하여 제1 숙주 세포에서 표적 서열을 변형시키고, 선택적으로, 상기 방법은 추가로 제55 또는 56 국면을 따르며, Cas는 Cas9인, 방법.
58. 제1 내지 제57 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 벡터 또는 MGE 모두 또는 일부가 각각의 어레이로 작동가능한 Cas 뉴클레아제-인코딩 서열을 포함하지 않는, 방법.
59. 제58 국면에 있어서, 상기 각각의 어레이는 제1 종의 세포에서 발견되는 Cas 엔도뉴클레아제와 작동가능한, 방법.
60. 제25 국면 또는 제26 내지 제59 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 제25 국면에 종속적인 경우, 각각의 MGE는 어레이의 반복 서열로 작동가능한 Cas 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 서열이 없고, 각각의 벡터는 MGE 외부의 이러한 서열(예를 들어, Cfp1의 Cas9를 인코딩하는 서열)을 포함하는, 방법.
61. 원유, 가스 또는 석유 화학물 회수, 처리, 저장 또는 차량운송 장비(예: 원유 탱커, 석유 장비 또는 석유 시추 장비)에 포함되는 기판의 미생물학적으로 영향을 받는 부식(MIC) 또는 바이오파울링을 제어하는 방법으로서, 기판의 표면은 제1 숙주 세포 개체군과 접촉하고, 제1 숙주 세포는 기판의 MIC 또는 바이오파울링을 매개하는 제1 종의 황- 또는 황산염-환원 박테리아 (SRB), 세포외 고분자 물질-생산 박테리아 (EPSB), 산-생산 박테리아 (APB), 황- 또는 황화물-산화 박테리아 (SOB), 철-산화 박테리아 (IOB), 망간-산화 박테리아 (MOB), 암모니아 생산 박테리아 (AmPB) 또는 아세테이트 생산 박테리아(AcPB)이고, 표면 및 세포 개체군은 해수, 담수, 파쇄액 또는 웰(예를 들어, 오일 또는 천연 가스 웰) 내의 액체로부터 선택된 액체와 접촉하고, 상기 방법은
(i) 제1 숙주 세포를 형질 전환 또는 형질 도입할 수 있는 다수의 벡터와 액체를 혼합하여 벡터와 세포 개체군을 접촉시키는 단계(각각의 벡터는 CRISPR 어레이를 포함함으로써, CRISPR 어레이가 숙주 세포 내로 도입됨),
(a) 각각의 CRISPR 어레이는 crRNA의 발현을 위한 하나 이상의 서열 및 숙주 세포에서 서열(들)의 전사를 위한 프로모터를 포함하며;
(b) 각각의 crRNA는 숙주 세포의 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 Cas(예: Cas 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9 또는 Cfp1)를 숙주 세포에 안내하여 표적 서열을 변형(예를 들어, 표적 서열 절단)시키고; 표적 서열은 숙주 세포 생존력을 매개하는 유전자 서열이고;
(c) (a)의 각 서열은 제1 숙주 세포에서 각각의 crRNA의 발현 및 생산을 위한 서열 R1-S1-R1'을 포함하고, R1은 제1 CRISPR 반복이고, R1'은 제2 CRISPR 반복이고, R1 또는 R1'는 선택적이며; S1은 상기 제 1 숙주 세포의 표적 서열과 70, 75, 80, 85, 90 또는 95% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 CRISPR 스페이서이며,
(ii) 숙주 세포 내 Cas의 존재하에 상기 cRNA의 발현을 가능하게 함으로써 숙주 세포에서 표적 서열을 변형시켜 숙주 세포 생존력의 감소 및 기판의 MIC 또는 바이오파울링을 제어하는 단계를 포함하는, 방법. 하나의 실시형태에서, R1 및 R1' 모두가 존재한다.
62. 제61 국면에 있어서, 방법은 제1 국면 또는 제1 국면에 종속적인 임의의 앞서 기술된 국면에 따른, 방법.
63. 제61 또는 제62 국면에 있어서, 각각의 벡터가 제1 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 파지이거나 또는 CRISPR 어레이를 포함하는 MGE(예: 트랜스포존)를 포함하는 벡터이고, MGE는 제1 숙주 세포로 이동할 수 있는, 방법.
64. 제61, 제62, 또는 제63에 있어서, 제1 세포가 데설포비브리오(desulfovibrio) 또는 데설포토마쿨럼(desulfotomaculum) 세포와 같은 황산염 환원 박테리아(SRB) 세포인, 방법.
65. 제64 국면에 있어서, R1 및 R1'은 제1 숙주 세포 종의 CRISPR 어레이의 반복 서열(예를 들어, 제1 반복)과 각각 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일하고, 벡터 어레이는 제1 종의 세포에서 발견되는 Cas 엔도뉴클레아제로 작동가능한, 방법. 하나의 예에서, R1 및 R1'은 동일한 서열이다.
66. 제65 국면에 있어서, R1 및 R1'은 서열번호 50 내지 74로 이루어진 그룹으로부터 선택된 반복 서열과 각각 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한, 방법. 하나의 예에서, R1 및 R1'은 동일한 서열이다.
67. 제66 국면에 있어서, R1 및 R1'은 서열번호 51, 54 및 69로 이루어진 그룹으로부터 선택된 반복 서열과 각각 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한, 방법. 표 1을 참조한다. 이는 특히, 예를 들어, SRB 유형이 처리될 산업용 시스템 또는 가정용 시스템에서 공존하는 경우, 예를 들어 처리될 기판 또는 유체와 접촉하는 개체군 또는 바이오필름에서 공존하는 경우, 본 발명의 CRISPR 어레이로 하나를 초과하는 SRB 유형을 표적화하는데 유용하다. 하나의 예에서, R1 및 R1'은 동일한 서열이다.
68. 제1 내지 제67 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 복수의 벡터는 추가의 벡터를 포함하고, 각 추가의 벡터는 개체군에 포함된 추가 숙주 세포를 표적화하기 위한 하나 이상의 CRISPR 어레이를 포함하고, 추가의 숙주 세포 종은 제1 숙주 세포 종과 상이하고, 단계 (i)에서 개체군의 추가 세포는 추가 세포를 형질 전환 또는 형질 도입할 수 있는 다수의 추가 벡터와 접촉하고, 각각의 벡터는 CRISPR 어레이를 포함함으로써, CRISPR 어레이가 추가의 숙주 세포에 도입되며,
(a) 각각의 CRISPR 어레이는 crRNA의 발현을 위한 하나 이상의 서열 및 숙주 세포에서 서열(들)의 전사를 위한 프로모터를 포함하며;
(b) 각각의 crRNA는 추가적인 숙주 세포의 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 숙주 세포에서 Cas(예: Cas 뉴클레아제)를 안내하여 표적 서열을 변형(예를 들어, 표적 서열을 절단)시키고; 표적 서열은 숙주 세포 생존력을 매개하는 유전자 서열이며;
단계 (ii)는 추가의 숙주 세포에서 Cas의 존재하에 cRNA의 발현을 허용함으로써, 추가적인 숙주 세포에서 표적 서열을 변형시키는 단계를 포함하는, 방법.
69. 제68 국면에 있어서, 부가적인 숙주 세포는 기판 또는 유체의 MIC 또는 바이오파울링을 매개하고, 단계 (ii)는 부가적인 숙주 세포 생존력의 감소 및 기판 또는 유체의 MIC 또는 바이오파울링의 제어를 초래하는, 방법.
70. 선박 또는 보트의 밸러스트 수 내 박테리아 바이오파울링을 제어하는 방법으로서, 물은 바이오파울링을 매개하는 제1 미생물 종의 제1 숙주 세포의 개체군을 포함하고, 방법은
(i) 세포를 형질 전환 또는 형질 도입할 수 있는 다수의 벡터와 개체군을 접촉시키는 단계 (각각의 벡터는 CRISPR 어레이를 포함함으로써, CRISPR 어레이가 숙주 세포 내로 도입됨), 여기서,
(a) 각각의 CRISPR 어레이는 crRNA의 발현을 위한 하나 이상의 서열 및 숙주 세포에서 서열(들)의 전사를 위한 프로모터를 포함하며;
(b) 각각의 crRNA는 숙주 세포의 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 숙주 세포에서 Cas(예: Cas 뉴클레아제)를 안내하여 표적 서열을 변형(예를 들어, 표적 서열을 절단)시키고; 표적 서열은 숙주 세포 생존력을 매개하는 유전자 서열이며;
(ii) 숙주 세포 내 Cas의 존재하에 상기 cRNA의 발현을 가능하게함으로써 숙주 세포에서 표적 서열을 변형시켜 숙주 세포 생존력의 감소 및 바이오파울링을 제어하게 되는 단계를 포함하는, 방법.
71. 제70 국면에 있어서, 제1 숙주 세포가 비브리오 콜레라, 대장균 또는 장구균 종 세포인, 방법.
72. 제70 또는 제71 국면에 있어서, 단계 (i)는 예를 들어, 선박 또는 보트의 선체에서 밸러스트 수와 벡터를 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
73. 제70 내지 제72 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 선박 또는 보트는 해양 운송 수단이고, 물은 해수인, 방법.
74. 제70 내지 제72 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 선박 또는 보트 대신에, 밸러스트 수는 컨테이너 또는 바다의 시추 플랫폼, 예를 들어 석유 플랫폼 또는 석유 장비(oil rig)에 포함되는, 방법. 하나의 예에서, 선박, 보트, 컨테이너, 플랫폼 또는 장비는 해상에 고정되어 있다(즉, 임시 위치가 아님).
75. 배출된 밸러스트 수는 제70 내지 제74 국면 중 어느 한 국면의 방법으로 처리된 물을 포함하는, 선박 또는 보트로부터 밸러스트 수를 배출하는 방법.
76. 제75 국면에 있어서, 물은 바다, 또는 해양 또는 수로(예: 강, 운하, 호수 또는 저장수)와 같은 물줄기, 또는 컨테이너로 배출되는, 방법.
77. 밸러스트 수는 제70 내지 제76 국면 중 어느 하나의 국면의 방법에 의해 수득되거나 또는 수득가능한, CRISPR 어레이를 포함하는 밸러스트 바닷물.
78. 제77 국면의 밸러스트 해수를 포함하는 선박, 보트, 컨테이너 또는 장비(rig).
79. 제61 내지 제69 중의 어느 한 국면의 방법에서 사용하기 위한 벡터로서, 제1 세포가 데설포비브리오(desulfovibrio) 또는 데설포토마쿨럼(desulfotomaculum) 세포와 같은 황산염 환원 박테리아(SRB) 세포이고, 각각의 벡터는 SRB를 표적화하기 위한 하나 이상의 CRISPR 어레이를 포함하며, 각각의 어레이는 제61 국면의 (a) 내지 (c)에 정의된 바와 같은, 벡터.
80. 제79 국면에 있어서, R1 및 R1'이 제65 내지 제67 국면 중 어느 하나의 국면에 따르는, 벡터.
81. 제70 내지 제76 중의 어느 한 국면의 방법에서 사용하기 위한 벡터로서, 제1 세포가 콜레라(예: 비브리오, 예를 들어 O1 또는 O139), 대장균 또는 장구균 종 세포이고, 벡터는 세포를 표적화하기 위한 하나 이상의 CRISPR 어레이를 포함하며, 각각의 어레이는 제70 국면의 (a) 및 (b)에 정의된 바와 같은, 벡터.
82. 제79 내지 제81 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 벡터가 세포를 감염시킬 수 있는 박테리오파지인, 벡터.
83. 제79 내지 제81 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 벡터가 세포 내로 이동할 수 있는 트랜스포존 또는 MGE인, 벡터.
84. 각각의 벡터가, 선택적으로 세포의 생존력을 감소시킬 수 있는 살생물제 또는 항생제와 조합하여 제82 또는 제83 국면을 따르는, 다수의 벡터.
MIC 또는 바이오파울링을 매개하는 박테리아: 하나의 예에서, 제1 숙주 세포는 황- 또는 황산염- 환원 박테리아 (SRB), 세포 외 고분자 물질 생산 박테리아 (EPSB, 예를 들어 슈도모나스), 산-생산 박테리아 (APB), 황- 또는 황화물-산화 박테리아 (SOB); 철- 또는 망간-산화 박테리아 (IOB), 암모니아 생산 박테리아 (AmPB) 및 아세테이트 생산 박테리아 (AcPB)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예를 들어, 제1 숙주 세포는 AcPB(예: 아세토박터 종 및/또는 글루콘아세토박터 종)이며 표면은 탄화수소 연료(예: 연료-등급 에탄올) 및/또는 물과 접촉한다.
본 발명과 관련된 박테리아의 예(하나의 예에서, 제1 숙주 세포는 다음의 종의 세포 중 어느 하나이다)가 다음에 기재되어 있다. 액시디티오바실러스 박테리아는 황산을 생산한다. 액시디티오바실러스 티오옥시단스(Acidithiobacillus thiooxidans), 액시디티오바실러스(Acidithiobacillus) 박테리아의 아속은 하수관을 자주 손상시킨다. 페로바실러스 페로옥시단스(Ferrobacillus ferrooxidans)는 철을 철 산화물 및 철 수산화물로 직접 산화시킨다. 다른 박테리아는 유기산과 무기질 또는 암모니아와 같은 다양한 산을 생성한다. 산소 존재 하에서, 티오바실러스 티오옥시단스(Thiobacillus thiooxidans), 티오바실러스 티오파루스Thiobacillus thioparus) 및 티오바실러스 콘크레티보러스(Thiobacillus concretivorus)와 같은 호기성 박테리아 세가지 모두는 환경에 광범위하게 존재하고, 생물 발생 황화물 부식을 야기하는 공통적인 부식 유발 요소이다. 산소가 없으면 혐기성 박테리아, 특히 데설포비브리오와 데설포토마쿨럼이 일반적이다. 데설포비브리오 살릭시겐(Desulphovibrio salixigens)는 적어도 2.5%의 염화나트륨 농도가 필요하지만 D. 불가리스(D. vulgaris)와 D. 데설푸리칸스(D. desulphuricans)은 담수와 소금물에서 자랄 수 있으며, D. 아프리카누스(D. africanus)는 또 다른 일반적인 부식-유발 미생물이다. 데설포토마쿨럼 속은 황산염-환원 포자-형성 박테리아를 포함한다. 데설포토마쿨럼 오리엔티스(Desulphotomaculum orientis) 및 니그리피칸(nigrificans)은 부식 과정에 관여한다. 황산염-환원제는 환원성 환경이 필요하며 번성하기 위해서는 최소 -100 mV의 전극 전위가 필요하다. 그러나 소량의 생성된 황화수소라도 이러한 변화를 달성할 수 있으므로 성장이 일단 시작되면 가속화되는 경향이 있다.
하나의 예에서, 제1 숙주 세포는 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 갈리오넬라 종, 슈도모나스 종, 바실러스 종 (예: B. 서브틸리스, B. 세레우스, B. 푸밀루스 또는 B. 메가테리움), 티오바실러스 종, 설폴로버스(Sulfolobus) 종, 클렙시엘라 옥시토카, 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), P. 스투체리, 마이크로코커스, 엔테로코커스, 스타필로코커스 (예: S. 아우레우스), E. 패칼리스 또는 M. 루테우스 세포이다. 하나의 예에서, 제1 숙주 세포는 2종 이상의 상기 종의 혼합물을 포함한다. 이 종들은 인도의 북서부 및 남서부 지역에 위치한 디젤 및 나프타-수송 파이프 라인에서 분리되며, 이들 컨소시엄이 존재할 때 파이프 라인 강철의 국부적 부식과의 연관성이 확증되었다. 다른 유럽 항공기 제조업체들의 합작 프로젝트에서 항공기 건설에 일반적으로 사용되는 알루미늄 합금에 강한 부식 손상에서 마이크로코커스, 엔테로코커스, 스타필로코커스 및 바실러스 속으로부터의 분리물이 관여되어 있음을 확인하였다. 이러한 박테리아는 다른 박테리아의 발생을 선호하거나 EPS를 생성하여 바이오필름(EPS-생산 박테리아)의 형성을 선호하는 미세 산성 환경(산 생산 박테리아)을 만들 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 실시형태에서, 처리될 시스템의 표면(예를 들어, 강철 표면)은 디젤 또는 나프타와 접촉하거나, 또는 처리될 유체가 디젤 또는 나프타(및 선택적으로 제1 숙주 세포는 이 단락에서 정의된 하나 이상의 종임)이다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 처리될 시스템의 표면(예를 들어, 항공기 표면과 같은 알루미늄-함유 표면)은 마이크로코커스, 엔테로코커스, 스타필로로커스 및 바실러스(제1 숙주 세포)의 1개, 2개, 3개의 속 또는 모든 속과 접촉한다. 이 단락의 임의의 실시형태의 하나의 예에서, 표면은 시스템의 강 또는 알루미늄 성분의 표면이다.
산-생산 박테리아: 호기성 박테리아는 유기물의 발효 대사작용으로부터 아세트산, 포름산, 젖산, 프로피온산 및 부티르산과 같은 단쇄 유기산을 대사 산물로 생성할 수 있다. 이들은 호기성 대사작용으로 인한 초기 콜로니 생성자이다. 이들 미생물은 가스 스탠드 및 오일을 포함한 다양한 환경에 존재한다. 유기산은 주위 매질의 pH를 낮추는 것 외에도 부식 과정을 가속화하는 SRB에 대한 기질로서 작용한다. 또한, 대량 생산된 유기산은 금속 탈분극에서 작용하여 국부적인 부식 과정을 시작한다.
황-산화 박테리아: 황-산화 박테리아는 호기성 및 통성 혐기성 미생물로 황화물, 황산염, 티오 황산염 및 경우에 따라서는 황과 같은 무기 황 화합물의 산화로부터 생장에 필요한 에너지를 수득한다. 산화 대사는 환경 산성화를 촉진하는 황산 생산을 야기한다. 이 그룹에는 가장 많이 연구되는 액시디티오바실러스 속 (Acidithiobacillus genus)이 다수 포함되어 있다. 이 그룹에는 또한 티오스패라 판토트로파(Thiosphaera pantotropha)와 파라코커스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans) 뿐만 아니라 설폴로버스, 티오마이크로스피라(Thiomicrospira), 베기아토아(Beggiatoa), 액시디티오바실러스, 및 티오트릭스(Thiothrix) 속으로부터의 박테리아 종을 포함한다. 하나의 예에서, 제1 숙주 세포는 이들 종들 중 어느 하나의 세포이다.
철-산화 박테리아: 철-산화 박테리아는 호기성 미생물로 철분 산화로부터의 신진 대사에 필요한 에너지를 얻는 크고 다양한 그룹에 속한다. 결과적으로, 기질 표면 상에 일반적으로 불용성 침전물을 형성하는 철 수산화물의 형성이 일어나서, 상이한 산소 수준을 갖는 영역을 촉진시킨다. 철-산화 박테리아는 강, 호수로부터의 물 및 오일 생산에서 널리 발견된다. 이들은 대부분 운동성이 있는 외장을 가지고 있으며, 그 존재는 부식 생성물로서 침전된 제2 철의 다량의 축적으로 검출될 수 있다. 이러한 축적 또는 무기 파울링은 오일 파이프라인의 막힘과 같은 산업 장비에 문제를 일으킨다. 가장 흔한 것으로 티오바실러스 페로옥시단스(Thiobacillus ferrooxidans) 및 크레노트릭스(Crenothrix), 갈리오넬라(Gallionella), 레프토트릭스(Leptothrix) 및 스페로틸러스(Spherotillus) 속이 있다. 하나의 예에서, 제1 숙주 세포는 이들 종들 중 어느 하나의 세포이다.
황- 또는 황산염-환원 박테리아(SRB): SRB는 박테리아 및 제한된 혐기성 고세균을 포함하는 형태학적- 및 계통학적으로 이질적인 그룹을 형성하지만 일부 종은 산소에 대한 내성이 크다. 이들 미생물은 주로 그람-음성 박테리아, 중온성 및 일부 고온성의 일반적으로 포자-형성 박테리아이다. 이들 미생물은 전자 수용체로서 황산염 이온 또는 다른 황 화합물(티오 황산염, 아황산염 등)을 사용하여 모노- 또는 디카복실산 지방산, 알콜, 탄화수소 및 방향족 화합물을 포함하는 저 분자량의 다양한 유기 화합물을 산화시킬 수 있다. 아세테이트, 락테이트, 피루베이트 및 에탄올은 SRB에 의해 가장 보편적으로 사용되는 기질 중 하나이다. SRB 성장의 촉진은 미생물과 결합된 부식 생성물의 침착으로 설명되는 바이오필름의 기존 혐기성 조건으로 인해, 또한, 석유 회수 중 황산염이 풍부한 바닷물과 같은 수성 매질의 주입이 있는 곳에서 일어난다. 다량의 생물학적 황화수소가 생성 될 수 있으며; 파이프라인 및 기타 석유, 가스 또는 석유 화학물의 회수, 처리, 저장 또는 운송 장비에서 형성되는 대부분의 H2S는 SRB의 대사 활동에 기인한다. 석유 산업에 또 다른 경제적 영향은 H2S에 의한 석유와 가스의 산성화이다.
SRB의 대사 활성과 관련된 거대한 경제적 손실을 고려하여, 몰리브덴산염, 질산염 및 아질산염과 같은 환경적으로 유해한 독성 대사 억제제의 사용과 살생물제의 적용에 대한 노력이 이루어져 왔으며, 이는 SRB의 대사 활성 조절 및 생물학적 H2S 생산의 후속 억제에 도움이 된다.
대사 억제제를 사용하여 생물학적 H2S의 형성 과정을 제어하는데 다음의 여러 가지 메커니즘이 기여한다. I - SRB와 통상적인 전자 공여체에 의한 아질산염 또는 질산염의 환원제인 종속영양 박테리아 간의 경쟁으로 인한 경쟁적 SRB 배제; II - H2S의 생물학적 생산은 낮은 산화 환원 전위(-100 mV 이하)에서만 발생하므로 질산염 환원 매개체(아산화 질소 및 산화 질소)의 존재로 인해 증가된 산화 환원 전위; III- 일부 SRB의 에너지 대사 변화, 황산염 대신 질산염 환원; IV - 황화물 산화 박테리아 및 질산염 또는 아질산염을 사용하여 H2S를 재산화시켜 H2S를 제거하는 질산염 또는 아질산염 환원 박테리아; V -SRB에서 황산염 환원을 통해 최종 효소 단계를 억제하기 위해 아질산염에 의한 이화적 아황산 환원 효소의 억제.
본 발명의 특정 실시형태에서, 처리될 기판과 접촉하거나 또는 처리될 유체에 포함되는 숙주 세포 개체군은 또한 본 발명의 벡터의 존재하에 하나 이상의 질산염 및/또는 하나 이상의 아질산염과 접촉된다. 예를 들어, 단계 (i)에서 벡터와 동시에 또는 순차적으로, 질산염/아질산염 및 벡터는 산업용 시스템 또는 가정용 시스템에 포함된 오일, 가스, 석유 화학물, 물 또는 다른 유체와 결합된다(예를 들어 주입된다). 유사하게, 부가적으로 또는 대안적으로, 몰리브덴산염 또한 SRB에 대한 제어 메카니즘으로서 이들 시스템에서 사용될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 처리될 기판과 접촉하거나 처리될 유체에 포함되는 숙주 세포 개체군은 또한 본 발명의 벡터의 존재하에 하나 이상의 몰리브데산염과 접촉된다. 예를 들어, 단계 (i)에서 벡터와 동시에 또는 순차적으로, 몰리브데산염(들) 및 벡터는 산업용 시스템 또는 가정용 시스템에 포함된 오일, 가스, 석유 화학물, 물 또는 다른 유체와 결합된다(예를 들어 주입된다).
다른 실시형태에서, 개체군은 본 발명의 벡터의 존재하에 질산염-환원 박테리아 및/또는 질산염 환원 황화물 산화 박테리아 (NRSOB)(본 명세서에서 집합적으로 "NRB"로 지칭한다)와 접촉된다. 예를 들어, 벡터와 동시에 또는 순차적으로, NRB는 산업용 시스템 또는 가정용 시스템에 포함된 오일, 가스, 석유 화학물, 물 또는 다른 유체와 결합된다(예를 들어 주입된다). 하나의 예에서 NRB는 본 발명의 벡터를 포함하고, 벡터는 NRB 세포로부터 제1 숙주 세포(SRB 세포)로 전달될 수 있고; NRB와 SRB 세포를 결합시킨 후, 벡터를 SRB 세포로 도입시킨다. 하나의 예에서, SRB 세포는 벡터와 접촉 전에 미생물 세포(예: 미생물 바이오필름에 포함된)의 혼합물에 포함되고, 혼합물은 NRB 종의 세포를 포함한다. 따라서, 이 경우, 본 발명은 SRB 세포를, NRB 세포 종이 표적화될 바이오필름에서 SRB와 이미 공존하는 NRB 세포(벡터 함유)와 접촉시키는 단계를 포함하여, 벡터-함유 NRB의 혼화성 및 세포 개체군 바이오필름에 삽입시키는 기회를 증가시킨다. 이것은 벡터가 바이오필름으로 들어갈 확률을 높이고, 이에 따라 SRB 세포를 변형시키는 효능의 가능성 및 바이오필름 내에서 본 발명의 CRISPR 어레이의 증식의 기회를 증가시키는데 유용하다(특히 어레이가 이동성 유전 요소, 예를 들어, 트랜스포존에 포함되거나 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 파지에 의해 포함되는 경우).
SRB와 NRB는 일반적으로 박테리아의 성장에 필요한 특정 유전 및 산업 용수 시스템에 존재하는 동일한 비-중합체 탄소원(예: 아세테이트)을 둘고 경쟁한다. SRB와 비교하여 NRB의 성장 속도를 증가시킴으로써, NRB는 이용가능한 비-중합체 탄소원의 소비에서 SRB와 경쟁할 수 있고, SRB가 성장하고 바람직하지 않은 황화물을 생성하는 능력을 박탈하여 부식 속도를 감소시킨다. 또한, SRB의 성장 속도를 억제함으로써, NRB가 우세하여 시스템(예: 유전 또는 공업용수 시스템) 내에서 이용 가능한 비-중합체 탄소에 대한 SRB와 다시 경쟁할 수 있다. 따라서, 개체군 내 SRB 세포를 NRB와 접촉시키는 것은 개체군 내에서 NRB와 SRB의 비를 증가시킴으로써 SRB 세포 생존력을 감소시키는데 도움을 줄 수 있다.
하나의 예에서, 본 발명은 제1 숙주 세포 (예: SRB)를 포함하는 개체군을 유기 및/또는 무기 질산염 및 아질산염과 접촉시키는 것을 포함한다. 이들은 NRB의 성장을 자극하여 NRB가 SRB를 능가하는 데 도움을 준다. 유기 및 무기 질산염 또는 무기 아질산염은 특정 유전 및 공업용수 시스템에 주입하는데 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 무기 질산염 및 무기 아질산염은 예를 들어 질산 칼륨, 아질산 칼륨, 질산 나트륨, 아질산 나트륨, 질산 암모늄 및 이들의 혼합물을 포함한다. 이들 유기 및 무기 질산염 및 무기 아질산염은 일반적으로 입수 가능하지만, 비-제한적이며 임의의 적절한 질산염 또는 아질산염이 사용될 수 있다.
사용된 유기 또는 무기 질산염 또는 아질산염의 양은 시스템 내의 개체군에 존재하는 황산염 및/또는 유기산의 양 및 SRB를 상쇄 시키는데 필요한 NRB의 예상량을 포함하여 다수의 요인에 좌우된다. 액체와 접촉하는 기판의 MIC를 처리하거나, 또는 본 발명에 따른 액체의 바이오파울링을 처리하기 위한 특정 실시형태에서, 사용된 유기 또는 무기 질산염 또는 아질산염의 농도는, 배치 적용 방법을 사용하여 적용될 때 액체의 중량 기준으로 2000 ppm 미만, 대안적으로는 500 내지 1600 ppm 또는 대안적으로는 약 900 내지 1100 ppm이다. 연속 작동을 통해 적용되는 경우, 유기 또는 무기 질산염 또는 아질산염의 농도는 액체의 중량 기준으로 500 ppm 미만, 또는 10 내지 500 ppm, 또는 10 내지 100 ppm 일 수 있다.
하나의 실시형태에서, 개체군은 본 발명의 벡터와 접촉하고 동시에 또는 순차적으로 NRB(예: 벡터를 포함하는) 및 질산염 및/또는 아질산염과 접촉한다.
적합한 NRB는 종속 영양 질산염-환원 박테리아 및 질산염-환원 황화물-산화 박테리아와 같은 혐기성 질산염 환원을 수행할 수 있는 임의의 유형의 박테리아를 포함한다. 하나의 예에서, NRB는 캄필로박터 종(Campylobacter sp.), 니트로박터 종 (Nitrobacter sp.), 티오바실러스 종(Thiobacillus sp.), 니트로소모나스 종(Nitrosomonas sp.), 티오마이크로스피라 종(Thiomicrospira sp.), 설푸로스피릴룸 종(Sulfurospirillum sp.), 타우에라 종(Thauera sp.), 파라코커스 종 (Paracoccus sp.), 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.), 및 로도박터 종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1, 2, 3 이상(예를 들어 하나 이상)의 NRB를 포함한다. 예를 들어, NRB는 니트로박터 불가리스, 니트로소모나스 유로페아, 슈도모나스 스투체리, 슈도모나스 에루지노사, 파라코커스 데니트리피칸스, 설푸로스피릴룸 델레이아눔, 및 로도박터 스페로이드 중 하나 이상으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, NRB는 원유, 가스, 석유 화학물 또는 물 회수, 처리, 수송 또는 저장 시스템 (예를 들어, 장비에서)에서 발견되거나, 또는 우물 또는 유정과 같은 지하 형성에서 발견되는 NRB 균주이다. NRB는 시스템 조건 하에서 대사하기 위해 최적화될 수 있다. NRB는 예를 들어 NRB 균주의 라이브러리로부터 선택되거나 또는 처리될 시스템 또는 유사한 시스템으로부터 배양될 수 있다.
시스템에서 SRB 세포와 접촉하는 NRB의 양은 존재할 수 있는 살생물제 뿐만 아니라 예상되는 SRB의 양을 포함하는 다수의 인자에 좌우될 수 있다. 지하 형성에 주입될 때, 지하의 침투성 및 다공성도 고려할 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 액체에 주입되는 NRB의 양은 액체 중 1 내지 108 박테리아 수/ml 또는 액체 중 10 내지104 박테리아 수/ml이다.
SRB와 경쟁하기 위해 NRB를 자극하는 것 이외에, 질산염과 함께 본 발명의 특정 실시형태에서 추가의 SRB 억제제를 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 하나의 예에서, SRB는 9,10-안트라퀴논, 몰리브데산염(예를 들면, 몰리브덴산 나트륨 및/또는 몰리브덴산 리튬) 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SRB 억제제와 접촉된다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 몰리브덴산은 액체의 중량 기준으로 5 내지 100 ppm의 범위로 액체에 첨가된다.
하나의 예에서, 본 발명의 벡터 및 하나 이상의 살생물제(즉, SRB 살생물제와 같은 제1 숙주 세포의 살생물제)는 제1 세포를 혼합물과 접촉시키기 전에, 예를 들어, 처리될 표면과 접촉하는 액체 내로 혼합물을 주입, 또는 처리될 유체 내로 혼합물을 주입하여 혼합된다.
벡터를 함유하는 NRB 세포에 부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 바실러스 세포의 종의 사용을 고려한다.
하나의 실시형태에서, 벡터는 SRB를 감염시킬 수 있는 박테리오파지이며, 파지는 제1 숙주 세포(예: SRB)와 접촉시킴으로써, 본 발명에 따라 제1 숙주 세포의 변형을 위해, 파지에 포함된 CRISPR 어레이를 제1 숙주 세포에 도입시킨다. 하나의 실시형태에서, 제1 세포가 SRB 인 경우, SRB는 또한 본 발명의 파지 벡터와 접촉하고, 동시에 또는 순차적으로 NRB와 접촉한다. NRB와 접촉하는 대신에 또는 접촉하는 것 이외에, SRB는 질산염 및/또는 아질산염과 접촉한다.
MIC와 관련된 메커니즘의 예는 다음과 같다; 하나의 실시예에서, 상기 방법을 사용하는 "제어하는" 단계는 다음으로부터 선택된 메커니즘을 감소시키는 단계를 포함한다:
* 금속 표면에 철 수산화물의 침착으로 인한 생물학적 무기물화의 미생물(예: 박테리아) 촉진, 계면 금속/용액에서 전기 화학적 과정의 수정; 부식 유도;
* 바이오필름의 형성에 유리한 EPS 생산;
* 금속의 부식에 작용하는 효소 아릴 탄화수소 하이드록실라제(AHH)의 방출로 인한 미생물(예: 박테리아)의 석유 제품의 분해 촉진.
* 부식 과정을 증가시키는 황산 생산; 및
* 황 산화.
하나의 예에서, 상기 방법은 다음으로부터 선택된 메커니즘을 감소시키는 단계를 포함한다:
* 금속성 표면에 철 수산화물의 침착으로 인한 생물학적 광물화의 박테리아 촉진.
* EPS의 생산;
* 효소 아릴 탄화수소 하이드록실라제(AHH)의 방출로 인한 시스템 내 석유 제품의 분해의 박테리아 촉진 (여기서, 표면은 금속성 표면임);
* 황산의 생산; 및
* 황의 산화.
MIC 또는 바이오파울링 제어 적용 가능한 예
박테리아와 관련된 부식 및/또는 바이오파울링을 감소시키기 위해 본 발명에 의해 구상되는 특별히 적용된 예시가 존재한다. 하기에 기술된 적용은 본 발명의 개념을 제한하려는 것이 아니며, 단지 본 발명이 박테리아에 의해 유발된 부식을 제어하거나 환경 오염을 감소시키는 방법을 설명하기 위한 것이다.
산성 광산 배수 (acid mine drainage): 산성 광산 배수에서는 박테리아 성장이 환경 내 산도를 증가시킬 수 있다. 산의 생성 및 이에 따른 잠재적인 환경 손상에 대한 반응 체계가 존재한다. 산성 광산 배수 문제는 전 세계적으로 심각한 환경 문제로 인식되고 있다. 산성 광산 배수의 기원은 황철석 및 기타 황화물 함유 무기질의 풍화 및 산화이다. 광산 배수는 황화철(pyrite)인 황화철이 노출되어 공기와 물과 반응하여 황산과 용해된 철을 형성할 때 형성된다. 이 철분의 일부 또는 전부가 광산 배수가 포함된 하천의 바닥에 침전되어 적색, 주황색 또는 황색 퇴적물을 형성할 수 있다. 산성 유거수는 구리, 납, 수은과 같은 중금속을 지표 또는 지하수에 추가로 용해시킨다. 산성 광산 배수가 진행되는 속도와 정도는 특정 박테리아의 작용에 의해 증가될 수 있다.
하나의 예에서, 시스템은 광산이거나 광산에 포함된다. 유체는 광산 배수 유체이며, 이 방법은 광산 배수로 인한 황산을 감소시킨다. 하나의 예에서, 표면이 광산 배수 유체와 접촉한다.
하나의 예에서, 제1 숙주 세포는 액시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 액시디티오바실러스 티오옥시단스(Acidithiobacillus thiooxidans), 액시디티오바실러스 데니트리피칸스(Acidithiobacillus denitrificans), 렙토스피릴룸 페로옥시단스(Leptospirillum ferrooxidans) 또는 설포바실러스 서모술피도옥시단스(Sulfobacillus thermosulfidooxidans) 세포 또는 이들 중 둘 이상의 혼합물이다.
수압 파쇄(Hydraulic Fracturing): 수압 파쇄는 가스 및 기타 탄화수소의 추출을 용이하게 하기 위해 암석 형성을 파쇄하는 방법이다. 본질적으로, 가스 베어링 형성이 확인되면 유정은 가스에 접근하기 위해 수직 및 수평 방향으로 땅에 파여있다. 유정을 사용하여 고압 수, 모래 및 과다학 화학물질을 사용하여 혈암을 파쇄하여, 일단 수압파괴가 완료되면 과부하의 강렬한 압력에 의해 균열과 틈이 막히는 것을 유지한다. 수백만 갤런의 물을 사용하여 유정을 파쇄한다. 파쇄 유체의 30%에서 70%가 "환류(flowback)"로 표면으로 돌아온다. 환류는 소금을 포함하여 파쇄수에 용해되어 있는 물질을 포함한다. 용해되어 있는 것은 위치에 따라 다르다. 환류는 처분되기 전에 트럭으로 운반되고 처리될 때까지 유정 부지의 플라스틱 줄로 표시된 구덩이에 보관된다. 어떤 시점에서는 높은 유속과 상대적으로 낮은 염분의 물이 낮은 흐름으로 변환되지만 "환류수"과 구별하기 위해 훨씬 높은 염분의 "생성된 물"이 된다.
두 경우 모두 미생물학적으로 영향을 받는 부식(MIC) 문제가 존재한다. SRB가 특히 흥미롭다. 따라서 하나의 예에서, 시스템은 수압 파쇄 시스템이며 유체는 수압 파쇄 액체(예: 환류수 또는 생성된 물)이거나 또는 처리될 표면이 이러한 액체와 접촉하고 있다. 예를 들어, 이 방법은 SRB 생존력을 감소시키고(예: SRB를 죽이고/죽이거나 액체에서 SRB 증식을 감소시킴), 제1 숙주 세포는 SRB이다.
예를 들어, 제1 숙주 세포는 액시디티오바실러스 박테리아, 액시디티오바실러스 티오옥시단스, 페로바실러스 페로옥시단스, 티오바실러스 티오옥시단스, 티오바실러스 티오파러스, 티오바실러스 콘크레티보러스(Thiobacillus concretivorus), 데설포비브리오(살릭시겐, 불가리스, 데설푸리칸스, 또는 아푸리카누스) 또는 데설포토마쿨룸(예: 오리엔티스 또는 니그리피칸스) 세포 또는 이들 종들 중 둘 이상의 혼합물이다.
냉각 장치 (예: 냉각탑) : 냉각탑과 같은 냉각 장비에 박테리아가 존재하면 여러 가지 방법으로 냉각 기능에 악영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, SRB는 냉각탑, 열교환기 등의 벽면에 산성 조건을 생성하는 것을 지원하여 수리가 이루어지는 동안 냉각 시스템의 부식 및 잠재적 차단을 초래한다. 또한, 예를 들어 열교환기의 벽에 있는 바이오필름은 열교환기의 열 전달 계수를 감소시켜 냉각 시스템의 작동 효율을 저하시킨다.
또한, 철-함유 성분의 부식은 특히 해로울 수 있다. 황화철의 침전 및 부식 수소 이온의 인시츄 발생을 가져오는 철 (II)로의 철의 산화 및 황화물 이온으로의 황산염의 환원은 SRB를 통해 발생할 수 있다. 황산염 환원 박테리아에 의한 철의 부식은 신속하고 보통의 녹과는 달리 자기 제한적이지 않다. 데설포비브리오에 의해 생산된 결핵균은 흑색 자성 산화철과 혼합된 적색 산화 제2 철 옥사이드의 외부 껍질로 이루어져 있으며, 황화 제1 철의 연질 흑색 중심을 포함한다.
따라서, 하나의 예에서, 시스템은 냉각 시스템이고 유체는 시스템에 포함된 유체(예를 들어, 물 또는 수성 액체)이거나 처리될 표면은 이러한 유체와 접촉하는 냉각 장치의 표면이다. 하나의 예에서, 제1 숙주 세포는 SRB(예를 들어, 본 명세서에 개시된 임의의 SRB)이다. 하나의 예에서, 표면은 철-함유 표면이다.
하나의 예에서, 제1 숙주 세포가 레지오넬라 세포이다. 이러한 종은 인체 건강에 해롭고 수냉, 난방, 가공 또는 저장 장비에서 전파된다. 따라서, 하나의 예에서, 시스템은 이러한 장비이다.
파이프라인 부식: 탄화수소 및 석유 화학물 파이프라인에는 박테리아의 증식을 허용 할 수 있는 충분한 수분이 포함되어 있어 예를 들어 SRB로 인해 MIC가 빈번하게 발생한다. MIC는 혐기성이고, 파이프라인의 내부 표면과 직접 접촉하는 SRB를 보호하는 호기성 박테리아의 바이오필름에 의해 빈번하게 발생한다. 이는 산성 조건 및 기타 금속 부식 조건을 만들어서 국부적인 부식 및 파이프가 결국 고장나는 결과를 초래한다.
하나의 예에서, 시스템은 제1 숙주 세포(예: SRB)와 접촉하는 표면을 포함하는 장비 표면(예: 파이프라인 또는 시추 장비)을 포함한다. 예를 들어, 시스템은 원유, 탄화수소, 석유 화학물(예: 디젤 또는 석유), 가스 또는 물 회수, 가공, 저장 또는 운송 시스템이다. 예를 들어, 파이프라인은 석유 화학 파이프 라인이다. 예를 들어, 파이프 라인은 석유 또는 가스 장비로 구성된다. 예를 들어, 파이프 라인 표면은 해수와 접촉한다. 예를 들어, 파이프 라인 표면은 석유 화학 유체, 원유 또는 천연 가스와 접촉한다.
폐수 처리: 폐수 처리는 유기 오염 물질을 제거하기 위해 폐수 처리장 하류에 활성 슬러지를 첨가하는 것을 포함한다. 따라서 물을 폐기물 처리 시설에서 처리한 후에, 박테리아에 의해 "소화"될 수 있는 많은 유기 오염원이 존재한다. 따라서, 활성 슬러지는 폐수 처리 설비로부터의 유출물을 처리하기 위해 탱크/컨테이너 내 처리된 물에 첨가된다.
그러나 때로는 탱크/컨테이너의 박테리아(활성 슬러지, 폐수 자체 또는 주변 환경에서 유래하든간에)가 매우 빠르게 지배하여 성장한다. 이러한 급속 성장은 필라멘트 형태의 박테리아 성장을 초래할 수 있다. 필라멘트는 탱크 또는 컨테이너에 박테리아 개체군의 최대 20-30%를 형성할 수 있으며 부유한다. 이 필라멘트 성장은 벌킹 슬러지(bulking sludge)로 알려진 것을 생성한다. 본 발명은 폐수 처리에서 중요한 측면인 슬러지 제어를 벌킹하는 데 이용할 수 있다.
따라서, 하나의 예에서, 시스템은 수 처리 시스템이고, 표면은 시스템의 컨테이너의 표면이고, 표면은 물 및 제1 숙주 세포와 접촉하거나; 또는 처리될 유체가 물과 세포를 포함한다. 하나의 예에서, 이 방법은 폐수 시스템의 슬러지에서 박테리아 성장을 제어한다.
해상운송 및 차량운송(Shipping & Transportation): 선박과 보트는 바닷물이나 수로(예를 들어, 강, 호수, 연못 또는 담수)와 접촉하여 외면(예: 선체)에서 MIC를 형성할 수 있다. 내부 선체 표면은 예를 들어 밸러스트 수와 접촉하는 박테리아와 같은 MIC-매개 미생물을 수용할 수 있는 수분 또는 액체와 전형적으로 접촉하기 때문에 MIC에 종속될 수도 있다. 예를 들어, 바닷물은 선박의 선체(예: 유조선)에서 종종 운반되어 바다에서 안정성을 제공하고; 이러한 바다는 SRB를 매개할 수 있는 박테리아를 보유한다. 모터 구동 차량 (자동차, 트럭, 밴 또는 화물차), 기차, 우주선 및 항공기와 같은 기타 운송 수단도 영향을 미칠 수 있다.
따라서, 하나의 예에서, 시스템은 운송 수단(예를 들어, 자동차, 트럭, 밴 또는 트럭, 기차, 우주선 또는 항공기와 같은 물품 및/또는 인간 또는 가축을 운송하기 위한 것)이다. 예를 들어, 차량은 선박이나 보트, 예를 들어 석유, 가스 또는 석유 화학 선박(예 : 유조선)이다. 하나의 예에서, 처리될 표면은 바닷물과 접촉한다. 하나의 예에서, 표면은 선박 또는 보트 선체의 외부 표면이다. 하나의 예에서, 표면은 선박 또는 보트 선체의 내부 표면이다.
밸러스트 수(Ballast Water)의 박테리아 잔류 또는 성장(바이오파울링): 본 발명의 특정 응용은 비브리오콜레라, 대장균 및/또는 장구균 종과 같은 바람직하지 않은 박테리아를 줄이기 위한, 해양 운송 수단(예: 선박 또는 보트) 발라스트 수의 처리이다.
해상운송은 세계 상품의 90% 이상을 움직이고 안정을 유지하기 위해 일상적으로 해상 운송되는 약 20 ~ 30억 톤의 밸러스트 수를 전 세계로 전달하고 있다. 비슷한 양의 밸러스트 수는 매년 국가 및 지역 내에서 국내로 이관 될 수 있다 (GloBallast Partnerships, www.globallast.imo.org). 밸러스트 수는 자연적으로 진화한 생물 다양성을 위협하는 침입 해양 생물의 주된 원인으로 인식되어 왔으며 이의 결과는 점차 현실화되고 있다(Anil et al. 2002). 질병-유발 병원성 박테리아의 의도하지 않은 도입은 원산지 또는 수송 중에 전달되어 사회와 인간의 건강에 직접적인 영향을 미칠 수 있다. 선박 밸러스트 탱크에는 다른 원산지가 아닌 척추 동물, 무척추 동물, 식물, 현미경 조류, 박테리아 등이 들어 있다. 참조문헌 (Williams 외 1988; Carlton 및 Geller 1993; Smith 외 1996; Ruiz 외 2000; Drake 외 2002, 2005, 2007; Mimura 외 2005). 박테리아와 같은 미생물은 자연 존재량이 많고, 휴식 단계를 형성할 수 있으며, 광범위한 환경 조건을 견딜 수 있는 능력으로 인해 다른 유기체보다 많은 수의 외래 환경으로 도입된다. 밸러스트 탱크로 옮긴 모든 생물체는 생존하지 못할 수 있지만 박테리아와 미세 조류는 포낭, 포자 또는 다른 생리학적 휴식 단계를 형성하여 장기간 불리한 조건에서 생존할 수 있다(참조문헌 Roszak 외, 1983; Hallegraeff and Bolch 1992 Anil 외, 2002; Carney 외, 2011). 일단 이들 미생물이 방출되면, 수동적인 분산 및 미생물보다 생존을 위한 간단한 요구 사항을 용이하게 하는 작은 크기로 인해 침입하기에 매우 적합하다(Deming 1997). 싱가포르 항구에 있는 선박에서 검사한 밸러스트 시료의 비브리오 종의 세포 농도는 1.1 내지 3.9 x 104 ml-1 범위였다 (Joachimsthal 외. 2004). 질병을 유발하는 병원성 박테리아의 의도하지 않은 도입은 인체 건강에 대한 영향을 포함하여 직접적인 사회적 영향을 미칠 수 있다. 이전의 연구에서 체사피크 만(Chesapeake Bay)에 도입된 병원균의 대부분은 물 기둥 자체보다는 플랑크톤과 관련된 박테리아에서 비롯된 것으로 밝혀졌다(Ruiz 외, 2000). 따라서, 밸러스트 수 처리/관리 프로그램에서 박테리아 및 고생물과 같은 밸러스트 수 미생물이 주요 관심사이다.
국제 해사기구(IMO)는 2004년에 선박 밸러스트 수 및 퇴적물(Ballast Water Management Convention)의 통제 및 관리를 위한 국제 협약을 채택하여 이러한 유해 영향을 방지하기 위한 협약을 개발했다. 미국에서는 밸러스트 수 관리에 관한 미국 해안 경비대의 최종 규정이 2012 년 6 월 발효되어 미국 해역의 밸러스트 수 배수에 적용된다.
바다에서의 밸러스트 수 교환은 밸러스트 수 관리의 이상적인 방법으로 간주되지 않으며, 처리 방법을 개발하기 위해 상당한 노력이 이루어지고 있다. 이 방법은 IMO 밸러스트 수 관리 협약의 표준 D-2에 따라야 한다. 표준 D2는 처리되고 배출된 밸러스트 수가 다음 조건을 가지고 있어야함을 명시하고 있다:
* 최소 입방 미터당 50 마이크로미터 이상인 생존 가능한 생물 10개 미만;
* 최소 치수가 50 마이크로미터 미만이고 밀리미터 당 최소 치수가 10 마이크로미터 이상인 생존 가능한 생물 10 개 미만.
또한, 표준 D2는 지표 미생물의 배출이 다음과 같이 특정 농도를 초과해서는 안된다고 명시하고 있다:
* 100 밀리리터 당 1 미만의 단일 콜로니 형성 단위 (cfu) 또는 1g (습 중량) 동물성 플랑크톤 시료 당 1 cfu를 갖는 독성 생성물 비브리오 콜레라 (O1 및 O139).
* 100 밀리리터 당 250 cfu 미만의 대장균
* 100 밀리리터 당 100 cfu 미만의 장구균.
이들은 인체 건강 기준으로서 지표 미생물이지만 이러한 유형에 국한되지 않는다. 실제로, 어떤 경우에는 사용된 밸러스트 수 처리가 상황을 악화시킬 수도 있음이 제안되었다. 박테리아를 먹는 작은 유기체를 제거함으로써 일부 처리 시스템은 밸러스트 탱크를 박테리아 배양기로 바꾸어서, 처리된 방류물은 일부 시도에서 처리되지 않은 채로 방류한 것보다 수천 배나 높은 수준의 박테리아를 지속적으로 함유하고 있다. 증가된 박테리아는 인간 병원균을 포함 할 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 예(예를 들어, 제70 국면 또는 제70 국면의 종속적인 국면)에서, 시스템은 선박 또는 보트 또는 해양 차량(예를 들어 선박 또는 보트, 예를 들어 항만, 선착장 또는 바다 내 유조선)이다. 하나의 예에서, 제1 숙주 세포를 포함하는 유체는 선박 또는 배 해양차량의 밸러스트 수(예: 유조선 밸러스트 수와 같은 선박 또는 보트 밸러스트 수)이다. 하나의 예에서, 시스템은 해양 컨테이너나 해양에서의 플랫폼 또는 장비(예: 석유 또는 가스 장비)이다. 하나의 예에서, 유체는 컨테이너, 플랫폼 또는 장비의 밸러스트 수이다.
하나의 실시형태에서, 유해 박테리아(본 발명, 예를 들어, 제70 국면 또는 제70 국면에 종속적인 국면에 따른 제1 숙주 세포)은 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae); 비브리오 루모이엔시스; 비브리오 종; 대장균; 엔테로코커스 종; 슈도모나스 신크산타 (Pseudomonas synxantha); 슈도모나스 스투체리; 비브리오 렌투스(Vibrio lentus); 슈도알테로모나스 마리나(Pseudoalteromonas marina); 슈도알테로모나스 테트라오도니스(Pseudoalteromonas tetraodonis); 슈도알테로모나스 종; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida); 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans); 비브리오 스플렌디두스(Vibrio splendidus); 비브리오 사이클리트로피쿠스(Vibrio cyclitrophicus); 엔테로코커스 히래(Enterococcus hirae); 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium); 비브리오 로티페리아누스(Vibrio rotiferianus); 슈도알테로모나스 운디나(Pseudoalteromonas undina); 세라티아 플리무치카(Serratia plymuthica); 슈도모나스 풀바(Pseudomonas fulva); 슈도모나스 톨라시(Pseudomonas tolaasii); 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri); 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri); 비브리오 투비아시(Vibrio tubiashii); 할로모나스 베누스타(Halomonas venusta); 이디오마리나 로이히엔시스(Idiomarina loihiensis); 비브리오 사이클리트로피쿠스(Vibrio cyclitrophicus); 비브리오 투비아시(Vibrio tubiashii); 세라티아 플리무치카; 슈도알테로모나스 종; 슈도알테로모나스 아틀란티카(Pseudoalteromonas atlantica); 슈도모나스 신크산타; 슈도모나스 스투체리; 슈도알테로모나스 카라게노보라(Pseudoalteromonas carrageenovora); 테나시바쿨럼(Tenacibaculum) 종; 바실러스 마이코이디즈(Bacillus mycoides); 비브리오 나트이겐스(Vibrio natriegens); 바실러스 백련겐시스(Bacillus baekryungensis); 엔테로코커스 히래; 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus); 슈도알테로모나스 카라게노보라; 및 슈도모나스 에루지노사로 이루어진 그룹으로부터 선택된 종이다.
하나의 예에서, 제1 숙주 세포가 호기성 종속 영양 박테리아이다. 하나의 예에서, 제1 숙주 세포는 비브리오 콜레라 세포(예: O1 및/또는 O139 균주)이다. 하나의 예에서, 제1 숙주 세포가 대장균 세포이다. 하나의 예에서, 제1 숙주 세포는 엔테로코커스 종 세포이다.
참조문헌 "MALDI-TOF 질량 분광법을 이용한 밸러스트 수에서 박테리아의 특성 분석", Kaveh E 외, PLoS One. 2012; 7(6): e38515; 2012년 6월 7일에 온라인으로 공개됨, doi: 10.1371/journal.pone.0038515(본 명세서에 참고로 인용됨)는 밸러스트 수에서 박테리아를 모니터링 하기 위한 신속하고 비용 효율적인 방법을 개시한다.
본 발명의 구체적인 예는 다음과 같다:
선박 또는 보트의 밸러스트 수 내 박테리아 바이오파울링을 제어하는 방법이 제공되며, 물은 바이오파울링을 매개하는 제1 미생물 종(예를 들어, 콜레라, 대장균 또는 장구균 종)의 제1 숙주 세포의 개체군을 포함하고, 방법은
(i) 세포를 형질 전환 또는 형질 도입할 수 있는 다수의 벡터와 개체군을 접촉시키는 단계로서, 각각의 벡터는 CRISPR 어레이를 포함함으로써, CRISPR 어레이가 숙주 세포 내로 도입되고,
(a) 각각의 CRISPR 어레이는 crRNA의 발현을 위한 하나 이상의 서열 및 숙주 세포에서 서열(들)의 전사를 위한 프로모터를 포함하며;
(b) 각각의 crRNA는 숙주 세포의 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 숙주 세포에서 Cas(예: Cas 뉴클레아제)를 안내하여 표적 서열을 변형(예를 들어, 표적 서열 절단)시키고; 표적 서열은 숙주 세포 생존력을 매개하는 유전자 서열이고;
(ii) 숙주 세포 내 Cas의 존재하에 상기 cRNA의 발현을 가능하게함으로써 숙주 세포에서 표적 서열을 변형시켜 숙주 세포 생존력의 감소 및 바이오파울링을 제어하게 되는 단계를 포함한다.
하나의 예에서, 단계 (i)는 밸러스트 수를 벡터, 예를 들어 배 또는 보트의 선체와 혼합하는 단계를 포함한다.
하나의 예에서, 선박 또는 보트는 해양 운송 수단이고 물은 바닷물이다. 선박이나 보트 대신에 밸러스트 수는 바다에서의 컨테이너나 석유 시추 플랫폼 (예: 석유 플랫폼 또는 석유 장비)에 포함된다.
본 발명은 또한 선박 또는 보트로부터 밸러스트 수를 배출하는 방법을 포함하며, 여기서 배출된 밸러스트 수는 위에 기재된 특정 예의 방법에 의해 처리된 물을 포함한다. 하나의 예에서, 물은 바다, 해양 또는 수로(예: 강, 운하, 호수 또는 저장수)와 같은 물줄기로 배출된다.
본 발명은 또한 CRISPR 어레이를 포함하는 선박 또는 보트 밸러스트 수를 포함하며, 상기 밸러스트 수는 상기 특정 예에 의해 수득되거나 또는 수득될 수 있다. 본 발명은 또한 CRISPR 어레이를 포함하는 바다 컨테이너 밸러스트 수를 포함하며, 상기 밸러스트 수는 상기 특정 예에 의해 수득되거나 또는 수득될 수 있다. 본 발명은 바다에서의 플랫폼 또는 장비(예: 석유 또는 가스 장비)의, CRISPR 어레이를 포함하는 밸러스트 수를 포함하며, 상기 밸러스트 수는 상기 특정 예에 의해 수득되거나 또는 수득될 수 있다. 어레이는 특정 예의 (a) 및 (b)에 기재되어 있다.
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본 발명은 또한 다음과 같은 벡터 및 CRISPR 어레이를 제공한다.
85. 박테리아 숙주 세포 내로 도입하기 위한 CRISPR 어레이를 포함하는 벡터로서, 박테리아는 수인성 전달이 가능하며,
(a) CRISPR 어레이는 crRNA의 발현을 위한 서열 및 상기 숙주 세포에서 서열의 전사를 위한 프로모터를 포함하고;
(b) crRNA는 숙주 세포의 표적 서열에 혼성화할 수 있어서 숙주 세포에서 Cas(예: Cas 뉴클레아제)를 안내하여 표적 서열을 변형(예를 들어, 표적 서열을 절단)시키고; 표적 서열은 숙주 세포 생존 능력을 매개하는 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 유전자 또는 조절 서열)이고;
(c) (a)의 서열은 crRNA의 발현 및 생산을 위한 서열 R1-S1-R1'을 포함하고, R1은 제1 CRISPR 반복이고, R1'은 제2 CRISPR 반복이고, R1 또는 R1'는 선택적이며; S1은 상기 숙주 세포의 표적 서열과 80% 이상 동일한(예를 들어, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한)뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 CRISPR 스페이서인, 벡터.
"수인성 전염(water-borne transmission)"은 박테리아의 세포가 다른 유기체 사이, 유기체 내, 상이한 환경 사이 또는 유기체와 환경 사이에서 물 또는 수성 액체로 분산될 수 있음을 의미한다. 예로는 비브리오 콜레라, 장구균 종 및 대장균을 포함한다. 비브리오 콜레라는 극성 편모가 있는 그람 음성 쉼표-모양 박테리아(gram negative comma-shaped bacterium)이다. 이는 감마 프로테오박테리아의 강에 속한다. V. 콜레라는 두 가지 주요 생물 유형인 고전(classical)형 콜레라 및 엘 토르(El Tor)형 콜레라, 및 수많은 혈청 그룹 (serogroups)이 존재한다. V. 콜레라는 콜레라의 병인으로서 소장의 심각한 박테리아 감염이며 개발 도상국의 주요 사망 원인이다. V. 콜레라의 병원성 유전자는 V. 콜레라 감염을 검출하고 연구하는 흥미로운 표적이다. 이 유전자들의 대부분은 TCP(독소 공조절 모상 구조물: toxin-coregulated pilus)와 CTX (콜레라 독소)라는 이름의 두 병원성 섬(pathogenicity islands)에 위치하고 있으며, 이들은 프로파지 1, 2로 조직화되어있다. TCP는 pili을 통한 숙주 유착에 관여하는 유전자 클러스터를 포함하고 CTX 유전자는 콜레라 독소3의 합성에 관여한다.
하나의 실시형태에서, 벡터는 분리된 벡터(즉, 숙주 세포에는 없는 벡터)이다. 하나의 예에서, 벡터는 조작된 또는 합성된 벡터(즉, 자연 발생적이지 않은 벡터)이다.
하나의 예에서, 어레이는 ICP1 어레이, 예를 들어, 파지가 ICP1_2003_A, ICP1_2004_A, ICP1_2005_A, ICP1_2006_E 또는 ICP1_20011_A인 ICP1 V 콜레라 파지의 어레이이다. 하나의 예에서, 어레이는 CR1 또는 CR2 ICP1 파지 어레이, 예를 들어 이러한 어레이의 조작된 또는 자연 발생적 유도체이다.
하나의 예에서, CRISPR 어레이 및 Cas는 유형 1-E 또는 유형 1-F, 예를 들어, 하위 유형 시스템 17이다.
하나의 예에서, CRISPR 어레이는 다수의 서열을 포함하고, 각각은 각각의 crRNA의 발현을 위한 것이며 상기 숙주 세포에서의 서열의 전사를 위한 프로모터와 관련되어 있다.
하나의 예에서, 벡터 또는 각 벡터는 다수(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상)의 CRISPR 어레이를 포함한다.
하나의 예에서, 벡터는 Cas를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
다른 예에서, 벡터는 이러한 서열이 없다. 예를 들어, 이 경우, 어레이(들)는 숙주 세포에 의해 생산된 하나 이상의 Cas로 작동 가능하다.
86. 제85 국면에 있어서, 세포가 비브리오 콜레라, 엔테로코커스 또는 대장균 세포인, 벡터.
87. 제85 또는 86 국면에 있어서, 벡터는 Cas를 발현할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 갖지 않는, 벡터.
하나의 예에서, 이에 따라서, 벡터는 Cas 뉴클레아제를 인코딩하지 않는다. 하나의 대안에서, 벡터는 상기 Cas를 인코딩한다.
88. 제85, 86 또는 87 국면에 있어서, 표적 서열이 17 내지 45개의 인접 뉴클레오타이드, 예를 들어, 18, 19, 20 또는 21개의 인접 뉴클레오타이드의 프로토스페이서 서열인, 벡터.
하나의 예에서, 각각의 스페이서 (S1)는 17 내지 45개의 인접 뉴클레오타이드, 예를 들어, 18, 19, 20, 21, 30, 31, 32 또는 33개의 인접 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이다. V. 콜레라 PLE에 대한 프로토스페이서 서열은 예를 들어 32 개의 인접 뉴클레오타이드이고, 이를 표적화하는 벡터는 예를 들어 32 개 뉴클레오타이드 PLE 서열과 100% 또는 적어도 80, 90 또는 95% 동일한 32개의 인접 뉴클레오타이드의 스페이서 서열을 가질 수 있다. 벡터가 다수의 스페이서를 포함하는 경우, 스페이서는 상이한 스페이서의 혼합물일 수 있거나, 동일한 스페이서일 수 있다. 예를 들어, 어레이는 다수의 스페이서를 포함하며, 스페이서의 하위 세트는 동일하다. 동일한 스페이서는 예를 들어, 숙주 세포의 병원성 인자를 인코딩하는 유전자의 프로토스페이서 서열에 상동일 수 있다. 다중 스페이서를 사용하는 것은, 일단 벡터가 세포 내부에 있으면, 숙주는 하나 이상의 스페이서를 절단하는데 유리할 수 있고, 절단되지 않은 스페이서는 여전히 crRNA를 형성 할 수 있으며 표적 서열을 유지할 수 있다. 벡터 또는 어레이에서 상이한 스페이서의 혼합물을 사용하는 것은 침입하는 벡터에 대한 숙주의 적응의 위험을 최소화하는데 유리하여, 저항을 최소화시킬 수 있다.
89. 제85 내지 88 국면 중 어느 하나의 국면에 있어서, 표적 서열은 독성, 내성 또는 필수 유전자 서열인, 벡터. 하나의 예에서, 표적 서열은 PICI 유사 요소 (PLE)의 서열, 예를 들면, V. 콜레라 PLE, 예를 들어, PLE1이다.
90. 제85 내지 89 국면 중 어느 하나의 국면에 있어서, 표적 서열은 병원성 섬 (pathogenicity island) 서열이며, 숙주 세포가 비브리오 콜레라 세포이고, 표적 서열이 TCP, CTX 또는 VPI 서열인, 벡터. 하나의 예에서, (예를 들어, 숙주가 비브리오인 경우) 병원성 섬은 TCP(독소 공조절 모상 구조물: toxin-coregulated pilus) 또는 CTX (콜레라 독소)이다. 비브리오 병원성 섬(Vibrio pathogenicity island, VPI)은 주로 독소 공조절 모상 구조물: (TCP)의 생산에 관여하는 유전자를 포함한다. 구조적으로 파지 게놈과 닮은 두 개의 반복적인 영역(att-유사 부위: att-like site)의 측면에 있는 큰 유전 요소(약 40kb)이다. VPI는 TCP 클러스터와 ACF 클러스터라는 두 개의 유전자 클러스터와 여러 다른 유전자를 함유한다. acf 클러스터는 4 개의 유전자: acfABCD로 구성된다. tcp 클러스터는 15 개의 유전자: tcpABCDEFHIJPQRST 및 조절 유전자 toxT로 구성된다.
91. 제85 내지 제90 국면 중 어느 하나의 국면에 있어서, 숙주 세포가 비브리오 콜레라이고 표적 서열이 CTXΦ 유전자 서열인, 벡터. 콜레라 독소에 대한 유전자는 V. 콜레라 게놈에 삽입된 적당한 박테리오파지인 CTXphi (CTXΦ)에 의해 운반된다. CTXΦ는 콜레라 독소 유전자를 하나의 V. 콜레라균주에서 또 다른 형태의 수평 유전자 전달로 전달할 수 있다. 독소 공조절 모상 구조물에 대한 유전자는 VPI 병원성 섬 (VPI)에 의해 인코딩된다.
92. 제85 내지 제90 국면 중 어느 하나의 국면에 있어서, 숙주 세포가 비브리오 콜레라이고 표적 서열이 ctxB, tcpA, ctxA, tcpB, wbet, hlyA, hapR, rstR, mshA 또는 tcpP 서열인, 벡터.
93. 제85 내지 제92 국면 중 어느 하나의 국면에 있어서, 표적 서열이 17 내지 45개의 인접 뉴클레오타이드(예를 들어, 18, 19, 20 또는 21개의 인접 뉴클레오타이드)이고, 그람 양성 박테리아의 파지 유도 염색체 섬 (PICI), 예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스 병원성 섬(Staphylococcus aureus pathogenicity island: SaPI)의 서열과 적어도 80% 이상 동일한(예를 들어, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한), 벡터. ICP1 파지 (일명 ICP1-관련 파지) 스페이서 서열의 예가 하기에 제공된다. 이러한 스페이서 서열은 V. 콜레라 내 표적 서열(프로토스페이서 서열)과 상동성이 있다.
94. 제85 내지 제93 국면 중의 어느 하나의 국면에 있어서, 숙주 세포가 비브리오 콜레라이고, crRNA가 비브리오 콜레라 세포의 프로토스페이서 인접 모티브(PAM)의 5, 4 또는 3 뉴클레오타이드 내 표적 서열에 혼성화될 수 있고, PAM은 GA인, 벡터.
95. 제85 내지 제94 국면 중 어느 하나의 국면에 있어서, 숙주 세포가 비브리오 콜레라이고 세포가 El Tor, O1 또는 O139 비브리오 콜레라 세포인, 벡터. 하나의 예에서, V. 콜레라는 혈청형 O1 El Tor N16961; El Tor 생물유형18; 또는 El Tor 균주 MJ-1236이다. 하나의 예에서, 숙주 세포는 대장균 O157:H7 세포이다.
96. 제85 내지 제95 국면 중 어느 한 국면에 있어서, 벡터는 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 박테리오파지인, 벡터. 하나의 예에서, 숙주 세포는 대장균이고, 파지는 람다 또는 T4 파지이다. 하나의 예에서, 숙주 세포는 엔테로코커스 세포이고 파지는 엔테로코커스 파지 IME-EF1, phiEF24C, φEf1 또는 EFDG1이다(참조문헌 Appl Environ Microbiol. 2015 Apr;81(8):2696-705. doi: 10.1128/AEM.00096-15. Epub 2015 Feb 6, "Targeting Enterococcus faecalis biofilms with phage therapy", Khalifa L 외).
97. 제96 국면에 있어서, 숙주 세포가 비브리오 콜레라이고 벡터가 비브리오 콜레라 세포를 감염시킬 수 있는 박테리오파지인, 벡터.
98. 제97 국면에 있어서, 박테리오파지가 CTXΦ, ICPI 파지 및 미오바이러스(myovirus)로부터 선택되고, 예를 들어 파지는 ICP1_2003_A, ICP1_2004_A, ICP1_2005_A, ICP1_2006_E 또는 ICP1_20011_A, 선택적으로 조작되고 자연적으로 존재하지 않는 파지인, 벡터.
99. 제85 내지 제98 국면 중 어느 하나의 국면에 있어서, 벡터는 ICE, 예를 들어, 트랜스포존인, 또는 ICE, 예를 들어, 트랜스포존을 포함하는, 벡터. ICE는 본 명세서에 기술된 ICE의 임의의 특징을 포함할 수 있다.
100. 제99 국면에 있어서, 트랜스포존이 제1의 숙주 세포에서 제 2의 숙주 세포로 전달될 수 있는 접합 트랜스포존인, 벡터.
101. 제99 또는 제100 국면에 있어서, 트랜스포존이 제1 세포에서 CRISPR 어레이의 카피를 남기는, 벡터.
102. 제85 내지 제101 국면 중 어느 하나의 국면에 있어서, 상기 또는 각각의 어레이는 각각의 이동성 유전 요소(MGE)에 포함되고, MGE는 숙주 세포에서 작동가능한 전달 기원(oriT)을 포함한다. MGE는 본 명세서에 설명된 MGE에 따라 결정될 수 있다.
103. 제85 내지 제102 국면 중 어느 하나의 국면에 있어서, 벡터는 조작된 벡터인, 벡터.
104. 제85 내지 제103 국면 중 어느 하나의 국면에 따른 다수의 벡터를 포함하는 물 또는 식품 처리 조성물.
하나의 예에서, 물은 밸러스트 수, 해수, 기수, 담수, 식수, 수로(예: 하구 물) 또는 공업용수이다. 하나의 예에서, 물은 인간 위장관 유체에 있는 물이다.
하나의 예에서, 숙주 세포는 패류, 어류, 쌀 또는 곡물에 포함된다. 하나의 예에서, 조성물은 식품을 처리하기 위한 것이며, 숙주 세포는 대장균 O157:H7 세포이다. 하나의 예에서, 표적 서열은 대장균(예를 들어, O157:H7) 숙주 세포에서 시가 독소(Shiga toxin)를 인코딩하는 서열이다. 지금까지 기술된 수인성 종의 대안에서, 숙주 세포는 살모넬라 또는 리스테리아 세포이다.
105. 제85 내지 제103 국면 중 어느 하나의 국면에 따른 다수의 벡터를 포함하는, 인간의 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae) 감염의 치료용 또는 예방용 약제. 대안으로, 본 발명은 인간의 대장균 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제공하며, 약제는 본 발명의 다수의 벡터를 포함한다. 하나의 대안에서, 본 발명은 인간의 엔테로코커스 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제공하며, 약제는 본 발명의 다수의 벡터를 포함한다.
106. 제104 또는 제105 국면에 있어서, 항-숙주 세포 항생제 또는 항-숙주 세포 살생물제를 더 포함하는, 조성물 또는 약제.
아래의 실시예 5는 콜레라에 관한 예이다.
일반적인 기능(아래 참조) 중 일부는 현재 구성(제6 구성)에도 적용될 수 있다. 아래의 임의의 구성은 예를 들어, 본 명세서의 하나 이상의 청구항에 포함되는 특징들의 조합을 제공하기 위해, 본 구성과 결합 가능하다.
CAS 활성 조절
본 발명의 이들 국면은 예를 들어 세포 또는 시험관 내에서 Cas 활성을 조절하는데 유용하다. 본 발명은 Cas 활성을 제한하도록 Cas-인코딩 유전자를 표적화함을 포함하는 것으로, Cas의 일시적인 조절에 유리하다. 본 발명은 또한 예를 들어, 세포의 게놈을 변형시킬 때 오프-타겟 Cas 절단에 대한 기회를 감소시키기 위해, Cas 활성의 증가된 엄격성이 바람직한 환경에서 유용할 수 있다. 예를 들면, 세포, 조직 또는 세포를 포함하는 유기체의 유전자 치료 또는 유전자 표적화와 같이 오프-타겟 영향을 최소화하거나 회피해야하는 인간, 동물 또는 식물 세포를 변형시키는데 응용가능하다. 예를 들면, 유전자 치료 또는 인간의 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위해 환자에게 투여되는, 인간 세포(예: iPS 세포)에서 원하는 변화를 만들기 위해 Cas 변형을 사용하는 경우 매우 높은 엄격성이 요구된다. 본 개시는 본 발명의 방법 및 제품의 일부로서 이들 응용을 제공한다.
따라서, 본 발명은 다음의 조항(clause)을 제공한다: -
1. 제1 Cas를 인코딩하는 발현 가능한 유전자를 변형시키는 방법으로서, 방법은
(a) 상기 유전자로부터 발현되는 제1 Cas의 존재하에 가이드 RNA(gRNA1)를 Cas 유전자와 결합시키는 단계; 및
(b) gRNA1을 상기 Cas 유전자의 서열(예를 들어, 프로모터 또는 이의 제1 Cas-인코딩 DNA 서열)에 혼성화시키고, 제1 Cas를 유전자에 안내함으로써, Cas가 Cas 유전자를 변형시키는 단계를 포함하는, 방법.
하나의 예에서, 방법은 시험관내에서 무-세포 방법(예: 재결합 방법)이다. 또 다른 예에서, 방법은 세포에서 수행되고, 예를 들어, 유전자가 자체를 인코딩하는 Cas에 의해 절단(즉, 내인성 Cas는 유전자를 절단하는데 사용됨)된다.
2. 제1 조항에 있어서, Cas가 뉴클레아제이고 Cas 유전자가 절단되는, 방법.
3. 제1 또는 제2 조항에 있어서, Cas 유전자가 돌연변이되고, 하향 조절 또는 불활성화되는, 방법.
4. 제1 내지 제3 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, 제1 Cas는 Cas9인, 방법.
5. 제1 내지 제4 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, gRNA1는 단일 가이드 RNA인, 방법.
6. 제1 내지 제5 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, 방법은 숙주 세포에서 수행되는, 방법.
7. 제6 조항에 있어서, 세포는 원핵 세포, 예를 들면 박테리아 또는 고세균 세포 (예를 들어, 대장균 세포)인, 방법.
8. 제6 조항에 있어서, 방법은 재조합방법인, 방법.
9. 제6, 7, 또는 8 조항에 있어서, 세포가 인간 또는 인간이 아닌 동물 병원성 종 또는 균주(예: 스타필로코커스 아우레우스)의 세포인, 방법.
10. 제6 내지 제9 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, 세포가 인간 미생물군집 종, 예를 들면, 인간 장내 미생물군집 종의 세포인, 방법.
11. 제6 내지 10 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, Cas 유전자는 숙주 CRISPR/Cas 시스템에 포함되는, 방법.
선택적으로, 예를 들어, 숙주 세포가 gRNA1에 동족인 야생형 내인성 Cas 뉴클레아제를 포함하는 경우, 외인성 제1 Cas-인코딩 서열이 본 방법에서 사용되지 않는다.
12. 제6 조항에 있어서, 세포는 진핵 세포(예를 들면 인간, 인간이 아닌 동물, 효모 또는 식물 세포)인, 방법.
13. 제12 조항에 있어서, 방법은 인간이 아닌 배아(non-human embryo); 인간이 아닌 접합체(non-human zygote); 인간이 아닌 배아 세포(non-human germ cell); 또는 인간 또는 동물(예를 들어, 상기 방법이 미용 방법인 경우)에서 수행되고; 선택적으로 상기 방법은 수술 또는 치료 또는 진단에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법이 아닌, 방법.
14. 제6 내지 제13 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, Cas 유전자가 단계 (a)에서 세포 내로 도입되는 핵산에 포함되는, 방법.
15. 제6 내지 제14 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, 핵산 벡터에 의한 형질 전환 또는 숙주 세포에서의 핵산 벡터의 유지에 대한 숙주 세포 내성의 발달을 감소시키기 위한, 방법.
16. 제1 내지 제15 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, 인간 또는 동물 의학 요법, 예방 또는 진단용(예: 방법이 인간 또는 동물 세포에서 수행되는 경우 인간 또는 동물, 인간 또는 동물 세포의 유전자 치료를 위한, 또는 방법이 박테리아 세포에서 수행되는 경우 인간 또는 동물에서 박테리아 감염을 치료 또는 예방하기 위한) 방법, 또는 이의 핵산 또는 세포 산물.
17. 제1 내지 제6 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, 방법은 시험관내에서 수행되는, 방법.
18. 제1 내지 제16 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, 방법은 생체 내에서 수행되고, 선택적으로 인간 배아에서 수행되지 않고, 선택적으로, 상기 방법은 수술 또는 치료 또는 진단에 의해 인간 또는 동물의 신체를 치료하는 방법이 아닌, 방법.
19. 제1 내지 제18 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, gRNA1은 단계 (a)에서 Cas 유전자와 조합된 제1 핵산으로부터의 전사에 의해 생산되는, 방법.
20. 제19 조항에 있어서, 방법은 세포에서 수행되고, gRNA1을 인코딩하는 제1 핵산은 단계 (a)에서 세포 내로 도입되거나; 또는 crRNA을 인코딩하는 제1 핵산은, crRNA이 세포 내 tracrRNA와 gRNA1을 형성하는 단계 (a)에서 세포 내로 도입되는, 방법.
21. 제19 또는 제20 조항에 있어서, Cas 유전자가 제1 Cas에 의해 변형될 표적 부위(CS-t)를 포함하는 표적 핵산과 결합되고,
I. Cas 유전자는 제1 Cas에 동족인 PAM (P1)에 인접한 제1 프로토스페이서(PS1)를 포함하고, PS1은 제1 Cas에 의해 제1 부위(CS1)에서 변형(예: 절단)되고;
II. gRNA1은 단계 (b)에서 PS1이 CS1에서 변형된 제1 Cas를 안내하기 위해 PS1에 상보적인 서열을 포함하고;
III. 표적 핵산은 PAM(P-t)에 인접한 프로토스페이서 서열(PS-t)을 포함하며, 여기서 P-t는 제1 Cas와 동족이고;
IV. 단계 (b) 전 또는 도중에, 상기 방법은 가이드 RNA(gRNA-t)를 표적 핵산 및 상기 유전자로부터 발현된 제1 Cas와 결합하는 단계를 포함하고, 여기서 gRNA-t는 PS-t에 혼성화되어 제1 Cas를 안내하여 CS-t를 변형시키고;
V. 상기 방법은 변형된 표적 핵산을 분리 또는 시퀀싱하는 단계를 선택적으로 포함하는, 방법.
22. 제21 조항에 있어서, gRNA-t가 단계 IV에서 Cas와 결합된 핵산(예를 들어, 상기 제1 핵산)으로부터 전사에 의해 생성되는, 방법.
23. 제22 조항에 있어서, 방법은 세포에서 수행되고, 핵산은 세포 내에서 tracrRNA와 함께 gRNA-t를 형성하는 crRNA를 인코딩하는, 방법.
24. 제21 내지 제23 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, gRNA1의 생산이 gRNA-t의 생산 후에 개시됨에 따라, PS1이 변형(예: 절단)되기 전에 표적 핵산의 카피에서 PS-t가 변형(예: 절단)되어 제1 Cas 발현을 하향 조절하거나 불활성화시키는, 방법.
25. 제1 내지 제24 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, 절단된 표적 핵산을 추가의 핵산과 결합함으로써, 핵산 간의 상동성 재조합이 발생하고,
(i) 표적 핵산의 뉴클레오타이드 서열이 결실되고;
(i) 추가의 핵산의 뉴클레오타이드 서열이 결실되고;
(iii) 표적 핵산의 뉴클레오타이드 서열이 추가 핵산에 삽입되고; 및/또는
(iv) 추가 핵산의 뉴클레오타이드 서열이 추가 핵산에 삽입되는 것을 추가로 포함하는, 방법.
26. 제25 조항에 있어서, (i)가 수행됨으로써, 표적 핵산의 뉴클레오타이드 서열 또는 조절 요소를 불활성시키는, 방법.
27. 제25 조항에 있어서, (i)가 수행됨으로써, 표적 핵산의 뉴클레오타이드 서열 또는 조절 요소를 활성화시키는, 방법.
28. 제25, 26, 또는 27 조항에 있어서, (ii)가 수행됨으로써, 추가의 핵산의 뉴클레오타이드 서열 또는 조절 요소를 불활성화시키는, 방법.
29. 제25, 26, 또는 27 조항에 있어서, (ii)가 수행됨으로써, 추가의 핵산의 뉴클레오타이드 서열 또는 조절 요소를 활성화시키는, 방법.
30. 제25 내지 29 조항에 있어서, (iii)가 수행됨으로써, 선택적으로 기능적 관계에 있는 삽입된 서열을 추가의 핵산의 조절 요소와 위치시키고/시키거나 새로운 마커 서열을 생성하는, 방법.
31. 제25 내지 30 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, (v)가 수행됨으로써, 선택적으로 기능적 관계에 있는 삽입된 서열을 핵산의 조절 요소와 위치시키고/시키거나 새로운 마커 서열을 생성하는, 방법.
32. 제30 또는 제31 조항에 있어서, 상동성 재조합이 발생했는지를 결정하기 위해 새로운 마커 서열 또는 발현 산물을 검출하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
33. 제21 내지 제32 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, 표적 핵산 산물, 추가 핵산 산물 및/또는 제1 벡터 산물을 분리 또는 시퀀싱하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
34. 제1 내지 제33 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, 제1 벡터는 제35 내지 55 조항 중 어느 하나의 조항에 정의된 바와 같은, 방법.
35. 제1 조항의 방법에서 사용하기 위한, 제1 (예를 들어, 분리된) 핵산 벡터 또는 벡터의 조합으로서,
(a) 제1 벡터 또는 상기 조합의 벡터는 제1 Cas를 안내하기 위한 소정의 프로토스페이서 서열(PS1)에 상보적인 가이드 RNA(gRNA1, 예를 들어 단일 gRNA)를 인코딩하는, 발현가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함하여 제1 부위(CS1)에서 PS1을 변형시키고, 여기서 PS1은 제 1 Cas에 동족인 PAM (P1)에 인접하거나; 또는 발현가능한 서열은 tracrRNA와 함께 gRNA1을 형성하는 crRNA를 인코딩하며;
(b) PS1 및 P1은 발현가능한 제1 Cas-인코딩 유전자의 서열이고, PS1은 제1 Cas에 의해 CS1에서 변형될 수 있는, 제1 핵산 벡터 또는 벡터의 조합.
임의의 구성에서 본 명세서의 각각의 벡터는 특정 서열(들)을 지닌 선형 또는 원형(예를 들어, 폐쇄형 원형, 선택적으로 슈퍼코일형) DNA일 수 있다.
36. 제35 조항에 있어서, 제1 Cas는 뉴클레아제(nuclease)이고, CS1은 뉴클레아제에 의해 절단될 수 있는, 벡터 또는 조합.
37. 제35 또는 제36 조항에 있어서, 제1 Cas는 Cas9인, 벡터 또는 조합.
38. 제35 내지 제37 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, gRNA1는 단일 가이드 RNA인, 벡터 또는 조합.
39. 제35 내지 제38 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열은 gRNA1을 생산하기 위한 원핵 세포(예: 박테리아 또는 고세균 세포)에서 발현될 수 있는, 벡터 또는 조합.
40. 제39 조항의 벡터 또는 조합(예를 들어, 세포가 재조합 허용성의 대장균 세포)을 포함하는 재조합 키트.
41. 제35 내지 제38 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열은 gRNA1을 생산하기 위한 진핵 세포(예: 인간, 동물, 식물 또는 효모 세포)에서 발현될 수 있는, 벡터 또는 조합.
42. 제35 내지 제41 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, 제1 벡터 또는 조합의 벡터(예: 제2 벡터)는 PS-t를 변형(예를 들어, 절단)하기 위해 제1 Cas를 유도하기 위한 표적 핵산의 미리 결정된 프로토스페이서 서열 (PS-t)에 상보적인 가이드 RNA(gRNA-t, 예를 들어 단일 gRNA)를 인코딩하는 발현 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 발현 가능한 서열은 tracrRNA와 함께 gRNA-t를 형성하는 crRNA를 인코딩하고; 표적 핵산은 PAM (P-t)에 인접한 PS-t를 포함하고, 여기서, P-t는 PS-t를 변형시키기 위한 제1 Cas에 동족인, 벡터 또는 조합.
43. 제42 조항에 있어서, 표적 핵산과 추가로 조합된, 벡터 또는 조합.
44. 제43 조항에 있어서, 표적 핵산이 세포의 염색체 또는 에피솜 핵산인, 벡터 또는 조합.
45. 제44 조항에 있어서, 세포가 인간 또는 인간이 아닌 동물 병원성 종 또는 균주(예: 스타필로코커스 아우레우스)인 세포인, 벡터 또는 조합.
46. 제44 또는 제45 조항에 있어서, 세포가 인간 미생물군집 종, 예를 들면, 인간 장내 미생물군집 종의 세포인, 벡터 또는 조합.
47. 제44 내지 제46 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, PS-t가 세포(예: 원핵 세포)의 필수 유전자, 독성 유전자 또는 항생제 내성 유전자 서열에 포함되는, 벡터 또는 조합.
48. 제47 조항에 있어서, 제1 Cas이 PS-t를 변형(예: 절단)할 때 유전자가 하향 조절되거나 불활성화되는, 벡터 또는 조합.
49. 제47 조항에 있어서, 제1 Cas이 PS-t를 변형할 때 유전자가 상향 조절되거나 불활성화되는, 벡터 또는 조합.
50. 제35 내지 제49 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, 제1 Cas(예를 들어, 제1 벡터에 포함됨)를 인코딩하는 유전자와 조합된, 벡터 또는 조합.
51. 제35 내지 제50 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, 세포 내부인 경우, 세포가 제1 Cas를 인코딩하는 유전자를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템을 포함하는, 벡터 또는 조합.
52. 제35 내지 제51 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, 인간 또는 인간이 아닌 동물의 질환 또는 상태를 치료, 예방 또는 진단하기 위한, 예를 들어, 방법이 인간 또는 동물 세포에서 수행되는 경우 인간 또는 동물, 인간 또는 동물 세포의 유전자 치료를 위한, 또는 방법이 박테리아 세포에서 수행되는 경우 인간 또는 동물에서 박테리아 감염을 치료 또는 예방하기 위한, 벡터 또는 조합.
53. 제35 내지 제52 조항 중 어느 하나의 조항에 따른 제1 벡터 또는 조합을 포함하는, 식료품, 식품 성분 또는 전구체 성분, 음료수, 물(예: 인간이 섭취하는 것을 목적으로 함), 산업 또는 환경 물질(예: 석유, 석유 제품, 토양 또는 수로 또는 저장고; 또는 석유, 석유 제품, 토양, 물, 식료품, 식료품 성분 또는 전구체, 또는 음료 또는 전구체의 음료 성분을 회수 또는 가공하는 장비).
54. 제35 내지 제52 조항 중 어느 하나의 조항에 따른 제1 벡터 또는 조합의 항생제(예를 들어, 항-박테리아 또는 항-고세균) 조성물.
55. 제35 내지 제52 조항 중 어느 하나의 조항에 따른 제1 벡터 또는 조합을 포함하는, 인간 또는 동물에서 질환 또는 상태(예를 들어, 박테리아 감염 또는 비만)을 치료 또는 예방하기 위한, 약제.
하나의 예에서, 벡터, 조합물, 약제 또는 항생제는 의료 기기 또는 의료 컨테이너(예: 주사기, 흡입기 또는 IV 백)에 포함된다.
일반적인 기능(아래 참조) 중 임의의 것은 현재 구성에도 적용될 수 있다. 아래의 임의의 구성은 예를 들어, 본 명세서의 하나 이상의 청구항에 포함되는 특징들의 조합을 제공하기 위해, 본 구성과 결합 가능하다.
일반적으로 적용 가능한 특징
다음 특징들은 본 발명의 임의의 구성(예를 들어, 임의의 국면, 실시형태, 컨셉, 단락 또는 실시예)에 적용된다:
하나의 예에서, 표적 서열은 염색체 서열, 내인성 숙주 세포 서열, 야생형 숙주 세포 서열, 비 바이러스 성 염색체 숙주 세포 서열, 외인성 서열 및/또는 비-파지 서열 (즉, 이들 중 하나 이상 또는 전부)이 아니고, 예를 들어, 서열은 항생제 내성 유전자 또는 숙주 세포 염색체에 포함되는 필수 유전자 서열과 같은 야생형 숙주 염색체 세포 서열이다. 하나의 예에서, 서열은 숙주 세포 플라스미드 서열, 예를 들어, 항생제 내성 유전자 서열이다.
하나의 예에서, 적어도 2 개의 표적 서열은 Cas, 예를 들어 항생제 내성 유전자 및 필수 유전자에 의해 변형된다. 이 방식에서 다중 표적화는 탈출 돌연변이 숙주 세포의 진화를 감소 시키는데 유용할 수 있다.
하나의 예에서, Cas는 야생형 내인성 숙주 세포 Cas 뉴클레아제이고/이거나 각각의 숙주 세포는 야생형 숙주 세포이다. 따라서, 본 발명의 하나의 실시형태에서, 본 발명은 관련된 Cas 활성을 제공하기 위해 먼저 내인성 Cas의 발현을 활성화할 필요없이 숙주 세포를 사용한다. 하나의 예에서, 각 숙주 세포는 구성적인 Cas 뉴클레아제 활성, 예를 들어, 구성적인 야생형 Cas 뉴클레아제 활성을 갖는다. 하나의 예에서, 숙주 세포는 박테리아 세포이고; 다른 예에서, 숙주 세포는 고세균 세포이다. 내인성 Cas의 사용은 HM- 또는 PM-cRNA 또는 gRNA를 인코딩하는 벡터에서 공간을 확보할 수 있기 때문에 유리하다. 예를 들어, 유형 II Cas9 뉴클레오타이드 서열이 크고, 대신에 숙주 세포의 내인성 Cas의 사용은 유형 II CRISPR/Cas 시스템이 본 발명에서 숙주 세포 변형을 위해 사용될 때 유리하다. 가장 일반적으로 사용되는 Cas9는 4.2 킬로베이스(kb)로 측정되며 S. 피오게네스에서 유래한다. 효율적인 뉴클레아제인 반면, 분자의 길이는 벡터가 수용할 수 있는 유전 물질의 양을 제한하여 살아있는 동물의 조직 및 본원에 설명된 다른 환경에서 CRISPR을 사용하는 장벽을 만든다(참조 문헌: FA Ran 외, "In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9," Nature, doi:10.1038/nature14299, 2015). 따라서, 하나의 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 AAV 벡터이거나 AAV 벡터보다 크지 않은 외인성 DNA 삽입 용량을 가지며, Cas는 바이러스 또는 고세균 세포인 숙주 세포의 내인성 Cas이다.
S. 서모필러스 Cas9 (UniProtKB-G3ECR1 (CAS9_STRTR)) 뉴클레오타이드 서열은 1.4kb의 크기를 갖는다.
따라서, 하나의 실시형태에서, 본 발명은 다음을 제공한다:
CRISPR/Cas 시스템의 성분을 인코딩하는 1.4kb를 초과하거나 또는 4.2 kb를 초과하는 외인성 DNA 서열을 포함하는 핵산 벡터를 제공하며, 여기서, 서열은 숙주 세포(본원에서 임의의 세포, 예를 들어, 인간, 암세포 또는 박테리아 또는 고세균류 숙주 세포)에서 하나 이상의 HM- 또는 PM-crRNA 또는 gRNA를 발현시키기 위한 조작된 어레이 또는 조작된 서열(선택적으로 본원에서 기술된 바와 같음)을 포함하고, 어레이 또는 조작된 서열은 cRNA(들) 또는 gRNA(들)에 동족인 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않으며; 선택적으로 적어도 2, 3 또는 4개의 cRNA 또는 gRNA는 외인성 DNA에 의해 인코딩된다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포는 crRNA 또는 gRNA에 동족인 Cas 뉴클레아제를 발현하는 박테리아 또는 고세균 세포이다. 인간 또는 동물(예: 설치류, 랫트 또는 마우스) 세포와 함께 사용하는 것과 같은 다른 예에서, Cas 뉴클레아제는 상이한 핵산 벡터에 의해 인코딩된다. 하나의 예에서, 세포가 인간 또는 동물 세포이고, 벡터는 AAV 또는 렌티 바이러스 벡터이다. 하나의 예에서, 본 발명은 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하며, 숙주 세포는 상기 Cas를 발현한다. 하나의 예에서, 숙주 세포는 생체 외 인간 또는 동물 세포이다.
본 발명은 또한 다음을 포함한다:
1.4 kb를 초과 또는 4.2kb를 초과하는 외인성 DNA 서열을 포함하는 핵산 벡터로서, 여기서, 외인성 DNA는 CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 성분을 인코딩하고, 숙주 세포에서 하나 이상의 HM-crRNA 또는 gRNA를 발현하기 위한 조작된 어레이 또는 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)을 포함하고, 외인성 서열은 cRNA(들) 또는 gRNA(들)에 동족인 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 결여되어 있고; 선택적으로 적어도 2개의 상이한 cRNA 또는 gRNA가 외인성 DNA에 의해 인코딩된다. 하나의 예에서, 본 발명은 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하며, 숙주 세포는 상기 Cas를 발현한다. 하나의 예에서, cRNA 또는 gRNA는 숙주 세포에서 각각의 표적 프로토스페이서 서열에 혼성화될 수 있으며, 각 프로토스페이서 서열은 항생제 내성 또는 필수 숙주 유전자에 포함된다. 이는 혼합된 및 비-혼합된 세포 개체군에서 적어도 10 배의 선택적 숙주 세포 성장 억제를 나타내는 본 발명의 수행된 실시예에 의해 예시된다. 혼합물은 인간 미생물군에서 발견된 종과 균주의 조합을 시뮬레이션한다.
"CRISPR/Cas 시스템의 성분을 인코딩하는 외인성 DNA 서열"은 벡터 주쇄에 삽입된 DNA 또는 상기 삽입이 (예를 들어, 재조합 DNA 기술, 예를 들면, 재결합을 사용하여) 이전에 일어난 벡터의 후대에서의 이러한 DNA를 의미한다. 하나의 예에서, 외인성 DNA는 벡터의 삽입 용량의 95, 90, 80, 85, 70 또는 60%이다.
하나의 예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 외인성 DNA 삽입을 위한 특히 제한된 용량을 가지므로 바이러스 포장 용량을 고려할 필요가 있다. 피복 단백질과 중합 효소를 발현하는 것과 같이 중요한 바이러스 기능을 인코딩하는 서열을 위해 공간을 남겨 둘 필요가 있다. 하나의 예에서, 벡터는 파지 벡터 또는 AAV 또는 렌티바이러스 벡터이다. 파지 벡터는 숙주가 박테리아 세포인 경우에 유용하다.
본 발명은 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 인간 또는 동물 대상에서 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위한) 복합 제품 키트를 제공하며, 키트는 항생제(제 1 항생제)와 조합된 어레이, 벡터, 시스템, 세포, 조작된 cRNA 또는 gRNA-인코딩 서열 또는 cRNA 또는 gRNA를 포함하며, cRNA 또는 gRNA는 항생제가 제 1 항생제인 박테리아 숙주 세포 항생제 내성 유전자에 포함되는 프로토스페이서 서열에 혼성화될 수 있다. 항생제는 본 명세서에 개시된 임의의 항생제일 수 있다. 하나의 실시형태에, 항생제는 어레이, 벡터, 시스템, 세포, 조작된 cRNA 또는 gRNA-인코딩 서열 또는 cRNA 또는 gRNA와의 형성에서 조합된다. 하나의 예에서, 키트는 어레이, 벡터, 시스템, 세포, 조작된 cRNA 또는 gRNA-인코딩 서열 또는 cRNA 또는 gRNA를 포함하는 컨테이너와는 별도의 컨테이너에 항생제를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 달리 명시되지 않는 한, 상기 또는 각각의 세포는 박테리아 세포, 고세균 세포, 조류 세포, 진균 세포, 원생 동물 세포, 무척추 세포, 척추 세포, 어류 세포, 조류 세포, 포유 동물 세포, 동반자 동물 세포, 개 세포, 고양이 세포, 말 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 토끼 세포, 진핵 세포, 원핵 세포, 인간 세포, 동물 세포, 설치류 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포이다. 또한, 이 경우 바람직하게는 세포는 동일한 문, 목, 과, 또는 속을 갖는다.
용어 "조작된(engineered)"을 사용함으로써, 본 발명의 어레이, 서열, 벡터, MGE 또는 임의의 다른 구성, 컨셉, 국면, 실시 양태, 단락 또는 실시예 등이 비-자연발생적으로 발생한다는 것은 당업자에게 명백 할 것이다. 예를 들어, MGE, 벡터 또는 어레이는 MGE, 벡터 또는 어레이의 다른 서열 또는 구성 요소와 함께 자연적으로 발견되지 않는 하나 이상의 서열 또는 구성 요소를 포함한다. 예를 들어, 어레이는 각각의 또는 상기 숙주 세포에 대해 재조합, 인공, 합성 또는 외인성(즉, 비-내인성 또는 야생형이 아님)이다.
하나의 예에서, 본 발명의 어레이 또는 벡터는 분리되고, 예를 들어 숙주 세포로부터 분리된다. 하나의 예에서 어레이 또는 벡터는 어레이의 반복 서열과 함께 세포에서 자연적으로 발견되는 Cas 엔도뉴클레아제-인코딩 서열과 조합되어 있지 않다.
하나의 예에서, 벡터, MGE 또는 어레이는 숙주 세포가 아닌 경우 Cas 엔도뉴클레아제-인코딩 서열과 조합되지 않는다. 하나의 예에서, 벡터 또는 MGE는 Cas 엔도뉴클레아제-인코딩 서열을 포함하지 않는다.
하나의 예에서, 표적 변형 또는 절단은 dsDNA Cas 뉴클레아제(예: Cas9, 예를 들어 spCas9 또는 saCas9)에 의해 수행됨으로써, 절단의 수리는 비-동종 말단 부착 (NHEJ)에 의해 수행된다. 이것은 전형적으로 수리 부위에서 돌연변이(indels)를 유도하는데, 이는 표적 부위 (예를 들어, 파지 유전자 또는 조절 요소, 예를 들어, 이의 필수 유전자 또는 조절 요소)의 불활성화에 유용하다. 다른 예에서, 절단은 단일 가닥에서 절단하는 ssDNA Cas 뉴클레아제(예: Cas9 뉴클레아제)에 의해 수행된다(그러나 이중 가닥 DNA 절단을 하지는 않음). 이는 절단의 HDR 수리를 선호할 때 유용하고, indels의 가능성을 줄인다. 이는 표적 부위(또는이를 포함하는 유전자 또는 조절 요소)가 바람직할 때 유용할 수 있는데, 예를 들어 표적 부위에 HM- 또는 PM-DNA가 삽입되어 원하는 부위를 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 이 경우, 변형된 유전자는 숙주 DNA-인코딩된 서열에 융합된 HM-DNA-인코딩된 아미노산 또는 파지 DNA-인코딩된 서열에 융합된 PM-DNA-인코딩된 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 생성한다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 융합 단백질을 인코딩하는 서열을 제공한다. 다른 예에서, HM- 또는 PM-DNA는 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 억제자 또는 유전자 발현을 조절하기 위한 유도성 스위치)를 포함하여, 융합 제품이 숙주 또는 파지 유전자 또는 조절 요소 DNA에 융합된 DNA를 포함함으로써, 융합 유전자를 생산한다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 융합 유전자를 제공한다. 하나의 실시형태에서, 본 발명은 이러한 융합 유전자를 포함하는 벡터(예: 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드, 프로파지 또는 플라스미드)를 제공하며, 선택적으로 벡터는 박테리아 세포(예: 원핵 생물, 진핵 생물, 박테리아, 고세균 또는 효모 세포)에 함유된다. 하나의 예에서, 세포는 시험관내에 있다.
하나의 예에서, HM- 또는 PM-DNA는 세포 내부의 벡터 DNA이다. 예를 들어, 벡터에서 HM- 또는 PM-DNA는 숙주 세포 또는 벡터 서열에 의해 인코딩되는 부위-특이적 재조합 효소의 작용에 의해 절단되는 부위-특이적 재조합 부위(예를 들어, frt 또는 lox 부위)에 측면에 위치할 수 있다. 다른 예에서, 벡터는 HM- 또는 PM-DNA의 RNA 카피로 전사되는 DNA 및 RNA로부터 HM- 또는 PM-DNA를 생성하기 위한 역전사효소(예를 들어, 벡터 핵산 서열에 의해 인코딩됨)를 포함한다. 이는 하나 이상의 표적 부위에서 효율적이고 효과적인 도입 기회를 높이기 위해 원하는 HM-DNA 또는 PM-DNA의 많은 카피를 생성하는 데 유용하다. 또 다른 실시형태에서, HM- 또는 PM-DNA는 숙주 세포를 형질 감염 시키거나 형질 전환한 제2 벡터(예를 들어, 제 2 파지 또는 플라스미드)의 핵산이거나 또는 핵산에 의해 인코딩된다. 예를 들어, 이것은 헬퍼 파지일 수 있다(제1 파지 벡터의 포장에 필요한 하나 이상의 코트 단백질을 안코딩할 수도 있음). 또 다른 예에서, DNA는 벡터 DNA에서 제공되고, 암(arm)이 측면에 위치하며, 5' 암(5' arm)은 벡터가 숙주 세포에 함유시 Cas 뉴클레아제에 의해 인식되는 PAM을 포함하고, 3' 암은 이러한 PAM에 의해 하류(3') 측면 가까이에 위치함으로써, 숙주 세포에서 Cas 절단은 숙주 표적 서열의 절단부에 인접한 숙주 서열과 상동성이 있도록 설계될 수 있는 이의 측면 암으로 HM- 또는 PM-DNA를 유리시켜 HM-DNA가 숙주 게놈에 통합되고, 또는 PM-DNA가 파지 게놈에 통합되어 있다. 하나의 국면에서, 본 발명은 이러한 HM- 또는 PM-DNA를 포함하는 핵산 및 이러한 핵산을 포함하는 암 또는 벡터(예를 들어, 파지 또는 포장된 파지)를 제공하고, 선택적으로 벡터는 숙주 세포에 의해 함유된다. 선택적으로, HM-DNA는 본 명세서에서 정의된 HM-어레이와 조합된다. 선택적으로, HM-DNA는 본 명세서에서 정의된 PM-어레이와 조합된다.
본 발명의 특정 적용은 생체 외 또는 생체 내 혼합된 박테리아 개체군에서의 박테로이데테스(예: 박테로이데스) 박테리아의 비율의 변경이다. 상기 논의된 바와 같이, 이것은 바람직하지 않은 박테로이데테스로 감염된 수로 또는 식수의 처리와 같은 환경적 처리 또는 인간 또는 동물에서 유용한 공생 또는 생리공생 박테로이데테스를 선호하는 것, 예를 들어 이러한 목적을 위해 인간 또는 동물에게 투여하기 위한 박테리아 배양물의 제조에 유용할 수 있다. 후자의 예에서, 본 발명은 체중의 감소와 관련된 박테로이데테스 대 페르미쿠테스의 상대적 비를 증가시키는데 유용하며, 따라서 의료 또는 미용 목적의 비만 치료 또는 예방에 유용하다.
연구에 따르면 박테로이데스는 클로스트리디움 디피실의 감염 예방에 중요한 역할을 한다. 잠재적인 병원체의 진입과 증식을 제한하는 면역 반응의 발달은 B. 프라질리스에 크게 의존한다. 또한, 파네스(Paneth) 세포 단백질은 B 테타이오토마이크론에 의한 자극에 반응하여 항균 펩타이드를 생성할 수 있으며, 이들 분자는 병원균이 장을 콜로니화시키는 것을 방지할 수 있다. 또한, B 테타이오토마이크론은 파네스 세포가 그람 양성 유기체의 펩티도글리칸(peptidoglycan)에 결합함으로써 항균 효과를 발휘하는 살균 렉틴 RegIII를 생산하도록 유도할 수 있다. 따라서, 장내 박테리아의 혼합된 개체군에서 박테로이데스(예를 들어, 테타이오토마이크론 및/또는 프라질리스)의 비율을 증가시키기 위한 임의의 이의 구성에서의 본 발명의 사용은 개체군 또는 인간 또는 인간이 아닌 동물의 장내 병원성 박테리아 콜로니화를 제한하는데 유용하다.
후퍼(Hooper) 등은 B 테타이오토마이크론이 푸코스 억제 유전자 및 신호 시스템에 의해 매개되는 복잡한 상호 작용에서 장내 푸코실화를 변형시킬 수 있음을 입증했다. 전사 분석을 사용하여 B 테타이오타오마이크론은 영양소 흡수, 점막 장벽 강화 및 혈관 형성 인자 생산과 관련된 다양한 숙주 유전자의 발현을 조절할 수 있음이 입증되었다.
하나의 실시형태에서, 혼합된 개체군은 제1 및 제2 박테리아 (즉, 박테리아 개체군이 추가로 없음)로 구성된다.
하나의 예에서, 상기 또는 각 어레이는 벡터 내의 재조합 어레이 및/또는 벡터 내의 분리된 어레이이다. 하나의 예에서, 어레이는 숙주 세포(예: 미생물, 박테리아 또는 고세균 세포)에 포함되어 있다.
하나의 예에서, 상기 Cas는 숙주 세포의 내인성 Cas 뉴클레아제(예 : Cas9)이다. 숙주의 Cas를 이용함으로써, 어레이 내에서의 숙주-유형 반복의 효율적인 사용 및 내인성 crRNA의 사용 가능성을 가능하게 하여 바이러스 또는 파지와 같은 벡터에서 제한된 용량을 확보할 수 있다(유형 II Cas9와 같은 Cas 유전자 서열은 큰 것에 주목한다).
하나의 예에서, 숙주 CRISPR/Cas 시스템은 유형 I 시스템이다. 하나의 예에서, 숙주 CRISPR/Cas 시스템은 유형 II 시스템이다. 하나의 예에서, 숙주 CRISPR/Cas 시스템은 유형 III 시스템이다.
본 발명의 HM-crRNA 또는 gRNA에 의해 안내되는 Cas는 표적 서열에서 PAM과 양립 가능한 숙주-내인성 Cas 또는 벡터-인코딩된 Cas이다.
선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 그람 음성 박테리아(예: 스피릴라 또는 비브리오)이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 그람 양성 박테리아이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 마이코플라스마, 클라미디아, 스피로체트 또는 마이코박테리움이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 스트렙토코커스(예를 들어, 피오게네스 또는 서모필러스) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 스타필로코커스 (예를 들어, 아우레우스, 예: MRSA) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 대장균(예를 들어, O157 : H7) 숙주이고, 예를 들어, Cas가 벡터에 의해 인코딩되거나 또는 내인성 숙주 Cas 뉴클레아제 활성의 발현이 활성화된다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 슈도모나스(예를 들어, 에루지노사) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 비브리오(예를 들어, 콜레라, 예: O139 또는 불니피쿠스) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 나이세리아(예를 들어, 고노르호애 또는 메닌지티디스) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 보르데텔라(예를 들어, 백일해) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 해모필러스(예를 들어, 인플루엔자) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 시겔라(예를 들어, 디센테리에) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 부르셀라(예를 들어, 아보르투스) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 프란시셀라 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 크산토모나스 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 아그로박테리움 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 에르비니아 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 리지오넬라(예를 들어, 뉴모필라) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 리스테리아(예를 들어, 모노사이토제니스) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 캄필로박터(예를 들어, 제주니) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 예르시니아(예를 들어, 페스트) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 보렐리아(예를 들어, 부르그도르페리) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 헬리코박터(예를 들어, 파일로리) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 클로스트리디움(예를 들어, 디피실 또는 보툴리눔) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 에를리히아(예를 들어, 샤펜시스) 숙주이다. 선택적으로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 살모넬라 (예컨대, 티피 또는 엔테리카, 예를 들어, 혈청형 티피무륨, 예를 들어, DT 104) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 클라미디아(예를 들어, 뉴모니에) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 파라클라미디아(Parachlamydia) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 코리네박테리움(예를 들어, 아미코락툼) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 클렙시엘라(예를 들어, 뉴모니에) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 엔테로코커스 (예를 들어, 패칼리스 또는 패시움: 리네졸리드-내성) 숙주이다. 선택적으로, 숙주(또는 제1 및/또는 제2 박테리아)는 아시네토박터(예를 들어, 바우만니, 예: 다중 약물 내성) 숙주이다.
하나의 예에서, 세포는 원핵 세포이다. 하나의 예에서, 세포는 박테리아 세포이다. 하나의 예에서, 세포는 고세균 세포이다. 하나의 예에서, 세포는 미생물 세포이다. 하나의 예에서, 세포는 원물 세포이다. 하나의 예에서, 세포는 물고기 세포이다. 하나의 예에서, 세포는 새 세포이다. 하나의 예에서, 세포는 파충류 세포이다. 하나의 예에서, 세포는 거미류 세포이다. 하나의 예에서, 세포는 효모 세포 (예: 사카로마이세스 세포)이다. 하나의 예에서, 숙주 세포는 식물 세포이다. 하나의 예에서, 숙주 세포는 동물 세포(예: 인간 세포가 아니라 설치류 세포)이다. 하나의 예에서, 숙주 세포는 인간 세포 (예: 배아 내 세포 또는 인간 내 세포가 아닌), 예를 들어 시험관 내 숙주 세포이다. 하나의 예에서, 세포는 가축 또는 동행하는 애완용 동물 세포 (예: 암소, 돼지, 염소, 양, 말, 개, 고양이 또는 토끼 세포)이다. 하나의 예에서, 숙주 세포는 곤충 세포(예: 달걀, 유충 또는 번데기의 모든 단계에서 곤충). 하나의 예에서, 숙주 세포는 원생 세포이다. 하나의 예에서, 세포는 두족류(cephalopod) 세포이다.
선택적으로, 어레이, 시스템, 조작된 뉴클레오타이드 서열 또는 벡터 핵산은 숙주 세포가 진핵 세포, 예를 들어, 식물 또는 동물인 경우, 핵을 표적화하기 위해 하나(예를 들어, 하나, 둘, 그 이상) 핵 편재 신호(NLS)를 추가로 포함한다. 하나의 예에서, NLS는 본 발명의 Cas-인코딩 핵산 서열의 각 말단 및/또는 본 발명의 어레이에 측면에 위치하여 - 특히 진핵 숙주 세포에서의 표적화에 사용된다.
tracrRNA 서열은 본 발명의 어레이 또는 벡터, 예를 들어 tracrRNA를 사용하지 않는 유형의 Cas 시스템에서 생략될 수 있다.
하나의 예에서, 표적으로 안내된 Cas는 엑소뉴클레아제(exonuclease)이다. 선택적으로, 본 명세서에서 언급된 니카아제는 이중 니카아제이다.
니카아제의 예는 Cas9 니카아제, 즉 RuvC 및/또는 HNH 도메인 중 하나가 불활성화된 2 개의 뉴클레아제 도메인 중 하나를 갖는 Cas9이다.
선택적으로, 숙주 시스템은 유형 I 시스템이다(선택적으로 어레이, HM-crRNA 또는 gRNA는 다른 CRISPR 시스템, 예를 들어, 유형 II 또는 III이다). 선택적으로, 어레이 또는 조작된 서열은, 예를 들어 Cas가 숙주 시스템과 효율적으로 작동하지 않거나 작동하지 않는 어레이, HM-crRNA 또는 gRNA와 동일한 시스템의 Cas를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 바이러스 또는 플라스미드에서 조합된다. 선택적으로, 숙주 시스템은 유형 II 시스템이다(선택적으로 어레이, HM-crRNA 또는 gRNA는 다른 CRISPR 시스템, 예를 들어, 유형 II 또는 III이다). 선택적으로, 어레이 또는 조작된 서열은, 예를 들어 Cas가 숙주 시스템과 효율적으로 작동하지 않거나 작동하지 않는 어레이, HM-crRNA 또는 gRNA와 동일한 시스템의 Cas를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 바이러스 또는 플라스미드에서 조합된다. 선택적으로, 숙주 시스템은 유형 III 시스템이다(선택적으로 어레이, HM-crRNA 또는 gRNA는 다른 CRISPR 시스템, 예를 들어, 유형 II 또는 III이다). 선택적으로, 어레이 또는 조작된 서열은, 예를 들어 Cas가 숙주 시스템과 효율적으로 작동하지 않거나 작동하지 않는 어레이와 동일한 시스템의 Cas를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 바이러스 또는 플라스미드에서 조합된다.
또 다른 실시형태에서 벡터 DNA를 사용하는 것에 대한 언급은 문맥이 허용하는 경우 벡터 RNA에 대해 적용 가능하다. 예를 들어, 벡터가 RNA 벡터인 경우이다. 그러므로 본 발명의 모든 특징은 대안으로 개시되어 있으며, 본원에서 벡터 DNA를 언급 할 때 문맥이 허락하는 한 "DNA"대신에 "RNA"로 기재된다. 하나의 예에서, 상기 또는 각 벡터는 역전사 효소를 인코딩한다.
하나의 예에서, 상기 또는 각각의 어레이 또는 조작된 뉴클레오타이드 서열은 나노 입자 벡터에 의해 또는 리포좀 내에서 제공된다.
하나의 예에서, Cas는 절단을 위한 Cas 뉴클레아제, 차단을 위한 죽은 Cas (dCas) 또는 표적 활성화를 위한 전사 활성화제에 접합된 dCas이다.
하나의 예에서, 숙주 CRISPR/Cas 시스템은 숙주에서 뉴클레오타이드 서열 표적화를 위한 숙주 CRISPR 어레이 및 동족 숙주 Cas를 포함한다. 하나의 예에서, 숙주 표적 서열은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 또는 40 개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다. 하나의 예에서, 표적 서열은 Cas, 예를 들어, Cas9에 의해 절단된다. 하나의 실시형태에서, 서열은 스페이서에 존재하지 않는다.
하나의 예에서, 상기 또는 각 어레이 또는 조작된 서열은 숙주 내에서의 crRNA 또는 gRNA의 전사에 대해 기능하는 외인성 프로모터를 포함한다.
하나의 예에서, 상기 또는 각 어레이 반복은 숙주 어레이에서의 반복과 동일하며, CRISPR 어레이는 숙주 CRISPR/Cas 시스템의 Cas (예를 들어, Cas 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9)에 의해 인식되는 PAM을 포함하지 않는다. 이는 HM-crRNA 및 gRNA의 반복 서열에 준용 적용된다. 이 실시 형태는 단순히 CRISPR 어레이가 내인성 숙주 Cas를 사용하여 숙주 표적 서열을 표적화할 수 있게 하기 때문에 유리하다. 이것은 어레이가 숙주 기계 장치에 의해 사용되도록 맞춤화되어 숙주 세포에서 기능하는데 도움이 되므로 효율적이다. 부가적으로 또는 대안으로(예를 들어, 어레이가 외인성(비-숙주 내인성) Cas-인코딩 서열과 조합하여 제공되는 경우), 이 실시형태는 CRISPR 어레이가 내인적-인코딩된 tracrRNA를 사용하는 것을 가능하게 하는데, CRISPR 어레이 반복은 pre-crRNA 생산 및 숙주 표적 서열에 혼성화되는 성숙한 crRNA 로의 가공을 위해 내인성 tracrRNA에 혼성화될 것이기 때문이다. 후자의 복합체는 CRISPR 어레이에 포함된 서열로부터 생성된 내인성 Cas 뉴클레아제(예: Cas9) 를 안내하거나 Cas를 안내할 수 있다. 따라서, 이 실시형태는 CRISPR 어레이를 함유하나 tracrRNA- 및/또는 Cas 뉴클레아제-인코딩 서열을 포함하지 않는 벡터(예를 들어, 포장된 바이러스 또는 파지)를 간단하게 제조하는 유연성을 제공한다. 이는 벡터 구축에 보다 직관적이며, 벡터(예: 바이러스 또는 파지)의 소중한 공간을 확보하여, 벡터, 특히 바이러스 벡터(예: 파지)의 용량 제한을 고려하는데 있어서 유용하다. 예를 들어, 숙주 유전자를 불활성화 시키거나 숙주에서 발현을 위해 원하는 비숙주 서열을 도입하는 것과 같이, 어레이 내에 더 많은 스페이서를 포함시킬 수 있는 것, 예를 들면, 변형을 위해 숙주 게놈을 표적화하는데 추가 공간은 유용 할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 벡터에 다수의 CRISPR 어레이를 포함시키는데 공간을 사용할 수 있다. 예를 들어, 이들은 제1 어레이가 제 1 CRISPR/Cas 유형 (예를 들어, 유형 II 또는 유형 II-A)이고 제 2 어레이가 제 2 유형 (예를 들어, 유형 I 또는 III 또는 유형 II-B)인 어레이일 수 있다. 부가적으로 또는 대안으로, 어레이는 숙주에서 상이한 Cas 뉴클레아제를 사용할 수 있다(예를 들어, 하나의 어레이는 숙주 Cas 뉴클레아제로 작동 가능하고 제2 어레이는 외인성 Cas 뉴클레아제 (즉, 벡터-인코딩된 뉴클레아제)로 작동 가능함). 이러한 국면은 일단 벡터가 도입되면 숙주에서 표적화하기 위한 기계 장치를 제공하는데, 이는 벡터에 대한 숙주 내성을 감소시키는데 유리하고, 따라서 숙주는 더 넓은 범위의 요소를 표적으로 할 필요가 있다. 예를 들어, 숙주가 제1 CRISPR 어레이 서열에 기초한 새로운 스페이서를 획득할 수 있다면, 제2 CRISPR 어레이는 숙주 세포 내에서 각각의 표적 서열을 표적하기 위해 숙주 내에서 여전히 기능 할 수 있다. 따라서, 이 실시형태는 벡터에 대한 숙주 적응을 감소시키는데 유용하다.
또 다른 이점은, 다수 카피의 동일한 스페이서(예를 들어, 표적을 숙주 세포에서 표적 부위를 표적화하는데 사용되는 스페이서)를 CRISPR 어레이(또는 벡터 내 다수의 어레이에 걸쳐 분포)에 포함시키는 것이 (예를 들면, 이 배열로) 가능하다는 것이다. 박테리아와 고세균과 같은 숙주의 적응은 스페이서가 유익한 숙주 DNA를 표적으로 하는 이들의 어레이로부터 스페이서의 손실을 포함할 수 있다고 제안되었기 때문에 유익하다(참조 문헌: PLoS Genet. 2013;9(9):e1003844. doi: 10.1371/journal.pgen.1003844. Epub 2013 Sep 26, "Dealing with the evolutionary downside of CRISPR immunity: bacteria and beneficial plasmids", Jiang W 외). 스페이서 반복-단위의 제거는 반복 서열의 재조합을 통해 일어난다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 본 국면에 따르면, 숙주 표적 서열에 혼성화하기 위한 스페이서의 다수(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100 이상) 카피를 포함하는 본 발명의 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 CRISPR 어레이 또는 조작된 서열이 제공된다. 이것은 숙주 세포에서 재조합에 의해 손실되는 모든 스페이서의 기회를 감소시킨다. 이 국면의 다른 적용에서, CRISPR 어레이는 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90 이상)의 스페이서 카피를 포함하는 제1 어레이 및 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4 5, 10,15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90 이상)의 동일한 스페이서 카피를 포함하는 제2 어레이를 포함하고, 제1 어레이 내의 스페이서 카피는 각각 제1 반복에 측면에 위치되고 제2 어레이 내의 동일한 스페이서 카피는 각각 제2 반복에 측면에 위치되며, 제1 반복은 제2 반복과는 상이하다. 이는 제1 및 제2 반복 중 적어도 하나가 숙주 Cas 뉴클레아제(또는 동일한 숙주 Cas 뉴클레아제)에 의해 인식되지 않도록 선택되어 하나를 초과하는 어레이를 포함하는 숙주 적응의 기회를 감소시킬 수 있다는 점에서 잇점을 갖는다. 예를 들어, 제1 어레이는 숙주 세포에 의해 인코딩되지 않고 제1 반복을 위한 동족체 Cas 인 Cas 뉴클레아제 서열과 조합된다. 선택적으로, 또한 제2 어레이는 숙주 세포에 의해 인코딩되지 않고 제2 반복용 동족체 Cas 인 Cas 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 제 1 어레이와 동일하거나 상이함)과 조합한다.
하나의 실시형태는 제1 벡터에 함유된 제1 어레이 및 제1 어레이를 함유하지 않는 제2 벡터에 함유된 제2 어레이를 제공한다(예를 들어, 벡터는 플라스미드 또는 비리온(예를 들어, 동일한 바이러스 유형) 또는 포장된 파지(예를 들어, 동일한 파지 유형). 이는 벡터가 동일한 숙주 세포 내로 동시에 또는 순차적으로 도입될 수 있기 때문에 유용하다. 따라서, 숙주가 제1 어레이에 대한 내성을 얻었을 때, 제2 어레이를 도입하여 내성 숙주(예를 들어, 박테리아 또는 고세균)가 미리 공동-진화되지 않은 제2 어레이를 제공함으로써, 숙주 세포에 대한 제2 변형(예를 들어,녹다운) 웨이브를 제공한다. 이는 또한 제1 및 제2 어레이 및 스페이서와 상이한 스페이서 또는 어레이를 포함하는 제3 벡터가 제2 벡터와 동시에 또는 순차적으로 숙주 세포 내로 도입되어, 제 1 어레이에서 스페이서에 내성인 숙주의 진화 중에 이전에는 존재하지 않았던 숙주 세포 변형에 대한 추가 경로를 제공할 수 있기 때문에 유연성을 제공한다. 어레이 대신에, 본 발명의 조작된 뉴클레오타이드 서열을 사용할 수 있다.
따라서, 하나의 실시 형태에서, 본 발명은 숙주 세포를 변형시키기 위한 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 어레이 또는 조작된 서열을 제공한다. 따라서, 하나의 실시 형태에서, 본 발명은 숙주 세포를 변형시키기 위한 조성물을 제공하며, 조성물은 제1 벡터(예: 비리온 또는 포장된 파지)에서 본원에 기재된 바와 같은 제 1 어레이 및 제2 벡터(예를 들어, 각각 비리온 또는 포장된 파지)에서 본원에 기재된 바와 같은 제1 어레이를 제공하며, 제 2 어레이는 하나 이상의 숙주 표적 서열을 표적으로 하고 제1 어레이에 포함되지 않는 하나 이상의 스페이서를 포함한다. 어레이 대신에, 본 발명의 조작된 뉴클레오타이드 서열을 사용할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 어레이 또는 조작된 서열은 바이러스 파지 벡터에 포함되며, 숙주는 대안적으로는 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스이다. 예를 들어, 숙주는 아메바 세포를 감염시킬 수 있는 커다란 바이러스이다. 예를 들어, 숙주는 스푸트니크 (Sputnik) 바이러스, 피토 바이러스 (Pithovirus), 미미 바이러스 (mimivirus), 마마 바이러스 (mamavirus), 메가 바이러스 또는 판도라 바이러스이고, 예를 들어, 숙주 바이러스는 수중에 존재한다. 이 실시형태의 예에서, 본 발명은 물 또는 하수 처리(예를 들어, 정제, 수로, 강, 호수, 연못 또는 바다 처리)와 같은 것이다.
하나의 실시형태에서, 상기 또는 각각의 벡터 또는 조작된 서열은 ΦNM1 파지이거나, 또는 ΦNM1 파지에 포함되고, 여기서, 예를 들면, 숙주 세포(들)가 S. 아우레우스 (예: MRSA) 세포이다.
일반적인 특징은 다음 조항도 제공한다:
1. 본 발명의 임의의 국면에 따른 어레이, 조작된 서열, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드, 프로파지, 개체군 또는 콜렉션을 포함하는 항균 조성물(예를 들어, 약, 소독제 또는 구강 세정제와 같은 항생제).
2. 제1 조항에 있어서, 의료용 또는 치과용 또는 안과용(예: 유기체에서의 감염을 치료 또는 예방하거나 유기체에서의 전염을 제한하기 위한) 조성물.
하나의 예에서, 유기체는 식물 또는 동물이고, 예를 들어 척추 동물(예: 본 명세서에 기재된 포유 동물 또는 인간) 또는 수확물 또는 식품 식물이다.
3. 화장품 용도(예: 화장용 제품, 예를 들어, 메이크업) 또는 위생 용도(위생 제품, 예를 들어, 비누)를 위한 본 발명에 따른 어레이, 조작된 서열, 시스템, 콜렉션, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드, 프로파지, 조성물, 개체군, 콜렉션, 용도 또는 방법을 포함하는 조성물.
4. 약제 또는 치과 치료학적 용도 또는 예방학적 용도를 위한 제1 내지 제35 조항 중 어느 하나의 조항에 따른 어레이, 조작된 서열, 콜렉션, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드, 프로파지, 개체군 또는 콜렉션을 포함하는 조성물의 용도.
5. 화장품 용도(예: 화장용 제품, 예를 들어, 메이크업) 또는 위생 용도(예: 위생 제품, 예를 들어, 비누)를 위한 본 발명에 따른 어레이, 조작된 서열, 콜렉션, 시스템, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드, 프로파지, 조성물, 개체군, 콜렉션, 용도 또는 방법을 포함하는 조성물의 용도.
6. 숙주 세포의 표적 뉴클레오타이드 서열을 변형시킬 수 있는 숙주 변형(HM) CRISPR/Cas9 시스템 (예: 유형 I, II 또는 III) 내 본 발명에 따른 어레이, 조작된 서열, 시스템, 콜렉션, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드, 프로파지, 조성물, 개체군, 또는 콜렉션의 용도로서, 상기 어레이, 조작된 서열, 시스템, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드, 프로파지, 개체군 또는 콜렉션이 본 발명에 따르는, 어레이, 조작된 서열, 시스템, 콜렉션, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드, 프로파지, 조성물, 개체군, 또는 콜렉션의 용도.
7. 제4, 제5, 또는 제6 조항에 있어서, 어레이, 조작된 서열, 시스템, 콜렉션, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드, 프로파지, 개체군 또는 콜렉션이 숙주 세포에 존재하지 않는, 용도.
8. 제5, 또는 제6 조항에 있어서, 어레이, 조작된 서열, 시스템, 콜렉션, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드, 프로파지, 개체군 또는 콜렉션이 숙주 세포(예: 미생물, 박테리아 또는 고세균 세포)에 존재하는, 용도.
9. 제4 내지 제6 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, 미생물 세포를 변형(예: 세포의 성장을 사멸 또는 감소시키거나 또는 미생물 세포를 배양하기 위함)시키기 위한, 용도.
10. 숙주 세포(예를 들어 미생물 박테리아 또는 고세균)에서 표적 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는 방법으로서, 상기 방법은 숙주 세포를 본 발명에 따른 어레이, 조작된 서열, 시스템, 콜렉션, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드, 개체군 또는 콜렉션으로 형질 전환시키는 것을 포함함으로써, 표적 뉴클레오타이드 서열은 Cas 변형된 것이고, 여기서 숙주 표적 서열은 세포의 숙주 CRISPR/Cas 시스템의 뉴클레오타이드 서열인, 방법.
11. 핵산 벡터에 의한 형질 전환 또는 숙주 세포에서의 핵산 벡터의 유지에 대한 숙주 세포 내성의 발달을 감소시키기 위한 방법으로서, 숙주 세포는 표적 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 방법은 본 발명에 따른 어레이, 조작된 서열, 콜렉션, 시스템, 바이러스, 비리온, 파지, 파지미드, 개체군 또는 콜렉션으로 숙주 세포를 형질 전환시키는 것을 포함하며, 이로써 표적 뉴클레오타이드 서열은 Cas 변형(예: 절단, 돌연변이된, 또는 녹아웃된)되는, 방법.
12. 제11 조항에 있어서, 벡터는 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스이고, 형질 전환 단계는 숙주 세포를 벡터로 감염시키는 단계를 포함하는 방법.
13. 제11 또는 제12 조항에 있어서, 숙주 세포가 박테리아 또는 고세균 세포이고 벡터가 파지 또는 파지미드인, 방법.
14. 제11 내지 제13 조항 중 어느 하나의 조항에 있어서, 숙주 표적 서열은 벡터 서열 스페이서의 숙주 CRISPR/Cas 매개형 취득에 필수적인, 방법.
15. 임의의 앞서 기술된 조항에 있어서, 적어도 성분 (ii)가 숙주 세포 용해를 위해 내독소를 발현할 수 있는 바이러스(예: 파지)에 함유되어 있고, 선택적으로 엔돌리신은 파지 phi11, 파지 Twort, 파지 P68, 파지 phiWMY 또는 파지K 엔돌리신(예: MV-L 엔돌리신 또는 P-27/HP 엔돌리신)인, 어레이, 조작된 서열, 시스템, 벡터, 세포, 콜렉션, 조성물, 용도 또는 방법.
16. 제15 조항에 있어서, 숙주 세포 용해를 위한 엔돌리신와 조합하는, 예를 들어, MV-L 엔돌리신 또는 P-27/HP 엔돌리신 또는 이의 기능적 유사체와 조합하는, 어레이, 조작된 서열, 시스템, 벡터, 콜렉션, 세포, 조성물, 용도 또는 방법.
17. 임의의 앞서 기술된 조항에 있어서, 항균제(예: 항생제, 예: 베타-락탐 항생제)와 조합하는, 어레이, 조작된 서열, 시스템, 벡터, 콜렉션, 세포, 조성물, 용도 또는 방법.
18. 임의의 앞서 기술된 조항에 있어서, 상기 또는 각각의 숙주 세포가 스타필로코커스, 스트렙토코커스, 슈도모나스, 살모넬라, 리스테리아, 대장균, 데설포비브리오 또는 클로스트리디움 숙주 세포인, 어레이, 조작된 서열, 시스템, 벡터, 콜렉션, 세포, 조성물, 용도 또는 방법.
19. 임의의 앞서 기술된 조항에 있어서, 숙주 세포가 스타필로코커스(예: 스타필로코커스 아우레우스) 숙주 세포이고, 적어도 성분 (ii)가 클래스 I, II 또는 III 스타필로코커스 파지(예: 포장된 파지), 선택적으로 카우도비랄스(Caudovirales) 또는 미오비리대(Myoviridae) 파지에 함유되어있는, 어레이, 조작된 서열, 시스템, 벡터, 콜렉션, 세포 조성물, 용도 또는 방법.
20. 임의의 앞서 기술된 조항에 있어서, 숙주 세포는 베타-락탐 항생제-내성 스트렙토코커스 아우레우스, 메티실린-내성 스트렙토코커스 아우레우스(MRSA), 반코마이신-내성 스트렙토코커스 아우레우스 또는 테이코플라닌-내성 스트렙토코커스 아우레우스이고, 선택적으로, 표적 서열은 숙주 베타-락탐 항생제-내성 유전자, 메티실린-내성 유전자, 반코마이신-내성 유전자 또는 테이코플라닌-내성 유전자 각각의 서열인, 어레이, 조작된 서열, 시스템, 벡터, 콜렉션, 세포 조성물, 용도 또는 방법.
본 발명의 파지 벡터의 제조 및 시험에 적합한 방법은 예를 들어 WO2014/124226에 개시된 일반적인 방법이다.
이동성 유전 요소, 트랜스포존 및 캐리어(본 발명의 임의의 구성에 대해)
플라스미드는 박테로이데스 종에서 매우 흔하게 발견되며 균주의 20 내지 50%에서 발견된다. 많은 플라스미드는 oriT와 거래 동원 유전자(transacting mobilisation gene)를 보유하고 있으며 이를 통해 접합에 의해 전달될 수 있다. 따라서, 하나의 예에서, 벡터는 oriT 및/또는 동원 유전자를 포함하는 플라스미드이고, 예를 들어, 제1 또는 제2 박테리아가 박테로이데스이다. 하나의 예에서, 조작된 서열은 이러한 벡터에 포함된다.
하나의 예에서, 숙주 세포 또는 제1 또는 제2 박테리아는 자연적으로 트랜스포존을 포함한다. 동원가능하고 접합성인 트랜스포존은 독립적으로 복제하지 않고; 오히려 이들은 염색체 DNA로부터 절제되어 염색체 DNA 내로 통합하여 염색체 DNA와 함께 카피된다. 접합성 트랜스포존은 플라스미드와 박테리오파지 둘 다의 일부 특징을 닮은 절제 및 통합 메커니즘을 가지고 있다. 접합성 트랜스포존은 박테로이데스 사이에서 실질적으로 유비쿼터스이다: 박테로이데스 균주의 80% 이상이 적어도 하나의 접합성 트랜스포존을 함유한다. 박테로이데스의 접합성 트랜스포존은 적어도 두 패밀리에 속하고, CTnDot이 가장 잘 기재되어 있다. 흔히, 발견된 균주의 이름이 지정에 추가된다(예: B. 테타이오타오마이크론의 DOT 균주에서 발견된, CTnDot). 염색체에 삽입할 수 있는 것 외에도, 박테로이데스 접합형 트랜스포존은 플라스미드에 통합시키고 플라스미드-접합체 트랜스포존 하이브리드를 다른 세포로 전달하는 것을 용이하게 함으로써 공존형 플라스미드에 삽입하여 cis로 동원할 수 있다(즉, 물리적으로 인접한 개체에 작용할 수 있다). 이들은 플라스미드와 물리적으로 분리된 채로 플라스미드의 전달을 촉진하는데 필요한 인자를 공급함으로써 "트랜스(trans)"형태로 공존하는 플라스미드를 동원할 수 있다.
접합성 트랜스포존은 플라스미드와 같이 서로 배제하지 않으므로 균주는 하나 이상의 접합성 트랜스포존을 축적할 수 있다. 또한, 균주에서 접합성 트랜스포존 카피가 두 개 이상 존재하면 전사(transactivation)가 촉진된다는 증거가 있다. 이론적으로 이는 환경에서 더 많은 접합성 트랜스포존이 축적됨에 따라 트랜스포존 유전자의 다른 박테리아로의 이동 또한 증가할 것이고 유전자의 분포가 현저하게 상승하는 나선형이 될 것임을 시사한다. 다수의 박테로이데스 트랜스포존은 tetQ 유전자를 가지고 있어서 테트라 사이클린 내성을 부여한다. 또한, 자기 전달 및 기타 활성은 tetQ-rteA-rteB 오페론에 의해 조절되는, 낮은 수준의 테트라사이클린에 의해 상당히 자극된다. 테트라사이클린은 rteA 및 -B의 전사를 증가 시키고, 2-성분 조절 시스템의 센서 및 활성제 성분에 대해 인코딩한다. 차례로, RteB는 자기 전사에 필요한 rteC의 발현을 활성화시킨다.
하나의 예에서, 벡터(예: 조작된 서열을 포함하는 벡터)는 트랜스포존을 포함하며, 트랜스포존은 본 발명의 조작된 서열, HM- 또는 PM-어레이를 포함하며, 트랜스포존은 숙주 세포 또는 제1 또는 제2 박테리아 숙주 세포 종에 작동가능하다. 하나의 실시형태에서, 트랜스포존은 박테로이데스 트랜스포존 (예를 들어, B. 테타이오타오마이크론 또는 B. 프라질리스 CTnDot 트랜스포존과 같은 CTnDot 트랜스포존) 및 숙주 세포이거나, 또는 제1 또는 제2 박테리아는 박테로이데스(예를 들어, 상기 CTnDot 트랜스포존과 동일한 종)이거나 또는 박테로이데스를 포함한다. 하나의 예에서, 트랜스포존은 접합성 트랜스포존이다. 하나의 예에서, 트랜스포존은 동원가능한 트랜스포존이다. 하나의 예에서, 트랜스포존은 박테로이데스 세포 사이에서 이동 가능하다. 하나의 예에서, 트랜스포존은 intDOT 서열을 포함한다. 하나의 예에서, 트랜스포존은 oriT를 포함한다. 하나의 예에서, 트랜스포존은 숙주 세포간에 트랜스포존의 접합성 전달을 위한 하나 이상의 교배 기공 단백질(mating pore protein)을 인코딩한다.
하나의 예에서, 본 발명은 박테로이데스 tetQ 유전자를 포함하는 트랜스포존을 제공한다. 하나의 예에서, 트랜스포존은 박테로이데스 tetQ-rteA-rteB 오페론을 추가로 포함한다. 하나의 예에서, 제1 또는 제2 박테리아는 박테로이데스이다. 하나의 예에서, 트랜스포존은 숙주 세포간에 트랜스포존의 접합성 전달을 위한 하나 이상의 교배 기공 단백질을 인코딩하는 박테로이데스 CTnDot 트랜스포존이고, 본 발명의 하나 이상의 어레이 또는 조작된 서열, oriT, intDOT 서열 및 tetQ-rteA-rteB 오페론을 포함하고, 선택적으로는 테트라 사이클린과 조합하여 본 명세서에 언급된 인간 또는 인간이 아닌 동물을 위해 투여되거나 인간 또는 인간이 아닌 동물에게 투여된다. 대부분의 박테로이데스 CTns의 이동은 테트라사이클린에 의해 자극된다. 트랜스포존은 숙주 세포에서 인테그라제(integrase)로 작동 가능하거나 또는 트랜스포존과 동일하거나 다른 벡터 상에 존재하는 외인성 인테그라제로 작동가능하다. 하나의 실시형태에서, 벡터는 트랜스포존, 및 동족 인테그라제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 파지(예를 들어, 포장된 파지)이다. 파지는 트랜스포존의 복제 및 절제를 위해, 예를 들어, 혼합된 박테리아 개체군(예: 장내 미생물군 개체군)의 이웃 숙주 세포로의 접합성 전달을 위해 숙주 박테리아 세포를 감염시킬 수 있다.
하나의 실시형태에서, 트랜스포존은 숙주 세포 사이에서 트랜스포존 이동에 필요한 하나 이상의 유전자 서열을 운반하는 벡터에 포함되며, 상기 유전자 서열은 벡터 핵산상의 트랜스포존 외부에있다. 예를 들어, 벡터는 숙주 세포 (예: 박테로이데스 숙주 세포)를 감염시킬 수 있는 포장된 파지이며, 파지 핵산은 본 발명의 어레이를 포함하는 트랜스포존을 포함하고, 트랜스포존의 상류 또는 하류에는 하나 이상의 유전자(예를 들어, 이완제를 인코딩하는 하나 이상의 유전자, 커플링 단백질 및/또는 트랜스포존 접합 전달용 교배 브릿지 단백질; 및/또는 mob 및 tra 오페론 중 하나 또는 둘 모두)가 트랜스포존의 접합성 전달에 대해 작동 가능하고, 하나 이상의 모든 유전자가 트랜스포존에 포함되지 않는다. 하나의 예에서, 이들 유전자는 제1 숙주 세포 내에서 염색체 DNA로부터 트랜스포존을 절단하기 위한 유전자이다. 따라서, 트랜스포존은 그 세포 내부에서 동원할 수 있고, 제2 숙주 세포 내로의 계속되는 접합성 전달에 필요한 유전자를 보유할 수 있다. 이러한 방법으로 트랜스포존 유전자의 일부를 트랜스포존 외부의 벡터에 제공함으로써, 이는 동원된 트랜스포존에 의해 수용되고 운반될 수 있도록 본 발명의 조작된 서열 또는 어레이 DNA를 포함시키기 위해 트랜스포존의 공간을 확보한다. 본 발명은 본 발명의 방법, 용도 또는 시스템에서 사용하기 위해 또는 일반적으로 박테리아 세포로 도입하기 위한 하나 이상의 이러한 트랜스포존을 포함하는 벡터를 제공하고(이 경우에, 파지 서열을 표적화하는 대신, 트랜스포존에 포함된 어레이는 박테리아 표적 서열을 표적화하여 서열을 변형시킬 수 있고, 예를 들어, 트랜스포존을 보유하는 세포에서 Cas를 사용하여 절단된다).
CTnDot 절제 및 통합의 분자 메커니즘은 치환보다 박테리오파지의 것과 유사하다. CTnDOT 인테그라제와 절제 단백질 자체는 박테리오파지와 매우 유사하다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 본 발명의 하나 이상의 인테그라제 및/또는 트랜스포존의 절제 단백질은 각각 파지 인테그라제 및/또는 절제 단백질에 의해 제공되며, 트랜스포존은 그 기능이 파지 단백질에 의해 제공되는 인테그라제 또는 절제 단백질을 인코딩하는 상응하는 유전자(들)을 포함하지 않는다.
하나의 예에서, 트랜스포존은 rteC 및 오페론 xis2c-xis2d-orf3-exc을 포함한다. 선택적으로, 부가적으로, 벡터는 트랜스포존 (예: 벡터 핵산의 트랜스포존의 상류 또는 하류) 외부의 mob 및 tra 오페론을 포함한다. 따라서, 이것은 CRISPR 어레이 서열 또는 본 발명의 조작된 서열을 제공하기 위한 트랜스포존의 공간을 확보한다.
다수의 접합성 트랜스포존은 다른 요소들을 동원할 수 있다. 예를 들어, 많은 공존형 플라스미드는 트랜스에서 접합형 트랜스포존에 의해 동원된다. 이는 oriT를 함유하는 플라스미드가 CTn이 제공하는 교배 기공 단백질을 이용하여 수혜자 세포로 전달시킬 때 발생한다. 박테로이데스 CTns는 또한 cis에서 요소를 동원하는 것으로 나타났으며, 이 특징은 CTns에 전형적인 것이 아니다. 예를 들어, CTnDOT이 염색체에서 절단되어 플라스미드에 통합되면 교배 기공, oriT 및 동원(이완제/커플링) 단백질을 제공하여 "시스 내(in cis)" 작용에 의해 전체 플라스미드를 전달하게 된다. 트랜스와 시스의 동원 메커니즘을 사용하는 이 능력은 흔하지 않은 일이며 박테로이데스 CTns가 다른 요소들을 동원 할 수 있는 능력이 더 크다는 것을 암시한다.
하나의 예에서, 본 발명의 벡터는 교배 기공 단백질을 인코딩하는 숙주 세포 종 CTnDot 트랜스포존에 동족인 본 발명의 하나 이상의 조작된 서열 또는 어레이 및 oriT를 포함하는 플라스미드이며, 이에 의해 플라스미드는 CTnDot 트랜스포존을 포함하는 숙주 세포에서 동원 가능하다. 따라서, 플라스미드는 숙주 세포간에 수평 이동이 가능하여, 이로써 숙주 세포 개체군(예를 들어, 박테로이데스 세포)에 본 발명의 어레이를 전파시킬 수 있다. 하나의 예에서, 본 발명은 캐리어 박테리아의 개체군을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 캐리어 박테리아는 본 발명의 플라스미드 벡터와 양립 가능하며, 이로써 벡터는, 캐리어 및 수용 박테리아가 혼합 될 때 동족체 CTnDot 트랜스포존을 포함하는 수용 숙주 박테리아 세포(예를 들어, 박테로이데스 또는 페르미쿠테스, 예를 들어, 스트렙토코커스 세포)로 수평 이동시킬 수 있다. 하나의 예에서, 캐리어 박테리아는 인간 또는 인간이 아닌 동물 소비를 위한 음료(예: 본 명세서에 기술된 것과 같은 프로바이오틱 음료) 또는 식료품에 포함되고, 이로써 캐리어 박테리아는 인간 또는 동물(예를 들어, 구강 또는 장내)이 보유하는 수용 박테리아와 혼합될 수 있다. CTnDOT 유사 패밀리 내의 다른 트랜스포존은 CTnERL 및 CTn341을 포함하지만, 이들 요소는 CTnDOT와 상이하고, 따라서 CTnDot 트랜스포존 대신에, 본 발명의 일반적인 양태의 트랜스포존은 트랜스포존이 박테리아 또는 고세균 숙주 세포에 포함될 때, 하나 이상의 박테리아 또는 파지 뉴클레오타이드 표적 부위를 표적화하기 위한 하나 이상의 목적하는 CRISPR 어레이 또는 조작된 서열을 갖는 CTnERL 또는 CTn341 트랜스포존 일 수 있다.
접합성 트랜스포존의 전달을 위해서는 세 가지 주요 단계가 있다. 제1 단계는 공유 결합으로 폐쇄된 원형 중간체를 형성하기 위해 염색체에서 절단하는 것이다. 둘째, 단일 가닥의 카피는 교배 기공을 통해 수용 세포로 옮겨지고 그 후 카피는 이중 가닥이 된다. 셋째, 손상되지 않은 이중 가닥 CTn은 수령인의 염색체에 통합된다. CTn의 카피가 기증자 세포에서 유지되므로 접합성 치환이 반복적이다. 이 요소는 염색체 내에 있기 때문에 자손 세포에도 수직으로 전달된다. 이것은 원하는 CRISPR 어레이 또는 조작된 서열(및 선택적으로 Cas 서열)이 CTns 상에 존재할 때 중요하기 때문에, 개체군 내에서 쉽게 전달될 뿐만 아니라 대대로 매우 안정적으로 유지된다. 예를 들어, 항생제 내성 결정 인자가 있는 경우에 나타난다. 또한, 박테로이데스는 박테로이데스 속 외부의 다른 유기체들에게 이 유전자를 퍼뜨려 일시적으로 장내를 통과하는 유기체로 이들 요소를 전달시키는 항생제 내성 결정 인자의 저장소 역할을 할 수 있다고 믿어진다. 유사하게, 본 발명의 어레이 또는 조작된 서열의 저장소는 인간 또는 인간이 아닌 동물에게 투여되는 본 발명의 벡터를 사용하여, 예를 들어, 비만, 당뇨병 또는 IBD 또는 개시된 임의의 다른 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위해 생성될 수 있다.
하나의 예에서, 박테로이데스 세포(예: 장내 또는 인간 또는 인간이 아닌 동물의 구강)에 의해 보유될 수 있는 트랜스포존(예: CTnDot)에 포함되는 하나 이상의 어레이 또는 서열을 사용하여 원하는 CRISPR 어레이 또는 조작된 서열의 저장소를 이용할 수 있고, 어레이(들)/서열(들)은 상기 숙주 박테로이데스 세포의 서열을 표적으로 하지 않고, 상이한 종(예: 페르미쿠테스 세포 또는 스트렙토코커스, C. 디피실, H. 파일로리, 살모넬라, 리스테리아, 예르시니아, 시겔라 또는 캄필로박터 세포와 같은 병원성 박테리아 세포)의 장내 미생물군 세포(예를 들어, 박테리아 세포)에 의해 포함된 뉴클레오타이드 서열을 표적으로 한다. 따라서, 이러한 방식으로 본 발명의 어레이 또는 서열을 인접한 수용체 병원성 또는 원치 않는 박테리아로 전달할 수 있으며, 일단 수용 세포 내로 들어가면, 본 발명의 어레이(들)는 숙주 세포 내의 각각의 표적 부위로 Cas를 안내하여 상기 부위를 변형(예: 절단) 할 수 있다. 이 경우, 어레이/서열은 관심있는 수용 세포 내에서 발견되는 반복 서열을 포함할 수 있어서, 어레이/서열은 수용 세포 내에서 내인성 CRISPR/Cas 시스템으로 작동할 수 있다. 이것은 Cas 및/또는 tracrRNA-인코딩 서열을 본 발명의 벡터, 조작된 서열 또는 트랜스포존에 포함시킬 필요가 없게 함으로써 공간을 확보하고 구조를 단순화시킨다. 공간을 늘리면 수용 세포에서 더 많은 표적 부위를 대상으로 추가 스페이서를 포함할 수 있는데 유용하다. 하나의 대안에서, 트랜스포존 어레이(들) 또는 서열(들)은 유형 II Cas9-인코딩 서열 및 동족 반복 서열을 포함한다. 예를 들어, Cas9(본 명세서에 언급된 모든 Cas9)는 S. 피오게네스, S. 서모필러스 또는 S. 아우레우스 Cas9이며 선택적으로 니카아제(nickase) 또는 dCas9 ("죽은 Cas9") 일 수 있다. 박테로이데스는 절대 혐기성(또는 혐기성 환경에 대한 선호도가 높음)이며 일반적으로 장내 외부의 병원성이기 때문에, 예를 들어 인간 또는 동물의 장 또는 구강에 투여하는 경우, 본 발명의 벡터 또는 트랜스포존을 위한 캐리어로서 박테로이데스 세포를 사용하는 것이 바람직하지 않을 수 있다. 이를 해결하기 위해, 본 발명은 본 발명의 벡터, 조작된 서열(들) 또는 트랜스포존을 보유하는 박테리아의 캐리어 개체군을 제공하며, 캐리어 개체군은 벡터, 서열 또는 트랜스포존과 양립 가능하고, 이로써 벡터, 서열 또는 트랜스포존은 캐리어 및 수용 박테리아가 혼합될 때 장내 미생물군에서 수용 숙주 박테리아 세포(예: 박테로이데스)로 수평이동이 가능할 수 있다. 하나의 예에서, 캐리어 박테리아는 인간 또는 인간이 아닌 동물 소비를 위한 음료(예: 본 명세서에 기술된 것과 같은 프로바이오틱 음료) 또는 식료품에 포함되고, 이로써 캐리어 박테리아는 인간 또는 동물(예를 들어, 구강 또는 장내)이 보유하는 수용 박테리아와 혼합될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 벡터, 서열 또는 트랜스포존은 본 발명의 CRISPR 어레이를 포함하며, 어레이는 예를 들어 상기 표적 서열을 포함하는 유전자를 불활성화시키기 위해 상기 서열을 절단함으로써 표적 서열을 변형시키기 위해 수용 세포에 포함된 뉴클레오타이드 서열을 표적으로 한다. 하나의 대안에서, 벡터, 서열 또는 트랜스포존은 제 1 수용 박테리아와 상이한 종인 박테리아의 제2 수용 개체군에 수평 이동(예를 들어, 접합 트랜스포존 이동) 가능하며, 뉴클레오타이드 서열 표적 부위는 제2 수용 박테리아에 포함되지만 제1 수용 박테리아에 포함되지 않으며, 이로써, 표적 부위는 제2 수용 박테리아(숙주 세포)에서 Cas에 의해 변형된다.
하나의 예에서, 제1 수용 박테리아는 박테로이데스 박테리아이며 제2 수용 박테리아는 페르미쿠테스 또는 병원성 박테리아, 예를 들어 장내 박테리아이다. 하나의 예에서, 캐리어 박테리아는 캐리어 박테리아, 제1 박테리아 및 제2 박테리아에 의해 보유될 수 있는 하나 이상의 접합 트랜스포존(예: CTnDot 트랜스포존)을 포함하는 본 발명의 벡터(예: 파지 또는 플라스미드)를 포함하고, 예를 들어, 트랜스포존은 oriT 및 캐리어 박테리아를 포함하고, 제 1 박테리아 및 제 2 박테리아는 oriT와 양립할 수 있다.
하나의 대안에서, 캐리어 박테리아는 본 발명의 벡터, 조작된 서열 또는 트랜스포존을 페르미쿠테스 또는 병원성 박테리아, 예를 들어, 동물 또는 인간이 아닌 동물, 예를 들어 장, 구강에 또는 전신(예를 들어, 혈액에서)에 직접 전달할 수 있다. 하나의 예에서, 병원성 박테리아는 C. 디피실, H. 파일로리, 병원성 대장균, 살모넬라, 리스테리아, 예르시니아, 시겔라, S. 아우레우스, 스트렙토코커스 또는 캄필로박터 박테리아이다.
하나의 예에서, 캐리어 박테리아는 락토바실러스 종(예: 액시도필러스(예: La-5, La-14 또는 NCFM), 브레비스(brevis), 불가리쿠스(bulgaricus), 플랜타룸(plantarum), 람모수스(rhammosus), 페르멘텀(fermentum), 카우카시쿠스(caucasicus), 헬베티쿠스(helveticus), 락티스(lactis), 루테리(reuteri) 또는 카세이(casei), 예를 들어, 카세이 시로타(casei Shirota), 비피도박테리움 종 (예: 비피둠, 브레브, 롱굼 또는 인판티스), 스트렙토코커스 서모필러스 및 엔테로코커스 패시움으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 종의 박테리아이다. 예를 들어, 박테리아는 L. 액시도필러스 박테리아이다.
동원성 플라스미드와 같은 동원성 트랜스포존은 자기 전달할 수 없지만 TcR 헬퍼 요소가 있는 상태에서 세포 간에 전달할 수 있다. 이 클래스의 가장 일반적으로 논의되는 박테로이데스 트랜스포존은 Tn4399, Tn4555 및 복제되지않은 박테로이데스 단위를 포함한다. 예를 들어 동원성 트랜스포존 Tn4555는 박테로이데스 불가투스의 임상 분리 균에서 전달 가능한 세폭시틴(cefoxitin) 내성을 연구하는 동안 처음 발견되었다. 따라서, 하나의 실시 형태에서, 본 발명의 트랜스포존은 본 발명의 하나 이상의 어레이 또는 서열을 포함하는 동원성 트랜스포존 (예를 들어, 박테로로이데스 동원성 트랜스포존), 예를 들어 Tn4399 또는 Tn4555이다. 트랜스포존은 TcR 헬퍼 요소와 결합되어 있다.
하나의 예에서, 본 발명의 트랜스포존은 엔테로코커스 Tn916 또는 그람 양성 Tn1546 트랜스포존이다. 트랜스포존 (예, CTnDot, Tn4399 또는 Tn4555 트랜스포존)은 예를 들어 이의 말단 반복 및/또는 유전자전위효소- 또는 리솔베이스( 위치특이성 재조합촉진효소: resolvase)-인코딩 서열(들)에 따라 특성화 될 수 있다. 대안적 예에서, 벡터 또는 트랜스포존은 pMB1, pBR322, ColE1, R6K (pir 유전자와 조합하여), p15A, pSC101, F1 및 pUC로부터 선택되는 복제 기원을 포함한다. 예를 들어, 트랜스포존은 트랜스포존 동원 또는 전달에 필요한 요소(예: 테트라사이클린과 같은 항생제)와 함께 사용된다. 하나의 예에서, 트랜스포존은 항생제 내성 유전자(예를 들어, 테트라사이클린 내성 유전자)를 포함하고 트랜스포존은 상기 항생제와 조합된다(예를 들어, 상기 항생제와 동시에 또는 순차적으로 인간에게 투여됨). 하나의 예에서, 트랜스포존은 피기백(piggyback), 마리너(Mariner) 또는 슬리핑 뷰티 트랜스포존(Sleeping Beauty transposon)과 동족 유전자전위효소(cognate tranpsosase)를 조합한 것이다. 하나의 예에서, 트랜스포존은 클래스 I 트랜스포존이다. 하나의 예에서, 트랜스포존은 클래스 II 트랜스포존이다. 하나의 예에서, 트랜스포존은 Tn 계 트랜스포존이다.
박테리아 숙주에서 항생제 내성 표적화
항생제 내성은 전세계적인 문제이다. 새로운 형태의 항생제 내성은 국제 경계를 넘어 대륙 사이에 쉽게 퍼질 수 있다. 많은 형태의 내성이 빠른 속도로 퍼졌다. 세계 보건 지도자들은 항생제 내성 미생물을 세계의 모든 국가 사람들에게 "치명적인 위협"을 가하는 "악몽 박테리아"로 묘사했다. 미국에서는 매년 적어도 2백만 명이 감염을 치료하기 위해 고안된 하나 이상의 항생제에 내성을 지닌 박테리아에 심각하게 감염된다. 이 항생제 내성 감염의 직접적인 결과로 적어도 매년 23,000명이 사망한다. 더 많은 사람들이 항생제 내성 감염으로 인해 다른 질환으로 사망한다. 또한 매년 약 25 만 명의 사람들이 클로스트리디움 디피실(C. difficile) 감염에 대한 병원 치료를 필요로 한다. 이 감염의 대부분에서 항생제를 사용하는 것이 질병을 일으키는 주요 원인이었다. C. 디피실 감염으로 미국에서 매년 적어도 14,000 명이 사망한다. 이 감염의 대부분은 예방될 수 있었다. 항생제에 내성을 가진 감염은 이미 과부하 상태인 미국 및 기타 의료 시스템에 상당한 비용을 발생시킨다. 대부분의 경우 항생제 내성 감염은 항생제로 쉽게 치료할 수 있는 감염에 비해 장기간 및/또는 고가의 치료가 필요하고, 입원 기간이 연장되며 추가 의사 방문 및 의료 사용이 필요하고 장애 및 사망이 더 커진다.미국 경제에 대한 항생제 내성의 총 경제적 비용을 계산하기가 어렵다. 견적은 다양하지만 과도한 직접 의료 비용이 200억 달러에 이르며, 사회에 생산성 손실로 인해 연간 350 억 달러 (2008 달러)에 달하는 추가 비용이 든다. 항생제 사용은 전 세계적으로 항생제 내성을 일으키는 가장 중요한 요소이다. 항생제는 인간의 약에 사용되는 가장 일반적으로 처방된 약물 중 하나이다. 그러나 사람들에게 처방된 모든 항생제의 최대 50%는 처방된 것처럼 필요하지 않거나 최적으로 효과적이지 않다. 항생제는 또한 질병을 예방, 통제 및 치료하고 식품-생산 동물의 성장을 촉진하기 위해 식품 동물에서 흔히 사용된다. 성장 촉진을 위한 항생제의 사용은 필요하지 않으며 실천은 단계적으로 중단되어야 한다. 미국 식품 의약국 (FDA)의 최근 지침은 이러한 목표를 향한 길을 설명한다. 식품 동물에 사용된 약물의 양을 사람에 사용된 양과 직접 비교하는 것은 어렵지만 식품 생산에 더 많은 항생제가 사용된다는 증거가 있다.
항생제 내성의 성장에 있어서 또 다른 주요 요인은 사람에게서 사람으로, 또는 음식을 포함한 환경에서 인간이 아닌 공급원(non-human source)으로부터 박테리아의 내성 균주가 확산되는 것이다. 이러한 치명적인 감염과 싸울 수 있는 4 가지 핵심 행동이 있다. 1. 감염 예방 및 내성 확산 방지; 2. 내성 박테리아 추적; 3. 오늘날의 항생제 사용 개선; 4. 새로운 항생제의 개발을 촉진하고 내성 박테리아에 대한 새로운 진단 테스트 개발. 박테리아는 개발 중인 항생제에 저항하는 방법을 필연적으로 찾아 낼 것이고, 새로운 항생제를 개발하고 이미 존재하는 내성이 퍼져 나가는 것을 막기 위해 공격적인 행동이 필요하다.
본 발명은 항생제-내성 숙주를 표적화하고 숙주가 본 발명의 조성물에 대한 추가 내성을 나타낼 가능성을 감소시키기 위한 개선된 수단을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 숙주 세포의 추가 예 및 이러한 세포에서의 항생제 내성의 표적화는 다음과 같다:
1. 선택적으로, 숙주 세포(들)는 예를 들어, 메티실린, 반코마이신, 리네졸리드, 뎁토마이신, 퀴누프리스틴, 달포프리스틴 및 테이코플라닌으로부터 선택된 항생제에 내성인 스타필로코커스 아우레우스 세포이며, 숙주 표적 부위(또는 하나 이상의 표적 부위)는 상기 항생제에 대한 숙주 내성을 부여하는 유전자에 포함된다.
2. 선택적으로, 숙주 세포(들)는 예를 들어, 세팔로스포린(예: 세프타지딤), 카바페넴(예: 이미페넴 또는 메로페님), 플루오로퀴놀론, 아미노글리코사이드(예: 겐타마이신 또는 토브라마이신) 및 콜리스틴으로부터 선택되는 항생제에 내성인 슈도모나스 에루지노사 세포이고, 숙주 표적 부위(또는 하나 이상의 표적 부위)는 항생제에 대한 숙주 내성을 부여하는 유전자에 포함된다..
3. 선택적으로, 숙주 세포(들)는 예를 들어, 카바페넴에 내성인 클렙시엘라(예 : 뉴모니에) 세포이고, 숙주 표적 부위(또는 하나 이상의 표적 부위)는 상기 항생제에 대한 숙주 내성을 부여하는 유전자에 포함된다.
4. 선택적으로, 숙주 세포(들)는 예를 들어, 에리스로마이신, 클린다마이신, 베타-락탐, 마크로라이드, 아목시실린, 아지트로마이신 및 페니실린으로부터 선택된 항생제에 내성인 스트렙토코커스(예를 들어, 서모필러스, 뉴모니에 또는 피오게네스)세포이고, 숙주 표적 부위(또는 하나 이상의 표적 부위)는 상기 항생제에 대한 숙주 내성을 부여하는 유전자에 포함된다.
5. 선택적으로, 예를 들어, 숙주 세포(들)는 세프트리악손(ceftriaxone), 아지트로마이신 (azithromycin) 및 시프로플록사신(cystrofloxacin)으로부터 선택되는 항생제에 내성인 살모넬라(예를 들어, 혈청형 티피) 세포이고, 숙주 표적 부위(또는 하나 이상의 표적 부위)는 상기 항생제에 대한 숙주 내성을 부여하는 유전자에 포함된다.
6. 선택적으로, 숙주 세포(들)는 예를 들어, 시프로플록사신 및 아지트로마이신으로부터 선택되는 항생제에 내성인 시겔라 세포이고, 숙주 표적 부위 (또는 하나 이상의 표적 부위)는 상기 항생제에 대한 숙주 내성을 부여하는 유전자에 포함된다.
7. 선택적으로, 숙주 세포(들)는 이소니아지드(INH), 리팜피신(RMP), 플루오로퀴놀론, 아미카신, 카나마이신 및 카프레오마이신으로부터 선택된 항생제에 내성인 마이코박테리움 투버쿨로시스 세포이고; 숙주 표적 부위(또는 하나 이상의 표적 부위)는 항생제에 대한 숙주 내성을 부여하는 유전자에 포함된다.
8. 선택적으로, 숙주 세포(들)는 예를 들어, 반코마이신에 내성인 엔테로코커스 세포이고, 숙주 표적 부위(또는 하나 이상의 표적 부위)는 상기 항생제에 대한 숙주 내성을 부여하는 유전자에 포함된다.
9. 선택적으로, 숙주 세포(들)는 예를 들어, 세팔로스포린 및 카바페넴으로부터 선택되는 항생제에 내성인 장내세균이고, 숙주 표적 부위 (또는 하나 이상의 표적 부위)는 상기 항생제에 대한 숙주 내성을 부여하는 유전자에 포함된다.
10. 선택적으로, 숙주 세포(들)는 예를 들어, 트리메토프림, 이트로푸란토인, 세팔렉신 및 아목시실린으로부터 선택된 항생제에 내성인 대장균 세포이고, 숙주 표적 부위 (또는 하나 이상의 표적 부위)는 상기 항생제에 대한 숙주 내성을 부여하는 유전자에 포함된다.
11. 선택적으로, 숙주 세포(들)는 예를 들어, 플루오로퀴놀론 항생제 및 카바페넴으로부터 선택되는 항생제에 내성인 클로스트리디움(예: 디피실) 세포이고, 숙주 표적 부위 (또는 하나 이상의 표적 부위)는 상기 항생제에 대한 숙주 내성을 부여하는 유전자에 포함된다.
12. 선택적으로, 숙주 세포(들)는 예를 들어, 세픽심(예: 구강 세팔로스포린), 세프리악손(주사용 세팔로스포린), 아지트로마이신 및 테트라사이클린으로부터 선택되는 항생제에 내성인 임질균 세포이고, 숙주 표적 부위(또는 하나 이상의 표적 부위)는 상기 항생제에 대한 숙주 내성을 부여하는 유전자에 포함된다..
13. 선택적으로, 숙주 세포(들)는 예를 들어, 베타-락탐, 메로페넴 및 카바페넴으로부터 선택되는 항생제에 내성인 아시네토박터 바우마니 세포이고, 숙주 표적 부위 (또는 하나 이상의 표적 부위)는 상기 항생제에 대한 숙주 내성을 부여하는 유전자에 포함된다.
14. 선택적으로, 숙주 세포(들)는 예를 들어, 시프로플록사신 및 아지트로마이신으로부터 선택되는 항생제에 내성인 캄필로박터 세포이고, 숙주 표적 부위 (또는 하나 이상의 표적 부위)는 상기 항생제에 대한 숙주 내성을 부여하는 유전자에 포함된다.
15. 선택적으로, 숙주 세포(들)는 베타(β )-락타마제를 생성한다.
16. 선택적으로, 숙주 세포(들)는 제1 내지 제14 실시예 중 어느 하나에 기재된 항생제에 내성인 박테리아 숙주 세포이다.
하나의 실시형태에서, 숙주 세포는 USA300 S. 아우레우스 균주 세포이다.
하나의 예에서, 상기 또는 각각의 숙주 표적 서열은 숙주 세포의 플라스미드, 예를 들어, S. 아우레우스 플라스미드(예를 들어, USA300 균주), 예를 들어, S. 아우레우스 세포의 pUSA01, pUSA02 또는 pUSA03 플라스미드에 포함된 표적에 포함된다. 하나의 예에서, 제1 및/또는 제2 표적은 숙주 mecA, mecA2 또는 sek 유전자 서열(예를 들어, S. 아우레우스 균주 세포)에 포함된다. 하나의 예에서, 제1 및/또는 제2 표적은 숙주 병원성 섬 뉴클레오타이드(예: DNA) 서열에 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 스페이서는 WO2014/124226의 26 페이지의 표 1에 개시된 스페이서를 포함하거나 이로 구성되며, 스페이서 서열은 본원에 참조로 인용된다. 하나의 예에서, 조작된 서열, HM-crRNA 또는 gRNA는 이러한 스페이서를 포함한다.
본 발명의 조성물, 용도, 방법, 시스템, 벡터, 콜렉션, 어레이, 조작된 서열, 바이러스, 파지, 파지미드, 프로파지 또는 비리온은 마우스 피부 콜로니화 분석에서 항생제-내성 박테리아 숙주의 성장을 감소 또는 사멸 또는 억제하는데 효과적이고, (예를 들면, WO2014/124226에 기재된 바와 같이 참조문헌 Kugelberg E, 외, Establishment of a superficial skin infection model in mice by using Staphylococcus aureus and Streptococcus pyogenes. Antimicrob Agents Chemother. 2005;49:3435-3441 or Pastagia M 외, 새로운 키메라 라이신은 메티실린 내성 및 메티실린 민감성 스타필로코커스 아우레우스 균주의 피부 탈콜로니에 있어서, 무피로신에 대한 우월성을 보여준다. Antimicrob Agents Chemother. 2011; 55 : 738-744), 여기서, 제1 및/또는 제2 표적은 항생제에 대한 내성을 부여하는 숙주 유전자(예를 들어 숙주가 스타필로코커스 아우레우스(예: USA300 균주) 숙주임)에 포함된다.
참조문헌 S. 피오게네스 서열은 위치 854757-858863에서 cas9 유전자와 함께 젠뱅크(Genbank) 수탁 번호 NC_002737로 입수 가능하다. S. 피오게네스 Cas9 아미노산 서열은 번호 NP_269215로 입수 가능하다. 이들 서열은 본 발명에서 사용하기 위해 본 명세서에 참고로 인용된다. 20150079680에 개시된 바와 같은 추가의 서열은, 본 명세서에 명시적으로 또는 본 명세서에 참고로 포함되어 있든지 간에 본 발명에서의 사용을 위해 본원에 참고로 포함된다. WO2013/176772의 서열 및 방법이 개시되어 있으며, 이는 본원에 참고로 인용된다. 예시적인 tracrRNA 서열은 WO2014/124226의 15 페이지에 개시된 것들이며, 본 발명에서 사용하기 위해 본원에 참고로 인용된다.
하나의 예에서, 상기 또는 각각의 반복은 길이가 20 내지 50 개(예를 들어, 24 개 내지 47 개, 예를 들어 30, 29, 28, 27, 26, 25 또는 24 개)의 인접 뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 이들로 구성된다.
하나의 예에서, 상기 또는 각각의 반복은 길이가 18개 내지 50개 (예를 들어 24 내지 47, 또는 20 내지 40, 예: 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18), 예: 19 또는 20개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 이들로 구성된다.
하나의 예에서, 제1 반복(본 발명의 HM-어레이에서 대부분 5')은 제1 숙주 표적을 포함하는 서열에 상보적인 스페이서 서열의 5' 가까이에 존재한다. 이는 새롭게 획득된 스페이서(예: 파지 서열 침입)가 박테리아의 이 위치에 일반적으로 혼입된다는 관찰에 비추어 유용하며, 따라서 이러한 방식으로 본 발명의 제 1 스페이서를 위치시키는 것은 이의 용도를 촉진시키는데 유용하다.
하나의 예에서, 바이러스(예: 파지) 핵산은 복제 기원(ori) 및 포장 부위를 포함한다. 하나의 예에서, 바이러스의 핵산은 필수 캡시드 단백질을 인코딩하는 하나 이상의, 또는 모든 유전자, 예를 들어 rinA, ter 및 terL 유전자를 포함한다. 하나의 예에서, 이들 중 하나 이상, 또는 전부가 대신에 본 발명의 바이러스와의 공-감염에 해당하는 동행 헬퍼(companio helper) 바이러스(예: 헬퍼 파지)에 포함되며, 이는 더 많은 HM-어레이 핵산 및/또는 숙주에서 작동 가능한 더 많은 Cas-인코딩 핵산을 포함시키기 위한 후자의 공간을 확보한다. 하나의 예에서, 바이러스 핵산은 야생형 파지 게놈의 단편을 포함하고, 단편은 적어도 rinA, terS 및 terL 유전자 또는 파지 단백질을 인코딩하는 등가 유전자를 포함하는 게놈의 연속적인 뉴클레오타이드로 구성된다.
하나의 예에서, 숙주 세포는 인간 미생물에서 발견되는 균주 또는 종이다.
하나의 예에서, 상기 또는 각각의 표적 부위는 숙주의 병원성 부착, 콜로니화, 침입, 면역 반응 억제, 독성, 필수 단백질 또는 기능 발현 또는 독소 생성을 매개하는 유전자에 포함된다. 하나의 예에서, 유전자는 세포 독소, 알파-헤모리신, 베타-헤모리신, 감마-헤모리신, 백혈구, 판톤-발렌틴 레코시딘(Panton-Valentine lekocidin: PVL), 외독소, TSST-1, 장 독소, SEA, SEB, SECn, SED , SEE, SEG, SEH, SEI, 박리 독소, ETA 또는 ETB를 인코딩하는 유전자이며, 선택적으로 숙주가 스타필로코커스 아우레우스, 예를 들어 MRSA 이다.
하나의 예에서, 상기 또는 각 CRISPR 어레이는 본원에 개시된 임의의 구성, 실시예, 예, 컨셉, 국면, 단락 또는 조항에 따른 어레이이다. 하나의 예에서, 상기 또는 각 조작된 뉴클레오타이드 서열은 본원에 개시된 임의의 구성, 실시예, 예, 컨셉, 국면, 단락 또는 조항에 따른 조작된 뉴클레오타이드 서열이다.
하나의 예에서, 상기 또는 각 벡터는 본원에 개시된 임의의 구성, 실시예, 예, 컨셉, 국면, 단락 또는 조항에 따른 벡터이다.
본원에 개시된 임의의 구성, 실시예, 예, 컨셉, 국면, 단락 또는 조항에 따른 하나의 예에서, 벡터 또는 MGE는 카스포손(casposon)이거나 또는 이를 포함한다. MGE는 아래에서 더 자세히 설명된다. 하나의 예에서, 카스포손은 패밀리 1, 2 또는 3 카스포손이다. 하나의 예에서, 본 발명의 MGE는 카스포손 말단 역전된 반복을 포함하고, 선택적으로 카스포손 Cas1-인코딩 서열을 포함한다. 하나의 예에서, 본 발명의 MGE는 카스포손에서 Cas1을 뺀 것이거나, 이를 포함하는 것으로, 숙주 세포의 Cas1과 동원화에 작용가능하다. 카스포손에 대한 상세내용은 문헌[BMC Biol. 2014 May 19;12:36. doi: 10.1186/1741-7007-12-36, "Casposons: a new superfamily of self-synthesizing DNA transposons at the origin of prokaryotic CRISPR-Cas immunity", Krupovic M 외]을 참조한다.
본 발명의 또 다른 실시예 적용.
하나의 예에서, 조성물(예: 항생제와 조합된 HM-조성물 또는 조작된 서열)은 다음 중 하나이다: 하나의 예에서, 조성물은 의학용, 안과용, 치과용 또는 약학용 조성물(예: 항-숙주 백신에 포함됨)이다. 하나의 예에서, 조성물은 항균 조성물, 예를 들어 항생제 또는 항바이러스제, 예를 들어, 약제, 소독제 또는 구강 세정제이다. 하나의 예에서, 조성물은 화장 조성물(예를 들어, 얼굴 또는 몸의 화장 조성물)이다. 하나의 예에서, 조성물은 제초제이다. 하나의 예에서, 조성물은 살충제(예: 숙주가 바실러스(예: 투린지엔시스(thuringiensis) 숙주인 경우)이다. 하나의 예에서, 조성물은 음료(예: 맥주, 와인 또는 알코올성 음료) 첨가제이다. 하나의 예에서, 조성물은 식품 첨가물(예: 숙주가 대장균, 살모넬라, 리스테리아 또는 클로스트리디움(예: 보툴리눔) 숙주인 경우)이다. 하나의 예에서, 조성물은 물 첨가제이다. 하나의 예에서 조성물은 수생 동물 환경(예를 들어, 수조)을 위한 첨가제이다. 하나의 예에서, 조성물은 오일 또는 석유 화학 산업 조성물이거나 상기 조성물(예를 들어, 숙주가 황산염-환원 박테리아, 예를 들어 데설포비브리오 숙주인 경우)에 포함된다. 하나의 예에서, 조성물은 오일 또는 석유화학 첨가제이다. 하나의 예에서, 조성물은 화학물질 첨가제이다. 하나의 예에서, 상기 조성물은 살균제(예를 들어, 인간 또는 동물용 기기의 살균, 예를 들어, 외과적 용도 또는 의학적 용도 또는 유아 섭취용)에 사용된다. 하나의 예에서, 조성물은 인간 또는 동물용 개인 위생 조성물이다. 하나의 예에서, 조성물은 토양 처리 또는 환경 오염 제거(예: 하수도 또는 오일, 석유화학 또는 화학 물질로부터 예를 들어 숙주가 황산염-환원 박테리아, 예를 들어 데설포비브리오 숙주인 경우의 처리)과 같은 환경적 용도를 위한 조성물이다. 하나의 예에서, 조성물은 식물 성장 자극제이다. 하나의 예에서, 조성물은 오일, 석유화학 물질, 금속 또는 광물 추출에서 사용하기 위한 조성물이다. 하나의 예에서, 조성물은 직물 처리제 또는 첨가제이다. 하나의 예에서, 조성물은 동물 가죽, 가죽 또는 스웨이드 처리 또는 첨가제이다. 하나의 예에서, 조성물은 염색 첨가제이다. 하나의 예에서, 조성물은 음료 (예: 맥주 또는 와인) 양조 또는 발효 첨가제 (예: 숙주가 락토 바실러스 숙주인 경우)이다. 하나의 예에서, 조성물은 종이 첨가제이다. 하나의 예에서, 조성물은 잉크 첨가제이다. 하나의 예에서, 조성물은 접착제 첨가제이다. 하나의 예에서, 조성물은 항-인간 또는 동물 또는 식물 기생 조성물이다. 하나의 예에서, 조성물은 공기 첨가제(예를 들어, 숙주가 레지오넬라 (Legionella) 숙주인 경우 공기 조절 설비 중 공기 또는 설비에 의해 제조된 공기)이다. 하나의 예에서, 조성물은 부동-방지 첨가제(예를 들어 숙주가 레지오넬라 숙주인 경우)이다. 하나의 예에서, 조성물은 안약 또는 안과 조성물(예: 콘택트 렌즈 유액)이다. 하나의 예에서, 조성물은 유제품(예를 들어, 상기 조성물이 우유 또는 유제품에 있거나, 예를 들어, 숙주가 락토바실러스, 스트렙토코커스, 락토코커스 또는 리스테리아 숙주인 경우)에 포함된다. 하나의 예에서, 조성물은 국내용 또는 산업용 세척 제품(예: 숙주가 대장균, 살모넬라, 리스테리아 또는 클로스트리디움(예: 보툴리눔) 숙주)이거나 또는 이들 제품에 포함된다. 하나의 예에서, 조성물은 연료에 포함된다. 하나의 예에서, 조성물은 용매(예: 물 이외의)에 포함된다. 하나의 예에서, 조성물은 베이킹 첨가제(예: 식품 베이킹 첨가제)이다. 하나의 예에서, 조성물은 실험실 시약(예: 생명 공학 또는 재조합 DNA 또는 RNA 기술에 사용하기 위함)이다. 하나의 예에서, 조성물은 섬유 레팅제(fibre retting agent)에 포함된다. 하나의 예에서, 조성물은 비타민 합성 공정에 사용하기 위한 것이다. 하나의 예에서, 조성물은 곡류고사(anti-crop)용 또는 식물 부패 조성물(예를 들어 숙주가 부생성 박테리아인 경우)이다. 하나의 예에서, 조성물은 예를 들어, 금속 부식을 방지 또는 감소시키기 위한 부식 방지 화합물(예: 기름 추출, 처리 또는 봉쇄 장비; 금속 추출, 처리 또는 봉쇄 장비; 또는 광물 추출, 처리 또는 봉쇄 장비의 부식을 감소 또는 방지하기 위한 황산염-환원 박테리아, 예를 들어 데설포비브리오 숙주인 경우)이다. 하나의 예에서, 조성물은 농장 또는 경작 조성물이거나 이러한 조성물에 포함된다. 하나의 예에서, 조성물은 사일리지(silage) 첨가제이다. 본 발명은 본 단락에 기술된 임의의 조성물에 사용하기 위해 또는 본 명세서에 기술된 임의의 적용에서 사용하기 위해(예를 들어, 숙주 세포는 미생물 세포 또는 박테리아 또는 고세균 세포임) 본원에 기재된 HM-CRISPR 어레이, HM-CRISPR/Cas 시스템, HM-crRNA, HM-스페이서, HM-DNA, HM-Cas, HM-조성물 또는 gRNAas를 제공한다. 본 발명은 본 단락에 기술된 임의의 적용을 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 HM-CRISP 어레이, HM-CRISPR/Cas 시스템, HM-crRNA, HM-스페이서, HM-DNA, HM-Cas, gRNA 또는 HM-조성물을 숙주 세포(예: 미생물, 박테리아 또는 고세균 세포)와 조합함을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포는 인간(또는 인간 배아) 또는 동물 내 또는 이들에 존재하지 않는다.
본 발명의 임의의 국면은 산업용 또는 가정용이거나, 또는 이러한 용도를 위한 방법에 사용된다. 예를 들어, 농업, 오일 또는 석유 산업, 식품 또는 음료 산업, 의류 산업, 포장 산업, 전자 산업, 컴퓨터 산업, 환경 산업, 화학 산업, 항공 우주 산업, 자동차 산업, 생명 공학 산업, 의료 산업, 건강관리 산업, 치과 산업, 에너지 산업, 소비재 산업, 제약 산업, 광업, 청소 산업, 임업 산업, 어업 산업, 레저 산업, 재활용 산업, 화장품 산업, 플라스틱 산업, 펄프 또는 제지 산업, 섬유 산업, 의류 산업, 가죽 또는 스웨이드 또는 동물 가죽 산업, 담배 산업 및 철강 산업을 위해 또는 이들 산업에서 사용된다.
여기서, 데설포비브리오 숙주에 대한 언급이 있는 경우, 숙주는 대신에 데설포불부스(Desulfobulbus), 데설포박터(Desulfobacter), 데설포박테리움(Desulfobacterium), 데설포코커스(Desulfococcus), 데설포모나일(Desulfomonile), 데설포네마(Desulfonema), 데설포보툴루스(Desulfobotulus) 또는 데설포아르쿨러스(Desulfoarculus) 숙주 또는 본원에 기술된 임의의 다른 황-환원 박테리아일 수 있다. 오일, 물, 하수 또는 환경 적용을 위한 실시형태에서, 숙주는 데설포비브리오 카필라투스(Desulfovibrio capillatus) 숙주이다.
광범위한 미생물 분석 및 16S rRNA 시퀀싱은 데설포비브리오 속이 환경에서 분리될 수 있는 황산염-환원 박테리아의 약 8가지 상이한 그룹 중 하나임을 나타낸다. 이들 그룹 중 7 개는 그람 음성 박테리아이며, 1 개는 그람 양성 박테리아(데설포토마쿨룸)를 나타낸다. 데설포비브리오 속은 오히려 작은 게놈을 갖는다. 초기 추정치는 D. 불가리스 및 D. 기가스(본 발명에 따른 숙주일 수 있음)의 게놈에 대해 각각 1.7 Mbp 및 1.6 Mbp이었다. 이는 본 발명에 사용하기 위한 원하는 표적 서열(예를 들어 필수 또는 내성 유전자의 서열)의 확인을 돕는다. D. 데설푸리칸스(본 발명에 따른 숙주일 수 있음) G200의 고유 플라스미드의 특성 규명은 셔틀 벡터(Wall 1993, 본 발명의 벡터로서 사용될 수 있는 벡터)의 제작을 허용하고, D. 불가리스 (본 발명에 따른 숙주일 수 있음)로부터 2 개의 박테리오파지의 분리 및 특성 규명(참조 문헌: Seyedirashti, 1992)은 데설포비브리오 종을 효율적으로 유전적으로 조작하는 다른 방법을 제공할 수 있다. 하나의 예에서, 벡터는 mu 또는 mu-유사 박테리오파지이다.
숙주의 예는 데설포비브리오 불가리스 하위 종 불가리스 포스트게이트 및 캄벨(Desulfovibrio vulgaris subsp. vulgaris Postgate 및 Campbell) (ATCC® 29579 ™) 균주 지정: NCIB 8303 [DSM 644, Hildenborough]이다.
미토마이신 C 또는 UV로 박테리아를 처리하는 것은 이전에 박테리아(Driggers & Schmidt)로부터 파지를 유도하는데 사용되어 왔으며, 이는 본 발명의 임의의 실시예 또는 국면에서 사용하기 위한 벡터를 생성하는데 적합한 숙주-일치된 파지를 수득하는데 적합한 방법이다.
본 발명은 낙농 산업(예: 치즈 또는 버터 또는 유제품 생산) 또는 발효(예: 와인 또는 식초 또는 대두) 또는 맥주 양조 또는 빵 제조 산업에서 적용된다. 예를 들어, 낙농 산업 분야에서, 본 발명의 방법은 젖산 생산 박테리아(예를 들어, 락토바실러스 숙주 세포)의 배양물을 일정 기간 동안 발효시켜 배양물로부터 젖산을 생성한 후, 박테리아와 혼합된 본 발명의 하나 이상의 어레이, 시스템, 벡터, 개체군 또는 콜렉션으로부터의 crRNA의 발현을 일으킴으로써 박테리아의 성장을 억제하는 단계를 포함하여 박테리아에 의한 젖산 생산이 감소 또는 억제되도록 하는, 유제품을 생산하는 방법이다. 이는 음식/음료의 부패를 줄이거나 바람직하지 않은 음식/음료의 맛 및/또는 냄새를 줄이는데 유용하다. 하나의 예에서, 박테리아에 유도성 HM-어레이가 포함되며,이 방법은 제 1 기간 후에 유도제를 첨가하는 것을 포함한다.
참조문헌:
Wall, J. D., B. J. Rapp-Giles, and M. Rousset. 1993. "Characterization of a small plasmid from Desulfovibrio desulfuricans and its use for shuttle vector construction". J. Bacteriol. 175:4121-4128;
Seyedirashti S 외; J Gen Microbiol. 1992 Jul;138(7):1393-7, "Molecular characterization of two bacteriophages isolated from Desulfovibrio vulgaris NCIMB 8303 (Hildenborough)";
Driggers & Schmidt, J. gen. Virol. (I97O), 6, 421-427, "Induction of Defective and Temperate Bacteriophages in Caulobacter".
컨셉:
박테리아의 혼합된 개체군에서, 예컨대 미생물무리에서 제1 및 제2 박테리아의 하위 개체군의 상대적 비 변경
1. 박테리아의 혼합된 개체군에서 제1 박테리아 및 숙주 세포를 포함하는 제2 박테리아의 하위 개체군의 상대적 비를 변경하기 위한 숙주 개질 (HM) CRISPR/Cas 시스템의 용도로서,
각각의 숙주 세포에 대하여, 상기 시스템은 다음의 (i) 내지 (iv)에 따른 성분을 포함하며,
(i) Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열;
(ii) 숙주 세포 표적 서열, 및 스페이서 서열(HM-스페이서)과 HM-crRNA(HM-crRNA는 숙주 세포 표적 서열과 혼성화하는 서열을 포함하여 상기 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시킴)을 인코딩하는 반복을 포함하는, 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이;
(iii) 선택적 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열;
(iv) 시스템의 상기 성분은 숙주 세포 및 숙주 세포를 형질 전환시키는 적어도 하나의 핵산 벡터 사이에서 분할됨에 따라, HM-crRNA는 Cas를 표적으로 안내하여 숙주 세포 내 숙주 CRISPR/Cas 시스템을 변형시키며;
표적 서열이 Cas에 의해 변형됨에 따라, 숙주 세포가 사멸되거나 숙주 세포의 성장이 감소되는, 용도.
2. 박테리아 숙주 세포의 표적 뉴클레오타이드 서열을 변형하기 위한 제1 컨셉의 용도의 숙주 개질 (HM) CRISPR/Cas 시스템으로서, 상기 시스템은 다음의 (i) 내지 (iv)에 따른 성분을 포함하며,
(i) Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열;
(ii) 숙주 세포 표적 서열, 및 스페이서 서열(HM-스페이서)과 HM-crRNA(HM-crRNA는 숙주 표적 서열과 혼성화하는 서열을 포함하여 상기 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시킴)을 인코딩하는 반복을 포함하는, 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이;
(iii) 선택적 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열;
(iv) 시스템의 상기 성분은 숙주 세포 및 숙주 세포를 형질 전환시키는 적어도 하나의 핵산 벡터 사이에서 분할됨에 따라, HM-crRNA는 Cas를 표적으로 안내하여 숙주 세포 내 숙주 CRISPR/Cas 시스템을 변형시키는, 시스템.;
3. 제2 컨셉에 있어서, 벡터 또는 벡터들이 Cas(예를 들어, Cas9) 뉴클레아제-인코딩 서열이 결핍되어 있는, 시스템.
4. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 각각의 숙주 세포가 인간 미생물군에서 발견되는 균주 또는 종, 용도 또는 시스템.
5. 제1 또는 제4 컨셉에 있어서,
(a) 혼합된 박테리아 개체군에서의 박테로이데테스 박테리아의 비율을 변경시키고;
(b) 혼합된 박테리아 개체군 내의 페르미쿠테스 하위 개체군(숙주 세포)의 비율을 감소시키고;
(c) 혼합된 개체군 내의 제1 페르미쿠테스 종 (숙주 세포)의 비율을 감소시키고(여기서, 혼합된 개체군은 cRNA에 의해 성장이 억제되지 않는 제 2 페르미쿠테스 종을 포함함);
(d) 혼합된 박테리아 개체군 내의 제1 그람 양성 박테리아 종(숙주 세포)의 비율을 감소시키고(여기서, 혼합된 개체군은 cRNA에 의해 성장이 억제되지 않는 제 2 그람 양성 박테리아 종을 포함함);
(e) 혼합된 박테리아 개체군 내의 박테리아 종(숙주 세포)의 비율을 감소시키고(상기 혼합된 개체군은 상기 cRNA에 의해 성장이 억제되지 않는 상이한 박테리아 종을 포함하고, 제 1 종은 다른 종의 16s 리보솜 RNA-인코딩 DNA 서열과 적어도 80, 82, 83, 84, 85, 90 또는 95% 동일한, 16s 리보솜 RNA-인코딩 DNA 서열을 가짐);
(f) 혼합된 박테리아 개체군에서 제1 박테리아 인간 장내 미생물군 종(숙주 세포, 예를 들어, 페르미쿠테스)의 비율을 감소시키거나(여기서, 혼합된 개체군은 상이한 박테리아 종을 포함하고, 상이한 종은 상기 cRNA에 의해 성장이 억제되지 않는 인간 장내 프로바이오틱 종임); 또는
(g) 혼합된 박테리아 개체군에서 박테리아 인간 장내 미생물군 종(숙주 세포, 예를 들어, 페르미쿠테스)의 비율을 감소(여기서, 혼합된 개체군은 상이한 박테리아 종을 포함하고, 상이한 종은 상기 cRNA에 의해 성장이 억제되지 않는 인간 장내 공생 종임)시키기 위한, 용도.
6. 제2 또는 제3 컨셉에 있어서,
(a) 혼합된 박테리아 개체군에서의 박테로이데테스 박테리아의 비율을 변경하고;
(b) 혼합된 박테리아 개체군 내의 페르미쿠테스 하위 개체군(숙주 세포)의 비율을 감소시키고;
(c) 혼합된 개체군 내의 제1 페르미쿠테스 종 (숙주 세포)의 비율을 감소시키고(여기서, 혼합된 개체군은 cRNA에 의해 성장이 억제되지 않는 제 2 페르미쿠테스 종을 포함함);
(d) 혼합된 박테리아 개체군 내의 제1 그람 양성 박테리아 종(숙주 세포)의 비율을 감소시키고(여기서, 혼합된 개체군은 cRNA에 의해 성장이 억제되지 않는 제 2 그람 양성 박테리아 종을 포함함);
(e) 혼합된 박테리아 개체군 내의 박테리아 종(숙주 세포)의 비율을 감소시키고(상기 혼합된 개체군은 상기 cRNA에 의해 성장이 억제되지 않는 상이한 박테리아 종을 포함하고, 제 1 종은 다른 종의 16s 리보솜 RNA-인코딩 DNA 서열과 적어도 80, 82, 83, 84, 85, 90 또는 95% 동일한, 16s 리보솜 RNA-인코딩 DNA 서열을 가짐);
(f) 혼합된 박테리아 개체군에서 제1 박테리아 인간 장내 미생물군 종(숙주 세포, 예를 들어, 페르미쿠테스)의 비율을 감소시키거나(여기서, 혼합된 개체군은 상이한 박테리아 종을 포함하고, 상이한 종은 상기 cRNA에 의해 성장이 억제되지 않는 인간 장내 프로바이오틱 종임); 또는
(g) 혼합된 박테리아 개체군에서 박테리아 인간 장내 미생물군 종(숙주 세포, 예를 들어, 페르미쿠테스)의 비율을 감소(여기서, 혼합된 개체군은 상이한 박테리아 종을 포함하고, 상이한 종은 상기 cRNA에 의해 성장이 억제되지 않는 인간 장내 공생 종이고; (a) 내지 (g)은 인간 또는 동물 대상에서 (i) 비율이 감소된 상기 박테리아 종에 의한 미생물군 감염; 또는 (ii) 비율이 감소된 박테리아 종에 의해 매개되는 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위함)시키기 위한, 시스템.
7. 제5 또는 제6 컨셉에 있어서,박테로이데테스 대 페르미쿠테스의 상대적 비를 높이기 위한, 용도 또는 시스템.
8. 임의의 앞서 기술된 개념에 있어서, 상기 Cas 뉴클레아제는 세포의 내인성 유형 II CRISPR/Cas 시스템에 의해 제공되는, 용도 또는 시스템.
9. 임의의 앞서 기술된 개념에 있어서, 성분 (i)이 숙주 세포에 내인성인, 용도 또는 시스템.
10. 임의의 앞서 기술된 개념에 있어서, 표적 서열이 숙주 세포의 항생제 내성 유전자, 독성 유전자 또는 필수 유전자로 구성되는, 용도 또는 시스템.
11. 임의의 앞서 기술된 개념에 있어서, 표적 서열이 숙주 염색체 서열인, 용도 또는 시스템.
12. 임의의 앞서 기술된 개념에 있어서, 대안적으로, HM-crRNA 및 tracrRNA가 예를 들어 벡터에 의해 제공되는 단일 가이드 RNA (gRNA)에 포함되는, 용도 또는 시스템.
13. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 숙주 세포는 관심있는 HM-서열을 인코딩하는 자유 말단(HM-DNA)을 갖는 디옥시리보 핵산 가닥을 포함하고/하거나 시스템은 상기 HM-DNA를 인코딩하는 서열을 포함하고, HM-DNA는 HM-DNA를 숙주 게놈 내(예를 들어, 염색체 또는 에피솜 부위 내)에 삽입하기 위해 표적 서열 내의 또는 측면에 위치한 서열 또는 서열들과 각각 상동인 서열 또는 서열들을 포함하는, 용도 또는 시스템.
14. 내인성 CRISPR/Cas 시스템을 포함하는 박테리아 숙주 세포를 변형하기 위한, 제1 컨셉에 사용하기 위한, 조작된 핵산 벡터로서, 벡터는
(g) CRISPR/Cas 시스템에서 사용하기 위한 또는 본 발명의 앞서 기술된 임의의 컨셉에 따른 용도로 사용하기 위한 다수의 상이한 crRNA(예를 들어, gRNA로 구성됨)를 발현하기 위한 핵산 서열을 포함하며;
(h)선택적으로 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열이 결핍되어 있으며,
제1의 상기 crRNA는 상기 숙주 세포에서 제1핵산 서열에 혼성화될 수 있고; 제2의 상기 crRNA는 상기 숙주 세포에서 제2 핵산 서열에 혼성화될 수 있고, 제2 서열은 제1 서열과 상이하며;
(i) 제1 서열은 항생제 내성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되고, 제2 서열은 항생제 내성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되며; 선택적으로 이들 유전자는 상이하며;
(j) 제1 서열은 항생제 내성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되며, 제2 서열은 필수 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되며;
(k) 제1 서열은 필수 유전자(또는 이의 RNA)로 구성되며, 제2 서열은 필수 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되거나; 또는
(l) 제1 서열은 독성 유전자(또는 이의 RNA)로 구성되며, 제2 서열은 필수 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되는, 조작된 핵산 벡터.
15. 제 14 컨셉에 있어서, 벡터에 의해 인코딩되는 cRNA(예를 들어, 단일 가이드 RNA)로 작동 가능한 하나 이상의 Cas를 포함하는 숙주 세포 내에서의 벡터.
16. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, HM-CRISPR 어레이가 동일한 스페이서의 다중 카피를 포함하는, 용도, 시스템 또는 벡터.
17. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 벡터(들)는 다수의 HM-CRISPR 어레이를 포함하는, 용도, 시스템 또는 벡터.
18. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 각각의 벡터가 바이러스 또는 파지인, 용도, 시스템 또는 벡터.
19. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 시스템 또는 벡터가 crRNA(예를 들어, gRNA)를 인코딩하는 핵산 서열의 2 개, 3 개 이상의 카피를 포함하고, 카피는 숙주 세포 서열(예를 들어, 독성, 내성 또는 필수 유전자 서열)을 표적화하기 위한 동일한 스페이서 서열을 포함하는, 용도, 시스템 또는 벡터.
20. 제20 컨셉에 있어서, 카피는 2 개 이상의 벡터 CRISPR 어레이 사이에서 분할되는, 용도, 시스템 또는 벡터.
21. 임의의 앞서 기술된 컨셉에서 언급된 시스템 또는 벡터를 포함하는 박테리아 숙주 세포.
22. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 상기 어레이는 항생제와 조합되거나; 또는 용도는 제 1 항생제에 상기 숙주 세포를 노출시키는 것을 포함하고, 표적 서열은 제1 항생제에 내성을 위한 항생제 내성 유전자에 포함되는, 용도, 시스템 또는 벡터.
23. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 상기 또는 각각의 숙주 세포가 스타필로코커스, 스트렙토코커스, 슈도모나스, 살모넬라, 리스테리아, 대장균, 데설포비브리오 또는 클로스트리디움 숙주 세포인, 용도, 시스템, 벡터 또는 세포.
24. 제1 내지 13 또는 16 내지 23 컨셉 중 어느 하나의 컨셉에 있어서, 각각의 벡터가 제14 또는 제15 컨셉에 따른, 용도, 시스템 또는 세포.
25. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 숙주 세포 개체군 성장이 상기 HM-어레이 또는 상기 gRNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질 전환되지 않은 숙주 세포의 개체군의 성장과 비교하여 적어도 5 배만큼 감소되는, 용도, 시스템, 벡터 또는 세포.
26. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 표면상의 숙주 세포 개체군 성장이 억제되는, 용도, 시스템, 벡터 또는 세포. 하나의 예에서, 개체군은 인간 조직 표면(예: 생체 내 또는 생체 외 장내 조직 표면)과 접촉한다.
27. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 제1 박테리아가 인간과 프로바이오틱, 공생 또는 생리공생(예를 들어, 인간 장내)인, 용도, 시스템, 벡터 또는 세포.
28. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 제1 및 제 2 박테리아가 둘다 페르미쿠테스이고, 상이한 종 또는 균주의 박테리아이거나; 또는 제 1 박테리아는 장내세균이고 제2 박테리아는 페르미쿠테스인, 용도, 시스템, 벡터 또는 세포.
29. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, 숙주 세포가 박테리아 세포 대신에 고세균이거나 각각의 개체군이 박테리아 개체군 대신에 고세균 개체군인, 용도, 시스템, 벡터 또는 세포.
30. 제1, 4, 5, 7 내지 13, 16 내지 20 및 22 내지 29 컨셉 중 어느 하나의 컨셉에 있어서, 산업용 또는 생체 외 의료용 유체, 표면, 장치 또는 컨테이너를 처리하기 위한; 또는 수로, 물, 음료, 식료품 또는 화장품을 처리하기 위한, 용도로서, 숙주 세포(들)가 유체, 표면, 장치, 컨테이너, 수로, 물, 음료, 식료품 또는 화장품으로 구성되거나 또는 이에 포함되는, 용도.
31. 임의의 앞서 기술된 컨셉에 있어서, HM-cRNA 또는 gRNA는 인접한 NNAGAAW 또는 NGGNG 프로토스페이서 인접 모티브(PAM) 인 숙주 세포 표적 프로토스페이서 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는, 용도, 시스템, 벡터 또는 세포.
32. 임의의 앞서 기술된 컨셉의 용도, 시스템 또는 세포에 따른 핵산 벡터, 또는 이들에서 사용하기 위한 핵산 벡터로서, 벡터는 1.4kb를 초과하는 외인성 DNA 서열을 포함하고, 외인성 DNA는 CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 성분을 인코딩하고, 숙주 세포에서 HM-crRNA 또는 gRNA를 발현하기 위한 조작된 어레이를 포함하고, 외인성 서열은 cRNA(들) 또는 gRNA(들)에 동족인 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 결여되어 있고; 적어도 2 개의 상이한 cRNA 또는 gRNA가 외인성 DNA에 의해(예를 들어, 적어도 2 개의 HM-CRISPR 어레이에 의해) 인코딩되는, 핵산 벡터.
33. 제32 컨셉에 있어서, 벡터가 숙주 세포를 형질 전환시킬 수 있는 바이러스 벡터인, 벡터.
34. 제32 또는 제33 컨셉에 있어서, cRNA 또는 gRNA는 숙주 세포에서 각각의 표적 프로토스페이서 서열에 혼성화될 수 있으며, 각 프로토스페이서 서열은 항생제 내성 또는 필수 숙주 유전자에 포함되는, 벡터.
35. 제34 내지 제36 컨셉 중 어느 하나의 컨셉에 있어서, 숙주 세포가 인간 미생물군 종의 세포인, 벡터.
실시형태:
개체군 성장 억제 및 표면상의 박테리아 처리를 위한 야생형 내인성 Cas 활용
1. 개체군의 성장을 억제하는 박테리아 숙주 세포 개체군의 야생형 내인성 Cas 뉴클레아제 활성의 용도로서, 개체군은 다수의 숙주 세포를 포함하고, 각각의 숙주 세포가 야생형 Cas 뉴클레아제 활성을 갖는 내인성 CRISPR/Cas 시스템을 가지며, 용도는 개체군의 숙주 세포를 형질 전환시키는 것을 포함하며, 각각의 형질 전환된 숙주 세포는 숙주 세포에서 숙주 개질 (HM) cRNA 또는 가이드 RNA (gRNA)를 제공하기 위해 조작된 뉴클레오타이드 서열로 형질 전환되고, HM-cRNA 또는 gRNA는 내인성 Cas를 표적으로 안내하기 위한 숙주 세포 표적 프로토스페이서 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하고, cRNA 또는 gRNA는 상기 야생형 뉴클레아제 활성을 갖는 숙주 세포의 내인성 Cas 뉴클레아제와 동족이고 상기 숙주 세포의 형질 전환 후에 상기 개체군의 성장이 억제되는, 용도.
숙주 세포는 동일한 종 또는 균주일 수 있다.
2. 제1 실시형태에 있어서, 숙주 세포 개체군 성장의 억제가 상기 조작된 뉴클레오타이드 서열로 형질 전환되지 않은 숙주 세포의 개체군의 성장과 비교하여 적어도 5 배의 성장 감소인, 용도.
3. 제1 실시형태에 있어서, 표면상에서의 개체군 성장이 억제되는, 용도.
4. 제2 실시형태에 있어서, 표면상에서의 개체군 성장이 억제되는, 용도.
5. 제1 실시형태에 있어서, 상기 억제는 박테리아 숙주 세포를 사멸하거나 성장을 감소시키기 위해 HM-CRISPR/Cas 시스템을 사용하는 것을 포함하는, 용도로서, 각각의 숙주 세포에 대하여, 상기 시스템은 다음의 (i) 내지 (iv)에 따른 성분을 포함하며,
(i) Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열;
(ii) 스페이서 서열(HM-스페이서) 및 HM-crRNA를 인코딩하는 반복을 포함하는, 조작된 HM-CRISPR 어레이;
(iii) 선택적 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열;
(iv) 시스템의 상기 성분은 숙주 세포 및 숙주 세포를 형질 전환시키는 적어도 하나의 핵산 벡터 사이에서 분할됨에 따라, HM-crRNA는 Cas를 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시키며;
표적 서열이 Cas에 의해 숙주 세포에서 변형됨에 따라, 숙주 세포가 사멸되거나 숙주 세포의 성장이 감소되는, 용도.
6. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 박테리아의 혼합된 개체군에서 제1 박테리아 및 숙주 세포를 포함하는 제2 박테리아의 하위 개체군의 상대적 비를 변경하기 위한, 용도.,
7. 제6 실시형태에 있어서, 숙주 세포가 인간 미생물군에서 발견되는 균주 또는 종인, 용도.
8. 제6 또는 제7 실시형태에 있어서, 숙주 세포가 상이한 균주 또는 종의 세포와 혼합되고, 상이한 세포는 장내 세균 또는 인간과 프로바이오틱, 공생 또는 생리공생(예를 들어, 인간 장내에서)되는 박테리아인, 용도.
9. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 박테로이데테스 박테리아 및 다른 박테리아를 포함하는 혼합된 박테리아 개체군에서 박테로이데테스 박테리아의 비율을 변경시키고, 선택적으로, 개체군 내 박테로이데테스 대 하나 이상의 또는 모든 페르미쿠테스 종(예를 들어, 박테로이데테스 대 스트렙토코커스)의 상대적 비를 증가시키기 위한, 용도.
10. 임의의 앞서 기술된 실시형태에 있어서, 혼합된 개체군에서 제1 박테리아 대 제2 박테리아의 상대적 비를 변경하기 위한, 용도로서, 제1 및 제2 박테리아는 모두 페르미쿠테스이고, 다른 종 또는 균주의 박테리아이며, 제2 박테리아는 숙주 세포를 포함하는, 용도. 하나의 예에서, 용도는 제1 박테리아 대 제2 박테리아의 비율을 증가시킨다.
11. 제1 실시형태에 있어서, 조작된 뉴클레오타이드 서열이 외인성 Cas 뉴클레아제-인코딩 서열과 조합되지 않는, 용도.
12. 제5 실시형태에 있어서, 벡터 또는 벡터들은 Cas 뉴클레아제-인코딩 서열이 결핍되어 있는, 용도.
13. 제1 실시형태에 있어서, 각각의 숙주 세포가 인간 미생물군에서 발견되는 균주 또는 종인, 용도.
14. 제6 실시형태에 있어서, 각각의 숙주 세포가 인간 미생물군에서 발견되는 균주 또는 종인, 용도.
15. 제13실시형태에 있어서, 각각의 숙주 세포가 상이한 균주 또는 종의 세포와 혼합되고, 상이한 세포는 장내 세균 또는 인간과 공생 또는 생리공생(예를 들어, 인간 장내에서)되는 박테리아인, 용도.
16. 제1 실시형태에 있어서, 용도는 박테로이데테스 박테리아 및 다른 박테리아를 포함하는 혼합된 박테리아 개체군에서 박테로이데테스 박테리아의 비율을 변경시키고, 선택적으로, 용도는 개체군 내 박테로이데테스 대 하나 이상의 또는 모든 페르미쿠테스 종(예를 들어, 박테로이데테스 대 스트렙토코커스)의 상대적 비를 변경시키는, 용도.
17. 제1 실시형태에 있어서, 제1 및 제2 박테리아는 모두 페르미쿠테스이고, 용도는 혼합된 개체군에서 제1 박테리아 대 제 2 박테리아의 상대적 비를 변경시키는, 용도. 하나의 예에서, 용도는 제1 박테리아 대 제2 박테리아의 비율을 증가시킨다.
18. 제1 실시형태에 있어서, 상기 Cas 뉴클레아제가 숙주 세포 내인성 유형 II CRISPR/Cas 시스템에 의해 제공되고/되거나 HM-cRNA 또는 gRNA는 인접한 5'-NNAGAAW-3' 프로토스페이서 인접 모티브(PAM)인, 숙주 세포 표적 프로토스페이서 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함하는, 용도.
19. 제5 실시형태에 있어서, 상기 Cas 뉴클레아제는 숙주 세포 내인성 유형 II CRISPR/Cas 시스템에 의해 제공되는, 용도.
20. 제5 실시형태에 있어서, 성분 (iii)이 숙주 세포에 내인성인, 용도.
21. 제 5 실시형태에 있어서, 각각의 형질 전환된 숙주 세포가 세포에서 상기 HM-crRNA의 생산시 성분 (ii)와 작동가능한 내인성 RNase 를 포함하는, 용도.
22. 제1 실시형태에 있어서, 표적 서열이 숙주 세포의 항생제 내성 유전자, 독성 유전자 또는 필수 유전자로 구성되는, 용도.
23. 제1 실시형태에 있어서, 조작된 뉴클레오타이드 서열이 항생제와 조합되는, 용도.
24. 제5 실시형태에 있어서, HM-crRNA 및 tracrRNA는 단일 가이드 RNA(gRNA)에 포함되는, 용도.
25. 제1 실시형태에 있어서, 형질 전환된 숙주 세포 각각은 관심있는 HM-서열을 인코딩하는 자유 말단 (HM-DNA)을 갖는 디옥시리보 핵산 가닥을 포함하고, HM-DNA는 HM-DNA를 숙주 게놈 내에 삽입하기 위해 표적 서열 내의 또는 측면에 위치한 서열 또는 서열들과 각각 상동인 서열 또는 서열들을 포함하고, HM-DNA 서열은 숙주 세포 게놈 내로 삽입되는, 용도.
26. 제1 실시형태에 있어서, 숙주 세포 프로토스페이서 표적 서열에 혼성화하기 위한 다수의 상이한 crRNA(또는 gRNA)를 숙주 세포에서 발현시키는 것을 포함하는, 용도로서, 제1의 상기 crRNA(또는 gRNA)는 제1 프로토스페이서 핵산 서열에 혼성화될 수 있고; 제2의 상기 crRNA(또는 gRNA)는 제2 프로토스페이서 핵산 서열에 혼성화될 수 있고, 제2 서열은 제1 서열과 상이하며;
(a) 제1 서열은 항생제 내성 유전자(또는 이의 RNA)로 구성되고, 제2 서열은 항생제 내성 유전자(또는 이의 RNA)로 구성되며; 선택적으로 이들 유전자는 상이하며;
(b) 제1 서열은 항생제 내성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되며, 제2 서열은 필수 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되며;
(c) 제1 서열은 필수 유전자(또는 이의 RNA)로 구성되며, 제2 서열은 필수 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되거나; 또는
(d) 제1 서열은 독성 유전자(또는 이의 RNA)로 구성되며, 제2 서열은 필수 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)로 구성되는, 용도.
27. 제6 실시형태에 있어서, 숙주 세포가 인간 또는 동물 대상체에 포함된 혼합된 박테리아 개체군에 포함되고, 용도는 (i) 혼합된 개체군에 포함된 숙주 세포에 의한 감염을 대상체에서 치료하고; (ii) 대상체에서 숙주 세포에 의해 매개되는 상태 또는 질병의 위험을 치료 또는 감소시키고; (iii) 숙주 세포에 의해 유발되거나 매개되는 인간의 신체 냄새를 감소시키거나; 또는 (iv) 인간의 개인 위생 처리인, 용도.
28. 제1 실시형태에 있어서, 용도는 인간 또는 동물 대상체에서 숙주 세포에 의한 감염의 위험을 치료 또는 감소시키고, 숙주 세포가 각각 표적 프로토스페이서 서열을 포함하는 항생제 내성 유전자(제1 항생제에 대한 내성)를 포함하고, 용도는 조작된 뉴클레오타이드 서열 및 제1 항생제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 감염은 대상체에서 감소되거나 예방되는, 용도.
29. 제1 실시형태에 있어서, 각각의 조작된 뉴클레오타이드 서열이 항생제 내성 유전자를 추가로 포함하고, HM-crRNA 또는 gRNA가 항생제 내성 유전자를 표적화하지 않으며, 용도는 개체군을 항생제 및 다수의 조작된 서열에 노출시키는 것을 포함함으로써, 숙주 세포에서 HM-crRNA 또는 gRNA-인코딩 서열의 유지를 촉진시키는, 용도.
30. 제1 실시형태에 있어서, 숙주 세포가 그람 양성 세포 또는 스트렙토코커스, 스타필로코커스, 슈도모나스, 살모넬라, 리스테리아, 대장균, 데설포비브리오, V. 콜레라 또는 클로스트리디움 세포인, 용도.
31. 제1 실시형태에 있어서, 산업용 또는 의료용 유체, 표면, 장치 또는 컨테이너를 처리하거나; 또는 수로, 물, 음료, 식품 또는 화장품을 처리하고, 여기서, 숙주 세포는 수로, 물, 음료, 식품 또는 화장품으로 구성되거나 또는 이에 포함되며, 숙주 세포 개체군의 성장이 억제됨으로써, 상기 처리를 수행하는, 용도.
하나의 대안에서, 임의의 실시형태는 임의의 앞서 기술된 실시형태에 의존한다.
국면:
혼합된 개체군에서 캐리어와 숙주 세포 사이의 수평 이동
1. 캐리어 박테리아를 포함하는 혼합된 박테리아 개체군을 생산하는 방법으로서, 개체군은 제1 및 제2 박테리아의 제1 및 제2 하위 개체군을 각각 포함하고, 하위 개체군은 서로 다른 제1 종 및 제2 종의 박테리아이고, 제2 박테리아는 다수의 숙주 세포를 포함하고, 캐리어 박테리아는 숙주 세포에서 숙주 세포 변형 (HM) cRNA 또는 가이드 RNA (gRNA)를 제공하기 위한 조작된 뉴클레오타이드 서열을 각각 포함하는 제1 박테리아 세포이고, HM-cRNA 또는 gRNA는, 제1 Cas 뉴클레아제를 표적으로 안내하기 위한 숙주 세포 표적 프로토스페이서 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함하여 표적을 변형시키고, 캐리어 박테리아는 표적 서열을 포함하지 않으며, 상기 방법은,
a. 각각이 조작된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 다수의 핵산을 제공하고;
b. 다수의 핵산을 각각 제1 및 제2 박테리아 종의 제1 및 제2 하위 개체군(제2 하위 개체군은 숙주 세포를 포함함)을 포함하는 제1 혼합된 개체군과 결합시키고;
c. 핵산이, 숙주 세포의 존재하에 상기 제1 하위 개체군의 세포를 형질 전환시키도록 함으로써, 캐리어 세포 및 숙주 세포를 포함하는 제2 혼합된 개체군을 생성시키는 단계(여기서, 캐리어 세포에 포함된 조작된 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포로 수평 이동이 가능하여서 형질전환된 숙주 세포에서 HM-cRNA 또는 gRNA의 생산을 위해 숙주 세포를 형질전환시킴)를 포함하는, 방법.
2. 제1 실시형태에 있어서, 제2 혼합된 개체군을 수득하는 단계를 더 포함하는, 방법.
3. 제1실시형태에 있어서, 제2 혼합된 개체군으로부터 다수의 캐리어 세포를 분리하는 단계를 더 포함하는, 방법.
4. 제1 국면에 있어서, 형질 전환된 숙주 세포에서 HM-cRNA 또는 gRNA를 생산하는 단계를 더 포함하는 방법으로서, HM-crRNA 또는 gRNA 서열은 상기 형질 전환된 숙주 세포에서 표적 프로토스페이서 서열에 혼성화되고, 표적으로 제1 Cas 뉴클레아제를 안내함으로써, 표적을 제1 Cas 뉴클레아제로 변형시키는, 방법.
5. 제4 실시형태에 있어서, 표적 변형을 포함하는 숙주 세포를 수득하는 단계(예를 들어, 숙주 세포가 제1 박테리아 종을 포함하는 혼합된 개체군에 포함됨)를 더 포함하는, 방법.
6. 제1 국면에 있어서, cRNA 또는 gRNA는 숙주 세포의 내인성 Cas 뉴클레아제에 동족이고, 뉴클레아제는 제1 Cas 뉴클레아제인, 방법.
7. 제1 국면에 있어서, cRNA 또는 gRNA는 캐리어 세포의 내인성 Cas 뉴클레아제에 동족이고, 상기 뉴클레아제는 제1 Cas 뉴클레아제인, 방법.
8. 제7 국면에 있어서, 뉴클레아제가 야생형 뉴클레아제 활성을 갖는, 방법.
9. 제1, 제6, 제7 또는 제8 국면에 있어서, 제1 Cas 뉴클레아제는 Cas9인, 방법.
10. 제9 국면에 있어서, Cas9는 스트렙토코커스 Cas9인, 방법.
11. 제1 국면에 있어서, 각각의 조작된 뉴클레오타이드 서열이 각각의 핵산 벡터에 포함되고, 벡터는 캐리어와 숙주 세포 사이에서 수평 이동이 가능한, 방법.
12. 제1 또는 제11 국면에 있어서, 각각의 조작된 서열이 각각의 이동성 유전 요소, 예를 들어, 트랜스포존 또는 플라스미드에 포함되는, 방법.
13. 제1 국면에 있어서, 숙주 세포의 형질 전환 후에, 숙주 세포 하위 개체군의 성장이 억제되는, 방법.
14. 제13 국면에 있어서, 숙주 세포 개체군 성장의 억제가 상기 조작된 핵산 서열로 형질 전환되지 않은 숙주 세포의 개체군의 성장과 비교하여 적어도 5 배의 성장 감소인, 방법.
15. 제13 또는 제14 국면에 있어서, 표면상의 숙주 세포 개체군 성장이 억제되는, 방법.
하나의 대안에서, 임의의 국면은 임의의 앞서 기술된 국면에 의존한다.
하나의 예에서, 방법은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 인간, 동물 또는 식물 대상체에서, 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 치료 또는 예방에 영향을 미친다. 본 발명은 이러한 치료 또는 예방 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 혼합된 박테리아 개체군을 제공한다.
하나의 예에서, 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같이 환경, 장비, 장치, 컨테이너, 수로, 물, 유체, 식품, 음료, 미생물군, 미생물군집 또는 화장품의 혼합된 박테리아 개체군에서 수행되며, 상기 방법은 제1 세포와 비교하여 숙주 세포의 비율을 감소시킨다.
하나의 예에서, 인간 또는 동물의 비만, 당뇨병 또는 IBD를 치료 또는 예방하기 위해 인간 또는 인간이 아닌 동물의 장내에 상기 방법의 산물을 투여한다.
하나의 예에서, 제1 종 및 제2 종은 인간 또는 인간이 아닌 동물 장내 공생 또는 생리공생 박테리아의 종이다.
상기 방법의 산물은 인간 또는 동물(예를 들어, 비강 내로)에 투여되어 박테리아가 인간 또는 동물의 하나 이상의 미생물군집(예를 들어, 장내 미생물군집)을 거주하도록 하기 때문에 유용하다. 제1 세포는 특히 세포가 인간 또는 동물에게 비-병원성인 경우(예: 장내 미생물군집에서 비-병원성인 경우) 캐리어로서 작용한다. 미생물군집은 본원에 개시된 임의의 다른 미생물군집 또는 미생물군 개체군일 수 있다.
하나의 예에서, 제1 및 제 2 박테리아 종은 인간 또는 인간이 아닌 동물의 장내 미생물군을 거주시킬 수 있고, 제1 박테리아는 인간 또는 동물과 공생 또는 생리공생이다. 유용하게도, 제1 박테리아는 인간 또는 동물에게 안전하게 투여될 수 있으며, 이후 조작된 서열을 미생물군의 숙주 세포로 전달하기 위한 캐리어로서 작용할 수 있다.
하나의 예에서, 조작된 서열은 본 명세서에 개시된 임의의 어레이 또는 벡터에 포함된다. 하나의 예에서, 방법은 본 명세서에 개시된 임의의 CRISPR/Cas 시스템을 사용한다.
하나의 예에서, 제1 세포는 박테로이데테스(예를 들어, 박테로이드 또는 박테로이데스) 세포; 락토바실러스(예: 액시도필러스(예: La-5, La-14 또는 NCFM), 브레비스(brevis), 불가리쿠스(bulgaricus), 플랜타룸(plantarum), 람모수스(rhammosus), 페르멘텀(fermentum), 카우카시쿠스(caucasicus), 헬베티쿠스(helveticus), 락티스(lactis), 루테리(reuteri) 또는 카세이(casei), 예를 들어, 카세이 시로타(casei Shirota); 비피도박테리움 종 (예: 비피둠, 브레브, 롱굼 또는 인판티스); 스트렙토코커스 서모필러스; 엔테로코커스 패시움; 알리스티페스(Alistipes); 알칼리플렉서스(Alkaliflexus); 파라박테로이데스(Parabacteroides); 탄네렐라(Tannerella); 대장균; 또는 자일라니박터(Xylanibacter) 세포이다.
하나의 예에서, 숙주 세포는 인간 미생물군 종이고 캐리어 세포는 상기 인간 미생물군에서 비-병원성인 종의 세포이며, 표적 서열은 캐리어 세포의 게놈에 포함되지 않고, 조작된 서열은 캐리어 및 숙주 세포에서 작동가능한 oriT를 포함하는 MGE에 포함되고, MGE는 캐리어 세포로부터 숙주 세포로 수평 이동이 가능하다. 하나의 예에서, 조작된 서열, MGE 또는 벡터는 제1 세포(캐리어)를 감염시켜 MGE를 제1 (캐리어) 세포에 도입할 수 있는 박테리오파지에 포함된다. 이 후 MGE는 숙주 세포로 수평 이동이 가능하다.
하나의 예에서, 제1 세포는 박테로이데테스 또는 프레보텔라 세포이고; 선택적으로, MGE는 제 1 세포 종으로부터 인간 미생물군의 페르미쿠테스 종(숙주 세포)으로의 수평 이동이 가능하다. 후자는 예를 들어, 표적 서열이 페르미쿠테스에 포함되지만 제1 (캐리어) 세포가 아닌 경우 인간 내 비만을 치료하거나 예방하는데 유용하다.
추가의 실시예
실시예 1: 환경 처리 또는 오염 제거
오일, 금속 및 광물 산업
하나의 실시형태에서, 숙주 세포는 광물 광산 또는 분야; 금속 광산 또는 분야; 오일 분야 또는 오일 또는 석유화학(예: 숙주가 혐기성 황산염-환원 박테리아, 예를 들어 데설포비브리오 박테리아일 때 이들 중 임의의 경우에) 중에 존재한다. 하나의 예에서, 이 조성물은 산화제(예: 차아 염소산 나트륨), 4급 암모늄 화합물 또는 이소티아졸론을 포함하거나 차아염소산 나트륨, 4 급 암모늄 화합물 또는 이소티아졸론과 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 데설포비브리오 박테리아 숙주를 변형시키기 위한 본 발명에서 사용하기에 적합한 벡터의 예는 박테리오파지이다. 아래 참고 문헌은 데설포비브리오를 감염시키는 파지를 분리하기 위한 적절한 방법을 기술한다. 본 발명에서 벡터로서 사용하기 위해, 임의의 참고 문헌에 기술된 박테리오파지가 사용될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 나노 입자에 의해 제공된다.
참조문헌[하이델베르그 (Heidelberg) 외]에서는 거의 동일한 mu-유사 박테리오파지 DVUO189-221, DVU2847-79, DVU2688-733의 2개의 카피와 박테리오파지의 잔류물이 데설포비브리오 불가리스의 게놈에 존재한다고 기술하고있다. 이러한 파지는 본 발명에서 사용하기 위한 파지 벡터를 설계하는 기초가 될 수 있다.
참조문헌:
Seyedirashti S 외, J Gen Microbiol. 1991 Jul;137(7):1545-9, "Induction and partial purification of bacteriophages from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough) and Desulfovibrio desulfuricans ATCC 13541;
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*[본원에 기술된 서열은 젠뱅크(GenBank)에 수탁번호 DQ826728-DQ826732로 기탁되어 있고, 본 명세서에 참고로 포함된다]
실시예 2: 물 또는 하수 처리 또는 환경(예: 토양) 금속 오염 제거
본 발명의 또 다른 적용은 물 또는 하수 처리를 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 HM-CRISPR 어레이, HM-CRISPR/Cas 시스템, HM-crRNA, HM-스페이서, HM-DNA, HM-Cas 또는 HM-조성물을 제공하며, 예를 들어, 숙주는 황산염-환원 박테리아, 예를 들면, 데설포비브리오 박테리아이다.
하나의 예에서, 숙주 내 표적 뉴클레오타이드 서열은 중금속 내성 유전자의 서열이다. 선택적으로, 또한 숙주는 데설포비브리오 박테리아, 예를 들어 D. 불가리스이다.
실시예 3: 의학적 용도
본 발명의 또 다른 적용은 인간 또는 동물에서 박테리아 감염을 처리, 예방 또는 감소(예를 들면, 박테리아 감염의 확산 또는 확장의 감소)하기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 HM-CRISPR 어레이, HM-CRISPR/Cas 시스템, HM-crRNA, HM-스페이서, HM-DNA, HM-Cas 또는 HM-조성물을 제공한다.
제1 실시예에서, 감염은 인간의 MRSA 숙주 세포에 의해 유발된다. 숙주 세포는 스타필로코커스 아우레우스 숙주 세포이고, 본 발명의 HM-어레이는 클래스 I, II 또는 III 스타필로코커스 아우레우스 포장된 파지[카우도비랄스: Caudovirales) 또는 미오비리대(Myoviridae) 파지]의 개체군에 함유되어 있다. 파지 개체군은 메티실린 또는 반코마이신 유무에 관계없이 MRSA-감염 환자에게 투여한다. 한 시도에서, 파지 HM-어레이는 (i) 내인성 스타필로코커스 아우레우스 CRISPR 어레이의 리더 프로모터의 3'에서 20 개 뉴클레오타이드의 영역 및 (ii) 숙주 세포에서의 메티실린 내성 유전자를 표적으로 한다. 반코마이신(vancomycin)을 투여하면 평소보다 낮은 용량으로 환자에게 투여된다. 숙주 세포 감염은 녹다운될 것이고 파지 약에 대한 내성은 평소보다 더 낮은 비율이나 중증도로 확립되거나 확립되지 않을 것으로 예상된다. 다른 시도에서, 이들 시도에서 파지가 필수적인 S. 아우레우스 유전자 ftsZ를 표적으로 한다는 것을 제외하고는 설계가 동일하다 (참조 문헌: Liang 외, Int J Infect Dis. 2015 Jan; 30 : 1-6. doi : 10.1016 / j.ijid. Epub 2014 Nov 5, "Inhibiting the growth of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in vitro with antisense peptide nucleic acid conjugates targeting the ftsZ gene").
추가 시도는 위의 시도를 반복 하였지만 파지 K, 엔돌리신을 메티실린에 추가하여 투여하거나 메티실린 대신 투여하였다.
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실시예 4: 혼합된 장내 미생물군 개체군에서 박테리아의 비(Ratio) 변경
박테리아 비의 변경은 본 발명의 실시예에 따라 수행되며, 이는 혼합된 장내 미생물군 시료에서 클로스트리디움 디피실(Clostridium dificile) 박테리아를 녹다운하는 것을 참고하여 기술된다. 이 시료에는 박테로이데스 및 메트로니다졸(metronidazole) (MTZ)-내성 C. 디피실 균주 630 하위 개체군이 함유될 것이다. 생체 외(ex vivo) 혼합된 개체군은 본 발명에 따라 CRISPR 어레이를 포함하도록 조작된 캐리어 박테리아(락토바실러스 액시도필러스 La-14 및/또는 La-5)의 개체군과 혼합된다.
각 CRISPR 어레이는 캐리어 박테리아 및 C. 디피실 세포와 호환되는 플라스미드에 포함된다. 어레이는 또한 oriT, intDOT 서열, tetQ-rteA-rteB 오페론, rteC 및 오페론 xis2c-xis2d-orf3-exc을 포함하는 박테로이데스 테타이오타마이크론 CTnDot 트랜스포존에 포함된다. 하나의 실험에서, mob와 tra 오페론은 배제된다(대신에 트랜스포존이 캐리어 박테리아와 조합하여 혼합물에 전달되는 박테로이데스 세포에 의해 공급된 것에 의존함). 다른 실험에서, mob 및 tra 오페론은 트랜스포존에 포함되어 있다.
세포막을 가로 지르는 단백질 전좌는 모든 박테리아에서 필수적인 과정이다. ATPase, SecA 및 막 채널인 SecYEG를 핵심으로 포함하는 Sec 시스템은 단백질 수송의 대부분을 담당한다. 제2 병렬 Sec 시스템은 다수의 그람 양성 종에서 기재되어 있다. 이 액세서리 Sec 시스템은 에너자이징(energizing) ATPase SecA2의 제2 카피가 존재하는 것을 특징으로 하고; 여기서, SecA2는 Sec 기질의 소집합의 전좌를 담당하는 것으로 연구되었다. 다수의 병원성 그람 양성 종과 공통적으로, 클로스트리디움 디피실은 SecA의 2개의 카피를 보유하고 있다. S 층 단백질(SLP) 및 추가 세포벽 단백질(CwpV)의 수출(export)은 SecA2에 좌우된다. SLP SlpA 및 다른 세포벽 단백질의 세포질 전구체의 축적은 우성-음성(dominant-negative) secA1 또는 secA2 대립 형질을 발현하는 세포에서 관찰되며, 세포벽에서 성숙한 SLP 수준의 감소와 함께 나타난다. 또한, SecA1 또는 SecA2의 우성-음성 대립 형질 또는 안티센스 RNA 녹다운의 발현은 성장을 현저하게 저해하여, Sec 시스템 모두가 C. 디피실에서 필수적임을 나타낸다.
C. 디피실 균주 630 (전염병 유형 X)은 4,290,252 bp (G + C 함량 = 29.06 %)의 단일 원형 염색체와 7,881 bp (G + C 함량 = 27.9 %)의 원형 플라스미드를 가지고 있다. 전체 게놈이 시퀀싱되었고 게놈의 11%가 접합성 트랜스포존과 같은 이동성 유전 요소로 구성된다는 것을 발견했다. 이들 요소는 C. 디피실에 항균제 내성, 독성, 숙주 상호 작용 및 표면 구조의 생성을 담당하는 유전자를 제공한다. 예를 들어, C. 디피실의 cdeA 유전자는 다중 약물 및 독성 화합물 추출운반(multidrug and toxic compound extrusion: MATE) 계열에서 알려진 유출 트랜스포터와 상동인 것으로 나타난 다중 약물 유출 펌프를 생산한다. 이 단백질은 세포로부터 에너지 의존적이며 나트륨과 결합된 약물의 유출을 촉진한다. 또한, C. 디피실의 cme 유전자는 다른 박테리아에서 다중 약제 내성을 제공하는 것으로 나타났다.
어레이는 C. 디피실 세포의 필수 유전자(SecA2)에서 서열을 표적화하기 위한 R1-S1-R1' CRISPR 유닛을 포함한다. 또 다른 실험에서, MTZ 및 선택적으로 하나 이상의 다른 항-C. 디피실 항생제의 존재하에 cdeA 유전자에 대해 표적하는 것이다. 각각의 스페이서 (S)는 SecA 또는 cdeA 유전자의 20mer 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 서열은 반복 서열에 동족인 C. 디피실 균주 630 CRISPR/Cas 시스템의 PAM을 포함한다. 각각의 반복은 C. 디피실 균주 630 반복과 동일하며, 서열 5'- ATTTACATACCACTTAGTTAATATAAAAC-3' (서열번호 118)을 갖는다.
실험의 대안적인 세트에서, 다음 서열이 반복에 사용된다:
5'- GTTTTATATTAACTAAGTGGTATGTAAAT-3' (서열번호 119)
반복은 혼합된 개체군 내 C. 디피실 세포에 내인성인 Cas와 기능한다. 혼합된 박테리아의 혼합된 개체군은 C. 디피실 감염을 앓고 있는 인간 환자의 대변 시료로부터 생체 외 시료로서 회수된다. 혼합된 개체군을 시험관 내에서 캐리어 박테리아와 혼합하고 혐기성 조건 하에서 37에서 항온 처리하여 테트라사이클린의 존재 하에서 장내 상태를 자극한다. CRISPR 어레이를 함유하는 트랜스포존은 혼합물 중 박테로이데스 및 C. 디피실 세포로 전달될 것으로 예상된다. 또한, 후자 세포에서 표적 부위는 Cas 뉴클레아제 작용에 의해 절단되어 혼합된 개체군에서 C. 디피실의 비를 감소시킬 것으로 기대된다(박테로이데스 대 C. 디피실의 비를 증가시킨다).
후속 실험에서, 캐리어 박테리아를 포함하는 음료가 제조되며, 이는 며칠 연속으로 인간 환자에서 1 내지 2회 소비된다. 또한 치료 기간 동안 환자에 테트라 사이클린을 함께 투여한다. 대변 분석 결과 대변 시료에서 C. 디피실의 비율이 감소(또한, 박테로이데스 대 C. 디피실의 비가 증가함)함을 알 수 있다.
실시예 5: 콜레라 치료 또는 예방
세계보건기구(WHO) 콜레라 팩트 시트(fact sheet) N° 107 (2015 년 7 월 업데이트)을 참조한다. 콜레라 (Cholera)는 박테리아인 비브리오 콜레라로 오염된 음식물이나 물 섭취로 인한 급성 설사 감염이다. 연구자들은 매년 콜레라로 인해 약 140 ~ 430 만 건의 사망자가 발생하고 전세계에서 연간 28,000 ~ 142,000 명의 사망자가 발생했다고 추정한다. 2 시간 내지 5일의 짧은 잠복기는 잠재적으로 폭발 패턴을 갖는 발병을 유발하는 요소이다. 콜레라는 극도로 치명적인 질병이다. 어린이와 성인 모두에게 영향을 미치고 몇 시간 내에 죽을 수 있다. V. 콜레라에 감염된 사람의 약 80 %는 감염 후 1 내지 10일 동안 대변에 박테리아가 존재하고 다른 사람들을 잠재적으로 감염시켜 환경으로 되돌려지지만 증상을 나타내지 않는다. 증상이 있는 사람들 중 80%는 경증 또는 중등도 증상을 나타내지만 약 20%는 심한 탈수증으로 급성 설사를 일으킨다. 이는 치료하지 않으면 사망으로 이어질 수 있다.
V. 콜레라-O1과 O139의 두 가지 혈청 그룹이 발병을 일으킨다. V. 콜레라 O1은 대다수의 발병을 일으키고, O139는 1992 년 방글라데시에서 처음 확인되었으며 동남아시아에 국한되어 있다. 비-O1 및 비-O139 V. 콜레라는 경증 설사를 일으킬 수 있지만 전염병을 유발하지는 않는다. 최근에는 아시아 및 아프리카의 여러 지역에서 새로운 변종 균주가 발견되었다. 관측 결과에 따르면 이들 균주는 보다 심각한 치명률을 가진 더 심각한 콜레라를 유발한다. V. 콜레라의 주요 저장소는 인간 및 기수와 강어귀와 같은 수인성 공급원이며, 종종 조류 번식과 관련이 있다.
문헌[Nature. 2013 Feb 28;494(7438):489-91. doi: 10.1038/nature11927, "A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity", Seed KD 외(본원에 참조로 인용됨)]을 참조하였으며, 비브리오 콜레라 혈청 그룹 O1이 심한 설사 질환 콜레라의 주요 원인균이며, 용균성 V. 콜레라 파지는 특히 벵골만을 둘러싸고 있는 고유 지역에서 질병 부담에 영향을 미치고 있다고 기재되어 있다. 저자는 2001부터 201114까지 수집된 콜레라 환자의 쌀-물 대변 시료 및 저자의 간행물에 기재된 연구 중 편재하는 ICP1(설사 질환 연구소, 방글라데시 콜레라 파지 1에 대한 국제 센터)과 관련된 V. 콜레라 O1-특이적 독성 마이오바이러스의 분리를 기재하고 있다.
저자는 ICP1 CRISPR/Cas 시스템이 두 개의 CRISPR 좌위 (CR1과 CR2로 표시)와 6-cas 유전자로 구성되어 있으며, 이들의 조직과 단백질 산물이 1-F (예르시니아 페스트: Yersinia pestis) 아형 시스템의 Cas 단백질과 가장 상동성이 있다고 설명한다. V. 콜레라는 두 개의 생물 유형, 고전형 및 El Tor형으로 분류되며, 전자는 초기 전염병과 관련되어 있으며 이후 El Tor 생물유형18로 대체되었다. 고전형 균주인 V. 콜레라, O395는 I-E(대장균) 아형17에 속하는 CRISPR/Cas 시스템을 가지고 있으며 현재까지 CRISPR/Cas 시스템을 보유하고 있는 El Tor 균주에 대해서는 어떠한 언급도 없다. 따라서 ICP1 파지에서 CRISPR/Cas 시스템의 기원은 알려지지 않았다.
밑줄 표시된 crRNA에서 예측된 줄기를 형성하는 부분 회문 서열을 갖는 CR1 및 CR2 컨센서스 직접 반복의 RNA 서열은 다음과 같다:
GUUAGCAGCCGCAUAGGCUGCUUAAAUA [서열번호 75]
본 발명의 하나의 예에서, 어레이의 상기 또는 각 반복은 서열 번호 75와 적어도 80, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열(또는 서열 번호 75와 동일함)을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
ICP1 CRISPR의 대다수의 스페이서는 1964년 인도에서 분리된 고전형 균주 O395, 1994년 방글라데시에서 분리된 El Tor 균주 MJ-1236, 및 2001 년에서 2011년까지 ICDDR,B에서 수집된 몇몇 El Tor 균주를 포함하는 V. 콜레라 균주의 소집합에서 발견되는 18kb 섬 내의 서열과 100 % 동일함을 보여주었다. 18 kb의 섬은 원형 스타필로코커스 아우레우스 병원성 섬 (SaPIs)을 포함하여 그람 양성 박테리아의 파지 유도성 염색체 섬 (PICIs)과 유사하다. SaPI는 특정 파지에 의한 감염 후 절제, 원형화 및 복제로 유도된다. 이들은 자신의 무차별확산을 가능하게 하기 위해 파지 생식주기를 방해하는 다양한 메커니즘을 사용하며, 이는 주변의 박테리아 개체군을 더 많은 파지 포식으로부터 보호할 수 있다. ICP1 CRISPR/Cas 시스템에 의해 표적된 V. 콜레라 18kb 섬의 조직은 길이, 염기 조성 및 조직이 PICI의 SaPI 소집합에서 관찰되는 것과 유사하며, 한쪽 끝에 인테그라제 동족체가 있고 GC 함량은 숙주 종에서보다 더 낮다(47.5 %와 비교하여 37 %). 따라서 18 kb 요소는 V. 콜레라 PICI 유사 요소(PLE)라고 지칭한다.
Figure pat00001
[뉴클레오타이드 서열 = 서열 번호 76 (32bp의 프로스페이서 서열 (서열 번호 77)은 회색으로 음영처리됨), 본 발명은 제1 T 음영처리된 회색에서 시작하여 마지막 C 음영처리된 회색에서 종료하는 서열을 포함함; 아미노산 서열 = 서열 번호 78]
문헌[참조: Seed 외]에서는 CR1 및 CR2 어레이가 GA PAM 서열의 인식에 의해 작동한다고 결정했다. Seed 외는 또한 연구된 ICP1 관련 파지 CRISPR 어레이의 대부분의 스페이서가 V. 콜레라 PLE에 대한 동일성을 나타냄을 발견했다. 스페이서는 하기 표 3에 나타내었고; 본 발명의 어레이에서 S1은 예를 들어 이들 서열 중 어느 하나로부터 선택된다. 하나의 실시 형태에서, S1은 밑줄 친 서열들 중 어느 하나로부터 선택된다.
하나의 예에서, 본 발명의 어레이(또는 각 어레이)는 하나 이상 또는 모든 밑줄 그어진 스페이서 서열을 포함하는 조작된 어레이이다. 어레이 스페이서는 다음과 같이 자연 발생적이지 않은 어레이를 포함할 수 있다:예를 들어, 어레이는 유형 8a 및/또는 9a 및 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 (그러나 7은 아님)의 유형 1a 내지 유형 7a의 스페이서를 포함한다. 예를 들어, 어레이는 유형 4b 및 0, 1 또는 2, 3 (그러나 3 이상은 아님)의 유형 1b 내지 3b의 스페이서를 포함한다. 예를 들어, 어레이는 유형 8a 및 하나 이상 또는 모든 9a, 4b, 1c, 3d, 1e 및 3e의 스페이서를 포함한다. 예를 들어, 어레이는 유형 9a 및 하나 이상 또는 모든 8a, 4b, 1c, 3d, 1e 및 3e의 스페이서를 포함한다. 예를 들어, 어레이는 유형 4b 및 하나 이상 또는 모든 8a, 9a, 1c, 3d, 1e 및 3e의 스페이서를 포함한다. 예를 들어, 어레이는 유형 1c 및 하나 이상 또는 모든 8a, 49a, 4b, 3d, 1e 및 3e의 스페이서를 포함한다. 예를 들어, 어레이는 유형 3d 및 하나 이상 또는 모든 8a, 9a, 4b, 1c, 1e 및 3e의 스페이서를 포함한다. 예를 들어, 어레이는 유형 1e 및 하나 이상 또는 모든 8a, 9a, 4b, 1c, 3d 및 3e의 스페이서를 포함한다. 예를 들어, 어레이는 유형 3e 및 하나 이상 또는 모든 8a, 9a, 4b, 1c, 3d 및 1e의 스페이서를 포함한다.
다른 자연 발생적이지 않은 어레이에서, 벡터는 본 발명의 제 1 및 제 2 어레이를 포함하며, 어레이는 1a 내지 1g (예를 들어, 8a, 9a, 4b, 1c, 3d, 1e 및 3e로부터 선택된 2 이상의 스페이서)로부터 선택된 2 이상의 스페이서를 포함하고, 스페이서는 동일한 ICP1 파지 게놈의 스페이서가 아니며, 예를 들어 ICP1_ 2011_A, 또는 ICP1_ 2006_E, 또는 ICP1_ 2005_A 또는 ICP1_ 2004_A의 모든 스페이서(위 표의 스페이서를 참조)가 아니다. 따라서, 하나의 실시형태에서
제 1 어레이는 ICP1_2011_A 스페이서 서열 (예를 들어, 8a 및/또는 9a)을 포함하고, 제 2 어레이는 ICP1_ 2006_E, ICP1_ 2005_A 또는 ICP1_ 2004_A (예를 들어, 4b, 1c, 3d, 1e 및 3e로부터 선택된 하나 이상의 스페이서)를 포함한다.
하나의 예에서, 벡터는 8a, 9a, 4b, 1c, 3d, 1e 및 3e로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개의 모든 스페이서 유형을 포함한다. 하나의 예에서, 상기 벡터는 상기 선택된 유형 중 하나 이상의 다수의 카피를 포함한다. 하나의 예에서, 벡터의 일부 또는 각 어레이는 (어레이의 프로모터에 가장 가까운) 제1 스페이서를 포함하고, 제 1 스페이서는 8a, 9a, 4b, 1c, 3d, 1e 및 3e로부터 선택된다. 이러한 방식으로 위치를 정하는 것은 자연 어레이가 제 1 스페이서를 가장 빈번하게 사용하므로 유리하다.
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예를 들어 vc0309와 vc0753의 삽입 돌연변이는 각각 평균 5.6과 4.7의 독성을 나타내어 성장이 심각하게 약화되었다. 마찬가지로, 시험관내 경쟁 실험에서 vc0237 및 vc1773 돌연변이가 야생형 세포보다 덜 적합했다. 이 목록에는 또한 vca0360, vca0477, vca0486 및 vca0488을 포함하여 추정 독소/항독소 중독 유전자 좌위로부터의 다수의 항독소 유전자가 포함되어있다. 이러한 유전자는 활성 독소와 관련될 때 필수적이라고 여겨진다.
저자는 표 4에서 필수 V. 콜레라 유전자를 발견했다. 저자는 필수로 보이는 200 개 이상의 유전자간 영역을 확인했다.
따라서, 본 발명의 하나의 예에서, 숙주 세포가 비브리오 콜레라 세포 인 경우, 표적 서열은 vc0631, vc2024, vc2626, vc2763-vc2767 또는 vc2768-vc2770 서열이다. 본 발명의 하나의 예에서, 숙주 세포가 비브리오 콜레라 세포인 경우, 표적 서열은 vc0309 및 vc0753, vc0237 및 vc1773, vca0360, vca0477, vca0486 또는 vca0488 서열이다.
문헌[Infect Immun. 2015 Sep;83(9):3381-95. doi: 10.1128/IAI.00411-15. Epub 2015 Jun 8, "A Genome-Wide Screen Reveals that the Vibrio cholerae Phosphoenolpyruvate Phosphotransferase System Modulates Virulence Gene Expression", Wang Q 외 (본원에 참조로 인용됨)]을 참조하였다. 저자는 유기체의 주요 장내 콜로니화 요인인TCP의 주요 소단위를 인코딩하는 tcpA의 발현에 필요한 새로운 인자를 확인하기 위해 트랜스포존 삽입 부위 (transposon insertion site: TIS) 시퀀싱 기반 전략을 사용했다. tcpA 발현을 조절하는 것으로 알려진 대부분의 유전자를 확인하는 것 외에도, V. 콜레라 포스포에놀피루베이트 포스포트랜스퍼라제 시스템(V. cholerae phosphoenolpyruvate phosphotransferase system (PTS))의 효소 I (EI)와 Hpr 성분을 인코딩하는 ptsI와 ptsH를 스크린-수득하였다. TcpA의 발현 감소 외에도, EI, Hpr 또는 관련 EIIA (Glc) 단백질이 결핍된 균주는 콜레라 독소 (CT)를 덜 생성하고 유아 마우스 장을 콜로니화시키는 능력이 감소했다.. PTS는, 독성 유전자 발현의 중심 활성화인자인 toxT의 발현을 조절하는 tcpPH 및 aphAB의 발현을 조절함으로써 독성 유전자 발현을 조절한다.
따라서, 숙주 세포가 비브리오 콜레라 세포인 경우의 본 발명의 예에서, 표적 서열은 tcpA 서열 또는 tcpA 조절자 서열(즉, tcpA 자체 또는 이의 발현 산물을 통해 조절하는 뉴클레오타이드 서열)이다. 예를 들어, 서열은 ptsI 또는 ptsH 서열이다. 하나의 예에서, 표적 서열은 포스포에놀피루베이트포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS)의 서열 또는 tcpPH, aphAB 또는 toxT 서열이다. 하나의 예에서, 표적 서열은 EIIA(Glc) 단백질을 인코딩하는 유전자 서열이다.
본 발명에 적합한 표적 서열은 또한 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 다음의 어느 하나의 서열이다(병원성 유전자는 밑줄 그어져 있다).
하나의 실시형태에서, 세포는 비브리오 (예: 콜레라) 세포이고, 표적 서열은 이들 유전자 중 임의의 서열이다.
병원성 유전자를 표 6에 나타내었다.
하나의 실시형태에서, 세포는 비브리오 (예: 콜레라) 세포이고, 표적 서열은 이들 유전자 중 임의의 서열이다.
TCP 및 CTX 병원성 섬의 유전자
하나의 실시형태에서, 세포는 비브리오 (예: 콜레라) 세포이고 표적 서열은 ace, cep, ctxA, ctxB, orfU, zot, rstA, rstB, rstR, acfA, acfB, acfC, tagE, aldA, int, tagA, tagD, tcpA, tcpB, tcpC, tcpD, tcpE, tcpF, tcpH, tcpI, tcpJ, tcpP, tcpQ, tcpR, tcpS, tcpT 또는 toxT 서열이다.
실시예 6: 야생형 내인성 Cas를 이용하여 특정 미생물군 박테리아 개체군 성장 억제
1. 물질 및 방법
1.1. 균주
본 실시예 및 실시예 7 및 8의 과정에서 하기 균주를 사용하였다: 대장균 MG1655, 대장균i TOP10, 스트렙토코커스 서모필러스 LMD-9 (ATCC BAA-491, Manassas, 버지니아), 스트렙토코커스 서모필러스 DSM 20617(T) (DSMZ, Braunschweig, 독일), 락토코커스 락티스 MG1363 및 스트렙토코커스 무탄스 Clarke 1924 DSM 20523 (DSMZ, Braunschweig, 독일).
배지 선택 및 유전체 구조의 시험 과정에서 다른 스트렙토코커스 균주가 사용되었다. 스트렙토코커스 서모필러스 LMD-9 (ATCC BAA-491)와 대장균 TOP10은 호환가능한 성장 요구 조건이 서로 다르기 때문에 고려되었다. 달리 언급되지 않는 한, 토드 헤위트(Todd-Hewitt: TH) 배지 (T1438 Sigma-Aldrich)에서 호기성 조건과 37에서 모든 균주를 재배하였다. 균주를 -80에서 25 % 글리세롤에 보관하였다.
1 2. 차동 성장 배지
모든 균주를 TH 배지에서 37에서 20 시간 동안 배양하였다. S. 서모필러스의 선택적 배지는 3 g l-1의 2-페닐에탄올 (PEA)을 보충한 TH 배지였다. PEA를 배지에 첨가하고 15 psi에서 15 분 동안 121 에서 고압멸균하였다. 1.5 % (wt/vol) 배지를 상응하는 배지에 첨가하여 배지 플레이트를 제조하였다. 선택 또는 플라스미드 유지 관리에 필요한 경우 S. 서모필러스 균주 및 대장균 둘 다에는 30 g ml-1 카나마이신을 사용하여, S. 무탄스에는 500 μg ml-1을 사용했다.
일부 경우에는 PEA가 보충된 배지에서 성장을 관찰하기 위해 균주와 플라스미드에 따라 48 시간 이상 배양하는 것이 필요할 수 있다. 사용된 유기체의 생존력을 제어하기 위해서는 대조군 TH 배지를 병행해야 한다.
1.3. 클로닝
모든 서브클로닝 절차에서 대장균 (One Shot® ThermoFisher TOP10 화학적으로 유능한 세포)을 사용했다. PCR은 Phusion 중합 효소를 이용하여 수행하였다. 모든 PCR 생성물을 제조업체의 프로토콜에 따라 Nucleospin 겔 및 Macherey-Nagel에 의한 PCR 클린-업으로 정제하였다. 정제된 단편을 제한 효소 DpnI로 1X FD 완충액에서 1㎕의 효소로 34㎕의 총 부피로 분해하였다. 분해된 반응물을 다시 제조업체의 프로토콜에 따라 Nucleospin 겔 및 Macherey-Nagel에 의한 PCR 클린-업으로 정제하였다. 제조업체의 프로토콜 (NewEngland Biolab)에 따라 10㎕ 반응물에서 깁슨 어셈블리를 수행하였다.
제조업체의 지침에 따라 Qiagen 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 제조하였다. 그람 양성 균주의 변형은 세포 용해를 촉진하기 위해 0.5% 글리신 및 리소자임이 보충된 배지에서 박테리아를 증식시키는 것을 포함하였다.
1.4. 형질 전환
1.4.1 전기능숙 대장균 세포와 형질 전환
상업적으로 전기능숙 세포를 클로닝 및 실험에 사용하였다(One Shot® ThermoFisher TOP10 화학적으로 유능한 대장균). Electro Cell Manipulator (BTX Harvard Apparatus ECM630)를 사용하여 1800 V, 25 μF 및 200 Ω의 표준 설정을 사용하여 전기천공을 수행했다. 펄스 후, LB-SOC 배지 1 ㎖를 첨가하고 세포를 37에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 형질 전환된 세포를 50 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB-배지에 도말하였다.
1.4.2 전기능숙한 S. 서모필러스 세포의 준비
전기천공 프로토콜은 1988 년 Somkuti와 Steinberg로부터 변형되었다. 40 mM DL-트레오닌(T8375 Sigma-Aldrich)이 보충된 TH 배지에서의 스트렙토코커스 서모필러스의 밤새 배양물을 동일한 배지 5 ml에서 100 배 희석하고 0.3 내지 0.5 (접종 후 약 2.5 시간) OD600으로 성장시켰다. 세포를 4에서 10 분간 10,000 x g으로 원심분리하여 수집하고 5 ml의 차가운 세척 완충액(0.5 M 수크로오스 + 10% 글리세롤)으로 3 회 세척하였다. 세포를 세척한 후, 15-30의 OD600으로 전기천공 완충액(0.5 M 수크로오스, 10 % 글리세롤 및 1 mM MgCl2)에 현탁시켰다. 전기천공 완충액의 세포를 사용전 4에서 (1 시간 이내) 유지시키거나 또는 나중에 사용하기 위해서는 에펜도르프 튜브로 50 μl로 나누어 액상 질소에서 동결시키고 -80에서 보관한다.
1.4.3 전기천공 S. 서모필러스 세포
1 ㎕의 정제된 플라스미드 DNA를 50 ㎕의 세포 현탁액에 첨가하고 미리 냉각시킨 2 mm간격의 전기 천공 큐벳(cuvette)에서 전기 천공을 수행하였다. 전기천공 설정은 Electro Cell Manipulator (BTX Harvard Apparatus ECM630)를 사용하여 2500V, 25μF 및 200Ω이었다. 전기 펄스 직후, 1ml의 TH 배지를 세포에 첨가하고 현탁액을 얼음 위에서 10 분간 유지 한 후, 세포를 37에서 3 시간 동안 항온처리하였다. 저항 유전자의 발현을 위한 시간을 허용한 후, 세포를 30 ㎍/ml-1의 카나마이신을 함유하는 TH-배지 플레이트 상에 도말하였다. 작제물에 따라, 37에서 12 시간에서 48 시간 사이의 배양으로 콜로니가 관찰되었다.
1.5. XylS 플라스미드의 작제
이 작업에 사용된 모든 플라스미드는 스트렙토코커스 크레모리스(Streptococcus cremoris) (Bryksin & Matsumura, 2010)의 잠재 플라스미드 pWV01로부터 유래한 광범위한 숙주 범위 발현 벡터인 pBAV1K-T5를 기반으로하며, 주쇄는 깁슨(Gibson)의 방법을 사용하여 다른 단편과 조립한 오버행(overhangs)을 함유하는 것을 사용하여 증폭시켰다.
자일로스 유도성(xylose inducible) 시스템은 XylR 억제자 앞에 프로모터 gyrA를 클로닝하여 작제하였다 (도 1). XylR 억제자는 깁슨 조립을 위한 오버행을 포함하는 역방향 프라이머 및 gyrA 프로모터(Xie 외, 2013)를 도입하는데 사용되는 울트라머(ultramer)이고 pBAV1KT5 주쇄로의 조립을 위한 상응하는 오버행인 순방향 프라이머를 가진 바실러스 서브틸리스 (Bacillus Subtilis) 균주 SCK6 (참조: Zhang 외, 2011)로부터 증폭시켰다(참조: Xie 외). 생성된 단편은 Pldha + PxylA 하이브리드 프로모터를 포함하는 울트라머로 pCL002 (미공개됨)로부터 증폭된 mCherry에 측면에 위치하였다(Xie 외, 2013).생성된 3 개의 PCR 산물을 깁슨 마스터 믹스®(Gibson Master Mix®) (NewEngland Biolab)에서 제조업체의 지침서에 따라 조립하였다. 산물을 최종적으로 대장균 TOP10 전기능숙(electrocompetent) 세포에서 형질 전환시켰다. 도 1을 참조한다.
1.6. CRISPR 어레이 플라스미드의 설계 및 제작
스트렙토코커스 서모필러스는 4 가지 별개의 CRISPR 시스템(참조: Sapranauskas 외 2011)을 보유하고 있으며,이 연구를 위해 유형 2 CRISPR1 (ST1-CRISPR) 시스템이 선택되었다. 표적 서열의 설계는 LMD-9 (GenBank : CP000419.1)의 이용 가능한 게놈 서열에 기초하였다. ST1-CRISPR 어레이는 자일로스 유도성 프로모터 (참조: Xie 외, 2013)에 따른 CRISPR 어레이 반복과 스페이서만을 함유하고, 이후 스트렙토코커스 종에 대한 강한 구성형 프로모터(Sorg 외 2014)에 상응하는 tracrRNA를 포함하도록 설계되었다 (도 2, 서열 번호).
tracrRNA는 crRNA의 성숙에 있어서 작용을 하며, S. 서모필러스 내인성 RNase III에 의해 처리되어 crRNA와 복합체를 형성한다. 이 복합체는 엔도뉴클레아제 ST1-Cas9(참조: Horvath & Barrangou, 2010)의 가이드로서 작용한다. 자일로스 유도성 프로모터로부터 합성 어레이를 전사한 후, 내인성 Cas9와 RNAses는 기능적 gRNA로 처리할 것이다. gRNA/Cas9 복합체는 표적 위치에서 이중 가닥 절단을 야기할 것이다.
어레이의 설계에서 GC 함량이 높고tracrRNA의 감소된 부분(즉, 완전한 tracrRNA 서열 미만)을 갖는 2 개의 특정 표적 서열을 사용하는데, 이는 crRNA의 적절한 성숙에 필요하지 않다고 제안되어왔다(참조: Horvath & Barrangou, 2010).
2개의 표적은 필수 유전자(DNA 중합 효소 III 소단위 알파) 및 항생제 내성 유전자 (tetA 유사 유전자) (서열 번호)였다.
프라이머를 사용하여 pBAV1KT5-XylR-PldhA 주쇄를 증폭시켰다. CRISPR 어레이 gBlock과 오버행을 가진 주쇄를 깁슨 마스터 믹스(Gibson Master Mix®)에서 제조업체의 지침서(NewEngland Biolabs)에 따라 조립했다. 산물을 최종적으로 대장균 TOP10 전기능숙(electrocompetent) 세포에서 형질 전환시켰다.
1.7. 스트렙토코커스 서모필러스 LMD-9에서의 자일로스 유도성 시스템의 특성
밤새 정지상 배양물을, 상응하는 항생제가 함유된 TH 배지에 1:100으로 희석시켰다. 미드-로그(Mid-log) 세포는 다른 농도의 D-(+)-자일로스(0, 0.001, 0.01, 0.1, 0.5 및 1% wt/vol)로 유도하였고 세포 배양물을 배지에서 직접 측정하여 세포 현탁액 또는 현탁액 완충액 (PBS 완충액) 상에 배지의 자가 형광의 정도를 평가하였다. 세포 배양물 시료 20μl를 평평한 바닥이 있는 96-웰 플레이트상에서 PBS 완충액으로 1/10 희석시켰다. 세포 현탁액 또는 배지의 형광을 플레이트 판독기에서 판독하였다. mCherry 형광은 여기 파장 558 nm 및 방출량 612 nm을 사용하여 측정되었다. 재현탁된 세포의 흡광도를 OD 600 nm에서 측정하였다. 각 실험마다 최소 3개의 독립적인 생물학적 복제가 수행되었다.
1.8. S. 서모필러스에서 CRISPR 어레이의 활성화
DNA 중합 효소 III 및 S. 서로필러스의 tetA를 표적으로 하는 CRISPR 어레이를 함유하는 플라스미드를 가진 S. 서모필러스 LMD-9 및 대장균 TOP10 둘 다를, 플라스미드 유지를 위해 30 μg ml-1의 카나마이신이 보충된 3 ml 배양물에서 밤새 성장시켰다. 다음 날 96 웰 깊은 플레이트에 30 μg ml-1카나마이신이 보충된 새로운 TH 배지에서 밤새 배양한 1/100의 500 μl를 접종하였다. 미드-로그 세포 배양은 1% 자일로스로 유도하였다. 살충 효과는 S. 서모필러스 및 대장균 단독에서 시험하였다. 시험된 각 균주 및 조건에 대하여, 음성 대조군은 자일로스없이 유지되었다. 세포를 약 OD 0.5까지 성장시키고 다음에 10 배로 TH 배지에서 일련 희석시키고96-웰 리플리케이터 (Mettler Toledo Liquidator ™ 96)를 사용하여 5 μL 부피의 드롭(drop)을 TH 배지 및 g l-1 PEA 플레이트로 보충한 TH 배지 상에 스폿하였다. 플레이트를 37에서 24 시간 동안 배양하고 콜로니 형성 단위(CFU)를 3회 측정하여 계산하였다.
2. 결과
2.1 성장 조건 및 선택적 배지
본 발명자들은 먼저 공동 배양 실험에 사용하기로 계획한 모든 균주의 성장을 지원해줄 박테리아 균주 및 배양 프로토콜을 수립하기 시작했다. 37에서 TH 배지에서 대장균과 비슷한 성장을 보인 S. 서모필러스 LMD-9 균주를 사용하였다 (도 3).
혼합된 배양물로부터 다른 박테리아를 구별하는 것은 다른 종의 세포 수를 결정하는 데 중요하다. 맥콘키(MacConkey) 배지를 사용하면 대장균을 선택적으로 성장시킬 수 있지만, S. 서모필러스의 선택적 성장을 위한 특정 배지는 없다. PEA 배지는 그람 음성 박테리아(대장균)에서 그람 양성 박테리아(S. 서모필러스)를 분리하는 데 사용되는 선택적 배지이다. 또한, 다른 농도의 PEA가 다른 그람 양성 박테리아의 성장을 부분적으로 억제하여 이 실험에 사용된 다른 그람 양성 박테리아 사이의 선택을 허용한다는 것을 발견했다 (도 4). 3g l-1의 PEA는 대장균의 성장을 제한하면서 S. 서모필러스 LMD-9를 선택적으로 성장시키는 것으로 나타났다.
2.2 유도성 시스템의 설계 및 검증
스트렙토코커스 종에 대한 유도성 시스템은 이종 자일로스 유도성 카세트 (Xyl-S)를 생성하여 바실러스 메가테리움 자일로스 오페론(Bacillus megaterium xylose operon) (도 5)에 기초하여 앞서 개발되었다. xylR 및 xylA 프로모터는 S. 무탄스의 구성적으로 발현된 gyrA 및 ldh 프로모터로 각각 대체되었다. 스트렙토코커스 종에 대한 이 발현 카세트는 다른 종 사이의 감수성 및 발현 수준에서 차이를 보였으나 시스템은 S. 서모필러스에서 시험되지 않았다 (참조: Xie 외, 2013). 그러므로 본 발명자들은 S. 서모필러스에서 자일로스 유도성 카세트의 유효성을 검증하기 시작했다.
유도성 카세트의 다른 버전은 xylR 프로모터를 S. 무탄스의 gyrA 프로모터로 대체만 하고 내인성 B. 메가테리움 xylA 프로모터는 그대로 남겨 두어 작제하였다. 자일로스 유도성 시스템의 설계 동안 본 발명자들은 유도성 프로모터, 바실러스 메가테리움에서 발견된 천연 PXylA 프로모터의 모든 버전 및 PXylA 프로모터의 억제자 결합 부위와 융합된 고도로 보존된 프로모터 Pldha의 하이브리드 프로모터를 모두 고려하였다 (도 5). 소수의 스트렙토코커스 종만이 자일로스를 대사한다고 보고되었으므로 다른 스트렙토코커스 종에서 xylA 프로모터를 인식할 수 있는 규제 기관이 존재하지는 않는다. 따라서 본 발명자들은 두 가지 자일로스 유도성 시스템을 구축하였으나, Pldha+XylA 시스템으로 mCherry의 유도성을 시험하였다.
자일로스에 의한 mCherry 유도성 발현을 결정하기 위해, 플라스미드 (pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA)를 갖는 세포의 미드-로그 배양을 상이한 농도의 자일로스로 유도하였다. 유도 6시간 후 본 발명자들은 배양물에서 mCherry 형광을 측정하였고, 플라스미드를 운반하는 세포에서 전반적으로 더 높은 발현 수준을 관찰했다(도 6). 자일로스가 첨가되지 않은 배양물에서도 시스템이 실질적인 수준의 기저 발현을 보였다는 것을 알아두는 것이 중요하다. 이는 시스템이 '누설된(leaky)' 것을 의미하고 사멸-어레이(kill-array)와 관련하여 시스템이 자일로스로 유도되기 전에도 세포 사멸을 초래할 수 있다. 그러나, 본 연구의 후속 과정에서 두 가지 버전의 플라스미드(pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA 및 pBAV1KT5-XylR-mCherry-PxylA)를 모두 사용했다.
2.3 CRISPR/CAS9 어레이의 설계
CRISPR 어레이의 게놈 표적화 스페이서가 S. 서모필러스 LMD-9에서 사멸을 유발할 수 있는지를 결정하기 위해, 이전에 제작된 두 가지 자일로스 유도성 시스템 (pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA 및 pBAV1KT5-XylR-mCherry-PxylA)으로 디자인한 CRISPR 어레이를 삽입하였다. 이 플라스미드에서 mCherry를 CRISPR 어레이를 포함하는 gBlock으로 대체했다 (도 7). Pldha+XylA 프로모터를 갖는 변이체는 PxylA보다 더 강하고 기저 활성이 더 높을 것으로 예상되었다(참조: Xie 외, 2013).
2.4 내인성 Cas9를 이용한 박테리아 개체군 성장 억제
대장균에 플라스미드를 작제한 후 플라스미드를 S. 서모필러스로 형질 전환시켰다. 이는 특정 박테리아 종의 세포 사멸을 일으킬 수 있는지 판단할 수 있게 한다. 흥미롭게도, 강한 Pldh+XylA 하이브리드 프로모터를 함유하는 플라스미드에 노출된 S. 서모필러스에서 박테리아 숙주 개체군의 크기(박테리아를 증식시키고 배지 플레이트에서 콜로니수를 계수하여 나타냄)는, 약한 정상 PxylA 프로모터를 함유하는 플라스미드에 노출 된 S. 서모필러스에 비해 10 배 적었고(도 8; 강한 어레이 발현을 보인 52 개의 콜로니 대 약한 어레이 발현을 보인 556 개의 콜로니, 10.7 배의 차이), 2 개의 균주는 동일한 배치의 전기능숙 S. 서모필러스 세포를 사용하여 평행하게 형질 전환되었다. 이는 S. 서모필러스 유전자를 표적으로 하는 CRISPR 어레이를 지닌 플라스미드가 내인성 Cas 뉴클레아제 및 RNase III를 사용하여 세포를 사멸시킬 수 있으며, 이로 인해 개체군 증가를 10 배까지 억제할 수 있음을 암시한다.
PxylA 프로모터를 포함하는 플라스미드에 의해 형질 전환 된 숙주 세포에서의 약한 어레이 발현이 강한 프로모터 플라스미드보다 훨씬 적지만 세포 사멸 정도를 유도할 것으로 예상한다. 강한 어레이 발현의 활성의 비교가 임의의 어레이-인코딩 플라스미드(예를 들어, 장내 미생물군에서 직접 분리된 박테리아)에 노출되지 않은 S. 서모필러스로 수행된 경우, 관찰된 10 배 억제보다 큰 개체군 성장 억제가 결정될 것으로 예상한다. 따라서, 내인성 Cas 뉴클레아제를 사용하기 위한 숙주 세포에서의 어레이(또는 단일 가이드 RNA) 발현은 본 명세서에서 언급된 환경, 의학 및 기타 환경에서 표적 숙주 세포의 효과적인 성장 억제를 제공하는데 유용할 것으로 생각된다. 항생제의 동시 투여는 특히 하나 이상의 항생제 내성 유전자가 표적화될 때 성장 억제를 강화시키는데 유용할 수 있다.
3. 토론 및 전망
이 연구에서 우리는 내인성 Cas9 시스템을 사용하여 S 서모필러스를 특이적으로 사멸하는 CRISPR-어레이를 설계하기 시작했다. 사멸 신호를 제어하기 위해서 우리는 S 서모필러스에 적용할 수 있는 유도성 시스템을 적용하려고하였다. B. 메가테리움으로부터 자일로스 유도성 XylR 시스템은 이전에 S. 무탄스 (Xie, 2013)에 적용되었으나 S. 서모필러스에는 적용되지 않았다. 이 연구에서 우리는 S. 서모필러스에서 설계된 XylR-mCherry-Pldha 회로를 사용하여 xylR 유도 시스템의 기능을 입증했다. 0.1 % wt/vol이 S. 서모필러스에서 XylR 시스템을 완전히 유도하는데 충분하다는 것을 발견했다 (도 6).
S. 서모필러스 및 대장균을 함께 배양할 때 풍요성(abundance)을 관찰하기 위해서 PEA 3 g l-1을 포함한 배양 배지의 보충이 대장균의 성장을 제한하면서 S. 서모필러스의 선택적 성장을 허용한다는 것을 확증했다(도4).
S 서모필러스 LMD-9 게놈에서 DNA 중합 효소 III 소단위 알파와 tetA 유사 유전자를 표적으로하는 ST1-CRISPR 어레이를 자일로스 유도성 프로모터(참조: Xie 외, 2013)에 위치시켰다. 이 부위를 표적으로 하면 이중 나선이 끊어지고 S. 서모필러스 생존력이 제한된다 (도 9). 조작된 어레이는 인코딩된 CRISPR 어레이를 처리하기 위해 내인성 CRISPR/Cas 기계를 사용하여 S. 서모필러스 게놈을 표적으로 하도록 설계되었기 때문에, 어레이는 대장균과 같은 관련없는 균주의 성장에 아무런 영향을 미치지 않을 것으로 예상되며, 심지어 유사한 표적도 게놈 상에 발견될 수 있다. 이것은 실시예 8에서 논의된 바와 같이 혼합된 박테리아 개체군(인간 미생물군의 국면을 시뮬레이션함)에서 성공적으로 시험되었다.
표면 상의 숙주 세포 성장을 억제하는 본 발명의 능력의 입증은 본 발명이 인간 또는 동물 대상체에서 본 명세서에 개시된 바와 같이 미생물군에 의해 매개되거나 유발되는 질병 또는 증상을 치료 또는 예방하는 실시형태에서 중요하고 바람직하다. 이러한 미생물군은 전형적으로 대상체의 조직(예, 장내, 구강, 폐, 겨드랑이, 안구, 질, 항문, 귀, 코 또는 목 조직)과 접촉하므로, 본 발명의 발명자들은 표면 상의 미생물군 박테리아 종(스트렙토코커스로 예시됨)의 성장을 억제하는 활동을 입증하는 것이 이러한 유용성을 지지하는 것으로 믿고 있다.
실시예 7: 다른 균주에서의 특정 미생물군 박테리아 개체군 성장 억제
실시예 6은 스트렙토코커스 서모필러스 LMD-9의 특이적 성장 억제를 입증하였다. 여기서 우리는 성장 억제가 제2 균주:스트렙토코커스 서모필러스 DSM 20617에서 수득될 수 있음을 입증하였다. 따라서, 실시예 6에 기술된 방법을 후자의 균주에 적용하였다(서모필러스 DSM 20617의 선택적 배지에는 2.5g l-1의 2-페닐에탄올 (PEA)이 보충된 TH 배지를 제외함).
CRISPR 어레이 플라스미드로 형질 전환된 스트렙토코커스 서모필러스 DSM 20617을 카나마이신 저항성의 발현을 허용하는 37에서 3 시간 동안 액체 배지에서 회수하기 위해 항온처리하였다. 회수 기간 후에, 세포를 대조군으로서 자일로스를 사용하지 않고 세포 사멸을 유도하기 위해 1% 자일로스 존재하에 상이한 선별 배지에 도말하였다(도 10). (1) 자일로스 유도에 의해 S 서모필러스의 성장이 억제될 수 있으며 ('강한' 프로모터 플라스미드 대 대조군이 약 10배 차이), (2) '강한' 시스템(pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA)이 '약한' 시스템(pBAV1KT5- XylR-CRISPR-PxylA)보다 더 많은 성장 감소를 가져오는 것이 분명해진다.
실시예 8: 다양한 미생물군종의 혼합된 컨소시엄에서 선택적 세균 박테리아 개체군 성장 억제
다음으로 본 발명자들은 3종의 혼합된 개체군에서 특정 박테리아 종의 선택적 성장 억제를 입증했다. 인간과 동물의 장내 미생물군 (S. 서모필러스 DSM 20617(T), 락토바실러스 락티스 및 대장균)에서 발견된 종을 선택했다. 이전 종의 선택적 사멸 능력에 영향을 미치는지 알아보기 위해; 또한 어려움을 증가시키기 위해(그리고 미생물군에서의 상황을 보다 면밀히 시뮬레이션하기 위해) 본 발명자들은 그람 양성 박테리아 2 종 (S. 서모필러스 및 L. 락티스)을 포함하였고, S. 서모필러스에 대한 계통발생학적으로 관련되는 종으로 L. 락티스가 선택되었다(두 종 사이에서 16s 리보솜 RNA 서열이 높은 동일성으로 나타남). S. 서모필러스 및 L. 락티스는 페르미쿠테스에 속한다. 또한, 미생물군을 시뮬레이션하기 위해 인간의 공생 장내 종(대장균)을 포함시켰다.
1. 물질 및 방법
실시예 6에 기재된 방법을 사용하였다(단, 선택 배지는 2-페닐 에탄올 (PEA) 2.5g l-1을 보충한 TH 배지였다).
1.1 전기능숙한 L. 락티스 세포의 준비
0.5M 수크로오스 및 1% 글리신으로 보충된 TH 배지에서 L. 락티스의 밤새 배양물을 동일한 배지 5㎖에서 100배 희석시키고, 0.2 내지 0.7의 OD600(항온처리 후 약 2 시간)으로 30에서 성장시켰다. 세포를 4에서 5 분간 7000 x g으로 수집하고 5 ml의 차가운 세척 완충액(0.5 M 수크로오스 + 10% 글리세롤)으로 3 회 세척하였다. 세포를 세척한 후, 15-30의 OD600으로 전기천공 완충액(0.5 M 수크로오스, 10 % 글리세롤 및 1 mM MgCl2)에 현탁시켰다. 전기천공 완충액의 세포를 사용전 4에서 (1 시간 이내) 유지시키거나 또는 나중에 사용하기 위해서는 에펜도르프 튜브로 50 μl로 나누어 액상 질소에서 동결시키고 -80에서 보관한다.
모든 종에 대한 전기천공 조건은 실시예 6에서 기술 한 바와 같다.
1.2 CRISPR 어레이의 활성화: 컨소시엄 실험.
S. 서모필러스 DSM 20617, L. 락티스 MG1363 및 대장균 TOP10을 DNA 중합 효소 III 및 S. 서모필러스의 tetA를 표적으로 하는 CRISPR 어레이를 함유하는 플라스미드로 유전적으로 형질 전환시켰다. 형질 전환시킨 후 모든 세포를 37에서 3시간 동안 공-배양하여 단독으로 성장시켜 회수를 위해 플라스미드에서 인코딩된 항생제 내성을 발현시켰다. CRISPR로 인코딩된 성장 억제를 판독할 때 형질전환 효율을 사용하기로 결정했다. 따라서, 세포를 회수하기 위해, 배양물을 TH 배지, PEA가 보충된 TH 배지, 및 맥콘키(MacConkey) 배지(모든 배지에 카나마이신이 보충됨)에 도말하고, 1 % 자일로스에 의해 유도하였다.
2. 결과
2.0. L. 락티스, 대장균, 및 S. 서모필러스 사이의 계통학적 거리
S. 서모필러스 및 L. 락티스의 16S rrNA-인코딩 DNA 서열에서 계산된 서열 유사성은 83.3 %로 결정되었다. 다음의 16S 서열을 사용하였다: 대장균: AB030918.1, S. 서모필러스: AY188354.1, L. 락티스: AB030918. 서열은 다음 매개 변수: -gapopen 10.0 -gapextend 0.5 -endopen 10.0 -endextend 0.5 -aformat3 pair -snucleotide1 -snucleotide2를 사용하여 니들(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html)로 정렬되었다.. 도 11은 S. 서모필러스 및 L. 락티스 및 대장균으로부터 유래한 16S 서열의 최대 계통발생수를 보여준다.
2.1 성장 조건 및 선택적 배지
S. 서모필러스 및 L. 락티스는 많은 발효 식품과 요구르트에서 함께 일반적으로 사용된다. 이들이 숙주와 친밀한 관계를 형성하는 장내 미생물로 일반적으로 알려져 있고, 서모필러스 및 L. 락티스의 16S 리보솜 RNA 영역의 이전 특성들은 이들 유기체가 계통발생학적으로 밀접하게 관련되어있음을 나타냈기 때문에 이들 균주를 선택했다(참조: Ludwig 외, 1995). 이와 병행하여 혼합된 개체군 공동 배양 실험에서 대장균의 성장을 평가하였는데, 그 이유는 유기체는 일반적으로 장내 미생물 군집에서도 발견되기 때문이다. 본 발명자들은 먼저 공동 배양 실험에 사용하기로 계획한 모든 균주의 성장을 지원해줄 박테리아 균주 및 배양 프로토콜을 수립하기 시작했다. 모든 균주가 37에서 TH 배지에서 성장을 지지할 수 있음을 발견했다(도 3).
혼합된 배양물로부터 다른 박테리아를 구별하는 것은 다른 종의 세포 수를 결정하는 데 중요하다. 맥콘키(MacConkey) 배지를 사용하면 대장균을 선택적으로 성장시킬 수 있지만, S. 서모필러스의 선택적 성장을 위한 특정 배지는 없다. PEA 배지는 그람 음성 박테리아(대장균)에서 그람 양성 박테리아(S. 서모필러스)를 분리하는 데 사용되는 선택적 배지이다. 또한, PEA의 농도가 다르면 상이한 그람 양성 종과 균주의 성장을 부분적으로 억제하여 이 실험에 사용된 다른 그람 양성 박테리아 사이에서 선택할 수 있다. 2.5 g l-1의 PEA를 사용하여 L. 락티스 및 대장균의 성장을 제한하면서 S. 서모필러스를 선택적으로 성장시켰다.
모든 균주는 카나마이신 선택 마커를 갖는 pBAV1KT5의 벡터 주쇄를 사용하는 플라스미드로 형질 전환시켰고; 30 ug ml-1의 카나마이신이 보충된 배지를 사용하는 것이 플라스미드를 유지하면서 세포를 키우기에 충분하다는 것을 발견했다.
2.3 혼합된 개체군에서의 형질 전환 및 선택적 성장 억제
S. 서모필러스, L. 락티스 및 대장균을 CRISPR 어레이가 들어있는 플라스미드로 형질 전환하고 모든 세균 종의 컨소시엄에서 균등하게 배양하여 S. 서모필러스에서 특이적으로 세포 사멸을 일으킬 수 있는지 여부를 결정할 수 있었다. 모든 종을 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PXylA 또는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-Pldha+XylA 플라스미드로 형질전환시켰다.
도 12는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA 또는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA 플라스미드를 갖는 대장균, L. 락티스 및 S. 서모필러스의 공동-배양물에서의 선택적 S. 서모필러스 성장 억제를 보여준다. pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA 또는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA 플라스미드를 갖는 대장균 (가운데 열) 간에는 성장 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, S. 서모필러스(2.5 gl-1 PEA이 보충된 TH 배지에서 선택적으로 성장됨, 마지막 열)는 우리가 예상한대로 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA (강함) 또는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA +XylA (약함) 플라스미드 사이의 형질 전환 효율의 감소를 나타낸다. 따라서 세포의 혼합된 개체군에서 표적 S. 서모필러스 하위 개체군의 선택적 성장 억제를 입증하였다.
참조문헌:
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표
표 1: 본 발명에서 사용하기 위한 SRB의 반복 서열
R1 및 R1' 각각은 예를 들어 시스템이 원유, 천연 가스 또는 물 회수, 처리 또는 저장 장비인 경우, 이러한 반복 컨센서스 서열로부터 선택될 수 있다.
박테리아 CRISPR_ID　 시작 위치 종료 위치 스페이서 수 DR (반복) 컨센서스　 서열번호 참고
데설포비브리오 데설푸리칸스
ND132		 NC_016803_1　 2325998　 2326074　 1　 CCTGGCCTGCCCCAAGTGCAAGG　 50
데설포비브리오 데설푸리칸스 ND132 NC_016803_4　 3491653　 3498191　 98　 GTCGCCCCCCACGCGGGGGCGTGGATTGAAAC　 51 1
데설포비브리오 불가리스 아종 불가리스str. Hildenborough NC_005863_3 175898 177711 28 GTCGCCCCCCACGCGGGGGCGTGGATTGAAAC　 51 1
데설포불버스 프로피오니쿠스 DSM 2032 NC_014972_1 1701541 1707620 92 GTCGCCCCCCACGCGGGGGCGTGGATTGAAAC　 51 1
데설포비브리오 불가리스 RCH1 NC_017311_1 170455 172268 28 GTCGCCCCCCACGCGGGGGCGTGGATTGAAAC　 51 1
데설포비브리오 데설푸리칸스 아종 데설푸리칸스 str. (ATCC 27774) NC_011883_1　 676246　 676547　 3 TGGAGCGGGAAACGGGATTTGAACCCGC　 52
데설포비브리오 데설푸리칸스 아종 데설푸리칸스 str. (ATCC 27774) NC_011883_2　 1083779　 1085579　 29 GTGTTCCCCACGGGCGTGGGGATGAACCG　 53
데설포비브리오 기가스 DSM 1382 (ATCC 19364) NC_022444_2　 430661　 430743　 1　 AACCTTTCTGCAAAAAGGTTTCCCC　 54 2
데설포비브리오 기가스 DSM 1382 (ATCC 19364) NC_022444_3　 915564　 915638　 1　 CCGCTGGATCCGGCTGCAGCGCC　 55
데설포비브리오 기가스 DSM 1382 (ATCC 19364) NC_022444_4　 1994976　 1995063 1　 GTTCACTGCCGCATAGGCAGCTCAGAAA　 56
데설포비브리오 기가스 DSM 1382 (ATCC 19364) NC_022444_5　 2555284　 2555600　 4　 CACCCGACTATTGAAGTCGGGCCTCATTGAAG　 57
데설푸리스피릴룸 인디쿰 S5 AACCTTTCTGCAAAAAGGTTTCCCC　 54 2
데설포비브리오 하이드로서말리스 NC_022579_1　 10819　 11067　 3　 GTCAAAACCCATACCGATATGGATACCTCTTTTGAG　 58
데설포비브리오 하이드로서말리스 NC_022579_2　 24430　 24678　 3　 GTCAAAACCCATACCGATATGGATACCTCTTTTGAG　 59
데설포비브리오 하이드로서말리스 NC_022579_3　 36027　 36275　 3　 GTCAAAACCCATACCGATATGGATACCTCTTTTGAG　 60
데설포비브리오 하이드로서말리스 NC_022579_4　 118127　 118736　 8　 GTCAAAACCCATACCGATATGGATACCTCTTTTGAG　 61
데설포비브리오 하이드로서말리스 NC_022579_5　 2366564　 2366737　 2　 CTCAAAAGAGGTATCCATATCGGTATGGGTTTTGAC　 62
데설포비브리오 하이드로서말리스 NC_022579_6　 2574826　 2575933　 18　 GTTCACTGCCGGATAGGCAGCTTAGAAA　 63
데설포비브리오 마그네티쿠스 RS-1 NC_012796_1　 1589785 1591828 30　 GTCGCCCCCTGCGCGGGGGCGTGGATTGAAAC　 64
데설포비브리오 마그네티쿠스 RS-1 NC_012796_3　 4725356　 4726585　 20　 TTTTCTGAGCTGCCTATGCGGCAGTGAAC　 65
데설포비브리오 불가리스 str. '미야자키 F' NC_011769_1　 241933　 242082　 1　 CATCGACGACGAACCCGGGCACCGCCTGATGGTCCACGCCGTCATG　 66
데설포비브리오 불가리스 str. '미야자키 F' NC_011769_3　 2444693　 2448088　 51　 GTCGCCCCTCACGCGGGGGCGTGGATAGAAAC　 67
데설포비브리오 불가리스 아종 불가리스 DP4 NC_008741_1　 29677　 32622　 44　 GTTTCAATCCACGCCCCCGCACGGGGGGCGAC　 68
데설푸리스피릴룸 인디쿰
데설푸리스피릴룸 인디쿰 S5		 NC_014836_1　 994780　 997087　 38　 TTTCTGAGCTGCCTATGCGGCAGTGAAC　 69 3
데설푸리스피릴룸 인디쿰 S5 NC_014836_2　 1123444 1127359 54　 GACCGAAGACCTGTCGGAAACGACGGGGATTGAGAC　 70
데설포비브리오 기가스 DSM 1382 (ATCC 19364) TTTCTGAGCTGCCTATGCGGCAGTGAAC　 69 3
데설포비브리오 기가스 DSM 1382 (ATCC 19364) NC_022444_4 1994976 1995063 2 GTTCACTGCCGCATAGGCAGCTCAGAAA 70
데설푸리비브리오 알칼리필러스 AHT2 NC_014216_2　 1780099　 1782570　 40　 CGGTTCATCCCCGCGAGTGCGGGGAACAT　 71
데설푸리비브리오 알칼리필러스 AHT2 NC_014216_3　 1785014　 1791956　 115　 TTTCTGAGCTGCCTGTGCGGCAGTGAAC　 72
데설푸로박테리움 서모리토트로품DSM 11699 NC_015185_1　 267992　 268349　 5　 GTTTTATCTGAACGTAGTGGGATATAAAG　 73
데설포비브리오 데설푸리칸스 G20 NC_007519_1　 885036　 886223　 19　 CGGTTCATCCCCGCGGGTGCGGGGAACAC　 74
CRISPR 데이터베이스(www.crispr.u-psud.fr)의 정보
1= 반복 서열(SEQ ID NO: 51)은 이들 박테리아에서 공통적이고;
2=반복 서열(SEQ ID NO: 54)은 이들 박테리아에서 공통적이고;
3=반복 서열(SEQ ID NO: 69)은 이들 박테리아에서 공통적이다.
다음의 예에 설명된 바와 같이 항목들을 읽는다.
Figure pat00002
CRISPR 어레이는 3491653 위치에서 시작하여 3498191 위치에서 종료되는 데설포비브리오 데설푸리칸스 ND132에서 발견되고, 여기서 상기 어레이는 98 개의 스페이서 서열을 가지며, 각각은 반복에 의해 측면에 위치되며, 반복 각각은 서열 번호 51의 서열을 갖는다. 이러한 반복은 참고 번호 1(표의 마지막 열)에 있는 다른 박테리아의 어레이에서도 발견된다.
박테로이데스 반복
서열번호 종/균주 반복 서열
107 1. 박테로이데스 프라질리스 NCTC 9343
2. 박테로이데스 프라질리스 638R 		GTTGTGATTTGCTTTCAAATTAGTATCTTTGAACCATTGGAAACAGC
108 3. 박테로이데스 프라질리스 NCTC 9343
4. 박테로이데스 프라질리스 YCH46 		ATTTCAATTCCATAAGGTACAATTAATAC
109 5. 박테로이데스 헬코게네스 P 36-108 GTTTCAATCCACACACCCGTATAGGGTGTGAC
110 6. 박테로이데스 종 CF50 ACTGTTTCTGATATGTCAAAGATAAAATTTTGAAAGCAAATCACAAC
111 7. 박테로이데스 테타이오타오마이크론 VPI-5482 GAAAAAATACAGTTTCGCTCTCA
프레보텔라 반복
서열번호 종/균주 반복 서열
112 8. 프레보텔라 덴탈리스 DSM 3688 GTCGCGTCTCACGTAGGCGCGTGGATTGAAAC
113 9. 프레보텔라 덴티콜라 F0289 ATTGTGCTTGCTACTGCAAAGATACACATTTTGAAGCAATTCACAAC
114 10. 프레보텔라 덴티콜라 F0289 CTCAATGAGTATCTTCCATTAAAACAAGGATTAAGAC
115 11. 프레보텔라 인터메디아 17 GTTGTTTTTACCTTGCAAACAGCAGGCAGATACAAC
116 12. 프레보텔라 인터메디아 17 GTTGTATTTGCCAATGCAAAGATACTAATTTTAAAGCTAATCACAAC
117 13. 프레보텔라 루미니콜라23 GTTGTATATCATTCCTTTCCTACATCAAACCACAAC
밑줄은 V. 콜레라 PLE 내의 서열과 100% 동일성을 갖는 CRISPR 스페이서를 의미한다.
파지 공급원 어레이 스페이서 스페이서 서열 서열번호
ICP1_ 2011_A CR1 1a CATTGCAACTATGCAAAATGATGAAGCTAAAA 79
2a TGTTAGAGTCGGTAGTATCTGGATGATCGATA 80
3a TTATGTATTGACCCCGACACGCCCCCCGACTG 81
4a TTACAGACGACCTAACTCTTCAGTACCATGAT 82
5a TACATAAGCTGCAACACGGTGTTCGTTTAAGT 83
6a AAAATACGCCTTTTTCCCTTCATCGTTTAAAG 84
7a ACCAACAAATCCCATAAACTGATAACCACGTT 85
8a GTCAACCCTTTGCTTATCTTCCCTATTTAAAT 86
9a TGTTAACCACCGCTTGAAATAATCATGATGCA 87
ICP1_ 2006_E CR1 1b TGTGTCTATACTCAACCAATTTAAGCGCCGCA 88
2b CTACTCTCCCCAATATTAGCCATTCCTAATTC 89
3b GTCACCTTACCGTAAGACAGGCAGTAAAATTA 90
4b AAACTAGTGGACGTAATGCAGTATTCACGGTT 91
CR2 1c ATCCACACTACAAATAGAACACTCAACCGTGA 92
ICP1_ 2005_A CR1 1d TGTGTCTATACTCAACCAATTTAAGCGCCGCA 93
2d CTACTCTCCCCAATATTAGCCATTCCTAATTC 94
3d AAACTAGTGGACGTAATGCAGTATTCACGGTT 95
4d ATAATCGTTTTGAGTCTCACCAGCTTTTAGGC 96
CR2 1e ATCCACACTACAAATAGAACACTCAACCGTGA 97
2e TATTGATTGGTCTCTAACCTTGGGATGATTAA 98
3e TTCACGGGTAGCAACAGGGTAATAAACCAATA 99
ICP1_ 2004_A CR1 1f CATTGCAACTATGCAAAATGATGAAGCTAAAA 100
2f TGTTAGAGTCGGTAGTATCTGGATGATCGATA 101
3f TAGAAGAGTAATAGGAGCTACTGCAAACTTGT 102
4f TAACTATGTGTGGTTTATATTTTGTGTGCAAG 103
5f TTTTGAAACTATTGACAGAAGGTTGGGAACCT 104
6f TTGAGGTTGAACCTCTTCCGGTTCCTCTTCTG 105
CR2 1g GTGTATTGCTTGCAGTGGGTTACACACAAGAA 106
V. 콜레라의 필수 동족체
 V. 콜레라의 중성 동족체
 대장균의 동족체 대장균 내 필수 여부 주석이 달린 기능
vc0631 vc0465 tyrS 필수임 티로실 tRNA 합성 효소
vc2024 vc0093 plsB 필수임 글리세롤 3 포스페이트
아실트랜스퍼라제
vc2626 dam 필수 아님 아데닌 메틸트랜스퍼라제
vc2763-vc2767 atpCDGAH 필수 아님 F1 ATP 합성 효소 (ε,β,γ,α,δ) 소단위
vc2768-vc2770 atpFEB 필수 아님 F0 ATP 합성 효소 (B,C,A) 소단위
유전자 특징
dnaE DNA 중합 효소 III 홀로효소 알파 소단위
recA 재조합 효소 A
ctxB 콜레라 독소 B
mdh 말산 탈수소 효소
gyrB DNA 자이레이스 소단위 B
tcpA 독소 동시-조절된 필린 A
ctxA 콜레라 독소 A 소단위
rpoA RNA 중합 효소 알파 소단위
tcpB 독소 동시-조절된 필러스 생합성 단백질 B
asd 아스파테이트-세미알데히드 탈수소 효소
유전자 특징
ctxB 콜레라 독소 B
tcpA 독소 동시-조절된 필린 A
ctxA 콜레라 독소 A 소단위
tcpB 독소 동시-조절된 필러스 생합성 단백질 B
wbet 오가와 특이적 항원
hlyA 용혈소 A
hapR 혈구 응집소/프로테아제 조절 단백질
rstR 잠재 파지 ctxphi 전사 억제자
mshA 만노오스-민감성 혈구 응집소 A
tcpP 독소 동시-조절된 필러스 생합성 단백질 P
서열:
하나의 예에서, 본 발명의 하나 이상의 스페이서는 이 서열 목록에서 각각의 서열을 표적으로 한다. 서열 번호 1 내지 44는 유형 II CRISPR/Cas 시스템 서열, 예를 들어, 스트렙토코커스 서열이다.
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
SEQUENCE LISTING <110> SNIPR TECHNOLOGIES LIMITED <120> ALTERING MICROBIAL POPULATIONS & MODIFYING MICROBIOTA <130> SNR0001-1 WO <160> 122 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> DNA <213> Bacterial <400> 1 ttgac 5 <210> 2 <211> 6 <212> DNA <213> Bacterial <400> 2 tataat 6 <210> 3 <211> 8 <212> DNA <213> Bacterial <400> 3 tatgaaaa 8 <210> 4 <211> 7 <212> DNA <213> Bacterial <400> 4 atttgag 7 <210> 5 <211> 8 <212> DNA <213> Bacterial <400> 5 atttgagg 8 <210> 6 <211> 3 <212> DNA <213> Bacterial <400> 6 gag 3 <210> 7 <211> 4 <212> DNA <213> Bacterial <400> 7 gagg 4 <210> 8 <211> 4 <212> DNA <213> Bacterial <400> 8 tgag 4 <210> 9 <211> 5 <212> DNA <213> Bacterial <400> 9 tgagg 5 <210> 10 <211> 5 <212> DNA <213> Bacterial <400> 10 ttgag 5 <210> 11 <211> 5 <212> DNA <213> Bacterial <400> 11 tgagg 5 <210> 12 <211> 6 <212> DNA <213> Bacterial <400> 12 tttgag 6 <210> 13 <211> 7 <212> DNA <213> Bacterial <400> 13 tttgagg 7 <210> 14 <211> 7 <212> DNA <213> Bacterial <400> 14 atttgag 7 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catcgatttc atagtagcca aggcgtgttt taacacttac 55680 cggaagccca cctgctttag tcgcttgaat aatttcggca gcaacgtcag gtcttaagat 55740 taagccggaa cccttaccct ttttagcaac atttgctaca ggacatccca tatttaagtc 55800 tatgccttta aagcccattt tagctaattg aatactcgtt tcacggaact gttctggctt 55860 atctccccat atatgagcga ccatcggctg ttcatcttca ctaaaagtta agcgtccgcg 55920 cacactatgt atgccttcag ggtggcaaaa gctttcagta tttgtaaatt cagtgaaaaa 55980 cacatccggt ctagctgctt cacttacaac gtgtcgaaag acgatatctg taacgtcttc 56040 cattggcgcc aaaataaaaa atggacgtgg taattcactc caaaaatttt ctttcataat 56100 atatttatac cctct 56115 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Bacterial <400> 50 cctggcctgc cccaagtgca agg 23 <210> 51 <211> 32 <212> DNA <213> Bacterial <400> 51 gtcgcccccc acgcgggggc gtggattgaa ac 32 <210> 52 <211> 28 <212> DNA <213> Bacterial <400> 52 tggagcggga aacgggattt gaacccgc 28 <210> 53 <211> 29 <212> DNA <213> Bacterial <400> 53 gtgttcccca cgggcgtggg gatgaaccg 29 <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> Bacterial <400> 54 aacctttctg caaaaaggtt tcccc 25 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Bacterial <400> 55 ccgctggatc cggctgcagc gcc 23 <210> 56 <211> 28 <212> DNA <213> Bacterial <400> 56 gttcactgcc gcataggcag ctcagaaa 28 <210> 57 <211> 32 <212> DNA <213> Bacterial <400> 57 cacccgacta ttgaagtcgg gcctcattga ag 32 <210> 58 <211> 36 <212> DNA <213> Bacterial <400> 58 gtcaaaaccc ataccgatat ggatacctct tttgag 36 <210> 59 <211> 36 <212> DNA <213> Bacterial <400> 59 gtcaaaaccc ataccgatat ggatacctct tttgag 36 <210> 60 <211> 36 <212> DNA <213> Bacterial <400> 60 gtcaaaaccc ataccgatat ggatacctct tttgag 36 <210> 61 <211> 36 <212> DNA <213> Bacterial <400> 61 gtcaaaaccc ataccgatat ggatacctct tttgag 36 <210> 62 <211> 36 <212> DNA <213> Bacterial <400> 62 ctcaaaagag gtatccatat cggtatgggt tttgac 36 <210> 63 <211> 28 <212> DNA <213> Bacterial <400> 63 gttcactgcc ggataggcag cttagaaa 28 <210> 64 <211> 32 <212> DNA <213> Bacterial <400> 64 gtcgccccct gcgcgggggc gtggattgaa ac 32 <210> 65 <211> 29 <212> DNA <213> Bacterial <400> 65 ttttctgagc tgcctatgcg gcagtgaac 29 <210> 66 <211> 46 <212> DNA <213> Bacterial <400> 66 catcgacgac gaacccgggc accgcctgat ggtccacgcc gtcatg 46 <210> 67 <211> 32 <212> DNA <213> Bacterial <400> 67 gtcgcccctc acgcgggggc gtggatagaa ac 32 <210> 68 <211> 32 <212> DNA <213> Bacterial <400> 68 gtttcaatcc acgcccccgc acggggggcg ac 32 <210> 69 <211> 28 <212> DNA <213> Bacterial <400> 69 tttctgagct gcctatgcgg cagtgaac 28 <210> 70 <211> 36 <212> DNA <213> Bacterial <400> 70 gaccgaagac ctgtcggaaa cgacggggat tgagac 36 <210> 71 <211> 29 <212> DNA <213> Bacterial <400> 71 cggttcatcc ccgcgagtgc ggggaacat 29 <210> 72 <211> 28 <212> DNA <213> Bacterial <400> 72 tttctgagct gcctgtgcgg cagtgaac 28 <210> 73 <211> 29 <212> DNA <213> Bacterial <400> 73 gttttatctg aacgtagtgg gatataaag 29 <210> 74 <211> 29 <212> DNA <213> Bacterial <400> 74 cggttcatcc ccgcgggtgc ggggaacac 29 <210> 75 <211> 28 <212> RNA <213> Bacterial <400> 75 guuagcagcc gcauaggcug cuuaaaua 28 <210> 76 <211> 33 <212> DNA <213> Bacterial <400> 76 aatttaaata gggaagataa gcaaagggtt gac 33 <210> 77 <211> 31 <212> DNA <213> Bacterial <400> 77 tttaaatagg gaagataagc aaagggttga c 31 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Bacterial <400> 78 Asn Leu Asn Arg Glu Asp Lys Gln Arg Val Asp 1 5 10 <210> 79 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 79 cattgcaact atgcaaaatg atgaagctaa aa 32 <210> 80 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 80 tgttagagtc ggtagtatct ggatgatcga ta 32 <210> 81 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 81 ttatgtattg accccgacac gccccccgac tg 32 <210> 82 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 82 ttacagacga cctaactctt cagtaccatg at 32 <210> 83 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 83 tacataagct gcaacacggt gttcgtttaa gt 32 <210> 84 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 84 aaaatacgcc tttttccctt catcgtttaa ag 32 <210> 85 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 85 accaacaaat cccataaact gataaccacg tt 32 <210> 86 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 86 gtcaaccctt tgcttatctt ccctatttaa at 32 <210> 87 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 87 tgttaaccac cgcttgaaat aatcatgatg ca 32 <210> 88 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 88 tgtgtctata ctcaaccaat ttaagcgccg ca 32 <210> 89 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 89 ctactctccc caatattagc cattcctaat tc 32 <210> 90 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 90 gtcaccttac cgtaagacag gcagtaaaat ta 32 <210> 91 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 91 aaactagtgg acgtaatgca gtattcacgg tt 32 <210> 92 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 92 atccacacta caaatagaac actcaaccgt ga 32 <210> 93 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 93 tgtgtctata ctcaaccaat ttaagcgccg ca 32 <210> 94 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 94 ctactctccc caatattagc cattcctaat tc 32 <210> 95 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 95 aaactagtgg acgtaatgca gtattcacgg tt 32 <210> 96 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 96 ataatcgttt tgagtctcac cagcttttag gc 32 <210> 97 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 97 atccacacta caaatagaac actcaaccgt ga 32 <210> 98 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 98 tattgattgg tctctaacct tgggatgatt aa 32 <210> 99 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 99 ttcacgggta gcaacagggt aataaaccaa ta 32 <210> 100 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 100 cattgcaact atgcaaaatg atgaagctaa aa 32 <210> 101 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 101 tgttagagtc ggtagtatct ggatgatcga ta 32 <210> 102 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 102 tagaagagta ataggagcta ctgcaaactt gt 32 <210> 103 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 103 taactatgtg tggtttatat tttgtgtgca ag 32 <210> 104 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 104 ttttgaaact attgacagaa ggttgggaac ct 32 <210> 105 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 105 ttgaggttga acctcttccg gttcctcttc tg 32 <210> 106 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 106 gtgtattgct tgcagtgggt tacacacaag aa 32 <210> 107 <211> 47 <212> DNA <213> Bacterial <400> 107 gttgtgattt gctttcaaat tagtatcttt gaaccattgg aaacagc 47 <210> 108 <211> 29 <212> DNA <213> Bacterial <400> 108 atttcaattc cataaggtac aattaatac 29 <210> 109 <211> 32 <212> DNA <213> Bacterial <400> 109 gtttcaatcc acacacccgt atagggtgtg ac 32 <210> 110 <211> 47 <212> DNA <213> Bacterial <400> 110 actgtttctg atatgtcaaa gataaaattt tgaaagcaaa tcacaac 47 <210> 111 <211> 23 <212> DNA <213> Bacterial <400> 111 gaaaaaatac agtttcgctc tca 23 <210> 112 <211> 32 <212> DNA <213> Bacterial <400> 112 gtcgcgtctc acgtaggcgc gtggattgaa ac 32 <210> 113 <211> 47 <212> DNA <213> Bacterial <400> 113 attgtgcttg ctactgcaaa gatacacatt ttgaagcaat tcacaac 47 <210> 114 <211> 37 <212> DNA <213> Bacterial <400> 114 ctcaatgagt atcttccatt aaaacaagga ttaagac 37 <210> 115 <211> 36 <212> DNA <213> Bacterial <400> 115 gttgttttta ccttgcaaac agcaggcaga tacaac 36 <210> 116 <211> 47 <212> DNA <213> Bacterial <400> 116 gttgtatttg ccaatgcaaa gatactaatt ttaaagctaa tcacaac 47 <210> 117 <211> 36 <212> DNA <213> Bacterial <400> 117 gttgtatatc attcctttcc tacatcaaac cacaac 36 <210> 118 <211> 487 <212> DNA <213> Synthetiic <400> 118 gcggataaca attactagag aaagaggaga aatactattc ttctcctctt taaataacga 60 aaacaccctg ccataaaatg acagggtgtt gatttcggca tgaagcctta tctttgtagc 120 ttctgcaaga tttaagtaac tgtgtaaggc gtcccttaca cttgcatgta tagttattat 180 accaggggga cagtgcaatg tcaagaataa actgtagaat gactagtgac ttaaatcttg 240 agagtacaaa aacccgttgg aatcgtgatt aatagtaact gttgttgtac agttacttaa 300 atcttgagag tacaaaaacg gccgagaaaa ggagctgatt cataggacag ttgtacagtt 360 acttaaatct tgagagtaca aaaactcaaa cttgcccgta gtttatctta tagccgttgt 420 acagttactt aaatcttgag agtacaaaaa catttacctc ctttgattta agtgaacaag 480 tttatcc 487 <210> 119 <211> 221 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 119 ttaaatcttg agagtacaaa aacccgttgg aatcgtgatt aatagtaact gttgttgtac 60 agttacttaa atcttgagag tacaaaaacg gccgagaaaa ggagctgatt cataggacag 120 ttgtacagtt acttaaatct tgagagtaca aaaactcaaa cttgcccgta gtttatctta 180 tagccgttgt acagttactt aaatcttgag agtacaaaaa c 221 <210> 120 <211> 112 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 120 ttaaataacg aaaacaccct gccataaaat gacagggtgt tgatttcggc atgaagcctt 60 atctttgtag cttctgcaag atttaagtaa ctgtgtaagg cgtcccttac ac 112 <210> 121 <211> 30 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 121 tgtcctatga atcagctcct tttctcggcc 30 <210> 122 <211> 30 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 122 ggctataaga taaactacgg gcaagtttga 30

Claims (19)

  1. 혼합된 박테리아 개체군에서 제1 및 제2 박테리아 하위 개체군들의 상대적 비율을 변경함으로써, 상기 혼합된 박테리아 개체군을 포함하는 인간 또는 동물 대상체에서 박테리아 숙주 세포에 의해 매개되는 상태 또는 질병을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 숙주 변형(Host modifying; HM) CRISPR/Cas 시스템으로서,
    상기 제2 박테리아는 숙주 세포들을 포함하고,
    상기 시스템은 (a) 상기 제2 박테리아의 개체군의 숙주 세포들, (b) 상기 (a)의 각각의 숙주 세포에 대한 적어도 하나의 핵산 벡터 및 하기 (i) 내지 (ii)에 따른 성분들을 포함하며:
    (i) Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및
    (ii) 숙주 세포 표적 서열, 및 스페이서 서열(HM-스페이서)과 HM-crRNA을 인코딩하는 반복(repeat)을 포함하는 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이로서, 상기 HM-crRNA는 숙주 표적 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하여 상기 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시킴;
    상기 (i) 성분 및 상기 (ii) 성분은, 상기 숙주 세포 및 상기 숙주 세포를 형질 전환시킬 수 있는 상기 적어도 하나의 핵산 벡터 사이에서 분할되며, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 상기 적어도 하나의 핵산 서열은 숙주 세포에 내인성이고, 상기 숙주 세포 표적 서열은 상기 숙주 세포에 존재하며, 상기 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이는 상기 적어도 하나의 벡터에 존재하며,
    이로써 상기 HM-crRNA는 Cas을 표적으로 안내하여 상기 숙주 세포에서 상기 표적 서열을 변형시키고;
    이로써 상기 숙주 세포는 사멸되거나 상기 숙주 세포의 성장이 감소되며;
    상기 제1 하위 개체군은 E coli 세포들로 구성되며;
    상기 제2 하위 개체군은 상기 제1 하위 개체군과 상이한 박테리아 종들로 구성되는, 시스템.
  2. 혼합된 박테리아 개체군에서 제1 및 제2 박테리아 하위 개체군들의 상대적 비율을 변경함으로써, 상기 혼합된 박테리아 개체군을 포함하는 인간 또는 동물 대상체에서 박테리아 숙주 세포에 의해 매개되는 상태 또는 질병을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 숙주 변형(Host modifying; HM) CRISPR/Cas 시스템으로서,
    상기 제2 박테리아는 숙주 세포들을 포함하고,
    상기 시스템은 (a) 상기 제2 박테리아의 개체군의 숙주 세포들, (b) 상기 (a)의 각각의 숙주 세포에 대한 적어도 하나의 핵산 벡터 및 하기 (i) 내지 (ii)에 따른 성분들을 포함하며:
    (i) Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및
    (ii) 숙주 세포 표적 서열, 및 스페이서 서열(HM-스페이서)과 HM-crRNA을 인코딩하는 반복(repeat)을 포함하는 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이로서, 상기 HM-crRNA는 숙주 표적 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하여 상기 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시킴;
    상기 (i) 성분 및 상기 (ii) 성분은, 상기 숙주 세포 및 상기 숙주 세포를 형질 전환시킬 수 있는 상기 적어도 하나의 핵산 벡터 사이에서 분할되며, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 상기 적어도 하나의 핵산 서열은 상기 적어도 하나의 벡터에 존재하고, 상기 숙주 세포 표적 서열은 상기 숙주 세포에 존재하며, 상기 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이는 상기 적어도 하나의 벡터에 존재하며,
    이로써 상기 HM-crRNA는 Cas을 표적으로 안내하여 상기 숙주 세포에서 상기 표적 서열을 변형시키고;
    이로써 상기 숙주 세포는 사멸되거나 상기 숙주 세포의 성장이 감소되며;
    상기 제1 하위 개체군은 E coli 세포들로 구성되며;
    상기 제2 하위 개체군은 상기 제1 하위 개체군과 상이한 박테리아 종들로 구성되는, 시스템.
  3. 생체 외의(ex vivo) 혼합된 박테리아 개체군에서 제1 및 제2 박테리아 하위 개체군들의 상대적 비율을 변경하기 위한, 숙주 변형(Host modifying; HM) CRISPR/Cas 시스템의 용도로서,
    상기 제2 박테리아는 숙주 세포들을 포함하고,
    상기 시스템은 (a) 상기 제2 박테리아의 개체군의 숙주 세포들, (b) 상기 (a)의 각각의 숙주 세포에 대한 적어도 하나의 핵산 벡터 및 하기 (i) 내지 (ii)에 따른 성분들을 포함하며:
    (i) Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및
    (ii) 숙주 세포 표적 서열, 및 스페이서 서열(HM-스페이서)과 HM-crRNA을 인코딩하는 반복(repeat)을 포함하는 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이로서, 상기 HM-crRNA는 숙주 세포 표적 서열에 혼성화하는 서열을 포함하여 상기 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시킴;
    상기 (i) 성분 및 상기 (ii) 성분은, 상기 숙주 세포 및 상기 숙주 세포를 형질 전환시키는 상기 적어도 하나의 핵산 벡터 사이에서 분할되며, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 상기 적어도 하나의 핵산 서열은 숙주 세포에 내인성이고, 상기 숙주 세포 표적 서열은 상기 숙주 세포에 존재하며, 상기 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이는 상기 적어도 하나의 벡터에 존재하며,
    이로써 상기 HM-crRNA는 Cas을 표적으로 안내하여 상기 숙주 세포에서 상기 표적 서열을 변형시키고;
    상기 표적 서열은 상기 Cas에 의해 변형되며 이로써 상기 숙주 세포는 사멸되거나 상기 숙주 세포의 성장이 감소되며;
    상기 제1 하위 개체군은 E coli 세포들로 구성되며;
    상기 제2 하위 개체군은 상기 제1 하위 개체군과 상이한 박테리아 종들로 구성되는, 용도.
  4. 생체 외의(ex vivo) 혼합된 박테리아 개체군에서 제1 및 제2 박테리아 하위 개체군들의 상대적 비율을 변경하기 위한, 숙주 변형(Host modifying; HM) CRISPR/Cas 시스템의 용도로서,
    상기 제2 박테리아는 숙주 세포들을 포함하고,
    상기 시스템은 (a) 상기 제2 박테리아의 개체군의 숙주 세포들, (b) 상기 (a)의 각각의 숙주 세포에 대한 적어도 하나의 핵산 벡터 및 하기 (i) 내지 (ii)에 따른 성분들을 포함하며:
    (i) Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및
    (ii) 숙주 세포 표적 서열, 및 스페이서 서열(HM-스페이서)과 HM-crRNA을 인코딩하는 반복(repeat)을 포함하는 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이로서, 상기 HM-crRNA는 숙주 세포 표적 서열에 혼성화하는 서열을 포함하여 상기 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시킴;
    상기 (i) 성분 및 상기 (ii) 성분은, 상기 숙주 세포 및 상기 숙주 세포를 형질 전환시키는 상기 적어도 하나의 핵산 벡터 사이에서 분할되며, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 상기 적어도 하나의 핵산 서열은 상기 적어도 하나의 벡터에 존재하며, 상기 숙주 세포 표적 서열은 상기 숙주 세포에 존재하며, 상기 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이는 상기 적어도 하나의 벡터에 존재하며,
    이로써 상기 HM-crRNA는 Cas을 표적으로 안내하여 상기 숙주 세포에서 상기 표적 서열을 변형시키고;
    상기 표적 서열은 상기 Cas에 의해 변형되며 이로써 상기 숙주 세포는 사멸되거나 상기 숙주 세포의 성장이 감소되며;
    상기 제1 하위 개체군은 E coli 세포들로 구성되며;
    상기 제2 하위 개체군은 상기 제1 하위 개체군과 상이한 박테리아 종들로 구성되는, 용도.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 용도는 산업용 또는 생체 외 의료용 유체, 표면, 장치 또는 컨테이너를 처리하거나; 또는 수로, 물, 음료, 식료품 또는 화장품을 처리하기 위한 것이며,
    상기 숙주 세포(들)은 상기 유체, 표면, 장치, 컨테이너, 수로, 물, 음료, 식료품 또는 화장품에 포함되거나 상기 유체, 표면, 장치, 컨테이너, 수로, 물, 음료, 식료품 또는 화장품 상에 위치하는, 용도.
  6. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 혼합된 개체군은 생체 외 장내 미생물군 개체군이며; 선택적으로 상기 숙주 세포들은 페르미쿠테스 세포들인, 용도.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 각각의 숙주 세포는 인간 미생물군에서 발견되는 균주(strain) 또는 종(species)이거나;
    (b) 각각의 숙주 세포가 스타필로코커스, 스트렙토코커스, 슈도모나스, 살모넬라, 리스테리아, 데설포비브리오 또는 클로스트리디움 숙주 세포이거나;
    (c) 상기 제1 박테리아가 프로바이오틱 박테리아 또는, 인간(예를 들어, 인간 장내)과 공생하는, 또는 생리공생하는 박테리아이거나; 또는
    (d) 상기 제1 박테리아는 장내세균(Enterobacteriaceae)이고 상기 제2 박테리아는 페르미쿠테스인, 용도 또는 시스템.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    대안적으로 HM-crRNA 및 tracrRNA가 단일 가이드 RNA(gRNA)에 포함되는, 용도 또는 시스템.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    숙주 세포 개체군 성장이,
    상기 HM-어레이 또는 상기 gRNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질 전환되지 않은 숙주 세포의 개체군의 성장과 비교하여 적어도 5배 감소되는, 용도 또는 시스템.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    표면상의 숙주 세포 개체군 성장이 억제되는, 용도 또는 시스템.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 벡터는 Cas 뉴클레아제-인코딩 서열이 결핍된, 용도 또는 시스템.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 벡터는 파지 벡터인, 용도 또는 시스템.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 숙주 세포에 대하여 상기 시스템은,
    tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열을 더 포함하는, 용도 또는 시스템.
  14. 제1항, 제2항 및, 제1항 또는 제2항에 따른 경우의 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혼합된 개체군은 상기 대상체의 장내 미생물군에 포함된, 시스템.
  15. 제2항, 제4항 및, 제2항 또는 제4항에 따른 경우의 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 상기 적어도 하나의 핵산 서열과 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이는 상이한 벡터에 존재하는, 용도 또는 시스템.
  16. 혼합된 박테리아 개체군에서 제1 및 제2 박테리아 하위 개체군들의 상대적 비율을 변경함으로써, 상기 혼합된 박테리아 개체군을 포함하는 인간 또는 동물 대상체에서 병원성 박테리아 숙주 세포(pathogenic bacterial host cell)에 의해 매개되는 상태 또는 질병을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 조작된 핵산 벡터로서,
    상기 제2 박테리아는 숙주 세포들을 포함하고,
    상기 제1 하위 개체군은 E coli 세포들로 구성되며;
    상기 제2 하위 개체군은 상기 제1 하위 개체군과 상이한 박테리아 종들로 구성되며,
    상기 벡터는, CRISPR/Cas 시스템에서의 사용 또는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 사용을 위한, 다수의 상이한 crRNA들을 발현하기 위한 핵산 서열(예컨대 gRNA들에 포함됨)을 포함하며,
    상기 crRNA들 중 제1의 crRNA는 상기 숙주 세포에서 제1 핵산 서열에 혼성화될 수 있고; 상기 crRNA들 중 제2의 crRNA는 상기 숙주 세포에서 제2 핵산 서열에 혼성화될 수 있고, 상기 제2 서열은 상기 제1 서열과 상이하며;
    그리고,
    (a) 상기 제1 서열은 항생제 내성 유전자 (또는 이의 RNA)에 포함되고, 상기 제2 서열은 항생제 내성 유전자 (또는 이의 RNA)에 포함되거나 -선택적으로 상기 유전자들은 상이함-;
    (b) 상기 제1 서열은 항생제 내성 유전자 (또는 이의 RNA)에 포함되고, 상기 제2 서열은 필수 유전자 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)에 포함되거나;
    (c) 상기 제1 서열은 필수 유전자 (또는 이의 RNA)에 포함되고, 상기 제2 서열은 필수 유전자 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)에 포함되거나; 또는
    (d) 상기 제1 서열은 독성 유전자 (또는 이의 RNA)에 포함되고, 상기 제2 서열은 필수 유전자 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)에 포함되는, 조작된 핵산 벡터.
  17. 혼합된 박테리아 개체군에서 제1 및 제2 박테리아 하위 개체군들의 상대적 비율을 변경함으로써, 상기 혼합된 박테리아 개체군을 포함하는 인간 또는 동물 대상체에서 병원성 박테리아 숙주 세포에 의해 매개되는 상태 또는 질병을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 핵산 벡터로서,
    상기 제2 박테리아는 숙주 세포들을 포함하고,
    상기 제1 하위 개체군은 E coli 세포들로 구성되며;
    상기 제2 하위 개체군은 상기 제1 하위 개체군과 상이한 박테리아 종들로 구성되며,
    i) 상기 벡터는 제1항, 제3항 및 제1항 또는 제3항에 따르는 경우의 제5항 내지 제16항 중 어느 한 항의 용도 또는 시스템에서 사용을 위한 것이며, 상기 벡터는 1.4kb를 초과하는 외인성 DNA 서열을 포함하고, 상기 외인성 DNA는 CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 성분을 인코딩하고, 숙주 세포들에서 HM-crRNA 또는 gRNA를 발현하기 위한 조작된 어레이를 포함하고, 적어도 2 개의 상이한 cRNA들 또는 gRNA들이 상기 외인성 DNA에 의해(예를 들어, 적어도 2 개의 HM-CRISPR 어레이에 의해) 인코딩되거나; 또는
    ii) 상기 벡터는 제1항, 제2항 및 제1항 또는 제2항에 따르는 경우의 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항의 시스템에서 사용을 위한 것이며, 상기 벡터는 상기 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이를 포함하고, 상기 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이는 스페이서 서열(HM-스페이서)과 HM-crRNA을 인코딩하는 반복(repeat)을 포함하며, 상기 HM-crRNA는 숙주 표적 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하여 상기 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 안내하여 표적 서열을 변형시키며, 상기 벡터는 인간 또는 동물 대상체에게 투여될 수 있고, 상기 HM-crRNA는 상기 대상체에서 발현되는, 핵산 벡터.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 벡터는 cRNA(들) 또는 gRNA(들)에 동족인 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 결여되어 있는, 핵산 벡터.
  19. 혼합된 박테리아 개체군에서 제1 및 제2 박테리아 하위 개체군들의 상대적 비율을 변경함으로써, 상기 혼합된 박테리아 개체군을 포함하는 인간 또는 동물 대상체에서 병원성 박테리아 숙주 세포에 의해 매개되는 상태 또는 질병을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 숙주 변형(HM) CRISPR/Cas 시스템으로서,
    상기 제2 박테리아는 숙주 세포들을 포함하고,
    상기 제1 하위 개체군은 E coli 세포들로 구성되며;
    상기 HM-crRNA는,
    제1항, 제2항 및, 제1항 또는 제2항에 따르는 경우의 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기술된 조작된 숙주 변형(HM) CRISPR 어레이에 의해 인코딩되며,
    제1항, 제2항 및, 제1항 또는 제2항에 따르는 경우의 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기술된 시스템의 벡터들은,
    인간 또는 동물 대상체에게 투여될 수 있고, 상기 HM-crRNA는 상기 대상체에서 발현되는, 시스템.
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